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▶ イースト チャイナ ユニバーシティ オブ サイエンス アンド テクノロジーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024123239
(43)【公開日】2024-09-10
(54)【発明の名称】新規のＲＮＡ検出と定量の方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/115 20100101AFI20240903BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20240903BHJP
【ＦＩ】
C12N15/115 Z ZNA
C12M1/34 Z
C12N15/115 Z
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024103271
(22)【出願日】2024-06-26
(62)【分割の表示】P 2022557982の分割
【原出願日】2021-03-29
(71)【出願人】
【識別番号】514061441
【氏名又は名称】イースト チャイナ ユニバーシティ オブ サイエンス アンド テクノロジー
(74)【代理人】
【識別番号】100166729
【弁理士】
【氏名又は名称】武田 幸子
(72)【発明者】
【氏名】ヤン イー
(72)【発明者】
【氏名】チェン シャンジュン
(72)【発明者】
【氏名】シエ シン
(72)【発明者】
【氏名】スー ニー
(57)【要約】 （修正有）
【課題】生細胞におけるＲＮＡ／ＤＮＡのリアルタイム標識に効果的に使用できる核酸アプタマー分子を提供する。
【解決手段】本発明は、核酸アプタマー分子、該アプタマーとフルオロフォア小分子とを含む複合体、該核酸アプタマー分子による細胞内又は細胞外のＲＮＡ、ＤＮＡ又は他の標的分子の検出方法、及び該アプタマーを含むキットを提供する。本発明のアプタマーは、一種のフルオロフォア小分子と特異的に結合して、かつその適切な波長の光で励起された場合の蛍光強度を著しく向上させることができる。
【選択図】図１
【解決手段】本発明は、核酸アプタマー分子、該アプタマーとフルオロフォア小分子とを含む複合体、該核酸アプタマー分子による細胞内又は細胞外のＲＮＡ、ＤＮＡ又は他の標的分子の検出方法、及び該アプタマーを含むキットを提供する。本発明のアプタマーは、一種のフルオロフォア小分子と特異的に結合して、かつその適切な波長の光で励起された場合の蛍光強度を著しく向上させることができる。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヌクレオチド配列（ａ）、ヌクレオチド配列（ｂ）、又はヌクレオチド配列（ｃ）を含む核酸アプタマー分子であって、
前記ヌクレオチド配列（ａ）は、Ｎ１ＡＧＡＵＵＧＵＡＡＡＣＡＮ１４－Ｎ１５－Ｎ１６ＧＡＣＡＣＵＮ２３であって、Ｎ１、Ｎ１４、Ｎ１５、Ｎ１６及びＮ２３は、長さがヌクレオチド１個分と同等又はそれ以上の断片を表し、かつＮ１とＮ２３ヌクレオチド配列のうちの少なくとも一対の塩基が、相補的塩基対を形成し、Ｎ１４とＮ１６ヌクレオチド配列のうちの少なくとも一対の塩基が、相補的塩基対を形成し、
前記ヌクレオチド配列（ｂ）は、ヌクレオチド配列（ａ）と少なくとも７０％、７２％、７７％、８３％、８８％、９４％又は１００％の同一性を有し、
前記ヌクレオチド配列（ｃ）は、ヌクレオチド配列（ａ）においてＮ１、Ｎ１４、Ｎ１５、Ｎ１６及びＮ２３を含まない位置で、１個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠損及び／又は挿入されて、かつアプタマー機能を有し、ヌクレオチド配列（ａ）から誘導されたものである、
核酸アプタマー分子。
前記ヌクレオチド配列（ａ）は、Ｎ１ＡＧＡＵＵＧＵＡＡＡＣＡＮ１４－Ｎ１５－Ｎ１６ＧＡＣＡＣＵＮ２３であって、Ｎ１、Ｎ１４、Ｎ１５、Ｎ１６及びＮ２３は、長さがヌクレオチド１個分と同等又はそれ以上の断片を表し、かつＮ１とＮ２３ヌクレオチド配列のうちの少なくとも一対の塩基が、相補的塩基対を形成し、Ｎ１４とＮ１６ヌクレオチド配列のうちの少なくとも一対の塩基が、相補的塩基対を形成し、
前記ヌクレオチド配列（ｂ）は、ヌクレオチド配列（ａ）と少なくとも７０％、７２％、７７％、８３％、８８％、９４％又は１００％の同一性を有し、
前記ヌクレオチド配列（ｃ）は、ヌクレオチド配列（ａ）においてＮ１、Ｎ１４、Ｎ１５、Ｎ１６及びＮ２３を含まない位置で、１個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠損及び／又は挿入されて、かつアプタマー機能を有し、ヌクレオチド配列（ａ）から誘導されたものである、
核酸アプタマー分子。
【請求項2】
ヌクレオチド配列（ｃ）は、ヌクレオチド配列（ａ）においてＮ１、Ｎ１４、Ｎ１５、Ｎ１６及びＮ２３を含まない位置で、５個、４個、３個、２個又は１個のヌクレオチドが置換、欠損及び／又は挿入されて得られた核酸アプタマー分子である、請求項１に記載の核酸アプタマー分子。
【請求項3】
ヌクレオチド配列（ａ）におけるＮ１とＮ２３が相補的塩基対を形成する場合、Ｎ１ヌクレオチド配列の方向は５’－３’であり、Ｎ２３ヌクレオチド配列の方向は３’－５’であり、Ｎ１４とＮ１６が相補的塩基対を形成する場合、Ｎ１４ヌクレオチド配列の方向は５’－３’であり、Ｎ１６ヌクレオチド配列の方向は３’－５’である、請求項１に記載の核酸アプタマー分子。
【請求項4】
Ｎ１とＮ２３における少なくとも１本の断片の長さが５個のヌクレオチド塩基と同等又はそれ以上である場合、Ｎ１とＮ２３ヌクレオチド配列のうちの少なくとも２対の塩基が、相補的塩基対を形成し、Ｎ１４とＮ１６における少なくとも１本の断片の長さが５個のヌクレオチド塩基と同等又はそれ以上である場合、Ｎ１４とＮ１６ヌクレオチド配列のうちの少なくとも２対の塩基が、相補的塩基対を形成している、請求項３に記載の核酸アプタマー分子。
【請求項5】
ヌクレオチド配列（ａ）へのヌクレオチド置換が、Ａ４Ｕ、Ａ４Ｇ、Ａ４Ｃ、Ｕ５Ａ、Ｕ５Ｇ、Ｕ５Ｃ、Ｇ７Ｃ、Ｇ７Ａ、Ｇ７Ｕ、Ｕ８Ｃ、Ａ１０Ｕ、Ａ１０Ｇ、Ａ１０Ｃ、Ａ１１Ｕ、Ａ１１Ｇ、Ａ１１Ｃ、Ｃ１２Ｇ、Ｃ１２Ａ、Ｃ１２Ｕ、Ａ１３Ｕ、Ａ１３Ｇ、Ａ１３Ｃ、Ｇ１７Ａ、Ｃ１９Ａ、Ｃ１９Ｕ、Ａ２０Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ａ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ｃ、Ａ４Ｃ／Ａ１１Ｇ、Ａ４Ｃ／Ｃ１２Ａ、Ａ４Ｃ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ａ／Ａ１１Ｇ、Ｕ５Ａ／Ｃ１２Ａ、Ｕ５Ａ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｇ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｃ／Ｇ７Ｕ、Ｕ５Ｃ／Ａ１１Ｇ、Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ｇ、Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ａ、Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ｕ、Ｕ５Ｃ／Ａ１３Ｃ、Ｇ７Ｕ／Ａ１３Ｃ、Ａ１１Ｇ／Ａ１３Ｃ、Ｃ１２Ｇ／Ａ１３Ｃ、Ｃ１２Ａ／Ａ１３Ｃ、Ｃ１２Ｕ／Ａ１３Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ｃ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｃ／Ｇ７Ｕ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ｇ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ｕ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｃ／Ａ１１Ｇ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ａ／Ａ１３Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ｃ／Ａ１１Ｇ／Ａ１３Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ａ／Ａ１３Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ｃ／Ｇ７Ｕ／Ａ１１Ｇ／Ａ１３Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ｃ／Ｇ７Ｕ／Ｃ１２Ａ／Ａ１３Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ａ／Ａ１１Ｇ／Ｃ１２Ａ／Ａ１３Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ｃ／Ａ１１Ｇ／Ｃ１２Ａ／Ａ１３Ｃからなる群から選択される１種である、請求項１に記載の核酸アプタマー分子。
【請求項6】
ヌクレオチド配列（ａ）におけるＮ１とＮ２３箇所のヌクレオチド配列が、Ｆ３０又はｔＲＮＡ足場ＲＮＡ配列である、請求項１に記載の核酸アプタマー分子。
【請求項7】
アプタマー分子は、ＲＮＡ分子、又は塩基修飾のＲＮＡ分子である、請求項１に記載の核酸アプタマー分子。
【請求項8】
前記核酸アプタマー分子は、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド分子、又は塩基修飾のＤＮＡ－ＲＮＡ分子である、請求項１に記載の核酸アプタマー分子。
【請求項9】
Ｎ１４－Ｎ１５－Ｎ１６が、標的分子を識別可能なヌクレオチド配列を１個含む、請求項１に記載の核酸アプタマー分子。
【請求項10】
前記標的分子は、タンパク質、核酸、脂質分子、炭水化物、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、代謝物、金属イオンを含む、請求項９に記載の核酸アプタマー分子。
【請求項11】
前記Ｎ１４－Ｎ１５－Ｎ１６は、Ｓ－アデノシルメチオニン及びアデノシン分子を識別可能なヌクレオチド配列である、請求項９に記載の核酸アプタマー分子。
【請求項12】
前記アプタマー機能とは、核酸アプタマーが、フルオロフォア分子の適切な波長の励起光での蛍光強度を、少なくとも２倍、少なくとも５～１０倍、少なくとも２０～５０倍、少なくとも１００～２００倍、又は少なくとも２００倍以上向上できることである、請求項１に記載の核酸アプタマー分子。
【請求項13】
複数個のフルオロフォア分子と結合できるコンカテマーを含み、前記コンカテマーは、適宜な長さのスペーサー配列によって連結され、個数は、２、３、４、５、６、７、８又はそれ以上であり得、前記コンカテマーのヌクレオチドは、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０から選択される、請求項１に記載の核酸アプタマー分子。
【請求項14】
前記核酸アプタマー分子が、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又は３１を有する、請求項１に記載の核酸アプタマー分子。
【請求項15】
核酸アプタマー分子とフルオロフォア分子との複合体であって、前記核酸アプタマー分子は、請求項１に記載の核酸アプタマー分子であり、前記フルオロフォア分子は、下記式（Ｉ）で示される構造を有し、
式中：Ａｒ１、Ａｒ２は独立して、６員アリール基、６員ヘテロアリール基であり、Ｄ－は、ＨＯ－又はＮ（Ｘ１）（Ｘ２）－であり、Ｘ１、Ｘ２はそれぞれ独立して、水素、アルキル基及び変性アルキル基から選択され、Ｘ１、Ｘ２は互いに結合して、Ｎ原子と共に脂肪族複素環を形成してもよく、Ｄ－がＮ（Ｘ１）（Ｘ２）－で、Ａｒ１がフェニル基である場合、Ｘ１、Ｘ２は独立して、ベンゼン環と飽和又は不飽和のエステル複素環を形成し、Ｄ－がＨＯ－で、Ａｒ１がフェニル基である場合、ＨＯ－と隣接する少なくとも１個の水素原子がハロゲンで置換され、Ｙは、Ｏ、Ｓであり、Ｒ１は、水素、アルキル基及び変性アルキル基であり、Ｒ２は、水素原子、ハロゲン原子、－ＯＨ、－ＣＮであり、前記アルキル基はそれぞれ独立して、Ｃ１－Ｃ１０直鎖又は分岐鎖のアルキル基であり、
前記変性アルキル基はそれぞれ独立して、アルキル基の任意の炭素原子がハロゲン原子、－ＯＨ、－ＣＯ－、－Ｏ－、－ＣＮ、－ＳＯ３Ｈ、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基から選択される１種又は複数種の基で代替された基であり、前記変性アルキル基は、１～１０個の炭素原子を有し、ただし、炭素－炭素一重結合は独立して、炭素－炭素二重結合又は炭素－炭素三重結合で代替されてもよく、前記炭素原子が代替されるとは、炭素原子が、あるいは炭素原子がその上の水素原子と共に、対応する基で代替されることである、複合体。
【化1】
前記変性アルキル基はそれぞれ独立して、アルキル基の任意の炭素原子がハロゲン原子、－ＯＨ、－ＣＯ－、－Ｏ－、－ＣＮ、－ＳＯ３Ｈ、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基から選択される１種又は複数種の基で代替された基であり、前記変性アルキル基は、１～１０個の炭素原子を有し、ただし、炭素－炭素一重結合は独立して、炭素－炭素二重結合又は炭素－炭素三重結合で代替されてもよく、前記炭素原子が代替されるとは、炭素原子が、あるいは炭素原子がその上の水素原子と共に、対応する基で代替されることである、複合体。
【請求項16】
前記フルオロフォア分子は下式化合物
から選択される、請求項１５に記載の複合体。
【化2(1)】
【化2(2)】
【請求項17】
複合体におけるアプタマー分子は、ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又は３１を含む、請求項１５に記載の複合体。
【請求項18】
請求項１に記載の核酸アプタマー分子、請求項１５に記載の複合体、発現ベクター又は宿主細胞のうちの少なくとも１種を含むキットであって、
前記発現ベクターは、前記核酸アプタマー分子を転写するＤＮＡ分子を含み、
前記宿主細胞は、前記発現ベクターを含む、キット。
前記発現ベクターは、前記核酸アプタマー分子を転写するＤＮＡ分子を含み、
前記宿主細胞は、前記発現ベクターを含む、キット。
【請求項19】
インビトロ又はインビボの標的核酸分子の検出又は標識、細胞外又は細胞内の標的分子の検出又は標識、ゲノムＤＮＡのイメージング、ＲＮＡとタンパク質との相互作用の検出、ゲノムＤＮＡの検出、及びＲＮＡの精製と純化のための、請求項１５に記載の複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、核酸アプタマー分子（アプタマー核酸分子）、該核酸アプタマー分子を細胞内又は細胞外のＲＮＡ、ＤＮＡ又は他の標的分子の検出に用いた方法、及び該アプタマーを含むキットに関する。本発明のアプタマーは、一種のフルオロフォア小分子と特異的に結合して、かつその適切な波長の光で励起された場合の蛍光強度を著しく向上させることができる。
【背景技術】
【0002】
ＲＮＡは、最も重要な生体分子の一つであり、その種類が数多くあり、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）などを含む。近年では、ＲＮＡが複数の生体活動において奏する極めて重要な機能は、科学者たちに発掘されつつあり、例えば、テロメラーゼ、スプライシング酵素、リボザイム及びリボスイッチなど、多くのＲＮＡ－タンパク質複合体を含む。また、細胞中には、数多くのノンコーディングＲＮＡ、例えば、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）及び長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）などが存在し、転写後のレベルで遺伝子発現の制御にとってかけがえのない役割を果たしている。したがって、細胞におけるＲＮＡの輸送及び代謝過程に対するリアルタイムのモニタリングは、ＲＮＡの位置特定、遺伝子発現及び細胞制御過程の関係に対する研究にとって至極重要である。
【0003】
現在、ＲＮＡを標識するための方法としては、インサイチューハイブリダイゼーション、ＲＮＡ結合タンパク質－蛍光タンパク質技術、及びＲＮＡアプタマー－蛍光染料技術を含む。蛍光インサイチューハイブリダイゼーションは、フルオロフォア修飾のオリゴヌクレオチドでＲＮＡを直接標識する技術であって、その基本的な原理としては、フルオロフォア修飾のオリゴヌクレオチドにはＲＮＡと相補する一部の配列を有し、塩基対合によって標的ＲＮＡへの標識を実現する（Ｒａｊ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１８．５：８７７－８７９）。その利点は、標的ＲＮＡ自体を修飾又は遺伝子組換えする必要がなく、直接標識することである。その欠点は、オリゴヌクレオチドが細胞に入り難く、細胞に導入する補助手順が必要で、細胞にダメージを与えやすく、バックグラウンド蛍光が比較的高く、複雑な溶出手順が必要であり、固定細胞の研究のみに使用でき、生細胞におけるＲＮＡの動的変化過程のリアルタイムモニタリングに使用できないことである。分子ビーコン技術は、ヘアピン構造のオリゴヌクレオチドプローブに基づき、標的ＲＮＡと結合した後、一端に標識された消光基の他端に標識された蛍光基に対する消光作用が解消され、蛍光基が蛍光を発するか、あるいは、両端の蛍光基のＦＲＥＴが消える（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０１０．３８：ｅ１４８）。その利点は、それ自体にバックグラウンド蛍光がないため、分子ビーコンが他のオリゴヌクレオチドプローブと比べて高い信号対雑音比を有することである。その欠点は、細胞に入り難いほか、細胞核に集まって非特異的な蛍光を発する傾向にあり、ＲＮＡ二次構造の影響を受けやすく、かつ１本１本のＲＮＡに対してオリゴヌクレオチドプローブなどを特別に作る必要があることであり（Ｙｏｕ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ ２０１５．４４：１８７－２０６）、これらの欠点によって当該技術の適用が制限されている。
【0004】
ＲＮＡ結合タンパク質－蛍光タンパク質技術は、現在慣用の生細胞ＲＮＡの標識方法であり、慣用のＲＮＡ結合タンパク質システムには、ＭＣＰ／ＭＳ２ファージシステム（Ｂｅｒｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ １９９８．２：４３７－４４５）、λＮ／ｂｏｘＢファージシステム（Ｄａｉｇｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００７．４：６３３－６３６）、及びｄＣａｓ９－ｓｇＲＮＡシステム（Ｎｅｌｌｅｓ ｅｔ ｓｌ．Ｃｅｌｌ ２０１６．１６５：４８８－４９６）がある。その基本的な原理としては、蛍光タンパク質を、特定のＲＮＡ配列と結合できるＲＮＡ結合タンパク質１個と融合させて、ＲＮＡ結合タンパク質－蛍光タンパク質の融合タンパク質を得ると同時に、この特定のＲＮＡ配列を標的ＲＮＡと融合させて、ＲＮＡ結合タンパク質と特定のＲＮＡ配列との結合によって、蛍光タンパク質で標的ＲＮＡを標識するという目的を達成する。この方法は、生細胞ＲＮＡの標識に広く利用されているが、結合していないＲＮＡ結合タンパク質－蛍光タンパク質の融合タンパク質は、比較的高いイメージングバックグラウンド蛍光をもたらしてしまう。科学者たちは、ＲＮＡ結合タンパク質に識別されるＲＮＡ配列を複数個直列連結することによって、１本の標的ＲＮＡに複数個の蛍光タンパク質を結合させてイメージングの信号対雑音（ノイズ）比を向上させているが、比較的大きい複合体の担持によりＲＮＡの正常な生理機能に影響を与える可能性がある。
【0005】
ＲＮＡアプタマー－蛍光染料による蛍光ＲＮＡ技術は、比較的望ましいＲＮＡ標識技術である。その基本的な原理としては、蛍光染料はＲＮＡアプタマーと結合する前に、蛍光が比較的低く、ＲＮＡアプタマーと結合した後、蛍光強度が増す。この技術の利点は、システムが簡単であり、ＲＮＡアプタマーを標的ＲＮＡと融合させればよく、更には、遺伝子コーディング特性及びモジュール性を有し、異なるＲＮＡに広く使用できることである。初期の蛍光ＲＮＡは、チアゾールオレンジ及びその類似体、又はフルオロフォア－消光基に基づいて開発され（Ｄｏｌｇｏｓｈｅｉｎａ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１４．９：２４１２－２４２０；Ｓｕｎｂｕｌ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ ２０１３．５２：１３４０１－１３４０４）、これらの蛍光染料自体は、バックグラウンド蛍光が高く、細胞毒性が大きく、又は細胞に入り難いなどの欠点があるため、それらが生細胞ＲＮＡ、特に哺乳類細胞の標識に向いていない。２０１１年、Ｓ．Ｊａｆｆｒｅｙの研究グループは、蛍光タンパク質発色団類似体（ＤＦＨＢＩ）に基づいてＳｐｉｎａｃｈと称されるＲＮＡアプタマーをスクリーニングして得た（Ｐａｉｇｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１１．３３３：６４２－６４６）。これまでの蛍光ＲＮＡと比べて、ＤＦＨＢＩは、バックグラウンド蛍光が低く、細胞に入りやすく、かつ細胞毒性がないなどの利点を有する。その後、同研究グループは、更に、Ｓｐｉｎａｃｈ２、Ｂｒｏｃｃｏｌｉ及びＣｏｒｎ蛍光ＲＮＡを開発した（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１７．１３：１１８７－１１９４；Ｆｉｌｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１４．１３６：１６２９９－１６３０８；Ｓｔｒａｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１３．１０：１２１９－１２２４）。これらの蛍光ＲＮＡは、哺乳類細胞において複数種の高い存在量のＲＮＡへの標識とイメージングに使用できるが、依然として蛍光が安定せず消光しやすく、輝度が低く、Ｍｇ２＋及び集合体特性に依存するなどの欠点が存在し、これらの欠点により、それらの幅広い使用が制限されている。２０１９年、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．は、Ｐｅｐｐｅｒと称される蛍光ＲＮＡを開発し、この蛍光ＲＮＡは、高輝度、高安定性などの利点を有し、生細胞において複数種のＲＮＡの標識とイメージングに使用できる（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１９．３７：１２８７－１２９３）。しかし、生細胞において、多くの細胞機能の実行には複数種のＲＮＡが同時に関与する必要があるため、細胞中の複数種のＲＮＡへの標識とイメージングを実現し、それらの生物機能を探究するように、優れた特性を有しかつ生体直交が可能な複数種の蛍光ＲＮＡを開発する必要がある。
【発明の概要】
【0006】
本発明は、核酸アプタマー分子、該核酸アプタマー分子をコードするＤＮＡ分子、核酸アプタマー分子とフルオロフォア分子との複合体、及び該複合体の使用を提供する。
【0007】
本発明は、下記の構成を提供する。
【0008】
１．本発明は、ヌクレオチド配列（ａ）、ヌクレオチド配列（ｂ）、又はヌクレオチド配列（ｃ）を含む核酸アプタマー分子に関し、
前記ヌクレオチド配列（ａ）は、Ｎ１ＡＧＡＵＵＧＵＡＡＡＣＡＮ１４－Ｎ１５－Ｎ１６ＧＡＣＡＣＵＮ２３（一般式Ｃａｒｒｏｔ構造と称する）であって、Ｎ１、Ｎ１４、Ｎ１５、Ｎ１６及びＮ２３は、長さがヌクレオチド１個分と同等又はそれ以上の断片を表し、かつＮ１とＮ２３ヌクレオチド配列のうちの少なくとも一対の塩基が、相補的塩基対を形成し、Ｎ１４とＮ１６ヌクレオチド配列のうちの少なくとも一対の塩基が、相補的塩基対を形成し、
前記ヌクレオチド配列（ｂ）は、ヌクレオチド配列（ａ）と少なくとも７０％の同一性を有し、
前記ヌクレオチド配列（ｃ）は、ヌクレオチド配列（ａ）においてＮ１、Ｎ１４、Ｎ１５、Ｎ１６及びＮ２３を含まない位置で、１個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠損及び／又は挿入されて、かつアプタマー機能を有し、ヌクレオチド配列（ａ）から誘導されたものである。
前記ヌクレオチド配列（ａ）は、Ｎ１ＡＧＡＵＵＧＵＡＡＡＣＡＮ１４－Ｎ１５－Ｎ１６ＧＡＣＡＣＵＮ２３（一般式Ｃａｒｒｏｔ構造と称する）であって、Ｎ１、Ｎ１４、Ｎ１５、Ｎ１６及びＮ２３は、長さがヌクレオチド１個分と同等又はそれ以上の断片を表し、かつＮ１とＮ２３ヌクレオチド配列のうちの少なくとも一対の塩基が、相補的塩基対を形成し、Ｎ１４とＮ１６ヌクレオチド配列のうちの少なくとも一対の塩基が、相補的塩基対を形成し、
前記ヌクレオチド配列（ｂ）は、ヌクレオチド配列（ａ）と少なくとも７０％の同一性を有し、
前記ヌクレオチド配列（ｃ）は、ヌクレオチド配列（ａ）においてＮ１、Ｎ１４、Ｎ１５、Ｎ１６及びＮ２３を含まない位置で、１個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠損及び／又は挿入されて、かつアプタマー機能を有し、ヌクレオチド配列（ａ）から誘導されたものである。
【0009】
２．本願の一部の実施例において、前記核酸アプタマー分子は、ヌクレオチド配列（ａ）の前記Ｃａｒｒｏｔ構造ヌクレオチド配列と少なくとも７２％、７７％、８３％、８８％、９４％又は１００％同一性を有する配列である。
【0010】
３．本願の一部の実施例において、ヌクレオチド配列（ｃ）は、ヌクレオチド配列（ａ）に規定されたＣａｒｒｏｔ構造ヌクレオチド配列においてＮ１、Ｎ１４、Ｎ１５、Ｎ１６及びＮ２３を含まない位置で、５個、４個、３個、２個又は１個のヌクレオチドが置換、欠損及び／又は挿入されて得られた核酸アプタマー分子である。
【0011】
４．本願の一部の実施例において、ヌクレオチド配列（ｃ）は、ヌクレオチド配列（ａ）においてＮ１、Ｎ１４、Ｎ１５、Ｎ１６及びＮ２３を含まない位置で、４個、３個、２個又は１個のヌクレオチドが置換されて得られた核酸アプタマー分子である。
【0012】
５．本願の一部の実施例において、ヌクレオチド配列（ａ）におけるＮ１とＮ２３が相補的塩基対を形成する場合、Ｎ１ヌクレオチド配列の方向は５’－３’であり、Ｎ２３ヌクレオチド配列の方向は３’－５’であり、Ｎ１４とＮ１６が相補的塩基対を形成する場合、Ｎ１４ヌクレオチド配列の方向は５’－３’であり、Ｎ１６ヌクレオチド配列の方向は３’－５’である。
【0013】
６．本願の一部の実施例において、Ｎ１とＮ２３における少なくとも１本の断片の長さが５個のヌクレオチド塩基と同等又はそれ以上である場合、Ｎ１とＮ２３ヌクレオチド配列のうちの少なくとも２対の塩基が、相補的塩基対を形成し、Ｎ１４とＮ１６における少なくとも１本の断片の長さが５個のヌクレオチド塩基と同等又はそれ以上である場合、Ｎ１４とＮ１６ヌクレオチド配列のうちの少なくとも２対の塩基が、相補的塩基対を形成している。
【0014】
７．上記核酸アプタマー分子は、一般式Ｃａｒｒｏｔ構造へのヌクレオチド置換が、Ａ４Ｕ、Ａ４Ｇ、Ａ４Ｃ、Ｕ５Ａ、Ｕ５Ｇ、Ｕ５Ｃ、Ｇ７Ｃ、Ｇ７Ａ、Ｇ７Ｕ、Ｕ８Ｃ、Ａ１０Ｕ、Ａ１０Ｇ、Ａ１０Ｃ、Ａ１１Ｕ、Ａ１１Ｇ、Ａ１１Ｃ、Ｃ１２Ｇ、Ｃ１２Ａ、Ｃ１２Ｕ、Ａ１３Ｕ、Ａ１３Ｇ、Ａ１３Ｃ、Ｇ１７Ａ、Ｃ１９Ａ、Ｃ１９Ｕ、Ａ２０Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ａ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ｃ、Ａ４Ｃ／Ａ１１Ｇ、Ａ４Ｃ／Ｃ１２Ａ、Ａ４Ｃ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ａ／Ａ１１Ｇ、Ｕ５Ａ／Ｃ１２Ａ、Ｕ５Ａ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｇ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｃ／Ｇ７Ｕ、Ｕ５Ｃ／Ａ１１Ｇ、Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ｇ、Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ａ、Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ｕ、Ｕ５Ｃ／Ａ１３Ｃ、Ｇ７Ｕ／Ａ１３Ｃ、Ａ１１Ｇ／Ａ１３Ｃ、Ｃ１２Ｇ／Ａ１３Ｃ、Ｃ１２Ａ／Ａ１３Ｃ、Ｃ１２Ｕ／Ａ１３Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ｃ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｃ／Ｇ７Ｕ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ｇ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ｕ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｃ／Ａ１１Ｇ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ａ／Ａ１３Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ｃ／Ａ１１Ｇ／Ａ１３Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ａ／Ａ１３Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ｃ／Ｇ７Ｕ／Ａ１１Ｇ／Ａ１３Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ｃ／Ｇ７Ｕ／Ｃ１２Ａ／Ａ１３Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ａ／Ａ１１Ｇ／Ｃ１２Ａ／Ａ１３Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ｃ／Ａ１１Ｇ／Ｃ１２Ａ／Ａ１３Ｃからなる群から選択される１種である。
【0015】
８．本願の一部の実施例において、一般式Ｃａｒｒｏｔ構造へのヌクレオチド置換が、Ａ４Ｃ、Ｕ５Ａ、Ｕ５Ｇ、Ｕ５Ｃ、Ｇ７Ｕ、Ａ１１Ｇ、Ｃ１２Ｇ、Ｃ１２Ａ、Ｃ１２Ｕ、Ａ１３Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ａ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ｃ、Ａ４Ｃ／Ａ１１Ｇ、Ａ４Ｃ／Ｃ１２Ａ、Ａ４Ｃ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ａ／Ａ１１Ｇ、Ｕ５Ａ／Ｃ１２Ａ、Ｕ５Ａ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｇ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｃ／Ｇ７Ｕ、Ｕ５Ｃ／Ａ１１Ｇ、Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ｇ、Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ａ、Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ｕ、Ｕ５Ｃ／Ａ１３Ｃ、Ｇ７Ｕ／Ａ１３Ｃ、Ａ１１Ｇ／Ａ１３Ｃ、Ｃ１２Ｇ／Ａ１３Ｃ、Ｃ１２Ａ／Ａ１３Ｃ、Ｃ１２Ｕ／Ａ１３Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ｃ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｃ／Ｇ７Ｕ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ｇ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ｕ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｃ／Ａ１１Ｇ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ａ／Ａ１３Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ｃ／Ａ１１Ｇ／Ａ１３Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ａ／Ａ１３Ｃからなる群から選択される１種である。
【0016】
９．本願の一部の実施例において、一般式Ｃａｒｒｏｔ構造へのヌクレオチド置換が、Ａ４Ｃ、Ｕ５Ａ、Ｕ５Ｇ、Ｕ５Ｃ、Ｇ７Ｕ、Ａ１１Ｇ、Ｃ１２Ｇ、Ｃ１２Ａ、Ｃ１２Ｕ、Ａ１３Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ｃ、Ａ４Ｃ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ａ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｃ／Ａ１１Ｇ、Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ａ、Ｕ５Ｃ／Ａ１３Ｃ、Ａ１１Ｇ／Ａ１３Ｃ、Ｃ１２Ａ／Ａ１３Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ｃ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｃ／Ａ１１Ｇ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ａ／Ａ１３Ｃからなる群から選択される１種である。
【0017】
１０．上記核酸アプタマー分子は、ヌクレオチド配列（ａ）におけるＮ１とＮ２３箇所のヌクレオチド配列が、Ｆ３０又はｔＲＮＡ足場ＲＮＡ配列である。
【0018】
１１．本願の一部の実施例において、前記アプタマー分子は、ＲＮＡ分子、又は塩基修飾のＲＮＡ分子である。
【0019】
１２．本願の一部の実施例において、前記アプタマー分子は、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド分子、又は塩基修飾のＤＮＡ－ＲＮＡ分子である。
【0020】
１３．上記核酸アプタマー分子は、Ｎ１４－Ｎ１５－Ｎ１６が、標的分子を識別可能なヌクレオチド配列を１個含む。
【0021】
１４．本願の一部の実施例において、標的分子は、タンパク質、核酸、脂質分子、炭水化物、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、代謝物、金属イオンを含むが、これらに限定されない。
【0022】
１５．本願の一部の実施例において、前記核酸アプタマー分子におけるＮ１４－Ｎ１５－Ｎ１６は、Ｓ－アデノシルメチオニン及びアデノシン分子を識別可能なヌクレオチド配列である。
【0023】
１６．本願の一部の実施例において、前記アプタマー機能とは、核酸アプタマーが、フルオロフォア分子の適切な波長の励起光での蛍光強度を、少なくとも２倍、少なくとも５～１０倍、少なくとも２０～５０倍、少なくとも１００～２００倍、又は少なくとも２００倍以上向上できることである。
【0024】
１７．本願の一部の実施例において、前記核酸アプタマー分子は、更に、複数個のフルオロフォア分子と結合できるコンカテマーを含み、前記コンカテマーは、適宜な長さのスペーサー配列によって連結され、個数は、２、３、４、５、６、７、８又はそれ以上であり得る。前記コンカテマーのヌクレオチドは、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０から選択できるが、これらに限定されない。
【0025】
１８．上記核酸アプタマー分子は、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又は３１を有する。
【0026】
１９．核酸アプタマー分子とフルオロフォア分子との複合体であって、前記核酸アプタマー分子は、上記核酸アプタマー分子であり、前記フルオロフォア分子は、下記式（Ｉ）で示される構造を有する。
【0027】
【化1】
【0028】
式中：Ａｒ１、Ａｒ２は独立して、６員アリール基、６員ヘテロアリール基であり、Ｄ－は、ＨＯ－又はＮ（Ｘ１）（Ｘ２）－であり、Ｘ１、Ｘ２はそれぞれ独立して、水素、アルキル基及び変性アルキル基から選択され、Ｘ１、Ｘ２は互いに結合して、Ｎ原子と共に脂肪族複素環を形成してもよく、Ｄ－がＮ（Ｘ１）（Ｘ２）－で、Ａｒ１がフェニル基である場合、Ｘ１、Ｘ２は独立して、ベンゼン環と飽和又は不飽和のエステル複素環を形成し、Ｄ－がＨＯ－で、Ａｒ１がフェニル基である場合、ＨＯ－と隣接する少なくとも１個の水素原子がハロゲンで置換され、Ｙは、Ｏ、Ｓであり、Ｒ１は、水素、アルキル基及び変性アルキル基であり、Ｒ２は、水素原子、ハロゲン原子、－ＯＨ、－ＣＮであり、
ただし、前記「アルキル基」はそれぞれ独立して、Ｃ１－Ｃ１０直鎖又は分岐鎖のアルキル基であり、Ｃ１－Ｃ７直鎖又は分岐鎖のアルキル基であってもよく、Ｃ１－Ｃ５直鎖又は分岐鎖のアルキル基であってもよく、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔ－ブチル基、ｓ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、１－メチルブチル基、２－メチルブチル基、３－メチルブチル基、イソペンチル基、１－エチルプロピル基、ネオペンチル基、ｎ－ヘキシル基、１－メチルペンチル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、イソヘキシル基、１，１－ジメチルブチル基、２，２－ジメチルブチル基、３，３－ジメチルブチル基、１，２－ジメチルブチル基、１，３－ジメチルブチル基、２，３－ジメチルブチル基、２－エチルブチル基、ｎ－ヘプチル基、２－メチルヘキシル基、３－メチルヘキシル基、２，２－ジメチルペンチル基、３，３－ジメチルペンチル基、２，３－ジメチルペンチル基、２，４－ジメチルペンチル基、３－エチルペンチル基又は２，２，３－トリメチルブチル基から選択されてもよく、
２０．本願の一部の実施例において、前記「変性アルキル基」はそれぞれ独立して、アルキル基の任意の炭素原子がハロゲン原子、－ＯＨ、－ＣＯ－、－Ｏ－、－ＣＮ、－ＳＯ３Ｈ、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基から選択される一種又は複数種の基で代替された基であり、前記変性アルキル基は、１～１０個の炭素原子を有し、ただし、炭素－炭素一重結合は独立して、炭素－炭素二重結合又は炭素－炭素三重結合で代替されてもよく、
前記炭素原子が代替されるとは、炭素原子が、あるいは炭素原子がその上の水素原子と共に、対応する基で代替されることであり、
前記「変性アルキレン基」は、Ｃ１－Ｃ１０（好ましくは、Ｃ１－Ｃ６である）アルキレン基の任意の炭素原子が－Ｏ－、－ＯＨ、－ＣＯ－、－ＣＳ－、－（Ｓ＝Ｏ）－から選択される基で代替された基であり、
好ましくは、前記「変性アルキル基」は、－ＯＨ、－Ｏ－、エチレングリコール単位（－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－）、単糖単位、－Ｏ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＳＯ２－Ｏ－、－ＳＯ－、Ｍｅ２Ｎ－、Ｅｔ２Ｎ－、－Ｓ－Ｓ－、－ＣＨ＝ＣＨ－、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、シアノ基から選択される一種又は複数種の基を含み、
好ましくは、Ａｒ１は、下式（II－１）～（II－１５）から選択される構造であり、
ただし、前記「アルキル基」はそれぞれ独立して、Ｃ１－Ｃ１０直鎖又は分岐鎖のアルキル基であり、Ｃ１－Ｃ７直鎖又は分岐鎖のアルキル基であってもよく、Ｃ１－Ｃ５直鎖又は分岐鎖のアルキル基であってもよく、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔ－ブチル基、ｓ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、１－メチルブチル基、２－メチルブチル基、３－メチルブチル基、イソペンチル基、１－エチルプロピル基、ネオペンチル基、ｎ－ヘキシル基、１－メチルペンチル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、イソヘキシル基、１，１－ジメチルブチル基、２，２－ジメチルブチル基、３，３－ジメチルブチル基、１，２－ジメチルブチル基、１，３－ジメチルブチル基、２，３－ジメチルブチル基、２－エチルブチル基、ｎ－ヘプチル基、２－メチルヘキシル基、３－メチルヘキシル基、２，２－ジメチルペンチル基、３，３－ジメチルペンチル基、２，３－ジメチルペンチル基、２，４－ジメチルペンチル基、３－エチルペンチル基又は２，２，３－トリメチルブチル基から選択されてもよく、
２０．本願の一部の実施例において、前記「変性アルキル基」はそれぞれ独立して、アルキル基の任意の炭素原子がハロゲン原子、－ＯＨ、－ＣＯ－、－Ｏ－、－ＣＮ、－ＳＯ３Ｈ、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基から選択される一種又は複数種の基で代替された基であり、前記変性アルキル基は、１～１０個の炭素原子を有し、ただし、炭素－炭素一重結合は独立して、炭素－炭素二重結合又は炭素－炭素三重結合で代替されてもよく、
前記炭素原子が代替されるとは、炭素原子が、あるいは炭素原子がその上の水素原子と共に、対応する基で代替されることであり、
前記「変性アルキレン基」は、Ｃ１－Ｃ１０（好ましくは、Ｃ１－Ｃ６である）アルキレン基の任意の炭素原子が－Ｏ－、－ＯＨ、－ＣＯ－、－ＣＳ－、－（Ｓ＝Ｏ）－から選択される基で代替された基であり、
好ましくは、前記「変性アルキル基」は、－ＯＨ、－Ｏ－、エチレングリコール単位（－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－）、単糖単位、－Ｏ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＳＯ２－Ｏ－、－ＳＯ－、Ｍｅ２Ｎ－、Ｅｔ２Ｎ－、－Ｓ－Ｓ－、－ＣＨ＝ＣＨ－、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、シアノ基から選択される一種又は複数種の基を含み、
好ましくは、Ａｒ１は、下式（II－１）～（II－１５）から選択される構造であり、
【0029】
【化2】
【0030】
Ａｒ２は、下式（III－１）～（III－２５）から選択される構造である。
【0031】
【化3】
【0032】
式（Ｉ）で示される化合物は、下式化合物から選択される。
【0033】
【化4(1)】
【化4(2)】
【0034】
２１．本願の一部の実施例において、複合体におけるアプタマー分子は、ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又は３１を含む。
２２．インビトロ又はインビボの標的核酸分子の検出又は標識のための、前記複合体。
２３．細胞外又は細胞内の標的分子の検出又は標識のための、前記複合体。
２４．ゲノムＤＮＡのイメージングのための、前記複合体。
２５．ＲＮＡとのタンパク質との相互作用の検出のための、前記複合体。
２６．上記核酸アプタマー分子を転写するＤＮＡ分子。
２７．前記ＤＮＡ分子を含む発現ベクター。
２８．前記発現ベクターを含む宿主細胞。
２９．前記核酸アプタマー分子及び／又は前記発現ベクター及び／又は前記宿主細胞及び／又は前記複合体を含むキット。
２２．インビトロ又はインビボの標的核酸分子の検出又は標識のための、前記複合体。
２３．細胞外又は細胞内の標的分子の検出又は標識のための、前記複合体。
２４．ゲノムＤＮＡのイメージングのための、前記複合体。
２５．ＲＮＡとのタンパク質との相互作用の検出のための、前記複合体。
２６．上記核酸アプタマー分子を転写するＤＮＡ分子。
２７．前記ＤＮＡ分子を含む発現ベクター。
２８．前記発現ベクターを含む宿主細胞。
２９．前記核酸アプタマー分子及び／又は前記発現ベクター及び／又は前記宿主細胞及び／又は前記複合体を含むキット。
【0035】
３０．ａ）標的分子を含む溶液に前記複合体を加える工程と、
ｂ）適切な波長の光で複合体を励起する工程と、
ｃ）複合体の蛍光を測定する工程と、
を含む標的分子の検出方法。
ｂ）適切な波長の光で複合体を励起する工程と、
ｃ）複合体の蛍光を測定する工程と、
を含む標的分子の検出方法。
【0036】
３１．前記複合体によってゲノムＤＮＡをイメージングすることを含む、ゲノムＤＮＡの検出方法。
３２．前記複合体によってＲＮＡを精製と純化することを含む、ＲＮＡの精製と純化方法。
３２．前記複合体によってＲＮＡを精製と純化することを含む、ＲＮＡの精製と純化方法。
【0037】
本発明者は、真新しい核酸アプタマー分子をデザインし、真新しいフルオロフォア分子を合成し、真新しいフルオロフォア－核酸アプタマー複合体を構成して、アプタマー分子がフルオロフォア分子と結合後にフルオロフォア分子の適切な波長の励起光での蛍光強度を向上でき、これまでのフルオロフォア－核酸アプタマー複合体の欠点を解消し、生細胞におけるＲＮＡ／ＤＮＡのリアルタイム標識に効果的に使用できる。本発明の核酸アプタマーは、フルオロフォア分子に対して比較的強い親和力を有し、異なる蛍光スペクトルを示す。これらの核酸アプタマー－フルオロフォア分子複合体は、原核細胞及び真核細胞におけるＲＮＡ／ＤＮＡをリアルタイムで標識・イメージングし、ＲＮＡ－タンパク質の相互作用を検出し、あるいはＲＮＡの精製と純化のタグなどの役割に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0038】
【図1】Ｃａｒｒｏｔ核酸アプタマー分子の一般的構造の二次構造予測である。
【図2】Ｃａｒｒｏｔ－１及びＣａｒｒｏｔ－２核酸アプタマー分子の二次構造予測である。
【図3】Ｆ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２の二次構造予測である。
【図4】ｔＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２の二次構造予測である。
【図5】Ｃａｒｒｏｔ－IV－３９複合体の特性同定である。（ａ）は、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－３９複合体の蛍光励起スペクトル及び発光スペクトルである。（ｂ）は、Ｃａｒｒｏｔ－１とＩＶ－３９とが結合した場合の解離定数の測定である。（ｃ）は、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－３９複合体のＭｇ２＋に対する依存性の測定である。
【図6】異なる塩基修飾のＣａｒｒｏｔのＩＶ－３９に対する活性化効果である。（ａ）は、異なる塩基修飾のＣａｒｒｏｔの模式図であり、Ｃａｒｒｏｔ－３の場合、構造模式図における濃い色の塩基は、デオキシリボースヌクレオチド塩基であり、Ｃａｒｒｏｔ－４の場合、構造模式図における濃い色の塩基は、２’－Ｆで修飾された塩基である。（ｂ）は、Ｃａｒｒｏｔ－３及びＣａｒｒｏｔ－４のＩＶ－３９フルオロフォア分子に対する蛍光の活性化効果であり、「コントロール」は、緩衝液でＣａｒｒｏｔ－３又はＣａｒｒｏｔ－４アプタマーＲＮＡを代替した。
【図7】異なるＣａｒｒｏｔコンカテマーのIV－３９に対する活性化効果である。（ａ）は、直列連結形態１の模式図であり、（ｂ）は、直列連結形態２の模式図であり、（ｃ）は、直列連結形態３の模式図であり、（ｄ）は、直列連結形態１のＣａｒｒｏｔコンカテマーのＩＶ－３９フルオロフォア分子に対する蛍光の活性化効果であり、（ｅ）は、直列連結形態２のＣａｒｒｏｔコンカテマーのＩＶ－３９フルオロフォア分子に対する蛍光の活性化効果であり、（ｆ）は、直列連結形態３のＣａｒｒｏｔコンカテマーのＩＶ－３９フルオロフォア分子に対する蛍光の活性化効果である。
【図8】Ｆ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２－ＩＶ－４複合体を細菌中のＲＮＡの標識に用いた効果である。
【図9】Ｆ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２－ＩＶ－４複合体を酵母細胞におけるＲＮＡの標識に用いた効果である。
【図10】ＣａｒｒｏｔとＩＶ－３９及びその類似体を哺乳類細胞におけるＲＮＡの標識に用いた効果である。（ａ）は、ｔＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２－ＩＶ－３９複合体を哺乳類細胞におけるＲＮＡの標識に用いた効果であり、（ｂ）は、ｔＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２－ＩＶ－３９複合体を哺乳類細胞におけるＲＮＡの標識に用いた統計結果であり、（ｃ）は、Ｆ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２とＩＶ－３９類似体を哺乳類細胞中でＲＮＡの標識に用いた効果である。
【図11】Ｃａｒｒｏｔ－１によるプローブの構築である。（ａ）は、プローブの構築模式図であり、（ｂ）は、プローブの標的非存在下でのＩＶ－３９フルオロフォア分子に対する蛍光の活性化効果である。
【図12】Ｃａｒｒｏｔによる細胞におけるＲＮＡ位置のトレースである。（ａ）は、４Ｃａｒｒｏｔ－２を細胞中のＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの位置の特定に用いた場合であり、（ｂ）は、４Ｃａｒｒｏｔ－２を細胞中のＡＣＴＢ ｍＲＮＡの位置の特定に用いた場合である。
【図13】ＣａｒｒｏｔをゲノムＤＮＡの検出に用いたイメージング結果である。（ａ）は、異なる嵌合ｓｇＲＮＡの模式図である。（ｂ）は、異なる嵌合ｓｇＲＮＡの生細胞中遺伝子部位に対するイメージング結果である。
【図14】ＣａｒｒｏｔをＲＮＡ－タンパク質相互作用の検出に用いた結果である。
【図15】ＣａｒｒｏｔをＲＮＡの精製と純化に用いた結果である。
【発明を実施するための形態】
【0039】
ここで下記の定義及び実施例の引用によって本発明について詳しく説明する。本明細書で言及されたすべての特許及び公開文献の記載は、これらの特許及び公開文献で開示されたすべての配列も含めて、明確に引用によって本明細書に取り込む。後文では、「ヌクレオチド」と「ヌクレオチド塩基」とを交換的に使用し、同じ意味を表す。
【0040】
核酸アプタマー分子
本発明にかかる「核酸アプタマー分子」は、「アプタマー分子」とも称される。該核酸アプタマー分子は、（ａ）Ｎ１ＡＧＡＵＵＧＵＡＡＡＣＡＮ１４－Ｎ１５－Ｎ１６ＧＡＣＡＣＵＮ２３（図１の一般式Ｃａｒｒｏｔ構造に対応）であるヌクレオチド配列、又は、（ｂ）前記ヌクレオチド配列（ａ）と少なくとも７０％の同一性を有する配列であって、ただし、Ｎ１とＮ２３ヌクレオチド配列のうちの少なくとも一対の塩基は逆方向の相補的塩基対を形成し、すなわち、Ｎ１ヌクレオチド配列の方向は５’－３’であり、Ｎ２３ヌクレオチド配列の方向は３’－５’であるヌクレオチド配列を含む。Ｎ１とＮ２３のうちの少なくとも１本のヌクレオチド塩基の長さが４以下である場合、少なくとも一対の塩基が相補的塩基対を形成する必要があり、Ｎ１とＮ２３のうちの少なくとも１本のヌクレオチド塩基の長さが５以上である場合、少なくとも二対の塩基が相補的塩基対を形成する必要がある。ただし、Ｎ１４とＮ１６ヌクレオチド配列のうちの少なくとも一対の塩基は逆方向の相補的塩基対を形成し、すなわち、Ｎ１４ヌクレオチド配列の方向は５’－３’であり、Ｎ１６ヌクレオチド配列の方向は３’－５’である。Ｎ１４とＮ１６のうちの少なくとも１本のヌクレオチド塩基の長さが４以下である場合、少なくとも一対の塩基が相補的塩基対を形成する必要があり、Ｎ１４とＮ１６のうちの少なくとも１本のヌクレオチド塩基の長さが５以上である場合、少なくとも二対の塩基が相補的塩基対を形成する必要がある。ただし、Ｎ１５は、任意の長さで任意に構成されたヌクレオチド塩基である。或いは、（ｃ）前記のヌクレオチド配列（ａ）のいずれかの位置で１～５個のヌクレオチドが置換、欠損及び／又は挿入されたヌクレオチド配列を含む。
本発明にかかる「核酸アプタマー分子」は、「アプタマー分子」とも称される。該核酸アプタマー分子は、（ａ）Ｎ１ＡＧＡＵＵＧＵＡＡＡＣＡＮ１４－Ｎ１５－Ｎ１６ＧＡＣＡＣＵＮ２３（図１の一般式Ｃａｒｒｏｔ構造に対応）であるヌクレオチド配列、又は、（ｂ）前記ヌクレオチド配列（ａ）と少なくとも７０％の同一性を有する配列であって、ただし、Ｎ１とＮ２３ヌクレオチド配列のうちの少なくとも一対の塩基は逆方向の相補的塩基対を形成し、すなわち、Ｎ１ヌクレオチド配列の方向は５’－３’であり、Ｎ２３ヌクレオチド配列の方向は３’－５’であるヌクレオチド配列を含む。Ｎ１とＮ２３のうちの少なくとも１本のヌクレオチド塩基の長さが４以下である場合、少なくとも一対の塩基が相補的塩基対を形成する必要があり、Ｎ１とＮ２３のうちの少なくとも１本のヌクレオチド塩基の長さが５以上である場合、少なくとも二対の塩基が相補的塩基対を形成する必要がある。ただし、Ｎ１４とＮ１６ヌクレオチド配列のうちの少なくとも一対の塩基は逆方向の相補的塩基対を形成し、すなわち、Ｎ１４ヌクレオチド配列の方向は５’－３’であり、Ｎ１６ヌクレオチド配列の方向は３’－５’である。Ｎ１４とＮ１６のうちの少なくとも１本のヌクレオチド塩基の長さが４以下である場合、少なくとも一対の塩基が相補的塩基対を形成する必要があり、Ｎ１４とＮ１６のうちの少なくとも１本のヌクレオチド塩基の長さが５以上である場合、少なくとも二対の塩基が相補的塩基対を形成する必要がある。ただし、Ｎ１５は、任意の長さで任意に構成されたヌクレオチド塩基である。或いは、（ｃ）前記のヌクレオチド配列（ａ）のいずれかの位置で１～５個のヌクレオチドが置換、欠損及び／又は挿入されたヌクレオチド配列を含む。
【0041】
核酸アプタマー分子は、一般式Ｃａｒｒｏｔ構造へのヌクレオチドの置換を含み、該置換は、Ａ４Ｕ、Ａ４Ｇ、Ａ４Ｃ、Ｕ５Ａ、Ｕ５Ｇ、Ｕ５Ｃ、Ｇ７Ｃ、Ｇ７Ａ、Ｇ７Ｕ、Ｕ８Ｃ、Ａ１０Ｕ、Ａ１０Ｇ、Ａ１０Ｃ、Ａ１１Ｕ、Ａ１１Ｇ、Ａ１１Ｃ、Ｃ１２Ｇ、Ｃ１２Ａ、Ｃ１２Ｕ、Ａ１３Ｕ、Ａ１３Ｇ、Ａ１３Ｃ、Ｇ１７Ａ、Ｃ１９Ａ、Ｃ１９Ｕ、Ａ２０Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ａ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ｃ、Ａ４Ｃ／Ａ１１Ｇ、Ａ４Ｃ／Ｃ１２Ａ、Ａ４Ｃ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ａ／Ａ１１Ｇ、Ｕ５Ａ／Ｃ１２Ａ、Ｕ５Ａ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｇ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｃ／Ｇ７Ｕ、Ｕ５Ｃ／Ａ１１Ｇ、Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ｇ、Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ａ、Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ｕ、Ｕ５Ｃ／Ａ１３Ｃ、Ｇ７Ｕ／Ａ１３Ｃ、Ａ１１Ｇ／Ａ１３Ｃ、Ｃ１２Ｇ／Ａ１３Ｃ、Ｃ１２Ａ／Ａ１３Ｃ、Ｃ１２Ｕ／Ａ１３Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ｃ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｃ／Ｇ７Ｕ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ｇ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ｕ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｃ／Ａ１１Ｇ／Ａ１３Ｃ、Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ａ／Ａ１３Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ｃ／Ａ１１Ｇ／Ａ１３Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ｃ／Ｃ１２Ａ／Ａ１３Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ｃ／Ｇ７Ｕ／Ａ１１Ｇ／Ａ１３Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ｃ／Ｇ７Ｕ／Ｃ１２Ａ／Ａ１３Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ａ／Ａ１１Ｇ／Ｃ１２Ａ／Ａ１３Ｃ、Ａ４Ｃ／Ｕ５Ｃ／Ａ１１Ｇ／Ｃ１２Ａ／Ａ１３Ｃ（すなわち、表１におけるアプタマー分子構造）からなる群から選択される１種である。これらの変異体は、フルオロフォア分子と特異的に結合でき、かつ結合後にフルオロフォア分子の適切な波長の励起光での蛍光強度を著しく向上できる。そのうち、ヌクレオチドの位置配列は、図１中の位置に対応する。
【0042】
上記変異は、一般式Ｃａｒｒｏｔ構造のアプタマーヌクレオチド配列の対応部位でヌクレオチドの代替が生じたことを表し、例えば、Ａ４Ｕは、Ｃａｒｒｏｔの４番目のアデニンヌクレオチドＡがウラシルヌクレオチドＵで置換されたもの、すなわち、表１におけるＣａｒｒｏｔ（Ａ４Ｕ）を表す。Ｕ５Ｃ／Ａ１３Ｃは、Ｃａｒｒｏｔの５番目のＵがＣで置換されたと同時に、１３番目のＡがＣで置換されたもの、すなわち、表１におけるＣａｒｒｏｔ（Ｕ５Ｃ／Ａ１３Ｃ）を表す。
【0043】
【表1(1)】
【表1(2)】
【0044】
アプタマー分子は、一本鎖核酸分子であり、１個又は複数個の塩基対形成領域（茎）と、１個又は複数個の塩基対非形成領域（環）とで構成された二次構造を有する（図１）。本発明にかかる核酸アプタマー分子は、図１で予測されたような二次構造を１個含む。前記構造の５’末端又は３’末端は、任意の標的ＲＮＡ分子と結合して、細胞外又は細胞内の標的ＲＮＡ分子の検出に使用することができる。本発明の一好適な実施形態において、核酸アプタマー分子の５’末端がＡＣＴＢ ＲＮＡ配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋ：ＢＣ０１６０４５）と結合する。本発明の別の好適な実施形態において、核酸アプタマー分子の５’末端がＧＡＰＤＨ ＲＮＡ配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋ：ＢＣ００９０８１）と結合する。
【0045】
図１における茎－環構造（Ｎ１４－Ｎ１５－Ｎ１６）は、核酸アプタマー分子の全体の構造を安定化する役割を果たし、他の茎－環構造を形成できる任意の長さで任意の構成のヌクレオチド配列で代替されることができる。本発明にかかるアプタマー分子は、更に、Ｎ１４－Ｎ１５－Ｎ１６位置に挿入された他のヌクレオチド配列を含むことができ、この挿入されたヌクレオチド配列は、図１における茎－環構造（Ｎ１４－Ｎ１５－Ｎ１６）を代替する。前記ヌクレオチド配列は、標的分子を特異的に識別／結合することができる。標的分子の非存在時に、前記アプタマー分子はフルオロフォア分子との結合能が弱いため、フルオロフォア分子が弱い蛍光を示すが、標的分子の存在時に、標的分子と前記アプタマーとの結合は、前記アプタマーとフルオロフォア分子との結合を促進し、フルオロフォア分子の適切な波長の励起光での蛍光強度を著しく向上させる。前記標的分子は、小分子、細胞表面のシグナル分子などであり得る。これらの核酸アプタマーは特定の標的分子と非共役で結合し、このような非共役結合は主に、分子間のイオン力、双極子力、水素結合力、ファンデルワールス力、電子と陽電子の相互作用、スタッキング効果、又は上述の複数種の作用力の組み合わせによる。前記茎－環構造（Ｎ１４－Ｎ１５－Ｎ１６）は、標的分子を識別するＲＮＡ配列で代替されて、細胞外又は細胞内の標的分子の検出に使用することができる。
【0046】
本発明の好適な実施形態において、前記核酸アプタマー分子は好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又は３１、或いは、それらのフルオロフォア分子と結合してフルオロフォア分子の適切な波長の励起光での蛍光を著しく向上できる変異配列である。
【0047】
本発明にかかる核酸アプタマー分子は、更に、一部にその安定性を向上させるヌクレオチド配列を含むことができる。本発明の一好適な実施形態において、Ｆ３０足場ＲＮＡ（配列３）を使用し、前記核酸アプタマー分子との結合形態は図３で示されたとおりである。本発明の別の好適な実施形態において、ｔＲＮＡ足場ＲＮＡ（配列４）を使用し、前記核酸アプタマー分子との結合形態は図４で示されたとおりである。
【0048】
同一性
「同一性」は、本発明において２個のヌクレオチド配列の間の関連性を説明するために用いられる。本発明の２個のアプタマーヌクレオチド配列の同一性計算では、（ａ）配列におけるＮ１、Ｎ１４、Ｎ１５、Ｎ１６、Ｎ２３を含まない。本発明にとって、２個のヌクレオチド配列の間の同一性の度合いは、例えば、ＥＭＢＯＳＳソフトウェア包（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅら，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６：２７６－２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラム用いて、好ましくは、３．０．０バージョン又はそれ以上のバージョンでＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を実行して特定する。用いられるオプションのパラメータは、ギャップペナルティ（ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）が１０、ギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）が０．５、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２置換行列（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳ版）である。Ｎｅｅｄｌｅで「最長同一性（ｌｏｎｇｅｓｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）と標識される出力結果を用いて、下記のようにパ－センテージの同一性を算出した。
「同一性」は、本発明において２個のヌクレオチド配列の間の関連性を説明するために用いられる。本発明の２個のアプタマーヌクレオチド配列の同一性計算では、（ａ）配列におけるＮ１、Ｎ１４、Ｎ１５、Ｎ１６、Ｎ２３を含まない。本発明にとって、２個のヌクレオチド配列の間の同一性の度合いは、例えば、ＥＭＢＯＳＳソフトウェア包（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅら，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６：２７６－２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラム用いて、好ましくは、３．０．０バージョン又はそれ以上のバージョンでＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を実行して特定する。用いられるオプションのパラメータは、ギャップペナルティ（ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）が１０、ギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）が０．５、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２置換行列（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳ版）である。Ｎｅｅｄｌｅで「最長同一性（ｌｏｎｇｅｓｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）と標識される出力結果を用いて、下記のようにパ－センテージの同一性を算出した。
【0049】
（同じ残基×１００）／（比較長さ－比較における欠損の合計数）。
【0050】
本発明の表１に示すように、Ｃａｒｒｏｔ－１及びＣａｒｒｏｔ－１（Ｕ５Ｃ）の配列は、Ｎ１ＡＧＡＵＵＧＵＡＡＡＣＡＮ１４－Ｎ１５－Ｎ１６ＧＡＣＡＣＵＮ２３及びＮ１ＡＧＡＣＵＧＵＡＡＡＣＡＮ１４－Ｎ１５－Ｎ１６ＧＡＣＡＣＵＮ２３であり、それらの同一性を比較する場合、本発明の定義に従って、Ｎ１、Ｎ１４－Ｎ１５－Ｎ１６及びＮ２３のヌクレオチド塩基を含まないべきであるため、それらの配列の同一性比較の結果は、９４．４％である（１個のヌクレオチドが違う）。
【0051】
フルオロフォア分子
本発明にかかる「フルオロフォア分子」は、「フルオロフォア」又は「蛍光分子」とも称される。「フルオロフォア分子」は、本発明において一種の条件に応じて活性化されるフルオロフォア分子である。それらは核酸アプタマーがない場合、比較的低い量子収率を示す。具体的な実施形態において、特定のアプタマーと結合していない場合、フルオロフォアの量子収率が０．１未満であり、更に好ましくは０．０１未満であり、最も好ましくは０．００１未満である。フルオロフォアが特定のアプタマーで結合された後、フルオロフォアの量子収率が２倍以上向上し、更に好ましくは１０倍以上向上し、最も好ましくは１００倍以上向上する。フルオロフォア分子は、水溶性で、細胞に無毒で細胞膜を透過しやすいものが好ましい。本発明のフルオロフォアは、能動輸送又は受動拡散によって細胞膜又は細胞壁を介して細胞質又はペリプラズムに入ることができるものが好ましい。本発明の実施形態において、フルオロフォアは、グラム陰性菌の外膜及び内膜、植物細胞の細胞壁及び細胞膜、真菌の細胞壁及び細胞膜、動物細胞の細胞膜、並びに生体動物のＧＩ及び内皮細胞膜を透過する。
本発明にかかる「フルオロフォア分子」は、「フルオロフォア」又は「蛍光分子」とも称される。「フルオロフォア分子」は、本発明において一種の条件に応じて活性化されるフルオロフォア分子である。それらは核酸アプタマーがない場合、比較的低い量子収率を示す。具体的な実施形態において、特定のアプタマーと結合していない場合、フルオロフォアの量子収率が０．１未満であり、更に好ましくは０．０１未満であり、最も好ましくは０．００１未満である。フルオロフォアが特定のアプタマーで結合された後、フルオロフォアの量子収率が２倍以上向上し、更に好ましくは１０倍以上向上し、最も好ましくは１００倍以上向上する。フルオロフォア分子は、水溶性で、細胞に無毒で細胞膜を透過しやすいものが好ましい。本発明のフルオロフォアは、能動輸送又は受動拡散によって細胞膜又は細胞壁を介して細胞質又はペリプラズムに入ることができるものが好ましい。本発明の実施形態において、フルオロフォアは、グラム陰性菌の外膜及び内膜、植物細胞の細胞壁及び細胞膜、真菌の細胞壁及び細胞膜、動物細胞の細胞膜、並びに生体動物のＧＩ及び内皮細胞膜を透過する。
【0052】
本発明にかかる核酸アプタマー分子は、一種のフルオロフォアと特異的に結合して、その特定の波長で励起された場合の蛍光値を著しく向上させることができる。前記フルオロフォア分子は、構造（I）から選択される。
【0053】
【化5】
【0054】
（Ι）式中：Ａｒ１、Ａｒ２は独立して、６員アリール基、６員ヘテロアリール基であり、Ｄ－は、ＨＯ－又はＮ（Ｘ１）（Ｘ２）－であり、Ｘ１、Ｘ２はそれぞれ独立して、水素、アルキル基及び変性アルキル基から選択され、Ｘ１、Ｘ２は互いに結合して、Ｎ原子と共に脂肪族複素環を形成してもよく、Ｄ－がＮ（Ｘ１）（Ｘ２）－で、Ａｒ１がフェニル基である場合、Ｘ１、Ｘ２は独立して、ベンゼン環と飽和又は不飽和のエステル複素環を形成し、Ｄ－がＨＯ－で、Ａｒ１がフェニル基である場合、ＨＯと隣接する少なくとも１個の水素原子がハロゲンで置換され、Ｙは、Ｏ、Ｓであり、Ｒ１は、水素、アルキル基及び変性アルキル基であり、Ｒ２は、水素原子、ハロゲン原子、－ＯＨ、－ＣＮであり、
式中：前記「アルキル基」はそれぞれ独立して、Ｃ１－Ｃ１０直鎖又は分岐鎖のアルキル基であり、Ｃ１－Ｃ７直鎖又は分岐鎖のアルキル基であってもよく、Ｃ１－Ｃ５直鎖又は分岐鎖のアルキル基であってもよく、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔ－ブチル基、ｓ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、１－メチルブチル基、２－メチルブチル基、３－メチルブチル基、イソペンチル基、１－エチルプロピル基、ネオペンチル基、ｎ－ヘキシル基、１－メチルペンチル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、イソヘキシル基、１，１－ジメチルブチル基、２，２－ジメチルブチル基、３，３－ジメチルブチル基、１，２－ジメチルブチル基、１，３－ジメチルブチル基、２，３－ジメチルブチル基、２－エチルブチル基、ｎ－ヘプチル基、２－メチルヘキシル基、３－メチルヘキシル基、２，２－ジメチルペンチル基、３，３－ジメチルペンチル基、２，３－ジメチルペンチル基、２，４－ジメチルペンチル基、３－エチルペンチル基又は２，２，３－トリメチルブチル基から選択されてもよく、
式中：前記「変性アルキル基」はそれぞれ独立して、アルキル基の任意の炭素原子がハロゲン原子、－ＯＨ、－ＣＯ－、－Ｏ－、－ＣＮ、－ＳＯ３Ｈ、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基から選択される一種又は複数種の基で代替された基であり、前記変性アルキル基は、１～１０個の炭素原子を有し、ただし、炭素－炭素一重結合は独立して、炭素－炭素二重結合又は炭素－炭素三重結合で代替されてもよく、
式中：前記炭素原子が代替されるとは、炭素原子が、あるいは炭素原子がその上の水素原子と共に、対応する基で代替されることであり、前記「変性アルキレン基」は、Ｃ１－Ｃ１０（好ましくは、Ｃ１－Ｃ６である）アルキレン基の任意の炭素原子が－Ｏ－、－ＯＨ、－ＣＯ－、－ＣＳ－、－（Ｓ＝Ｏ）－から選択される基で代替された基であり、
好ましくは、前記「変性アルキル基」は、－ＯＨ、－Ｏ－、エチレングリコール単位（－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－）、単糖単位、－Ｏ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＳＯ２－Ｏ－、－ＳＯ－、Ｍｅ２Ｎ－、Ｅｔ２Ｎ－、－Ｓ－Ｓ－、－ＣＨ＝ＣＨ－、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、シアノ基から選択される一種又は複数種の基を含み、
好ましくは、Ａｒ１は、下式（II－１）～（II－１５）から選択される構造であり、
式中：前記「アルキル基」はそれぞれ独立して、Ｃ１－Ｃ１０直鎖又は分岐鎖のアルキル基であり、Ｃ１－Ｃ７直鎖又は分岐鎖のアルキル基であってもよく、Ｃ１－Ｃ５直鎖又は分岐鎖のアルキル基であってもよく、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔ－ブチル基、ｓ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、１－メチルブチル基、２－メチルブチル基、３－メチルブチル基、イソペンチル基、１－エチルプロピル基、ネオペンチル基、ｎ－ヘキシル基、１－メチルペンチル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、イソヘキシル基、１，１－ジメチルブチル基、２，２－ジメチルブチル基、３，３－ジメチルブチル基、１，２－ジメチルブチル基、１，３－ジメチルブチル基、２，３－ジメチルブチル基、２－エチルブチル基、ｎ－ヘプチル基、２－メチルヘキシル基、３－メチルヘキシル基、２，２－ジメチルペンチル基、３，３－ジメチルペンチル基、２，３－ジメチルペンチル基、２，４－ジメチルペンチル基、３－エチルペンチル基又は２，２，３－トリメチルブチル基から選択されてもよく、
式中：前記「変性アルキル基」はそれぞれ独立して、アルキル基の任意の炭素原子がハロゲン原子、－ＯＨ、－ＣＯ－、－Ｏ－、－ＣＮ、－ＳＯ３Ｈ、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基から選択される一種又は複数種の基で代替された基であり、前記変性アルキル基は、１～１０個の炭素原子を有し、ただし、炭素－炭素一重結合は独立して、炭素－炭素二重結合又は炭素－炭素三重結合で代替されてもよく、
式中：前記炭素原子が代替されるとは、炭素原子が、あるいは炭素原子がその上の水素原子と共に、対応する基で代替されることであり、前記「変性アルキレン基」は、Ｃ１－Ｃ１０（好ましくは、Ｃ１－Ｃ６である）アルキレン基の任意の炭素原子が－Ｏ－、－ＯＨ、－ＣＯ－、－ＣＳ－、－（Ｓ＝Ｏ）－から選択される基で代替された基であり、
好ましくは、前記「変性アルキル基」は、－ＯＨ、－Ｏ－、エチレングリコール単位（－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－）、単糖単位、－Ｏ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＳＯ２－Ｏ－、－ＳＯ－、Ｍｅ２Ｎ－、Ｅｔ２Ｎ－、－Ｓ－Ｓ－、－ＣＨ＝ＣＨ－、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、シアノ基から選択される一種又は複数種の基を含み、
好ましくは、Ａｒ１は、下式（II－１）～（II－１５）から選択される構造であり、
【0055】
【化6】
【0056】
Ａｒ２は、下式（III－１）～（III－２５）から選択される構造である。
【0057】
【化7】
【0058】
好ましくは、式（Ｉ）で示される化合物は、下式化合物から選択される。
【0059】
【化8(1)】
【化8(2)】
【0060】
本発明の好適な実施形態において、前記フルオロフォア分子は、ＩＶ－１、ＩＶ－２、ＩＶ－３、ＩＶ－４、ＩＶ－５、ＩＶ－６、ＩＶ－７、ＩＶ－８、ＩＶ－９、ＩＶ－１０、ＩＶ－１１、ＩＶ－１２、ＩＶ－１３、ＩＶ－１４、ＩＶ－１５、ＩＶ－１６、ＩＶ－１７、ＩＶ－１８、ＩＶ－１９、ＩＶ－２０、ＩＶ－２１、ＩＶ－２２、ＩＶ－２３、ＩＶ－２４、ＩＶ－２５、ＩＶ－２６、ＩＶ－２７、ＩＶ－２８、ＩＶ－２９、ＩＶ－３０、ＩＶ－３１、ＩＶ－３２、ＩＶ－３３、ＩＶ－３４、ＩＶ－３５、ＩＶ－３６、ＩＶ－３７、ＩＶ－３８、ＩＶ－３９、ＩＶ－４０を含む。本発明において「蛍光シグナルの向上」、「蛍光の増加」、「蛍光強度の向上」、「蛍光強度の増加」とは、適切な波長の励起光で照射された場合のフルオロフォアの量子収率の向上、又は蛍光シグナルの最大発光ピークのシフト（エタノール又は水溶液でのフルオロフォア自体の発光ピークに対して）、又はモル吸光係数の増加、又はこれらの２種以上である。本発明の一好適な実施形態において、量子収率の増加は少なくとも２倍であり、本発明の別の好適な実施形態において、量子収率の増加は少なくとも５～１０倍であり、本発明の別のより好適な実施形態において、量子収率の増加は少なくとも２０～５０倍であり、本発明の別のより好適な実施形態において、量子収率の増加は少なくとも１００～２００倍であり、本発明の別のより好適な実施形態において、量子収率の増加は少なくとも２００倍以上である。フルオロフォアを励起して蛍光シグナルを生じさせる光源は、任意の適切な光照射装置であればよく、例えば、ＬＥＤライト、白熱灯、蛍光灯、レーザーを含み、励起光は、これらの装置から直接発光されたものでもよいし、他のフルオロフォア、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のドナーフルオロフォア、又は発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）のドナー発光団を介して間接的に得られるものでもよい。
【0061】
標的分子
本発明にかかる標的分子は、任意の生体材料又は小分子であってもよく、タンパク質、核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）、脂質分子、炭水化物、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、代謝物、金属イオンなどを含むが、これらに限定されない。標的分子は、疾患又は病原菌感染に関わる分子であってもよい。
本発明にかかる標的分子は、任意の生体材料又は小分子であってもよく、タンパク質、核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）、脂質分子、炭水化物、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、代謝物、金属イオンなどを含むが、これらに限定されない。標的分子は、疾患又は病原菌感染に関わる分子であってもよい。
【0062】
本発明にかかるアプタマー分子、例えば、図１で示される構造において、挿入されたヌクレオチド配列が図１におけるＮ１４－Ｎ１５－Ｎ１６の茎－環構造を代替したことによって、該ヌクレオチド配列は、標的分子を特異的に識別／結合することができる。標的分子の非存在時に、アプタマー分子はフルオロフォア分子と結合しないか、あるいは結合能が弱く、フルオロフォア分子の適切な波長の励起光での蛍光を著しく向上させることができないが、標的分子の存在時に、標的分子と前記ヌクレオチド配列との結合は、アプタマー分子とフルオロフォア分子との結合を促進し、フルオロフォア分子の適切な波長の励起光での蛍光を著しく向上させ、標的分子に対する検出、イメージング及び定量分析を実現する。
【0063】
標的分子はまた、細胞全体又は細胞表面全体で発現されている分子であってもよい。典型的な細胞は、ガン細胞、細菌細胞、真菌細胞、及び正常な動物細胞を含むが、これらに限定されない。標的分子は、ウイルス粒子であってもよい。現在、多くの上記標的分子のアプタマーが同定され、それらを本発明の複数種の核酸アプタマーにインテグレートすることが可能となった。現在、報道されている標的分子と結合できるＲＮＡアプタマーは、Ｔ４ＲＮＡポリメラーゼアプタマー、ＨＩＶ逆転写酵素アプタマー、ファージＲ１７キャプシドタンパク質アプタマーを含むが、これらに限定されない。
【0064】
標的核酸分子
「標的核酸分子」とは、「ターゲット核酸分子」とも称され、検出される核酸分子のことであり、細胞内のものであってもよく、細胞外のものであってもよく、標的ＲＮＡ分子及び標的ＤＮＡ分子を含む。本発明は、標的核酸分子と前記核酸アプタマー分子とを連結することで、フルオロフォア分子と核酸アプタマー分子とを結合させることによって、フルオロフォア分子の適切な波長の励起光での蛍光値を著しく向上させ、更に、標的核酸分子の含有量と分布を測定するという目的を達成する。
「標的核酸分子」とは、「ターゲット核酸分子」とも称され、検出される核酸分子のことであり、細胞内のものであってもよく、細胞外のものであってもよく、標的ＲＮＡ分子及び標的ＤＮＡ分子を含む。本発明は、標的核酸分子と前記核酸アプタマー分子とを連結することで、フルオロフォア分子と核酸アプタマー分子とを結合させることによって、フルオロフォア分子の適切な波長の励起光での蛍光値を著しく向上させ、更に、標的核酸分子の含有量と分布を測定するという目的を達成する。
【0065】
「標的ＲＮＡ分子」は、本発明において、任意のＲＮＡ分子を含み、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、細胞自体又は外源発現生成物をコードするｍＲＮＡ、ｐｒｅ－ｒＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ファージキャプシドタンパク質ＭＣＰ識別結合配列ＭＳ２ＲＮＡ、ファージキャプシドタンパク質ＰＣＰ識別結合配列ＰＰ７ＲＮＡ、λファージ転写終結タンパク質Ｎ識別結合配列ｂｏｘＢ ＲＮＡなどを含むが、これらに限定されない。標的ＲＮＡは、本発明ＲＮＡアプタマー分子の５’末端又は３’末端又はＮ１４－Ｎ１５－Ｎ１６の位置に融合することができる。
【0066】
「ｓｇＲＮＡ」とは、本発明において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにてｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡを改造した後に形成されたシングルガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）であり、その５’末端の２０ｎｔ程度の配列が塩基の相補的塩基対形成によってＤＮＡ部位をターゲットし、Ｃａｓ９タンパク質の当該部位でのＤＮＡ二重鎖の破断誘発を促進する。
【0067】
核酸アプタマーのコンカテマー
本発明にかかる核酸アプタマー分子は、更に、複数個のフルオロフォア分子を連結可能なコンカテマーをも含むことができる。前記コンカテマーは、適宜な長さのスペーサー配列によって連結され、直列連結されたＣａｒｒｏｔ構造の個数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上であってもよい。コンカテマーは様々の形態があり得、本発明の好適な一実施形態において、直列連結の形態は、「直列連結１」であり、図７ａで示されるように、好ましいヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８、９、１０又は１１であり、そのうちの２Ｃａｒｒｏｔ－２は、Ｃａｒｒｏｔ－２構造を２個有するコンカテマー１を表す。本発明の別の好適な実施形態において、直列連結の形態は、「直列連結２」であり、図７ｂで示されるように、好ましいヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、１３、１４、１５又は１６であり、そのうちの２×Ｃａｒｒｏｔ－２は、Ｃａｒｒｏｔ－２構造を２個有するコンカテマー２を表す。本発明の別の好適な実施形態において、直列連結の形態は、「直列連結３」であり、図７ｃで示されるように、好ましいヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、１８、１９又は２０であり、そのうちの２×２Ｃａｒｒｏｔ－２は、Ｃａｒｒｏｔ－２構造を４個有するコンカテマー３を表す。いずれの形態においても、コンカテマーの間のスペーサー配列は取替可能である。
本発明にかかる核酸アプタマー分子は、更に、複数個のフルオロフォア分子を連結可能なコンカテマーをも含むことができる。前記コンカテマーは、適宜な長さのスペーサー配列によって連結され、直列連結されたＣａｒｒｏｔ構造の個数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上であってもよい。コンカテマーは様々の形態があり得、本発明の好適な一実施形態において、直列連結の形態は、「直列連結１」であり、図７ａで示されるように、好ましいヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８、９、１０又は１１であり、そのうちの２Ｃａｒｒｏｔ－２は、Ｃａｒｒｏｔ－２構造を２個有するコンカテマー１を表す。本発明の別の好適な実施形態において、直列連結の形態は、「直列連結２」であり、図７ｂで示されるように、好ましいヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、１３、１４、１５又は１６であり、そのうちの２×Ｃａｒｒｏｔ－２は、Ｃａｒｒｏｔ－２構造を２個有するコンカテマー２を表す。本発明の別の好適な実施形態において、直列連結の形態は、「直列連結３」であり、図７ｃで示されるように、好ましいヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、１８、１９又は２０であり、そのうちの２×２Ｃａｒｒｏｔ－２は、Ｃａｒｒｏｔ－２構造を４個有するコンカテマー３を表す。いずれの形態においても、コンカテマーの間のスペーサー配列は取替可能である。
【0068】
本発明にかかる単量体形態のアプタマーとは、Ｃａｒｒｏｔ構造を１個のみ含有するアプタマーであり、すなわち、図１で示されるアプタマーを１個のみ含有する。
【0069】
多量体形態のアプタマーとは、Ｃａｒｒｏｔ構造のアプタマーを１個以上含有し、図７で示される直列連結形態で構成されたアプタマーを含むが、これに限定されない。
【0070】
アプタマー－フルオロフォア複合体
本発明のアプタマー－フルオロフォア複合体は、１個の核酸アプタマー分子と１個又は複数個のフルオロフォア分子とを含む。本発明の具体的な一実施形態において、１個の核酸分子と１個のフルオロフォア分子とを含む分子複合体は、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－１、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－２、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－３、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－４、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－５、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－６、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－７、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－８、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－９、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－１０、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－１１、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－１２、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－１３、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－１４、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－１５、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－１６、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－１７、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－１８、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－１９、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－２０、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－２１、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－２２、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－２３、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－２４、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－２５、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－２６、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－２７、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－２８、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－２９、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－３０、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－３１、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－３２、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－３３、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－３４、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－３５、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－３６、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－３７、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－３８、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－３９、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－４０である。
本発明のアプタマー－フルオロフォア複合体は、１個の核酸アプタマー分子と１個又は複数個のフルオロフォア分子とを含む。本発明の具体的な一実施形態において、１個の核酸分子と１個のフルオロフォア分子とを含む分子複合体は、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－１、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－２、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－３、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－４、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－５、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－６、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－７、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－８、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－９、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－１０、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－１１、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－１２、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－１３、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－１４、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－１５、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－１６、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－１７、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－１８、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－１９、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－２０、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－２１、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－２２、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－２３、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－２４、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－２５、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－２６、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－２７、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－２８、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－２９、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－３０、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－３１、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－３２、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－３３、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－３４、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－３５、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－３６、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－３７、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－３８、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－３９、Ｃａｒｒｏｔ－１－IV－４０である。
【0071】
本発明の別の具体的な実施形態において、コンカテマーの核酸分子と複数個のフルオロフォア分子とが複合体を形成し、例えば、「直列連結１」の形態で形成されたアプタマー単位を４個含むＦ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２と４個のフルオロフォア分子とが形成された複合体Ｆ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２－４×（ＩＶ－１）、Ｆ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２－４×（ＩＶ－２）、Ｆ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２－４×（ＩＶ－３）、Ｆ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２－４×（ＩＶ－４）、Ｆ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２－４×（ＩＶ－５）、Ｆ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２－４×（ＩＶ－６）、Ｆ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２－４×（ＩＶ－３７）、Ｆ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２－４×（ＩＶ－１７）、Ｆ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２－４×（ＩＶ－１８）、Ｆ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２－４×（ＩＶ－１９）、Ｆ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２－４×（ＩＶ－２０）、Ｆ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２－４×（ＩＶ－２１）、及びＦ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２－４×（ＩＶ－２２）である。前記分子複合体は、インビトロで独立した２種類の溶液として存在し、又は同一の溶液中で存在してもよく、細胞内に存在してもよい。
【0072】
核酸アプタマー機能
本発明のアプタマー機能とは、フルオロフォア分子の適切な波長の励起光での蛍光強度を著しく向上できることであり、具体的な実施例に記載の慣用の実験方法（五）核酸アプタマーの機能検出を用いてアプタマーを測定することができる。本発明の一好適な一実施形態において、蛍光強度の増加が少なくとも２倍であり（蛍光強度は実験方法（五）に従って検出）、本発明の別の好適な実施形態において、蛍光強度の増加が少なくとも５～１０倍であり、本発明の別のより好適な実施形態において、蛍光強度の増加が少なくとも２０～５０倍であり、本発明の別のより好適な実施形態において、蛍光強度の増加が少なくとも１００～２００倍であり、本発明の別のより好適な実施形態において、蛍光強度の増加が少なくとも２００倍以上である。
本発明のアプタマー機能とは、フルオロフォア分子の適切な波長の励起光での蛍光強度を著しく向上できることであり、具体的な実施例に記載の慣用の実験方法（五）核酸アプタマーの機能検出を用いてアプタマーを測定することができる。本発明の一好適な一実施形態において、蛍光強度の増加が少なくとも２倍であり（蛍光強度は実験方法（五）に従って検出）、本発明の別の好適な実施形態において、蛍光強度の増加が少なくとも５～１０倍であり、本発明の別のより好適な実施形態において、蛍光強度の増加が少なくとも２０～５０倍であり、本発明の別のより好適な実施形態において、蛍光強度の増加が少なくとも１００～２００倍であり、本発明の別のより好適な実施形態において、蛍光強度の増加が少なくとも２００倍以上である。
【0073】
核酸アプタマー二次構造
本発明における核酸アプタマーの二次構造は、ｍＦｏｌｄオンライン分析ソフトウェアによってシミュレーション予測して得られたものである（ｈｔｔｐ：／／ｕｎａｆｏｌｄ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／？ｑ＝ｍｆｏｌｄ）。二次構造における茎構造とは、核酸アプタマー分子一本鎖内の一部の領域で水素結合力により相補的塩基対をなして形成された局部の二重鎖構造である。一般的には、二重鎖構造の形成は、この部分の領域内のすべてのヌクレオチドが相補的塩基対を形成する必要がない。一般的には、Ｎ１とＮ２３、及びＮ１４とＮ１６のうちの一部の配列の少なくとも５０％のヌクレオチドと別の断片とが相補的塩基対をなせば、茎構造を形成できる。Ｎ１とＮ２３が単個（単一）のヌクレオチドである場合、Ｎ１とＮ２３が完全な相補性でなければ、茎構造を形成することができない（図１で示されるように）。
本発明における核酸アプタマーの二次構造は、ｍＦｏｌｄオンライン分析ソフトウェアによってシミュレーション予測して得られたものである（ｈｔｔｐ：／／ｕｎａｆｏｌｄ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／？ｑ＝ｍｆｏｌｄ）。二次構造における茎構造とは、核酸アプタマー分子一本鎖内の一部の領域で水素結合力により相補的塩基対をなして形成された局部の二重鎖構造である。一般的には、二重鎖構造の形成は、この部分の領域内のすべてのヌクレオチドが相補的塩基対を形成する必要がない。一般的には、Ｎ１とＮ２３、及びＮ１４とＮ１６のうちの一部の配列の少なくとも５０％のヌクレオチドと別の断片とが相補的塩基対をなせば、茎構造を形成できる。Ｎ１とＮ２３が単個（単一）のヌクレオチドである場合、Ｎ１とＮ２３が完全な相補性でなければ、茎構造を形成することができない（図１で示されるように）。
【0074】
核酸アプタマーを発現するＤＮＡ分子
前記ＤＮＡ分子は、本発明の核酸アプタマー分子をコードできるＤＮＡ配列を含む。前記ＤＮＡ分子は、ヌクレオチド配列Ｒ１ＡＧＡＴＴＧＴＡＡＡＣＡＲ１４－Ｒ１５－Ｒ１６ＧＡＣＡＣＴＲ２３、及びそれと少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。そのうち、Ｒ１が一般式Ｃａｒｒｏｔ構造におけるＮ１をコードし、Ｒ１４が一般式Ｃａｒｒｏｔ構造におけるＮ１４をコードし、Ｒ１５が一般式Ｃａｒｒｏｔ構造におけるＮ１５をコードし、Ｒ１６が一般式Ｃａｒｒｏｔ構造におけるＮ１６をコードし、Ｒ２３が一般式Ｃａｒｒｏｔ構造におけるＮ２３をコードする。前記ＤＮＡ分子は、更に、ＤＮＡ転写を制御するプロモーターを１個含んでもよく、プロモーターと核酸アプタマーをコードするＤＮＡ配列との間は、操作可能に連結される。本発明の一具体的な実施形態において、ＤＮＡ分子はＵ６プロモーターを含み、本発明の別の具体的な実施形態において、ＤＮＡ分子はＣＭＶプロモーターを含む。ＤＮＡ分子は前記ＤＮＡ分子を含むほか、更に、任意の標的核酸分子をコードするＤＮＡ配列をも含むことができる。本発明の一具体的な実施形態において、標的ＲＮＡをコードするＤＮＡ分子は、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）又はβ－アクチン（β－ａｃｔｉｎ）をコードするＤＮＡ配列を含む（キメラＲＮＡの配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２６、２７である）。
前記ＤＮＡ分子は、本発明の核酸アプタマー分子をコードできるＤＮＡ配列を含む。前記ＤＮＡ分子は、ヌクレオチド配列Ｒ１ＡＧＡＴＴＧＴＡＡＡＣＡＲ１４－Ｒ１５－Ｒ１６ＧＡＣＡＣＴＲ２３、及びそれと少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。そのうち、Ｒ１が一般式Ｃａｒｒｏｔ構造におけるＮ１をコードし、Ｒ１４が一般式Ｃａｒｒｏｔ構造におけるＮ１４をコードし、Ｒ１５が一般式Ｃａｒｒｏｔ構造におけるＮ１５をコードし、Ｒ１６が一般式Ｃａｒｒｏｔ構造におけるＮ１６をコードし、Ｒ２３が一般式Ｃａｒｒｏｔ構造におけるＮ２３をコードする。前記ＤＮＡ分子は、更に、ＤＮＡ転写を制御するプロモーターを１個含んでもよく、プロモーターと核酸アプタマーをコードするＤＮＡ配列との間は、操作可能に連結される。本発明の一具体的な実施形態において、ＤＮＡ分子はＵ６プロモーターを含み、本発明の別の具体的な実施形態において、ＤＮＡ分子はＣＭＶプロモーターを含む。ＤＮＡ分子は前記ＤＮＡ分子を含むほか、更に、任意の標的核酸分子をコードするＤＮＡ配列をも含むことができる。本発明の一具体的な実施形態において、標的ＲＮＡをコードするＤＮＡ分子は、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）又はβ－アクチン（β－ａｃｔｉｎ）をコードするＤＮＡ配列を含む（キメラＲＮＡの配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２６、２７である）。
【0075】
プロモーター
「プロモーター」は、本発明において、真核細胞と原核細胞のプロモーターを含む。真核細胞のプロモーター配列は、原核細胞のプロモーター配列とは全く異なる。一般には、真核プロモーターは、原核細胞におけるＲＮＡポリメラーゼに識別されてＲＮＡの転写を媒介することができない。同様の理由により、原核プロモーターも、真核細胞におけるＲＮＡポリメラーゼに識別されてＲＮＡの転写を媒介することができない。異なるプロモーターは強度の差が大きい（強度とは、転写を媒介する能力のことである）。実際の応用によって、強いプロモーターを用いて高レベルの転写を実現することができる。例えば、標識に用いる場合、高レベルの発現のほうが好ましいが、転写挙動を評価する場合、比較的低いレベルの転写では、細胞の適時な転写過程の調整を許容できる。宿主細胞によって、一種又は複数種の適切なプロモーターを選択して使用できる。例えば、大腸菌細胞に用いる場合、Ｔ７ファージプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、リボソームＲＮＡプロモーター、λファージにおけるＰＲとＰＬプロモーター、及びその他プロモーターがあるが、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｏｍｐＦプロモーター、ｂｌａプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどに限られない。また、１個のハイブリッドのｔｒｐ－ｌａｃＵＶ５プロモーター（ｔａｃプロモーター）、又は他のＤＮＡの組換え又は合成技術によって得られた大腸菌プロモーターはいずれも、本発明にかかるＲＮＡアプタマーの転写に使用できる。細菌はそれ自体の一部のオペレーター配列がプロモーター配列と結合して共に誘導性プロモーターを構成でき、この場合、特定のインデューサーを加えなければ、ＤＮＡ分子の転写を誘導できない。例えば、ｌａｃオペレーターは、ラクトース又はラクトース類似体（ＩＰＴＧ）を加えてその発現を誘導する必要があり、他のオペレーターは、ｔｒｐ、ｐｒｏなどがある。
「プロモーター」は、本発明において、真核細胞と原核細胞のプロモーターを含む。真核細胞のプロモーター配列は、原核細胞のプロモーター配列とは全く異なる。一般には、真核プロモーターは、原核細胞におけるＲＮＡポリメラーゼに識別されてＲＮＡの転写を媒介することができない。同様の理由により、原核プロモーターも、真核細胞におけるＲＮＡポリメラーゼに識別されてＲＮＡの転写を媒介することができない。異なるプロモーターは強度の差が大きい（強度とは、転写を媒介する能力のことである）。実際の応用によって、強いプロモーターを用いて高レベルの転写を実現することができる。例えば、標識に用いる場合、高レベルの発現のほうが好ましいが、転写挙動を評価する場合、比較的低いレベルの転写では、細胞の適時な転写過程の調整を許容できる。宿主細胞によって、一種又は複数種の適切なプロモーターを選択して使用できる。例えば、大腸菌細胞に用いる場合、Ｔ７ファージプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、リボソームＲＮＡプロモーター、λファージにおけるＰＲとＰＬプロモーター、及びその他プロモーターがあるが、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｏｍｐＦプロモーター、ｂｌａプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどに限られない。また、１個のハイブリッドのｔｒｐ－ｌａｃＵＶ５プロモーター（ｔａｃプロモーター）、又は他のＤＮＡの組換え又は合成技術によって得られた大腸菌プロモーターはいずれも、本発明にかかるＲＮＡアプタマーの転写に使用できる。細菌はそれ自体の一部のオペレーター配列がプロモーター配列と結合して共に誘導性プロモーターを構成でき、この場合、特定のインデューサーを加えなければ、ＤＮＡ分子の転写を誘導できない。例えば、ｌａｃオペレーターは、ラクトース又はラクトース類似体（ＩＰＴＧ）を加えてその発現を誘導する必要があり、他のオペレーターは、ｔｒｐ、ｐｒｏなどがある。
【0076】
上述のように、ＤＮＡ分子をコードする配列の５’末端の調節配列はプロモーターである。インビトロの転写でＲＮＡアプタマーを得るにも、培養する細胞又は組織でアプタマーを発現するにも、プロモーターの強度に応じて適切なプロモーターを選択する必要がある。インビボで発現するアプタマーは遺伝子操作が可能なため、別のタイプのプロモーターは、特定の環境に応じてＤＮＡ転写を誘導する誘導性プロモーターであり、例えば、特定の組織、特定の時間、特定の発達段階などで発現するものである。これらの異なるプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ又はＩＩＩによって識別することができる。
【0077】
真核細胞において転写の開始にも適切なプロモーターが必要であり、β－グロブリンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、β－アクチンプロモーター、アクチンプロモーター、Ｃｓｔｆ２ｔプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＭＭＴＶプロモーター、アデノウイルスＥｌａプロモーター、ＣＭＶプロモーターなどを含むが、これらに限定されない。真核細胞において転写の終了は、ＲＮＡ配列における特定の切断部位に依存する。同様に、ＲＮＡポリメラーゼが転写する遺伝子によって、その転写ターミネーターの差も大きい。しかし、適切な３’転写ターミネーター領域のスクリーニングは、当業者が基礎的な実験技術によれば実現できる。
【0078】
発現系
本発明の「発現系」は、「発現ベクター」とも称され、核酸アプタマーを発現するＤＮＡ分子をインテグレート・含有する。本発明の発現系は、プラスミドであってもよく、ウイルス粒子であってもよい。
本発明の「発現系」は、「発現ベクター」とも称され、核酸アプタマーを発現するＤＮＡ分子をインテグレート・含有する。本発明の発現系は、プラスミドであってもよく、ウイルス粒子であってもよい。
【0079】
「発現ベクター」組換えウイルスは、ウイルスを感染した細胞にプラスミドをトランスフェクションすることによって得ることができる。適切なベクターは、ウイルスベクター、例えば、λベクター系ｇｔ１１、ｇｔ ＷＥＳ．ｔＢ、Ｃｈａｒｏｎ ４を含むが、これらに限定されない。プラスミドベクターは、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＬＧ３９９、ｐＲ２９０、ｐＫＣ３７、ｐＫＣ１０１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋／－又はＫＳ＋／－（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅクローンシステムを参照）、ｐＥＴ２８シリーズ、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ１、ｐＣＤＦＤｕｅｔ１、ｐＲＳＥＴシリーズ、ｐＢＡＤシリーズ、ｐＱＥ、ｐＩＨ８２１，ｐＧＥＸ、ｐＩＩＩＥｘ４２６ＲＰＲなどを含む。
【0080】
多くの宿主発現系は、本発明にかかるＤＮＡ分子の発現に使用できる。主に、ベクター系は、用いられる宿主細胞と相溶性でなければならず、宿主・ベクター系は、転換されたファージＤＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ、又はコスミドＤＮＡの細菌、酵母ベクターを含む酵母、ウイルス（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、逆転写ウイルス）を感染した哺乳類細胞、プラスミドをトランスフェクションした哺乳類細胞、ウイルスを感染した昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス）、細菌を感染した又は粒子砲撃によって転換された植物細胞を含むが、これらに限定されない。前記ベクターにおける転写要素の強度及び特性の差が大きい。用いられる宿主－ベクター系に応じて、任意の一種又は複数種の適切な転写要素を選択して使用する。
【0081】
構築されたＤＮＡ分子がベクター系にクローンされたら、それらを容易に宿主細胞に移すことができる。ベクター又は宿主細胞システムによって、方法は、転換、形質導入、結合、固定、エレクトロポレーションなどを含むが、これらに限定されない。
【0082】
本発明の具体的な一実施形態では、Ｆ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２ ＲＮＡをコードするＤＮＡ分子を含む発現プラスミドｐＥＴ２８ａ－Ｔ７－Ｆ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２及びｐＹＥＳ２．１－Ｆ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２を提供する。本発明の別の具体的な実施形態では、ｔＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２ ＲＮＡをコードするＤＮＡ分子を含む発現プラスミドｐＵ６－ｔＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２を提供する。本発明の別の具体的な実施形態では、Ｆ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２ ＲＮＡをコードするＤＮＡ分子を含む発現プラスミドｐＵ６－Ｆ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２を提供する。本発明の別の具体的な実施形態では、ＧＡＰＤＨ－４Ｃａｒｒｏｔ－２及びＡＣＴＢ－４Ｃａｒｒｏｔ－２をコードするＤＮＡ分子を含む、発現プラスミドｐＣＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏ（＋）－ＧＡＰＤＨ－４Ｃａｒｒｏｔ－２及びｐＣＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏ（＋）－ＡＣＴＢ－４Ｃａｒｒｏｔ－２を提供する。本発明の別の具体的な実施形態では、ｓｇＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２－１、ｓｇＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２－２及びｓｇＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２－３をコードするＤＮＡ分子を含む発現プラスミドｐｓｇＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２－１、ｐｓｇＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２－２及びｐｓｇＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２－３を提供する。本発明の別の具体的な実施形態では、Ｃａｒｒｏｔ－１－ＭＳ２をコードするＤＮＡ分子を含む発現プラスミドｐＵ６－Ｃａｒｒｏｔ－１－ＭＳ２を提供する。
【0083】
本発明は、核酸アプタマーをコードするＤＮＡ分子をインテグレートしたが、標的ＲＮＡ分子コーディングＤＮＡ配列の欠如した発現ベクターをも提供する。標的ＲＮＡ分子コーディングＤＮＡ配列の欠如により、ユーザーは自分で検出したい標的ＲＮＡ分子のＤＮＡ配列、例えば、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対応するコーディングＤＮＡ配列を選択して、標準の組換えＤＮＡ技術でＤＮＡ配列を本発明のこのような発現ベクターに挿入し、得られる発現ベクターを宿主細胞に導入（トランスフェクション、転換、感染など）して、標的ＲＮＡの含有量及び分布を検出することができる。
【0084】
宿主細胞
「宿主細胞」は、本発明において、細菌、酵母、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、ゼブラフィッシュ細胞、ショウジョウバエ細胞、線虫細胞を含むが、これらに限定されない。宿主細胞はより好ましくは、培養されたインビトロ細胞又は全体のインビボ活体組織である。本発明における宿主細胞は、含まれる哺乳類細胞が、２９７Ｔ、ＣＯＳ－７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、Ｈ１２９９、受精卵幹細胞、誘導全能性幹細胞、哺乳類組織から直接分離された初代細胞などを含むが、これらに限定されず、含まれる大腸菌細胞が、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３，Ｓｔａｒ）、ＴＯＰ１０、Ｍａｃｈ１、ＤＨ５αを含むが、これらに限定されず、含まれる酵母細胞が、ＢＹ４７４１、ＢＹ４７４２、ＡＨ１０９を含むが、これらに限定されない。
「宿主細胞」は、本発明において、細菌、酵母、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、ゼブラフィッシュ細胞、ショウジョウバエ細胞、線虫細胞を含むが、これらに限定されない。宿主細胞はより好ましくは、培養されたインビトロ細胞又は全体のインビボ活体組織である。本発明における宿主細胞は、含まれる哺乳類細胞が、２９７Ｔ、ＣＯＳ－７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、Ｈ１２９９、受精卵幹細胞、誘導全能性幹細胞、哺乳類組織から直接分離された初代細胞などを含むが、これらに限定されず、含まれる大腸菌細胞が、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３，Ｓｔａｒ）、ＴＯＰ１０、Ｍａｃｈ１、ＤＨ５αを含むが、これらに限定されず、含まれる酵母細胞が、ＢＹ４７４１、ＢＹ４７４２、ＡＨ１０９を含むが、これらに限定されない。
【0085】
検出アレイ
本発明にかかる検出アレイは、１個又は複数個の本発明の核酸アプタマー分子を含み、そのうち、核酸アプタマー分子はアレイ表面の離れた位置にアンカー固定され、アレイ表面は固体の支持体で構成され、ガラス、金属、陶瓷（セラミックス）などを含むが、これらに限定されない。本発明にかかる核酸アプタマー分子のアレイ表面へのアンカー固定は、下記の方法によって実現されるが、これらに限定されない。（１）ビオチンによって前記核酸アプタマー分子の５’又は３’末端を標識し、ストレプトアビジンをアレイ表面に被覆し、ビオチンとストレプトアビジンとの特異的結合によって前記核酸アプタマー分子をアンカー固定する。（２）ファージキャプシドタンパク質ＭＣＰ識別結合配列ＭＳ２、ファージキャプシドタンパク質ＰＣＰ識別結合配列ＰＰ７、又はλファージ転写終結タンパク質Ｎ識別結合配列ｂｏｘＢ ＲＮＡ配列を、前記核酸アプタマー分子の５’、３’又は茎環構造に融合させて、それらの識別・結合したタンパク質ＭＣＰ、ＰＰ７又はλＮタンパク質をアレイ表面に被覆し、ＭＳ２とＭＣＰタンパク質、ＰＰ７とＰＣＰタンパク質、又はｂｏｘＢ ＲＮＡとλＮタンパク質との特異的作用によって前記核酸アプタマー分子をアンカー固定する。（３）一部のＲＮＡ又はＤＮＡ配列を、前記核酸アプタマー分子の５’又は３’末端に融合させて、当該ＲＮＡ配列と相補性のＲＮＡ配列又は当該ＤＮＡ配列と相補性のＤＮＡ配列を、アレイ表面にアンカー固定し、分子ハイブリッドの原理によって前記核酸アプタマー分子をアレイ表面にアンカー固定する。前記検出アレイは、標的分子の存在の有無及び濃度高低の検出に使用できるため、標的分子が存在する場合のみ、前記核酸アプタマー分子はフルオロフォア分子と結合して、その適切な励起光波長での蛍光強度を著しく向上させ、かつ一定の範囲内で、標的分子の濃度が高ければ、蛍光強度が高い。
本発明にかかる検出アレイは、１個又は複数個の本発明の核酸アプタマー分子を含み、そのうち、核酸アプタマー分子はアレイ表面の離れた位置にアンカー固定され、アレイ表面は固体の支持体で構成され、ガラス、金属、陶瓷（セラミックス）などを含むが、これらに限定されない。本発明にかかる核酸アプタマー分子のアレイ表面へのアンカー固定は、下記の方法によって実現されるが、これらに限定されない。（１）ビオチンによって前記核酸アプタマー分子の５’又は３’末端を標識し、ストレプトアビジンをアレイ表面に被覆し、ビオチンとストレプトアビジンとの特異的結合によって前記核酸アプタマー分子をアンカー固定する。（２）ファージキャプシドタンパク質ＭＣＰ識別結合配列ＭＳ２、ファージキャプシドタンパク質ＰＣＰ識別結合配列ＰＰ７、又はλファージ転写終結タンパク質Ｎ識別結合配列ｂｏｘＢ ＲＮＡ配列を、前記核酸アプタマー分子の５’、３’又は茎環構造に融合させて、それらの識別・結合したタンパク質ＭＣＰ、ＰＰ７又はλＮタンパク質をアレイ表面に被覆し、ＭＳ２とＭＣＰタンパク質、ＰＰ７とＰＣＰタンパク質、又はｂｏｘＢ ＲＮＡとλＮタンパク質との特異的作用によって前記核酸アプタマー分子をアンカー固定する。（３）一部のＲＮＡ又はＤＮＡ配列を、前記核酸アプタマー分子の５’又は３’末端に融合させて、当該ＲＮＡ配列と相補性のＲＮＡ配列又は当該ＤＮＡ配列と相補性のＤＮＡ配列を、アレイ表面にアンカー固定し、分子ハイブリッドの原理によって前記核酸アプタマー分子をアレイ表面にアンカー固定する。前記検出アレイは、標的分子の存在の有無及び濃度高低の検出に使用できるため、標的分子が存在する場合のみ、前記核酸アプタマー分子はフルオロフォア分子と結合して、その適切な励起光波長での蛍光強度を著しく向上させ、かつ一定の範囲内で、標的分子の濃度が高ければ、蛍光強度が高い。
【0086】
キット
本発明のキットは、本発明にかかる核酸アプタマー分子及び／又はフルオロフォア分子、及び対応する説明書を含み、あるいは、前記核酸アプタマー分子を発現する発現系及び／又はフルオロフォア分子、及び対応する説明書を含み、あるいは、核酸アプタマー分子発現系を発現する宿主細胞及び／又はフルオロフォア分子、及び対応する説明書を含む。キットにおける核酸アプタマー分子とフルオロフォア分子がそれぞれ独立した溶液に存在し、又は核酸アプタマー分子とフルオロフォア分子が同一の溶液に存在する。
本発明のキットは、本発明にかかる核酸アプタマー分子及び／又はフルオロフォア分子、及び対応する説明書を含み、あるいは、前記核酸アプタマー分子を発現する発現系及び／又はフルオロフォア分子、及び対応する説明書を含み、あるいは、核酸アプタマー分子発現系を発現する宿主細胞及び／又はフルオロフォア分子、及び対応する説明書を含む。キットにおける核酸アプタマー分子とフルオロフォア分子がそれぞれ独立した溶液に存在し、又は核酸アプタマー分子とフルオロフォア分子が同一の溶液に存在する。
【0087】
実施例
以下、実施例によって本発明について更に説明する。これらの実施例は例示用のものに過ぎず、本発明の技術的範囲を何ら制限していない。実施例では主に通常の遺伝子工程分子生物学のクローン方法を使用し、これらの方法は当業者が熟知しているものであり、例えば、ジェーン・ロスカムスらの「分子生物学実験室リファレンスマニュアル」（中訳版）、及びＪ．サムブルック、Ｄ．Ｗ．ラッセル著，黄培堂ら訳，「分子クローニング実験マニュアル」（第三版、２００２年８月、科学出版社出版、北京）の関連する章・節である。当業者にとって、以下の実施例に従って、実情に応じて若干な変更・変換をして本発明をうまく実施するのは難しいことではない。
以下、実施例によって本発明について更に説明する。これらの実施例は例示用のものに過ぎず、本発明の技術的範囲を何ら制限していない。実施例では主に通常の遺伝子工程分子生物学のクローン方法を使用し、これらの方法は当業者が熟知しているものであり、例えば、ジェーン・ロスカムスらの「分子生物学実験室リファレンスマニュアル」（中訳版）、及びＪ．サムブルック、Ｄ．Ｗ．ラッセル著，黄培堂ら訳，「分子クローニング実験マニュアル」（第三版、２００２年８月、科学出版社出版、北京）の関連する章・節である。当業者にとって、以下の実施例に従って、実情に応じて若干な変更・変換をして本発明をうまく実施するのは難しいことではない。
【0088】
実施例で用いられたｐＣＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏ（＋）プラスミドベクターは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入し、ｐＬＫＯ．１－ｐｕｒｏプラスミドベクターは、Ｓｉｇｍａ社から購入し、ｐＥＴ２８ａプラスミドベクターは、Ｎｏｖａｇｅｎ社から購入し、ｐＹＥＳ２．１ ＴＯＰＯ ＴＡプラスミドベクターは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ＰＣＲに用いられたすべてのプライマーはいずれも、上海傑瑞生物工程技術有限公司が合成、純化及び質量分析によって正確であると同定したものである。実施例で構築された発現プラスミドはいずれも配列測定を経たものであり、配列測定は傑李測序公司が完成した。各実施例で用いられたＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、上海翊聖聖生物科技有限公司から購入し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＤＮＡポリメラーゼは、ＴａＫａＲａ社から購入し、３種類のポリメラーゼはいずれも購入時に対応するポリメラーゼ緩衝液及びｄＮＴＰが付いていた。ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｃＩ、ＸｂａＩ、ＳｐｅＩなどの制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４リガーゼ、Ｔ４ホスホリラーゼ（Ｔ４ ＰＮＫ）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社から購入し、購入時に対応する緩衝液などが付いていた。実施例で用いられたＨｉｅｆｆ Ｃｌｏｎｅ（登録商標）Ｏｎｅ Ｓｔｅｐクローンキットは、上海翊聖生物科技有限公司から購入した。特に断りがない限り、無機塩類の化学試薬はいずれも、国薬集団上海化学試剤公司から購入した。カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）は、Ａｍｅｒｅｓｃｏ社から購入し、アンピシリン（Ａｍｐ）は、Ａｍｅｒｅｓｃｏ社から購入し、３８４穴及び９６穴の蛍光検出ブラックパネルは、Ｇｒｅｎｉｅｒ社から購入した。ＤＦＨＢＩ－１Ｔ及びＤＦＨＯは、Ｌｕｃｅｒｎａ社から購入した。ＧＴＰ及びＳＡＭは、Ｓｉｇｍａ社から購入した。
【0089】
実施例で用いられたＤＮＡ純化キットは、ＢＢＩ社（カナダ）から購入し、普通プラスミドミニ抽出キットは、天根生化科技（北京）有限公司から購入した。ＢＬ２１（ＤＥ３，Ｓｔａｒ）菌株は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入した。２９３Ｔ／１７細胞及びＣＯＳ－７細胞は、中国科学院典型培養物保藏委員会細胞庫から購入した。ＢＹ４７４１酵母菌株は、上海唯地生物技術有限公司から購入した。
【0090】
実施例で用いられた機器は、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２多機能マイクロプレートリーダー（米Ｂｉｏ－Ｔｅｋ社）、Ｘ－１５Ｒ高速冷凍遠心機（米Ｂｅｃｋｍａｎ社）、Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ２２Ｒ卓上型高速冷凍遠心機（米Ｂｅｃｋｍａｎ社）、ＰＣＲ増幅装置（独Ｂｉｏｍｅｔｒａ社）、生体イメージングシステム（米Ｋｏｄａｋ社）、光度計（日本和光社）、核酸電気泳動装置（上海申能博彩生物科技有限公司）。
【0091】
略記の意味は下記のとおりである。「ｈ」は時間、「ｍｉｎ」は分、「ｓ」は秒、「ｄ」は日、「μＬ」はマイクロリットル、「ｍＬ」はミリリットル、「Ｌ」はリットル、「ｂｐ」は塩基対、「ｍＭ」はミリモル、「μＭ」はマイクロモルを表す。
【0092】
実施例で慣用の実験方法及び材料
【0093】
（一）核酸アプタマー分子の製造：
Ｔ７プロモーターを含むプライマーによって、被検ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを増幅し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社から購入）によって、回収された二重鎖ｃＤＮＡを鋳型として転写して、ＲＮＡを得た。２０μＬの転写系に、１０μＬ ３Ｍ ＮａＡｃ、１１５μＬ ＤＥＰＣ水を加えて、均一に混合した後、１５０μＬのフェノール－クロロホルム－イソプロパノール混合液（フェノール：クロロホルム：イソプロパノール＝２５：２４：１）を加えて、振盪して均一に混合し、１００００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心した後、上澄みを取った。等体積のクロロホルム溶液を加えて、振盪して均一に混合し、１００００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心した後、上澄みを取って、この手順を一度繰り返した。上澄みに２．５倍体積の無水エタノールを加えて、－２０℃の冷蔵庫で３０ｍｉｎ放置し、４℃で１２０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心し、上澄みを捨て、７５％予冷された無水エタノールで２回洗浄・沈殿した。エタノールが揮発し終わった後、適量のスクリーニング緩衝液を加えて再懸濁・沈殿し、７５℃で５ｍｉｎ処理し、室温で１０ｍｉｎ以上放置し、後の実験に用いた。
Ｔ７プロモーターを含むプライマーによって、被検ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを増幅し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社から購入）によって、回収された二重鎖ｃＤＮＡを鋳型として転写して、ＲＮＡを得た。２０μＬの転写系に、１０μＬ ３Ｍ ＮａＡｃ、１１５μＬ ＤＥＰＣ水を加えて、均一に混合した後、１５０μＬのフェノール－クロロホルム－イソプロパノール混合液（フェノール：クロロホルム：イソプロパノール＝２５：２４：１）を加えて、振盪して均一に混合し、１００００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心した後、上澄みを取った。等体積のクロロホルム溶液を加えて、振盪して均一に混合し、１００００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心した後、上澄みを取って、この手順を一度繰り返した。上澄みに２．５倍体積の無水エタノールを加えて、－２０℃の冷蔵庫で３０ｍｉｎ放置し、４℃で１２０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心し、上澄みを捨て、７５％予冷された無水エタノールで２回洗浄・沈殿した。エタノールが揮発し終わった後、適量のスクリーニング緩衝液を加えて再懸濁・沈殿し、７５℃で５ｍｉｎ処理し、室温で１０ｍｉｎ以上放置し、後の実験に用いた。
【0094】
（二）細胞培養及びトランスフェクション：
本実施例における細胞はいずれも、ＣＯ２インキュベーターにおいて１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びストレプトマイシンとペニシリンを含む高グルコース培地（ＤＭＥＭ）で培養し、８０～９０％のコンフルエンスまで成長した時点で細胞を継代培養した。トランスフェクションの際に、（Ｐｒｏｍｅｇａから購入）を用いて説明書に従って操作した。
本実施例における細胞はいずれも、ＣＯ２インキュベーターにおいて１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びストレプトマイシンとペニシリンを含む高グルコース培地（ＤＭＥＭ）で培養し、８０～９０％のコンフルエンスまで成長した時点で細胞を継代培養した。トランスフェクションの際に、（Ｐｒｏｍｅｇａから購入）を用いて説明書に従って操作した。
【0095】
（三）蛍光イメージング：
実施例において主なイメージング実験は、Ｌｅｉｃａ ＳＰ８共焦点レーザー顕微鏡によって撮影し、ＨＣＸＰＬ ＡＰＯ ６３．０×１．４７オイルミラー及びＨｙＤ検出器を使用し、４０５ｎｍ、４５７ｎｍ、４７６ｎｍ、４８８ｎｍ、４９７ｎｍ、５１４ｎｍ、５６１ｎｍ、６３３ｎｍの複数種のレーザーを用いてイメージングすることができ、各Ｃａｒｒｏｔと染料分子とで形成された複合体は、その最大励起ピークの対応波長に近いレーザーを用いてイメージングした。なお、ＧＦＰは、４８８ｎｍレーザーを使用し、Ｈｏｅｃｈｓｔ及びＤＡＰＩ蛍光は、４０５ｎｍレーザーを使用し、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅは、５６１ｎｍレーザーを使用した。
実施例において主なイメージング実験は、Ｌｅｉｃａ ＳＰ８共焦点レーザー顕微鏡によって撮影し、ＨＣＸＰＬ ＡＰＯ ６３．０×１．４７オイルミラー及びＨｙＤ検出器を使用し、４０５ｎｍ、４５７ｎｍ、４７６ｎｍ、４８８ｎｍ、４９７ｎｍ、５１４ｎｍ、５６１ｎｍ、６３３ｎｍの複数種のレーザーを用いてイメージングすることができ、各Ｃａｒｒｏｔと染料分子とで形成された複合体は、その最大励起ピークの対応波長に近いレーザーを用いてイメージングした。なお、ＧＦＰは、４８８ｎｍレーザーを使用し、Ｈｏｅｃｈｓｔ及びＤＡＰＩ蛍光は、４０５ｎｍレーザーを使用し、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅは、５６１ｎｍレーザーを使用した。
【0096】
（四）相同組換え方法による組換えプラスミドの構築
１．線形化ベクトルの製造：適切なクローン部位を選択するとともに、ベクターを線形化し、酵素切断又は逆ＰＣＲ増幅を用いて線形化ベクトルを製造することができる。
１．線形化ベクトルの製造：適切なクローン部位を選択するとともに、ベクターを線形化し、酵素切断又は逆ＰＣＲ増幅を用いて線形化ベクトルを製造することができる。
【0097】
２．ＰＣＲ増幅による挿入断片の製造：挿入断片の正、逆方向ＰＣＲプライマーの５’末端に、１５－２５ｂｐ（酵素切断部位を含まない）の線形化ベクトル末端相同配列を導入することによって、挿入断片ＰＣＲ生成物５’及び３’末端のそれぞれに、線形化ベクトル両末端に相対する完全に一致した配列を持たせる。
【0098】
３．線形化ベクトルと挿入断片の濃度測定：線形化ベクトル及び挿入断片増幅生成物を、複数の等体積希釈勾配にして、元の生成物及び希釈後生成物をそれぞれ１μＬ取って、アガロースゲル電気泳動を行って、バンド輝度をＤＮＡ分子量標準（ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ）と比較してその近似濃度を決定する。
【0099】
４．組換え反応
組換え反応系は、最適ベクター使用量が０．０３ｐｍｏｌであり、最適ベクターと挿入断片とのモル比が１：２～１：３であり、すなわち、最適挿入断片使用量が０．０６～０．０９ｐｍｏｌである。
組換え反応系は、最適ベクター使用量が０．０３ｐｍｏｌであり、最適ベクターと挿入断片とのモル比が１：２～１：３であり、すなわち、最適挿入断片使用量が０．０６～０．０９ｐｍｏｌである。
【0100】
【表1(3)】
【0101】
Ｘ及びＹはそれぞれ、式によって算出された線形化ベクトル及び挿入断片の使用量である。系を調製完了後、各成分を均一に混合し、５０℃に置いて２０ｍｉｎ反応させた。挿入断片＞５ｋｂの場合、インキュベーション温度を２５ｍｉｎまで延長可能である。反応終了後、反応管を氷上に置いて５ｍｉｎ冷却することを薦める。反応生成物を直接転換してもよく、－２０℃で貯蔵して、必要な時に解凍して転換してもよい。
【0102】
（五）核酸アプタマーの機能検出
慣用の実験方法（一）に従ってＣａｒｒｏｔ又はＣａｒｒｏｔ変異体核酸アプタマー分子を製造し、５μＭの核酸アプタマー分子と１μＭのフルオロフォア分子とを、検出緩衝液（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１２５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５％ＤＭＳＯ）の中でインキュベーションして、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２多機能マイクロプレートリーダーによって核酸アプタマー－フルオロフォア分子複合体蛍光の最大励起ピーク及び最大発光ピークを検出した。更にＳｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２多機能マイクロプレートリーダーによって核酸アプタマー－フルオロフォア分子複合体のその最大励起及び発光条件での蛍光強度を検出し、コントロールサンプル（核酸アプタマーを含まない１μＭのフルオロフォア分子）も同じ条件で測定し、蛍光強度の比を算出した。例えば、５μＭ Ｃａｒｒｏｔ－１核酸アプタマーと１μＭ ＩＶ－３９フルオロフォア分子とで形成された複合体は蛍光最大励起ピークが、５２４ｎｍであり、最大発光ピークが、５８０ｎｍである。Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２多機能マイクロプレートリーダーによって検出されたこの複合体の５２４±１０ｎｍ励起、５８０ｎｍ±１０ｎｍ発光条件での蛍光強度は、５７２０であるが、コントロール（１μＭ ＩＶ－３９フルオロフォア分子）の同じ検出条件での蛍光強度は、２０であり、そうすると、Ｃａｒｒｏｔ－１核酸アプタマーのＩＶ－３９フルオロフォア分子に対する活性化倍数は、２８６倍となる。
慣用の実験方法（一）に従ってＣａｒｒｏｔ又はＣａｒｒｏｔ変異体核酸アプタマー分子を製造し、５μＭの核酸アプタマー分子と１μＭのフルオロフォア分子とを、検出緩衝液（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１２５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５％ＤＭＳＯ）の中でインキュベーションして、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２多機能マイクロプレートリーダーによって核酸アプタマー－フルオロフォア分子複合体蛍光の最大励起ピーク及び最大発光ピークを検出した。更にＳｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２多機能マイクロプレートリーダーによって核酸アプタマー－フルオロフォア分子複合体のその最大励起及び発光条件での蛍光強度を検出し、コントロールサンプル（核酸アプタマーを含まない１μＭのフルオロフォア分子）も同じ条件で測定し、蛍光強度の比を算出した。例えば、５μＭ Ｃａｒｒｏｔ－１核酸アプタマーと１μＭ ＩＶ－３９フルオロフォア分子とで形成された複合体は蛍光最大励起ピークが、５２４ｎｍであり、最大発光ピークが、５８０ｎｍである。Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２多機能マイクロプレートリーダーによって検出されたこの複合体の５２４±１０ｎｍ励起、５８０ｎｍ±１０ｎｍ発光条件での蛍光強度は、５７２０であるが、コントロール（１μＭ ＩＶ－３９フルオロフォア分子）の同じ検出条件での蛍光強度は、２０であり、そうすると、Ｃａｒｒｏｔ－１核酸アプタマーのＩＶ－３９フルオロフォア分子に対する活性化倍数は、２８６倍となる。
【0103】
実施例１．Ｃａｒｒｏｔ核酸アプタマー分子の二次構造
ｍＦｏｌｄオンラインＲＮＡ構造分析ソフトウェアによってＣａｒｒｏｔ核酸アプタマー一般式の二次構造を予測分析する（図１）が、その本当の二次構造を表すものではない。２種類の与えられたＮ１、Ｎ１４－Ｎ１５－Ｎ１６及びＮ２３のＣａｒｒｏｔ－１及びＣａｒｒｏｔ－２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２）について、それらの予測された二次構造は、図２である。
ｍＦｏｌｄオンラインＲＮＡ構造分析ソフトウェアによってＣａｒｒｏｔ核酸アプタマー一般式の二次構造を予測分析する（図１）が、その本当の二次構造を表すものではない。２種類の与えられたＮ１、Ｎ１４－Ｎ１５－Ｎ１６及びＮ２３のＣａｒｒｏｔ－１及びＣａｒｒｏｔ－２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２）について、それらの予測された二次構造は、図２である。
【0104】
実施例２．Ｃａｒｒｏｔ－ＩＶ－３９複合体の特性同定
Ｃａｒｒｏｔ－ＩＶ－３９複合体のスペクトル特性を検出するために、慣用の実験方法（一）に従ってＣａｒｒｏｔ－１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）ＲＮＡを製造した。１μＭ ＩＶ－３９と５μＭ Ｃａｒｒｏｔ－１とをインキュベーションした。検出結果によれば、Ｃａｒｒｏｔ－ＩＶ－３９複合体は最大励起光が、５２４ｎｍであり、最大発光光が、５８０ｎｍである（図５ａ）。
Ｃａｒｒｏｔ－ＩＶ－３９複合体のスペクトル特性を検出するために、慣用の実験方法（一）に従ってＣａｒｒｏｔ－１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）ＲＮＡを製造した。１μＭ ＩＶ－３９と５μＭ Ｃａｒｒｏｔ－１とをインキュベーションした。検出結果によれば、Ｃａｒｒｏｔ－ＩＶ－３９複合体は最大励起光が、５２４ｎｍであり、最大発光光が、５８０ｎｍである（図５ａ）。
【0105】
Ｃａｒｒｏｔ－１のＩＶ－３９と結合する結合定数を検出するために、２０ｎＭのＣａｒｒｏｔ－１を利用して異なる濃度のＩＶ－３９とインキュベーションし、それらの蛍光値を検出した。検出結果によれば、Ｃａｒｒｏｔ－１のＩＶ－３９と結合する結合定数は、５８ｎＭである（図５ｂ）。
【0106】
Ｃａｒｒｏｔ－ＩＶ－３９複合体のＭｇ２＋イオンへの依存性を検出するために、Ｃａｒｒｏｔ－１－ＩＶ－３９複合体を異なるＭｇ２＋イオンを含む緩衝液に置いて、蛍光値を検出した。検出結果によれば、Ｐｅｐｐｅｒ５９９及びＣｏｒｎ－ＤＦＨＯと比較して、Ｃａｒｒｏｔ－１－ＩＶ－３９複合体のＭｇ２＋イオンへの依存性が低い（図５ｃ）。
【0107】
実施例３．異なるＣａｒｒｏｔ変異体のＩＶ－３９フルオロフォア分子への蛍光活性化効果。
【0108】
異なるＣａｒｒｏｔ変異体のＩＶ－３９フルオロフォア分子への蛍光活性化効果を検出するために、Ｃａｒｒｏｔ－１配列に対して、表１で示されるような点突然変異を行い、慣用の実験方法（一）に従って異なる塩基変異を含むＣａｒｒｏｔ変異体ＲＮＡを製造し、１μＭ ＩＶ－３９をそれぞれ５μＭの異なるＣａｒｒｏｔ－１変異体ＲＮＡとインキュベーションし、慣用の実験方法（五）に従ってそれらのＩＶ－３９フルオロフォア分子への蛍光活性化倍数を検出した。検出結果によれば、一部の一塩基変異を含むＣａｒｒｏｔ－１変異体は、ＩＶ－３９に対する比較的強い蛍光活性化効果（＞２０倍）を保っている（表２）。一部の２～５個塩基変異を含むＣａｒｒｏｔ－１変異体は依然として、ＩＶ－３９に対する一定の蛍光活性化効果（＞１０倍）を保っている（表３）。以上の理由により、Ｃａｒｒｏｔ－１の多くの一塩基及び多塩基変異体は依然として、ＩＶ－３９フルオロフォア分子を活性化するアプタマー機能を保っている。
【0109】
【表2】
【0110】
注：表２におけるＣａｒｒｏｔ－１は、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１である核酸アプタマーであり、他のアプタマーは、Ｃａｒｒｏｔ－１配列において図１のＣａｒｒｏｔの対応するヌクレオチド位置で実施した点突然変異である。
【0111】
【表3】
【0112】
実施例４．塩基修飾のＣａｒｒｏｔのＩＶ－３９への活性化効果
塩基修飾のＣａｒｒｏｔのＩＶ－３９への活性化効果を検出するために、塩基修飾を含むＣａｒｒｏｔ－３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、この配列、
塩基修飾のＣａｒｒｏｔのＩＶ－３９への活性化効果を検出するために、塩基修飾を含むＣａｒｒｏｔ－３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、この配列、
【0113】
【数1】
【0114】
における太字で下線付きの塩基は、デオキシリボースヌクレオチド塩基である）及びＣａｒｒｏｔ－４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、この配列、
【0115】
【数2】
【0116】
における太字で下線付きの塩基は、２’－Ｆで修飾された塩基である）を合成した（図６ａ）（上海吉瑪製薬技術有限公司が合成）。慣用の実験方法（五）に従ってこれらの塩基修飾のＣａｒｒｏｔのＩＶ－３９フルオロフォア分子への蛍光活性化効果を検出した。検出結果によれば、塩基修飾のＣａｒｒｏｔ－３及びＣａｒｒｏｔ－４は依然として、ＩＶ－３９フルオロフォア分子の蛍光を著しく活性化することができる（図６ｂ）。
【0117】
実施例５．Ｃａｒｒｏｔコンカテマー
ＣａｒｒｏｔコンカテマーのＩＶ－３９フルオロフォア分子への蛍光活性化効果を検出するために、Ｃａｒｒｏｔ－２を異なる形態で直列連結し、以下の３種類を含む。
ＣａｒｒｏｔコンカテマーのＩＶ－３９フルオロフォア分子への蛍光活性化効果を検出するために、Ｃａｒｒｏｔ－２を異なる形態で直列連結し、以下の３種類を含む。
【0118】
（１）「直列連結１」形態（図７ａ）では、Ｃａｒｒｏｔ構造上の「頭」と「尻尾」を「頭－尻尾」の形で連結することにより、ｎＣａｒｒｏｔを得た（ただし、ｎは、任意のコピーのＣａｒｒｏｔである）。本実施例において、Ｆ３０－２Ｃａｒｒｏｔ－２、Ｆ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２、Ｆ３０－６Ｃａｒｒｏｔ－２、Ｆ３０－８Ｃａｒｒｏｔ－２及びＦ３０－１０Ｃａｒｒｏｔ－２のコーディングｃＤＮＡをそれぞれ全ゲノム合成し（ＲＮＡアプタマーをコードする配列はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１である）、ＰＣＲ増幅した後、慣用の実験方法（一）に従って核酸アプタマーＲＮＡを製造し、０．２μＭ ＲＮＡアプタマーを５μＭ ＩＶ－３９とインキュベーションした後、慣用の実験方法（五）に従って蛍光強度を検出した。検出結果によれば、ｎの増加に連れて、Ｆ３０－ｎＣａｒｒｏｔ－ＩＶ－３９の蛍光も増加する（図７ｄ）ことから、「直列連結１」形態によってＣａｒｒｏｔ－ＩＶ－３９複合体の蛍光強度を向上できることが分かった。
【0119】
（２）「直列連結２」形態（図７ｂ）では、Ｃａｒｒｏｔを１個の構成単位として直列連結することにより、ｎ×Ｃａｒｒｏｔを得た（ただし、ｎは、任意のコピーのＣａｒｒｏｔであってもよい）。本実施例において、２×Ｃａｒｒｏｔ－２，４×Ｃａｒｒｏｔ－２、６×Ｃａｒｒｏｔ－２、８×Ｃａｒｒｏｔ－２及び１０×Ｃａｒｒｏｔ－２のコーディングｃＤＮＡをそれぞれ全ゲノム合成し（ＲＮＡアプタマーをコードする配列はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６である）、慣用の実験方法（一）に従って核酸アプタマーＲＮＡを製造し、０．２μＭ ＲＮＡアプタマーを５μＭ ＩＶ－３９とインキュベーションした後、慣用の実験方法（五）に従って蛍光強度を検出した。検出結果によれば、ｎの増加に連れて、ｎ×Ｃａｒｒｏｔ－ＩＶ－３９の蛍光も増加する（図７ｅ）ことから、「直列連結２」形態によってＣａｒｒｏｔ－ＩＶ－３９複合体の蛍光強度を向上できることが分かった。
【0120】
（３）「直列連結３」形態（図７ｃ）では、上記「直列連結１」と「直列連結２」を組み合わせて、「直列連結１」で得られたｎＣａｒｒｏｔを１個の構成単位として「直列連結２」の形態で直列連結することにより、ｎ２×ｎ１Ｃａｒｒｏｔを得た（ただし、ｎ１及びｎ２は、任意のコピーのＣａｒｒｏｔであってもよい）。本実施例において、２×２Ｃａｒｒｏｔ－２、２×４Ｃａｒｒｏｔ－２，４×２Ｃａｒｒｏｔ－２，４×４Ｃａｒｒｏｔ－２のコーディングｃＤＮＡをそれぞれ全ゲノム合成し（ＲＮＡアプタマーをコードする配列はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０である）、慣用の実験方法（一）に従って核酸アプタマーＲＮＡを製造し、０．２μＭ ＲＮＡアプタマーを５μＭ ＩＶ－３９とインキュベーションした後、慣用の実験方法（五）に従って蛍光強度を検出した。検出結果によれば、このような「直列連結３」形態によって得られたＣａｒｒｏｔコンカテマー－ＩＶ－３９の蛍光強度が明らかにＣａｒｒｏｔ－２－ＩＶ－３９を上回る（図７ｆ）ことから、「直列連結３」形態によってＣａｒｒｏｔ－ＩＶ－３９複合体の蛍光強度を向上できることが分かった。
【0121】
実施例６．ＩＶ－３９類似体の特性同定
慣用の実験方法（一）に従ってＣａｒｒｏｔ－１ ＲＮＡアプタマー分子を製造し、それを利用してＩＶ－３９類似体のＣａｒｒｏｔと結合した場合の、蛍光スペクトル、モル吸光係数、量子収率及び蛍光活性化倍数を含む基本的特性を検出し、検出結果を表４に示した。表中のデータから、Ｃａｒｒｏｔ－１は、ＩＶ－３９類似体の蛍光強度を異なる程度で活性化することが分かった。
慣用の実験方法（一）に従ってＣａｒｒｏｔ－１ ＲＮＡアプタマー分子を製造し、それを利用してＩＶ－３９類似体のＣａｒｒｏｔと結合した場合の、蛍光スペクトル、モル吸光係数、量子収率及び蛍光活性化倍数を含む基本的特性を検出し、検出結果を表４に示した。表中のデータから、Ｃａｒｒｏｔ－１は、ＩＶ－３９類似体の蛍光強度を異なる程度で活性化することが分かった。
【0122】
【表4(1)】
【表4(2)】
【0123】
実施例７．Ｃａｒｒｏｔ－ＩＶ－４複合体による細菌におけるＲＮＡの標識
Ｃａｒｒｏｔ－ＩＶ－４の細菌での効果を検出するために、まず、Ｆ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２を発現する細菌発現プラスミドを構築した。Ｆ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２をコードするＤＮＡ配列を全ゲノム合成し、プライマーによって増幅し、プライマーによってｐＥＴ２８ａを増幅してプロモーター及びマルチクローニングサイト領域を除去し、増幅されたＦ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２ ＤＮＡ断片とｐＥＴ２８ａ線形化ベクトルとを実験方法（四）に従って連結し、得られた組換えプラスミドを、ｐＥＴ２８ａ－Ｔ７－Ｆ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２と命名した。
Ｃａｒｒｏｔ－ＩＶ－４の細菌での効果を検出するために、まず、Ｆ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２を発現する細菌発現プラスミドを構築した。Ｆ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２をコードするＤＮＡ配列を全ゲノム合成し、プライマーによって増幅し、プライマーによってｐＥＴ２８ａを増幅してプロモーター及びマルチクローニングサイト領域を除去し、増幅されたＦ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２ ＤＮＡ断片とｐＥＴ２８ａ線形化ベクトルとを実験方法（四）に従って連結し、得られた組換えプラスミドを、ｐＥＴ２８ａ－Ｔ７－Ｆ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２と命名した。
【0124】
Ｆ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２断片の増幅に用いられたプライマーは、下記のとおりである。
【0125】
上流プライマー（Ｐ１）：５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＧＣＣＡＴＧＴＧＴＡＴＧＴＧＧＧＡ－３’
下流プライマー（Ｐ２）：５’－ＣＡＡＧＧＧＧＴＴＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＣＡＴＧＡＡＴＧＡＴＣＣ－３’
ｐＥＴ２８ａベクターを増幅し線形化する際に用いられたプライマーは、下記のとおりである。
下流プライマー（Ｐ２）：５’－ＣＡＡＧＧＧＧＴＴＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＣＡＴＧＡＡＴＧＡＴＣＣ－３’
ｐＥＴ２８ａベクターを増幅し線形化する際に用いられたプライマーは、下記のとおりである。
【0126】
上流プライマー（Ｐ３）：５’－ＴＡＧＣＡＴＡＡＣＣＣＣＴＴＧＧＧＧＣＣＴＣ－３’
下流プライマー（Ｐ４）：５’－ＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＴＴＴＣＧＣＧＧＧＡＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣＧ－３’
ｐＥＴ２８ａ－Ｔ７－Ｆ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２を組換えプラスミドの形質転換によってＢＬ２１（ＤＥ３，Ｓｔａｒ）大腸菌の菌株に導入し、モノクローナルを選んで３７℃培養し、ＯＤ６００＝０．２程度となる時点で、１ｍＭ ＩＰＴＧを加えてＦ３０－Ｆ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２の発現を誘導し、４ｈ後に菌を回収し、１μＭ ＩＶ－４を含むＰＢＳ（１０ｍＭ Ｍｇ２＋を含む）溶液によって再懸濁させた。ｐＥＴ２８ａ空ベクターを形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３，Ｓｔａｒ）大腸菌をコントロールとした。結果によれば、Ｆ３０－Ｆ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２を発現しかつＩＶ－４の存在下でのみ、細菌が明るいオレンジレッドの蛍光を示す（図８）ことから、Ｃａｒｒｏｔ－ＩＶ－４複合体を細菌におけるＲＮＡの蛍光標識に使用できることが分かった。
下流プライマー（Ｐ４）：５’－ＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＴＴＴＣＧＣＧＧＧＡＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣＧ－３’
ｐＥＴ２８ａ－Ｔ７－Ｆ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２を組換えプラスミドの形質転換によってＢＬ２１（ＤＥ３，Ｓｔａｒ）大腸菌の菌株に導入し、モノクローナルを選んで３７℃培養し、ＯＤ６００＝０．２程度となる時点で、１ｍＭ ＩＰＴＧを加えてＦ３０－Ｆ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２の発現を誘導し、４ｈ後に菌を回収し、１μＭ ＩＶ－４を含むＰＢＳ（１０ｍＭ Ｍｇ２＋を含む）溶液によって再懸濁させた。ｐＥＴ２８ａ空ベクターを形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３，Ｓｔａｒ）大腸菌をコントロールとした。結果によれば、Ｆ３０－Ｆ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２を発現しかつＩＶ－４の存在下でのみ、細菌が明るいオレンジレッドの蛍光を示す（図８）ことから、Ｃａｒｒｏｔ－ＩＶ－４複合体を細菌におけるＲＮＡの蛍光標識に使用できることが分かった。
【0127】
実施例８ Ｃａｒｒｏｔ－ＩＶ－４複合体による酵母細胞におけるＲＮＡの標識
Ｃａｒｒｏｔ－ＩＶ－４の酵母での効果を検出するために、まず、Ｆ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２を発現する酵母発現プラスミドを構築した。プライマーによって実施例７におけるＦ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２ ＤＮＡ断片を増幅し、実験方法（四）に従って増幅されたＦ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２断片をｐＹＥＳ２．１ ＴＯＰＯ ＴＡベクターに挿入して、得られた組換えプラスミドを、ｐＹＥＳ２．１－Ｆ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２と命名した。
Ｃａｒｒｏｔ－ＩＶ－４の酵母での効果を検出するために、まず、Ｆ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２を発現する酵母発現プラスミドを構築した。プライマーによって実施例７におけるＦ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２ ＤＮＡ断片を増幅し、実験方法（四）に従って増幅されたＦ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２断片をｐＹＥＳ２．１ ＴＯＰＯ ＴＡベクターに挿入して、得られた組換えプラスミドを、ｐＹＥＳ２．１－Ｆ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２と命名した。
【0128】
Ｆ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２断片の増幅に用いられたプライマーは、下記のとおりである。
【0129】
上流プライマー（Ｐ５）：５’－ＧＧＡＡＴＡＴＴＡＡＧＣＴＣＧＣＣＣＴＴＴＴＧＣＣＡＴＧＴＧＴＡＴＧＴＧＧＧ－３’
下流プライマー（Ｐ６）：５’－ＴＧＡＣＣＴＣＧＡＡＧＣＴＣＧＣＣＣＴＴＧＴＴＧＣＣＡＴＧＡＡＴＧＡＴＣＣ－３’
ｐＹＥＳ２．１－Ｆ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２を組換えプラスミドの形質転換によってＢＹ４７４１菌株に導入し、モノクローナルを選んで３０℃培養し、ＯＤ６００＝０．１程度となる時点で、１ｍＭガラクトースを加えてＦ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２の発現を誘導し、１０ｈ後に菌を回収し、１μＭ ＩＶ－４を含むＰＢＳ（１０ｍＭ Ｍｇ２＋を含む）溶液によって再懸濁させた。処理されていないＢＹ４７４１菌株をコントロールとした。イメージング結果によれば、Ｆ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２を発現しかつＩＶ－４の存在下でのみ、酵母細胞が明るいオレンジレッドの蛍光を示す（図９）ことから、Ｃａｒｒｏｔ－ＩＶ－４複合体を酵母細胞におけるＲＮＡの蛍光標識に使用できることが分かった。
下流プライマー（Ｐ６）：５’－ＴＧＡＣＣＴＣＧＡＡＧＣＴＣＧＣＣＣＴＴＧＴＴＧＣＣＡＴＧＡＡＴＧＡＴＣＣ－３’
ｐＹＥＳ２．１－Ｆ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２を組換えプラスミドの形質転換によってＢＹ４７４１菌株に導入し、モノクローナルを選んで３０℃培養し、ＯＤ６００＝０．１程度となる時点で、１ｍＭガラクトースを加えてＦ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２の発現を誘導し、１０ｈ後に菌を回収し、１μＭ ＩＶ－４を含むＰＢＳ（１０ｍＭ Ｍｇ２＋を含む）溶液によって再懸濁させた。処理されていないＢＹ４７４１菌株をコントロールとした。イメージング結果によれば、Ｆ３０－Ｃａｒｒｏｔ－２を発現しかつＩＶ－４の存在下でのみ、酵母細胞が明るいオレンジレッドの蛍光を示す（図９）ことから、Ｃａｒｒｏｔ－ＩＶ－４複合体を酵母細胞におけるＲＮＡの蛍光標識に使用できることが分かった。
【0130】
実施例９ ＣａｒｒｏｔとＩＶ－３９及びその類似体による哺乳類細胞におけるＲＮＡの標識
ＣａｒｒｏｔとＩＶ－３９によって哺乳類細胞におけるＲＮＡの標識を検出するために、報道されているＰｅｐｐｅｒ及びＣｏｒｎ核酸アプタマー分子（それぞれＨＢＣ５９９及びＤＦＨＯフルオロフォア分子と結合）をコントロールとして（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１９．３７：１２８７－１２９３；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１７．１３：１１８７－１１９４）、それらの哺乳類細胞発現プラスミドを構築した。ｔＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２（コードするＲＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４である）、ｔＲＮＡ－Ｐｅｐｐｅｒ（コードするＲＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２２である）及びｔＲＮＡ－Ｃｏｒｎ（コードするＲＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２１である）をコードするＤＮＡ断片を全ゲノム合成し、それぞれプライマーＰ７及びＰ８によってこれらの断片をＰＣＲ増幅し、プライマーＰ９及びＰ１０によってｐＥＧＦＰ－Ｎ１ベクターを増幅し、それ自身のＣＭＶプロモーター及びマルチクローニングサイト領域を除去した。実験方法（四）によってこれらの断片をそれぞれ、プロモーター及びマルチクローニングサイト領域を除去されたｐＥＧＦＰ－Ｎ１ベクターに挿入した。更に、Ｐ１１及びＰ１２によってこれらのベクターを増幅して線形化し、Ｐ１３及びＰ１４によってｐＬＫＯ．１ｐｕｒｏベクターを鋳型としてＵ６プロモーター（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２３）を増幅し、実験方法（四）によってＵ６プロモーターをそれぞれ、線形化したベクターに挿入して、得られたプラスミドを、ｐＵ６－ｔＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２、ｐＵ６－ｔＲＮＡ－Ｐｅｐｐｅｒ及びｐＵ６－ｔＲＮＡ－Ｃｏｒｎと命名し、これらのプラスミドはそれぞれ、ｔＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２、ｔＲＮＡ－Ｐｅｐｐｅｒ及びｔＲＮＡ－Ｃｏｒｎを発現する。ｐＵ６－ｔＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２、ｐＵ６－ｔＲＮＡ－Ｐｅｐｐｅｒ及びｐＵ６－ｔＲＮＡ－Ｃｏｒｎをプラスミドトランスフェクションによって２９３Ｔ／１７細胞に導入し、２４ｈ後に０．５μＭ ＩＶ－３９、０．５μＭ ＨＢＣ５９９及び１０μＭ ＤＦＨＯを加えて、ｔＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２、ｔＲＮＡ－Ｐｅｐｐｅｒ及びｔＲＮＡ－Ｃｏｒｎのそれぞれを標識し、対応するＲＮＡアプタマーを発現しない細胞作をコントロールとして、実験方法（三）によって標識効果を検出した。結果によれば、検出緩衝液への２０ｍＭ Ｍｇ２＋の添加の有無に関わらず、ｔＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－ＩＶ－３９複合体は非常に明るいオレンジレッドの蛍光を示し（図１０ａ）、蛍光強度が明らかにｔＲＮＡ－Ｐｅｐｐｅｒ－ＨＢＣ５９９及びｔＲＮＡ－Ｃｏｒｎ－ＤＦＨＯ複合体を上回り（図１０ｂ）、このことから、Ｃａｒｒｏｔ－ＩＶ－３９は哺乳類細胞においてうまく働けることが分かった。
ＣａｒｒｏｔとＩＶ－３９によって哺乳類細胞におけるＲＮＡの標識を検出するために、報道されているＰｅｐｐｅｒ及びＣｏｒｎ核酸アプタマー分子（それぞれＨＢＣ５９９及びＤＦＨＯフルオロフォア分子と結合）をコントロールとして（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１９．３７：１２８７－１２９３；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１７．１３：１１８７－１１９４）、それらの哺乳類細胞発現プラスミドを構築した。ｔＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２（コードするＲＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４である）、ｔＲＮＡ－Ｐｅｐｐｅｒ（コードするＲＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２２である）及びｔＲＮＡ－Ｃｏｒｎ（コードするＲＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２１である）をコードするＤＮＡ断片を全ゲノム合成し、それぞれプライマーＰ７及びＰ８によってこれらの断片をＰＣＲ増幅し、プライマーＰ９及びＰ１０によってｐＥＧＦＰ－Ｎ１ベクターを増幅し、それ自身のＣＭＶプロモーター及びマルチクローニングサイト領域を除去した。実験方法（四）によってこれらの断片をそれぞれ、プロモーター及びマルチクローニングサイト領域を除去されたｐＥＧＦＰ－Ｎ１ベクターに挿入した。更に、Ｐ１１及びＰ１２によってこれらのベクターを増幅して線形化し、Ｐ１３及びＰ１４によってｐＬＫＯ．１ｐｕｒｏベクターを鋳型としてＵ６プロモーター（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２３）を増幅し、実験方法（四）によってＵ６プロモーターをそれぞれ、線形化したベクターに挿入して、得られたプラスミドを、ｐＵ６－ｔＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２、ｐＵ６－ｔＲＮＡ－Ｐｅｐｐｅｒ及びｐＵ６－ｔＲＮＡ－Ｃｏｒｎと命名し、これらのプラスミドはそれぞれ、ｔＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２、ｔＲＮＡ－Ｐｅｐｐｅｒ及びｔＲＮＡ－Ｃｏｒｎを発現する。ｐＵ６－ｔＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２、ｐＵ６－ｔＲＮＡ－Ｐｅｐｐｅｒ及びｐＵ６－ｔＲＮＡ－Ｃｏｒｎをプラスミドトランスフェクションによって２９３Ｔ／１７細胞に導入し、２４ｈ後に０．５μＭ ＩＶ－３９、０．５μＭ ＨＢＣ５９９及び１０μＭ ＤＦＨＯを加えて、ｔＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２、ｔＲＮＡ－Ｐｅｐｐｅｒ及びｔＲＮＡ－Ｃｏｒｎのそれぞれを標識し、対応するＲＮＡアプタマーを発現しない細胞作をコントロールとして、実験方法（三）によって標識効果を検出した。結果によれば、検出緩衝液への２０ｍＭ Ｍｇ２＋の添加の有無に関わらず、ｔＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－ＩＶ－３９複合体は非常に明るいオレンジレッドの蛍光を示し（図１０ａ）、蛍光強度が明らかにｔＲＮＡ－Ｐｅｐｐｅｒ－ＨＢＣ５９９及びｔＲＮＡ－Ｃｏｒｎ－ＤＦＨＯ複合体を上回り（図１０ｂ）、このことから、Ｃａｒｒｏｔ－ＩＶ－３９は哺乳類細胞においてうまく働けることが分かった。
【0131】
ｔＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２、ｔＲＮＡ－Ｐｅｐｐｅｒ及びｔＲＮＡ－Ｃｏｒｎの増幅に用いられたプライマーは、下記のとおりである。
【0132】
上流プライマー（Ｐ７）：５’－ＧＣＣＧＣＣＣＣＣＴＴＣＡＣＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＣＧＧＡＴＡＧＣＴＣＡＧＴＣＧＧ－３’
下流プライマー（Ｐ８）：５’－ＧＡＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＡＡＴＧＧＣＧＣＣＣＧＡＡＣＡＧＧＧＡＣ－３’
ｐＥＧＦＰ－Ｎ１を増幅しプロモーター及びマルチクローニングサイト領域を除去した際に用いられたプライマーは、下記のとおりである。
下流プライマー（Ｐ８）：５’－ＧＡＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＡＡＴＧＧＣＧＣＣＣＧＡＡＣＡＧＧＧＡＣ－３’
ｐＥＧＦＰ－Ｎ１を増幅しプロモーター及びマルチクローニングサイト領域を除去した際に用いられたプライマーは、下記のとおりである。
【0133】
上流プライマー（Ｐ９）：５’－ＴＴＴＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡＣＣＴＣＧＡＧＡＣＡＡＡＴＧＧＣＡＧＴＡＴＴＣＡ－３’
下流プライマー（Ｐ１０）：５’－ＧＧＴＧＡＡＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧ－３’
ベクターを増幅して線形化しＵ６プロモーターを導入した際に用いられたプライマーは、下記のとおりである。
下流プライマー（Ｐ１０）：５’－ＧＧＴＧＡＡＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧ－３’
ベクターを増幅して線形化しＵ６プロモーターを導入した際に用いられたプライマーは、下記のとおりである。
【0134】
上流プライマー（Ｐ１１）：５’－ＴＣＴＡＧＡＧＣＣＣＧＧＡＴＡＧＣＴＣＡＧＴＣＧＧＴ－３’
下流プライマー（Ｐ１２）：５’－ＧＧＴＧＡＡＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧ－３’
Ｕ６プロモーターの増幅に用いられたプライマーは、下記のとおりである。
下流プライマー（Ｐ１２）：５’－ＧＧＴＧＡＡＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧ－３’
Ｕ６プロモーターの増幅に用いられたプライマーは、下記のとおりである。
【0135】
上流プライマー（Ｐ１３）：５’－ＧＣＣＧＣＣＣＣＣＴＴＣＡＣＣＧＡＧＧＧＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＡＴＧ－３’
下流プライマー（Ｐ１４）：５’－ＴＡＴＣＣＧＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＴＴＴＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＡＣＡＡＧＡＴＡＴＡＴ－３’
ＣａｒｒｏｔとＩＶ－３９類似体によって哺乳類細胞におけるＲＮＡの標識を検出するために、Ｆ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２を発現する哺乳類発現プラスミドを構築した。本実施例におけるプライマーＰ１５及びＰ１６によって実施例５におけるＦ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２断片を増幅し、実験方法（四）によってこれらの断片を、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩで酵素切断されたｐＵ６－ｔＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２ベクターに挿入して、得られた発現ベクターを、ｐＵ６－Ｆ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２と命名した。
下流プライマー（Ｐ１４）：５’－ＴＡＴＣＣＧＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＴＴＴＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＡＣＡＡＧＡＴＡＴＡＴ－３’
ＣａｒｒｏｔとＩＶ－３９類似体によって哺乳類細胞におけるＲＮＡの標識を検出するために、Ｆ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２を発現する哺乳類発現プラスミドを構築した。本実施例におけるプライマーＰ１５及びＰ１６によって実施例５におけるＦ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２断片を増幅し、実験方法（四）によってこれらの断片を、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩで酵素切断されたｐＵ６－ｔＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２ベクターに挿入して、得られた発現ベクターを、ｐＵ６－Ｆ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２と命名した。
【0136】
Ｆ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２断片の増幅に用いられたプライマーは、下記のとおりである。
【0137】
上流プライマー（Ｐ１５）：５’－ＧＧＡＡＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＴＣＴＡＧＡＴＴＧＣＣＡＴＧＴＧＴＡＴＧＴＧＧＧＡ－３’
下流プライマー（Ｐ１６）：５’－ＴＧＴＣＴＣＧＡＧＧＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＡＡＴＴＧＣＣＡＴＧＡＡＴＧＡＴＣＣＣＧＡＡＧ－３’
ｐＵ６－Ｆ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２をプラスミドトランスフェクションによって２９３Ｔ／１７細胞に導入し、２４ｈ後に異なるＩＶ－３９類似体を加えて標識し、実験方法（三）によって標識効果を検出した。結果によれば、異なるＩＶ－３９類似体はいずれも、Ｆ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２を発現する細胞を特異的に標識できるが、Ｆ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２を発現しないコントロール細胞を標識しない（図１０ｃ）ことから、ＣａｒｒｏｔとＩＶ－３９及びその類似体とを哺乳類細胞におけるＲＮＡの標識に使用できることが分かった。
下流プライマー（Ｐ１６）：５’－ＴＧＴＣＴＣＧＡＧＧＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＡＡＴＴＧＣＣＡＴＧＡＡＴＧＡＴＣＣＣＧＡＡＧ－３’
ｐＵ６－Ｆ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２をプラスミドトランスフェクションによって２９３Ｔ／１７細胞に導入し、２４ｈ後に異なるＩＶ－３９類似体を加えて標識し、実験方法（三）によって標識効果を検出した。結果によれば、異なるＩＶ－３９類似体はいずれも、Ｆ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２を発現する細胞を特異的に標識できるが、Ｆ３０－４Ｃａｒｒｏｔ－２を発現しないコントロール細胞を標識しない（図１０ｃ）ことから、ＣａｒｒｏｔとＩＶ－３９及びその類似体とを哺乳類細胞におけるＲＮＡの標識に使用できることが分かった。
【0138】
実施例１０．Ｃａｒｒｏｔによるプローブ構築
Ｃａｒｒｏｔによる被検物プローブを構築するために、Ｃａｒｒｏｔ－１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１）一般式におけるＮ１４－Ｎ１５－Ｎ１６ヌクレオチドを、アデノシン（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）及びＳ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を特異的に識別・結合できるＲＮＡアプタマーに交換し、これらのアプタマーとＣａｒｒｏｔ－１との間は適切な塩基によって連結し（図１１ａ）、慣用の実験方法（一）に従ってプローブＲＮＡを製造し、それをＩＶ－３９とインキュベーションし、多機能マイクロプレートリーダーによってそれらのアデノシン又はＳＡＭの存在の有無での蛍光強度をそれぞれ検出した。検出結果によれば、これらのプローブはターゲット存在時の蛍光が明らかにターゲット非存在時の蛍光を上回る（図１１ｂ）ことから、それらをそれぞれ、アデノシン及びＳＡＭを検出するプローブとして使用できることが分かり、対応するプローブＲＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２４及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２５である。
Ｃａｒｒｏｔによる被検物プローブを構築するために、Ｃａｒｒｏｔ－１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１）一般式におけるＮ１４－Ｎ１５－Ｎ１６ヌクレオチドを、アデノシン（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）及びＳ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を特異的に識別・結合できるＲＮＡアプタマーに交換し、これらのアプタマーとＣａｒｒｏｔ－１との間は適切な塩基によって連結し（図１１ａ）、慣用の実験方法（一）に従ってプローブＲＮＡを製造し、それをＩＶ－３９とインキュベーションし、多機能マイクロプレートリーダーによってそれらのアデノシン又はＳＡＭの存在の有無での蛍光強度をそれぞれ検出した。検出結果によれば、これらのプローブはターゲット存在時の蛍光が明らかにターゲット非存在時の蛍光を上回る（図１１ｂ）ことから、それらをそれぞれ、アデノシン及びＳＡＭを検出するプローブとして使用できることが分かり、対応するプローブＲＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２４及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２５である。
【0139】
実施例１１．Ｃａｒｒｏｔによるトレース細胞におけるＲＮＡの位置特定
Ｃａｒｒｏｔをトレース細胞におけるＲＮＡの位置特定に用いた結果を検出するために、まず、Ｃａｒｒｏｔと異なるＲＮＡとが融合させたキメラＲＮＡの発現プラスミドを構築した。プライマーＰ１７及びＰ１８によって４Ｃａｒｒｏｔ－２断片を増幅し、実験方法（四）によってＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩで二重酵素切断されたｐＣＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏ（＋）ベクターに挿入し、ｐＣＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏ（＋）－４Ｃａｒｒｏｔ－２組換えプラスミドを得た。ＧＡＰＤＨ及びＡＣＴＢ遺伝子断片を全ゲノム合成し（ＧＡＰＤＨ及びＡＣＴＢをコードする遺伝子配列はそれぞれ、Ｇｅｎｅｂａｎｋ：ＢＣ００９０８１、ＢＣ０１６０４５である）、プライマーによってＧＡＰＤＨ及びＡＣＴＢ遺伝子断片をそれぞれ増幅し、それらをＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで二重酵素切断されたｐＣＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏ（＋）－４Ｃａｒｒｏｔ－２ベクターに挿入して、ｐＣＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏ（＋）－ＧＡＰＤＨ－４Ｃａｒｒｏｔ－２及びｐＣＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏ（＋）－ＡＣＴＢ－４Ｃａｒｒｏｔ－２組換えプラスミドを得、それらはＧＡＰＤＨ－４Ｃａｒｒｏｔ－２及びＡＣＴＢ－４Ｃａｒｒｏｔ－２キメラＲＮＡをそれぞれコードし、それらの配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２６及び２７である。
Ｃａｒｒｏｔをトレース細胞におけるＲＮＡの位置特定に用いた結果を検出するために、まず、Ｃａｒｒｏｔと異なるＲＮＡとが融合させたキメラＲＮＡの発現プラスミドを構築した。プライマーＰ１７及びＰ１８によって４Ｃａｒｒｏｔ－２断片を増幅し、実験方法（四）によってＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩで二重酵素切断されたｐＣＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏ（＋）ベクターに挿入し、ｐＣＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏ（＋）－４Ｃａｒｒｏｔ－２組換えプラスミドを得た。ＧＡＰＤＨ及びＡＣＴＢ遺伝子断片を全ゲノム合成し（ＧＡＰＤＨ及びＡＣＴＢをコードする遺伝子配列はそれぞれ、Ｇｅｎｅｂａｎｋ：ＢＣ００９０８１、ＢＣ０１６０４５である）、プライマーによってＧＡＰＤＨ及びＡＣＴＢ遺伝子断片をそれぞれ増幅し、それらをＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで二重酵素切断されたｐＣＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏ（＋）－４Ｃａｒｒｏｔ－２ベクターに挿入して、ｐＣＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏ（＋）－ＧＡＰＤＨ－４Ｃａｒｒｏｔ－２及びｐＣＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏ（＋）－ＡＣＴＢ－４Ｃａｒｒｏｔ－２組換えプラスミドを得、それらはＧＡＰＤＨ－４Ｃａｒｒｏｔ－２及びＡＣＴＢ－４Ｃａｒｒｏｔ－２キメラＲＮＡをそれぞれコードし、それらの配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２６及び２７である。
【0140】
４Ｃａｒｒｏｔ－２の増幅に用いられたプライマーは、下記のとおりである。
【0141】
上流プライマー（Ｐ１７）：５’－ＴＡＧＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴＴＡＡＧＣＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＴＡＡＡＣＡＣＧＣＣ－３’
下流プライマー（Ｐ１８）：５’－ＡＣＧＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＧＧＡＡＧＴＧＴＣＣＧＣＣＧＧＡＡＧＴ－３’
ＧＡＰＤＨの増幅に用いられたプライマーは、下記のとおりである。
下流プライマー（Ｐ１８）：５’－ＡＣＧＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＧＧＡＡＧＴＧＴＣＣＧＣＣＧＧＡＡＧＴ－３’
ＧＡＰＤＨの増幅に用いられたプライマーは、下記のとおりである。
【0142】
上流プライマー（Ｐ１９）：５’－ＧＧＡＧＡＣＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧ－３’
下流プライマー（Ｐ２０）：５’－ＣＡＣＧＧＡＣＡＣＡＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴＡＡＣＣＡＴＧＣＴＣＴＡＧＣＧＡＧＴＧＴＴＡＣＴＣＣＴＴＧＧＡＧＧＣＣＡＴＧＴ－３’
ＡＣＴＢの増幅に用いられたプライマーは、下記のとおりである。
下流プライマー（Ｐ２０）：５’－ＣＡＣＧＧＡＣＡＣＡＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴＡＡＣＣＡＴＧＣＴＣＴＡＧＣＧＡＧＴＧＴＴＡＣＴＣＣＴＴＧＧＡＧＧＣＣＡＴＧＴ－３’
ＡＣＴＢの増幅に用いられたプライマーは、下記のとおりである。
【0143】
上流プライマー（Ｐ２１）：５’－ＧＧＡＧＡＣＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＴＧＡＣＧＣＴＴＧＣＴＧＡＡＣＴ－３’
下流プライマー（Ｐ２２）：５’－ＣＡＣＧＧＡＣＡＣＡＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴＡＡＣＣＡＴＧＣＴＣＴＡＧＣＧＡＧＴＧＣＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡ－３’
上述のプラスミドを構築完了後、いずれもシーケンシングによって挿入された配列が完全に正確であると特定し、トランスフェクショングレードのプラスミド抽出キットを用いてプラスミドを抽出して、後のトランスフェクション実験に用いた。
下流プライマー（Ｐ２２）：５’－ＣＡＣＧＧＡＣＡＣＡＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴＡＡＣＣＡＴＧＣＴＣＴＡＧＣＧＡＧＴＧＣＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡ－３’
上述のプラスミドを構築完了後、いずれもシーケンシングによって挿入された配列が完全に正確であると特定し、トランスフェクショングレードのプラスミド抽出キットを用いてプラスミドを抽出して、後のトランスフェクション実験に用いた。
【0144】
本実施例で構築されたｐＣＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏ（＋）－ＧＡＰＤＨ－４Ｃａｒｒｏｔ－２及びｐＣＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏ（＋）－ＡＣＴＢ－４Ｃａｒｒｏｔ－２組換えプラスミドをそれぞれ、ＣＯＳ－７細胞にトランスフェクションし、トランスフェクション２４ｈ後に１μＭ ＩＶ－４を加えて標識し、具体的には実験方法（三）に記載の蛍光イメージング方法に従って細胞をイメージングした。イメージング結果によれば、ＧＡＰＤＨ－４Ｃａｒｒｏｔ－２及びＡＣＴＢ－４Ｃａｒｒｏｔ－２の蛍光は主に細胞質中に集中し（図１２）、これは以前の報道と一致しており、蛍光標識のインサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）結果とも一致しており（図１２）、以上の結果から、ＣａｒｒｏｔをＲＮＡの位置のトレースに使用できることが分かった。
【0145】
実施例１２．ＣａｒｒｏｔによるゲノムＤＮＡの検出
ＣａｒｒｏｔによってゲノムＤＮＡを検出するために、まず、Ｃａｒｒｏｔ－２とｓｇＲＮＡキメラＲＮＡを発現する組換えプラスミドを構築した。セントロメアターゲティング配列を含むｓｇＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２－１、ｓｇＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２－２及びｓｇＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２－３のｃＤＮＡを全ゲノム合成し、それらのコードするＲＮＡ配列はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２８、２９及び３０である。プライマーＰ２３及びＰ２４によって上記キメラＲＮＡのｃＤＮＡを増幅し、プライマーＰ２５及びＰ２６によってｐｓｇＲＮＡプラスミド（Ｓｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１６．４４：ｅ８６）を増幅し、実験方法（四）によって増幅されたｃＤＮＡと線形化したｐｓｇＲＮＡベクターとを連結して、得られたプラスミドをそれぞれ、ｐｓｇＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２－１、ｐｓｇＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２－２及びｐｓｇＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２－３と命名した（図１３ａ）。プライマーＰ２７及びＰ２８によってｐＳＬＱ１６４５（ｄＣａｓ９－ＧＦＰ）（Ｓｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１６．４４：ｅ８６）を鋳型としてｄＣａｓ９－ＧＦＰ遺伝子断片を増幅し、実験方法（四）によってＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩで二重酵素切断されたｐＣＤＮＡ３．１ｈｙｇｒｏ（＋）ベクターに挿入して、得られたプラスミドを、ｐＣＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏ（＋）－ｄＣａｓ９－ＧＦＰと命名した。
ＣａｒｒｏｔによってゲノムＤＮＡを検出するために、まず、Ｃａｒｒｏｔ－２とｓｇＲＮＡキメラＲＮＡを発現する組換えプラスミドを構築した。セントロメアターゲティング配列を含むｓｇＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２－１、ｓｇＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２－２及びｓｇＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２－３のｃＤＮＡを全ゲノム合成し、それらのコードするＲＮＡ配列はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２８、２９及び３０である。プライマーＰ２３及びＰ２４によって上記キメラＲＮＡのｃＤＮＡを増幅し、プライマーＰ２５及びＰ２６によってｐｓｇＲＮＡプラスミド（Ｓｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１６．４４：ｅ８６）を増幅し、実験方法（四）によって増幅されたｃＤＮＡと線形化したｐｓｇＲＮＡベクターとを連結して、得られたプラスミドをそれぞれ、ｐｓｇＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２－１、ｐｓｇＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２－２及びｐｓｇＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２－３と命名した（図１３ａ）。プライマーＰ２７及びＰ２８によってｐＳＬＱ１６４５（ｄＣａｓ９－ＧＦＰ）（Ｓｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１６．４４：ｅ８６）を鋳型としてｄＣａｓ９－ＧＦＰ遺伝子断片を増幅し、実験方法（四）によってＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩで二重酵素切断されたｐＣＤＮＡ３．１ｈｙｇｒｏ（＋）ベクターに挿入して、得られたプラスミドを、ｐＣＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏ（＋）－ｄＣａｓ９－ＧＦＰと命名した。
【0146】
ＣａｒｒｏｔとｓｇＲＮＡキメラＲＮＡに対応するｃＤＮＡの増幅に用いられたプライマーは、下記のとおりである。
【0147】
上流プライマー（Ｐ２３）：５’－ＡＡＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＣＣＧＡＡＴＣＴＧＣＡＡＧＴＧＧＡＴＡＴＴＧＴＴＴＧＡＧ－３’
下流プライマー（Ｐ２４）：５’－ＴＧＡＴＣＴＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣ－３’
ｐｓｇＲＮＡプラスミドを増幅して線形化したプライマーは、下記のとおりである。
下流プライマー（Ｐ２４）：５’－ＴＧＡＴＣＴＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣ－３’
ｐｓｇＲＮＡプラスミドを増幅して線形化したプライマーは、下記のとおりである。
【0148】
上流プライマー（Ｐ２５）：５’－ＴＴＴＴＴＴＴＣＴＡＧＡＴＣＡＴＡＡＴＣＡＧＣＣＡＴＡＣＣ－３’
下流プライマー（Ｐ２６）：５’－ＧＧＴＧＴＴＴＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＡＣＡＡＧ－３’
ＳｐｄＣａｓ９－ＧＦＰの増幅に用いられたプライマーは、下記のとおりである。
下流プライマー（Ｐ２６）：５’－ＧＧＴＧＴＴＴＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＡＣＡＡＧ－３’
ＳｐｄＣａｓ９－ＧＦＰの増幅に用いられたプライマーは、下記のとおりである。
【0149】
上流プライマー（Ｐ２７）：５’－ＴＡＧＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴＴＡＡＧＣＴＴＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＣＣ－３’
下流プライマー（Ｐ２８）：５’－ＡＣＧＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣ－３’
ｐＣＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏ（＋）－ｄＣａｓ９－ＧＦＰを、ｐｓｇＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２－１、ｐｓｇＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２－２及びｐｓｇＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２－３のそれぞれと組換えプラスミドの同時トランスフェクションによってＣＯＳ－７細胞に導入し、トランスフェクション２４ｈ後に、１μＭ ＩＶ－４及びＨｏｅｃｈｓｔによって細胞を標識し、蛍光顕微鏡によってＣａｒｒｏｔ－２－ＩＶ－４複合体、ＧＦＰ及びＨｏｅｃｈｓｔの蛍光を観察した。イメージング結果によれば、Ｃａｒｒｏｔ－２－ＩＶ－４の蛍光は主に細胞核中に集中し、かつ点状に集まり（セントロメア）、ｄＣａｓ９－ＧＦＰの蛍光と完全に合致する（図１３ｂ）ことから、Ｃａｒｒｏｔを遺伝子ＤＮＡへのイメージングに使用できることが分かった。
下流プライマー（Ｐ２８）：５’－ＡＣＧＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣ－３’
ｐＣＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏ（＋）－ｄＣａｓ９－ＧＦＰを、ｐｓｇＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２－１、ｐｓｇＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２－２及びｐｓｇＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２－３のそれぞれと組換えプラスミドの同時トランスフェクションによってＣＯＳ－７細胞に導入し、トランスフェクション２４ｈ後に、１μＭ ＩＶ－４及びＨｏｅｃｈｓｔによって細胞を標識し、蛍光顕微鏡によってＣａｒｒｏｔ－２－ＩＶ－４複合体、ＧＦＰ及びＨｏｅｃｈｓｔの蛍光を観察した。イメージング結果によれば、Ｃａｒｒｏｔ－２－ＩＶ－４の蛍光は主に細胞核中に集中し、かつ点状に集まり（セントロメア）、ｄＣａｓ９－ＧＦＰの蛍光と完全に合致する（図１３ｂ）ことから、Ｃａｒｒｏｔを遺伝子ＤＮＡへのイメージングに使用できることが分かった。
【0150】
実施例１３．ＣａｒｒｏｔによるＲＮＡ－タンパク質間の相互作用の検出
ＣａｒｒｏｔによってＲＮＡ－タンパク質間の相互作用を検出するために、ファージキャプシドタンパク質ＭＣＰの配列ＭＳ２ ＲＮＡの識別・結合を例とした。Ｃａｒｒｏｔ－１－ＭＳ２断片（コードするＲＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３１である）を全ゲノム合成し、プライマーＰ２９及びＰ３０によってそれを鋳型として増幅し、得られた断片を、実験方法（四）によってＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩで二重酵素切断されたｐＵ６－ｔＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２に挿入して、得られたプラスミドを、ｐＵ６－Ｃａｒｒｏｔ－１－ＭＳ２と命名した。ｔｄＭＣＰタンパク質をコードする遺伝子断片（ＭＣＰタンパク質の二量体形態であり、それをコードするＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３２である）及びＮａｎｏＬｕｃタンパク質をコードする遺伝子断片（それをコードするＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３３である）を全ゲノム合成し、プライマーＰ３１及びＰ３２、Ｐ３３及びＰ３４のそれぞれによってｔｄＭＣＰ遺伝子断片をそれぞれ増幅し、Ｐ３５及びＰ３６によってＮａｎｏＬｕｃ遺伝子断片を増幅し、実験方法（四）によって増幅された断片をＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩで二重酵素切断されたｐＣＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏ（＋）ベクターに挿入して、得られたプラスミドを、ｐＣＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏ（＋）－ｔｄＭＣＰ－ＮａｎｏＬｕｃ－ｔｄＭＣＰと命名し、そのコードする融合タンパク質の遺伝子配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３４である。
ＣａｒｒｏｔによってＲＮＡ－タンパク質間の相互作用を検出するために、ファージキャプシドタンパク質ＭＣＰの配列ＭＳ２ ＲＮＡの識別・結合を例とした。Ｃａｒｒｏｔ－１－ＭＳ２断片（コードするＲＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３１である）を全ゲノム合成し、プライマーＰ２９及びＰ３０によってそれを鋳型として増幅し、得られた断片を、実験方法（四）によってＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩで二重酵素切断されたｐＵ６－ｔＲＮＡ－Ｃａｒｒｏｔ－２に挿入して、得られたプラスミドを、ｐＵ６－Ｃａｒｒｏｔ－１－ＭＳ２と命名した。ｔｄＭＣＰタンパク質をコードする遺伝子断片（ＭＣＰタンパク質の二量体形態であり、それをコードするＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３２である）及びＮａｎｏＬｕｃタンパク質をコードする遺伝子断片（それをコードするＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３３である）を全ゲノム合成し、プライマーＰ３１及びＰ３２、Ｐ３３及びＰ３４のそれぞれによってｔｄＭＣＰ遺伝子断片をそれぞれ増幅し、Ｐ３５及びＰ３６によってＮａｎｏＬｕｃ遺伝子断片を増幅し、実験方法（四）によって増幅された断片をＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩで二重酵素切断されたｐＣＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏ（＋）ベクターに挿入して、得られたプラスミドを、ｐＣＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏ（＋）－ｔｄＭＣＰ－ＮａｎｏＬｕｃ－ｔｄＭＣＰと命名し、そのコードする融合タンパク質の遺伝子配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３４である。
【0151】
Ｃａｒｒｏｔ－１－ＭＳ２断片の増幅に用いられたプライマーは、下記のとおりである。
【0152】
上流プライマー（Ｐ２９）：５’－ＧＧＡＡＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＧＡＡＧＡＴＴＧＴＡＡＡＣＡＣ－３’
下流プライマー（Ｐ３０）：５’－ＴＧＴＣＴＣＧＡＧＧＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＧＴＧＴＣＣＧＡＴＧＧＧ－３’
ｔｄＭＣＰの増幅に用いられたプライマーは、下記のとおりである。
下流プライマー（Ｐ３０）：５’－ＴＧＴＣＴＣＧＡＧＧＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＧＴＧＴＣＣＧＡＴＧＧＧ－３’
ｔｄＭＣＰの増幅に用いられたプライマーは、下記のとおりである。
【0153】
上流プライマー（Ｐ３１）：５’－ＴＡＧＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧＣＴＡＧＣＣＧＴＴＡＡＡＡＴＧＧＣ－３’
下流プライマー（Ｐ３２）：５’－ＡＣＴＣＣＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＡＡＴＣＣＧＣＧＴＡＧＡＴＧＣ－３’
ｔｄＭＣＰの増幅に用いられた別の１セットのプライマーは、下記のとおりである。
下流プライマー（Ｐ３２）：５’－ＡＣＴＣＣＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＡＡＴＣＣＧＣＧＴＡＧＡＴＧＣ－３’
ｔｄＭＣＰの増幅に用いられた別の１セットのプライマーは、下記のとおりである。
【0154】
上流プライマー（Ｐ３３）：５’－ＡＣＴＣＣＣＴＣＣＣＧＣＣＡＧＡＡＴＧＣＧＴＴＣＧＣＡＣ－３’
下流プライマー（Ｐ３４）：５’－ＡＣＧＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＣＡＧＡＡＴＣＣＧＣＧＴＡＧ－３’
ＮａｎｏＬｕｃの増幅に用いられたプライマーは、下記のとおりである。
下流プライマー（Ｐ３４）：５’－ＡＣＧＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＣＡＧＡＡＴＣＣＧＣＧＴＡＧ－３’
ＮａｎｏＬｕｃの増幅に用いられたプライマーは、下記のとおりである。
【0155】
上流プライマー（Ｐ３５）：５’－ＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＧＴＡＴＧＧＴＣＴＴＣＡＣＡＣＴＣＧＡＡＧＡ－３’
下流プライマー（Ｐ３６）：５’－ＡＣＴＣＣＣＴＣＣＣＧＣＣＡＧＡＡＴＧＣＧＴＴＣＧＣＡＣ－３’
ｐＣＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏ（＋）－ｔｄＭＣＰ－ＮａｎｏＬｕｃ－ｔｄＭＣＰをｐＵ６－Ｃａｒｒｏｔ－１－ＭＳ２と組換えプラスミドの同時トランスフェクションによって２９３Ｔ／１７細胞に導入し、トランスフェクション２４ｈ後に、まず、１μＭ ＩＶ－４フルオロフォアを加えてＣａｒｒｏｔを標識した後、培地に２０μＭ Ｆｕｒｉｍａｚｉｎｅを加えた直後にイメージングした。イメージング結果によれば、ｔｄＭＣＰ－ＮａｎｏＬｕｃ－ｔｄＭＣＰ融合タンパク質におけるｔｄＭＣＰタンパク質は、Ｃａｒｒｏｔ－１－ＭＳ２キメラＲＮＡにおけるＭＳ２ ＲＮＡを識別・結合するため、Ｃａｒｒｏｔ－ＩＶ－４複合体とＮａｎｏＬｕｃタンパク質との間の距離が非常に近く、ＮａｎｏＬｕｃの触媒基質Ｆｕｒｉｍａｚｉｎｅが発した光はＣａｒｒｏｔ－ＩＶ－４複合体へ移動するので、発光エネルギー移動（ＢＲＥＴ）の効率が比較的高く、更に、Ｃａｒｒｏｔ－ＩＶ－４複合体を励起して明らかなオレンジレッドの蛍光を生じる（図１４）。コントロールとして、ＭＳ２を含まない単独のＣａｒｒｏｔ－１ＲＮＡは、ｔｄＭＣＰ－ＮａｎｏＬｕｃ－ｔｄＭＣＰ融合タンパク質と相互作用を生じず、Ｃａｒｒｏｔ－ＩＶ－４複合体とＮａｎｏＬｕｃタンパク質との間の距離が比較的遠く、ＮａｎｏＬｕｃの触媒基質Ｆｕｒｉｍａｚｉｎｅが発した光はＣａｒｒｏｔ－ＩＶ－４複合体へ移動しないため、発光エネルギー移動（ＢＲＥＴ）の効率が比較的低く、Ｃａｒｒｏｔ－ＩＶ－４複合体を励起して明らかなオレンジレッドの蛍光を生じることができない（図１４）。
下流プライマー（Ｐ３６）：５’－ＡＣＴＣＣＣＴＣＣＣＧＣＣＡＧＡＡＴＧＣＧＴＴＣＧＣＡＣ－３’
ｐＣＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏ（＋）－ｔｄＭＣＰ－ＮａｎｏＬｕｃ－ｔｄＭＣＰをｐＵ６－Ｃａｒｒｏｔ－１－ＭＳ２と組換えプラスミドの同時トランスフェクションによって２９３Ｔ／１７細胞に導入し、トランスフェクション２４ｈ後に、まず、１μＭ ＩＶ－４フルオロフォアを加えてＣａｒｒｏｔを標識した後、培地に２０μＭ Ｆｕｒｉｍａｚｉｎｅを加えた直後にイメージングした。イメージング結果によれば、ｔｄＭＣＰ－ＮａｎｏＬｕｃ－ｔｄＭＣＰ融合タンパク質におけるｔｄＭＣＰタンパク質は、Ｃａｒｒｏｔ－１－ＭＳ２キメラＲＮＡにおけるＭＳ２ ＲＮＡを識別・結合するため、Ｃａｒｒｏｔ－ＩＶ－４複合体とＮａｎｏＬｕｃタンパク質との間の距離が非常に近く、ＮａｎｏＬｕｃの触媒基質Ｆｕｒｉｍａｚｉｎｅが発した光はＣａｒｒｏｔ－ＩＶ－４複合体へ移動するので、発光エネルギー移動（ＢＲＥＴ）の効率が比較的高く、更に、Ｃａｒｒｏｔ－ＩＶ－４複合体を励起して明らかなオレンジレッドの蛍光を生じる（図１４）。コントロールとして、ＭＳ２を含まない単独のＣａｒｒｏｔ－１ＲＮＡは、ｔｄＭＣＰ－ＮａｎｏＬｕｃ－ｔｄＭＣＰ融合タンパク質と相互作用を生じず、Ｃａｒｒｏｔ－ＩＶ－４複合体とＮａｎｏＬｕｃタンパク質との間の距離が比較的遠く、ＮａｎｏＬｕｃの触媒基質Ｆｕｒｉｍａｚｉｎｅが発した光はＣａｒｒｏｔ－ＩＶ－４複合体へ移動しないため、発光エネルギー移動（ＢＲＥＴ）の効率が比較的低く、Ｃａｒｒｏｔ－ＩＶ－４複合体を励起して明らかなオレンジレッドの蛍光を生じることができない（図１４）。
【0156】
実施例１４．ＣａｒｒｏｔによるＲＮＡの精製と純化のタグ
実施例１１におけるｐＣＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏ（＋）－ＧＡＰＤＨ－４Ｃａｒｒｏｔ－２を組換えプラスミドトランスフェクションによってＣＯＳ－７細胞に導入し、２４ｈ後に細胞を収集し、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１２５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２の緩衝液によって再懸濁させた（氷上で取り扱い）。Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔｈｉｏｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を取って５００μＬ ＰＢＳで２回洗浄した後、１０ｍＭ ＴＣＥＰ（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳを加えて室温で１ｈインキュベーションした。５００μＬ ＰＢＳで２回洗浄した後、マレアミドを含むＩＶ－３９フルオロフォア分子（Ｍａｌ－ＩＶ－３９）を加えて室温で３０ｍｉｎ反応し、５００μＬ ＰＢＳで３回洗浄した。再懸濁された細胞を破砕後に処理済みのビーズと４℃でインキュベーションし、３０ｍｉｎ後に４０００ｒｐｍで２ｍｉｎ遠心し、上澄みを捨て、予冷された４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１２５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２の緩衝液でアガロースビーズを６回洗浄し、毎回とも遠心して上澄みを捨てた。ＤＥＰＣ水でビーズを再選択し、７０℃で１０ｍｉｎ処理し、４０００ｒｐｍで２ｍｉｎ遠心して、上澄みを集めた。集められた上澄みに１／１０体積のＮａＡｃ、２．５倍体積の無水エタノールを加えて、－８０℃の冷蔵庫で２０ｍｉｎ放置し、４℃条件下で１４０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心し、沈殿物を残し、上澄みを捨て、予冷された７０％エタノール溶液で沈殿物を洗浄し、４℃条件下で１４０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心し、沈殿物を残し、上澄みを捨て、この手順を１回繰り返した。沈殿物を室温で５ｍｉｎ置いて、エタノールが揮発し終わった後、少量体積のＤＥＰＣ水を加えて沈殿物を再懸濁させた。
実施例１１におけるｐＣＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏ（＋）－ＧＡＰＤＨ－４Ｃａｒｒｏｔ－２を組換えプラスミドトランスフェクションによってＣＯＳ－７細胞に導入し、２４ｈ後に細胞を収集し、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１２５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２の緩衝液によって再懸濁させた（氷上で取り扱い）。Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔｈｉｏｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を取って５００μＬ ＰＢＳで２回洗浄した後、１０ｍＭ ＴＣＥＰ（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳを加えて室温で１ｈインキュベーションした。５００μＬ ＰＢＳで２回洗浄した後、マレアミドを含むＩＶ－３９フルオロフォア分子（Ｍａｌ－ＩＶ－３９）を加えて室温で３０ｍｉｎ反応し、５００μＬ ＰＢＳで３回洗浄した。再懸濁された細胞を破砕後に処理済みのビーズと４℃でインキュベーションし、３０ｍｉｎ後に４０００ｒｐｍで２ｍｉｎ遠心し、上澄みを捨て、予冷された４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１２５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２の緩衝液でアガロースビーズを６回洗浄し、毎回とも遠心して上澄みを捨てた。ＤＥＰＣ水でビーズを再選択し、７０℃で１０ｍｉｎ処理し、４０００ｒｐｍで２ｍｉｎ遠心して、上澄みを集めた。集められた上澄みに１／１０体積のＮａＡｃ、２．５倍体積の無水エタノールを加えて、－８０℃の冷蔵庫で２０ｍｉｎ放置し、４℃条件下で１４０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心し、沈殿物を残し、上澄みを捨て、予冷された７０％エタノール溶液で沈殿物を洗浄し、４℃条件下で１４０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心し、沈殿物を残し、上澄みを捨て、この手順を１回繰り返した。沈殿物を室温で５ｍｉｎ置いて、エタノールが揮発し終わった後、少量体積のＤＥＰＣ水を加えて沈殿物を再懸濁させた。
【0157】
細胞破砕後の上澄み液、及び最終高温溶出後の溶出液をフルオロフォアＩＶ－３９とインキュベーションした後の蛍光をそれぞれ検出し、ブランク細胞を破砕した上澄みをコントロールとした。検出結果によれば、溶出液をＩＶ－３９とインキュベーションした後の蛍光は明らかにサンプルローディング前の破砕後上澄み液を上回り（図１５）、このことから、ＧＡＰＤＨ－４Ｃａｒｒｏｔ－２ ＲＮＡがうまく濃化されていることが分かり、Ｃａｒｒｏｔを１個のタグとしてＲＮＡの分離と純化に使用できることが分かった。
【0158】
実施例１５．IV－３９及びその類似体の合成
化合物IV－１：
化合物IV－１：
【0159】
【化9】
化合物IV－２：
【0160】
【化10】
化合物IV－３：
【0161】
【化11】
化合物IV－４：
【0162】
【化12】
化合物IV－５：
【0163】
【化13】
化合物IV－６：
【0164】
【化14】
化合物IV－７：
化合物２：
【0165】
【化15】
【0166】
【化16】
化合物IV－８：
化合物３：
【0167】
【化17】
【0168】
【化18】
化合物IV－９：
化合物５：
【0169】
【化19】
【0170】
【化20】
化合物IV－１０：
化合物６：
【0171】
【化21】
【0172】
【化22】
化合物IV－１１：
化合物７：
【0173】
【化23】
【0174】
【化24】
化合物IV－１２：
化合物８：
【0175】
【化25】
【0176】
【化26】
化合物IV－１３：
化合物９：
【0177】
【化27】
【0178】
【化28】
化合物IV－１４：
化合物１０：
【0179】
【化29】
【0180】
【化30】
化合物IV－１５：
化合物１１：
【0181】
【化31】
【0182】
【化32】
化合物IV－１６：
化合物１２：
【0183】
【化33】
【0184】
【化34】
化合物IV－１７：
【0185】
【化35】
化合物IV－１８：
【0186】
【化36】
化合物IV－１９：
【0187】
【化37】
化合物IV－２０：
【0188】
【化38】
化合物IV－２１：
【0189】
【化39】
化合物IV－２２：
【0190】
【化40】
化合物IV－２３：
化合物１３：
【0191】
【化41】
化合物１４：
【0192】
【化42】
【0193】
【化43】
化合物IV－２４：
化合物１５：
【0194】
【化44】
化合物１６：
【0195】
【化45】
【0196】
【化46】
化合物IV－２５：
化合物１７：
【0197】
【化47】
【0198】
【化48】
化合物IV－２６：
化合物１８：
【0199】
【化49】
【0200】
【化50】
化合物IV－２７：
化合物１９：
【0201】
【化51】
【0202】
【化52】
化合物IV－２８：
化合物２０：
【0203】
【化53】
【0204】
【化54】
化合物IV－２９：
化合物２１：
【0205】
【化55】
【0206】
【化56】
化合物IV－３０：
化合物２２：
【0207】
【化57】
【0208】
【化58】
化合物IV－３１：
【0209】
【化59】
化合物IV－３２：
化合物３１：
【0210】
【化60】
【0211】
【化61】
ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ Ｃａｌｃｄ．Ｆｏｒ Ｃ２５Ｈ２８ＢｒＮ４Ｏ３ ５１１．１３４５；ｆｏｕｎｄ ５１１．１３４４，[Ｍ＋Ｈ]＋．
化合物IV－３３：
化合物２５：
【0212】
【化62】
【0213】
【化63】
【0214】
残留物を３０ｍｌ ＴＨＦに溶解し、Ｐｈ３Ｐ（０．５２４ｇ、２．０ｍｍｏｌ）、２ｍｌの水を加えて、Ａｒ保護条件で室温で一晩撹拌し、翌日に加圧で溶媒を除去し、残留物をカラムクロマトグラフィーで分離して目的の生成物（０．３０１ｇ、７９％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ ８．１７（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝１５．８Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｄｔ，Ｊ＝１０．６，２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．５０（ｔｄ，Ｊ＝８．０，６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３４－７．２０（ｍ，２Ｈ），６．９７（ｓ，１Ｈ），６．８４－６．７３（ｍ，２Ｈ），３．３８（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．９２（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．２７（ｓ，３Ｈ），３．０６（ｓ，３Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ Ｃａｌｃｄ．Ｆｏｒ Ｃ２２Ｈ２４ＦＮ４Ｏ ３７９．１９３４；ｆｏｕｎｄ ３７９．１９３５，[Ｍ＋Ｈ]＋．
化合物IV－３４：
化合物IV－３４：
【0215】
【化64】
化合物IV－３５：
化合物２６：
【0216】
【化65】
【0217】
【化66】
化合物IV－３６：
【0218】
【化67】
化合物IV－３７：
【0219】
【化68】
化合物IV－３８：
【0220】
【化69】
化合物IV－３９：
【0221】
【化70】
化合物IV－４０：
【0222】
【化71】
【0223】
本明細書の各実施例における使用量、反応条件などは、特に明記がない限り、いずれも近似値であり、実状に応じて若干の変更を加えて類似する結果を得ることができる、と理解すべきである。特に定義がない限り、本明細書で用いられたすべての専門用語と科学用語は、当業者が理解する意味と同一である。本明細書で言及されたすべての文献は、いずれも参考として本願に取り込まれる。本明細書で説明したのは、例示用の好適な実施形態であり、当業者であれば、本明細書で説明したのと似た方法及び材料を用いて本発明を実施して同一又は類似する結果を得ることができ、本発明に加えた様々な変更又は修正は依然として本願に添付の請求の範囲で規定された範囲内に包含される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-07-24
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヌクレオチド配列（ａ）、ヌクレオチド配列（ｂ）、又はヌクレオチド配列（ｃ）を含む核酸アプタマー分子であって、
前記ヌクレオチド配列（ａ）は、Ｎ１ＡＧＡＵＵＧＵＡＡＡＣＡＮ１４－Ｎ１５－Ｎ１６ＧＡＣＡＣＵＮ２３であって、Ｎ１、Ｎ１４、Ｎ１５、Ｎ１６及びＮ２３は、長さがヌクレオチド１個分と同等又はそれ以上の断片を表し、かつＮ１とＮ２３ヌクレオチド配列のうちの少なくとも一対の塩基が、相補的塩基対を形成し、Ｎ１４とＮ１６ヌクレオチド配列のうちの少なくとも一対の塩基が、相補的塩基対を形成し、
前記ヌクレオチド配列（ｂ）は、ヌクレオチド配列（ａ）と少なくとも７０％、７２％、７７％、８３％、８８％、９４％又は１００％の同一性を有し、
前記ヌクレオチド配列（ｃ）は、ヌクレオチド配列（ａ）においてＮ１、Ｎ１４、Ｎ１５、Ｎ１６及びＮ２３を含まない位置で、１個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠損及び／又は挿入されて、かつアプタマー機能を有し、ヌクレオチド配列（ａ）から誘導されたものである、
核酸アプタマー分子。
前記ヌクレオチド配列（ａ）は、Ｎ１ＡＧＡＵＵＧＵＡＡＡＣＡＮ１４－Ｎ１５－Ｎ１６ＧＡＣＡＣＵＮ２３であって、Ｎ１、Ｎ１４、Ｎ１５、Ｎ１６及びＮ２３は、長さがヌクレオチド１個分と同等又はそれ以上の断片を表し、かつＮ１とＮ２３ヌクレオチド配列のうちの少なくとも一対の塩基が、相補的塩基対を形成し、Ｎ１４とＮ１６ヌクレオチド配列のうちの少なくとも一対の塩基が、相補的塩基対を形成し、
前記ヌクレオチド配列（ｂ）は、ヌクレオチド配列（ａ）と少なくとも７０％、７２％、７７％、８３％、８８％、９４％又は１００％の同一性を有し、
前記ヌクレオチド配列（ｃ）は、ヌクレオチド配列（ａ）においてＮ１、Ｎ１４、Ｎ１５、Ｎ１６及びＮ２３を含まない位置で、１個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠損及び／又は挿入されて、かつアプタマー機能を有し、ヌクレオチド配列（ａ）から誘導されたものである、
核酸アプタマー分子。
【外国語明細書】