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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024123940
(43)【公開日】2024-09-12
(54)【発明の名称】ウイルスベクターの製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/64 20060101AFI20240905BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20240905BHJP
【ＦＩ】
C12N15/64 Z
C12N15/867 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】16
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023031784
(22)【出願日】2023-03-02
(71)【出願人】
【識別番号】504132272
【氏名又は名称】国立大学法人京都大学
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】垣塚 彰
(72)【発明者】
【氏名】小池 雅昭
(57)【要約】
【課題】本開示の目的は、培養細胞を用いるウイルスベクターの製造において、ウイルスベクターの生産量を高めることである。
【解決手段】ウイルスベクターの製造方法であって、ウイルスベクターのウイルス粒子の産生に必要な核酸およびウイルスベクターにより送達しようとする核酸を含む細胞を、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化する条件下で培養することを含み、ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢおよびＹＹ１から選択される少なくとも１つの転写因子の結合部位を含むプロモーターに作動可能に連結している、方法を提供する。
【選択図】図３３
【解決手段】ウイルスベクターの製造方法であって、ウイルスベクターのウイルス粒子の産生に必要な核酸およびウイルスベクターにより送達しようとする核酸を含む細胞を、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化する条件下で培養することを含み、ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢおよびＹＹ１から選択される少なくとも１つの転写因子の結合部位を含むプロモーターに作動可能に連結している、方法を提供する。
【選択図】図３３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ウイルスベクターの製造方法であって、ウイルスベクターのウイルス粒子の産生に必要な核酸およびウイルスベクターにより送達しようとする核酸を含む細胞を、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化する条件下で培養することを含み、
ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢおよびＹＹ１から選択される少なくとも１つの転写因子の結合部位を含むプロモーターに作動可能に連結している、方法。
ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢおよびＹＹ１から選択される少なくとも１つの転写因子の結合部位を含むプロモーターに作動可能に連結している、方法。
【請求項2】
ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
ウイルスベクターにより送達しようとする核酸が、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢおよびＹＹ１から選択される少なくとも１つの転写因子の結合部位を含むプロモーターに作動可能に連結している、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
【請求項5】
ＰＫＣ活性化剤の存在下で前記細胞を培養することによりＰＫＣを活性化する、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
ＰＫＣ活性化剤が、式（Ｉ）：
｛式中、
Ｒ１は、Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ６－１４アリールまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ３であり、ここで、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－６アルコキシまたはアリールは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよく、
Ｒ２は、Ｃ６－１２アルキル、Ｃ６－１２アルケニル、Ｃ６－１２アルキニルまたはＣ６－１２アルコキシであり、ここで、Ｃ６－１２アルキル、Ｃ６－１２アルケニル、Ｃ６－１２アルキニルまたはＣ６－１２アルコキシは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよく、
Ｒ３は、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、アミノまたはＣ６－１４アリールであり、ここでＣ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニルまたはＣ６－１４アリールは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよい｝、
式（ＩＩ）：
｛式中、
Ｒ４は、Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、Ｃ２－１８アルキニル、Ｃ１－１８アルコキシまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ６であり、ここで、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、Ｃ２－１８アルキニルまたはＣ１－１８アルコキシは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよく、
Ｒ５は、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニルまたはアミノであり、ここで、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニルまたはＣ２－６アルキニルは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよく、
Ｒ６は、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、Ｃ２－１８アルキニルまたはアミノであり、ここでＣ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニルまたはＣ２－１８アルキニルは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよい｝、
または、
式（ＩＩＩ）：
｛式中、
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、Ｃ２－１８アルキニルまたは－Ｃ（Ｏ）Ｒ９であり、ここで、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニルまたはＣ２－１８アルキニルは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよく、
Ｒ８は、Ｈ、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、Ｃ２－１８アルキニルまたは－Ｃ（Ｏ）Ｒ９であり、ここで、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニルまたはＣ２－１８アルキニルは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよく、
Ｒ９は、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、Ｃ２－１８アルキニルまたはアミノであり、ここでＣ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニルまたはＣ２－１８アルキニルは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよい｝
の化合物またはそのエステル、塩もしくは溶媒和物である、請求項５に記載の方法。
【化1】
Ｒ１は、Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ６－１４アリールまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ３であり、ここで、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－６アルコキシまたはアリールは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよく、
Ｒ２は、Ｃ６－１２アルキル、Ｃ６－１２アルケニル、Ｃ６－１２アルキニルまたはＣ６－１２アルコキシであり、ここで、Ｃ６－１２アルキル、Ｃ６－１２アルケニル、Ｃ６－１２アルキニルまたはＣ６－１２アルコキシは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよく、
Ｒ３は、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、アミノまたはＣ６－１４アリールであり、ここでＣ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニルまたはＣ６－１４アリールは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよい｝、
式（ＩＩ）：
【化2】
Ｒ４は、Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、Ｃ２－１８アルキニル、Ｃ１－１８アルコキシまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ６であり、ここで、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、Ｃ２－１８アルキニルまたはＣ１－１８アルコキシは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよく、
Ｒ５は、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニルまたはアミノであり、ここで、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニルまたはＣ２－６アルキニルは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよく、
Ｒ６は、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、Ｃ２－１８アルキニルまたはアミノであり、ここでＣ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニルまたはＣ２－１８アルキニルは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよい｝、
または、
式（ＩＩＩ）：
【化3】
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、Ｃ２－１８アルキニルまたは－Ｃ（Ｏ）Ｒ９であり、ここで、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニルまたはＣ２－１８アルキニルは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよく、
Ｒ８は、Ｈ、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、Ｃ２－１８アルキニルまたは－Ｃ（Ｏ）Ｒ９であり、ここで、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニルまたはＣ２－１８アルキニルは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよく、
Ｒ９は、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、Ｃ２－１８アルキニルまたはアミノであり、ここでＣ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニルまたはＣ２－１８アルキニルは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよい｝
の化合物またはそのエステル、塩もしくは溶媒和物である、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
ＰＫＣ活性化剤が、
ＴＰＡ、プロストラチン、（－）－インドラクタムＶ、ホルボール１２，１３－ジブチラート、インゲノール３－アンゲラートおよび（２Ｓ，５Ｓ）－（Ｅ，Ｅ）－８－（５－（４－（トリフルオロメチル）フェニル）－２，４－ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラクタムから選択される化合物またはそのエステル、塩もしくは溶媒和物である、請求項５または６に記載の方法。
【化4】
【請求項8】
ＰＫＣ活性化剤が、化合物Ｘおよび化合物＃１～＃７から選択される化合物またはそのエステル、塩もしくは溶媒和物である、請求項５～７のいずれかに記載の方法。
【請求項9】
ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、Ｐｒｏ領域またはＲＩＮＧ領域を含むペプチドをコードする核酸と連結されている、請求項５～８のいずれかに記載の方法。
【請求項10】
活性化型ＰＫＣを前記細胞に発現させることによりＰＫＣを活性化する、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
【請求項11】
カルモジュリン阻害剤の存在下で前記細胞を培養する、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
【請求項12】
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で前記細胞を培養する、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。
【請求項13】
細胞がパッケージング細胞である、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
【請求項14】
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤または活性化型ＰＫＣをコードする核酸と、ウイルスベクターのウイルス粒子の産生に必要な核酸とを含む、ウイルスベクターを製造するためのキットであって、
ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢおよびＹＹ１から選択される少なくとも１つの転写因子の結合部位を含むプロモーターに作動可能に連結しているものである、キット。
ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢおよびＹＹ１から選択される少なくとも１つの転写因子の結合部位を含むプロモーターに作動可能に連結しているものである、キット。
【請求項15】
ＰＫＣ活性化剤を含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項16】
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤または活性化型ＰＫＣをコードする核酸を含む、ウイルスベクターの産生を増強するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、ウイルスベクターの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
遺伝子治療は近年成長が期待されている分野である。遺伝子治療では、目的の遺伝子を細胞に送達するために、各種のベクターが使用される。ウイルスベクターはその１種であり、目的に応じてレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどが選択される。
【0003】
ウイルスベクターは、抗体などの生物製剤（バイオ医薬品）と同様に、培養細胞を用いて製造される。通常、ウイルス粒子の産生に必要な核酸と、目的の遺伝子の核酸を培養細胞に発現させることにより、目的の遺伝子を含むウイルスベクターを産生させ、培養培地に放出されたウイルスベクターを回収する。従って、ウイルスベクターの生産量は、細胞のタンパク質生産能、培養容積および培養時間に依存する。細胞のタンパク質生産能を高めることができれば、製造コストを抑制しながらウイルスベクターの生産量を増加させられると期待される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本開示の目的は、ウイルスベクターの生産量を高めることである。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者らは、ＰＫＣを活性化することにより、ＣＭＶプロモーターなどのプロモーターの転写活性を高められること、および、ＰＫＣを活性化する新たな方法を見出し、それにより培養細胞におけるウイルスベクターの生産量を高められることを明らかにした。
【0006】
従って、ある態様では、本開示は、ウイルスベクターの製造方法であって、ウイルスベクターのウイルス粒子の産生に必要な核酸およびウイルスベクターにより送達しようとする核酸を含む細胞を、ＰＫＣを活性化する条件下で培養することを含み、
ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢおよびＹＹ１から選択される少なくとも１つの転写因子の結合部位を含むプロモーターに作動可能に連結している、方法を提供する。
ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢおよびＹＹ１から選択される少なくとも１つの転写因子の結合部位を含むプロモーターに作動可能に連結している、方法を提供する。
【0007】
ある態様では、本開示は、ＰＫＣ活性化剤または活性化型ＰＫＣをコードする核酸と、ウイルスベクターのウイルス粒子の産生に必要な核酸とを含む、ウイルスベクターを製造するためのキットであって、
ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢおよびＹＹ１から選択される少なくとも１つの転写因子の結合部位を含むプロモーターに作動可能に連結しているものである、キットを提供する。
ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢおよびＹＹ１から選択される少なくとも１つの転写因子の結合部位を含むプロモーターに作動可能に連結しているものである、キットを提供する。
【0008】
ある態様では、本開示は、ＰＫＣ活性化剤または活性化型ＰＫＣをコードする核酸を含む、ウイルスベクターの産生を増強するための組成物を提供する。
【発明の効果】
【0009】
本開示により、ウイルスベクターの生産量を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】ｐＲＬ－ＣＭＶ（Renilla Luciferase）を恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞における、化合物Ｘまたは化合物＃１～＃７のいずれかの存在下、ＰＫＣ阻害剤の存在下または非存在下でのルシフェラーゼ活性を示す。
【図2】ｐＲＬ－ＣＭＶ（Renilla Luciferase）を恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞における、化合物Ｘの存在下または非存在下でのルシフェラーゼ活性の変化を示す。
【図3】ｐＲＬ－ＣＭＶ（Renilla Luciferase）を恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞における、化合物ＸまたはＰＫＣ活性化剤＃１～＃４のいずれかの存在下、ＰＫＣ阻害剤の存在下または非存在下でのルシフェラーゼ活性を示す。
【図4】ｐＲＬ－ＣＭＶ（Renilla Luciferase）を恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞における、化合物ＸまたはＰＫＣ活性化剤＃５～＃６のいずれかの存在下、ＰＫＣ阻害剤の存在下または非存在下でのルシフェラーゼ活性を示す。
【図5】ｐＲＬ－ＣＡＧまたはｐＲＬ－ＥＦ１をトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ａ細胞における、化合物Ｘまたは化合物＃１～＃５のいずれかの存在下、ＰＫＣ阻害剤の存在下または非存在下でのルシフェラーゼ活性を示す。
【0011】
【図6】ｐＲＬ－ＣＡＧをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ａ細胞における、化合物Ｘ、化合物＃６～＃７およびＰＫＣ活性化剤＃１～＃６のいずれかの存在下、ＰＫＣ阻害剤の存在下または非存在下でのルシフェラーゼ活性を示す。
【図7】ｐＲＬ－ＥＦ１をトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ａ細胞における、化合物Ｘ、化合物＃６～＃７およびＰＫＣ活性化剤＃１～＃６のいずれかの存在下、ＰＫＣ阻害剤の存在下または非存在下でのルシフェラーゼ活性を示す。
【図8】ＨＥＫ２９３Ａ細胞における、化合物Ｘ、化合物＃１～＃７、ＰＫＣ活性化剤＃１～＃６、化合物ＳＣおよび化合物ＳＢのいずれかの存在下、ＰＫＣ阻害剤の存在下または非存在下でのＰＫＣの基質タンパク質のリン酸化状態を示す。
【図9】ｐＲＬ－ＣＭＶ（Renilla Luciferase）を恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞における、化合物Ｘおよび／または化合物ＳＣの存在下、ＰＫＣ阻害剤の存在下または非存在下でのルシフェラーゼ活性を示す。
【図10】ｐＲＬ－ＣＭＶ（Renilla Luciferase）を恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞における、化合物Ｘ、化合物ＳＣおよび／またはＳＢの存在下でのルシフェラーゼ活性を示す。
【0012】
【図11】ｐＲＬ－ＣＭＶ（Renilla Luciferase）を恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞における、化合物Ｘおよび化合物＃１～＃７のいずれかの存在下、化合物ＳＢまたは化合物ＳＢ＋ＳＣの存在下または非存在下でのルシフェラーゼ活性を示す。
【図12】ｐＲＬ－ＣＭＶ（Renilla Luciferase）を恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞における、化合物ＸおよびＰＫＣ活性化剤＃１～＃６のいずれかの存在下、化合物ＳＢまたは化合物ＳＢ＋ＳＣの存在下または非存在下でのルシフェラーゼ活性を示す。
【図13】ｐＲＬ－ＣＭＶ（Renilla Luciferase）を恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞における、化合物Ｘまたは化合物Ｘ＋化合物ＳＣの存在下、各種ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下でのルシフェラーゼ活性を示す。
【図14】ＣＭＶプロモーターの制御下にマウスＩｇＧ抗体重鎖のｃＤＮＡを連結した発現コンストラクトおよびＣＭＶプロモーターの制御下にマウスＩｇＧ抗体軽鎖のｃＤＮＡを連結した発現コンストラクトをＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクションし、化合物Ｘ、化合物＃１～＃５、ＰＫＣ活性化剤＃１～＃６のいずれかを添加した培地中、化合物ＳＢ＋ＳＣの存在下または非存在下で培養し、培地中のマウスＩｇＧ抗体の濃度を測定した結果を示す。
【図15】ＣＭＶプロモーターの制御下にヒトプロインスリンを恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を、化合物Ｘ、化合物＃１～＃５、ＰＫＣ活性化剤＃１～＃３、＃５または＃６を添加した培地中、化合物ＳＢ＋ＳＣの存在下または非存在下で培養し、培地中のヒトプロインスリンの濃度を測定した結果を示す。
【0013】
【図16】ＣＭＶプロモーターの制御下にヒトレプチンのｃＤＮＡを連結した発現コンストラクトをＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクションし、化合物Ｘ、化合物＃１～＃５、ＰＫＣ活性化剤＃１～＃６のいずれかを添加した培地中、化合物ＳＢ＋ＳＣの存在下または非存在下で培養し、培地中のヒトレプチンの濃度を測定した結果を示す。
【図17】図１４～１６と同様にマウスＩｇＧ抗体重鎖および軽鎖、ヒトプロインスリンまたはヒトレプチンを一過性または恒常的に発現する細胞を、化合物Ｘ、化合物＃６または化合物＃７を添加した培地中、化合物ＳＢ＋ＳＣの存在下または非存在下で培養し、培地中の各タンパク質の濃度を測定した結果を示す。
【図18】ＣＭＶプロモーターの制御下にマウスＩｇＧ抗体重鎖および軽鎖、ヒトプロインスリンまたはヒトレプチンを恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を、化合物Ｘまたは化合物Ｘ＋ＳＢの存在下または非存在下で培養し、培地中の各タンパク質の濃度を３日間または４日間にわたって測定した結果を示す。
【図19】ＣＭＶプロモーター、タンパク質のｃＤＮＡ（ＸＸＸ）、ＩＲＥＳおよび活性化型ＰＫＣのｃＤＮＡを連結した発現コンストラクトの模式図である。
【図20】ＣＭＶプロモーター、ＲｌｕｃのｃＤＮＡ、ＩＲＥＳおよび活性化型ＰＫＣのｃＤＮＡを連結した発現コンストラクトをＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクションし、ルシフェラーゼ活性を測定した結果を示す。
【0014】
【図21】ＣＭＶプロモーター、ＲｌｕｃのｃＤＮＡ、ＩＲＥＳまたはＰ２Ａ、および活性化型ＰＫＣのｃＤＮＡを連結した発現コンストラクトをＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクションし、ルシフェラーゼ活性を測定した結果を示す。
【図22】ＣＭＶプロモーター、マウスＩｇＧ抗体重鎖のｃＤＮＡ、ＩＲＥＳおよび活性化型ＰＫＣのｃＤＮＡを連結した発現コンストラクトおよびＣＭＶプロモーター、マウスＩｇＧ抗体軽鎖のｃＤＮＡ、ＩＲＥＳおよび活性化型ＰＫＣのｃＤＮＡを連結した発現コンストラクトをＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクションし、培地中のＩｇＧ抗体の濃度を４日間にわたって測定した結果を示す。
【図23】ＣＭＶプロモーター、ヒトレプチンのｃＤＮＡ、ＩＲＥＳおよび活性化型ＰＫＣのｃＤＮＡを連結した発現コンストラクトをＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクションし、培地中のレプチンの濃度を４日間にわたって測定した結果を示す。
【図24】ｐＲＬ－ＣＭＶをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ａ細胞における、ナフタレンスルホンアミド誘導体の存在下、化合物Ｘの存在下または非存在下でのルシフェラーゼ活性を示す。
【図25】ＣＭＶプロモーター、ＲｌｕｃのｃＤＮＡ、ＩＲＥＳおよびＰＭＬ（野生型または欠損型）のｃＤＮＡを連結した発現コンストラクトの模式図を示す。
【0015】
【図26】ＣＭＶプロモーター、ＲｌｕｃのｃＤＮＡ、ＩＲＥＳおよびＰＭＬ（野生型または欠損型）のｃＤＮＡを含む発現コンストラクトをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ａ細胞における、化合物Ｘの存在下または非存在下でのルシフェラーゼ活性を示す。
【図27】ＣＭＶプロモーター、ＲｌｕｃのｃＤＮＡ、ＩＲＥＳおよびＰＭＬΔ９またはＰＭＬ－ＲｉｎｇのｃＤＮＡを含む発現コンストラクトをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ａ細胞における、化合物Ｘ、ＳＢ、化合物ＳＣまたはこれらの組合せの存在下または非存在下でのルシフェラーゼ活性を示す。
【図28】ＰＭＬのＲＩＮＧ領域のアミノ酸配列をＢＬＡＳＴ解析し、相同性のあるアミノ酸配列を持つ遺伝子間での系統樹を示す。
【図29】ＣＭＶプロモーター、ＲｌｕｃのｃＤＮＡ、ＩＲＥＳおよびＲＩＮＧ領域のｃＤＮＡを連結した発現コンストラクトの模式図を示す。
【図30】ＣＭＶプロモーター、ＲｌｕｃのｃＤＮＡ、ＩＲＥＳおよびＲＩＮＧ領域のｃＤＮＡを連結した発現コンストラクトをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ａ細胞における、化合物Ｘの存在下または非存在下でのルシフェラーゼ活性を示す。
【0016】
【図31】ＣＭＶプロモーター、ＲｌｕｃのｃＤＮＡ、ＩＲＥＳおよびＰＭＬ（停止コドン導入）のｃＤＮＡを連結した発現コンストラクト、および、ＣＭＶプロモーター、ＲｌｕｃのｃＤＮＡおよびＰＭＬ（野生型または欠損型）のｃＤＮＡを連結した発現コンストラクトの模式図を示す。
【図32】ＣＭＶプロモーター、ＲｌｕｃのｃＤＮＡ、ＩＲＥＳおよびＰＭＬ（停止コドン導入）のｃＤＮＡを連結した発現コンストラクト、および、ＣＭＶプロモーター、ＲｌｕｃのｃＤＮＡおよびＰＭＬ（野生型または欠損型）のｃＤＮＡを連結した発現コンストラクトをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ａ細胞における、化合物Ｘの存在下または非存在下でのルシフェラーゼ活性を示す。
【図33】ＧＦＰ遺伝子が挿入されたレトロウイルスベクターを、化合物Ｘ、化合物ＳＣおよび／またはＳＢの存在下でＰｌａｔ－Ｅ細胞に産生させ、ＨＥＫ２９３Ａ細胞へと感染させ、ＧＦＰ陽性細胞数を測定した結果を示す。
【図34】ＧＦＰ遺伝子が挿入されたレンチウイルスベクターを、化合物Ｘ、化合物ＳＣおよび／またはＳＢの存在下でＬｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞に産生させ、ＨＥＫ２９３Ａ細胞へと感染させ、ＧＦＰ陽性細胞数を測定した結果を示す。
【図35】ＧＦＰ遺伝子が挿入されたアデノウイルスベクターを、化合物Ｘ、化合物ＳＣおよび／またはＳＢの存在下でＬｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞に産生させ、ＨＥＫ２９３Ａ細胞へと感染させ、ＧＦＰ陽性細胞数を測定した結果を示す。
【0017】
【図36】ＧＦＰ遺伝子が挿入されたアデノ随伴ウイルスベクターを、化合物Ｘ、化合物ＳＣおよび／またはＳＢの存在下でＬｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞に産生させ、ＨＥＫ２９３Ａ細胞へと感染させ、ＧＦＰ陽性細胞数を測定した結果を示す。
【図37】ＧＦＰ遺伝子が挿入されたレトロウイルスベクターを、化合物Ｘ、化合物＃１～＃４、＃６、＃７およびＰＫＣ活性化剤＃１～＃６のいずれかの存在下、ＰＫＣ阻害剤の存在下または非存在下でＰｌａｔ－Ｅ細胞に産生させ、ＨＥＫ２９３Ａ細胞へと感染させ、ＧＦＰ陽性細胞数を測定した結果を示す。
【図38】ＧＦＰ遺伝子が挿入されたレトロウイルスベクターを、化合物Ｘ、化合物ＳＣ、ＳＢおよび／またはＰＫＣ阻害剤の存在下でＰｌａｔ－Ｅ細胞に産生させ、ＨＥＫ２９３Ａ細胞へと感染させ、ＧＦＰ陽性細胞数を測定した結果を示す。
【図39】ＧＦＰ遺伝子が挿入されたレンチウイルスベクターを、化合物Ｘ、化合物ＳＣ、ＳＢおよび／またはＰＫＣ阻害剤の存在下でＰｌａｔ－Ｅ細胞に産生させ、ＨＥＫ２９３Ａ細胞へと感染させ、ＧＦＰ陽性細胞数を測定した結果を示す。
【図40】ＧＦＰ遺伝子が挿入されたアデノウイルスベクターを、化合物Ｘ、化合物ＳＣ、ＳＢおよび／またはＰＫＣ阻害剤の存在下でＰｌａｔ－Ｅ細胞に産生させ、ＨＥＫ２９３Ａ細胞へと感染させ、ＧＦＰ陽性細胞数を測定した結果を示す。
【0018】
【図41】ＧＦＰ遺伝子が挿入されたアデノ随伴ウイルスベクターを、化合物Ｘ、化合物ＳＣ、ＳＢおよび／またはＰＫＣ阻害剤の存在下でＰｌａｔ－Ｅ細胞に産生させ、ＨＥＫ２９３Ａ細胞へと感染させ、ＧＦＰ陽性細胞数を測定した結果を示す。
【図42】実施例で使用したＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーターおよびＥＦ１プロモーターにおける転写因子の結合部位を示す。
【図43】ｐＡｄ／ＤＥＳＴ／ＣＭＶベクターに含まれるプロモーターにおける転写因子の結合部位を示す。
【図44】ＨＥＫ２９３細胞内のアデノウイルス遺伝子のプロモーターにおける転写因子の結合部位を示す。ＨＫＥ２９３細胞にはアデノウイルス５型の１－４３５５ｎｔ（Ｅ１遺伝子：Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂを含む）が組み込まれている。
【図45】ｐＡＡＶ－２／９ｎベクターに含まれるプロモーターにおける転写因子の結合部位を示す。ＲＥＰ上流領域は、ｐＡＡＶ－２／９ｎのｆ１ｏｒｉ配列からＲＥＰ遺伝子の上流までの２５８ｎｔの領域である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
特に具体的な定めのない限り、本開示で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本開示で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本開示において、一般的な理解に優先する。
【0020】
本開示のウイルスベクターの製造方法は、ウイルスベクターの産生に必要な核酸を培養細胞に導入し、ウイルスベクターを産生させて回収する、遺伝子工学的手法を利用するものである。かかる遺伝子工学的手法は、当分野で周知であり、文献に記載される方法などに準じて行うことができる（例えば、Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983)、DNA Cloning, DM.Glover, IRL PRESS (1985)）。
【0021】
「ウイルスベクター」とは、インビトロ、エクスビボまたはインビボで細胞に送達しようとする核酸を含むように組み換えられたウイルスゲノムがウイルス粒子内にパッケージされているベクターを意味する。
【0022】
野生型ウイルスに基づいて作製された様々なウイルスベクターが知られており、いかなるウイルスベクターも使用し得る。公知のウイルスベクターには、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、マウス白血病ウイルスベクター、ハイブリッドウイルスベクターが含まれる。ある実施態様では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクター、好ましくはレトロウイルスベクターである。
【0023】
一般的に、ウイルスベクターは、ウイルスベクターの産生に必要な核酸、即ち、ウイルスベクターのウイルス粒子の産生に必要な核酸およびウイルスベクターにより送達しようとする核酸を含む細胞を培養することにより製造される。ウイルスベクターのウイルス粒子の産生に必要な核酸は、ウイルスベクターが由来するウイルスのタンパク質またはＲＮＡをコードするものであり、天然の核酸であってもよく、ウイルスベクターの目的に応じて改変されていてもよい。
【0024】
ウイルスベクターのウイルス粒子の産生に必要な核酸は、ウイルスベクターのウイルス粒子の産生に必要なタンパク質をコードする核酸であり得る。ウイルスベクターのウイルス粒子の産生に必要なタンパク質は、ウイルスベクターが由来するウイルスによって異なり、当分野で周知である。
【0025】
例えば、レトロウイルスベクターのウイルス粒子の産生に必要なタンパク質には、Ｇａｇ、Ｐｏｌおよびエンベロープタンパク質（ＶＳＶ－Ｇ、ＭＬＶなど）が含まれる。レンチウイルスベクターのウイルス粒子の産生に必要なタンパク質には、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｒｅｖおよびエンベロープタンパク質（ＶＳＶ－Ｇ、ＭＬＶなど）が含まれる。
【0026】
アデノウイルスベクターは多数のタンパク質からなり、例えば、アデノウイルスベクターのウイルス粒子の産生に必要なタンパク質は、アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４またはＬ５領域にコードされるタンパク質である。また、アデノウイルスではウイルス関連ＲＮＡ（ＶＡ ＲＮＡ）などのＲＮＡもウイルス粒子の産生に必要なことが知られている。アデノウイルスには多数の血清型が知られており、例えば、ヒトアデノウイルス２型またはヒトアデノウイルス５型に由来するアデノウイルスベクター、または、Ｅ１遺伝子および／またはＥ３遺伝子が欠失したこれらのアデノウイルスベクター、特に、Ｅ１遺伝子およびＥ３遺伝子が欠失したヒトアデノウイルス５型のアデノウイルスに由来するアデノウイルスベクターを使用し得る。
【0027】
アデノ随伴ウイルスベクターは、ウイルス複製にアデノウイルスなどのヘルパーウイルスを必要とするアデノ随伴ウイルスに基づくベクターであり、ウイルス粒子の産生に必要なタンパク質には、例えば、アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２ＡおよびＥ４領域にコードされるタンパク質、並びに、アデノ随伴ウイルスゲノムのＲｅｐおよびＣａｐ領域にコードされるタンパク質が含まれる。また、ヘルパーウイルスのウイルス関連ＲＮＡ（ＶＡ ＲＮＡ）などのＲＮＡもウイルス粒子の産生に必要なことが知られている。アデノ随伴ウイルスには多数の血清型が知られており、例えばＡＡＶ２型、ＡＡＶ５型またはＡＡＶ９型のアデノ随伴ウイルスに由来するアデノ随伴ウイルスベクターを使用し得る。
【0028】
少なくとも１つのウイルス粒子の産生に必要な核酸は、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢおよびＹＹ１から選択される少なくとも１つの転写因子の結合部位を含むプロモーターに作動可能に連結している。少なくとも１つのウイルス粒子の産生に必要な核酸が当該プロモーターに作動可能に連結していれば、他のウイルス粒子の産生に必要な核酸は、当該プロモーターに作動可能に連結していても、していなくてもよい。ウイルス粒子の産生に必要な２以上の、例えば全部の核酸が、当該プロモーターに作動可能に連結していてもよく、この場合、各核酸と連結するプロモーターの種類は同じであっても異なっていてもよい。１つのプロモーターにウイルス粒子の産生に必要な１つの核酸が作動可能に連結していてもよく、１つのプロモーターに２以上の当該核酸が作動可能に連結していてもよい。
【0029】
本開示において、プロモーターは、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢおよびＹＹ１から選択される少なくとも１つの転写因子の結合部位を含む。即ち、プロモーターは、これらの結合部位のうち１個を含むか、これらの結合部位のうち２個、３個もしくは４個を任意の組合せで含むか、または、これらの結合部位をすべて含む。プロモーターは、さらに他の転写因子、例えばＣＲＥＢの結合部位を含んでもよい。ある実施態様では、プロモーターは、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢおよびＹＹ１の結合部位を含む。ある実施態様では、プロモーターは、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢ、ＹＹ１およびＣＲＥＢの結合部位を含む。使用し得るプロモーターの例として、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーターおよびＥＦ１プロモーター、好ましくはＣＭＶプロモーターおよびＥＦ１プロモーター、特に好ましくはＣＭＶプロモーターが挙げられる。プロモーターは、ウイルス由来のプロモーターであってもよい。例えば、アデノウイルスのＥ１Ａプロモーター、Ｅ１Ｂプロモーター、Ｅ２Ａプロモーター、Ｅ２Ｂプロモーター、Ｅ４プロモーター、主要後期プロモーターもしくはＩＸプロモーター、アデノ随伴ウイルスのｐ５プロモーター、ｐ１９プロモーターもしくはｐ４０プロモーターを使用し得る。これらの転写因子、結合部位、プロモーターは当分野で周知であり、文献に記載される方法などに準じて使用できる。
【0030】
本開示において、「作動可能に連結した」とは、プロモーター、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）および２Ａ自己切断ペプチド（２Ａペプチド）配列などの調節配列エレメントと、ウイルスベクターの産生に必要な核酸が、遺伝子の発現を可能とする様式で連結されていることを意味し、各ＤＮＡの３’末端と、その下流のＤＮＡの５’末端とは、直接連結していてもよく、その間に任意のＤＮＡ配列が存在してもよい。
【0031】
ウイルスベクターにより送達しようとする核酸は、所望のタンパク質または核酸をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であり得る。ウイルスベクターにより送達しようとする核酸は、使用する培養細胞に対して許容し得ない毒性がない限り、限定されない。例えば、当該核酸は、遺伝子治療用の核酸であり得る。当該核酸は、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子等の、遺伝子導入された細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子を含んでもよい。当該核酸は、核酸の配列情報に基づき、例えば、通常のＤＮＡ合成やＲＴ－ＰＣＲによる増幅などによって、製造することができる。ウイルスベクターにより送達しようとする核酸が連結するプロモーターは限定されず、例えば、当該核酸は、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢおよびＹＹ１から選択される少なくとも１つの転写因子の結合部位を含むプロモーターに作動可能に連結していてもよい。
【0032】
ウイルスベクターの産生に必要な核酸を発現ベクターに組み込むことにより、発現コンストラクトを作製することができる。ここで用いる発現ベクターは、産生しようとするウイルスベクター、用いる培養細胞等に応じて適宜選択することができ、プラスミド、ウイルスベクター等が挙げられる。例えば、ｐＱＣＸＩＮ、ｐｃＤＮＡ、ｐＬＶＳＩＮ、ｐｓＰＡＸ２、ｐＡｄ、ｐＡＡＶ、ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６、ｐＫＣＲ、ｐＣＤＭ８、ｐＧＬ２、ｐｃＤＮＡ３.１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶなどのプラスミドベクターや、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、マウス白血病ウイルスベクター、ハイブリッドウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。発現コンストラクトは、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を含んでもよい。ウイルスベクターにより送達しようとする核酸を含む発現コンストラクトは、当該核酸のウイルス粒子内へのパッケージを可能にする因子を含んでもよい。ウイルスベクターの産生に必要な核酸をすべて含む発現コンストラクトを用いてもよく、１つまたは複数のウイルスベクターの産生に必要な核酸を含む発現コンストラクトを組み合わせて用いてもよい。例えば、アデノ随伴ウイルスベクターを製造する場合、アデノウイルス由来の遺伝子の一部（Ｅ４、Ｅ２Ａ、ＶＡ ＲＮＡなど）を組み込んだヘルパープラスミドを用いてもよい。
【0033】
発現コンストラクトで宿主細胞を形質転換することにより、ウイルスベクターの産生に必要な核酸を含む細胞を作製することができる。宿主細胞にウイルスベクターの産生に必要なすべての核酸を導入してもよい。ウイルスベクターの産生に必要な核酸の一部が予め導入された宿主細胞に、ウイルスベクターの産生に必要な残りの核酸を導入してもよい。ウイルス粒子の産生に必要な核酸の一部または全部が予め導入された宿主細胞（パッケージング細胞）に、ウイルスベクターにより送達しようとする核酸と、場合によりウイルス粒子の産生に必要な残りの核酸を導入してもよい。宿主細胞は典型的には動物細胞であり、例えば、ＨＥＫ２９３Ａ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ９２９細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などが挙げられる。パッケージング細胞としては、例えば、レトロウイルスのＧａｇおよび／またはＰｏｌおよび／またはエンベロープタンパク質が導入された細胞、アデノウイルスのＥ１Ａおよび／またはＥ１Ｂ領域が導入された細胞が挙げられる。ウイルスベクターの産生に適する市販の細胞を使用してもよく、例えば、Ｐｌａｔ－Ｅ細胞（コスモバイオ、#RV-101）、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞（Takara、#Z2180N）が挙げられる。
【0034】
宿主細胞への発現コンストラクトの導入方法としては、宿主細胞と発現ベクターに適合した通常の導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法などが挙げられる。
【0035】
一過性にウイルスベクターを産生するように細胞を形質転換してもよく、継続的にウイルスを産生する能力を有するように形質転換し、細胞株としてもよい。後者の場合、細胞株をマスターセルバンク（ＭＣＢ）やワーキングセルバンク（ＷＣＢ）として使用し得る。
【0036】
形質転換した細胞を、ＰＫＣを活性化する条件下で培養することにより、ウイルスベクターを効率よく製造することができる。各細胞と各ウイルスベクターの培養に適する培地、培養時間、培養温度等の培養条件は、当業者に周知であり、適宜選択すればよい。例えば、ＰＫＣを活性化する条件下で、１時間以上、２時間以上、４時間以上、６時間以上、８時間以上、１２時間以上、１８時間以上、２４時間以上、３６時間以上、４８時間以上、かつ、７２時間以内、６０時間以内、４８時間以内、３６時間以内、３０時間以内または２４時間以内、例えば２４時間～７２時間、３６時間～６０時間、４２時間～５４時間、４５時間～５１時間、４６時間～５０時間、４７時間～４９時間または約４８時間、細胞を培養した後に、ウイルスベクターを含む培養上清を回収する。
【0037】
ウイルスベクターは、前記の上清のまま、または、上清をフィルターろ過して得られたろ液、公知の方法により希釈、濃縮もしくは精製されたウイルスベクターとして使用されてよく、適切な方法により、例えば凍結して、使用するまで保存されてもよい。精製手段としては、超遠心法、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。市販の濃縮試薬、例えば、Retro-X Concentrator（TaKaRa #631455）、Lenti-X Concentrator（TaKaRa #631231）などを使用してもよい。
【0038】
ある実施態様では、ＰＫＣを活性化する条件は、ＰＫＣ活性化剤の存在下で細胞を培養することである。ＰＫＣは、基質タンパク質のセリン残基およびスレオニン残基のヒドロキシル基をリン酸化するタンパク質キナーゼの一種であり、１０種類以上のアイソザイムが知られている。アイソザイムはその構造、活性化の機序、生理活性によって在来型（α、βＩ、βＩＩ、γ）、新型（δ、ε、θ、η）、非典型（ζ、Ｍζ、ι／λ）の３種類のサブファミリーに分類される。本開示において、ＰＫＣは、好ましくは在来型ＰＫＣアイソザイムまたは新型ＰＫＣアイソザイム、特に好ましくはＰＫＣαまたはＰＫＣδである。
【0039】
本開示において、「ＰＫＣ活性化剤」は、ＰＫＣのキナーゼ活性を増強する物質を意味する。２種以上のＰＫＣ活性化剤を併用してもよい。
【0040】
ある実施態様では、ＰＫＣ活性化剤として、式（Ｉ）：
｛式中、
Ｒ１は、Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ６－１４アリールまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ３であり、ここで、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－６アルコキシまたはアリールは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよく、
Ｒ２は、Ｃ６－１２アルキル、Ｃ６－１２アルケニル、Ｃ６－１２アルキニルまたはＣ６－１２アルコキシであり、ここで、Ｃ６－１２アルキル、Ｃ６－１２アルケニル、Ｃ６－１２アルキニルまたはＣ６－１２アルコキシは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよく、
Ｒ３は、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、アミノまたはＣ６－１４アリールであり、ここでＣ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニルまたはＣ６－１４アリールは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよい｝、
式（ＩＩ）：
｛式中、
Ｒ４は、Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、Ｃ２－１８アルキニル、Ｃ１－１８アルコキシまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ６であり、ここで、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、Ｃ２－１８アルキニルまたはＣ１－１８アルコキシは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよく、
Ｒ５は、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニルまたはアミノであり、ここで、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニルまたはＣ２－６アルキニルは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよく、
Ｒ６は、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、Ｃ２－１８アルキニルまたはアミノであり、ここでＣ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニルまたはＣ２－１８アルキニルは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよい｝、
または、
式（ＩＩＩ）：
｛式中、
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、Ｃ２－１８アルキニルまたは－Ｃ（Ｏ）Ｒ９であり、ここで、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニルまたはＣ２－１８アルキニルは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよく、
Ｒ８は、Ｈ、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、Ｃ２－１８アルキニルまたは－Ｃ（Ｏ）Ｒ９であり、ここで、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニルまたはＣ２－１８アルキニルは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよく、
Ｒ９は、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、Ｃ２－１８アルキニルまたはアミノであり、ここでＣ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニルまたはＣ２－１８アルキニルは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよい｝
の化合物またはそのエステル、塩もしくは溶媒和物を使用し得る。
【化1】
Ｒ１は、Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ６－１４アリールまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ３であり、ここで、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－６アルコキシまたはアリールは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよく、
Ｒ２は、Ｃ６－１２アルキル、Ｃ６－１２アルケニル、Ｃ６－１２アルキニルまたはＣ６－１２アルコキシであり、ここで、Ｃ６－１２アルキル、Ｃ６－１２アルケニル、Ｃ６－１２アルキニルまたはＣ６－１２アルコキシは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよく、
Ｒ３は、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、アミノまたはＣ６－１４アリールであり、ここでＣ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニルまたはＣ６－１４アリールは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよい｝、
式（ＩＩ）：
【化2】
Ｒ４は、Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、Ｃ２－１８アルキニル、Ｃ１－１８アルコキシまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ６であり、ここで、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、Ｃ２－１８アルキニルまたはＣ１－１８アルコキシは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよく、
Ｒ５は、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニルまたはアミノであり、ここで、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニルまたはＣ２－６アルキニルは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよく、
Ｒ６は、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、Ｃ２－１８アルキニルまたはアミノであり、ここでＣ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニルまたはＣ２－１８アルキニルは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよい｝、
または、
式（ＩＩＩ）：
【化3】
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、Ｃ２－１８アルキニルまたは－Ｃ（Ｏ）Ｒ９であり、ここで、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニルまたはＣ２－１８アルキニルは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよく、
Ｒ８は、Ｈ、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、Ｃ２－１８アルキニルまたは－Ｃ（Ｏ）Ｒ９であり、ここで、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニルまたはＣ２－１８アルキニルは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよく、
Ｒ９は、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、Ｃ２－１８アルキニルまたはアミノであり、ここでＣ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニルまたはＣ２－１８アルキニルは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよい｝
の化合物またはそのエステル、塩もしくは溶媒和物を使用し得る。
【0041】
本開示において、用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素から選ばれる原子を意味する。
本開示において、用語「アルキル」は、飽和した、直鎖または分岐鎖の炭化水素基を示す。
本開示において、用語「アルケニル」は、１つまたはそれ以上の二重結合を含む直鎖または分岐鎖の炭化水素を意味する。
本開示において、用語「アルキニル」は、１つまたはそれ以上の三重結合を含む直鎖または分岐鎖の炭化水素を意味する。
本開示において、用語「アルコキシ」は、－Ｏ－アルキル（ここで、アルキルは本開示に定義されている通りである）を意味する。
本開示において、用語「アルキル」は、飽和した、直鎖または分岐鎖の炭化水素基を示す。
本開示において、用語「アルケニル」は、１つまたはそれ以上の二重結合を含む直鎖または分岐鎖の炭化水素を意味する。
本開示において、用語「アルキニル」は、１つまたはそれ以上の三重結合を含む直鎖または分岐鎖の炭化水素を意味する。
本開示において、用語「アルコキシ」は、－Ｏ－アルキル（ここで、アルキルは本開示に定義されている通りである）を意味する。
【0042】
本開示において、用語「アリール」は、１個の環（例えばフェニル）または複数の縮合環（例えばナフチルまたはアントリル）を有する６～１４個の炭素原子の１価芳香族性炭素環式基を意味する。アリールは典型的には、フェニルおよびナフチルを含む。
本開示において、用語「アミノ」は－ＮＨ２の基を意味する。
本開示において、用語「アミノ」は－ＮＨ２の基を意味する。
【0043】
本開示において、「エステル」は、インビボまたはインビトロで加水分解され得るエステルを意味し、容易に分解されて親化合物またはその塩を放出するものを含む。好適なエステル基は、例えば、脂肪族カルボン酸、特にアルカン酸、アルケン酸、シクロアルカン酸およびアルカン二酸に由来するもの（ここで、各アルキルまたはアルケニル基は、例えば６個以下の炭素原子を有する）を含む。具体的なエステルの例には、ギ酸エステル、酢酸エステル、プロピオン酸エステル、ブチル酸エステル、アクリル酸エステルおよびエチルコハク酸エステルが含まれる。
【0044】
本開示において、「塩」は、化合物の無機または有機酸との塩であり得る。好ましい塩は、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸または硫酸との塩、または、有機カルボン酸またはスルホン酸、例えば、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、安息香酸またはメタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸またはナフタレンジスルホン酸との塩である。
【0045】
また、塩は、常套の塩基との塩、例えばアルカリ金属塩（例えばナトリウムまたはカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えばカルシウムまたはマグネシウム塩）、または、アンモニアまたは有機アミン（例えば、ジエチルアミン、トリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、ジヒドロアビエチルアミン、メチルピペリジン、Ｌ－アルギニン、クレアチン、コリン、Ｌ－リジン、エチレンジアミン、ベンザチン、エタノールアミン、メグルミンまたはトロメタミン）から誘導されるアンモニウム塩、特にナトリウム塩であり得る。
【0046】
本開示において、「溶媒和物」は、固体または液体状態で溶媒分子との配位により錯体を形成している化合物を意味する。好適な溶媒和物は水和物である。
【0047】
ある実施態様では、式（Ｉ）中、
Ｒ１は、Ｈまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ３であり、
Ｒ２は、Ｃ６－１２アルキルまたはＣ６－１２アルケニルであり、
Ｒ３は、Ｃ１－６アルキルまたはＣ６－１４アリールである。
Ｒ１は、Ｈまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ３であり、
Ｒ２は、Ｃ６－１２アルキルまたはＣ６－１２アルケニルであり、
Ｒ３は、Ｃ１－６アルキルまたはＣ６－１４アリールである。
【0048】
ある実施態様では、式（Ｉ）中、
Ｒ１は、Ｈまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ３であり、
Ｒ２は、ノニルまたは１,３－ノナジエニルであり、
Ｒ３は、メチルまたはフェニルである。
Ｒ１は、Ｈまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ３であり、
Ｒ２は、ノニルまたは１,３－ノナジエニルであり、
Ｒ３は、メチルまたはフェニルである。
【0049】
ある実施態様では、式（Ｉ）の化合物は、後述する化合物Ｘ、化合物＃１または化合物＃２である。
【0050】
ある実施態様では、式（ＩＩ）中、
Ｒ４は、Ｈまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ６であり、
Ｒ５は、Ｃ１－６アルキルまたはＣ２－６アルケニルであり、
Ｒ６は、Ｃ１－１８アルキルである。
Ｒ４は、Ｈまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ６であり、
Ｒ５は、Ｃ１－６アルキルまたはＣ２－６アルケニルであり、
Ｒ６は、Ｃ１－１８アルキルである。
【0051】
ある実施態様では、式（ＩＩ）中、
Ｒ４は、Ｈまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ６であり、
Ｒ５は、メチル、プロピル、ｓｅｃ－ブチルまたはブテニルであり、
Ｒ６は、プロピル、ノニルまたはトリデシルである。
Ｒ４は、Ｈまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ６であり、
Ｒ５は、メチル、プロピル、ｓｅｃ－ブチルまたはブテニルであり、
Ｒ６は、プロピル、ノニルまたはトリデシルである。
【0052】
ある実施態様では、式（ＩＩ）の化合物は、後述する化合物＃３、化合物＃４、化合物＃５、ＴＰＡ、ホルボール１２，１３－ジブチラートまたはプロストラチン、特に化合物＃３、化合物＃４または化合物＃５である。
【0053】
ある実施態様では、式（ＩＩＩ）中、
Ｒ７は、Ｈまたは－Ｃ（Ｏ）Ｒ９であり、
Ｒ８は、Ｈまたは－Ｃ（Ｏ）Ｒ９であり、
Ｒ９は、Ｃ１－１８アルキルまたはＣ２－１８アルケニルである。
Ｒ７は、Ｈまたは－Ｃ（Ｏ）Ｒ９であり、
Ｒ８は、Ｈまたは－Ｃ（Ｏ）Ｒ９であり、
Ｒ９は、Ｃ１－１８アルキルまたはＣ２－１８アルケニルである。
【0054】
ある実施態様では、式（ＩＩＩ）中、
Ｒ７は、Ｈまたは－Ｃ（Ｏ）Ｒ９であり、
Ｒ８は、Ｈまたは－Ｃ（Ｏ）Ｒ９であり、
Ｒ９は、ペンタデシルまたはブテニルである。
Ｒ７は、Ｈまたは－Ｃ（Ｏ）Ｒ９であり、
Ｒ８は、Ｈまたは－Ｃ（Ｏ）Ｒ９であり、
Ｒ９は、ペンタデシルまたはブテニルである。
【0055】
ある実施態様では、式（ＩＩＩ）の化合物は、後述する化合物＃６、化合物＃７またはインゲノール３－アンゲラート、特に化合物＃６または化合物＃７である。
【0056】
式（Ｉ）～（ＩＩＩ）の化合物またはそのエステル、塩もしくは溶媒和物は、例えば、０．１～１０μｇ／ｍｌ、０．１～１μｇ／ｍｌ、０．１～１０００ｎｇ／ｍｌ、２～５００ｎｇ／ｍｌまたは５～２００ｎｇ／ｍｌの濃度で培養培地に添加し得る。
【0057】
ある実施態様では、ＰＫＣ活性化剤は、式（Ｉ）の化合物またはそのエステル、塩もしくは溶媒和物である。これらは、例えば、０．１～１０μｇ／ｍｌ、０．１～１μｇ／ｍｌ、０．１～１０００ｎｇ／ｍｌ、２０～５００ｎｇ／ｍｌまたは５０～２００ｎｇ／ｍｌの濃度で培養培地に添加し得る。
【0058】
ある実施態様では、ＰＫＣ活性化剤は、下記の化合物Ｘおよび化合物＃１～＃７から選択される化合物またはそのエステル、塩もしくは溶媒和物である。
【化4】
【0059】
化合物Ｘおよび化合物＃１～＃７は、化学合成により入手してもよく、これらを含有する植物から抽出してもよい。例えば、化合物Ｘは黄芫花（Lowdaphne Stringbush）から、化合物＃１および＃２は芫花（Lilac Daphne）から、化合物＃３～＃５は巴豆（Croton）から、化合物＃６～＃７は千金子（Caper Euphorbia）から抽出し得る。これらの化合物を含む植物加工物、例えば、植物エキスまたは抽出物を使用してもよい。
【0060】
ある実施態様では、ＰＫＣ活性化剤は化合物Ｘまたはそのエステル、塩もしくは溶媒和物である。
【0061】
公知のＰＫＣ活性化剤を使用してもよい。公知のＰＫＣ活性化剤として、１２－Ｏ－テトラデカノイルホルボール１３－アセタート（ＴＰＡ、ホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート（ＰＭＡ）とも呼ばれる）、プロストラチン、ブリオスタチン１、ブリオスタチン２、ＦＲ２３６９２４、（－）－インドラクタムＶ、ＰＥＰ００５、ホルボール１２，１３－ジブチラート、１－オレオイル－２－アセチル－ｓｎ－グリセロール、１－Ｏ－ヘキサデシル－２－Ｏ－アラキドニル－ｓｎ－グリセロール、１，２－ジオクタノイル－ｓｎ－グリセロール、ＰＩＰ２、レシニフェラトキシン、ホルボール１２，１３－ジヘキサノアート、メゼレイン、インゲノール３－アンゲラート、ＲＨＣ－８０２６７、ＤＣＰ－ＬＡ、リポキシンＡ４、（２Ｓ，５Ｓ）－（Ｅ，Ｅ）－８－（５－（４－（トリフルオロメチル）フェニル）－２，４－ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラクタムなどが例示されるが、これらに限定されない。ある実施態様では、ＰＫＣ活性化剤は、ＴＰＡ、プロストラチン、（－）－インドラクタムＶ、ホルボール１２，１３－ジブチラート、インゲノール３－アンゲラート、または、（２Ｓ，５Ｓ）－（Ｅ，Ｅ）－８－（５－（４－（トリフルオロメチル）フェニル）－２，４－ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラクタムである。公知のＰＫＣ活性化剤は、当分野で知られている方法、例えば製造業者の推奨する方法により、適宜使用し得る。
【0062】
ある実施態様では、ＰＫＣ活性化剤は、化合物Ｘ、化合物＃１～＃７、ＴＰＡ、プロストラチン、（－）－インドラクタムＶ、ホルボール１２，１３－ジブチラート、インゲノール３－アンゲラートおよび（２Ｓ，５Ｓ）－（Ｅ，Ｅ）－８－（５－（４－（トリフルオロメチル）フェニル）－２，４－ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラクタムから選択される化合物またはそのエステル、塩もしくは溶媒和物である。
【0063】
ある実施態様では、細胞は、Ｐｒｏ領域またはＲＩＮＧ領域を含むペプチドをコードする核酸をさらに含む。Ｐｒｏ領域またはＲＩＮＧ領域を含むペプチドをコードする核酸は、ウイルス粒子の産生に必要な核酸と同じ発現コンストラクトに含まれてもよく、別の発現コンストラクトに含まれてもよい。例えば、作動可能に連結されている、プロモーター、ウイルス粒子の産生に必要な核酸、および、Ｐｒｏ領域またはＲＩＮＧ領域を含むペプチドをコードする核酸を含む発現コンストラクトを使用し得る。ある実施態様では、プロモーター、ウイルス粒子の産生に必要な核酸、および、Ｐｒｏ領域またはＲＩＮＧ領域を含むペプチドをコードする核酸は、この順序で作動可能に連結されている。
【0064】
Ｐｒｏ領域またはＲＩＮＧ領域を含むペプチドをコードする核酸は、ペプチドに翻訳されてもされなくてもよい。翻訳されるようにする場合、ウイルス粒子の産生に必要な核酸とＰｒｏ領域またはＲＩＮＧ領域を含むペプチドをコードする核酸の間に、ＩＲＥＳまたは２Ａペプチド配列を挿入し得る。ＩＲＥＳおよび２Ａペプチド配列の詳細は、後述する。例えば、作動可能に連結されている、プロモーター、ウイルス粒子の産生に必要な核酸、ＩＲＥＳまたは２Ａペプチド配列、および、Ｐｒｏ領域またはＲＩＮＧ領域を含むペプチドをコードする核酸を含む発現コンストラクトを使用し得る。ある実施態様では、プロモーター、ウイルス粒子の産生に必要な核酸、ＩＲＥＳまたは２Ａペプチド配列、および、Ｐｒｏ領域またはＲＩＮＧ領域を含むペプチドをコードする核酸は、この順序で作動可能に連結されている。
【0065】
本開示において、Ｐｒｏ領域またはＲＩＮＧ領域はいかなる種のものであってもよく、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、サル、ヒト等、特にヒトに由来するものである。好ましくは、Ｐｒｏ領域またはＲＩＮＧ領域は、使用する細胞と同じ種に由来するものである。
【0066】
Ｐｒｏ領域はプロリン残基に富んだアミノ酸配列を有する領域を指し、ＷＷドメインやＳＨ３ドメインなどの機能性ドメインとの特異的相互作用を媒介する。Ｐｒｏ領域としては、反復性の短いプロリン残基に富んだアミノ酸配列、タンデムに繰り返されたプロリン残基に富んだアミノ酸配列、非反復性のプロリン残基に富んだアミノ酸配列、およびヒドロキシプロリン残基に富んだアミノ酸配列を有する領域が挙げられる。Ｐｒｏ領域は、これだけに限定されないが、核内タンパク質、転写因子、輸送体、チャネル、および受容体などの内在性膜タンパク質、球状タンパク質、ホルモン、神経ペプチド、ムチン、免疫グロブリン、ならびに細胞外マトリックスタンパク質を含めた種々のタンパク質に見いだすことができる。
【0067】
Ｐｒｏ領域は、いかなるタンパク質に由来してもよい。Ｐｒｏ領域を含むタンパク質として、例えば、ＰＭＬ、ＡＲＨＧＥＦ１、アグリカン－１、ＲＡＬＧＤＳ、ＤＧＫＫ、ＳＰＡＴＡ２１、ラブフィリン－３Ａ、ＴＥＡＤ３、ＳＰＰＬ２ＢおよびＦＬＪ４３０９３が挙げられる。
【0068】
ＲＩＮＧ領域は、ＲＩＮＧフィンガー領域とも呼ばれ、一対の亜鉛原子に結合し、タンパク質間相互作用を媒介する。ＲＩＮＧ領域は、一般的に下記の共通配列を有する。
Ｃ－Ｘ２－Ｃ－Ｘ９－３９－Ｃ－Ｘ１－３－Ｈ－Ｘ２－３－Ｃ－Ｘ２－Ｃ－Ｘ４－４８－Ｃ－Ｘ２－Ｃ
｛式中、Ｃはシステイン残基であり、Ｈはヒスチジン残基であり、Ｘは任意のアミノ酸残基である。｝
これらのシステイン残基およびヒスチジン残基は、亜鉛原子との結合を介した構造を形成するために必要であり、高度に保存されている。
Ｃ－Ｘ２－Ｃ－Ｘ９－３９－Ｃ－Ｘ１－３－Ｈ－Ｘ２－３－Ｃ－Ｘ２－Ｃ－Ｘ４－４８－Ｃ－Ｘ２－Ｃ
｛式中、Ｃはシステイン残基であり、Ｈはヒスチジン残基であり、Ｘは任意のアミノ酸残基である。｝
これらのシステイン残基およびヒスチジン残基は、亜鉛原子との結合を介した構造を形成するために必要であり、高度に保存されている。
【0069】
ＲＩＮＧ領域は、いかなるタンパク質に由来してもよい。ＲＩＮＧ領域を含むタンパク質として、例えば、ＴＲＩＭ１３、ＬＯＮＲＦ３、ＴＲＩＭ４７、ＲＮＦ１３５、ＴＲＩＭ１０、ＴＲＩＭ７２、ＴＲＩＭ６０、ＴＲＩＭ３９、ＴＲＩＭ４、ＴＲＩＭ４３Ｂ、ＴＲＩＭ４３、ＴＲＩＭ２５、ＴＲＩＭ２６、ＴＲＩＭ３１、ＨＴＬＦ、ＢＲＣＡ１、ＴＲＩＭ５０、ＴＲＩＭ２１、ＳＳＡ１、ＴＲＩＭ５ｄ、ＴＲＩＭ２２、ＫＩＡＡ０１８２、ＴＲＩＭ６５、ＲＡＧ１、ＢＦＡＲ、Ｐｅｘ１０、ＲＮＦ８、ＲＩＮＧ２、ＣＯＰＩ、ＴＲＩＭ２、ＴＲＩＭ３、ＳＨ３ＲＦ２、ＰＭＬおよびＴＲＩＭ５６が挙げられる。ある実施態様では、ＲＩＮＧ領域は、ＰＭＬ、ＴＲＩＭ３、ＴＲＩＭ５６、ＣＯＰＩ、Ｐｅｘ１０、ＢＲＣＡ１またはＨＴＬＦのＲＩＮＧ領域である。
【0070】
ある実施態様では、Ｐｒｏ領域またはＲＩＮＧ領域は、前骨髄球性白血病タンパク質（ＰＭＬ）に由来する。ＰＭＬは、ＰＭＬボディと呼ばれる核内構造体の組み立てに必要とされる。ＰＭＬボディは多様な機能を有し、幅広い細胞内プロセスへの関与が示唆されている。ヒトＰＭＬには複数のアイソフォームが知られており、Ｎ末端側はすべてのアイソフォームで同一のアミノ酸配列である。
【0071】
ヒト野生型（ＷＴ）ＰＭＬアイソフォーム５（Gene ID: 5371, NCBI Reference Sequence: NP_150247.2）のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を配列番号７および８に示す。アミノ酸配列は、５６０個のアミノ酸からなり、図２５に示す各領域を有する。配列番号７のアミノ酸配列の第１位～第４５位（配列番号９）がＰｒｏ領域であり、第４６位～第１０５位（配列番号１０）がＲＩＮＧ領域である。配列番号８のヌクレオチド配列の第１位～第１３５位（配列番号１１）がＰｒｏ領域をコードし、第１３６位～第３１５位（配列番号１２）がＲＩＮＧ領域をコードする。
【0072】
Ｐｒｏ領域は、あるタンパク質のアミノ酸配列と配列番号７のアミノ酸配列を最適な状態（アミノ酸の一致が最大となる状態）にアラインメントしたときに、配列番号７の第１位～第４５位の領域と一致する、当該タンパク質の領域であり得る。ある実施態様では、Ｐｒｏ領域は、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。ある実施態様では、Ｐｒｏ領域は、配列番号９のアミノ酸配列を含む。ある実施態様では、Ｐｒｏ領域は、配列番号９のアミノ酸配列からなる。ある実施態様では、Ｐｒｏ領域は、配列番号１１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列により、または、それを含むヌクレオチド配列によりコードされる。ある実施態様では、Ｐｒｏ領域は、配列番号１１のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によりコードされる。ある実施態様では、Ｐｒｏ領域は、配列番号１１のヌクレオチド配列によりコードされる。
【0073】
ＲＩＮＧ領域は、あるタンパク質のアミノ酸配列と配列番号７のアミノ酸配列を最適な状態にアラインメントしたときに、配列番号７の第４６位～第１０５位の領域と一致する、当該タンパク質の領域であり得る。ある実施態様では、ＲＩＮＧ領域は、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。ある実施態様では、ＲＩＮＧ領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。ある実施態様では、ＲＩＮＧ領域は、配列番号１０のアミノ酸配列からなる。ある実施態様では、ＲＩＮＧ領域は、配列番号１２のヌクレオチド配列と、少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列により、または、それを含むヌクレオチド配列によりコードされる。ある実施態様では、ＲＩＮＧ領域は、配列番号１２のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によりコードされる。ある実施態様では、ＲＩＮＧ領域は、配列番号１２のヌクレオチド配列によりコードされる。
【0074】
本開示において、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性とは、核酸またはタンパク質間の配列の類似の程度を意味し、比較対象の配列の領域にわたって最適な状態（ヌクレオチドまたはアミノ酸の一致が最大となる状態）にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。配列同一性の数値（％）は両方の配列に存在する同一のヌクレオチドまたはアミノ酸を決定して、適合部位の数を決定し、次いでこの適合部位の数を比較対象の配列領域内のヌクレオチドまたはアミノ酸の総数で割り、得られた数値に１００をかけることにより算出される。最適なアラインメントおよび配列同一性を得るためのアルゴリズムとしては、当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなど）が挙げられる。配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの配列解析ソフトウェアを用いて決定され得る。
【0075】
ある実施態様では、ＰＫＣを活性化する条件は、活性化型ＰＫＣを細胞に発現させることである。「活性化型ＰＫＣ」は、恒常的にキナーゼ活性を示すＰＫＣ変異体を意味する。活性化型ＰＫＣは、Ｎ末端の調節領域を欠くＰＫＣであり得る（Molecular and Cellular Biology 19(2):1313-24, 1999）。活性化型ＰＫＣは、さらに、キナーゼ活性を増強する変異を有してもよい（PNAS 115(24):E5497-E5505. 2018）。活性化型ＰＫＣの例として、ＰＫＣδ－ＣＡ（配列番号１）およびＰＫＣαＣＡ－Ｍ４８９Ｖ（配列番号２）が挙げられる。
【0076】
ＰＫＣ変異体のキナーゼ活性は、当分野で知られている各種の方法により測定し得る。例えば、培養細胞にＰＫＣ変異体を過剰発現させ、リン酸化型基質特異的抗体を用いて基質のリン酸化レベルをウェスタンブロットで検出する方法（例えば、THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 279, No. 27, pp. 27986-27993, 2004）、ＥＬＩＳＡ法（例えば、Cell Death and Differentiation (2015) 22, 2078-2086）、インビトロで３２Ｐ－ガンマ－ＡＴＰを用いて基質へのリン酸基の取り込みを評価する方法（例えば、THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 262, No. 20, pp. 9569-9573, 1987）などを使用できる。PKC kinase activity kit（Enzo Life Science, #ADI-EKS-420A）などの、キナーゼ活性を測定する各種キットを使用してもよい。
【0077】
ある実施態様では、ＰＫＣ変異体を発現する細胞をＰＫＣ阻害剤の存在下および非存在下で培養し、リン酸化タンパク質を特異的に認識する抗体を用いる免疫学的手法によりリン酸化タンパク質の量を測定し、ＰＫＣ阻害剤によりリン酸化タンパク質の量が減少する場合に、ＰＫＣ変異体が活性化型ＰＫＣであると決定し得る。免疫学的手法としては、フローサイトメトリー解析、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、酵素免疫固相法（ＥＬＩＳＡ法）、ウェスタンブロッティング、免疫組織染色などを例示できる。
【0078】
例えば、活性化型ＰＫＣをコードする核酸を含む発現コンストラクトを用いてもよく、作動可能に連結されている、プロモーター、ウイルス粒子の産生に必要な核酸、ＩＲＥＳまたは２Ａペプチド配列、および活性化型ＰＫＣをコードする核酸を含む発現コンストラクトを使用して、ウイルス粒子の産生に必要なタンパク質と活性化型ＰＫＣを細胞に発現させてもよい。ある実施態様では、プロモーター、ウイルス粒子の産生に必要な核酸、ＩＲＥＳまたは２Ａペプチド配列、および活性化型ＰＫＣをコードする核酸は、この順序で作動可能に連結されている。
【0079】
ＩＲＥＳを利用して１つの発現コンストラクトからウイルス粒子の産生に必要なタンパク質と活性化型ＰＫＣを発現させることにより、ウイルス粒子の産生に必要なタンパク質を効率よく製造することができる。ＩＲＥＳは、真核生物のリボソームをｍＲＮＡへリクルートすることができるＲＮＡ領域であり、タンパク質合成のプロセスの一部として、キャップ非依存的な翻訳の開始を可能にする。多くのＩＲＥＳが、ウイルスゲノムおよび真核ゲノムで同定されており、合成ＩＲＥＳも開発されている。
【0080】
例えば、ＩＲＥＳは、エンテロウイルス（例えばヒトパピローマウイルス１、ヒトコクサッキーウイルスＢ）；ライノウイルス（例えばヒトライノウイルス）；へパトウイルス（Ａ型肝炎ウイルス）；カーディオウイルス（脳心筋炎ウイルスＥＣＭＶおよびタイラー脳脊髄炎ウイルス）；アフトウイルス（口蹄疫ウイルス、ウマ鼻炎Ａウイルス、ウマ鼻炎Ｂウイルス）；ぺスティウイルス（例えばウシウイルス性下痢ウイルスおよびブタコレラウイルス；ヘパシウイルス（例えばＣ型肝炎ウイルス）およびＧＢウイルスＢ）を含む種々のウイルスに由来するものであり得る。あるいは、ＩＲＥＳは、レトロウイルス科のウイルス、例えば、レンチウイルスファミリーのメンバー（例えば、シミアン免疫不全ウイルスおよびヒト免疫不全ウイルス１）；ＢＬＶ－ＨＴＬＶレトロウイルス（例えば、ヒトＴ－リンホトロピックウイルス１型）；および哺乳動物Ｃ型レトロウイルスファミリー（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、トリ細網内皮症ウイルス、マウス白血病ウイルス（ｅｎｖＲＮＡ）、ラウス肉腫ウイルス）に由来するものであり得る。真核生物のｍＲＮＡに由来するＩＲＥＳとしては、例えば、ＢｉＰ、ショウジョウバエのアンテナペディア（エクソンｄおよびｅ）、ｃ－ｍｙｃ、およびアポトーシスのＸ連結阻害剤（ＸＩＡＰ）遺伝子のＩＲＥＳが挙げられる。また、様々な合成ＩＲＥＳが開発されており、例えば、De Gregorio et al. (1999) EMBO J. 75:4865-74; Owens et al. (2001) PNAS 4:1471-6；およびVenkatesan et al. (2001) Molecular and Cellular Biology 21:2826-37を参照し得る。当分野で知られているさらなるＩＲＥＳについては、例えば rangueil.inserm.fr/IRESdatabase を参照し得る。ある実施態様では、脳心筋炎ウイルスＥＣＭＶ由来のＩＲＥＳを用いる。
【0081】
２Ａペプチド配列は、タンパク質の翻訳中にリボソームスキッピングを誘発する。タンパク質のアミノ酸配列中に２Ａペプチド配列が存在すると、当該タンパク質は２Ａペプチド配列のＣ末端で切断された２つのポリペプチドとして翻訳される。２Ａペプチドとしては、例えば、Kim, J. H., et al., PLoS One. 6(4), e18556 (2011) に記載されるペプチドが挙げられ、例えば、Ｐ２Ａペプチド（配列番号３：（ＧＳＧ）ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）、Ｔ２Ａペプチド（配列番号４：（ＧＳＧ）ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）、Ｅ２Ａペプチド（配列番号５：（ＧＳＧ）ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）およびＦ２Ａぺプチド（配列番号６：（ＧＳＧ）ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）などが知られている（各配列中、Ｎ末端のＧＳＧは存在してもしなくてもよい）。
【0082】
ＰＫＣを活性化する際に、さらにカルモジュリン阻害剤を培地に添加してもよい。カルモジュリンは、カルシウムセンサーとして機能する酸性タンパク質であり、細胞内カルシウムレベルを調節する。カルモジュリン阻害剤として、式（ＩＶ）
｛式中、
ｎは１～８の整数であり、
Ｒは、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ６－１４アリール、アミノ、ヒドロキシ、ＣＯＯＨまたはＣＯＯＲ’であり、ここでＲ’はＣ１－６アルキルである｝
の化合物またはそのエステル、塩もしくは溶媒和物を使用し得る。
【化5】
ｎは１～８の整数であり、
Ｒは、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ６－１４アリール、アミノ、ヒドロキシ、ＣＯＯＨまたはＣＯＯＲ’であり、ここでＲ’はＣ１－６アルキルである｝
の化合物またはそのエステル、塩もしくは溶媒和物を使用し得る。
【0083】
ある実施態様では、式（ＩＶ）中、
ｎは４～６の整数であり、
Ｒは、Ｃ１－６アルキル、Ｃ６－１４アリールまたはアミノである。
ｎは４～６の整数であり、
Ｒは、Ｃ１－６アルキル、Ｃ６－１４アリールまたはアミノである。
【0084】
ある実施態様では、式（ＩＶ）中、
ｎは４または６の整数であり、
Ｒは、メチル、フェニルまたはアミノである。
ｎは４または６の整数であり、
Ｒは、メチル、フェニルまたはアミノである。
【0085】
式（ＩＶ）の化合物には、例えば、ＳＣ－９、ＳＣ－１０、Ｗ－７が含まれる。式（ＩＶ）の化合物は、例えば、０．５～１００μｇ／ｍｌ、１～５０μｇ／ｍｌまたは２～１０μｇ／ｍｌの濃度で使用し得る。
【0086】
公知のカルモジュリン阻害剤、例えば、Ｗ－７、カルミダゾリウム、ビスインドリルマレイミドＩ、トリフルオペラジン、ルテニウムレッド、オフィオボリンＡ、ＣａＭキナーゼＩＩ（２９０－３０９）、Ｅ６ベルバミン、マストパラン、コンパウンド４８／８０、フェノキシベンザミン、Ｗ－７アイソマー、ポリステスマストパラン、Ａ－７、フルフェナジン－Ｎ－２－クロロエタン、Ｗ－１３、Ｗ－１３アイソマー、ＣＧＳ ９３４３Ｂ、Ｗ－５アイソマー、Ｗ－１２、Ｎ－（５－アミノペンチル）－５－クロロ－２－ナフタレンスルホンアミド、Ｗ－５を、当分野で知られている方法、例えば製造業者の推奨する方法により、適宜使用してもよい。２種以上のカルモジュリン阻害剤を併用してもよい。
【0087】
ＰＫＣを活性化する際に、さらにヒストンデアセチラーゼ阻害剤を培地に添加してもよい。ヒストンデアセチラーゼは、クロマチン構造において主要な構成因子であるヒストンを脱アセチル化する酵素であり、遺伝子の転写制御において重要な役割を果たしている。公知のヒストンデアセチラーゼ阻害剤、例えば、トリコスタチンＡ、Ｍ３４４、酪酸塩、フェニル酪酸塩、アピシジン、バルプロ酸、ＢＭＬ－２１０、デプデシン、ロミデプシン（ＦＫ－２２８）、ＨＣトキシン、オキサムフラチン、スクリプタイド、スプリトマイシン、スベロイルビス－ヒドロキサム酸、ボリノスタット、ダシノスタット（ＬＡＱ－８２４）、パノビノスタット（ＬＢＨ－５８９）、ベリノスッタト（ＰＸＤ－１０１）、酢酸フェニル、ＩＦ２３５７、ＦＫ－２２８、エンチノスタット（ＭＳ－２７５）、モセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）またはタセジナリン（ＣＩ９９４）、好ましくは、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、ボリノスタット、アピシジン、エンチノスタットまたはタセジナリン、特に好ましくは酪酸ナトリウムを、当分野で周知の方法、例えば、製造業者の推奨する方法に従って、適宜使用し得る。例えば、酪酸ナトリウムは、０．１～１０ｍＭ、０．５～５ｍＭまたは１～３ｍＭの濃度で使用し得る。２種以上のヒストンデアセチラーゼ阻害剤を併用してもよい。
【0088】
ある態様では、本開示の方法に使用し得るキットも提供される。キットに含まれる各構成要素は、各々別個に、あるいは可能であれば混合した状態で、水または適当な緩衝液中に溶解されるか、または凍結乾燥された状態で、適切な容器中に収容されて提供され得る。好適な容器には、ボトル、バイアル、試験管、チューブ、プレート等が含まれる。容器は、ガラス、プラスチック、金属などの多様な材料から形成されていてよい。容器は、ラベルを有していてもよい。キットは、さらに、使用のための説明を含む文書（例えば、書面または記憶媒体等）等の、商業的見地および使用者の見地から望ましいその他の構成要素を含んでもよい。
【0089】
ある態様では、ＰＫＣ活性化剤または活性化型ＰＫＣをコードする核酸を含む、ウイルスベクターの産生を増強するための組成物も提供される。当該組成物は、ＰＫＣ活性化剤または活性化型ＰＫＣをコードする核酸を適当な賦形剤と共に含み、本開示の方法に準じて使用し得る。
【0090】
例えば、下記の実施態様が提供される。
［１］ウイルスベクターの製造方法であって、ウイルスベクターのウイルス粒子の産生に必要な核酸およびウイルスベクターにより送達しようとする核酸を含む細胞を、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化する条件下で培養することを含み、
ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢおよびＹＹ１から選択される少なくとも１つの転写因子の結合部位を含むプロモーターに作動可能に連結している、方法。
［２］ウイルスベクターのウイルス粒子の産生に必要な核酸および／またはウイルスベクターにより送達しようとする核酸を細胞に導入する工程を含む、第１項に記載の方法。
［３］ウイルスベクターを回収する工程を含む、第１項または第２項に記載の方法。
［４］ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターである、第１項～第３項のいずれかに記載の方法。
［５］ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、第１項～第４項のいずれかに記載の方法。
［６］ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、Ｇａｇ、Ｐｏｌおよびエンベロープタンパク質から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする、第５項に記載の方法。
［７］ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、第１項～第４項のいずれかに記載の方法。
［８］ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｒｅｖおよびエンベロープタンパク質から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする、第７項に記載の方法。
［９］ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、第１項～第４項のいずれかに記載の方法。
［１０］ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５領域にコードされるタンパク質から選択される少なくとも１つのタンパク質またはＶＡ ＲＮＡをコードする、第９項に記載の方法。
［１］ウイルスベクターの製造方法であって、ウイルスベクターのウイルス粒子の産生に必要な核酸およびウイルスベクターにより送達しようとする核酸を含む細胞を、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化する条件下で培養することを含み、
ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢおよびＹＹ１から選択される少なくとも１つの転写因子の結合部位を含むプロモーターに作動可能に連結している、方法。
［２］ウイルスベクターのウイルス粒子の産生に必要な核酸および／またはウイルスベクターにより送達しようとする核酸を細胞に導入する工程を含む、第１項に記載の方法。
［３］ウイルスベクターを回収する工程を含む、第１項または第２項に記載の方法。
［４］ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターである、第１項～第３項のいずれかに記載の方法。
［５］ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、第１項～第４項のいずれかに記載の方法。
［６］ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、Ｇａｇ、Ｐｏｌおよびエンベロープタンパク質から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする、第５項に記載の方法。
［７］ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、第１項～第４項のいずれかに記載の方法。
［８］ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｒｅｖおよびエンベロープタンパク質から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする、第７項に記載の方法。
［９］ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、第１項～第４項のいずれかに記載の方法。
［１０］ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５領域にコードされるタンパク質から選択される少なくとも１つのタンパク質またはＶＡ ＲＮＡをコードする、第９項に記載の方法。
【0091】
［１１］ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである、第１項～第４項のいずれかに記載の方法。
［１２］ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２ＡおよびＥ４領域、並びに、アデノ随伴ウイルスゲノムのＲｅｐおよびＣａｐ領域にコードされるタンパク質から選択される少なくとも１つのタンパク質またはＶＡ ＲＮＡをコードする、第１１項に記載の方法。
［１３］ウイルス粒子の産生に必要な全部の核酸が、当該プロモーターに作動可能に連結している、第１項～第１２項のいずれかに記載の方法。
［１４］ウイルスベクターにより送達しようとする核酸が、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢおよびＹＹ１から選択される少なくとも１つの転写因子の結合部位を含むプロモーターに作動可能に連結している、第１項～第１３項のいずれかに記載の方法。
［１５］プロモーターが、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢおよびＹＹ１の結合部位を含む、第１項～第１４項のいずれかに記載の方法。
［１６］プロモーターが、さらにＣＲＥＢの結合部位を含む、第１項～第１５項のいずれかに記載の方法。
［１７］プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーターまたはＥＦ１プロモーターである、第１項～第１６項のいずれかに記載の方法。
［１８］プロモーターが、ＣＭＶプロモーターまたはＥＦ１プロモーターである、第１項～第１７項のいずれかに記載の方法。
［１９］プロモーターがＣＭＶプロモーターである、第１項～第１８項のいずれかに記載の方法。
［２０］プロモーターがウイルス由来のプロモーターである、第１項～第１４項のいずれかに記載の方法。
［１２］ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２ＡおよびＥ４領域、並びに、アデノ随伴ウイルスゲノムのＲｅｐおよびＣａｐ領域にコードされるタンパク質から選択される少なくとも１つのタンパク質またはＶＡ ＲＮＡをコードする、第１１項に記載の方法。
［１３］ウイルス粒子の産生に必要な全部の核酸が、当該プロモーターに作動可能に連結している、第１項～第１２項のいずれかに記載の方法。
［１４］ウイルスベクターにより送達しようとする核酸が、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢおよびＹＹ１から選択される少なくとも１つの転写因子の結合部位を含むプロモーターに作動可能に連結している、第１項～第１３項のいずれかに記載の方法。
［１５］プロモーターが、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢおよびＹＹ１の結合部位を含む、第１項～第１４項のいずれかに記載の方法。
［１６］プロモーターが、さらにＣＲＥＢの結合部位を含む、第１項～第１５項のいずれかに記載の方法。
［１７］プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーターまたはＥＦ１プロモーターである、第１項～第１６項のいずれかに記載の方法。
［１８］プロモーターが、ＣＭＶプロモーターまたはＥＦ１プロモーターである、第１項～第１７項のいずれかに記載の方法。
［１９］プロモーターがＣＭＶプロモーターである、第１項～第１８項のいずれかに記載の方法。
［２０］プロモーターがウイルス由来のプロモーターである、第１項～第１４項のいずれかに記載の方法。
【0092】
［２１］ウイルス由来のプロモーターが、アデノウイルスのＥ１Ａプロモーター、Ｅ１Ｂプロモーター、Ｅ２Ａプロモーター、Ｅ２Ｂプロモーター、Ｅ４プロモーター、主要後期プロモーターもしくはＩＸプロモーター、アデノ随伴ウイルスのｐ５プロモーター、ｐ１９プロモーターもしくはｐ４０プロモーターである、第２０項に記載の方法。
［２２］ＰＫＣ活性化剤の存在下で前記細胞を培養することによりＰＫＣを活性化する、第１項～第２１項のいずれかに記載の方法。
［２３］ＰＫＣ活性化剤が、式（Ｉ）、式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）の化合物またはそのエステル、塩もしくは溶媒和物である、第２２項に記載の方法。
［２４］ＰＫＣ活性化剤が、式（Ｉ）の化合物またはそのエステル、塩もしくは溶媒和物である、第２２項または第２３項に記載の方法。
［２５］Ｒ１が、Ｈまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ３であり、Ｒ２が、Ｃ６－１２アルキルまたはＣ６－１２アルケニルであり、Ｒ３が、Ｃ１－６アルキルまたはＣ６－１４アリールである、第２４項に記載の方法。
［２６］Ｒ１が、Ｈまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ３であり、Ｒ２が、ノニルまたは１,３－ノナジエニルであり、Ｒ３が、メチルまたはフェニルである、第２４項または第２５項に記載の方法。
［２７］ＰＫＣ活性化剤が、式（ＩＩ）の化合物またはそのエステル、塩もしくは溶媒和物である、第２２項または第２３項に記載の方法。
［２８］Ｒ４が、Ｈまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ６であり、Ｒ５が、Ｃ１－６アルキルまたはＣ２－６アルケニルであり、Ｒ６が、Ｃ１－１８アルキルである、第２７項に記載の方法。
［２９］Ｒ４が、Ｈまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ６であり、Ｒ５が、メチル、プロピル、ｓｅｃ－ブチルまたはブテニルであり、Ｒ６が、プロピル、ノニルまたはトリデシルである、第２５項または第２８項に記載の方法。
［３０］ＰＫＣ活性化剤が、式（ＩＩＩ）の化合物またはそのエステル、塩もしくは溶媒和物である、第２２項または第２３項に記載の方法。
［２２］ＰＫＣ活性化剤の存在下で前記細胞を培養することによりＰＫＣを活性化する、第１項～第２１項のいずれかに記載の方法。
［２３］ＰＫＣ活性化剤が、式（Ｉ）、式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）の化合物またはそのエステル、塩もしくは溶媒和物である、第２２項に記載の方法。
［２４］ＰＫＣ活性化剤が、式（Ｉ）の化合物またはそのエステル、塩もしくは溶媒和物である、第２２項または第２３項に記載の方法。
［２５］Ｒ１が、Ｈまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ３であり、Ｒ２が、Ｃ６－１２アルキルまたはＣ６－１２アルケニルであり、Ｒ３が、Ｃ１－６アルキルまたはＣ６－１４アリールである、第２４項に記載の方法。
［２６］Ｒ１が、Ｈまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ３であり、Ｒ２が、ノニルまたは１,３－ノナジエニルであり、Ｒ３が、メチルまたはフェニルである、第２４項または第２５項に記載の方法。
［２７］ＰＫＣ活性化剤が、式（ＩＩ）の化合物またはそのエステル、塩もしくは溶媒和物である、第２２項または第２３項に記載の方法。
［２８］Ｒ４が、Ｈまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ６であり、Ｒ５が、Ｃ１－６アルキルまたはＣ２－６アルケニルであり、Ｒ６が、Ｃ１－１８アルキルである、第２７項に記載の方法。
［２９］Ｒ４が、Ｈまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ６であり、Ｒ５が、メチル、プロピル、ｓｅｃ－ブチルまたはブテニルであり、Ｒ６が、プロピル、ノニルまたはトリデシルである、第２５項または第２８項に記載の方法。
［３０］ＰＫＣ活性化剤が、式（ＩＩＩ）の化合物またはそのエステル、塩もしくは溶媒和物である、第２２項または第２３項に記載の方法。
【0093】
［３１］Ｒ７が、Ｈまたは－Ｃ（Ｏ）Ｒ９であり、Ｒ８が、Ｈまたは－Ｃ（Ｏ）Ｒ９であり、Ｒ９が、Ｃ１－１８アルキルまたはＣ２－１８アルケニルである、第３０項に記載の方法。
［３２］Ｒ７が、Ｈまたは－Ｃ（Ｏ）Ｒ９であり、Ｒ８が、Ｈまたは－Ｃ（Ｏ）Ｒ９であり、Ｒ９が、ペンタデシルまたはブテニルである、第３０項または第３１項に記載の方法。
［３３］ＰＫＣ活性化剤が、化合物Ｘ、化合物＃１～＃７、ＴＰＡ、プロストラチン、（－）－インドラクタムＶ、ホルボール１２，１３－ジブチラート、インゲノール３－アンゲラートおよび（２Ｓ，５Ｓ）－（Ｅ，Ｅ）－８－（５－（４－（トリフルオロメチル）フェニル）－２，４－ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラクタムから選択される化合物またはそのエステル、塩もしくは溶媒和物である、第２２項に記載の方法。
［３４］ＰＫＣ活性化剤が、化合物Ｘおよび化合物＃１～＃７から選択される化合物またはそのエステル、塩もしくは溶媒和物である、第３３項に記載の方法。
［３５］ＰＫＣ活性化剤が、化合物Ｘまたはそのエステル、塩もしくは溶媒和物である、第３１項または第３４項に記載の方法。
［３６］前記細胞が、Ｐｒｏ領域またはＲＩＮＧ領域を含むペプチドをコードする核酸をさらに含む、第１項～第３５項のいずれかに記載の方法。
［３７］ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、Ｐｒｏ領域またはＲＩＮＧ領域を含むペプチドをコードする核酸と連結されている、第１項～第３６項のいずれかに記載の方法。
［３８］前記細胞がＲＩＮＧ領域を含むペプチドをコードする核酸をさらに含む、第３６項または第３７項に記載の方法。
［３９］ＲＩＮＧ領域が、
Ｃ－Ｘ２－Ｃ－Ｘ９－３９－Ｃ－Ｘ１－３－Ｈ－Ｘ２－３－Ｃ－Ｘ２－Ｃ－Ｘ４－４８－Ｃ－Ｘ２－Ｃ
｛式中、Ｃはシステイン残基であり、Ｈはヒスチジン残基であり、Ｘは任意のアミノ酸残基である。｝
のアミノ酸配列を含む、第３８項に記載の方法。
［４０］ＲＩＮＧ領域が、ＴＲＩＭ１３、ＬＯＮＲＦ３、ＴＲＩＭ４７、ＲＮＦ１３５、ＴＲＩＭ１０、ＴＲＩＭ７２、ＴＲＩＭ６０、ＴＲＩＭ３９、ＴＲＩＭ４、ＴＲＩＭ４３Ｂ、ＴＲＩＭ４３、ＴＲＩＭ２５、ＴＲＩＭ２６、ＴＲＩＭ３１、ＨＴＬＦ、ＢＲＣＡ１、ＴＲＩＭ５０、ＴＲＩＭ２１、ＳＳＡ１、ＴＲＩＭ５ｄ、ＴＲＩＭ２２、ＫＩＡＡ０１８２、ＴＲＩＭ６５、ＲＡＧ１、ＢＦＡＲ、Ｐｅｘ１０、ＲＮＦ８、ＲＩＮＧ２、ＣＯＰＩ、ＴＲＩＭ２、ＴＲＩＭ３、ＳＨ３ＲＦ２、ＰＭＬまたはＴＲＩＭ５６のＲＩＮＧ領域である、第３８項に記載の方法。
［３２］Ｒ７が、Ｈまたは－Ｃ（Ｏ）Ｒ９であり、Ｒ８が、Ｈまたは－Ｃ（Ｏ）Ｒ９であり、Ｒ９が、ペンタデシルまたはブテニルである、第３０項または第３１項に記載の方法。
［３３］ＰＫＣ活性化剤が、化合物Ｘ、化合物＃１～＃７、ＴＰＡ、プロストラチン、（－）－インドラクタムＶ、ホルボール１２，１３－ジブチラート、インゲノール３－アンゲラートおよび（２Ｓ，５Ｓ）－（Ｅ，Ｅ）－８－（５－（４－（トリフルオロメチル）フェニル）－２，４－ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラクタムから選択される化合物またはそのエステル、塩もしくは溶媒和物である、第２２項に記載の方法。
［３４］ＰＫＣ活性化剤が、化合物Ｘおよび化合物＃１～＃７から選択される化合物またはそのエステル、塩もしくは溶媒和物である、第３３項に記載の方法。
［３５］ＰＫＣ活性化剤が、化合物Ｘまたはそのエステル、塩もしくは溶媒和物である、第３１項または第３４項に記載の方法。
［３６］前記細胞が、Ｐｒｏ領域またはＲＩＮＧ領域を含むペプチドをコードする核酸をさらに含む、第１項～第３５項のいずれかに記載の方法。
［３７］ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、Ｐｒｏ領域またはＲＩＮＧ領域を含むペプチドをコードする核酸と連結されている、第１項～第３６項のいずれかに記載の方法。
［３８］前記細胞がＲＩＮＧ領域を含むペプチドをコードする核酸をさらに含む、第３６項または第３７項に記載の方法。
［３９］ＲＩＮＧ領域が、
Ｃ－Ｘ２－Ｃ－Ｘ９－３９－Ｃ－Ｘ１－３－Ｈ－Ｘ２－３－Ｃ－Ｘ２－Ｃ－Ｘ４－４８－Ｃ－Ｘ２－Ｃ
｛式中、Ｃはシステイン残基であり、Ｈはヒスチジン残基であり、Ｘは任意のアミノ酸残基である。｝
のアミノ酸配列を含む、第３８項に記載の方法。
［４０］ＲＩＮＧ領域が、ＴＲＩＭ１３、ＬＯＮＲＦ３、ＴＲＩＭ４７、ＲＮＦ１３５、ＴＲＩＭ１０、ＴＲＩＭ７２、ＴＲＩＭ６０、ＴＲＩＭ３９、ＴＲＩＭ４、ＴＲＩＭ４３Ｂ、ＴＲＩＭ４３、ＴＲＩＭ２５、ＴＲＩＭ２６、ＴＲＩＭ３１、ＨＴＬＦ、ＢＲＣＡ１、ＴＲＩＭ５０、ＴＲＩＭ２１、ＳＳＡ１、ＴＲＩＭ５ｄ、ＴＲＩＭ２２、ＫＩＡＡ０１８２、ＴＲＩＭ６５、ＲＡＧ１、ＢＦＡＲ、Ｐｅｘ１０、ＲＮＦ８、ＲＩＮＧ２、ＣＯＰＩ、ＴＲＩＭ２、ＴＲＩＭ３、ＳＨ３ＲＦ２、ＰＭＬまたはＴＲＩＭ５６のＲＩＮＧ領域である、第３８項に記載の方法。
【0094】
［４１］ＲＩＮＧ領域が、ＰＭＬ、ＴＲＩＭ３、ＴＲＩＭ５６、ＣＯＰＩ、Ｐｅｘ１０、ＢＲＣＡ１またはＨＴＬＦのＲＩＮＧ領域である、第３８項～第４０項のいずれかに記載の方法。
［４２］ＲＩＮＧ領域がＰＭＬのＲＩＮＧ領域である、第３８項～第４１項のいずれかに記載の方法。
［４３］ＲＩＮＧ領域が、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、第３８項～第４２項のいずれかに記載の方法。
［４４］ＲＩＮＧ領域が、配列番号１２のヌクレオチド配列と、少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされる、第３８項～第４３項のいずれかに記載の方法。
［４５］前記細胞がＰｒｏ領域を含むペプチドをコードする核酸をさらに含む、第３６項または第３７項に記載の方法。
［４６］Ｐｒｏ領域が、ＰＭＬ、ＡＲＨＧＥＦ１、アグリカン－１、ＲＡＬＧＤＳ、ＤＧＫＫ、ＳＰＡＴＡ２１、ラブフィリン－３Ａ、ＴＥＡＤ３、ＳＰＰＬ２ＢまたはＦＬＪ４３０９３のＰｒｏ領域である、第４５項に記載の方法。
［４７］Ｐｒｏ領域がＰＭＬのＰｒｏ領域である、第４５項または第４６項に記載の方法。
［４８］Ｐｒｏ領域が、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、第４５項～第４７項のいずれかに記載の方法。
［４９］Ｐｒｏ領域を含むペプチドをコードする核酸が、配列番号１１のヌクレオチド配列と、少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなる、第４５項～第４８項のいずれかに記載の方法。
［５０］前記細胞がＰｒｏ領域およびＲＩＮＧ領域を含むペプチドをコードする核酸をさらに含む、第３６項または第３７項に記載の方法。
［４２］ＲＩＮＧ領域がＰＭＬのＲＩＮＧ領域である、第３８項～第４１項のいずれかに記載の方法。
［４３］ＲＩＮＧ領域が、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、第３８項～第４２項のいずれかに記載の方法。
［４４］ＲＩＮＧ領域が、配列番号１２のヌクレオチド配列と、少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされる、第３８項～第４３項のいずれかに記載の方法。
［４５］前記細胞がＰｒｏ領域を含むペプチドをコードする核酸をさらに含む、第３６項または第３７項に記載の方法。
［４６］Ｐｒｏ領域が、ＰＭＬ、ＡＲＨＧＥＦ１、アグリカン－１、ＲＡＬＧＤＳ、ＤＧＫＫ、ＳＰＡＴＡ２１、ラブフィリン－３Ａ、ＴＥＡＤ３、ＳＰＰＬ２ＢまたはＦＬＪ４３０９３のＰｒｏ領域である、第４５項に記載の方法。
［４７］Ｐｒｏ領域がＰＭＬのＰｒｏ領域である、第４５項または第４６項に記載の方法。
［４８］Ｐｒｏ領域が、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、第４５項～第４７項のいずれかに記載の方法。
［４９］Ｐｒｏ領域を含むペプチドをコードする核酸が、配列番号１１のヌクレオチド配列と、少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなる、第４５項～第４８項のいずれかに記載の方法。
［５０］前記細胞がＰｒｏ領域およびＲＩＮＧ領域を含むペプチドをコードする核酸をさらに含む、第３６項または第３７項に記載の方法。
【0095】
［５１］前記細胞が、作動可能に連結されている、プロモーター、ウイルス粒子の産生に必要な核酸、および、Ｐｒｏ領域またはＲＩＮＧ領域を含むペプチドをコードする核酸を含む発現コンストラクトを含む、第３６項～第５０項のいずれかに記載の方法。
［５２］プロモーター、ウイルス粒子の産生に必要な核酸、および、Ｐｒｏ領域またはＲＩＮＧ領域を含むペプチドをコードする核酸が、この順序で作動可能に連結されている、第５１項に記載の方法。
［５３］発現コンストラクトがさらに内部リボソーム進入部位または２Ａペプチド配列をコードする核酸を含む、第５１項または第５２項に記載の方法。
［５４］プロモーター、ウイルス粒子の産生に必要な核酸、内部リボソーム進入部位または２Ａペプチド配列、および、Ｐｒｏ領域またはＲＩＮＧ領域を含むペプチドをコードする核酸が、この順序で作動可能に連結されている、第５１項～第５３項のいずれかに記載の方法。
［５５］活性化型ＰＫＣを前記細胞に発現させることによりＰＫＣを活性化する、第１項～第２１項のいずれかに記載の方法。
［５６］前記細胞が、活性化型ＰＫＣをコードする核酸を含む発現コンストラクトを含む、第５５項に記載の方法。
［５７］前記細胞が、作動可能に連結されている、プロモーター、ウイルス粒子の産生に必要な核酸、内部リボソーム進入部位または２Ａペプチド配列、および、活性化型ＰＫＣをコードする核酸を含む発現コンストラクトを含む、第５５項に記載の方法。
［５８］プロモーター、ウイルス粒子の産生に必要な核酸、内部リボソーム進入部位または２Ａペプチド配列、および、活性化型ＰＫＣをコードする核酸が、この順序で作動可能に連結されている、第５７項に記載の方法。
［５９］活性化型ＰＫＣが、ＰＫＣδ－ＣＡまたはＰＫＣαＣＡ－Ｍ４８９Ｖである、第５５項～第５８項のいずれかに記載の方法。
［６０］カルモジュリン阻害剤の存在下で前記細胞を培養する、第１項～第５９項のいずれかに記載の方法。
［５２］プロモーター、ウイルス粒子の産生に必要な核酸、および、Ｐｒｏ領域またはＲＩＮＧ領域を含むペプチドをコードする核酸が、この順序で作動可能に連結されている、第５１項に記載の方法。
［５３］発現コンストラクトがさらに内部リボソーム進入部位または２Ａペプチド配列をコードする核酸を含む、第５１項または第５２項に記載の方法。
［５４］プロモーター、ウイルス粒子の産生に必要な核酸、内部リボソーム進入部位または２Ａペプチド配列、および、Ｐｒｏ領域またはＲＩＮＧ領域を含むペプチドをコードする核酸が、この順序で作動可能に連結されている、第５１項～第５３項のいずれかに記載の方法。
［５５］活性化型ＰＫＣを前記細胞に発現させることによりＰＫＣを活性化する、第１項～第２１項のいずれかに記載の方法。
［５６］前記細胞が、活性化型ＰＫＣをコードする核酸を含む発現コンストラクトを含む、第５５項に記載の方法。
［５７］前記細胞が、作動可能に連結されている、プロモーター、ウイルス粒子の産生に必要な核酸、内部リボソーム進入部位または２Ａペプチド配列、および、活性化型ＰＫＣをコードする核酸を含む発現コンストラクトを含む、第５５項に記載の方法。
［５８］プロモーター、ウイルス粒子の産生に必要な核酸、内部リボソーム進入部位または２Ａペプチド配列、および、活性化型ＰＫＣをコードする核酸が、この順序で作動可能に連結されている、第５７項に記載の方法。
［５９］活性化型ＰＫＣが、ＰＫＣδ－ＣＡまたはＰＫＣαＣＡ－Ｍ４８９Ｖである、第５５項～第５８項のいずれかに記載の方法。
［６０］カルモジュリン阻害剤の存在下で前記細胞を培養する、第１項～第５９項のいずれかに記載の方法。
【0096】
［６１］カルモジュリン阻害剤が、式（ＩＶ）の化合物またはそのエステル、塩もしくは溶媒和物である、第６０項に記載の方法。
［６２］カルモジュリン阻害剤が、ＳＣ－９、ＳＣ－１０またはＷ－７である、第６０項または第６１項に記載の方法。
［６３］カルモジュリン阻害剤がＳＣ－１０である、第６０項～第６２項のいずれかに記載の方法。
［６４］ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で前記細胞を培養する、第１項～第６３項のいずれかに記載の方法。
［６５］ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、ボリノスタット、アピシジン、エンチノスタットまたはタセジナリンである、第６４項に記載の方法。
［６６］ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が酪酸ナトリウムである、第６４項または第６５項に記載の方法。
［６７］細胞がパッケージング細胞である、第１項～第６６項のいずれかに記載の方法。
［６８］細胞がＰｌａｔ－Ｅ細胞またはＬｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞である、第１項～第６７項のいずれかに記載の方法。
［６９］プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤または活性化型ＰＫＣをコードする核酸と、ウイルスベクターのウイルス粒子の産生に必要な核酸とを含む、ウイルスベクターを製造するためのキットであって、
ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢおよびＹＹ１から選択される少なくとも１つの転写因子の結合部位を含むプロモーターに作動可能に連結しているものである、キット。
［７０］ＰＫＣ活性化剤または活性化型ＰＫＣをコードする核酸を含む、ウイルスベクターの産生を増強するための組成物。
［６２］カルモジュリン阻害剤が、ＳＣ－９、ＳＣ－１０またはＷ－７である、第６０項または第６１項に記載の方法。
［６３］カルモジュリン阻害剤がＳＣ－１０である、第６０項～第６２項のいずれかに記載の方法。
［６４］ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で前記細胞を培養する、第１項～第６３項のいずれかに記載の方法。
［６５］ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、ボリノスタット、アピシジン、エンチノスタットまたはタセジナリンである、第６４項に記載の方法。
［６６］ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が酪酸ナトリウムである、第６４項または第６５項に記載の方法。
［６７］細胞がパッケージング細胞である、第１項～第６６項のいずれかに記載の方法。
［６８］細胞がＰｌａｔ－Ｅ細胞またはＬｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞である、第１項～第６７項のいずれかに記載の方法。
［６９］プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤または活性化型ＰＫＣをコードする核酸と、ウイルスベクターのウイルス粒子の産生に必要な核酸とを含む、ウイルスベクターを製造するためのキットであって、
ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢおよびＹＹ１から選択される少なくとも１つの転写因子の結合部位を含むプロモーターに作動可能に連結しているものである、キット。
［７０］ＰＫＣ活性化剤または活性化型ＰＫＣをコードする核酸を含む、ウイルスベクターの産生を増強するための組成物。
【0097】
本明細書で引用するすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
以下、実施例にて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこの実施例に限定されない。また、上記の説明は、すべて非限定的なものであり、本発明は添付の特許請求の範囲において定義され、その技術的思想を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。
以下、実施例にて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこの実施例に限定されない。また、上記の説明は、すべて非限定的なものであり、本発明は添付の特許請求の範囲において定義され、その技術的思想を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。
【実施例0098】
コンストラクト
ＣＭＶプロモーターによるルシフェラーゼ活性測定用には、ｐＲＬ－ＣＭＶ（Promega, #E2261）を使用した。ＣＡＧプロモーターはｐＣＡＧＧＳベクター、ＥＦ１プロモーターはｐＥＦＢＯＳベクター由来のプロモーターを使用し、ｐＲＬ－ＣＭＶのＣＭＶ領域と載せ換えたコンストラクトを作製した。マウスＩｇＧ抗体（重鎖、軽鎖）、ヒトプロインスリンおよびヒトレプチン発現コンストラクトはｐｃＤＮＡベクターのＣＭＶプロモーターの下流にこれらのｃＤＮＡを挿入したコンストラクトを作製した。これらのプロモーターにおける転写因子の結合部位を図４２に示す。
ＣＭＶプロモーターによるルシフェラーゼ活性測定用には、ｐＲＬ－ＣＭＶ（Promega, #E2261）を使用した。ＣＡＧプロモーターはｐＣＡＧＧＳベクター、ＥＦ１プロモーターはｐＥＦＢＯＳベクター由来のプロモーターを使用し、ｐＲＬ－ＣＭＶのＣＭＶ領域と載せ換えたコンストラクトを作製した。マウスＩｇＧ抗体（重鎖、軽鎖）、ヒトプロインスリンおよびヒトレプチン発現コンストラクトはｐｃＤＮＡベクターのＣＭＶプロモーターの下流にこれらのｃＤＮＡを挿入したコンストラクトを作製した。これらのプロモーターにおける転写因子の結合部位を図４２に示す。
【0099】
細胞
ＨＥＫ２９３Ａ細胞（ヒト胎児腎細胞）は１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地を用いて３７℃、５％ＣＯ２、湿度９０％の条件下で培養した。マウスＩｇＧ抗体、ヒトプロインスリン、および、レプチンを恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞株は、ＣＭＶプロモーターの下流にこれらのｃＤＮＡを挿入したコンストラクトをトランスフェクションした後、長期培養によって単一クローンを形成させた。その後、各クローンから目的タンパク質の発現をＥＬＩＳＡ法を用いて確認し、細胞株を樹立した。これらの細胞株も同様の条件で培養した。
ＨＥＫ２９３Ａ細胞（ヒト胎児腎細胞）は１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地を用いて３７℃、５％ＣＯ２、湿度９０％の条件下で培養した。マウスＩｇＧ抗体、ヒトプロインスリン、および、レプチンを恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞株は、ＣＭＶプロモーターの下流にこれらのｃＤＮＡを挿入したコンストラクトをトランスフェクションした後、長期培養によって単一クローンを形成させた。その後、各クローンから目的タンパク質の発現をＥＬＩＳＡ法を用いて確認し、細胞株を樹立した。これらの細胞株も同様の条件で培養した。
【0100】
トランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ａ細胞を２４ウェルプレートに１．０×１０５細胞／ウェルとなるように播種し、２４時間培養した。特記しない限り、１ウェルあたり５０ｎｇの発現コンストラクト、１μｌ-Plus Reagent、１μｌ-Lipofectamine LTX を５０μｌのOpti-MEMで調整し、細胞を培養した２４ウェルプレートの各ウェルに添加し、３７℃で２４時間培養することでトランスフェクションを行った。
ＨＥＫ２９３Ａ細胞を２４ウェルプレートに１．０×１０５細胞／ウェルとなるように播種し、２４時間培養した。特記しない限り、１ウェルあたり５０ｎｇの発現コンストラクト、１μｌ-Plus Reagent、１μｌ-Lipofectamine LTX を５０μｌのOpti-MEMで調整し、細胞を培養した２４ウェルプレートの各ウェルに添加し、３７℃で２４時間培養することでトランスフェクションを行った。
【0101】
ルシフェラーゼアッセイ
トランスフェクションから２４時間後にウェルから培地を除去し、各濃度の化合物を添加した培地を加え、さらに２４時間培養した。その後、培地を除去し、５００μｌＰＢＳで洗浄した後、５０μｌの１ｘ Glo Lysis buffer（Promega #E2661）で細胞を溶解した。この内、５μｌをルシフェラーゼ活性測定に、５μｌをタンパク質濃度測定に用いた。ルシフェラーゼ活性はセレンテラジンｈ（FUJIFILM #035-22991）の発光を検出することでＲｌｕｃの発現量を定量し、また、タンパク質濃度はＢＣＡ法を用いて定量し、各ルシフェラーゼ活性はＲｌｕｃ／ＢＣＡ値で算出した。なお、発光検出、ＢＣＡ測定にはマルチラベルリーダー 2030 ARVOTM X（Perkin Elmer）を用いた。
トランスフェクションから２４時間後にウェルから培地を除去し、各濃度の化合物を添加した培地を加え、さらに２４時間培養した。その後、培地を除去し、５００μｌＰＢＳで洗浄した後、５０μｌの１ｘ Glo Lysis buffer（Promega #E2661）で細胞を溶解した。この内、５μｌをルシフェラーゼ活性測定に、５μｌをタンパク質濃度測定に用いた。ルシフェラーゼ活性はセレンテラジンｈ（FUJIFILM #035-22991）の発光を検出することでＲｌｕｃの発現量を定量し、また、タンパク質濃度はＢＣＡ法を用いて定量し、各ルシフェラーゼ活性はＲｌｕｃ／ＢＣＡ値で算出した。なお、発光検出、ＢＣＡ測定にはマルチラベルリーダー 2030 ARVOTM X（Perkin Elmer）を用いた。
【0102】
ウェスタンブロット
ＨＥＫ２９３Ａ細胞を６－ウェルプレートに５．０×１０５細胞／ウェルとなるように播種し、２４時間培養した。その後、培地交換によって各化合物群を処理し、３時間後に細胞を２ｍｌＰＢＳで洗浄したのち、２００μｌＲＩＰＡバッファーを用いて溶解した。溶解した細胞を超音波処理を用いて破砕し、遠心（２０，０００ｇ、１５分、４℃）し、上清を回収し、タンパク質濃度を定量した。それらの溶解液を等量に合わせた後、１ｘＳＤＳサンプルバッファーを加え、９５℃で３分間熱処理した物をＳＤＳ－ＰＡＧＥのサンプルとして用いた（１レーンあたり５μｇのタンパク質）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥのゲルはスーパーセップＴＭエース５－２０％，１７ウェル（Wako）のゲルを用い、ゲル１枚あたり
５００Ｖ、４０ｍＡ、３５分間の条件下で電気泳動を行った。その後、ブロッキング装置（ATTO）を用いてゲル１枚あたり５００Ｖ、１００ｍＡ、６０分間の条件でＰＶＤＦメンブレンに転写した。転写後のメンブレンをブロッキング溶液（３％ＢＳＡ／ＴＢＳ－Ｔ）を用いて室温で３０分間浸透し、一次抗体の反応は、ブロッキング溶液に一次抗体（Phospho-PKC Substrate Motif [(R/K)XpSX(R/K)] MultiMabTM Rabbit mAb mix, Cell Signaling Technology #6967)）を３０００倍希釈の条件下、４℃で一晩で行った。その後、ＴＢＳ－Ｔを用いてメンブレンを３回洗浄し、二次抗体反応を、ＴＢＳ－Ｔ中にＨＲＰ標識二次抗体（Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey, Cytiva #NA934-1ML）を５０００倍希釈の条件下、室温で３時間行った。その後、ＴＢＳＴを用いてメンブレンを３回洗浄し、Chemi-Lumi One（nacalai #07880-70）と ImageQuant LAS4010 を用いて検出を行った。
ＨＥＫ２９３Ａ細胞を６－ウェルプレートに５．０×１０５細胞／ウェルとなるように播種し、２４時間培養した。その後、培地交換によって各化合物群を処理し、３時間後に細胞を２ｍｌＰＢＳで洗浄したのち、２００μｌＲＩＰＡバッファーを用いて溶解した。溶解した細胞を超音波処理を用いて破砕し、遠心（２０，０００ｇ、１５分、４℃）し、上清を回収し、タンパク質濃度を定量した。それらの溶解液を等量に合わせた後、１ｘＳＤＳサンプルバッファーを加え、９５℃で３分間熱処理した物をＳＤＳ－ＰＡＧＥのサンプルとして用いた（１レーンあたり５μｇのタンパク質）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥのゲルはスーパーセップＴＭエース５－２０％，１７ウェル（Wako）のゲルを用い、ゲル１枚あたり
５００Ｖ、４０ｍＡ、３５分間の条件下で電気泳動を行った。その後、ブロッキング装置（ATTO）を用いてゲル１枚あたり５００Ｖ、１００ｍＡ、６０分間の条件でＰＶＤＦメンブレンに転写した。転写後のメンブレンをブロッキング溶液（３％ＢＳＡ／ＴＢＳ－Ｔ）を用いて室温で３０分間浸透し、一次抗体の反応は、ブロッキング溶液に一次抗体（Phospho-PKC Substrate Motif [(R/K)XpSX(R/K)] MultiMabTM Rabbit mAb mix, Cell Signaling Technology #6967)）を３０００倍希釈の条件下、４℃で一晩で行った。その後、ＴＢＳ－Ｔを用いてメンブレンを３回洗浄し、二次抗体反応を、ＴＢＳ－Ｔ中にＨＲＰ標識二次抗体（Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey, Cytiva #NA934-1ML）を５０００倍希釈の条件下、室温で３時間行った。その後、ＴＢＳＴを用いてメンブレンを３回洗浄し、Chemi-Lumi One（nacalai #07880-70）と ImageQuant LAS4010 を用いて検出を行った。
【0103】
ＥＬＩＳＡ法
各分泌タンパク質発現細胞を２４ウェルプレートに１．０×１０４細胞／ウェルとなるように播種し、２４時間培養した。その後、１ｍｌ／ウェルの条件で培地交換によって各化合物群を処理し、２４時間ごとに培地を１２０μｌ回収、冷蔵保存した。その後、各ＥＬＩＳＡキット（マウスIgG, Betyl Lab #E99-131, ヒトプロインスリン: Mercodia #10-1118-01, ヒトレプチン: Proteintech #KE00095）を用いて培地中の目的タンパク質の濃度を測定した。測定にはマルチラベルリーダー2030 ARVOTM X（Perkin Elmer）を用いた。
各分泌タンパク質発現細胞を２４ウェルプレートに１．０×１０４細胞／ウェルとなるように播種し、２４時間培養した。その後、１ｍｌ／ウェルの条件で培地交換によって各化合物群を処理し、２４時間ごとに培地を１２０μｌ回収、冷蔵保存した。その後、各ＥＬＩＳＡキット（マウスIgG, Betyl Lab #E99-131, ヒトプロインスリン: Mercodia #10-1118-01, ヒトレプチン: Proteintech #KE00095）を用いて培地中の目的タンパク質の濃度を測定した。測定にはマルチラベルリーダー2030 ARVOTM X（Perkin Elmer）を用いた。
【0104】
化合物
下表の化合物を使用した。
下表の化合物を使用した。
【表1】
【0105】
試験１：ＣＭＶプロモーターの転写活性を増強する化合物の同定
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＣＭＶプロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を挿入したプラスミドを２４－ウェルプレートの１ウェルあたり２０ｎｇでトランスフェクションし、２４時間後に３０μｇ／ｍｌの植物エキスを含んだ培地に培地交換した。その後、２４時間後にルシフェラーゼアッセイを用いて、ＣＭＶプロモーター活性を測定した。本研究では約１０００種類の植物エキスを用いた。独自の植物（生薬原料）エキスライブラリーから、ＣＭＶプロモーターの転写活性を劇的に増強する５種類の植物エキスおよびその活性を担う化合物（下記の８種類）を同定した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＣＭＶプロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を挿入したプラスミドを２４－ウェルプレートの１ウェルあたり２０ｎｇでトランスフェクションし、２４時間後に３０μｇ／ｍｌの植物エキスを含んだ培地に培地交換した。その後、２４時間後にルシフェラーゼアッセイを用いて、ＣＭＶプロモーター活性を測定した。本研究では約１０００種類の植物エキスを用いた。独自の植物（生薬原料）エキスライブラリーから、ＣＭＶプロモーターの転写活性を劇的に増強する５種類の植物エキスおよびその活性を担う化合物（下記の８種類）を同定した。
【化6】
【0106】
試験２：化合物の活性はプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の阻害剤により阻害される
ｐＲＬ－ＣＭＶを恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を、図１に示す濃度で化合物Ｘまたは化合物＃１～＃７を含む培地中、ＰＫＣ阻害剤の存在下または非存在下で２４時間培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図１に示す。ＣＭＶプロモーターの転写活性は、化合物の存在下で増強され、その増強はＰＫＣ阻害剤により阻害された。
ｐＲＬ－ＣＭＶを恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を、図１に示す濃度で化合物Ｘまたは化合物＃１～＃７を含む培地中、ＰＫＣ阻害剤の存在下または非存在下で２４時間培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図１に示す。ＣＭＶプロモーターの転写活性は、化合物の存在下で増強され、その増強はＰＫＣ阻害剤により阻害された。
【0107】
ｐＲＬ－ＣＭＶを恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を、化合物Ｘ（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地中で２４時間培養し、ルシフェラーゼ活性を経時的に測定した。結果を図２に示す。化合物ＸによるＣＭＶプロモーターの転写活性増強は、化合物Ｘ添加の１時間後から観察された。
【0108】
試験３：ＣＭＶプロモーターの活性は既知のＰＫＣ活性化剤によっても増強される
ｐＲＬ－ＣＭＶを恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を、図３に示す濃度で化合物ＸまたはＰＫＣ活性化剤＃１～＃４を含む培地中、ＰＫＣ阻害剤の存在下または非存在下で２４時間培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図３に示す。ＣＭＶプロモーターの転写活性は、既知のＰＫＣ活性化剤によっても増強された。
ｐＲＬ－ＣＭＶを恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を、図３に示す濃度で化合物ＸまたはＰＫＣ活性化剤＃１～＃４を含む培地中、ＰＫＣ阻害剤の存在下または非存在下で２４時間培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図３に示す。ＣＭＶプロモーターの転写活性は、既知のＰＫＣ活性化剤によっても増強された。
【0109】
化合物Ｘ、化合物＃１～＃７およびＰＫＣ活性化剤＃１～＃４は、テルペンに属し、ジテルペンと総称される化合物である。骨格により以下の３種類に分類される。
【化7】
【0110】
試験４：ＣＭＶプロモーターの活性はジテルペン以外のＰＫＣ活性化剤によっても増強される
ｐＲＬ－ＣＭＶを恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を、図４に示す濃度で化合物ＸまたはＰＫＣ活性化剤＃５～＃６を含む培地中、ＰＫＣ阻害剤（Ｒｏ－３１８４２５）の存在下または非存在下で２４時間培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図４に示す。ＣＭＶプロモーターの転写活性は、ジテルペン以外のＰＫＣ活性化剤によっても増強された。
ｐＲＬ－ＣＭＶを恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を、図４に示す濃度で化合物ＸまたはＰＫＣ活性化剤＃５～＃６を含む培地中、ＰＫＣ阻害剤（Ｒｏ－３１８４２５）の存在下または非存在下で２４時間培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図４に示す。ＣＭＶプロモーターの転写活性は、ジテルペン以外のＰＫＣ活性化剤によっても増強された。
【0111】
試験５：化合物はＣＡＧプロモーターおよびＥＦ１プロモーターの活性も増強する
ＨＥＫ２９３Ａ細胞に、ｐＣＡＧ－Ｒｌｕｃ、もしくはｐＥＦ１－Ｒｌｕｃをトランスフェクションし、図５～７に示す濃度で化合物Ｘ、化合物＃１～＃７またはＰＫＣ活性化剤＃１～＃６を含む培地中で培養し、ｐＣＡＧＧＳベクター由来のＣＡＧプロモーターおよびｐＥＦＢＯＳベクター由来のＥＦ１プロモーターの転写活性を測定した。結果を図５～７に示す。ＣＡＧプロモーターおよびＥＦ１プロモーターの転写活性は、化合物またはＰＫＣ活性化剤の存在下で増強されたが、その増強はＰＫＣ阻害剤により阻害された。これらのプロモーターは、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢ、ＹＹ１などの転写因子の結合部位を有する。従って、これらの化合物およびＰＫＣ活性化剤は、共通の転写因子を介してこれらのプロモーターを活性化することが示唆される。
ＨＥＫ２９３Ａ細胞に、ｐＣＡＧ－Ｒｌｕｃ、もしくはｐＥＦ１－Ｒｌｕｃをトランスフェクションし、図５～７に示す濃度で化合物Ｘ、化合物＃１～＃７またはＰＫＣ活性化剤＃１～＃６を含む培地中で培養し、ｐＣＡＧＧＳベクター由来のＣＡＧプロモーターおよびｐＥＦＢＯＳベクター由来のＥＦ１プロモーターの転写活性を測定した。結果を図５～７に示す。ＣＡＧプロモーターおよびＥＦ１プロモーターの転写活性は、化合物またはＰＫＣ活性化剤の存在下で増強されたが、その増強はＰＫＣ阻害剤により阻害された。これらのプロモーターは、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢ、ＹＹ１などの転写因子の結合部位を有する。従って、これらの化合物およびＰＫＣ活性化剤は、共通の転写因子を介してこれらのプロモーターを活性化することが示唆される。
【0112】
試験６：化合物群はＰＫＣを活性化する
ＨＥＫ２９３Ａ細胞を、試験２～５と同様の濃度で化合物Ｘ、化合物＃１～＃７、ＰＫＣ活性化剤＃１～＃６、化合物ＳＣまたは酪酸ナトリウム（ＳＢ）を含む培地中、ＰＫＣ阻害剤（３μＭ）の存在下または非存在下で３時間培養した。細胞を溶解し、ＰＫＣによってリン酸化されたタンパク質を特異的に認識する抗体を用いてウェスタンブロットを行った。結果を図８に示す。化合物Ｘ、化合物＃１～＃７およびＰＫＣ活性化剤＃１～＃６は、ＰＫＣを活性化した。化合物ＳＣおよび酪酸ナトリウムによるＰＫＣ活性化は確認されなかった。
ＨＥＫ２９３Ａ細胞を、試験２～５と同様の濃度で化合物Ｘ、化合物＃１～＃７、ＰＫＣ活性化剤＃１～＃６、化合物ＳＣまたは酪酸ナトリウム（ＳＢ）を含む培地中、ＰＫＣ阻害剤（３μＭ）の存在下または非存在下で３時間培養した。細胞を溶解し、ＰＫＣによってリン酸化されたタンパク質を特異的に認識する抗体を用いてウェスタンブロットを行った。結果を図８に示す。化合物Ｘ、化合物＃１～＃７およびＰＫＣ活性化剤＃１～＃６は、ＰＫＣを活性化した。化合物ＳＣおよび酪酸ナトリウムによるＰＫＣ活性化は確認されなかった。
【0113】
試験７：新たなＣＭＶプロモーター活性化剤の同定
ｐＲＬ－ＣＭＶを恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を、図９に示す濃度で化合物Ｘおよび／または化合物ＳＣを含む培地中、ＰＫＣ阻害剤の存在下または非存在下で２４時間培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図９に示す。ＣＭＶプロモーターの転写活性は、化合物ＳＣによっても増強されたが、この増強はＰＫＣ阻害剤により阻害されなかった。化合物Ｘと化合物ＳＣを併用すると転写活性はさらに増強された。
ｐＲＬ－ＣＭＶを恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を、図９に示す濃度で化合物Ｘおよび／または化合物ＳＣを含む培地中、ＰＫＣ阻害剤の存在下または非存在下で２４時間培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図９に示す。ＣＭＶプロモーターの転写活性は、化合物ＳＣによっても増強されたが、この増強はＰＫＣ阻害剤により阻害されなかった。化合物Ｘと化合物ＳＣを併用すると転写活性はさらに増強された。
【0114】
試験８：ＰＫＣ活性化剤、化合物ＳＣおよびヒストンデアセチラーゼ阻害剤の併用によりＣＭＶプロモーターの転写活性はさらに増強される
ｐＲＬ－ＣＭＶを恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を、図１０に示す濃度で化合物Ｘ、化合物ＳＣおよび／または酪酸ナトリウム（ＳＢ）を含む培地中で２４時間培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図１０に示す。ＣＭＶプロモーターの転写活性は、化合物Ｘ、化合物ＳＣおよび酪酸ナトリウムを併用すると最も高かった。同様の結果が化合物＃１～＃７およびＰＫＣ活性化剤＃１～＃６でも得られた（図１１および１２）。酪酸ナトリウムの代わりにヒストンデアセチラーゼ阻害剤のバルプロ酸、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ボリノスタット（ＳＡＨＡ）、アピシジン、エンチノスタット（ＭＳ－２７５）またはタセジナリン（ＣＩ９９４）を用いても、同様の結果が得られた（図１３）。
ｐＲＬ－ＣＭＶを恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を、図１０に示す濃度で化合物Ｘ、化合物ＳＣおよび／または酪酸ナトリウム（ＳＢ）を含む培地中で２４時間培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図１０に示す。ＣＭＶプロモーターの転写活性は、化合物Ｘ、化合物ＳＣおよび酪酸ナトリウムを併用すると最も高かった。同様の結果が化合物＃１～＃７およびＰＫＣ活性化剤＃１～＃６でも得られた（図１１および１２）。酪酸ナトリウムの代わりにヒストンデアセチラーゼ阻害剤のバルプロ酸、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ボリノスタット（ＳＡＨＡ）、アピシジン、エンチノスタット（ＭＳ－２７５）またはタセジナリン（ＣＩ９９４）を用いても、同様の結果が得られた（図１３）。
【0115】
試験９：ＰＫＣ活性化剤によるタンパク質生産の増加
ｐｃＤＮＡベクターのＣＭＶプロモーターの下流にマウスＩｇＧ抗体重鎖、マウスＩｇＧ抗体軽鎖、ヒトプロインスリンまたはヒトレプチンのｃＤＮＡを挿入し、発現コンストラクトを作製した。マウスＩｇＧ抗体およびヒトレプチンのコンストラクトをそれぞれＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクションした。ヒトプロインスリンのコンストラクトをＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクションし、ヒトプロインスリンを恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を作製した。図１４～１７に示す濃度で化合物Ｘ、化合物＃１～＃７、ＰＫＣ活性化剤＃１～＃６を含む培地中、化合物ＳＣまたは化合物ＳＣ＋酪酸ナトリウム（ＳＢ）の存在下または非存在下で細胞を２４時間培養し、培地中の各タンパク質の濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した。結果を図１４～１７に示す。さらに、化合物Ｘについて、マウスＩｇＧ抗体重鎖および軽鎖、ヒトプロインスリンまたはヒトレプチンを恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を用い、酪酸ナトリウム（ＳＢ）の存在下または非存在下で、２４時間毎に４日間にわたりタンパク質濃度を測定した。結果を図１８に示す。ＩｇＧ抗体、プロインスリンおよびレプチンの生産はこれらの化合物により増強された。ＩｇＧ抗体およびプロインスリンの生産は、これらの化合物と化合物ＳＣおよび酪酸ナトリウムを併用するとさらに増強された。レプチンの生産は、これらの化合物と化合物ＳＣを併用した場合に最も増強され、ＳＢの存在下では減少したが、いずれの物質も含まない培地で培養した場合よりは多かった。
ｐｃＤＮＡベクターのＣＭＶプロモーターの下流にマウスＩｇＧ抗体重鎖、マウスＩｇＧ抗体軽鎖、ヒトプロインスリンまたはヒトレプチンのｃＤＮＡを挿入し、発現コンストラクトを作製した。マウスＩｇＧ抗体およびヒトレプチンのコンストラクトをそれぞれＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクションした。ヒトプロインスリンのコンストラクトをＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクションし、ヒトプロインスリンを恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を作製した。図１４～１７に示す濃度で化合物Ｘ、化合物＃１～＃７、ＰＫＣ活性化剤＃１～＃６を含む培地中、化合物ＳＣまたは化合物ＳＣ＋酪酸ナトリウム（ＳＢ）の存在下または非存在下で細胞を２４時間培養し、培地中の各タンパク質の濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した。結果を図１４～１７に示す。さらに、化合物Ｘについて、マウスＩｇＧ抗体重鎖および軽鎖、ヒトプロインスリンまたはヒトレプチンを恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を用い、酪酸ナトリウム（ＳＢ）の存在下または非存在下で、２４時間毎に４日間にわたりタンパク質濃度を測定した。結果を図１８に示す。ＩｇＧ抗体、プロインスリンおよびレプチンの生産はこれらの化合物により増強された。ＩｇＧ抗体およびプロインスリンの生産は、これらの化合物と化合物ＳＣおよび酪酸ナトリウムを併用するとさらに増強された。レプチンの生産は、これらの化合物と化合物ＳＣを併用した場合に最も増強され、ＳＢの存在下では減少したが、いずれの物質も含まない培地で培養した場合よりは多かった。
【0116】
試験１０：遺伝子工学的ＰＫＣ活性化によるＣＭＶプロモーターの活性化
遺伝子工学的にＰＫＣを活性化して、ＣＭＶプロモーターの転写活性を調べた。ＣＭＶプロモーターの下流に、タンパク質のｃＤＮＡ（ＸＸＸ）、ＩＲＥＳおよび活性化型ＰＫＣのｃＤＮＡを連結した発現コンストラクトを使用した。活性化型ＰＫＣとして、ヒトＰＫＣδの３３４－６９５アミノ酸領域（ＰＫＣδ－ＣＡ）、ヒトＰＫＣαの３２６－６７２アミノ酸領域の４８９番目のメチオニンをバリンに変えた恒常的活性化体（ＰＫＣαＣＡ－Ｍ４８９Ｖ）を使用した。またＸＸＸにはＲｌｕｃ、マウスＩｇＧ抗体（重鎖、軽鎖）、およびヒトレプチン遺伝子を挿入した。これらのコンストラクトの模式図を図１９に示す。
遺伝子工学的にＰＫＣを活性化して、ＣＭＶプロモーターの転写活性を調べた。ＣＭＶプロモーターの下流に、タンパク質のｃＤＮＡ（ＸＸＸ）、ＩＲＥＳおよび活性化型ＰＫＣのｃＤＮＡを連結した発現コンストラクトを使用した。活性化型ＰＫＣとして、ヒトＰＫＣδの３３４－６９５アミノ酸領域（ＰＫＣδ－ＣＡ）、ヒトＰＫＣαの３２６－６７２アミノ酸領域の４８９番目のメチオニンをバリンに変えた恒常的活性化体（ＰＫＣαＣＡ－Ｍ４８９Ｖ）を使用した。またＸＸＸにはＲｌｕｃ、マウスＩｇＧ抗体（重鎖、軽鎖）、およびヒトレプチン遺伝子を挿入した。これらのコンストラクトの模式図を図１９に示す。
【0117】
ｐｃＤＮＡベクターのＣＭＶプロモーターの下流に、ＲｌｕｃのｃＤＮＡ、ＩＲＥＳ、および、ＰＫＣδ－ＣＡまたはＰＫＣαＣＡ－Ｍ４８９ＶのｃＤＮＡを挿入し、発現コンストラクトを作製した。ＰＫＣを欠く対照のコンストラクトも作製した。これらのコンストラクトを６．２５～２００ｎｇ／ウェルの濃度でＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクションし、２４時間培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図２０に示す。ＰＫＣ群では、ルシフェラーゼ活性が高かった。この結果は、ＣＭＶプロモーターの転写活性がポジティブフィードバックにより増強されることを示す。ＩＲＥＳの代わりに２Ａ自己切断ペプチド配列であるＰ２Ａペプチド配列を用いた発現コンストラクトでも、同様の結果が得られた（図２１）。
【0118】
ｐｃＤＮＡベクターのＣＭＶプロモーターの下流に、マウスＩｇＧ抗体重鎖または軽鎖のｃＤＮＡ、ＩＲＥＳ、および、ＰＫＣδ－ＣＡまたはＰＫＣαＣＡ－Ｍ４８９ＶのｃＤＮＡを挿入し、発現コンストラクトを作製した。ＰＫＣを欠く対照のコンストラクトも作製した。ＩｇＧ抗体重鎖および軽鎖のコンストラクトを組み合わせて、１００ｎｇ／ウェルの濃度でＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクションし、２４時間培養し、培地中のＩｇＧ抗体の濃度をＥＬＩＳＡ法により２４時間毎に４日間にわたって測定した。結果を図２２に示す。ＰＫＣ群では、ＩｇＧ抗体の生産が増強された。この結果は、遺伝子工学的ＰＫＣ活性化により、ＣＭＶプロモーターを活性化し、タンパク質生産を増強できることを示す。
【0119】
ｐｃＤＮＡベクターのＣＭＶプロモーターの下流に、ヒトレプチンのｃＤＮＡ、ＩＲＥＳ、および、ＰＫＣαＣＡ－Ｍ４８９ＶのｃＤＮＡを挿入し、発現コンストラクトを作製した。ＰＫＣを欠く対照のコンストラクトも作製した。これらのコンストラクトを１００ｎｇ／ウェルの濃度でＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクションし、２４時間培養し、培地中のレプチンの濃度をＥＬＩＳＡ法により４日間にわたって測定した。結果を図２３に示す。ＰＫＣ群では、レプチンの生産が増強された。この結果は、遺伝子工学的ＰＫＣ活性化により、ＣＭＶプロモーターを活性化し、タンパク質生産を増強できることを示す。
【0120】
試験１１：化合物ＳＣの標的タンパク質の探索
化合物ＳＣを含む下記の構造を有するナフタレンスルホンアミド誘導体について、化合物Ｘとの相乗効果を調べた。
化合物ＳＣを含む下記の構造を有するナフタレンスルホンアミド誘導体について、化合物Ｘとの相乗効果を調べた。
【表2】
【0121】
ｐＲＬ－ＣＭＶを恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を、いずれかのナフタレンスルホンアミド誘導体を図２４に示す濃度で含む培地中、化合物Ｘ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で２４時間培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図２４に示す。ＣＭＶプロモーターの転写活性は、ナフタレンスルホンアミド誘導体のみでは変化しなかったが、ナフタレンスルホンアミド誘導体を化合物Ｘと併用すると増強された。ナフタレンスルホンアミド誘導体Ｗ－７はカルモジュリン阻害剤として利用されており、化合物ＳＣおよびＳＣ－９もカルモジュリン阻害剤として作用し、化合物Ｘとの相乗効果を示していると考えられる。
【0122】
試験１２：ＰＫＣ活性化剤および遺伝子工学的ＰＭＬ発現によりＣＭＶプロモーターの転写活性は増強される
ｐｃＤＮＡベクターのＣＭＶプロモーターの下流に、ＲｌｕｃのｃＤＮＡ、ＩＲＥＳ、および、野生型ＰＭＬまたは欠損変異型ＰＭＬ（ＰＭＬΔ１～１０またはＰＭＬ－Ｒｉｎｇ）のｃＤＮＡを挿入し、発現コンストラクトを作製した（図２５）。野生型ＰＭＬおよびＰＭＬΔ１～１０のコンストラクトをＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクションし、化合物Ｘの存在下または非存在下で２４時間培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図２６に示す。野生型ＰＭＬ、ＰＭＬΔ１およびＰＭＬΔ６～１０を導入された細胞では、対照（－）の細胞と比較して、化合物Ｘ存在下のルシフェラーゼ活性が高かった。この結果は、ＰＭＬが化合物Ｘにより増強されるＣＭＶプロモーターの転写活性をさらに増強し、ＰＭＬの第１位～第４６位を含むＰｒｏ領域がその活性を担うことを示唆する。また、野生型ＰＭＬ、ＰＭＬΔ１およびＰＭＬΔ６～１０を導入された細胞では、化合物Ｘの非存在下でも、ルシフェラーゼ活性が対照（－）の細胞と比較して高かった。
ｐｃＤＮＡベクターのＣＭＶプロモーターの下流に、ＲｌｕｃのｃＤＮＡ、ＩＲＥＳ、および、野生型ＰＭＬまたは欠損変異型ＰＭＬ（ＰＭＬΔ１～１０またはＰＭＬ－Ｒｉｎｇ）のｃＤＮＡを挿入し、発現コンストラクトを作製した（図２５）。野生型ＰＭＬおよびＰＭＬΔ１～１０のコンストラクトをＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクションし、化合物Ｘの存在下または非存在下で２４時間培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図２６に示す。野生型ＰＭＬ、ＰＭＬΔ１およびＰＭＬΔ６～１０を導入された細胞では、対照（－）の細胞と比較して、化合物Ｘ存在下のルシフェラーゼ活性が高かった。この結果は、ＰＭＬが化合物Ｘにより増強されるＣＭＶプロモーターの転写活性をさらに増強し、ＰＭＬの第１位～第４６位を含むＰｒｏ領域がその活性を担うことを示唆する。また、野生型ＰＭＬ、ＰＭＬΔ１およびＰＭＬΔ６～１０を導入された細胞では、化合物Ｘの非存在下でも、ルシフェラーゼ活性が対照（－）の細胞と比較して高かった。
【0123】
また、ＰＭＬΔ９またはＰＭＬ－Ｒｉｎｇを含むコンストラクトをＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクションし、化合物Ｘ、ＳＢ、化合物ＳＣまたはこれらの組合せの存在下または非存在下で２４時間培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図２７に示す。ＰＭＬΔ９またはＰＭＬ－Ｒｉｎｇを導入された細胞では、対照（Ｍｏｃｋ）の細胞と比較して、いずれの条件でもルシフェラーゼ活性が高かった。この結果は、ＰＭＬの第４７位～第１０６位を含むＲＩＮＧ領域も、化合物Ｘにより増強されるＣＭＶプロモーターの転写活性をさらに増強することを示唆する。また、ＰＭＬΔ９またはＰＭＬ－Ｒｉｎｇを導入された細胞では、化合物Ｘの非存在下でも、ルシフェラーゼ活性が対照（－）の細胞と比較して高かった。
【0124】
試験１３：ＰＫＣ活性化剤およびＲＩＮＧ領域を含むペプチドの遺伝子工学的発現によりＣＭＶプロモーターの転写活性は増強される
ＲＩＮＧ領域は、各種のタンパク質間で共通の配列を有する。ＰＭＬのＲＩＮＧ領域のアミノ酸配列をＢＬＡＳＴ解析し、類似の配列を有するタンパク質として図２８に示すタンパク質を同定した。これらのタンパク質のＲＩＮＧ領域において、いくつかのシステイン残基およびヒスチジン残基に高い保存性が見られた。ＰＭＬのＲＩＮＧ領域との類似性の程度が異なるタンパク質をいくつか選択し、以下の解析に用いた。
ＲＩＮＧ領域は、各種のタンパク質間で共通の配列を有する。ＰＭＬのＲＩＮＧ領域のアミノ酸配列をＢＬＡＳＴ解析し、類似の配列を有するタンパク質として図２８に示すタンパク質を同定した。これらのタンパク質のＲＩＮＧ領域において、いくつかのシステイン残基およびヒスチジン残基に高い保存性が見られた。ＰＭＬのＲＩＮＧ領域との類似性の程度が異なるタンパク質をいくつか選択し、以下の解析に用いた。
【0125】
ｐｃＤＮＡベクターのＣＭＶプロモーターの下流に、ＲｌｕｃのｃＤＮＡ、ＩＲＥＳ、および、ＰＭＬ、ＴＲＩＭ３、ＴＲＩＭ５６、ＣＯＰＩ、Ｐｅｘ１０、ＢＲＣＡ１またはＨＴＬＦのＲＩＮＧ領域のｃＤＮＡを挿入し、発現コンストラクトを作製した（図２９）。これらの発現コンストラクトをＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクションし、化合物Ｘの存在下または非存在下で２４時間培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図３０に示す。ＲＩＮＧ領域を導入された細胞では、対照（－）の細胞と比較して、化合物Ｘ存在下のルシフェラーゼ活性が高かった。この結果は、各種タンパク質のＲＩＮＧ領域が、化合物Ｘにより増強されるＣＭＶプロモーターの転写活性をさらに増強することを示唆する。また、ＲＩＮＧ領域を導入された細胞では、化合物Ｘの非存在下でも、対照（－）の細胞と比較してルシフェラーゼ活性が高かった。
【0126】
試験１４：ＰＭＬによるＣＭＶプロモーターの転写活性増強はｍＲＮＡの発現に依存する
ｐｃＤＮＡベクターのＣＭＶプロモーターの下流に、ＲｌｕｃのｃＤＮＡ、ＩＲＥＳ、および、野生型ＰＭＬまたは欠損変異型ＰＭＬ（ＰＭＬΔ９、第２位に停止コドンが導入されたＰＭＬΔ９、または、第７位に停止コドンが導入されたＰＭＬΔ９）のｃＤＮＡを挿入し、発現コンストラクトを作製した（図３１左）。また、ｐｃＤＮＡベクターのＣＭＶプロモーターの下流に、ＲｌｕｃのｃＤＮＡ、および、野生型ＰＭＬまたは欠損変異型ＰＭＬ（ＰＭＬΔ９、ＰＭＬΔ１０またはＰＭＬ－ＲＩＮＧ）のｃＤＮＡを挿入し、発現コンストラクトを作製した（図３１右）。これらのコンストラクトを細胞に導入すると、ＰＭＬのｍＲＮＡは転写されるが、タンパク質には翻訳されない。これらのコンストラクトをＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクションし、化合物Ｘの存在下または非存在下で２４時間培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図３２に示す。いずれのコンストラクトでも、化合物Ｘの存在下および非存在下で、対照よりも高いルシフェラーゼ活性が見られた。この結果は、ＰＭＬによるＣＭＶプロモーターの転写活性増強は、ＰＭＬのタンパク質ではなく、ＰＭＬのＰｒｏ領域またはＲＩＮＧ領域をコードするｍＲＮＡの発現に依存することを示唆する。
ｐｃＤＮＡベクターのＣＭＶプロモーターの下流に、ＲｌｕｃのｃＤＮＡ、ＩＲＥＳ、および、野生型ＰＭＬまたは欠損変異型ＰＭＬ（ＰＭＬΔ９、第２位に停止コドンが導入されたＰＭＬΔ９、または、第７位に停止コドンが導入されたＰＭＬΔ９）のｃＤＮＡを挿入し、発現コンストラクトを作製した（図３１左）。また、ｐｃＤＮＡベクターのＣＭＶプロモーターの下流に、ＲｌｕｃのｃＤＮＡ、および、野生型ＰＭＬまたは欠損変異型ＰＭＬ（ＰＭＬΔ９、ＰＭＬΔ１０またはＰＭＬ－ＲＩＮＧ）のｃＤＮＡを挿入し、発現コンストラクトを作製した（図３１右）。これらのコンストラクトを細胞に導入すると、ＰＭＬのｍＲＮＡは転写されるが、タンパク質には翻訳されない。これらのコンストラクトをＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクションし、化合物Ｘの存在下または非存在下で２４時間培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図３２に示す。いずれのコンストラクトでも、化合物Ｘの存在下および非存在下で、対照よりも高いルシフェラーゼ活性が見られた。この結果は、ＰＭＬによるＣＭＶプロモーターの転写活性増強は、ＰＭＬのタンパク質ではなく、ＰＭＬのＰｒｏ領域またはＲＩＮＧ領域をコードするｍＲＮＡの発現に依存することを示唆する。
【0127】
試験１５：ウイルスベクターの製造
材料と方法
コンストラクト
レトロウイルスベクターには、ｐＱＣＸＩＮベクター（TaKaRa #631514）のマルチクローニングサイトにＧＦＰ遺伝子を挿入したコンストラクトを作製した。また、エンベロープタンパク質を発現するベクターとしてｐｃＤＮＡ－ＶＳＶ－Ｇ（水疱性口内炎ウイルスのＧ糖タンパク質）を用いた。
レンチウイルスベクターには、ｐＬＶＳＩＮ－ＣＭＶ Ｐｕｒベクター（TaKaRa #6183）のマルチクローニングサイトにＧＦＰ遺伝子を挿入したコンストラクトを作製した。また、エンベロープタンパク質を発現するベクターとしてｐｃＤＮＡ－ＶＳＶ－Ｇを、ウイルス産生に必要な構造遺伝子（ｇａｇ，ｐｏｌ）を発現するベクターとしてｐｓＰＡＸ２（Addgene #12260）を用いた。
アデノウイルスベクターには、ｐＡｄ／ＤＥＳＴ／ＣＭＶ／Ｖ５－ＤＥＳＴ Ｇａｔｅｗａｙベクター（Invitrogen #V49320）にＧＦＰを挿入したベクターを作製し、制限酵素ＰａｃＩで酵素処理したものを精製した後に用いた。
アデノ随伴ウイルスベクターには、ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－ＰＩ－ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｂＧＨ（Addgene #105530）とｐＡＡＶ－２／９ｎ（Addgene #112865）、ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（Addgene #112867）を用いた。
材料と方法
コンストラクト
レトロウイルスベクターには、ｐＱＣＸＩＮベクター（TaKaRa #631514）のマルチクローニングサイトにＧＦＰ遺伝子を挿入したコンストラクトを作製した。また、エンベロープタンパク質を発現するベクターとしてｐｃＤＮＡ－ＶＳＶ－Ｇ（水疱性口内炎ウイルスのＧ糖タンパク質）を用いた。
レンチウイルスベクターには、ｐＬＶＳＩＮ－ＣＭＶ Ｐｕｒベクター（TaKaRa #6183）のマルチクローニングサイトにＧＦＰ遺伝子を挿入したコンストラクトを作製した。また、エンベロープタンパク質を発現するベクターとしてｐｃＤＮＡ－ＶＳＶ－Ｇを、ウイルス産生に必要な構造遺伝子（ｇａｇ，ｐｏｌ）を発現するベクターとしてｐｓＰＡＸ２（Addgene #12260）を用いた。
アデノウイルスベクターには、ｐＡｄ／ＤＥＳＴ／ＣＭＶ／Ｖ５－ＤＥＳＴ Ｇａｔｅｗａｙベクター（Invitrogen #V49320）にＧＦＰを挿入したベクターを作製し、制限酵素ＰａｃＩで酵素処理したものを精製した後に用いた。
アデノ随伴ウイルスベクターには、ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－ＰＩ－ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｂＧＨ（Addgene #105530）とｐＡＡＶ－２／９ｎ（Addgene #112865）、ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（Addgene #112867）を用いた。
【0128】
【0129】
細胞
Ｐｌａｔ－Ｅ細胞株（コスモバイオ #RV-101）、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞株（TaKaRa #Z2180N）は１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地を用いて３７℃、５％ＣＯ２、湿度９０％の条件下で培養した。
Ｐｌａｔ－Ｅ細胞株（コスモバイオ #RV-101）、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞株（TaKaRa #Z2180N）は１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地を用いて３７℃、５％ＣＯ２、湿度９０％の条件下で培養した。
【0130】
トランスフェクション
Ｐｌａｔ－Ｅ細胞、もしくはＬｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートに２．０×１０６細胞／ウェルとなるように播種し、２４時間培養した。１ウェルあたり２～５μｇのコンストラクト、１２μｌ－ＰＥＩ－Ｍａｘを１００μｌのＤＭＥＭで調整し、細胞を培養した６ウェルプレートの各ウェルに添加し、３７℃で２４時間培養することでトランスフェクションを行った。
Ｐｌａｔ－Ｅ細胞、もしくはＬｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートに２．０×１０６細胞／ウェルとなるように播種し、２４時間培養した。１ウェルあたり２～５μｇのコンストラクト、１２μｌ－ＰＥＩ－Ｍａｘを１００μｌのＤＭＥＭで調整し、細胞を培養した６ウェルプレートの各ウェルに添加し、３７℃で２４時間培養することでトランスフェクションを行った。
【0131】
ウイルス液の回収および調整
トランスフェクションから２４時間後にウェルから培地を除去し、各濃度の化合物を添加した培地を加え、さらに４８時間培養した。その後、培地を回収し、シリンジフィルター（孔径０．４５μｍ）を通した後、レトロウイルスとアデノ随伴ウイルスの培地にはRetro-X Concentrator（TaKaRa #631455）を、レンチウイルスとアデノウイルスの培地にはLenti-X Concentrator（TaKaRa #631231）を適量加え、４℃で一晩静置した。その後、遠心処理（１，５００ｇ、４５分、４℃）を行い、沈殿画分をウイルス培地に懸濁し濃縮したウイルス溶液とした。
トランスフェクションから２４時間後にウェルから培地を除去し、各濃度の化合物を添加した培地を加え、さらに４８時間培養した。その後、培地を回収し、シリンジフィルター（孔径０．４５μｍ）を通した後、レトロウイルスとアデノ随伴ウイルスの培地にはRetro-X Concentrator（TaKaRa #631455）を、レンチウイルスとアデノウイルスの培地にはLenti-X Concentrator（TaKaRa #631231）を適量加え、４℃で一晩静置した。その後、遠心処理（１，５００ｇ、４５分、４℃）を行い、沈殿画分をウイルス培地に懸濁し濃縮したウイルス溶液とした。
【0132】
ウイルス感染細胞数の計測
ＨＥＫ２９３Ａ細胞を２４－ウェルプレートに１．０×１０５細胞／ウェルとなるように播種し、２４時間培養した。その後、培地交換によって濃縮したウイルス液を処理し、４８時間、ウイルスの感染をおこなった。その後、培地交換時に Hoechst 33258（Wako #343-07961）を処理することで核ＤＮＡの染色を行った。ＣＯ２インキュベーター内で３０分以上静置した後、オールインワン蛍光顕微鏡（キーエンス BZ-X810）を用いてＧＦＰとHoechst 33258像の写真を撮影し、その後、（ＧＦＰ陽性細胞数／Hoechst 33258陽性細胞数）を用いて、ウイルス感染細胞数の割合を計測した。
ＨＥＫ２９３Ａ細胞を２４－ウェルプレートに１．０×１０５細胞／ウェルとなるように播種し、２４時間培養した。その後、培地交換によって濃縮したウイルス液を処理し、４８時間、ウイルスの感染をおこなった。その後、培地交換時に Hoechst 33258（Wako #343-07961）を処理することで核ＤＮＡの染色を行った。ＣＯ２インキュベーター内で３０分以上静置した後、オールインワン蛍光顕微鏡（キーエンス BZ-X810）を用いてＧＦＰとHoechst 33258像の写真を撮影し、その後、（ＧＦＰ陽性細胞数／Hoechst 33258陽性細胞数）を用いて、ウイルス感染細胞数の割合を計測した。
【0133】
結果
（１）ＣＭＶプロモーター活性化化合物によるレトロウイルスベクター産生増強
６ウェルプレートにＰｌａｔ－Ｅ細胞を２．０×１０６細胞／ウェルとなるように播種し、２４時間培養した後、ｐＱＣＸＩＮベクターのマルチクローニングサイトにＧＦＰ遺伝子を挿入したコンストラクトを１ウェルあたり１．５μｇ、ｐｃＤＮＡ－ＶＳＶ－Ｇを０．４μｇ、トランスフェクションを行った。その後、２４時間後に培地交換を行い、各化合物（化合物Ｘ：１００ｎｇ／ｍｌ、ソジウムブチレイト（ＳＢ）：２ｍＭ、化合物ＳＣ：５μｇ／ｍｌ）を添加し、４８時間培養した。その後、培地からウイルスを回収・濃縮し、４００μｌの１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地へと懸濁した。その懸濁液を原液でＨＥＫ２９３Ａ細胞へと感染させ、４８時間後にHoechst 33258を処理することで核ＤＮＡを染色し、写真撮影を行なった。（ＧＦＰ陽性細胞数／Hoechst 33258陽性細胞数）を計測することで、ウイルス感染細胞数の割合を計測した。化合物Ｘ処理、または化合物ＸとＳＢ、化合物ＸとＳＢと化合物ＳＣの処理により、ＧＦＰ陽性細胞数（ウイルス感染細胞数）の劇的な増加が確認された（図３３）。
（１）ＣＭＶプロモーター活性化化合物によるレトロウイルスベクター産生増強
６ウェルプレートにＰｌａｔ－Ｅ細胞を２．０×１０６細胞／ウェルとなるように播種し、２４時間培養した後、ｐＱＣＸＩＮベクターのマルチクローニングサイトにＧＦＰ遺伝子を挿入したコンストラクトを１ウェルあたり１．５μｇ、ｐｃＤＮＡ－ＶＳＶ－Ｇを０．４μｇ、トランスフェクションを行った。その後、２４時間後に培地交換を行い、各化合物（化合物Ｘ：１００ｎｇ／ｍｌ、ソジウムブチレイト（ＳＢ）：２ｍＭ、化合物ＳＣ：５μｇ／ｍｌ）を添加し、４８時間培養した。その後、培地からウイルスを回収・濃縮し、４００μｌの１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地へと懸濁した。その懸濁液を原液でＨＥＫ２９３Ａ細胞へと感染させ、４８時間後にHoechst 33258を処理することで核ＤＮＡを染色し、写真撮影を行なった。（ＧＦＰ陽性細胞数／Hoechst 33258陽性細胞数）を計測することで、ウイルス感染細胞数の割合を計測した。化合物Ｘ処理、または化合物ＸとＳＢ、化合物ＸとＳＢと化合物ＳＣの処理により、ＧＦＰ陽性細胞数（ウイルス感染細胞数）の劇的な増加が確認された（図３３）。
【0134】
（２）ＰＫＣ活性化剤によるレンチウイルスベクター産生増強
６ウェルプレートにＬｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞を２．０×１０６細胞／ウェルとなるように播種し、２４時間培養した後、ｐＬＶＳＩＮ－ＣＭＶＰｕｒベクターのマルチクローニングサイトにＧＦＰを挿入したコンストラクトを１ウェルあたり２μｇ、ｐｃＤＮＡ－ＶＳＶ－Ｇを０．６μｇ、ｐｓＰＡＮ２を１．６μｇ、トランスフェクションを行った。その後、２４時間後に培地交換を行い、各化合物（化合物Ｘ：１００ｎｇ／ｍｌ、ソジウムブチレイト（ＳＢ）：２ｍＭ、化合物ＳＣ：５μｇ／ｍｌ）を添加し、４８時間培養した。その後、培地からウイルスを回収・濃縮し、４００μｌの１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地へと懸濁した。その懸濁液を１００倍希釈した後にＨＥＫ２９３Ａ細胞へと感染させ、４８時間後にHoechst 33258を処理することで核ＤＮＡを染色し、写真撮影を行なった。（ＧＦＰ陽性細胞数／Hoechst 33258陽性細胞数）を計測することで、ウイルス感染細胞数の割合を計測した。化合物Ｘ処理、または化合物ＸとＳＢ、化合物ＸとＳＢと化合物ＳＣの処理により、ＧＦＰ陽性細胞数（ウイルス感染細胞数）の増加が確認された（図３４）。
６ウェルプレートにＬｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞を２．０×１０６細胞／ウェルとなるように播種し、２４時間培養した後、ｐＬＶＳＩＮ－ＣＭＶＰｕｒベクターのマルチクローニングサイトにＧＦＰを挿入したコンストラクトを１ウェルあたり２μｇ、ｐｃＤＮＡ－ＶＳＶ－Ｇを０．６μｇ、ｐｓＰＡＮ２を１．６μｇ、トランスフェクションを行った。その後、２４時間後に培地交換を行い、各化合物（化合物Ｘ：１００ｎｇ／ｍｌ、ソジウムブチレイト（ＳＢ）：２ｍＭ、化合物ＳＣ：５μｇ／ｍｌ）を添加し、４８時間培養した。その後、培地からウイルスを回収・濃縮し、４００μｌの１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地へと懸濁した。その懸濁液を１００倍希釈した後にＨＥＫ２９３Ａ細胞へと感染させ、４８時間後にHoechst 33258を処理することで核ＤＮＡを染色し、写真撮影を行なった。（ＧＦＰ陽性細胞数／Hoechst 33258陽性細胞数）を計測することで、ウイルス感染細胞数の割合を計測した。化合物Ｘ処理、または化合物ＸとＳＢ、化合物ＸとＳＢと化合物ＳＣの処理により、ＧＦＰ陽性細胞数（ウイルス感染細胞数）の増加が確認された（図３４）。
【0135】
（３）ＣＭＶプロモーター活性化化合物によるアデノウイルスベクター産生増強
６ウェルプレートにＬｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞を２．０×１０６細胞／ウェルとなるように播種し、２４時間培養した後、ＰａｃＩ処理したｐＡｄ／ＤＥＳＴ／ＣＭＶ／Ｖ５－ＤＥＳＴ GatewayベクターにＧＦＰを挿入したベクターを１ウェルあたり２μｇ、トランスフェクションを行った。その後、２４時間後に培地交換を行い、各化合物（化合物Ｘ：１００ｎｇ／ｍｌ、ソジウムブチレイト（ＳＢ）：２ｍＭ、化合物ＳＣ：５μｇ／ｍｌ）を添加し、４８時間培養した。その後、培地からウイルスを回収・濃縮し、４００μｌの１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地へと懸濁した。その懸濁液を３倍希釈した後にＨＥＫ２９３Ａ細胞へと感染させ、４８時間後にHoechst 33258を処理することで核ＤＮＡを染色し、写真撮影を行なった。（ＧＦＰ陽性細胞数／Hoechst 33258陽性細胞数）を計測することで、ウイルス感染細胞数の割合を計測した。化合物Ｘ処理、または化合物ＸとＳＢ、化合物ＸとＳＢと化合物ＳＣの処理により、ＧＦＰ陽性細胞数（ウイルス感染細胞数）の増加が確認された（図３５）。
６ウェルプレートにＬｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞を２．０×１０６細胞／ウェルとなるように播種し、２４時間培養した後、ＰａｃＩ処理したｐＡｄ／ＤＥＳＴ／ＣＭＶ／Ｖ５－ＤＥＳＴ GatewayベクターにＧＦＰを挿入したベクターを１ウェルあたり２μｇ、トランスフェクションを行った。その後、２４時間後に培地交換を行い、各化合物（化合物Ｘ：１００ｎｇ／ｍｌ、ソジウムブチレイト（ＳＢ）：２ｍＭ、化合物ＳＣ：５μｇ／ｍｌ）を添加し、４８時間培養した。その後、培地からウイルスを回収・濃縮し、４００μｌの１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地へと懸濁した。その懸濁液を３倍希釈した後にＨＥＫ２９３Ａ細胞へと感染させ、４８時間後にHoechst 33258を処理することで核ＤＮＡを染色し、写真撮影を行なった。（ＧＦＰ陽性細胞数／Hoechst 33258陽性細胞数）を計測することで、ウイルス感染細胞数の割合を計測した。化合物Ｘ処理、または化合物ＸとＳＢ、化合物ＸとＳＢと化合物ＳＣの処理により、ＧＦＰ陽性細胞数（ウイルス感染細胞数）の増加が確認された（図３５）。
【0136】
（４）ＣＭＶプロモーター活性化化合物によるアデノ随伴ウイルスベクター産生増強
６ウェルプレートにＬｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞を２．０×１０６細胞／ウェルとなるように播種し、２４時間培養した後、ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－ＰＩ－ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｂＧＨを１ウェルあたり１．５μｇ、ｐＡＡＶ－２／９ｎを１．５μｇ、ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６を１．５μｇ、トランスフェクションを行った。その後、２４時間後に培地交換を行い、各化合物（化合物Ｘ：１００ｎｇ／ｍｌ、ソジウムブチレイト（ＳＢ）：２ｍＭ、化合物ＳＣ：５μｇ／ｍｌ）を添加し、４８時間培養した。その後、培地からウイルスを回収・濃縮し、４００μｌの１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地へと懸濁した。その懸濁液を３倍希釈した後にＨＥＫ２９３Ａ細胞へと感染させ、４８時間後にHoechst 33258を処理することで核ＤＮＡを染色し、写真撮影を行なった。（ＧＦＰ陽性細胞数／Hoechst 33258陽性細胞数）を計測することで、ウイルス感染細胞数の割合を計測した。化合物Ｘ処理、または化合物ＸとＳＢ、化合物ＸとＳＢと化合物ＳＣの処理により、ＧＦＰ陽性細胞数（ウイルス感染細胞数）の増加が確認された（図３６）。
６ウェルプレートにＬｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞を２．０×１０６細胞／ウェルとなるように播種し、２４時間培養した後、ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－ＰＩ－ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｂＧＨを１ウェルあたり１．５μｇ、ｐＡＡＶ－２／９ｎを１．５μｇ、ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６を１．５μｇ、トランスフェクションを行った。その後、２４時間後に培地交換を行い、各化合物（化合物Ｘ：１００ｎｇ／ｍｌ、ソジウムブチレイト（ＳＢ）：２ｍＭ、化合物ＳＣ：５μｇ／ｍｌ）を添加し、４８時間培養した。その後、培地からウイルスを回収・濃縮し、４００μｌの１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地へと懸濁した。その懸濁液を３倍希釈した後にＨＥＫ２９３Ａ細胞へと感染させ、４８時間後にHoechst 33258を処理することで核ＤＮＡを染色し、写真撮影を行なった。（ＧＦＰ陽性細胞数／Hoechst 33258陽性細胞数）を計測することで、ウイルス感染細胞数の割合を計測した。化合物Ｘ処理、または化合物ＸとＳＢ、化合物ＸとＳＢと化合物ＳＣの処理により、ＧＦＰ陽性細胞数（ウイルス感染細胞数）の増加が確認された（図３６）。
【0137】
（５）ＣＭＶプロモーター活性化化合物とＰＫＣ阻害剤によるレトロウイルスベクター産生増強の変化
（１）と同様にＰｌａｔ－Ｅ細胞を用いてレトロウイルスベクターをトランスフェクションし、２４時間後に培地交換を行い、その際にＰＫＣ阻害剤Ｒｏ－３１８４２５、３μＭ有無の条件下で各活性化合物を添加し、４８時間培養した。その後、培地からウイルスを回収・濃縮し、４００μｌの１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地へと懸濁した。その懸濁液を原液でＨＥＫ２９３Ａ細胞へと感染させ、４８時間後にHoechst 33258を処理することで核ＤＮＡを染色し、写真撮影を行なった。（ＧＦＰ陽性細胞数／Hoechst 33258陽性細胞数）を計測することで、ウイルス感染細胞数の割合を計測した。活性化化合物群によるＧＦＰ陽性細胞数（ウイルス感染細胞数）の劇的な増加と、ＰＫＣ阻害剤による抑制が確認された（図３７）。
（１）と同様にＰｌａｔ－Ｅ細胞を用いてレトロウイルスベクターをトランスフェクションし、２４時間後に培地交換を行い、その際にＰＫＣ阻害剤Ｒｏ－３１８４２５、３μＭ有無の条件下で各活性化合物を添加し、４８時間培養した。その後、培地からウイルスを回収・濃縮し、４００μｌの１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地へと懸濁した。その懸濁液を原液でＨＥＫ２９３Ａ細胞へと感染させ、４８時間後にHoechst 33258を処理することで核ＤＮＡを染色し、写真撮影を行なった。（ＧＦＰ陽性細胞数／Hoechst 33258陽性細胞数）を計測することで、ウイルス感染細胞数の割合を計測した。活性化化合物群によるＧＦＰ陽性細胞数（ウイルス感染細胞数）の劇的な増加と、ＰＫＣ阻害剤による抑制が確認された（図３７）。
【0138】
（６）ＣＭＶプロモーター活性化化合物とＰＫＣ阻害剤によるウイルスベクター産生増強の変化
（５）と同様にＰｌａｔ－Ｅ細胞を用いてレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターをトランスフェクションし、２４時間後に培地交換を行い、その際にＰＫＣ阻害剤Ｒｏ－３１８４２５、３μＭ有無の条件下で各活性化合物を添加し、４８時間培養した。その後、培地からウイルスを回収・濃縮し、４００μｌの１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地へと懸濁した。その懸濁液をレトロウイルスは原液で、レンチウイルスは１００倍希釈した後、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターは３倍希釈した後、ＨＥＫ２９３Ａ細胞へと感染させ、４８時間後にHoechst 33258を処理することで核ＤＮＡを染色し、写真撮影を行なった。（ＧＦＰ陽性細胞数／Hoechst 33258陽性細胞数）を計測することで、ウイルス感染細胞数の割合を計測した。活性化化合物群によるＧＦＰ陽性細胞数（ウイルス感染細胞数）の劇的な増加と、ＰＫＣ阻害剤による抑制が確認された（図３８～図４１）。
（５）と同様にＰｌａｔ－Ｅ細胞を用いてレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターをトランスフェクションし、２４時間後に培地交換を行い、その際にＰＫＣ阻害剤Ｒｏ－３１８４２５、３μＭ有無の条件下で各活性化合物を添加し、４８時間培養した。その後、培地からウイルスを回収・濃縮し、４００μｌの１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地へと懸濁した。その懸濁液をレトロウイルスは原液で、レンチウイルスは１００倍希釈した後、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターは３倍希釈した後、ＨＥＫ２９３Ａ細胞へと感染させ、４８時間後にHoechst 33258を処理することで核ＤＮＡを染色し、写真撮影を行なった。（ＧＦＰ陽性細胞数／Hoechst 33258陽性細胞数）を計測することで、ウイルス感染細胞数の割合を計測した。活性化化合物群によるＧＦＰ陽性細胞数（ウイルス感染細胞数）の劇的な増加と、ＰＫＣ阻害剤による抑制が確認された（図３８～図４１）。
【産業上の利用可能性】
【0139】
本開示は、ウイルスベクターの生産量を高めることを可能にするため、バイオ医薬品の製造に利用できる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【配列表】