特開 2024-124284 ＡＩＭ２タンパク質の活性の抑制に用いられる化合物またはその派生製品

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024124284

(43)【公開日】2024-09-12

(54)【発明の名称】ＡＩＭ２タンパク質の活性の抑制に用いられる化合物またはその派生製品

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/12 20060101AFI20240905BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20240905BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240905BHJP

   C07K 14/47 20060101ALN20240905BHJP

   C12N 9/12 20060101ALN20240905BHJP

【ＦＩ】

A61K31/12 ZNA

A61P17/06

A61P43/00 111

C07K14/47

C12N9/12

【審査請求】有

【請求項の数】9

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023066347

(22)【出願日】2023-04-14

(31)【優先権主張番号】202310207413.6

(32)【優先日】2023-03-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(71)【出願人】

【識別番号】521557687

【氏名又は名称】孫 良丹

【氏名又は名称原語表記】ＳＵＮ Ｌｉａｎｇｄａｎ

【住所又は居所原語表記】２１８ Ｊｉｘｉ Ｒｏａｄ， Ｓｈｕｓｈａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｈｅｆｅｉ Ｃｉｔｙ， Ａｎｈｕｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ２３００２２， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】100205936

【弁理士】

【氏名又は名称】崔 海龍

(74)【代理人】

【識別番号】100132805

【弁理士】

【氏名又は名称】河合 貴之

(72)【発明者】

【氏名】孫 良丹

(72)【発明者】

【氏名】李 報

(72)【発明者】

【氏名】陳 微微

(72)【発明者】

【氏名】王 義睿

(72)【発明者】

【氏名】李 卓

(72)【発明者】

【氏名】甄 ▲き▼

【テーマコード（参考）】

4C206

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C206AA01

4C206AA02

4C206AA03

4C206CB14

4C206KA01

4C206MA01

4C206MA04

4C206MA33

4C206MA37

4C206MA48

4C206MA55

4C206MA57

4C206MA61

4C206MA72

4C206MA76

4C206MA77

4C206MA83

4C206MA86

4C206NA14

4C206ZA89

4C206ZC41

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA89

4H045EA60

(57)【要約】

【課題】この発明は、タンパク質抑制剤技術分野に属し、ＡＩＭ２タンパク質の活性抑制における化合物またはその医薬品誘導体の使用に関するものである。
【解決手段】この化合物は、従来の広域な免疫調整剤に比べて、より強力なターゲット作用を持ち、より正確で迅速かつ効果的で安全で安定している。また、人間由来のＡＩＭ２タンパク質およびマウス由来のタンパク質との結合力が非常に強く、結合定数はそれぞれＫＤ＝１．５６Ｅ^－６ＭおよびＫＤ＝５．１２Ｅ^－６Ｍに達し、従来の生物抑制剤と比較して保存が容易で、活性が安定しており、分子量が小さく、製造コストが低く、吸収が容易である。
【選択図】図９

【特許請求の範囲】

【請求項1】

化合物またはその医薬品誘導体はＡＩＭ２タンパク質の活性抑制に使用され、前記化合物は下記式Ｉ

【化1】

で表されることを特徴とする化合物またはその医薬品誘導体のＡＩＭ２タンパク質活性抑制における用途。

【請求項2】

前記化合物は医薬用塩の形態であることを特徴とする請求項１に記載の化合物またはその医薬品誘導体のＡＩＭ２タンパク質活性抑制における用途。

【請求項3】

前記化合物は医薬用酸付加塩の形態であることを特徴とする請求項２に記載の化合物またはその医薬品誘導体のＡＩＭ２タンパク質活性抑制における用途。

【請求項4】

化合物またはその医薬品誘導体はＡＩＭ２タンパク質の活性抑制のための薬剤の製造に使用され、前記化合物は下記式Ｉ

【化2】

で表されることを特徴とする化合物またはその医薬品誘導体でＡＩＭ２タンパク質活性抑制薬物を製造する方法。

【請求項5】

前記ＡＩＭ２タンパク質の活性抑制薬剤は乾癬病変組織のＡＩＭ２タンパク質活性を抑制するための薬剤であることを特徴とする請求項４に記載の化合物またはその医薬品誘導体でＡＩＭ２タンパク質活性抑制薬物を製造する方法。

【請求項6】

前記化合物は医薬用塩の形態であることを特徴とする請求項４または５に記載の化合物またはその医薬品誘導体でＡＩＭ２タンパク質活性抑制薬物を製造する方法。

【請求項7】

前記化合物は医薬用酸付加塩の形態であることを特徴とする請求項６に記載の化合物またはその医薬品誘導体でＡＩＭ２タンパク質活性抑制薬物を製造する方法。

【請求項8】

前記ＡＩＭ２タンパク質の活性抑制薬剤の剤型は、カプセル剤、錠剤、口服剤、微粒子剤、注射剤、栓剤、噴霧剤、または軟膏剤であることを特徴とする請求項４、５及び７のうちいずれか一項に記載の化合物またはその医薬品誘導体でＡＩＭ２タンパク質活性抑制薬物を製造する方法。

【請求項9】

前記ＡＩＭ２タンパク質の活性抑制薬剤の剤型は、カプセル剤、錠剤、口服剤、微粒子剤、注射剤、栓剤、噴霧剤、または軟膏剤であることを特徴とする請求項６に記載の化合物またはその医薬品誘導体でＡＩＭ２タンパク質活性抑制薬物を製造する方法。

【請求項10】

乾癬病の治療用医薬組成物であって、少なくとも式Ｉに示された化合物

【化3】

を含み、該医薬組成物は医薬用担体および／または希釈剤を含むことを特徴とする乾癬病の治療用医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、タンパク質抑制薬技術領域に属し、式Ｉで示される化合物またはその医薬品誘導体のＡＩＭ２タンパク質活性抑制における用途に関するものである。

【背景技術】

【0002】

乾癬は、世界的に見て、難治性で高い罹患率を持つ炎症免疫疾患であり、２０２１年現在、中国だけでも６５０万人以上がこの病気に苦しんでいる。しかし、現在の医療水準では完全に治療することができない。臨床的には、乾癬の治療法は多岐にわたるが、免疫系を広く抑制することで炎症症状を緩和しようとする手段が多く、ステロイドや免疫抑制剤の使用が含まれる。また、物理療法や漢方薬の使用もある。しかし、広範囲な対症療法は効果が低く、病気が再発したり、他の系統への損傷を引き起こす可能性があり、患者にとって心理的および経済的な負担をもたらすことがある。近年、乾癬の精密医療は、伝統的な治療方法の不足をある程度補うことになった。多くの生物製剤が、ＩＬ－１７、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２３などの下流効果分子を標的にして乾癬の表現型を消去しようとする努力をしている。

【0003】

従来の治療法と比較すると、生物製剤は一定期間内に乾癬患者の治癒率を異なる程度で増加させることができ、投与間隔も長く、依従性が高くなる傾向がある。しかし、従来の治療法と同じ欠点がある。現在市場にある乾癬治療のすべての生物製剤は、根本的には下流効果分子の効果を遮断することによって表現型を軽減する対症療法であり、生物製剤の使用を半年以上中止すると、乾癬の再発リスクが大幅に増加している。また、生物製剤の価格が高額であり、長期的な維持治療が必要なため、途中で効果が低下した場合は、多くの生物製剤を併用する必要があり、患者に大きな経済的負担をもたらすことがある。

【0004】

以上を総括すると、現在、乾癬治療に用いられる薬は、広範な免疫調節薬とターゲット薬の２つの主要なタイプに大別できる。広範な伝統的な免疫調節剤は、長期的な効果が理想的ではなく、バイオ製剤を代表とするターゲット薬は、ある程度伝統的な薬物療法の欠点を補うものの、価格が高く、適用基準が比較的高い。市場には、乾癬に対するその他のタイプのターゲット薬（天然小分子または人工化合物）が少なく、ほとんどが乾癬の発病過程で下流効果経路を標的としている。発病の重要な細胞因子であるＩＬ－１７や、その上流の開始経路に対する影響が比較的弱いため、上流の因子に干渉する治療法と比較して、この対症療法の長期的な効果は不十分かも知らない。

【0005】

そのため、伝統的な治療やバイオ製剤の長所を補完する新しいタイプの薬物の開発が必要であり、薬物の有効性、ターゲティング性、経済性、安全性、順応性など、さまざまな側面を同時に考慮する必要がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

上記の問題に対して、本発明の目的は、化合物またはその医薬品誘導体がＡＩＭ２タンパク質活性を抑制するための使用を提供することであり、この化合物は乾癬治療薬として使用でき、ＩＬ－１βの生成を著しく抑制し、ＩＭＱマウスのＣＤ３^＋ＴＣＲ ｄ^＋ＲＯＲ γＴ^＋比率を低下させ、ＩＭＱマウスの炎症表現型を明らかに改善する。上記の化合物は、式Ｉに示されるものである。

【化1】

【課題を解決するための手段】

【0007】

上記の目的を達成するため、本発明は以下の技術的方案を採用することができる。
一方面、上記の化合物またはその医薬品誘導体がＡＩＭ２タンパク質活性を抑制するための使用を提供する。

【0008】

他方面、上記の化合物またはその医薬品誘導体を用いたＡＩＭ２タンパク質活性を抑制するための薬剤の製造方法を提供する。

【0009】

他方面、少なくとも式Ｉに示される化合物と／または医薬品用担体および／または希釈剤を含む、乾癬治療薬として使用される薬物組成物を提供する。

【発明の効果】

【0010】

（１）本発明の化合物Ｉ（化合物ライブラリ番号はＴ６Ｓ１６８３）、ＡＩＭ２タンパク質に対する活性を持つ小分子であり、乾癬治療に使用される医薬品の製造に使用される。従来の広範な免疫調節薬に比べて、より強いターゲット作用を持ち、より精密で迅速、効果的、安全、安定である。さらに、ＡＩＭ２ヒト由来タンパク質およびマウス由来タンパク質との結合能が非常に強く、結合定数はそれぞれＫＤ＝１．５６Ｅ^－６ＭおよびＫＤ＝５．１２Ｅ^－６Ｍに達する。
（２）本発明の化合物およびその製造された医薬品は、乾癬においてＡＩＭ２経路の上流にある標的を結合して抑制する。従来の生物学的抑制剤（生物学的抑制剤は乾癬の免疫炎症経路の中下流に作用し、症状に対して直接作用するが、効果の維持に不安定性があり、ほぼすべての生物制剤は半年後に再発率が著しく増加する）と比較して、炎症因子の阻止レベルがより高く、本発明の化合物は生物制剤よりも長期的な効果があり、重要な効果が得られる。また、従来の生物制剤の多くは全身投与であり、他のシステムに影響を与える可能性が非常に高いが、本発明の化合物は局所的に使用され、吸収が容易であり、多くの副作用を回避することができるため、安全性が高く、広く使用され、使用が簡単であるため、服従性が高い。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】ＡＩＭ２の結晶構造の模式図である。

【図2】仮想スクリーニングのワークフローの模式図である。

【図3】ＨａＣａｔ細胞中のＩＬ－１β ｍＲＮＡのリアルタイム定量ＰＣＲ検出結果である。

【図4】Ｔ６Ｓ１６８３の核磁気共鳴スペクトルである。

【図5】Ｔ６Ｓ１６８３のＨＰＬＣスペクトルである。

【図6】Ｔ６Ｓ１６８３とＡＩＭ２タンパク質の相互作用の模式図である。

【図7】Ｔ６Ｓ１６８３とＡＩＭ２ヒト由来タンパク質の親和性検出結果である。

【図8】Ｔ６Ｓ１６８３とＡＩＭ２マウス由来タンパク質の親和性検出結果である。

【図9】異なる用量のＴ６Ｓ１６８３で処理したＨａＣａｔ細胞のＩＬ－１β転写レベルである。

【図10】１０ｕＭのＴ６Ｓ１６８３で処理したＨａＣａｔ細胞の形態学的変化である。

【図11】１０ｕＭのＴ６Ｓ１６８３で処理したＨａＣａｔ細胞のＡＩＭ２経路タンパク質の発現状況（ゲル電気泳動）である。

【図12】１０ｕＭのＴ６Ｓ１６８３で処理したＨａＣａｔ細胞のＡＩＭ２経路タンパク質の発現状況（ＥＬＩＳＡ）である。

【図13】各処理グループのマウスのＰＡＳＩスコアである。

【図14】５ｍｇ／ｋｇのＴ６Ｓ１６８３を塗布したＩＭＱマウスの表現型である。

【図15】各処理グループのマウスの皮膚病理学的表現型である。

【図16】異なるＴ６Ｓ１６８３濃度のＣＤ３^＋ＴＣＲｄ^＋ＲＯＲγＴ^＋Ｔリンパ球比率である。

【図17】各処理グループのマウスのＣＤ３^＋ＴＣＲｄ^＋ＲＯＲγＴ^＋Ｔリンパ球比率である。

【図18】５ｍｇ／ｋｇのＴ６Ｓ１６８３で処理したＩＭＱマウスの皮膚中のＩＬ－１βタンパク質の発現状況である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明の実施例は、よりよく本発明を説明するために示されたものであり、本発明の内容は、これらの実施例に限定されるものではない。したがって、技術分野に精通した者は、本発明の内容に基づいて実施案を本質的に改善および調整することができるが、これらは本発明の保護範囲に含まれる。

【0013】

本文で使用される用語は、特定の実施例を説明するためにのみ使用され、本開示を制限する意図はない。文脈に明らかに異なる意味がない限り、単数形式の表現には複数形式の表現が含まれる。本文で使用されるように、例えば「包括する」、「具有する」、「含む」などの用語は、特徴、数字、操作、コンポーネント、部品、要素、材料またはそれらの組み合わせの存在を示すために使用される。本明細書に開示された用語は、他の特徴、数字、操作、コンポーネント、部品、要素、材料またはそれらの組み合わせが存在する可能性または追加できる可能性を排除することを意図していない。また、本文で使用される「／」は、「および」または「または」と解釈できる。

【0014】

本発明の実施例は、式Ｉで示される化合物またはその医薬衍生物がＡＩＭ２タンパク質の活性を抑制するために使用されることを提供する。

【化2】

【0015】

上記のＣａＭＫ２γタンパク質のアミノ酸配列には、「ＭＥＳＫＹＫＥＩＬＬＬＴＧＬＤＮＩＴＤＥＥＬＤＲＦＫＦＦＬＳＤＥＦＮＩＡＴＧＫＬＨＴＡＮＲＩＱＶＡＴＬＭＩＱＮＡＧＡＶＳＡＶＭＫＴＩＲＩＦＱＫＬＮＹＭＬＬＡＫＲＬＱＥＥＫＥＫＶＤＫＱＹＫＳＶＴＫＰＫＰＬＳＱＡＥＭＳＰＡＡＳＡＡＩＲＮＤＶＡＫＱＲＡＡＰＫＶＳＰＨＶＫＰＥＱＫＱＭＶＡＱＱＥＳＩＲＥＧＦＱＫＲＣＬＰＶＭＶＬＫＡＫＫＰＦＴＦＥＴＱＥＧＫＱＥＭＦＨＡＴＶＡＴＥＫＥＦＦＦＶＫＶＦＮＴＬＬＫＤＫＦＩＰＫＲＩＩＩＩＡＲＹＹＲＨＳＧＦＬＥＶＮＳＡＳＲＶＬＤＡＥＳＤＱＫＶＮＶＰＬＮＩＩＲＫＡＧＥＴＰＫＩＮＴＬＱＴＱＰＬＧＴＩＶＮＧＬＦＶＶＱＫＶＴＥＫＫＫＮＩＬＦＤＬＳＤＮＴＧＫＭＥＶＬＧＶＲＮＥＤＴＭＫＣＫＥＧＤＫＶＲＬＴＦＦＴＬＳＫＮＧＥＫＬＱＬＴＳＧＶＨＳＴＩＫＶＩＫＡＫＫＫＴ」が含まれる。

【0016】

また、注意すべきは、乾癬患者およびミキャーモット誘発乾癬マウスの単一細胞トランスクリプトームシークエンシング、ＡＴＡＣシークエンシング、トランスクリプトーム学、遺伝子学などの多数のオミックス研究により、ＡＩＭ２炎症体遺伝子だけが乾癬の皮膚病変と末梢血中で顕著に活性化されることが示されている。また、ＡＩＭ２－ＩＬ－１β－ＩＬ－１７シグナル経路には、乾癬の感受性遺伝子が複数含まれており、ＡＩＭ２経路が乾癬の発症および悪化に重要な役割を果たすことが証明されている。ＡＩＭ２経路の活性を調節することで、ミキャーモットマウスモデルの乾癬様炎症表現型を制御できる。ＡＩＭ２は経路の上流側の開始者であり、乾癬ではＡＩＭ２タンパク質の活性化下流タンパク質の阻害能力を阻止することで、経路の効果を効率的に阻止できる。原則的に、単に実行因子ＩＬ－１７を除去するよりも、より強力かつ持続的な治療効果がある。従来のシステムバイオロジー治療において上流分子を阻害することが、関連する経路に影響を与える可能性のある他のシステム異常を引き起こす可能性があることを考慮して、本発明ではＢｉａｃｏｒｅＴ２００装置を用いて、アミノ基カップリング法に基づいて蛋白質モデルの化合物親和性を測定し、コンピューターによって親和性の大きさで並べ替えられた１００種類のＡＩＭ２小分子阻害剤をスクリーニングした。最後に、抑制効果があるより安全な化合物をＨａＣａｔ細胞モデルでスクリーニングし、上記の式Ｉで示される化合物を得た。

【0017】

上記の化合物の医薬品誘導体は、母核構造を保持しながら、母核構造を基盤に化合物構造を変更した化合物を指し、化合物構造の変更により、ＡＩＭ２タンパク質活性の抑制効果を維持するか、化合物の活性を高めたり、薬物代動態特性を改善することができる。

【0018】

一部の具体的な実施例では、上記の用途において、化合物は医薬品の塩形式であることがある。

【0019】

一部の具体的な実施例では、上記の用途において、上記の化合物は医薬品の酸付加塩形式であることがある。もちろん、他の成塩形式も排除しない。

【0020】

本発明のさらなる実施例では、上記の化合物またはその医薬品誘導体の製造に用いられる、ＡＩＭ２タンパク質活性を抑制するための薬剤の用途が提供される。

【0021】

いくつかの具体的な実施例では、上記の用途において、ＡＩＭ２タンパク質の活性を抑制するための薬剤は、乾癬組織のＡＩＭ２タンパク質の活性を抑制するためのものである。具体的には、上記のように、上記の化合物は乾癬のＡＩＭ２－ＩＬ－１β－ＩＬ－１７シグナル経路を介してＡＩＭ２タンパク質の活性を抑制し、乾癬を治療するために使用される。さらに、この化合物は主にＡＩＭ２に標的を絞り、生物学的活性を持つアクティブなカスパーゼ－１ ｐ２０およびＩＬ－１β ｐ１７の含量を低下させることができるため、上記の化合物は乾癬のＡＩＭ２－ＩＬ－１β－ＩＬ－１７シグナル経路にのみ影響を与え、他のシステムには影響を与えないことを示しており、乾癬に対して特異的であり、副作用が低いことを意味している。

【0022】

いくつかの具体的な実施例では、上記の用途において、上記の化合物は、薬用塩の形式である。

【0023】

いくつかの具体的な実施例では、上記の用途において、上記の化合物は、薬用酸加成塩の形式である。

【0024】

いくつかの具体的な実施例では、上記の用途において、ＡＩＭ２タンパク質の活性を抑制するための上記の薬剤の剤型は、カプセル剤、錠剤、口服製剤、マイクロカプセル製剤、注射剤、坐剤、スプレー剤、またはクリーム剤である。具体的には、本分野の技術者は、投与経路や投与対象などに応じて適切な剤型を選択することができる。

【0025】

本発明の特定の実施例において、銀屑病の治療に使用される薬剤組成物が提供される。この薬剤組成物は、少なくとも式Ｉで表される化合物と、必要に応じて薬剤用のキャリアと／または希釈剤とを含む。経路や投与対象に応じて、適切な剤型を選択することができる。

【化3】

【0026】

いくつかの具体的な実施例では、上記の組成物において、上記の可溶性担体および／または希釈剤は、溶液剤型、コロイド溶液剤型、乳剤剤型、懸濁剤型、気体分散剤型、微粒子分散剤型、固体分散剤型のいずれかに適用されることがある。

【0027】

いくつかの具体的な実施例では、上記の組成物において、上記の式Ｉで示される化合物は、他の乾癬治療薬との併用によりより良い治療効果を得るために使用されることがある。たとえば、下流分子ＩＬ－１７またはＩＬ－２３を標的とする生物学的製剤との併用は、生物学的製剤の最小有効量を低下させ、一定程度の系統への干渉を減らすことができ、単一の生物学的製剤よりも安定性が高く、安全な効果を得ることができる。

【0028】

いくつかの具体的な実施例では、上記の組成物において、薬物中の化合物の有効成分の使用量は５ｍｇ／ｋｇに選択される。

【0029】

本発明において、ＡＩＭ２タンパク質の活性を抑制するために使用される化合物は、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００装置を利用して、アミノ基カップリング法に基づいてタンパク質モデルの化合物親和力を測定し、コンピュータによって親和力の大きさに従ってＡＩＭ２の小分子阻害剤１００個を選択し、最後にＨａＣａｔ細胞モデルで抑制効果を持つ化合物を選択することで、選択される。具体的には、次の手順が含まれる。

【0030】

（１） ＡＩＭ２蛋白の結晶構造の選択
ＡＩＭ２蛋白（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎＡＩＭ２、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｏ１４８６２）のアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示す）およびタンパク質の３次元構造に基づいて、参照可能なタンパク質結合領域をスクリーニングする。ＲＣＳＢＰＤＢライブラリでＡＩＭ２のタンパク質の３次元結晶構造が５種類見つかり、表１に示すように、分解能が良いのは３ＶＤ８と４Ｏ７Ｑである。３ＶＤ８の結晶構造は４Ｏ７Ｑのアミノ酸配列よりも多くの情報を提供しているため、スクリーニング可能な結晶構造として優先的にリストされている。

【0031】

【表1】

【0032】

（２）結合部位の選択
ＡＩＭ２のＰＹＤ構造領域は、下流のシグナル伝達経路の調節にとって極めて重要である。ＰＹＤ構造領域のα２アミノ酸は特異性を持ち、また、ＰＹＤ構造領域は６つのヘリックスで構成されている。ＰＹＤ構造領域のα２のＤ１９、Ｅ２０、Ｄ２３、Ｆ２７、Ｆ２８は、ＡＩＭ２がリガンドタンパク質ＡＳＣのＰＹＤとＰＹＤ－ＰＹＤ相互作用を起こすために最も重要なアミノ酸である。したがって、３ＶＤ８の晶体構造を参考に、Ｄ１９、Ｅ２０、Ｄ２３、Ｆ２７、Ｆ２８から構成される結合部位を選択し、ＡＩＭ２タンパク質の新しい小分子阻害剤の仮想スクリーニングを行う。

【0033】

（３）コンピューターによる仮想スクリーニングの手順、小分子化合物ライブラリ、およびターゲットタンパク質の選択と準備の決定
コンピューターによる仮想スクリーニングの手順：ＡＩＭ２のＤ１９、Ｅ２０、Ｄ２３、Ｆ２７、Ｆ２８から構成される結合部位を新しい小分子阻害剤のスクリーニング部位として確定し、ＡＩＭ２三次元晶体構造（ＰＤＢＩＤ：３ＶＤ８）を参考にする（図１参照）。仮想スクリーニングの計画手順は、図２に示されている。

【0034】

小分子化合物ライブラリ：小分子データベースはＣｈｅｍｄｉｖを選択した。
ターゲットタンパク質の選択と準備：ＡＩＭ２の三次元構造（３ｖｄ８．ｐｄｂ）を基に、ｓｙｂｙｌ－Ｘ２．１の「ＰｒｅｐａｒｅＰｒｏｔｅｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒｅ」モジュールを使用してＡＩＭ２タンパク質を処理した。「ＲｅｍｏｖｅＳｕｂｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ」ですべての水分子を選択して除去し、次に「ＡｎａｌｙｚｅＳｅｌｅｃｔｅｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ」を使用してタンパク質を分析および修正し、タンパク質の水素原子を追加した。最後に、ｓｙｂｙｌのｐｒｏｔｏｍｏｌモジュールを使用して、ＰＹＤドメインのａｌｐｈａ２のＤ１９、Ｅ２０、Ｄ２３、Ｆ２７、Ｆ２８を選択し、活性部位の「Ｒｅｓｉｄｕｅ」生成方法を使用して、抑制剤の結合空洞ファイルである３ｖｄ８＿Ｈ－Ｒ－０．５０－０．ｓｆｘｃを生成した。これがターゲットタンパク質の処理後の出力ファイルである。

【0035】

（４）仮想スクリーニングの計算
ｓｙｂｙｌ－Ｘ２．１の「ＣｏｍｐｏｕｎｄＦｉｌｔｅｒｉｎｇ」モジュールを使用して、データベース内の化合物を選択し、以下の規則に合致する化合物を選択した。（ａ）分子量が７００未満であること。（ｂ）ｃＬｏｇＰ（エステル水分配係数）が－４から６の範囲内であること。（ｃ）水素結合受容体数が１５以下であること。（ｄ）水素結合供与体数が６以下であること。（ｅ）回転可能結合数が１１未満であること。このプロジェクトでは、ｓｙｂｙｌ薬剤設計プラットフォームの「ＣｏｍｐｏｕｎｄＦｉｌｔｅｒｉｎｇ」モジュールを使用して、小分子データベースを初期スクリーニングした。上記の５つの規則に基づく総合原則に従って、完全に５つの規則に従ってスクリーニングを行うと、小分子データベース内の化合物の数が大幅に減少し、化合物の多様性が明らかに低下するため、仮想スクリーニング段階で、化合物の多様性を増やすため、ある程度の生物活性を持つリード化合物の数を増やす必要がある。したがって、化合物の多様性を増やすため、仮想スクリーニングの段階で、「５つの規則」のパラメータ範囲を適度に拡大する必要がある。たとえば、分子量を７００に拡大し、ｃｌｏｇＰは化合物の親水性／疎水性を記述するため、範囲を広げることができる。同様に、水素結合供与体と受容体、回転可能な結合の数の範囲を適切に拡大する必要がある。

【0036】

（ｉ）第一回のバーチャルスクリーニング計算
Ｓｙｂｙｌ－Ｘ２．１ソフトウェアのＳｕｒｆｌｅｘモジュールを使用してスクリーニングを行う。ドッキングパラメータを一部変更して、最初のバーチャルスクリーニング速度を速め、スコアがトップ１％の分子をスクリーニングしてください。具体的には、「ＭａｘｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｐｅｒＦｒａｇｍｅｎｔ」をデフォルトの２０から１０に変更し、「Ｍａｘｎｕｍｂｅｒｏｆｒｏｔａｔａｂｌｅｂｏｎｄｓｐｅｒｍｏｌｅｃｕｌｅ」をデフォルトの１００から５０に変更する。デフォルトの「Ｐｅｒ－ＤｏｃｋＭｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ」と「Ｐｏｓｔ－ＤｏｃｋＭｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ」のオプションをキャンセルする。「Ｍａｘｉｍｕｍｎｕｍｂｅｒｏｆｐｏｓｅｓｐｅｒｌｉｇａｎｄ」をデフォルトの２０から３に変更し、各リガンド分子の上位３つの分子構造のみを保持し、ドッキング速度を速め、最終的にトップ１％の化合物を得る。

【0037】

（ｉｉ）第二回のバーチャルスクリーニング計算
Ｓｙｂｙｌ－Ｘ２．１ソフトウェアのＳｕｒｆｌｅｘモジュールを使用して第二のスクリーニングを行う。最初のスクリーニングでトップ１％に入った分子をベースにして、デフォルトのパラメータに戻す（つまり、「ＭａｘｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｐｅｒＦｒａｇｍｅｎｔ」はデフォルトの２０、「Ｍａｘｎｕｍｂｅｒｏｆｒｏｔａｔａｂｌｅｂｏｎｄｓｐｅｒｍｏｌｅｃｕｌｅ」はデフォルトのままである；「Ｐｅｒ－ＤｏｃｋＭｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ」および「Ｐｏｓｔ－ＤｏｃｋＭｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ」のオプションをデフォルトで選択し、化合物のドッキング前後のエネルギー最小化を最適化する。さらに、各分子の初期構造数を４つに増やし、トップ５００のターゲット化合物を人工的にスクリーニングする。

【0038】

（ｉｉｉ）手動フィルタリングとレビュー
第二次スクリーニングで得られた５００個のターゲット中の化合物を人工的にスクリーニングし、ＡＩＭ２のＰＹＤ構造ドメインのアルファ２と安定的な相互作用（水素結合、疎水性、π－π積み重ね相互作用）ができることを総合的に考慮した。具体的には、ＡＩＭ２上のＡｒｇ２４、Ｌｅｕ７２、Ａｓｎ７３などの多くのアミノ酸と複数の水素結合相互作用ができる。同時に、疎水性アミノ酸が多数存在する結合部位に結合することができる、Ｐｈｅ２７、Ｐｈｅ２８、Ａｌａ３６、Ｌｅｕ４０、Ｌｅｕ７２は疎水性ポケットを形成する。したがって、ターゲット化合物は、水素結合供与体（および受容体）基部、芳香族環構造、および疎水性置換基を多く持っている必要がある。化合物の構造は、比較的剛性があり、回転可能なキーの数が多すぎない必要がある。最終的に、Ｃｈｅｍｄｉｖライブラリから、表２に示すように、４４個の化合物をＡＩＭ２阻害剤として選択した。

【0039】

【表2】

【0040】

（５）ＨａＣａｔ細胞モデルで抑制効果を持つ化合物をスクリーニングする
上記のスクリーニングで選ばれた１００種類の化合物をＨａＣａｔ細胞においてＯｌｉｇｏｄＡ－Ｔ刺激から保護する能力を評価する。評価基準は、刺激後の細胞中のＩＬ－１β ｍＲＮＡをリアルタイム蛍光定量ＰＣＲで検出することである。陽性対照と比較して、４４種の小分子阻害剤の中で最も顕著な抑制効果（ｐ＜０．０００１）を示すものを理想的な阻害剤の候補として選択し、本発明で使用される化合物Ｉ（またはＴ６Ｓ１６８３とも呼ばれる）とする。

【0041】

（ｉ）実験グループは陽性対照（ＰＣ）と陰性対照（ＮＣ）を設定し、ＰＣグループはＬｉｐ３０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ３０００ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ）とＯｌｉｇｏｄＡ－Ｔの包装体（ＯｌｉｇｏｄＡ－Ｔ：Ｌｉｐ３０００：Ｐ３０００＝１：１：２５、ＯｌｉｇｏｄＡ－Ｔ濃度は１ｕｇ／ｍＬ）をＨａＣａｔ細胞にトランスフェクションする。各処理グループはＬｉｐ３０００－ＯｌｉｇｏｄＡ－Ｔの包装体と１０μＭの小分子阻害剤をＨａＣａｔ細胞に共同トランスフェクションする。ＮＣグループは同量のトランスフェクション試薬（Ｌｉｐ３０００：Ｐ３０００＝１：１）のみを加える。

【0042】

（ｉｉ）各実験グループは、細胞培養箱に５％含まれる３７℃で２４時間培養し、実時蛍光量ＰＣＲ検査に使用するために細胞を収集し、４６種類の小分子抑制剤の中から、最も顕著な抑制効果（ｐ＜０．０００１）を示す小分子を候補として選択した。さらに、２回目の検証を行い、結果は図３に示されている。（注：Ｔ６Ｓ１６８３はスクリーニング番号４である）

【0043】

この方法で選択された小分子、脱メトキシジンジャー（Ｔ６Ｓ１６８３とも呼ばれる）は、次のように名付けられた。１，６－ヘキセンジオン、１－（４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル）－７－（４－ヒドロキシフェニル）－、（１Ｅ、６Ｅ）－；化合物の分子量は３３８．３６であり、構造式は式Ｉのように示されている。

【化4】

【0044】

以下は、選択された小分子化合物Ｉの特性に関する詳細である。
（１）小分子化合物Ｔ６Ｓ１６８３について核磁気共鳴による特性評価を行った。図に示すように、芳香環の特徴的な水素が明確に観測され、２つのフェノールヒドロキシ基の活発な水素がピークを示し、裂け目が鮮明であり、化合物の構造と一致している。化合物の構造は正しい。

【0045】

（２）小分子化合物Ｔ６Ｓ１６８３について、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による特性評価を行った。図５に示すように、保持時間１０．１４、ピーク面積比が９８．１％であり、化合物の純度が非常に高いことを示している。

【0046】

選択された小分子化合物Ｉの合成ルートは以下の通りである。

【化5】

【0047】

以下の実施例において、データの統計学的解析方法は、ＳＰＳＳ２３．０およびＲＶｅｒｓｉｏｎ４．０．２版ソフトウェアを使用してデータ処理と分析を行い、すべての検定は両側検定を採用し、Ｐ値が０．０５未満であれば統計的意義があると見なされる。

【0048】

本発明をよりよく理解するために、具体的な例を組み合わせて本発明の内容をさらに説明するが、本発明の内容は以下の例に限定されるものではない。

【0049】

実施例１ Ｔ６Ｓ１６８３とＡＩＭ２タンパク質の相互作用モード
本発明の実施例では、Ｔ６Ｓ１６８３とＡＩＭ２の結合モードを予測分析した。まず、Ｓｙｂｙｌ－Ｘ２．１ソフトウェアのＳｕｒｆｌｅｘモジュールを使用して、結合モードを予測し、次に、小分子が蛋白質ＡＩＭ２のＡｒｇ２４、Ｌｅｕ７２、Ａｓｎ７３などの複数のアミノ酸と多数の水素結合を形成するかどうかを人工的にスクリーニングと再確認した。結果は図６に示されており、Ｔ６Ｓ１６８３はＡｒｇ２４、Ａｓｐ２３、Ｈｉｓ４１との間に水素結合を形成する。複数の水素結合の相互作用は、化合物Ｔ６Ｓ１６８３とＡＩＭ２タンパク質の結合を維持するのに共同している。

【0050】

実施例２ Ｔ６Ｓ１６８３とＡＩＭ２ヒトタンパク質の高い親和力のテスト
本発明の実施例では、Ｔ６Ｓ１６８３とＡＩＭ２ヒトタンパク質の親和力を測定した。まず、ｐＥＴ２８Ａベクターを使用して、ヒト全長ＡＩＭ２タンパク質をそれぞれ発現して純化した。その後、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ－ｐｌａｓｍｏｎｒｅｓｏｎａｎｃｅ， ＳＰＲ）法を使用して、ＣＭ５チップのアミン結合法を使用して親和能力を測定した。結果は図７に示されており、Ｔ６Ｓ１６８３はヒト源ＡＩＭ２タンパク質と特異的に結合し、結合定数は１．５６Ｅ^－６Ｍで、高い結合能力を持つことが示された。

【0051】

実施例３ Ｔ６Ｓ１６８３とＡＩＭ２マウス由来タンパク質の強い親和性テスト
本発明の実施例では、Ｔ６Ｓ１６８３とＡＩＭ２マウス由来タンパク質の親和性を検査した。まず、ｐＥＴ２８Ａベクターを使用してマウス由来全長ＡＩＭ２タンパク質をそれぞれ発現精製した。次に、Ｂｉａｃｏｒｅの表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ－ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ， ＳＰＲ）法を用いてＣＭ５チップのアミノ基結合法を使用して親和力を測定した。検査結果は図８に示されており、Ｔ６Ｓ１６８３はマウス由来ＡＩＭ２タンパク質と特異的に結合し、結合定数は５．１２Ｅ^－６Ｍで、結合能力が非常に強いことが示されている。

【0052】

実施例４ ＨａＣａｔ細胞モデルにおけるＴ６Ｓ１６８３によるＡＩＭ２タンパク質活性の効果的な抑制
（１）陽性対照（ＰＣ）、陰性対照（ＮＣ）および各処理グループを設定する。ＰＣグループでは、Ｌｉｐ３０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ３０００ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ）およびＯｌｉｇｏｄＡ－Ｔパッケージ（ＯｌｉｇｏｄＡ－Ｔ：Ｌｉｐ３０００：Ｐ３０００＝１：１：２５、ＯｌｉｇｏｄＡ－Ｔ濃度は１ｕｇ／ｍＬ）を使用してＨａＣａｔ細胞に転染する。ＮＣグループでは、同量のトランスフェクション試薬（Ｌｉｐ３０００：Ｐ３０００＝１：１）のみを加える。各処理グループでは、Ｌｉｐ３０００－ＯｌｉｇｏｄＡ－Ｔパッケージで共にＨａＣａｔ細胞に梯度用量（０．１ｕＭ、１ｕＭ、５ｕＭ、１０ｕＭ、および２５ｕＭ）のＴ６Ｓ１６８３を転染する。

【0053】

（２）上記の陽性対照群（ＰＣ）、陰性対照群（ＮＣ）および各処理群を含む培養細胞箱に入れ、５％ ＣＯ２を含む３７℃で２４時間培養し、細胞を収集してリアルタイム蛍光定量ＰＣＲ検査を行い、異なる投与量の抑制剤がＨａＣａｔ細胞内のＡＩＭ２経路の活性化に及ぼす影響を観察した。結果は図９に示されており、陽性対照群と比較して、１０μＭのＴ６Ｓ１６８３が５つの投与量グラデーションの中でＨａＣａｔ細胞のＩＬ－β転写水準を最も低下させることがわかった。

【0054】

（３）同時に、１００倍の顕微鏡視野で１０μＭグラデーションの細胞状態を観察し、その結果は図１０に示されており、この群の細胞状態は陰性対照群の細胞状態に近く、透明な焦死細胞の割合が非常に少なく、細胞密度が高く、壁に密着していた。

【0055】

（２）および（３）の結果から、１０μＭのＴ６Ｓ１６８３がＨａＣａｔ細胞のＡＩＭ２活性を抑制する最適な用量である可能性があることがわかった。

【0056】

（４）その後、１０ｕＭのＴ６Ｓ１６８３で処理されたＨａＣａｔ細胞のＡＩＭ２下流タンパク質の発現状況を検査し、結果は図１１と図１２に示されている。１０ｕＭのＴ６Ｓ１６８３処理によるＡＩＭ２下流のｃａｓｐａｓｅ－１の発現はわずかに低下したことが確認された（ＷＢ試験では、ＰＭＡ刺激を受けたＴＨＰ１細胞をタンパク質の陽性参照として使用した）。その後、活性化されたＩＬ－１βの発現を検出するために、ＥＬＩＳＡ試薬キットを使用した。その結果、１０ｕＭのＴ６Ｓ１６８３がＩＬ－１βの分泌を抑制する効果があることが明らかになった。

【0057】

実施例５ Ｔ６Ｓ１６８３が乾癬動物モデルにおいてＡＩＭ２蛋白質活性を高効率に抑制するテスト
本発明の実施例では、ＤＭＳＯを使用してＴ６Ｓ１６８３パウダーを溶解し、異なる使用量のパウダーを称量し、β－シクロデキストリンで希釈する。ＤＭＳＯの最終濃度は５％以下になる。設定されたＴ６Ｓ１６８３の投与量グラデーションは、０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇで、各マウスは２０ｇで計算され、１日あたりの投与量は、０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇになる。

【0058】

７週齢のＣ５７／ＢＬ６マウスを選択し、ＳＰＦレベルの環境で飼育およびモデリングを行い、実験グループは以下の通りである。（ａ）０ｍｇ／ｋｇのＴ６Ｓ１６８３を使用したＩＭＱと皮膚に塗布；（ｂ）１ｍｇ／ｋｇのＴ６Ｓ１６８３を使用したＩＭＱと皮膚に塗布；（ｃ）２．５ｍｇ／ｋｇのＴ６Ｓ１６８３を使用したＩＭＱと皮膚に塗布；（ｄ）５ｍｇ／ｋｇのＴ６Ｓ１６８３を使用したＩＭＱと皮膚に塗布；（ｅ）１０ｍｇ／ｋｇのＴ６Ｓ１６８３を使用したＩＭＱと皮膚に塗布；（ｆ）０ｍｇ／ｋｇのＴ６Ｓ１６８３を使用したＶａｓｅｌｉｎｅと皮膚に塗布；（ｇ）１ｍｇ／ｋｇのＴ６Ｓ１６８３を使用したＶａｓｅｌｉｎｅと皮膚に塗布；（ｈ）２．５ｍｇ／ｋｇのＴ６Ｓ１６８３を使用したＶａｓｅｌｉｎｅと皮膚に塗布；（ｉ）５ｍｇ／ｋｇのＴ６Ｓ１６８３を使用したＶａｓｅｌｉｎｅと皮膚に塗布；（ｊ）１０ｍｇ／ｋｇのＴ６Ｓ１６８３を使用したＶａｓｅｌｉｎｅと皮膚に塗布。（注：（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）グループのマウスには、ＩＭＱを１日あたり６２．５ｍｇ／１匹使用する。（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）および（ｊ）グループのマウスには、Ｖａｓｅｌｉｎｅを１日あたり６２．５ｍｇ／１匹使用する。

【0059】

上記、６匹のグループごとにマウスを剃って、背中の毛を取り除き、裸皮面積が４平方センチメートルになるように調整し、実験開始日をＤａｙ０、終了日をＤａｙ６と設定した。Ｄａｙ０からＤａｙ５まで、毎日５００マイクロリットルの薬液を均一にマウスの皮膚に塗布して吸収させる。５００μｌの薬液は、朝に１５０μｌ、昼に２００μｌ、夜に１５０μｌの投与量に分割して塗布する。 Ｄａｙ２からＤａｙ５まで、Ｔ６Ｓ１６８３抑制剤を塗布した後、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）のグループの各マウスに６２．５ｍｇのＩＭＱを塗布する。（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）のグループの各マウスには６２．５ｍｇのバセリンを塗布する。毎日マウスの皮膚を評価し、Ｄａｙ６にマウスを安楽死し、皮膚組織を採取して一連の検査を行った。

【0060】

上記ＩＭＱモデルのマウスのＰＡＳＩ評価結果、皮膚表現型、皮膚病理表現型は、それぞれ図１３、図１４、図１５に示されている。３つの用量のＴ６Ｓ１６８３は、ＩＭＱマウスの炎症表現型を異なる程度で軽減した。そのうち、５ｍｇ／ｋｇ投与量の軽減効果が最も顕著であり、１ｍｇ／ｋｇ投与量の効果に差がなかった。

【0061】

上記の各グループのマウスの皮膚リンパ球（ＣＤ３^＋ ＴＣＲｄ^＋ ＲＯＲγＴ^＋のＴ細胞の割合、このタイプの細胞はＡＩＭ２経路によって中介される主要な効果細胞であり、大量のＩＬ－１７細胞因子を分泌することにより乾癬を悪化させる）を分離し、流式細胞分析を行った。その結果、Ｔ６Ｓ１６８３の５ｍｇ／ｋｇ処理を受けたＩＭＱマウス（図１６と図１７）と、Ｔ６Ｓ１６８３を使用しないＩＭＱマウスと比較して、ＣＤ３^＋ＴＣＲｄ^＋ＲＯＲγＴ^＋の割合が有意に低下していることが示された。

【0062】

その後、ＡＩＭ２経路遺伝子の転写レベルをマウスの皮膚で測定し、５ｍｇ／ｋｇ群のマウスではＩＬ－１β遺伝子発現レベルが有意に低下していることが統計的に示された（図１８）。これは、５ｍｇ／ｋｇのＴ６Ｓ１６８３を使用して処理されたマウスの皮膚中のＡＩＭ２下流のＩＬ－１βが抑制され、その含量が低下し、炎症表現が緩和されたことを示している。

【0063】

最後に説明すると、上記の実施例は、本発明の技術的な解決策を説明するためのものであり、制限するものではない。最適な実施例を参照しても、本分野の一般的な技術者は、本発明の技術的な解決策を変更または同等のものに置き換えることができることを理解する必要がある。それらは、本発明の技術的な解決策の目的と範囲から外れることなく、本発明の請求範囲に含まれるものとする。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

2024124284000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2024-06-05

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、タンパク質抑制薬の技術領域に属し、特に、ＡＩＭ２タンパク質の活性の抑制に用いられる化合物またはその派生製品に関するものである。

【背景技術】

【0002】

乾癬は、世界的に見て、難治性で高い罹患率を持つ炎症免疫疾患であり、２０２１年現在、中国だけでも６５０万人以上がこの病気に苦しんでいる。しかし、現在の医療水準では完全に治療することができない。臨床的には、乾癬の治療法は多岐にわたるが、免疫系を広く抑制することで炎症症状を緩和しようとする手段が多く、ステロイドや免疫抑制剤の使用が含まれる。また、物理療法や漢方薬の使用もある。しかし、広範囲な対症療法は効果が低く、病気が再発したり、他の系統への損傷を引き起こす可能性があり、患者にとって心理的および経済的な負担をもたらすことがある。近年、乾癬の精密医療は、伝統的な治療方法の不足をある程度補うことになった。多くの生物製剤が、ＩＬ－１７、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２３などの下流効果分子を標的にして乾癬の表現型を消去しようとする努力をしている。

【0003】

従来の治療法と比較すると、生物製剤は一定期間内に乾癬患者の治癒率を異なる程度で増加させることができ、投与間隔も長く、依従性が高くなる傾向がある。しかし、従来の治療法と同じ欠点がある。現在市場にある乾癬治療のすべての生物製剤は、根本的には下流効果分子の効果を遮断することによって表現型を軽減する対症療法であり、生物製剤の使用を半年以上中止すると、乾癬の再発リスクが大幅に増加している。また、生物製剤の価格が高額であり、長期的な維持治療が必要なため、途中で効果が低下した場合は、多くの生物製剤を併用する必要があり、患者に大きな経済的負担をもたらすことがある。

【0004】

以上を総括すると、現在、乾癬治療に用いられる薬は、広範な免疫調節薬とターゲット薬の２つの主要なタイプに大別できる。広範な伝統的な免疫調節剤は、長期的な効果が理想的ではなく、バイオ製剤を代表とするターゲット薬は、ある程度伝統的な薬物療法の欠点を補うものの、価格が高く、適用基準が比較的高い。市場には、乾癬に対するその他のタイプのターゲット薬（天然小分子または人工化合物）が少なく、ほとんどが乾癬の発病過程で下流効果経路を標的としている。発病の重要な細胞因子であるＩＬ－１７や、その上流の開始経路に対する影響が比較的弱いため、上流の因子に干渉する治療法と比較して、この対症療法の長期的な効果は不十分かも知らない。

【0005】

そのため、伝統的な治療やバイオ製剤の長所を補完する新しいタイプの薬物の開発が必要であり、薬物の有効性、ターゲティング性、経済性、安全性、順応性など、さまざまな側面を同時に考慮する必要がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の目的は、ＡＩＭ２タンパク質の活性の抑制に用いられる化合物またはその派生製品を提供することにあり、この化合物は乾癬治療薬として使用でき、ＩＬ－１βの生成を著しく抑制し、ＩＭＱマウスのＣＤ３ ^＋ ＴＣＲ ｄ ^＋ ＲＯＲ γＴ ^＋ 比率を低下させ、ＩＭＱマウスの炎症表現型を明らかに改善する。前記化合物は、式Ｉに示されるものである。

【化1】

【課題を解決するための手段】

【0007】

前記目的を達成するため、本発明は下記技術的方案を採用する。
一方面、ＡＩＭ２タンパク質の活性の抑制に用いられる化合物またはその派生製品を提供する。

【0008】

他方面、化合物またはその派生製品でＡＩＭ２タンパク質活性抑制薬物を製造する方法を提供する。

【0009】

他方面、乾癬治療薬として使用される薬物組成物を提供する。前記薬物組成物は少なくとも式Ｉに示される化合物と／または医薬品用担体および／または希釈剤を含む。

【発明の効果】

【0010】

（１）本発明の化合物Ｉ（化合物ライブラリ番号はＴ６Ｓ１６８３）、ＡＩＭ２タンパク質に対する活性を持つ小分子であり、乾癬治療に使用される医薬品の製造に使用される。従来の広範な免疫調節薬に比べて、より強いターゲット作用を持ち、より精密で迅速、効果的、安全、安定である。さらに、ＡＩＭ２ヒト由来タンパク質およびマウス由来タンパク質との結合能が非常に強く、結合定数はそれぞれＫＤ＝１．５６Ｅ ^－６ ＭおよびＫＤ＝５．１２Ｅ ^－６ Ｍに達する。
（２）本発明の化合物およびその製造された医薬品は、乾癬においてＡＩＭ２経路の上流にある標的を結合して抑制する。従来の生物学的抑制剤（生物学的抑制剤は乾癬の免疫炎症経路の中下流に作用し、症状に対して直接作用するが、効果の維持に不安定性があり、ほぼすべての生物制剤は半年後に再発率が著しく増加する）と比較して、炎症因子の阻止レベルがより高く、本発明の化合物は生物制剤よりも長期的な効果があり、重要な効果が得られる。また、従来の生物制剤の多くは全身投与であり、他のシステムに影響を与える可能性が非常に高いが、本発明の化合物は局所的に使用され、吸収が容易であり、多くの副作用を回避することができるため、安全性が高く、広く使用され、使用が簡単であるため、服従性が高い。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】ＡＩＭ２の結晶構造の模式図である。

【図2】仮想スクリーニングのワークフローの模式図である。

【図3】 ＨａＣａｔ細胞中のＩＬ－１β ｍＲＮＡのリアルタイム定量ＰＣＲ検出結果である。

【図4】 Ｔ６Ｓ１６８３の核磁気共鳴スペクトルである。

【図5】 Ｔ６Ｓ１６８３のＨＰＬＣスペクトルである。

【図6】 Ｔ６Ｓ１６８３とＡＩＭ２タンパク質の相互作用の模式図である。

【図7】 Ｔ６Ｓ１６８３とＡＩＭ２ヒト由来タンパク質の親和性検出結果である。

【図8】 Ｔ６Ｓ１６８３とＡＩＭ２マウス由来タンパク質の親和性検出結果である。

【図9】異なる用量のＴ６Ｓ１６８３で処理したＨａＣａｔ細胞のＩＬ－１β転写レベルである。

【図10】 １０ｕＭのＴ６Ｓ１６８３で処理したＨａＣａｔ細胞の形態学的変化である。

【図11】 １０ｕＭのＴ６Ｓ１６８３で処理したＨａＣａｔ細胞のＡＩＭ２経路タンパク質の発現状況（ゲル電気泳動）である。

【図12】 １０ｕＭのＴ６Ｓ１６８３で処理したＨａＣａｔ細胞のＡＩＭ２経路タンパク質の発現状況（ＥＬＩＳＡ）である。

【図13】各処理グループのマウスのＰＡＳＩスコアである。

【図14】 ５ｍｇ／ｋｇのＴ６Ｓ１６８３を塗布したＩＭＱマウスの表現型である。

【図15】各処理グループのマウスの皮膚病理学的表現型である。

【図16】異なるＴ６Ｓ１６８３濃度のＣＤ３ ^＋ ＴＣＲｄ ^＋ ＲＯＲγＴ ^＋ Ｔリンパ球比率である。

【図17】各処理グループのマウスのＣＤ３ ^＋ ＴＣＲｄ ^＋ ＲＯＲγＴ ^＋ Ｔリンパ球比率である。

【図18】 ５ｍｇ／ｋｇのＴ６Ｓ１６８３で処理したＩＭＱマウスの皮膚中のＩＬ－１βタンパク質の発現状況である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明の実施例は、よりよく本発明を説明するために示されたものであり、本発明の内容は、これらの実施例に限定されるものではない。したがって、技術分野に精通した者は、本発明の内容に基づいて実施案を本質的に改善および調整することができるが、これらは本発明の保護範囲に含まれる。

【0013】

本文で使用される用語は、特定の実施例を説明するためにのみ使用され、本開示を制限する意図はない。文脈に明らかに異なる意味がない限り、単数形式の表現には複数形式の表現が含まれる。本文で使用されるように、例えば「包括する」、「具有する」、「含む」などの用語は、特徴、数字、操作、コンポーネント、部品、要素、材料またはそれらの組み合わせの存在を示すために使用される。本明細書に開示された用語は、他の特徴、数字、操作、コンポーネント、部品、要素、材料またはそれらの組み合わせが存在する可能性または追加できる可能性を排除することを意図していない。また、本文で使用される「／」は、「および」または「または」と解釈できる。

【0014】

本発明の実施例は、ＡＩＭ２タンパク質の活性の抑制に用いられ、かつ式Ｉで示される化合物またはその派生製品（Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）を提供する。

【化2】

【0015】

前記ＣａＭＫ２γタンパク質のアミノ酸配列には、「ＭＥＳＫＹＫＥＩＬＬＬＴＧＬＤＮＩＴＤＥＥＬＤＲＦＫＦＦＬＳＤＥＦＮＩＡＴＧＫＬＨＴＡＮＲＩＱＶＡＴＬＭＩＱＮＡＧＡＶＳＡＶＭＫＴＩＲＩＦＱＫＬＮＹＭＬＬＡＫＲＬＱＥＥＫＥＫＶＤＫＱＹＫＳＶＴＫＰＫＰＬＳＱＡＥＭＳＰＡＡＳＡＡＩＲＮＤＶＡＫＱＲＡＡＰＫＶＳＰＨＶＫＰＥＱＫＱＭＶＡＱＱＥＳＩＲＥＧＦＱＫＲＣＬＰＶＭＶＬＫＡＫＫＰＦＴＦＥＴＱＥＧＫＱＥＭＦＨＡＴＶＡＴＥＫＥＦＦＦＶＫＶＦＮＴＬＬＫＤＫＦＩＰＫＲＩＩＩＩＡＲＹＹＲＨＳＧＦＬＥＶＮＳＡＳＲＶＬＤＡＥＳＤＱＫＶＮＶＰＬＮＩＩＲＫＡＧＥＴＰＫＩＮＴＬＱＴＱＰＬＧＴＩＶＮＧＬＦＶＶＱＫＶＴＥＫＫＫＮＩＬＦＤＬＳＤＮＴＧＫＭＥＶＬＧＶＲＮＥＤＴＭＫＣＫＥＧＤＫＶＲＬＴＦＦＴＬＳＫＮＧＥＫＬＱＬＴＳＧＶＨＳＴＩＫＶＩＫＡＫＫＫＴ」が含まれる。

【0016】

また、注意すべきは、乾癬患者およびミキャーモット誘発乾癬マウスの単一細胞トランスクリプトームシークエンシング、ＡＴＡＣシークエンシング、トランスクリプトーム学、遺伝子学などの多数のオミックス研究により、ＡＩＭ２炎症体遺伝子だけが乾癬の皮膚病変と末梢血中で顕著に活性化されることが示されている。また、ＡＩＭ２－ＩＬ－１β－ＩＬ－１７シグナル経路には、乾癬の感受性遺伝子が複数含まれており、ＡＩＭ２経路が乾癬の発症および悪化に重要な役割を果たすことが証明されている。ＡＩＭ２経路の活性を調節することで、ミキャーモットマウスモデルの乾癬様炎症表現型を制御できる。ＡＩＭ２は経路の上流側の開始者であり、乾癬ではＡＩＭ２タンパク質の活性化下流タンパク質の阻害能力を阻止することで、経路の効果を効率的に阻止できる。原則的に、単に実行因子ＩＬ－１７を除去するよりも、より強力かつ持続的な治療効果がある。従来のシステムバイオロジー治療において上流分子を阻害することが、関連する経路に影響を与える可能性のある他のシステム異常を引き起こす可能性があることを考慮して、本発明ではＢｉａｃｏｒｅＴ２００装置を用いて、アミノ基カップリング法に基づいて蛋白質モデルの化合物親和性を測定し、コンピューターによって親和性の大きさで並べ替えられた１００種類のＡＩＭ２小分子阻害剤をスクリーニングした。最後に、抑制効果があるより安全な化合物をＨａＣａｔ細胞モデルでスクリーニングし、前記式Ｉで示される化合物を得た。

【0017】

前記化合物の派生製品は、母核構造を保持しながら、母核構造を基盤に化合物構造を変更した化合物を指し、化合物構造の変更により、ＡＩＭ２タンパク質活性の抑制効果を維持するか、化合物の活性を高めたり、薬物代動態特性を改善することができる。

【0018】

本発明の具体的な実施例に係る前記ＡＩＭ２タンパク質の活性の抑制に用いられる化合物において、化合物は医薬品の塩形式であることがある。

【0019】

本発明の具体的な実施例に係る前記ＡＩＭ２タンパク質の活性の抑制に用いられる化合物において、前記化合物は医薬品の酸付加塩形式であることがある。もちろん、他の成塩形式も排除しない。

【0020】

本発明の実施例では、前記化合物またはその派生製品の製造に用いられ、かつＡＩＭ２タンパク質活性を抑制する薬剤が提供される。

【0021】

本発明の具体的な実施例に係る前記ＡＩＭ２タンパク質の活性の抑制に用いられる化合物において、ＡＩＭ２タンパク質の活性を抑制する薬剤は、乾癬組織のＡＩＭ２タンパク質の活性を抑制するためのものである。具体的には、上記のように、前記化合物は乾癬のＡＩＭ２－ＩＬ－１β－ＩＬ－１７シグナル経路を介してＡＩＭ２タンパク質の活性を抑制し、乾癬の治療に使用される。さらに、この化合物は主にＡＩＭ２に標的を絞り、生物学的活性を持つアクティブなカスパーゼ－１ ｐ２０およびＩＬ－１β ｐ１７の含量を低下させることができるため、前記化合物は乾癬のＡＩＭ２－ＩＬ－１β－ＩＬ－１７シグナル経路にのみ影響を与え、他のシステムには影響を与えないことを示しており、乾癬に対して特異的であり、副作用が低いことを意味している。

【0022】

本発明の具体的な実施例に係る前記ＡＩＭ２タンパク質の活性の抑制に用いられる化合物において、前記化合物は、薬用塩の形式である。

【0023】

本発明の具体的な実施例に係る前記ＡＩＭ２タンパク質の活性の抑制に用いられる化合物において、前記化合物は、薬用酸加成塩の形式である。

【0024】

本発明の具体的な実施例に係る前記ＡＩＭ２タンパク質の活性の抑制に用いられる化合物において、ＡＩＭ２タンパク質の活性を抑制する前記薬剤の剤型は、カプセル剤、錠剤、口服製剤、マイクロカプセル製剤、注射剤、坐剤、スプレー剤、またはクリーム剤である。具体的には、本分野の技術者は、投与経路や投与対象などに応じて適切な剤型を選択することができる。

【0025】

本発明の特定の実施例において、銀屑病の治療に使用される薬剤組成物が提供される。この薬剤組成物は、少なくとも式Ｉで表される化合物と、必要に応じて薬剤用のキャリアと／または希釈剤とを含む。経路や投与対象に応じて、適切な剤型を選択することができる。

【化3】

【0026】

いくつかの具体的な実施例では、前記組成物において、前記可溶性担体および／または希釈剤は、溶液剤型、コロイド溶液剤型、乳剤剤型、懸濁剤型、気体分散剤型、微粒子分散剤型、固体分散剤型のいずれかに適用されることがある。

【0027】

いくつかの具体的な実施例では、前記組成物において、前記式Ｉで示される化合物は、他の乾癬治療薬との併用によりより良い治療効果を得るために使用されることがある。たとえば、下流分子ＩＬ－１７またはＩＬ－２３を標的とする生物学的製剤との併用は、生物学的製剤の最小有効量を低下させ、一定程度の系統への干渉を減らすことができ、単一の生物学的製剤よりも安定性が高く、安全な効果を得ることができる。

【0028】

いくつかの具体的な実施例では、前記組成物において、薬物中の化合物の有効成分の使用量は５ｍｇ／ｋｇに選択される。

【0029】

本発明において、ＡＩＭ２タンパク質の活性の抑制に使用される化合物は、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００装置を利用して、アミノ基カップリング法に基づいてタンパク質モデルの化合物親和力を測定し、コンピュータによって親和力の大きさに従ってＡＩＭ２の小分子阻害剤１００個を選択し、最後にＨａＣａｔ細胞モデルで抑制効果を持つ化合物を選択することで、選択される。具体的には、次の手順が含まれる。

【0030】

（１）ＡＩＭ２蛋白の結晶構造の選択
ＡＩＭ２蛋白（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎＡＩＭ２、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｏ１４８６２）のアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示す）およびタンパク質の３次元構造に基づいて、参照可能なタンパク質結合領域をスクリーニングする。ＲＣＳＢＰＤＢライブラリでＡＩＭ２のタンパク質の３次元結晶構造が５種類見つかり、表１に示すように、分解能が良いのは３ＶＤ８と４Ｏ７Ｑである。３ＶＤ８の結晶構造は４Ｏ７Ｑのアミノ酸配列よりも多くの情報を提供しているため、スクリーニング可能な結晶構造として優先的にリストされている。

【0031】

【表1】

【0032】

（２）結合部位の選択
ＡＩＭ２のＰＹＤ構造領域は、下流のシグナル伝達経路の調節にとって極めて重要である。ＰＹＤ構造領域のα２アミノ酸は特異性を持ち、また、ＰＹＤ構造領域は６つのヘリックスで構成されている。ＰＹＤ構造領域のα２のＤ１９、Ｅ２０、Ｄ２３、Ｆ２７、Ｆ２８は、ＡＩＭ２がリガンドタンパク質ＡＳＣのＰＹＤとＰＹＤ－ＰＹＤ相互作用を起こすために最も重要なアミノ酸である。したがって、３ＶＤ８の晶体構造を参考に、Ｄ１９、Ｅ２０、Ｄ２３、Ｆ２７、Ｆ２８から構成される結合部位を選択し、ＡＩＭ２タンパク質の新しい小分子阻害剤の仮想スクリーニングを行う。

【0033】

（３）コンピューターによる仮想スクリーニングの手順、小分子化合物ライブラリおよびターゲットタンパク質の選択と準備の決定
コンピューターによる仮想スクリーニングの手順：ＡＩＭ２のＤ１９、Ｅ２０、Ｄ２３、Ｆ２７、Ｆ２８から構成される結合部位を新しい小分子阻害剤のスクリーニング部位として確定し、ＡＩＭ２三次元晶体構造（ＰＤＢＩＤ：３ＶＤ８）を参考にする（図１参照）。仮想スクリーニングの計画手順は、図２に示されている。

【0034】

小分子化合物ライブラリ：小分子データベースはＣｈｅｍｄｉｖを選択した。
ターゲットタンパクの選択と準備：ＡＩＭ２の三次元構造（３ｖｄ８．ｐｄｂ）を基に、ｓｙｂｙｌ－Ｘ２．１の「ＰｒｅｐａｒｅＰｒｏｔｅｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒｅ」モジュールを使用してＡＩＭ２タンパク質を処理した。「ＲｅｍｏｖｅＳｕｂｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ」ですべての水分子を選択して除去し、次に「ＡｎａｌｙｚｅＳｅｌｅｃｔｅｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ」を使用してタンパク質を分析および修正し、タンパク質の水素原子を追加した。最後に、ｓｙｂｙｌのｐｒｏｔｏｍｏｌモジュールを使用して、ＰＹＤドメインのａｌｐｈａ２のＤ１９、Ｅ２０、Ｄ２３、Ｆ２７、Ｆ２８を選択し、活性部位の「Ｒｅｓｉｄｕｅ」生成方法を使用して、抑制剤の結合空洞ファイルである３ｖｄ８＿Ｈ－Ｒ－０．５０－０．ｓｆｘｃを生成した。これがターゲットタンパク質の処理後の出力ファイルである。

【0035】

（４）仮想スクリーニングの計算
ｓｙｂｙｌ－Ｘ２．１の「ＣｏｍｐｏｕｎｄＦｉｌｔｅｒｉｎｇ」モジュールを使用して、データベース内の化合物を選択し、以下の規則に合致する化合物を選択した。（ａ）分子量が７００未満であること。（ｂ）ｃＬｏｇＰ（エステル水分配係数）が－４から６の範囲内であること。（ｃ）水素結合受容体数が１５以下であること。（ｄ）水素結合供与体数が６以下であること。（ｅ）回転可能結合数が１１未満であること。このプロジェクトでは、ｓｙｂｙｌ薬剤設計プラットフォームの「ＣｏｍｐｏｕｎｄＦｉｌｔｅｒｉｎｇ」モジュールを使用して、小分子データベースを初期スクリーニングした。上記の５つの規則に基づく総合原則に従って、完全に５つの規則に従ってスクリーニングを行うと、小分子データベース内の化合物の数が大幅に減少し、化合物の多様性が明らかに低下するため、仮想スクリーニング段階で、化合物の多様性を増やすため、ある程度の生物活性を持つリード化合物の数を増やす必要がある。したがって、化合物の多様性を増やすため、仮想スクリーニングの段階で、「５つの規則」のパラメータ範囲を適度に拡大する必要がある。たとえば、分子量を７００に拡大し、ｃｌｏｇＰは化合物の親水性／疎水性を記述するため、範囲を広げることができる。同様に、水素結合供与体と受容体、回転可能な結合の数の範囲を適切に拡大する必要がある。

【0036】

（ｉ）第一回のバーチャルスクリーニング計算
Ｓｙｂｙｌ－Ｘ２．１ソフトウェアのＳｕｒｆｌｅｘモジュールを使用してスクリーニングを行う。ドッキングパラメータを一部変更して、最初のバーチャルスクリーニング速度を速め、スコアがトップ１％の分子をスクリーニングしてください。具体的には、「ＭａｘｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｐｅｒＦｒａｇｍｅｎｔ」をデフォルトの２０から１０に変更し、「Ｍａｘｎｕｍｂｅｒｏｆｒｏｔａｔａｂｌｅｂｏｎｄｓｐｅｒｍｏｌｅｃｕｌｅ」をデフォルトの１００から５０に変更する。デフォルトの「Ｐｅｒ－ＤｏｃｋＭｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ」と「Ｐｏｓｔ－ＤｏｃｋＭｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ」のオプションをキャンセルする。「Ｍａｘｉｍｕｍｎｕｍｂｅｒｏｆｐｏｓｅｓｐｅｒｌｉｇａｎｄ」をデフォルトの２０から３に変更し、各リガンド分子の上位３つの分子構造のみを保持し、ドッキング速度を速め、最終的にトップ１％の化合物を得る。

【0037】

（ｉｉ）第二回のバーチャルスクリーニング計算
Ｓｙｂｙｌ－Ｘ２．１ソフトウェアのＳｕｒｆｌｅｘモジュールを使用して第二のスクリーニングを行う。最初のスクリーニングでトップ１％に入った分子をベースにして、デフォルトのパラメータに戻す（つまり、「ＭａｘｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｐｅｒＦｒａｇｍｅｎｔ」はデフォルトの２０、「Ｍａｘｎｕｍｂｅｒｏｆｒｏｔａｔａｂｌｅｂｏｎｄｓｐｅｒｍｏｌｅｃｕｌｅ」はデフォルトのままである；「Ｐｅｒ－ＤｏｃｋＭｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ」および「Ｐｏｓｔ－ＤｏｃｋＭｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ」のオプションをデフォルトで選択し、化合物のドッキング前後のエネルギー最小化を最適化する。さらに、各分子の初期構造数を４つに増やし、トップ５００のターゲット化合物を人工的にスクリーニングする。

【0038】

（ｉｉｉ）手動フィルタリングとレビュー
第二次スクリーニングで得られた５００個のターゲット中の化合物を人工的にスクリーニングし、ＡＩＭ２のＰＹＤ構造ドメインのアルファ２と安定的な相互作用（水素結合、疎水性、π－π積み重ね相互作用）ができることを総合的に考慮した。具体的には、ＡＩＭ２上のＡｒｇ２４、Ｌｅｕ７２、Ａｓｎ７３などの多くのアミノ酸と複数の水素結合相互作用ができる。同時に、疎水性アミノ酸が多数存在する結合部位に結合することができる、Ｐｈｅ２７、Ｐｈｅ２８、Ａｌａ３６、Ｌｅｕ４０、Ｌｅｕ７２は疎水性ポケットを形成する。したがって、ターゲット化合物は、水素結合供与体（および受容体）基部、芳香族環構造および疎水性置換基を多く持っている必要がある。化合物の構造は、比較的剛性があり、回転可能なキーの数が多すぎない必要がある。最終的に、Ｃｈｅｍｄｉｖライブラリから、表２に示すように、４４個の化合物をＡＩＭ２阻害剤として選択した。

【0039】

【表2】

【0040】

（５）ＨａＣａｔ細胞モデルで抑制効果を持つ化合物をスクリーニングする
前記スクリーニングで選ばれた１００種類の化合物をＨａＣａｔ細胞においてＯｌｉｇｏｄＡ－Ｔ刺激から保護する能力を評価する。評価基準は、刺激後の細胞中のＩＬ－１β ｍＲＮＡをリアルタイム蛍光定量ＰＣＲで検出することである。陽性対照と比較して、４４種の小分子阻害剤の中で最も顕著な抑制効果（ｐ＜０．０００１）を示すものを理想的な阻害剤の候補として選択し、本発明で使用される化合物Ｉ（またはＴ６Ｓ１６８３とも呼ばれる）とする。

【0041】

（ｉ）実験グループは陽性対照（ＰＣ）と陰性対照（ＮＣ）を設定し、ＰＣグループはＬｉｐ３０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ３０００ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ）とＯｌｉｇｏｄＡ－Ｔの包装体（ＯｌｉｇｏｄＡ－Ｔ：Ｌｉｐ３０００：Ｐ３０００＝１：１：２５、ＯｌｉｇｏｄＡ－Ｔ濃度は１ｕｇ／ｍＬ）をＨａＣａｔ細胞にトランスフェクションする。各処理グループはＬｉｐ３０００－ＯｌｉｇｏｄＡ－Ｔの包装体と１０μＭの小分子阻害剤をＨａＣａｔ細胞に共同トランスフェクションする。ＮＣグループは同量のトランスフェクション試薬（Ｌｉｐ３０００：Ｐ３０００＝１：１）のみを加える。

【0042】

（ｉｉ）各実験グループは、細胞培養箱に５％含まれる３７℃で２４時間培養し、実時蛍光量ＰＣＲ検査に使用するために細胞を収集し、４６種類の小分子抑制剤の中から、最も顕著な抑制効果（ｐ＜０．０００１）を示す小分子を候補として選択した。さらに、２回目の検証を行い、結果は図３に示されている。（注：Ｔ６Ｓ１６８３はスクリーニング番号４である）

【0043】

この方法で選択された小分子、脱メトキシジンジャー（Ｔ６Ｓ１６８３とも呼ばれる）は、次のように名付けられた。１，６－ヘキセンジオン、１－（４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル）－７－（４－ヒドロキシフェニル）－、（１Ｅ、６Ｅ）－；化合物の分子量は３３８．３６であり、構造式は式Ｉのように示されている。

【化4】

【0044】

以下は、選択された小分子化合物Ｉの特性に関する詳細である。
（１）小分子化合物Ｔ６Ｓ１６８３について核磁気共鳴による特性評価を行った。図に示すように、芳香環の特徴的な水素が明確に観測され、２つのフェノールヒドロキシ基の活発な水素がピークを示し、裂け目が鮮明であり、化合物の構造と一致している。化合物の構造は正しい。

【0045】

（２）小分子化合物Ｔ６Ｓ１６８３について、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による特性評価を行った。図５に示すように、保持時間１０．１４、ピーク面積比が９８．１％であり、化合物の純度が非常に高いことを示している。

【0046】

選択された小分子化合物Ｉの合成ルートは以下の通りである。

【化5】

【0047】

以下の実施例において、データの統計学的解析方法は、ＳＰＳＳ２３．０およびＲＶｅｒｓｉｏｎ４．０．２版ソフトウェアを使用してデータ処理と分析を行い、すべての検定は両側検定を採用し、Ｐ値が０．０５未満であれば統計的意義があると見なされる。

【0048】

本発明をよりよく理解するために、具体的な例を組み合わせて本発明の内容をさらに説明するが、本発明の内容は以下の例に限定されるものではない。

【0049】

実施例１ Ｔ６Ｓ１６８３とＡＩＭ２タンパク質の相互作用モード
本発明の実施例では、Ｔ６Ｓ１６８３とＡＩＭ２の結合モードを予測分析した。まず、Ｓｙｂｙｌ－Ｘ２．１ソフトウェアのＳｕｒｆｌｅｘモジュールを使用して、結合モードを予測し、次に、小分子が蛋白質ＡＩＭ２のＡｒｇ２４、Ｌｅｕ７２、Ａｓｎ７３などの複数のアミノ酸と多数の水素結合を形成するかどうかを人工的にスクリーニングと再確認した。結果は図６に示されており、Ｔ６Ｓ１６８３はＡｒｇ２４、Ａｓｐ２３、Ｈｉｓ４１との間に水素結合を形成する。複数の水素結合の相互作用は、化合物Ｔ６Ｓ１６８３とＡＩＭ２タンパク質の結合を維持するのに共同している。

【0050】

実施例２ Ｔ６Ｓ１６８３とＡＩＭ２ヒトタンパク質の高い親和力のテスト
本発明の実施例では、Ｔ６Ｓ１６８３とＡＩＭ２ヒトタンパク質の親和力を測定した。まず、ｐＥＴ２８Ａベクターを使用して、ヒト全長ＡＩＭ２タンパク質をそれぞれ発現して純化した。その後、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ－ｐｌａｓｍｏｎｒｅｓｏｎａｎｃｅ， ＳＰＲ）法を使用して、ＣＭ５チップのアミン結合法を使用して親和能力を測定した。結果は図７に示されており、Ｔ６Ｓ１６８３はヒト源ＡＩＭ２タンパク質と特異的に結合し、結合定数は１．５６Ｅ ^－６ Ｍで、高い結合能力を持つことが示された。

【0051】

実施例３ Ｔ６Ｓ１６８３とＡＩＭ２マウス由来タンパク質の強い親和性テスト
本発明の実施例では、Ｔ６Ｓ１６８３とＡＩＭ２マウス由来タンパク質の親和性を検査した。まず、ｐＥＴ２８Ａベクターを使用してマウス由来全長ＡＩＭ２タンパク質をそれぞれ発現精製した。次に、Ｂｉａｃｏｒｅの表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ－ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ， ＳＰＲ）法を用いてＣＭ５チップのアミノ基結合法を使用して親和力を測定した。検査結果は図８に示されており、Ｔ６Ｓ１６８３はマウス由来ＡＩＭ２タンパク質と特異的に結合し、結合定数は５．１２Ｅ ^－６ Ｍで、結合能力が非常に強いことが示されている。

【0052】

実施例４ ＨａＣａｔ細胞モデルにおけるＴ６Ｓ１６８３によるＡＩＭ２タンパク質活性の効果的な抑制
（１）陽性対照（ＰＣ）、陰性対照（ＮＣ）および各処理グループを設定する。ＰＣグループでは、Ｌｉｐ３０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ３０００ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ）およびＯｌｉｇｏｄＡ－Ｔパッケージ（ＯｌｉｇｏｄＡ－Ｔ：Ｌｉｐ３０００：Ｐ３０００＝１：１：２５、ＯｌｉｇｏｄＡ－Ｔ濃度は１ｕｇ／ｍＬ）を使用してＨａＣａｔ細胞に転染する。ＮＣグループでは、同量のトランスフェクション試薬（Ｌｉｐ３０００：Ｐ３０００＝１：１）のみを加える。各処理グループでは、Ｌｉｐ３０００－ＯｌｉｇｏｄＡ－Ｔパッケージで共にＨａＣａｔ細胞に梯度用量（０．１ｕＭ、１ｕＭ、５ｕＭ、１０ｕＭおよび２５ｕＭ）のＴ６Ｓ１６８３を転染する。

【0053】

（２）前記陽性対照群（ＰＣ）、陰性対照群（ＮＣ）および各処理群を含む培養細胞箱に入れ、５％のＣＯ _２ を含む３７℃で２４時間培養し、細胞を収集してリアルタイム蛍光定量ＰＣＲ検査を行い、異なる投与量の抑制剤がＨａＣａｔ細胞内のＡＩＭ２経路の活性化に及ぼす影響を観察した。結果は図９に示されており、陽性対照群と比較して、１０μＭのＴ６Ｓ１６８３が５つの投与量グラデーションの中でＨａＣａｔ細胞のＩＬ－β転写水準を最も低下させることがわかった。

【0054】

（３）同時に、１００倍の顕微鏡視野で１０μＭグラデーションの細胞状態を観察し、その結果は図１０に示されており、この群の細胞状態は陰性対照群の細胞状態に近く、透明な焦死細胞の割合が非常に少なく、細胞密度が高く、壁に密着していた。

【0055】

（２）および（３）の結果から、１０μＭのＴ６Ｓ１６８３がＨａＣａｔ細胞のＡＩＭ２活性を抑制する最適な用量である可能性があることがわかった。

【0056】

（４）その後、１０ｕＭのＴ６Ｓ１６８３で処理されたＨａＣａｔ細胞のＡＩＭ２下流タンパク質の発現状況を検査し、結果は図１１と図１２に示されている。１０ｕＭのＴ６Ｓ１６８３処理によるＡＩＭ２下流のｃａｓｐａｓｅ－１の発現はわずかに低下したことが確認された（ＷＢ試験では、ＰＭＡ刺激を受けたＴＨＰ１細胞をタンパク質の陽性参照として使用した）。その後、活性化されたＩＬ－１βの発現を検出するために、ＥＬＩＳＡ試薬キットを使用した。その結果、１０ｕＭのＴ６Ｓ１６８３がＩＬ－１βの分泌を抑制する効果があることが明らかになった。

【0057】

実施例５ Ｔ６Ｓ１６８３が乾癬動物モデルにおいてＡＩＭ２蛋白質活性を高効率に抑制するテスト
本発明の実施例では、ＤＭＳＯを使用してＴ６Ｓ１６８３パウダーを溶解し、異なる使用量のパウダーを称量し、β－シクロデキストリンで希釈する。ＤＭＳＯの最終濃度は５％以下になる。設定されたＴ６Ｓ１６８３の投与量グラデーションは、０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇで、各マウスは２０ｇで計算され、１日あたりの投与量は、０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇになる。

【0058】

７週齢のＣ５７／ＢＬ６マウスを選択し、ＳＰＦレベルの環境で飼育およびモデリングを行い、実験グループは以下の通りである。（ａ）０ｍｇ／ｋｇのＴ６Ｓ１６８３を使用したＩＭＱと皮膚に塗布；（ｂ）１ｍｇ／ｋｇのＴ６Ｓ１６８３を使用したＩＭＱと皮膚に塗布；（ｃ）２．５ｍｇ／ｋｇのＴ６Ｓ１６８３を使用したＩＭＱと皮膚に塗布；（ｄ）５ｍｇ／ｋｇのＴ６Ｓ１６８３を使用したＩＭＱと皮膚に塗布；（
ｅ）１０ｍｇ／ｋｇのＴ６Ｓ１６８３を使用したＩＭＱと皮膚に塗布；（ｆ）０ｍｇ／ｋｇのＴ６Ｓ１６８３を使用したＶａｓｅｌｉｎｅと皮膚に塗布；（ｇ）１ｍｇ／ｋｇのＴ６Ｓ１６８３を使用したＶａｓｅｌｉｎｅと皮膚に塗布；（ｈ）２．５ｍｇ／ｋｇのＴ６Ｓ１６８３を使用したＶａｓｅｌｉｎｅと皮膚に塗布；（ｉ）５ｍｇ／ｋｇのＴ６Ｓ１６８３を使用したＶａｓｅｌｉｎｅと皮膚に塗布；（ｊ）１０ｍｇ／ｋｇのＴ６Ｓ１６８３を使用したＶａｓｅｌｉｎｅと皮膚に塗布。（注：（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）グループのマウスには、ＩＭＱを１日あたり６２．５ｍｇ／１匹使用する。（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）および（ｊ）グループのマウスには、Ｖａｓｅｌｉｎｅを１日あたり６２．５ｍｇ／１匹使用する。

【0059】

６匹のグループごとにマウスを剃って、背中の毛を取り除き、裸皮面積が４平方センチメートルになるように調整し、実験開始日をＤａｙ０、終了日をＤａｙ６と設定した。Ｄａｙ０からＤａｙ５まで、毎日５００マイクロリットルの薬液を均一にマウスの皮膚に塗布して吸収させる。５００μｌの薬液は、朝に１５０μｌ、昼に２００μｌ、夜に１５０μｌの投与量に分割して塗布する。Ｄａｙ２からＤａｙ５まで、Ｔ６Ｓ１６８３抑制剤を塗布した後、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）のグループの各マウスに６２．５ｍｇのＩＭＱを塗布する。（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）のグループの各マウスには６２．５ｍｇのバセリンを塗布する。毎日マウスの皮膚を評価し、Ｄａｙ６にマウスを安楽死し、皮膚組織を採取して一連の検査を行った。

【0060】

前記ＩＭＱモデルのマウスのＰＡＳＩ評価結果、皮膚表現型、皮膚病理表現型は、それぞれ図１３、図１４、図１５に示されている。３つの用量のＴ６Ｓ１６８３は、ＩＭＱマウスの炎症表現型を異なる程度で軽減した。そのうち、５ｍｇ／ｋｇ投与量の軽減効果が最も顕著であり、１ｍｇ／ｋｇ投与量の効果に差がなかった。

【0061】

前記各グループのマウスの皮膚リンパ球（ＣＤ３ ^＋ ＴＣＲｄ ^＋ ＲＯＲγＴ ^＋ のＴ細胞の割合、このタイプの細胞はＡＩＭ２経路によって中介される主要な効果細胞であり、大量のＩＬ－１７細胞因子を分泌することにより乾癬を悪化させる）を分離し、流式細胞分析を行った。その結果、Ｔ６Ｓ１６８３の５ｍｇ／ｋｇ処理を受けたＩＭＱマウス（図１６と図１７）と、Ｔ６Ｓ１６８３を使用しないＩＭＱマウスと比較して、ＣＤ３ ^＋ ＴＣＲｄ ^＋ ＲＯＲγＴ ^＋ の割合が有意に低下していることが示された。

【0062】

その後、ＡＩＭ２経路遺伝子の転写レベルをマウスの皮膚で測定し、５ｍｇ／ｋｇ群のマウスではＩＬ－１β遺伝子発現レベルが有意に低下していることが統計的に示された（図１８）。これは、５ｍｇ／ｋｇのＴ６Ｓ１６８３を使用して処理されたマウスの皮膚中のＡＩＭ２下流のＩＬ－１βが抑制され、その含量が低下し、炎症表現が緩和されたことを示している。

【0063】

最後に説明すると、前記実施例は、本発明の技術的な解決策を説明するためのものであり、制限するものではない。最適な実施例を参照しても、本分野の一般的な技術者は、本発明の技術的な解決策を変更または同等のものに置き換えることができることを理解する必要がある。それらは、本発明の技術的な解決策の目的と範囲から外れることなく、本発明の請求範囲に含まれるものとする。

【手続補正2】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＡＩＭ２タンパク質の活性の抑制に用いられる化合物またはその派生製品であって、前記化合物は下記式Ｉ

【化1】

で表されることを特徴とするＡＩＭ２タンパク質の活性の抑制に用いられる化合物またはその派生製品。

【請求項2】

前記化合物は医薬用塩の形態であることを特徴とする請求項１に記載のＡＩＭ２タンパク質の活性の抑制に用いられる化合物またはその派生製品。

【請求項3】

前記化合物は医薬用酸付加塩の形態であることを特徴とする請求項２に記載のＡＩＭ２タンパク質の活性の抑制に用いられる化合物またはその派生製品。

【請求項4】

化合物またはその派生製品でＡＩＭ２タンパク質活性抑制薬物を製造する方法であって、前記化合物は下記式Ｉで

【化2】

表されることを特徴とする化合物またはその派生製品でＡＩＭ２タンパク質活性抑制薬物を製造する方法。

【請求項5】

前記ＡＩＭ２タンパク質の活性抑制薬剤は乾癬病変組織のＡＩＭ２タンパク質活性を抑制するための薬剤であることを特徴とする請求項４に記載の化合物またはその派生製品でＡＩＭ２タンパク質活性抑制薬物を製造する方法。

【請求項6】

前記化合物は医薬用塩の形態であることを特徴とする請求項４または５に記載の化合物またはその派生製品でＡＩＭ２タンパク質活性抑制薬物を製造する方法。

【請求項7】

前記化合物は医薬用酸付加塩の形態であることを特徴とする請求項６に記載の化合物またはその派生製品でＡＩＭ２タンパク質活性抑制薬物を製造する方法。

【請求項8】

前記ＡＩＭ２タンパク質の活性抑制薬剤の剤型は、カプセル剤、錠剤、口服剤、微粒子剤、注射剤、栓剤、噴霧剤、または軟膏剤であることを特徴とする請求項４に記載の化合物またはその派生製品でＡＩＭ２タンパク質活性抑制薬物を製造する方法。

【請求項9】

前記ＡＩＭ２タンパク質の活性抑制薬剤の剤型は、カプセル剤、錠剤、口服剤、微粒子剤、注射剤、栓剤、噴霧剤、または軟膏剤であることを特徴とする請求項６に記載の化合物またはその派生製品でＡＩＭ２タンパク質活性抑制薬物を製造する方法。