特開 2024-123548 細胞接着性支持体及び細胞培養方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024123548

(43)【公開日】2024-09-12

(54)【発明の名称】細胞接着性支持体及び細胞培養方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/00 20060101AFI20240905BHJP

   C12M 1/14 20060101ALI20240905BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20240905BHJP

【ＦＩ】

C12M3/00 A

C12M1/14

C12N5/071

【審査請求】有

【請求項の数】14

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023031060

(22)【出願日】2023-03-01

(71)【出願人】

【識別番号】000003609

【氏名又は名称】株式会社豊田中央研究所

(71)【出願人】

【識別番号】000241463

【氏名又は名称】豊田合成株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110002789

【氏名又は名称】弁理士法人ＩＰＸ

(72)【発明者】

【氏名】森部 真也

(72)【発明者】

【氏名】平野 稔

(72)【発明者】

【氏名】深野 達雄

(72)【発明者】

【氏名】岩田 晃輔

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA01

4B029AA21

4B029BB11

4B029CC02

4B029DG08

4B029FA15

4B029GB06

4B065AA90X

4B065AC20

4B065BD50

4B065CA44

(57)【要約】

【課題】細胞接着性と細胞観察性とを両立させることが可能な細胞接着性支持体等を提供する。
【解決手段】本発明の一態様によれば、細胞接着性支持体が提供される。この細胞接着性支持体は、基材と、透明性を有する被覆層とを備える。基材は、樹脂から構成される。被覆層は、基材の表面の少なくとも一部を被覆するように形成される。被覆層は、細胞との親和性が樹脂よりも高い材料から構成される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞接着性支持体であって、
基材と、透明性を有する被覆層とを備え、
前記基材は、樹脂から構成され、
前記被覆層は、前記基材の表面の少なくとも一部を被覆するように形成され、
前記被覆層は、細胞との親和性が前記樹脂よりも高い材料から構成される、
細胞接着性支持体。

【請求項2】

請求項１に記載の細胞接着性支持体において、
前記被覆層は、無機化合物から構成される、
細胞接着性支持体。

【請求項3】

請求項２に記載の細胞接着性支持体において、
前記無機化合物は、チタン化合物、ジルコニウム化合物、ストロンチウム化合物、及びリン酸カルシウム系化合物からなる群から選択される１種以上を主成分として含有する、
細胞接着性支持体。

【請求項4】

請求項１に記載の細胞接着性支持体において、
前記樹脂は、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリカーボネート、シリコーン、及びフッ素樹脂からなる群から選択される１種以上を主成分として含有する、
細胞接着性支持体。

【請求項5】

請求項１に記載の細胞接着性支持体において、
前記基材は、複数の空孔を有する多孔質体である、
細胞接着性支持体。

【請求項6】

請求項１に記載の細胞接着性支持体において、
前記基材は、平板状をなし、その厚さ方向に貫通する貫通孔を有する、
細胞接着性支持体。

【請求項7】

請求項６に記載の細胞接着性支持体において、
前記貫通孔の孔径は、０．１～１００μｍである、
細胞接着性支持体。

【請求項8】

請求項１に記載の細胞接着性支持体において、
前記被覆層の厚みは、０．１ｎｍ～５ｍｍである、
細胞接着性支持体。

【請求項9】

請求項１に記載の細胞接着性支持体において、
前記被覆層の光透過率は、前記基材の光透過率の９０％以上である、
細胞接着性支持体。

【請求項10】

請求項１に記載の細胞接着性支持体において、
前記細胞は、上皮細胞である、
細胞接着性支持体。

【請求項11】

請求項１０に記載の細胞接着性支持体において、
前記上皮細胞は、気道上皮細胞、嗅上皮細胞、肺胞上皮細胞、皮膚角化細胞、角膜上皮細胞、腸管上皮細胞、尿管上皮細胞、及び膣上皮細胞からなる群から選択される１種以上である、
細胞接着性支持体。

【請求項12】

細胞培養方法であって、
播種工程と、培養工程とを備え、
前記播種工程では、請求項１から１１までの何れか１項に記載の細胞接着性支持体に細胞を播種し、
前記培養工程では、播種された前記細胞を培養する、
細胞培養方法。

【請求項13】

請求項１２に記載の細胞培養方法において、
前記培養工程では、培養された前記細胞の前記細胞接着性支持体における被覆率が閾値以上である場合、前記細胞の培養を終了させる、
細胞培養方法。

【請求項14】

請求項１２に記載の細胞培養方法において、
前記培養工程では、培養された前記細胞の経上皮電気抵抗値が閾値以上である場合、前記細胞の培養を終了させる、
細胞培養方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞接着性支持体及び細胞培養方法に関する。

【背景技術】

【0002】

特許文献１には、バイオコーティングされた基材を調製するための方法が開示されている。

【0003】

この方法は、選択された基材に蒸着される生物活性表面コーティングに関する。ほとんどの金属または非金属基材に蒸着されて表面を提供する表面ナノ構造膜コーティングは、組織／細胞接着の強化を促進するように設計することが可能である。骨芽細胞、線維芽細胞および内皮細胞を含む付着細胞は、生存能力を保持し、適切な条件下で直ちに分化および増殖する。線維芽細胞および内皮細胞は、ナノ表面構造シリコーンを除くほとんどのコーティング基材上で良好な付着および成長を示す。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特表２００９－５４２２６１号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、特許文献１に開示された方法では、培養細胞を観察することが困難であるため、細胞接着性と細胞観察性とを両立させることができなかった。

【0006】

本発明では上記事情を鑑み、細胞接着性と細胞観察性とを両立させることが可能な細胞接着性支持体等を提供することとした。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の一態様によれば、細胞接着性支持体が提供される。この細胞接着性支持体は、基材と、透明性を有する被覆層とを備える。基材は、樹脂から構成される。被覆層は、基材の表面の少なくとも一部を被覆するように形成される。被覆層は、細胞との親和性が樹脂よりも高い材料から構成される。

【0008】

このような態様によれば、細胞接着性と細胞観察性とを両立させることができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】細胞培養用足場１００を表す構成図である。

【図2】被覆層１２０の表面の状態を示す図であり、（Ａ）ＳＥＭの二次電子像（１０００倍）、（Ｂ）ＳＥＭの反射電子像（１０００倍）を示す。

【図3】被覆層１２０の表面の状態を示す図であり、（Ａ）ＳＥＭの二次電子像（１０００倍）、（Ｂ）ＳＥＭの反射電子像（１０００倍）を示す。

【図4】細胞培養用足場１００の製造方法を示すアクティビティ図である。

【図5】細胞培養用足場１００を使用した細胞培養方法を示すアクティビティ図である。

【図6】細胞培養用足場１００の鳥瞰平面図である。

【図7】細胞培養用足場１００のＡ－Ａ断面図である。

【図8】細胞培養用足場１００の両面で細胞を培養した状態を示す図である。

【図9】（Ａ）ＳＥＭの二次電子像（１０００倍）、（Ｂ）ＳＥＭの反射電子像（１０００倍）を示す。

【図10】（Ａ）ＥＤＸの画像（１０００倍）、（Ｂ）ＥＤＸの元素分析結果を示す。

【図11】ＳＥＭの二次電子像（５０００倍）、ＳＥＭの反射電子像（５０００倍）を示す。

【図12】（Ａ）ＥＤＸの画像（５０００倍）、（Ｂ）ＥＤＸの元素分析結果を示す。

【図13】（Ａ）ＳＥＭの二次電子像（１０００倍）、（Ｂ）ＳＥＭの反射電子像（１０００倍）を示す。

【図14】（Ａ）ＥＤＸの画像（１０００倍）、（Ｂ）ＥＤＸの元素分析結果を示す。

【図15】ＳＥＭの二次電子像（５０００倍）、ＳＥＭの反射電子像（５０００倍）を示す。

【図16】（Ａ）ＥＤＸの画像（５０００倍）、（Ｂ）ＥＤＸの元素分析結果を示す。

【図17】気道上皮細胞を培養したサンプル上の表面観察画像である。

【図18】サンプル上における気道上皮細胞の細胞被覆率を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0010】

以下、図面を用いて本発明の実施形態について説明する。以下に示す実施形態中で示した各種特徴事項は、互いに組み合わせ可能である。

【0011】

１．第１実施形態
第１節では、第１実施形態について説明する。

【0012】

図１は、細胞培養用足場１００を表す構成図である。本実施形態では、細胞接着性支持体の一例として、細胞培養用足場１００について説明する。細胞接着性支持体は、各種細胞を接着（付着）させて支持可能なものであればよく、細胞培養用足場１００以外にも、例えばカテーテルのような医療用器具であってもよい。細胞培養用足場１００は、基材１１０と、被覆層１２０とを備える。これらの構成要素についてさらに説明する。

【0013】

このような細胞培養用足場１００は、被覆層１２０の表面に細胞２００を付着させ、この細胞２００が増殖できる足場となるものである。

【0014】

細胞２００は、例えば、動物由来の細胞であってもよく、結合組織に由来する細胞（骨細胞、線維芽細胞、免疫細胞、周皮細胞、内皮細胞、炎症性細胞等）、筋組織に由来する細胞、神経組織に由来する細胞、上皮組織に由来する細胞（以下「上皮細胞」ともいう。）等であってもよい。細胞２００は、上皮細胞であると好ましく、この上皮細胞は、気道上皮細胞、嗅上皮細胞、肺胞上皮細胞、皮膚角化細胞、角膜上皮細胞、腸管上皮細胞、尿管上皮細胞、及び膣上皮細胞からなる群から選択される１種以上であってもよい。

【0015】

基材１１０は、樹脂、好ましくは可撓性を有する樹脂から構成される。可撓性を有する樹脂は、特に限定されることなく、例えば、ポリオレフィン（ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン－プロピレン共重合体、エチレン－酢酸ビニル共重合体、架橋型エチレン－酢酸ビニル共重合体等）、ポリエステル、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリアミド、ポリアミドエラストマーのような熱可塑性樹脂等が挙げられる。また、ポリスチレン、ポリカーボネート、シリコーン、及びテフロン（登録商標）／ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）などのフッ素樹脂であってもよい。これらの樹脂は、１種を単独で使用しても、２種以上を併用してもよい。基材１１０が可撓性を有する樹脂である場合、人工皮膚等の生体材料への応用が可能となる。

【0016】

可撓性を有する樹脂は、ポリウレタンを主成分として含有すると好ましい。ポリウレタンは、加工性、細胞観察性、強度、構造多様性を有し、柔らかい培養基材としての用途に対応することができる。ここで、本明細書において、「ＸがＡを主成分として含有する」とは、Ｘに含まれるＡの量が、好ましくは６０，６５，７０，７５，８０，８５，９０，９５質量％以上であり、１００質量％であってもよいことを意味する。

【0017】

基材１１０の形状は、特に限定されることなく、例えば、粒状、ペレット状、ブロック状、管状、又は平板状であってもよい。これにより、細胞培養用足場１００として、基材１１０の形状に対応するものが得られるため、細胞接着性支持体としての用途の多様化に対する要求に対応することができる。

【0018】

基材１１０の形状は、平板状であると好ましい。基材１１０が平板状である場合、個々の形状のバラツキを小さく抑えることができるため、細胞２００を培養する際に与える影響を最小限に抑えることができる。

【0019】

基材１１０の形状は、管状であると好ましい。基材１１０が管状である場合、その管の外部に細胞２００が安定的に接着可能であるため、例えば医療用カテーテルに適用することができる。この場合、細胞２００は、医療用カテーテルを挿入される患者自身の細胞が該当する。またこの場合、医療用カテーテルを挿入された患者自身の細胞がカテーテルと密着するため、使用時に雑菌等が体内に侵入することを効果的に抑制することができる。

【0020】

また、基材１１０が管状である場合、その管腔内に細胞２００を保持した状態で体内にアクセスすることが容易であるため、例えば細胞治療（細胞として例えば膵島Ｂ細胞等）の細胞保持担体として利用することができる。

【0021】

被覆層１２０は、基材１１０の表面の少なくとも一部を被覆するように形成される。本実施形態では、被覆層１２０は、基材１１０の上面（一方の面）の全体を被覆するように形成されるが、上面と下面の両面全体を被覆する場合もある。被覆層１２０は、基材１１０の全面を完全に被覆している必要はなく、例えば、島状に点在していてもよい。基材１１０の一方の面に対する被覆層１２０の被覆率は、１０％以上あればよく、さらに可撓性を求める際には５～９０％あればよい。また、被覆層１２０は、亀裂のあるひび割れ構造状に形成されてもよい。

【0022】

基材１１０上に形成された被覆層１２０は、透明性を有する。ここで、「透明性」とは、被覆層１２０の表面において、細胞２００等の被写体を十分に観察可能な状態であることを示す。被写体を十分に観察可能な状態は、観察光（紫外光、可視光、近赤外光、赤外光、遠赤外光）の波長の１／１０以上のサイズのランダムな凹凸構造が無いことにより、確保される。すなわち、被覆層１２０の表面が、光散乱を起こさない程度に十分に平滑な表面である場合に、透明性が確保される。

【0023】

図２及び図３は、被覆層１２０の表面の状態を示す図であり、（Ａ）ＳＥＭの二次電子像（１０００倍）、（Ｂ）ＳＥＭの反射電子像（１０００倍）を示す。図２及び図３に示すように、被覆層１２０の表面に、観察光の波長の１／１０以上のサイズのランダムな凹凸構造が無い場合に、透明性が確保される。

【0024】

被覆層１２０は、光透過性を有する材料から構成されてもよい。被覆層１２０は、細胞２００との親和性が基材１１０を構成する材料（可撓性を有する樹脂）よりも高い材料から構成される。

【0025】

ここで、「光透過性」とは、観察性という観点から、主に、紫外光、可視光、近赤外光、赤外光、遠赤外光に対する透過性の事を指す。また、「光透過性を有する」とは、例えば、光透過率が所定％以上であることを示し、具体的には例えば、１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０，５５，６０，６５，７０，７５，８０，８５，９０，９５，１００％であり、ここで例示した数値の何れか２つの間の範囲内であってもよい。

【0026】

また、「光透過性を有する」とは、基材１１０に対する光透過率が所定％以上であってもよく、具体的には例えば、１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０，５５，６０，６５，７０，７５，８０，８５，９０，９５，１００％であり、ここで例示した数値の何れか２つの間の範囲内であってもよい。被覆層１２０の光透過率は、基材１１０の光透過率の９０％以上であると好ましく、９２．５％以上であるとより好ましく、９５％以上であるとさらに好ましい。これにより、細胞培養用足場１００の細胞観察性を十分に高めることができる。

【0027】

なお、光透過率が上記に満たない材料であっても、被覆層１２０の表面に上記ランダム凹凸構造が無い場合は、透明性を確保可能である。この場合、例えば、露光時間を上げることにより、被写体を十分に観察することができる。

【0028】

さらに、「細胞２００との親和性が可撓性を有する樹脂よりも高い材料」とは、例えば、細胞２００が接着して増殖しやすい性質を有する材料のことを示し、ポリスチレンと細胞２００との親和性（例えば細胞２００によるポリスチレンの細胞被覆率）を１００としたとき、１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０，５５，６０，６５，７０，７５，８０，８５，９０，９５，１００，１０５，１１０，１１５，１２０，１２５，１３０，１３５，１４０，１４５，１５０，１５５，１６０，１６５，１７０，１７５，１８０，１８５，１９０，１９５，２００であり、ここで例示した数値の何れか２つの間の範囲内であってもよい。

【0029】

被覆層１２０は、細胞２００との親和性が高い性質を有することにより、細胞２００の付着（接着）、増殖、進展を促進させる基質となり得るものである。

【0030】

被覆層１２０の厚みは、０．１ｎｍ～５ｍｍであればよく、好ましくは０．１ｎｍ～１μｍであり、より好ましくは０．１ｎｍ～１００ｎｍである。具体的には例えば、０．１，０．２，０．３，０．４，０．５，０．６，０．７，０．８，０．９，１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，１５０，２００，２５０，３００，３５０，４００，４５０，５００，５５０，６００，６５０，７００，７５０，８００，８５０，９００，９５０，１０００ｎｍ（１μｍ），２，３，４，５，６，７，８，９，１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，１５０，２００，２５０，３００，３５０，４００，４５０，５００，５５０，６００，６５０，７００，７５０，８００，８５０，９００，９５０，１０００μｍ（１ｍｍ），２，３，４，５ｍｍであり、ここで例示した数値の何れか２つの間の範囲内であってもよい。

【0031】

被覆層１２０は、その材料の性質に応じて厚みを設定することで、細胞培養用足場１００全体としての可撓性（柔軟性）が低下するのを抑制しつつ、適切な細胞観察性を得ることができる。

【0032】

被覆層１２０の材料は、無機化合物から構成されてもよい。この無機化合物は、チタン化合物、ジルコニウム化合物、ストロンチウム化合物、及びリン酸カルシウム系化合物からなる群から選択される１種以上を主成分として含有してもよい。

【0033】

チタン化合物は、特に限定されることなく、例えば、塩化チタン、炭化チタン、窒化チタン、フッ化チタン、リン化チタン、酸化チタン等のうちの１種又は２種以上を混合して用いることができる。

【0034】

ジルコニウム化合物は、特に限定されることなく、例えば、ジルコン、二酸化ジルコニウム、タングステン酸ジルコニウム、塩化ジルコニウム、チタン酸ジルコン酸塩等のうちの１種又は２種以上を混合して用いることができる。

【0035】

ストロンチウム化合物は、特に限定されることなく、例えば、塩化ストロンチウム、硝酸ストロンチウム、酢酸ストロンチウム等のうちの１種又は２種以上を混合して用いることができる。

【0036】

リン酸カルシウム系化合物は、特に限定されることなく、Ｃａ／Ｐモル比が１．０～２．０の各種化合物を用いることができ、例えば、ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、リン酸二カルシウム、フッ素アパタイト等のうちの１種又は２種以上を混合して用いることができる。

【0037】

２．製造方法
第２節では、前述した細胞培養用足場１００の製造方法について説明する。この製造方法は、準備工程と、反応工程とを備える。

【0038】

図４は、細胞培養用足場１００の製造方法を示すアクティビティ図である。第２節では、このアクティビティ図の各アクティビティに沿って、説明するものとする。ここで、反応工程は、特に限定されることなく、例えば、物理成膜法、化学成膜法、原子層堆積法など、種々の方法により実行されうる。

【0039】

まず、準備工程では、基材１１０を準備する（アクティビティＡ１１０）。そして、反応容器内に載置された基材１１０に対して被覆層１２０の原料を導入する。

【0040】

続いて、反応工程では、被覆層１２０の原料を反応させつつ、基材１１０とも反応させて、基材１１０の表面に被覆層１２０を形成させる。（アクティビティＡ１２０）。
被覆層１２０の形成時や形成後に、例えば、表面処理、酸化処理、加熱処理等の追加の処理を行ってもよい。
なお、被覆層１２０の特性は、原料の種類、被覆層１２０の形成条件、追加の処理の処理条件等を適宜設定することにより、調整することができる。

【0041】

３．細胞培養方法
第３節では、前述した細胞培養用足場１００を使用した細胞培養方法について説明する。この細胞培養方法は、滅菌工程と、播種工程と、培養工程とを備える。

【0042】

図５は、細胞培養用足場１００を使用した細胞培養方法を示すアクティビティ図である。第３節では、このアクティビティ図の各アクティビティに沿って、説明するものとする。

【0043】

まず、滅菌工程では、基材１１０の消毒処理を行う（アクティビティＡ２０５）。

【0044】

基材１１０の消毒処理は、特に限定されることなく、例えば、７０％エタノールあるいはそれに代替可能なアルコール溶液（イソプロパノール等）に１５分程度基材１１０を浸漬させ、その後十分にアルコール溶液を除去することにより行なわれてもよい。なお、この方法以外にも、エチレンオキサイドガスによる処理、乾熱滅菌処理、ガンマ線照射処理などの滅菌（殺菌）処理を採用することができる。

【0045】

続いて、播種工程では、細胞培養用足場１００に細胞２００を播種する（アクティビティＡ２１０）。

【0046】

細胞培養用足場１００の大きさは、適宜設定されればよく、例えば、使用するウェルプレートの大きさに適合するように設定されると好ましい。これにより、細胞２００を培養する際の好適な環境を設定することができる。

【0047】

播種される細胞２００の数は、培養目的に対して１以上の任意の数に決定することができる。仮に基材面全面を被覆することを想定した用途においては、細胞培養用足場１００の上面（細胞２００を播種する領域）の単位面積（１ｃｍ^２）あたり、１００～１００００００個であると好ましく、１０００～５
０００００個であるとより好ましい。細胞を播種する際には、細胞２００を液体培地に懸濁された状態で行われる。

【0048】

続いて、培養工程では、細胞２００が播種された細胞培養用足場１００を液体培地（培養液）に浸漬させた状態で、細胞２００を培養し、単にその状態のまま生育させるか、増殖させるか、あるいは分化させる（アクティビティＡ２２０）。

【0049】

液体培地の温度は、細胞２００の種類に応じて適宜設定されればよく、１５～５０℃であると好ましく、２５～４０℃であるとより好ましい。これにより、細胞２００を効率よく増殖させることができる。
利用される液体培地は全てのものが利用可能であり、例えば、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｈａｍ'ｓ Ｆ１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＥＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６２９培地、ＲＰＭＩ１６３０培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＩＭＤＭ培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ'ｓ培地、ＭｃＣｏｙ'ｓ培地、Ｗｉｌｌｉａｍ'ｓ培地等が挙げられる。

【0050】

続いて、培養工程では、所定条件が満たされた場合、細胞２００の培養を終了させる（アクティビティＡ２３０）。

【0051】

所定条件として、例えば、（１）細胞２００の細胞培養用足場１００における被覆率が閾値以上になった時点、（２）培養された細胞２００における所定の遺伝子やタンパク質の発現量が閾値以上である場合、（３）経上皮電気抵抗が閾値以上である場合、（４）細胞形状が特定の形状になった時点、（５）液体培地中のサイトカインその他分泌物や老廃物成分が特定の値を取った時点、等を設定可能である。

【0052】

ここで、各所定条件について説明する。（１）実験の目的に合わせて設定された細胞２００の被覆率（例えば、０．１～１００％）を、例えば顕微鏡観察等を使用した目視観察により判別する。（２）遺伝子の発現量を細胞２００からＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲ装置等により特定の細胞に分化した際のマーカー分子の設定閾値に達した時点とする。（３）実験の目的に合わせて設定された閾値を、例えば公知の経上皮電気抵抗測定装置により測定する。仮に、シート状の基材１１０において、細胞２００の被覆率を１００％まで形成させる場合、細胞種により大きく異なるが、例えば、２０～１００００Ω・ｃｍ^２の値を基準としてもよい。（４）例えば、神経細胞特有の軸索のようなアスペクト比の高い形状、血球系細胞のような球状形体、マクロファージ等の仮足構造体、筋肉のようなサルコメア構造や多核化した融合細胞、心筋細胞のような自発的な収縮運動等の確認によって判別する。（５）細胞２００が浸漬されている液体培地を採取し、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏ－ｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）等で目的のサイトカイン種が特定の濃度になった時点、又は、液体培地中の成分（例えば、グルコース等）が特定の濃度以下まで消費された時点、又は、細胞２００が液体培地中に放出した老廃物等の成分が設定した閾値に達した時点とする。

【0053】

続いて、所定条件（２）について説明する。所定の遺伝子の発現量は、公知の遺伝子発現解析法を用いて定量されてもよいし、抗体を利用したタンパク発現量として決定することもできる。

【0054】

細胞２００の培養を終了させる指標である閾値は、実験の目的により決定することができ特に限定されないが、基材を覆う細胞シートを形成したい場合において、８０％以上であると好ましく、９０％以上であるとより好ましい。この場合、細胞２００が十分に増殖したことがわかる。

【0055】

所定の遺伝子は、タイトジャンクションの構成成分を合成するための遺伝子であり、例えば、オクルーディン、クローディン、トリセルリン、アンギュリン、ＺＯファミリー、ＪＡＭファミリー、シングリンファミリーを構成する遺伝子のうちの１種又は２種以上であると好ましい。これらの成分は、タイトジャンクションを形成した時のみに遺伝子が高発現することから好適である。

【0056】

４．第２実施形態
第４節では、第２実施形態について説明する。第２実施形態では、第１実施形態との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。

【0057】

図６は、細胞培養用足場１００の鳥瞰平面図である。図７は、細胞培養用足場１００のＡ－Ａ断面図である。図８は、細胞培養用足場１００の両面で細胞を培養した状態を示す図である。

【0058】

基材１１０は、複数の空孔を有する多孔質体であってもよい。複数の空孔は、例えば、化学反応発泡法、ポローゲンリーチング法、ハンドミキシング発泡法、簡易発泡法、注入法、フロス注入法、スプレー法等の各方法を用いて形成することができる。

【0059】

基材１１０が多孔質体である場合、複数の空孔は、隣接する空孔同士が連通する連通空孔を含んでいてもよい。かかる連通空孔は、平板状の基材１１０を厚さ方向に貫通する貫通孔１１１を構成する。すなわち、基材１１０が平板状をなす場合、基材１１０は、その厚さ方向に貫通する貫通孔１１１を含むと好ましい。これにより、図８に示すように、細胞培養用足場１００の両面に２種類の細胞（細胞２１０及び細胞２２０）を培養して、２層の細胞組織を作成することができる。この場合、基材１１０の両面に、それぞれ被覆層１２０が形成されると好ましい。

【0060】

貫通孔１１１の直径（空孔の孔径）は、特に限定されることなく、０．１～１００μｍであると好ましく、０．５～１０μｍであるとより好ましく、１～７．５μｍであるとさらに好ましい。これにより、１つの細胞に対して１つの貫通孔１１１が対応することとなり、細胞培養用足場１００の両面に、２層の細胞組織を互いに確実に分離した状態で作成することができる。
なお、基材１１０は、厚さ方向に貫通する貫通孔１１１を有する平板状の緻密体で構成されてもよい。

【0061】

以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明はこれに限定されることなく、その発明の技術的思想を逸脱しない範囲で適宜変更可能である。

【0062】

５．その他
次に記載の各態様で提供されてもよい。

【0063】

（１）細胞接着性支持体であって、基材と、透明性を有する被覆層とを備え、前記基材は、樹脂から構成され、前記被覆層は、前記基材の表面の少なくとも一部を被覆するように形成され、前記被覆層は、細胞との親和性が前記樹脂よりも高い材料から構成される、細胞接着性支持体。

【0064】

（２）上記（１）に記載の細胞接着性支持体において、前記被覆層は、無機化合物から構成される、細胞接着性支持体。

【0065】

（３）上記（２）に記載の細胞接着性支持体において、前記無機化合物は、チタン化合物、ジルコニウム化合物、ストロンチウム化合物、及びリン酸カルシウム系化合物からなる群から選択される１種以上を主成分として含有する、細胞接着性支持体。

【0066】

（４）上記（１）から（３）までの何れか１つに記載の細胞接着性支持体において、前記樹脂は、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリカーボネート、シリコーン、及びフッ素樹脂からなる群から選択される１種以上を主成分として含有する、細胞接着性支持体。

【0067】

（５）上記（１）から（４）までの何れか１つに記載の細胞接着性支持体において、前記基材は、複数の空孔を有する多孔質体である、細胞接着性支持体。

【0068】

（６）上記（１）から（５）までの何れか１つに記載の細胞接着性支持体において、前記基材は、平板状をなし、その厚さ方向に貫通する貫通孔を有する、細胞接着性支持体。

【0069】

（７）上記（６）に記載の細胞接着性支持体において、前記貫通孔の孔径は、０．１～１００μｍである、細胞接着性支持体。

【0070】

（８）上記（１）から（７）までの何れか１つに記載の細胞接着性支持体において、前記被覆層の厚みは、０．１ｎｍ～５ｍｍである、細胞接着性支持体。

【0071】

（９）上記（１）から（８）までの何れか１つに記載の細胞接着性支持体において、前記被覆層の光透過率は、前記基材の光透過率の９０％以上である、細胞接着性支持体。

【0072】

（１０）上記（１）から（９）までの何れか１つに記載の細胞接着性支持体において、前記細胞は、上皮細胞である、細胞接着性支持体。

【0073】

（１１）上記（１０）に記載の細胞接着性支持体において、前記上皮細胞は、気道上皮細胞、嗅上皮細胞、肺胞上皮細胞、皮膚角化細胞、角膜上皮細胞、腸管上皮細胞、尿管上皮細胞、及び膣上皮細胞からなる群から選択される１種以上である、細胞接着性支持体。

【0074】

（１２）細胞培養方法であって、播種工程と、培養工程とを備え、前記播種工程では、上記（１）から（１１）までの何れか１つに記載の細胞接着性支持体に細胞を播種し、前記培養工程では、播種された前記細胞を培養する、細胞培養方法。

【0075】

（１３）上記（１２）に記載の細胞培養方法において、前記培養工程では、培養された前記細胞の前記細胞接着性支持体における被覆率が閾値以上である場合、前記細胞の培養を終了させる、細胞培養方法。

【0076】

（１４）上記（１２）に記載の細胞培養方法において、前記培養工程では、培養された前記細胞の経上皮電気抵抗値が閾値以上である場合、前記細胞の培養を終了させる、細胞培養方法。
もちろん、この限りではない。

【実施例0077】

以下、本発明の具体的な実施例について説明する。なお、以下の実施例は、本発明を限定するものではない。
［１］細胞培養用足場の製造
以下に示すようにして、各実施例及び比較例において、それぞれ、細胞培養用足場を製造した。

【0078】

（実施例１）
まず、厚さ１ｍｍのポリウレタン基材（基材１１０）の上に、原子層堆積法を用いて、酸化チタン膜（被覆層１２０）を成膜した。原子層堆積法は、一般的な方法として例えば下記の参考論文が挙げられる。参考論文：Ａｔｏｍｉｃ ｌａｙｅｒ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ＴｉＯ_２ ｆｒｏｍ ｔｅｔｒａｋｉｓ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｔｉｔａｎｉｕｍ ａｎｄ Ｈ_２Ｏ， Ｔｈｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｆｉｌｍ， ５４５， （２０１３）， １７６－１８２．

【0079】

ここで、実施例１の原子層堆積法による成膜条件は、次の通りである。（１）原料のチタン化合物の温度を７５℃に設定した。（２）原料系配管温度を１２０℃に設定した。（３）チタン化合物の導入前に、反応容器を真空引きし、反応容器内の圧力を１×１０^－４Ｐａに設定した。（４）キャリアガスとしてアルゴンを使用し、当該アルゴンの流量を３０ｓｃｃｍとした。（５）チタン化合物の導入間隔（パルス幅）を０．２５秒とした。

【0080】

（６）チタン化合物の導入後、酸化剤により処理した。その後、（７）反応容器内を排気処理（パージ）した。

【0081】

上記（１）～（７）のプロセスを１００回繰り返して、酸化チタン膜が成膜されたポリウレタン（細胞培養用足場１００）を得た。

【0082】

（比較例１）
酸化チタン膜を成膜させることなく、厚さ１ｍｍのポリウレタン基材をそのまま使用した。

【0083】

［２］評価
実施例１で得られた細胞培養用足場１００及び比較例１で得られたポリウレタン基材（基材１１０）の表面を走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察し、エネルギー分散型Ｘ線分析（ＥＤＸ）により元素分析をした。評価の例として、実施例１で得られた細胞培養用足場１００及び比較例１で得られたポリウレタン基材の表面の観察画像及び元素分析結果を図９～図１６に示す。

【0084】

実施例１は、図９～図１２に対応する。図９は、（Ａ）ＳＥＭの二次電子像（１０００倍）、（Ｂ）ＳＥＭの反射電子像（１０００倍）を示す。図１０は、（Ａ）ＥＤＸの画像（１０００倍）、（Ｂ）ＥＤＸの元素分析結果を示す。図１１は、ＳＥＭの二次電子像（５０００倍）、ＳＥＭの反射電子像（５０００倍）を示す。図１２は、（Ａ）ＥＤＸの画像（５０００倍）、（Ｂ）ＥＤＸの元素分析結果を示す。

【0085】

図１０（Ｂ）の元素分析結果は、次の表１に示す。なお、表１では、炭素（Ｃ）を含めずに値を算出した。

【0086】

【表1】

【0087】

図１２（Ｂ）の元素分析結果は、次の表２に示す。なお、表２では、炭素（Ｃ）を含めて値を算出した。

【0088】

【表2】

【0089】

比較例１は、図１３～図１６に対応する。図１３は、（Ａ）ＳＥＭの二次電子像（１０００倍）、（Ｂ）ＳＥＭの反射電子像（１０００倍）を示す。図１４は、（Ａ）ＥＤＸの画像（１０００倍）、（Ｂ）ＥＤＸの元素分析結果を示す。図１５は、ＳＥＭの二次電子像（５０００倍）、ＳＥＭの反射電子像（５０００倍）を示す。図１６は、（Ａ）ＥＤＸの画像（５０００倍）、（Ｂ）ＥＤＸの元素分析結果を示す。

【0090】

図１４（Ｂ）の元素分析結果は、次の表３に示す。なお、表３では、炭素（Ｃ）を含めずに値を算出した。

【0091】

【表3】

【0092】

図１６（Ｂ）の元素分析結果は、次の表４に示す。なお、表４では、炭素（Ｃ）を含めて値を算出した。

【0093】

【表4】

【0094】

図９～図１６及び表１～表４を比較すると、実施例１で得られた細胞培養用足場１００では、表面にチタン化合物である酸化チタン膜（被覆層１２０）が形成されているのが確認された。一方、比較例１で得られたポリウレタン基材では、表面に酸化チタン膜は確認されなかった。

【0095】

次の表５は、シリコンウェハ上に原子層堆積法を用いて形成した酸化チタン膜の膜厚を測定した結果である。原子層堆積法は、５０サイクル又は１００サイクルとした。酸化チタン膜の膜厚の測定には、分光エリプソメトリーを用いた。

【0096】

【表5】

【0097】

続いて、実施例１の細胞培養用足場１００、比較例１のポリウレタン基材、及び市販のポリスチレン製細胞培養用足場（コントロール）（以下総称して「サンプル」ともいう。）を、それぞれ直径１４ｍｍで切り抜き、２４ウェルプレートに入れ、気道上皮細胞を播種した。そして、播種から１１日目に、細胞染色用色素（製品名：Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ）により気道上皮細胞の生細胞を染色し、公知の画像解析法により、サンプルの細胞被覆率を計算した。

【0098】

図１７は、気道上皮細胞を培養したサンプル上の表面観察画像である。図１８は、サンプル上における気道上皮細胞の細胞被覆率を示すグラフである。

【0099】

コントロール上では、気道上皮細胞は接着かつ増殖し、表面を効率的に被覆することが観察された。実施例１の細胞培養用足場１００では、基材１１０として細胞接着性が高くないポリウレタンを使用したにもかかわらず、気道上皮細胞が増殖した。比較例１のポリウレタン基材上では、気道上皮細胞はほとんど接着、増殖、進展しなかった。

【0100】

上記実験例によれば、細胞接着性が高くないポリウレタンを基材として使用したとしても、基材の表面を酸化チタン膜で被覆させることにより、被覆率を１０倍程度向上させることができることが分かった。この被覆率の向上は、細胞接着性が高まったことが要因であると考えられる。したがって、本実施形態によれば、細胞接着性と細胞観察性とを両立させることができることが分かった。

【符号の説明】

【0101】

１００ ：細胞培養用足場
１１０ ：基材
１１１ ：貫通性発泡構造
１２０ ：被覆層
２００ ：細胞
２１０ ：細胞
２２０ ：細胞

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】