特開 2024-123243 ヒト化抗糖タンパク質ＩＢアルファ（ＧＰＩＢＡＬＰＨＡ）抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024123243

(43)【公開日】2024-09-10

(54)【発明の名称】ヒト化抗糖タンパク質ＩＢアルファ（ＧＰＩＢＡＬＰＨＡ）抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20240903BHJP

   C07K 16/46 20060101ALN20240903BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C12N15/13 ZNA

C07K16/46 ZNA

C07K16/46

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024103442

(22)【出願日】2024-06-27

(62)【分割の表示】P 2022535596の分割

【原出願日】2020-12-10

(31)【優先権主張番号】62/946,086

(32)【優先日】2019-12-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】522230174

【氏名又は名称】シーシーオーエイ セラピューティクス （ハンヂョウ） カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100095407

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 満

(74)【代理人】

【識別番号】100132883

【弁理士】

【氏名又は名称】森川 泰司

(74)【代理人】

【識別番号】100148633

【弁理士】

【氏名又は名称】桜田 圭

(74)【代理人】

【識別番号】100147924

【弁理士】

【氏名又は名称】美恵 英樹

(72)【発明者】

【氏名】ニ、ヘユ

(57)【要約】      （修正有）

【課題】血小板の活性化、血小板破壊、血小板減少症、または重大な出血性合併症を引き起こさない血小板ＧＰＩｂ－ＩＸ－Ｖ複合体を標的とする改善された治療薬を提供する。
【解決手段】血小板糖タンパク質Ｉ（ｂ）α（ＧＰＩｂα）を特異的に認識するヒト化抗体であって、前記ヒト化抗体は、Ｆｃ部分を欠いており、且つ、血小板の活性化、凝集、および／または血栓の成長を防ぐことができ、血小板を活性化する能力を欠いており、血小板減少症を誘発する能力を欠いており、および／または、治療用量では出血時間を延長する能力を欠いている、ことを特徴とするヒト化抗体が提供される。
【選択図】図１８

【特許請求の範囲】

【請求項1】

血小板糖タンパク質Ｉ（ｂ）α（ＧＰＩｂα）を特異的に認識するヒト化抗体であって、
前記ヒト化抗体は、Ｆｃ部分を欠いており、且つ、
血小板の活性化、凝集、および／または血栓の成長を防ぐことができ、
血小板を活性化する能力を欠いており、
血小板減少症を誘発する能力を欠いており、および／または、
治療用量では出血時間を延長する能力を欠いている、
ことを特徴とするヒト化抗体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願と配列表の相互参照）
本願は、２０１９年１２月１０日に出願された米国仮出願第６２／９４６，０８６号の優先権を主張し、その全体が参照により本願に組み込まれるものとする。当該出願に関連する配列表はテキスト形式で提供され、参照により本願に組み込まれるものとする。配列表を含むテキストのファイル名は、「PCT_-_Sequence_listing_as_filed」である。テキストファイルは８１．２Ｋｏで、２０２０年１２月９日に作成され、電子的に送信されている。

【0002】

（技術分野）
本開示は、血小板糖タンパク質Ｉ（ｂ）α（ＧＰＩｂα）を特異的に認識し結合するヒト化抗体、およびそれを含むタンパク質構築物、ならびに、それに関連する治療用途に関する。

【背景技術】

【0003】

冠状動脈または大脳動脈におけるアテローム性動脈硬化症の破裂部位での血小板の接着および凝集は、通常急性血栓症における重要な事象である。したがって、抗血小板療法は、心血管死を減らすための重要な治療法の１つであり、次のようなものがある。（ｉ）アスピリンなどのシクロオキシゲナーゼ阻害剤、（ｉｉ）クロピドグレル、プラスグレル、チカグレロルのような血小板Ｐ２Ｙ１２受容体拮抗薬、（ｉｉｉ）アブシキシマブ、エプチフィバチド、チロフィバンのようなαＩＩｂβ３拮抗薬、および（ｉｖ）ボラパキサルのようなＰＡＲ１拮抗薬、等々。しかし、血小板機能の遅発性／弱い／貧弱な阻害、過度の出血性合併症、血小板減少症、および予期しない血小板活性化のような現在の抗血小板療法の限界は、治療の進歩を促進するに主要な懸念事項である。特に、急性虚血性脳卒中に関して、現在の抗血栓／血栓溶解薬の潜在的な神経毒性（例えば、組換え組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ））および／または頭蓋内出血のリスクがあるために、ならびに、静脈内血栓溶解治療時間窓を通過した患者について、それが利用できない場合、治療は非常に限られている。

【0004】

血小板ＧＰＩｂ－ＩＸ－Ｖ複合体が有望な抗血小板標的として浮上してきている。ＧＰＩｂ－ＩＸ－Ｖ複合体は、特に高せん断で、損傷した血管壁への血小板の接着と移動を開始する際の重要な血小板受容体である。血小板の内皮下層への接着／移動は、損傷した血管壁に固定／固定化されたフォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）へのＧＰＩｂαサブユニットの結合により媒介される。ＶＷＦは、活性化された内皮細胞および血小板から分泌される多量体接着性血液タンパク質である。次に、ＧＰＩｂα－ＶＷＦ結合は、トロンボキサンＡ２やＡＤＰなどの血小板アゴニストの放出をもたらすシグナル伝達過程ならびに血小板αＩＩｂβ３インテグリンの活性化を引き起こし、フィブリノーゲン、ＶＷＦなどへのαｉｉｂβ３結合による血小板凝集をもたらす。高せん断条件下では、ＧＰＩｂα－ＶＷＦ相互作用は、血液が１００００～４００００秒を超える可能性のある壁せん断速度で流れる動脈狭窄部位での閉塞性血栓の病理学的成長（血小板接着および血小板凝集／粘着の両方）に必要である。一方、低せん断条件下（止血のほとんどの場合など）では、血小板接着は、αＩＩｂβ３－フィブリノーゲン／フィブリンとα２β１／ＧＰＶＩ－コラーゲン相互作用などによって直接媒介され得る。したがって、ＧＰＩｂαの薬理学的阻害は、高せん断での血栓症を特異的に標的としない他の抗血小板薬と比較して、全身性出血の危険性を低下させ、安全性を向上させる可能性がある。ＧＰＩｂαは、急性虚血性脳卒中などの血栓炎症性条件下での白血球動員に重要であることが示されている。さらに、以前に低酸素であった脳領域の虚血－再灌流（例えば、血栓溶解または血栓除去によって）は、ＧＰＩｂαを介して血小板の炎症誘発性機能を増加させる可能性があり、これは血栓炎症性神経障害および梗塞成長をさらに促進する可能性がある。さらに、ＧＰＩｂαは血小板と巨核球に特異的に発現すると考えられる。したがって、直接血小板ＧＰＩｂα拮抗薬は、心臓発作や脳卒中などの急性血栓性事象の治療のために効果的で安全な抗血小板薬として開発される可能性が大きい。

【0005】

特に、ＧＰＩｂα－ＶＷＦ相互作用を標的とする新規抗血小板戦略は、後天性血栓性血小板減少性紫斑病（ａｃｑｕｉｒｅｄ ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ ｐｕｒｐｕｒａ、ａＴＴＰ）、血栓性微小血管障害、および未治療の場合に高い死亡率を伴う生命を脅かす状態を治療するために効果的な治療法として示されている。ＡＤＡＭＴＳ１３（トロンボスポンジン１型モチーフを持つディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３）に対する自己抗体として、ＶＷＦの多量体サイズを切断／縮小するＶＷＦ切断プロテアーゼは、ＡＤＡＭＴＳ１３活性の重篤な欠損をもたらす。これらの超大型ＶＷＦは、血管内で血小板（ＧＰＩｂα）－ＶＷＦ微小血栓の形成を引き起こし、臓器の虚血と梗塞、血小板数の減少、赤血球の破壊につながるハイパー接着剤である。したがって、ＶＷＦと血小板ＧＰＩｂαの間の相互作用をブロックすると、血小板数のより迅速な正常化を達成し、血栓塞栓性イベントを減らすことにより、急性ＴＴＰの発症を防ぐことができる。

【0006】

ＶＷＦ Ａ１ドメインを標的とするナノボディカプラシズマブは、血漿交換（ＰＥＸ）および毎日のＰＥＸの停止後の最低３０日間の免疫抑制と組み合わせて、ａＴＴＰの急性エピソードを経験している成人の治療のために承認されていた。ただし、出血に関連する有害事象は、深刻な出血事象と同様に（１１％対１％）、カプラシズマブでより一般的であった（６５％対４８％）。カプラシズマブのもう１つの障壁は、薬剤の莫大な費用であった。２０２０年のカプラシズマブの現在価格は、ＡＤＡＭＴＳ１３活性の回復まで継続的な治療の可能性がある最後の血漿交換後に３０日間毎日投与を推奨する治療レジメンで、８，０００米ドル以上である。ＶＷＦは活性化された内皮から一貫して放出されるため、血小板上のＧＰＩｂαの比較的安定したレベルは、ヒトで７～１０日の短い寿命で、ＴＴＰ療法にとってより魅力的で強力な標的であるように思われる。

【0007】

特許文献１には、ヘビ「Ｄｅｉｎａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ａｃｕｔｕｓ」の毒液から精製されたＧＰＩｂα結合ヘビＣ型レクチン（ｓｎａｃｌｅｃ）抗血小板血栓溶解薬について記載されている。抗血小板トロンボライシンは、出血時間や凝固を大幅に変えることなく、ＧＰＩｂ－ＶＷＦ相互作用を阻止することにより、リストセチン誘発性ヒト血小板凝集および血栓症を抑制した。抗血小板トロンボライシンは、現在、後天性血栓性血小板減少性紫斑病およびＳＴ上昇型心筋梗塞の患者を対象とした第ＩＩ相臨床試験で評価されている。しかし、外来のヘビタンパク質が、免疫応答を誘発し、抗薬物抗体を生成して薬物を中和し、治療効果を排除する可能性があることが知られている。さらに、これらの抗体は、腎臓や関節（関節炎）に損傷を与える可能性のあるアレルギー反応または免疫複合体形成を引き起こす可能性がある。さらに、必要な再投与は、記憶免疫細胞を刺激し、そのような免疫応答と免疫反応を高める可能性がある。

【0008】

特許文献２には、ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片にプロリンを介して結合した変異型ＧＰＩｂαＮ末端細胞外２９０アミノ酸（Ｇ２３３ＶおよびＭ２３９Ｖ）を含む可溶性キメラタンパク質である組換えＧＰＧ－２９０またはＧＰＩｂ－２９０／２Ｖ－免疫グロブリン（Ｉｇ）融合ポリペプチドについて記載されている。ＧＰＧ－２９０は、ＶＷＦとの結合について、血小板ＧＰＩｂαと競合し、野生型ＧＰＩｂαと比較してＶＷＦに対して１４倍の親和性を示した。動物モデルでは、ＧＰＧ－２９０は、冠状動脈閉塞までの時間を用量依存的に延長し、また、５０～１００μｇ／ｋｇ範囲の用量で、出血時間を延長することなく、血小板凝集、血栓症、および再発性冠状動脈循環流の減少を抑制した。しかしながら、試験されたより高い用量（５００μｇ／ｋｇ）は、おそらくα－トロンビンを止血に利用できなくする高い親和性でのα－トロンビンへのＧＰＧ－２９０結合のために、出血時間の３～４倍の増加を誘発した。

【0009】

特許文献３には、さらに、ＧＰＩＢ－２９０／２Ｖ／ＦＦＦＩｇバリアント融合タンパク質（Ｙ２７６Ｆ、Ｙ２８８Ｆ、および／またはＹ２９７Ｆ）が記載されている。これは、α－トロンビンに対する限定的な／低い親和性結合を示し、反復性冠状動脈血栓症を抑制すること（すなわち、再発性冠状動脈循環減少を阻害する）において５０％の効力低下を示し、また、ＧＰＧ－２９０と比較して、血小板機能分析－１００（Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ－１００、ＰＦＡ－１００）で評価する場合、尾部出血時間の延長とＡＤＰ閉鎖時間の増加を示す。ただし、これらのＧＰＩｂ－Ｉｇ融合タンパク質は、高分子量キメラタンパク質（約１３０ｋＤａ）であり、高せん断速度条件で主に内皮下固定化ＶＷＦまたは血漿ＶＷＦを標的とする。したがって、これらの融合タンパク質の量およびアクセス可能性は、あまり予測できず、注入されるべき製品の量が多いと潜在的な制限になる可能性がある。もう一つの制限は抗薬物抗体生成のリスクである可能性がある。ＧＰＩｂ－Ｉｇ融合タンパク質は、生物工学的キメラ蛋白質である。ＧＰＩｂαポリペプチドとＦｃ断片はどちらもヒト遺伝子に由来するため、抗原性を最小限に抑えることができるが、ＧＰＩｂαバリアントの変異およびＧＰＩｂαとＦｃ部分との間の関節領域は、免疫応答を誘発するネオエピトープを生成する可能性がある。さらに、融合タンパク質は、抗薬物抗体産生を誘導するいくつかの立体配座ネオエピトープを生成することができる。

【0010】

また、当技術分野には、ヒトＧＰＩｂαに対する中和モノクローナル抗体（抗ＧＰＩｂα ｍＡｂ）も記載された。しかし、現在入手可能な抗ＧＰＩｂαｍＡｂの大部分は、マウス由来であり、従って臨床使用におけるヒト抗マウス応答を引き起こす可能性がある。さらに、無傷の抗ＧＰＩｂα ｍＡｂは、血小板の活性化につながることが多く、これは無傷のｍＡｂの結合が血小板ＧＰＩｂαを介したシグナル伝達を誘導し、血小板の凝集と血栓症を予期せず悪化させる可能性があるためであると思われる。さらに、血小板に結合する無傷の抗ＧＰＩｂαｍＡｂは、Ｆｃ依存性およびＦｃ非依存性の両方の血小板クリアランスを引き起こし、血小板減少症（すなわち、血小板数の低下）を引き起こす可能性がある。したがって、無傷の抗ＧＰＩｂα ｍＡｂは、非常に限られた治療の可能性を示す。

【0011】

特許文献４には、リストセチン誘発血小板凝集をインビトロで用量依存的に阻害するヒトＧＰＩｂαに対するキメラｍＡｂであるキメラ抗体ｃｈＳＺ２のＦａｂ断片が記載されている。しかし、それはマウス抗体の可変領域を保持し、定常領域がヒトのものに置き換わっているキメラ抗体であるため、免疫原性は依然として大きな懸念事項である。重要なことに、本技術分野で知られているように他の動物種からのＧＰＩｂαを認識できない可能性があり、動物モデルが不足しているため、血栓性疾患を予防／治療するためのｃｈＳＺ２の生体内機能は実証されていない。

【0012】

特許文献５には、ヒト化６Ｂ４（ｈ６Ｂ４－Ｆａｂ）の別のＦａｂ断片であって、精製されたヒトＧＰＩｂαに対して産生されたマウスｍＡｂが記載されている。ｈ６Ｂ４－Ｆａｂは、ヒヒの狭窄した大腿動脈の循環流の減少を減らすか、または完全に消失させる。ただし、ｈ６Ｂ４－Ｆａｂの抗血栓効果に伴て、出血時間が延長した。さらに、これらの抗ＧＰＩｂα抗体は、それらの対応するＦａｂ断片と共に、従来の技術を用いて（すなわち、ヒトＧＰＩｂαにより免疫化された）野生型マウスで生成された。これらの抗ＧＰＩｂα抗体は、マウスＧＰＩｂαを認識できず（マウスおよびヒトＧＰＩｂαは、重要な相同性を有する）、ヒトＧＰＩｂαに存在しマウスＧＰＩｂαには存在しないエピトープに対して産生される抗体のレパートリーは限られている。したがって、これらのｍＡｂは、重要な前臨床薬理学、毒物学、および薬物動態研究のために、齧歯類または他の動物種で解析・評価することができない。ｈ６Ｂ４－Ｆａｂが血小板活性化を引き起こす可能性があるかどうかは、その前駆体ｍＡｂ６Ｂ４が明らかに血小板活性化と重症血小板減少症を引き起こすことができるので、また懸念されている。

【0013】

したがって、血小板の活性化、血小板破壊、血小板減少症、または重大な出血性合併症を引き起こさない血小板ＧＰＩｂ－ＩＸ－Ｖ複合体を標的とする改善された治療薬が、必要である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0014】

【特許文献1】中国特許第１０３２６３６６２号明細書

【特許文献2】米国特許第７０４９１２８号明細書

【特許文献3】米国特許第７７２７５３５号明細書

【特許文献4】中国特許第１０２９８８９８３号明細書

【特許文献5】米国特許第７３３２１６２号明細書

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0015】

本開示は、糖タンパク質Ｉ（ｂ）α（ＧＰＩｂα）を特異的に認識するヒト化抗体およびそれを含むタンパク質構築物ならびにそれに関連する治療用途に関する。ヒト化抗体は、（特に高せん断で）血小板の活性化、凝集、血栓の成長を防ぐ能力を有し、血小板を活性化する能力を欠き（例えば、血小板を活性化せず）、血小板減少症を誘発する能力を欠き、および／または、治療用量では出血時間を延長する能力を欠く。

【0016】

第１の実施態様によれば、本開示は、糖タンパク質Ｉ（ｂ）α（ＧＰＩｂα）を特異的に認識するヒト化抗体を提供する。ヒト化抗体は、Ｆｃ受容体部分を欠いている。ヒト化抗体は、血小板の活性化、凝集、および／または血栓増殖を防ぐ能力を有し、血小板を活性化する能力を欠いており、血小板減少症を誘発する能力を欠いており、および／または、治療用量では出血時間を延長する能力を欠いている。一実施形態によれば、ヒト化抗体は、ヒトＧＰＩｂα、マウスＧＰＩｂα、イヌＧＰＩｂα、ラットＧＰＩｂα、ウサギＧＰＩｂα、および／またはサルＧＰＩｂαを認識する能力を有する。別の実施形態によれば、ヒト化抗体は抗体断片である。一実施例には、抗体はＦ（ａｂ）_２断片である。例えば、抗体断片はＦａｂ抗体断片である。別の実施形態によれば、抗体断片は単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。一実施形態によれば、ヒト化抗体は重鎖を有する。いくつかの実施形態において、重鎖は、ＧＦＴＦＳＳＦＡＭＳ（配列番号３７）のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する第１のＣＤＲ、ＳＩＴＳＡＧＴＰＹＹＰＤＳＶＬＧ（配列番号３８）のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する第２のＣＤＲ、および／または、ＳＲＧＹＥＤＹＦＤＹ（配列番号３９）のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する第３のＣＤＲを含む。さらに別の実施形態において、重鎖は、ヒトＩｇＧ_１抗体のＣＨ１領域をさらに含む。例えば、ヒトＩｇＧ_１抗体のＣＨ１領域は、配列番号４０、４７、５４または６１のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する。一実施形態において、重鎖は、配列番号３６、４３、５０または５７のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する。別の実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体は軽鎖を有する。いくつかの実施形態において、軽鎖は、ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号６５）のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する第１のＣＤＲ、ＦＴＳＴＲＥＳのアミノ酸配列（配列番号６６）、そのバリアントまたはその断片を有する第２のＣＤＲ、および／または、ＱＱＨＹＳＳＰＷＴ（配列番号６７）のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する第３のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、軽鎖はヒトＩｇＧ１抗体のカッパ鎖Ｃ領域をさらに含む。いくつかの追加の実施形態において、カッパ鎖Ｃ領域は、配列番号６８、７５、８２または８９のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する。さらなる実施形態において、軽鎖は、配列番号６４、７１、７８または８５のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、配列番号３６の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号６４の軽鎖、そのバリアントまたはその断片；配列番号３６の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号７１の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、配列番号３６の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号７８の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、配列番号３６の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号８５の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、配列番号４３の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号６４の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、配列番号４３の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号７１の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、配列番号４３の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号７８の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、配列番号４３の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号８５の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、配列番号５０の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号６４の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、配列番号５０の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号７１の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、配列番号５０の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号７８の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、配列番号５０の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号８５の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、配列番号５７の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号６４の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、配列番号５７の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号７１の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、配列番号５７の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号７８の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、または、配列番号５７の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号８５の軽鎖、そのバリアントまたはその断片を含む。

【0017】

第２の実施態様によれば、本開示は、本明細書に記載されているヒト化抗体および担体タンパク質を含むキメラタンパク質を提供する。

【0018】

第３の実施態様によれば、本開示は、（ｉ）前記のヒト化抗体または前記のキメラタンパク質、および、（ｉｉ）医薬添加物を含む医薬組成物を提供する。

【0019】

第４の実施態様によれば、本開示は、血小板上に存在する糖タンパク質Ｉ（ｂ）α（ＧＰＩｂα）とＧＰＩｂαリガンド（例えば、フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、キニノーゲン、Ｐ－セレクチン、トロンビンスポンジンなど）との間の相互作用を防止または制限する方法を提供する。該方法は、本明細書に記載のヒト化抗体、本明細書に記載のキメラタンパク質、または本明細書に記載の医薬組成物を血小板と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、血小板の活性化を防止または制限するためのものである。一実施形態において、ＧＰＩｂαリガンドは、フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）および／またはトロンビンである。一具体的な実施形態において、ヒト化抗体、キメラタンパク質、または医薬組成物は、ＧＰＩｂαリガンドが血小板と接触される前に、それと同時に、またはその後に、血小板と接触される。さらなる実施形態において、この方法は、対象における体内での相互作用を防止または制限するためのものである。別の実施形態において、この方法は、対象における血栓の形成または成長を防止するためのものである。別の実施形態において、この方法は、対象の血栓のサイズまたは血栓の数を減らすためのものである。いくつかの実施形態において、この方法は、対象の血栓の存在、位置、および／またはサイズを決定することをさらに含む。さらに別の実施形態において、対象は病的血栓症を経験するリスクがあるかまたは経験したことがある。さらに別の実施形態において、対象は、虚血性脳卒中、血栓性血小板減少性紫斑病、心筋梗塞、急性冠症候群、アテローム血栓症、末梢血管疾患、深部静脈血栓症、敗血症、および／または血管性炎症を経験するリスクがあるまたは経験したことがある。いくつかの実施形態において、この方法は、必要とされる対象における腫瘍転移を低減または制限するためのものである。さらなる実施形態において、腫瘍転移は、肝腫瘍転移である。さらに別の実施形態において、この方法は、対象における腫瘍転移の存在、位置、および／またはサイズを決定することをさらに含む。

【0020】

第５の実施態様によれば、本開示は、本明細書に記載のヒト化抗体、本明細書に記載のキメラタンパク質、または血小板上に存在する糖タンパク質Ｉ（ｂ）α（ＧＰＩｂα）とフォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）および／またはトロンビンならびに他のＧＰＩｂαリガンドとの間の相互作用を防止または制限するための医薬組成物を提供する。本開示はまた、本明細書に記載されているヒト化抗体、本明細書に記載のキメラタンパク質、または血小板上に存在する糖蛋白質Ｉ（ｂ）α（ＧＰＩｂα）とフォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）および／またはトロンビンならびに他のＧＰＩｂαリガンドとの間の相互作用を防止または制限するための医薬品の製造における医薬組成物を使用することを提供する。接触ステップは、低いまたは高いせん断速度下で引き起こすことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体、キメラタンパク質、または医薬組成物は、血小板活性化を防止または制限するためのものである。一具体的な実施形態において、ヒト化抗体、キメラタンパク質、または医薬組成物は、ＶＷＦおよび／またはトロンビンならびに他のＧＰＩｂαリガンドが血小板と接触する前に、それと同時に、またはその後に、血小板と接触するためのものである。さらなる実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体、キメラタンパク質、または医薬組成物は、それを必要とする対象において体内での相互作用を防止または制限するためのものである。別の実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体、キメラタンパク質、または医薬組成物は、それを必要とする対象における血栓の形成または成長を防止するためのものである。別の実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体、キメラタンパク質、または医薬組成物は、それを必要とする対象における血栓のサイズまたは血栓の数を減少させるためのものである。いくつかの実施形態において、血栓の存在、位置、および／またはサイズは、対象において予め決定されていた。さらに別の実施形態において、対象は病的血栓症を経験するリスクがあるまたは経験したことがある。さらに別の実施形態において、対象は、虚血性脳卒中、血栓性血小板減少性紫斑病、心筋梗塞、急性冠症候群、アテローム血栓症、末梢血管疾患、深部静脈血栓症、敗血症、および／または血管性炎症を経験するリスクがあるまたは経験したことがある。いくつかの実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体、キメラタンパク質、または医薬組成物は、それを必要とする対象における腫瘍転移を低減または制限するためのものである。さらなる実施形態において、腫瘍転移は、肝腫瘍転移である。さらに別の実施形態において、腫瘍転移の存在、位置、および／またはサイズは、対象において予め決定されている。

【0021】

第６の実施態様によれば、本開示は、本明細書に記載のヒト化抗体、本明細書に記載のキメラタンパク質、または血小板上に存在する糖タンパク質Ｉ（ｂ）α（ＧＰＩｂα）とフォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）および／またはトロンビンとの間の相互作用を防止または制限するための医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体、キメラタンパク質、または医薬組成物は、血小板活性化を防止または制限するためのものである。一具体的な実施形態において、ヒト化抗体、キメラタンパク質、または医薬組成物は、ＶＷＦおよび／またはトロンビンならびに他のＧＰＩｂαリガンドが血小板と接触する前に、それと同時に、またはその後に、血小板と接触するためのものである。特定の実施形態において、ヒト化抗体、キメラタンパク質、または医薬組成物は、低いまたは高いせん断速度で血小板と接触するためのものである。さらなる実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体、キメラタンパク質、または医薬組成物は、それを必要とする対象において体内での相互作用を防止または制限するためのものである。別の実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体、キメラタンパク質、または医薬組成物は、それを必要とする対象における血栓の形成または成長を防止するためのものである。別の実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体、キメラタンパク質、または医薬組成物は、それを必要とする対象における血栓のサイズまたは血栓の数を減少させるためのものである。いくつかの実施形態において、血栓の存在、位置、および／またはサイズは、対象において予め決定されていた。さらに別の実施形態において、対象は、病的血栓症を経験するリスクがあるか、または経験した。さらに別の実施形態において、対象は、虚血性脳卒中、血栓性血小板減少性紫斑病、心筋梗塞、急性冠症候群、アテローム血栓症、末梢血管疾患、深部静脈血栓症、敗血症、および／または血管性炎症を経験するリスクがあるまたは経験したことがある。いくつかの実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体、キメラタンパク質、または医薬組成物は、それを必要とする対象における腫瘍転移を低減または制限するためのものである。さらなる実施形態において、腫瘍転移は、肝腫瘍転移である。さらに別の実施形態において、腫瘍転移の存在、位置、および／またはサイズは、対象において予め決定されている。

【図面の簡単な説明】

【0022】

このように本発明の本質を概括的に説明したので、次に、例示として、下記の添付の図面を参照して、その好ましい実施形態を示す。

【0023】

【図1】非還元条件下での上澄み液中のヒト化ＦａｂのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。重鎖と軽鎖のさまざまな組み合わせがゲルの上に示されている。分子量ラダー（ＫＤａ）が左側に示されている。矢印はヒト化Ｆａｂを指している。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を対照として使用した。

【図2】非還元条件下でのヒト化Ｆａｂのウエスタンブロット結果の結果を示す。各レーンに約２０μＬの上澄み液をロードした。分子量ラダー（ＫＤａ）が左側に示されている。重鎖のみ（ＨＣＡｂ）の抗体を対照として使用した。

【図3】図３ＡからＨは、それぞれ下記のものを含む精製Ｆａｂの非還元条件（「Ｎ」と表示）および還元条件（「Ｒ」と表示）でのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。図３Ａ、ＶＨ１およびＶＬ２鎖。図３Ｂ、ＶＨ１およびＶＬ３鎖。図３Ｃ、ＶＨ２およびＶＬ１鎖。図３Ｄ、ＶＨ３およびＶＬ２鎖。図３Ｅ、ＶＨ３およびＶＬ３鎖。図３Ｆ、ＶＨ４およびＶＬ１鎖。図３Ｇ、ＶＨ４およびＶＬ２鎖。図３Ｈ、ＶＨ４およびＶＬ３鎖。

【図4】図４ＡおよびＢは、ヒト化Ｆａｂ Ｈ００１～Ｈ００８が、（図４Ａ）野生型マウス血小板に結合するが、（図４Ｂ）ＧＰＩｂα－／－マウス血小板（５μｇ／ｍＬ）には結合しないことを示す。図４Ｂに示されている「＊」は制御信号を示す。

【図5】図５ＡからＥは、精製されたＦａｂ Ｈ００１（△）とＨ００２（▽）が、（図５Ａ）マウス、（図５Ｂ）イヌ、（図５Ｃ）ヒト、（図５Ｄ）ラット、（図５Ｅ）ウサギの血小板に結合することを示す（注：原文では、「△」及び「▽」は黒塗りである）。血小板に結合するヒト化Ｆａｂは、フローサイトメトリーアッセイによってインビトロでテストされた。

【図6】精製されたＦａｂＨ００１およびＨ００２がサルの血小板に結合する場合のフローサイトメトリー結果を示す。

【図7】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイにおいて、精製されたＦａｂＨ００１抗体が組換えＧＰＩｂαに結合することを示す。図７Ａは、５００、１００、５０、および１０ｎＭのＨ００１の２５μＬ注入のＳＰＲデータを示し、動力学結合モデルに当てはめると、ｋ_ａ（オンレート）＝２．６１×１０^７ｓ^－１、ｋ_ｄ（オフレート）＝１．１×１０^－１ｓ^－１、およびｋ_ｄ（解離または結合定数）＝４．４ｎＭとなる。図７Ｂは、リガンド濃度に対してプロットされた５００、１００、５０、および１０ｎＭの精製ＦａｂＨ００１の２５μＬ注入のＳＰＲ応答の用量応答曲線を示す。該曲線を１サイトのリガンド結合モデルに当てはめると、Ｒ^２＝０．９９２９およびＫ_ｄ＝８．０±２．１ｎＭとなる。

【図8】図８ＡからＤは、精製されたＦａｂ（図８Ａ）Ｈ００１、（図８Ｂ）Ｈ００２、（図８Ｃ）Ｈ００５、および、（図８Ｄ）Ｈ００８が、多血小板血漿で血小板活性化を誘発しなかったことを示す標準的な凝集測定トレースを示す。

【図9】図９ＡからＤは、精製されたＦａｂ（図９Ａおよび９Ｄ）Ｈ００１および（図９Ｂ、９Ｃ、および９Ｄ）Ｈ００２が、リストセチン（Ａ、Ｂ、およびＤ）または低用量トロンビン（Ｃ）によって誘導される血小板凝集を阻害したことを示す標準的な凝集測定トレースを示す。血小板は、健康なボランティア（ＡからＣ）または末梢血管疾患の患者（Ｄ）から入手した。

【図10】図１０ＡからＤは、ヒト化Ｆａｂ Ｈ００１（図１０Ａおよび１０Ｂ）およびＨ００２（図１０Ｃおよび１０Ｄ）の抗体が、低いせん断（３００ｓ^－、図１０Ａおよび１０Ｃ）と高いせん断（１８００ｓ^－、図１０Ｂおよび１０Ｄ）条件の両方でヒト全血からの血栓形成を阻害したことを示す。図１０Ａは、ヘパリン化ヒト全血を１、２、および３分間灌流し、対照ＰＢＳバッファー（上部パネル）およびヒト化Ｆａｂ Ｈ００１抗体（５μｇ／ｍＬ、下部パネル）により低せん断（３００ｓ^－）条件で処理した後の血小板血栓形成を示す代表的な写真を示す。図１０Ｂは、ヘパリン化ヒト全血を１、２、および３分間灌流し、対照ＰＢＳバッファー（上部パネル）およびヒト化Ｆａｂ Ｈ００１抗体（２．５μｇ／ｍＬ、中部パネル、および５μｇ／ｍＬ、下部パネル）により高いせん断速度（１８００ｓ^－）条件で処理した後の血小板血栓形成を示す代表的な写真を示す。図１０Ｃは、ヘパリン化ヒト全血を１、２、および３分間灌流し、対照ＰＢＳバッファー（上部パネル）およびヒト化Ｆａｂ Ｈ００２抗体（５μｇ／ｍＬ、下部パネル）により低せん断（３００ｓ^－）速度条件で処理した後の血小板血栓形成を示す代表的な写真を示す。図１０Ｄは、ヘパリン化ヒト全血を１、２、および３分間灌流し、対照ＰＢＳバッファー（上部パネル）およびヒト化Ｆａｂ Ｈ００２抗体（２．５μｇ／ｍＬ、中部パネル、および５μｇ／ｍＬ、下部パネル）により高いせん断速度（１８００ｓ^－）条件で処理した後の血小板血栓形成を示す代表的な写真を示す。

【図11】図１１ＡおよびＢは、ヒト化Ｆａｂ Ｈ００１およびＨ００２抗体が、体内でのＦｅＣｌ_３誘発腸間膜細動脈血栓症モデルにおいて血管閉塞時間を延長したことを示す。図１１Ａは、使用された抗体または用量に関する閉塞までの時間（分単位）を示すヒストグラムである。図１１Ｂは、ＦｅＣｌ_３によって誘発された血管損傷後に、異なる時間に対照（上のパネル）、ヒト化Ｆａｂ Ｈ００１抗体（５μｇ／マウス、中央のパネル）、ヒト化Ｆａｂ Ｈ００２抗体（５μｇ／マウス、下のパネル）で処理された細動脈の代表的な写真である。^＊ Ｐ＜０．０５、^＊＊ Ｐ＜０．０１。

【図12】図１２ＡからＣは、ヒト化Ｆａｂ Ｈ００１およびＨ００２抗体が、体内でのレーザー誘発精巣挙筋細動脈血栓症モデルにおける血栓形成を阻害したことを示す。図１２Ａは、動物が、対照治療（上）またはＨ００１抗体（下、５μｇの用量）を受けたときのレーザー損傷時の時間に関する血小板平均蛍光強度（ＭＦＩ；影の部分はＳＤを示す）を示すヒストグラムである。図１２Ｂは、動物が、対照治療（上）またはＨ００２抗体（下、５μｇの用量）を受けたときのレーザー損傷時の時間に関する血小板平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示すヒストグラムである。図１２Ｃは、動物が、損傷の２４時間前に対照治療（上）またはＨ００２抗体（下、１０μｇの用量）を受けたときのレーザー損傷時の時間に関する血小板平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示すヒストグラム。

【図13】図１３ＡからＣは、注入されたヒト化Ｆａｂ Ｈ００１が体内で血小板に結合できる一方で、Ｐ－セレクチンまたはホスファチジルセリン（ＰＳ）の発現の増加を引き起こさなかったことを示す。結果は、（図１３Ａ）血小板、（図１３Ｂ）Ｐ－セレクチン、および（図１３Ｃ）ホスファチジルセリンのフローサイトメトリー結果として示されている。

【図14】図１４ＡおよびＢは、ヒト化Ｆａｂ Ｈ００１およびＨ００２抗体が、体内でのＦｅＣｌ_３誘発頸動脈血栓症モデルにおける血管閉塞を予防または延長したことを示す。図１４Ａは、動物が、傷害の５分前に対照治療（上のパネル）、Ｆａｂ Ｈ００１抗体（中央のパネル、１０μｇの用量）治療、またはＦａｂ Ｈ００２抗体（下のパネル、１０μｇの用量）治療を受けたときのマウス頸動脈流（ｍＬ／分）を示す代表的な写真である。矢印は血管閉塞の時間を示す。図１４Ｂは、使用された抗体または用量に関する血管閉塞までの時間（分単位）を示すヒストグラムである。^＊ Ｐ＜０．０５、^＃ Ｐ＜０．０５、^＊＊ Ｐ＜０．０１。

【図15】図１５ＡからＣは、ヒト化Ｆａｂ Ｈ００１およびＨ００２が、脳虚血および再灌流障害マウスモデル（一過性中大脳動脈閉塞（ｔＭＣＡＯ）モデル）における脳内出血のリスクを増加させることなく、虚血性脳の梗塞サイズを劇的に減少させたことを示す。図１５Ａは、ｔＭＣＡＯの誘導直後に使用された抗体または用量に関する虚血性脳梗塞領域を示すヒストグラムである。図１５Ｂは、ｔＭＣＡＯの１時間後にヒト化Ｆａｂ Ｈ００２（１００μｇの用量）治療に関する虚血性脳梗塞領域を示すヒストグラムである。図１５Ｃは、シャム群（フィラメントを挿入しない）対照群、または、それぞれｔＭＣＡＯの直後に、ＰＢＳ対照（２００μＬ）で治療された対照群、または、ヒト化Ｆａｂ Ｈ００１抗体（１００μｇ／マウス）またはＨ００２抗体（１００μｇ／マウスおよび５０μｇ／マウス）で治療された治療群におけるｔＭＣＡＯ誘導の２４時間後に全脳から切り取った複数の厚さ２ｍｍの冠状脳切片の代表的な写真を示す。白色領域は梗塞脳を示す。^＊ Ｐ＜０．０５、^＊＊ Ｐ＜０．０１。

【図16】図１６ＡからＢは、ヒト化Ｆａｂ Ｈ００１またはヒトアルブミンと融合したヒト化Ｃ１００－ｓｃＦｖ（Ｃ１００－ｓｃＦｖ－ＨＳＡ）によるＡＤＡＭＴＳ１３^－／－マウスの予防的治療が、ＴＴＰのマウスモデルにおいてイオノフォア誘発性ＶＷＦ媒介性微小血管血栓症を効果的に抑制したことを示す。図１６Ａは、Ｈ００１またはＣ１００－ｓｃＦｖ－ＨＡＳ治療を行った場合と行わなかった場合のＡＤＡＭＴＳ１３^－／－マウスにおける血小板血栓の蓄積を示す代表的な写真である。ＡＤＡＭＴＳ１３^－／－マウスに、同じ遺伝子型のマウスからの蛍光標識血小板を注射し、腸間膜血管を露出させ、カルシウムイオノフォアで処理してＶＷＦ分泌を誘導した。血管における血小板の蓄積を顕微鏡でモニターした。ＡＤＡＭＴＳ１３^－／－マウス（対照）に、カルシウムイオノフォアを適用した後、またはＨ００１あるいはＣ１００－ｓｃＦｖ－ＨＳＡの予防的治療を行った後、指定された時間に、撮影された連続画像である。図１６Ｂは、ＴＴＰのマウスモデルにおいてイオノフォア誘発性のＵＬＶＷＦ媒介性微小血管血栓症における塞栓（直径２０μｍを超える血小板血栓）の数を示すヒストグラムである。図１６Ｃは、使用された抗体または用量に関する正常な血流に回復する時間を示すヒストグラムである。^＊ Ｐ＜０．０５、^＊＊ Ｐ＜０．０１。

【図17】ヒト化ＦａｂＨ００１およびＨ００２抗体が、血小板減少症を誘発しなかったことを示す。結果は、時間（時単位）および抗体治療に関する血小板数の変化（％）として示されている。ＩＶＩＧ（○）、ＮＩＴ－Ｂ１（◆）、Ｈ００１（△）またはＨ００２（▽）。（注：原文では、「▽」は黒塗りである。）

【図18】ヒト化Ｆａｂ Ｈ００１およびＨ００２抗体が出血時間を延長しなかったのに対し、マウスＮＩＴ－Ｂは出血時間を著しく増加させたことを示す。結果は、治療および用量（Ｘ軸の下に示されている）に関する出血時間（分単位）として示されている。

【図19】図１９ＡからＤは、ヒト化Ｃ１００－ｓｃＦｖおよびヒトアルブミンと融合したヒト化Ｃ１００－ｓｃＦｖ（Ｃ１００－ｓｃＦｖ－ＨＳＡ）が、（図１９Ａ）野生型マウス血小板に結合するが、（図１９Ｂ）ＧＰＩＢα－／－マウス血小板に結合せず、また、（図１９Ｃ）示された用量でヒトの血小板に結合することを示す。図１９ＡおよびＣに示す「＊」は、対照信号を示す。

【図20】ヒト化Ｃ１００－ｓｃＦｖが、リストセチンによって誘発される血小板凝集を阻害したことを示す標準的な凝集測定トレースを示す。

【図21】ヒト化Ｃ１００－ｓｃＦｖが多血小板血漿において血小板活性化を誘導しなかったことを示す標準的な凝集測定トレースを示す。

【図22】ヒト化Ｃ１００－ｓｃＦｖ－ＨＳＡが、高せん断（１２００ｓ^－）速度条件でヒト全血からの血栓形成を阻害したことを示す。ヘパリン化ヒト全血を１、２、および３分間灌流した後の血小板血栓形成を示す代表的な写真であり、これらは、高せん断（１２００ｓ^－）条件で、対照ＰＢＳバッファー（上部パネル）およびヒト化Ｃ１００－ｓｃＦｖ－ＨＳＡ（１０μｇ／ｍＬ、下部パネル）で処理された。

【発明を実施するための形態】

【0024】

（抗ＧＰＩｂα抗体）
米国特許第８，３２３，６５２号には、ＧＰＩｂα欠損ＢＡＬＢ／ｃマウスを野生型血小板で免疫することによって生成されたマウスＮＩＴｍＡｂ（ＮＩＴ－Ａ１、ＮＩＴ－Ｂ１、およびＮＩＴ－Ｆ１）が、ヒトおよびマウスのＧＰＩｂαの両方を特異的に認識でき、リストセチン誘発性血小板凝集および血栓形成を著しく阻害したことが記載されている。ただし、以下の例に示すように、これらの無傷のｍＡｂは、重度の血小板減少症を誘発する可能性がある。さらに、それらはマウス起源であるため、ヒトにおいて免疫原性を有する。

【0025】

本開示は、ＧＰＩｂαポリペプチドに対する特異的抗体を提供する。抗体は、ＧＰＩｂαポリペプチドに対する親和性が他のポリペプチド（例えば、他の血小板表面ポリペプチド）よりも高いため、ＧＰＩｂαポリペプチドに「特異的」であると見なされる。本開示の抗体は、ヒトＧＰＩｂαポリペプチド（Ｇｅｎｅ ＩＤ：２８１１に記載される）、マウスＧＰＩｂαポリペプチド（Ｇｅｎｅ ＩＤ：１１０３３１８０５およびＧｅｎｅ ＩＤ：１１０３０４２７４に記載される）、ラットＧＰＩｂαポリペプチド（Ｇｅｎｅ ＩＤ：６９１９９２に記載されているように）、サルＧＰＩｂαポリペプチド（Ｇｅｎｅ ＩＤ：７２１５８４）、イヌＧＰＩｂαポリペプチド（Ｇｅｎｅ ＩＤ：４０３６３８）、および／または、ウサギＧＰＩｂαポリペプチド（Ｇｅｎｅ ＩＤ：１００３４９９５１）を認識することができ、それらに結合することができる。一実施形態によれば、本開示の抗体は、ヒトＧＰＩｂαポリペプチド（Ｇｅｎｅ ＩＤ：２８１１に記載される）、マウスＧＰＩｂαポリペプチド（Ｇｅｎｅ ＩＤ：１１０３３１８０５ならびにＧｅｎｅ ＩＤ：１１０３０４２７４に記載される）、ラットＧＰＩｂαポリペプチド（Ｇｅｎｅ ＩＤ：６９１９９２に記載）、サルＧＰＩｂαポリペプチド（Ｇｅｎｅ ＩＤ：７２１５８４）、イヌＧＰＩｂαポリペプチド（Ｇｅｎｅ ＩＤ：４０３６３８）、および／または、ウサギＧＰＩｂαポリペプチド（Ｇｅｎｅ ＩＤ：１００３４９９５１）を認識することができ、それらに結合することができる。

【0026】

一実施形態において、本開示のヒト化抗体は、１０μＭ、１０ｎＭ、１０ｐＭ、または、それ以下のヒトＧＰ１ｂαとの解離定数（Ｋ_Ｄ）を有する。いくつかの実施形態において、ヒトＧＰ１ｂαとのヒト化抗体との解離定数（Ｋ_Ｄ）は、９、８、７、６、５、４、３、２、１μＭ、または、それ以下である。いくつかの実施形態において、ヒトＧＰ１ｂαとのヒト化抗体の解離定数（Ｋ_Ｄ）は、９、８、７、６、５、４、３、２、１ｎＭ、または、それ以下である。いくつかの実施形態において、ヒトＧＰ１ｂαとのヒト化抗体との解離定数（Ｋ_Ｄ）は、９、８、７、６、５、４、３、２、１ｐＭ、または、それ以下である。

【0027】

本開示の抗体は、ヒト抗体または免疫グロブリンに由来する部分と非ヒト抗体または免疫グロブリンに由来する部分の両方を含むため、「ヒト化」抗体である。抗体をヒト化することは、非ヒト抗体の一部をヒト抗体の対応する部分で置き換えることを含む。例えば、本明細書で使用されるヒト化抗体は、ＧＰＩｂαを特異的に認識する能力を有する非ヒト由来可変領域（例えば、ネズミ科（例えば、マウス）抗体に由来する領域）と、ヒト抗体に由来するヒトフレームワーク領域を含み得る。別の実施例では、ヒト化免疫グロブリンは、重鎖および軽鎖を含み得る。その中、軽鎖には、ＧＰＩｂαポリペプチドに結合する非ヒト由来の抗体に由来する１つ以上の相補性決定領域（またはＣＤＲ）と、ヒト由来の軽鎖に由来するフレームワーク領域（またはＦＲ）とを含む。そして、重鎖には、ＧＰＩｂαポリペプチドに結合する非ヒト由来の抗体に由来する相補性決定領域と、ヒト由来の重鎖に由来するフレームワーク領域とを含む。「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、ポリペプチドの可変部分に位置し、エピトープを特異的に結合する免疫グロブリンの領域を指す。ＣＤＲの組み合わせは、抗体のパラトープを構成する。

【0028】

ヒト化抗体のヒト領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤアイソタイプに由来し得る。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体のヒト領域は、ＩｇＧアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブクラスに由来し得る。いくつかの具体的な実施形態において、ヒト化抗体のヒト領域は、ＩｇＧ１サブクラスに由来し得る。以下に示すように、ヒト化抗体は一価抗体であるため、ヒト化抗体のヒト領域は、ＣＨ_１領域および／またはＶ_Ｈ領域（ＣＤＲを除く）に由来しＣＨ_２および／またはＣＨ_３領域を含まない重鎖を含み得る。ヒト化抗体のヒト領域は、Ｃ_Ｌ領域および／またはＶ_Ｌ領域（ＣＤＲを除く）に由来する軽鎖を含み得る。ヒト化抗体のヒト領域は、カッパ型またはラムダ型であり得る軽鎖を含む。一具体的な実施形態において、ヒト化抗体のヒト領域は、カッパ型に由来する軽鎖を含む。

【0029】

本開示のヒト化抗体は、Ｆｃ部分を含まない（例えば、欠く）。たとえば、ヒト化抗体部分は、多価抗体の断片抗原結合領域Ｆ（ａｂ）_２である。Ｆ（ａｂ）_２断片は、２つの分子実体（軽鎖断片と重鎖断片）の二量体であり、単一の抗原結合部位で構成され、二硫化物結合によって互いに結合している抗体の各重鎖および軽鎖に由来する１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインを含む。Ｆ（ａｂ）_２の各鎖は、３つのＶ_Ｌドメインと３つのＶ_Ｈドメインを含む。Ｆ（ａｂ）_２抗体部分は、親の多価抗体と比較した場合、完全にまたは部分的にグリコシル化されてもよい。

【0030】

いくつかの実施形態において、本開示の抗体は「一価」抗体である。本開示の内容で使用されるように、「一価」抗体は、単一の抗原結合部位を含む。一価抗体部分は、結合された（共有結合であるかどうかにかかわらず）１つ以下の可変軽ドメイン（Ｖ_Ｌ）および１つ以下の対応する可変重ドメイン（Ｖ_Ｈ）を有する。これは、少なくとも２つの抗原結合部位と複数のＶ_Ｈおよび複数のＶ_Ｌドメインを含む多価全長抗体とは異なる。一価の抗体部分は、それを由来し得る親の多価抗体と比較した場合、完全にまたは部分的にグリコシル化されてもよい。場合によっては、一価抗体部分は、グリコシル化されていない。一価抗体部分は、対応する多価抗体（例えば、いくつかの実施形態においてＮＩＴ－Ｂ１）によって認識される結合部位をめぐって競合する能力を有する。一価抗体部分は、それが由来する多価抗体の結晶性断片（Ｆｃ断片）を含まない。

【0031】

場合によっては、一価抗体は、１つまたは複数の多価抗体に由来する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは、単一の抗原結合領域からなる単一分子実体（融合タンパク質）であり、リンカー（通常は短いペプチドリンカー）に接続され多価抗体からのＶ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインを１つだけ持っている。そのため、ｓｃＦｖは単一の抗原結合領域で構成され、１つのＶ_Ｈドメインと１つのＶ_Ｌドメインを含む。ｓｃＦｖは、例えば、ｓｃＦｖのファージディスプレイライブラリーのようなｓｃＦｖの合成ライブラリーをスクリーニングすることから得ることができる。本開示のｓｃＦｖは、例えば、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインとの間に１つまたは複数のＧＧＧＧＳ（配列番号９２）リンカーを含むことがあり得る。いくつかの実施形態において、Ｖ_Ｌドメインのカルボキシ末端は、Ｖ_Ｈドメインのアミノ末端に連結され得る。別の実施形態において、Ｖ_Ｈドメインのカルボキシ末端は、Ｖ_Ｌドメインのアミノ末端に連結され得る。いくつかの実施形態において、本開示のｓｃＦｖは、ｓｃＦｖが精製されると除去され得る精製タグ（例えば、６Ｘ Ｈｉｓタグなど）を含み得る。いくつかの追加の実施形態において、ｓｃＦｖは、（共有結合的に）担体タンパク質と結合して、キメラタンパク質を形成することができる。そのような実施形態において、担体タンパク質は、ｓｃＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端で連結され得る。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、精製タグを含まないか、または精製タグを除去するために処理されている。

【0032】

他の例では、一価抗体は、多価（または、いくつかの実施形態において、モノクローナル）抗体の断片抗原結合領域（Ｆａｂ）である。Ｆａｂ断片は、２つの分子実体（軽鎖断片および重鎖断片）を含み、単一の抗原結合部位からなり、二硫化物結合によって互いに結合している抗体の各重鎖および軽鎖からの１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインを含む。Ｆａｂは、単一のＶ_Ｌドメインと単一のＶ_Ｈドメインを含む。

【0033】

さらなる例において、一価抗体は、単一ドメイン抗体またはナノボディである。単一ドメイン抗体は、少なくとも３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む単一の単量体可変抗体ドメインを含む。単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物（Ｖ_ＨＨ抗体など）、魚（Ｖ_ＮＡＲ抗体など）、またはファージディスプレイから取得することができる。単一ドメイン抗体は、重鎖または軽鎖に由来し得る。単一ドメイン抗体は、ヒト化することができる。

【0034】

本開示の抗体は、血小板の活性化および凝集を防止する能力を有し得る。「血小板の活性化および凝集を防止する能力を有する」という表現は、血小板および血小板アゴニストの存在下で、血小板の活性化および血小板の凝集を回避するという本開示のヒト化抗体の能力を指す。血小板の活性化は、主に止血または血栓症の開始時に発生する。活性化されると、血小板はその形状を変化させ、顆粒の内容物を放出することとなる。活性化された血小板は、それらの膜タンパク質（例えば、Ｐ－セレクチン）、脂質（例えば、ホスファチジルセリン）の発現、および血小板凝集をもたらす血小板αＩＩｂβ３インテグリンの立体配座変化を調節する。血小板の活性化および凝集は、例えば、血小板の形状、血小板の凝集のレベル（例えば、凝集計を使用して）、表面タンパク質または脂質の発現などを決定することによって測定することができる。血小板は、以下のアゴニスト（活性化剤）、トロンビン、ＡＤＰ、コラーゲンなどで活性化することができる。リストセチンは、また、フォン・ヴィレブランド因子を血小板受容体ＧＰＩｂαに結合させることができる。ヒト化抗体が血小板の活性化および凝集を防止するかどうかを決定するために、まずは、血小板（例えば、多血小板血漿またはゲル濾過血小板の形で得られる）をヒト化抗体と接触させ、次にアゴニストと接触させることができる。次に、当技術分野において知られる方法によって、血小板が活性化／凝集しているかどうかを決定する必要がある。血小板活性化および凝集を防止する抗体は、本開示の抗体であると見なされる。

【0035】

さらに、本開示のヒト化抗体は、血小板活性化を誘導する能力を欠くことができる。「血小板活性化を誘導する能力を欠く」という表現は、本開示のヒト化抗体の特性の１つを、すなわち、既知の血小板アゴニストの不在下で血小板を活性化させないことを指す。ヒト化抗体が血小板活性化を誘導する能力を欠いているかどうかを決定するために、血小板（例えば、多血小板血漿またはゲル濾過血小板の形で得ることができる）を抗体と接触させて（既知の血小板アゴニストの不在下で）置いてもよく、そして、次に、血小板が活性化されるかどうかが当技術分野で知られている方法によって決定されるべきである。血小板活性化を誘発できない抗体は、本開示の抗体であると見なされる。

【0036】

本開示の抗体は、血小板減少症を誘発する能力を欠くことができる。「血小板減少症を誘発する能力を欠く」という表現は、本開示のヒト化抗体の特性の１つを、すなわち、血小板の総数に実質的かつ病理学的な欠損を引き起こさないことを指す。ヒトでは、血液中に１μＬあたり５００００血小板未満の場合、緊急治療を必要とする血小板減少症となる。ヒト化抗体が血小板減少症を誘発する能力を欠いているかどうかを決定するために、それを試験対象（例えばマウス）に投与し、抗体が血小板数の減少（もしそうなら、血小板数の実質的な、または、病理学的な減少）を引き起こすかどうかを決定するために、血小板のレベルが当技術分野で知られている技術を使用してモニターされる。血小板減少症を誘発しない抗体は、本開示の抗体であると見なされる。

【0037】

本開示の抗体は、（治療用量で）出血時間を延長する能力を欠くことができる。「出血時間を延長する能力を欠く」という表現は、本開示のヒト化抗体の特性の１つを、すなわち、それらが出血を止めるのにかかる時間を実質的かつ病理学的に増加させないことを指す。ヒト化抗体が、出血時間を延長する能力を欠いているかどうかを決定するために、対象（例えばマウス）の尾に切断（標準化された幅と深さ）が行われ、出血が止まるのにかかる時間（例えば、最小限の時間の血流停止）を、当技術分野で知られている技術（いくつかの実施形態において、アイビー法またはデューク法）を使用して決定し、基準と比較して抗体が出血時間の増加（もしそうなら、出血時間の実質的な増加）を引き起こすかどうかを確かめる。示された用量で出血時間を延長することに失敗する抗体は、本開示の抗体であると見なされる。

【0038】

本開示の抗体は、また、ＧＰＩｂαポリペプチドの生物活性と拮抗する能力を有し得る。ＧＰＩｂαポリペプチドは、フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、トロンビン、およびその他のリガンドの受容体として機能する血小板表面膜糖タンパク質である。したがって、その生物活性と拮抗することによって、本開示の抗体は、（特に高せん断条件下で）血小板の活性化および凝集を制限または防止するために使用することができる。

【0039】

本開示の抗体は、モノクローナル抗体に由来し得る。ＧＰＩｂαポリペプチド上の単一エピトープに特異的な抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂとも呼ばれる）と考えられる。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、免疫細胞の単一のクローンから産生される。モノクローナル抗体は、当技術分野において知られている技術で、例えば、ＧＰＩｂαポリペプチドのエピトープを含む抗原で免疫された対象（マウスまたはヒトなど）からの脾臓細胞に骨髄腫細胞を融合させることによる細胞培養を使用することなどによって、産生することができる。モノクローナル抗体は、ＧＰＩｂαポリペプチドのエピトープを含む抗原を用いてモノクローナル抗体のライブラリーをスクリーニングすることにより、ファージディスプレイで取得することもできる。モノクローナル抗体を作製するためのさらなる技術には、単一のＢ細胞培養、Ｂ細胞集団からの単一細胞の増幅が含まれるが、これらに限定されない。本開示のモノクローナル抗体は、様々な起源（例えば、マウスまたはヒト）に由来することができ、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖を含むことができ、各鎖は３つのＣＤＲを含む。モノクローナル抗体は、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４を含む）、またはＩｇＭを含むがこれらに限定されない任意のアイソタイプから形成され得る。一実施形態において、モノクローナル抗体は、ＩｇＧアイソタイプから形成され得る。

【0040】

一実施形態において、本開示の抗体は、配列番号３７、３８、３９、６５、６６または６７のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を含むかまたはそれらから本質的になる少なくとも１つの相補性決定領域を有する。本開示の内容において、特にＣＤＲのアミノ酸配列に関して言及される場合、「から本質的になる」という表現は、ＣＤＲが必ず配列番号３７、３８、３９、６５、６６または６７のアミノ酸配列を含むが、付加的な非必須のアミノ酸残基が、これらの配列のアミノ末端またはカルボキシル末端に（これらのアミノ酸残基がＧＰＩｂαポリペプチドに対する抗体の親和性またはそのＧＰＩｂαポリペプチドの生物活性に拮抗する能力を実質的に変更しない限り）追加されてもよいことを示す。

【0041】

一実施形態において、本開示の抗体は、配列番号３７、３８、３９、６５、６６または６７のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を含むかまたはそれらから本質的になる少なくとも２つの相補性決定領域を有する。さらに別の実施形態において、本開示の抗体は、配列番号３７、３８、３９、６５、６６または６７のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を含むかまたはそれらから本質的になる少なくとも３つの相補性決定領域を有する。さらに別の実施形態において、一実施形態において、本開示の抗体は、配列番号３７、３８、３９、６５、６６または６７のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を含むかまたはそれらから本質的になる少なくとも４つの相補性決定領域を有する。さらに別の実施形態において、一実施形態において、本開示の抗体は、配列番号３７、３８、３９、６５、６６または６７のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を含むかまたはそれらから本質的になる少なくとも５つの相補性決定領域を有する。さらに別の実施形態において、本開示の抗体は、配列番号３７、３８、３９、６５、６６および６７のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を含むかまたはそれらから本質的になる相補性決定領域を有する。

【0042】

いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、配列番号３７、３８および３９のアミノ酸配列（バリアントおよび断片を含む）を含むかまたはそれらから本質的になる相補性決定領域、および配列番号６５、６６または６７のアミノ酸配列（バリアントおよび断片を含む）を含むかまたはそれらから本質的になる少なくとも１つの相補性決定領域を有する。いくつかの追加の実施形態において、本開示の抗体は、配列番号３７、３８および３９のアミノ酸配列（バリアントおよび断片を含む）を含むかまたはそれらから本質的になる相補性決定領域、および配列番号６５、６６または６７のアミノ酸配列（バリアントおよび断片を含む）を含むかまたはそれらから本質的になる少なくとも２つの相補性決定領域を有する。いくつかのさらなる実施形態において、本開示の抗体は、配列番号６５、６６または６７のアミノ酸配列（バリアントおよび断片を含む）を含むかまたはそれらから本質的になる相補性決定領域、および配列番号３７、３８および３９のアミノ酸配列（バリアントおよび断片を含む）を含むかまたはそれらから本質的になる少なくとも１つの相補性決定領域を有する。いくつかの追加の実施形態において、本開示の抗体は、配列番号６５、６６または６７のアミノ酸配列（バリアントおよび断片を含む）を含むかまたはそれらから本質的になる相補性決定領域、および配列番号３７、３８および３９のアミノ酸配列（バリアントおよび断片を含む）を含むかまたはそれらから本質的になる少なくとも２つの相補性決定領域を有する。

【0043】

本開示の抗体は、配列番号３７、３８、３９、６５、６６または６７のアミノ酸配列を有するＣＤＲの機能的バリアントを含み得る。バリアントＣＤＲは、ＣＤＲのアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸差異を含む。本明細書で使用される場合、バリアントは、（例えば、ＧＰＩｂαポリペプチドに対する特異性および親和性を提供する）抗体の生物学的機能に悪影響を及ぼさないアミノ酸配列の変化を指す。いくつかの実施形態において、抗体の、全体的な電荷、構造、または疎水性親水性特性は、生物活性に悪影響を与えることなく変更することができる。したがって、ＣＤＲのアミノ酸配列は、例えば、抗体の生物活性に悪影響を与えることなく、抗体をより疎水性または親水性にするように変更することができる。ＣＤＲバリアントは、少なくともここに記載されているＣＤＲと５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を持っている。当技術分野で知られているように、「パーセント同一性」という用語は、配列を比較することによって決定される２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。同一性のレベルは、既知のコンピュータプログラムを使用して従来通りに決定することができる。同一性は、以下に記載されているものを含むがこれらに限定されない既知の方法によって容易に計算することができる。『Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ』（Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．編、オックスフォード大学出版局、ニューヨーク、１９８８年）、『Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ』（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、アカデミックプレス、ニューヨーク、１９９３年）、『Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ Ｉ』（Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ、Ｈ．Ｇ．編、ヒューマナプレス、ニュージャージー、１９９４年）、『Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ』（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、Ｇ．編、アカデミックプレス、１９８７年）、および『Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ』（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９１年）。同一性を決定するための好適な方法は、テストされたシーケンス間の最高の一致を与えるように設計されている。同一性と類似性を決定する方法は、公に利用可能なコンピュータプログラムに書き込まれている。配列アラインメントおよびパーセント同一性の計算は、「ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ」生物情報計算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．、ウィスコンシン、マディソン）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して実行されることができる。本明細書に開示される配列のマルチプルアラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌのアラインメント法（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、１９８９年、ＣＡＢＩＯＳ、５：１５１－１５３）を使用してデフォルトのパラメータ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）で実行された。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用したペアワイズアライメントのデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＢ １、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５であった。

【0044】

ＣＤＲバリアントは、（ｉ）１つまたは複数のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）で置換されているものであり得、そのような置換アミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされるものである場合もそうでない場合もあるか、または（ｉｉ）１つまたは複数のアミノ酸残基が置換基を含むものである。ＣＤＲの「バリアント」は、保存的バリアントまたはアレルバリアントであってもよい。

【0045】

本開示の抗体は、配列番号３７、３８、３９、６５、６６または６７のアミノ酸配列を有するＣＤＲの機能的断片を含み得る。ＣＤＲの断片は、ＣＤＲのアミノ酸配列に比較して少なくとも１つ少ないアミノ酸残基を含む。ＣＤＲ断片は、ＣＤＲの配列番号３７、３８、３９、６５、６６または６７のアミノ酸配列のいくつかの連続するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲ断片は、ここに記載されているＣＤＲと少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を持っている。

【0046】

別の実施形態において、本開示の抗体は、重鎖を含み、重鎖は、配列番号３７、３８または３９のアミノ酸配列、その機能的バリアントおよびその機能的断片を含むかまたはそれらから本質的になる少なくとも１つのＣＤＲを含む。さらなる実施形態において、重鎖は、配列番号３７、３８または３９のアミノ酸配列、その機能的バリアントおよびその機能的断片を含むかまたはそれらから本質的になる少なくとも２つのＣＤＲを含む。さらに別の実施形態において、重鎖は、配列番号３７、３８または３９のアミノ酸配列、その機能的バリアントおよびその機能的断片を含むかまたはそれらから本質的になる少なくとも３つのＣＤＲを含む。

【0047】

別の実施形態において、重鎖は、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ１領域を含み、且つ、配列番号４０、４７、５４または６１のアミノ酸配列、その機能的バリアント、ならびにその機能的断片を含む。本開示の文脈で使用される場合、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ１領域の機能的バリアントは、（例えば、ＧＰＩｂαポリペプチドに対する特異性および親和性を提供する）抗体の生物学的機能に悪影響を及ぼさないアミノ酸配列の変化を指す。一実施形態において、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ１領域の機能的バリアントは、本明細書に記載のＣＨ１領域（例えば、配列番号４０、４７、５４または６１のアミノ酸配列を有するものなど）に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。本開示の文脈でも使用されるように、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ１領域の機能的断片は、（例えば、ＧＰＩｂαポリペプチドに対する特異性と親和性を提供する）抗体の生物学的機能に悪影響を及ぼさないようにヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ１領域のアミノ酸配列と比較して少なくとも１つ少ないアミノ酸残基を含むことを指す。一実施形態において、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ１領域の機能的断片は、本明細書に記載のＣＨ１領域（例えば、配列番号４０、４７、５４または６１のアミノ酸配列を有するものなど）に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。

【0048】

いくつかの実施形態において、重鎖は、配列番号３６、４３、５０または５７のアミノ酸配列、その機能的バリアントおよびその機能的断片を含むかまたはそれらから本質的になる。本開示の文脈において、特に重鎖のアミノ酸配列に言及する場合、「から本質的になる」という表現は、重鎖が必ず配列番号３６、４３、５０または５７のアミノ酸配列を含むが、付加的な非必須のアミノ酸残基が、これらの配列のアミノ末端またはカルボキシル末端に（これらのアミノ酸残基がＧＰＩｂαポリペプチドに対する抗体の親和性またはそのＧＰＩｂαポリペプチドの生物活性に拮抗する能力を実質的に変更しない限り）追加されてもよいことを示す。本開示の文脈で使用される場合、重鎖抗体の機能的バリアントは、（例えば、ＧＰＩｂαポリペプチドに対する特異性および親和性を提供する）抗体の生物学的機能に悪影響を及ぼさないアミノ酸配列の変化を指す。一実施形態において、重鎖の機能的バリアントは、本明細書に記載の重鎖（例えば、配列番号３６、４３、５０または５７のアミノ酸配列を有するものなど）に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。本開示の文脈においても使用されるように、重鎖の機能的断片は、（例えば、ＧＰＩｂαポリペプチドに対する特異性と親和性を提供する）抗体の生物学的機能に悪影響を及ぼさない重鎖のアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つ少ないアミノ酸残基を含む。一実施形態において、重鎖の機能的断片は、本明細書に記載の重鎖（例えば、配列番号３６、４３、５０または５７のアミノ酸配列を有するものなど）に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。

【0049】

別の実施形態において、抗体は軽鎖を含み、軽鎖は、配列番号６５、６６または６７のアミノ酸配列、その機能的バリアントおよびその機能的断片を含むかまたはそれらから本質的になる少なくとも１つのＣＤＲを含む。さらなる実施形態において、軽鎖は、配列番号６５、６６または６７のアミノ酸配列、それらの機能的バリアントおよびその機能的断片を含むかまたはそれらから本質的になる少なくとも２つのＣＤＲを含む。さらに別の実施形態において、軽鎖は、配列番号６５、６６または６７のアミノ酸配列、その機能的バリアントおよびその機能的断片を含むかまたはそれらから本質的になる少なくとも３つのＣＤＲを含む。

【0050】

別の実施形態において、軽鎖は、例えば、配列番号６８、７５、８２、または８９のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有し得るヒトＩｇＧ１カッパ鎖Ｃ領域を含む。本開示の文脈において使用されるように、ヒトＩｇＧ１カッパ鎖Ｃ領域の機能的バリアントは、（例えば、ＧＰＩｂαポリペプチドに対する特異性および親和性を提供する）抗体の生物学的機能に悪影響を及ぼさないアミノ酸配列の変化を指す。一実施形態において、ヒトＩｇＧ１カッパ鎖Ｃ領域の機能的バリアントは、本明細書に記載のヒトＩｇＧ１カッパ鎖Ｃ領域（例えば、配列番号６８、７５、８２または８９のアミノ酸配列を有するものなど）に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。本開示の文脈でも使用されるように、ヒトＩｇＧ１カッパ鎖Ｃ領域の機能的断片は、ヒトＩｇＧ１カッパ鎖Ｃ領域のアミノ酸配列と比較して（例えば、ＧＰＩｂαポリペプチドに対する特異性と親和性を提供する）抗体の生物学的機能に悪影響を及ぼさないように少なくとも１つ少ないアミノ酸残基を含むことを指す。一実施形態において、ヒトＩｇＧ１カッパ鎖Ｃ領域の機能的断片は、本明細書に記載のＣＨ１領域（例えば、配列番号６８、７５、８２または８９のアミノ酸配列を有するものなど）に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％９７％、９８％または９９％の同一性を有する。

【0051】

別の実施形態において、軽鎖は、配列番号６４、７１、７８または８５のアミノ酸配列、その機能的バリアントおよびその機能的断片を含むかまたはそれらから本質的になる。本開示の文脈において、特に軽鎖のアミノ酸配列に関して言及される場合、「から本質的になる」という表現は、ＣＤＲが必ず配列番号号６４、７１、７８または８５のアミノ酸配列を含むが、付加的な非必須のアミノ酸残基が、これらの配列のアミノ末端またはカルボキシル末端に（これらのアミノ酸残基がＧＰＩｂαポリペプチドに対する抗体の親和性またはそのＧＰＩｂαポリペプチドの生物活性に拮抗する能力を実質的に変更しない限り）追加されてもよいことを示す。本開示の文脈で使用される場合、軽鎖抗体の機能的バリアントは、（例えば、ＧＰＩｂαポリペプチドに対する特異性および親和性を提供する）抗体の生物学的機能に悪影響を及ぼさないアミノ酸配列の変化を指す。一実施形態において、軽鎖の機能的バリアントは、本明細書に記載の軽鎖（例えば、配列番号６４、７１、７８または８５のアミノ酸配列を有するものなど）に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。本開示の文脈でも使用されるように、軽鎖の機能的断片は、（例えば、ＧＰＩｂαポリペプチドに対する特異性と親和性を提供する）抗体の生物学的機能に悪影響を及ぼさないように、重鎖のアミノ酸配列と比較して少なくとも１つ少ないアミノ酸残基を含む。一実施形態において、軽鎖の機能的断片は、本明細書に記載の軽鎖（例えば、配列番号６４、７１、７８または８５のアミノ酸配列を有するものなど）に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。

【0052】

いくつかの実施形態において、重鎖は、配列番号３６、４３、５０または５７のアミノ酸配列、その機能的バリアントおよびその機能的断片を含むかまたはそれらから本質的になる。本開示の文脈において、特に重鎖のアミノ酸配列に関して言及される場合、「から本質的になる」という表現は、ＣＤＲが必ず配列番号３６、４３、５０または５７のアミノ酸配列を含むが、付加的な非必須のアミノ酸残基が、これらの配列のアミノ末端またはカルボキシル末端に（これらのアミノ酸残基がＧＰＩｂαポリペプチドに対する抗体の親和性またはそのＧＰＩｂαポリペプチドの生物活性に拮抗する能力を実質的に変更しない限り）追加されてもよいことを示す。本開示の文脈で使用される場合、重鎖抗体の機能的バリアントは、（例えば、ＧＰＩｂαポリペプチドに対する特異性および親和性を提供する）抗体の生物学的機能に悪影響を及ぼさないアミノ酸配列の変化を指す。一実施形態において、重鎖の機能的バリアントは、本明細書に記載の重鎖（例えば、配列番号３６、４３、５０または５７のアミノ酸配列を有するものなど）に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。本開示の文脈でも使用されるように、重鎖の機能的断片は、（例えば、ＧＰＩｂαポリペプチドに対する特異性と親和性を提供する）抗体の生物学的機能に悪影響を及ぼさないように、重鎖のアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つ少ないアミノ酸残基を含む。一実施形態において、重鎖の機能的断片は、本明細書に記載の重鎖（例えば、配列番号３６、４３、５０または５７のアミノ酸配列を有するものなど）に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。

【0053】

さらに別の実施形態において、抗体は、重鎖と軽鎖の両方を含み得る。そのような実施形態において、ヒト化抗体は、配列番号３６の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号６４の軽鎖、そのバリアントまたはその断片を有し得る。別の実施形態において、ヒト化抗体は、配列番号３６の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号６４の軽鎖、そのバリアントまたはその断片を有し得る。さらに別の実施形態において、ヒト化抗体は、配列番号３６の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号７１の軽鎖、そのバリアントまたはその断片を有し得る。さらに別の実施形態において、ヒト化抗体は、配列番号３６の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号７８の軽鎖、そのバリアントまたはその断片を有し得る。別の実施形態において、ヒト化抗体は、配列番号３６の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号８５の軽鎖、そのバリアントまたはその断片を有し得る。さらに別の実施形態において、ヒト化抗体は、配列番号４３の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号６４の軽鎖、そのバリアントまたはその断片を有し得る。さらに別の実施形態において、ヒト化抗体は、配列番号４３の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号７１の軽鎖、そのバリアントまたはその断片を有し得る。さらに別の実施形態において、ヒト化抗体は、配列番号４３の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号７８の軽鎖、そのバリアントまたはその断片を有し得る。さらなる実施形態において、ヒト化抗体は、配列番号４３の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号８５の軽鎖、そのバリアントまたはその断片を有し得る。さらなる実施形態において、ヒト化抗体は、配列番号５０の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号６４の軽鎖、そのバリアントまたはその断片を有し得る。さらなる実施形態において、ヒト化抗体は、配列番号５０の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号７１の軽鎖、そのバリアントまたはその断片を有し得る。さらに別の実施形態において、ヒト化抗体は、配列番号５０の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号７８の軽鎖、そのバリアントまたはその断片を有し得る。さらに別の実施形態において、ヒト化抗体は、配列番号５０の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号８５の軽鎖、そのバリアントまたはその断片を有し得る。一実施形態において、ヒト化抗体は、配列番号５７の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号６４の軽鎖、そのバリアントまたはその断片を有し得る。さらに一実施形態において、ヒト化抗体は、配列番号５７の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号７１の軽鎖、そのバリアントまたはその断片を有し得る。さらに別の実施形態において、ヒト化抗体は、配列番号５７の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号７８の軽鎖、そのバリアントまたはその断片を有し得る。さらに別の実施形態において、ヒト化抗体は、配列番号５７の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号８５の軽鎖、そのバリアントまたはその断片を有し得る。

【0054】

本開示の抗体の重鎖および軽鎖は、細胞から分泌されたら切断されるリーダー配列を含み得る。例えば、配列番号３５のアミノ酸配列は、配列番号３６のアミノ酸配列と、リーダー配列として作用するＮ末端の追加アミノ酸残基とを含む。重鎖および／または軽鎖に含めることができるリーダー配列には、配列番号９１のアミノ酸配列が含まれるが、これに限定されない。

【0055】

いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、とりわけ、それらの循環半減期を増加させるために、キメラタンパク質（担体タンパク質を含む）にさらに改変または設計されてもよい。ヒト化抗体部分は、任意の（１つ又は複数の）アミノ酸残基で担体に（例えば、直接的に、または、１つまたは複数のＧＧＧＧＳ（配列番号９２）リンカーなどのリンカーにより間接的に）結合することができる。ただし、この結合によりヒト化抗体部分がＧＰＩｂαに結合してその生物活性を阻害することを妨げることがない場合に限る。一実施形態において、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号９２）リンカーの３つのコピーを含む。一実施形態において、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号９２）リンカーの４つのコピーを含む。いくつかの例では、リンカー（存在する場合）または担体は、ヒト化抗体部分の１つまたは複数のアミノ酸残基に関連しており、ＧＰＩｂαへの特異的結合およびその生物活性の阻害に関与していない。いくつかの例では、リンカーまたは担体は、ヒト化抗体部分の単一のアミノ酸残基に関連する。リンカーまたは担体は、ヒト化抗体部分のアミノ末端またはヒト化抗体部分のカルボキシル末端に位置するアミノ酸残基を含むヒト化抗体部分の任意のアミノ酸残基に結合させることができる。いくつかの実施形態において、担体タンパク質は、ヒト化抗体部分の上流（アミノ末端）または下流（カルボキシ末端）に位置することができる。リンカーおよび担体が、タンパク質性である場合、ヒト化抗体部分は、リンカーまたは担体のアミノ末端に位置するアミノ酸残基や、リンカーまたは担体のカルボキシル末端に位置するアミノ酸残基を含むリンカーまたは担体の任意のアミノ酸残基に結合させることができる。一実施形態において、リンカーまたは担体のアミノ末端に位置するアミノ酸残基は、ヒト化抗体部分のカルボキシル末端に位置するアミノ酸残基に結合している。さらに別の実施形態において、リンカーが存在し、タンパク質性である場合、そのアミノ末端はヒト化抗体のカルボキシル末端に結合し、そのカルボキシル末端は担体のアミノ末端に結合する。一実施形態において、担体タンパク質は、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）である。一実施形態において、担体は、１つまたは複数のさらなる抗体または抗体断片を含む。

【0056】

ヒト化抗体部分と担体との間に共有結合が求められる場合、２つの実体間の結合はペプチド結合である得る。そのような実施形態は、少なくとも２つの実体が両方ともタンパク性であり且つこれらが遺伝子組換え技術を使用して生物（原核生物または真核生物）内で融合タンパク質として産生されることが意図されるキメラタンパク質に特に有用である。あるいは、２つの部分間の共有結合は、他のタイプの化学的共有結合によって媒介されてもよい。いくつかの例では、キメラタンパク質は、全身循環（例えば、血漿中）において２つの部分に切断されにくいように設計されている。

【0057】

上記に示したように、２つの実体（例えば、ヒト化抗体部分および担体部分）間の結合は、非共有結合であり得る。体表的な非共有結合には、ビオチン－ストレプトアビジン／アビジン系が含まれるが、これらに限定されない。このようなシステムでは、ラベル（ビオチン）が１つの実体／部分に共有結合しているし、タンパク質（ストレプトアビジンまたはビオチン）が他の実体／部分に共有結合している。そのような実施形態において、システム内の他の実体がストレプトアビジンまたはアビジンに結合されることを条件に、ビオチンはヒト化抗体部分または担体に結合され得る。

【0058】

非共有結合のさらなるシステムでは、第１の実体は、意図されたレシピエントへのその投与時にのみ、第２の実体に非共有結合されるように設計されている。この実施形態は、担体がレシピエントの血液中に存在するタンパク質である場合に、特に有用である。例えば、ヒト化抗体部分は、意図されたレシピエントに一度投与されたら担体に非共有結合する能力を有する第２の抗体、レクチンまたはその断片（本明細書では抗体由来リンカーと呼ばれる）と（共有結合または非共有結合の様式で）結合され得る。例えば、第２の抗体、レクチンまたはその断片は、意図されたレシピエントに存在する任意の血液／血漿タンパク質に特異的であり得る（例えば、血清アルブミン、免疫グロブリン断片（これらの断片は、活性化Ｆｃ受容体に直接結合しないか、またキメラタンパク質が活性化Ｆｃ受容体の複数の部位に同時に結合することを引き起こさないことを条件とする）、アルファ－１－酸性糖タンパク質、トランスフェリン、またはリポタンパク質）。第２の抗体、レクチンまたはその断片は、好ましくは共有的に、ヒト化抗体部分の任意のアミノ酸残基で、好ましくはヒト化抗体部分のアミノ末端またはカルボキシル末端で、ヒト化抗体部分と結合させることができる。そのような実施形態において、第２の抗体、レクチンまたはその断片は、ヒト化抗体部分と担体との間のリンカーに類似している。この実施形態のヒト化抗体部分をレシピエントに投与したら、担体（例えば、血液または血漿タンパク質）は、第２の抗体、レクチンまたはその断片と結合して、体内でキメラタンパク質を形成する。一具体的な実施形態において、第２の抗体は、アルブミンを特異的に認識する抗体（例えば、ヒトアルブミンを特異的に認識する抗体など）である。

【0059】

本開示はまた、本明細書に記載の抗体をコードするヌクレオチド分子も提供する。ヌクレオチド分子は、単離された形態で提供することができ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、誘導体、模倣物、またはそれらの組み合わせを含む様々な供給源から由来し得る。そのような配列は、ゲノムＤＮＡを含んでもよく、該ゲノムＤＮＡは、天然に存在するイントロン、遺伝子領域、非遺伝子領域、および調節領域を含む場合も含まない場合もある。さらに、そのようなゲノムＤＮＡは、プロモーター領域またはポリ（Ａ）配列と結合しているように得られてもよい。配列、ゲノムＤＮＡ、または相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、いくつかの方法のいずれかで取得できる。ゲノムＤＮＡは、当技術分野で周知の手段によって適切な細胞から抽出および精製することができる。あるいは、ｍＲＮＡは、細胞から単離され、逆転写または他の手段によってｃＤＮＡを生成するために使用することができる。本明細書に記載のヌクレオチド分子は、宿主細胞、組織、または生物への組み込みを介して、ＲＮＡ、タンパク質、またはポリペプチドの生産のために、本開示の方法の具体的な実施形態において使用される。一実施形態において、ヌクレオチド分子は、特定の宿主での発現のためにコドン最適化することができる。ヌクレオチド分子は、いくつかの実施形態において、１つまたは複数のプロモーター配列および／または１つまたは複数のターミネーター配列を含み得る。ヌクレオチド分子は、組換え宿主での発現ベクターに含めることができる。本開示のヌクレオチド分子は、いくつかの実施形態において、配列番号４１、４８、５５、６２、６９、７６、８３および／または９０の核酸配列を含み得る。一実施形態において、本開示のヌクレオチド配列は、配列番号４１と６９、４１と７６、４１と８３、または４１と９０の核酸配列を含む。別の実施形態において、本開示のヌクレオチド配列は、配列番号４８と６９、４８と７６、４８と８３、または４８と９０の核酸配列を含む。別の実施形態において、本開示のヌクレオチド配列は、配列番号５５と６９、５５と７６、５５と８３、または５５と９０の核酸配列を含む。さらに別の実施形態において、本開示のヌクレオチド配列は、配列番号６２と６９、６２と７６、６２と８３、または６２と９０の核酸配列を含む。

【0060】

（ヒト化抗体の治療的使用）
血小板ＧＰＩｂαとそのリガンド（ＶＷＦなど）の相互作用は、さまざまな疾患の病因において重要なプレーヤーとして認識されているため、ヒト化抗体は、虚血性脳卒中、急性心筋梗塞、再狭窄、狭心症、急性冠状動脈症候群、アテローム血栓症、血管炎症、静脈血栓症、末梢血管疾患、血栓性血小板減少性紫斑病、敗血症および／または腫瘍転移の予防および／または治療に使用できる。ヒト化抗体またはキメラタンパク質は、ヒト化抗体（またはキメラタンパク質のヒト化抗体部分）によって特異的に認識される血小板を有する対象において使用することができる。したがって、ヒト化抗体は、例えば、ヒト、サル、マウス、ウサギ、および／またはイヌなどの哺乳動物対象において使用することができる。

【0061】

本開示は、ＧＰＩｂαとその同族リガンドとの間の物理的相互作用を防止または制限するための方法を提供する。この方法は、ヒト化抗体／ヒト化抗体部分とＧＰＩｂαとの結合を可能にする条件下で、本明細書に記載の、ヒト化抗体、キメラタンパク質、または医薬組成物を血小板（その表面でＧＰＩｂα発現する）と接触させることを含む。以下の実施例に示されるように、本開示のヒト化抗体およびキメラタンパク質は、ＧＰＩｂαに結合し、低および高せん断応力下でその生物活性に拮抗する能力を有する。そのため、この方法は、加えられたせん断応力に関係なくＧＰＩｂαに結合するために使用できる。この方法は、それを必要とする対象において、インビトロまたはインビボで使用することができる。この方法は、低せん断速度または高せん断速度で使用することができる。

【0062】

ＧＰＩｂαとそのリガンド（ＶＷＦなど）との間の相互作用を防止することが求められる場合、ＧＰＩｂαとそのリガンドとの接触に先立って、ヒト化抗体またはキメラタンパク質を使用することができる。そうすれば、血小板は、そのリガンドが血小板の近くに配置されるかまたは発見される前に、最初にヒト化抗体（これは、任意で、キメラタンパク質または医薬組成物として提示される）と接触させられる。そのような実施形態において、本開示のヒト化抗体の結合は、ＧＰＩｂαとそのリガンドとの物理的結合を防ぎ、そして最終的に血小板の活性化および凝集を防止または制限すると理解される。

【0063】

ＧＰＩｂαとそのリガンド（ＶＷＦなど）との間の相互作用を制限することが求められる場合、ＧＰＩｂαとそのリガンドとの間の接触が起こったのと同時に、または、その後に、ヒト化抗体を使用することができる。そうすれば、血小板は、そのリガンドが血小板の近くに配置されるまたは発見されると同時に、またはその後に、ヒト化抗体（これは、任意で、キメラタンパク質または医薬組成物として提示される）と接触させられる。そのような実施形態において、本開示のヒト化抗体の結合は、ＧＰＩｂαとそのリガンドとの物理的結合を制限し、いくつかの実施形態において、血小板の活性化および凝集を防止または制限すると理解される。

【0064】

ヒト化抗体（任意で、キメラ形態のヒト化抗体または医薬組成物内のヒト化抗体）を使用して、それを必要とする対象の病的血栓症に関連する症状を予防、治療、または軽減するために使用することができる。本開示のヒト化抗体は、（少なくとも以下の実施例において）血小板の活性化および凝集を防止することができるので、それらは、病的血栓症に感受性のある対象における病的血栓症を予防するために使用することができる。さらに、本開示のヒト化抗体は、血小板減少症または長期出血を誘発しないので、それらの使用は（例えば、それらが由来する元のモノクローナル抗体と比べ）より安全である。本開示の文脈で使用される場合、「病的血栓症」という用語は、血栓（血餅）が血管内に形成され、周囲の組織に損傷を引き起こす状態を指す。病的血栓症は、静脈または動脈で発生する可能性がある。病的血栓は、海綿静脈洞、腎静脈、深部静脈、または肺（肺塞栓症）で発生または観察される可能性がある。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体またはキメラタンパク質は、高せん断応力条件下での病的血栓症に関連する症状を予防、治療または緩和するために使用される。閉塞または部分的に閉塞した血管の近くでは、せん断応力が高く、ＧＰＩｂαとＶＷＦの間の相互作用が血管閉塞にとって重要である。

【0065】

血栓の形成または増殖を防止することが保証されている実施形態において、ヒト化抗体またはキメラタンパク質を、血栓を形成または増殖するリスクのある対象に使用することができる。一実施形態において、この方法は、抗体の投与前に、（当技術分野で知られている方法およびアッセイを用いて）対象が血栓を形成または成長させるリスクがあるかどうかを判定することを含み得る。ヒト化抗体は、血栓を形成または成長させるリスクがあると予め判定された対象に使用することができる。別の実施形態において、この方法は、ヒト化抗体またはキメラタンパク質の少なくとも１回の投与後に、対象が少なくとも１つの血栓を有するかどうか、および、いくつかのさらなる実施形態では血栓のサイズ、を決定することを含み得る。そのような決定は、所望の治療効果を達成するために対象に追加の用量を投与すべきかどうかを判定するのに役立ち得る。

【0066】

複数の血栓を有する対象において、ヒト化抗体またはキメラタンパク質を使用して、血栓のサイズおよび／または数を減らすことができる。一実施形態において、この方法は、抗体の投与前に、対象が１つまたは複数の血栓を有するかどうか、および、任意で、血栓のサイズ、を（当技術分野で知られている方法およびアッセイを用いて）決定することを含んでもよい。ヒト化抗体は、複数の血栓を有すること、および、任意で、血栓のサイズを予め決定された対象において使用することができる。別の実施形態において、この方法は、ヒト化抗体またはキメラタンパク質の少なくとも１回の投与後、血栓の存在、数、およびサイズを決定することを含み得る。そのような決定は、所望の治療効果を達成するために対象に追加の用量を投与すべきかどうかを判定するのに役立ち得る。

【0067】

いくつかの実施形態において、本開示の方法は、対象が病的血栓症を経験するリスクがあるまたは経験したことがあるかどうかを判定することを含む。対象が病的血栓症を経験するリスクがあるまたは経験したことがあるという肯定的な判定は、対象が本開示のヒト化抗体を受け取ることから利益を得るであろうことを示している。このように、本開示の方法は、病的血栓症を経験するリスクがあるまたは経験したことがあると判定された対象に、ヒト化抗体またはキメラタンパク質を投与することを含み得る。本開示のヒト化抗体およびキメラタンパク質は、病的血栓症を経験するリスクがあるまたは経験したことがあると判定された対象に、使用され得る。

【0068】

いくつかのさらなる実施形態において、本開示の方法は、対象が、虚血性脳卒中、血栓性血小板減少性紫斑病、心筋梗塞、急性冠症候群、アテローム血栓症、末梢血管疾患、深部静脈血栓症、敗血症、および／または血管性炎症を経験するリスクがあるまたは経験したことがあるかどうかを判定することを含む。対象が、虚血性脳卒中、血栓性血小板減少性紫斑病、心筋梗塞、急性冠症候群、アテローム血栓症、末梢血管疾患、深部静脈血栓症、敗血症、および／または血管性炎症を経験するリスクがあるまたは経験したことがあるという肯定的な判定は、該対象が本開示のヒト化抗体を受け取ることによって利益を得るであろうことを示している。したがって、本開示の方法は、虚血性脳卒中、血栓性血小板減少性紫斑病、心筋梗塞、急性冠症候群、アテローム血栓症、末梢血管疾患、深部静脈血栓症、敗血症、および／または血管性炎症を経験するリスクがあるまたは経験したことがあると判定された対象に、ヒト化抗体を投与することを含み得る。本開示のヒト化抗体は、虚血性脳卒中、血栓性血小板減少性紫斑病、心筋梗塞、急性冠症候群、アテローム血栓症、末梢血管疾患、深部静脈血栓症、敗血症、および／または血管性炎症を経験するリスクがあるまたは経験したことがあると判定された対象に、使用され得る。

【0069】

ＧＰＩｂαとＶＷＦとの間の相互作用は、腫瘍転移の伝播にとって重要であるため、本開示のヒト化抗体またはキメラタンパク質を使用して、それを必要とする対象における腫瘍転移を低減または制限することができる。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体またはキメラタンパク質が、腫瘍転移の数および／または腫瘍転移のサイズを減少させるために、使用され得る。一実施形態において、腫瘍転移は、肝癌（例えば、肝癌または腺癌）に関連しており、ヒト化抗体は、肝腫瘍転移を低減または制限するために使用され得る。

【0070】

いくつかの実施形態において、本開示の方法は、ヒト化抗体またはキメラタンパク質を１回以上提供する前および／または提供した後の、腫瘍転移の存在、位置および／またはサイズを判定することを含む。そのような評価は、対象において所望の治療結果を達成するために、ヒト化抗体の追加用量を投与すべきかどうかを判定するために有用であり得る。

【0071】

ヒト化抗体またはそれを含むキメラタンパク質は、添加物とともに投与するための医薬組成物として処方配合され得る。添加物または「医薬品添加物」は、１つまたは複数のキメラタンパク質を対象に送達するための薬学的に許容される溶媒、懸濁剤または他の薬理学的に不活性な媒介物であり、典型的には液体である。医薬添加物は、一般に、意図された投与様式を考慮して、所与の医薬組成物の成分と組み合わされたときに、所望の嵩、粘稠度などを提供するように選択される。典型的な医薬添加物には、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、充填剤（例えば、乳糖および他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）、崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）、および湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）などが含まれるが、これらに限定されない。

【0072】

ヒト化抗体またはそれを含むキメラタンパク質は、投与するために単位剤形でまたは医薬組成物として、薬学的に許容される添加物と共に処方配合され得る。従来の製薬慣行を使用して、そのような組成物を対象に投与するための適切な製剤または組成物を提供することができる。静脈内投与が好ましいが、例えば、経口、腸内、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼内、脳室内、被膜内、脊髄内、髄腔内、硬膜外、大槽内、腹腔内、鼻腔内、またはエアロゾル投与のいずれかの適切なルートを使用することができる。治療用製剤は、液体溶液または懸濁液の形態であり得る。製剤を作製するための当技術分野でよく知られている方法は、例えば、『Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ』（第１９版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ、１９９５年、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルベニア、イーストン）。

【0073】

さらに、いくつかの実施形態において、ヒト化抗体またはキメラタンパク質は、薬学的に有効な量で投与され得る。「薬学的に有効な量」または「治療的に有効な量」という用語は、血栓性、転移性または炎症性の状態または障害に罹患しているまたは罹患している疑いのある対象を治療するのに有効な量（用量）を指す。本明細書において、「薬学的に有効な量」は、単独でまたは他の治療薬と組み合わせて、１回の用量または任意の投与量もしくはルートのいずれかで投与されて、所望の治療効果を与える量として解釈され得ることも理解されたい。

【0074】

本明細書に開示されているヒト化抗体またはそれを含むキメラタンパク質あるいは医薬組成物の治療有効量または投与量は、約０．００１から３０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得、本発明の他の範囲は、約０．０１から２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０２５～１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．３～２０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１～２０ｍｇ／ｋｇ体重、約１～１０ｍｇ／ｋｇ体重、２～９ｍｇ／ｋｇ体重、３～８ｍｇ／ｋｇ体重、４～７ｍｇ／ｋｇ体重、５～６ｍｇ／ｋｇ体重、および２０～５０ｍｇ／ｋｇ体重、を含む。他の実施形態において、治療有効量または投与量は、合計で約０．００１から５０ｍｇの範囲であり得、本発明の他の範囲は、約０．０１から１０ｍｇ、約０．３から３ｍｇ、約３から１０ｍｇ、約６ｍｇ、約９ｍｇ、約１０～２０ｍｇ、約２０～３０ｍｇ、約３０～４０ｍｇ、および約４０～５０ｍｇ、を含む。一実施形態において、キメラは、約４０～８０ｍｇ／ｋｇの間（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ）の投薬量で投与される。

【0075】

（実施例Ｉ：ネズミＮＩＴ－Ｂ１抗体のヒト化）
ネズミＮＩＴ－Ａ１およびＮＩＴ－Ｂ１抗体の可変ドメイン（米国特許第８，３２３，６５２号に記載されており、２００８年１０月７日にカナダ国際寄託機関（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ ｏｆ Ｃａｎａｄａ）に、アクセッション番号０７１００８－０１（ＮＩＴ Ａ１クローン）、０７１００８－０２（ＮＩＴ Ｂ１クローン）でそれぞれ寄託されている。）の配列が決定された。ネズミＮＩＴ－Ａ１抗体は、配列番号１の重鎖（配列番号３のＣＤＲ１、配列番号４のＣＤＲ２および配列番号５のＣＤＲ３を含む）および配列番号１１の軽鎖（配列番号１３のＣＤＲ１、配列番号１４のＣＤＲ２および配列番号１５のＣＤＲ３を含む）を有する。ネズミＮＩＴ－Ｂ１抗体は、配列番号６の重鎖（配列番号８のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２および配列番号１０のＣＤＲ３を含む）および配列番号１６の軽鎖（配列番号１８のＣＤＲ１、配列番号１９のＣＤＲ２および配列番号２０のＣＤＲ３を含む）を有する。

【0076】

ネズミＮＩＴ－Ｂ１抗体は、ＮＩＴ－Ｂ１重鎖可変ドメイン（配列番号６）をヒトＩｇＧ１定常領域ＣＨ１（配列番号２６；https://www.uniprot.org/uniprot/P01857）と融合させ、また、ＮＩＴ－Ｂ１軽鎖可変ドメイン（配列番号１６）をヒトＩｇカッパ軽鎖定常領域（配列番号３３；http://www.uniprot.org/uniprot/P01834）と融合させることによってキメラＣ１００－Ｆａｂとしてさらに開発された。

【0077】

（実施例ＩＩ：ヒト化抗ＧＰＩＢＡＬＰＨＡ抗体の特性評価）
グラフト法（Ｓａｆｄａｒｉ等、２０１３）を使用して、４つのヒト重鎖（配列番号３５のＶＨ１、配列番号４２のＶＨ２、配列番号４９のＶＨ３、配列番号５６のＶＨ４）および４つのヒト軽鎖（配列番号６３のＶＬ１、配列番号７０のＶＬ２、配列番号７７のＶＬ３、配列番号８４のＶＬ４）が、ＮＣＢＩデータベースにおけるＣＤＲと注釈されたヒト配列に対するフレームワーク相同性に基づいて合成され。

【0078】

簡単に説明すると、ＮＣＢＩ Ｉｇ－Ｂｌａｓｔ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/igblast/）を使用して、ヒト生殖細胞系列のデータベースで親抗体の可変ドメイン配列を検索した。各重鎖および軽鎖について、４つの多様なヒト受容体（すなわち、親抗体と高い相同性を有するヒト可変ドメイン）を選択した。ヒト受容体のＣＤＲは、マウスの対応物に置換され、結果としてヒト化可変ドメイン配列が得られた。

【0079】

ヒト化単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）および関連キメラタンパク質：ＶＨ１とＶＬ２の両方を含むｓｃＦｖを準備した。これには、ＶＨ１とＶＬ２の間に（ＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２））ｘ４リンカーが含まれていた（ＶＨ１－（Ｇ_４Ｓ）４－ＶＬ２のように配列する）。精製を容易にするために、ｓｃＦｖにはＶＨ１の前に６ｘＨｉｓタグとＴＥＶ切断部位ＥＮＬＹＦＱＧがあった。ただし、別のテストの前に、ＴＥＶプロテアーゼを使用してタグを削除した。ｓｃＦｖは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とともにキメラタンパク質（ｓｃＦｖ－ＨＳＡ）にも含まれていた。これらの例では、ｓｃＦｖ－ＨＳＡには、ＨＳＡの前に追加のリンカーＧＧＧＧＳ（配列番号９２）が含まれていた。キメラｓｃＦｖ－ＨＳＡは安定した形で生成され、その生成または精製中に凝集体を形成しなかった。

【0080】

サイズ：ヒト化重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ配列を合成し、ｐＴＴ５ベクターに挿入して、Ｆａｂの発現プラスミドを構築した。１６個のヒト化ＦａｂをＨＥＫ２９３またはＣＨＯ３Ｅ７細胞培養で一過性に発現させた後、細胞をスピンダウンした。上澄みを濾過し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析で評価した。ヒト化Ｆａｂの分子量は、非還元条件下で約４７ｋＤａである（図１および２）。

【0081】

次に、８つの選択されたヒト化Ｆａｂ（表１を参照）の上澄み液をＣａｐｔｕｒｅ ｓｅｌｅｃｔ^ＴＭ カッパＸＬ親和性マトリックス樹脂（Ｃａｐｔｕｒｅ ｓｅｌｅｃｔ^ＴＭ Ｋａｐｐａ ＸＬ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｒｉｘ ｒｅｓｉｎ）で精製した。精製されたヒト化Ｆａｂを、ＰＤ－１０脱塩カラムを用いてＰＢＳにバッファー交換された。精製タンパク質の濃度と純度は、それぞれＯＤ_２８０とＳＤＳ－ＰＡＧＥ（各々のレーンに約２μｇのタンパク質をロードした）によって測定した。図３に示すように、精製されたヒト化Ｆａｂは、非還元条件の下でＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて約４７ｋＤａバンドで、還元条件下で約２４ｋＤａおよび約２３ｋＤａバンドに移動した。

【0082】

表１：ヒト化Ｆａｂの説明

【表1】

【0083】

特異性：ヒトおよびマウスの多血小板血漿（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ、ＰＲＰ）が、３００ｇで７分間の遠心分離によって調製され、２００μＬのＰＲＰを１０ｍＬのＰＢＳに移し、続いて８００ｇで１０分間遠心分離することによって洗浄された。次に、上澄み液を除去し、血小板を２００μＬのＰＢＳに再懸濁した。洗浄された血小板（１０μＬ）をさまざまな抗体（２．５－５μｇ／ｍＬ）とともに２００μＬシステムで室温で３０分間インキュベートし、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＦａｂ抗体で検出した。これらの８つの選択されたヒト化ＦａｂＨ００１－Ｈ００８、ｓｃＦｖ、およびキメラタンパク質はすべて、ヒトおよび野生型マウス血小板の両方に結合したが、ＧＰＩｂα欠損マウス血小板には結合しなかった。これは、ヒト化Ｆａｂが血小板ＧＰＩｂαに特異的であることを示す（図４および１９）。

【0084】

マウス、イヌ、ヒト、ラット、およびウサギのＰＲＰからの血小板（２×１０^５）を、５０、１６．７、５．６、１．８、０．６、０．２ｎＭ（マウスおよびイヌの場合）、２００、６７、２２、７．４、２．５、０．８、０．３、０．１ｎＭ（ヒトおよびラットの場合）および５００、１００、２０、４、０．８ｎＭ（ウサギの場合）での一連の濃度のＦａｂ Ｈ００１またはＨ００２を含む２００μＬのＰＢＳに移した。３０分間のインキュベーション後、検出抗体（ＦＩＴＣ標識抗ヒトカッパ鎖、１：２００）を添加し、暗所で１５分間インキュベートした。フローサイトメトリーは、ＢＤＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ^ＴＭ Ｘ－２０を使用して実行された。Ｈ００１とＨ００２は、ラット、イヌ、ウサギの血小板にも結合した（図５）。

【0085】

ＳＥＣ－ＦＰＬＣクロマトグラフィーによる２回目の精製あり（精製Ｈ００１／Ｈ００２、５μｇ／ｍＬ）および精製なし（非精製Ｈ００１／Ｈ００２、５μｇ／ｍＬ）のヒト化Ｆａｂを、カニクイザル洗浄血小板（２×１０^６）と３０分間インキュベートした。次に、ＦＩＴＣ標識抗ヒトカッパ鎖第２の抗体（Ａｂ）を３０分間インキュベートした。サル血小板に結合するヒト化Ｆａｂは、フローサイトメトリーアッセイによって検出された。図６は、ＦａｂＨ００１およびＨ００２抗体がサルの血小板に結合したことを示している。

【0086】

Ｈ００１と組換えＧＰＩｂαの間の親和性は、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）アッセイで測定された。ＳＰＲバイオセンサーの調製のために、ＳＰＲ裸金被覆バイオセンサー（Ｂｉｏｓｅｎｓｉｎｇ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｉｎｃ．、アリゾナ、米国）を、１：１の無水エタノール：ｄｄＨ_２Ｏに溶解した０．５Ｍ水素化ホウ素ナトリウムの溶液中で２時間洗浄した。バイオセンサーを大量の無水エタノールですすぎ、続いて１ｍＭメルカプトプロピオン酸のジメチルホルムアミド溶液中で１６時間インキュベートした。インキュベーション後、ＳＰＲバイオセンサーを大量のジメチルホルムアミド、続いて無水エタノール、最後にｄｄＨ_２Ｏですすいだ。次に、バイオセンサーを、ｄｄＨ_２Ｏに溶解した４０ｍＭの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよび２０ｍＭのＮ－ヒドロキシスクシンイミド中で１時間インキュベートした。次に、センサーを大量のｄｄＨ_２Ｏで洗浄し、１００ｍＭのＮα、Ｎα－ビス（カルボキシメチル）－Ｌ－リジン水和物と４時間インキュベートした。インキュベーション後、バイオセンシング表面をｄｄＨ２Ｏですすいだ。ＳＰＲ実験前の最後のステップは、官能化されたバイオセンシング表面を１００ｍＭのＮｉＣｌ_２に１時間暴露することであった。

【0087】

ＳＰＲ実験は、バイオセンシングインスツルメント４０００ＳＰＲで実行された。官能化されたバイオセンサーを機器に搭載し、バイオセンサーを４０μＬ／分の流速でランニングバッファー（１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾールｐＨ＝７．４）で平衡化した。結合測定のために、２５μＬの５００ｎＭヘキサヒスチジンタグ付きＧＰＩｂαをバイオセンシング表面に注入し、ＧＰＩｂαをＳＰＲセンサー表面に固定した。ベースラインを平衡化させた後、２５μＬの所望濃度のリガンド（Ｆａｂ Ｈ００１または対照）を注入した。バイオセンシング表面は、１００μＬの５００ｍＭイミダゾールをランニングバッファーに注入し、続いて１００μＬの１００ｍＭ ＮｉＣｌ_２を注入することにより、リガンド注入の間に再生された。得られたデータは、機器に含まれるＳＰＲ分析ソフトウェアを使用して分析された。

【0088】

ＧＰＩｂα固定化ＳＰＲバイオセンサーは、５００、１００、５０、または１０ｎＭのＦａｂ Ｈ００１抗体、および１００ｎＭの対照抗体（ＰＳＩ Ｅ１、ＧＰＩＩｂＩＩＩａに対する抗体）に曝露された。対照は、固定化されたＧＰＩｂαに結合せず、注射の終了前にバイオセンサーから完全に解離した（データを表示せず）。一方、Ｆａｂ Ｈ００１抗体は、ＧＰＩｂαに明確に結合し、注射終了後に部分的な解離のみに伴い明確なＳＰＲシフトをもたらした（図７Ａ）。ＳＰＲシフトを、速度論的結合モデルに当てはめると、オンレート（ｋ_ａ）は２．６１×１０^７ｓ^－１、オフレート（ｋ_ｄ）＝１．１×１０^－１ｓ^－１、解離定数（Ｋｄ）は４．４ｎＭになった（図７Ｂ）。解離定数を決定するために、ＳＰＲシフトの大きさをＦａｂ Ｈ００１抗体濃度に対してプロットし、１サイト結合モデルに当てはめて０．９９２９の適合度Ｒ^２と８．０±２．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を得た。データは、Ｆａｂ Ｈ００１抗体が組換えＧＰＩｂαにしっかりと結合し、ナノモルの解離定数が低く、結合速度が速いことを明確に示している。

【0089】

アゴニスト誘発血小板凝集のインビトロ阻害：ヒト化Ｆａｂが異常な血小板活性化を誘発し得るかどうか、および血小板凝集におけるそれらの役割を評価するために、インビトロ血小板凝集アッセイを行った。健康なボランティアおよび末梢血管疾患の患者からのヒトＰＲＰは、クエン酸ナトリウム抗凝固処理全血から３００ｇで７分間の遠心分離によって調製された。ＰＲＰでの血小板凝集が、５μｇ／ｍＬのヒト化Ｆａｂクローンの添加によって誘導され、コンピューター化されたＣｈｒｏｎｏ－ｌｏｇ ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒ（Ｃｈｒｏｎｏ－ｌｏｇ、米国）によってモニターされた。ヒト化Ｆａｂありまたはなしで、ＰＲＰでの血小板凝集が、リストセチン（１ｍｇ／ｍＬ）によって誘発され、ゲルろ過された血小板では、トロンビン（０．０５Ｕ／ｍｌ）により誘導され、コンピューター化されたＣｈｒｏｎｏ－ｌｏｇ ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒ（Ｃｈｒｏｎｏ－ｌｏｇ、米国）を用いた。

【0090】

Ｆａｂ Ｈ００１、Ｈ００２、Ｈ００５、Ｈ００８抗体、およびｓｃＦｖ抗体は、血小板の活性化を誘導しなかった。さらに、Ｈ００１およびＨ００２は、ＰＲＰにおけるリストセチン誘発性のヒト血小板凝集、およびゲル濾過血小板における低用量トロンビン誘発性血小板凝集を、有意に阻害した（図８、９、２０および２１）。

【0091】

低せん断速度および高せん断速度での血栓形成の抑制：異なるせん断速度で血小板の付着、凝集、および血栓形成を測定するために、３０人の健康なボランティアからのヘパリン化全血を、リアルタイム蛍光顕微鏡下で、体外灌流室システムを使用してＩ型コラーゲンコーティング表面に灌流した。簡単に説明すると、長方形のマイクロ毛細管（ｉｂｉｄｉチャネルスライド、ｉｂｉｄｉ ＧｍｂＨ）をＨｏｒｍコラーゲン（１００μｇ／ｍＬ、一晩、４℃、ニーコッドリンツ、オーストリア）でコーティングした。健康なドナーからの抗凝固（ヘパリン１５Ｕ／ｍＬ）全血をＤｉＯＣ_６（１μＭ、１０分、３７℃、シグマ）で蛍光標識した。次に、対照またはヒト化ＦａｂまたはｓｃＦｖ－ＨＳＡで処理した全血を、シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、米国）を使用して、３００ｓ^－１、１２００ｓ^－１、および１８００ｓ^－１のせん断速度でコラーゲンコーティング表面に３分間灌流した。血小板の蓄積と血栓の形成は、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ １３５倒立蛍光顕微鏡（６０×／０．９０ＮＡ水対物レンズ）でリアルタイムに記録された。血小板蛍光強度の定量的ダイナミクスは、ＳｌｉｄｅＢｏｏｋソフトウェアを使用して取得した。

【0092】

ヒト化されたＦａｂＨ００１およびＨ００２は、それぞれ細静脈／大動脈および細動脈の血流に対応する、３００ｓ^－１および１８００ｓ^－１の両方の壁せん断速度（ただし、好ましくは１８００ｓ^－１の壁せん断速度）で血栓形成を著しく阻害した（図１０）。キメラタンパク質は、１２００ｓ^－１の壁せん断速度で血栓形成を著しく阻害する（図２２）。これらの体外の結果は、ヒト化Ｃ１００－Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、およびキメラタンパク質が、低せん断および高せん断の両方の条件下での血栓症の有意な阻害剤であることを示唆している。

【0093】

血栓の成長と血管閉塞の体内阻害：ヒト化Ｆａｂが体内で血栓の成長に影響を与えるかどうかを調べるために、２つの補完的な生体内顕微鏡血栓症モデルと大動脈血栓症モデルを利用した。

【0094】

腸間膜細動脈における血栓形成を、３～４週齢のＣ５７ＢＬ／６野生型マウスで、モニターした。マウスにドナーに適合した蛍光標識血小板を注射し、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ １３５倒立蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）で視覚化した。簡単に説明すると、ドナーを適合させたマウスから、血液を酸性クエン酸デキストロース溶液（ａｃｉｄ ｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｘｔｒｏｓｅ、ＡＣＤ；抗凝固剤として）に収集した。ゲル濾過した血小板を調製し、カルセインＡＭ（１ｍｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カナダ）で室温で２０分間標識した。次に、血小板を、対照生理食塩水緩衝液、Ｆａｂ Ｈ００１、またはＨ００２（２．５または５μｇ／マウス）とともに尾静脈を介して実験マウスに注射した。次に、マウスを麻酔し、腸間膜を外部化した。直径１００～１２０μｍの単一腸間膜細動脈を選択し、３０μＬの２５０ｍＭ塩化第二鉄を局所塗布することにより損傷を誘発した。血管閉塞を完了するまでの時間を記録した。血栓の形成と溶解の画像を蛍光顕微鏡で可視化した。図１１と表２に示すように、ＦｅＣｌ_３損傷によって誘発された血栓の成長と血管閉塞は、ヒト化Ｆａｂ Ｈ００１およびＨ００２抗体の注射によって有意に抑制された（対照の生理食塩水注射と比較した場合）。

【0095】

表２：受けた治療に関する閉塞しなかったマウスの数。

【表2】

【0096】

レーザー誘発精巣挙筋細動脈血栓症モデルでは、Ｃ５７Ｂ／６野生型マウス（オス、６～８週齢）を麻酔し、呼吸を容易にするために気管チューブを挿入した。精巣挙筋は、解剖顕微鏡下で準備され、予熱された重炭酸塩緩衝生理食塩水で実験全体を通して灌流された。血小板抗体、対照（生理食塩水緩衝液）、ヒト化並びに一価のＨ００１およびＨ００２抗体（５または１０μｇ／マウス）を、頸静脈カニューレに示されるところに投与した。血小板は、ラット抗マウスＣＤ４１抗体（Ｌｅｏ．Ａ１、ＥＭＦＲＥＴ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ、ドイツ、０．１μｇ／ｇ）注射によって標識された。オリンパスＢＸ５１ＷＩ顕微鏡を使用してパルス窒素色素レーザーにより精巣挙筋細動脈に複数の独立した上流損傷が誘発された。成長中の血栓内の蛍光標識血小板の動的蓄積を捕獲し、Ｓｌｉｄｅｂｏｏｋソフトウェアを使用して分析した。この精巣挙筋細動脈生体内顕微鏡血栓症モデル（レーザーで軽度の血管損傷を誘発するため、酸化ストレスを伴わない）では、ヒト化並びに一価のＨ００１およびＨ００２抗体の静脈内注入後に、血栓の成長がほぼ完全に消失した（図１２）。以上の結果は、ヒト化Ｆａｂが血栓の成長を阻害し、血栓の溶解を促進し、新規抗血栓剤として開発される可能性が大きいことを示している。

【0097】

生体内顕微鏡法による血栓症モデル実験の前後に、マウスの血液を採取し、フローサイトメトリーとＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ６２Ｐ抗体およびアネキシンＶ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７を使用して、血小板を単離し特性評価した。図１３に示すように、ヒト化一価Ｈ００１抗体は、血小板Ｐ－セレクチンの発現やホスファチジルセリン（ＰＳ）への曝露を引き起こさなかったので、体内で血小板異常活性化を誘導しなかった。ヒト化ＦａｂＨ００２抗体でも同様の結果が得られた（データを示さず）。

【0098】

塩化第二鉄誘発性大頸動脈血栓症モデルでは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス（両性含む、８週齢以上、２５～３０ｇ）に麻酔をかけ、Ｆａｂ Ｈ００１またはＨ００２抗体（５、１０、または２０μｇ／マウス）または等量（２００μＬ）のＰＢＳを、動脈損傷を誘発する５分前に静脈内注射した。左総頸動脈を切開し、小型ドップラーフロープローブ（ＴＳ４２０ ｔｒａｎｓｉｔ－ｔｉｍｅ ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ ｆｌｏｗｍｅｔｅｒ、Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、米国）で保持した。ベースラインの血流量を３０秒間測定した。次に、７．５％塩化第二鉄で飽和させたワットマン濾紙のストリップで、頸動脈損傷を３分間誘発した。完全な血管閉塞が観察されるまで血流をモニターした。Ｆａｂ Ｈ００１およびＨ００２抗体は、血栓の成長を大幅に抑制し、安定した血管閉塞を防止した（図１４）。

【0099】

脳内出血のリスクを高めることのない虚血性脳の梗塞サイズの体内での減少：虚血性脳卒中における抗体の治療可能性を検討するために、脳虚血および再灌流障害モデル（一過性中大脳動脈閉塞（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ、ｔＭＣＡＯ））を実施した。雄マウス（２５ｇ）を吸入イソフルランで麻酔した。正中頚部切開を行い，軟部組織を剥離した。左総頸動脈（ＬＣＣＡ）を慎重に周囲の神経から切り離し（迷走神経を傷つけずに）、５．０ストリングを使用して結紮を作った。次に、左外頸動脈（ＬＥＣＡ）を分離し、２番目の結紮を作った。次に、左内頸動脈（ＬＩＣＡ）を分離し、６．０フィラメントで結紮を作成した。左内頸動脈（ＬＩＣＡ）と左翼口蓋動脈（ＬＰＡ）がよく見えるようにした後、微小血管クリップを使用して両方の動脈をクリップした。ＬＥＣＡとＬＩＣＡに分岐する前に、ＬＣＣＡに小さな穴を開けた。標準化されたシリコンゴムでコーティングされた６．０ナイロンモノフィラメント（６０２１、Ｄｏｃｃｏｌ Ｃｏｒｐ、レッドランズ、カリフォルニア）が、クリップで止まるまでＬＩＣＡに導入された。ウィリス動脈輪のＬＭＣＡの起点を閉塞するために、フィラメントをＬＩＣＡに挿入しながら、クリップされた動脈が開かれた。フィラメントを所定の位置に固定するために、ＬＩＣＡ上の３番目の結紮を閉じた。１時間後、３番目の結紮を開き、フィラメントを引き抜いた。フィラメントを挿入した直後に、またはフィラメントが引き抜かれた１時間後に、抗体を静脈内投与した。

【0100】

大脳梗塞の体積を測定するために、ｔＭＣＡＯ誘導２４時間後に、マウスを安楽死させた。脳梗塞を視覚化するために、全脳から切り取った厚さ２ｍｍの複数の冠状脳切片を、２％の２，３，５－トリフェニル－テトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ）で染色した。脳出血の存在を肉眼で評価した。ｔＭＣＡＯ誘導２４時間後に神経機能を測定するために、マウスを修正ベダーソンテストとグリップテストにかけ、それぞれ全体的な神経機能と運動機能を評価した。その結果、ヒト化Ｆａｂ Ｈ００１およびＨ００２抗体とｓｃＦｖ－ＨＳＡによるＧＰＩｂαの遮断により、脳内出血のリスクを高めることなく、脳内の梗塞サイズが大幅に減少し、ｔＭＣＡＯ後の機能的転帰が改善されることを示した（図１５）。

【0101】

ＴＴＰの体内保護：ＴＴＰにおける抗体の治療効果を試験するために、イオノフォア誘発超大型ＶＷＦ（ＵＬＶＷＦ）を介した微小血管血栓症モデルを使用した。ＡＤＡＭＴＳ１３^－／－マウスに麻酔をかけ、同じ遺伝子型のドナーマウスから精製した蛍光標識血小板を静脈内注射し、腸間膜静脈におけるイオノフォア誘発微小血管血栓症を生体内顕微鏡下でリアルタイムにモニターした。血小板調製のために、マウス（６～８週齢）をケタミン／キシラジン（それぞれ１００ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ体重）の腹腔内注射によって麻酔し、ヘパリン被覆ガラス毛細管を用いて後眼窩神経叢から全眼血を採取した。血液をクエン酸塩－デキストロース溶液（３８ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸、７５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸三ナトリウム、１００ｍｍｏｌ／Ｌデキストロース）を含むチューブに集めた。全血を３００ｇで７分間遠心分離することにより、多血小板血漿を得った。次に、ゲル濾過した血小板を、ＰＩＰＥＳバッファー（ＰＩＰＥＳ ５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＣｌ １．３７ｍｍｏｌ／Ｌ、ＫＣｌ ４ｍｍｏｌ／Ｌ、およびグルコース０．１％、ｐＨ７．０）においてセファロース２Ｂカラムを使用して多血小板血漿から分離した。血小板数は、Ｈｅｍｏｖｅｔ（ＨＶ９５０、Ｄｒｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した。ゲル濾過血小板の蛍光標識化は、血小板を室温で１５分間カルセイン－アセトキシメチルエステル（１μｇ／ｍＬ）でインキュベートすることにより達成された。体内イメージングに使用する前に、血小板の蛍光標識の有効性を、蛍光顕微鏡で判定した。

【0102】

生体内顕微鏡観察のために、４週齢マウスに麻酔をかけ、蛍光標識血小板（同じ遺伝子型のマウスからの１．２５×１０^６血小板／ｇ）を注射した。腸間膜血管を外科的に準備し、２５倍のオイル対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ）を使用して倒立蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｚ１ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｒｉａｎａｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）でモニターした。腸間膜静脈の約２．５ｍｍの切片（直径１００～１５０μｍｏｌ／Ｌ）を１０μＬの１０μｍｏｌ／Ｌのカルシウムイオノフォアで局所的に処理し、内皮からのＵＬＶＷＦのバイベル・パラーデ小体分泌を誘導し、蛍光標識された血小板の即時接着と、血管壁に固定された血小板血栓の形成を生じた。各マウスについて、血栓形成のプロセスおよび血栓の消散をモニターし、事前記録に加えて２０分間記録した。Ｆａｂ Ｈ００１またはｓｃＦｖ－ＨＳＡキメラタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３^－／－の腸間膜微小血管系におけるカルシウムイオノフォア刺激による血栓症の発症の１０分前（予防的）に、尾静脈カテーテルを介して投与された。選択した血管セグメントにおける血小板蓄積の動力学は、（１）塞栓の数（直径２０μｍを超える血小板血栓）、および（２）正常な血流を回復する時間（血小板蛍光が局所適用後、ほぼベースラインに戻るのに必要な時間として定義される）、により定量的に分析した。

【0103】

図１６に示すように、生理食塩水（対照）、Ｆａｂ Ｈ００１抗体、またはｓｃＦｖ－ＨＳＡキメラタンパク質で処理したすべてのＡＤＡＭＴＳ１３^－／－マウスにイオノフォアを適用する前に、生体内顕微鏡下で腸間膜血管壁への血小板の付着は検出されなかった。対照ＡＤＡＭＴＳ１３^－／－マウスにおける腸間膜血管へのカルシウムイオノフォアの局所適用の直後に、血小板の付着が腸間膜細静脈に観察され、血流の方向に内皮に付着した単一の血小板ストリング形成として現れた。１分間以内に、複数の大きな血栓（直径＞２０μｍ）が形成され、一部はイオノフォアで処理された血管の直径の５０％まで成長した。血小板ストリングと血栓は、視覚的に非常に緩く、血管壁と塞栓から下流に容易に分離した。対照マウスにおける血小板の血管壁への付着および塞栓性血栓症は、１０分以上継続したが、経時的に死亡し、最終的に血管の影響を受けた部分で正常な血流を回復した。ＡＤＡＭＴＳ１３^－／－マウスの血栓反応は、Ｆａｂ Ｈ００１抗体またはｓｃＦｖ－ＨＳＡキメラタンパク質の両方の予防治療によって劇的に抑制された（図１６）。血管壁への血小板の付着と大きな血栓の形成は、Ｆａｂ Ｈ００１抗体またはｓｃＦｖ－ＨＳＡキメラタンパク質処理の両方により強く阻害された（図１６）。対照群と比較した場合、Ｆａｂ Ｈ００１抗体またはｓｃＦｖ－ＨＳＡキメラタンパク質治療群の両方では、大きな塞栓血栓の数は有意に少なく、腸間膜細静脈の正常な血流を回復する時間は短かった（図１６）。これらの結果は、Ｆａｂ Ｈ００１抗体またはｓｃＦｖ－ＨＳＡキメラタンパク質によるＡＤＡＭＴＳ１３^－／－マウスの予防的治療が、イオノフォア誘発性のＶＷＦ媒介性微小血管血栓症を効果的に阻害し、ＴＴＰにおける新規遊離内皮結合ＵＬＶＷＦ上の血小板蓄積を模倣することを示した。

【0104】

血小板減少症の抑制：Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）、ヒト化Ｆａｂ Ｈ００１またはＨ００２抗体（１０μｇ／マウス、各グループｎ＝３）、またはＮＩＴ－Ｂ１抗体（５μｇ／マウス、ｎ＝２）を静脈内注射した。異なる時点（０、３０分、１、２、４、８時間、１、２、３、４、５、６、および７日）での一連の血液サンプルを、マウスの内側伏在静脈から採取した。各時点で、１０μＬの血液サンプルを採取し、凝固を防ぐために２４０μＬの１％ＰＢＳ－ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）に添加した。血小板をカウントするために、５０μＬの血液サンプル（ＰＢＳ－ＥＤＴＡ中）を１０ｍＬの希釈液（アイソトンＩＩ、コールターコーポレーション）に移し、コールターカウンター（ベックマンＺ２、コールターコーポレーション）を使用して血小板数を測定した。図１７に示すように、ヒト化および一価のＨ００１またはＨ００２抗体は、投与後最初の２４時間で血小板数の有意な減少を誘発しなかった。これは、ＮＩＴ－Ｂ１抗体とは明らかに対照的である。

【0105】

出血時間：ＢＡＬＢ／ｃマウスに、損傷の１２０分前にＰＢＳ（ｎ＝４）、Ｆａｂ Ｈ００１またはＨ００２抗体（５－１０ｕｇ／マウス、ｎ＝３）を静脈内注射した。マウスを２．５％アベルチン（１８ｍＬ／ｋｇ体重、ｉ．ｐ）で麻酔し、３７°Ｃの加熱パッド上に維持した。尾の先端（２ｍｍ）を鋭利なメスで切り取り、ティッシュペーパーを使用して１５秒ごとに傷口を軽くたたいた。出血時間は、血流が停止するまでの時間として記録された（出血は１０秒以上停止した）。尾がまだ出血している場合は、１５分後に分析を終了した。図１８に示すように、Ｈ００１またはＨ００２抗体の投与は、出血時間を延長しなかった。

【0106】

（参考文献）
Ｙａｇｈｏｕｂ Ｓａｆｄａｒｉ、Ｓａｆａｒ Ｆａｒａｊｎｉａ、Ｍｏｈａｍｍａｄ Ａｓｇｈａｒｚａｄｅｈ＆Ｍａｓｏｕｍｅｈ Ｋｈａｌｉｌｉ（２０１３）、『Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ － ａ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｕｐｄａｔｅ』、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ、２９：２、１７５－１８６。

【0107】

本発明を、その特定の実施形態に関連して説明されてきたが、特許請求の範囲は、実施例に記載された好ましい実施形態によって限定されるべきではなく、全体として説明と一致する最も広い解釈を与えられるべきであることが理解されるべきである。

【0108】

［付記］
［付記１］
血小板糖タンパク質Ｉ（ｂ）α（ＧＰＩｂα）を特異的に認識するヒト化抗体であって、
前記ヒト化抗体は、Ｆｃ部分を欠いており、且つ、
血小板の活性化、凝集、および／または血栓の成長を防ぐことができ、
血小板を活性化する能力を欠いており、
血小板減少症を誘発する能力を欠いており、および／または、
治療用量では出血時間を延長する能力を欠いている、
ことを特徴とするヒト化抗体。

【0109】

［付記２］
ヒトＧＰＩｂα、マウスＧＰＩｂα、イヌＧＰＩｂα、ラットＧＰＩｂα、ウサギＧＰＩｂα、および／またはサルＧＰＩｂαを認識することができる、付記１に記載のヒト化抗体。

【0110】

［付記３］
抗体断片である、付記１または２に記載のヒト化抗体。

【0111】

［付記４］
Ｆ（ａｂ）_２断片である、付記３に記載のヒト化抗体。

【0112】

［付記５］
前記抗体は一価抗体である、付記３に記載のヒト化抗体。

【0113】

［付記６］
Ｆａｂ抗体断片である、付記５に記載ヒト化抗体。

【0114】

［付記７］
単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、付記５に記載のヒト化抗体。

【0115】

［付記８］
重鎖を有する、付記１から７のいずれか一つに記載のヒト化抗体。

【0116】

［付記９］
前記重鎖は、
ＧＦＴＦＳＳＦＡＭＳ（配列番号３７）のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する第１のＣＤＲ、
ＳＩＴＳＡＧＴＰＹＹＰＤＳＶＬＧ（配列番号３８）のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する第２のＣＤＲ、および／または、
ＳＲＧＹＥＤＹＦＤＹ（配列番号３９）のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する第３のＣＤＲ、
を含む、付記８に記載のヒト化抗体。

【0117】

［付記１０］
前記重鎖はヒトＩｇＧ_１抗体のＣＨ１領域をさらに含む、付記８または９に記載のヒト化抗体。

【0118】

［付記１１］
前記ヒトＩｇＧ_１抗体のＣＨ１領域は、配列番号４０、４７、５４または６１のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する、付記１０に記載のヒト化抗体。

【0119】

［付記１２］
前記重鎖は、配列番号３６、４３、５０または５７のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する、付記１１に記載のヒト化抗体。

【0120】

［付記１３］
軽鎖を有する、付記１から１２のいずれか一つに記載のヒト化抗体。

【0121】

［付記１４］
前記軽鎖は、
ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号６５）のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する第１のＣＤＲ、
ＦＴＳＴＲＥＳのアミノ酸配列（配列番号６６）、そのバリアントまたはその断片を有する第２のＣＤＲ、および／または、
ＱＱＨＹＳＳＰＷＴ（配列番号６７）のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する第３のＣＤＲ、
を含む、付記１３に記載のヒト化抗体。

【0122】

［付記１５］
前記軽鎖はヒトＩｇＧ_１抗体のカッパ鎖Ｃ領域をさらに含む、付記１３または１４に記載のヒト化抗体。

【0123】

［付記１６］
前記カッパ鎖Ｃ領域は、配列番号６８、７５、８２または８９のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する、付記１５に記載のヒト化抗体。

【0124】

［付記１７］
前記軽鎖は、配列番号６４、７１、７８または８５のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する、付記１６に記載のヒト化抗体。

【0125】

［付記１８］
配列番号３６の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号６４の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、
配列番号３６の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号７１の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、
配列番号３６の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号７８の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、
配列番号３６の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号８５の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、
配列番号４３の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号６４の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、
配列番号４３の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号７１の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、
配列番号４３の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号７８の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、
配列番号４３の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号８５の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、
配列番号５０の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号６４の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、
配列番号５０の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号７１の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、
配列番号５０の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号７８の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、
配列番号５０の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号８５の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、
配列番号５７の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号６４の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、
配列番号５７の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号７１の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、
配列番号５７の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号７８の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、または、
配列番号５７の重鎖、そのバリアントまたはその断片、および配列番号８５の軽鎖、そのバリアントまたはその断片、
を含む、付記１から１７のいずれか一つに記載のヒト化抗体。

【0126】

［付記１９］
付記１から１８のいずれか一つに記載のヒト化抗体および担体タンパク質を含む、キメラタンパク質。

【0127】

［付記２０］
（ｉ）付記１から１８のいずれか一つに記載のヒト化抗体または付記１９に記載のキメラタンパク質、および、（ｉｉ）医薬添加物を含む、医薬組成物。

【0128】

［付記２１］
血小板上に存在する糖タンパク質Ｉ（ｂ）α（ＧＰＩｂα）とＧＰＩｂαリガンドとの間の相互作用を防止または制限する方法であって、血小板を、付記１から１８のいずれか一つに記載のヒト化抗体、付記１９に記載のキメラタンパク質、または、付記２０に記載の医薬組成物、に接触させることを含む方法。

【0129】

［付記２２］
血小板活性化を予防または制限するための、付記２１に記載の方法。

【0130】

［付記２３］
前記ＧＰＩｂαリガンドは、フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）および／またはトロンビンである、ことを特徴とする付記２１または２２に記載の方法。

【0131】

［付記２４］
前記接触させることは、低いまたは高いせん断速度下で引き起こされる、付記２１から２３のいずれか一つに記載の方法。

【0132】

［付記２５］
前記ＧＰＩｂαリガンドが前記血小板と接触される前に、それと同時に、またはその後に、前記ヒト化抗体、前記キメラタンパク質、または前記医薬組成物は、前記血小板と接触される、付記２１から２４のいずれか一つに記載の方法。

【0133】

［付記２６］
それを必要とする対象における体内での相互作用を防止または制限するための、付記２１から２５のいずれか一つに記載の方法。

【0134】

［付記２７］
それを必要とする対象における血栓の形成または成長を防止するための、付記２６に記載の方法。

【0135】

［付記２８］
それを必要とする対象における血栓のサイズまたは血栓の数を低減するための、付記２６に記載の方法。

【0136】

［付記２９］
前記対象における血栓の存在、位置、および／またはサイズを決定することをさらに含む、付記２６から２８のいずれか一つに記載の方法。

【0137】

［付記３０］
前記対象は病的血栓症を経験するリスクがあるまたは経験したことがある、付記２６から２８のいずれか一つに記載の方法。

【0138】

［付記３１］
前記対象は、虚血性脳卒中、血栓性血小板減少性紫斑病、心筋梗塞、急性冠症候群、アテローム血栓症、末梢血管疾患、深部静脈血栓症、敗血症、および／または血管炎症を経験するリスクがあるまたは経験したことがある、付記２６から２８のいずれか一つに記載の方法。

【0139】

［付記３２］
それを必要とする対象における腫瘍転移を低減または制限するため、付記２６から２８のいずれか一つに記載の方法。

【0140】

［付記３３］
前記対象における腫瘍転移の存在、位置、および／またはサイズを決定することをさらに含む、付記３２に記載の方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【配列表】

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