特開2024-123234アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症のための組成物及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024123234
(43)【公開日】2024-09-10
(54)【発明の名称】アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症のための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20240903BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240903BHJP
C07K 14/765 20060101ALI20240903BHJP
C07K 14/81 20060101ALI20240903BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240903BHJP
C12N 15/14 20060101ALI20240903BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240903BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240903BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240903BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240903BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240903BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240903BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20240903BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20240903BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240903BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240903BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240903BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K19/00 ZNA
C07K14/765
C07K14/81
C12N15/12
C12N15/14
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/02 C
A61K38/16
A61K47/64
A61P11/00
A61P1/16
A61K48/00
C07K19/00
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024103143
(22)【出願日】2024-06-26
(62)【分割の表示】P 2021548539の分割
【原出願日】2019-10-29
(31)【優先権主張番号】62/752,182
(32)【優先日】2018-10-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】521185479
【氏名又は名称】スピン セラピューティクス， エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】アーロン サト
(72)【発明者】
【氏名】マーク デソウザ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症の治療に有用な組成物及び方法を提供する。
【解決手段】特定の実施形態では、（ａ）アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインと、（ｂ）ヒト血清アルブミン結合ドメインとを含む、組換えタンパク質が提供される。
【選択図】なし
【解決手段】特定の実施形態では、（ａ）アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインと、（ｂ）ヒト血清アルブミン結合ドメインとを含む、組換えタンパク質が提供される。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
本願は、本明細書において参照により援用する２０１８年１０月２９日出願の６２／７５２，１８２号の優先権を主張する。
【0002】
セルピンは、プロテアーゼを阻害するそれらの能力が最初に特定された類似の構造を持つタンパク質のスーパーファミリーである。セルピンという名称は、元々は造語であったが、これは最初に特定されたセルピンが、キモトリプシン様セリンプロテアーゼに対して作用することが発見されたことが理由である。結果として、ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（セリンプロテアーゼインヒビター）の語の最初の文字の組み合わせを組み込むように、頭字語であるセルピン（ｓｅｒｐｉｎ）が選択された。
【0003】
セルピンは、大規模なコンホメーション変化を受けて標的プロテアーゼにおける活性部位を破壊することによって不可逆的に標的プロテアーゼを阻害する、というセルピンの稀な作用機序を理由に関心がもたれている。セルピンによるプロテアーゼ阻害は、凝血及び炎症を含めて数々の生物学的プロセスを制御する。このプロテアーゼ阻害の機序は、一定の利点を与えるが、欠点も有する。主要な欠点のひとつには、タンパク質の折り畳み異常及び不活性な長鎖高分子形成等であるセルピン病（ｓｅｒｐｉｎｏｐａｔｈｙ）を結果としてもたらす可能性がある変異に対して、セルピンが特に脆弱であるということがある。
【0004】
アルファ－１－アンチトリプシン又はα１－アンチトリプシン（「Ａ１ＡＴ」、「Ａ１Ａ」、又は「ＡＡＴ」）は、セルピンスーパーファミリーに属するタンパク質である。アルファ－１－アンチトリプシンはヒトにおいては、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子がコードするが、当該遺伝子は、４個のコードエキソンと３個の非翻訳エキソンとを有して、１４番染色体のｑ３１－３１．２に位置する。アルファ－１－アンチトリプシンはまたアルファ１－プロテイナーゼインヒビター又はアルファ１－アンチプロテイナーゼとしても知られるが、これはトリプシンだけでなく、様々なプロテアーゼを阻害するからである。アルファ－１－アンチトリプシンはアンチプロテアーゼとして機能する５２ｋＤの糖タンパク質である。アルファ－１－アンチトリプシンは、長さが２４アミノ酸であるシグナルペプチドが付加した、３９４個のアミノ酸の単鎖を有する。アルファ－１－アンチトリプシンは、あるタイプの酵素インヒビターとして、特に好中球エラスターゼ及びプロテイナーゼ３（「ＰＲ３」）である炎症細胞の酵素から組織を保護し、そして血中での正常な基準域は１．５～３．５ｇ／Ｌである。このアルファ－１－アンチトリプシンの濃度は、急性炎症の際に何倍も上昇する可能性がある。
【0005】
好中球エラスターゼは、肺に弾性収縮力を与えるゴム様巨大分子であるエラスターゼを破壊するセリンプロテアーゼである。血液が、十分な量のアルファ－１－アンチトリプシンを含有していない又は機能的に欠陥のあるアルファ－１－アンチトリプシンを含有していると、好中球エラスターゼが過度に自由にエラスチンを破壊でき、肺の弾力が低下する。弾力が低下すると、結果として、慢性閉塞性肺疾患等の呼吸器合併症がもたらされる。
【0006】
ＰＲ３は、主に好中球顆粒細胞中で発現したセリンプロテアーゼ酵素である。好中球の機能におけるその正確な役割はわかっていないが、ヒト好中球においては、プロテイナーゼ３は、抗菌ペプチドのタンパク質生成に寄与する。
【0007】
アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症（「ＡＡＴＤ」）は、アルファ－１－アンチトリプシンの産生不全の原因となる遺伝性疾患である。ＡＡＴＤは、ＡＡＴＤの低下した血清中レベルが引き起こす常染色体劣性遺伝疾患である。この疾患は、アルファ－１－アンチトリプシンの減少を導く。この疾患はしばしば、肺及び肝臓の疾患を引き起こし、遺伝性肺気腫と呼ばれる。ＡＡＴＤは、ヨーロッパ系子孫のコーカソイドの最も多くみられる致死性の遺伝性疾患のひとつである。
【0008】
アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症にはいくつかの形態と程度があり、当該形態と程度は、患者が欠陥のある対立遺伝子のコピーを１つ持っているか又は２つ持っているかに左右される。深刻なアルファ－１－アンチトリプシン欠乏症では、症状をもつ多くの人々の成人期において、特に彼らがタバコの煙に曝露するのであれば、汎小葉性肺気腫又はＣＯＰＤ様症状を引き起こす可能性がある。当該疾患はまた、小児及び成人において種々の肝疾患につながる可能性があり、そして場合によっては、より稀な問題につながる可能性がある。アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症によれば、通常、ある程度の障害がもたらされ、余命が短くなる。
【0009】
アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症は、有害な吸入剤を回避して、アルファ－１－アンチトリプシンの静脈内注入によって又は肝臓もしくは肺の移植によって治療する。組換え型のアルファ－１－アンチトリプシンもまた公知であるが、現在は治療としてよりも医学研究で用いられている。承認されたアルファ－１－アンチトリプシン欠乏症の製剤は、ヒト血漿から精製されて、高用量（６０～１２０ｍｇ／ｋｇ）での毎週の頻繁な注入を必要としており、そして限られた効能しか得られない。アルファ－１－アンチトリプシンを増大する療法は、血漿由来のＡＡＴを高濃度で投与するにもかかわらず、循環ＡＡＴレベルで確認されるピーク値とトラフ値から貧弱な薬物動態であることを理由に理想的ではない。
【0010】
近年の研究では、タンパク質工学を介した長時間作用性のアルファ－１－アンチトリプシン融合体を開発することに焦点を当てているものもある。例えば、以下の２つのグループによって、ＡＡＴ Ｆｃが発現及び開発されている：Ｓｏｏｈｙｕｎ Ｋｉｍ（建国大学校（Ｋｏｎｋｕｋ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、韓国ソウル；ＯｍｎｉＢｉｏ社がライセンスをもつ（「Ｋｉｍ／ＯｍｎｉＢｉｏ分子」）（Ｌｅｅ Ｓ，Ｌｅｅ Ｙ，Ｈｏｎｇ Ｋ，Ｈｏｎｇ Ｊ，Ｂａｅ Ｓ，Ｃｈｏｉ Ｊ，Ｊｈｕｎ Ｈ，Ｋｗａｋ Ａ，Ｋｉｍ Ｅ，Ｊｏ Ｓ，Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ ＣＡ，Ｋｉｍ Ｓ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ α１－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ Ｆｅ－ｆｕｓｅｄ（ＡＡＴ－Ｆｃ）ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ
ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１３ Ｍａｙ ２０；１９：６５－７１．ｄｏｉ：１０．２１１９／ｍｏｌｍｅｄ．２０１２．００３０８．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２３５５２７２６；ＰｕｂＭｅｄ Ｃｅｎｔｒａｌ ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３６６７２１３を参照されたく、これはいずれの図面も含めて、全体として本明細書において参照により援用する）及びＩｎｈｉｂＲｘ（「ＩｎｈｉｂＲｘ分子」）（例えば、米国特許第８，９８０，２６６Ｂ２号、Ｓｅｒｐｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｔｈｅｒｅｏｆ（セルピン融合ポリペプチドならびにその方法及び使用）を参照されたく、これはいずれの図面も含めて、全体として本明細書において参照により援用する。）。いずれの分子も、ＩｇＧ１ ＦｃとのＮ－末端ＡＡＴ融合体である。Ｋｉｍ／ＯｍｎｉＢｉｏ分子は、ヒト好中球エラスターゼのみならず血漿由来のＡＡＴを阻害せず、これは精製中にプロテインＡクロマトグラフィーからの溶出でｐＨ不安定性が低いという結果となり得る。ＩｎｈｉｂＲｘ分子は、血漿由来のＡＡＴ同様にヒト好中球エラスターゼを阻害することが報告されている。
ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１３ Ｍａｙ ２０；１９：６５－７１．ｄｏｉ：１０．２１１９／ｍｏｌｍｅｄ．２０１２．００３０８．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２３５５２７２６；ＰｕｂＭｅｄ Ｃｅｎｔｒａｌ ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３６６７２１３を参照されたく、これはいずれの図面も含めて、全体として本明細書において参照により援用する）及びＩｎｈｉｂＲｘ（「ＩｎｈｉｂＲｘ分子」）（例えば、米国特許第８，９８０，２６６Ｂ２号、Ｓｅｒｐｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｔｈｅｒｅｏｆ（セルピン融合ポリペプチドならびにその方法及び使用）を参照されたく、これはいずれの図面も含めて、全体として本明細書において参照により援用する。）。いずれの分子も、ＩｇＧ１ ＦｃとのＮ－末端ＡＡＴ融合体である。Ｋｉｍ／ＯｍｎｉＢｉｏ分子は、ヒト好中球エラスターゼのみならず血漿由来のＡＡＴを阻害せず、これは精製中にプロテインＡクロマトグラフィーからの溶出でｐＨ不安定性が低いという結果となり得る。ＩｎｈｉｂＲｘ分子は、血漿由来のＡＡＴ同様にヒト好中球エラスターゼを阻害することが報告されている。
【0011】
他の者は、Ｎ－グリカンの数を増加させることによって（例えば、Ｃｈｕｎｇ ＨＳ，Ｋｉｍ ＪＳ，Ｌｅｅ ＳＭ，Ｐａｒｋ ＳＪ．Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ－１ ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ ｉｎ Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ ｒａｔｓ．Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ．２０１６ Ａｐｒ；３３（２）：２０１－８．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１０７１９－０１６－９６５７－３．Ｅｐｕｂ
２０１６ Ｍａｒ ７．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２６９４７８７４を参照されたく、これはいずれの図面も含めて、本明細書においてその全体として参照により援用する）、又はポリシアル化（ｐｏｌｙｓｉａｌｙａｔｉｏｎ）を付加することによって（例えば、Ｌｉｎｄｈｏｕｔ Ｔ，Ｉｑｂａｌ Ｕ，Ｗｉｌｌｉｓ ＬＭ，Ｒｅｉｄ ＡＮ，Ｌｉ Ｊ，Ｌｉｕ Ｘ，Ｍｏｒｅｎｏ Ｍ，Ｗａｋａｒｃｈｕｋ ＷＷ．Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｏｌｙｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１１ Ｍａｙ ３；１０８（１８）：７３９７－４０２．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１０１９２６６１０８．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ａｐｒ １８．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２１５０２５３２；ＰｕｂＭｅｄ Ｃｅｎｔｒａｌ ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３０８８６３９を参照されたく、これはいずれの図面も含めて、本明細書においてその全体として参照により援用する）、ＡＡＴのグリコシル化パターンを改変した。一部の者はアグリコシル化ＡＡＴ（例えば、Ｃａｎｔｉｎ ＡＭ，Ｗｏｏｄｓ ＤＥ，Ｃｌｏｕｔｉｅｒ Ｄ，Ｈｅｒｏｕｘ Ｊ，Ｄｕｆｏｕｒ ＥＫ，Ｌｅｄｕｃ Ｒ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｅｌａｓｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ：ｒｏｌｅ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ－１－ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｖｅｒｓｕｓ ｌｕｎｇ．Ｊ Ａｅｒｏｓｏｌ Ｍｅｄ．２００２ Ｓｕｍｍｅｒ；１５（２）：１４１－８．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１２１８４８６４を参照されたく、これはいずれの図面も含めて、本明細書においてその全体として参照により援用する）を産生した。さらに他の者は、半減期が伸びるようにペグ化されたアグリコシル化ＡＡＴを開発した（例えば、Ｃａｎｔｉｎ ＡＭ，Ｗｏｏｄｓ ＤＥ，Ｃｌｏｕｔｉｅｒ Ｄ，Ｄｕｆｏｕｒ ＥＫ，Ｌｅｄｕｃ Ｒ．Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｔ Ｃｙｓ２３２ ｐｒｏｌｏｎｇｓ ｔｈｅ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ ｏｆ ａｌｐｈａ１ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ
Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００２ Ｄｅｃ；２７（６）：６５９－６５．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１２４４４０２５を参照されたく、これはいずれの図面も含めて、本明細書においてその全体として参照により援用する）。
２０１６ Ｍａｒ ７．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２６９４７８７４を参照されたく、これはいずれの図面も含めて、本明細書においてその全体として参照により援用する）、又はポリシアル化（ｐｏｌｙｓｉａｌｙａｔｉｏｎ）を付加することによって（例えば、Ｌｉｎｄｈｏｕｔ Ｔ，Ｉｑｂａｌ Ｕ，Ｗｉｌｌｉｓ ＬＭ，Ｒｅｉｄ ＡＮ，Ｌｉ Ｊ，Ｌｉｕ Ｘ，Ｍｏｒｅｎｏ Ｍ，Ｗａｋａｒｃｈｕｋ ＷＷ．Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｏｌｙｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１１ Ｍａｙ ３；１０８（１８）：７３９７－４０２．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１０１９２６６１０８．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ａｐｒ １８．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２１５０２５３２；ＰｕｂＭｅｄ Ｃｅｎｔｒａｌ ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３０８８６３９を参照されたく、これはいずれの図面も含めて、本明細書においてその全体として参照により援用する）、ＡＡＴのグリコシル化パターンを改変した。一部の者はアグリコシル化ＡＡＴ（例えば、Ｃａｎｔｉｎ ＡＭ，Ｗｏｏｄｓ ＤＥ，Ｃｌｏｕｔｉｅｒ Ｄ，Ｈｅｒｏｕｘ Ｊ，Ｄｕｆｏｕｒ ＥＫ，Ｌｅｄｕｃ Ｒ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｅｌａｓｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ：ｒｏｌｅ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ－１－ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｖｅｒｓｕｓ ｌｕｎｇ．Ｊ Ａｅｒｏｓｏｌ Ｍｅｄ．２００２ Ｓｕｍｍｅｒ；１５（２）：１４１－８．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１２１８４８６４を参照されたく、これはいずれの図面も含めて、本明細書においてその全体として参照により援用する）を産生した。さらに他の者は、半減期が伸びるようにペグ化されたアグリコシル化ＡＡＴを開発した（例えば、Ｃａｎｔｉｎ ＡＭ，Ｗｏｏｄｓ ＤＥ，Ｃｌｏｕｔｉｅｒ Ｄ，Ｄｕｆｏｕｒ ＥＫ，Ｌｅｄｕｃ Ｒ．Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｔ Ｃｙｓ２３２ ｐｒｏｌｏｎｇｓ ｔｈｅ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ ｏｆ ａｌｐｈａ１ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ
Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００２ Ｄｅｃ；２７（６）：６５９－６５．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１２４４４０２５を参照されたく、これはいずれの図面も含めて、本明細書においてその全体として参照により援用する）。
【0012】
ＡＡＴは肺においてＭｅｔ酸化する傾向があるため、一部のグループは、メチオニン酸化に対して抵抗性があるが活性は保持している変異ＡＡＴバリアントを構築した。特に、Ｍ３５１Ｖ／Ｍ３５８Ｖ変異体は、酸化に対して抵抗性がある（例えば、Ｔａｇｇａｒｔ Ｃ，Ｃｅｒｖａｎｔｅｓ－Ｌａｕｒｅａｎ Ｄ，Ｋｉｍ Ｇ，ＭｃＥｌｖａｎｅｙ ＮＧ，Ｗｅｈｒ Ｎ，Ｍｏｓｓ Ｊ，Ｌｅｖｉｎｅ ＲＬ．Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｉｔｈｅｒ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ３５１ ｏｒ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ３５８ ｉｎ ａｌｐｈａ １－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｃａｕｓｅｓ ｌｏｓｓ ｏｆ ａｎｔｉ－ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｌａｓｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０００ Ｓｅｐ １；２７５（３５）：２７２５８－６５．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１０８６７０１４を参照されたく、これはいずれの図面も含めて、本明細書においてその全体として参照により援用する）。Ｂａｅｋらは、ＡＡＴ内にジスルフィド結合（Ｋ１６８Ｃ－Ｆ１８９Ｃ）を導入して、ループ－シート重合に対する抵抗性を実質的に増加させた（Ｂａｅｋ ＪＨ，Ｉｍ Ｈ，Ｋａｎｇ ＵＢ，Ｓｅｏｎｇ ＫＭ，Ｌｅｅ Ｃ，Ｋｉｍ Ｊ，Ｙｕ ＭＨ．Ｐｒｏｂｉｎｇ ｔｈｅ ｌｏｃａｌ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ａｌｐｈａ １－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２００７ Ｓｅｐ；１６（９）：１８４２－５０．Ｅｐｕｂ ２００７ Ｊｕｌ ２７．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１７６６０２５６；ＰｕｂＭｅｄ Ｃｅｎｔｒａｌ ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２２０６９６６ｍを参照されたく、これはいずれの図面も含めて、本明細書においてその全体として参照により援用する）。またＡＡＴ内に単一の点変異（Ｆ５１Ｌ、Ｇ１１７Ｆ、Ｋ３３１Ｆ、Ｋ３３５Ａ）を作製して安定性とループ／シート重合に対する抵抗性とが増加した（Ｄａｆｆｏｒｎ ＴＲ，Ｍａｈａｄｅｖａ Ｒ，Ｅｌｌｉｏｔｔ ＰＲ，Ｓｉｖａｓｏｔｈｙ Ｐ，Ｌｏｍａｓ ＤＡ．Ａ ｋｉｎｅｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ１－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９９ Ａｐｒ ２；２７４（１４）：９５４８－５５．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１００９２６４０；Ｐａｒｆｒｅｙ Ｈ，Ｍａｈａｄｅｖａ Ｒ，Ｒａｖｅｎｈｉｌｌ ＮＡ，Ｚｈｏｕ Ａ，Ｄａｆｆｏｒｎ ＴＲ，Ｆｏｒｅｍａｎ ＲＣ，Ｌｏｍａｓ ＤＡ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａ
ｓｕｒｆａｃｅ ｃａｖｉｔｙ ｏｆ ａｌｐｈａ １－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００３ Ａｕｇ ２９；２７８（３５）：３３０６０－６．Ｅｐｕｂ ２００３ Ｊｕｎ １３．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１２８０７８８９；Ｇｉｌｉｓ Ｄ，ＭｃＬｅｎｎａｎ ＨＲ，Ｄｅｈｏｕｃｋ Ｙ，Ｃａｂｒｉｔａ ＬＤ，Ｒｏｏｍａｎ Ｍ，Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙ ＳＰ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｌｐｈａ１－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００３ Ｊａｎ １７；３２５（３）：５８１－９．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１２４９８８０４；及びＩｍ Ｈ，Ｓｅｏ ＥＪ，Ｙｕ ＭＨ．Ｍｅｔａｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ１－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９９ Ａｐｒ １６；２７４（１６）：１１０７２－７．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１０１９６１９０を参照されたく、このそれぞれはいずれの図面も含めて、本明細書においてその全体として参照により援用する）。
しかしながら、上記した進捗にもかかわらず、さらなる治療上の選択肢が要望されている。
ｓｕｒｆａｃｅ ｃａｖｉｔｙ ｏｆ ａｌｐｈａ １－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００３ Ａｕｇ ２９；２７８（３５）：３３０６０－６．Ｅｐｕｂ ２００３ Ｊｕｎ １３．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１２８０７８８９；Ｇｉｌｉｓ Ｄ，ＭｃＬｅｎｎａｎ ＨＲ，Ｄｅｈｏｕｃｋ Ｙ，Ｃａｂｒｉｔａ ＬＤ，Ｒｏｏｍａｎ Ｍ，Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙ ＳＰ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｌｐｈａ１－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００３ Ｊａｎ １７；３２５（３）：５８１－９．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１２４９８８０４；及びＩｍ Ｈ，Ｓｅｏ ＥＪ，Ｙｕ ＭＨ．Ｍｅｔａｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ１－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９９ Ａｐｒ １６；２７４（１６）：１１０７２－７．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１０１９６１９０を参照されたく、このそれぞれはいずれの図面も含めて、本明細書においてその全体として参照により援用する）。
しかしながら、上記した進捗にもかかわらず、さらなる治療上の選択肢が要望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0013】
【特許文献1】米国特許第８，９８０，２６６号明細書
【非特許文献】
【0014】
【非特許文献1】Ｌｅｅ Ｓ，Ｌｅｅ Ｙ，Ｈｏｎｇ Ｋ，Ｈｏｎｇ Ｊ，Ｂａｅ Ｓ，Ｃｈｏｉ Ｊ，Ｊｈｕｎ Ｈ，Ｋｗａｋ Ａ，Ｋｉｍ Ｅ，Ｊｏ Ｓ，Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ ＣＡ，Ｋｉｍ Ｓ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ α１－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ Ｆｅ－ｆｕｓｅｄ（ＡＡＴ－Ｆｃ）ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１３ Ｍａｙ ２０；１９：６５－７１．ｄｏｉ：１０．２１１９／ｍｏｌｍｅｄ．２０１２．００３０８．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２３５５２７２６；ＰｕｂＭｅｄ Ｃｅｎｔｒａｌ ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３６６７２１３
【非特許文献2】Ｃｈｕｎｇ ＨＳ，Ｋｉｍ ＪＳ，Ｌｅｅ ＳＭ，Ｐａｒｋ ＳＪ．Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ－１ ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ ｉｎ Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ ｒａｔｓ．Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ．２０１６ Ａｐｒ；３３（２）：２０１－８．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１０７１９－０１６－９６５７－３．Ｅｐｕｂ ２０１６ Ｍａｒ ７．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２６９４７８７４
【非特許文献3】Ｌｉｎｄｈｏｕｔ Ｔ，Ｉｑｂａｌ Ｕ，Ｗｉｌｌｉｓ ＬＭ，Ｒｅｉｄ ＡＮ，Ｌｉ Ｊ，Ｌｉｕ Ｘ，Ｍｏｒｅｎｏ Ｍ，Ｗａｋａｒｃｈｕｋ ＷＷ．Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｏｌｙｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１１ Ｍａｙ ３；１０８（１８）：７３９７－４０２．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１０１９２６６１０８．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ａｐｒ １８．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２１５０２５３２；ＰｕｂＭｅｄ Ｃｅｎｔｒａｌ ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３０８８６３９
【非特許文献4】Ｃａｎｔｉｎ ＡＭ，Ｗｏｏｄｓ ＤＥ，Ｃｌｏｕｔｉｅｒ Ｄ，Ｈｅｒｏｕｘ Ｊ，Ｄｕｆｏｕｒ ＥＫ，Ｌｅｄｕｃ Ｒ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｅｌａｓｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ：ｒｏｌｅ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ－１－ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｖｅｒｓｕｓ ｌｕｎｇ．Ｊ Ａｅｒｏｓｏｌ Ｍｅｄ．２００２ Ｓｕｍｍｅｒ；１５（２）：１４１－８．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１２１８４８６４
【非特許文献5】Ｃａｎｔｉｎ ＡＭ，Ｗｏｏｄｓ ＤＥ，Ｃｌｏｕｔｉｅｒ Ｄ，Ｄｕｆｏｕｒ ＥＫ，Ｌｅｄｕｃ Ｒ．Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｔ Ｃｙｓ２３２ ｐｒｏｌｏｎｇｓ ｔｈｅ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ ｏｆ ａｌｐｈａ１ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００２ Ｄｅｃ；２７（６）：６５９－６５．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１２４４４０２５
【非特許文献6】Ｔａｇｇａｒｔ Ｃ，Ｃｅｒｖａｎｔｅｓ－Ｌａｕｒｅａｎ Ｄ，Ｋｉｍ Ｇ，ＭｃＥｌｖａｎｅｙ ＮＧ，Ｗｅｈｒ Ｎ，Ｍｏｓｓ Ｊ，Ｌｅｖｉｎｅ ＲＬ．Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｉｔｈｅｒ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ３５１ ｏｒ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ３５８ ｉｎ ａｌｐｈａ １－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｃａｕｓｅｓ ｌｏｓｓ ｏｆ ａｎｔｉ－ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｌａｓｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０００ Ｓｅｐ １；２７５（３５）：２７２５８－６５．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１０８６７０１４
【非特許文献7】Ｂａｅｋ ＪＨ，Ｉｍ Ｈ，Ｋａｎｇ ＵＢ，Ｓｅｏｎｇ ＫＭ，Ｌｅｅ Ｃ，Ｋｉｍ Ｊ，Ｙｕ ＭＨ．Ｐｒｏｂｉｎｇ ｔｈｅ ｌｏｃａｌ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ａｌｐｈａ １－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２００７ Ｓｅｐ；１６（９）：１８４２－５０．Ｅｐｕｂ ２００７ Ｊｕｌ ２７．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１７６６０２５６；ＰｕｂＭｅｄ Ｃｅｎｔｒａｌ ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２２０６９６６ｍ
【非特許文献8】Ｄａｆｆｏｒｎ ＴＲ，Ｍａｈａｄｅｖａ Ｒ，Ｅｌｌｉｏｔｔ ＰＲ，Ｓｉｖａｓｏｔｈｙ Ｐ，Ｌｏｍａｓ ＤＡ．Ａ ｋｉｎｅｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ１－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９９ Ａｐｒ ２；２７４（１４）：９５４８－５５．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１００９２６４０
【非特許文献9】Ｐａｒｆｒｅｙ Ｈ，Ｍａｈａｄｅｖａ Ｒ，Ｒａｖｅｎｈｉｌｌ ＮＡ，Ｚｈｏｕ Ａ，Ｄａｆｆｏｒｎ ＴＲ，Ｆｏｒｅｍａｎ ＲＣ，Ｌｏｍａｓ ＤＡ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａ ｓｕｒｆａｃｅ ｃａｖｉｔｙ ｏｆ ａｌｐｈａ １－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００３ Ａｕｇ ２９；２７８（３５）：３３０６０－６．Ｅｐｕｂ ２００３ Ｊｕｎ １３．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１２８０７８８９
【非特許文献10】Ｇｉｌｉｓ Ｄ，ＭｃＬｅｎｎａｎ ＨＲ，Ｄｅｈｏｕｃｋ Ｙ，Ｃａｂｒｉｔａ ＬＤ，Ｒｏｏｍａｎ Ｍ，Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙ ＳＰ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｌｐｈａ１－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００３ Ｊａｎ １７；３２５（３）：５８１－９．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１２４９８８０４
【非特許文献11】Ｉｍ Ｈ，Ｓｅｏ ＥＪ，Ｙｕ ＭＨ．Ｍｅｔａｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ１－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９９ Ａｐｒ １６；２７４（１６）：１１０７２－７．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１０１９６１９０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0015】
本明細書に記載の発明は、ヒト血清アルブミン結合ドメイン又はヒト血清アルブミンドメインと融合した、組換え操作されたアルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインに一部基づく。
一部の実施形態は、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインとヒト血清アルブミン結合ドメイン又はヒト血清アルブミンドメインとを含む組換えタンパク質を含む。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１の全て又は一部を含む配列を有する。一部の実施形態においては、組換えタンパク質は、１又は複数のリンカーを含む。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインのＣ末端が、組換えタンパク質においてヒト血清アルブミン又はヒト血清アルブミン結合ドメインのＮ末端と融合する。一部の実施形態は、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインとヒト血清アルブミンドメインとを含む組換えタンパク質であって、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメイン及びヒト血清アルブミンドメインが、いずれも野生型アルファ－１－アンチトリプシン及び野生型ヒト血清アルブミンではない、当該組換えタンパク質を含む。
一部の実施形態は、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインとヒト血清アルブミン結合ドメイン又はヒト血清アルブミンドメインとを含む組換えタンパク質を含む。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１の全て又は一部を含む配列を有する。一部の実施形態においては、組換えタンパク質は、１又は複数のリンカーを含む。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインのＣ末端が、組換えタンパク質においてヒト血清アルブミン又はヒト血清アルブミン結合ドメインのＮ末端と融合する。一部の実施形態は、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインとヒト血清アルブミンドメインとを含む組換えタンパク質であって、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメイン及びヒト血清アルブミンドメインが、いずれも野生型アルファ－１－アンチトリプシン及び野生型ヒト血清アルブミンではない、当該組換えタンパク質を含む。
【0016】
一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、野生型アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインと比較して、活性を保持する。一部の実施形態においては、１又複数の変異は、野生型アルファ－１－アンチトリプシンと比較して、メチオニン酸化に対する抵抗性を引き起こす。一部の実施形態においては、１又は複数の変異は、配列番号１に従って番号付けした残基でのＭ３５１Ｖ及び／又はＭ３５８Ｖを含む。一部の実施形態においては、１又は複数の変異は、配列番号１に従って番号付けした残基でのＫ１６８Ｃ及びＦ１８９Ｃを含む。一部の実施形態においては、１又は複数の変異は、野生型アルファ－１－アンチトリプシンと比較して、ループ－シート重合に対する実質的に増加した抵抗性を与える。一部の実施形態においては、１又は複数の変異は、配列番号１に従って番号付けした残基でのＦ５１Ｌ、Ｇ１１７Ｆ、Ｋ３３１Ｆ又はＫ３３５Ａから選択された１又は複数の点変異である。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、野生型アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインと比較して、ヒト好中球エラスターゼ及び／又はＰＲ３に対する活性を保持する。
【0017】
一部の実施形態においては、１又は複数の変異は、配列番号１に従う以下の残基位置のうちの少なくとも１つにおける変異を含む：５１、１００、１１４、１１７、１６３、１６４、１６５、１６８、１６９、１７２、１７３、１７４、１８３、１８９、２３２、２８３、３００、３０２、３０３、３０４、３０６、３３０、３３１、３３３、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３５１、３５６、３５８、又は３６１。一部の実施形態においては、１又は複数の変異は、配列番号１に以下の変異のうちの１又は複数を含む：Ｆ５１Ｌ、Ｌ１００Ｆ、Ｌ１００Ｃ、Ｔ１１４Ｆ、Ｇ１１７Ｆ、Ｋ１６３Ｔ、Ｇ１６４Ｖ、Ｔ１６５Ｓ、Ｋ１６８Ｃ、Ｋ１６８Ｉ、Ｋ１６８Ａ、Ｋ１６９Ｖ、Ｌ１７２Ｖ、Ｌ１７２Ａ、Ｌ１７２Ｃ、Ｖ１７３Ｃ、Ｋ１７４Ｔ、Ａ１８３Ｖ、Ｆ１８９Ｃ、Ｆ１８９Ｉ、Ｆ１８９Ｖ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ２８３Ｃ、Ｋ３００Ａ、Ｖ３０２Ａ、Ｌ３０３Ａ、Ｇ３０４Ａ、Ｌ３０６Ａ、Ｓ３３０Ｒ、Ｋ３３１Ｆ、Ｋ３３１Ｉ、Ｋ３３１Ｖ、Ｋ３３１Ｔ、Ｋ３３１Ｃ、Ｖ３３３Ｃ、Ｖ３３３Ａ、Ｋ３３５Ａ、Ｋ３３１Ｆ、Ｋ３３５Ｇ、Ｋ３３５Ｔ、Ａ３３６Ｇ、Ｖ３３７Ｃ、Ｖ３３７Ａ、Ｌ３３８Ａ．、Ｔ３３９Ｓ、Ｉ３４０Ｖ Ｍ３５１Ｖ、Ｉ３５６Ｍ、Ｍ３５８Ｉ、Ｍ３５８Ｐ、Ｍ３５８Ａ、Ｍ３５８Ｒ、Ｍ３５８Ｌ、Ｍ３５８Ｖ、又はＰ３６１Ｃ。一部の実施形態においては、１又は複数の変異は、配列番号１にＦ５１Ｌ、Ｇ１１７Ｆ、Ｋ１６８Ｃ、Ｆ１８９Ｃ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ２８３Ｃ、Ｋ３３１Ｆ、Ｋ３３５Ａ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｖ、Ｍ３５８Ｌ、又はＰ３６１Ｃを含む。一部の実施形態においては、１又は複数の変異は、配列番号１にＫ１６８Ｃ及びＦ１８９Ｃの両方である。一部の実施形態においては、１又は複数の変異は、配列番号１にＰ３６１Ｃ及びＳ２８３Ｃの両方である。
【0018】
一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＣ２３２Ｓを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＭ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｖを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＭ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＣ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｖを含む１又は複数の変異を有する。
【0019】
一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＦ５１Ｌ、Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＧ１１７Ｆ、Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＣ２３２Ｓ、Ｋ３３１Ｆ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＣ２３２Ｓ、Ｋ３３５Ａ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＫ１６８Ｃ、Ｆ１８９Ｃ、Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＣ２３２Ｓ、Ｓ２８３Ｃ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ、及びＰ３６１Ｃを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＦ５１Ｌ、Ｇ１１７Ｆ、Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＦ５１Ｌ、Ｃ２３２Ｓ、Ｋ３３１Ｆ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＦ５１Ｌ、Ｃ２３２Ｓ、Ｋ３３５Ａ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＫ５１Ｌ、Ｋ１６８Ｃ、Ｆ１８９Ｃ、Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＦ５１Ｌ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ２８３Ｃ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ、及びＰ３６１Ｃを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＧ１１７Ｆ、Ｃ２３２Ｓ、Ｋ３３１Ｆ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＧ１１７Ｆ、Ｋ３３５Ａ、Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＧ１１７Ｆ、Ｋ１６８Ｃ、Ｆ１８９Ｃ、Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＧ１１７Ｆ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ２８３Ｃ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ、及びＰ３６１Ｃを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＣ２３２Ｓ、Ｋ３３１Ｆ、Ｋ３３５Ａ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＫ１６８Ｃ、Ｆ１８９Ｃ、Ｃ２３２Ｓ、Ｋ３３１Ｆ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＣ２３２Ｓ、Ｓ２８３Ｃ、Ｋ３３１Ｆ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ、及びＰ３６１Ｃを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＫ１６８Ｃ、Ｆ１８９Ｃ、Ｃ２３２Ｓ、Ｋ３３５Ａ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＣ２３２Ｓ、Ｓ２８３Ｃ、Ｋ３３５Ａ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ、及びＰ３６１Ｃを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＫ１６８Ｃ、Ｆ１８９Ｃ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ２８３Ｃ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ、及びＰ３６１Ｃを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１に点変異Ｋ３３５Ａを含む。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１に点変異Ｋ３３１Ｆを含む。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１に点変異Ｇ１１７Ｆを含む。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１に点変異Ｓ２８３Ｃを含む。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１に点変異Ｐ３６１Ｃを含む。
【0020】
一部の実施形態においては、ヒト血清アルブミンは、配列番号３又は配列番号５の少なくとも一部分である。一部の実施形態においては、ヒト血清アルブミン結合ドメインは、配列番号２２～３６のうちの１つである。一部の実施形態においては、ヒト血清アルブミン結合ドメインは、配列番号６～２１から選択された１又は複数のＣＤＲを含む。一部の実施形態においては、ヒト血清アルブミン又はヒト血清アルブミン結合ドメインが、野生型アルファ－１－アンチトリプシンと比較してアルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインの血漿中半減期を長くする。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメイン内の組換えタンパク質のＮ－グリカン又はポリシアル化（ｐｏｌｙｓｉａｌｙａｔｉｏｎ）の数が、野生型アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインよりも多い。
【0021】
一部の実施形態においては、ヒト血清アルブミンは、１又は複数の変異を含む。一部の実施形態においては、１又は複数の変異は、配列番号５に従って番号付けられた１又は複数の残基である残基４０７、４０８、４０９、４１０、４１３、及び４１４のうちの１又は複数である。一部の実施形態においては、１又は複数の変異は、配列番号５に従って番号付けられた１又は複数の残基であるＬ４０７Ａ、Ｌ４０８Ｖ、Ｖ４０９Ａ、Ｒ４１０Ａ、Ｌ４１３Ｑ、及びＬ４１４Ｑのうちの１又は複数である。一部の実施形態においては、ヒト血清アルブミンは、ヒト血清アルブミンの部分又はバリアントを含む。
【0022】
一部の実施形態においては、ヒト血清アルブミン結合タンパク質は、配列番号３又は配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンタンパク質の全て又は一部と結合することが可能であるアミノ酸配列を含む。
【0023】
一部の実施形態においては、組換えタンパク質は、配列番号６４～６８又は配列番号７１のいずれか１つを有するタンパク質を含む又は当該タンパク質からなる。一部の実施形態においては、組換えタンパク質は、配列番号６４を有するタンパク質を含む又は当該タンパク質からなる。一部の実施形態においては、組換えタンパク質は、配列番号６５を有するタンパク質を含む又は当該タンパク質からなる。一部の実施形態においては、組換えタンパク質は、配列番号６６を有するタンパク質を含む又は当該タンパク質からなる。一部の実施形態においては、組換えタンパク質は、配列番号６７を有するタンパク質を含む又は当該タンパク質からなる。一部の実施形態においては、組換えタンパク質は、配列番号６８を有するタンパク質を含む又は当該タンパク質からなる。一部の実施形態においては、組換えタンパク質は、配列番号７１を有するタンパク質を含む又は当該タンパク質からなる。
【0024】
一部の実施形態においては、本明細書で提供する組換えタンパク質をコードする核酸を提供する。一部の実施形態においては、核酸はベクターを含む。一部の実施形態においては、ベクターは宿主細胞を含む。
【0025】
一部の実施形態は、本明細書で提供する核酸のうちの１つと共に宿主細胞を培養することと、組換えタンパク質を回収することとを含む、組換えタンパク質の作製方法に向けられる。一部の実施形態においては、宿主細胞は、真核生物宿主細胞である。一部の実施形態においては、宿主細胞は、哺乳類宿主細胞である。一部の実施形態においては、哺乳類宿主は、ＣＨＯ細胞である。一部の実施形態においては、組換えタンパク質は、ｐＨが中性のアルファ－１－アンチトリプシン－Ｆｃ捕捉選択培地を用いて回収する。
【0026】
一部の実施形態は、それを必要とする患者におけるアルファ－１－アンチトリプシン欠乏症を治療する方法であって、当該患者に対して、本明細書で提供する組換えタンパク質を投与することを含む、当該方法に向けられる。一部の実施形態においては、組換えタンパク質は、医薬組成物を含む。一部の実施形態においては、組換えタンパク質の投与は、約週１回もしくは約週１回よりも長い間隔で、約１０日毎に１回もしくは約１０日毎に１回よりも長い間隔で、約１５日毎に１回もしくは約１５日毎に１回よりも長い間隔で、約２０日毎に１回もしくは約２０日毎に１回よりも長い間隔で、約２５日毎に１回もしくは約２５日毎に１回よりも長い間隔で、約１月毎に１回もしくは約１月毎に１回よりも長い間隔で、又は約２月毎に１回もしくは約２月毎に１回よりも長い間隔で、投与する。
【0027】
一部の実施形態は、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインを含むタンパク質の薬物動態を改善する方法に向けられる。一部の実施形態においては、タンパク質は、本明細書に記載する組換えタンパク質のいずれかである。一部の実施形態においては、改善された薬物動態は、Ｐｒｏｌａｓｔｉｎ（プロラスチン）に対する改善を意味する。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
（ａ）アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインと、
（ｂ）ヒト血清アルブミン結合ドメインと
を含む、組換えタンパク質。
（項目２）
配列番号６３からなるリンカーをさらに含む、項目１記載の組換えタンパク質。
（項目３）
前記アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインのＣ末端が、前記ヒト血清アルブミン結合ドメインのＮ末端と融合する、項目１から２のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目４）
前記ヒト血清アルブミン結合ドメインは、配列番号３又は配列番号５のいずれかを有するヒト血清アルブミンの少なくとも一部分である、項目１から３のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目５）
前記アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインの半減期が、野生型アルファ－１－アンチトリプシンと比較して長い、項目１から４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目６）
前記アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメイン内の組換えタンパク質のＮ－グリカン又はポリシアル化（ｐｏｌｙｓｉａｌｙａｔｉｏｎ）の数が、野生型アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインよりも多い、項目１から５のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目７）
前記アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、野生型アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインと比較して、１又は複数の変異を有する、項目１から６のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目８）
前記１又は複数の変異は、野生型アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインと比較して、メチオニン酸化に対する抵抗性を引き起こす、項目７記載の組換えタンパク質。
（項目９）
前記アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、野生型アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインと比較して、活性を保持する、項目７又は８に記載の組換えタンパク質。
（項目１０）
前記１又は複数の変異は、配列番号１に従って番号付けした残基でのＭ３５１Ｖ及び／又はＭ３５８Ｖを含む、項目７又は８に記載の組換えタンパク質。
（項目１１）
前記１又は複数の変異は、配列番号１に従って番号付けされた残基でのＫ１６８Ｃ及びＦ１８９Ｃを含み、また前記１又は複数の変異が、野生型アルファ－１－アンチトリプシンと比較して、ループ－シート重合に対する増加した抵抗性を与える、項目７から１０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目１２）
前記１又は複数の変異は、配列番号１に従って番号付けした残基でのＦ５１Ｌ、Ｇ１１７Ｆ、Ｋ３３１Ｆ、又はＫ３３５Ａより選択された１又は複数の点変異である、項目７から１１のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目１３）
アルファ－１－アンチトリプシンが、野生型アルファ－１－アンチトリプシンと比較して、ヒト好中球エラスターゼ及び／又はＰＲ３に対する活性を保持する、項目１から１２のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目１４）
前記ヒト血清アルブミン結合ドメインは、配列番号２２～３６のいずれか１つに記載の配列を有するポリペプチドを含む、項目１から１３のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目１５）
項目１から１４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質をコードする、単離された核酸。
（項目１６）
項目１５に記載の前記単離された核酸を含む、ベクター。
（項目１７）
項目１６に記載の前記ベクターを含む、宿主細胞。
（項目１８）
項目１７に記載の前記宿主細胞を培養することと、組換えタンパク質を回収することとを含む、組換えタンパク質の作製方法。
（項目１９）
前記宿主細胞は、哺乳類宿主細胞である、項目１７又は項目１８に記載の方法。
（項目２０）
哺乳類宿主は、ＣＨＯ細胞である、項目１９記載の方法。
（項目２１）
前記組換えタンパク質は、ｐＨが中性のアルファ－１－アンチトリプシン－Ｆｃ捕捉選択培地を用いて回収する、項目１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
それを必要とする患者におけるアルファ－１－アンチトリプシン欠乏症を治療する又は予防的に治療する方法であって、当該患者に対して、項目１から１４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質を投与することを含む、方法。
（項目２３）
前記組換えタンパク質の投与は、約週１回もしくは約週１回よりも長い間隔で、約１０日毎に１回もしくは約１０日毎に１回よりも長い間隔で、約１５日毎に１回もしくは約１５日毎に１回よりも長い間隔で、約２０日毎に１回もしくは約２０日毎に１回よりも長い間隔で、約２５日毎に１回もしくは約２５日毎に１回よりも長い間隔で、約１月毎に１回もしくは約１月に１回よりも長い間隔で、又は約２月毎に１回もしくは約２月毎に１回よりも長い間隔で、投与する、項目２２記載の方法。
（項目２４）
（ａ）アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインと、
（ｂ）ヒト血清アルブミンドメインと
を含む、組換えタンパク質。
（項目２５）
前記ヒト血清アルブミンドメインは、野生型ヒト血清アルブミンである、項目２４記載の組換えタンパク質。
（項目２６）
配列番号６３に記載の配列を有するリンカーを含む、項目２４から２５のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目２７）
前記アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインのＣ末端が、前記ヒト血清アルブミンドメインのＮ末端と融合する、項目２４から２６のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目２８）
前記ヒト血清アルブミンドメインが、野生型アルファ－１－アンチトリプシンと比較してアルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインの血漿中半減期を長くする、項目２４から２７のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目２９）
前記アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメイン内の組換えタンパク質のＮ－グリカン又はポリシアル化（ｐｏｌｙｓｉａｌｙａｔｉｏｎ）の数が、野生型アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインよりも多い、項目２４から２８のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目３０）
前記アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、野生型アルファ－１－アンチトリプシンと比較して、１又は複数の変異を有する、項目２４から２９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目３１）
前記１又は複数の変異は、野生型アルファ－１－アンチトリプシンと比較して、メチオニン酸化に対する抵抗性を引き起こす、項目３０記載の組換えタンパク質。
（項目３２）
前記１又は複数の変異は、配列番号１に従って番号付けした残基でのＣ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ及び／又はＭ３５８Ｖを含む、項目３０又は３１に記載の組換えタンパク質。
（項目３３）
前記１又は複数の変異は、配列番号１に従って番号付けした残基でのＫ１６８Ｃ及びＦ１８９Ｃを含み、また前記１又は複数の変異が、野生型アルファ－１－アンチトリプシンと比較して、ループ－シート重合に対する実質的に増加したアルファ－１－アンチトリプシンの抵抗性を与える、項目３０から３２のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目３４）
前記１又は複数の変異は、配列番号１に従って番号付けした残基でのＦ５１Ｌ、Ｇ１１７Ｆ、Ｓ２８３Ｃ、Ｋ３３１Ｆ、Ｋ３３５Ａ、又はＰ３６１Ｃより選択される１又は複数の点変異である、項目３０から３３のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目３５）
前記１又は複数の変異は、配列番号１にＣ２３２Ｓ、配列番号１にＭ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｖ、配列番号１にＭ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌ、ならびに配列番号１にＣ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｖ、から選択される変異を含む、項目３０から３４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目３６）
アルファ－１アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＦ５１Ｌ、Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＧ１１７Ｆ、Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＣ２３２Ｓ、Ｋ３３１Ｆ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＣ２３２Ｓ、Ｋ３３５Ａ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＫ１６８Ｃ、Ｆ１８９Ｃ、Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＣ２３２Ｓ、Ｓ２８３Ｃ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ及びＰ３６１Ｃを含む１又は複数の変異、配列番号１にＦ５１Ｌ、Ｇ１１７Ｆ、Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＦ５１Ｌ、Ｃ２３２Ｓ、Ｋ３３１Ｆ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＦ５１Ｌ、Ｃ２３２Ｓ、Ｋ３３５Ａ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＫ５１Ｌ、Ｋ１６８Ｃ、Ｆ１８９Ｃ、Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＦ５１Ｌ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ２８３Ｃ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ及びＰ３６１Ｃを含む１又は複数の変異、配列番号１にＧ１１７Ｆ、Ｃ２３２Ｓ、Ｋ３３１Ｆ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＧ１１７Ｆ、Ｋ３３５Ａ、Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＧ１１７Ｆ、Ｋ１６８Ｃ、Ｆ１８９Ｃ、Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＧ１１７Ｆ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ２８３Ｃ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ及びＰ３６１Ｃを含む１又は複数の変異、配列番号１にＣ２３２Ｓ、Ｋ３３１Ｆ、Ｋ３３５Ａ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＫ１６８Ｃ、Ｆ１８９Ｃ、Ｃ２３２Ｓ、Ｋ３３１Ｆ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＣ２３２Ｓ、Ｓ２８３Ｃ、Ｋ３３１Ｆ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ及びＰ３６１Ｃを含む１又は複数の変異、配列番号１にＫ１６８Ｃ、Ｆ１８９Ｃ、Ｃ２３２Ｓ、Ｋ３３５Ａ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＣ２３２Ｓ、Ｓ２８３Ｃ、Ｋ３３５Ａ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ及びＰ３６１Ｃを含む１又は複数の変異、又は配列番号１にＫ１６８Ｃ、Ｆ１８９Ｃ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ２８３Ｃ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ及びＰ３６１Ｃを含む１又は複数の変異を有する、項目３０から３５のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目３７）
アルファ－１－アンチトリプシンは、野生型アルファ－１－アンチトリプシンと比較して、活性を保持する、項目２４から３６のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目３８）
アルファ－１－アンチトリプシンは、野生型アルファ－１－アンチトリプシンと比較して、ヒト好中球エラスターゼ及び／又はＰＲ３に対する活性を保持する、項目２４から３７のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目３９）
項目２４から３８のいずれか一項に記載の組換えタンパク質をコードする、単離された核酸。
（項目４０）
項目３９に記載の前記単離された核酸を含む、ベクター。
（項目４１）
項目４０の前記ベクターを含む、宿主細胞。
（項目４２）
項目４１の前記宿主細胞を培養することと、組換え融合タンパク質を回収することとを含む、組換えタンパク質の作製方法。
（項目４３）
前記宿主細胞は、真核細胞である、項目４２記載の方法。
（項目４４）
前記真核細胞は、酵母細胞である、項目４３記載の方法。
（項目４５）
前記宿主細胞は、哺乳類宿主細胞である、項目４４記載の方法。
（項目４６）
哺乳類宿主は、ＣＨＯ細胞である、項目４５記載の方法。
（項目４７）
前記組換えタンパク質は、ｐＨが中性のアルファ－１－アンチトリプシン－Ｆｃ選択培地を用いて回収する、項目４０から４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
それを必要とする患者におけるアルファ－１－アンチトリプシン欠乏症を治療する又は予防的に治療する方法であって、当該患者に対して、項目１から１４又は項目２４から３８のいずれか一項に記載の組換えタンパク質を投与することを含む、方法。
（項目４９）
前記組換えタンパク質の投与は、約週１回もしくは約週１回よりも長い間隔で、約１０日毎に１回もしくは約１０日毎に１回よりも長い間隔で、約１５日毎に１回もしくは約１５日毎に１回よりも長い間隔で、約２０日毎に１回もしくは約２０日毎に１回よりも長い間隔で、約２５日毎に１回もしくは約２５日毎に１回よりも長い間隔で、約１月毎に１回もしくは約１月に１回よりも長い間隔で、又は約２月毎に１回もしくは約２月毎に１回よりも長い間隔で、投与する、項目４８記載の方法。
（項目５０）
（ａ）アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインと、
（ｂ）ヒト血清アルブミンドメインと
を含む、組換えタンパク質であって、
前記アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインと、当該ヒト血清アルブミンとは、野生型のアルファ－１－アンチトリプシン及びヒト血清アルブミンではない、組換えタンパク質。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
（ａ）アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインと、
（ｂ）ヒト血清アルブミン結合ドメインと
を含む、組換えタンパク質。
（項目２）
配列番号６３からなるリンカーをさらに含む、項目１記載の組換えタンパク質。
（項目３）
前記アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインのＣ末端が、前記ヒト血清アルブミン結合ドメインのＮ末端と融合する、項目１から２のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目４）
前記ヒト血清アルブミン結合ドメインは、配列番号３又は配列番号５のいずれかを有するヒト血清アルブミンの少なくとも一部分である、項目１から３のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目５）
前記アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインの半減期が、野生型アルファ－１－アンチトリプシンと比較して長い、項目１から４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目６）
前記アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメイン内の組換えタンパク質のＮ－グリカン又はポリシアル化（ｐｏｌｙｓｉａｌｙａｔｉｏｎ）の数が、野生型アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインよりも多い、項目１から５のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目７）
前記アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、野生型アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインと比較して、１又は複数の変異を有する、項目１から６のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目８）
前記１又は複数の変異は、野生型アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインと比較して、メチオニン酸化に対する抵抗性を引き起こす、項目７記載の組換えタンパク質。
（項目９）
前記アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、野生型アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインと比較して、活性を保持する、項目７又は８に記載の組換えタンパク質。
（項目１０）
前記１又は複数の変異は、配列番号１に従って番号付けした残基でのＭ３５１Ｖ及び／又はＭ３５８Ｖを含む、項目７又は８に記載の組換えタンパク質。
（項目１１）
前記１又は複数の変異は、配列番号１に従って番号付けされた残基でのＫ１６８Ｃ及びＦ１８９Ｃを含み、また前記１又は複数の変異が、野生型アルファ－１－アンチトリプシンと比較して、ループ－シート重合に対する増加した抵抗性を与える、項目７から１０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目１２）
前記１又は複数の変異は、配列番号１に従って番号付けした残基でのＦ５１Ｌ、Ｇ１１７Ｆ、Ｋ３３１Ｆ、又はＫ３３５Ａより選択された１又は複数の点変異である、項目７から１１のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目１３）
アルファ－１－アンチトリプシンが、野生型アルファ－１－アンチトリプシンと比較して、ヒト好中球エラスターゼ及び／又はＰＲ３に対する活性を保持する、項目１から１２のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目１４）
前記ヒト血清アルブミン結合ドメインは、配列番号２２～３６のいずれか１つに記載の配列を有するポリペプチドを含む、項目１から１３のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目１５）
項目１から１４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質をコードする、単離された核酸。
（項目１６）
項目１５に記載の前記単離された核酸を含む、ベクター。
（項目１７）
項目１６に記載の前記ベクターを含む、宿主細胞。
（項目１８）
項目１７に記載の前記宿主細胞を培養することと、組換えタンパク質を回収することとを含む、組換えタンパク質の作製方法。
（項目１９）
前記宿主細胞は、哺乳類宿主細胞である、項目１７又は項目１８に記載の方法。
（項目２０）
哺乳類宿主は、ＣＨＯ細胞である、項目１９記載の方法。
（項目２１）
前記組換えタンパク質は、ｐＨが中性のアルファ－１－アンチトリプシン－Ｆｃ捕捉選択培地を用いて回収する、項目１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
それを必要とする患者におけるアルファ－１－アンチトリプシン欠乏症を治療する又は予防的に治療する方法であって、当該患者に対して、項目１から１４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質を投与することを含む、方法。
（項目２３）
前記組換えタンパク質の投与は、約週１回もしくは約週１回よりも長い間隔で、約１０日毎に１回もしくは約１０日毎に１回よりも長い間隔で、約１５日毎に１回もしくは約１５日毎に１回よりも長い間隔で、約２０日毎に１回もしくは約２０日毎に１回よりも長い間隔で、約２５日毎に１回もしくは約２５日毎に１回よりも長い間隔で、約１月毎に１回もしくは約１月に１回よりも長い間隔で、又は約２月毎に１回もしくは約２月毎に１回よりも長い間隔で、投与する、項目２２記載の方法。
（項目２４）
（ａ）アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインと、
（ｂ）ヒト血清アルブミンドメインと
を含む、組換えタンパク質。
（項目２５）
前記ヒト血清アルブミンドメインは、野生型ヒト血清アルブミンである、項目２４記載の組換えタンパク質。
（項目２６）
配列番号６３に記載の配列を有するリンカーを含む、項目２４から２５のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目２７）
前記アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインのＣ末端が、前記ヒト血清アルブミンドメインのＮ末端と融合する、項目２４から２６のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目２８）
前記ヒト血清アルブミンドメインが、野生型アルファ－１－アンチトリプシンと比較してアルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインの血漿中半減期を長くする、項目２４から２７のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目２９）
前記アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメイン内の組換えタンパク質のＮ－グリカン又はポリシアル化（ｐｏｌｙｓｉａｌｙａｔｉｏｎ）の数が、野生型アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインよりも多い、項目２４から２８のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目３０）
前記アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、野生型アルファ－１－アンチトリプシンと比較して、１又は複数の変異を有する、項目２４から２９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目３１）
前記１又は複数の変異は、野生型アルファ－１－アンチトリプシンと比較して、メチオニン酸化に対する抵抗性を引き起こす、項目３０記載の組換えタンパク質。
（項目３２）
前記１又は複数の変異は、配列番号１に従って番号付けした残基でのＣ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ及び／又はＭ３５８Ｖを含む、項目３０又は３１に記載の組換えタンパク質。
（項目３３）
前記１又は複数の変異は、配列番号１に従って番号付けした残基でのＫ１６８Ｃ及びＦ１８９Ｃを含み、また前記１又は複数の変異が、野生型アルファ－１－アンチトリプシンと比較して、ループ－シート重合に対する実質的に増加したアルファ－１－アンチトリプシンの抵抗性を与える、項目３０から３２のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目３４）
前記１又は複数の変異は、配列番号１に従って番号付けした残基でのＦ５１Ｌ、Ｇ１１７Ｆ、Ｓ２８３Ｃ、Ｋ３３１Ｆ、Ｋ３３５Ａ、又はＰ３６１Ｃより選択される１又は複数の点変異である、項目３０から３３のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目３５）
前記１又は複数の変異は、配列番号１にＣ２３２Ｓ、配列番号１にＭ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｖ、配列番号１にＭ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌ、ならびに配列番号１にＣ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｖ、から選択される変異を含む、項目３０から３４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目３６）
アルファ－１アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＦ５１Ｌ、Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＧ１１７Ｆ、Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＣ２３２Ｓ、Ｋ３３１Ｆ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＣ２３２Ｓ、Ｋ３３５Ａ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＫ１６８Ｃ、Ｆ１８９Ｃ、Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＣ２３２Ｓ、Ｓ２８３Ｃ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ及びＰ３６１Ｃを含む１又は複数の変異、配列番号１にＦ５１Ｌ、Ｇ１１７Ｆ、Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＦ５１Ｌ、Ｃ２３２Ｓ、Ｋ３３１Ｆ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＦ５１Ｌ、Ｃ２３２Ｓ、Ｋ３３５Ａ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＫ５１Ｌ、Ｋ１６８Ｃ、Ｆ１８９Ｃ、Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＦ５１Ｌ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ２８３Ｃ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ及びＰ３６１Ｃを含む１又は複数の変異、配列番号１にＧ１１７Ｆ、Ｃ２３２Ｓ、Ｋ３３１Ｆ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＧ１１７Ｆ、Ｋ３３５Ａ、Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＧ１１７Ｆ、Ｋ１６８Ｃ、Ｆ１８９Ｃ、Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＧ１１７Ｆ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ２８３Ｃ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ及びＰ３６１Ｃを含む１又は複数の変異、配列番号１にＣ２３２Ｓ、Ｋ３３１Ｆ、Ｋ３３５Ａ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＫ１６８Ｃ、Ｆ１８９Ｃ、Ｃ２３２Ｓ、Ｋ３３１Ｆ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＣ２３２Ｓ、Ｓ２８３Ｃ、Ｋ３３１Ｆ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ及びＰ３６１Ｃを含む１又は複数の変異、配列番号１にＫ１６８Ｃ、Ｆ１８９Ｃ、Ｃ２３２Ｓ、Ｋ３３５Ａ、Ｍ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異、配列番号１にＣ２３２Ｓ、Ｓ２８３Ｃ、Ｋ３３５Ａ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ及びＰ３６１Ｃを含む１又は複数の変異、又は配列番号１にＫ１６８Ｃ、Ｆ１８９Ｃ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ２８３Ｃ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ及びＰ３６１Ｃを含む１又は複数の変異を有する、項目３０から３５のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目３７）
アルファ－１－アンチトリプシンは、野生型アルファ－１－アンチトリプシンと比較して、活性を保持する、項目２４から３６のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目３８）
アルファ－１－アンチトリプシンは、野生型アルファ－１－アンチトリプシンと比較して、ヒト好中球エラスターゼ及び／又はＰＲ３に対する活性を保持する、項目２４から３７のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
（項目３９）
項目２４から３８のいずれか一項に記載の組換えタンパク質をコードする、単離された核酸。
（項目４０）
項目３９に記載の前記単離された核酸を含む、ベクター。
（項目４１）
項目４０の前記ベクターを含む、宿主細胞。
（項目４２）
項目４１の前記宿主細胞を培養することと、組換え融合タンパク質を回収することとを含む、組換えタンパク質の作製方法。
（項目４３）
前記宿主細胞は、真核細胞である、項目４２記載の方法。
（項目４４）
前記真核細胞は、酵母細胞である、項目４３記載の方法。
（項目４５）
前記宿主細胞は、哺乳類宿主細胞である、項目４４記載の方法。
（項目４６）
哺乳類宿主は、ＣＨＯ細胞である、項目４５記載の方法。
（項目４７）
前記組換えタンパク質は、ｐＨが中性のアルファ－１－アンチトリプシン－Ｆｃ選択培地を用いて回収する、項目４０から４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
それを必要とする患者におけるアルファ－１－アンチトリプシン欠乏症を治療する又は予防的に治療する方法であって、当該患者に対して、項目１から１４又は項目２４から３８のいずれか一項に記載の組換えタンパク質を投与することを含む、方法。
（項目４９）
前記組換えタンパク質の投与は、約週１回もしくは約週１回よりも長い間隔で、約１０日毎に１回もしくは約１０日毎に１回よりも長い間隔で、約１５日毎に１回もしくは約１５日毎に１回よりも長い間隔で、約２０日毎に１回もしくは約２０日毎に１回よりも長い間隔で、約２５日毎に１回もしくは約２５日毎に１回よりも長い間隔で、約１月毎に１回もしくは約１月に１回よりも長い間隔で、又は約２月毎に１回もしくは約２月毎に１回よりも長い間隔で、投与する、項目４８記載の方法。
（項目５０）
（ａ）アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインと、
（ｂ）ヒト血清アルブミンドメインと
を含む、組換えタンパク質であって、
前記アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインと、当該ヒト血清アルブミンとは、野生型のアルファ－１－アンチトリプシン及びヒト血清アルブミンではない、組換えタンパク質。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】図１は、アルファ－１－アンチトリプシンのタンパク質及び遺伝子の構造を表す。上方図は、その直線状形態での通常の当該タンパク質、配列番号１に従う残基４６、８３及び２４７において３つのアスパラギニル連結複合体炭水化物の側鎖を伴う３９４アミノ酸の単鎖タンパク質、を示す。下方図は、当該遺伝子（配列番号６９）であって、３つの非コードエキソン（ＩＡ、ＩＢ及びＩＣ）及び４つのコードエキソン（ＩＩからＶ）からなる当該遺伝子を示す。アルファヘリックスを四角で示しており、またベータシートをジグザグ線で示す。開始コドンは、エキソンＩＩ内にあり、その後に２４残基のシグナルペプチドが続く。炭水化物付加部位は、ＣＨＯとして図面に示している。
【図4A】図４は、本発明のコンストラクトに関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す。図４Ａは、ＰＰ１１２８８に関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す。図４Ｂは、ＰＰ１１２８９に関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す。図４Ｃは、ＰＰ１１２９０に関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す。図４Ｄは、ＰＰ１１２９１に関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す。図４Ｅは、ＰＰ１１２９２に関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す。図４Ｆは、精製した試料に関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す（還元のオーバーレイ）。図４Ｇは、精製した試料に関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す（非還元条件）。
【図4B】同上。
【図4C】同上。
【図4D】同上。
【図4E】同上。
【図4F】同上。
【図4G】同上。
【図7A】図７は、本発明のコンストラクトに関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す。図７Ａは、ＰＰ１３５７９に関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す。図７Ｂは、ＰＰ１３５８０に関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す。図７Ｃは、ＰＰ１３５８１に関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す。図７Ｄは、ＰＰ１３５８２に関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す。図７Ｅは、ＰＰ１３５８３に関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す。図７Ｆは、ＰＰ１３５８４に関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す。図７Ｇは、ＰＰ１３５８５に関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す。図７Ｈは、ＰＰ１３５８６に関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す。図７Ｉは、ＰＰ１３５８７に関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す。図７Ｊは、ＰＰ１３５８８に関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す。図７Ｋは、ＰＰ１３５８９に関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す。図７Ｌは、ＰＰ１３５９０に関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す。図７Ｍは、ＰＰ１３５９２に関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す。図７Ｎは、ＰＰ１３５９３に関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す。図７Ｏは、ＰＰ１３５９４に関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す。図７Ｐは、ＰＰ１３５９５に関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す。図７Ｑは、ＰＰ１３５９６に関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す。図７Ｒは、ＰＰ１３５９７に関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す。図７Ｓは、ＰＰ１３５９８に関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す。図７Ｔは、ＰＰ１３５９９に関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す。図７Ｕは、ＰＰ１３６００に関する精製ＣＥ－ＳＤＳを表す。
【図7B】同上。
【図7C】同上。
【図7D】同上。
【図7E】同上。
【図7F】同上。
【図7G】同上。
【図7H】同上。
【図7I】同上。
【図7J】同上。
【図7K】同上。
【図7L】同上。
【図7M】同上。
【図7N】同上。
【図7O】同上。
【図7P】同上。
【図7Q】同上。
【図7R】同上。
【図7S】同上。
【図7T】同上。
【図7U】同上。
【図9B】同上。
【図9C】同上。
【発明を実施するための形態】
【0029】
専門用語
本明細書で用いる場合、「約」の語は、おおよその数学量を指すものとし、整数値のみならず百分率に対しても用いることがある。上限又は下限が整数値を含む場合、約という語はおおよそである境界を指すものとし、そしてその語はまた、その境界（下限に対して）よりも上又はその境界（その上限に対して）よりも下の全てを含むものとする。例えば、３９３残基配列のうちの「約」２０残基を含む配列の部分は、およそ２０残基である境界と、その値よりも上の全ての整数値とを含むものとする。
本明細書で用いる場合、「約」の語は、おおよその数学量を指すものとし、整数値のみならず百分率に対しても用いることがある。上限又は下限が整数値を含む場合、約という語はおおよそである境界を指すものとし、そしてその語はまた、その境界（下限に対して）よりも上又はその境界（その上限に対して）よりも下の全てを含むものとする。例えば、３９３残基配列のうちの「約」２０残基を含む配列の部分は、およそ２０残基である境界と、その値よりも上の全ての整数値とを含むものとする。
【0030】
本明細書で用いる場合、「アルブミン」は、アルブミンタンパク質、もしくはアルブミンの１もしくは複数の機能活性を有するアルブミンの断片、部分もしくはバリアントを指すか、又はアルブミンの１もしくは複数の機能活性を有する、アルブミンのタンパク質、断片、部分又はそのバリアントをコードする核酸配列を指すものとする。アルブミンは、任意の脊椎動物由来、特に任意の哺乳類由来であり得る。一部の実施形態においては、アルブミンは、ヒト、ウシ、ヒツジ、又はブタに由来する。非哺乳類のアルブミンとしては、雌鳥及びサケが挙げられるがこれに限定されない。一部の実施形態においては、任意の脊椎動物由来のアルブミンは、ヒトアルブミン又はヒト血清アルブミンの代替となり得る。
【0031】
本明細書で用いる場合、「抗体」の語はあるタイプの免疫グロブリン分子を指し、その広義の意味で用いる。抗体は、詳細には、インタクトな抗体（例えば、インタクトな免疫グロブリン）及び抗体断片を含む。抗体は、少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む。抗原結合ドメインの一例は、ＶＨ－ＶＬ二量体により形成される抗原結合ドメインである。抗体の他の例は、以下の節において記載する。
【0032】
ＶＨ及びＶＬ領域は、より保存された領域が分散した、超可変性の領域（「超可変領域（ＨＶＲ）」、本明細書で規定される場合、ＣＤＲとも呼ぶ）にさらに細分化され得る。より保存された領域をフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ぶ。ＶＨ及びＶＬはそれぞれ、概して以下の順序（Ｎ－末端からＣ－末端へ）で配置した、３つのＣＤＲと４つのＦＲとを含む：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４。ＣＤＲは、抗原結合に関与して、抗原特異性と、抗体に対する結合親和性とを与える。Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ ５ｔｈ ｅｄ．（１９９１）Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤを参照されたく、当該文献はその全体として参照により援用する。
【0033】
任意の脊椎動物種よりの軽鎖は、定常ドメインの配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる２種のうちの一方に割り当てることが可能である。
【0034】
任意の脊椎動物種よりの重鎖は、以下の５つの異なるクラス（又はアイソタイプ）のうちの１つに割り当てることが可能である：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ。これらクラスはまた、それぞれα、δ、ε、γ、及びμとも示す。ＩｇＧ及びＩｇＡのクラスは、配列及び機能の違いに基づいてサブクラスにさらに分けられる。ヒトは、以下のサブクラスを発現する：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２。
【0035】
「抗体断片」は、インタクトな抗体の抗原結合領域又は可変領域等である、インタクトな抗体の部分を含む。抗体断片としては、例えばＦｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ（ｓＦｖ）断片、及びｓｃＦｖ－Ｆｃ断片が挙げられる。
【0036】
「Ｆｖ」断片は、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの非共有結合的に連結した二量体を含む。
【0037】
「Ｆａｂ」断片は、重鎖及び軽鎖の可変ドメインに加えて、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む。Ｆａｂ断片は、例えば全長抗体のパパイン消化によって生成し得る。
【0038】
「Ｆ（ａｂ’）２」断片は、ジスルフィド結合によってヒンジ領域付近で結合した２つのＦａｂ’断片を含有する。Ｆ（ａｂ’）２断片は、例えばインタクトな抗体のペプシン消化によって生成し得る。Ｆ（ａｂ’）断片は、例えばβ－メルカプトエタノールでの処理によって分離可能である。
【0039】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」の抗体断片は、ペプチドリンカーで連結した一本鎖ポリペプチド内のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ
Ａ．（１９９４）を参照されたい。「ｓｃＦｖ－Ｆｃ」断片は、Ｆｃドメインに付加したｓｃＦｖを含む。例えば、Ｆｃドメインは、ｓｃＦｖのＣ－末端に付加し得る。Ｆｃドメインは、ＶＨ又はＶＬに続き得るものであり、これはｓｃＦｖにおける可変ドメインの配置（すなわち、ＶＨ－ＶＬ又はＶＬ－ＶＨ）に左右される。当技術分野で公知の又は本明細書に記載の任意の好適なＦｃドメインを用いることができる。
Ａ．（１９９４）を参照されたい。「ｓｃＦｖ－Ｆｃ」断片は、Ｆｃドメインに付加したｓｃＦｖを含む。例えば、Ｆｃドメインは、ｓｃＦｖのＣ－末端に付加し得る。Ｆｃドメインは、ＶＨ又はＶＬに続き得るものであり、これはｓｃＦｖにおける可変ドメインの配置（すなわち、ＶＨ－ＶＬ又はＶＬ－ＶＨ）に左右される。当技術分野で公知の又は本明細書に記載の任意の好適なＦｃドメインを用いることができる。
【0040】
非ヒト抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体に由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。ヒト化抗体は、概して、１又は複数のＣＤＲよりの残基が非ヒト抗体（ドナー抗体）の１又は複数のＣＤＲよりの残基で置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。
【0041】
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生した又はヒト抗体レパートリーもしくはヒト抗体コード配列（例えば、ヒトから取得又はデノボで設計）を利用する非ヒトの源に由来する、抗体の配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体は特に、ヒト化抗体を除外する。
【0042】
本明細書において用いる場合、「単一ドメイン抗体」は、そのＣＤＲが単一ドメインポリペプチドのうちの一部である抗体を指すものとする。例としては、重鎖抗体、天然に軽鎖を欠いている抗体、従来の四鎖抗体由来の単一ドメイン抗体、及び抗体由来のもの以外の単一ドメイン足場が挙げられるが、これに限定されない。単一ドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、サメ、及びウシを含むがこれに限定されない任意の種に由来し得る。例として、単一ドメイン抗体は、ラクダ、ヒトコブラクダ、アルパカ、及びグアナコ等のラクダ科の種で生じ得る。一部の実施形態においては、単一ドメイン抗体は、配列番号２２～２８及び配列番号２９～３６のうちのいずれか１つに記載の配列を含む。
【0043】
本明細書で用いる場合、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」は、抗体内の可変鎖の一部である。ＣＤＲは、特異抗体に重要である。当業者は、特異抗体のために抗体内のＣＤＲの位置を決定する方法を認識するものであり、またＣＤＲの位置を決定するシステムがいくつか存在する。明確にするため、本願においては、単一ドメイン抗体のＣＤＲは、本明細書においてその全体として参照によって援用する米国特許出願公開第２０１０／０１１３３９号に従って決定するものとする。
【0044】
「エピトープ」の語は、例えば限定するものではないが抗体等である結合タンパク質に特異的に結合することが可能である抗原の部分を意味する。エピトープは、表面接近可能なアミノ酸残基及び／もしくは糖の側鎖からなることがよくあり、また特異的な三次元構造特性のみならず特異的な電荷特性を有し得る。エピトープは、当該結合に直接関与するアミノ酸残基と、当該結合に直接関与しない他のアミノ酸残基とを含み得る。抗体が結合するエピトープは、エピトープ決定に関する公知の技術を用いて決定することが可能である。
【0045】
本明細書で用いる場合、「ヒトアルブミン」は、ヒトアルブミンタンパク質、もしくはヒトアルブミンの１もしくは複数の機能活性を有するヒトアルブミンの断片もしくはバリアントもしくは部分を指すか、又はヒトアルブミンの１もしくは複数の機能活性を有する、ヒトアルブミン、その断片、部分もしくはバリアントをコードする核酸配列を指す。ヒトアルブミンは、６０９個のアミノ酸のポリペプチド配列であり、その最初の１８個のアミノ酸は、最終的な血液由来産物では見られないリーダー配列を構成する。ヒトアルブミンは、一部の実施形態において配列番号３で記載する。
【0046】
本明細書で用いる場合、「ヒト血清アルブミン」は、ヒト血液中に存在するヒト血清アルブミンを指すものとし、これは通常、最初の１８個のアミノ酸リーダー配列を欠いている。一部の実施形態においては、ヒト血清アルブミンは、配列番号５で記載する配列を有する。ヒト血清アルブミンドメインはまた、任意のヒト血清アルブミンタンパク質、又はヒト血清アルブミンの１もしくは複数の機能活性を有するヒト血清アルブミンの断片又はバリアント又は部分を指すものとする。
【0047】
本明細書で用いる場合、「ヒト血清アルブミン結合タンパク質」又は「ヒトアルブミン結合ドメイン」は、ヒトアルブミン又はヒト血清アルブミンに対する１又は複数の結合活性を有する、任意のタンパク質又はタンパク質の断片もしくはバリアントを指すものとする。
【0048】
本明細書で用いる場合、「アルファ－１－アンチトリプシン」又は「α１－アンチトリプシン」（「Ａ１ＡＴ」、「Ａ１Ａ」又は「ＡＡＴ」とも）は、アルファ－１－アンチトリプシンタンパク質、又はアルファ－１－アンチトリプシンの１もしくは複数の機能活性を有するアルファ－１－アンチトリプシンの断片もしくはバリアント、又はアルファ－１－アンチトリプシンの１もしくは複数の機能活性を有する、アルファ－１－アンチトリプシンタンパク質、断片もしくはそのバリアントをコードする核酸配列を指すものとする。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンタンパク質は、配列番号１で記載の配列を有する。
【0049】
本明細書で用いる場合、「アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメイン」又は「α１－アンチトリプシンセルピンドメイン」（「Ａ１ＡＴドメイン」、「Ａ１Ａドメイン」又は「ＡＡＴドメイン」とも）は、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメイン、又はアルファ－１－アンチトリプシンタンパク質もしくは断片の１もしくは複数の機能活性を有するアルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインの断片もしくはバリアント、又はアルファ－１－アンチトリプシンタンパク質の１もしくは複数の機能活性を有する、アルファ－１－アンチトリプシンタンパク質セルピンドメインもしくは断片もしくはそのバリアントをコードする核酸配列を指すものとする。
【0050】
本明細書で用いる場合、「アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症」又は「ＡＡＴＤ」は、アルファ－１－アンチトリプシンの産生不全の原因となる遺伝性疾患である。当該疾患は、アルファ－１－アンチトリプシンの減少につながり、また遺伝性肺気腫とも呼ばれ、結果的に肺及び肝臓の疾患を生じる。当該欠乏症にはいくつかの形態と程度が存在する。当該形態及び程度は、患者が欠陥のある対立遺伝子のコピーを１つ持っているか又は２つ持っているかに左右される。深刻なアルファ－１－アンチトリプシン欠乏症では、症状をもつ多くの人々の成人期において、特に彼らがタバコの煙に曝露するのであれば、汎小葉性肺気腫又はＣＯＰＤを引き起こす。当該疾患はまた、少数の小児及び成人において種々の肝疾患につながる可能性があり、そして場合によっては、より稀な問題につながる可能性がある。アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症によれば、通常、ある程度の障害がもたらされ、余命が短くなる。
【0051】
本明細書に記載の組換えタンパク質又はその機能的断片もしくはバリアントの「有効量」は、複数用量の集合体を投与したとき、又は任意の他のタイプの規定された治療レジメンの一部として投与したときに、合併症と関連する少なくとも１つの臨床パラメータによって明らかになされるような、予後又は予防における測定可能な統計学的な改善を生じるような、ポリペプチド又はその機能的断片もしくはバリアントの量を指す。
【0052】
本明細書において用いる場合、「好中球エラスターゼ」は、肺に弾性収縮力を与えるゴム様巨大分子であるエラスターゼを破壊するセリンプロテアーゼを指すものである。血液が含有するＡＡＴが不十分な量であるとき、好中球エラスターゼはエラスチンを破壊する可能性があり、肺の弾力は低下し、これは結果的に、例えば慢性的な閉塞性肺疾患等の呼吸器合併症をもたらす。
【0053】
本明細書で用いる場合、「部分」の語は、例えばタンパク質又はポリペプチド等である何かの全体の一部又は欠片を意味するものとする。
【0054】
本明細書で用いる場合、タンパク質又はポリペプチドの分子に関する「組換え」は、単離した核酸分子又は組換え核酸分子を利用して発現した、タンパク質又はポリペプチドの分子を指す。
【0055】
本明細書において用いる場合、「バリアント」の語は、例えば挿入、欠失及び保存性又は非保存性のいずれかである置換であって、こうした変化が、アルブミンもしくはアルブミン結合ドメインのコロイド的な有用なリガンド結合及び非免疫原性特性のうちの１又は複数を実質的に変化させない、又はセルピンドメインを変えない、当該挿入、欠失及び当該置換含むがこれに限定されない、タンパク質の異なる配列を意味するものである。
【0056】
本明細書に記載するポリペプチドのバリアントは、本明細書で提供するヒト野生型ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有するポリペプチドを含む。例えば、アルファ－１－アンチトリプシンのバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有するポリペプチドを含む。例えば、ヒトアルブミンのバリアントは、配列番号３又は配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有するポリペプチドを含む。２つの配列間の「同一性」又は「配列相同性」（これら語は本明細書において区別なく用いる）の計算は、最適比較用のアラインメントによって実施する（例えば、第１及び第２のアミノ酸又は核酸の配列のうちの一方又は両方に、最適なアラインメントのためにギャップを挿入することが可能であり、また比較目的のために、非相同性の配列を無視することが可能である）。その後、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列内の位置が、第２の配列内の対応する位置と同一のアミノ酸残基又はヌクレオチドで占有されている場合、当該分子同士は、その位置で同一である（本明細書において用いる場合、アミノ酸又は核酸の「同一性」は、アミノ酸又は核酸の「相同性」と同等である）。２つの配列間の同一性の割合は、その配列が共有する同一の位置の数の関数である。バリアントは、ヒト野生型ポリペプチドと比較して化学的に改変されているか、及び／又はヒト野生型ポリペプチドと比較して１もしくは複数のアミノ酸配列の変更を含有しているかのいずれかであるポリペプチドを含むがこれに限定されない。
【0057】
本明細書に記載するポリペプチドのバリアントは、ポリペプチドの野生型のアミノ酸配列に対してアミノ酸修飾（例えば、欠失、付加、又は例えば保存的置換等である置換）を有するものであり得る。一部の実施形態においては、ＡＡＴのバリアントは、アルファ－１－アンチトリプシン（配列番号１）と少なくとも１、２、３、４、５又はそれ以上の残基が異なり得、またヒト血清アルブミンのバリアントは、ヒト血清アルブミン（配列番号５）より少なくとも１、２、３、４、又は５の残基が変動し得る。
【0058】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されている置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において既に規定されている。これらファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）をもつアミノ酸を含む。保存的置換を有する組換えタンパク質は、本発明の範囲内にあることを意図する。
【0059】
「融合体」又は「融合分子」の語は、その文脈に応じて、ポリペプチド又は核酸の融合体を指し得る。それは、全長配列又はタンパク質又は核酸又はその断片を含み得る。またそれは、リンカー分子を伴う又は伴わない組換えタンパク質を含み得る。
【0060】
「単離」タンパク質は、それから単離されるタンパク質を取得することが可能である天然試料の少なくとも１つの成分のうちの少なくとも約９０％から回収したタンパク質を指す。タンパク質は、その種又は関心の種の集団が重量対重量基準で少なくとも約５、２５、５０、７５、８０、９０、９２、９５、９８、又は９９％純粋であれば、「少なくともおよそ」ある程度の純度のものであり得る。
【0061】
本明細書で用いる場合、「コロイドの」の語は、コロイド浸透圧又は膠質コロイド浸透圧を指すものとする。それは、循環系へと水を引き入れる血管の血漿において、特にアルブミンであるタンパク質によって発揮されるコロイド浸透圧の形態である。それは、静水圧に対する反力である。それは、糸球体のフィルターを通る圧力に対して大きな影響を及ぼす。
【0062】
主題の方法によって治療しようとする「患者」、「対象」又は「宿主」（これら語は区別なく用いられる）は、ヒト又は非ヒト動物のいずれかを意味し得る。好ましくは、患者、対象、又は宿主は、ヒト患者を指す。
【0063】
対象における疾患を「予防的に治療すること」の語は、対象を薬物治療に供することを指し、例えば、疾患の少なくとも１つの症状を予防的に治療するような、すなわち、それが望ましくない症状の発達から宿主を保護するように、望ましくない症状の臨床的出現に先立って投与されるような、薬剤の投与である。疾患を「予防的に治療すること」はまた、「予防」とも呼び得る。一部の実施形態においては、予防的治療が当該疾患を防ぐ。
【0064】
本明細書において用いる場合、それを必要とする対象においてアルファ－１－アンチトリプシン欠乏症に関連した障害を「治療すること」又はアルファ－１－アンチトリプシン欠乏症に関連した障害を有する対象を「治療すること」は、当該対象を薬物治療に供すること、例えば疾患の少なくとも１つの症状を治癒、緩和又は軽減するように薬物を投与すること、を指す。
【0065】
本明細書に記載する治療のいずれかを、別の薬剤又は療法と併用して施与することが可能である。「併用」の語は、同一の患者を治療するために２以上の薬剤又は療法を用いることを指すものであり、当該薬剤又は療法の使用又は作用は、時間的に重複している。薬剤又は療法は、同時に（例えば、患者に投与する単一の剤形として又は同時に投与する２つの別個の剤形として）又は任意の順序で順次に、施与することが可能である。
【0066】
組換えタンパク質
一部の実施形態は、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメイン又はその機能的断片もしくはバリアントと、ヒト血清アルブミンドメインもしくはその機能的断片もしくはバリアント、又はヒト血清アルブミン結合ドメインもしくはその機能的断片もしくはバリアントとを含む組換えタンパク質を提供する。
一部の実施形態は、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメイン又はその機能的断片もしくはバリアントと、ヒト血清アルブミンドメインもしくはその機能的断片もしくはバリアント、又はヒト血清アルブミン結合ドメインもしくはその機能的断片もしくはバリアントとを含む組換えタンパク質を提供する。
【0067】
アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメイン
一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、全長アルファ－１－アンチトリプシンを含む。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンは、配列番号１で記載の配列を含むタンパク質である。
一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、全長アルファ－１－アンチトリプシンを含む。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンは、配列番号１で記載の配列を含むタンパク質である。
【0068】
一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、１又は複数の変異を含む。一部の実施形態においては、１又は複数の変異は、配列番号１に従う以下の残基位置のうちの少なくとも１つにおける変異を含む：５１、１００、１１４、１１７、１６３、１６４、１６５、１６８、１６９、１７２、１７３、１７４、１８３、１８９、２３２、２８３、３００、３０２、３０３、３０４、３０６、３３０、３３１、３３３、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３５１、３５６、３５８、又は３６１。一部の実施形態においては、１又は複数の変異は、配列番号１に以下の変異Ｆ５１Ｌ、Ｌ１００Ｆ、Ｌ１００Ｃ、Ｔ１１４Ｆ、Ｇ１１７Ｆ、Ｋ１６３Ｔ、Ｇ１６４Ｖ、Ｔ１６５Ｓ、Ｋ１６８Ｃ、Ｋ１６８Ｉ、Ｋ１６８Ａ、Ｋ１６９Ｖ、Ｌ１７２Ｖ、Ｌ１７２Ａ、Ｌ１７２Ｃ、Ｖ１７３Ｃ、Ｋ１７４Ｔ、Ａ１８３Ｖ、Ｆ１８９Ｃ、Ｆ１８９Ｉ、Ｆ１８９Ｖ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ２８３Ｃ、Ｋ３００Ａ、Ｖ３０２Ａ、Ｌ３０３Ａ、Ｇ３０４Ａ、Ｌ３０６Ａ、Ｓ３３０Ｒ、Ｋ３３１Ｆ、Ｋ３３１Ｉ、Ｋ３３１Ｖ、Ｋ３３１Ｔ、Ｋ３３１Ｃ、Ｖ３３３Ｃ、Ｖ３３３Ａ、Ｋ３３５Ａ、Ｋ３３１Ｆ、Ｋ３３５Ｇ、Ｋ３３５Ｔ、Ａ３３６Ｇ、Ｖ３３７Ｃ、Ｖ３３７Ａ、Ｌ３３８Ａ、Ｔ３３９Ｓ、Ｉ３４０Ｖ、Ｍ３５１Ｖ、Ｉ３５６Ｍ、Ｍ３５８Ｉ、Ｍ３５８Ｐ、Ｍ３５８Ａ、Ｍ３５８Ｒ、Ｍ３５８Ｌ、Ｍ３５８Ｖ、又はＰ３６１Ｃのうちの１又は複数を含む。一部の実施形態においては、１又は複数の変異は、配列番号１にＦ５１Ｌ、Ｇ１１７Ｆ、Ｋ１６８Ｃ、Ｆ１８９Ｃ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ２８３Ｃ、Ｋ３３１Ｆ、Ｋ３３５Ａ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｖ、Ｍ３５８Ｌ、又はＰ３６１Ｃを含む。一部の実施形態においては、１又は複数の変異は、配列番号１にＫ１６８Ｃ及びＦ１８９Ｃの両方である。一部の実施形態においては、１又は複数の変異は、配列番号１にＰ３６１Ｃ及びＳ２８３Ｃの両方である。
【0069】
一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＣ２３２Ｓを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＭ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｖを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＭ３５１Ｖ及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＣ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｖを含む１又は複数の変異を有する。
【0070】
一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＦ５１Ｌ、Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＧ１１７Ｆ、Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＣ２３２Ｓ、Ｋ３３１Ｆ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＣ２３２Ｓ、Ｋ３３５Ａ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＫ１６８Ｃ、Ｆ１８９Ｃ、Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＣ２３２Ｓ、Ｓ２８３Ｃ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ、及びＰ３６１Ｃを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＦ５１Ｌ、Ｇ１１７Ｆ、Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＦ５１Ｌ、Ｃ２３２Ｓ、Ｋ３３１Ｆ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＦ５１Ｌ、Ｃ２３２Ｓ、Ｋ３３５Ａ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＫ５１Ｌ、Ｋ１６８Ｃ、Ｆ１８９Ｃ、Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＦ５１Ｌ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ２８３Ｃ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ、及びＰ３６１Ｃを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＧ１１７Ｆ、Ｃ２３２Ｓ、Ｋ３３１Ｆ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＧ１１７Ｆ、Ｋ３３５Ａ、Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＧ１１７Ｆ、Ｋ１６８Ｃ、Ｆ１８９Ｃ、Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＧ１１７Ｆ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ２８３Ｃ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ、及びＰ３６１Ｃを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＣ２３２Ｓ、Ｋ３３１Ｆ、Ｋ３３５Ａ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＫ１６８Ｃ、Ｆ１８９Ｃ、Ｃ２３２Ｓ、Ｋ３３１Ｆ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＣ２３２Ｓ、Ｓ２８３Ｃ、Ｋ３３１Ｆ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ、及びＰ３６１Ｃを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＫ１６８Ｃ、Ｆ１８９Ｃ、Ｃ２３２Ｓ、Ｋ３３５Ａ、Ｍ３５１Ｖ、及びＭ３５８Ｌを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＣ２３２Ｓ、Ｓ２８３Ｃ、Ｋ３３５Ａ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ、及びＰ３６１Ｃを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１にＫ１６８Ｃ、Ｆ１８９Ｃ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ２８３Ｃ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ、及びＰ３６１Ｃを含む１又は複数の変異を有する。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１に点変異Ｋ３３５Ａを含む。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１に点変異Ｋ３３１Ｆを含む。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１に点変異Ｇ１１７Ｆを含む。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１に点変異Ｓ２８３Ｃを含む。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１に点変異Ｐ３６１Ｃを含む。
【0071】
一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメイン内のグリカン部位は、切断されて、欠失している。一部の実施形態においては、配列番号１のうちの最初の残基は、グリカン部位が欠失するように変異している。一部の実施形態においては、配列番号１のうちの残基１～４６が欠失している。
【0072】
一部の実施形態においては、１又は複数の変異は、酸化に対する安定性の向上、ヒト好中球エラスターゼに対する効力の保持、重合に対する抵抗性、及び産生の容易性を含めた、安定性の向上を提供するものであって、当該向上した安定性は、野生型に対して測定される。
【0073】
一部の実施形態においては、当該１又は複数の変異は、配列番号１に従って記載した残基位置での、表１及び表２～５に記載するような１又は複数の変異である。
ＡＡＴ－アルブミン融合体
ベース ＷＴ（野生型）
ベース Ｃ２３２Ｓ
ベース Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｖ
ベース Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ
ベース Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ
ＡＡＴ－アルブミン融合体
ベース ＷＴ（野生型）
ベース Ｃ２３２Ｓ
ベース Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｖ
ベース Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ
ベース Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ
【0074】
【表1】
【0075】
一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、アルファ－１－アンチトリプシンの部分を含む。一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインの部分は、例えば配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメイン等であるがこれに限定されない全長ヒトアルファ－１－アンチトリプシン以上の活性を有する。一部の実施形態においては、当該部分は、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約２０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約３０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約４０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約５０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約６０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約７０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約８０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約９０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約１００の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約１１０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約１２０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約１３０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約１４０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約１５０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約１６０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約１７０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約１８０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約１９０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約２００の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約２１０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約２２０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約２３０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約２４０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約２５０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約２６０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約２７０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約２８０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約２９０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約３００の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約３１０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約３２０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約３３０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約３４０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約３５０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約３６０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約３７０の残基、アルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約３８０の残基、又はアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約３９０の残基である。
【0076】
一部の実施形態においては、当該部分は、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約２０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約３０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約４０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約５０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約６０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約７０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約８０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約９０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約１００の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約１１０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約１２０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約１３０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約１４０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約１５０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約１６０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約１７０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約１８０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約１９０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約２００の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約２１０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約２２０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約２３０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約２４０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約２５０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約２６０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約２７０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約２８０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約２９０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約３００の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約３１０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約３２０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約３３０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約３４０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約３５０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約３６０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約３７０の残基、配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約３８０の残基、又は配列番号１に記載の配列を有するアルファ－１－アンチトリプシンの少なくとも約３９０の残基である。
【0077】
一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、配列番号１に記載の通常のアルファ－１－アンチトリプシンのバリアントを含む。一部の実施形態においては、当該バリアントは、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインの活性部分を含む。
【0078】
アルブミン
一部の実施形態においては、ヒト血清アルブミンドメインは、全長ヒトアルブミンを含む。一部の実施形態においては、ヒト血清アルブミンドメインは、配列番号３又は配列番号５で記載する配列を含む。一部の実施形態においては、ヒト血清アルブミンドメインは、配列番号３又は配列番号５を含む配列を有する。
一部の実施形態においては、ヒト血清アルブミンドメインは、全長ヒトアルブミンを含む。一部の実施形態においては、ヒト血清アルブミンドメインは、配列番号３又は配列番号５で記載する配列を含む。一部の実施形態においては、ヒト血清アルブミンドメインは、配列番号３又は配列番号５を含む配列を有する。
【0079】
一部の実施形態においては、ヒト血清アルブミンドメインは、１又は複数の変異を含む。一部の実施形態においては、当該１又は複数の変異は、以下の位置：４０７、４０８、４０９、４１０、４１３及び４１４のうちの１又は複数における変異を含むものであって、当該位置の番号は配列番号５に対する。一部の実施形態においては、１又は複数の変異が、以下の変異：Ｌ４０７Ａ、Ｌ４０８Ｖ、Ｖ４０９Ａ、Ｒ４１０Ａ、Ｌ４１３Ｑ、及びＬ４１４Ｑのうちの少なくとも１つを含むものであって、当該位置の番号は、配列番号５に対する（例えば、本明細書において参照によってその全体としてここに援用する、国際公開第９５／２３８５７号を参照）。一部の実施形態においては、１又は複数の変異は、Ｌ４０７Ａ、Ｌ４０８Ｖ、Ｖ４０９Ａ、及びＲ４１０Ａを含むものであって、当該位置の番号は、配列番号５に対する。一部の実施形態においては、１又は複数の変異は、Ｒ４１０Ａ、Ｌ４１３Ｑ及びＬ４１４Ｑを含むものであって、当該位置の番号は、配列番号５に対する。一部の実施形態においては、１又は複数の変異が、安定性を向上させ、及び／又は組換えタンパク質の産生を増加させる。
【0080】
一部の実施形態においては、ヒト血清アルブミンドメインは、ヒトアルブミンの部分を含む。一部の実施形態においては、当該部分は、ヒト血清アルブミンの少なくとも約２０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約３０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約４０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約５０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約６０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約７０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約８０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約９０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約１００の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約１１０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約１２０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約１３０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約１４０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約１５０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約１６０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約１７０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約１８０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約１９０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約２００の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約２１０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約２２０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約２３０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約２４０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約２５０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約２６０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約２７０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約２８０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約２９０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約３００の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約３１０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約３２０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約３３０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約３４０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約３５０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約３６０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約３７０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約３８０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約３９０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約４００の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約４１０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約４２０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約４３０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約４４０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約４５０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約４６０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約４７０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約４８０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約４９０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約５００の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約５１０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約５２０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約５３０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約５４０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約５５０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約５６０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約５７０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約５８０の残基、ヒト血清アルブミンの少なくとも約５９０の残基、又はヒト血清アルブミンの少なくとも約６００の残基である。
【0081】
一部の実施形態においては、当該部分は、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約２０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約３０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約４０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約５０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約６０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約７０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約８０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約９０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約１００の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約１１０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約１２０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約１３０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約１４０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約１５０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約１６０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約１７０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約１８０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約１９０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約２００の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約２１０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約２２０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約２３０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約２４０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約２５０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約２６０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約２７０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約２８０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約２９０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約３００の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約３１０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約３２０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約３３０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約３４０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約３５０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約３６０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約３７０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約３８０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約３９０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約４００の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約４１０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約４２０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約４３０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約４４０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約４５０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約４６０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約４７０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約４８０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約４９０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約５００の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約５１０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約５２０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約５３０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約５４０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約５５０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約５６０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約５７０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約５８０の残基、配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約５９０の残基、又は配列番号３もしくは配列番号５に記載の配列を有するヒト血清アルブミンの少なくとも約６００の残基である。
【0082】
一部の実施形態においては、ヒト血清アルブミンの部分は、配列番号５のアミノ酸残基１～１９４、配列番号５のアミノ酸残基１９５～３８７、配列番号５のアミノ酸残基３８８～５８５、配列番号５の１～３８７、配列番号５の１９５～５８５に記載の配列の、又は配列番号５のアミノ酸残基１～１９４及び配列番号５のアミノ酸残基３８８～５８５の、少なくとも１つのアミノ酸配列もしくはそのバリアントを含む、又は当該少なくとも１つのアミノ酸配列もしくはそのバリアントからなる。各ドメイン自体は、フレキシブルなサブドメイン間リンカー領域を備えた２つの相同なサブドメイン、すなわち１～１０５、１２０～１９４、１９５～２９１、３１６～３８７、３８８～４９１及び５１２～５８５で構成されている（例えば、いずれの図面も含めて、本明細書において参照によって援用する、欧州特許出願公開第２ ０９０ ５８９Ａ１号を参照）。一部の実施形態においては、当該部分は、少なくとも１つのサブドメインからなる、又は当該サブドメインを含む。
【0083】
一部の実施形態においては、ヒト血清アルブミンドメインの部分は、全長ヒトアルブミンなど以上の活性を有する。一部の実施形態においては、ヒト血清アルブミンは、配列番号５で記載する配列を含む配列を有する。
【0084】
一部の実施形態においては、ヒト血清アルブミンドメインが、野生型ヒト血清アルブミンのバリアントを含む。
【0085】
アルブミン結合タンパク質
一部の実施形態においては、ヒト血清アルブミン結合ドメインは、ヒト血清アルブミンに結合することが可能であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態においては、ヒト血清アルブミンは、配列番号３又は配列番号５で記載する配列を有する。一部の実施形態においては、ヒト血清アルブミンが、配列番号５で記載するヒト血清アルブミンの部分を含む。一部の実施形態においては、ヒトアルブミンの部分が、エピトープを含む。
一部の実施形態においては、ヒト血清アルブミン結合ドメインは、ヒト血清アルブミンに結合することが可能であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態においては、ヒト血清アルブミンは、配列番号３又は配列番号５で記載する配列を有する。一部の実施形態においては、ヒト血清アルブミンが、配列番号５で記載するヒト血清アルブミンの部分を含む。一部の実施形態においては、ヒトアルブミンの部分が、エピトープを含む。
【0086】
一部の実施形態においては、ヒト血清アルブミン結合ドメインが、抗体を含む。一部の実施形態においては、抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態においては、抗体は、ヒト化抗体である。一部の実施形態においては、抗体はヒト免疫グロブリン（（例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）；ＩｇＥ（例えば、ＩｇＥ１）、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＭ（例えば、ＩｇＭ１）、ＩｇＤ（例えば、ＩｇＤ１））、又はヒト免疫グロブリンの断片、部分、もしくはバリアントである。
【0087】
一部の実施形態においては、ヒト血清アルブミン結合ドメインは、単一ドメイン抗体を含む。一部の実施形態においては、単一ドメイン抗体は、配列番号６～９から選択される配列を含む、当該配列からなる、又は実質的に当該配列からなる、ＣＤＲ１配列を含む。一部の実施形態においては、単一ドメイン抗体は、配列番号１０～１６から選択される配列を含む、当該配列からなる、又は実質的に当該配列からなる、ＣＤＲ２配列を含む。一部の実施形態においては、単一ドメイン抗体は、配列番号１７～２１から選択される配列を含む、当該配列からなる、又は実質的に当該配列からなる、ＣＤＲ３配列を含む。一部の実施形態においては、単一ドメイン抗体は、配列番号３７～６２を含む配列を有するフレームワーク領域のいずれか１つ又は複数を含む。
【0088】
一部の実施形態においては、単一ドメイン抗体は、１又は複数の結合ドメインの組み合わせを含む。一部の実施形態においては、単一ドメイン抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のうちの１又は複数の組み合わせを含む。一部の実施形態においては、単一ドメイン抗体は、配列番号６～９から選択される配列を含む、当該配列からなる、又は実質的に当該配列からなる、ＣＤＲ１配列と、配列番号１０～１６から選択される配列を含む、当該配列からなる、又は実質的に当該配列からなる、ＣＤＲ２配列とを含む。一部の実施形態においては、単一ドメイン抗体は、配列番号６～９から選択される配列を含む、当該配列からなる、又は実質的に当該配列からなる、ＣＤＲ１配列と、配列番号１７～２１から選択される配列を含む、当該配列からなる、又は実質的に当該配列からなる、ＣＤＲ３配列とを含む。一部の実施形態においては、単一ドメイン抗体は、配列番号１０～１６から選択される配列を含む、当該配列からなる、又は実質的に当該配列からなる、ＣＤＲ２配列と、配列番号１７～２１から選択される配列を含む、当該配列からなる、又は実質的に当該配列からなる、ＣＤＲ３配列とを含む。一部の実施形態においては、単一ドメイン抗体は、配列番号６～９から選択される配列を含む、当該配列からなる、又は実質的に当該配列からなる、ＣＤＲ１配列と、配列番号１０～１６から選択される配列を含む、当該配列からなる、又は実質的に当該配列からなる、ＣＤＲ２配列と、配列番号１７～２１から選択される配列を含む、当該配列からなる、又は実質的に当該配列からなる、ＣＤＲ３配列とを含む。
【0089】
一部の実施形態においては、単一ドメイン抗体は、配列番号２２～２８から選択される配列を含む。
【0090】
一部の実施形態においては、単一ドメイン抗体は、配列番号２９～３６から選択されるヒト化配列を含む。一部の実施形態においては、単一ドメイン抗体は、配列番号２９を含む、配列番号２９からなる、又は実質的に配列番号２９からなる、ヒト化配列を含む。一部の実施形態においては、単一ドメイン抗体は、配列番号３０を含む、配列番号３０からなる、又は実質的に配列番号３０からなる、ヒト化配列を含む。一部の実施形態においては、単一ドメイン抗体は、配列番号３１を含む、配列番号３１からなる、又は実質的に配列番号３１からなる、ヒト化配列を含む。一部の実施形態においては、単一ドメイン抗体は、配列番号３２を含む、配列番号３２からなる、又は実質的に配列番号３２からなる、ヒト化配列を含む。一部の実施形態においては、単一ドメイン抗体は、配列番号３３を有するヒト化配列を含む。一部の実施形態においては、単一ドメイン抗体は、配列番号３４を含む、配列番号３４からなる、又は実質的に配列番号３４からなる、ヒト化配列を含む。一部の実施形態においては、単一ドメイン抗体は、配列番号３５を含む、配列番号３５からなる、又は実質的に配列番号３５からなる、ヒト化配列を含む。一部の実施形態においては、単一ドメイン抗体は、配列番号３６を含む、配列番号３６からなる、又は実質的に配列番号３６からなる、ヒト化配列を含む。
【0091】
一部の実施形態においては、単一ドメイン抗体は、配列番号２９～３６から選択されるヒト化配列のバリアントを含む。本明細書に記載するバリアントは、本明細書で提供するポリペプチドの任意の配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有するポリペプチドを含む。例えば、ヒト化単一ドメイン抗体のバリアントは、配列番号２９～３６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有することとなる。
核酸
核酸
【0092】
一部の実施形態は、ヒト血清アルブミン又はヒト血清アルブミン結合ドメインをコードするヌクレオチド配列に結合していてもよいアルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインをコードする核酸を含む組換えタンパク質をコードする単離された核酸分子を含む。一部の実施形態においては、ヒト血清アルブミン結合ドメインは、抗体を含む。一部の実施形態においては、抗体は、単一ドメイン抗体を含む。
【0093】
一部の実施形態においては、本開示は、配列をコードするアルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインの断片と、配列をコードするヒト血清アルブミン結合ドメイン又はヒト血清アルブミンドメインの断片とを含む核酸分子を特徴とする。一部の実施形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号１のアルファ－１－アンチトリプシンの断片もしくはバリアントを、及び／又は配列番号３もしくは配列番号５もしくは配列番号２２～３６のうちのいずれかの配列をコードするヒト血清アルブミン結合ドメインもしくはヒト血清アルブミンドメインの断片をコードする。
【0094】
一部の実施形態においては、核酸は、以下に記載するようなベクターを含む。
【0095】
ドメイン、ドメインの順序及びリンカー
一部の実施形態においては、本発明の組換えタンパク質は、１つのヒト血清アルブミンドメイン又は１つのヒト血清アルブミン結合ドメインと、１つのアルファ１－アンチトリプシン血清ドメインとを有する。しかしながら、一部の実施形態においては、各タンパク質の複数のドメインを用いて本発明の組換えタンパク質を作製してもよい。同様に、１以上のアルファ－１－アンチトリプシン血清ドメインを用いて、本発明の組換えタンパク質を作製することができる。例えば、アルファ－１－アンチトリプシン血清ドメインは、ヒト血清アルブミンドメイン又はヒト血清アルブミン結合ドメインのＮ－末端の端部及びＣ－末端の端部の両方に融合することができる。
一部の実施形態においては、本発明の組換えタンパク質は、１つのヒト血清アルブミンドメイン又は１つのヒト血清アルブミン結合ドメインと、１つのアルファ１－アンチトリプシン血清ドメインとを有する。しかしながら、一部の実施形態においては、各タンパク質の複数のドメインを用いて本発明の組換えタンパク質を作製してもよい。同様に、１以上のアルファ－１－アンチトリプシン血清ドメインを用いて、本発明の組換えタンパク質を作製することができる。例えば、アルファ－１－アンチトリプシン血清ドメインは、ヒト血清アルブミンドメイン又はヒト血清アルブミン結合ドメインのＮ－末端の端部及びＣ－末端の端部の両方に融合することができる。
【0096】
一部の実施形態においては、組換えタンパク質は、ポリペプチドの融合部分間にリンカーを含有しない（例えば、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインの部分は、ヒト血清アルブミンドメイン及び／又はヒト血清アルブミン結合ドメインの部分に融合する）。一部の実施形態においては、組換えタンパク質は、ポリペプチドの融合部分間にリンカーペプチドを含む。当該リンカーは、ペプチドリンカーであり得る。リンカーが、組換えタンパク質の発現量を向上させ得る。リンカーが、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインの生物学的活性を向上及び／又は増強させ得る。
【0097】
当業者は、本発明に用いることが可能なリンカーは多数存在するということを認識するであろう（例えば、Ｃｈｅｎ ａｔ ａｌ．，Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｒｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｙ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１３ Ｏｃｔｏｂｅｒ １５；６５（１０）：１３５７－１３６９（２０１２）を参照されたく、当該文献はその全体として本明細書に参照により援用する）。一部の実施形態においては、リンカーは、配列番号６３の記載を含む、当該記載からなる、又は実質的に当該記載からなる配列を有するペプチドである。
【0098】
組成物
本開示は、本明細書で記載する組換えタンパク質のいずれかを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、任意の許容可能な医薬製剤の形態をとり得る。医薬組成物は、液体、半固体、及び固体の剤形等の種々の異なる形態、例えば溶液（例えば、注射液及び不溶解性溶液）、分散剤又は懸濁剤、タブレット、錠剤、粉剤、リポソーム、及び座薬等で製剤化することが可能である。好ましい形態は、投与及び治療の適用の意図する形態に左右され得る。
本開示は、本明細書で記載する組換えタンパク質のいずれかを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、任意の許容可能な医薬製剤の形態をとり得る。医薬組成物は、液体、半固体、及び固体の剤形等の種々の異なる形態、例えば溶液（例えば、注射液及び不溶解性溶液）、分散剤又は懸濁剤、タブレット、錠剤、粉剤、リポソーム、及び座薬等で製剤化することが可能である。好ましい形態は、投与及び治療の適用の意図する形態に左右され得る。
【0099】
例示的な医薬組成物を以下に記載する。医薬組成物には、非経口（静脈内、皮下、皮内、筋肉内、及び関節内を含む）、外用（皮膚、経皮、経粘膜、頬側、舌下、及び眼内を含む）、及び直腸内の投与に好適であるものを含むが、最も好適なルートは、例えば、レシピエントの症状及び障害に左右され得る。
【0100】
本明細書に記載する医薬組成物は、例えば非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、及び関節内）で、全身に投与することが可能である。本明細書に記載の医薬組成物は、局所的に施与、例えば医薬組成物を投与することにより治療される症状又は障害が影響を及ぼす領域に施与することが可能である。
【0101】
非経口投与用の組成物には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び組成物を意図するレシピエントの血液と等張にさせる溶質を含有し得る、水系及び非水系の滅菌注射液、ならびに懸濁化剤及び増粘剤を含み得る水系及び非水系の滅菌懸濁液が含まれる。組成物は、例えば密閉されたアンプル及びバイアルである単位用量又は複数回用量の容器中に存在してもよく、そして使用の直前に、例えば生理食塩水又は注射用蒸留水である滅菌液キャリアを加えることだけを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存してもよい。即時の注射液及び懸濁剤は、無菌の粉剤、顆粒剤、及びタブレットから調製され得る。非経口投与用の例示的な組成物としては、例えば好適な無毒の非経口的に許容可能な希釈剤、又は例えばＥＤＴＡ、マンニトール、１，３－ブタンジオール、水、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム溶液等の溶媒、又は他の好適な拡散用もしくは湿潤用の懸濁剤を含有することが可能である注射剤又は懸濁剤が挙げられる。組成物は、ＥＤＴＡ、例えば０．５ｍＭのＥＤＴＡ；ｐＨ調製用及び緩衝用の薬剤、及び／又は、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンラウリン酸モノエステルである等張化剤、例えば湿潤剤又は乳化剤又は防腐剤等の少量の無毒の補助剤、を含むがこれに限定されない、薬理学的に許容可能な物質又はアジュバントを含有し得る。
【0102】
治療
一部の実施形態においては、本開示は、アルファ－１アンチトリプシン欠乏症に関連する障害を治療する方法であって、それを必要とする、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症に関連する障害を有する患者又は対象に、本明細書に提供する有効量の組換えタンパク質又は医薬組成物を投与することを含む方法、を特徴とする。一部の実施形態においては、本開示は、アルファ－１アンチトリプシン欠乏症に関連する障害を予防的に治療する方法であって、それを必要とする、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症に関連する障害を有する患者又は対象に、本明細書に記載する有効量の組換えタンパク質又は医薬組成物を投与することを含む方法、を特徴とする。一部の実施形態においては、組換えタンパク質又は医薬組成物は、それを必要とする患者に、単独で又は別の化合物と併用で投与することができる。
一部の実施形態においては、本開示は、アルファ－１アンチトリプシン欠乏症に関連する障害を治療する方法であって、それを必要とする、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症に関連する障害を有する患者又は対象に、本明細書に提供する有効量の組換えタンパク質又は医薬組成物を投与することを含む方法、を特徴とする。一部の実施形態においては、本開示は、アルファ－１アンチトリプシン欠乏症に関連する障害を予防的に治療する方法であって、それを必要とする、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症に関連する障害を有する患者又は対象に、本明細書に記載する有効量の組換えタンパク質又は医薬組成物を投与することを含む方法、を特徴とする。一部の実施形態においては、組換えタンパク質又は医薬組成物は、それを必要とする患者に、単独で又は別の化合物と併用で投与することができる。
【0103】
一部の実施形態においては、組換えタンパク質又は医薬組成物の投与は、約週１回もしくは約週１回よりも長い間隔で、約１０日毎に１回もしくは約１０日毎に１回よりも長い間隔で、約１５日毎に１回もしくは約１５日毎に１回よりも長い間隔で、約２０日毎に１回もしくは約２０日毎に１回よりも長い間隔で、約２５日毎に１回もしくは約２５日毎に１回よりも長い間隔で、約１月毎に１回もしくは約１月毎に１回よりも長い間隔で、約２月毎に１回もしくは約２月毎に１回よりも長い間隔で、又は約３月毎に１回もしくは約３月ごとに１回よりも長い間隔で、投与する。
【0104】
一部の実施形態においては、対象は、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症と診断されたか、又はアルファ－１－アンチトリプシン欠乏症と診断される危険性がある。一部の実施形態においては、当該アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症が、肝疾患の根拠又は肺疾患の根拠を示している。一部の実施形態においては、当該アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症が、肝疾患又は肺疾患の原因が現れていなかった者で発症する。一部の実施形態においては、肝疾患の根拠又は肺疾患の根拠は、肺気腫、肝不全、肝炎、ヘパトモロジー（ｈｅｐａｔｏｍｏｌｏｇｙ）、黄疸、肝硬変、ネフローゼ症候群、常染色体劣性遺伝、ＣＯＰＤ様症状、呼吸困難、肝トランスアミナーゼ上昇、及び肝細胞癌からなる群から選択された少なくとも１つである。
【0105】
一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症は、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子における欠乏変異が引き起こす。ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子における１２０以上の欠乏変異が同定されているが、本発明による診断法に有用であり得る。一部の欠乏変異は、アルファ－１アンチトリプシンの産生に影響を及ぼさないが、他の欠乏変異は当該タンパク質の不足又は欠乏を引き起こす。一部の実施形態においては、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子における欠乏変異が、配列番号１に従う３４２位のタンパク質においてアミノ酸であるグルタミン酸を、アミノ酸であるリシンで置換させる。
【0106】
異常なアルファ－１アンチトリプシンタンパク質同士が共に結合して、肝臓を出ることができない大きい分子を形成する可能性がある。これら高分子の蓄積がしばしば、結果として肝障害をもたらす。さらに、アルファ－１アンチトリプシンが好中球エラスターゼ又はＰＲ３からの保護に利用するのに十分でないという理由から、肺組織は破壊される。アルファ－１アンチトリプシンの高分子はまた、過度の炎症に寄与し得るが、これは例えば脂肪織炎と呼ばれる皮膚症状等のアルファ－１アンチトリプシン欠乏症の他の特徴の一部を説明することができる。他のＳＥＲＰＩＮＡ１欠乏変異は、肝臓において素早く破壊される異常に小さい形態のアルファ－１アンチトリプシンの産生を招く。その結果、肺で利用できるアルファ－１アンチトリプシンがほぼ無いか全く無くなる。これら欠乏変異をもつ個体では、肝臓は健常なままであるが、肺は好中球エラスターゼ又はＰＲ３から保護されないままである。
【0107】
一部の実施形態においては、欠乏変異は、機能喪失型変異である。一部の実施形態においては、欠乏変異は、結果として停止コドンをもたらす。一部の実施形態においては、欠乏変異は、結果としてアミノ酸置換をもたらす。一部の実施形態においては、欠乏変異は、点変異、挿入、欠失及び／又は置換である。一部の実施形態においては、欠乏変異は、点変異である。一部の実施形態においては、欠乏変異は、欠失である。当該欠失は、１つのみ又は少量の塩基対、複数のエキソン又は遺伝子全体に関与し得る。一部の実施形態においては、欠乏変異は、遺伝子全体の欠失である。一部の実施形態においては、欠乏変異は、部分的な遺伝子の欠失である。一部の実施形態においては、欠乏変異は、結果として、スプライシングに影響を及ぼすイントロンの変化をもたらす。一部の実施形態においては、欠乏変異は、遺伝子の３’－非翻訳領域の変更である。一部の実施形態においては、欠乏変異は、大規模染色体再編（ｇｒｏｓｓ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）である。一部の実施形態においては、欠乏変異は、結果としてＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子産物の切断をもたらす。
【0108】
一部の実施形態においては、対象は、参照標準と比較してアルファ－１－アンチトリプシンタンパク質の発現が異常である。一部の実施形態においては、当該参照標準は、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症に関連する障害を有していない対象におけるアルファ－１－アンチトリプシンタンパク質の発現レベルである。一部の実施形態においては、対象は、参照標準と比較してアルファ－１－アンチトリプシンタンパク質の発現が低下している又は実質的に無い。一部の実施形態においては、当該参照標準は、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症に関連する障害を有していない対象におけるアルファ－１－アンチトリプシンタンパク質の発現レベルである。
【0109】
一部の実施形態においては、アルファ－１－アンチトリプシンセルピンドメインは、通常のアルファ－１－アンチトリプシンドメインの対立遺伝子である（Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｒ．Ｇ．Ｔｈｅ ａｌｐｈａ－１－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｓｔａｔｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．５：４１１－４１７，１９８９．［ＰｕｂＭｅｄ：２６９６１８５］を参照されたく、当該文献は、その全体として本明細書に参照により援用する）。一部の実施形態においては、当該対立遺伝子は、配列番号１に従う２１３位にバリンを含む対立遺伝子と（Ｍ１Ｖ、１０７４００．０００２）、２１３位にアラニンを含む対立遺伝子（Ｍ１Ａ；１０７４００．０００１）である（Ｎｕｋｉｗａ，Ｔ．，Ｂｒａｎｔｌｙ，Ｍ．Ｌ．，Ｏｇｕｓｈｉ，Ｆ．，Ｆｅｌｌｓ，Ｇ．Ａ．，Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｒ．Ｇ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎ ａｌｐｈａ－１－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｎｏｒｍａｌ Ｍ２ ａｌｌｅｌｅ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４３：３２２－３３０，１９８８．［ＰｕｂＭｅｄ：２９０１２２６］を参照されたく、当該文献は本明細書においてその全体として参照により援用する）。一部の実施形態においては、対立遺伝子は、欠乏対立遺伝子又はヌル対立遺伝子である。
【0110】
一部の実施形態においては、対象は、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症と関連する障害をもつと診断されたか、又は当該障害の危険性がある。一部の実施形態においては、対象は、アルファ－１－アンチトリプシンドメインをコードする遺伝子において変異を有する。一部の実施形態においては、変異は、アルファ－１－アンチトリプシンのエキソンのひとつにおける変異である。一部の実施形態においては、変異は、アルファ－１－アンチトリプシンのエキソン１、アルファ－１－アンチトリプシンのエキソン２の５プライムコード領域、又はアルファ－１－アンチトリプシンのエキソン５の３プライム部分にある変異である（Ｌｏｎｇ，Ｇ．Ｌ．，Ｃｈａｎｄｒａ，Ｔ．，Ｗｏｏ，Ｓ．Ｌ．Ｃ．，Ｄａｖｉｅ，Ｅ．Ｗ．，Ｋｕｒａｃｈｉ，Ｋ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ
ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ－１－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓ ｖａｒｉａｎｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３：４８２８－４８３７，１９８４．［ＰｕｂＭｅｄ：６０９３８６７］を参照されたく、当該文献は、本明細書においてその全体として参照により援用する）。
ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ－１－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓ ｖａｒｉａｎｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３：４８２８－４８３７，１９８４．［ＰｕｂＭｅｄ：６０９３８６７］を参照されたく、当該文献は、本明細書においてその全体として参照により援用する）。
【0111】
一部の実施形態においては、組換えタンパク質又は医薬組成物は、静脈内に投与する。一部の実施形態においては、組換えタンパク質又は医薬組成物は、皮内に投与する。一部の実施形態においては、組換えタンパク質又は医薬組成物は、局所的に投与する。一部の実施形態においては、組換えタンパク質又は医薬組成物は、皮下に投与する。一部の実施形態においては、組換えタンパク質又は医薬組成物は、くも膜下腔内に投与する。一部の実施形態においては、組換えタンパク質又は医薬組成物は、くも膜下腔内に投与する。
【0112】
ベクター及び宿主細胞、及びポリペプチドの発現
一部の実施形態においては、核酸はベクターである。一部の実施形態においては、ベクターは宿主細胞を含む。一部の実施形態は、本明細書で提供する核酸のうちの１つと共に宿主細胞を培養することと、組換えタンパク質を回収することとを含む、組換えタンパク質の作製方法に向けられる。一部の実施形態においては、組換えタンパク質は、ｐＨが中性のアルファ－１－アンチトリプシン－Ｆｃ捕捉選択培地を用いて回収する。
一部の実施形態においては、核酸はベクターである。一部の実施形態においては、ベクターは宿主細胞を含む。一部の実施形態は、本明細書で提供する核酸のうちの１つと共に宿主細胞を培養することと、組換えタンパク質を回収することとを含む、組換えタンパク質の作製方法に向けられる。一部の実施形態においては、組換えタンパク質は、ｐＨが中性のアルファ－１－アンチトリプシン－Ｆｃ捕捉選択培地を用いて回収する。
【0113】
本明細書に記載する組換えタンパク質は、例えば任意の好適な宿主細胞からの分泌によって組換え分子として産生することができる。 多数の発現系が公知であり、細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、酵母（例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ及びＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、糸状菌（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属）、植物細胞、動物細胞、及び昆虫細胞、を含めて用いることができる。
【0114】
一部の実施形態においては、宿主細胞は、真核細胞である。一部の実施形態においては、宿主細胞は、哺乳類細胞である。一部の実施形態においては、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ－７細胞、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞及び３Ｔ３細胞からなる群から選択される。一部の実施形態においては、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【0115】
一部の実施形態においては、宿主細胞は、酵母細胞である。本明細書に記載する宿主として用いることが可能である酵母の例示的な属としては、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、酵母菌属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ属、シゾサッカロミケス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ属、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属、Ｍｕｃｏｒ属、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属、Ｍｅｔｓｃｈｕｎｉｋｏｗｉａ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属、Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属、Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ属、Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ属、Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓ属等が挙げられるがこれに限定されない。酵母菌種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ）の例としては、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｉｔａｌｉｃｕｓ及びＳ．ｒｏｕｘｉｉがある。本明細書に記載の融合ポリペプチドの産生に好適な酵母菌株としては、Ｄ８８、ＤＸＹ１及びＢＸＰ１０を挙げることができるがこれに限定されない。
【0116】
また本明細書においては、形質転換した宿主細胞自体に加えて、栄養培地における、それら細胞の培養、好ましくはモノクローナル（クローン的に均一）な培養、又はモノクローナルな培養に由来する培養について記載する。組換えタンパク質が分泌される場合、培地が、細胞とともに、又は細胞がろ過された又は遠心分離で除かれた場合には細胞を伴わずに、組換えタンパク質を含有することとなる。
【0117】
組換えタンパク質は、例えば宿主の染色体内に又は遊離プラスミド上に挿入されたコード配列から、従来のやり方で産生することが可能である。宿主細胞は、例えば電気穿孔法である当技術分野で公知の任意の方法によって、組換えタンパク質のためのコード配列で形質転換される。良好に形質転換された細胞、すなわち本明細書に記載するＤＮＡコンストラクトを含有する細胞は、当業者にとって公知の技術によって同定することが可能である。例えば、発現コンストラクトの導入の結果得られた細胞を増殖させて、組換えタンパク質を産生することが可能である。細胞は回収して、溶解させて、それらのＤＮＡ含量を当技術分野で公知の方法を用いてＤＮＡの存在に対して調べることが可能である。上清中の組換えタンパク質の存在は、当技術分野で公知の任意の方法（例えば、抗体に基づく検出方法）を用いて検出することが可能である。
【0118】
また、本明細書に記載する組換えタンパク質の発現に用いる核酸を含むプラスミドベクターも本明細書において開示する。本明細書に記載する組換えタンパク質を発現するために、適切な組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列又は機能的に同等のものを、好適なベクター内に挿入することが可能である。好適なベクターは、挿入された核酸配列の発現にとって必要かつ適切な転写制御配列及び翻訳制御配列を含有する。当業者に公知である標準的な方法を用いて、本明細書に記載の核酸配列を含有する組換え発現ベクターを構築してもよい。これら方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏの組換え技術、合成技術、及びｉｎ ｖｉｖｏの組換え／遺伝子組換えが挙げられるがこれに限定されず、方法の選択は、特定のヌクレオチド断片の性質に依存するものであり、当業者が決定してよい。
【0119】
本明細書で用いるために好適なベクターは、複製の源及び制限エンドヌクレアーゼ配列部位を含有してもよい。当業者は、宿主細胞において用いるための好適な複製の源及び制限エンドヌクレアーゼ配列についての知識を有するであろう。本明細書で用いるために好適なベクターは、プロモーター要素及びエンハンサー要素を含むがこれに限定されない、転写を支援する配列要素を含有してもよい。当業者は、宿主細胞において好適となるであろう、プロモーター、誘導性プロモーター、及びエンハンサー要素を含むがこれに限定されない、様々な転写制御要素の知識を有するであろう。
【0120】
本明細書で用いるための好適なベクターはまた、特定の条件下で増殖及び生存する宿主細胞に必要な産物をコードする選択的マーカー遺伝子であって、その中にベクターが導入されている宿主細胞の選択を支援する、選択的マーカー遺伝子を含有し得る。典型的な選択遺伝子は、抗生剤、薬剤又は毒（例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、ネオマイシン、ハイグロマイシン等）に対する抵抗性を与えるタンパク質をコードする遺伝子を含み得るがこれに限定されない。当業者は、宿主細胞において用いるための好適な選択的マーカー及びレポーター遺伝子のためのコード配列についての知識を有するであろう。
【0121】
本明細書に記載する発現ベクターは、従来の形質転換又はトランスフェクションの技術を経て宿主細胞に導入することが可能である。形質転換及びトランスフェクションの技術としては、リン酸カルシウム又は塩化カルシウムの共沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラン介在性のトランスフェクション、リポフェクタミン、電気穿孔法、微量注入法及びウイルス介在性のトランスフェクションが挙げられるがこれに限定されない（米国特許第６，６３２，６３７号を参照されたいが、これはその全体として本明細書において参照により援用する）。当業者は、宿主細胞／ベクターの組み合わせに基づく好適な形質転換及びトランスフェクションの方法についての知識を有するであろう。長期間にわたる、高産生量の組換えタンパク質、当該組換えタンパク質の安定した発現が好ましいものであり得る。組換えタンパク質を安定的に発現する宿主細胞は、設計することができる。酵母プラスミドベクターとしては、ｐＲＳ４０３～４０６、ｐＲＳ４１３～４１６、ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６、ｐＲＳ４１３～４１６、ｐＰＰＣ０００５、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、及びｐＣ４を含むことが可能であるがこれに限定されない。
【0122】
別の実施形態においては、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞型において優先的にポリペプチドの発現を司ることが可能である（例えば、組織特異的な制御因子を用いてＩ、ポリペプチドを発現する）。組織特異的制御因子は、当技術分野で公知である。好適な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８－２７７）、リンパ特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５－２７５）、Ｔ細胞プロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９－７３３）及び免疫グロブリンプロモーター（Ｂａｎｅｒｊｉ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：７２９－７４０及びＱｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：７４１－７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３－５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２－９１６）、及び乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号及び欧州特許出願第２６４，１６６号）が挙げられる。発達的に制御されるプロモーターもまた包含され、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４－３７９）及びアルファ－フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ３：５３７－５４６）である。上記に特定した参考文献はそれぞれ、いずれの図面も含めて、それら全体として参照により援用する。
【0123】
本明細書に記載する組換えタンパク質は、硫酸アンモニウム又はエタノール沈降、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性の電荷相互作用クロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーを含む、周知の方法によって組換え細胞培養液から回収及び精製することが可能である。一部の実施形態においては、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を精製に用いる。本明細書に記載する組換え及び分子生物学的な方法によって産生及び回収されたポリペプチドは、当技術分野で公知の標準プロトコールに従って精製され得る（例えば、透析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ＳＤＳゲル電気泳動等）。本明細書に記載するポリペプチド及び／又は融合ポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、又はゲルろ過によって均一に精製され得る。組換え産生手順に用いる宿主に応じて、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、又は非グリコシル化され得る。一部の実施形態においては、組換えタンパク質は、ｐＨが中性のアルファ－１－アンチトリプシン－Ｆｃ捕捉選択培地により精製することとなる。
【0124】
一部の実施形態においては、本明細書に記載する組換えタンパク質をコードする核酸は、酵母における発現に最適である。本明細書に記載する融合ポリペプチドを発現するための宿主として用いることが可能である酵母の例示的な属としては、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、酵母菌属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ属、シゾサッカロミケス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ属、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属、Ｍｕｃｏｒ属、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属、Ｍｅｔｓｃｈｕｎｉｋｏｗｉａ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属、Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属、Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ属、Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ属、Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓ属等が挙げられるがこれに限定されない。本明細書に記載の融合ポリペプチドの産生に好適な酵母菌株としては、Ｄ８８、ＤＸＹ１及びＢＸＰ１０を挙げることができるがこれに限定されない。酵母プラスミドベクターとしては、ｐＲＳ４０３～４０６、ｐＲＳ４１３～４１６、ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６、ｐＲＳ４１３～４１６、ｐＰＰＣ０００５、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、及びｐＣ４を含むことが可能であるがこれに限定されない。酵母における発現のためのアルブミン融合タンパク質を作製するベクターには、ｐＰＰＣ０００５、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、及びｐＣ４：ＨＳＡが含まれる。
【0125】
一部の実施形態においては、本明細書に記載する組換えタンパク質をコードする核酸は、酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）において発現する。酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の好ましい例示的な種には、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｉｔａｌｉｃｕｓ、Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、及びＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉが含まれる。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属の好ましい例示的な種には、Ｋ ｆｒａｇｉｌｉｓ及びＫ ｌａｃｔｉｓが含まれる。ハンヌゼラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）の好ましい例示的な種には、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（現在はＰｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）、Ｈ．ａｎｏｍａｌａ（現在はＰｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ）及びＰｉｃｈｉａ
ｃａｐｓｕｌａｔａが含まれる。
ｃａｐｓｕｌａｔａが含まれる。
【0126】
発現のために、他の有機体を用いてもよい。ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）のさらなる例示的な種には、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓが含まれる。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の例示的な種には、Ａ．ｎｉｇｅｒ及びＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓが含まれる。Ｙａｒｒｏｗｉａ属の好ましい例示的な種は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが含まれる。ＡＴＣＣ（登録商標）（アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より、多数の好ましい酵母種が利用可能である。
【0127】
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【表2-4】
【表2-5】
【表2-6】
【表2-7】
【表2-8】
【表2-9】
【表2-10】
【表2-11】
【表2-12】
【表2-13】
【表2-14】
【表2-15】
【実施例0128】
実施例１：ＡＡＴ－アルブミンの構築
野生型のアルファ－１－アンチトリプシン（アルファ－１－アンチトリプシン、配列番号１）と４つのバリアント（Ｃ２３２Ｓ、配列番号６４；Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｖ、配列番号６５；Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ、配列番号６６；Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ、配列番号６７）とを、長いグリシン－セリンリンカー（ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号６３））を介してヒト血清アルブミンのＮ－末端に融合した。ヒトＡＡＴをコードする遺伝子を、ヒト肝臓ｃＤＮＡ（Ｚｙａｇｅｎ社）よりＰＣＲ増幅させることが可能である。ＡＡＴ遺伝子内の特異的な点変異は、重複ＰＣＲによって生成する（例えば、Ｈｉｇｕｃｈｉ Ｒ，Ｋｒｕｍｍｅｌ Ｂ，Ｓａｉｋｉ Ｒ（１９８８）“Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ：ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６（１５）：７３５１－６７を参照されたく、当該文献は、いずれの図面も含めて、その全体として本明細書において参照により援用する）。アルファ－１－アンチトリプシン遺伝子は、アルファ－１－アンチトリプシン遺伝子挿入部位の上流の哺乳類の分泌シグナル配列を含有する哺乳類発現ベクターに、ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子及びリンカーを用いてフレーム内においてクローンニングする。
野生型のアルファ－１－アンチトリプシン（アルファ－１－アンチトリプシン、配列番号１）と４つのバリアント（Ｃ２３２Ｓ、配列番号６４；Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｖ、配列番号６５；Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ、配列番号６６；Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ、配列番号６７）とを、長いグリシン－セリンリンカー（ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号６３））を介してヒト血清アルブミンのＮ－末端に融合した。ヒトＡＡＴをコードする遺伝子を、ヒト肝臓ｃＤＮＡ（Ｚｙａｇｅｎ社）よりＰＣＲ増幅させることが可能である。ＡＡＴ遺伝子内の特異的な点変異は、重複ＰＣＲによって生成する（例えば、Ｈｉｇｕｃｈｉ Ｒ，Ｋｒｕｍｍｅｌ Ｂ，Ｓａｉｋｉ Ｒ（１９８８）“Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ：ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６（１５）：７３５１－６７を参照されたく、当該文献は、いずれの図面も含めて、その全体として本明細書において参照により援用する）。アルファ－１－アンチトリプシン遺伝子は、アルファ－１－アンチトリプシン遺伝子挿入部位の上流の哺乳類の分泌シグナル配列を含有する哺乳類発現ベクターに、ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子及びリンカーを用いてフレーム内においてクローンニングする。
【0129】
最初のＡＡＴバリアントは、それらがシステイン酸化及び／又はメチオニン酸化のいずれかに抵抗性があることを理由に選択される。メチオニン酸化は、ヒト好中球エラスターゼに対するＡＡＴ阻害活性を低下させることがわかっている。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内で発現したら、ＡＡＴヒト血清アルブミン（野生型（ＷＴ）又はバリアント、配列番号１～５）はそれぞれ、抗ＡＡＴ樹脂（ＧＥ社）を用いて精製して、ヒト好中球エラスターゼ（ｈＮＥ）の阻害に関して試験する。ＡＡＴヒト血清アルブミン（野生型（ＷＴ）又はバリアント、配列番号１～５）はまたそれぞれ、動的光散乱法（ＤＬＳ）及び動的スキャン蛍光分析法（ｄｙｎａｍｉｃ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ）（ＤＳＦ）の機器（ＵＮｃｌｅ、Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ社）を用いて、タンパク質全体の安定性を試験する。
【0130】
ＡＡＴタンパク質全体の安定性は、ＡＡＴの自己重合に対する抵抗性と関連があることがわかっている。このデータを用いて、少なくとも１つの追加的な変異（上記表１を参照）によるさらなる変異誘発性のために、ＡＡＴ－ヒト血清アルブミンを選択する。これら変異は、ＡＡＴ安定性をさらに増大させて自己重合を防止することがわかっている。ＡＡＴヒト血清アルブミンバリアントはそれぞれ、ＣＨＯで発現し、精製し、そしてｈＮＥ阻害及びタンパク質安定性について試験する。
【0131】
複数の変異を共に組み合わせることによって、ｈＮＥ阻害ほとんど又は全く失わずに、予期されない相乗的な安定性の増加が観察された。
【0132】
各遺伝子配列を、専売の高発現哺乳類ベクターにクローンニングした。完成したコンストラクトはそれぞれ、ＤＮＡのスケールアップに進める前に配列確認した。ＤＮＡ発現コンストラクトはそれぞれ、トランスフェクションに適切な量までスケールアップした。プラスミドＤＮＡを、品質評価のためにアガロースゲルにかけて、そしてトランスフェクションに進める前に配列を確認した。
【0133】
実施例２：ＡＡＴアルブミン結合ドメインの構築
好ましいＡＡＴドメインを、実施例１に記載するようなヒト血清アルブミンの代わりに、アルブミン結合単一ドメイン抗体に融合する。例えば、それぞれの配列である配列番号２２～３６のいずれかを有する単一ドメイン抗体を、実施例１に提供するようなＡＡＴに融合する。ＡＡＴアルブミン結合ドメインバリアントは、ＣＨＯにおいて発現し、精製し、そして実施例１に記載するようにｈＮＥ阻害及びタンパク質安定性について試験する。
好ましいＡＡＴドメインを、実施例１に記載するようなヒト血清アルブミンの代わりに、アルブミン結合単一ドメイン抗体に融合する。例えば、それぞれの配列である配列番号２２～３６のいずれかを有する単一ドメイン抗体を、実施例１に提供するようなＡＡＴに融合する。ＡＡＴアルブミン結合ドメインバリアントは、ＣＨＯにおいて発現し、精製し、そして実施例１に記載するようにｈＮＥ阻害及びタンパク質安定性について試験する。
【0134】
各遺伝子配列を、専売の高発現哺乳類ベクターにクローンニングした。完成したコンストラクトはそれぞれ、ＤＮＡのスケールアップに進める前に配列確認した。ＤＮＡ発現コンストラクトはそれぞれ、トランスフェクションに適切な量までスケールアップした。プラスミドＤＮＡを、品質評価のためにアガロースゲルにかけて、そしてトランスフェクションに進める前に配列を確認した。
【0135】
実施例３：ＣＨＯ一過性トランスフェクション
懸濁ＣＨＯ細胞を振とうフラスコに播種し、血清を含まない化学的に確認された培地を用いて増殖させた。増殖した細胞は、トランスフェクションの日に、新しい培地を含む新しいフラスコに播種した。各ＤＮＡコンストラクトを、ＣＨＯ細胞内に一過性的にトランスフェクションした。産生操作の終了まで、細胞は、流加培養液（Ｃ１６０３及びＣ１６０４、Ｍｅｄｎａ社）で維持した。
懸濁ＣＨＯ細胞を振とうフラスコに播種し、血清を含まない化学的に確認された培地を用いて増殖させた。増殖した細胞は、トランスフェクションの日に、新しい培地を含む新しいフラスコに播種した。各ＤＮＡコンストラクトを、ＣＨＯ細胞内に一過性的にトランスフェクションした。産生操作の終了まで、細胞は、流加培養液（Ｃ１６０３及びＣ１６０４、Ｍｅｄｎａ社）で維持した。
【0136】
【表3】
【0137】
【表4-1】
【表4-2】
【0138】
実施例４：ＣＨＯアルブミンのアフィニティ精製
一過性的産生操作よりの馴化培地を回収して、遠心分離及びろ過により精製した。アルファ－１アンチトリプシン選択樹脂を充填してＰＢＳ、ｐＨ７．４で予め平衡化したカラムに、上清をロードした。カラムをＰＢＳで洗浄して、ＯＤ２８０（ＮａｎｏＤｒｏｐ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社で測定）がゼロ周辺に低下するまで、不純物を除去した。標的タンパク質を、高塩濃度溶出緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、２ＭのＭｇＣ１２、ｐＨ７．４）で溶出して、フラクションを回収して、ＯＤ２８０を測定して記録した。標的タンパク質を含有するフラクションを貯留し、最終緩衝液からＰＢＳ、ｐＨ７．４へ透析した。最終産物を、０．２μｍ膜フィルターでろ過した。緩衝液交換後に、タンパク質濃度及び最終収量をＯＤ２８０値から計算し、吸光係数（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を計算した。
一過性的産生操作よりの馴化培地を回収して、遠心分離及びろ過により精製した。アルファ－１アンチトリプシン選択樹脂を充填してＰＢＳ、ｐＨ７．４で予め平衡化したカラムに、上清をロードした。カラムをＰＢＳで洗浄して、ＯＤ２８０（ＮａｎｏＤｒｏｐ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社で測定）がゼロ周辺に低下するまで、不純物を除去した。標的タンパク質を、高塩濃度溶出緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、２ＭのＭｇＣ１２、ｐＨ７．４）で溶出して、フラクションを回収して、ＯＤ２８０を測定して記録した。標的タンパク質を含有するフラクションを貯留し、最終緩衝液からＰＢＳ、ｐＨ７．４へ透析した。最終産物を、０．２μｍ膜フィルターでろ過した。緩衝液交換後に、タンパク質濃度及び最終収量をＯＤ２８０値から計算し、吸光係数（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を計算した。
【0139】
ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎｓ Ｅｌｍｅｒ社）を用いて、標的タンパク質のＣＥ－ＳＤＳ解析を行った。
【0140】
【0141】
実施例５：安定性解析
解析のために、試料をＵＮｃｌｅシステム（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ社）にかけた。動的光散乱（「ＤＳＦ」）及び静的光散乱（「ＳＬＳ」）のために、２５℃から９５℃まで観察しながら１℃／ｍｉｎでの温度傾斜（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒａｍｐ）を実施した。ＵＮｃｌｅで、２６６ｎｍ及び４７３ｎｍでのＳＬＳを測定した。ＤＬＳは、温度傾斜の開始時点で測定した。ＵＮｃｌｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いて、Ｔｍ、Ｔａｇｇ、及びＤＬＳの測定値を計算して分析した。測定したＴｍは、ＤＳＦグラフにおいて実線のドロップラインで示される。
解析のために、試料をＵＮｃｌｅシステム（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ社）にかけた。動的光散乱（「ＤＳＦ」）及び静的光散乱（「ＳＬＳ」）のために、２５℃から９５℃まで観察しながら１℃／ｍｉｎでの温度傾斜（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒａｍｐ）を実施した。ＵＮｃｌｅで、２６６ｎｍ及び４７３ｎｍでのＳＬＳを測定した。ＤＬＳは、温度傾斜の開始時点で測定した。ＵＮｃｌｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いて、Ｔｍ、Ｔａｇｇ、及びＤＬＳの測定値を計算して分析した。測定したＴｍは、ＤＳＦグラフにおいて実線のドロップラインで示される。
【0142】
【0143】
実施例６：ｈＮＡ解析
Ａｂｃａｍ社よりのスクリーニングキット（カタログ番号ａｂ１１８９７１）を用いて、好中球エラスターゼ阻害アッセイを実施した。結果を図６に示している。
Ａｂｃａｍ社よりのスクリーニングキット（カタログ番号ａｂ１１８９７１）を用いて、好中球エラスターゼ阻害アッセイを実施した。結果を図６に示している。
【0144】
実施例７：ＩＣ５０
ＡＡＴ変異体のＩＣ５０解析もまた、Ａｂｃａｍ社よりのスクリーニングキット（カタログ番号ａｂ１１８９７１）を用いて実施した。ＩＣ５０解析のために用いる濃度範囲を４００ｎＭ～９８ｐＭとし、また２つのデュプリケートより得たデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて解析した。
ＡＡＴ変異体のＩＣ５０解析もまた、Ａｂｃａｍ社よりのスクリーニングキット（カタログ番号ａｂ１１８９７１）を用いて実施した。ＩＣ５０解析のために用いる濃度範囲を４００ｎＭ～９８ｐＭとし、また２つのデュプリケートより得たデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて解析した。
【0145】
【表5】
【0146】
２１種のＡＡＴ変異体タンパク質及び１種のＡＡＴ血清対照をまた用いて、ＩＣ５０解析曲線を生成した。表５は、変異体ＡＡＴに関するＩＣ５０を示している。
【0147】
【表6】
【0148】
図９は、ＡＡＴ変異体のＩＣ５０解析を示しており、ｘ軸はＡＡＴタンパク質のｌｏｇ濃度（ｎＭ）を示しており、ｙ軸は阻害率を示している。より高い傾斜を有する曲線は、非常に協働的な阻害特性を示す。変異体Ｇ１１Ｆ／Ｋ３３５Ａ、Ｇ１１７Ｆ／Ｋ３３１Ｆ、Ｆ５１Ｌ／Ｋ３３１Ｆ及びＫ３３１Ｆ／Ｋ３３５Ａは全て、非常に協働的な阻害特性を有する。
【0149】
実施例８：インシリコ免疫原性
専売のスクリーンを用いて、タンパク質を、臨床で既に使用されているものと比較した（Ｊａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｔ－ｃｅｌｌ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ
ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ，１４９ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５３４－５５５（２０１３）を参照されたく、当該文献は、いずれの図面も含めて、その全体として本明細書に参照により援用する）。推定されるＴ細胞エピトープの存在に関して、ＡＡＴアルブミン融合体（「ＡＡＴ＿ＭＬＡ」）、ＡＡＴ変異体（「ＡＡＴ＿Ｍｕｔａｎｔ」）及びアルブミンタンパク質（「Ａｌｂｕｍｉｎ」）をスクリーニングした。ＡＡＴ変異体は、配列番号１に以下の変異を有する：Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ、Ｋ３３５Ａ、Ｓ２８３Ｃ、及びＰ３６１Ｃ。各Ｔ細胞エピトープ又はＡＡＴ－アルブミン融合体、ＡＡＴ変異体及びアルブミンタンパク質の免疫原性を互いに比較して、正規化して、順位付けした。
専売のスクリーンを用いて、タンパク質を、臨床で既に使用されているものと比較した（Ｊａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｔ－ｃｅｌｌ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ
ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ，１４９ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５３４－５５５（２０１３）を参照されたく、当該文献は、いずれの図面も含めて、その全体として本明細書に参照により援用する）。推定されるＴ細胞エピトープの存在に関して、ＡＡＴアルブミン融合体（「ＡＡＴ＿ＭＬＡ」）、ＡＡＴ変異体（「ＡＡＴ＿Ｍｕｔａｎｔ」）及びアルブミンタンパク質（「Ａｌｂｕｍｉｎ」）をスクリーニングした。ＡＡＴ変異体は、配列番号１に以下の変異を有する：Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５８Ｌ、Ｋ３３５Ａ、Ｓ２８３Ｃ、及びＰ３６１Ｃ。各Ｔ細胞エピトープ又はＡＡＴ－アルブミン融合体、ＡＡＴ変異体及びアルブミンタンパク質の免疫原性を互いに比較して、正規化して、順位付けした。
【0150】
入力した配列を、重複する９－ｍｅｒフレームに分解して、各フレームを、８つの共通のＩＩ型ＨＬＡ対立遺伝子のパネルに対して評価した。当該対立遺伝子は、上位型と呼ぶ。各上位型は、多数のさらなるファミリーメンバーの対立遺伝子に対して、機能的に同等であるか又はほぼ同等である。まとめると、８つの上位型の対立遺伝子は、それらそれぞれのファミリーメンバーと共に、ヒト母集団の９５％を良好にカバーする。フレーム対対立遺伝子での各評価は、予測されるＨＬＡ結合親和性についての記載となる。
【0151】
評価のスコアは、およそ－３から＋３までの範囲にわたる。１．６４より高い評価スコアを「ヒット」として規定して、免疫原性の可能性があり、さらに検討する価値があるものとみなした。しばしば、全ての評価の約５％が、１．６４より高いスコアであることを期待することが可能である。これらペプチドは、ＨＬＡ分子を中程度から高い親和性で結合する有意な機会を有しているため、樹状細胞又はマクロファージ等のＡＰＣであって、通過するＴ細胞によって照合され得る当該ＡＰＣの表面上に存在するという有意な機会を有する。所与のタンパク質が含有するＨＬＡリガンドの量（すなわち、ヒット）が大きいほど、タンパク質が免疫応答を誘発する可能性が高くなる。
【0152】
ＥｐｉＭａｔｒｉｘタンパク質スコアは、所与のサイズのタンパク質において発見することを期待することができる推定されるＴ細胞エピトープの数と、ＥｐｉＭａｔｒｉｘシステムで予測される推定上のエピトープの数との間の差異である。ＥｐｉＭａｔｒｉｘタンパク質スコアは「正規化」されて、また標準化されたスケール上にプロットすることができる（例えば、図１０を参照）。「平均」のタンパク質のＥｐｉＭａｔｒｉｘタンパク質スコアは、ゼロである。ゼロを超えるＥｐｉＭａｔｒｉｘタンパク質スコアは、過剰なＭＨＣリガンドの存在を示唆し、また免疫原性の可能性がより高いことを示す一方で、ゼロより低いスコアは期待されるよりも潜在的なＭＨＣリガンドの存在が少ないこと、及び免疫原性の可能性がより低いことを示唆する。
【0153】
完全なＡＡＴ＿ＭＬＡ配列の解析において、アルゴリズムで、合計７，８８０のフレーム対対立遺伝子評価を実施した。ＡＡＴ＿ＭＵＴＡＮＴドメインの解析において、アルゴリズムで、合計３，０８８のフレーム対対立遺伝子評価を実施した。ＡＬＢＵＭＩＮドメインの解析において、アルゴリズムで、合計４，６１６のフレーム対対立遺伝子評価を実施した。この結果は、表６に示している。変異体ＡＡＴは、野生型ＡＡＴと比較して、わずかに高い免疫原性スコアを示す。高スコアのＡＡＴ＿ＭＵＴＡＮＴドメインの、低スコアのグリシン－セリンリンカー及び低スコアのＡＬＢＵＭＩＮドメインとの融合は、ＡＡＴ＿ＭＬＡ融合体のエピトープ全体の密度を低下させる。ＡＡＴは、アルブミンと融合する場合（ＡＡＴ＿ＭＬＡ）、マイナスのスコアを有し、これは野生型又はＡＡＴ単独の変異体と比較して、免疫原性が低いことを示唆する。
【0154】
【表7-1】
【表7-2】
【0155】
完全融合配列ＡＡＴ＿ＭＬＡにおいて、ペプチド対ＨＬＡの３８４ヒットが確認されたが、これは結果として全体スコアが－１０．７２となった。完全融合配列ＡＡＴ＿ＭＵＴＡＮＴにおいては、２０６ヒットが確認されたが、これは結果として全体スコアが２６．８７となった。完全融合配列ＡＡＴ＿ＷＴにおいては、２０２ヒットが確認されたが、これは結果として全体スコアが２１．０１となった。完全融合配列ＡＡＴ＿ＭＬＡにおいては、１７８ヒットが確認されたが、これは結果として全体スコアが－３２．０４となった。この結果を図１０に示している。
【0156】
実施例９：ベース（Ｃ２３２Ｓ、Ｍ３５１Ｖ、Ｍ３５１Ｌ）でのＡＡＴバリアント（Ｋ３３５Ａ、Ｓ２８３Ｃ／Ｐ３６１Ｃ）の安定性解析
解析のために、試料をＵＮｃｌｅ（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ社）にかけた。ＤＳＦ及びＳＬＳのために、１℃／ｍｉの温度範囲を、２５℃から９５℃までで観察しながら実施した。ＵＮｃｌｅで、２６６ｎｍ及び４７３ｎｍでのＳＬＳを測定した。ＤＬＳは、温度傾斜の開始時点で測定した。ＵＮｃｌｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いて、Ｔｍ、Ｔａｇｇ、及びＤＬＳの測定値を計算して分析した。Ｔｍは、図１１の実線のドロップラインで表すように測定された。確認できるように、バリアントＡＡＴアルブミン融合体は、非常に安定である。
解析のために、試料をＵＮｃｌｅ（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ社）にかけた。ＤＳＦ及びＳＬＳのために、１℃／ｍｉの温度範囲を、２５℃から９５℃までで観察しながら実施した。ＵＮｃｌｅで、２６６ｎｍ及び４７３ｎｍでのＳＬＳを測定した。ＤＬＳは、温度傾斜の開始時点で測定した。ＵＮｃｌｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いて、Ｔｍ、Ｔａｇｇ、及びＤＬＳの測定値を計算して分析した。Ｔｍは、図１１の実線のドロップラインで表すように測定された。確認できるように、バリアントＡＡＴアルブミン融合体は、非常に安定である。
【0157】
実施例１０：Ｃｙｎｏ ＰＫ
カニクイザルに静脈内ボーラス注入で１度に与えた場合の、ヒト血清アルブミンに融合した組換えアルファ－１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）Ｋ３３５Ａ／Ｓ２８３Ｃ／Ｐ３６１Ｃ（ＡＡＴアルブミン融合体）の潜在毒性を求めた。カニクイザルは、規制当局により前臨床毒性試験で許可された非げっ歯類の種であり、またヒト対象において予測される試験薬剤の薬物動態及び薬理学を最も正確に反映することから、この試験のために動物モデルとして選択された。ヒト血漿由来のＡＡＴ（Ｐｒｏｌａｓｔｉｎ Ｃ）と比較した、ＡＡＴアルブミン融合体の薬物動態特性もまた求めた。
カニクイザルに静脈内ボーラス注入で１度に与えた場合の、ヒト血清アルブミンに融合した組換えアルファ－１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）Ｋ３３５Ａ／Ｓ２８３Ｃ／Ｐ３６１Ｃ（ＡＡＴアルブミン融合体）の潜在毒性を求めた。カニクイザルは、規制当局により前臨床毒性試験で許可された非げっ歯類の種であり、またヒト対象において予測される試験薬剤の薬物動態及び薬理学を最も正確に反映することから、この試験のために動物モデルとして選択された。ヒト血漿由来のＡＡＴ（Ｐｒｏｌａｓｔｉｎ Ｃ）と比較した、ＡＡＴアルブミン融合体の薬物動態特性もまた求めた。
【0158】
表７に、被験物質及び対照物質を示す。
【0159】
【表8】
【0160】
被験物質の希釈には、対照物質を用いた。被験物質のストック（７．８ｍｇ／ｍＬ）を、対照物質での４倍以下の段階希釈で希釈することによって、被験物質の２ｍｇ／ｍＬの用量製剤を調製して、用量レベルの要件を満たした。用量レベルは、これまでに発行されている研究に基づいて選択した（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ（２０１３）１０（６）：６８７－９５；Ｌａｎｃｅｔ（２０１５）３８６（９９９１）：３６０－８）。ヒト血漿由来のアルファ－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）の静脈内（ＩＶ）注射での毎週６０ｍｇ／ｋｇでの療法は、アルファ－１アンチトリプシン欠乏症を罹患した個体で承認されている。１２０ｍｇ／ｋｇ用量のＡＡＴの毎週の注射についての安全性及び薬物動態プロファイルは、ＡＡＴＤを罹患した成人において、安全でありまた良好に忍容であると考えられた。
【0161】
動物はランダム化して、試験に移行する前にコンピュータに基づく手順により複数のグループに割り当てた。用いた実験設計を表８に示す。
【0162】
【表9】
【0163】
被験物質を、１日目に１回、静脈内（遅いボーラス）注射で動物に投与した。動物毎の用量は、直近の体重測定値に基づいた。用量投与のために動物を一時的に拘束したが、鎮静させなかった。
【0164】
静脈穿刺により血液を採取した。試料は、表９に従って採取した。
【0165】
【表10】
【0166】
採血は、１ｍＬの目標体積及びカリウム（Ｋ３）ＥＤＴＡの抗凝固剤で実施した。各血液試料から血液塗抹標本を調製した。塗抹標本を調べて、以下の動物の健康状態を評価した。非健常な動物は認められなかった。
【0167】
２ｍＬの目標体積で、抗凝固剤なしで、臨床化学を実施した。
【0168】
試料は、表１０に従って採取した。
【0169】
【表11-1】
【表11-2】
【0170】
被験物質の濃度のために試料からの血漿を解析し、気管支肺胞洗浄試料を麻酔した動物から採取して、解析した（データは示さず）。
【0171】
血漿の結果を図１２に示しており、またグラフパッドプリズム（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ）で２相の指数関数減衰モデルに当てはめた。図１２より確認できるように、バリアントは、有意に長い消失相半減期を有する。ＡＡＴ－ＨＳＡバリアント（被験物質１）の半減期（ベータ相、遅い）は、Ｐｒｏｌａｓｔｉｎ（血漿ＡＡＴ）がより少ない１０時間であるのと比較して３０時間を超えていた。
【0172】
血漿の結果は、３コンパートメントモデル（表１１～１３）でさらに解析し、図１３にも示している。図１３は、個別の測定値（シンボル）を伴う、シミューレションによる１０００のＰＫプロファイルからの中央値（線）、第５及び第９５のパーセンタイル（領域）を示す。定量限界（ＢＬＱ、×印）を下回る測定値については、解析に含めなかった。
【0173】
上記より確認できるように、１０ｍｇ／ｋｇ以後のサルのＰＫは３コンパートメントであった。１０ｍｇ／ｋｇの化合物に関して、被験物質２のＣｍａｘは、被験物質１のＣｍａｘよりも約４０倍高かった。中央分布容積は、被験物質２で０．２１３Ｌ、被験物質１で８Ｌであった。合計の分布容積は、被験物質２で１．４５Ｌ、被験物質１で４２Ｌであった。ヒトにおけるＡｒａｌａｓｔ（血漿由来のＡＡＴ）の分布容積は５．６Ｌであった［ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ０００５８］。ＮＨＰに対する非比例的スケーリング（ａｌｌｏｍｅｔｒｉｃ ｓｃａｌｉｎｇ）より、分布容積は０．２４０Ｌと予測することができるが、これはこの試験よりの被験物質２と同等である。
【0174】
サルにおけるＨＳＡの消失相半減期は、約５日である。被験物質１のβ半減期及びγ半減期は、それぞれ、０．７５日及び５．８日であった。被験物質２のβ半減期及びγ半減期は、それぞれ、０．３６日及び１．４９日であった。被験物質２のγ半減期は、被験物質１のγ半減期よりも約３．９倍長い。ＨＳＡのγ消失相半減期（文献より）と被験物質１のγ消失相半減期は、サルでは同等である。
【0175】
表１１は、被験物質２及び被験物質１のＰＫパラメータを示している。
【0176】
【表12-1】
【表12-2】
【0177】
表１２は、被験物質２の母集団ＰＫパラメータを示す：
【0178】
【表13】
【0179】
表１３は、被験物質１の母集団ＰＫパラメータを示す：
【0180】
【表14-1】
【表14-2】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図4G】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図7F】
【図7G】
【図7H】
【図7I】
【図7J】
【図7K】
【図7L】
【図7M】
【図7N】
【図7O】
【図7P】
【図7Q】
【図7R】
【図7S】
【図7T】
【図7U】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】
【外国語明細書】