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特開2024-123352創薬スクリーニング方法及び脊椎動物細胞への遺伝子導入方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024123352
(43)【公開日】2024-09-12
(54)【発明の名称】創薬スクリーニング方法及び脊椎動物細胞への遺伝子導入方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/85 20060101AFI20240905BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240905BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240905BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240905BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20240905BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240905BHJP
C12N 15/55 20060101ALN20240905BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20240905BHJP
【ＦＩ】
C12N15/85 Z
C12N5/10
C12Q1/02
C12N15/09 100
C12N15/31
C12N15/12
C12N15/55
C12N15/54
【審査請求】未請求
【請求項の数】17
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023030686
(22)【出願日】2023-03-01
(71)【出願人】
【識別番号】521240929
【氏名又は名称】川上 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100173679
【弁理士】
【氏名又は名称】備後 元晴
(72)【発明者】
【氏名】川上 浩一
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 良知
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA05
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ13
4B063QQ43
4B063QS38
4B063QX02
4B065AA90X
4B065AA94X
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA46
(57)【要約】
【課題】ゲノムＤＮＡプロモーターを用いた目的タンパク質の組織特異的な発現を、生きている脊椎動物の個体レベルで簡便に可視化し、かつ、ハイスループットで評価可能な創薬スクリーニングシステムを提供する。
【解決手段】本発明は、ＤＮＡ構築物を脊椎動物細胞に導入する工程と、目的タンパク質の組織特異的な発現の程度を観察する工程とを含む創薬スクリーニング方法である。ＤＮＡ構築物は、一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列の間に、目的タンパク質をコードする外来遺伝子断片を含む遺伝子断片が挿入され、外来遺伝子断片の配列が脊椎動物の所定細胞に組織特異的に発現する組織特異的プロモーター配列を有する。
【選択図】図７
【解決手段】本発明は、ＤＮＡ構築物を脊椎動物細胞に導入する工程と、目的タンパク質の組織特異的な発現の程度を観察する工程とを含む創薬スクリーニング方法である。ＤＮＡ構築物は、一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列の間に、目的タンパク質をコードする外来遺伝子断片を含む遺伝子断片が挿入され、外来遺伝子断片の配列が脊椎動物の所定細胞に組織特異的に発現する組織特異的プロモーター配列を有する。
【選択図】図７
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＤＮＡ構築物を脊椎動物細胞に導入する工程と、
目的タンパク質の組織特異的な発現の程度を観察する工程を含み、
前記ＤＮＡ構築物は、一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列の間に、前記目的タンパク質をコードする外来遺伝子断片を含む遺伝子断片が挿入され、前記外来遺伝子断片の配列が脊椎動物の所定細胞に組織特異的に発現する組織特異的プロモーター配列を有する、創薬スクリーニング方法。
目的タンパク質の組織特異的な発現の程度を観察する工程を含み、
前記ＤＮＡ構築物は、一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列の間に、前記目的タンパク質をコードする外来遺伝子断片を含む遺伝子断片が挿入され、前記外来遺伝子断片の配列が脊椎動物の所定細胞に組織特異的に発現する組織特異的プロモーター配列を有する、創薬スクリーニング方法。
【請求項2】
前記遺伝子断片は、前記外来遺伝子断片の下流に、蛍光タンパク質遺伝子、発光タンパク質遺伝子、活性酸素産生遺伝子及び薬剤耐性遺伝子から選択される選択マーカー遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の創薬スクリーニング方法。
【請求項3】
前記遺伝子断片は、前記外来遺伝子断片の下流に、酵母転写因子ＧＡＬ４をコードするＧＡＬ４遺伝子をさらに含み、
前記選択マーカー遺伝子は、前記ＧＡＬ４遺伝子の下流に配される、請求項２に記載の創薬スクリーニング方法。
前記選択マーカー遺伝子は、前記ＧＡＬ４遺伝子の下流に配される、請求項２に記載の創薬スクリーニング方法。
【請求項4】
ゲノム編集法によって前記ＤＮＡ構築物を構築する工程をさらに含む、請求項１に記載の創薬スクリーニング方法。
【請求項5】
前記ゲノム編集法は、ＣＲＩＳＰＲを介した遺伝子編集、Ｂａｓｅ Ｅｄｉｔｏｒ（塩基エディター）を介した遺伝子編集、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰを介した遺伝子編集、及びＰｒｉｍｅ ｅｄｉｔｏｒから選択される１種以上を含む、請求項４に記載の創薬スクリーニング方法。
【請求項6】
前記ゲノム編集法は、ＣＲＩＳＰＲを介した遺伝子編集であり、
前記ＣＲＩＳＰＲを介した遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した遺伝子編集、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｎを介した遺伝子編集、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａを介した遺伝子編集から選択される１種以上を含む、請求項５に記載の創薬スクリーニング方法。
前記ＣＲＩＳＰＲを介した遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した遺伝子編集、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｎを介した遺伝子編集、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａを介した遺伝子編集から選択される１種以上を含む、請求項５に記載の創薬スクリーニング方法。
【請求項7】
前記外来遺伝子断片がアンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）をコードするＤＮＡ断片である、請求項１に記載の創薬スクリーニング方法。
【請求項8】
前記一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列のうち、５’側の塩基配列の長さが１８０ｂｐ以上である、請求項１に記載の創薬スクリーニング方法。
【請求項9】
前記一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列のうち、３’側の塩基配列の長さが１４０ｂｐ以上である、請求項１に記載の創薬スクリーニング方法。
【請求項10】
前記外来遺伝子断片の長さが７００ｂｐ以上１６４ｋｂｐ以下である、請求項１に記載の創薬スクリーニング方法。
【請求項11】
前記ＤＮＡ構築物を用いて前記脊椎動物内で配列番号２のアミノ酸配列であるトランスポゼースを提供するＤＮＡ配列のコドンは、導入する前記脊椎動物の種類に最適化したものである、請求項１に記載の創薬スクリーニング方法。
【請求項12】
前記ＤＮＡ構築物を用いてゼブラフィッシュＤａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ内でＴｏｌ２トランスポゾンを転移誘導するトランスポゼースのアミノ酸配列において、配列番号２に記載のアミノ酸配列と比べたときのＮ末端の欠失は、３アミノ酸残基以下である、請求項１に記載の創薬スクリーニング方法。
【請求項13】
前記ＤＮＡ構築物を用いてゼブラフィッシュＤａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ内でＴｏｌ２トランスポゾンを転移誘導するトランスポゼースのアミノ酸配列において、配列番号２に記載のアミノ酸配列と比べたときのＣ末端の欠失は、９アミノ酸残基以下である、請求項１に記載の創薬スクリーニング方法。
【請求項14】
前記脊椎動物細胞は、魚類の受精卵、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウス胚性幹細胞（マウスＥＳ細胞）、ヒト由来ＨｅＬａ細胞、ヒト由来子宮内膜細胞、ヒトリンパ細胞、及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から選択される１種以上である、請求項１に記載の創薬スクリーニング方法。
【請求項15】
前記脊椎動物細胞が魚類の受精卵である、請求項１３に記載の創薬スクリーニング方法。
【請求項16】
ＤＮＡ構築物を脊椎動物細胞に導入する工程を含み、
前記ＤＮＡ構築物は、一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列の間に、目的タンパク質をコードする外来遺伝子断片を含む遺伝子断片が挿入され、前記外来遺伝子断片の配列が脊椎動物の所定細胞に組織特異的に発現する組織特異的プロモーター配列を有する、脊椎動物細胞への遺伝子導入方法。
前記ＤＮＡ構築物は、一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列の間に、目的タンパク質をコードする外来遺伝子断片を含む遺伝子断片が挿入され、前記外来遺伝子断片の配列が脊椎動物の所定細胞に組織特異的に発現する組織特異的プロモーター配列を有する、脊椎動物細胞への遺伝子導入方法。
【請求項17】
魚類の受精卵、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウス胚性幹細胞（マウスＥＳ細胞）、ヒト由来ＨｅＬａ細胞、ヒト由来子宮内膜細胞、ヒトリンパ細胞、及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から選択される１種以上にＤＮＡ構築物が導入されており、
前記ＤＮＡ構築物は、一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列の間に、前記目的タンパク質をコードする外来遺伝子断片を含む遺伝子断片が挿入され、前記外来遺伝子断片の配列が脊椎動物の所定細胞に組織特異的に発現する組織特異的プロモーター配列を有する、組換え脊椎動物細胞。
前記ＤＮＡ構築物は、一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列の間に、前記目的タンパク質をコードする外来遺伝子断片を含む遺伝子断片が挿入され、前記外来遺伝子断片の配列が脊椎動物の所定細胞に組織特異的に発現する組織特異的プロモーター配列を有する、組換え脊椎動物細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、創薬スクリーニング方法及び脊椎動物細胞への遺伝子導入方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヒト細胞への感染は、ウイルス外膜のスパイクタンパク質（Ｓタンパク質）とヒト細胞表面に存在するＡＣＥ２（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ２）受容体との結合が引き金となる。ＡＣＥ２受容体に結合したＳタンパク質は、タンパク質分解酵素であるＴＭＰＲＳＳ２により切断されて活性化され、ウイルス外膜と細胞膜との融合を促進することにより、ウイルスはヒト細胞へと侵入する。このようにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染はＡＣＥ２とＴＭＰＲＳＳ２を発現する細胞において起こるが、ＴＭＰＲＳＳ２は広汎な細胞に発現が見られており、ＡＣＥ２の発現が主にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染を規定している。
【0003】
ヒトＡＣＥ２遺伝子は、小腸・十二指腸・大腸の腸上皮細胞や、腎臓、精巣、胆嚢、心臓などの一部の細胞に特に強く発現するが、一部の鼻粘膜上皮細胞や肺胞細胞にも発現している。ＣＯＶＩＤ－１９の主な症状である呼吸器系の症状はこの鼻粘膜上皮細胞や肺胞細胞への感染を通じて生じると考えられるが、下痢などの症状が出るケースもあり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はＡＣＥ２の発現を利用して種々の細胞に入り込み増殖し、その機能を撹乱するものと考えられている。
【0004】
また、ＡＣＥ２は角膜で強く発現されていることも報告されており、眼がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の入り口になりうる可能性も提唱されている。小児では鼻粘膜上皮細胞におけるＡＣＥ２の発現が低いという報告もあり、このＡＣＥ２の低発現が小児での流行が抑制されている理由である可能性もある。
【0005】
このように、ある特定の組織におけるＡＣＥ２の発現を調節することが可能であれば、感染リスクの低減、重症化の抑制につながるものと考えられる。
【0006】
ここで、ＡＣＥ２の発現と機能についてマウスを用いた個体レベルでの研究が進められている（特許文献１／非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Hongpeng Jia et al., ACE2 mouse models: a toolbox for cardiovascular and pulmonary research, Nature Communications 11, 5165 (2020)
【非特許文献2】Koga, et al., Transposable element in fish, Nature, 383, 30 (1996)
【非特許文献3】Kawakami, K., Shima, A., and Kawakami, Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage, N. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 11403-11408 (2000)
【非特許文献4】Kawakami, K. and Noda, T., Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells. Genetics 166, 895-899 (2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
非特許文献１に記載の研究は、マウスＡＣＥ２プロモーターで行われたものであり、ヒトプロモーターを用いて行われたものではない。また、ＡＣＥ２の発現を、個体レベルで簡便に可視化し、かつ、ハイスループットで評価するシステムは存在しなかった。
【0009】
本発明は、このような問題に鑑みてなされたものであり、ゲノムＤＮＡプロモーターを用いた目的タンパク質の組織特異的な発現を、生きている脊椎動物の個体レベルで簡便に可視化し、かつ、ハイスループットで評価可能なシステムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
メダカ（Ｏｒｙｚｉａｓ ｌａｔｉｐｅｓ）は、東アジアに生息する魚である。メダカのｉ遺伝子座の変異は、メラニン欠乏症及び赤目を生じさせる。このｉ遺伝子座は、チロシナーゼの遺伝子をコードしていることが知られている。図１は、トランスポゾンの全体構造を示す。図１の太線部分がトランスポゾンを表し、網掛け部分が転移酵素遺伝子のエキソンを表し、矢印が転移酵素遺伝子の転写を表す。白抜き三角はトランスポゾン両端の繰り返し配列を表し、網掛け三角はトランスポゾンに隣接するゲノム上の繰り返し配列を表す。また、ＡＴＧは開始であり、ＴＡＧは終止コドンである。
【0011】
図１に示すように、ｉ遺伝子座のアレル変異体のひとつであるｉ４から約４．７ｋｂのＤＮＡがクローニングされ、トランスポゾン様の配列を有しているとされていた。即ち、ショウジョウバエのｈｏｂｏ、トウモロコシの実のＡｃやキンギョソウのＴａｍ３などのｈＡＴファミリーのトランスポゾンのトランスポザーゼ（ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅｓ）に類似したオープンリーディングフレーム及び両端に逆転した配列の繰り返し（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔｓ）を有していた。メダカのこのエレメントは、Ｔｏｌ２と命名された。実験室で使用されるメダカは、一倍体（ｈａｐｌｏｉｄ）のゲノム当たり約１０コピー有している（上述の非特許文献２）。また、Ｔｏｌ２トランスポゾンは、ゼブラフィッシュ細胞（上述の非特許文献３）及びマウスＥＳ細胞（上述の非特許文献４）において転移することが確認されている。
【0012】
そこで、本発明者らは、トランスポゾンを用いて脊椎動物の遺伝子構造を改変する技術を使用することで上記の課題を解決できる可能性を見出し、実際に鋭意研究を重ねた結果、上記の課題を解決できることの知見を得て本発明を完成するに至った。
【0013】
本発明者らは、ＡＣＥ２遺伝子の発現を誘導するプロモーター領域の単離に成功した。図２は、ヒトとゼブラフィッシュのＡＣＥ２遺伝子のプロモーター領域を示す。図２のうち、上の図は、ゼブラフィッシュＡＣＥ遺伝子とプロモーター領域の模式図であり、下の図は、ヒトＡＣＥ遺伝子とプロモーター領域の模式図である。図２において、緑色がタンパク質をコードする遺伝子のエキソン－イントロン構造を示し、水色が転写を制御するプロモーター領域を示す。魚類においてａｃｅ２遺伝子は消化管上皮細胞に特異的に発現するが、本発明者らは、魚類の一つであるゼブラフィッシュａｃｅ２遺伝子の翻訳開始点より上流４，６３０ｂｐからなるプロモーター領域、及びヒトＡＣＥ２遺伝子の翻訳開始点より上流５，７７０ｂｐからなるプロモーター領域が、共にゼブラフィッシュにおいて消化管上皮細胞に選択的な発現を誘導することの知見を得、ヒトＡＣＥ２プロモーターを用いたＡＣＥ２の発現を、個体レベルで簡便に可視化し、かつ、ハイスループットで評価するシステムを提供できるに至った。
【0014】
具体的に、本発明では、以下のようなものを提供する。
【0015】
第１の特徴に係る発明は、ＤＮＡ構築物を脊椎動物細胞に導入する工程と、目的タンパク質の組織特異的な発現の程度を観察する工程を含み、前記ＤＮＡ構築物は、一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列の間に、前記目的タンパク質をコードする外来遺伝子断片を含む遺伝子断片が挿入され、前記外来遺伝子断片の配列が脊椎動物の所定細胞に組織特異的に発現する組織特異的プロモーター配列を有する、創薬スクリーニング方法を提供する。
【0016】
第１の特徴に係る発明によると、外来遺伝子断片の配列に含まれる組織特異的プロモーター配列が脊椎動物の所定細胞に目的タンパク質の選択的な発現を誘導する。これにより、ゲノムＤＮＡプロモーターを用いた目的タンパク質の発現を、生きている脊椎動物の個体レベル、かつ、ハイスループットで評価可能な創薬スクリーニングシステムを提供できる。
【0017】
第２の特徴に係る発明は、第１の特徴に係る発明であって、前記遺伝子断片は、前記外来遺伝子断片の下流に、蛍光タンパク質遺伝子、発光タンパク質遺伝子、活性酸素産生遺伝子及び薬剤耐性遺伝子から選択される選択マーカー遺伝子をさらに含む、創薬スクリーニング方法を提供する。
【0018】
第２の特徴に係る発明によると、脊椎動物の所定細胞において、組織特異的な発光、活性酸素の酸性又は薬剤耐性がみられるため、目的タンパク質の発現の程度をより短時間で評価可能な創薬スクリーニングシステムを、脊椎動物の個体レベルで提供できる。
【0019】
第３の特徴に係る発明は、第２の特徴に係る発明であって、前記遺伝子断片は、前記外来遺伝子断片の下流に、酵母転写因子ＧＡＬ４をコードするＧＡＬ４遺伝子をさらに含み、前記選択マーカー遺伝子は、前記ＧＡＬ４遺伝子の下流に配される、創薬スクリーニング方法を提供する。
【0020】
第３の特徴に係る発明によると、目的タンパク質をコードする外来遺伝子断片に、酵母転写因子ＧＡＬ４のＤＮＡ結合配列をコードするＧＡＬ４又はＧＡＬ４を改変した遺伝子を組み込むことができる。脊椎動物の所定細胞において、当該転写因子に誘導された選択マーカーが組織特異的に発現する。
【0021】
第４の特徴に係る発明は、第１から第３のいずれか１つの特徴に係る発明であって、ゲノム編集法によって前記ＤＮＡ構築物を構築する工程をさらに含む、創薬スクリーニング方法を提供する。
【0022】
第５の特徴に係る発明は、第４の特徴に係る発明であって、前記ゲノム編集法は、ＣＲＩＳＰＲを介した遺伝子編集、Ｂａｓｅ Ｅｄｉｔｏｒ（塩基エディター）を介した遺伝子編集、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰを介した遺伝子編集、及びＰｒｉｍｅ ｅｄｉｔｏｒから選択される１種以上を含む、創薬スクリーニング方法を提供する。
【0023】
第６の特徴に係る発明は、第５の特徴に係る発明であって、前記ゲノム編集法は、ＣＲＩＳＰＲを介した遺伝子編集であり、前記ＣＲＩＳＰＲを介した遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した遺伝子編集、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｎを介した遺伝子編集、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａを介した遺伝子編集から選択される１種以上を含む、創薬スクリーニング方法を提供する。
【0024】
第４から第６の特徴に係る発明によると、ゲノム編集法を用いた遺伝子ノックインによって目的タンパク質の発現の程度をより短時間で評価可能な創薬スクリーニングシステムを、脊椎動物の個体レベルにてより低毒性に、かつ、ハイスループットで提供できる。
【0025】
第７の特徴に係る発明は、第１から第６のいずれか１つの特徴に係る発明であって、前記外来遺伝子断片がアンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）をコードするＤＮＡ断片である、創薬スクリーニング方法を提供する。
【0026】
第７の特徴に係る発明によると、外来遺伝子断片の配列に含まれる組織特異的プロモーター配列が脊椎動物の所定細胞にアンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）の選択的な発現を誘導する。これにより、ヒトゲノムＤＮＡプロモーターを用いたＡＣＥ２の発現を、脊椎動物の個体レベルで簡便に可視化し、かつ、ハイスループットで評価可能な創薬スクリーニングシステムを提供できる。
【0027】
ＡＣＥ２遺伝子は、元々アンジオテンシンＩＩの不活性化に関わる酵素として同定された。レニン－アンジオテンシン・アルドステロン系は、主に血圧や細胞外容量の調節に関わり、アンジオテンシンＩＩは血圧の上昇を引き起こす。アンジオテンシンＩＩの活性化を担うＡｃｅ遺伝子の阻害剤やアンジオテンシンＩＩ受容体であるＡＴ１Ｒ遺伝子のブロッカーは、高血圧やアテローム動脈硬化性心血管疾患に治療に使用されている。Ａｃｅ２ノックアウトマウスでは心不全等の異常が生じることが知られており、これはアンジオテンシンＩＩの恒常的活性化によるものと考えられている。
【0028】
このことから、第７の特徴に係る発明によると、消化管特異的ａｃｅ２プロモーター活性を利用した細胞、又は遺伝子組換え動物を用いて、ａｃｅ２遺伝子の発現制御を指標にした、ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染抑制薬の開発や、血圧調節薬、及び心血管疾患治療薬の開発に繋がり得る。
【0029】
第８の特徴に係る発明は、第１から第７のいずれか１つの特徴に係る発明であって、前記一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列のうち、５’側の塩基配列の長さが１８０ｂｐ以上である、創薬スクリーニング方法を提供する。
【0030】
第９の特徴に係る発明は、第１から第８のいずれか１つの特徴に係る発明であって、前記一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列のうち、３’側の塩基配列の長さが１４０ｂｐ以上である、創薬スクリーニング方法を提供する。
【0031】
第８及び第９の特徴に係る発明によると、脊椎動物の所定細胞に目的タンパク質を選択的に発現可能な創薬スクリーニングシステムを、一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列の長さを不必要に長くすることなく提供できる。
【0032】
第１０の特徴に係る発明は、第１から第９のいずれか１つの特徴に係る発明であって、前記外来遺伝子断片の長さが７００ｂｐ以上１６４ｋｂｐ以下である、創薬スクリーニング方法を提供する。
【0033】
第１０の特徴に係る発明によると、外来遺伝子断片が、７００ｂｐ程度の相対的に短い場合であっても、あるいは１６４ｋｂｐ程度の非常に長い場合であっても、個体レベルで簡便に可視化し、かつ、ハイスループットで評価可能なシステムを利用可能である。これにより、第１０の特徴に係る発明によると、挿入可能な外来遺伝子断片の汎用性が非常に高い評価システムを提供できる。
【0034】
第１１の特徴に係る発明は、第１から第１０のいずれか１つの特徴に係る発明であって、前記ＤＮＡ構築物を用いて前記脊椎動物内で配列番号２のアミノ酸配列であるトランスポゼースを提供するＤＮＡ配列のコドンは、導入する前記脊椎動物の種類に最適化したものである創薬スクリーニング方法を提供する。
【0035】
第１２の特徴に係る発明は、第１から第１１のいずれか１つの特徴に係る発明であって、前記ＤＮＡ構築物を用いてゼブラフィッシュＤａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ内でＴｏｌ２トランスポゾンを転移誘導するトランスポゼースのアミノ酸配列において、配列番号２に記載のアミノ酸配列と比べたときのＮ末端の欠失は、３アミノ酸残基以下である創薬スクリーニング方法を提供する。
【0036】
第１３の特徴に係る発明は、第１から第１２のいずれか１つの特徴に係る発明であって、前記ＤＮＡ構築物を用いてゼブラフィッシュＤａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ内でＴｏｌ２トランスポゾンを転移誘導するトランスポゼースのアミノ酸配列において、配列番号２に記載のアミノ酸配列と比べたときのＣ末端の欠失は、９アミノ酸残基以下である、創薬スクリーニング方法を提供する。
【0037】
トランスポゼース活性は、転移酵素遺伝子のｃＤＮＡを鋳型とし試験管内で転写したｍＲＮＡ、転移酵素遺伝子のｃＤＮＡを組み込んだ発現プラスミド、又は転移酵素遺伝子のｃＤＮＡをゲノムに組み込んだトランスジェニック動物などの方法で供給される。
【0038】
第１１から第１３の特徴に係る発明によると、脊椎動物の任意の細胞でトランスポゾン転移酵素の活性（転移活性）が認められるシステムを、脊椎動物の種類に最適化し、また、一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列の長さをできるだけ短くしつつ提供できる。
【0039】
第１４の特徴に係る発明は、第１から第１３のいずれか１つの特徴に係る発明であって、前記脊椎動物細胞は、魚類の受精卵、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウス胚性幹細胞（マウスＥＳ細胞）、ヒト由来ＨｅＬａ細胞、ヒト由来子宮内膜細胞、ヒトリンパ細胞、及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から選択される１種以上である、創薬スクリーニング方法を提供する。
【0040】
第１５の特徴に係る発明は、第１４の特徴に係る発明であって、前記脊椎動物細胞が魚類の受精卵である、創薬スクリーニング方法を提供する。
【0041】
第１４及び第１５の特徴に係る発明によると、ゲノムＤＮＡプロモーターを用いた目的タンパク質の発現を、生きている脊椎動物である魚類等の個体レベルで簡便に可視化し、かつ、ハイスループットで評価可能な創薬スクリーニングシステムを提供できる。
【0042】
第１６の特徴に係る発明は、ＤＮＡ構築物を脊椎動物細胞に導入する工程を含み、前記ＤＮＡ構築物は、一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列の間に、目的タンパク質をコードする外来遺伝子断片を含む遺伝子断片が挿入され、前記外来遺伝子断片の配列が脊椎動物の所定細胞に組織特異的に発現する組織特異的プロモーター配列を有する、脊椎動物細胞への遺伝子導入方法を提供する。
【0043】
第１７の特徴に係る発明は、魚類の受精卵、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウス胚性幹細胞（マウスＥＳ細胞）、ヒト由来ＨｅＬａ細胞、ヒト由来子宮内膜細胞、ヒトリンパ細胞、及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から選択される１種以上にＤＮＡ構築物が導入されており、前記ＤＮＡ構築物は、一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列の間に、前記目的タンパク質をコードする外来遺伝子断片を含む遺伝子断片が挿入され、前記外来遺伝子断片の配列が脊椎動物の所定細胞に組織特異的に発現する組織特異的プロモーター配列を有する、組換え脊椎動物細胞を提供する。
【0044】
第１６及び第１７の特徴に係る発明によると、外来遺伝子断片の配列に含まれる組織特異的プロモーター配列が脊椎動物の所定細胞に目的タンパク質の選択的な発現を誘導する。これにより、ゲノムＤＮＡプロモーターを用いた目的タンパク質の発現を、生きている脊椎動物の個体レベル、かつ、ハイスループットで評価可能な創薬スクリーニングシステムを提供できる。
【発明の効果】
【0045】
本発明によると、ゲノムＤＮＡプロモーターを用いた目的タンパク質の組織特異的な発現を、生きている脊椎動物の個体レベルで簡便に可視化し、かつ、ハイスループットで評価可能な創薬スクリーニングシステムを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【0046】
【図2】図２は、ヒトとゼブラフィッシュのＡＣＥ２遺伝子のプロモーター領域を説明するための模式図である。図２のうち、上の図は、ゼブラフィッシュＡＣＥ遺伝子とプロモーター領域の模式図であり、下の図は、ヒトＡＣＥ遺伝子とプロモーター領域の模式図である。
【図3】図３は、ノックイントランスジェニックゼブラフィッシュにおいて、ゼブラフィッシュａｃｅ２遺伝子がゼブラフィッシュの消化管上皮細胞に特異的に発現したことを示す図である。図３のうち、上の図は、ノックイントランスジェニックフィッシュ５日胚の明視野画像であり、下の図は、ノックイントランスジェニックフィッシュ５日胚の蛍光画像である。
【図4】図４は、ゼブラフィッシュａｃｅ２プロモーター活性によってゼブラフィッシュａｃｅ２遺伝子がゼブラフィッシュの消化管上皮細胞に特異的に発現したことを示す図である。図４のうち、上の図は、トランスジェニックフィッシュ５日胚の明視野画像であり、下の図は、トランスジェニックフィッシュ５日胚の蛍光画像である。
【図6】図６は、試験例１－４において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いた遺伝子ノックインの概要を説明するための図である。図６のうち、上の図は、ゼブラフィッシュＡＣＥ２遺伝子の構造を示し、下の図は、ノックインに用いたプラスミドの構造を示す。
【図21】図２１は、試験例７において、ヒト用にコドンを最適化した転移酵素発現プラスミド（配列番号１０）とＴｏｌ２トランスポゾンドナーベクターをヒト由来細胞ＨｅＬａ細胞に導入することを説明するための図である。
【図24】図２４は、試験例７において、哺乳動物用にコドンを最適化した転移酵素発現プラスミド（配列番号１０）とＧＦＰ遺伝子をもつＴｏｌ２トランスポゾンドナーベクターをＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）に導入することを説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【0047】
以下、本発明の具体的な実施形態について、詳細に説明するが、本発明は、以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。
【0048】
＜ＤＮＡ構築物＞
本実施形態に記載のＤＮＡ構築物は、一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列の間に、目的タンパク質をコードするヒトゲノムＤＮＡ断片を含む遺伝子断片が挿入されたものである。
本実施形態に記載のＤＮＡ構築物は、一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列の間に、目的タンパク質をコードするヒトゲノムＤＮＡ断片を含む遺伝子断片が挿入されたものである。
【0049】
〔トランスポゾン〕
本実施形態において、「トランスポゾン」とは、転移性遺伝要素であり、一定の構造を保ったまま染色体上を、又は染色体から別の染色体へ転移（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）する遺伝子単位を意味する。
本実施形態において、「トランスポゾン」とは、転移性遺伝要素であり、一定の構造を保ったまま染色体上を、又は染色体から別の染色体へ転移（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）する遺伝子単位を意味する。
【0050】
トランスポゾンは、遺伝子単位の両端に逆向き又は同じ向きの繰り返しのトランスポゾン配列、及び該トランスポゾン配列を認識して、該トランスポゾン配列の間に存在する遺伝子を転移させるトランスポゼース（転移酵素と同じ）をコードする塩基配列を含む。
【0051】
トランスポゾンから翻訳されたトランスポゼースは、トランスポゾンの両端のトランスポゾン配列を認識し、一対のトランスポゾン配列の間に挿入されたＤＮＡ断片を切り出し、転移先へ挿入することで、ＤＮＡの転移を行うことができる。
【0052】
本実施形態において、「トランスポゾン配列」とは、トランスポゼースによって認識されるトランスポゾンの塩基配列を意味する。該塩基配列を含むＤＮＡは、トランスポゼースの作用により転移（ゲノム中のほかの位置に挿入）可能であれば、不完全な繰り返し部分を含んでいてもよく、トランスポゼースに特異的なトランスポゾン配列が存在する。
【0053】
［自律的Ｔｏｌ２トランスポゾン］
通常、トランスポゾンの転移には、トランスポジションを誘導する酵素（トランスポゼース）とこのトランスポゼースにより認識されて転移するＤＮＡ配列（トランスポゾンシスエレメント）が必要になる。Ｔｏｌ２トランスポゾンは、この両者を備えたＤＮＡ型のトランスポゾンである。なお、本願明細書においては、自らトランスポゼースを発現して転移し得るということから、このＴｏｌ２トランスポゾンを自律的Ｔｏｌ２トランスポゾンとも称する。
通常、トランスポゾンの転移には、トランスポジションを誘導する酵素（トランスポゼース）とこのトランスポゼースにより認識されて転移するＤＮＡ配列（トランスポゾンシスエレメント）が必要になる。Ｔｏｌ２トランスポゾンは、この両者を備えたＤＮＡ型のトランスポゾンである。なお、本願明細書においては、自らトランスポゼースを発現して転移し得るということから、このＴｏｌ２トランスポゾンを自律的Ｔｏｌ２トランスポゾンとも称する。
【0054】
メダカ（Ｏｒｙｚｉａｓ ｌａｔｉｐｅｓ）は、東アジアに生息する魚である。メダカのｉ遺伝子座の変異は、メラニン欠乏症及び赤目を生じさせる。このｉ遺伝子座はチロシナーゼの遺伝子をコードしていることが知られている。このｉ遺伝子座のアレル変異体のひとつであるｉ４から約４．７ｋｂのＤＮＡがクローニングされている。このＤＮＡは、トランスポゾン様の配列を有している。即ち、ショウジョウバエのｈｏｂｏ、トウモロコシの実のＡｃやキンギョソウのＴａｍ３などのｈＡＴファミリーのトランスポゾンのトランスポザーゼ（ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅｓ）に類似したオープンリーディイングフレームや短い逆転した配列の繰り返し（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔｓ）を有している。メダカのこのエレメントは、Ｔｏｌ２と称される。
【0055】
配列番号１は、メダカのゲノムＤＮＡから得られるＴｏｌ２の全長配列である。本実施形態に記載の自律的Ｔｏｌ２トランスポゾンＤＮＡの代表としては、配列番号１に記載の塩基配列を挙げることができるが、Ｔｏｌ２トランスポゾンと同様に宿主動物において転移し得るＴｏｌ２トランスポゾンと類似のＤＮＡも含まれる。このような類似のトランスポゾンＤＮＡとしては配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ等を挙げることができる。Ｔｏｌ２トランスポゾンと機能的に同等なＤＮＡを単離するためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者であれば、適宜選択することができる。
【0056】
Ｔｏｌ２トランスポゾンはメダカで見出されたことから、メダカのゲノムＤＮＡより得ることができるが、簡便には、Ｔｏｌ２トランスポゾンを保持した形質転換体から生成することができる。また、Ｔｏｌ２トランスポゾンの類似体は、配列番号１に記載の配列からＤＮＡを人工的に改変することにより、また、メダカ以外の生物種から上記ハイブリダイゼーション法により得ることもできる。
【0057】
［非自律的Ｔｏｌ２トランスポゾン］
ここで、Ｔｏｌ２トランスポゾンは、上述した自律的Ｔｏｌ２トランスポゾンであってもよいが、トランスポゼースが欠損していることにより自律的には対象動物内で転移し得ないＴｏｌ２トランスポゾンであり、Ｔｏｌ２トランスポゼースの供給により転移し得る非自律的Ｔｏｌ２トランスポゾンであることが好ましい。
ここで、Ｔｏｌ２トランスポゾンは、上述した自律的Ｔｏｌ２トランスポゾンであってもよいが、トランスポゼースが欠損していることにより自律的には対象動物内で転移し得ないＴｏｌ２トランスポゾンであり、Ｔｏｌ２トランスポゼースの供給により転移し得る非自律的Ｔｏｌ２トランスポゾンであることが好ましい。
【0058】
Ｔｏｌ２トランスポゾンは自律的に転移し得るため、一旦、対象動物の染色体内にＴｏｌ２トランスポゾンが転移した後に、これが切り出され、別の部位に転移する可能性がある。このような自律的トランスポゾンは、単独で哺乳動物の染色体変異を導入し得るが、転移した位置から別の位置へ転移する可能性がある点では不安定といえる。そのため、Ｔｏｌ２トランスポゾンにおいて、トランスポゼースを欠損させて自律的に転移する能力を欠損させることにより、染色体に転移した後の再転移を抑制し、安定して染色体内に変異を導入して、遺伝子改変を行うことができる。こうした非自律的Ｔｏｌ２トランスポゾンは、上述した配列番号１に記載の塩基配列を有するトランスポゾンＤＮＡあるいは同等の機能を有する類似のＤＮＡ中、トランスポゼースをコードした領域に塩基配列の欠失、挿入又は置換が加えられ、トランスポゼース活性を失ったＤＮＡが挙げられる。
【0059】
［トランスポゼースのアミノ酸配列］
対象動物内でＴｏｌ２トランスポゾンを転移誘導し得るトランスポゼースの例として、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＴｏｌ２トランスポゼースが挙げられる。トランスポゼースの配列は、この配列に限定されるものではない。例えば、対象動物内でＴｏｌ２トランスポゼースと同様の活性を有し、配列番号２記載のアミノ酸配列に類似したタンパク質も含まれる。この類似したタンパク質としては、配列番号２と比べ１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有したトランスポゼース活性を有するタンパク質、他の生物由来のＴｏｌ２トランスポゼースに類似したタンパク質及び人工的に創製したＴｏｌ２トランスポゼース変異体が含まれる。
対象動物内でＴｏｌ２トランスポゾンを転移誘導し得るトランスポゼースの例として、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＴｏｌ２トランスポゼースが挙げられる。トランスポゼースの配列は、この配列に限定されるものではない。例えば、対象動物内でＴｏｌ２トランスポゼースと同様の活性を有し、配列番号２記載のアミノ酸配列に類似したタンパク質も含まれる。この類似したタンパク質としては、配列番号２と比べ１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有したトランスポゼース活性を有するタンパク質、他の生物由来のＴｏｌ２トランスポゼースに類似したタンパク質及び人工的に創製したＴｏｌ２トランスポゼース変異体が含まれる。
【0060】
上記「アミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列」の語において、アミノ酸の変異数や変異部位はＴｏｌ２トランスポゼースにおけるトランスポジション誘導活性が保持される範囲内であれば制限はない。アミノ酸の変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内であると考えられる。
【0061】
配列番号２のアミノ酸配列であるトランスポゼースを提供するＤＮＡ配列のコドンは、任意に変更することが可能で、導入する動物種に最適化したものに改変することが望ましい。
【0062】
Ｔｏｌ２トランスポゾンを転移誘導し得るトランスポゼースの特性について明らかすることが好ましい。そこで、トランスポゼースのアミノ酸配列について、Ｎ末端及びＣ末端に着目する。本実施形態に記載の発明において、ＤＮＡ構築物を用いてゼブラフィッシュＤａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ内でＴｏｌ２トランスポゾンを転移誘導するトランスポゼースのアミノ酸配列において、Ｎ末端は、配列番号２に記載のアミノ酸配列のＮ末端から４アミノ酸残基以上欠失すると、トランスポゼースの活性（転移活性）が失活する。そのため、Ｎ末端のアミノ酸配列において、欠失は３アミノ酸残基以下であり、２アミノ酸残基以下であることがより好ましく、１アミノ酸残基以下であることがさらに好ましい。したがって、Ｔｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列を構成する際、生成されるアミノ酸のＮ末端側については、配列番号２に記載のアミノ酸配列のＮ末端と一致するよう、Ｔｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列を構成することが好ましい。
【0063】
また、Ｃ末端についてみると、ＤＮＡ構築物を用いてゼブラフィッシュＤａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ内でＴｏｌ２トランスポゾンを転移誘導するトランスポゼースのアミノ酸配列において、Ｃ末端は、配列番号２に記載のアミノ酸配列のＣ末端から１０アミノ酸残基以上欠失すると、トランスポゼースの活性（転移活性）が失活する。そのため、Ｃ末端のアミノ酸配列において、欠失は９アミノ酸残基以下である。したがって、Ｔｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列を構成する際、生成されるアミノ酸のＣ末端側については、長さにある程度の自由度をもたせることができる。
【0064】
Ｔｏｌ２トランスポゼースの調製は、メダカを用いて行うこともできるが、簡便には、Ｔｏｌ２トランスポゼースをコードしたＤＮＡを担持したプラスミド（ベクターとも称される。）により形質転換された形質転換体を用いて生成することができる。また、ゲノム編集法によってＴｏｌ２トランスポゼースをコードしたＤＮＡ構築物を構築することによって生成することもできる。
【0065】
ゲノム編集法は、ＣＲＩＳＰＲを介した遺伝子編集、Ｂａｓｅ Ｅｄｉｔｏｒ（塩基エディター）を介した遺伝子編集、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰを介した遺伝子編集、及びＰｒｉｍｅ ｅｄｉｔｏｒから選択される１種以上を含む。中でも、ゲノム編集法がＣＲＩＳＰＲを介した遺伝子編集である場合、ＣＲＩＳＰＲを介した遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した遺伝子編集、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｎを介した遺伝子編集、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａを介した遺伝子編集から選択される１種以上を含む。
【0066】
トランスポゼースをコードした領域における塩基配列の欠失、挿入又は置換は、トランスポゼース活性を失い得る変異であれば、変異領域の塩基数、種類などには限定されない。また、トランスポゼースをコードした領域に限られず非コード領域の欠失、挿入、置換などの変異によりトランスポゼースの発現を阻害し得る変異をも含めることができる。但し、これら変異はトランスポゾンとして転移し得る能力を担保し得るためにトランスポジションのシスエレメントを欠損しない範囲に限られる。このようなトランスポジションのシスエレメントは、配列番号１に記載の塩基配列を系統的に欠失させたシリーズを当業者に公知の方法あるいは市販のディリーションキットなどを用いて作製し、転移に必要な領域を解析することにより同定することができる。
【0067】
トランスポゼースコード領域の欠失変異の一例としては、図１に示すようなＴｏｌ２トランスポゾンＤＮＡにおいてエキソン２の５’側からエキソン４の中央付近（具体的には配列番号１における第２２３０塩基から第４１４６塩基）にかけて欠失を有するものを挙げることができるが、これよりも長い欠失、あるいは短い欠失であってもよく、また欠失部位は複数に分断されていてもよい。
【0068】
また、挿入変異の一例としては、Ｔｏｌ２トランスポゾン上のトランスポゼースがコードされた領域等に、リンカー配列、制限酵素認識配列、マルチクローニングサイトあるいは任意の遺伝子を挿入することにより、トランスポゼース活性を欠損させるような変異が挙げられる。
【0069】
また、置換変異の一例としては、トランスポゼースコード領域等の塩基配列を他の塩基配列に置換して、トランスポゼースの転移誘導活性を欠損させる置換変異が挙げられる。これら欠失、挿入、置換変異は単独でも組み合わせて用いてもよい。このような変異の組合せの一例を挙げれば、配列番号３に記載の塩基配列からなる非自律的トランスポゾンＤＮＡを示すことができる。このＤＮＡは、配列番号１に記載のＴｏｌ２トランスポゾンＤＮＡ中、第２２３０塩基から第４１４６塩基が欠失され、この欠失領域に「ＡＧＡＴＣＴＣ ＡＴＡＴＧＣＴＣＧＡ ＧＧＧＣＣＣ」からなるＸｈｏＩ認識配列を含むリンカー配列が挿入されている。
【0070】
［塩基配列］
一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列としては、配列表の配列番号１で表されるＴｏｌ２トランスポゾンの塩基配列の１番目から２２２９番目の塩基配列及び４１４８番目から４６８２番目の塩基配列が挙げられる。
一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列としては、配列表の配列番号１で表されるＴｏｌ２トランスポゾンの塩基配列の１番目から２２２９番目の塩基配列及び４１４８番目から４６８２番目の塩基配列が挙げられる。
【0071】
本実施形態に記載の発明に用いるトランスポゾン配列には、上記のトランスポゾン由来のトランスポゾン配列の部分配列を用いること、塩基配列の長さを調節すること、及び塩基配列の付加、欠失又は置換による改変を行うことにより、転移反応が制御されたトランスポゾン配列も含まれる。
【0072】
トランスポゾンベクターの操作が容易になる点、及びトランスポゾンベクター内にクローニングされた外来遺伝子の発現や、トランスポゾン集積部位（transposon integration site）近傍の染色体遺伝子の発現に及ぼすＴｏｌ２配列の影響を最小限に抑える点で、ベクターから不要な部分を除去することが好ましい。
【0073】
（５’末端）
活性のある目的タンパク質を発現させる観点から、一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列のうち５’末端の塩基配列は、１８０ｂｐ以上であることを要する。すなわち、５’末端の塩基配列は、配列表の配列番号１で表されるＴｏｌ２トランスポゾンの塩基配列における、１番目から１８０番目の塩基配列（配列番号４）を含むことを要する。
活性のある目的タンパク質を発現させる観点から、一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列のうち５’末端の塩基配列は、１８０ｂｐ以上であることを要する。すなわち、５’末端の塩基配列は、配列表の配列番号１で表されるＴｏｌ２トランスポゾンの塩基配列における、１番目から１８０番目の塩基配列（配列番号４）を含むことを要する。
【0074】
５’末端の塩基配列の長さは、短いほど好ましいため、特に限定されない。５’末端の塩基配列の長さは、２２２９ｂｐ以下であり、１０００ｂｐ以下であることが好ましく、５００ｂｐ以下であることがより好ましく、３００ｂｐ以下であることがさらに好ましく、２００ｂｐ以下であることがよりさらに好ましく、１９０ｂｐ以下であることが特に好ましい。これにより、脊椎動物の所定細胞に目的タンパク質を選択的に発現可能な創薬スクリーニングシステムを、一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列の長さを不必要に長くすることなく提供できる。
【0075】
一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列のうち５’末端の塩基配列のことを、以下「Ｔｏｌ２－Ｌ配列」とも称する。
【0076】
なお、５’末端の塩基配列を外側から１９ｂｐ、６ｂｐと欠失させると、いずれも転移活性を失う。そのため、５’末端の塩基配列を外側から欠失させることは、できない。
【0077】
（３’末端）
５’末端と同様、３’末端についてもまた、ベクターから不要な部分を除去することが好ましい。
５’末端と同様、３’末端についてもまた、ベクターから不要な部分を除去することが好ましい。
【0078】
活性のある目的タンパク質を発現させる観点から、一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列のうち３’末端の塩基配列は、１４０ｂｐ以上であることを要する。すなわち、３’末端の塩基配列は、配列表の配列番号１で表されるＴｏｌ２トランスポゾンの塩基配列における、４５４３番目から４６８２番目の塩基配列（配列番号５）を含むことを要する。
【0079】
３’末端の塩基配列の長さは、短いほど好ましいため、特に限定されない。３’末端の塩基配列の長さは、５３５ｂｐ以下であり、３００ｂｐ以下であることが好ましく、２００ｂｐ以下であることがより好ましく、１７０ｂｐ以下であることがさらに好ましく、１６０ｂｐ以下であることがよりさらに好ましく、１５０ｂｐ以下であることが特に好ましい。これにより、脊椎動物の所定細胞に目的タンパク質を選択的に発現可能な創薬スクリーニングシステムを、一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列の長さを不必要に長くすることなく提供できる。
【0080】
上述したとおり、トランスポゾンの転移反応は、一対（二つ）のトランスポゾン配列の間に含まれる塩基配列の長さを短くすることでその転移反応を増加させることができ、長くすることで転移反応を低下させることができる。本実施形態に記載の発明によると、５’末端の塩基配列は、１８０ｂｐ以上であればよく、３’末端の塩基配列は、１４０ｂｐ以上であればよいため、転移反応の効率を自在に変更することができる。
【0081】
一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列のうち３’末端の塩基配列のことを、以下「Ｔｏｌ２－Ｒ配列」とも称する。
【0082】
このような塩基配列を用いて染色体に変異導入を行った場合、本ＤＮＡ自体はトランスポゼース活性を保持しないため、トランスポゼースが外部から供給されない限り、本ＤＮＡは染色体上に安定的にとどまることができる。そのため、この変異導入による機能遺伝子の同定や、安定したトランスジェニック個体の作製に有利となる。
【0083】
（末端反復配列：ダイレクトリピート配列）
本実施形態に記載の発明では、５’末端及び３’末端の両端における８ｂｐの末端反復配列（ダイレクトリピート配列）を欠いたＴｏｌ２ベクターであっても、活性（転移活性）が見られる。よって、ダイレクトリピート配列は、転移反応に不要である。
本実施形態に記載の発明では、５’末端及び３’末端の両端における８ｂｐの末端反復配列（ダイレクトリピート配列）を欠いたＴｏｌ２ベクターであっても、活性（転移活性）が見られる。よって、ダイレクトリピート配列は、転移反応に不要である。
【0084】
しかしながら、切り出し後の塩基配列は、
野生型：ggcatatg GTTCTTGA ccccctac
欠失型：ggcatat CTTGA ccccctac
となっており、正確な転移反応のためには、ダイレクトリピートが必要である。
野生型：ggcatatg GTTCTTGA ccccctac
欠失型：ggcatat CTTGA ccccctac
となっており、正確な転移反応のためには、ダイレクトリピートが必要である。
【0085】
〔トランスポゾンの転移反応〕
トランスポゾンの転移反応の制御は、トランスポゼースによるトランスポゾン配列の認識を促進又は抑制することによって、転移反応を促進又は抑制することができる。
トランスポゾンの転移反応の制御は、トランスポゼースによるトランスポゾン配列の認識を促進又は抑制することによって、転移反応を促進又は抑制することができる。
【0086】
本明細書において「トランスポゼース」とは、トランスポゾン配列を有する塩基配列を認識して、該塩基配列の間に存在するＤＮＡを染色体上、又は染色体から別の染色体へ転移させる酵素を意味する。
【0087】
トランスポゼース活性は、転移酵素遺伝子のｃＤＮＡを鋳型とし試験管内で転写したｍＲＮＡ、転移酵素遺伝子のｃＤＮＡを組み込んだ発現プラスミド、又は転移酵素遺伝子のｃＤＮＡをゲノムに組み込んだトランスジェニック動物等の方法で供給される。
【0088】
トランスポゼースは、天然型の酵素を用いてもいいし、トランスポゼースと同様の転移活性を保持していれば、その一部のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されていてもよい。トランスポゼースの酵素活性を制御することで、トランスポゾン配列の間に存在するＤＮＡの転移反応を制御することができる。
【0089】
トランスポゼースと同様の転移活性を保持するかを解析するには、２－コンポーネント解析システムにより測定することができる。具体的には、別々の、Ｔｏｌ２トランスポゼースを欠損したＴｏｌ２トランスポゾン（Ｔｏｌ２由来非自律性トランスポゾン）を含むプラスミドとＴｏｌ２トランスポゼースを含むプラスミドとを用いて、トランスポゼースの作用により非自律性Ｔｏｌ２エレメントが対象動物細胞の染色体内に転移、挿入し得るかを解析することができる。
【0090】
〔遺伝子断片〕
遺伝子断片は、目的タンパク質をコードする外来遺伝子断片を含む。また、必須ではないが、遺伝子断片は、外来遺伝子断片の下流に選択マーカー遺伝子をさらに含むことが好ましい。
遺伝子断片は、目的タンパク質をコードする外来遺伝子断片を含む。また、必須ではないが、遺伝子断片は、外来遺伝子断片の下流に選択マーカー遺伝子をさらに含むことが好ましい。
【0091】
また、遺伝子断片は、外来遺伝子断片の下流に、酵母転写因子ＧＡＬ４をコードするＧＡＬ４遺伝子をさらに含むことが好ましい。この場合、選択マーカー遺伝子をＧＡＬ４遺伝子の下流に配することができる。
【0092】
本明細書において「発現プラスミド」とは、目的タンパク質を発現させるために、対象動物細胞を形質転換させるために用いる発現プラスミドを意味する。本発明で用いる発現プラスミドは、発現カセットの両側に少なくとも１対のトランスポゾン配列が存在する構造を有する。
【0093】
本明細書において「発現カセット」とは、目的タンパク質を発現させるために必要な遺伝子発現制御領域及び目的タンパク質をコードする配列を有する核酸配列を意味する。該遺伝子発現制御領域としては、例えば、エンハンサー、プロモーター及びターミネーターなどが挙げられる。発現カセットには、選択マーカー遺伝子を含んでいても良い。
【0094】
［外来遺伝子断片］
本実施形態において、外来遺伝子断片とは、ＤＮＡ構築物を導入する対象となる脊椎動物とは異なる生物に由来するゲノムＤＮＡ断片をいう。ここで、生物は、脊椎動物を含み、脊椎動物に限らず、真核生物（動物、植物、菌類、原生生物）、細菌（バクテリア）及び古細菌（アーキア）のいずれも含み得る。
本実施形態において、外来遺伝子断片とは、ＤＮＡ構築物を導入する対象となる脊椎動物とは異なる生物に由来するゲノムＤＮＡ断片をいう。ここで、生物は、脊椎動物を含み、脊椎動物に限らず、真核生物（動物、植物、菌類、原生生物）、細菌（バクテリア）及び古細菌（アーキア）のいずれも含み得る。
【0095】
（目的タンパク質）
外来遺伝子断片は、目的タンパク質をコードする。
外来遺伝子断片は、目的タンパク質をコードする。
【0096】
目的タンパク質は、脊椎動物の所定細胞に組織特異的に発現可能であれば、特に限定されない。このような目的タンパク質の例として、ヒト由来アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）のほか、ＧＦＰ、人工抗体等が挙げられる。
【0097】
（組織特異的プロモーター配列）
外来遺伝子断片は、魚類の所定細胞に組織特異的に発現する組織特異的プロモーター配列を有する。
外来遺伝子断片は、魚類の所定細胞に組織特異的に発現する組織特異的プロモーター配列を有する。
【0098】
例えば、ヒト由来アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）をコードするＤＮＡ断片は、ヒトＡＣＥ２遺伝子の翻訳開始点より上流５７７０ｂｐからなるプロモーター領域を含み、哺乳動物（ヒト）及び魚類（ゼブラフィッシュ）の双方で消化管上皮細胞に選択的な発現を誘導する。
【0099】
（外来遺伝子断片の大きさ）
本実施形態に記載の発明では、外来遺伝子断片の大きさに関して汎用性が非常に高いことを特徴とする。
本実施形態に記載の発明では、外来遺伝子断片の大きさに関して汎用性が非常に高いことを特徴とする。
【0100】
例えば、外来遺伝子断片は、７００ｂｐ程度の相対的に短い場合であってもよい。また、外来遺伝子断片は、１６４ｋｂｐ程度の非常に長い場合であってもよい。本実施形態に記載の発明によると、外来遺伝子断片が、７００ｂｐ程度の相対的に短い場合であっても、あるいは１６４ｋｂｐ程度の非常に長い場合であっても、個体レベル、かつ、ハイスループットで評価可能なシステムを利用可能である。これにより、挿入可能な外来遺伝子断片の汎用性が非常に高い評価システムを提供できる。
【0101】
［選択マーカー遺伝子］
「選択マーカー遺伝子」とは、人工的に構築されたプラスミド（ベクター）が導入された細胞と該ベクターを欠く細胞とを区別するために使用することができる任意のマーカー遺伝子を意味する。
「選択マーカー遺伝子」とは、人工的に構築されたプラスミド（ベクター）が導入された細胞と該ベクターを欠く細胞とを区別するために使用することができる任意のマーカー遺伝子を意味する。
【0102】
選択マーカー遺伝子は、蛍光タンパク質遺伝子、発光タンパク質遺伝子、活性酸素産生遺伝子及び薬剤耐性遺伝子から選択される。
【0103】
蛍光タンパク質とは、紫外線等の短波長の光を照射すると蛍光を発する蛋白質をいい、蛍光タンパク質遺伝子とは、当該蛍光タンパク質をコードする遺伝子をいう。蛍光タンパク質として、緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、黄色蛍光タンパク質ＹＦＰ（Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、シアン色蛍光タンパク質ＣＦＰ（Ｃｙａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、及び赤色蛍光タンパク質ＲＦＰ（Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）等が挙げられる。
【0104】
発光タンパク質とは、短波長の光といった外部光源を要することなく自ら発光するタンパク質をいい、発光タンパク質遺伝子とは、当該発光タンパク質をコードする遺伝子をいう。発光タンパク質として、イクオリン等が挙げられる。
【0105】
活性酸素産生遺伝子とは、活性酸素生成酵素をコードする遺伝子をいう。活性酸素産生遺伝子の例として、キサンチンオキシダーゼ遺伝子及び一酸化窒素合成酵素遺伝子等が挙げられる。
【0106】
薬剤耐性遺伝子とは、タンパク質合成の阻害剤に対する耐性をコードする遺伝子をいう。薬剤耐性遺伝子の例として、ネオマイシン耐性遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、及びシクロヘキシミド耐性遺伝子等が挙げられる。
【0107】
本実施形態では、脊椎動物の所定細胞において、目的タンパク質の発現の程度を視覚的により短時間で評価可能なシステムを脊椎動物の個体レベルで提供できることから、選択マーカー遺伝子は、蛍光タンパク質遺伝子又は発光タンパク質遺伝子であることが好ましい。
【0108】
［誘導性プロモーターシステム］
必須ではないが、遺伝子断片は、誘導性プロモーターシステムをコードする遺伝子を含むことが好ましい。誘導性プロモーターシステムにより、目的タンパク質及び選択マーカーの発現を人為的にコントロールすることができる。
必須ではないが、遺伝子断片は、誘導性プロモーターシステムをコードする遺伝子を含むことが好ましい。誘導性プロモーターシステムにより、目的タンパク質及び選択マーカーの発現を人為的にコントロールすることができる。
【0109】
誘導性プロモーターシステムの種類は特に限定されず、ＧＡＬ４／ＵＡＳシステム、テトラサイクリン依存性プロモーター調節システム、メタロチオニンプロモーターシステム、ＩＰＴＧ／ｌａｃＩプロモーターシステム、及びエクジソンプロモーターシステム等が挙げられる。
【0110】
中でも、脊椎動物の所定細胞において、選択マーカーの発現を組織特異的にかつ低毒性で誘導できることから、プロモーターシステムは、ＧＡＬ４／ＵＡＳシステムであることが好ましい。プロモーターシステムとしてＧＡＬ４／ＵＡＳシステムを採用する場合、遺伝子断片は、前記ヒトゲノムＤＮＡ断片の下流に、酵母転写因子ＧＡＬ４をコードするＧＡＬ４遺伝子をさらに含み、選択マーカー遺伝子は、ＧＡＬ４遺伝子の下流に配される。
【0111】
ＧＡＬ４タンパク質は酵母由来の転写因子で、認識配列（ＵＡＳ）に結合することにより、転写を活性化する。細胞・組織特異的にＧＡＬ４を発現する系統とＵＡＳの下流に興味の対象となる遺伝子をもつ系統をかけ合わせることにより、特異的な細胞・組織において標的遺伝子の発現を誘導できる。
【0112】
〔プラスミド〕
プラスミドとしては特に限定はなく、トランスポゼース遺伝子を組み込んだプラスミドを導入する宿主細胞、用途などに応じて、当業者において知られている発現プラスミドから適宜選択して使用することができる。
プラスミドとしては特に限定はなく、トランスポゼース遺伝子を組み込んだプラスミドを導入する宿主細胞、用途などに応じて、当業者において知られている発現プラスミドから適宜選択して使用することができる。
【0113】
Ｔｏｌ２トランスポゾンＤＮＡそのままをトランスポゾンドナー（供与体）として用いることもできるが、トランスポゾンプラスミドを導入する対象動物あるいはその細胞に導入する場合などにおいては、端部からのデグラデーションを防止等するために、このＤＮＡをプラスミド（ベクター）につなぐことができる。このプラスミドは、導入する宿主や目的に応じて選択することができる。
【0114】
＜遺伝子導入方法＞
本実施形態において、遺伝子導入方法は、上述したＤＮＡ構築物を脊椎動物細胞に導入する工程を含む。
本実施形態において、遺伝子導入方法は、上述したＤＮＡ構築物を脊椎動物細胞に導入する工程を含む。
【0115】
〔ＤＮＡ構築物の導入対象〕
ＤＮＡ構築物の導入対象となる宿主は、脊椎動物であれば特に限定されるものでなく、魚類、チャイニーズハムスター、マウス、ヒト等が挙げられる。中でも、細胞の倍化時間が短く、細胞の継代培養が可能で安定的に目的タンパク質を発現できる細胞をもつ宿主であることが好ましく、その観点から、宿主は、魚類であることが好ましく、分類Ｃｙｐｒｉｎｉｄａｅ（コイ科）、Ｃｉｃｈｌｉｄａｅ（シクリッド科，カワスズメ科とも称される）、Ｓａｌｍｏｎｉｄａｅ（サケ科）、Ｃｌａｒｉｉｄａｅ（ヒレナマズ科）及びＩｃｔａｌｕｒｉｄａｅ（アメリカナマズ科）等に属する魚類であることがより好ましい。
ＤＮＡ構築物の導入対象となる宿主は、脊椎動物であれば特に限定されるものでなく、魚類、チャイニーズハムスター、マウス、ヒト等が挙げられる。中でも、細胞の倍化時間が短く、細胞の継代培養が可能で安定的に目的タンパク質を発現できる細胞をもつ宿主であることが好ましく、その観点から、宿主は、魚類であることが好ましく、分類Ｃｙｐｒｉｎｉｄａｅ（コイ科）、Ｃｉｃｈｌｉｄａｅ（シクリッド科，カワスズメ科とも称される）、Ｓａｌｍｏｎｉｄａｅ（サケ科）、Ｃｌａｒｉｉｄａｅ（ヒレナマズ科）及びＩｃｔａｌｕｒｉｄａｅ（アメリカナマズ科）等に属する魚類であることがより好ましい。
【0116】
Ｃｙｐｒｉｎｉｄａｅ（コイ科）に属する魚類として、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｎｏ ｒｅｒｉｏ）及びコイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ ｃａｒｐｉｏ）等が挙げられる。Ｃｉｃｈｌｉｄａｅ（シクリッド科）に属する魚類として、ティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）等が挙げられる。Ｓａｌｍｏｎｉｄａｅ（サケ科）に属する魚類として、ニジマス（Ｏｒｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）等が挙げられる。Ｃｌａｒｉｉｄａｅ（ヒレナマズ科）に属する魚類として、アフリカナマズ（Ｃｌａｒｉａｓ ｇａｒｉｅｐｉｎｕｓ）等が挙げられる。また、Ｉｃｔａｌｕｒｉｄａｅ（アメリカナマズ科）に属する魚類として、アメリカナマズ（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ ｐｕｎｃｔａｔｕｓ）等が挙げられる。
【0117】
中でも、（１）雑食で繁殖、大量飼育が容易である、（２）多産で１組の雌雄が一度に数百の卵を産み、世代時間が比較的短い、（３）胚が透明で、体外で発生が進むため初期発生過程の観察、操作が容易であることから、宿主は、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｎｏ ｒｅｒｉｏ）であることが好ましい。
【0118】
細胞の種類は特に限定されないが、細胞の倍化時間が短いことが好ましく、例えば、魚類の受精卵、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウス胚性幹細胞（マウスＥＳ細胞）、ヒト由来ＨｅＬａ細胞、ヒト由来子宮内膜細胞、ヒトリンパ細胞、及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から選択される１種以上であることが好ましい。中でも、いったん遺伝子を導入すれば、その後に成長する個体の細胞には全て遺伝子が導入された状態になるため、個体への導入の際には細胞の種類は、受精卵であることが好ましい。
【0119】
宿主細胞に、上記のトランスポゾン配列を含むＤＮＡ構築物を導入する方法は、特に限定はなく、例えば、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、ジーンガン法及びリポフェクション法などを用いることができる。
【0120】
宿主細胞は、染色体ＤＮＡの改変及び外来性遺伝子の導入等により、タンパク質の発現に適するように改変してもよい。
【0121】
宿主細胞に導入する転移酵素発現プラスミドの量に応じて、細胞ゲノムへの組み込み頻度が上昇する。ただし、発現プラスミドの量には最適値があり、発現プラスミドの量が多いことが好ましい。なお、発現プラスミドの量が多すぎると細胞ゲノムへの組み込み頻度が下がることに留意する必要がある。
【0122】
本実施形態に記載の発明は、Ｔｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列を用いることで、魚類から哺乳類まで種々の脊椎動物にて目的タンパク質を発現させることができる。実際、魚類細胞のみならず、チャイニーズハムスター卵巣細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ、ＣＨＯ細胞）、マウス胚性幹細胞（マウスＥＳ細胞）、ヒト由来ＨｅＬａ細胞、ヒト由来子宮内膜細胞、ヒトリンパ細胞、及び人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ｉＰＳ細胞）等にも応用可能である。そのため、本実施形態に記載の発明によると、目的タンパク質の発現を、共通の手法にて、生きている脊椎動物である魚類の個体レベル、かつ、ハイスループットで評価した後、哺乳動物での評価に迅速に移行できるため、創薬スクリーニングシステムの効率が高まる。
【0123】
＜創薬スクリーニング方法＞
本実施形態において、創薬スクリーニング方法は、上述した遺伝子導入方法を経て目的タンパク質の組織特異的な発現の程度を観察することを含む。この方法によると、ゲノムＤＮＡプロモーターを用いた目的タンパク質の発現を、生きている脊椎動物の個体レベルで簡便に可視化し、かつ、ハイスループットで評価可能な創薬スクリーニングシステムを提供できる。
本実施形態において、創薬スクリーニング方法は、上述した遺伝子導入方法を経て目的タンパク質の組織特異的な発現の程度を観察することを含む。この方法によると、ゲノムＤＮＡプロモーターを用いた目的タンパク質の発現を、生きている脊椎動物の個体レベルで簡便に可視化し、かつ、ハイスループットで評価可能な創薬スクリーニングシステムを提供できる。
【0124】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【実施例0125】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、上述の説明及び以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。したがって、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、請求の範囲によってのみ限定される。
【0126】
以降に記述するクローニング等、遺伝子組換えに関する各種実験技術については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；モレキュラークローニング第４版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）及びＦｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ発行、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ等に記載の遺伝子工学的方法に準じて行った。
【0127】
＜試験例１＞ ゼブラフィッシュａｃｅ２遺伝子及びヒトＡＣＥ２遺伝子の発現解析
本試験では、ゼブラフィッシュのａｃｅ２プロモーターとヒトのＡＣＥ２プロモーターの活性を、個体レベルでのハイスループットな解析が容易なゼブラフィッシュ幼生を用いて評価した。
本試験では、ゼブラフィッシュのａｃｅ２プロモーターとヒトのＡＣＥ２プロモーターの活性を、個体レベルでのハイスループットな解析が容易なゼブラフィッシュ幼生を用いて評価した。
【0128】
〔試験例１－１〕 予備試験
まず、ゼブラフィッシュ幼生においてａｃｅ２遺伝子座にリポーター遺伝子をノックインし、発現解析を行った。図３は、その結果である。図３のうち、上の図は、ノックイントランスジェニックフィッシュ５日胚の明視野画像であり、下の図は、ノックイントランスジェニックフィッシュ５日胚の蛍光画像である。図３から、ａｃｅ２遺伝子が消化管上皮細胞特異的に発現していることが確認された。
まず、ゼブラフィッシュ幼生においてａｃｅ２遺伝子座にリポーター遺伝子をノックインし、発現解析を行った。図３は、その結果である。図３のうち、上の図は、ノックイントランスジェニックフィッシュ５日胚の明視野画像であり、下の図は、ノックイントランスジェニックフィッシュ５日胚の蛍光画像である。図３から、ａｃｅ２遺伝子が消化管上皮細胞特異的に発現していることが確認された。
【0129】
〔試験例１－２〕 ゼブラフィッシュａｃｅ２遺伝子の発現解析
ゼブラフィッシュａｃｅ２遺伝子の発現を誘導するゲノムＤＮＡ領域を単離した。単離は、ゼブラフィッシュａｃｅ２遺伝子の翻訳開始点より上流４，６３０ｂｐからなるプロモーターをＰＣＲ反応により単離することで行なった。用いた遺伝子のＤＮＡは、その両端配列のプライマーを作製し、適当なＤＮＡソースを鋳型としてＰＣＲを行うことにより取得した。プライマーの端には後の遺伝子操作のために制限酵素切断部位を付加した。取得したＤＮＡの塩基配列を配列番号６に示す。
ゼブラフィッシュａｃｅ２遺伝子の発現を誘導するゲノムＤＮＡ領域を単離した。単離は、ゼブラフィッシュａｃｅ２遺伝子の翻訳開始点より上流４，６３０ｂｐからなるプロモーターをＰＣＲ反応により単離することで行なった。用いた遺伝子のＤＮＡは、その両端配列のプライマーを作製し、適当なＤＮＡソースを鋳型としてＰＣＲを行うことにより取得した。プライマーの端には後の遺伝子操作のために制限酵素切断部位を付加した。取得したＤＮＡの塩基配列を配列番号６に示す。
【0130】
次に、ゼブラフィッシュゲノムからａｃｅ２上流領域をクローニングし、リポーター遺伝子に接続しトランスジェニックゼブラフィッシュを作製した。具体的には、プロモーター領域のＤＮＡをＴｏｌ２トランスポゾンベクターにクローニングして転移酵素をコードするｍＲＮＡと共に、ゼブラフィッシュ受精卵にマイクロインジェクションし、トランスジェニックゼブラフィッシュを作製した。
【0131】
タンパク質発現用プラスミドには、一対のＴｏｌ２トランスポゾン配列の間に挿入された、ａｃｅ２遺伝子の発現を誘導するゲノムＤＮＡ断片及び蛍光タンパク質遺伝子を含む、遺伝子発現カセットを含むプラスミドを用いた。
【0132】
トランスポゾン配列は、非自律性Ｔｏｌ２トランスポゾンの塩基配列（配列番号３）のうち、１番目から２００番目の塩基配列（Ｔｏｌ２－Ｌ配列）（配列番号７）と、２６３９番目から２７８８番目の塩基配列（Ｔｏｌ２－Ｒ配列）（配列番号８）の塩基配列を用いた。
【0133】
ａｃｅ２プロモーターの発現解析を行ったところ、消化管上皮細胞特異的に発現を誘導する活性をしていた。結果を図４に示す。図４のうち、上の図は、トランスジェニックフィッシュ５日胚の明視野画像であり、下の図は、トランスジェニックフィッシュ５日胚の蛍光画像である。図４から、トランスジェニックゼブラフィッシュにおいて、リポーター遺伝子ＧＦＰが消化管上皮細胞に組織特異的に発現することを発見した。
【0134】
〔試験例１－３〕 ヒトＡＣＥ２遺伝子の発現解析 その１
ヒトＡＣＥ２遺伝子の発現を誘導するゲノムＤＮＡ領域を単離した。単離は、ヒトＡＣＥ２遺伝子の翻訳開始点より上流５，７７０ｂｐからなるプロモーター領域をＰＣＲ反応により単離することで行なった。用いた遺伝子のＤＮＡは、その両端配列のプライマーを作製し、適当なＤＮＡソースを鋳型としてＰＣＲを行うことにより取得した。プライマーの端には後の遺伝子操作のために制限酵素切断部位を付加した。取得したＤＮＡの塩基配列を配列番号９に示す。
ヒトＡＣＥ２遺伝子の発現を誘導するゲノムＤＮＡ領域を単離した。単離は、ヒトＡＣＥ２遺伝子の翻訳開始点より上流５，７７０ｂｐからなるプロモーター領域をＰＣＲ反応により単離することで行なった。用いた遺伝子のＤＮＡは、その両端配列のプライマーを作製し、適当なＤＮＡソースを鋳型としてＰＣＲを行うことにより取得した。プライマーの端には後の遺伝子操作のために制限酵素切断部位を付加した。取得したＤＮＡの塩基配列を配列番号９に示す。
【0135】
次に、ヒトゲノムからａｃｅ２上流領域をクローニングし、リポーター遺伝子に接続しトランスジェニックゼブラフィッシュ作製により、活性の評価を行った。結果を図５に示す。図５は、トランスジェニックフィッシュ５日胚の蛍光画像である。ａｃｅ２プロモーターの発現解析を行ったところ、消化管上皮細胞特異的に発現を誘導する活性をしていた。このことから、ＡＣＥ２プロモーターの消化管上皮細胞での発現活性は進化的に保存されていること、その活性はクローニングした領域に限定されていることを発見した。
【0136】
この発見は、ａｃｅ２プロモーター活性をターゲットにした創薬の可能性の道を拓くものである。本発明のプロモーター活性を利用し、アッセイ用の細胞の作製や、本発明に含まれるａｃｅ２プロモーター活性を利用したトランスジェニックゼブラフィッシュを用いるアッセイ系により、ａｃｅ２遺伝子の発現制御に影響を与える低分子化合物や因子を、ハイスループットで評価することを可能にするものである。
【0137】
〔試験例１－４〕 ヒトＡＣＥ２遺伝子の発現解析 その２
図６のうち、上の図は、ゼブラフィッシュＡＣＥ２遺伝子の構造を示し、下の図は、ノックインに用いたプラスミドの構造を示す。図６に示すように、ＧＦＰ遺伝子を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法（ゲノム編集法）でゼブラフィッシュＡＣＥ２遺伝子に酵母転写因子ＧＡＬ４を組み込み、トランスジェニックフィッシュを作製した。Ｍ ｂａｉｔの配列をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて切断し、第２エキソン部分に組み込む。このトランスジェニックフィッシュにおいて、ＧＡＬ４に誘導されたＧＦＰが、組織特異的に、消化管上皮細胞に、選択的に発現することを発見した。
図６のうち、上の図は、ゼブラフィッシュＡＣＥ２遺伝子の構造を示し、下の図は、ノックインに用いたプラスミドの構造を示す。図６に示すように、ＧＦＰ遺伝子を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法（ゲノム編集法）でゼブラフィッシュＡＣＥ２遺伝子に酵母転写因子ＧＡＬ４を組み込み、トランスジェニックフィッシュを作製した。Ｍ ｂａｉｔの配列をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて切断し、第２エキソン部分に組み込む。このトランスジェニックフィッシュにおいて、ＧＡＬ４に誘導されたＧＦＰが、組織特異的に、消化管上皮細胞に、選択的に発現することを発見した。
【0138】
本試験によると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いた遺伝子ノックインによって、生きている脊椎動物である魚類の個体レベル、かつ、ハイスループットで評価可能な創薬スクリーニングシステムを提供できる。
【0139】
＜試験例２＞ Ｔｏｌ２の長さ
〔５’末端側の転移活性〕
図７は、トランスポゾンの全体の構造と、転移活性を調べるために構築したプラスミドの構造を表す。左端からそれぞれ２００ｂｐ、１９０ｂｐ、１８０ｂｐ、１７０ｂｐのＤＮＡ、右端から１５０ｂｐのＤＮＡをもち、その間にＧＦＰを組み込んだプラスミドを構築した。そして、図７に示したトランスポゾンコンストラクトを有するプラスミドを、転移酵素ｍＲＮＡとともにゼブラフィッシュ受精卵に微量注入したのち、１０～２４時間後にＤＮＡを回収し、ＰＣＲにより転移活性（切り出し活性）を調べた。切り出し活性を調べる方法は、以下文献に記載のとおりである。
Kawakami, K., and Shima, A. Identification of the Tol2 transposase of the medaka fish Oryzias latipes that catalyzes excision of a nonautonomous Tol2 element in zebrafish Danio rerio. Gene 240, 239-244 (1999).
〔５’末端側の転移活性〕
図７は、トランスポゾンの全体の構造と、転移活性を調べるために構築したプラスミドの構造を表す。左端からそれぞれ２００ｂｐ、１９０ｂｐ、１８０ｂｐ、１７０ｂｐのＤＮＡ、右端から１５０ｂｐのＤＮＡをもち、その間にＧＦＰを組み込んだプラスミドを構築した。そして、図７に示したトランスポゾンコンストラクトを有するプラスミドを、転移酵素ｍＲＮＡとともにゼブラフィッシュ受精卵に微量注入したのち、１０～２４時間後にＤＮＡを回収し、ＰＣＲにより転移活性（切り出し活性）を調べた。切り出し活性を調べる方法は、以下文献に記載のとおりである。
Kawakami, K., and Shima, A. Identification of the Tol2 transposase of the medaka fish Oryzias latipes that catalyzes excision of a nonautonomous Tol2 element in zebrafish Danio rerio. Gene 240, 239-244 (1999).
【0140】
図８は、転移活性（切り出し活性）の結果である。５’末端側を２００－ｂｐ、１９０－ｂｐ、１８０－ｂｐ、１７０－ｂｐと短くしていくと、２００－ｂｐ、１９０－ｂｐ、１８０－ｂｐに活性（転移活性）が見られた。一方、１７０ｂｐでは転移活性が見られなかった。
【0141】
〔３’末端側の転移活性〕
図９は、トランスポゾンの全体の構造と、転移活性を調べるために構築したプラスミドの構造を表す。右端からそれぞれ１５０ｂｐ、１４０ｂｐ、１３０ｂｐ、１２０ｂｐのＤＮＡ、右端から２００ｂｐのＤＮＡをもち、その間にＧＦＰを組み込んだプラスミドを構築した。そして、図９に示したトランスポゾンコンストラクトを有するプラスミドについて、５’末端側での測定と同様の手法によって転移活性（切り出し活性）を調べた。
図９は、トランスポゾンの全体の構造と、転移活性を調べるために構築したプラスミドの構造を表す。右端からそれぞれ１５０ｂｐ、１４０ｂｐ、１３０ｂｐ、１２０ｂｐのＤＮＡ、右端から２００ｂｐのＤＮＡをもち、その間にＧＦＰを組み込んだプラスミドを構築した。そして、図９に示したトランスポゾンコンストラクトを有するプラスミドについて、５’末端側での測定と同様の手法によって転移活性（切り出し活性）を調べた。
【0142】
図１０は、転移活性（切り出し活性）の結果である。３’末端側１５０－ｂｐ、１４０－ｂｐ、１３０－ｂｐ、１２０－ｂｐと短くしていくと、１５０－ｂｐ、１４０－ｂｐに活性（転移活性）が見られた。一方、１３０ｂｐ、１２０ｂｐでは転移活性が見られなかった。
【0143】
＜試験例３＞ Ｔｏｌ２の外側からの欠失
〔５’末端側の外側からの欠失〕
図１１は、トランスポゾンの全体の構造と、転移活性を調べるために構築したプラスミドの構造を表す。左端から２００ｂｐのＤＮＡ、右端から１５０ｂｐのＤＮＡをもち、その間にＧＦＰを組み込んだプラスミドを構築した。また、そのプラスミドの左端の外側から１９ｂｐ、６ｂｐ欠失させたものを構築した。そして、図１１に示したトランスポゾンコンストラクトを有するプラスミドについて、試験例２での測定と同様の手法によって転移活性を調べた。
〔５’末端側の外側からの欠失〕
図１１は、トランスポゾンの全体の構造と、転移活性を調べるために構築したプラスミドの構造を表す。左端から２００ｂｐのＤＮＡ、右端から１５０ｂｐのＤＮＡをもち、その間にＧＦＰを組み込んだプラスミドを構築した。また、そのプラスミドの左端の外側から１９ｂｐ、６ｂｐ欠失させたものを構築した。そして、図１１に示したトランスポゾンコンストラクトを有するプラスミドについて、試験例２での測定と同様の手法によって転移活性を調べた。
【0144】
図１２は、転移活性の結果である。左端（５’末端）の外側から１９ｂｐ、６ｂｐ欠失させると転移活性が失われた。
【0145】
＜試験例４＞ Ｔｏｌ２ベクターに組み込むＤＮＡの長さ
〔最小長さ〕
Ｔｏｌ２ベクターに組み込むＤＮＡの長さを短くしていき、転移活性を調べた。図１３は、トランスポゾンの全体の構造と、転移活性を調べるために構築したプラスミドの構造を表す。左端から２００ｂｐのＤＮＡ、右端から１５０ｂｐのＤＮＡをもち、その間にさまざまな長さのＤＮＡを組み込んだプラスミドを構築した。そして、図１３に示したトランスポゾンコンストラクトを有するプラスミドについて、試験例２での測定と同様の手法によって転移活性を調べた。
〔最小長さ〕
Ｔｏｌ２ベクターに組み込むＤＮＡの長さを短くしていき、転移活性を調べた。図１３は、トランスポゾンの全体の構造と、転移活性を調べるために構築したプラスミドの構造を表す。左端から２００ｂｐのＤＮＡ、右端から１５０ｂｐのＤＮＡをもち、その間にさまざまな長さのＤＮＡを組み込んだプラスミドを構築した。そして、図１３に示したトランスポゾンコンストラクトを有するプラスミドについて、試験例２での測定と同様の手法によって転移活性を調べた。
【0146】
図１４は、転移活性の結果である。５’末端に２００ｂｐ、３’末端に１５０ｂｐをもつベクターに異なる長さのＤＮＡを挿入したところ、７００ｂｐ以上で転移活性が見られた。なお、当該ＤＮＡは、トランスポゾンの内部の配列である。
【0147】
〔最大長さ〕
また、トランスポゾンベクターに１６３．６１ｋｂのＤＮＡを挿入させ転移反応を行ったところ、転移活性が認められたことを確認した。なお、当該ＤＮＡは、Ｆｇｆ２４遺伝子を含むゲノム領域である。
また、トランスポゾンベクターに１６３．６１ｋｂのＤＮＡを挿入させ転移反応を行ったところ、転移活性が認められたことを確認した。なお、当該ＤＮＡは、Ｆｇｆ２４遺伝子を含むゲノム領域である。
【0148】
＜試験例５＞ ダイレクトリピートの必要性
Ｔｏｌ２を組み込む際に両端にできる８－ｂｐのダイレクトリピートの必要性について調べた。図１５は、トランスポゾンの全体の構造と、転移活性を調べるために構築したプラスミドの構造を表す。左端から２００ｂｐのＤＮＡ、右端から１５０ｂｐのＤＮＡをもち、その間にＧＦＰを組み込んだプラスミドを構築した。また、そのプラスミドの左端に隣接する繰り返し配列（８ｂｐ）を除去したものを構築した。そして、図１５に示したトランスポゾンコンストラクトを有するプラスミドについて、試験例２での測定と同様の手法によって転移活性を調べた。
Ｔｏｌ２を組み込む際に両端にできる８－ｂｐのダイレクトリピートの必要性について調べた。図１５は、トランスポゾンの全体の構造と、転移活性を調べるために構築したプラスミドの構造を表す。左端から２００ｂｐのＤＮＡ、右端から１５０ｂｐのＤＮＡをもち、その間にＧＦＰを組み込んだプラスミドを構築した。また、そのプラスミドの左端に隣接する繰り返し配列（８ｂｐ）を除去したものを構築した。そして、図１５に示したトランスポゾンコンストラクトを有するプラスミドについて、試験例２での測定と同様の手法によって転移活性を調べた。
【0149】
図１６は、転移活性の結果である。トランスポゾンが転移する際に、トランスポゾンの外側に作られるダイレクトリピートを欠いても、転移活性は失われなかった。すなわち、これは転移に不要である。
【0150】
ただし、切り出し後の塩基配列は、
野生型：ggcatatg GTTCTTGA ccccctac
欠失型：ggcatat CTTGA ccccctac
となっており、正確な転移反応のためには、ダイレクトリピートが必要である。
野生型：ggcatatg GTTCTTGA ccccctac
欠失型：ggcatat CTTGA ccccctac
となっており、正確な転移反応のためには、ダイレクトリピートが必要である。
【0151】
＜試験例６＞ 転移酵素の末端
〔Ｎ端側〕
図１７に示す通り、左端から２００ｂｐのＤＮＡ、右端から１５０ｂｐのＤＮＡをもち、その間にＧＦＰを組み込んだプラスミドを構築し、野生型の転移酵素あるいは変異型の転移酵素をコードするｍＲＮＡとともに、ゼブラフィッシュ受精卵にマイクロインジェクションで導入し、試験例２での測定と同様の手法によって転移活性を調べた。変異型の転移酵素としては、Ｎ端から１アミノ酸欠失および４アミノ酸欠失を作製した。
〔Ｎ端側〕
図１７に示す通り、左端から２００ｂｐのＤＮＡ、右端から１５０ｂｐのＤＮＡをもち、その間にＧＦＰを組み込んだプラスミドを構築し、野生型の転移酵素あるいは変異型の転移酵素をコードするｍＲＮＡとともに、ゼブラフィッシュ受精卵にマイクロインジェクションで導入し、試験例２での測定と同様の手法によって転移活性を調べた。変異型の転移酵素としては、Ｎ端から１アミノ酸欠失および４アミノ酸欠失を作製した。
【0152】
図１８は、転移活性の結果である。１アミノ酸欠失では転移活性が見られたが、４アミノ酸欠失では転移活性が見られなかった。
【0153】
〔Ｃ端側〕
図１９に示す通り、左端から２００ｂｐのＤＮＡ、右端から１５０ｂｐのＤＮＡをもち、その間にＧＦＰを組み込んだプラスミドを構築し、野生型の転移酵素あるいは変異型の転移酵素をコードするｍＲＮＡとともに、ゼブラフィッシュ受精卵にマイクロインジェクションで導入し、試験例２での測定と同様の手法によって転移活性を調べた。変異型の転移酵素としては、Ｃ端から１アミノ酸欠失、５アミノ酸欠失、１０アミノ酸欠失および１５アミノ酸欠失を作製した。
図１９に示す通り、左端から２００ｂｐのＤＮＡ、右端から１５０ｂｐのＤＮＡをもち、その間にＧＦＰを組み込んだプラスミドを構築し、野生型の転移酵素あるいは変異型の転移酵素をコードするｍＲＮＡとともに、ゼブラフィッシュ受精卵にマイクロインジェクションで導入し、試験例２での測定と同様の手法によって転移活性を調べた。変異型の転移酵素としては、Ｃ端から１アミノ酸欠失、５アミノ酸欠失、１０アミノ酸欠失および１５アミノ酸欠失を作製した。
【0154】
図２０は、転移活性の結果である。１アミノ酸、５アミノ酸欠失では転移活性が見られたが、１０アミノ酸、１５アミノ酸酸欠失では転移活性が見られなかった。
【0155】
＜試験例７＞ 哺乳動物細胞への導入
〔ヒト由来細胞ＨｅＬａ細胞への導入〕
図２１に示す、ヒト用にコドンを最適化した転移酵素発現プラスミド（配列番号１０）とＴｏｌ２トランスポゾンドナーベクターをヒト由来細胞ＨｅＬａ細胞に導入した。トランスポゾンドナーベクターは、左端から２００ｂｐのＤＮＡ、右端から１５０ｂｐのＤＮＡをもち、その間にＧ４１８耐性遺伝子が組み込まれている。転移酵素発現プラスミドは、ＣＡＧプロモーターの下流に転移酵素遺伝子ｃＤＮＡが組み込まれている。導入した結果、転移酵素発現プラスミドの量に応じて、細胞ゲノムへの組み込み頻度が上昇することが分かった（表１）。また、発現プラスミドの量には最適値があることが分かった（表１）。
〔ヒト由来細胞ＨｅＬａ細胞への導入〕
図２１に示す、ヒト用にコドンを最適化した転移酵素発現プラスミド（配列番号１０）とＴｏｌ２トランスポゾンドナーベクターをヒト由来細胞ＨｅＬａ細胞に導入した。トランスポゾンドナーベクターは、左端から２００ｂｐのＤＮＡ、右端から１５０ｂｐのＤＮＡをもち、その間にＧ４１８耐性遺伝子が組み込まれている。転移酵素発現プラスミドは、ＣＡＧプロモーターの下流に転移酵素遺伝子ｃＤＮＡが組み込まれている。導入した結果、転移酵素発現プラスミドの量に応じて、細胞ゲノムへの組み込み頻度が上昇することが分かった（表１）。また、発現プラスミドの量には最適値があることが分かった（表１）。
【表1】
【0156】
〔ヒト由来細胞子宮内膜細胞への導入〕
図２２に示す、転移酵素発現プラスミド（配列番号１０）とＴｏｌ２トランスポゾンドナーベクターをヒト由来細胞子宮内膜細胞に導入した。トランスポゾンドナーベクターは、左端から約２ｋｂのＤＮＡ、右端から約０．５ｋｂのＤＮＡをもち、その間にＧ４１８耐性遺伝子が組み込まれている。転移酵素発現プラスミドは、ＣＡＧプロモーターの下流に転移酵素遺伝子ｃＤＮＡが組み込まれている。
図２２に示す、転移酵素発現プラスミド（配列番号１０）とＴｏｌ２トランスポゾンドナーベクターをヒト由来細胞子宮内膜細胞に導入した。トランスポゾンドナーベクターは、左端から約２ｋｂのＤＮＡ、右端から約０．５ｋｂのＤＮＡをもち、その間にＧ４１８耐性遺伝子が組み込まれている。転移酵素発現プラスミドは、ＣＡＧプロモーターの下流に転移酵素遺伝子ｃＤＮＡが組み込まれている。
【0157】
図２３は、導入した結果を示す。ヒト由来細胞子宮内膜細胞へ、トランスポゾンドナーベクター単独あるいはトランスポゾンドナーベクターと転移酵素発現プラスミドを導入したところ、転移酵素発現プラスミドとともに導入したときに薬剤耐性コロニーがより多く出現した。
【0158】
〔ＣＨＯ細胞への導入〕
図２４に示す、ヒト用にコドンを最適化した転移酵素発現プラスミド（配列番号１０）と右端の配列を１７５－ｂｐ及び１４５－ｂｐとＧＦＰ遺伝子をもつＴｏｌ２トランスポゾンドナーベクターをＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）に導入した。トランスポゾンドナーベクターは、左端から２００ｂｐのＤＮＡ、右端から１７５ｂｐ又は１４５ｂｐのＤＮＡをもち、その間にＧＦＰ遺伝子が組み込まれている。転移酵素発現プラスミドは、ＣＡＧプロモーターの下流に転移酵素遺伝子ｃＤＮＡが組み込まれている。
図２４に示す、ヒト用にコドンを最適化した転移酵素発現プラスミド（配列番号１０）と右端の配列を１７５－ｂｐ及び１４５－ｂｐとＧＦＰ遺伝子をもつＴｏｌ２トランスポゾンドナーベクターをＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）に導入した。トランスポゾンドナーベクターは、左端から２００ｂｐのＤＮＡ、右端から１７５ｂｐ又は１４５ｂｐのＤＮＡをもち、その間にＧＦＰ遺伝子が組み込まれている。転移酵素発現プラスミドは、ＣＡＧプロモーターの下流に転移酵素遺伝子ｃＤＮＡが組み込まれている。
【0159】
図２５は、導入した結果を示す。ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）へ、トランスポゾンドナーベクターと転移酵素発現プラスミドを導入したところ、ＧＦＰ発現コロニーが多数出現した。
【0160】
〔ヒト由来の抹消血リンパ球への導入〕
図２６に示す、ヒト用にコドンを最適化した転移酵素発現プラスミド（配列番号１０）とＣＤ１９－Ｃａｒ遺伝子をもつＴｏｌ２トランスポゾンドナーベクターをヒト由来の抹消血リンパ球に導入した。トランスポゾンドナーベクターは、左端から２００ｂｐのＤＮＡ、右端から１７５ｂｐのＤＮＡをもち、その間にＣＤ１９－Ｃａｒ遺伝子が組み込まれている。転移酵素発現プラスミドは、ＣＡＧプロモーターの下流に転移酵素遺伝子ｃＤＮＡが組み込まれている。
図２６に示す、ヒト用にコドンを最適化した転移酵素発現プラスミド（配列番号１０）とＣＤ１９－Ｃａｒ遺伝子をもつＴｏｌ２トランスポゾンドナーベクターをヒト由来の抹消血リンパ球に導入した。トランスポゾンドナーベクターは、左端から２００ｂｐのＤＮＡ、右端から１７５ｂｐのＤＮＡをもち、その間にＣＤ１９－Ｃａｒ遺伝子が組み込まれている。転移酵素発現プラスミドは、ＣＡＧプロモーターの下流に転移酵素遺伝子ｃＤＮＡが組み込まれている。
【0161】
【産業上の利用可能性】
【0162】
本発明により、ノムＤＮＡプロモーターを用いた目的タンパク質の組織特異的な発現を、生きている脊椎動物の個体レベルで簡便に可視化し、かつ、ハイスループットで評価可能なシステムを提供できる。
【0163】
具体的に、以下の利点が得られる。
（１）魚類から哺乳類まで種々の脊椎動物にて目的タンパク質を発現させることができる。
（２）トランスポゾンベクターの大きさを比較的小さく抑えることができる。
（３）目的タンパク質の大きさは、小さいものから大きいものまで比較的自在に扱うことができる。
（４）目的タンパク質の発現を、共通の手法にて、生きている脊椎動物（例えば、魚類）の個体レベル、かつ、ハイスループットで評価した後、哺乳動物での評価を進められ、創薬スクリーニングシステムの効率が高まる。
（１）魚類から哺乳類まで種々の脊椎動物にて目的タンパク質を発現させることができる。
（２）トランスポゾンベクターの大きさを比較的小さく抑えることができる。
（３）目的タンパク質の大きさは、小さいものから大きいものまで比較的自在に扱うことができる。
（４）目的タンパク質の発現を、共通の手法にて、生きている脊椎動物（例えば、魚類）の個体レベル、かつ、ハイスループットで評価した後、哺乳動物での評価を進められ、創薬スクリーニングシステムの効率が高まる。
【配列表フリーテキスト】
【0164】
配列番号１－メダカのゲノムＤＮＡから得られるＴｏｌ２の全長配列
配列番号２－対象動物内でＴｏｌ２トランスポゾンを転移誘導し得るＴｏｌ２トランスポゼースのアミノ酸配列
配列番号３－人工配列の説明；非自律性Ｔｏｌ２トランスポゾンの塩基配列
配列番号４－人工配列の説明；Ｔｏｌ２－Ｌ配列（１８０ｂｐ）
配列番号５－人工配列の説明；Ｔｏｌ２－Ｒ配列（１４０ｂｐ）
配列番号６－人工配列の説明；ゼブラフィッシュａｃｅ２遺伝子の発現をコードする塩基配列
配列番号７－人工配列の説明；Ｔｏｌ２－Ｌ配列（２００ｂｐ）
配列番号８－人工配列の説明；Ｔｏｌ２－Ｒ配列（１５０ｂｐ）
配列番号９－人工配列の説明；ヒトＡＣＥ２遺伝子の発現をコードする塩基配列
配列番号１０－人工配列の説明；ヒト用にコドンを最適化した転移酵素発現プラスミドの塩基配列
配列番号２－対象動物内でＴｏｌ２トランスポゾンを転移誘導し得るＴｏｌ２トランスポゼースのアミノ酸配列
配列番号３－人工配列の説明；非自律性Ｔｏｌ２トランスポゾンの塩基配列
配列番号４－人工配列の説明；Ｔｏｌ２－Ｌ配列（１８０ｂｐ）
配列番号５－人工配列の説明；Ｔｏｌ２－Ｒ配列（１４０ｂｐ）
配列番号６－人工配列の説明；ゼブラフィッシュａｃｅ２遺伝子の発現をコードする塩基配列
配列番号７－人工配列の説明；Ｔｏｌ２－Ｌ配列（２００ｂｐ）
配列番号８－人工配列の説明；Ｔｏｌ２－Ｒ配列（１５０ｂｐ）
配列番号９－人工配列の説明；ヒトＡＣＥ２遺伝子の発現をコードする塩基配列
配列番号１０－人工配列の説明；ヒト用にコドンを最適化した転移酵素発現プラスミドの塩基配列
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【配列表】