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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024123281
(43)【公開日】2024-09-11
(54)【発明の名称】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のＴ細胞エピトープペプチド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/50 20060101AFI20240904BHJP
C07K 14/165 20060101ALI20240904BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240904BHJP
C07K 14/74 20060101ALI20240904BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20240904BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20240904BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20240904BHJP
A61K 39/215 20060101ALI20240904BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240904BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20240904BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240904BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240904BHJP
【ＦＩ】
C12N15/50
C07K14/165 ZNA
C12N15/63 Z
C07K14/74
C12N5/0783
C07K7/06
C12Q1/04
A61K39/215
A61K48/00
A61P31/14
A61P37/04
A61P43/00 107
【審査請求】未請求
【請求項の数】16
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021086285
(22)【出願日】2021-05-21
(71)【出願人】
【識別番号】307014555
【氏名又は名称】北海道公立大学法人 札幌医科大学
(71)【出願人】
【識別番号】505210115
【氏名又は名称】国立大学法人旭川医科大学
(71)【出願人】
【識別番号】390004097
【氏名又は名称】株式会社医学生物学研究所
(74)【代理人】
【識別番号】110001047
【氏名又は名称】弁理士法人セントクレスト国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】鳥越 俊彦
(72)【発明者】
【氏名】廣橋 良彦
(72)【発明者】
【氏名】小林 博也
(72)【発明者】
【氏名】大栗 敬幸
(72)【発明者】
【氏名】矢島 優己
(72)【発明者】
【氏名】古市 華菜
(72)【発明者】
【氏名】李 棟梁
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QQ79
4B063QQ96
4B063QR48
4B063QS12
4B063QS32
4B063QS38
4B065AA94X
4B065AC20
4B065BA21
4B065BB19
4B065CA44
4C084AA13
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZB02
4C084ZB05
4C084ZB09
4C084ZB22
4C084ZB33
4C084ZC41
4C085AA03
4C085BA71
4C085BB18
4C085CC08
4C085CC32
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG01
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA15
4H045CA01
4H045DA86
4H045EA31
4H045FA20
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する細胞性免疫の誘導を可能とする抗原ペプチドを提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列における連続した少なくとも５アミノ酸を含み、かつ細胞傷害性Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞の誘導活性を有する、ペプチド。
【選択図】なし
【解決手段】特定のアミノ酸配列における連続した少なくとも５アミノ酸を含み、かつ細胞傷害性Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞の誘導活性を有する、ペプチド。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のエピトープペプチドであって、
配列番号：５２に記載のアミノ酸配列における連続した少なくとも５アミノ酸を含み、かつ細胞傷害性Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞の誘導活性を有する、ペプチド。
配列番号：５２に記載のアミノ酸配列における連続した少なくとも５アミノ酸を含み、かつ細胞傷害性Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞の誘導活性を有する、ペプチド。
【請求項2】
下記ペプチド群から選択される少なくとも１のペプチドを含む、請求項１に記載のエピトープペプチド：
（１）配列番号：７に記載のアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ－Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド
（２）配列番号：３８～４３及び４６のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ－ＤＲ５３拘束性ヘルパーＴ細胞の誘導活性を有するペプチド
（３）配列番号：２９～３３及び４７のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ－ＤＰ２拘束性ヘルパーＴ細胞の誘導活性を有するペプチド
（４）配列番号：５３に記載のアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ－ＤＲ１５拘束性ヘルパーＴ細胞の誘導活性を有するペプチド。
（１）配列番号：７に記載のアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ－Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド
（２）配列番号：３８～４３及び４６のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ－ＤＲ５３拘束性ヘルパーＴ細胞の誘導活性を有するペプチド
（３）配列番号：２９～３３及び４７のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ－ＤＰ２拘束性ヘルパーＴ細胞の誘導活性を有するペプチド
（４）配列番号：５３に記載のアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ－ＤＲ１５拘束性ヘルパーＴ細胞の誘導活性を有するペプチド。
【請求項3】
配列番号：１９、４８～５０、５４及び５５のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１又は２に記載のエピトープペプチド。
【請求項4】
請求項１～３のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチドをコードする核酸。
【請求項5】
請求項１～３のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチドをコードする核酸を含有する発現ベクター。
【請求項6】
請求項１～３のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチドを有効成分として含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を治療又は予防するためのワクチン。
【請求項7】
請求項１～３のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチドをコードする核酸を有効成分として含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を治療又は予防するためのワクチン。
【請求項8】
請求項１～３のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチドとＨＬＡ分子との複合体を表面上に提示する抗原提示細胞を有効成分として含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を治療又は予防するためのワクチン。
【請求項9】
請求項１～３のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチドとＨＬＡ分子との複合体又は該複合体の多量体。
【請求項10】
請求項１～３のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチド又は該ペプチドとＨＬＡ分子との複合体を表面上に提示する抗原提示細胞により、単核球を刺激して得られるＴ細胞を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を治療又は予防するための受動免疫療法剤。
【請求項11】
請求項９に記載の複合体又は該複合体の多量体と、単核球とを反応させ、前記複合体又は前記多量体にＴ細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得られるＴ細胞を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を治療又は予防するための受動免疫療法剤。
【請求項12】
請求項１～３のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチド又は該ペプチドとＨＬＡ分子との複合体を表面上に提示する抗原提示細胞により、単核球を刺激してＴ細胞を取得する工程を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を治療又は予防するための受動免疫療法剤の製造方法。
【請求項13】
請求項９に記載の複合体又は該複合体の多量体と、単核球とを反応させ、前記複合体又は前記多量体にＴ細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体からＴ細胞を単離する工程を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を治療するための受動免疫療法剤の製造方法。
【請求項14】
請求項１～３のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチドと単核球とを培地中で接触させ、Ｔ細胞を誘導することを特徴とする、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするＴ細胞を誘導する方法。
【請求項15】
請求項１～３のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチドを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするＴ細胞の誘導するためのキット。
【請求項16】
請求項９に記載の複合体又は該複合体の多量体と、被検試料とを反応させる工程を含む、当該試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なＴ細胞を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のＴ細胞エピトープペプチドに関し、より詳しくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ スパイクタンパクに由来し、細胞傷害性Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞の誘導活性を有する、抗原性のペプチドに関する。本発明はまた、前記ペプチドをコードする核酸及び当該核酸を含有する発現ベクターに関する。さらに、本発明は、前記ペプチド等を有効成分として含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を治療又は予防するためのワクチンに関する。また、本発明は、前記ペプチド等を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を治療又は予防するための受動免疫療法剤の製造方法、及びそれによって製造された受動免疫療法剤に関する。さらにまた、前記ペプチド等を用いたＴ細胞の誘導方法、及びそれに用いるキットに関する。また、本発明は、前記ペプチドとＨＬＡ分子との複合体又は該複合体の多量体に関し、さらに、当該複合体又はその多量体を用いた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なＴ細胞を検出する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
２０１９年１２月に発生した新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）による感染症(ＣＯＶＩＤ－１９)は、その後わずか数ヶ月程度の間に世界中に伝播し、各国にて恐ろしい記録の更新が続いており、感染拡大に歯止めがかからない状況である。より大きな被害を及ぼすとされる更なるパンデミックの波も懸念される中、ＣＯＶＩＤ－１９に対する有効かつ安全なワクチンの開発が強く求められている。
【0003】
現在世界で開発進行中のＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの殆どが、ウイルスに対する中和抗体、すなわち液性免疫の誘導を標的とするものである。しかし、ウイルス感染に対する獲得（特異的）免疫反応は、液性免疫だけではなく細胞性免疫も極めて重要であり、それぞれ役割が異なる。
【0004】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、スパイク(Ｓ)タンパクを介して感染するため、Ｓタンパクに対する中和抗体は感染防御に働くと考えられる。しかしながら、細胞内に感染したウイルスに対して抗体は無力であり、ウイルス感染細胞を殺傷できる細胞性免疫、すなわち細胞傷害性Ｔ細胞がその役割を担う。さらに、抗体及び細胞傷害性Ｔ細胞の誘導には、ヘルパーＴ細胞が重要な働きを果たす。
【0005】
ウイルス感染に対する細胞性免疫について、より具体的に説明すると、その免疫に関与する重要な細胞に、細胞表面タンパク質であるＣＤ８を発現しているＴ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）と、細胞表面タンパク質であるＣＤ４を発現しているＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）とがある。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、活性化された場合、ＨＬＡクラス１分子に結合するウイルス由来の抗原を提示している細胞を溶解するＴ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ＣＴＬ）である。ＣＤ４＋Ｔ細胞はサイトカインを分泌するヘルパー（Ｔｈ）細胞であって、ＨＬＡクラス２分子によりウイルス由来の抗原を提示するマクロファージ、樹状細胞等により活性化され、ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導及び維持のためのヘルパー機能を発揮する。また、Ｔｈ細胞は分泌するサイトカインの種類によってＴｈ１細胞（ＩＦＮ－γ等を産生する細胞）及びＴｈ２細胞（インターロイキン－４等を産生する細胞）等に分類されることが知られており、各細胞の役割も解明されつつある。
【0006】
こと、ＣＯＶＩＤ－１９病勢制御においても、かかる細胞性免疫の重要性が明らかになりつつある。例えば、ＣＯＶＩＤ－１９重症患者では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体価が高いことが報告されている(非特許文献１)。さらに、重症患者では末梢血Ｔ細胞の減少がみられることも報告されている(非特許文献２)。逆に、無症候ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者又は軽症ＣＯＶＩＤ－１９患者では、ＣＯＶＩＤ－１９重症患者と比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する高い細胞性免疫応答がみられることが報告されている(非特許文献３)。
【0007】
これらの結果から、ＣＯＶＩＤ－１９病勢制御に、液性免疫より細胞性免疫が重要である可能性が示唆され、細胞性免疫を誘導可能なワクチン等の開発が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２防御において重要な戦略となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｎｉｓｒｅｅｎ Ｍ Ａ Ｏｋｂａら、Ｅｍｅｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．、２０２０年７月、２６巻、７号、１４７８～１４８８ページ
【非特許文献2】Ｃｏｎｇ－Ｙｉｎｇ Ｓｏｎｇら、「ＣＯＶＩＤ－１９ ｅａｒｌｙ ｗａｒｎｉｎｇ ｓｃｏｒｅ：ａ ｍｕｌｔｉ－ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｏｏｌ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｈｉｇｈｌｙ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ．」、Ｐｒｅｐｒｉｎｔ ｆｒｏｍ ｍｅｄＲｘｉｖ、２０２０年３月８日
【非特許文献3】Ｔａｋｕｙａ Ｓｅｋｉｎｅら、Ｃｅｌｌ、２０２０年１０月１日、１８３巻、１号、１５８‐１６４．ｅ１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する細胞性免疫の誘導を可能とする抗原ペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、前記目的を達成すべく、先ず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパクを対象とし、当該ウイルス特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導し得る抗原ペプチドの同定を試みた。その結果、Ｓタンパク ４４８～４５６位の９アミノ酸からなるペプチド（ＮＹＮ ９ｍｅｒペプチド、アミノ酸配列：ＮＹＮＹＬＹＲＬＦ、配列番号：７）は、ＨＬＡクラス１分子（ＨＬＡ－Ａ＊２４及びβ２－ミクログロブリン）と複合体を形成し得ることが明らかになった。さらに、当該エピトープペプチドは、末梢血単核球より当該ペプチド特異的ＣＴＬを誘導し、また当該ＣＴＬを増幅し得ることも明らかにした。
【0011】
さらに、本発明者らは、鋭意研究を進めた結果、前記９アミノ酸からなるＣＴＬ誘導性エピトープペプチドを含む、Ｓタンパク ４４８～４７７位の３０アミノ酸からなるペプチド（ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチド、アミノ酸配列：ＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳ、配列番号：１９）は、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞を誘導する活性も有していることを明らかにした。また、ＨＬＡ－ＤＲ５３拘束性のＴｈ細胞は、Ｓタンパク ４６１～４７０位の１０アミノ酸からなるペプチド（ＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴ、配列番号：４６）によって誘導される一方で、ＨＬＡ－ＤＰ２拘束性のＴｈ細胞は、Ｓタンパク ４５１～４６１位の１１アミノ酸からなるペプチド（ＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬ、配列番号：４７）によって誘導されることも明らかにした。
【0012】
さらに、本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株（Ｎ５０１Ｙ）のＳタンパク ４８９～５１３位の２５アミノ酸からなるペプチド（Ｎ５０１Ｙ ２５ｍｅｒペプチド、アミノ酸配列：ＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＹＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬ、配列番号：５１）が、ＨＬＡ－ＤＲ１５拘束性のＴｈ細胞を誘導する活性も有していることを明らかにした。
【0013】
このように、ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチド及びＮ５０１Ｙ ２５ｍｅｒペプチドを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク ４４８～５１３位の６６アミノ酸からなるペプチド（配列番号：５２）は、由来及び種類の異なるＴ細胞（少なくとも、ＨＬＡ－Ａ＊２４拘束性ＣＴＬ、ＨＬＡ－ＤＲ５３拘束性Ｔｈ細胞、ＨＬＡ－ＤＰ２拘束性Ｔｈ細胞、ＨＬＡ－ＤＲ１５拘束性Ｔｈ細胞）を刺激し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を誘導し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0014】
すなわち、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパクに由来し、細胞傷害性Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞の誘導活性を有する、抗原性のペプチドに関し、より具体的には以下に関する。
＜１＞ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のエピトープペプチドであって、
配列番号：５２に記載のアミノ酸配列における連続した少なくとも５アミノ酸を含み、かつ細胞傷害性Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞の誘導活性を有する、ペプチド。
＜２＞ 下記ペプチド群から選択される少なくとも１のペプチドを含む、＜１＞に記載のエピトープペプチド：
（１）配列番号：７に記載のアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ－Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド
（２）配列番号：３８～４３及び４６のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ－ＤＲ５３拘束性ヘルパーＴ細胞の誘導活性を有するペプチド
（３）配列番号：２９～３３及び４７のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ－ＤＰ２拘束性ヘルパーＴ細胞の誘導活性を有するペプチド
（４）配列番号：５３に記載のアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ－ＤＲ１５拘束性ヘルパーＴ細胞の誘導活性を有するペプチド。
＜３＞ 配列番号：１９、４８～５０、５４及び５５のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列を含むペプチドである、＜１＞又は＜２＞に記載のエピトープペプチド。
＜４＞ ＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチドをコードする核酸。
＜５＞ ＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチドをコードする核酸を含有する発現ベクター。
＜６＞ ＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチドを有効成分として含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を治療又は予防するためのワクチン。
＜７＞ ＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチドをコードする核酸を有効成分として含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を治療又は予防するためのワクチン。
＜８＞ ＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチドとＨＬＡ分子との複合体を表面上に提示する抗原提示細胞を有効成分として含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を治療又は予防するためのワクチン。
＜９＞ ＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチドとＨＬＡ分子との複合体又は該複合体の多量体。
＜１０＞ ＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチド又は該ペプチドとＨＬＡ分子との複合体を表面上に提示する抗原提示細胞により、単核球を刺激して得られるＴ細胞を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を治療又は予防するための受動免疫療法剤。
＜１１＞ ＜９＞に記載の複合体又は該複合体の多量体と、単核球とを反応させ、前記複合体又は前記多量体にＴ細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得られるＴ細胞を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を治療又は予防するための受動免疫療法剤。
＜１２＞ ＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチド又は該ペプチドとＨＬＡ分子との複合体を表面上に提示する抗原提示細胞により、単核球を刺激してＴ細胞を取得する工程を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を治療又は予防するための受動免疫療法剤の製造方法。
＜１３＞ ＜９＞に記載の複合体又は該複合体の多量体と、単核球とを反応させ、前記複合体又は前記多量体にＴ細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体からＴ細胞を単離する工程を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を治療するための受動免疫療法剤の製造方法。
＜１４＞ ＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチドと単核球とを培地中で接触させ、Ｔ細胞を誘導することを特徴とする、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするＴ細胞を誘導する方法。
＜１５＞ ＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチドを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするＴ細胞の誘導するためのキット。
＜１６＞ ＜９＞に記載の複合体又は該複合体の多量体と、被検試料とを反応させる工程を含む、当該試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なＴ細胞を検出する方法。
＜１＞ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のエピトープペプチドであって、
配列番号：５２に記載のアミノ酸配列における連続した少なくとも５アミノ酸を含み、かつ細胞傷害性Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞の誘導活性を有する、ペプチド。
＜２＞ 下記ペプチド群から選択される少なくとも１のペプチドを含む、＜１＞に記載のエピトープペプチド：
（１）配列番号：７に記載のアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ－Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド
（２）配列番号：３８～４３及び４６のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ－ＤＲ５３拘束性ヘルパーＴ細胞の誘導活性を有するペプチド
（３）配列番号：２９～３３及び４７のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ－ＤＰ２拘束性ヘルパーＴ細胞の誘導活性を有するペプチド
（４）配列番号：５３に記載のアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ－ＤＲ１５拘束性ヘルパーＴ細胞の誘導活性を有するペプチド。
＜３＞ 配列番号：１９、４８～５０、５４及び５５のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列を含むペプチドである、＜１＞又は＜２＞に記載のエピトープペプチド。
＜４＞ ＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチドをコードする核酸。
＜５＞ ＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチドをコードする核酸を含有する発現ベクター。
＜６＞ ＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチドを有効成分として含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を治療又は予防するためのワクチン。
＜７＞ ＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチドをコードする核酸を有効成分として含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を治療又は予防するためのワクチン。
＜８＞ ＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチドとＨＬＡ分子との複合体を表面上に提示する抗原提示細胞を有効成分として含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を治療又は予防するためのワクチン。
＜９＞ ＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチドとＨＬＡ分子との複合体又は該複合体の多量体。
＜１０＞ ＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチド又は該ペプチドとＨＬＡ分子との複合体を表面上に提示する抗原提示細胞により、単核球を刺激して得られるＴ細胞を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を治療又は予防するための受動免疫療法剤。
＜１１＞ ＜９＞に記載の複合体又は該複合体の多量体と、単核球とを反応させ、前記複合体又は前記多量体にＴ細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得られるＴ細胞を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を治療又は予防するための受動免疫療法剤。
＜１２＞ ＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチド又は該ペプチドとＨＬＡ分子との複合体を表面上に提示する抗原提示細胞により、単核球を刺激してＴ細胞を取得する工程を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を治療又は予防するための受動免疫療法剤の製造方法。
＜１３＞ ＜９＞に記載の複合体又は該複合体の多量体と、単核球とを反応させ、前記複合体又は前記多量体にＴ細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体からＴ細胞を単離する工程を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を治療するための受動免疫療法剤の製造方法。
＜１４＞ ＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチドと単核球とを培地中で接触させ、Ｔ細胞を誘導することを特徴とする、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするＴ細胞を誘導する方法。
＜１５＞ ＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載のエピトープペプチドを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするＴ細胞の誘導するためのキット。
＜１６＞ ＜９＞に記載の複合体又は該複合体の多量体と、被検試料とを反応させる工程を含む、当該試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なＴ細胞を検出する方法。
【発明の効果】
【0015】
本発明によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞を誘導し、当該ウイルスの感染症の治療又は予防を可能とする。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】ＨＬＡ－モノマー形成が認められる場合の代表的なゲル濾過カラム分析例を示す図である。
【図2】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原由来候補ペプチドのフォールディングテスト結果を示すグラフである。
【図3】ＨＬＡ－テトラマー調製におけるペプチド交換反応をフローサイトメーターで解析した結果を示す図である。
【図4】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原由来候補ペプチドのペプチド交換率を示すグラフである。
【図5】ドナーから採取したサンプルからペプチドと共培養して誘導したＣＴＬのＩＦＮ－γの産生能を、ＥＬＩＳＰＯＴで解析した結果を示す図である。図中、「Ｙ」及び「Ｈ」は、各々異なるドナー由来から採取したサンプルであることを示す。
【図6】ＮＹＮ ９ｍｅｒペプチドと共培養した際に誘導したＣＴＬとＨＬＡ－テトラマー試薬との反応を、フローサイトメーターで解析した結果を示す図である。
【図7】ＱＹＩ ９ｍｅｒペプチド（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク １２０８～１２１６位の９アミノ酸からなるペプチド、アミノ酸配列：ＱＹＩＫＷＰＷＹＩ、配列番号：１５）と共培養した際に誘導したＣＴＬとＨＬＡ－テトラマー試薬との反応を、フローサイトメーターで解析した結果を示す図である。
【図8】ＮＹＮ ９ｍｅｒペプチドと共培養した際に誘導したＣＴＬを、単クローン化して増幅した後に、ＩＦＮ－γの産生能をＥＬＩＳＰＯＴで解析した結果を示す図である。
【図9】Ｍｉｎｉ ｇｅｎｅを発現させた２９３Ｔ細胞又は２９３Ｔ／ＨＬＡ－Ａ＊２４＋細胞に対する、ＣＴＬクローンのＩＦＮ－γ産生能を、ＥＬＩＳＰＯＴで解析した結果を示す図である。
【図10】ドナーから採取したサンプルからＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチドで誘導したＴｈ細胞株の、ＩＦＮ－γ及びＧｒａｎｚｙｍｅ Ｂの産生能を、フローサイトメーターで解析した結果を示す図である。
【図11】抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体存在下、ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチドで誘導したＴｈ細胞株のＩＦＮ－γ及びＧＭ－ＣＳＦの産生能を、ＥＬＩＳＡで解析した結果を示す図である。
【図12】ＨＬＡ－ＤＲ－４、９、及び５３の遺伝子が各々導入されたマウス由来線維芽細胞株に対する、ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチドで誘導したＴｈ細胞株のＩＦＮ－γ及びＧＭ－ＣＳＦ産生能を、ＥＬＩＳＡキットで解析した結果を示す図である。図中、各試験群において、左側がＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチド非存在下での培養結果（ｃｏｎｔｒｏｌ）を示し、右側がＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチド存在下での培養結果（＋ｐｅｐｔｉｄｅ）を示す。
【図13】ドナーから採取したサンプルからＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチドで誘導したＴｈ細胞株のＩＦＮ－γ及びＧｒａｎｚｙｍｅ Ｂの産生能を、フローサイトメーターで解析した結果を示す図である。
【図14】抗ＨＬＡ－ｃｌａｓｓ Ｉ抗体、抗ＨＬＡ－ＤＰ抗体、抗ＨＬＡ－ＤＱ抗体、又は抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体の存在下、ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチドで誘導したＴｈ細胞株のＩＦＮ－γ及びＧＭ－ＣＳＦの産生能を、ＥＬＩＳＡキットで解析した結果を示す図である。
【図15】ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチドで誘導したＴｈ細胞株とＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０２：０１又はＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１を保持するＬＣＬ細胞との共培養における、ＩＦＮ－γ及びＧＭ－ＣＳＦの産生能を、ＥＬＩＳＡキットで解析した結果を示す図である。
【図16A】ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチドで誘導したＴｈ細胞株（ＨＬＡ－ＤＲ５３拘束性Ｔｈ細胞（ＤＲ５３－ＨＫ３６））を当該ペプチド由来の断片化ペプチドで刺激培養し、ＩＦＮ－γ及びＧＭ－ＣＳＦの産生能をＥＬＩＳＡで解析した結果を示す図である。
【図16B】ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチドで誘導したＤＲ５３－ＨＫ３６を当該ペプチド由来のオーバーラップペプチドで刺激培養し、ＩＦＮ－γ産生能をＥＬＩＳＡで解析した結果を示す図である。
【図17A】ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチドで誘導したＴｈ細胞株（ＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０２：０１拘束性のＴｈ細胞（ＤＰ２－ＨＫ１３））を当該ペプチド由来の断片化ペプチドで刺激培養し、ＩＦＮ－γ及びＧＭ－ＣＳＦの産生能をＥＬＩＳＡで解析した結果を示す図である。
【図17B】ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチドで誘導したＤＰ２－ＨＫ１３を当該ペプチド由来のオーバーラップペプチドで刺激培養し、ＩＦＮ－γ産生能をＥＬＩＳＡで解析した結果を示す図である。
【図18】ドナーから採取したサンプルからＮ５０１Ｙ ２５ｍｅｒペプチドで誘導したＴｈ細胞株の、ＩＦＮ－γ及びＧｒａｎｚｙｍｅ Ｂの産生能を、フローサイトメーターで解析した結果を示す図である。
【図19】抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体存在下、Ｎ５０１Ｙ ２５ｍｅｒペプチドで誘導したＴｈ細胞株のＩＦＮ－γの産生能を、ＥＬＩＳＡで解析した結果を示す図である。
【図20】ＨＬＡ－ＤＲ４、１５、及び５３の遺伝子が導入されたマウス由来線維芽細胞株に対する、Ｎ５０１Ｙ ２５ｍｅｒペプチドで誘導したＴｈ細胞株のＩＦＮ－γ産生能をＥＬＩＳＡキットで解析した結果を示す図である。図中、各試験群において、左側がＮ５０１Ｙ ２５ｍｅｒペプチド非存在下での培養結果（ｃｏｎｔｒｏｌ）を示し、右側がＮ５０１Ｙ ２５ｍｅｒペプチド存在下での培養結果（＋ｐｅｐｔｉｄｅ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【0017】
〔エピトープペプチド〕
後述の実施例において示すとおり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイク（Ｓ）タンパク ４４８～５１３位の６６アミノ酸からなるペプチド（ＮＹＮ ６６ｍｅｒペプチド、アミノ酸配列：ＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＸＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬ、ＸはＮ（アスパラギン）又はＹ（チロシン）を表す、配列番号：５２）は、由来及び種類の異なるＴ細胞を刺激し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を誘導し得る。
後述の実施例において示すとおり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイク（Ｓ）タンパク ４４８～５１３位の６６アミノ酸からなるペプチド（ＮＹＮ ６６ｍｅｒペプチド、アミノ酸配列：ＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＸＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬ、ＸはＮ（アスパラギン）又はＹ（チロシン）を表す、配列番号：５２）は、由来及び種類の異なるＴ細胞を刺激し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を誘導し得る。
【0018】
したがって、本発明は、配列番号：５２に記載のアミノ酸配列における連続した少なくとも５アミノ酸を含み、かつ細胞傷害性Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞の誘導活性を有する、ペプチドを提供する。
【0019】
本発明において「細胞傷害性Ｔ細胞」とは、「ＣＴＬ」又は「キラーＴ細胞」とも称する細胞であり、細胞表面蛋白質であるＣＤ８を発現しているＴ細胞（ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞）であって、ＨＬＡクラス１分子を介して提示された抗原を認識して活性化した場合、同抗原を有する細胞に傷害を与え得る細胞である。なお、かかる細胞傷害性活性は、免疫チェックポイント機構が抑制（解除）された状況下にて発揮し得る細胞も、本発明にかかる細胞傷害性Ｔ細胞に含まれる。
【0020】
「ＨＬＡクラス１分子」とは、ヒト由来の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子を意味し、通常、α鎖及びβ２ミクログロブリンの複合体である。なお、後述のＭＨＣ－モノマー等に用いられる場合には、α鎖はその細胞外領域のみであってもよい。また、ＨＬＡクラス１分子のα鎖は、例えば、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子座又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子座にコードされているα鎖が挙げられる。
【0021】
「ＨＬＡ－Ａ」は、例えば、ＨＬＡ－Ａ２４（ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０４、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０８、ＨＬＡ－Ａ＊２４：２０等）、ＨＬＡ－Ａ２（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０３、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０７、ＨＬＡ－Ａ＊０２：１０、ＨＬＡ－Ａ＊０２：１８等）、ＨＬＡ－Ａ１１（ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０２等）、ＨＬＡ－Ａ２６（ＨＬＡ－Ａ＊２６：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２６：０２、ＨＬＡ－Ａ＊２６：０３、ＨＬＡ－Ａ＊２６：０４、ＨＬＡ－Ａ＊２６：０５、ＨＬＡ－Ａ＊２６：０６等）のアリルが挙げられる。
【0022】
「ＨＬＡ－Ｂ」は、例えば、ＨＬＡ－Ｂ１３（ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２等）、ＨＬＡ－Ｂ１５（ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０７、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：１１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：１８、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：２７等）、ＨＬＡ－Ｂ３９（ＨＬＡ－Ｂ＊３９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３９：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３９：０４等）、ＨＬＡ－Ｂ４０（ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０６等）のアリルが挙げられる。
【0023】
「ＨＬＡ－Ｃ」は、例えば、ＨＬＡ－Ｃ０１（ＨＬＡ－Ｃｗ＊０１：０２、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０２：０２等）、ＨＬＡ－Ｃ０３（ＨＬＡ－Ｃｗ＊０３：０２、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０３：０７等）、ＨＬＡ－Ｃ０４（ＨＬＡ－Ｃｗ＊０４：０１等）、ＨＬＡ－Ｃ０５（ＨＬＡ－Ｃｗ＊０５：０１等）、ＨＬＡ－Ｃ０８（ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８：０１）等のアリルが挙げられる。
【0024】
「ヘルパーＴ細胞」とは、「Ｔｈ細胞」とも称する細胞であり、細胞表面蛋白質であるＣＤ４を発現しているＴ細胞（ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞）であって、ＨＬＡクラス２分子を介して提示された抗原を認識して活性化した場合、細胞性免疫に関する他の免疫細胞（例えば、ＣＴＬ、マクロファージ）の活性化及び／又は刺激を助けるために様々なサイトカイン（ＩＦＮ－γ等）等を分泌し、他の細胞の活性化、機能の行使等を助ける細胞であり、より具体的には、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ０細胞が挙げられる。
【0025】
「ＨＬＡクラス２分子」とは、ヒト由来のＭＨＣクラス２分子を意味し、通常、α鎖及びβ鎖の複合体である。なお、後述のＭＨＣ－モノマー等に用いられる場合には、α鎖及び／又はβ鎖はそれらの細胞外領域のみであってもよい。また、ＨＬＡクラス２分子のα鎖は、例えば、ＨＬＡ－ＤＰＡ遺伝子座、ＨＬＡ－ＤＱＡ遺伝子座又はＨＬＡ－ＤＲＡ遺伝子座にコードされているα鎖が挙げられる。ＨＬＡクラス２分子のβ鎖は、例えば、ＨＬＡ－ＤＰＢ遺伝子座、ＨＬＡ－ＤＱＢ遺伝子座又はＨＬＡ－ＤＲＢ遺伝子座にコードされているβ鎖が挙げられる。
【0026】
「ＨＬＡ－ＤＲ」は、例えば、ＨＬＡ－ＤＲ１、ＨＬＡ－ＤＲ２、ＨＬＡ－ＤＲ３、ＨＬＡ－ＤＲ４、ＨＬＡ－ＤＲ５、ＨＬＡ－ＤＲ６、ＨＬＡ－ＤＲ７、ＨＬＡ－ＤＲ８、ＨＬＡ－ＤＲ９、ＨＬＡ－ＤＲ１０、ＨＬＡ－ＤＲ１１、ＨＬＡ－ＤＲ１２、ＨＬＡ－ＤＲ１３、ＨＬＡ－ＤＲ１４、ＨＬＡ－ＤＲ１５、ＨＬＡ－ＤＲ５２、ＨＬＡ－ＤＲ５３が挙げられる。例えば、α鎖としてＨＬＡ－ＤＲＡ１等のＨＬＡ－ＤＲＡと、β鎖としてＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４又はＨＬＡ－ＤＲＢ５等のＨＬＡ－ＤＲＢとを含む分子が挙げられる。より具体的には、α鎖として、ＨＬＡ－ＤＲＡ１＊０１等のアリル、β鎖として、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０７、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１０、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１６、ＨＬＡ－ＤＲＢ３＊０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ４＊０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ５＊０１等のアリルが挙げられる。
【0027】
「ＨＬＡ－ＤＰ」は、例えば、ＨＬＡ－ＤＰ１、ＨＬＡ－ＤＰ２、ＨＬＡ－ＤＰ３、ＨＬＡ－ＤＰ４、ＨＬＡ－ＤＰ５が挙げられる。例えば、α鎖としてＨＬＡ－ＤＰＡ１等のＨＬＡ－ＤＰＡと、β鎖としてＨＬＡ－ＤＰＢ１等のＨＬＡ－ＤＰＢとを含む分子が挙げられる。より具体的には、α鎖として、ＨＬＡ－ＤＰＡ１＊０１、ＨＬＡ－ＤＰＡ１＊０２、ＨＬＡ－ＤＰＡ１＊０３、ＨＬＡ－ＤＰＡ１＊０４等、β鎖として、ＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０２、ＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０４、ＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５、ＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０９等のアリルが挙げられる。
【0028】
「ＨＬＡ－ＤＱ」は、例えば、ＨＬＡ－ＤＱ１、ＨＬＡ－ＤＱ２、ＨＬＡ－ＤＱ３、Ｈ
ＬＡ－ＤＱ４、ＨＬＡ－ＤＱ５、ＨＬＡ－ＤＱ６、ＨＬＡ－ＤＱ７、ＨＬＡ－ＤＱ８が挙げられる。例えば、α鎖としてＨＬＡ－ＤＱＡ１等のＨＬＡ－ＤＱＡと、β鎖としてＨＬＡ－ＤＱＢ１等のＨＬＡ－ＤＱＢとを含む分子が挙げられる。より具体的には、α鎖として、ＨＬＡ－ＤＱＡ１＊０１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１＊０２、ＨＬＡ－ＤＱＡ１＊０３、ＨＬＡ－ＤＱＡ１＊０４、ＨＬＡ－ＤＱＡ１＊０５、ＨＬＡ－ＤＱＡ１＊０６、β鎖として、例えば、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０３、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０４、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０５、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０６等のアリルが挙げられる。
ＬＡ－ＤＱ４、ＨＬＡ－ＤＱ５、ＨＬＡ－ＤＱ６、ＨＬＡ－ＤＱ７、ＨＬＡ－ＤＱ８が挙げられる。例えば、α鎖としてＨＬＡ－ＤＱＡ１等のＨＬＡ－ＤＱＡと、β鎖としてＨＬＡ－ＤＱＢ１等のＨＬＡ－ＤＱＢとを含む分子が挙げられる。より具体的には、α鎖として、ＨＬＡ－ＤＱＡ１＊０１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１＊０２、ＨＬＡ－ＤＱＡ１＊０３、ＨＬＡ－ＤＱＡ１＊０４、ＨＬＡ－ＤＱＡ１＊０５、ＨＬＡ－ＤＱＡ１＊０６、β鎖として、例えば、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０３、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０４、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０５、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０６等のアリルが挙げられる。
【0029】
「ペプチド」は、隣接するアミノ酸残基のα－アミノ基とカルボキシル基間のペプチド結合により相互に結合した分子鎖を意味する。ペプチドは特定長のものを意味するものではなく、種々の長さであり得る。すなわち、所謂ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質も含まれる。また、無電荷又は塩の形態であってもよく、さらに、ペプチドを構成する「アミノ酸」は、天然型であってもよく、非天然型であってもよく、アナログ（アミノ酸のＮ－アシル化物、Ｏ－アシル化物、エステル化物、酸アミド化物、アルキル化物等）であってもよい。また、アミノ酸の側鎖は、化学的に修飾（糖鎖付加、脂質付加、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化等）が施されているものであってもよい。さらに、ポリペプチドのアミノ末端や遊離のアミノ基には、ホルミル基、アセチル基、ｔ－ブトキシカルボニル（ｔ－Ｂｏｃ）基等が結合していてもよく、本発明のペプチドのカルボニル末端や遊離のカルボキシル基には、メチル基、エチル基、ｔ－ブチル基、ベンジル基等が結合していてもよい。
【0030】
「エピトープペプチド」とは、細胞傷害性Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞の増殖、分化及び／又は活性化を誘導する活性を有する抗原ペプチドを意味する。なお、ペプチドがかかる誘導活性を有するか否かは、後述のとおり、「（２）エピトープペプチド特異的ＣＴＬの検出」、「（３）エピトープペプチド特異的Ｔｈ細胞の検出」に記載の方法等を用い、当業者であれば適宜判断することができる。
【0031】
本発明において、エピトープペプチドは、配列番号：５２に記載のアミノ酸配列から選択される、連続した少なくとも５アミノ酸を含み、かつ前記活性を有する限り、特に制限はないが、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する活性を有するペプチド（キラーエピトープ）としては、通常５～３０アミノ酸であり、好ましくは６～２５アミノ酸であり、より好ましくは８～２０アミノ酸であり、特に好ましくは９アミノ酸である。ヘルパーＴ細胞を誘導する活性を有するペプチド（ヘルパーエピトープ）としては、通常５～３０アミノ酸であり、好ましくは６～２５アミノ酸であり、より好ましくは９～２０アミノ酸であり、特に好ましくは１０～１１アミノ酸である。
【0032】
このような活性を有し得るエピトープペプチドのアミノ酸配列は、コンピュータープログラムを利用した分析によって推測することができる。キラーエピトープのアミノ酸配列は、ＮｅｔＭＨＣｃｏｎｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ.ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣｃｏｎｓ）、ＢＩＭＡＳ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／）、ＳＶＭＨＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｂｃ．ｓｕ．ｓｅ／ｓｖｍｈｃ／）、ＰＲＥＤＥＰ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｍｄ．ｈｕｊｉ．ａｃ．ｉｌ／ｍａｒｇ／Ｔｅｐｐｒｅｄ／ｍｈｃ－ｂｉｎｄ／）、ＮｅｔＭＨＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣ／）、ＰＲＥＤＩＣＴ（ｈｔｔｐ：／／ｓｄｍｃ．ｋｒｄｌ．ｏｒｇ．ｓｇ：８０８０／ｐｒｅｄｉｃｔ／）、ＬｐＰｅｐ（ｈｔｔｐ：／／ｒｅｉｎｅｒ．ｂｕ．ｅｄｕ／ｚｈｉｐｉｎｇ／ｌｐｐｅｐ．ｈｔｍｌ）等のコンピュータープログラムによって推測することができる。ヘルパーエピトープのアミノ酸配列は、ＭＨＣ－ＴＨＲＥＡＤ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓｄ．ａｂｄｎ．ａｃ．ｕｋ／～ｇｊｌｋ／ＭＨＣ－Ｔｈｒｅａｄ／）、ＥｐｉＰｒｅｄｉｃｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｐｉｐｒｅｄｉｃｔ．ｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）、ＨＬＡ－ＤＲ４ ｂｉｎｄｉｎｇ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ－ｄｃｓ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｒａｎｃｈｅｓ／ｓｕｒｇｅｒｙ／ｓｂｐｒｏｇ．ｈｔｍｌ）、ＰｒｏＰｒｅｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｔｅｃｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｐｒｏｐｒｅｄ／）等のコンピュータープログラムによって推測することができる。また、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（ｈｔｔｐ：／／ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｍｉ－ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／Ｓｃｒｉｐｔｓ／ＭＨＣＳｅｒｖｅｒ．ｄｌｌ／ＥｐｉＰｒｅｄｉｃｔ．ｈｔｍ）、ＲａｎｋＰｅｐ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ．ｏｒｇ／Ｔｏｏｌｓ／ｒａｎｋｐｅｐ．ｈｔｍｌ）等のコンピュータープログラムによって、キラーエピトープ及びヘルパーエピトープのアミノ酸配列を推測することもできる。
【0033】
よって、本発明においては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイク（Ｓ）タンパク ４４８～５１３位の６６アミノ酸からなるアミノ酸配列（配列番号：５２）におけるエピトープペプチドを推測し得る。前記Ｓタンパクの配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ：ＱＨＤ４３４１６．１によって特定されるアミノ酸配列であり、アイソフォームの報告はない。しかしながら、ウイルス由来のタンパク質は、それをコードするＤＮＡ配列は天然において変異し得る。したがって、前記典型的なアミノ酸配列を有するもの以外に、天然においてアミノ酸が変異したものも存在しうることを理解されたい。
【0034】
また、以上のようにして推測されるエピトープペプチド（候補ペプチド）が、前記活性を奏せるか否かは、例えば、後述の実施例に示すように、以下の分析（１）～（４）等を行うことにより評価することができる。
【0035】
（１）フォールディングテスト
ＨＬＡ分子（ＨＬＡクラス１分子又はＨＬＡクラス２分子）と、候補ペプチドとを試験管内の適切な溶液（フォールディング溶液）中で混合すると、ＨＬＡ分子と前記ペプチドとの結合力が高ければ、当該溶液中では、これら分子の会合反応はスムーズに進行し、複合体（以下、ＭＨＣ－モノマーとも称する）が形成される。そして、このＭＨＣ－モノマーは、ゲル濾過カラム等で分析することによって検出することができる。一方、ＨＬＡ分子と候補ペプチドとの結合力が無い場合は、ＭＨＣ－モノマーは殆ど検出されない。したがって、フォールディング溶液を経時的に分析することで、又は熱処理等を行うことで、ＨＬＡ分子と候補ペプチドの結合性と安定性とを検証することが可能である。
ＨＬＡ分子（ＨＬＡクラス１分子又はＨＬＡクラス２分子）と、候補ペプチドとを試験管内の適切な溶液（フォールディング溶液）中で混合すると、ＨＬＡ分子と前記ペプチドとの結合力が高ければ、当該溶液中では、これら分子の会合反応はスムーズに進行し、複合体（以下、ＭＨＣ－モノマーとも称する）が形成される。そして、このＭＨＣ－モノマーは、ゲル濾過カラム等で分析することによって検出することができる。一方、ＨＬＡ分子と候補ペプチドとの結合力が無い場合は、ＭＨＣ－モノマーは殆ど検出されない。したがって、フォールディング溶液を経時的に分析することで、又は熱処理等を行うことで、ＨＬＡ分子と候補ペプチドの結合性と安定性とを検証することが可能である。
【0036】
（２）エピトープペプチド特異的ＣＴＬの検出
ヒト（例えば、健常人）から分離した末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ；ＰＢＭＣ）を適切な培地に浮遊させ、これに候補ペプチドを単独にて、または数種類の候補ペプチドを混合して加え、当該ペプチドとＩＬ－２による刺激を繰り返し与えながらＣＴＬを誘導する。
ヒト（例えば、健常人）から分離した末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ；ＰＢＭＣ）を適切な培地に浮遊させ、これに候補ペプチドを単独にて、または数種類の候補ペプチドを混合して加え、当該ペプチドとＩＬ－２による刺激を繰り返し与えながらＣＴＬを誘導する。
【0037】
（３）エピトープペプチド特異的Ｔｈ細胞の検出
ヒト（例えば、健常人）から分離したＰＢＭＣから、浮遊細胞を除去することにより樹状細胞（付着細胞）を調製する。また別途、同一のヒトからＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅの密度勾配遠心法又は磁気細胞分離システム等によりＣＤ４陽性Ｔ細胞を調製する。次に、前記樹状細胞に候補ペプチドを添加して培養した後、この樹状細胞と前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞とを混合培養する。その後、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を回収し、候補ペプチドと培養した樹状細胞で同様に繰り返し刺激し、Ｔｈ細胞を誘導する。
ヒト（例えば、健常人）から分離したＰＢＭＣから、浮遊細胞を除去することにより樹状細胞（付着細胞）を調製する。また別途、同一のヒトからＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅの密度勾配遠心法又は磁気細胞分離システム等によりＣＤ４陽性Ｔ細胞を調製する。次に、前記樹状細胞に候補ペプチドを添加して培養した後、この樹状細胞と前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞とを混合培養する。その後、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を回収し、候補ペプチドと培養した樹状細胞で同様に繰り返し刺激し、Ｔｈ細胞を誘導する。
【0038】
そして、このようにして誘導したＣＴＬ又はＴｈ細胞が、候補ペプチドに対して特異性があるかどうかの検討は、例えば、後述のＭＨＣ－多量体法等を用いて判定することができ、後述のＭＨＣ－多量体で染色可能なＣＴＬ又はＴｈ細胞が検出された場合、使用した候補ペプチドは、ＣＴＬ又はＴｈ細胞を誘導する活性を有するエピトープペプチドであると同定する事が可能である。
【0039】
また、候補ペプチドが、刺激に反応してＣＴＬ又はＴｈ細胞が活性化（誘導）されたことは、ＣＴＬ又はＴｈ細胞の増殖活性や、ＣＴＬ又はＴｈ細胞によるサイトカイン産生活性測定することによって分析することができる。
【0040】
（４）培養細胞株を用いた検討
プロテアソームによるタンパク質分解で生じたペプチド断片はＴＡＰ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）分子により小胞体内腔へと導かれ、ＨＬＡ分子に結合し、細胞膜表面へ輸送される。このＴＡＰ分子を欠損した、ＴＡＰ遺伝子欠損細胞株は、内在性タンパク質の分解産物であるペプチド断片を細胞膜表面に発現できない。また、代表的なＴＡＰ遺伝子欠損細胞株であるヒトリンパ芽球様細胞株Ｔ２、あるいはＴ２にＨＬＡ分子を遺伝子導入した細胞株（Ｔ２－Ａ１１）のＨＬＡ分子は、細胞膜表面上での発現が非常に不安定である。しかし、外部から供給したペプチドと結合した場合、ＨＬＡ分子は細胞膜表面上で安定化する。この性質を利用して、ＴＡＰ遺伝子欠損細胞株は、ＨＬＡ分子と外部から供給したペプチドの結合性を検証する実験に使用することが可能である。具体的には、ＴＡＰ遺伝子欠損細胞株と改変ペプチドを混合培養後、抗ＨＬＡ抗体で染色し、フローサイトメトリーでＨＬＡ分子の発現強度の変化を算出することで、目的とするＨＬＡ分子と候補ペプチドとの結合性を検討できる。ＴＡＰ遺伝子欠損細胞株が発現するＨＬＡ分子に添加した候補ペプチドが結合した場合、ＨＬＡ分子と候補ペプチドの複合体は細胞膜表面上で安定化し、抗ＨＬＡ抗体で染色した場合、ＨＬＡ分子の発現増強が観察される。一方、添加した候補ペプチドがＨＬＡ分子と結合性を示さない場合は、細胞膜表面上のＨＬＡ分子は不安定であり、抗ＨＬＡ抗体で染色してもＨＬＡ分子の発現増強は確認されない。この様な方法を用いて、候補ペプチドのＨＬＡ分子への結合性を検証することが可能である。
プロテアソームによるタンパク質分解で生じたペプチド断片はＴＡＰ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）分子により小胞体内腔へと導かれ、ＨＬＡ分子に結合し、細胞膜表面へ輸送される。このＴＡＰ分子を欠損した、ＴＡＰ遺伝子欠損細胞株は、内在性タンパク質の分解産物であるペプチド断片を細胞膜表面に発現できない。また、代表的なＴＡＰ遺伝子欠損細胞株であるヒトリンパ芽球様細胞株Ｔ２、あるいはＴ２にＨＬＡ分子を遺伝子導入した細胞株（Ｔ２－Ａ１１）のＨＬＡ分子は、細胞膜表面上での発現が非常に不安定である。しかし、外部から供給したペプチドと結合した場合、ＨＬＡ分子は細胞膜表面上で安定化する。この性質を利用して、ＴＡＰ遺伝子欠損細胞株は、ＨＬＡ分子と外部から供給したペプチドの結合性を検証する実験に使用することが可能である。具体的には、ＴＡＰ遺伝子欠損細胞株と改変ペプチドを混合培養後、抗ＨＬＡ抗体で染色し、フローサイトメトリーでＨＬＡ分子の発現強度の変化を算出することで、目的とするＨＬＡ分子と候補ペプチドとの結合性を検討できる。ＴＡＰ遺伝子欠損細胞株が発現するＨＬＡ分子に添加した候補ペプチドが結合した場合、ＨＬＡ分子と候補ペプチドの複合体は細胞膜表面上で安定化し、抗ＨＬＡ抗体で染色した場合、ＨＬＡ分子の発現増強が観察される。一方、添加した候補ペプチドがＨＬＡ分子と結合性を示さない場合は、細胞膜表面上のＨＬＡ分子は不安定であり、抗ＨＬＡ抗体で染色してもＨＬＡ分子の発現増強は確認されない。この様な方法を用いて、候補ペプチドのＨＬＡ分子への結合性を検証することが可能である。
【0041】
そして、本発明においてこのようにして同定された、キラーエピトープとしては、配列番号：７に記載のアミノ酸配列を含む、ＨＬＡ－Ａ２４拘束性キラーＴ細胞の誘導活性を有するペプチドが挙げられる。また、ヘルパーエピトープとしては、配列番号：３８～４３及び４６のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列（好ましくは、配列番号：４６に記載のアミノ酸配列）を含む、ＨＬＡ－ＤＲ５３拘束性ヘルパーＴ細胞の誘導活性を有するペプチド、配列番号：２９～３３及び４７のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列（好ましくは、配列番号：４７に記載のアミノ酸配列）を含む、ＨＬＡ－ＤＰ２拘束性ヘルパーＴ細胞の誘導活性を有するペプチド、配列番号：５３に記載のアミノ酸配列を含む、ＨＬＡ－ＤＲ１５拘束性ヘルパーＴ細胞の誘導活性を有するペプチドが挙げられる。
【0042】
また、下記表１に示すとおり、これら４種の中から複数種のエピトープペプチドを含むことにより、由来及び／又は種類の異なるＴ細胞を誘導できるという観点から、本発明のエピトープペプチドとして、配列番号：１９、４８～５０、５４及び５５のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列を含むペプチドが好適な例として挙げられる。なお、表１中、ＸはＮ（アスパラギン）又はＹ（チロシン）を表す。
【0043】
【表1】
【0044】
また、本発明においては、このようなエピトープペプチドが２種以上、直接又は適宜スペーサーを介して連結してなる融合ペプチドの形態をとり得る。このような融合ペプチドであっても、後述の実施例に示すとおり、抗原提示細胞内にてプロセシングを受け、生じたエピトープペプチドが当該細胞に提示され、各種Ｔ細胞を誘導し得る。
【0045】
スペーサーとしては、抗原提示細胞内におけるプロセシングに影響を及ぼさないものであれば特に限定されないが、通常、各々のエピトープペプチドとペプチド結合で連結されるリンカーであり、例えば、いくつかのアミノ酸が連結したペプチドリンカーや、両端にアミノ基及びカルボキシル基を有するリンカーが挙げられる。具体的には、グリシンリンカー、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）リンカーが挙げられる。グリシンリンカーとしては、ポリグリシン（例えば、グリシン６個からなるペプチド；ＣａｎｃｅｒＳｃｉ，ｖｏｌ．１０３，ｐ１５０－１５３）等が挙げられる。ＰＥＧリンカーとしては、ＰＥＧの両端にアミノ基及びカルボキシ基を有する化合物由来のリンカーが挙げられる（例えば、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）２－（ＯＣＨ２ＣＨ２）３－ＣＯＯＨ；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００８，４７，７５５１－７５５６）。
【0046】
本発明の融合ペプチドにおいては、同一のエピトープペプチドが複数個連結されていてもよいし、複数の異なるエピトープペプチドが連結されたものであってもよい。当然ながら、２種以上のエピトープペプチドが選択される場合であっても、選択されたエピトープペプチドのうちの１種又は２種以上が複数個連結されてもよい。
【0047】
また、本発明の融合ペプチドにおいては、本発明のエピトープペプチド（すなわち、配列番号：５２に記載のアミノ酸配列における連続した少なくとも５アミノ酸を含み、Ｔ細胞の誘導活性を有する、エピトープペプチド）以外のエピトープペプチドを含んでいてもよい。かかるエピトープペプチドとしては、特に制限はなく、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を対象とするものであってもよく、また異なるウイルスを対象とするものであってもよい。かかる本発明のエピトープペプチド以外のエピトープペプチドとしては、例えば、後述の実施例に示す、ＱＹＩ ９ｍｅｒペプチド（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク １２０８～１２１６位の９アミノ酸からなるペプチド、アミノ酸配列：ＱＹＩＫＷＰＷＹＩ、配列番号：１５）が挙げられる。また、本発明のエピトープペプチド以外のエピトープペプチドについても、同様に複数種及び／又はは複数個のエピトープペプチドが連結されてよい。
【0048】
本発明の融合ペプチドにおいて連結するエピトープペプチドの数としては、特に制限はないが、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個以上（１１個、１２個、１３個、１４個、１５個等）が挙げられる。また、その長さとしては、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸であって、また５００アミノ酸以内、４５０アミノ酸以内、４００アミノ酸以内、３５０アミノ酸以内、３００アミノ酸以内、２５０アミノ酸以内、２００アミノ酸以内、１５０アミノ酸以内、１００アミノ酸以内である。
【0049】
また、本発明のエピトープペプチドは、上述の活性を保持している限り、例えば、配列番号：５２、７、３８～４３、４６、２９～３３、４７、５３、１９、４８～５０、５４及び５５のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されている、ペプチドも本発明に含まれる。アミノ酸配列の置換、欠失、挿入又は付加は、好ましくは１０アミノ酸以内（例えば、９アミノ酸以内、８アミノ酸以内、７アミノ酸以内、６アミノ酸以内）、より好ましくは５アミノ酸以内（例えば、４アミノ酸以内、３アミノ酸以内、２アミノ酸以内）、さらに好ましくは１アミノ酸である。
【0050】
また、このようなアミノ酸の改変目的としては、例えば、
１．ＨＬＡとの親和性を高める為の変更（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｍｅｄ．１９９８；４：３２１－３２７、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ ＪＡ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１：２０９－２１９）、
２．ＴＣＲの認識性を向上させる為の変更（Ｆｏｎｇ Ｌ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００１；９８：８８０９－８８１４、Ｒｉｖｏｌｔｉｎｉ Ｌ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９９；５９：３０１－３０６）、
３．血清中のペプチド分解酵素等による代謝を回避する為の変更（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ ＪＡ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１：２０９－２１９、Ｐａｒｍｉａｎｉ Ｇ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．２００２；９４：８０５－８１８、Ｂｒｉｎｃｋｅｒｈｏｆｆ ＬＨ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．１９９９；８３：３２６－３３４）等が挙げられる。
１．ＨＬＡとの親和性を高める為の変更（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｍｅｄ．１９９８；４：３２１－３２７、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ ＪＡ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１：２０９－２１９）、
２．ＴＣＲの認識性を向上させる為の変更（Ｆｏｎｇ Ｌ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００１；９８：８８０９－８８１４、Ｒｉｖｏｌｔｉｎｉ Ｌ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９９；５９：３０１－３０６）、
３．血清中のペプチド分解酵素等による代謝を回避する為の変更（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ ＪＡ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１：２０９－２１９、Ｐａｒｍｉａｎｉ Ｇ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．２００２；９４：８０５－８１８、Ｂｒｉｎｃｋｅｒｈｏｆｆ ＬＨ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．１９９９；８３：３２６－３３４）等が挙げられる。
【0051】
なお、このようにしてアミノ酸配列を改変したエピトープペプチドが、各種活性を保持しているかは、当業者であれば、上述の候補ペプチド同様に、フォールディングテスト、エピトープペプチド特異的Ｔ細胞の検出、培養細胞株を用いた検討等によって評価することができる。
【0052】
また、上述の目的の為にペプチドのＮ末端又はＣ末端に付加的アミノ酸配列が介在するものも含まれる。さらに、本発明のエピトープペプチドは、糖類、ポリエチレングリコール、脂質等が付加された複合体、放射性同位元素等による誘導体、あるいは重合体等の形態として用いることができる。
【0053】
また、ＨＬＡ分子とエピトープペプチドとの複合体を細胞表面に提示する細胞を、Ｔ細胞が特異的に認識できる範囲内であれば、本発明のエピトープペプチドのＮ末端や遊離のアミノ基には、ホルミル基、アセチル基、ｔ－Ｂｏｃ基等が結合していてもよく、抗原ペプチドのＣ末端や遊離のカルボキシル基には、メチル基、エチル基、ｔ－ブチル基、ベンジル基等が結合していてもよい。
【0054】
また、本発明のエピトープペプチドは、生体内への導入を容易にしうる各種修飾を施されたものであってもよい。生体内への導入を容易にしうる各種修飾の例としては、ＰＴ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）ドメインが有名である。ＨＩＶのＰＴドメインは、Ｔａｔタンパク質の４９～５７番目のアミノ酸（ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、配列番号：６２）で構成されたペプチドである。このＰＴドメインを目的とするタンパク質あるいはペプチドのＮ末端とＣ末端の両方、またはいずれかに付加することで、容易に細胞内に導入できることが報告されている（Ｒｙｕ Ｊ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌｓ．２００３；１６：３８５－３９１、Ｋｉｍ ＤＴ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７；１５９：１６６６－１６６８）。
【0055】
ＨＬＡ分子を介して提示される殆どの抗原は、細胞質内のプロテアソームにより分解された後、ＴＡＰ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）へと移送され、粗面小胞体内においてＴＡＰに会合しているＨＬＡ分子と結合し、ゴルジ装置を経てエクソサイトーシスにより細胞表面へと運搬される。したがって、これら一連の抗原提示経路にて作用するシャペロンであるＨＳＰ（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｔｅｉｎ）７０やＨＳＰ９０、またはｇｐ９６と目的とするペプチドやタンパク質を融合させることで、効率的に抗原提示させることが可能である（Ｂａｓｕ Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００１；１４：３０３－３１３）。
【0056】
また、本発明のエピトープペプチドには、タンパク質の分離精製に有用な精製用タグ（Ｈｉｓタグ等）や、タンパク質の検出に有用なマーカータンパク質（ＧＦＰ等）の様な機能性タンパク質がさらに付加されていたり、またビオチン等の標識化合物が付加されていてもよい。
【0057】
本発明のエピトープペプチドは、当業者であれば、公知の製造方法を適宜用いて調製することができる。かかる公知の製造方法としては、例えば、化学的合成、抗原となるタンパク質（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来Ｓタンパク）の分解、組換えＤＮＡ技術を用いた合成が挙げられる。化学的合成方法の場合、エピトープペプチドは、例えば、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）等の保護基を用いた公知の有機化学的合成法（固相ペプチド合成法等）により製造できる。また、市販の化学合成装置（例えば、アプライドバイオシステムズ社のペプチド合成装置）による合成によっても調製することができる。抗原となるタンパク質の分解による場合、エピトープペプチドは、例えば、当該タンパク質を、プロテアーゼ、ペプチダーゼ等の公知のタンパク質分解酵素で分解することにより製造できる。前記タンパク質の分解条件は、例えば、そのタンパク質の種類、前記タンパク質分解酵素の基質特異性等に応じて適宜設定できる。組換えＤＮＡ技術を用いる場合、エピトープペプチドは、例えば、当該エピトープペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを作製する。そして、この発現ベクターを用いた前記エピトープペプチドの発現系により当該エピトープペプチドを合成し、それを回収（単離、精製等）することにより調製できる。前記発現系は、例えば、前記発現ベクターを宿主に導入することで調製することができる。前記宿主は、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、細菌等の公知の宿主が挙げられる。また、前記組換えＤＮＡ技術を用いる場合、エピトープペプチドは、例えば、エピトープペプチドをコードする核酸と、公知の無細胞翻訳系とを用いて作製してもよい。そして、前記無細胞翻訳系により、前記核酸から翻訳されたエピトープペプチドを回収することにより製造できる。
【0058】
〔ＭＨＣ－モノマー及びその多量体〕
後述の実施例に示すとおり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするＴ細胞の誘導、及びＴ細胞を定量化する上で、本発明のエピトープぺプチドとＨＬＡ分子とからなる複合体、及び当該複合体の多量体は、有用である。また、エピトープペプチドのＨＬＡ分子への結合性を評価する上でも、有用である。よって、本発明は、本発明のエピトープぺプチドとＨＬＡ分子とからなる複合体、及びその多量体（ＭＨＣ－モノマー、及びその多量体）も提供する。なお、ＨＬＡ分子（ＨＬＡクラス１分子及びＨＬＡクラス２分子）については、上述のとおりである。
後述の実施例に示すとおり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするＴ細胞の誘導、及びＴ細胞を定量化する上で、本発明のエピトープぺプチドとＨＬＡ分子とからなる複合体、及び当該複合体の多量体は、有用である。また、エピトープペプチドのＨＬＡ分子への結合性を評価する上でも、有用である。よって、本発明は、本発明のエピトープぺプチドとＨＬＡ分子とからなる複合体、及びその多量体（ＭＨＣ－モノマー、及びその多量体）も提供する。なお、ＨＬＡ分子（ＨＬＡクラス１分子及びＨＬＡクラス２分子）については、上述のとおりである。
【0059】
本発明のエピトープペプチドを含む、ＭＨＣ－モノマー及びその多量体は、例えば、公知の方法（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｕｍｂｅｒ ５，６３５，３６３、Ｆｒｅｎｃｈ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＦＲ９９１１１３３）により調製することができる。より具体的には、タンパク質発現用の遺伝子組換え宿主から精製したＨＬＡ分子と、本発明のエピトープペプチドとの複合体であるＭＨＣ－モノマーをフォールディング溶液内で形成させる。ここで、ＨＬＡ分子のＣ末端には予めビオチン結合部位を付加しておき、ＭＨＣ－モノマー形成後この部位にビオチンを付加する。市販の色素標識されたストレプトアビジンとビオチン化ＭＨＣ－モノマーを所望のモル比（例えば、四量体を形成する場合は、１：４）で混合することによってＭＨＣ－多量体を製造することができる。
【0060】
なお、本発明において、ＭＨＣ－多量体を形成するＭＨＣ－モノマーの数としては特に制限はないが、通常２～１０であり、好ましくは４～８であり、より好ましくは４（ＭＨＣテトラマー試薬）又は５（ＭＨＣペンタマー試薬）であり、特に好ましくは４である。
【0061】
また、ＭＨＣ－多量体と細胞表面タンパク質に対する抗体（例えば、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７やＣＤ４５ＲＡ等に対する抗体）と組み合わせて用いることで、ＣＴＬの分化段階を調べることができる（Ｓｅｄｅｒ ＲＡ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；４：８３５－８４２）。あるいは細胞内サイトカイン染色法と組み合わせることで、ＣＴＬの機能性評価に用いることも可能である。
【0062】
このように特異的なＴ細胞が認識し得るエピトープペプチドを同定し、ＭＨＣ－多量体を製造すれば、特異的なＴ細胞の定量と定性が可能になり、診断情報を得る上で多大な貢献が可能になる。すなわち、本発明は、本発明のＭＨＣ－モノマー又はＭＨＣ－多量体と、被検試料とを反応させる工程を含む、当該試料中のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２に特異的なＴ細胞を検出する方法をも提供する。
【0063】
本発明において「被検試料」とは、特に制限はないが、例えば、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２感染者、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２感染が疑われる者等から分離した、末梢血、Ｂｌｏｏｄ（全血）、ＰＢＭＣ、ＴＩＬ（Ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ：腫瘍組織浸潤性リンパ球）が挙げられる。
【0064】
また「検出」は、本発明のＭＨＣ－モノマー又はＭＨＣ－多量体と結合したＴ細胞（ＣＴＬ、Ｔｈ細胞、ＴＣＲ遺伝子導入細胞）を、標識色素によって染色することにより、または標識色素が付加された本発明のＭＨＣ－モノマー又はＭＨＣ－多量体を用いることにより、フローサイトメーター、顕微鏡等を用いて行なうことができる。
【0065】
〔エピトープペプチドをコードする核酸等〕
本発明には、本発明のエピトープペプチドをコードする核酸、又は当該核酸を含有する発現ベクターも含まれる。
本発明には、本発明のエピトープペプチドをコードする核酸、又は当該核酸を含有する発現ベクターも含まれる。
【0066】
本発明のエピトープペプチドをコードする核酸は、遺伝子組換え技術を用いて、当該エピトープペプチドを宿主内で産生させる為に重要である。この場合、宿主間でアミノ酸コドンの使用頻度（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）が異なる為、産生させる宿主のｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅに適合するようアミノ酸コドンを変更することが望ましい。
【0067】
また、本発明のエピトープペプチドをコードする核酸は、後述のとおり、遺伝子ワクチンとしても重要で、むき出しの核酸として移送することも、適切なウイルス又は細菌ベクターを用いて移送することもできる（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ ＪＡ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００４；１１４：４５０－４６２、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ ＪＡ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ２００４；１１３：１５１５－１５２５）。適切な細菌ベクターとしては、例えばサルモネラ属亜種の細菌由来のベクターが挙げられる。適切なウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、ＥＢＶベクター、ワクシニアベクター、センダイウイルスベクター、レンチウイルスベクターである。適切なワクシニアベクターの１例は、改変ワクシニア・アンカラベクターである。
【0068】
また、本発明のベクターの好ましい態様としては、本発明のエピトープペプチドを発現し得るベクターを例示することができる。該ベクターは、通常、プロモーターの下流に本発明の核酸が機能的に連結された構造のＤＮＡ構築物を担持するベクターである。また、プロモーターの他に、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等の調節配列も有していてもよい。本発明の発現ベクターにおいて、これら調節配列の配置は特に制限されないが、当業者であれば適切に調整し、配置することができる。
【0069】
〔能動免疫ワクチン〕
本発明において「ワクチン」とは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染、発症、重症化等のいずれかを抑制できるものであれば、特に制限はなく、例えば、以下に説明する、ペプチドワクチン、抗原提示細胞を利用したワクチン、遺伝子ワクチンの態様をとり得る。
本発明において「ワクチン」とは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染、発症、重症化等のいずれかを抑制できるものであれば、特に制限はなく、例えば、以下に説明する、ペプチドワクチン、抗原提示細胞を利用したワクチン、遺伝子ワクチンの態様をとり得る。
【0070】
ペプチドワクチン
本発明のエピトープペプチドは、能動免疫療法においてペプチドワクチンとして用いることができる。すなわち、本発明のエピトープペプチドを含んでなるワクチンを患者に投与し、当該ペプチドとＨＬＡ分子との複合体を認識するＴ細胞を体内で増殖させ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療及び予防に役立てることができる。
本発明のエピトープペプチドは、能動免疫療法においてペプチドワクチンとして用いることができる。すなわち、本発明のエピトープペプチドを含んでなるワクチンを患者に投与し、当該ペプチドとＨＬＡ分子との複合体を認識するＴ細胞を体内で増殖させ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療及び予防に役立てることができる。
【0071】
使用するエピトープペプチドは１種のみの使用であっても、あるいはワクチンの使用目的に応じて２種以上（例えば、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上）のエピトープペプチドを混合して用いることができる。また上述のとおり、エピトープペプチドを連結して融合ペプチドの形態にて使用することもできる。
【0072】
抗原提示細胞を利用したワクチン
本発明のエピトープペプチドが提示された抗原提示細胞は、能動免疫療法においてワクチンとして用いることができる。「抗原提示細胞」とは、例えば、樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ある種のＴ細胞等を意味するが、該ペプチドが結合し得るＨＬＡ分子をその細胞表面上に発現する細胞であって、Ｔ細胞を誘導する活性を有するものを意味する。
本発明のエピトープペプチドが提示された抗原提示細胞は、能動免疫療法においてワクチンとして用いることができる。「抗原提示細胞」とは、例えば、樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ある種のＴ細胞等を意味するが、該ペプチドが結合し得るＨＬＡ分子をその細胞表面上に発現する細胞であって、Ｔ細胞を誘導する活性を有するものを意味する。
【0073】
「エピトープペプチドが提示された抗原提示細胞」とは、
１．適当な培養液中で、抗原提示細胞とエピトープペプチドを、例えば３０分から１時間混合して調製したエピトープペプチドパルス抗原提示細胞
２．エピトープペプチドをコードする核酸を用い、遺伝子導入等で抗原提示細胞にエピトープペプチドを提示させた細胞
３．人工的に調製した抗原提示能を有する人工抗原提示細胞
を意味する。「人工的に調製した抗原提示能を有する人工抗原提示細胞」とは、例えば脂質二重膜やプラスティックあるいはラテックス等のビーズに、ＨＬＡ分子とエピトープペプチドとの複合体を固定し、Ｔ細胞を刺激し得るＣＤ８０、ＣＤ８３やＣＤ８６等の共刺激分子を固定するか、若しくは、共刺激分子と結合するＴ細胞側のリガンドであるＣＤ２８等に対してアゴニスティックに作用する抗体等を固定することで調製可能である（Ｏｅｌｋｅ Ｍら，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００３；９：６１９－６２４、Ｗａｌｔｅｒ Ｓら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；１７１：４９７４－４９７８、Ｏｏｓｔｅｎ ＬＥら，Ｂｌｏｏｄ ２００４；１０４：２２４－２２６）。
１．適当な培養液中で、抗原提示細胞とエピトープペプチドを、例えば３０分から１時間混合して調製したエピトープペプチドパルス抗原提示細胞
２．エピトープペプチドをコードする核酸を用い、遺伝子導入等で抗原提示細胞にエピトープペプチドを提示させた細胞
３．人工的に調製した抗原提示能を有する人工抗原提示細胞
を意味する。「人工的に調製した抗原提示能を有する人工抗原提示細胞」とは、例えば脂質二重膜やプラスティックあるいはラテックス等のビーズに、ＨＬＡ分子とエピトープペプチドとの複合体を固定し、Ｔ細胞を刺激し得るＣＤ８０、ＣＤ８３やＣＤ８６等の共刺激分子を固定するか、若しくは、共刺激分子と結合するＴ細胞側のリガンドであるＣＤ２８等に対してアゴニスティックに作用する抗体等を固定することで調製可能である（Ｏｅｌｋｅ Ｍら，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００３；９：６１９－６２４、Ｗａｌｔｅｒ Ｓら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；１７１：４９７４－４９７８、Ｏｏｓｔｅｎ ＬＥら，Ｂｌｏｏｄ ２００４；１０４：２２４－２２６）。
【0074】
遺伝子ワクチン
本発明のエピトープペプチドをコードする核酸は、能動免疫療法においてＤＮＡワクチンや組換えウイルスベクターワクチン等に用いることができる。この場合、エピトープペプチドの核酸配列は、組換えワクチンや、組換えウイルスワクチンを産生させる宿主に適合したｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅに変更することが望ましい（Ｃａｓｉｍｉｒｏ，Ｄ．Ｒ．ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００３；７７：６３０５－６３１３、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ ＪＡ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００４；１１４：４５０－４６２）。
本発明のエピトープペプチドをコードする核酸は、能動免疫療法においてＤＮＡワクチンや組換えウイルスベクターワクチン等に用いることができる。この場合、エピトープペプチドの核酸配列は、組換えワクチンや、組換えウイルスワクチンを産生させる宿主に適合したｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅに変更することが望ましい（Ｃａｓｉｍｉｒｏ，Ｄ．Ｒ．ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００３；７７：６３０５－６３１３、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ ＪＡ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００４；１１４：４５０－４６２）。
【0075】
また、本発明のエピトープペプチドをコードする核酸は、ＲＮＡワクチンとして用いることができる。この場合、ＲＮＡはプロタミン等のカチオン性ペプチドと複合体を形成し、ＲＮａｓｅから保護される態様をとり得る。また、デリバリーの観点から、脂質ナノ粒子（ＰＥＧ化脂質ナノ粒子等）、リポソーム等でカプセル化する態様や、ＲＮＡウイルス（レトロウイルス、レンチウイルス、アルファウイルス、ラブドウイルス等）をウイルスベクターとして用いる態様もとり得る。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）との反応性や抗原ペプチドの産生という観点から、修飾核酸（シュードウリジン、１メチルシュードウリジン等）への置換を導入しうる。また、Ａｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ（ＡＲＣＡ）法を用いたＲＮＡへのＣＡＰ構造の付加、２’－Ｏメチルトランスフェラーゼ処理によるＣａｐ０からＣａｐ１構造への置換も、本発明の核酸（ＲＮＡ）において適宜用いうる。
【0076】
〔受動免疫療法剤〕
本発明のエピトープペプチドは、受動免疫療法剤の調製に用いることができる。すなわち、本発明のエピトープペプチドを用い、下記のようにしてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするＴ細胞を調製し、また必要に応じて純度を高める為に精製し、さらに当該細胞をヒトアルブミン含有ＰＢＳ等に懸濁させることによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する受動免疫療法剤とすることができる。
本発明のエピトープペプチドは、受動免疫療法剤の調製に用いることができる。すなわち、本発明のエピトープペプチドを用い、下記のようにしてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするＴ細胞を調製し、また必要に応じて純度を高める為に精製し、さらに当該細胞をヒトアルブミン含有ＰＢＳ等に懸濁させることによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する受動免疫療法剤とすることができる。
【0077】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするＴ細胞は、例えば、
（１）本発明のエピトープペプチド、該ペプチドとＨＬＡ分子との複合体、該複合体の多量体、又は前記複合体を表面上に提示する抗原提示細胞により、単核球を刺激させる工程を含む方法、又は
（２）本発明のエピトープペプチドとＨＬＡ分子との複合体又は該複合体の多量体と、単核球とを反応させ、前記複合体又は前記多量体にＴ細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体からＴ細胞を単離する工程を含む方法
によって、製造することができる。
（１）本発明のエピトープペプチド、該ペプチドとＨＬＡ分子との複合体、該複合体の多量体、又は前記複合体を表面上に提示する抗原提示細胞により、単核球を刺激させる工程を含む方法、又は
（２）本発明のエピトープペプチドとＨＬＡ分子との複合体又は該複合体の多量体と、単核球とを反応させ、前記複合体又は前記多量体にＴ細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体からＴ細胞を単離する工程を含む方法
によって、製造することができる。
【0078】
本発明において「単核球」とはリンパ球及び単球を意味し、例えば、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、臍帯血単核球の態様が挙げられる。
【0079】
本発明のエピトープペプチド等による単核球への「刺激」とは、例えば、単核球を培養している培地中に、本発明のエピトープペプチド等を添加することにより行うことができる。また、本発明のエピトープペプチドを固相化したプレートにて、単核球を培養することによって行ってもよい。また、利用し得る抗原提示細胞としては、本発明のエピトープペプチドが結合し得るＨＬＡをその表面上に発現している細胞であればよく、例えば、樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージが挙げられる。また、本発明にかかる抗原提示細胞としては、単核球を刺激する前に、Ｘ線照射やマイトマイシン処理等により、増殖能を喪失させたものであってもよい。
【0080】
単核球を刺激する際の条件としては、単核球等の維持に好適であればよく、例えば、単核球等を維持するために利用される培地（例えば、ＡＩＭ－Ｖ培地）にて、３７℃、５％ＣＯ２、１～７日間にて培養することが挙げられる。また当該インキュベーションの際に、培地には、Ｔ細胞を刺激するという観点から、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＰＨＡ、抗ＣＤ３抗体、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１２、抗ＩＬ－４抗体又はこれらの組み合わせを培地に添加してもよい。さらに、種々のサイトカインを産生させることにより免疫応答を増強させるという観点から、ピシバニール（ＯＫ－４３２）、ＣｐＧ ＤＮＡ等のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のアゴニスト等を培地に添加してもよい。また、この抗原提示細胞と単核球とのインキュベーションは、受動免疫療法に必要なＴ細胞数を確保するため、複数回繰り返してもよい。
【0081】
また、前記複合体又は該複合体の多量体と単核球との反応の条件としては、前記刺激の際同様に、単核球等の維持に好適であればよい。また、そのように反応して形成させた結合体からのＴ細胞の単離については、特に制限はなく、前記複合体又は該複合体の多量体に標識物質（標識色素等）を付加し、それをセルソーター、顕微鏡等を用いて検出することにより行なうことができる。また、前記複合体又は該複合体の多量体を担体（プレート等）に固定することにより、前記反応の後、当該担体を洗浄することにより、Ｔ細胞を単離することもできる。
【0082】
さらに、後述の実施例に示すとおり、このようにして製造されたＴ細胞には、本発明のエピトープペプチド特異的にサイトカインを産生するＣＤ４＋Ｔ細胞（抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞）及び／又は本発明のエピトープペプチド特異的にサイトカインを産生するＣＤ８＋Ｔ細胞（抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞）が含まれている。かかるＴ細胞を精製する方法としては、例えば、本発明のエピトープペプチドを固相化した担体等を用いて分離することができる。さらに、かかるＴ細胞は、分泌されるサイトカインを指標として精製することもできる。すなわち、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－４等のサイトカインを産生するので、これらに対する抗体を用いたフロサイトメトリー、アフィニティクロマトグラフィー、磁気ビーズ精製法により精製することができる。一方、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α等のサイトカインを産生するので、これらに対する抗体を用いたフロサイトメトリー、アフィニティクロマトグラフィー、磁気ビーズ精製法により精製することができる。
【0083】
また、かかるＴ細胞は、各Ｔ細胞の細胞表面に発現しているタンパク質に対する抗体を用いたフローサイトメトリー、アフィニティクロマトグラフィー、磁気ビーズ精製法により精製することができる。抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞表面に発現しているタンパク質としては、ＣＤ２９、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ等が挙げられ、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞表面に発現しているタンパク質としては、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ６３、ＣＤ６９等が挙げられる。
【0084】
さらに、ＣＴＬに関しては、より具体的に、以下のような調製方法、精製方法を例示することができる。
【0085】
〔ＣＴＬ調製方法〕
ＣＴＬ調製方法１
ＰＢＭＣと、適当な濃度の本発明のＭＨＣ－多量体を反応させる。ＭＨＣ－多量体と結合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＣＴＬは標識色素により染色されるので、セルソーター、顕微鏡等を用いて染色されたＣＴＬのみを単離する。このようにして単離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＣＴＬは、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＩＬ－２等のＴ細胞刺激薬剤や、Ｘ線照射あるいはマイトマイシン処理等で増殖能を損失させた抗原提示細胞で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
ＣＴＬ調製方法１
ＰＢＭＣと、適当な濃度の本発明のＭＨＣ－多量体を反応させる。ＭＨＣ－多量体と結合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＣＴＬは標識色素により染色されるので、セルソーター、顕微鏡等を用いて染色されたＣＴＬのみを単離する。このようにして単離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＣＴＬは、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＩＬ－２等のＴ細胞刺激薬剤や、Ｘ線照射あるいはマイトマイシン処理等で増殖能を損失させた抗原提示細胞で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
【0086】
ＣＴＬ調製方法２
本発明のＭＨＣ－モノマー及び／又はＭＨＣ－多量体を無菌プレート等に固相化し、ＰＢＭＣを当該固相化プレートで培養する。プレートに固相化されたＭＨＣ－モノマー及び／又はＭＨＣ－多量体に結合したＣＴＬを単離するためには、結合せずに浮遊している他の細胞を洗い流した後に、プレート上に残ったＣＴＬだけを新しい培地に懸濁する。このようにして単離されたＣＴＬは、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＩＬ－２等のＴ細胞刺激薬剤や、Ｘ線照射あるいはマイトマイシン処理等で増殖能を損失させた抗原提示細胞で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
本発明のＭＨＣ－モノマー及び／又はＭＨＣ－多量体を無菌プレート等に固相化し、ＰＢＭＣを当該固相化プレートで培養する。プレートに固相化されたＭＨＣ－モノマー及び／又はＭＨＣ－多量体に結合したＣＴＬを単離するためには、結合せずに浮遊している他の細胞を洗い流した後に、プレート上に残ったＣＴＬだけを新しい培地に懸濁する。このようにして単離されたＣＴＬは、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＩＬ－２等のＴ細胞刺激薬剤や、Ｘ線照射あるいはマイトマイシン処理等で増殖能を損失させた抗原提示細胞で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
【0087】
ＣＴＬ調製方法３
本発明のＭＨＣ－モノマー及び／又はＭＨＣ－多量体と、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６等の共刺激分子、若しくは、共刺激分子と結合するＴ細胞側のリガンドであるＣＤ２８に対してアゴニスティックに作用する抗体等を無菌プレート等に固相化し、ＰＢＭＣを固相化プレートで培養する。そして、例えば、２日後にＩＬ－２を培地に添加し５％ ＣＯ２恒温槽にて３７℃で７～１４日培養する。培養した細胞を回収し新たな固相化プレート上で培養を続ける。この操作を繰り返すことで受動免疫療法に必要な細胞数のＣＴＬを確保する。
本発明のＭＨＣ－モノマー及び／又はＭＨＣ－多量体と、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６等の共刺激分子、若しくは、共刺激分子と結合するＴ細胞側のリガンドであるＣＤ２８に対してアゴニスティックに作用する抗体等を無菌プレート等に固相化し、ＰＢＭＣを固相化プレートで培養する。そして、例えば、２日後にＩＬ－２を培地に添加し５％ ＣＯ２恒温槽にて３７℃で７～１４日培養する。培養した細胞を回収し新たな固相化プレート上で培養を続ける。この操作を繰り返すことで受動免疫療法に必要な細胞数のＣＴＬを確保する。
【0088】
ＣＴＬ調製方法４
ＰＢＭＣあるいはＴ細胞を本発明のエピトープペプチドで直接刺激するか、該ペプチドをパルスした抗原提示細胞、遺伝子導入した抗原提示細胞、又は人工的に調製した抗原提示能を有する人工抗原提示細胞で刺激する。そして、例えば、刺激によって誘導されたＣＴＬを５％ ＣＯ２恒温槽にて３７℃で７～１４日培養する。エピトープペプチドとＩＬ－２、又は抗原提示細胞とＩＬ－２による刺激を週に１度繰り返すことで受動免疫療法に必要な細胞数のＣＴＬを確保する。
ＰＢＭＣあるいはＴ細胞を本発明のエピトープペプチドで直接刺激するか、該ペプチドをパルスした抗原提示細胞、遺伝子導入した抗原提示細胞、又は人工的に調製した抗原提示能を有する人工抗原提示細胞で刺激する。そして、例えば、刺激によって誘導されたＣＴＬを５％ ＣＯ２恒温槽にて３７℃で７～１４日培養する。エピトープペプチドとＩＬ－２、又は抗原提示細胞とＩＬ－２による刺激を週に１度繰り返すことで受動免疫療法に必要な細胞数のＣＴＬを確保する。
【0089】
なお、後述の実施例において示す通り、本発明のエピトープペプチドで直接刺激する場合において、当該ペプチドとＰＢＭＣとを、培地中で接触させることが好ましく、血漿を含む培地中で接触させることがより好ましい。ＣＴＬを調製する際の培地としては特に制限はなく、公知の培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地）を適宜用いることができる。また、培地中の血漿の濃度は、１～１０％であることが好ましく、３～１０％であることがより好ましく、５～１０％であることがさらに好ましく、長期間の培養において十分な血漿量を確保し易いという観点から、５％であることが特に好ましい。
【0090】
［ＣＴＬの精製法］
ＣＴＬ調製方法において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするＣＴＬの割合が低い場合は、随時以下の方法を用いることで当該ＣＴＬを高純度で回収することが可能である。
ＣＴＬ調製方法において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするＣＴＬの割合が低い場合は、随時以下の方法を用いることで当該ＣＴＬを高純度で回収することが可能である。
【0091】
ＭＨＣ－多量体による精製
本発明のＭＨＣ－モノマー及び／又はＭＨＣ－多量体と、ＣＴＬ調製方法にて誘導されたＣＴＬを反応させ、ＭＨＣ－モノマー及び／又はＭＨＣ－多量体を標識している標識色素に対する抗体等を磁気標識した２次抗体を用いて分離することが可能である。このような磁気標識した２次抗体と、磁気標識細胞分離装置は、例えばＤｙｎａｌ社やＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ社から入手可能である。このようにして単離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするＣＴＬは、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＩＬ－２等のＴ細胞刺激薬剤で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
本発明のＭＨＣ－モノマー及び／又はＭＨＣ－多量体と、ＣＴＬ調製方法にて誘導されたＣＴＬを反応させ、ＭＨＣ－モノマー及び／又はＭＨＣ－多量体を標識している標識色素に対する抗体等を磁気標識した２次抗体を用いて分離することが可能である。このような磁気標識した２次抗体と、磁気標識細胞分離装置は、例えばＤｙｎａｌ社やＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ社から入手可能である。このようにして単離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするＣＴＬは、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＩＬ－２等のＴ細胞刺激薬剤で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
【0092】
分泌されるサイトカインによる精製
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするＣＴＬが、放出するサイトカイン等を利用して、当該ＣＴＬを精製することができる。例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ社から入手可能なキットを用いることで、ＣＴＬから放出されるサイトカインを細胞表面で特異抗体により捕捉し、抗サイトカイン標識抗体で染色し、続いて磁気標識した標識物質特異的な抗体で反応させた後、磁気標識細胞分離装置を用いて精製することも可能である。このようにして単離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするＣＴＬは、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＩＬ－２等のＴ細胞刺激薬剤で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするＣＴＬが、放出するサイトカイン等を利用して、当該ＣＴＬを精製することができる。例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ社から入手可能なキットを用いることで、ＣＴＬから放出されるサイトカインを細胞表面で特異抗体により捕捉し、抗サイトカイン標識抗体で染色し、続いて磁気標識した標識物質特異的な抗体で反応させた後、磁気標識細胞分離装置を用いて精製することも可能である。このようにして単離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするＣＴＬは、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＩＬ－２等のＴ細胞刺激薬剤で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
【0093】
細胞表面タンパク質特異的抗体を用いた精製
ＣＴＬの細胞表面では、特異的刺激により発現が増強する細胞表面タンパク質（例えばＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ６３、ＣＤ６９等）が報告されている（Ｂｅｔｔｓ ＭＲら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００３；２８１：６５－７８、Ｔｒｉｍｂｌｅ ＬＡら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０００；７４：７３２０－７３３０）。このような細胞表面タンパク質に対する特異抗体を磁気標識することで、磁気分離装置等を用いてＣＴＬを精製することが可能である。また、このような抗体に対する抗ＩｇＧ抗体等を磁気標識することでも同様にＣＴＬの精製が可能である。あるいは、これら抗体を培養用のプラスティックプレートにコートし、このプレートを用いて刺激を加えたＰＢＭＣを培養し、プレートに結合しなかった細胞集団を洗い流すことでＣＴＬを精製することも可能である。このようにして単離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするＣＴＬは、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＩＬ－２等のＴ細胞刺激薬剤で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する（ＷＯ２００８／０２３７８６ 参照のほど）。
ＣＴＬの細胞表面では、特異的刺激により発現が増強する細胞表面タンパク質（例えばＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ６３、ＣＤ６９等）が報告されている（Ｂｅｔｔｓ ＭＲら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００３；２８１：６５－７８、Ｔｒｉｍｂｌｅ ＬＡら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０００；７４：７３２０－７３３０）。このような細胞表面タンパク質に対する特異抗体を磁気標識することで、磁気分離装置等を用いてＣＴＬを精製することが可能である。また、このような抗体に対する抗ＩｇＧ抗体等を磁気標識することでも同様にＣＴＬの精製が可能である。あるいは、これら抗体を培養用のプラスティックプレートにコートし、このプレートを用いて刺激を加えたＰＢＭＣを培養し、プレートに結合しなかった細胞集団を洗い流すことでＣＴＬを精製することも可能である。このようにして単離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするＣＴＬは、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＩＬ－２等のＴ細胞刺激薬剤で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する（ＷＯ２００８／０２３７８６ 参照のほど）。
【0094】
なお、このようにして調製したＣＴＬ細胞の細胞傷害性活性は、例えば、蛍光色素ＣＦＳＥ（同仁化学社）で標的細胞を標識するＩＭＭＵＮＯＣＹＴＯ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＭＢＬ社）や、標的細胞から放出されるＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）を測定するＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社）等を利用して測定することも可能である。また、放射性同位元素である５１Ｃｒで標的細胞を標識して利用するクロムリリースアッセイにより測定することが可能である。
【0095】
［Ｔ細胞誘導キット］
本発明においては、上述の様々な方法において有用な、本発明のエピトープペプチドを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導するためのキットも提供される。
本発明においては、上述の様々な方法において有用な、本発明のエピトープペプチドを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導するためのキットも提供される。
【0096】
かかるキットにおいては、本発明のエピトープペプチドは、ＭＨＣ－モノマー、ＭＨＣ－多量体、当該ペプチドが提示された抗原提示細胞の態様にて含まれていてもよい。また、本発明のエピトープペプチドの他、当該ペプチドと反応させる単核球（ＰＢＭＣ等）、当該ペプチドを検出するための試薬（色素、２次抗体）を、本発明のキットに含めてもよく、さらに、単核球又は誘導されたＴ細胞を培養するための培地、Ｔ細胞を増幅するためのＴ細胞刺激薬剤等を含んでいてもよい。
【0097】
［本発明のエピトープペプチド等を含む医薬組成物、及びその利用］
上述の通り、本発明のエピトープペプチド、当該ペプチドをコードする核酸、及び当該ペプチドが提示された抗原提示細胞は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に対する能動免疫療法において有用である。また、前記抗原提示細胞等によって誘導されたＴ細胞は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に対する受動免疫療法において有用である。したがって、本発明は、本発明のエピトープペプチド等を含む医薬組成物（薬剤）も提供する。
上述の通り、本発明のエピトープペプチド、当該ペプチドをコードする核酸、及び当該ペプチドが提示された抗原提示細胞は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に対する能動免疫療法において有用である。また、前記抗原提示細胞等によって誘導されたＴ細胞は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に対する受動免疫療法において有用である。したがって、本発明は、本発明のエピトープペプチド等を含む医薬組成物（薬剤）も提供する。
【0098】
本発明の医薬組成物の治療又は予防の対象となる「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症」とは、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）とも称され、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶ）に属するコロナウイルスであり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＳＡＲＳコロナウイルス２、ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２）を病因とするものである。
【0099】
本発明において、「治療」には、感染症からの完全な回復のみならず、その症状を緩和又は改善し、その進行を抑制することが含まれる。「予防」には、感染の抑制若しくは遅延、又は発症の抑制若しくは遅延が含まれる。
【0100】
また、本発明の医薬組成物に含まれる細胞（抗原提示細胞、Ｔ細胞）は、各々独立して、当該組成物が投与される対象に由来するもの（自家）であってもよく、また前記対象とＨＬＡの型が適合する同種異系の関係でもあってもよい。
【0101】
本発明の医薬組成物は、本発明のエピトープペプチド、細胞に、これらの作用を阻害しない範囲で、医薬の製剤化のために一般的に利用される種々の賦形剤や他の医薬活性成分等を含んでいてもよく、当分野において公知の方法を用いて製剤化することができる。例えば、かかる医薬組成物としては、本発明のエピトープペプチドを有効成分として含有する注射剤又は固形剤等がある。エピトープペプチドは、中性又は塩の形態で処方することができ、例えば、薬学上許容され得る塩としては、塩酸、リン酸等の無機塩、又は、酢酸、酒石酸等の有機酸が挙げられる。また、本発明の抗原提示細胞又はＴ細胞は、製薬上許容され、該ペプチド又は該細胞の活性と相容性を有する賦形剤、例えば、水、食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール、液体培地、ＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）、及びその他のアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム、ＫＬＨ、ＭＰＬ、ＱＳ２１、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、ＢＣＧ、ミョウバン、ＣｐＧ ＤＮＡ等のＴＬＲのアゴニスト）等、又はこれらの組み合わせと混合して用いることができる。さらに、必要に応じて、アルブミン、湿潤剤、乳化剤等の補助剤を添加してもよい。また、上記アジュバント以外にも、免疫増強剤として、各種サイトカイン（例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮω、Ｆｌｔ３リガンド）を添加してもよい。
【0102】
本発明の医薬組成物は、非経口投与及び経口投与により投与することができるが、一般的には非経口投与が好ましい。非経口投与としては経鼻投与や皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、静脈内注射、患部局所注射等の注射剤、座薬等がある。また、経口投与としては、スターチ、マンニトール、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、セルロース等の賦形剤との混合物として調製することができる。
【0103】
本発明の医薬組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療又は予防に用いられる公知の薬剤と併用してもよい。かかる公知の薬剤として、治療の観点からは、例えば、抗ＩＬ６抗体、副腎皮質ステロイド、抗ウイルス剤（ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤等）が挙げられる。また予防の観点からは、例えば、他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスワクチン、他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＮＡワクチン、他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＤＮＡワクチン、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質ワクチン、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２弱毒ワクチンが挙げられる。さらに、インターフェロン（ＩＦＮ）製剤との併用も挙げられる。
【0104】
本発明の医薬組成物は、通常ヒトを対象として使用するものだが、他の動物（種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物等）も対象となり得る。また、本発明の医薬組成物を投与される対象としては特に制限されることなく、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を罹患しているもののみならず、罹患していないもの（未感染）であってもよく、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症から既に回復しているものであってもよい。例えば、本発明の医薬組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の症状（発熱、咳嗽、味覚異常、嗅覚異常等）が認められた時点、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者との濃厚接触が確認された時点において、投与され得る。
【0105】
本発明の医薬組成物は、治療上有効な量で投与する。投与される量は、治療対象、免疫系に依存し、必要とする投与量は臨床医の判断により決定される。通常、適当な投与量は、患者一人当たり、エピトープペプチドは１～１００ｍｇ、当該ペプチドが提示された抗原提示細胞又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするＴ細胞では１０６～１０９個の含有量とする。また、投与間隔は、対象、目的により設定することができる。
【0106】
また、免疫寛容機構によるＣＴＬの免疫学的不応答性を解除するという観点から、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体等の免疫チェックポイント阻害剤を併用することも、必要に応じて行うこともできる。
【0107】
本発明は、このように、本発明の医薬組成物を対象に投与させることを特徴とする、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療又は予防するための方法をも提供する。
【0108】
本発明の医薬組成物の製品又はその説明書は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療又は予防に用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品又は説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装等に表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物等に表示を付したことを意味する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療又は予防に用いられる旨の表示においては、本発明のエピトープポリペプチド、該ペプチドが提示された抗原提示細胞、又は前記抗原提示細胞等によって誘導されたＴ細胞によって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の抑制、当該ウイルス及びそれに感染した細胞の溶解等が誘導される機序についての情報を含むことができる。
【実施例0109】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、特に断りがない限り、実験方法は、例えば「免疫実験操作法」、編集：右田俊介、紺田進、本庶佑、濱岡利之、に記載の方法等、当該技術分野において通常用いられる方法を用いた。
【0110】
〔ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的Ｔ細胞エピトープ候補ペプチドの選択〕
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的Ｔ細胞エピトープ候補ペプチドの選択は、スパイク（Ｓ）タンパク（ＧＥＮＢＡＮＫ：ＱＨＤ４３４１６．１）のアミノ酸配列を対象として行なった。Ｓタンパクは全長１２７３個のアミノ酸で構成されるタンパク質であり、アイソフォームの報告はない。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的Ｔ細胞エピトープ候補ペプチドの選択は、スパイク（Ｓ）タンパク（ＧＥＮＢＡＮＫ：ＱＨＤ４３４１６．１）のアミノ酸配列を対象として行なった。Ｓタンパクは全長１２７３個のアミノ酸で構成されるタンパク質であり、アイソフォームの報告はない。
【0111】
具体的には、ＨＬＡ－Ａ２４分子に対して結合モチーフを有する８～１０個のアミノ酸よりなるＴ細胞エピトープ候補ペプチドを検索し得る、インターネット上に公開されているソフトウェアに照合して実施した。その結果、下記表２に示すとおり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のアミノ酸配列よりＨＬＡ－Ａ２４分子の結合モチーフを有する９個のアミノ酸よりなるエピトープ候補ペプチドを、合計１５種類選択し、これらのペプチドを常法に従って化学合成した。
【0112】
【表2】
【0113】
また、下記表３に示すとおり、陽性コントロール用のペプチドとして、ＥＢＶ ＬＭＰ２抗原由来のＨＬＡ－Ａ２４拘束性エピトープペプチド（ＰＹＬＦＷＬＡＡＩ、配列番号：１６）を合成した。陰性コントロール用のペプチドとして、ＥＢＶ ＬＭＰ２抗原由来のＨＬＡ－Ａ１１拘束性エピトープペプチド（ＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ、配列番号：１７）を合成した。
【0114】
【表3】
【0115】
そして、これらのエピトープペプチドを、後述の各種評価試験に供した。なお、表２及び表３において、「ペプチド名」は合成したペプチドのＮ末端側から３つのアミノ酸配列及び構成するアミノ酸数で示す。表２及び表３における「位置」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来Ｓタンパク及びＥＢＶ ＬＭＰ２タンパク質の各アミノ酸配列上における各々の位置を示す。表２及び表３における「スコア」は、解析に用いたＮｅｔＭＨＣｃｏｎｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣｃｏｎｓ）で算出されたスコアを示した。このスコアは、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２とペプチドとの親和性を予測する数値で、スコアが高い程、ＨＬＡとペプチドが安定した複合体を形成する可能性があることを意味する。
【0116】
〔候補ペプチドのフォールディング試験〕
本発明者らは、表２及び表３に記載した１７種類のペプチドを用いてフォールディング試験を実施した。具体的には、大腸菌発現系を利用して発現精製したＨＬＡ－Ａ*２４：０２及びβ2－ミクログロブリンと、前述の各種合成ペプチドとを、フォールディング溶液に添加して混合した後、当該溶液を経時的に分取してゲル濾過カラムにて分析を行った。なお、フォールディング溶液の組成は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、４００ｍＭ アルギニン、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＧＳＨ、０．５ｍＭ ＧＳＳＧ（Ｄｏｎｇｌｉａｎｇ Ｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．、２０１９年４月；１１０（４）：１１５６－１１６８ 参照）。
本発明者らは、表２及び表３に記載した１７種類のペプチドを用いてフォールディング試験を実施した。具体的には、大腸菌発現系を利用して発現精製したＨＬＡ－Ａ*２４：０２及びβ2－ミクログロブリンと、前述の各種合成ペプチドとを、フォールディング溶液に添加して混合した後、当該溶液を経時的に分取してゲル濾過カラムにて分析を行った。なお、フォールディング溶液の組成は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、４００ｍＭ アルギニン、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＧＳＨ、０．５ｍＭ ＧＳＳＧ（Ｄｏｎｇｌｉａｎｇ Ｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．、２０１９年４月；１１０（４）：１１５６－１１６８ 参照）。
【0117】
ゲル濾過カラム分析では、ＨＬＡ－Ａ*２４：０２及びβ2－ミクログロブリンと、前記合成ペプチドとの３者複合体（ＨＬＡ－モノマー）の形成が認められる場合、ＨＬＡ－モノマーは原料よりも分子量が大きいため、ゲル濾過カラム分析での溶出時間が早くなる。また、ＨＬＡ－モノマー形成量は、２８０ｎｍの吸収波長によって得られるピーク面積から算出可能である。一方、ＨＬＡ分子との結合性を有さない合成ペプチドではＨＬＡ－モノマー形成が殆ど検出されないことになる。ＨＬＡ－モノマー形成が認められる場合の代表的なゲル濾過カラム分析例を図１に示す。また、各種合成ペプチドに対して実施したフォールディング経過７日後のゲル濾過カラムによる分析結果として、ＨＬＡ－モノマー形成を示すピーク面積を図２に示す。
【0118】
なお、ＨＬＡ分子及びβ2－ミクログロブリンは、大腸菌発現系を利用して発現精製する際に、封入体として不溶性分画を精製した後、８Ｍ尿素に可溶化させている。この点に関し、ゲル濾過カラム分析の結果では、図１に示すとおり、ＨＬＡ－モノマー形成に至らないものが凝集体として７～８分に検出される。次に、ＨＬＡ－モノマーのピークが１０分前後に検出され、β２－ミクログロブリンは１４分付近に検出される。１５分以降にはフォールディング溶液の成分やペプチドが検出されることになる。
【0119】
そして、前記ゲル濾過カラム分析の結果、図２に示すとおり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の候補ペプチド（配列番号：１～１５）は、陰性コントロールと比較して、十分なＨＬＡ－モノマー形成、すなわちＨＬＡ分子との結合性を有することが明らかになった。
【0120】
〔ＨＬＡ－テトラマー試薬の作製、及びペプチド交換率の測定〕
上記１５種類の候補ペプチドを対象に、Ｑｕｉｃｋｓｗｉｔｃｈ Ｑｕａｎｔテトラマー合成キット（ＭＢＬ社）を用いてペプチド交換反応を行い、ＨＬＡ－テトラマー試薬を調製した。
上記１５種類の候補ペプチドを対象に、Ｑｕｉｃｋｓｗｉｔｃｈ Ｑｕａｎｔテトラマー合成キット（ＭＢＬ社）を用いてペプチド交換反応を行い、ＨＬＡ－テトラマー試薬を調製した。
【0121】
簡潔に説明すると、キットに含まれるＨＬＡ－テトラマー分子には構造を維持するために低親和性のＥｘｉｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅが結合している。そこに、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｆａｃｔｏｒの存在下、目的のペプチドを加え、Ｅｘｉｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅとの交換反応を行った。そして、その４時間後に、ＨＬＡ－テトラマー試薬を回収した。
【0122】
また、前記キットには、ＨＬＡ上に結合しているＥｘｉｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅを検出する抗体（ＦＩＴＣ標識）が含まれている。前記ペプチド交換反応終了後、テトラマー分子を専用粒子に吸着させ、さらに当該抗体を反応させることによって、フローサイトメトリーによるＦＩＴＣ蛍光強度（ＭＦＩ）を計測し、そのＭＦＩ値からペプチド交換率を算出することができる。
【0123】
図３に、代表的な測定結果として、目的のペプチドがＮＹＮペプチドである場合の、ペプチド交換後のテトラマー分子のＦＩＴＣ蛍光強度及びペプチド交換前のそれと、前記専用粒子のみのＦＩＴＣ蛍光強度とをフローサイトメーターで解析した結果を示す。
【0124】
なお、粒子のみのサンプルでは、Ｅｘｉｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅの存在比率が０％のため、この時のペプチド交換率は１００％となる。一方、ペプチド交換前のテトラマー分子におけるＥｘｉｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅの存在比率は１００％となるため、その時のペプチド交換率は０％である。ＭＦＩ値を用いて検量線を引くことにより、目的のペプチドとＥｘｉｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅとの交換率を計算することができ、ペプチドとＨＬＡとの親和性を示すことができる。
【0125】
そして、１５種類の候補ペプチドについてペプチド交換率を測定した結果、図４に示すとおり、いずれの候補ペプチドも、Ｅｘｉｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅより親和性が高く、目的とするＨＬＡ－テトラマーを調製することができた。
【0126】
なお、このようにして作製したＨＬＡ－テトラマー試薬は、例えば、Ａ２４－ＮＹＮ－ｔｅｔｒａｍｅｒと略号で示すが、これは、ＮＹＮ ９ｍｅｒペプチドを用いて作製されたＨＬＡ－テトラマー試薬であることを示す。
【0127】
〔細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）誘導〕
ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２を保持しているドナー２名から末梢血を採取し、３，０００ｒｐｍで５～１０分間遠心処理して上清の血漿部分を除去した。血漿部分以外から、密度勾配遠心法にて末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離した。そして、ＰＢＭＣ １～３×１０６個を、ＣＴＬ誘導用培地１～２．５ｍＬに浮遊させた。
ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２を保持しているドナー２名から末梢血を採取し、３，０００ｒｐｍで５～１０分間遠心処理して上清の血漿部分を除去した。血漿部分以外から、密度勾配遠心法にて末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離した。そして、ＰＢＭＣ １～３×１０６個を、ＣＴＬ誘導用培地１～２．５ｍＬに浮遊させた。
【0128】
なお、ＣＴＬ誘導用培地として、Ｈｅｐｅｓ改変ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社）に２－メルカプトエタノール（最終濃度５５μＭ）、Ｌ－グルタミン（最終濃度２ｍＭ）、抗生物質としてストレプトマイシン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）及びペニシリンＧ（最終濃度１００Ｕ／ｍＬ）、並びに５％の血漿成分を加えた培地を使用した（なお、これ以外にインスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、ピルビン酸、ヒト血清アルブミン、非必須アミノ酸溶液等を加えてもよい）。
【0129】
前記ＰＢＭＣを含むＣＴＬ誘導用培地に、配列番号：１～５に記載のアミノ酸配列から各々なるペプチドの群（グループ１）、配列番号：６～１０に記載のアミノ酸配列から各々なるペプチドの群（グループ２）及び配列番号：１１～１５に記載のアミノ酸配列から各々なるペプチドの群（グループ３）を、混合ペプチドとして、１～２０μｇ／ｍＬの濃度になるよう、それぞれ加え、培養した。
【0130】
２日間培養した後、最終濃度が２０～１００Ｕ／ｍＬになるようＩＬ－２を添加し、さらに１週間培養した。これに１～２０μｇ／ｍＬの濃度になるよう、上記グループ分けした混合ペプチドをさらに追加し、１週間培養した。なお、ＰＢＭＣとペプチドとの混合培養は、炭酸ガス交換可能な丸底の培養皿を用いることが望ましく、本実施例においては、ポリプロピレン製１４ｍＬの丸底チューブ（ＢＤ社）又は９６穴Ｕ底細胞培養用マイクロテストプレート（ＢＤ社）を用いた。
【0131】
〔インターフェロン（ＩＦＮ）－γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ〕
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原特異的なＣＴＬの検出は、ＥＬＩＳＰＯＴ Ｓｅｔ（ＢＤ社）キットを用い、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにて行った。具体的には、前記混合ペプチドを添加してから約２週間後に、細胞集団の一部を採取して、５×１０５個／ｍＬになるよう調製した。これらサンプルを、抗ＩＦＮ－γ抗体が固相されたＥＬＩＳＰＯＳＴアッセイ用プレートに１００μＬ／ウェルで撒き、３７℃のＣＯ２インキュベーターの中で、３０分静置した。さらに、そのプレートに、各候補ペプチドにてパルスしたヒトリンパ芽球様細胞（Ｔ２－Ａ２４細胞）を１×１０４個／ウェルとなるように添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーターの中で、一晩静置した。そして、洗浄した後、ビオチン標識抗ＩＦＮ－γ抗体を加え、室温にて２時間反応させた。反応液を洗い、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを加え反応させ、洗浄した後、発色剤を１００μＬ／ウェル加え、１５～３０分反応することにより、ＣＴＬが分泌したＩＦＮ－γをスポット化して測定した。得られた結果を図５に示す。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原特異的なＣＴＬの検出は、ＥＬＩＳＰＯＴ Ｓｅｔ（ＢＤ社）キットを用い、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにて行った。具体的には、前記混合ペプチドを添加してから約２週間後に、細胞集団の一部を採取して、５×１０５個／ｍＬになるよう調製した。これらサンプルを、抗ＩＦＮ－γ抗体が固相されたＥＬＩＳＰＯＳＴアッセイ用プレートに１００μＬ／ウェルで撒き、３７℃のＣＯ２インキュベーターの中で、３０分静置した。さらに、そのプレートに、各候補ペプチドにてパルスしたヒトリンパ芽球様細胞（Ｔ２－Ａ２４細胞）を１×１０４個／ウェルとなるように添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーターの中で、一晩静置した。そして、洗浄した後、ビオチン標識抗ＩＦＮ－γ抗体を加え、室温にて２時間反応させた。反応液を洗い、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを加え反応させ、洗浄した後、発色剤を１００μＬ／ウェル加え、１５～３０分反応することにより、ＣＴＬが分泌したＩＦＮ－γをスポット化して測定した。得られた結果を図５に示す。
【0132】
図５に示した結果から明らかなように、ペプチドでパルスをしない場合（図中「(－）」）と比較して、ＮＹＮ ９ｍｅｒペプチド又はＱＹＩ ９ｍｅｒペプチドで刺激した場合は、ＩＦＮγのスポットが明らかに多く検出された。すなわち、ＮＹＮペプチド又はＱＹＩペプチドを加えて培養したＰＢＭＣ中には、これらペプチド各々に特異的であり、ＩＦＮ－γを産生するＣＴＬが誘導されていることが明らかになった。
【0133】
〔ＣＴＬクローンのソーティング及び培養〕
上記ＩＦＮ－γ産生能が検出されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＣＴＬについて、ＨＬＡ－テトラマー試薬及び抗ＣＤ８抗体を用いて免疫学的に染色し、フローサイトメーターにより検出した。得られた結果を図６及び図７に示す。
上記ＩＦＮ－γ産生能が検出されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＣＴＬについて、ＨＬＡ－テトラマー試薬及び抗ＣＤ８抗体を用いて免疫学的に染色し、フローサイトメーターにより検出した。得られた結果を図６及び図７に示す。
【0134】
これら図面において、ドットプロット展開図中の数字は、展開図を四分割した領域を、Ｑ１（左上）、Ｑ２（右上）、Ｑ３（左下）、Ｑ４（右下）と表記した場合、（Ｑ１＋Ｑ３）分のＱ１の百分率を示す。陰性コントロール用のＨＬＡ－テトラマー試薬としては、ＨＩＶ ｅｎｖｅｌｏｐｅ抗原由来のペプチド（ＲＹＬＲＤＱＱＬＬ、配列番号：１８）を用いて合成したＨＬＡ－テトラマー（図中「Ａ２４－ＨＩＶ－ｔｅｔｒａｍｅｒ」として表記）を使用した。
【0135】
前記フローサイトメトリーによる分析の結果、図６に示すとおり、ＣＤ８陽性・Ａ２４－ＮＹＮ－ｔｅｔｒａｍｅｒ陽性の細胞集団が、３．１７％の割合で検出された。また図７に示すとおり、ＣＤ８陽性・Ａ２４－ＱＹＩ－ｔｅｔｒａｍｅｒ陽性の細胞集団が、２．１４％の割合で検出された。
【0136】
以上の結果から、ＮＹＮペプチド又はＱＹＩペプチドを加えて培養したＰＢＭＣ中には、ＩＦＮ－γを産生する細胞が誘導されることが明らかになった。さらに、これらの細胞は、対応するＨＬＡ－テトラマー試薬にて染色されることから、ＮＹＮペプチド及びＱＹＩペプチドは、ＣＴＬエピトープペプチドであり、当該ペプチドの刺激に特異的なＣＴＬが誘導されることが明らかになった。
【0137】
次に、ＨＬＡ－テトラマー試薬及び抗ＣＤ８抗体に反応した細胞（ＣＴＬ）を、フローサイトメーターにより、９６ウェルプレート（コーニング社）に１細胞ずつ播種した。この細胞培養には、ＡＩＭ－Ｖ培養培地に、終濃度１０％のヒトＡＢ血清（ロンザジャパン社）、終濃度１％のペニシリン／ストレプトマイシン（ライフテクノロジーズ社）、終濃度１％のＧｌｕｔａＭＡＸ（ライフテクノロジーズ社）、終濃度１００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（シオノギ社）及び終濃度５μｇ／ｍＬのＰＨＡ（Ｗａｋｏ社）を添加したものを用いた。そして、各ウェルに、ドナーから採血し分取し、１００Ｇｙの放射線照射を施したＰＢＭＣ（５００００個）を添加した。また、前記ＣＴＬは、培地の色を観察して随時、半分量の培地交換を行った。さらに、細胞が増えた段階で、４８ウェルプレートに移し替えた。そして、このように培養したＣＴＬについて、前述と同様の方法を用いてＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行い、それら細胞の増幅を検出した。得られた結果を図８に示す。
【0138】
その結果、ＮＹＮ ９ｍｅｒペプチド特異的なＣＴＬに関し、得られた２４個のＣＴＬシングルクローンのいずれにおいても、ＩＦＮ－γのスポットが明らかに多く検出された。このことは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原由来ＮＹＮペプチド特異的なＣＴＬのシングルクローン化及び増幅に成功したことを示す。
【0139】
〔ＣＴＬペプチド内在性提示の確認〕
ａ）Ｍｉｎｉ ｇｅｎｅプラスミドの作製
ＣＴＬペプチド配列を含むＭｉｎｉ ｇｅｎｅを発現するプラスミドを作製するために、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の制限酵素認識部位に、下記３種類のＤＮＡ配列を各々挿入した。
Ｍｉｎｉ ｇｅｎｅ １：ＮＹＮペプチドをコードするＤＮＡ
ＡＴＧＡＡＴＴＡＴＡＡＴＴＡＣＣＴＧＴＡＴＡＧＡＴＴＧＴＴＴＴＡＡ（配列番号：５６）、
Ｍｉｎｉ ｇｅｎｅ ２：シグナル配列及びＮＹＮペプチドをコードするＤＮＡ
ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＧＧＴＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＣＡＴＴＣＣＡＣＴＧＧＴＧＡＣＡＡＴＴＡＴＡＡＴＴＡＣＣＴＧＴＡＴＡＧＡＴＴＧＴＴＴＴＡＡ（配列番号：５８）、
Ｍｉｎｉ ｇｅｎｅ ３：ＮＹＮペプチド及びその前後１０アミノ酸をコードするＤＮＡ
ＡＴＧＴＣＴＡＡＣＡＡＴＣＴＴＧＡＴＴＣＴＡＡＧＧＴＴＧＧＴＧＧＴＡＡＴＴＡＴＡＡＴＴＡＣＣＴＧＴＡＴＡＧＡＴＴＧＴＴＴＡＧＧＡＡＧＴＣＴＡＡＴＣＴＣＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＡＧＡＧＡＴＡＡ（配列番号：６０）。
ａ）Ｍｉｎｉ ｇｅｎｅプラスミドの作製
ＣＴＬペプチド配列を含むＭｉｎｉ ｇｅｎｅを発現するプラスミドを作製するために、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の制限酵素認識部位に、下記３種類のＤＮＡ配列を各々挿入した。
Ｍｉｎｉ ｇｅｎｅ １：ＮＹＮペプチドをコードするＤＮＡ
ＡＴＧＡＡＴＴＡＴＡＡＴＴＡＣＣＴＧＴＡＴＡＧＡＴＴＧＴＴＴＴＡＡ（配列番号：５６）、
Ｍｉｎｉ ｇｅｎｅ ２：シグナル配列及びＮＹＮペプチドをコードするＤＮＡ
ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＧＧＴＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＣＡＴＴＣＣＡＣＴＧＧＴＧＡＣＡＡＴＴＡＴＡＡＴＴＡＣＣＴＧＴＡＴＡＧＡＴＴＧＴＴＴＴＡＡ（配列番号：５８）、
Ｍｉｎｉ ｇｅｎｅ ３：ＮＹＮペプチド及びその前後１０アミノ酸をコードするＤＮＡ
ＡＴＧＴＣＴＡＡＣＡＡＴＣＴＴＧＡＴＴＣＴＡＡＧＧＴＴＧＧＴＧＧＴＡＡＴＴＡＴＡＡＴＴＡＣＣＴＧＴＡＴＡＧＡＴＴＧＴＴＴＡＧＧＡＡＧＴＣＴＡＡＴＣＴＣＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＡＧＡＧＡＴＡＡ（配列番号：６０）。
【0140】
そして、調製した各Ｍｉｎｉ ｇｅｎｅプラスミドを、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｇｉｇａ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）で増幅、精製した。また、これらプラスミドＤＮＡの濃度は、吸光度（２６０ｎｍ）を測定することにより求めた。
【0141】
ｂ）Ｍｉｎｉ ｇｅｎｅ発現細胞の作製
ＨＥＫ２９３Ｔ（２９３Ｔ）細胞及びＨＬＡ－Ａ２４遺伝子導入済みＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ／ＨＬＡ－Ａ＊２４＋）を、各々７０％の密度になるまで培養した。そして、各種Ｍｉｎｉ ｇｅｎｅプラスミドを、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ社）を用い、これら細胞に遺伝子導入した。３７℃で４８時間培養した後、細胞を回収した。
ＨＥＫ２９３Ｔ（２９３Ｔ）細胞及びＨＬＡ－Ａ２４遺伝子導入済みＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ／ＨＬＡ－Ａ＊２４＋）を、各々７０％の密度になるまで培養した。そして、各種Ｍｉｎｉ ｇｅｎｅプラスミドを、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ社）を用い、これら細胞に遺伝子導入した。３７℃で４８時間培養した後、細胞を回収した。
【0142】
ｃ）ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
上記にて樹立したＣＴＬシングルクローン（１－Ｃ１）を、抗ＩＦＮ－γ抗体が固相されたＥＬＩＳＰＯＳＴアッセイ用プレートに２×１０４個／ウェルになるよう撒き、３７℃のＣＯ２インキュベーターの中で、３０分静置した。そのプレートに、Ｍｉｎｉ ｇｅｎｅを発現させた２９３Ｔ細胞又は２９３Ｔ／ＨＬＡ－Ａ＊２４細胞を１×１０４個／ウェルとなるように添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーターの中で、一晩静置した。洗浄後、ビオチン標識抗ＩＦＮ－γ抗体を加え、室温にて２時間反応した。反応液を洗い、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを加え反応させた。洗浄後、発色剤を１００μＬ／ウェル加え、１５～３０分反応することにより、ＣＴＬが分泌したＩＦＮ－γをスポット化して検出した。得られた結果を図９に示す。
上記にて樹立したＣＴＬシングルクローン（１－Ｃ１）を、抗ＩＦＮ－γ抗体が固相されたＥＬＩＳＰＯＳＴアッセイ用プレートに２×１０４個／ウェルになるよう撒き、３７℃のＣＯ２インキュベーターの中で、３０分静置した。そのプレートに、Ｍｉｎｉ ｇｅｎｅを発現させた２９３Ｔ細胞又は２９３Ｔ／ＨＬＡ－Ａ＊２４細胞を１×１０４個／ウェルとなるように添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーターの中で、一晩静置した。洗浄後、ビオチン標識抗ＩＦＮ－γ抗体を加え、室温にて２時間反応した。反応液を洗い、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを加え反応させた。洗浄後、発色剤を１００μＬ／ウェル加え、１５～３０分反応することにより、ＣＴＬが分泌したＩＦＮ－γをスポット化して検出した。得られた結果を図９に示す。
【0143】
ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果、ＨＬＡ－Ａ２４を保持しない２９３Ｔ細胞において、スポットは検出されなかった。一方、Ｍｉｎｉ ｇｅｎｅ １又はＭｉｎｉ ｇｅｎｅ ３を発現させた２９３Ｔ／ＨＬＡ－Ａ＊２４細胞において、明らかなＩＦＮγスポットが検出された。
【0144】
なお、Ｍｉｎｉ ｇｅｎｅ ２を発現させた２９３Ｔ／ＨＬＡ－Ａ＊２４細胞においては、配列番号：５８及び５９に示すとおり、フレームシフトが生じているため、ＮＹＮペプチドを含むポリペプチドが産生されず、ＨＬＡ－Ａ２４を保持しない２９３Ｔ細胞同様に、スポットが検出されなかったものと推察される。
【0145】
これらのことから、ＮＹＮ ９ｍｅｒペプチドは、細胞内でプロセシング処理を経て生成され、ＨＬＡを介して提示される、内在性のエピトープペプチドであることが明らかとなった。
【0146】
以上より、同定されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のＮＹＮ ９ｍｅｒペプチド及びＱＹＩ ９ｍｅｒペプチドは、末梢血中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＣＴＬを増殖させる機能を有することが明らかとなった。また、これらの細胞集団はＩＦＮ－γ産出能を有しかつＨＬＡ－テトラマーで検出可能であったことから、これらのペプチドは、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２拘束性のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原特異的ＣＴＬエピトープペプチドであることが判明した。さらに、ＮＹＮ ９ｍｅｒペプチドは、内在性に提示されるＣＴＬエピトープペプチドであることも証明された。
【0147】
〔ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチド特異的ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞の誘導〕
次に、ＮＹＮ ９ｍｅｒペプチドを含む下記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の３０ｍｅｒペプチドを化学合成し、これについてＴｈ細胞誘導活性を評価した。
ＮＹＮ ３０ｍｅｒ：ＮＹＮ ９ｍｅｒ及びその後２１アミノ酸からなるペプチド
ＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳ（配列番号：１９）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来Ｓタンパクにおける位置：４４８－４７７。
次に、ＮＹＮ ９ｍｅｒペプチドを含む下記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の３０ｍｅｒペプチドを化学合成し、これについてＴｈ細胞誘導活性を評価した。
ＮＹＮ ３０ｍｅｒ：ＮＹＮ ９ｍｅｒ及びその後２１アミノ酸からなるペプチド
ＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳ（配列番号：１９）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来Ｓタンパクにおける位置：４４８－４７７。
【0148】
具体的には先ず、ドナーから末梢血を採取し、リンホプレップ（Ａｌｅｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＡＳ １１１４５４７）を用いた密度勾配分離法によってＰＢＭＣを回収した。さらに、ＰＢＭＣから磁気細胞分離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ １３０－０５０－２０１）を用い、ＣＤ１４陽性細胞を分離した。次いで、ＣＤ１４陽性細胞を、５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＡＦ－３００－０３）及び５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＡＦ－２００－０４）存在下、３ｍＬのヒト細胞用培地を用い、６穴培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ ３５３０４６）にて７日間培養することによって、樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ；ＤＣｓ）に分化させた。
【0149】
なお、ヒト細胞用培地には、ＡＩＭ－Ｖ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ０８７０１１２ＤＫ）に５６℃、３０分非働化したヒトＡＢ型血清（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＰＬＡ－ＳＥＲＡＢ）を３％添加したものを用いた。
【0150】
また、ＰＢＭＣから、磁気細胞分離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ １３０－０４５－１０１）を用い、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を分離した。そして、１ｘ１０５個のＣＤ４陽性Ｔ細胞を、ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチド ３μｇ／ｍＬの存在下、５ｘ１０４個のＤＣｓと共に、２００μＬのヒト細胞用培地を用い、９６穴平底培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ ３５３０７２）にて、培養を開始した。
【0151】
その共培養７日後に、ＣＤ４陽性Ｔ細胞にペプチド刺激を施すために、１００μＬの培養上清を取り除いた後、ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチド（３μｇ／ｍＬ）と、ガンマ線照射（４０Ｇｙ）した不活化ＰＢＭＣ（２ｘ１０５個）とを含む、新たな培地１００μＬを添加した。そして、その２日後に、５０μＬの培養上清を取り除き、５０μＬのＩＬ－２（塩野義製薬 イムネース注３５）を最終濃度が１０Ｕ／ｍＬになるように添加した。
【0152】
以後、活性化したＣＤ４陽性Ｔ細胞を持続的に増殖させるために、前記ペプチド及び不活化ＰＢＭＣ（１ｘ１０６個）を用い、１週間おきにＣＤ４陽性Ｔ細胞（１ｘ１０６個）を刺激し、以降に述べる各種実験に供した。
【0153】
〔ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチド特異的Ｔｈ細胞株の特異性評価とＨＬＡ－ＤＲ拘束性の検討〕
ドナーＡから増殖してきたＣＤ４陽性Ｔ細胞のＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチドに対する特異的反応性を調べるために、当該ペプチド（３μｇ／ｍＬ）存在下、９６穴平底培養プレートにて、最終濃度が２μＭのモネンシン（２ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ４２０７０１）を含む２００μＬのヒト細胞用培地を用い、培養した。
ドナーＡから増殖してきたＣＤ４陽性Ｔ細胞のＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチドに対する特異的反応性を調べるために、当該ペプチド（３μｇ／ｍＬ）存在下、９６穴平底培養プレートにて、最終濃度が２μＭのモネンシン（２ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ４２０７０１）を含む２００μＬのヒト細胞用培地を用い、培養した。
【0154】
その培養６時間後、細胞表面をＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３００３０６），ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３００５１２）、ＣＤ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３０１０１６）に対する抗体を用いて染色し、次いで、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５４７２２）にて固定した後、ＩＦＮ－γ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ５０６５０７）、ＧｒａｎｚｙｍｅＢ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ５０２３１２）に対する抗体で染色した。そして、ＣｙｔｏＦＬＥＸ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ Ｂ５３０１３）を用いたフローサイトメトリーに供した。得られた結果を図１０に示す。
【0155】
その結果、図１０で示すように、ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチドの存在下、ＩＦＮ－γ及びＧｒａｎｚｙｍｅ Ｂの産生が認められたことから、当該ペプチド特異的Ｔｈ細胞が樹立されていることが明らかになった。
【0156】
次に、ＣＤ４陽性Ｔ細胞のＨＬＡ拘束性を調べるために、ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチド ３μｇ／ｍＬ存在下、５ｘ１０４個のＴｈ細胞及び１ｘ１０５個のＰＢＭＣを、２００μＬのヒト細胞用培地を用い、９６穴平底培養プレートにて共培養した。なお、一部の培養系には、抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ３０７６１２）を、又は対照群として抗ＨＬＡ－ｃｌａｓｓ Ｉ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ３１１４１２）を、各々終濃度５μｇ／ｍＬになるように添加した。
【0157】
その共培養２４～４８時間後に、培養上清１００μＬを回収し、それに含まれるＩＦＮ－γ及びＧＭ－ＣＳＦの濃度を、ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５５１４２（ＩＦＮ－γ）、５５５１２６（ＧＭ－ＣＳＦ））を用い、付属の取扱説明書に従って測定した。得られた結果を図１１に示す。
【0158】
図１１に示した結果から明らかなように、ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチド特異的なＴｈ細胞は、抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体の存在下で培養した場合（図中「ａＤＲ」）、当該ペプチドに特異的なＩＦＮ－γ及びＧＭ－ＣＳＦの産生が抑制されたことから、ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチドは、ＨＬＡ－ＤＲ拘束的にＴｈ細胞を刺激していることが明らかとなった。
【0159】
さらに、拘束されるＨＬＡ型を調べるために、ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチド（３μｇ／ｍＬ）存在下、５ｘ１０４個のＣＤ４陽性Ｔ細胞と、ＨＬＡ－ＤＲ４、ＤＲ９又はＤＲ５３の遺伝子が導入された３ｘ１０４個のマウス由来線維芽細胞株（各々「Ｌ－ＤＲ４細胞」、「Ｌ－ＤＲ９細胞」、「Ｌ－ＤＲ５３細胞」と称する）とを、２００μＬのヒト細胞用培地を用い、９６穴平底培養プレートにて共培養した。そして、上記と同様に２４～４８時間後に培養上清を回収し、ＩＦＮ－γ濃度及びＧＭ－ＣＳＦ濃度を測定した。得られた結果を図１２に示す。
【0160】
図１２に示した結果から明らかなように、ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチド特異的Ｔｈ細胞が、Ｌ－ＤＲ５３細胞にのみペプチド特異的反応を示したことから、当該ペプチドはＨＬＡ－ＤＲ５３に結合し、Ｔｈ細胞を刺激していることが明らかとなった。
【0161】
〔ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチド特異的Ｔｈ細胞株の特異性評価とＨＬＡ－ＤＰ拘束性の検討〕
ＣＤ４陽性Ｔ細胞のＨＬＡ－ＤＰ拘束性を調べるために、ドナーから増殖してきたＣＤ４陽性Ｔ細胞に対して、上記同様抗体染色を行い、ＣｙｔｏＦＬＥＸを用いたフローサイトメトリーに供した。その結果、図１３に示すとおり、ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチド存在下にて、ＩＦＮ－γ及びＧｒａｎｚｙｍｅ Ｂの産生が認められたことから、当該ペプチド特異的Ｔｈ細胞が樹立されていることが確認された。
ＣＤ４陽性Ｔ細胞のＨＬＡ－ＤＰ拘束性を調べるために、ドナーから増殖してきたＣＤ４陽性Ｔ細胞に対して、上記同様抗体染色を行い、ＣｙｔｏＦＬＥＸを用いたフローサイトメトリーに供した。その結果、図１３に示すとおり、ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチド存在下にて、ＩＦＮ－γ及びＧｒａｎｚｙｍｅ Ｂの産生が認められたことから、当該ペプチド特異的Ｔｈ細胞が樹立されていることが確認された。
【0162】
次に、３μｇ／ｍＬのＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチド存在下、５ｘ１０４個のＴｈ細胞と１ｘ１０５個のＰＢＭＣとを、２００μＬのヒト細胞用培地を用い、９６穴平底培養プレートにて共培養した。一部の培養系には、抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ３０７６１２）、抗ＨＬＡ－ＤＰ抗体（ＢＲＡＦＢ６：Ｓａｎｔａ Ｃｌｕｚ ｓｃ－３３７１９）、抗ＨＬＡ－ＤＱ抗体（ＳＰＶ－Ｌ３：Ａｂｃａｍ ａｂ８５６１４）を、各々終濃度５μｇ／ｍＬになるように添加した。また、対照群として、抗ＨＬＡ－ｃｌａｓｓ Ｉ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ３１１４１２）を、終濃度５μｇ／ｍＬになるように添加した。そして、２４～４８時間後の培養上清を１００μＬ回収し、それに含まれるＩＦＮ－γ及びＧＭ－ＣＳＦの濃度をＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５５１４２（ＩＦＮ－γ）、５５５１２６（ＧＭ－ＣＳＦ））を用い、付属の取扱説明書に従って測定した。得られた結果を図１４に示す。
【0163】
その結果、ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチド特異的なＴｈ細胞は、抗ＨＬＡ－ＤＰ抗体を添加して培養した場合に、ペプチド特異的ＩＦＮ－γ及びＧＭ－ＣＳＦ産生が抑制されたことから、当該ペプチドはＨＬＡ－ＤＰ拘束性にＴｈ細胞を刺激し得ることも明らかになった。
【0164】
さらに、拘束されるＨＬＡ型を調べるために、ＤＰＢ１＊０２：０１又はＤＰＢ１＊０５：０１を有するＥＶウイルス感染によって不死化したＢ細胞（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ：ＬＣＬ）を、３μｇ／ｍＬのＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチド存在下２時間培養し、培地中に残存する当該ペプチドを完全に洗浄して取り除いた後、２００μＬのヒト細胞用培地を用い、９６穴平底培養プレートにて、ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチド特異的なＴｈ細胞と共培養し、上記同様に２４～４８時間後の培養上清におけるＩＦＮ－γ濃度及びＧＭ－ＣＳＦ濃度を測定した。得られた結果を図１５に示す。なお、図１５に示す「ＣＫ０５」及び「ｋｉｔ」は、これらＤＰＢ１＊０２：０１を有する不死化Ｂ細胞株の由来（Ｂ細胞を単離した被験者）が異なることを示す。同様に、「Ｏｋｒ」及び「Ｆｕｌｌ」は、これらＤＰＢ１＊０５：０１を有する不死化Ｂ細胞株の由来が異なることを示す。
【0165】
図１５に示した結果から明らかなように、ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチド特異的Ｔｈ細胞がＤＰＢ１＊０２：０１陽性ＬＣＬにのみペプチド特異的反応を示したことから、当該ペプチドはＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０２：０１に結合し、Ｔｈ細胞を刺激していることが明らかになった。
【0166】
以上のポリペプチド特異的ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞株の特異性評価と、ＨＬＡ－ＤＲ及びＨＬＡ－ＤＰ拘束性の検討から、ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチドはＩＦＮ－γやＧｒａｎｚｙｍｅ Ｂを産生するタイプ１型Ｔｈ細胞を刺激、誘導することができ、ＨＬＡ－ＤＲ５３拘束性かつＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０２：０１拘束性のＴ細胞エピトープであることが明らかとなった。然るに、当該ペプチは複数のＨＬＡに提示されることにより、様々なＴ細胞クローンを刺激・活性化できる有用なＴ細胞ワクチンとして機能し得る。
【0167】
〔ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ペプチド特異的ヘルパーＴ細胞株の、断片化ペプチドに対する反応性評価〕
ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチドの繰り返し刺激により増殖してきたＣＤ４陽性Ｔ細胞（ＤＰ２－ＨＫ１３及びＤＲ５３－ＨＫ３６）の反応領域を特定するために、下記表４に示す、ＮＹＮ １８ｍｅｒペプチド、ＲＫＳ ２１ｍｅｒペプチド、ＰＦＥ １５ｍｅｒペプチド、ＨＬＡ－Ａ２４、ＤＰ２、ＤＲ５３に結合するエピトープ配列が少しずつオーバーラップしているＳ４４８－Ｔ１～Ｓ４４８－Ｔ２４、及びＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチド（各々３μｇ／ｍＬ）存在下、５ｘ１０４個のＴｈ細胞及び１ｘ１０５個のＰＢＭＣを、２００μＬのヒト細胞用培地を用いて９６穴平底培養プレートにて共培養した。そして、２４時間後の培養上清を１００μＬ回収し、それに含まれるＩＦＮ－γ及びＧＭ－ＣＳＦの濃度をＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５５１４２（ＩＦＮ－γ）、５５５１２６（ＧＭ－ＣＳＦ））を用いて付属の取扱説明書に従って測定した。
ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチドの繰り返し刺激により増殖してきたＣＤ４陽性Ｔ細胞（ＤＰ２－ＨＫ１３及びＤＲ５３－ＨＫ３６）の反応領域を特定するために、下記表４に示す、ＮＹＮ １８ｍｅｒペプチド、ＲＫＳ ２１ｍｅｒペプチド、ＰＦＥ １５ｍｅｒペプチド、ＨＬＡ－Ａ２４、ＤＰ２、ＤＲ５３に結合するエピトープ配列が少しずつオーバーラップしているＳ４４８－Ｔ１～Ｓ４４８－Ｔ２４、及びＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチド（各々３μｇ／ｍＬ）存在下、５ｘ１０４個のＴｈ細胞及び１ｘ１０５個のＰＢＭＣを、２００μＬのヒト細胞用培地を用いて９６穴平底培養プレートにて共培養した。そして、２４時間後の培養上清を１００μＬ回収し、それに含まれるＩＦＮ－γ及びＧＭ－ＣＳＦの濃度をＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５５１４２（ＩＦＮ－γ）、５５５１２６（ＧＭ－ＣＳＦ））を用いて付属の取扱説明書に従って測定した。
【0168】
【表4】
【0169】
その結果、図１６Ａに示すとおり、ＨＬＡ－ＤＲ５３拘束性Ｔｈ細胞（ＤＲ５３－ＨＫ３６）において、ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチド及びＲＫＳ ２１ｍｅｒペプチド存在下でのみ、ＩＦＮ－γ及びＧＭ－ＣＳＦの産生が認められた。さらに、図１６Ｂに示すとおり、Ｓ４４８－Ｔ１７～Ｓ４４８－Ｔ２２ペプチド存在下でＩＦＮ－γ産生が認められたことから、ＤＲ５３－ＨＫ３６の最小認識配列はＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴであることが明らかになった。
【0170】
一方、図１７Ａに示すとおり、ＤＰＢ１＊０２：０１拘束性のＴｈ細胞（ＤＰ２－ＨＫ１３）においては、ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチド及びＮＹＮ １８ｍｅｒペプチド存在下でのみ、ＩＦＮ－γ及びＧＭ－ＣＳＦ産生が認められた。さらに、図１７Ｂに示すとおり、Ｓ４４８－Ｔ８～Ｓ４４８－Ｔ１２ペプチド存在下でＩＦＮ－γ産生が認められたことから、ＤＰ２－ＨＫ１３の最小認識配列はＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬであることが明らかになった。
【0171】
〔Ｎ５０１Ｙ ２５ｍｅｒペプチド特異的Ｔｈ細胞の誘導〕
次に、Ｎ５０１Ｙ ２５ｍｅｒペプチドを化学合成し、これについてＴｈ細胞誘導活性を評価した。なお、Ｎ５０１Ｙは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異型である。
Ｎ５０１Ｙ ２５ｍｅｒ：ＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＹＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬ（配列番号：５１）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来Ｓタンパクにおける位置：４８９－５１３。
次に、Ｎ５０１Ｙ ２５ｍｅｒペプチドを化学合成し、これについてＴｈ細胞誘導活性を評価した。なお、Ｎ５０１Ｙは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異型である。
Ｎ５０１Ｙ ２５ｍｅｒ：ＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＹＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬ（配列番号：５１）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来Ｓタンパクにおける位置：４８９－５１３。
【0172】
具体的には、上記〔ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチド特異的ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞の誘導〕に記載の方法にて、ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチドの代わりに、Ｎ５０１Ｙ ２５ｍｅｒペプチドを用いた以外は同様にして、活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞を調製し、持続的に増殖させ、下記実験に供した。
【0173】
〔Ｎ５０１Ｙ ２５ｍｅｒペプチド特異的Ｔｈ細胞株の特異性評価とＨＬＡ－ＤＲ拘束性の検討〕
上記〔ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチド特異的Ｔｈ細胞株の特異性評価とＨＬＡ－ＤＲ拘束性の検討〕に記載の方法にて、ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチドの代わりに、Ｎ５０１Ｙ ２５ｍｅｒペプチドを用いた以外は同様にして、増殖してきたＣＤ４陽性Ｔ細胞のＮ５０１Ｙ ２５ｍｅｒペプチドに対する特異的反応性を調べた。また、当該ＣＤ４陽性Ｔ細胞のＨＬＡ拘束性を調べた。得られた結果を図１８及び１９に示す。
上記〔ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチド特異的Ｔｈ細胞株の特異性評価とＨＬＡ－ＤＲ拘束性の検討〕に記載の方法にて、ＮＹＮ ３０ｍｅｒペプチドの代わりに、Ｎ５０１Ｙ ２５ｍｅｒペプチドを用いた以外は同様にして、増殖してきたＣＤ４陽性Ｔ細胞のＮ５０１Ｙ ２５ｍｅｒペプチドに対する特異的反応性を調べた。また、当該ＣＤ４陽性Ｔ細胞のＨＬＡ拘束性を調べた。得られた結果を図１８及び１９に示す。
【0174】
その結果、図１８に示すように、Ｎ５０１Ｙ ２５ｍｅｒペプチドの存在下、ＩＦＮ－γ及びＧｒａｎｚｙｍｅ Ｂの産生が認められたことから、当該ペプチド特異的Ｔｈ細胞が樹立されていることが明らかになった。
【0175】
図１９に示した結果から明らかなように、Ｎ５０１Ｙ ２５ｍｅｒペプチド特異的なＴｈ細胞は、抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体の存在下で培養した場合（図中「ａＤＲ」）、当該ペプチドに特異的なＩＦＮ－γの産生が抑制されたことから、Ｎ５０１Ｙ ２５ｍｅｒペプチドは、ＨＬＡ－ＤＲ拘束的にＴｈ細胞を刺激していることが明らかとなった。
【0176】
さらに、拘束されるＨＬＡ型を調べるために、Ｎ５０１Ｙ ２５ｍｅｒペプチド（３μｇ／ｍＬ）存在下、５ｘ１０４個のＣＤ４陽性Ｔ細胞と、ＨＬＡ－ＤＲ４、ＤＲ１５又はＤＲ５３の遺伝子が導入された３ｘ１０４個のマウス由来線維芽細胞株（各々「Ｌ－ＤＲ４細胞」、「Ｌ－ＤＲ１５細胞」、「Ｌ－ＤＲ５３細胞」と称する）とを、２００μＬのヒト細胞用培地を用い、９６穴平底培養プレートにて共培養した。そして、２４～４８時間後に培養上清を回収し、ＩＦＮ－γ濃度を測定した。得られた結果を図２０に示す。
【0177】
図２０に示した結果から明らかなように、Ｎ５０１Ｙ ２５ｍｅｒペプチド特異的Ｔｈ細胞が、Ｌ－ＤＲ１５細胞にのみペプチド特異的反応を示したことから、当該ペプチドはＨＬＡ－ＤＲ１５に結合し、Ｔｈ細胞を刺激していることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【0178】
以上説明したように、本発明によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞を誘導し、当該ウイルスの感染症の治療又は予防が可能となる。したがって、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に対するワクチン及び受動免疫療法剤等として有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図17A】
【図17B】
【図18】
【図19】
【図20】
【配列表】