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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024123475
(43)【公開日】2024-09-12
(54)【発明の名称】細胞凍結装置及び細胞凍結方法
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20240905BHJP
C12N 1/04 20060101ALI20240905BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 A
C12N1/04
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023030921
(22)【出願日】2023-03-01
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和４年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、橋渡し研究プログラム「アカデミア発革新的技術を活かした先端医療開発拠点の構築」「インクジェット凍結によるヒト血小板の添加物フリー保存技術開発」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】504180239
【氏名又は名称】国立大学法人信州大学
(74)【代理人】
【識別番号】100165179
【弁理士】
【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100152272
【弁理士】
【氏名又は名称】川越 雄一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100181722
【弁理士】
【氏名又は名称】春田 洋孝
(72)【発明者】
【氏名】秋山 佳丈
(72)【発明者】
【氏名】渡部 広機
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA27
4B029BB11
4B029CC01
4B065AA90X
4B065BD09
4B065CA60
(57)【要約】
【課題】細胞を内包する液滴を瞬時に凍結させることで細胞を凍結する新規な細胞凍結装置を提供する。また、このような装置を用い細胞を凍結する新規な細胞凍結方法を提供する。
【解決手段】細胞が分散する分散液を吐出し、細胞を内包する液滴を形成する吐出部と、液滴を凍結する凍結部と、を備え、凍結部は、沸点が－１３７℃未満の冷媒が貯留される貯留部と、冷媒で冷却され液滴が着弾する着弾部と、吐出部は、吐出孔から液滴を吐出するインクジェットヘッドと、吐出部と着弾部との間の空間を加熱する加熱手段と、を有する細胞凍結装置。
【選択図】図２
【解決手段】細胞が分散する分散液を吐出し、細胞を内包する液滴を形成する吐出部と、液滴を凍結する凍結部と、を備え、凍結部は、沸点が－１３７℃未満の冷媒が貯留される貯留部と、冷媒で冷却され液滴が着弾する着弾部と、吐出部は、吐出孔から液滴を吐出するインクジェットヘッドと、吐出部と着弾部との間の空間を加熱する加熱手段と、を有する細胞凍結装置。
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞が分散する分散液を吐出し、前記細胞を内包する液滴を形成する吐出部と、
前記液滴を凍結する凍結部と、を備え、
前記凍結部は、沸点が－１３７℃未満の冷媒が貯留される貯留部と、
前記冷媒で冷却され前記液滴が着弾する着弾部と、
前記吐出部は、吐出孔から前記液滴を吐出するインクジェットヘッドと、
前記吐出部と前記着弾部との間の空間を加熱する加熱手段と、を有する細胞凍結装置。
前記液滴を凍結する凍結部と、を備え、
前記凍結部は、沸点が－１３７℃未満の冷媒が貯留される貯留部と、
前記冷媒で冷却され前記液滴が着弾する着弾部と、
前記吐出部は、吐出孔から前記液滴を吐出するインクジェットヘッドと、
前記吐出部と前記着弾部との間の空間を加熱する加熱手段と、を有する細胞凍結装置。
【請求項2】
前記加熱手段は、前記吐出孔と連通する内部空間を有し、前記インクジェットヘッドから前記着弾部に向けて延びる筒状部材と、
前記筒状部材を加熱する第１ヒータと、を有する請求項１に記載の細胞凍結装置。
前記筒状部材を加熱する第１ヒータと、を有する請求項１に記載の細胞凍結装置。
【請求項3】
前記第１ヒータは、前記筒状部材の一部に設けられ、
前記筒状部材において前記第１ヒータが設けられていない部分の少なくとも一部は、光透過性を有する請求項２に記載の細胞凍結装置。
前記筒状部材において前記第１ヒータが設けられていない部分の少なくとも一部は、光透過性を有する請求項２に記載の細胞凍結装置。
【請求項4】
前記インクジェットヘッドは、前記液滴を吐出する筒状のノズルを有し、
前記ノズルは、前記筒状部材の前記内部空間に挿入されている請求項２又は３に記載の細胞凍結装置。
前記ノズルは、前記筒状部材の前記内部空間に挿入されている請求項２又は３に記載の細胞凍結装置。
【請求項5】
前記インクジェットヘッドは、前記分散液を収容する液室と、
前記インクジェットヘッドを加熱する第２ヒータと、を有する請求項１に記載の細胞凍結装置。
前記インクジェットヘッドを加熱する第２ヒータと、を有する請求項１に記載の細胞凍結装置。
【請求項6】
前記第２ヒータは、前記液室内に露出すること無く設けられている請求項５に記載の細胞凍結装置。
【請求項7】
前記着弾部の上面と平行な方向に前記吐出部と前記凍結部とを相対移動させる駆動部を有する請求項１に記載の細胞凍結装置。
【請求項8】
前記冷媒は液体窒素である請求項１に記載の細胞凍結装置。
【請求項9】
請求項１に記載の細胞凍結装置を用い、前記インクジェットヘッドから前記冷媒により冷却された着弾部に向けて前記液滴を吐出させる工程を有し、
前記吐出させる工程は、少なくとも前記加熱手段により前記吐出部と前記着弾部との間の空間を加熱しながら行う細胞凍結方法。
前記吐出させる工程は、少なくとも前記加熱手段により前記吐出部と前記着弾部との間の空間を加熱しながら行う細胞凍結方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞凍結装置及び細胞凍結方法に関する。
【背景技術】
【0002】
細胞を取り扱う多くの研究分野及び臨床医療において、細胞の凍結保存技術が検討開発されている。発明者らは、従来知られた凍結保護剤を用いた凍結保存技術の代わりとして、細胞を内包する液滴を急速に冷却し凍結させることで、凍結保護剤を全く用いることなく細胞を凍結保存する装置を開発している（例えば、特許文献１参照）。
【0003】
特許文献１に記載の発明においては、インクジェット技術を用いて液滴内に細胞を内包するとともに、液滴を液体窒素で冷却された基板に吐出することで、液滴ごと細胞を瞬間的に凍結している。このように凍結された粒子では、凍結時に細胞内外の水分子が結晶化することなくアモルファス状態で凍結するため、細胞の損傷を抑制することができると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開２０２２－１５８５７２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかし、特許文献１に記載の装置は、細胞が凍結保存された粒子を安定して継続的に製造することが困難であり、改善の余地があった。
【0006】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであって、細胞を内包する液滴を瞬時に凍結させることで細胞を凍結する新規な細胞凍結装置を提供することを目的とする。また、このような装置を用い細胞を凍結する新規な細胞凍結方法を提供することを併せて目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
特許文献１に記載の装置においては、低温の基板と周囲の空間との温度差により対流（気流）が生じていると考えられる。また、基板を液体窒素で冷却する場合、液体窒素が徐々に気化し、気化した窒素が立ち上ることによる気流も生じている。飛翔中の液滴は、この気流の影響を受けやすく、基板における液滴の着弾位置が所望の位置からずれるおそれがある。
【0008】
また、液滴が飛翔する空間は、低温の基板や、気化した低温の窒素により冷却されている。そのため、液滴が飛翔中に徐々に冷やされ、基板に付着する前に液滴の凍結が始まるおそれがあった。液滴の冷却速度は、液体窒素で冷やされた基板による冷却よりも、飛翔中の空間における冷却の方が遅いことから、液滴が飛翔中に凍結すると細胞内外の水分子が結晶化し、細胞を損傷するおそれがあった。
【0009】
これらの課題意識に基づき、発明者らは、飛翔中の液滴の凍結を抑制することにより、細胞を内包し凍結した粒子を安定して製造し、細胞を凍結保存可能であると考えた。この着想に基づいて発明者らが鋭意検討した結果、発明を完成させた。以下、細胞を内包し凍結した粒子を、単に「凍結粒子」と称することがある。
【0010】
上記の課題を解決するため、本発明の一態様は、以下の態様を包含する。
【0011】
［１］細胞が分散する分散液を吐出し、前記細胞を内包する液滴を形成する吐出部と、前記液滴を凍結する凍結部と、を備え、前記凍結部は、沸点が－１３７℃未満の冷媒が貯留される貯留部と、前記冷媒で冷却され前記液滴が着弾する着弾部と、前記吐出部は、吐出孔から前記液滴を吐出するインクジェットヘッドと、前記吐出部と前記着弾部との間の空間を加熱する加熱手段と、を有する細胞凍結装置。
【0012】
［２］前記加熱手段は、前記吐出孔と連通する内部空間を有し、前記インクジェットヘッドから前記着弾部に向けて延びる筒状部材と、前記筒状部材を加熱する第１ヒータと、を有する［１］に記載の細胞凍結装置。
【0013】
［３］前記第１ヒータは、前記筒状部材の一部に設けられ、前記筒状部材において前記第１ヒータが設けられていない部分の少なくとも一部は、光透過性を有する［２］に記載の細胞凍結装置。
【0014】
［４］前記インクジェットヘッドは、前記液滴を吐出する筒状のノズルを有し、前記ノズルは、前記筒状部材の前記内部空間に挿入されている［２］又は［３］に記載の細胞凍結装置。
【0015】
［５］前記インクジェットヘッドは、前記分散液を収容する液室と、前記インクジェットヘッドを加熱する第２ヒータと、を有する［１］から［４］のいずれか１項に記載の細胞凍結装置。
【0016】
［６］前記第２ヒータは、前記液室内に露出すること無く設けられている［５］に記載の細胞凍結装置。
【0017】
［７］前記着弾部の上面と平行な方向に前記吐出部と前記凍結部とを相対移動させる駆動部を有する［１］から［６］のいずれか１項に記載の細胞凍結装置。
【0018】
［８］前記冷媒は液体窒素である［１］から［７］のいずれか１項に記載の細胞凍結装置。
【0019】
［９］［１］から［８］のいずれか１項に記載の細胞凍結装置を用い、前記インクジェットヘッドから前記冷媒により冷却された着弾部に向けて前記液滴を吐出させる工程を有し、前記吐出させる工程は、少なくとも前記加熱手段により前記吐出部と前記着弾部との間の空間を加熱しながら行う細胞凍結方法。
【発明の効果】
【0020】
本願発明によれば、細胞を内包する液滴を瞬時に凍結させることで細胞を凍結する新規な細胞凍結装置を提供することができる。また、このような装置を用い細胞を凍結する新規な細胞凍結方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【発明を実施するための形態】
【0022】
【0023】
以下の説明においては、ｘｙｚ直交座標系を設定し、このｘｙｚ直交座標系を参照しつつ各部材の位置関係について説明する。ここでは、水平面内の所定方向をｘ軸方向、水平面内においてｘ軸方向と直交する方向をｙ軸方向、ｘ軸方向及びｙ軸方向のそれぞれと直交する方向（すなわち鉛直方向）をｚ軸方向とする。
【0024】
また、「上」とは鉛直方向上方である＋ｚ方向とし、「下」とは鉛直方向下方である－ｚ方向とする。
【0025】
《細胞凍結装置》
図１は、本実施形態の細胞凍結装置１００の概略斜視図である。図１は、一部破断図として示している。図２は、細胞凍結装置１００の概略断面図である。図１，２に示すように、細胞凍結装置１００は、吐出部１０と、凍結部２０と、駆動部３０と、制御部８０と、回収容器９０とを有する。
図１は、本実施形態の細胞凍結装置１００の概略斜視図である。図１は、一部破断図として示している。図２は、細胞凍結装置１００の概略断面図である。図１，２に示すように、細胞凍結装置１００は、吐出部１０と、凍結部２０と、駆動部３０と、制御部８０と、回収容器９０とを有する。
【0026】
［吐出部］
吐出部１０は、インクジェットヘッド１１と、筒状部材１２と、下部ヒータ１３と、上部ヒータ１４と、移動部材１５と、配管１８と、容器１９とを有する。筒状部材１２と下部ヒータ１３と上部ヒータ１４とは、本発明における「加熱手段」に該当する。また、下部ヒータ１３と上部ヒータ１４とは、本発明における「第１ヒータ」に該当する。
吐出部１０は、インクジェットヘッド１１と、筒状部材１２と、下部ヒータ１３と、上部ヒータ１４と、移動部材１５と、配管１８と、容器１９とを有する。筒状部材１２と下部ヒータ１３と上部ヒータ１４とは、本発明における「加熱手段」に該当する。また、下部ヒータ１３と上部ヒータ１４とは、本発明における「第１ヒータ」に該当する。
【0027】
（インクジェットヘッド）
インクジェットヘッド１１は、吐出孔１１ａから、分散媒ＤＭに細胞Ｃが分散する分散液ＤＬを吐出する。インクジェットヘッド１１としては、細胞Ｃを損傷させること無く分散液ＤＬを吐出可能な公知の構成を採用することができる。
インクジェットヘッド１１は、吐出孔１１ａから、分散媒ＤＭに細胞Ｃが分散する分散液ＤＬを吐出する。インクジェットヘッド１１としては、細胞Ｃを損傷させること無く分散液ＤＬを吐出可能な公知の構成を採用することができる。
【0028】
インクジェットヘッド１１は、液滴Ｄｐを吐出する筒状のノズル１１１を有する。ノズル１１１の内部は、インクジェットヘッド１１において分散液ＤＬを収容する液室１１ｘに該当する。
【0029】
インクジェットヘッド１１としては、一つのヘッドユニットに一つの吐出孔を有するシングルノズルヘッドを好適に用いることができる。このようなインクジェットヘッド１１として、例えば、高耐液ガラスノズルヘッド（ＧｌａｓｓＪｅｔ、株式会社マイクロジェット製）を用いることができる。
【0030】
図２において、液滴Ｄｐには、１つの細胞Ｃが内包されていることとして示しているが、これに限らず、複数の細胞Ｃが内包されていてもよい。液滴Ｄｐの液滴量は、例えば、１ｐＬ以上１０００ｐＬ以下としてもよく、５ｐＬ以上２００ｐＬ以下とすることが好ましく、５ｐＬ以上５０ｐＬ以下とすることが更に好ましい。
【0031】
インクジェットヘッド１１には、配管１８を介して容器１９が接続されている。容器１９には分散液ＤＬが貯留され、容器１９からインクジェットヘッド１１に分散液ＤＬが供給される。
【0032】
（筒状部材）
筒状部材１２は、吐出孔１１ａと連通する内部空間１２ｘを有し、インクジェットヘッド１１から凍結部２０が有する着弾部２２に向けて延びる部材である。詳細には、筒状部材１２は、吐出孔１１ａから吐出される液滴Ｄｐの吐出方向に向けて（吐出孔１１ａの中心軸に沿って）延びている。
筒状部材１２は、吐出孔１１ａと連通する内部空間１２ｘを有し、インクジェットヘッド１１から凍結部２０が有する着弾部２２に向けて延びる部材である。詳細には、筒状部材１２は、吐出孔１１ａから吐出される液滴Ｄｐの吐出方向に向けて（吐出孔１１ａの中心軸に沿って）延びている。
【0033】
内部空間１２ｘにはノズル１１１が挿入され、内部空間１２ｘにおいて液滴Ｄｐの吐出が行われる。筒状部材１２の下端は、着弾部２２に向けて開口している。また、筒状部材１２の上端は、例えばインクジェットヘッド１１に接続して閉塞していると好ましい。
【0034】
筒状部材１２の材料は、樹脂材料であってもよく、ガラス等の無機材料であってもよい。筒状部材１２は光透過性を有していることが好ましい。
【0035】
なお、筒状部材１２の内部空間１２ｘにおいて、ノズル１１１は固定されていてもよく、ノズル１１１の先端と筒状部材１２の先端とのｚ軸方向の相対位置を変更可能に設けられていてもよい。このような構成の吐出部は、例えば、ノズル１１１の先端を筒状部材１２の下端から露出させることにより、ノズル１１１の吐出孔１１ａの閉塞の解消や汚れの除去などのメンテナンスを容易に実施可能となる。
【0036】
（第１ヒータ）
細胞凍結装置１００は、筒状部材１２を加熱する第１ヒータとして、下部ヒータ１３と上部ヒータ１４とを有する。本実施形態においては、第１ヒータを２つ有することとしているが、第１ヒータは、下部ヒータ１３と上部ヒータ１４とのいずれか一方であってもよい。さらに、細胞凍結装置１００は、第１ヒータとして３以上のヒータを有していてもよい。
細胞凍結装置１００は、筒状部材１２を加熱する第１ヒータとして、下部ヒータ１３と上部ヒータ１４とを有する。本実施形態においては、第１ヒータを２つ有することとしているが、第１ヒータは、下部ヒータ１３と上部ヒータ１４とのいずれか一方であってもよい。さらに、細胞凍結装置１００は、第１ヒータとして３以上のヒータを有していてもよい。
【0037】
（下部ヒータ）
下部ヒータ１３は、筒状部材１２の先端部１２ａにおいて筒状部材１２の外面の一部を覆っている。下部ヒータ１３は、筒状部材１２の外側から筒状部材１２を介し内部空間１２ｘを加熱する。下部ヒータ１３としては、抵抗加熱式の電熱ヒータを採用することができる。電熱ヒータとしては、ニクロム線を電熱線とした公知の構成を採用することができる。
下部ヒータ１３は、筒状部材１２の先端部１２ａにおいて筒状部材１２の外面の一部を覆っている。下部ヒータ１３は、筒状部材１２の外側から筒状部材１２を介し内部空間１２ｘを加熱する。下部ヒータ１３としては、抵抗加熱式の電熱ヒータを採用することができる。電熱ヒータとしては、ニクロム線を電熱線とした公知の構成を採用することができる。
【0038】
下部ヒータ１３の材料として、ＩＴＯ（酸化インジウム錫）やＩＺＯ（酸化インジウム亜鉛）を採用すると、下部ヒータ１３に光透過性を持たせることができる。この場合、筒状部材１２が光透過性を有していると、筒状部材１３及び下部ヒータ１３を介して内部空間１２ｘを観察可能となる。
【0039】
下部ヒータ１３は、内部空間１２ｘの温度を測定する温度センサ（不図示）の測定結果に基づいて、後述する制御部８０によりフィードバック制御されることとしてもよい。
【0040】
（上部ヒータ）
上部ヒータ１４は、インクジェットヘッド１１の外側を覆っている。詳細には、上部ヒータ１４は、インクジェットヘッド１１の外側に配置された筒状部材１２に設けられ、筒状部材１２の外面の一部を覆っている。上部ヒータ１４は、インクジェットヘッド１１の外側からインクジェットヘッド１１の内部の液室１１ｘに露出することなく、液室１１ｘ内の分散液ＤＬを加熱する。上部ヒータ１４としては、下部ヒータ１３と同様に、抵抗加熱式の電熱ヒータを採用することができる。上部ヒータ１４の材料として、ＩＴＯやＩＺＯを採用すると、上部ヒータ１４に光透過性を持たせることができる。
上部ヒータ１４は、インクジェットヘッド１１の外側を覆っている。詳細には、上部ヒータ１４は、インクジェットヘッド１１の外側に配置された筒状部材１２に設けられ、筒状部材１２の外面の一部を覆っている。上部ヒータ１４は、インクジェットヘッド１１の外側からインクジェットヘッド１１の内部の液室１１ｘに露出することなく、液室１１ｘ内の分散液ＤＬを加熱する。上部ヒータ１４としては、下部ヒータ１３と同様に、抵抗加熱式の電熱ヒータを採用することができる。上部ヒータ１４の材料として、ＩＴＯやＩＺＯを採用すると、上部ヒータ１４に光透過性を持たせることができる。
【0041】
上部ヒータ１４は、液室１１ｘの温度を測定する温度センサ（不図示）の測定結果に基づいて、後述する制御部８０によりフィードバック制御されることとしてもよい。
【0042】
筒状部材１２において下部ヒータ１３が設けられていない部分、詳細には下部ヒータ１３と上部ヒータ１４との間には、筒状部材１２が露出する。筒状部材１２が光透過性を有する場合、下部ヒータ１３と上部ヒータ１４との間は、筒状部材１２の内部を確認可能な窓部１２１として機能する。
【0043】
ノズル１１１の先端１１１ａは、ｚ軸方向において窓部１２１と同じ高さに位置している。これにより、本装置の使用者は、窓部１２１からノズル１１１の先端１１１ａの様子や、ノズル１１１から吐出される液滴Ｄｐの様子を確認可能となる。
【0044】
「先端１１１ａの様子」とは、例えば、液滴Ｄｐの吐出前に形成されるメニスカスの大きさや、液滴Ｄｐの吐出の有無が挙げられる。
【0045】
「液滴Ｄｐの様子」とは、例えば、液滴Ｄｐの大きさ（直径）が挙げられる。
【0046】
（移動部材）
移動部材１５は、ｚ軸方向（上下方向）に移動可能とする移動部１５１と、移動部１５１とインクジェットヘッド１１とを連結しインクジェットヘッド１１を支持するアーム１５２と、を有する。移動部１５１は、例えば、駆動源としてステッピングモータを備えｚ軸方向に移動可能な公知のリニアアクチュエータ採用することができる。
移動部材１５は、ｚ軸方向（上下方向）に移動可能とする移動部１５１と、移動部１５１とインクジェットヘッド１１とを連結しインクジェットヘッド１１を支持するアーム１５２と、を有する。移動部１５１は、例えば、駆動源としてステッピングモータを備えｚ軸方向に移動可能な公知のリニアアクチュエータ採用することができる。
【0047】
移動部材１５は、移動部１５１を用いてインクジェットヘッド１１を符号αで示す方向に移動させることができる。
【0048】
［凍結部］
凍結部２０は、吐出部１０から吐出された液滴を凍結し、細胞を内包し凍結した凍結粒子Ｐを生成する。凍結部２０は、液状の冷媒Ｒを貯留する貯留部２１と、冷媒Ｒで冷却され液滴Ｄｐが着弾する着弾部２２と、を有する。
凍結部２０は、吐出部１０から吐出された液滴を凍結し、細胞を内包し凍結した凍結粒子Ｐを生成する。凍結部２０は、液状の冷媒Ｒを貯留する貯留部２１と、冷媒Ｒで冷却され液滴Ｄｐが着弾する着弾部２２と、を有する。
【0049】
（貯留部）
貯留部２１は、内部２１ｘに冷媒Ｒである液体窒素を貯留する。貯留部２１は、容器２１１と、蓋２１２と、基台２１５と、を有する。なお、冷媒Ｒとしては、液体窒素に限らず、水分子のガラス転移点である－１３７℃を下回る冷媒であれば種々の物質を採用可能である。例えば、冷媒Ｒとして、液体ヘリウム、液体アルゴン、液体酸素を用いても発明を実施可能である。これらの中でも、安全性やコストを考慮すれば、冷媒Ｒとして液体窒素を用いることが好ましい。
貯留部２１は、内部２１ｘに冷媒Ｒである液体窒素を貯留する。貯留部２１は、容器２１１と、蓋２１２と、基台２１５と、を有する。なお、冷媒Ｒとしては、液体窒素に限らず、水分子のガラス転移点である－１３７℃を下回る冷媒であれば種々の物質を採用可能である。例えば、冷媒Ｒとして、液体ヘリウム、液体アルゴン、液体酸素を用いても発明を実施可能である。これらの中でも、安全性やコストを考慮すれば、冷媒Ｒとして液体窒素を用いることが好ましい。
【0050】
容器２１１は、冷媒Ｒを貯留する。容器２１１は、発泡樹脂製の容器や二重壁容器等、液体窒素を貯留する構成として公知の容器を採用することができる。
【0051】
蓋２１２は、容器２１１の上部を覆い着脱自在に設けられている。蓋２１２としては、例えば、容器２１１と同様の発泡樹脂を材料とする板材を採用することができる。蓋２１２の平面視中央には、蓋２１２の厚さ方向に貫通する開口部２１２ａが設けられている。
【0052】
基台２１５は、容器２１１の内部に配置されている。基台２１５の上面２１５ａは、開口部２１２ａから露出している。
【0053】
基台２１５は、容器２１１において冷媒Ｒに浸漬し、液体窒素の沸点（－１９６℃）相当に冷却されている。基台２１５は、アルミニウム、チタン、チタン系合金等の金属、又はアルミナ等のセラミックスを材料とする。
【0054】
また、基台２１５の材料として、液体窒素吸収材を用いることもできる。液体窒素吸収剤とは、液体窒素を吸収する吸収材を意味する。液体窒素吸収材には、液体窒素に対し濡れ性を有する繊維材料またはスポンジフォームを用いることができ、例えば、ポリプロピレン樹脂やナイロン樹脂等の不織布、ガラスウール等の繊維、ならびにメラミン、ウレタンおよびポリビニルアルコール等からなる連続気泡を有するスポンジフォームを用いることができる。液体窒素吸収材が液体窒素に対し親液性を有することで、基台２１５は液体窒素を十分含み冷却される。
【0055】
濡れ性は、接触角θの大小で評価することができる。接触角θが小さいほど、液体窒に対する親和性が高く濡れ性に優れる。接触角θとしては９０°以下であることが望ましい。このとき、液体窒素吸収材は、毛細管現象が顕著になって液体窒素が浸み込み、液体窒素を十分含むことができる。また、液体窒素吸収材は、液体窒素吸着後も硬化しない点から不織布等繊維材料が好適である。
【0056】
また、基台２１５は、上面２１５ａにおいて着弾部２２を支持する。冷媒Ｒにより冷却された基台２１５は、着弾部２２を液体窒素の沸点（－１９６℃）相当に冷却する。
【0057】
（着弾部）
着弾部２２は、液滴Ｄｐが着弾する基板２２１と、基板２２１を保持し運搬する運搬部２２２と、を有する。
着弾部２２は、液滴Ｄｐが着弾する基板２２１と、基板２２１を保持し運搬する運搬部２２２と、を有する。
【0058】
基板２２１は、インクジェットヘッド１１が吐出した液滴Ｄｐが着弾する部材である。基板２２１は、平面視で基台２１５と重なる位置に配置されている。そのため、着弾部２２の中でも特に基板２２１は、基台２１５により冷却されている。
【0059】
基板２２１は、例えばガラス基板であってもよく、樹脂フィルムであってもよい。
基板２２１がガラス基板である場合、基板２２１の厚みは、例えば５００μｍ以下としてもよく、１５０μｍ以下とすることが好ましい。また、ガラス基板である基板２２１の厚みは、できるだけ薄い方が好ましく、製造可能であれば下限に制限はない。基板２２１の厚みは、例えば１μｍ以上としてもよく、５μｍ以上としてもよい。
基板２２１がガラス基板である場合、基板２２１の厚みは、例えば５００μｍ以下としてもよく、１５０μｍ以下とすることが好ましい。また、ガラス基板である基板２２１の厚みは、できるだけ薄い方が好ましく、製造可能であれば下限に制限はない。基板２２１の厚みは、例えば１μｍ以上としてもよく、５μｍ以上としてもよい。
【0060】
基板２２１が樹脂フィルムである場合、基板２２１の厚みは、例えば２００μｍ以下としてもよく、５０μｍ以下とすることが好ましい。また、樹脂フィルムである基板２２１の厚みもできるだけ薄い方が好ましく、製造可能であれば下限に制限はない。基板２２１の厚みは、例えば１μｍ以上としてもよく、５μｍ以上としてもよい。
【0061】
吐出部１０から吐出された液滴Ｄｐは、液体窒素の沸点相当に冷却された基板２２１に付着することで瞬時に冷却され、凍結する。このとき、液滴Ｄｐ中の細胞Ｃの内外に存在する水分子は、結晶化する前にガラス転移温度（Ｔｇ：－１３７℃）以下まで冷却され、ガラス化状態にされる。これにより、基板２２１上に複数の凍結粒子Ｐが形成される。
【0062】
運搬部２２２は、平面視矩形の板材であり、長手方向の一端側に基板２２１を保持する。運搬部２２２は、インクジェットヘッド１１に対向する位置に基板２２１を配置すると共に、ｙ軸方向に延びて配置している。なお、図１では運搬部２２２の形状について、平面視矩形であることとして示したが、これに限らず種々の平面視形状を採用することができる。
【0063】
運搬部２２２は、基板２２１が設けられた側とは反対側に設けられた回転軸Ａｘを中心として、回動自在に設けられている。運搬部２２２は、回転軸Ａｘを中心として符号βで示す方向に回動する。
【0064】
運搬部２２２は、回転軸Ａｘを中心として運搬部２２２を回動させる弾性部材と、弾性部材が弾性力を蓄えた状態で運搬部２２２を基台２１５の上面２１５ａに固定する固定機構と、を有していてもよい。例えば、弾性部材としてヒンジばねを用い、固定機構による運搬部２２２の固定を開放することにより、ヒンジばねが運搬部２２２を回動させる構成とすることができる。これにより、細胞凍結装置１００では、運搬部２２２が回動し、基板２２１上に形成された凍結粒子Ｐを、回収容器９０に投入することができる。
【0065】
［駆動部］
駆動部３０は、基板２２１の上面２２１ａと平行な方向に吐出部１０と凍結部２０とを相対移動させる。駆動部３０は、ｘステージ３１と、ｙステージ３２とを有する。
駆動部３０は、基板２２１の上面２２１ａと平行な方向に吐出部１０と凍結部２０とを相対移動させる。駆動部３０は、ｘステージ３１と、ｙステージ３２とを有する。
【0066】
ｘステージ３１は、凍結部２０を支持し固定する。また、ｘステージ３１は、凍結部２０をｘ軸方向に水平移動させる。ｙステージ３２は、ｘステージ３１をｙ軸方向に水平移動させる。これにより、水平方向における基板２２１と吐出部１０との相対位置が制御される。
【0067】
駆動部３０は、ｘｙステージとして公知の構成を採用することができる。
【0068】
［制御部］
制御部８０は、吐出部１０、凍結部２０、駆動部３０の各部の制御信号を作成し、各部に供給することで細胞凍結装置１００の動作を制御する。
制御部８０は、吐出部１０、凍結部２０、駆動部３０の各部の制御信号を作成し、各部に供給することで細胞凍結装置１００の動作を制御する。
【0069】
制御部８０は、例えば、吐出部１０に供給する駆動信号により、吐出部１０による液滴の吐出を制御する。また、制御部８０は、駆動部３０に供給する駆動信号を作成し、吐出部１０から吐出される液滴の、基板２２１に対する吐出位置を制御する。
【0070】
［回収容器］
回収容器９０は、凍結粒子Ｐを回収する。回収容器９０は、不図示の蓋を備え、例えば液滴Ｄｐを凍結する凍結液が貯留されている。着弾部２２においては、運搬部２２２が回転軸Ａｘを中心として回動し、基板２２１上に形成された凍結粒子Ｐを回収容器９０の内部に投入する。これにより、回収容器９０では、凍結粒子Ｐを回収し保存することができる。
回収容器９０は、凍結粒子Ｐを回収する。回収容器９０は、不図示の蓋を備え、例えば液滴Ｄｐを凍結する凍結液が貯留されている。着弾部２２においては、運搬部２２２が回転軸Ａｘを中心として回動し、基板２２１上に形成された凍結粒子Ｐを回収容器９０の内部に投入する。これにより、回収容器９０では、凍結粒子Ｐを回収し保存することができる。
【0071】
《細胞凍結方法》
細胞凍結装置１００を用いた細胞凍結方法は、インクジェットヘッド１１から液体窒素により冷却された基板２２１に向けて液滴Ｄｐを吐出させる工程を有する。ここで、吐出させる工程は、少なくとも下部ヒータ１３により筒状部材１２を加熱しながら行う。
細胞凍結装置１００を用いた細胞凍結方法は、インクジェットヘッド１１から液体窒素により冷却された基板２２１に向けて液滴Ｄｐを吐出させる工程を有する。ここで、吐出させる工程は、少なくとも下部ヒータ１３により筒状部材１２を加熱しながら行う。
【0072】
さらに、細胞凍結方法においては、上部ヒータ１４によりインクジェットヘッド１１を加熱しながら行うと好ましい。
【0073】
［効果］
このような構成の細胞凍結装置１００の効果について、図２を用いて以下説明する。
このような構成の細胞凍結装置１００の効果について、図２を用いて以下説明する。
【0074】
まず、吐出部１０から吐出された液滴Ｄｐが飛翔する空間（以下、飛翔空間と称する）では、液体窒素の沸点相当にまで冷却された基板２２１と、周囲の空間との温度差により対流（気流）が生じていると考えられる。また、貯留部２１に貯留された液体窒素は、徐々に気化し、気化した窒素Ｎ２が立ち上ることによる気流も生じている。飛翔空間を飛翔する液滴Ｄｐは、これらの気流の影響を受けやすいと考えられる。
【0075】
また、飛翔空間は、低温の基板２２１や、気化した低温の窒素Ｎ２により冷却されている。そのため、液滴Ｄｐは飛翔中に徐々に冷やされ、基板２２１に付着する前に液滴Ｄｐに含まれる水の凍結が始まるおそれがあった。
【0076】
これらの懸念に対し、細胞凍結装置１００は、インクジェットヘッド１１の吐出孔１１ａと連通する筒状部材１２を有している。筒状部材１２は、飛翔空間を飛翔する液滴Ｄｐに対し、気流の影響を低減させる風防として機能する。また、筒状部材１２の上端が閉塞していると、立ち上る窒素Ｎ２は、符号Ａに示すように筒状部材１２の内部空間１２ｘを通り抜けること無く筒状部材１２を避けて流動すると考えられる。
【0077】
そのため、内部空間１２ｘを飛翔する液滴Ｄｐは、気流の影響を受けることなく設定された吐出方向に飛翔することができる。これにより、基板２２１上の凍結粒子Ｐに液滴Ｄｐが着弾し凍結粒子Ｐが一部融解してしまう不具合を抑制できる。また、基板２２１上で凍結粒子Ｐを高密度に配列して形成することができ、凍結粒子Ｐの生産効率を向上させることができる。
【0078】
さらに、細胞凍結装置１００は、筒状部材１２を加熱する下部ヒータ１３を有する。これにより、内部空間１２ｘを加熱し、飛翔中の液滴Ｄｐの凍結を抑制することができる。
【0079】
加えて、上部ヒータ１４によりインクジェットヘッド１１を加熱することで、液室１１ｘ内の分散液ＤＬの凍結や、分散液ＤＬの粘度上昇を抑制し、安定した液滴Ｄｐの吐出を実現できる。
【0080】
これらの効果により、以上のような構成の細胞凍結装置１００によれば、細胞Ｃを内包する液滴Ｄｐを安定して吐出し、液滴Ｄｐを基板２２１上で瞬時に凍結させ、細胞Ｃを凍結することが可能となる。
【0081】
また、以上のような細胞凍結方法によれば、安定的に細胞Ｃを凍結することが可能となる。
【0082】
なお、本実施形態においては、移動部材１５及び駆動部３０を用いて、インクジェットヘッド１１と基板２２１との相対位置をｘｙｚ方向に変更可能としたが、この構成に限らない。着弾部２２の上面と平行な方向に吐出部１０と凍結部２０とを相対移動させる構成として、例えば、移動部材１５をｚ軸方向の他、ｘ軸方向にも平行移動可能である構成とし、駆動部３０としてｙステージ３２のみ有することとしてもよい。また、移動部材１５及び駆動部３０の代わりに、インクジェットヘッド１１を保持し、インクジェットヘッド１１をｘｙｚ方向に移動させることが可能なロボットアームを用いることとしてもよい。
【0083】
また、本実施形態においては、インクジェットヘッド１１として、ノズル１１１を有するシングルノズルヘッドを採用することとしたが、これに限らない。
【0084】
図３は、変形例に係る細胞凍結装置２００の概略図であり、吐出部５０が有するインクジェットヘッドの概略断面図である。
【0085】
図３に示すように、細胞凍結装置２００の吐出部５０は、インクジェットヘッド５１と、筒状部材５２と、第１ヒータ５３と、第２ヒータ５４と、を有する。
【0086】
インクジェットヘッド５１は、圧電素子５１５を駆動させて液室５１ｘに貯留した分散液ＤＬを加圧し、複数（図では３つ）の吐出孔５１ａから液滴Ｄｐを吐出する。
【0087】
筒状部材５２は、吐出孔５１ａに連通する内部空間５２ｘを有し、インクジェットヘッド５１から不図示の着弾部に向けて延びる。
【0088】
第１ヒータ５３は、筒状部材５２の先端部において筒状部材１２の外面の一部を覆っている。第１ヒータ５３は、筒状部材５２の外側から内部空間５２ｘを加熱する。
【0089】
（第２ヒータ）
第２ヒータ５４は、インクジェットヘッド５１の外面を覆い、インクジェットヘッド５１の外側から液室５１ｘに露出することなく、液室５１ｘ内の分散液ＤＬを加熱する。第２ヒータ５４としては、ニクロム線を電熱線とした公知の構成を採用することができる。
第２ヒータ５４は、インクジェットヘッド５１の外面を覆い、インクジェットヘッド５１の外側から液室５１ｘに露出することなく、液室５１ｘ内の分散液ＤＬを加熱する。第２ヒータ５４としては、ニクロム線を電熱線とした公知の構成を採用することができる。
【0090】
なお、図３では、第２ヒータ５４が、インクジェットヘッド５１の外側から分散液ＤＬヲ加熱することとしたが、これに限らない。第２ヒータ５４は、インクジェットヘッド５１が内蔵することとしてもよい。
【0091】
筒状部材５２において第１ヒータ５３と第２ヒータ５４との間には、筒状部材５２が露出する。筒状部材５２が光透過性を有する場合、第１ヒータ５３と第２ヒータ５４との間は、筒状部材５２の内部を確認可能な窓部５２１として機能する。
【0092】
このような構成の細胞凍結装置２００においても、細胞Ｃを内包する液滴Ｄｐを安定して吐出し、液滴Ｄｐを基板上で瞬時に凍結させ、細胞Ｃを凍結することが可能となる。
【0093】
また、本実施形態の細胞凍結装置においては、加熱手段が筒状部材と第１ヒータとを有することとしたが、これに限らない。例えば、加熱手段が筒状部材を有すること無く、ヒータだけを有することとしてもよい。この場合、筒状に形成されたヒータを用い、吐出部と着弾部との間の空間にヒータを配置する構成としてもよい。筒状に形成されたヒータとしては、ニクロム線を螺旋状に形成された電熱ヒータを例示することができる。
【0094】
本実施形態の細胞凍結装置においては、この場合、ヒータを支持する支持部材を適宜設けるとよい。
【0095】
上記装置構成を採用する細胞凍結装置においては、筒状に形成されたヒータで囲まれた空間、すなわち吐出部と着弾部との間の空間を加熱することができる。そのため、本装置においては、加熱された空間の液滴を飛翔させることで、発明の効果が得られる。
【0096】
また、本実施形態の細胞凍結装置においては、着弾部２２が基板２２１と運搬部２２２とを有することとしたが、これに限らない。運搬部２２２の代わりに、凍結粒子Ｐが上面に形成された基板２２１をｘｙ平面と平行方向に移動させるマニピュレータを有する構成を採用することもできる。また、細胞凍結装置が基板２２１を運搬する構成を有することなく、細胞凍結装置の使用者が、基板２２１を手動で運搬してもよい。
【0097】
以上、添付図面を参照しながら本発明に係る好適な実施の形態例について説明したが、本発明は係る例に限定されない。上述した例において示した各構成部材の諸形状や組み合わせ等は一例であって、本発明の主旨から逸脱しない範囲において設計、仕様等に基づき種々変更可能である。
【実施例0098】
以下に本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。以下の説明においては、適宜上述した図面に記した符号を用いて説明する。
【0099】
（実施例）
図１に示す構成の細胞凍結装置を構成し、液体窒素で約－１９０℃に冷却した着弾部に向けて細胞（マウス繊維芽（ＮＩＨ－３Ｔ３））が分散する分散液（１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を吐出した。吐出した液滴の大きさは約２０ｐＬであった。細胞凍結装置を構成する主要な部品は以下の通りであった。
インクジェットヘッド：高耐液ガラスノズルヘッド（ＧｌａｓｓＪｅｔ、型番ＩＪＨＤ－３０、株式会社マイクロジェット製）
筒状部材：石英管１（長さ６０ｍｍ、内径４．１５ｍｍ、外径６．１５ｍｍ）の先端に、石英管２（長さ５ｍｍ、内径２．０ｍｍ、外径４．０ｍｍ）を挿入し、透明接着剤で固定。
上部ヒータ：ニクロム線
下部ヒータ：ニクロム線
貯留部：発泡樹脂製の容器
着弾部：ガラス板（カバーグラス（Ｎｏ．１）、松浪硝子工業株式会製）
運搬部２２２を回動させる弾性部材：ヒンジばね（ＨＨＳＰ２０、ミスミ社製）
図１に示す構成の細胞凍結装置を構成し、液体窒素で約－１９０℃に冷却した着弾部に向けて細胞（マウス繊維芽（ＮＩＨ－３Ｔ３））が分散する分散液（１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を吐出した。吐出した液滴の大きさは約２０ｐＬであった。細胞凍結装置を構成する主要な部品は以下の通りであった。
インクジェットヘッド：高耐液ガラスノズルヘッド（ＧｌａｓｓＪｅｔ、型番ＩＪＨＤ－３０、株式会社マイクロジェット製）
筒状部材：石英管１（長さ６０ｍｍ、内径４．１５ｍｍ、外径６．１５ｍｍ）の先端に、石英管２（長さ５ｍｍ、内径２．０ｍｍ、外径４．０ｍｍ）を挿入し、透明接着剤で固定。
上部ヒータ：ニクロム線
下部ヒータ：ニクロム線
貯留部：発泡樹脂製の容器
着弾部：ガラス板（カバーグラス（Ｎｏ．１）、松浪硝子工業株式会製）
運搬部２２２を回動させる弾性部材：ヒンジばね（ＨＨＳＰ２０、ミスミ社製）
【0100】
上部ヒータ、下部ヒータに通電し、吐出部を加熱した。赤外線サーモグラフィカメラ（ＩｎｆＲｅＣ Ｒ５５０Ｐｒｏ、日本アビオニクス株式会社製）にて吐出部の温度を確認したところ、吐出部の温度は約２０℃であり、室温と同等であった。
【0101】
吐出部を着弾部に近づけ、加熱したまま液滴の吐出を開始したところ、サーモグラフィカメラの画像では、液滴の吐出開始から３分後においても、吐出部の温度、特に筒状部材の近傍が約２０℃に保たれていることが確認できた。筒状部材の内部に位置するノズル１１１の周囲や筒状部材の内部空間（吐出部と着弾部との間の空間）についても約２０℃に保たれていると想定される。
【0102】
また、実施例の装置では、安定して液滴の吐出が可能な状態のまま、インクジェットヘッドの先端から着弾部までの距離を２ｍｍまで近づけることができた。
【0103】
（比較例）
上部ヒータ、下部ヒータ、筒状部材を有さないこと以外は、実施例で用いたものと同じ構成の細胞凍結装置を用いた。
上部ヒータ、下部ヒータ、筒状部材を有さないこと以外は、実施例で用いたものと同じ構成の細胞凍結装置を用いた。
【0104】
サーモグラフィカメラにて吐出部の温度を確認したところ、吐出開始時の吐出部の温度は約２０℃であった。しかし、吐出開始から３分後には、ノズル１１１及びノズル１１１の先端から着弾部までの空間の温度がサーモグラフィカメラの検出下限以下（－２０℃以下）であることを確認した。
【0105】
また、実施例及び比較例の装置でそれぞれ形成した凍結粒子について、凍結粒子に含まれる細胞の生存率を確認した。
【0106】
約３７℃に予温した培地を回収容器９０（５ｍＬチューブ）に入れておき、運搬部２２２を固定していた固定機構を開放することにより、反転ヒンジばねを用いて凍結粒子を培地に投入した。解凍後に採取した細胞数は２７０個（標準偏差：４３個）であった。
【0107】
その結果、実施例の装置で形成した凍結粒子中の細胞の生存率は、比較例の装置で形成した凍結粒子中の細胞の生存率よりも、約１５％高いことが確認できた。実施例の装置においては、第１ヒータ（上部ヒータ、下部ヒータ）及び筒状部材により、吐出部と着弾部との間の空間を加熱することができ、飛翔中の液滴の凍結を抑制することができたため、細胞の生存率が向上したものと考えられる。
（生存率の測定方法）
凍結粒子中の細胞を解凍して、細胞二重染色キット（ＣＳ０１、株式会社同人化学研究所製）を用いて生細胞と死細胞とをそれぞれ染色した。染色後の細胞を蛍光顕微鏡により蛍光観察し、各実施例において解凍された全細胞数のうち、生細胞の数の割合として算出した。
（生存率の測定方法）
凍結粒子中の細胞を解凍して、細胞二重染色キット（ＣＳ０１、株式会社同人化学研究所製）を用いて生細胞と死細胞とをそれぞれ染色した。染色後の細胞を蛍光顕微鏡により蛍光観察し、各実施例において解凍された全細胞数のうち、生細胞の数の割合として算出した。
【0108】
以上の結果より、本発明が有用であることが確認できた。
【符号の説明】
【0109】
１０，５０…吐出部、１１，５１…インクジェットヘッド、１１ａ，５１ａ…吐出孔、１１ｘ，５１ｘ…液室、１２，５２…筒状部材、１２ｘ，５２ｘ…内部空間、１３…下部ヒータ（第１ヒータ）、１４…上部ヒータ（第１ヒータ）、２０…凍結部、２１…貯留部、２１ｘ…内部、２２…着弾部、３０…駆動部、５３…第１ヒータ、５４…第２ヒータ、１００，２００…細胞凍結装置、１１１…ノズル、１１１ａ…先端、１２１，５２１…窓部、２２１ａ…上面、２２１…基板、Ｃ…細胞、ＤＬ…分散液、Ｄｐ…液滴、Ｎ２…窒素、Ｒ…冷媒
【図1】
【図2】
【図3】