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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024012431
(43)【公開日】2024-01-30
(54)【発明の名称】抗ＢＣＭＡ抗体及びその用途
(51)【国際特許分類】
C07K 16/18 20060101AFI20240123BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240123BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20240123BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240123BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240123BHJP
【ＦＩ】
C07K16/18 ZNA
A61K39/395 N
A61K39/395 D
A61P7/00
A61P35/00
C12N15/09 Z
【審査請求】有
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023186050
(22)【出願日】2023-10-31
(62)【分割の表示】P 2020559502の分割
【原出願日】2019-06-26
(31)【優先権主張番号】10-2018-0073320
(32)【優先日】2018-06-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519238473
【氏名又は名称】エービーエル バイオ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110003007
【氏名又は名称】弁理士法人謝国際特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】パク、キョンジン
(72)【発明者】
【氏名】チェン、ヘジン
(72)【発明者】
【氏名】パク、キョンス
(72)【発明者】
【氏名】イ、ヤンソン
(72)【発明者】
【氏名】チャン、ミキョン
(72)【発明者】
【氏名】チョン、ジェヒョン
(72)【発明者】
【氏名】キム、ヨングァン
(72)【発明者】
【氏名】チョン、チュンヒョン
(72)【発明者】
【氏名】ユ、チソン
(72)【発明者】
【氏名】キム、ヨンチュ
(72)【発明者】
【氏名】ヨム、トンフン
(72)【発明者】
【氏名】キム、ウンチョン
(72)【発明者】
【氏名】イ、ボラ
(72)【発明者】
【氏名】チョン、ジンウォン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ＢＣＭＡ（Ｂ-cell maturation antigen）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、それを製造する方法、及びその用途を提供する。
【解決手段】本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＢＣＭＡタンパク質と、ＢＣＭＡタンパク質に特異的に結合する物質との結合を阻害するものである。前記ＢＣＭＡタンパク質に特異的に結合する物質は、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）、またはそれらの組み合わせである。前記抗体またはその抗原結合断片を含む癌の予防用または治療用の薬学的組成物も提供する。
【選択図】なし
【解決手段】本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＢＣＭＡタンパク質と、ＢＣＭＡタンパク質に特異的に結合する物質との結合を阻害するものである。前記ＢＣＭＡタンパク質に特異的に結合する物質は、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）、またはそれらの組み合わせである。前記抗体またはその抗原結合断片を含む癌の予防用または治療用の薬学的組成物も提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（１）配列番号２９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
配列番号３７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、
配列番号４８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、
配列番号１２７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号６８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
配列番号７７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体；
（２）配列番号２９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
配列番号３７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、
配列番号４８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、
配列番号１２４からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号６８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
配列番号７７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体；
（３）配列番号２９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
配列番号３７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、
配列番号４８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、
配列番号１２５からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号６８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
配列番号７７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体；
（４）配列番号２９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
配列番号３７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、
配列番号４８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、
配列番号１２６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号６８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
配列番号７７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体；
（５）配列番号２９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
配列番号３７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、
配列番号４８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、
配列番号１２８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号６８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
配列番号７７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体；及び
（６）配列番号２９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
配列番号３７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、
配列番号４８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、
配列番号５８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号６８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
配列番号７７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体。
からなる群から選択された、
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
配列番号３７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、
配列番号４８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、
配列番号１２７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号６８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
配列番号７７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体；
（２）配列番号２９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
配列番号３７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、
配列番号４８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、
配列番号１２４からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号６８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
配列番号７７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体；
（３）配列番号２９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
配列番号３７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、
配列番号４８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、
配列番号１２５からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号６８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
配列番号７７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体；
（４）配列番号２９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
配列番号３７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、
配列番号４８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、
配列番号１２６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号６８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
配列番号７７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体；
（５）配列番号２９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
配列番号３７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、
配列番号４８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、
配列番号１２８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号６８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
配列番号７７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体；及び
（６）配列番号２９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
配列番号３７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、
配列番号４８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、
配列番号５８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号６８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
配列番号７７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体。
からなる群から選択された、
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項2】
重鎖可変領域は、配列番号７のアミノ酸配列を含むものである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項3】
軽鎖可変領域は、配列番号１８、及び配列番号１１５ないし１１９からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むものである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項4】
前記抗体またはその抗原結合断片は、ＢＣＭＡタンパク質と、ＢＣＭＡタンパク質に特異的に結合する物質との結合を阻害するものである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項5】
前記ＢＣＭＡタンパク質に特異的に結合する物質は、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）、またはそれらの組み合わせである、請求項４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項6】
前記抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項7】
前記抗体またはその抗原結合断片は、抗癌剤と接合されたものである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項8】
請求項１ないし７のうちいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む癌の予防用または治療用の薬学的組成物。
【請求項9】
前記癌は、多発性骨髄腫である、請求項８に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）タンパク質に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片、それを製造する方法、及びその用途に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ：Ｂ-cell maturation antigen）は、約２０ＫＤａのタンパク質であり、腫瘍懐死因子受容体（ＴＮＦＲ：tumor necrosis factor receptor）に属するタンパク質である。ＢＣＭＡは、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ：Ｂ－cell activating factor belonging to the tumor necrosis factor family）と増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ：a proliferation inducing ligand）とのリガンドとして知られている。病理的状況において、ＢＣＭＡは、多発性骨髄腫（ＭＭ：multiple myeloma）患者の腫瘍形質細胞（neoplastic plasma cell）で発現し、多発性骨髄腫患者群の生存率は、ＢＣＭＡ発現が高いほど低くなる（Moreaux et al., Eur J Haematol 2009; 83: 119-129）。
多発性骨髄腫は、形質細胞の単クローン性の増殖によって発生する腫瘍性疾患であり、これまで、サリドマイド（thalidomide）、ボルテゾミブ（bortezomib）、レナリドミド（lenalidomide）のような薬剤の開発と、治療方法の発達とにより、初期治療反応率は、上昇したが、いまだに生存期間において、明らかな向上性を示すことができない実情である。最近、多発性骨髄腫の治療剤として、ＣＤ３８とＣＳ－１／ＳＬＡＭＦ７とを標的とするモノクローン抗体がＦＤＡに承認を受けたが、再発性／難治性多発性骨髄腫患者（relapsed/refractory ＭＭ patients）を含んだ一部群においては、効果が微々たるものであり、特に、ＣＤ３８がリンパ球を含む免疫細胞だけではなく、赤血球の表面においても一部発現され、ＣＤ３８に対する抗体処理時、各種輸血前検査において、偽陽性を示す場合が報告されている。従って、既存薬物対比で副作用が少なく、効能が増大された多発性治療剤の開発が必要である実情である。
正常細胞での制限的な発現と、病理的状況での特異的発現との様相を示すＢＣＭＡは、多発性骨髄腫治療剤の主要ターゲット候補物質のうち一つに考慮されている。従って、ＢＣＭＡを特異的に認識し、その機能を抑制または調節することができる抗体を開発する必要性がある。
多発性骨髄腫は、形質細胞の単クローン性の増殖によって発生する腫瘍性疾患であり、これまで、サリドマイド（thalidomide）、ボルテゾミブ（bortezomib）、レナリドミド（lenalidomide）のような薬剤の開発と、治療方法の発達とにより、初期治療反応率は、上昇したが、いまだに生存期間において、明らかな向上性を示すことができない実情である。最近、多発性骨髄腫の治療剤として、ＣＤ３８とＣＳ－１／ＳＬＡＭＦ７とを標的とするモノクローン抗体がＦＤＡに承認を受けたが、再発性／難治性多発性骨髄腫患者（relapsed/refractory ＭＭ patients）を含んだ一部群においては、効果が微々たるものであり、特に、ＣＤ３８がリンパ球を含む免疫細胞だけではなく、赤血球の表面においても一部発現され、ＣＤ３８に対する抗体処理時、各種輸血前検査において、偽陽性を示す場合が報告されている。従って、既存薬物対比で副作用が少なく、効能が増大された多発性治療剤の開発が必要である実情である。
正常細胞での制限的な発現と、病理的状況での特異的発現との様相を示すＢＣＭＡは、多発性骨髄腫治療剤の主要ターゲット候補物質のうち一つに考慮されている。従って、ＢＣＭＡを特異的に認識し、その機能を抑制または調節することができる抗体を開発する必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本発明が解決しようとする課題は、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供することである。
本発明が解決しようとする課題は、また、ＢＣＭＡの活性化または過生産と係わる癌の予防用または治療用の薬学的組成物を提供することである。
本発明が解決しようとする課題は、また、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を製造する方法を提供することである。
本発明が解決しようとする課題は、また、ＢＣＭＡタンパク質の活性化または過生産と係わる癌を予防または治療する方法を提供する。
本発明が解決しようとする課題は、また、ＢＣＭＡの活性化または過生産と係わる癌の予防用または治療用の薬学的組成物を提供することである。
本発明が解決しようとする課題は、また、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を製造する方法を提供することである。
本発明が解決しようとする課題は、また、ＢＣＭＡタンパク質の活性化または過生産と係わる癌を予防または治療する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0004】
配列番号２７ないし５５からなる群から選択された１以上のアミノ酸配列を含む重鎖（heavy chain）可変領域（variable region）；
配列番号５６ないし８４、及び配列番号１２０ないし１２８からなる群から選択された１以上のアミノ酸配列を含む軽鎖（light chain）可変領域；
または前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域；を含むＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ：Ｂ-cell maturation antigen）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。
前記重鎖は、５種（γ、δ、α、μ、ε）があり、重鎖が抗体の種類を決定づける。αとγは、４５０個、μとεは、５５０個のアミノ酸によって構成されている。該重鎖は、２つの領域、すなわち、可変領域と不変領域とがある。
前記軽鎖は、λ、κの２種があり、およそ２１１ないし２１７個のアミノ酸によって構成されている。ヒト抗体それぞれには、いずれも同一に１種の鎖だけが存在する。該軽鎖は、不変領域と可変領域とから連続してなっている。
前記可変領域は、抗体において、抗原が結合する領域を言う。
前記重鎖可変領域は、配列番号２７ないし３４からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ：complementarity determining region）－Ｈ１；配列番号３５ないし４５からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び配列番号４６ないし５５からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含んでもよい。用語「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、抗体の可変部位において、抗原との結合特異性を付与する部位を言う。例えば、前記重鎖可変領域は、配列番号５ないし１５からなる群から選択されたアミノ酸配列を含んでもよい。
前記軽鎖可変領域は、配列番号５６ないし６５、配列番号１２０，１２１、及び配列番号１２４ないし１２８からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号６６ないし７４からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び配列番号７５ないし８４、及び配列番号１２２，１２３からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含んでもよい。例えば、前記軽鎖可変領域は、配列番号１６ないし２６、及び配列番号１０７ないし１１９からなる群から選択されたアミノ酸配列を含んでもよい。
前記抗体は、配列番号２７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３５からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号５６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７５からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号５７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号５８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号３０からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号５９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号３１からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号６０からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号３１からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４０からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号５０からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号６１からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７０からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号８０からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号３２からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４１からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号５１からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号６２からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７１からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号８１からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号３３からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４２からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号５２からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号６３からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７２からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号８２からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号３３からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４３からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号５３からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号６４からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７３からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号８３からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号３３からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４４からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号５４からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号６３からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７２からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号８２からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号３４からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４５からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号５５からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号６５からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７４からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号８４からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２０からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２１からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号５７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１２２からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号５７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１２３からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２０からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１２２からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２０からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１２３からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２１からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１２２からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２１からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１２３からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２４からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２５からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記配列番号１２０ないし１２８のうち１以上の軽鎖ＣＤＲを含む抗体は、それぞれの野生型抗体に比べ、標的抗原結合能が向上されたものでもある。
前記Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片でもある。ＢＣＭＡは、ＴＮＦＲＳＦ１７（tumor necrosis factor receptor super family member １７）、ＢＣＭ、ＣＤ２６９、またはＴＮＦＲＳＦ１３Ａ、ＴＮＦ受容体スーパーファミリメンバー１７とも呼ばれる。前記ＢＣＭＡポリペプチドは、GenBank Accession Ｎｏ．ＮＰ＿００１１８３のヒトアミノ酸配列、またはGenBank Accession Ｎｏ．ＮＰ＿０３５７３８のマウスアミノ酸配列を含んでもよい。前記ＢＣＭＡポリペプチドは、GenBank Accession Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９２のポリヌクレオチド（ヒト）、またはGenBank Accession Ｎｏ．ＮＭ＿０１１６０８のポリヌクレオチド（マウス）によって暗号化されるアミノ酸配列を含んでもよい。前記断片は、ＢＣＭＡポリペプチドの一部アミノ酸配列を含むポリペプチドでもある。
前記ＢＣＭＡに特異的に結合するものは、ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片に親和度を有するものでもある。前記抗体またはその抗原結合断片は、ＢＣＭＡの細胞外ドメインに親和度を有するものでもある。前記抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１において、Ｎ末端から、１ないし５４番目のアミノ酸配列のうちいずれかのアミノ酸に特異的に結合することができる。
前記抗体またはその抗原結合断片は、ＢＣＭＡタンパク質と、ＢＣＭＡタンパク質に特異的に結合する物質との結合を阻害することができる。前記ＢＣＭＡタンパク質に特異的に結合する物質は、リガンドとも称され、例えば、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ：Ｂ－cell activating factor belonging to the tumor necrosis factor family）、増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ：a proliferation inducing ligand）、またはそれらの組み合わせである。
前記用語「抗体（antibody）」は、用語「免疫グロブリン（Ｉｇ：immunoglobulin）」と相互交換的に使用される。完全な抗体は、２個の全長（full length）軽鎖、及び２個の全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖と二硫化結合（ＳＳ-bond：disulfide bond）で結合する。該抗体は、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭでもある。前記抗体は、モノクローン抗体またはポリクローン抗体でもある。前記抗体は、動物由来抗体、マウス・ヒトキメラ抗体（chimeric antibody）、ヒト化抗体（humanized antibody）またはヒト抗体でもある。
前記用語「抗原結合断片（antigen-binding fragment）」は、免疫グロブリン全体構造に係わるその断片であり、抗原が結合することができる部分を含むポリペプチドの一部を言う。例えば、該抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ＦｖＦ（ａｂ’）２、またはそれらの組み合わせでもある。
前記抗体またはその抗原結合断片は、変形されたものでもある。例えば、前記抗体またはその抗原結合断片は、接合（conjugation）または結合、糖化（glycosylation）、脱アミド化（deamidation）、タグ付着、またはそれらの組み合わせによって変形されたものでもある。
前記抗体またはその抗原結合断片は、抗癌剤のような他の薬物とも接合される。例えば、前記抗体またはその抗原結合断片は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ：horseradish peroxidase）、アルカリホスファターゼ、ヘプテン（hapten）、ビオチン、ストレブトアビジン、蛍光物質、放射性物質、量子点、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ：polyethylene glycol）、ヒスチジンタグ、またはそれらの組み合わせと結合されたものでもある。前記蛍光物質は、Alexa Fluor(登録商標) ５３２、Alexa Fluor(登録商標) ５４６、Alexa Fluor(登録商標) ５６８、Alexa Fluor(登録商標) ６８０、Alexa Fluor(登録商標) ７５０、Alexa Fluor(登録商標) ７９０またはAlexa Fluor(登録商標) ＴＭ３５０でもある。
ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む癌の予防用または治療用の薬学的組成物を提供する。
前述の抗体、抗原結合断片及びＢＣＭＡは、前述の通りである。
前記癌は、ＢＣＭＡタンパク質の活性化または過生産と係わる疾病でもある。前記癌は、固形癌または非固形癌でもある。固形癌は、例えば、肝臓、肺、乳房、皮膚のような臓器に癌腫瘍が発生したものを言う。非固形癌は、血液内で発生した癌であり、血液癌とも呼ばれる。前記癌は、多発性骨髄腫でもある。
前記用語「予防」は、前記薬学的組成物の投与により、癌を抑制したり、その発病を遅延させたりする全ての行為を言う。前記用語「治療」は、前記薬学的組成物の投与により、癌の症状が好転したり、好ましく変更されたりする全ての行為を言う。
前記薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。前記担体は、賦形剤、希釈剤または補助剤を含む意味で使用される。前記担体は、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、生理食塩水、ＰＢＳのような緩衝液、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルからなる群から選択されたものでもある。前記組成物は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、風味剤、乳化剤、保存剤、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。
前記薬学的組成物は、通常の方法により、任意の剤形に準備することができる。前記組成物は、例えば、経口投与剤形（例えば、粉末、錠剤、カプセル、シロップ、丸薬または顆粒）、あるいは非経口剤形（例えば、注射剤）にも剤形化される。また、前記組成物は、全身剤形または局所剤形にも製造される。
前記薬学的組成物は、前記抗体またはその抗原結合断片、抗癌剤、またはそれらの組み合わせを有効な量にも含む。用語「有効な量」は、予防または治療を必要とする個体に投与される場合、予防または治療の効果を示すに十分な量を言う。前記有効な量は、当業者が、選択される細胞または個体によって適切に選択することができる。疾患の重症度、患者の年齢・体重・健康状態・性別、患者の薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、使用された組成物との配合、または同時使用される薬物を含む要素、及びその他医学分野に周知の要素によっても決定される。前記有効な量は、前記薬学的組成物当たり約０．５μｇないし約２ｇでもある。
前記薬学的組成物の投与量は、例えば、大人基準で、約０．００１ｍｇ／ｋｇないし約１００ｍｇ／ｋｇの範囲内でもある。前記投与は、１日１回、１日多数回、または１週間ないし４週間に１回、または１年に１回ないし１２回投与されうる。
ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を個体に投与する段階を含む癌を予防または治療する方法を提供する。
前述の抗体、抗原結合断片、ＢＣＭＡ、癌、予防及び治療は、前述の通りである。
前記個体は、哺乳動物、例えば、ヒト、牛、馬、豚、犬、羊、山羊または猫でもある。前記個体は、ＢＣＭＡタンパク質の活性化または過生産と係わる疾病、例えば、癌を病んでいたり、病む可能性が高かったりする大きい個体でもある。
前記抗体またはその抗原結合断片、抗癌剤、またはそれらの組み合わせは、例えば、経口、静脈内、筋肉内、経皮（transdermal）、粘膜、鼻内（intranasal）、器官内（intratracheal）または皮下投与のような任意手段により、個体に直接的に投与されうる。前記抗体またはその抗原結合断片、抗癌剤、またはそれらの組み合わせは、全身的または局所的にも投与され、単独、または他の薬学的活性化合物と共にも投与される。
前述の抗体またはその抗原結合断片、抗癌剤、またはそれらの組み合わせの望ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者によって適切に選択されうる。前記投与量は、例えば、大人基準で、約０．００１ｍｇ／ｋｇないし約１００ｍｇ／ｋｇの範囲内でもある。前記投与は、１日１回、１日多数回、または１週間ないし４週間に１回、または１年に１回ないし１２回投与されうる。
配列番号５６ないし８４、及び配列番号１２０ないし１２８からなる群から選択された１以上のアミノ酸配列を含む軽鎖（light chain）可変領域；
または前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域；を含むＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ：Ｂ-cell maturation antigen）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。
前記重鎖は、５種（γ、δ、α、μ、ε）があり、重鎖が抗体の種類を決定づける。αとγは、４５０個、μとεは、５５０個のアミノ酸によって構成されている。該重鎖は、２つの領域、すなわち、可変領域と不変領域とがある。
前記軽鎖は、λ、κの２種があり、およそ２１１ないし２１７個のアミノ酸によって構成されている。ヒト抗体それぞれには、いずれも同一に１種の鎖だけが存在する。該軽鎖は、不変領域と可変領域とから連続してなっている。
前記可変領域は、抗体において、抗原が結合する領域を言う。
前記重鎖可変領域は、配列番号２７ないし３４からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ：complementarity determining region）－Ｈ１；配列番号３５ないし４５からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び配列番号４６ないし５５からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含んでもよい。用語「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、抗体の可変部位において、抗原との結合特異性を付与する部位を言う。例えば、前記重鎖可変領域は、配列番号５ないし１５からなる群から選択されたアミノ酸配列を含んでもよい。
前記軽鎖可変領域は、配列番号５６ないし６５、配列番号１２０，１２１、及び配列番号１２４ないし１２８からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号６６ないし７４からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び配列番号７５ないし８４、及び配列番号１２２，１２３からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含んでもよい。例えば、前記軽鎖可変領域は、配列番号１６ないし２６、及び配列番号１０７ないし１１９からなる群から選択されたアミノ酸配列を含んでもよい。
前記抗体は、配列番号２７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３５からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号５６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７５からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号５７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号５８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号３０からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号５９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号３１からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号６０からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号３１からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４０からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号５０からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号６１からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７０からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号８０からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号３２からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４１からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号５１からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号６２からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７１からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号８１からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号３３からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４２からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号５２からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号６３からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７２からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号８２からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号３３からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４３からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号５３からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号６４からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７３からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号８３からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号３３からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４４からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号５４からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号６３からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７２からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号８２からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号３４からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４５からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号５５からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号６５からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７４からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号８４からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２０からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２１からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号５７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１２２からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号５７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１２３からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２０からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１２２からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２０からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１２３からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２１からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１２２からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２１からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１２３からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２４からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２５からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２６からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記抗体は、配列番号２９からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６８からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７７からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体でもある。
前記配列番号１２０ないし１２８のうち１以上の軽鎖ＣＤＲを含む抗体は、それぞれの野生型抗体に比べ、標的抗原結合能が向上されたものでもある。
前記Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片でもある。ＢＣＭＡは、ＴＮＦＲＳＦ１７（tumor necrosis factor receptor super family member １７）、ＢＣＭ、ＣＤ２６９、またはＴＮＦＲＳＦ１３Ａ、ＴＮＦ受容体スーパーファミリメンバー１７とも呼ばれる。前記ＢＣＭＡポリペプチドは、GenBank Accession Ｎｏ．ＮＰ＿００１１８３のヒトアミノ酸配列、またはGenBank Accession Ｎｏ．ＮＰ＿０３５７３８のマウスアミノ酸配列を含んでもよい。前記ＢＣＭＡポリペプチドは、GenBank Accession Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９２のポリヌクレオチド（ヒト）、またはGenBank Accession Ｎｏ．ＮＭ＿０１１６０８のポリヌクレオチド（マウス）によって暗号化されるアミノ酸配列を含んでもよい。前記断片は、ＢＣＭＡポリペプチドの一部アミノ酸配列を含むポリペプチドでもある。
前記ＢＣＭＡに特異的に結合するものは、ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片に親和度を有するものでもある。前記抗体またはその抗原結合断片は、ＢＣＭＡの細胞外ドメインに親和度を有するものでもある。前記抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１において、Ｎ末端から、１ないし５４番目のアミノ酸配列のうちいずれかのアミノ酸に特異的に結合することができる。
前記抗体またはその抗原結合断片は、ＢＣＭＡタンパク質と、ＢＣＭＡタンパク質に特異的に結合する物質との結合を阻害することができる。前記ＢＣＭＡタンパク質に特異的に結合する物質は、リガンドとも称され、例えば、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ：Ｂ－cell activating factor belonging to the tumor necrosis factor family）、増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ：a proliferation inducing ligand）、またはそれらの組み合わせである。
前記用語「抗体（antibody）」は、用語「免疫グロブリン（Ｉｇ：immunoglobulin）」と相互交換的に使用される。完全な抗体は、２個の全長（full length）軽鎖、及び２個の全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖と二硫化結合（ＳＳ-bond：disulfide bond）で結合する。該抗体は、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭでもある。前記抗体は、モノクローン抗体またはポリクローン抗体でもある。前記抗体は、動物由来抗体、マウス・ヒトキメラ抗体（chimeric antibody）、ヒト化抗体（humanized antibody）またはヒト抗体でもある。
前記用語「抗原結合断片（antigen-binding fragment）」は、免疫グロブリン全体構造に係わるその断片であり、抗原が結合することができる部分を含むポリペプチドの一部を言う。例えば、該抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ＦｖＦ（ａｂ’）２、またはそれらの組み合わせでもある。
前記抗体またはその抗原結合断片は、変形されたものでもある。例えば、前記抗体またはその抗原結合断片は、接合（conjugation）または結合、糖化（glycosylation）、脱アミド化（deamidation）、タグ付着、またはそれらの組み合わせによって変形されたものでもある。
前記抗体またはその抗原結合断片は、抗癌剤のような他の薬物とも接合される。例えば、前記抗体またはその抗原結合断片は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ：horseradish peroxidase）、アルカリホスファターゼ、ヘプテン（hapten）、ビオチン、ストレブトアビジン、蛍光物質、放射性物質、量子点、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ：polyethylene glycol）、ヒスチジンタグ、またはそれらの組み合わせと結合されたものでもある。前記蛍光物質は、Alexa Fluor(登録商標) ５３２、Alexa Fluor(登録商標) ５４６、Alexa Fluor(登録商標) ５６８、Alexa Fluor(登録商標) ６８０、Alexa Fluor(登録商標) ７５０、Alexa Fluor(登録商標) ７９０またはAlexa Fluor(登録商標) ＴＭ３５０でもある。
ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む癌の予防用または治療用の薬学的組成物を提供する。
前述の抗体、抗原結合断片及びＢＣＭＡは、前述の通りである。
前記癌は、ＢＣＭＡタンパク質の活性化または過生産と係わる疾病でもある。前記癌は、固形癌または非固形癌でもある。固形癌は、例えば、肝臓、肺、乳房、皮膚のような臓器に癌腫瘍が発生したものを言う。非固形癌は、血液内で発生した癌であり、血液癌とも呼ばれる。前記癌は、多発性骨髄腫でもある。
前記用語「予防」は、前記薬学的組成物の投与により、癌を抑制したり、その発病を遅延させたりする全ての行為を言う。前記用語「治療」は、前記薬学的組成物の投与により、癌の症状が好転したり、好ましく変更されたりする全ての行為を言う。
前記薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。前記担体は、賦形剤、希釈剤または補助剤を含む意味で使用される。前記担体は、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、生理食塩水、ＰＢＳのような緩衝液、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルからなる群から選択されたものでもある。前記組成物は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、風味剤、乳化剤、保存剤、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。
前記薬学的組成物は、通常の方法により、任意の剤形に準備することができる。前記組成物は、例えば、経口投与剤形（例えば、粉末、錠剤、カプセル、シロップ、丸薬または顆粒）、あるいは非経口剤形（例えば、注射剤）にも剤形化される。また、前記組成物は、全身剤形または局所剤形にも製造される。
前記薬学的組成物は、前記抗体またはその抗原結合断片、抗癌剤、またはそれらの組み合わせを有効な量にも含む。用語「有効な量」は、予防または治療を必要とする個体に投与される場合、予防または治療の効果を示すに十分な量を言う。前記有効な量は、当業者が、選択される細胞または個体によって適切に選択することができる。疾患の重症度、患者の年齢・体重・健康状態・性別、患者の薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、使用された組成物との配合、または同時使用される薬物を含む要素、及びその他医学分野に周知の要素によっても決定される。前記有効な量は、前記薬学的組成物当たり約０．５μｇないし約２ｇでもある。
前記薬学的組成物の投与量は、例えば、大人基準で、約０．００１ｍｇ／ｋｇないし約１００ｍｇ／ｋｇの範囲内でもある。前記投与は、１日１回、１日多数回、または１週間ないし４週間に１回、または１年に１回ないし１２回投与されうる。
ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を個体に投与する段階を含む癌を予防または治療する方法を提供する。
前述の抗体、抗原結合断片、ＢＣＭＡ、癌、予防及び治療は、前述の通りである。
前記個体は、哺乳動物、例えば、ヒト、牛、馬、豚、犬、羊、山羊または猫でもある。前記個体は、ＢＣＭＡタンパク質の活性化または過生産と係わる疾病、例えば、癌を病んでいたり、病む可能性が高かったりする大きい個体でもある。
前記抗体またはその抗原結合断片、抗癌剤、またはそれらの組み合わせは、例えば、経口、静脈内、筋肉内、経皮（transdermal）、粘膜、鼻内（intranasal）、器官内（intratracheal）または皮下投与のような任意手段により、個体に直接的に投与されうる。前記抗体またはその抗原結合断片、抗癌剤、またはそれらの組み合わせは、全身的または局所的にも投与され、単独、または他の薬学的活性化合物と共にも投与される。
前述の抗体またはその抗原結合断片、抗癌剤、またはそれらの組み合わせの望ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者によって適切に選択されうる。前記投与量は、例えば、大人基準で、約０．００１ｍｇ／ｋｇないし約１００ｍｇ／ｋｇの範囲内でもある。前記投与は、１日１回、１日多数回、または１週間ないし４週間に１回、または１年に１回ないし１２回投与されうる。
【発明の効果】
【0005】
ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片及びその用途によれば、癌を効果的に予防または治療するのに利用される。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【図1A】１Ｈ抗体、２Ｇ抗体及び５Ｇ抗体の、ヒトＢＣＭＡまたはサルＢＣＭＡに対する結合力を、ＥＬＩＳＡで測定した結果を示したグラフである。
【図1B】Ｂ５８抗体、２Ｃ６抗体、５Ｃ３抗体、５Ｂ５抗体、５Ａ６抗体、５Ｄ５抗体、２Ｆ８抗体及び４Ｈ９抗体のヒトＢＣＭＡに対する結合力を、ＥＬＩＳＡで測定した結果を示したグラフである。
【図2A】Ｈ９２９（多発性骨髄腫細胞）、ＯＰＭ－２（多発性骨髄腫細胞）及びヒトＢＣＭＡが過発現されたＣＨＯＫ１－ｈＢＣＭＡ細胞株において、細胞表面ＢＣＭＡに対する選別された抗体の結合力をＦＡＣＳで測定したグラフである。
【図2B】ＢＣＭＡ発現をしないＲａｊｉ（Ｂリンパ球癌細胞株）及びＣＨＯＫ１細胞株において、細胞表面ＢＣＭＡに対する選別された抗体の結合力をＦＡＣＳで測定したグラフである。
【図3】ヒト、サル、マウス及びラットのＢＣＭＡに対する、Ｂ５８抗体、５Ａ６抗体、５Ｄ５抗体及び５Ｂ５抗体の結合力を、ＥＬＩＳＡで測定した結果を示したグラフである。
【図4】ヒトＢＣＭＡ受容体、ヒトＴＡＣＩ受容体及びヒトＢＡＦＦ受容体に対する、Ｂ５８抗体、５Ａ６抗体、５Ｄ５抗体及び５Ｂ５抗体の結合力を、ＥＬＩＳＡで測定した結果を示したグラフである。
【図5A】Ｂ５８抗体を他の抗体と共に、ヒトＢＣＭＡと競争的に結合させた結果を示したグラフである（Ｒｅｆ．Ａｂ：Ｊ６ＭＯ抗体）。
【図5B】５Ａ６抗体を他の抗体と共に、ヒトＢＣＭＡと競争的に結合させた結果を示したグラフである。
【図5C】５Ｂ５抗体を他の抗体と共に、ヒトＢＣＭＡと競争的に結合させた結果を示したグラフである（Ｒｅｆ．Ａｂ：Ｊ６ＭＯ抗体）。
【図5D】５Ｄ５抗体を他の抗体と共に、ヒトＢＣＭＡと競争的に結合させた結果を示したグラフである（Ｒｅｆ．Ａｂ：Ｊ６ＭＯ抗体）。
【図6A】ヒトＢＣＭＡに係わるＡＰＲＩＬリガンドと抗体とを競争的に結合させた結果を示したグラフである。
【図6B】ヒトＢＣＭＡに係わるＢＡＦＦリガンドと抗体とを競争的に結合させた結果を示したグラフである。
【図7】Ｈ９２９細胞及びＲａｊｉ細胞において、Ｂ５８抗体、５Ａ６抗体、５Ｄ５抗体、５Ｂ５抗体及び５Ａ６（ＤＡＮＡ）抗体の抗体依存性細胞毒性評価（ＡＤＣＣ）結果を示したグラフである。
【図8A】多発性骨髄腫癌細胞株Ｈ９２９注射後、経時的（時間：日）な腫瘍の大きさ（ｍｍ３）を示したグラフである。
【図8B】多発性骨髄腫癌細胞株Ｈ９２９注射後、経時的（時間：日）な抗体別腫瘍の大きさ（ｍｍ３）を示したグラフである。
【図8C】多発性骨髄腫癌細胞株Ｈ９２９注射後、経時的（時間：日）な抗体別腫瘍の重さ（ｇ）を示したグラフである。
【図9A】多発性骨髄腫癌細胞株ＯＰＭ－２注射後、経時的（時間：日）な腫瘍の大きさ（ｍｍ３）を示したグラフである。
【図9B】多発性骨髄腫癌細胞株ＯＰＭ－２注射後、経時的（時間：日）な抗体別腫瘍の大きさ（ｍｍ３）を示したグラフである。
【図9C】多発性骨髄腫癌細胞株ＯＰＭ－２注射後、経時的（時間：日）な抗体別腫瘍の重さ（ｇ）を示したグラフである。
【図10A】突然変異５Ａ６とその野生型抗体との標的抗原に対する結合力を示した結果である。
【図10B】突然変異５Ｄ５とその野生型抗体との標的抗原に対する結合力を示した結果である。
【図10C】突然変異５Ａ６とその野生型抗体との、細胞表面ＢＣＭＡに対する選別された抗体の結合力をＦＡＣＳで測定したグラフである。
【図10D】突然変異５Ｄ５とその野生型抗体との、細胞表面ＢＣＭＡに対する選別された抗体の結合力をＦＡＣＳで測定したグラフである。
【図11】突然変異５Ａ６ ＬＭ６，５Ｄ５ ＬＭ４と、それぞれの野生型抗体を利用した、組み換えヒトＢＣＭＡ抗原に対する結合力を示したグラフである。
【図12】突然変異５Ａ６ ＬＭ６，５Ｄ５ ＬＭ４と、それぞれの野生型抗体との抗体依存性細胞毒性評価（ＡＤＣＣ）結果を示したグラフである。
【図13】多発性骨髄腫癌細胞株であるＨ９２９をマウスに注入し、突然変異５Ａ６ ＬＭ６，５Ｄ５ ＬＭ４と、それぞれの野生型抗体とを投与した場合、経時的（時間：日）な腫瘍の大きさ（ｍｍ３）を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0007】
以下、実施例を介し、さらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。
実施例１．抗ＢＣＭＡ抗体の準備
１．抗原の製造
抗ＢＣＭＡ抗体の製造のために、抗原を次のように製造した。ヒトＢＣＭＡ（ＮＰ＿００１１８３．２、配列番号１）のアミノ酸配列において、Ｎ末端から、５ないし５４番目の残基、１ないし５１番目の残基、１ないし５４番目の残基、及び４ないし４８番目の残基を含む抗原をそれぞれ使用した。
具体的には、ヒトＢＣＭＡ ５ないし５４番目の残基（Genscript(登録商標)、Ｚ０２７３１）を含む抗原（「ヒトＢＣＭＡ（５－５４）」）、ヒトＢＣＭＡ１－５１（自体作製、ＣＨＯ細胞で発現させる）をヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合させた抗原（「ヒトＢＣＭＡ－Ｆｃ（１－５１））、Ｃ末端に、Ｆｃ領域及びＨｉｓタグが融合されたヒトＢＣＭＡ１－５１抗原（１０６２０－Ｈ０３Ｈ、Sino Biological Ｉｎｃ．）（「ヒトＢＣＭＡ－Ｆｃ／Ｈｉｓ（１－５１）」）、及びヒトＢＣＭＡ４－４８（自体作製、ＨＥＫ２９３細胞で発現させる）をＦｃ領域に融合させた抗原（「ヒトＢＣＭＡ－Ｆｃ（４－４８）」）を準備した。
ヒトＢＣＭＡ－Ｆｃ（４－４８）は、下記のように製造した。ヒトＢＣＭＡ ４ないし４８番目の残基を暗号化するポリヌクレオチドを、ＣＭＶプローモーターを含む動物細胞発現用ベクターであるｐＡＢ１－Ｆｃにクローニングした。クローニングされたベクターを、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞に形質転換させ、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーを使用し、ヒトＢＣＭＡ－Ｆｃ（４－４８）を精製した。ヒトＢＣＭＡ－Ｆｃ（１－５１）も、同じ方法で製造した。
また、種間交差反応性を確認するために、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域が融合されたサル（rhesus）ＢＣＭＡ（１－５３）（９０１０３－Ｃ０２Ｈ、Sino Biological Ｉｎｃ．）、マウスＢＣＭＡ（１－４９）（５００７６－Ｍ０１Ｈ、Sino Biological Ｉｎｃ．）及びラットＢＣＭＡ（１－４９）（８０１５６－Ｒ０１Ｈ、Sino Biological Ｉｎｃ．）を使用した。サルＢＣＭＡ（１－５３）、マウスＢＣＭＡ及びラットＢＣＭＡのアミノ酸配列を下記表１に記載した。
２．ライブラリーファージ（library phage）準備及びファージディスプレイパンニング（panning）
多様な抗原に対して結合可能性を有するヒト由来ＳｃＦｖ（single-chain variable fragment）ファージライブラリー細胞（Mol. Cells OT, 225-235, February 28, 2009）を準備した。準備されたファージライブラリーに、ヘルパーファージ（helper phage）を感染させた後、ファージパッキングを誘導した。その後、培養液を、４℃で４，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、上澄み液に、４％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ６０００（Fluka、８１２５３）及び３％ ＮａＣｌ（Sigma、Ｓ７６５３）を添加して十分に溶かした後、氷で１時間インキュベーションした。それを、再び４℃で８，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、ペレットをＰＢＳに懸濁した後、さらに４℃で１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ライブラリーファージを含む上澄み液を得た。得られたライブラリーファージは、使用時まで４℃で保管した。
ヒトＢＣＭＡ、ヒトＢＣＭＡ及びサルＢＣＭＡに交差反応性がある抗体をスクリーニングするために、次のような方法で、総３回パンニングを行った。免疫試験管（Immunotube、maxisorp ４４４２０２）に、５μｇの実施例１．１で準備された抗原を加え、４℃で１６時間インキュベーションし、試験管表面にタンパク質をコーティングした。上澄み液を除去し、非特異的結合を遮断するために、ＢＳＡ（bovine serum albumin）を加えてブロッキングした。
実施例１．２で準備された１０１２ＣＦＵのファージライブラリーに、１．５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを混合し、抗原タンパク質がコーティングされた免疫試験管に加えた後、３７℃で１時間反応させ、ＢＣＭＡ特異的なファージを抗原に結合させた。続いて、ＰＢＳ－Ｔ（phosphate buffered saline；０．０５％ Tween ２０）溶液で多数回洗浄後、１００ｍＭトリエチルアミン溶液を使用し、ＢＣＭＡに結合したファージを回収した。回収されたファージを、１Ｍ Tris緩衝液（ｐＨ７．４）で中和させた後、Ｋ１２ ＥＲ２７３８大腸菌に感染させ、さらにファージを回収する過程を４回反復し、ファージをパンニングした。パンニングラウンドが進められるほど、ＰＢＳ－Ｔを利用した洗浄回収を増加させ、抗原特異的ファージを増幅及び濃縮した。
３．単一クローンファージ抗体選別（single clone screening）
ファージプール（phage pool）からＢＣＭＡに特異的に結合する単一クローン抗体を選別するために、単一クローンファージ抗体選別過程を遂行した。
具体的には、実施例１．２で得たファージプールを順次希釈し、ＬＢ－テトラサイクリン／カベニシリンを含む固体培地で培養し、単一コロニーを確保した。各コロニーを、９６ deepウェルプレトで培養し、ＯＤ６００が０．５ないし０．７になるように培養した。前記培養液に、２０ ＭＯＩヘルパーファージを加え、３７℃で１時間反応させた。その後、培養液にカナマイシンを加え、３０℃で一晩培養した。翌日、培養液を遠心分離し、上澄み液を取った後、それを利用し、ＢＣＭＡ特異的ファージを選別するためのＥＬＩＳＡを遂行した。各ウェル当たり１００ｎｇの組み換えＢＣＭＡをＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、非特異的結合を防止するために、３％ ＢＳＡでコーティングした後、プレートをＰＢＳで洗浄した。準備された単一クローンファージを各ウェルに加えた後、３７℃で１時間インキュベーションし、プレートをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が接合された抗ＨＡ（hemagglutinin）抗体とＴＭＢ（tetramethylbenzidine、Sigma、Ｔ０４４０）を使用してＥＬＩＳＡを遂行した。４５０ｎｍでの吸光度が０．５以上であり、抗ＨＡＨＲＰ単独である対照群の吸光度と比べ、５倍以上の吸光度が増大されたクローンを選別した。ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体クローン１１種（Ｂ５８、５Ａ６、５Ｄ５、５Ｂ５、２Ｃ６、２Ｆ８、４Ｈ９、１Ｈ、２Ｇ、５Ｇ及び５Ｃ３）を選別した。
選別された抗体を暗号化する核酸配列から、抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号５ないし１５）、及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１６ないし２６）を分析し、Kabat定義により、相補性決定領域（ＣＤＲ：complementarity determining region）を決定した。決定された重鎖及び軽鎖のＣＤＲアミノ酸配列（Ｎ→Ｃ）をそれぞれ表２及び表３に示した。
重鎖可変領域を暗号化する核酸配列、及び軽鎖可変領域を暗号化する核酸配列は、下記表４に示した。
４．選別された抗ＢＣＭＡＰｈａｇｅから抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体の生産
実施例１．３で選別された抗体を暗号化する核酸配列を有するポリヌクレオチドを合成した。準備されたポリヌクレオチドを、動物細胞培養用ベクター（重鎖発現ベクター：ｐＡＢ１－ＨＣ、軽鎖発現ベクター：ｐＡＢ１－ＬＣ）にクローニングした。前記１１種の抗体クローン（Ｂ５８、５Ａ６、５Ｄ５、５Ｂ５、２Ｃ６、２Ｆ８、４Ｈ９、１Ｈ、２Ｇ、５Ｇ及び５Ｃ３）に対し、それぞれ重鎖及び軽鎖を暗号化するポリヌクレオチドを含む総２２個のベクターを製造した。準備されたベクターは、ＩｇＧ１タイプ配列を含む。
ＣＨＯ－Ｓ細胞をＣＤ－ＣＨＯ（Gibco、１０７４３）培地で培養し、準備されたベクターは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用し、ＣＨＯ－Ｓ細胞に導入した。形質導入されたＣＨＯ－Ｓ細胞を、ＣＤ－ＣＨＯ培地で、８％ ＣＯ２、３７℃及び１１０ｒｐｍの条件で約７日間培養した。
平衡化緩衝液（５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化されたMabSelect ＳｕＲｅカラム（ＧＥ Healthcare、５ｍｌ）に、準備されたＣＨＯ－Ｓ細胞培養液を通過させ、発現された抗体をカラムに結合させた。該抗体を、５０ｍＭ Ｎａ－クエン酸塩（ｐＨ３．４）及び１００ｍＭ ＮａＣｌの溶液で溶出させた後、１Ｍ Tris－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で中和させ、最終ｐＨが７．２になるようにした。その後、緩衝液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で交換し、使用時まで、抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体であるＢ５８、５Ａ６、５Ｄ５、５Ｂ５、２Ｃ６、２Ｆ８、４Ｈ９、１Ｈ、２Ｇ、５Ｇ及び５Ｃ３を４℃で保管した。
５．５Ａ６及び５Ｄ５の突然変異の製造
選別された５Ａ６抗体及び５Ｄ５抗体の生産性を改善させるために、表４の核酸配列を利用し、抗体の軽鎖ＣＤＲにおいて、１個あるいは２個のアミノ酸残基を突然変異させた突然変異抗体を製造した。
５Ａ６突然変異抗体の軽鎖可変領域（配列番号１０７ないし１１４）、及び５Ｄ５突然変異抗体の軽鎖可変領域（配列番号１１５ないし１１９）において、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列を、それぞれ表５及び表６に示した。表５及び６において、下線及び太字で表示されたアミノ酸残基が突然変異された部分である（ＷＴ：野生型、ＬＭ：軽鎖突然変異）。
実施例２．抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体の動力学的分析
１．抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体のＢＣＭＡに対する結合力の確認
（１）組み換えＢＣＭＡに対する結合力の確認
実施例１．４で分離された抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体の組み換えＢＣＭＡタンパク質に対する特異的結合力を、ＥＬＩＳＡ方法で分析した。
抗原としては、組み換えヒトＢＣＭＡまたはサルＢＣＭＡを使用し、二次抗体として、ＨＲＰ接合されたＦａｂ多重クローナル抗体試薬（Pierce、３１４１４）を使用し、実施例１．３に記載されているようにＥＬＩＳＡを遂行した。抗体の濃度による４５０ｎｍにおける吸光度を、図１Ａ及び図１Ｂに示した。図１Ａは、１Ｈ抗体、２Ｇ抗体及び５Ｇ抗体の、ヒトＢＣＭＡまたはサルＢＣＭＡに対する結合力を示したグラフでであり、図１Ｂは、Ｂ５８抗体、２Ｃ６抗体、５Ｃ３抗体、５Ｂ５抗体、５Ａ６抗体、５Ｄ５抗体、４Ｈ９抗体及び２Ｆ８抗体の、ヒトＢＣＭＡに対する結合力を示したグラフである。
図１Ａから分かるように、１Ｈ抗体、２Ｇ抗体及び５Ｇ抗体は、ヒトＢＣＭＡ及びサルＢＣＭＡに対し、濃度依存的に結合した。ヒトＢＣＭＡに対する結合力は、２Ｇ抗体、１Ｈ抗体及び５Ｇ抗体の順序で高く、サルＢＣＭＡに対する結合力は、１Ｈ抗体が最も好ましく、２Ｇ抗体と５Ｇ抗体は、同等な水準であった。図１Ｂから分かるように、８種（Ｂ５８、２Ｃ６、５Ｃ３、５Ｂ５、５Ａ６、５Ｄ５、４Ｈ９及び２Ｆ８）の抗ＢＣＭＡ抗体が、いずれもヒトＢＣＭＡに対し、濃度依存的に結合するということを確認した。
（２）細胞表面のＢＣＭＡに対する結合力の確認
選別された抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体が細胞表面に発現されたＢＣＭＡに結合する程度を、ＦＡＣＳシステムを介して分析した。
ＢＣＭＡが発現されると知られている多発性骨髄腫癌細胞であるＨ９２９（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－９０６８ＴＭ）及びＯＰＭ－２細胞株（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ５０）を準備し、ヒトＢＣＭＡが過発現されているＣＨＯＫ１－ｈＢＣＭＡ細胞株（ＡＢＩＢｉｏ製）を準備した。比較群として、ＢＣＭＡ発現をしないＣＨＯＫ１（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－９６１８）及びＲａｊｉ（Ｂ－lymphocyte cancer cell line）（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－８６ＴＭ）細胞株を使用した。
前記準備された細胞に、実施例１．４で精製された７種（Ｂ５８、５Ａ６、５Ｄ５、５Ｂ５、１Ｈ、２Ｇ及び５Ｇ）のＩｇＧ抗体１０μｇ／ｍｌを加え、４℃で１時間インキュベーションした後、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。抗ヒトＦｃＦＩＴＣを１：４００に希釈し、さらに４℃で１時間インキュベーションした後、ＰＢＳ緩衝液で洗浄する過程を反復した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機器を利用し、細胞の蛍光強度を測定し、図２Ａ及び図２Ｂに示した（ＭＦＩ：平均蛍光強度）。
図２Ａ及び図２Ｂから分かるように、選別された抗体は、いずれも細胞表面に発現されたＢＣＭＡに特異的に結合し、ＢＣＭＡが発現されない細胞には、結合しないということを確認した。従って、選別された抗体は、組み換えＢＣＭＡタンパク質だけではなく、細胞表面に発現されたＢＣＭＡの細胞外ドメインに対して特異的な結合能があり、その抗ＢＣＭＡ抗体を利用し、ＢＣＭＡ発現癌細胞株を選択的にターゲッティングすることができるということを確認した。
２．抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体の、ヒトＢＣＭＡ及びサルＢＣＭＡに対する親和度分析
選別された１１種の抗ＢＣＭＡ抗体の、ヒトＢＣＭＡ及びサルＢＣＭＡに対する親和度を分析した。
バイオセンサトレイケースに、９６ウェルブラックマイクロプレートを装着し、８個ウェルそれぞれに、１ＸＫＢ ２００μｌを入れた後、Ｎｉ－ＮＴＡバイオセンサ（Fortebio）８個を差し入れ、水和反応（hydration）を１０分間行った。抗原固定のために、５μｇ／ｍｌの組み換えヒトＢＣＭＡ－Ｈｉｓ（Sino Biological Ｉｎｃ．）１ＸＫＢを使用して希釈した。閾値０．５ないし１．０ｎｍに固定して実験し、Ｏｃｔｅｔ Data Acquisition ９．０ソフトウェアを活性化させ、Ｏｃｔｅｔプログラムテンプレートを作成した。最初段階は、基線（baseline）１、２番目段階は、積載（loading）段階であり、閾値を０．５ないし１．０ｎｍに固定した。３番目段階は、基線（baseline）２であり、５分間結合（association）過程及び２０分間解離（dissociation）過程を遂行した。プレート温度は、３０℃に固定し、Ｏｃｔｅｔプログラムテンプレートに合わせ、新たな９６ウェルブラックマイクロプレートに準備された緩衝液を、順序に合うように入れた。基線（baseline）１として使用される１ＸＫＢ ２００μｌに、積載される抗原として、組み換えヒトＢＣＭＡ－Ｆｃ／Ｈｉｓを５μｇ／ｍｌに希釈し、２００μｌ入れた。基線（baseline）２として使用される１ＸＫＢを２００μｌ入れた後、抗原と反応させる抗体を２００μｌずつ分注し、機器を作動させた。実験終了後、Ｏｃｔｅｔ Analysis ９．０ソフトウェアで、各抗体に対する吸着率定数（ｋｏｎ：association constant）、分離率定数（ｋｄｉｓ：dissociation constant及び平衡分離定数（ＫＤ：equilibrium dissociation constant）を分析して算出し、その内容は表７に示した。
表７から分かるように、Ｂ５８抗体及び５Ａ６抗体の親和度は、約１０－１１のＫＤ値を有し、２Ｃ６抗体、５Ｂ５抗体及び５Ｄ５抗体が、約１０－１０のＫＤ値を有し、選別された抗体が、ヒトＢＣＭＡタンパク質に対し、高い結合力を有するということを確認した。それらのうち、細胞表面のヒトＢＣＭＡに対する結合力が微々たる２Ｃ６抗体と、サルＢＣＭＡに対する親和力がないＢ５８抗体とを除いた３種の抗体（５Ａ６、５Ｂ５、５Ｄ５）を利用し、サルＢＣＭＡに対する親和度を追加して確認して、その結果を表８に示した。
表８から分かるように、５Ａ６抗体、５Ｂ５及び５Ｄ５抗体が、ヒトＢＣＭＡだけではなく、サルＢＣＭＡに対しても、高い親和力を有するというということを確認した。
３．抗ＢＣＭＡ抗体の種間交差反応性分析
選別された抗体において、Ｂ５８抗体、５Ａ６抗体、５Ｄ５抗体及び５Ｂ５抗体の種間交差結合いかんをＥＬＩＳＡ方法で分析した。
実施例１．１で準備されたヒト、サル、マウス及びラットのＢＣＭＡ抗原１００ｎｇをプレート底にコーティングした後、３％ ＢＳＡでコーティングし、非特異的な結合を遮断した。一次抗体として選別された抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体、及び二次抗体として抗ヒトＦａｂ ＨＲＰ（１：２０，０００希釈）を使用し、実施例１．３に記載されているように、ＥＬＩＳＡ分析法を遂行した。
マイクロプレートリーダで測定された４５０ｎｍでの吸光度を図３に示し、５０％最大有効濃度（ＥＣ５０：half maximal effective concentration）（ｎＭ）を表９に示した。
図３及び表９から分かるように、Ｂ５８抗体は、ヒトＢＣＭＡにだけ結合力を有し、５Ａ６抗体は、ヒトＢＣＭＡ及びサルＢＣＭＡに結合力を有している。５Ｄ５抗体と５Ｂ５抗体は、分析され全種のＢＣＭＡ（ヒト、サル、マウス及びラット）に結合力を有するということを確認した。
４．抗ＢＣＭＡ ＩｇＧのＢＣＭＡの特異度確認
ＢＣＭＡは、Ｂ細胞の成熟化過程に関与すると知られており、該成熟化過程に、ＴＡＣＩ受容体及びＢＡＦＦ受容体が関与すると知られている。選別された抗体が、ＢＣＭＡ関連タンパク質に結合される否かということを、ＥＬＩＳＡ技法を介して分析した。
具体的には、ヒトＢＣＭＡ－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Systems、１９３－ＢＣ－０５０）、ＴＡＣＩ－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Systems、１７４－ＴＣ）及びＢＡＦＦ－受容体（Ｒ＆Ｄ Systems、１１６２－ＢＲ）を、ＰＢＳバッファを利用して希釈した後、ＥＬＩＳＡプレートに、ウェル当たり１００ｎｇずつコーティングした。一次抗体として、選別された抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体を使用し、二次抗体として、抗ヒトＦａｂ ＨＲＰ（１：２０，０００希釈）を使用し、実施例１．４（１）に記載されているように、ＥＬＩＳＡ分析法を遂行した。比較群として、抗ＢＣＭＡモノクローン抗体Ｊ６ＭＯ（ＧＳＫ）を使用した。マイクロプレートリーダで測定された４５０ｎｍでの吸光度を図４に示した。
図４から分かるように、Ｂ５８抗体、５Ａ６抗体、５Ｄ５抗体及び５Ｂ５抗体は、ＴＡＣＩ受容体及びＢＡＦＦ受容体には結合しないが、ＢＣＭＡにだけ結合した。従って、選別された４種の抗ＢＣＭＡ抗体であるＢ５８抗体、５Ａ６抗体、５Ｄ５抗体及び５Ｂ５抗体は、ＢＣＭＡに特異的に結合するということを確認した。
５．抗ＢＣＭＡ抗体の抗体別エピトープの相対比較
選別された４種の抗体（ＩｇＧ）を使用し、ＢＣＭＡに結合する部位を相対比較するために、選別された抗体間のヒトＢＣＭＡに対する競争的結合能を分析した。
実施例２．２に記載されているように、Ｏｃｔｅｔ分析システムを利用し、抗体間の結合能を分析した。Ｏｃｔｅｔプログラムテンプレートにおける最初段階は、基線（baseline）１であり、２番目段階は、積載とし、閾値を０．３ｎｍに固定した。３番目段階は、基線（baseline）とした。４番目及び５番目の段階は、それぞれの抗体を反応させ、時間は１０分に設定した。Ｏｃｔｅｔプログラムテンプレートに合わせ、新たな９６ウェルブラックマイクロプレートに準備された緩衝液を、順序に合うように入れた。基線（baseline）１として使用される１ＸＫＢを、２００μｌ入れた。積載する抗原である組み換えヒトＢＣＭＡ（Ｆｃタグ及びＨｉｓタグを融合）を５μｇ／ｍｌに希釈し、２００μｌずつ入れた。基線（baseline）２として使用される１ＸＫＢ ２００μｌを入れた。抗原と最初に結合する抗体を２００μｌずつ入れた。２番目抗体を２００μｌずつ入れた。実験プレートの温度は、３０℃に固定した。試料をいずれも入れた後、機器を作動させた。実験終了後、Ｏｃｔｅｔ analysis ９．０ソフトウェアで、最初抗体と２番目抗体との競争を分析し、その結果を、図５Ａないし図５Ｄに示した（Ｒｅｆ．Ａｂ：Ｊ６ＭＯ抗体）。
図５Ａないし図５Ｄから分かるように、Ｂ５８抗体と５Ａ６抗体は、抗原に対する結合部位、すなわち、エピトープが異なっており、５Ｂ５抗体と５Ｄ５抗体は、エピトープが同一であると確認された。また、５Ｂ５抗体と５Ｄ５抗体とのエピトープは、Ｂ５８のエピトープと部分的に同一であると確認された。従って、選別された４種の抗体は、抗原であるＢＣＭＡに結合する部位が多様であるということを確認した。
実施例３．抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体の癌細胞に対する効果
１．抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体の中和効果
選別された抗ＢＣＭＡ抗体が、ＢＣＭＡとリガンド（ＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦ）との結合を妨害することができるか否かということを、ＥＬＩＳＡ基盤溶液競争試験で確認した。
具体的には、ヒトＢＣＭＡ－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Systems、１９３－ＢＣ－０５０）を、ＰＢＳバッファを利用して希釈した後、ＥＬＩＳＡプレートに、ウェル当たり１００ｎｇずつコーティングした。コーティング後、プレートを空にし、１％ ＢＳＡが含まれたＰＢＳＴを、各ウェル当たり１００μｌずつ加え、３７℃で２時間インキュベーションした。５０μｇ／ｍｌないし０．０００２８μｇ／ｍｌの濃度に希釈された抗体と、１０ｎｇ／ｍｌのＡＰＲＩＬタンパク質（Ｒ＆Ｄ、５８６０－ＡＰ－０１０／ＣＦ）、または２００ｎｇ／ｍｌのＢＡＦＦ（Ｒ＆Ｄ、２１４９－ＢＦ－０１０／ＣＦ）とを混合した。陰性対照群として、ＩｇＧ１抗体を使用し、比較群として、Ｊ６ＭＯ抗体を使用した。
二次抗体として、抗ＨＡ－ＨＲＰ（Roche、１２０１３８１９００１）または抗Ｈｉｓ－ＨＲＰ（Roche、１１９６５０８５００１）を使用し、実施例１．４（１）に記載されているように、ＥＬＩＳＡ分析法を遂行した。比較群として、抗ＢＣＭＡモノクローン抗体Ｊ６ＭＯ（ＧＳＫ）を使用した。４５０ｎｍでの吸光度を測定し、その結果を図６Ａ及び図６Ｂに示した。
図６Ａ及び図６Ｂから分かるように、Ｂ５８抗体は、ＢＣＭＡとＢＡＦＦとの結合を効果的に阻害し、ＢＣＭＡとＡＰＲＩＬとの結合も妨害するということで確認した。５Ａ６抗体、５Ｂ５抗体及び５Ｄ５抗体は、ＢＣＭＡに対するＡＰＲＩＬの結合能を阻害することができないが、ＢＡＦＦの結合能は、一部阻害すると確認された。従って、選別された抗体は、ターゲット抗原ＢＣＭＡに対する結合部位が異なっており、ＢＣＭＡリガンド結合能阻害程度に違いがあるが、リガンド結合を調節して抑制し、癌細胞成長を効果的に抑制する可能性があるということが確認された。
２．抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体の抗体依存性細胞毒性評価（ＡＤＣＣ：antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）
ＡＤＣＣ bioassay core kit（Promega、Ｇ０７１８）を使用し、選別された抗体の抗体依存性細胞毒性を測定した。
具体的には、ヒトＢＣＭＡを多く発現しているＨ９２９（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－９０６８ＴＭ）と、少なく発現するＲａｊｉ（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－８６ＴＭ）とを標的細胞として使用した。抗ＢＣＭＡ抗体として、Ｂ５８抗体、５Ａ６抗体、５Ｄ５抗体及び５Ｂ５抗体を準備した。
また、抗体依存性細胞毒性に関与するＦｃ部分に機能阻害を誘発し、陰性対照群として使用するために、５Ａ６Ｆｃ部分の２６５番のアスパラギン酸のアミノ酸残基をアラニンで置換（「Ｄ２６５Ａ」）し、２９７番のアスパラギン残基をアラニンで置換（「Ｎ２９７Ａ」）した５Ａ６ ＤＡＮＡ突然変異抗体を準備した（Cancer Cell, vol.19, issue 1, pp. 101-113）。
ＡＤＣＣ分析緩衝液は、ＲＰＭＩ／１６４０（Promega、Ｇ７０８Ａ）及び４％低ＩｇＧ血清（Promega、ＡＸ２０Ａ）を添加して製造した。ＡＤＣＣ分析緩衝液に再懸濁したＨ９２９細胞株とＲａｊｉ細胞株とを、９６ウェルプレート（白、平底、Corning、ＣＬＳ３９１７）に、ウェル当たり５，０００個の細胞（２５μｌ）で添加した。抗ＢＣＭＡ抗体は、ＡＤＣＣ分析緩衝液で、１３３．３ｎＭ（２０μｇ／ｍｌ）から１／８ずつ順次希釈して準備した。準備された抗体を、各ウェル当たり２５μｌずつ添加した。３．６ｍｌのＡＤＣＣ分析緩衝液を１５ｍｌチューブに入れた後、液化窒素タンクから、ＡＤＣＣ Bioassay Effector cell（Promega、Ｇ７０１Ａ）を取り出し、３７℃槽で迅速に溶かした後、ＡＤＣＣ分析緩衝液が入れられた１５ｍｌチューブに流し込んだ。Effector cellを十分に混ぜた後、２５μｌずつチューブに慎重に加え、３７℃、５％ ＣＯ２の条件で、細胞を約６時間培養した。その間、Ｂｉｏ－ＧｌｏＴＭルシフェラーゼ分析緩衝液（Promega、Ｇ７２０Ａ）を常温で溶かした後、Ｂｉｏ－ＧｌｏＴＭルシフェラーゼ分析基質（Promega、Ｇ７１９Ａ）に入れて十分に混ぜ、Ｂｉｏ－ＧｌｏＴＭルシフェラーゼ分析試薬を製造した。細胞培養後、９６ウェルプレートを、常温で約１０分間放置した後、各ウェルに、２５μｌのＢｉｏ－ＧｌｏＴＭルシフェラーゼ分析試薬を慎重に加えた。常温で５分間放置した後、ＰＨＥＲＡstar ＦＳ ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ機器で発光強度を測定した。結果値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Prismを利用し、非線形回帰分析法（curve fit）で分析し、その結果を図７に示した。
図７から分かるように、ＢＣＭＡの発現が高いＨ９２９細胞において、選別された抗ＢＣＭＡ抗体が、濃度依存的に抗体依存性細胞毒性を誘発した（Ｂ５８＞５Ａ６＝５Ｄ５＞５Ｂ５）。Ｆｃ領域の機能阻害を誘発した５Ａ６ ＤＡＮＡ突然変異抗体の場合、ＡＤＣＣが誘発されず、ＡＤＣＣは、抗体のＦｃ領域によって引き起こされるということを確認した。一方、ＢＣＭＡ発現が観察されていないＲａｊｉについては、ＡＤＣＣが誘発されなていない。従って、選別されたＢ５８抗体、５Ａ６抗体、５Ｄ５抗体及び５Ｂ５抗体は、ＢＣＭＡが発現された癌細胞にだけ特異的に結合し、Ｆｃ機能による抗体細胞毒性を誘発することができるということを確認した。
３．抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体の癌細胞株移植マウスモデルでの腫瘍成長抑制評価
（１）多発性骨髄腫癌細胞株Ｈ９２９－移植マウスモデルでの腫瘍成長抑制評価
６週齢雄ＣＢ１７－ＳＣＩＤマウスを、７日間馴化期間を通過させた後、動物実験に使用した。細胞移植前、マウス細胞移植部位の除毛を進め、耳には、個体識別のための耳タグを付着させた。
細胞移植日、条件に合うように培養された多発性骨髄腫癌細胞株Ｈ９２９を収集し、ＰＢＳで、ベックマン・コールター（Beckman coulter）で細胞数／生存度を測定した。最終的に、１００μｌの、ＰＢＳ当たり投与細胞数（１ｘ１０７細胞／匹）になるように準備した。細胞懸濁液と同一体積でマトリゲル（Matrigel）（ＢＤ）を加え、ピペットで混合した。マウスに対して、イソフルラン吸入麻酔を施した後、除毛されている右側背中側皮下に、２００μｌの細胞懸濁液を投与した。マウスをケージに入れ、麻酔から覚めた後、活動に問題がないか否かということを最終確認した。腫瘍サイズは、ノギス（callipers）を使用し、腫瘍の長軸と短軸とを測定した、下記数式１を利用し、最終腫瘍サイズを計算した。
（数１）
腫瘍サイズ（ｍｍ３）＝（０．５）ｘ（長軸）ｘ（短軸）２
薬物投与は、腫瘍サイズが平均２６９ｍｍ３であるときから投与を始めた。投与薬物は、対照群（ＰＢＳ）及び抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体４種（Ｂ５８、５Ａ６、５Ｄ５及び５Ｂ５）の５グループ（各ｎ＝７）で進めた。薬物は、２ｍｇ／ｍｌ（２０ｇ基準：１００μｌ／head）で準備した。投与用量は、１０ｍｇ／ｋｇであり、週２回ずつ総５回、尾に静脈投与した。体重は、動物用体重計を使用して測定した。体重及び腫瘍サイズは、週２回測定した。薬物投与後の２１日目、体重及び腫瘍サイズの測定後、安楽死させた後、各個体別腫瘍を摘出し、重さを測定した。
腫瘍注射後、経時的（時間：日）な腫瘍サイズ（ｍｍ３）、抗体別腫瘍サイズ（ｍｍ３）、及び抗体別腫瘍の重さ（ｇ）を示したグラフを、図８Ａないし図８Ｃに示した（矢印：薬物投与時点）。各抗体の対照群対比の体積減少率（％）及び重さ減少率（％）を表１０に示した（ｐ＜０．００１）。
図８Ａないし図８Ｃ、及び表１０から分かるように、Ｈ９２９移植マウスモデルにおいて、対照群（ＰＢＳ）に比べ、抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体４種（Ｂ５８、５Ａ６、５Ｄ５及び５Ｂ５）を投与した群において、腫瘍成長抑制効果が示された。各群の腫瘍サイズを最終分析した結果、対照群の腫瘍サイズ対比での、本願抗体処理群の腫瘍が、約５１．７％ないし約６７．４％減少した。一元配置分散分析結果、対照群（ＰＢＳ）対比の、抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体４種における統計学的有意性が示された（ｐ＜０．００１）。従って、多発性骨髄腫に選別された抗体を処理する場合、有意的に、腫瘍成長を抑制することができるということを証明した。また、５Ｄ５と５Ａ６との場合、抗体依存性細胞毒性評価ないしＢＣＭＡ関連リガンド結合妨害結果において、Ｂ５８抗体対比で、低活性を示したが、生体内（in vivo）活性評価において、Ｂ５８と同等以上の効果を示した。それは、前記２つの抗体が、腫瘍成長阻害に有利なエピトープを認知するか、あるいは抗体自体の物性にすぐれているということを意味する。
（２）多発性骨髄腫癌細胞株ＯＰＭ－２－移植マウスモデルにおける腫瘍成長抑制評価
実施例３．３（１）に記載されているように、マウスに、多発性骨髄腫癌細胞株ＯＰＭ２を移植し、抗体投与による腫瘍成長抑制を評価した。
薬物投与は、腫瘍サイズが平均１７２ｍｍ３であるときから投与を始めた。投与薬物は、対照群（ＰＢＳ）及び抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体４種（Ｂ５８、５Ａ６及び５Ｄ５）の４グループ（各ｎ＝９）で進めた。投与用量が１０ｍｇ／ｋｇになるように、投与薬物を２ｍｇ／ｍｌ（２０ｇ基準：１００μｌ／head）で準備した。投与用量は、１０ｍｇ／ｋｇであり、週２回ずつ総５回、尾に静脈投与した。薬物投与後の２７日目、体重及び腫瘍サイズを測定して安楽死させた後、各個体から腫瘍を摘出して重さを測定した。
腫瘍注射後、経時的（時間：日）な腫瘍サイズ（ｍｍ３）、抗体別腫瘍サイズ（ｍｍ３）、及び抗体別腫瘍の重さ（ｇ）を示したグラフを、図９Ａないし図９Ｃに示した（矢印：薬物投与時点）。各抗体の対照群対比の腫瘍の体積減少率（％）及び重さ減少率（％）を表１１に示した（ｐ＜０．００１）。
図９Ａないし図９Ｃ、及び表１１から分かるように、ＯＰＭ－２移植マウスモデルにおいて、対照群（ＰＢＳ）に比べ、抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体３種（Ｂ５８、５Ａ６及び５Ｄ５）を投与した群において、腫瘍成長抑制効果が示された。各群の腫瘍サイズを最終分析した結果、各群の対照群対比の腫瘍抑制程度は、それぞれＢ５８ ４２．５％、５Ａ６ ３５．４％、５Ｄ５ ３８．５％と測定され、重さ測定時、対照群対比で、それぞれＢ５８ ４１．４％、５Ａ６ ３５．１％、５Ｄ５ ４０．５％の重さ減少率を示した。一元配置分散分析結果、対照群対比の、抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ３種の抗腫瘍効果は、統計的に有意性が示され（ｐ＜０．００１）、３種抗体間の腫瘍サイズ及び腫瘍重さの差は、統計学的に有意的な差が観察されていない。図６及び図７から分かるように、５Ｄ５と５Ａ６との場合、抗体依存性細胞毒性評価ないしＢＣＭＡ関連リガンド結合妨害分析結果において、Ｂ５８抗体対比で低い活性を示したが、生体内（in vivo）効能評価において、Ｂ５８と同等程度の効果を示した。それは、前記２つの抗体が腫瘍成長阻害に有利なエピトープを認知するか、あるいは抗体自体の物性すぐれている可能性があるということを意味する。
４．突然変異導入５Ａ６と５Ｄ５のターゲット抗原に対する結合力確認
（１）野生型５Ａ６，５Ｄ５と突然変異５Ａ６，５Ｄ５との組み換えＢＣＭＡに対する結合力確認
実施例１．５に記載された内容のように、抗ＢＣＭＡ抗体５Ａ６と抗ＢＣＭＡ抗体５Ｄ５とに突然変異を導入し、５Ａ６からの８種突然変異抗体、及び５Ｄ５からの５種突然変異抗体を製造して精製した。それらに対して、それぞれの野生型抗体と共に、組み換えタンパク質に対する結合力を分析し、その結果を図１０Ａ及び図１０Ｂに示した。
図１０Ａ及び図１０Ｂから分かるように、５Ａ６からの８種突然変異抗体のうち６種の抗体（５Ａ６ ＬＭ１、５Ａ６ ＬＭ３、５Ａ６ ＬＭ４、５Ａ６ ＬＭ５、５Ａ６ ＬＭ７及び５Ａ６ ＬＭ８）は、野生型に比べ、結合活性が同等であるか、それよりも低くなったが、２種の抗体（５Ａ６ ＬＭ２及び５Ａ６ ＬＭ６）は、野生型に比べ、上昇された抗原結合力を示した。５Ｄ５の場合、５種の突然変異抗体のうち２種の抗体（５Ｄ５ ＬＭ１及び５Ｄ５ ＬＭ２）は、野生型５Ｄ５に比べ、抗原結合活性が低下したが、残り３種（５Ｄ５ ＬＭ３、５Ｄ５ ＬＭ４及び５Ｄ５ ＬＭ５）は、野生型５Ｄ５と同等な抗原結合活性を示した。各抗体の５０％最大有効濃度（ＥＣ５０：half maximal effective concentration）（ｎＭ）を表１２に示した。
（２）野生型５Ａ６、野生型５Ｄ５、及びそれらの突然変異の細胞表面ＢＣＭＡに対する結合力確認
野生型抗体とその突然変異抗体との細胞表面抗原に対する結合力を比較した。
ＢＣＭＡが高発現された多発性骨髄腫癌細胞Ｈ９２９（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－９０６８ＴＭ）に、野生型５Ａ６抗体、野生型５Ｄ５抗体、及びそれらの突然変異抗体を加え、抗体の細胞表面結合レベルを、ＦＡＣＳ分析を介して測定した。細胞表面の蛍光強度を測定し、その結果を図１０Ｃ及び図１０Ｄに示し、各抗体の平均蛍光強度（ＭＦＩ：mean fluorescence intensity）価格は表１３に示した。
図１０Ｃ、図１０Ｄ及び表１３から分かるように、５Ａ６の場合、５種の突然変異抗体（５Ａ６ ＬＭ１、５Ａ６ ＬＭ３、５Ａ６ ＬＭ４、５Ａ６ ＬＭ５及び５Ａ６ ＬＭ６）の細胞結合力は、野生型５Ａ６抗体の細胞結合力に比べ、上昇された細胞結合力を示した。また、５Ｄ５の２種の突然変異抗体（５Ｄ５ ＬＭ４及び５Ｄ５ ＬＭ５）の細胞結合力は、野生型５Ｄ５抗体の細胞結合力に比べ、確実に上昇した。従って、野生型抗体のＣＤＲアミノ酸の一部変更により、組み換えＢＣＭＡ及び細胞表面ＢＣＭＡに対する結合力が一部改善されているということを確認した。
（３）５Ａ６ ＬＭ６と５Ｄ５ ＬＭ４とのヒトＢＣＭＡに対する親和度分析
単量体（monomer）ヒトＢＣＭＡ抗原に結合する５Ａ６ ＬＭ６及び５Ｄ５ ＬＭ４と、それぞれの野生型抗体との標的抗原結合親和度を分析した。
具体的には、１ｘ ＨＰＳ－ＥＰ緩衝液（ＧＥ Healthcare、ＢＲ－１００６－６９）を使用して準備された抗体を希釈した。標的抗原結合親和度分析は、Biacore Ｔ２００（ＧＥ Healthcare）を使用した。接触時間６０秒、安定化時間３０秒、及び３０μｌ／分の流速で、タンパク質Ａチップに流し、キャプチャレベルが１２８ＲＵ（response unit）に逹するようにし、抗体がキャプチャされたタンパク質Ａチップを準備した。
抗原は、１ｘ ＨＰＳ－ＥＰ緩衝液を使用し、１００ｎＭから６．２５ｎＭまで、２倍ずつ順次に希釈し、総６個の試料を準備し、陰性対照群（blank）として、１ｘ ＨＰＳ－ＥＰ緩衝液を利用した。
抗体がキャプチャされたタンパク質Ａチップに準備された抗原を、３０μｌ／分の流速で、結合時間６０秒及び解離時間１８０秒で流した。再生（regeneration）は、１０ｍＭグリシン－ＨＣＬ、ｐＨ１．５緩衝液（ＧＥ Healthcare、ＢＲ－１００３－５４）を使用し、流速３０μｌ／分、接触時間３０秒で行った。
反応時間（秒）による反応（ＲＵ：response unit）を示したグラフを図１１に示し、そこから算出された抗体の標的抗原結合親和度を表１４に示した。
図１１及び表１４から分かるように、５Ａ６ ＬＭ６は、野生型５Ａ６に比べ、ＢＣＭＡに結合した後で解離される速度（dissociation rate）が低くなった。５Ｄ５ ＬＭ４は、野生型５Ａ６に比べ、ＢＣＭＡに結合する速度（association rate）が上昇した。従って、５Ａ６ ＬＭ６抗体と５Ｄ５ ＬＭ４抗体は、それぞれの野生型抗体に比べ、改善された標的抗原親和度を有するということを確認した。
５．５Ａ６ ＬＭ６と５Ｄ５ ＬＭ４との抗体依存性細胞毒性評価（ＡＤＣＣ）
５Ａ６ ＬＭ６と５Ｄ５ ＬＭ４との抗体依存性細胞毒性評価を、それぞれの野生型抗体と比較測定するために、実施例３．２に記載された方法で測定し、測定された抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）結果を図１２に示した。
図１２から分かるように、５Ａ６ ＬＭ６抗体と５Ｄ５ ＬＭ４抗体は、ＢＣＭＡ高発現細胞株であるＨ９２９に対し、野生型抗体より上昇された抗体依存性細胞毒性程度を示した（図１２左側）。一方、５Ａ６ＷＴ抗体及び５Ｄ５ＷＴ抗体だけではなく、それらの突然変異抗体も、ＢＣＭＡ未発現Jurkat細胞株については、抗体依存性細胞毒性を引き起こすことができなかった（図１２右側）。
また、野生型抗体からＦｃ領域の機能阻害を誘発した突然変異抗体である５Ａ６ＮＡ突然変異及び５Ｄ５ＮＡ突然変異の場合、ＢＣＭＡ高発現Ｈ９２９細胞株に対し、抗体依存性細胞毒性が引き起こされていない（図１２左側）。
従って、５Ａ６ ＬＭ６抗体及び５Ｄ５ ＬＭ４抗体は、それぞれの野生型抗体に比べ、上昇されたＢＣＭＡ依存的な細胞毒性誘発能を示しながら、それは、実施例３．４で証明された抗原結合改善による上昇と一致する結果である。それにより、突然変異５Ａ６ ＬＭ６抗体と５Ｄ５ ＬＭ４抗体は、それぞれの野生型抗体に比べ、効果的な癌細胞成長阻害能を引き起こすことができるということを示す。
６．５Ａ６ ＬＭ６抗体または５Ｄ５ ＬＭ４の癌細胞株移植マウスモデルにおける腫瘍成長抑制評価
重症免疫複合免疫欠乏症（ＳＣＩＤ：severe combined immunodeficiency）マウスモデルに、ＢＣＭＡを高発現するヒト骨髄腫ＮＩＨ－Ｈ９２９細胞株を、マウスのわき腹に、１ｘ１０７細胞／headずつ移植し、ヒト癌移植腫瘍マウスを作製した。移植後、腫瘍サイズが平均１８０ｍｍ３に逹したとき、群分離を実施した（初日）。
突然変異が導入された５Ａ６ ＬＭ６抗体及び５Ｄ５ ＬＭ４抗体と、それぞれの野生型抗体５Ａ６ＷＴ，５Ｄ５ＷＴ、陰性対照群であるヒトＩｇＧ１（ＩｎＶｉｖｏ Ｐｌｕｓ human ＩｇＧ１ isotype control、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）の総５種抗体を、週２回、１０ｍｇ／ｋｇずつ、総４回１ｍＬシリンジを利用し、尾静脈に投与した（初日、第４日、第７日及び第１１日）。マウスに移植された腫瘍サイズと、体重は、初投与後、週２回、デジタルノギスと動物用秤とを利用して測定した（初日、第４日、第７日、第１１日、第１８日、第２２日及び第２５日）。
実験物質投与終了２週間後（第２５日）、マウスを、ＣＯ２ガスを利用して犠牲にし、腫瘍を摘出した後、摘出された腫瘍の体積及び重さを測定した。経時的な腫瘍体積を、図１３に示し、陰性対照群対比の投与群の腫瘍体積減少率（％）及び腫瘍重さ減少率（％）を表１５に示した。
図１３から分かるように、抗ＢＣＭＡ抗体４種（５Ａ６ＷＴ、５Ａ６ ＬＭ６、５Ｄ５ＷＴ及び５Ｄ５ ＬＭ４）は、陰性対照群であるヒトＩｇＧ１抗体対比で、腫瘍成長を顕著に低下させた。また、表１５から分かるように、投与された抗ＢＣＭＡ抗体４種は、陰性対照群対比で、癌細胞成長阻害率（ＴＧＩ％：％ of tumor growth inhibition）について、統計学的有意性を示した（一元配置分散分析、Ｐ値＜０．０５）。ただし、野生型抗体とその突然変異抗体との間（５Ａ６ＷＴ対５Ａ６ ＬＭ６、及び５Ｄ５ＷＴ対５Ｄ５ ＬＭ４）には、腫瘍サイズ減少が同等な程度であると分析され、群間に統計学的有意性は、なかった。
それにより、突然変異５Ａ６ ＬＭ６抗体と５Ｄ５ ＬＭ４抗体は、それぞれの野生型抗体に比べ、上昇された試験管内（in vitro）活性（標的抗原結合能及び抗体依存性細胞毒性誘発）を示したが、生体内（in vivo）活性評価については、それぞれの野生型抗体と同一レベルの癌細胞成長阻害能があるということを確認した。
実施例１．抗ＢＣＭＡ抗体の準備
１．抗原の製造
抗ＢＣＭＡ抗体の製造のために、抗原を次のように製造した。ヒトＢＣＭＡ（ＮＰ＿００１１８３．２、配列番号１）のアミノ酸配列において、Ｎ末端から、５ないし５４番目の残基、１ないし５１番目の残基、１ないし５４番目の残基、及び４ないし４８番目の残基を含む抗原をそれぞれ使用した。
具体的には、ヒトＢＣＭＡ ５ないし５４番目の残基（Genscript(登録商標)、Ｚ０２７３１）を含む抗原（「ヒトＢＣＭＡ（５－５４）」）、ヒトＢＣＭＡ１－５１（自体作製、ＣＨＯ細胞で発現させる）をヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合させた抗原（「ヒトＢＣＭＡ－Ｆｃ（１－５１））、Ｃ末端に、Ｆｃ領域及びＨｉｓタグが融合されたヒトＢＣＭＡ１－５１抗原（１０６２０－Ｈ０３Ｈ、Sino Biological Ｉｎｃ．）（「ヒトＢＣＭＡ－Ｆｃ／Ｈｉｓ（１－５１）」）、及びヒトＢＣＭＡ４－４８（自体作製、ＨＥＫ２９３細胞で発現させる）をＦｃ領域に融合させた抗原（「ヒトＢＣＭＡ－Ｆｃ（４－４８）」）を準備した。
ヒトＢＣＭＡ－Ｆｃ（４－４８）は、下記のように製造した。ヒトＢＣＭＡ ４ないし４８番目の残基を暗号化するポリヌクレオチドを、ＣＭＶプローモーターを含む動物細胞発現用ベクターであるｐＡＢ１－Ｆｃにクローニングした。クローニングされたベクターを、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞に形質転換させ、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーを使用し、ヒトＢＣＭＡ－Ｆｃ（４－４８）を精製した。ヒトＢＣＭＡ－Ｆｃ（１－５１）も、同じ方法で製造した。
また、種間交差反応性を確認するために、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域が融合されたサル（rhesus）ＢＣＭＡ（１－５３）（９０１０３－Ｃ０２Ｈ、Sino Biological Ｉｎｃ．）、マウスＢＣＭＡ（１－４９）（５００７６－Ｍ０１Ｈ、Sino Biological Ｉｎｃ．）及びラットＢＣＭＡ（１－４９）（８０１５６－Ｒ０１Ｈ、Sino Biological Ｉｎｃ．）を使用した。サルＢＣＭＡ（１－５３）、マウスＢＣＭＡ及びラットＢＣＭＡのアミノ酸配列を下記表１に記載した。
【表1】
多様な抗原に対して結合可能性を有するヒト由来ＳｃＦｖ（single-chain variable fragment）ファージライブラリー細胞（Mol. Cells OT, 225-235, February 28, 2009）を準備した。準備されたファージライブラリーに、ヘルパーファージ（helper phage）を感染させた後、ファージパッキングを誘導した。その後、培養液を、４℃で４，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、上澄み液に、４％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ６０００（Fluka、８１２５３）及び３％ ＮａＣｌ（Sigma、Ｓ７６５３）を添加して十分に溶かした後、氷で１時間インキュベーションした。それを、再び４℃で８，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、ペレットをＰＢＳに懸濁した後、さらに４℃で１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ライブラリーファージを含む上澄み液を得た。得られたライブラリーファージは、使用時まで４℃で保管した。
ヒトＢＣＭＡ、ヒトＢＣＭＡ及びサルＢＣＭＡに交差反応性がある抗体をスクリーニングするために、次のような方法で、総３回パンニングを行った。免疫試験管（Immunotube、maxisorp ４４４２０２）に、５μｇの実施例１．１で準備された抗原を加え、４℃で１６時間インキュベーションし、試験管表面にタンパク質をコーティングした。上澄み液を除去し、非特異的結合を遮断するために、ＢＳＡ（bovine serum albumin）を加えてブロッキングした。
実施例１．２で準備された１０１２ＣＦＵのファージライブラリーに、１．５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを混合し、抗原タンパク質がコーティングされた免疫試験管に加えた後、３７℃で１時間反応させ、ＢＣＭＡ特異的なファージを抗原に結合させた。続いて、ＰＢＳ－Ｔ（phosphate buffered saline；０．０５％ Tween ２０）溶液で多数回洗浄後、１００ｍＭトリエチルアミン溶液を使用し、ＢＣＭＡに結合したファージを回収した。回収されたファージを、１Ｍ Tris緩衝液（ｐＨ７．４）で中和させた後、Ｋ１２ ＥＲ２７３８大腸菌に感染させ、さらにファージを回収する過程を４回反復し、ファージをパンニングした。パンニングラウンドが進められるほど、ＰＢＳ－Ｔを利用した洗浄回収を増加させ、抗原特異的ファージを増幅及び濃縮した。
３．単一クローンファージ抗体選別（single clone screening）
ファージプール（phage pool）からＢＣＭＡに特異的に結合する単一クローン抗体を選別するために、単一クローンファージ抗体選別過程を遂行した。
具体的には、実施例１．２で得たファージプールを順次希釈し、ＬＢ－テトラサイクリン／カベニシリンを含む固体培地で培養し、単一コロニーを確保した。各コロニーを、９６ deepウェルプレトで培養し、ＯＤ６００が０．５ないし０．７になるように培養した。前記培養液に、２０ ＭＯＩヘルパーファージを加え、３７℃で１時間反応させた。その後、培養液にカナマイシンを加え、３０℃で一晩培養した。翌日、培養液を遠心分離し、上澄み液を取った後、それを利用し、ＢＣＭＡ特異的ファージを選別するためのＥＬＩＳＡを遂行した。各ウェル当たり１００ｎｇの組み換えＢＣＭＡをＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、非特異的結合を防止するために、３％ ＢＳＡでコーティングした後、プレートをＰＢＳで洗浄した。準備された単一クローンファージを各ウェルに加えた後、３７℃で１時間インキュベーションし、プレートをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が接合された抗ＨＡ（hemagglutinin）抗体とＴＭＢ（tetramethylbenzidine、Sigma、Ｔ０４４０）を使用してＥＬＩＳＡを遂行した。４５０ｎｍでの吸光度が０．５以上であり、抗ＨＡＨＲＰ単独である対照群の吸光度と比べ、５倍以上の吸光度が増大されたクローンを選別した。ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体クローン１１種（Ｂ５８、５Ａ６、５Ｄ５、５Ｂ５、２Ｃ６、２Ｆ８、４Ｈ９、１Ｈ、２Ｇ、５Ｇ及び５Ｃ３）を選別した。
選別された抗体を暗号化する核酸配列から、抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号５ないし１５）、及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１６ないし２６）を分析し、Kabat定義により、相補性決定領域（ＣＤＲ：complementarity determining region）を決定した。決定された重鎖及び軽鎖のＣＤＲアミノ酸配列（Ｎ→Ｃ）をそれぞれ表２及び表３に示した。
【表2】
【表3】
重鎖可変領域を暗号化する核酸配列、及び軽鎖可変領域を暗号化する核酸配列は、下記表４に示した。
【表4】
４．選別された抗ＢＣＭＡＰｈａｇｅから抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体の生産
実施例１．３で選別された抗体を暗号化する核酸配列を有するポリヌクレオチドを合成した。準備されたポリヌクレオチドを、動物細胞培養用ベクター（重鎖発現ベクター：ｐＡＢ１－ＨＣ、軽鎖発現ベクター：ｐＡＢ１－ＬＣ）にクローニングした。前記１１種の抗体クローン（Ｂ５８、５Ａ６、５Ｄ５、５Ｂ５、２Ｃ６、２Ｆ８、４Ｈ９、１Ｈ、２Ｇ、５Ｇ及び５Ｃ３）に対し、それぞれ重鎖及び軽鎖を暗号化するポリヌクレオチドを含む総２２個のベクターを製造した。準備されたベクターは、ＩｇＧ１タイプ配列を含む。
ＣＨＯ－Ｓ細胞をＣＤ－ＣＨＯ（Gibco、１０７４３）培地で培養し、準備されたベクターは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用し、ＣＨＯ－Ｓ細胞に導入した。形質導入されたＣＨＯ－Ｓ細胞を、ＣＤ－ＣＨＯ培地で、８％ ＣＯ２、３７℃及び１１０ｒｐｍの条件で約７日間培養した。
平衡化緩衝液（５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化されたMabSelect ＳｕＲｅカラム（ＧＥ Healthcare、５ｍｌ）に、準備されたＣＨＯ－Ｓ細胞培養液を通過させ、発現された抗体をカラムに結合させた。該抗体を、５０ｍＭ Ｎａ－クエン酸塩（ｐＨ３．４）及び１００ｍＭ ＮａＣｌの溶液で溶出させた後、１Ｍ Tris－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で中和させ、最終ｐＨが７．２になるようにした。その後、緩衝液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で交換し、使用時まで、抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体であるＢ５８、５Ａ６、５Ｄ５、５Ｂ５、２Ｃ６、２Ｆ８、４Ｈ９、１Ｈ、２Ｇ、５Ｇ及び５Ｃ３を４℃で保管した。
５．５Ａ６及び５Ｄ５の突然変異の製造
選別された５Ａ６抗体及び５Ｄ５抗体の生産性を改善させるために、表４の核酸配列を利用し、抗体の軽鎖ＣＤＲにおいて、１個あるいは２個のアミノ酸残基を突然変異させた突然変異抗体を製造した。
５Ａ６突然変異抗体の軽鎖可変領域（配列番号１０７ないし１１４）、及び５Ｄ５突然変異抗体の軽鎖可変領域（配列番号１１５ないし１１９）において、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列を、それぞれ表５及び表６に示した。表５及び６において、下線及び太字で表示されたアミノ酸残基が突然変異された部分である（ＷＴ：野生型、ＬＭ：軽鎖突然変異）。
【表5】
【表6】
実施例２．抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体の動力学的分析
１．抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体のＢＣＭＡに対する結合力の確認
（１）組み換えＢＣＭＡに対する結合力の確認
実施例１．４で分離された抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体の組み換えＢＣＭＡタンパク質に対する特異的結合力を、ＥＬＩＳＡ方法で分析した。
抗原としては、組み換えヒトＢＣＭＡまたはサルＢＣＭＡを使用し、二次抗体として、ＨＲＰ接合されたＦａｂ多重クローナル抗体試薬（Pierce、３１４１４）を使用し、実施例１．３に記載されているようにＥＬＩＳＡを遂行した。抗体の濃度による４５０ｎｍにおける吸光度を、図１Ａ及び図１Ｂに示した。図１Ａは、１Ｈ抗体、２Ｇ抗体及び５Ｇ抗体の、ヒトＢＣＭＡまたはサルＢＣＭＡに対する結合力を示したグラフでであり、図１Ｂは、Ｂ５８抗体、２Ｃ６抗体、５Ｃ３抗体、５Ｂ５抗体、５Ａ６抗体、５Ｄ５抗体、４Ｈ９抗体及び２Ｆ８抗体の、ヒトＢＣＭＡに対する結合力を示したグラフである。
図１Ａから分かるように、１Ｈ抗体、２Ｇ抗体及び５Ｇ抗体は、ヒトＢＣＭＡ及びサルＢＣＭＡに対し、濃度依存的に結合した。ヒトＢＣＭＡに対する結合力は、２Ｇ抗体、１Ｈ抗体及び５Ｇ抗体の順序で高く、サルＢＣＭＡに対する結合力は、１Ｈ抗体が最も好ましく、２Ｇ抗体と５Ｇ抗体は、同等な水準であった。図１Ｂから分かるように、８種（Ｂ５８、２Ｃ６、５Ｃ３、５Ｂ５、５Ａ６、５Ｄ５、４Ｈ９及び２Ｆ８）の抗ＢＣＭＡ抗体が、いずれもヒトＢＣＭＡに対し、濃度依存的に結合するということを確認した。
（２）細胞表面のＢＣＭＡに対する結合力の確認
選別された抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体が細胞表面に発現されたＢＣＭＡに結合する程度を、ＦＡＣＳシステムを介して分析した。
ＢＣＭＡが発現されると知られている多発性骨髄腫癌細胞であるＨ９２９（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－９０６８ＴＭ）及びＯＰＭ－２細胞株（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ５０）を準備し、ヒトＢＣＭＡが過発現されているＣＨＯＫ１－ｈＢＣＭＡ細胞株（ＡＢＩＢｉｏ製）を準備した。比較群として、ＢＣＭＡ発現をしないＣＨＯＫ１（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－９６１８）及びＲａｊｉ（Ｂ－lymphocyte cancer cell line）（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－８６ＴＭ）細胞株を使用した。
前記準備された細胞に、実施例１．４で精製された７種（Ｂ５８、５Ａ６、５Ｄ５、５Ｂ５、１Ｈ、２Ｇ及び５Ｇ）のＩｇＧ抗体１０μｇ／ｍｌを加え、４℃で１時間インキュベーションした後、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。抗ヒトＦｃＦＩＴＣを１：４００に希釈し、さらに４℃で１時間インキュベーションした後、ＰＢＳ緩衝液で洗浄する過程を反復した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機器を利用し、細胞の蛍光強度を測定し、図２Ａ及び図２Ｂに示した（ＭＦＩ：平均蛍光強度）。
図２Ａ及び図２Ｂから分かるように、選別された抗体は、いずれも細胞表面に発現されたＢＣＭＡに特異的に結合し、ＢＣＭＡが発現されない細胞には、結合しないということを確認した。従って、選別された抗体は、組み換えＢＣＭＡタンパク質だけではなく、細胞表面に発現されたＢＣＭＡの細胞外ドメインに対して特異的な結合能があり、その抗ＢＣＭＡ抗体を利用し、ＢＣＭＡ発現癌細胞株を選択的にターゲッティングすることができるということを確認した。
２．抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体の、ヒトＢＣＭＡ及びサルＢＣＭＡに対する親和度分析
選別された１１種の抗ＢＣＭＡ抗体の、ヒトＢＣＭＡ及びサルＢＣＭＡに対する親和度を分析した。
バイオセンサトレイケースに、９６ウェルブラックマイクロプレートを装着し、８個ウェルそれぞれに、１ＸＫＢ ２００μｌを入れた後、Ｎｉ－ＮＴＡバイオセンサ（Fortebio）８個を差し入れ、水和反応（hydration）を１０分間行った。抗原固定のために、５μｇ／ｍｌの組み換えヒトＢＣＭＡ－Ｈｉｓ（Sino Biological Ｉｎｃ．）１ＸＫＢを使用して希釈した。閾値０．５ないし１．０ｎｍに固定して実験し、Ｏｃｔｅｔ Data Acquisition ９．０ソフトウェアを活性化させ、Ｏｃｔｅｔプログラムテンプレートを作成した。最初段階は、基線（baseline）１、２番目段階は、積載（loading）段階であり、閾値を０．５ないし１．０ｎｍに固定した。３番目段階は、基線（baseline）２であり、５分間結合（association）過程及び２０分間解離（dissociation）過程を遂行した。プレート温度は、３０℃に固定し、Ｏｃｔｅｔプログラムテンプレートに合わせ、新たな９６ウェルブラックマイクロプレートに準備された緩衝液を、順序に合うように入れた。基線（baseline）１として使用される１ＸＫＢ ２００μｌに、積載される抗原として、組み換えヒトＢＣＭＡ－Ｆｃ／Ｈｉｓを５μｇ／ｍｌに希釈し、２００μｌ入れた。基線（baseline）２として使用される１ＸＫＢを２００μｌ入れた後、抗原と反応させる抗体を２００μｌずつ分注し、機器を作動させた。実験終了後、Ｏｃｔｅｔ Analysis ９．０ソフトウェアで、各抗体に対する吸着率定数（ｋｏｎ：association constant）、分離率定数（ｋｄｉｓ：dissociation constant及び平衡分離定数（ＫＤ：equilibrium dissociation constant）を分析して算出し、その内容は表７に示した。
【表7】
表７から分かるように、Ｂ５８抗体及び５Ａ６抗体の親和度は、約１０－１１のＫＤ値を有し、２Ｃ６抗体、５Ｂ５抗体及び５Ｄ５抗体が、約１０－１０のＫＤ値を有し、選別された抗体が、ヒトＢＣＭＡタンパク質に対し、高い結合力を有するということを確認した。それらのうち、細胞表面のヒトＢＣＭＡに対する結合力が微々たる２Ｃ６抗体と、サルＢＣＭＡに対する親和力がないＢ５８抗体とを除いた３種の抗体（５Ａ６、５Ｂ５、５Ｄ５）を利用し、サルＢＣＭＡに対する親和度を追加して確認して、その結果を表８に示した。
【表8】
表８から分かるように、５Ａ６抗体、５Ｂ５及び５Ｄ５抗体が、ヒトＢＣＭＡだけではなく、サルＢＣＭＡに対しても、高い親和力を有するというということを確認した。
３．抗ＢＣＭＡ抗体の種間交差反応性分析
選別された抗体において、Ｂ５８抗体、５Ａ６抗体、５Ｄ５抗体及び５Ｂ５抗体の種間交差結合いかんをＥＬＩＳＡ方法で分析した。
実施例１．１で準備されたヒト、サル、マウス及びラットのＢＣＭＡ抗原１００ｎｇをプレート底にコーティングした後、３％ ＢＳＡでコーティングし、非特異的な結合を遮断した。一次抗体として選別された抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体、及び二次抗体として抗ヒトＦａｂ ＨＲＰ（１：２０，０００希釈）を使用し、実施例１．３に記載されているように、ＥＬＩＳＡ分析法を遂行した。
マイクロプレートリーダで測定された４５０ｎｍでの吸光度を図３に示し、５０％最大有効濃度（ＥＣ５０：half maximal effective concentration）（ｎＭ）を表９に示した。
【表9】
図３及び表９から分かるように、Ｂ５８抗体は、ヒトＢＣＭＡにだけ結合力を有し、５Ａ６抗体は、ヒトＢＣＭＡ及びサルＢＣＭＡに結合力を有している。５Ｄ５抗体と５Ｂ５抗体は、分析され全種のＢＣＭＡ（ヒト、サル、マウス及びラット）に結合力を有するということを確認した。
４．抗ＢＣＭＡ ＩｇＧのＢＣＭＡの特異度確認
ＢＣＭＡは、Ｂ細胞の成熟化過程に関与すると知られており、該成熟化過程に、ＴＡＣＩ受容体及びＢＡＦＦ受容体が関与すると知られている。選別された抗体が、ＢＣＭＡ関連タンパク質に結合される否かということを、ＥＬＩＳＡ技法を介して分析した。
具体的には、ヒトＢＣＭＡ－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Systems、１９３－ＢＣ－０５０）、ＴＡＣＩ－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Systems、１７４－ＴＣ）及びＢＡＦＦ－受容体（Ｒ＆Ｄ Systems、１１６２－ＢＲ）を、ＰＢＳバッファを利用して希釈した後、ＥＬＩＳＡプレートに、ウェル当たり１００ｎｇずつコーティングした。一次抗体として、選別された抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体を使用し、二次抗体として、抗ヒトＦａｂ ＨＲＰ（１：２０，０００希釈）を使用し、実施例１．４（１）に記載されているように、ＥＬＩＳＡ分析法を遂行した。比較群として、抗ＢＣＭＡモノクローン抗体Ｊ６ＭＯ（ＧＳＫ）を使用した。マイクロプレートリーダで測定された４５０ｎｍでの吸光度を図４に示した。
図４から分かるように、Ｂ５８抗体、５Ａ６抗体、５Ｄ５抗体及び５Ｂ５抗体は、ＴＡＣＩ受容体及びＢＡＦＦ受容体には結合しないが、ＢＣＭＡにだけ結合した。従って、選別された４種の抗ＢＣＭＡ抗体であるＢ５８抗体、５Ａ６抗体、５Ｄ５抗体及び５Ｂ５抗体は、ＢＣＭＡに特異的に結合するということを確認した。
５．抗ＢＣＭＡ抗体の抗体別エピトープの相対比較
選別された４種の抗体（ＩｇＧ）を使用し、ＢＣＭＡに結合する部位を相対比較するために、選別された抗体間のヒトＢＣＭＡに対する競争的結合能を分析した。
実施例２．２に記載されているように、Ｏｃｔｅｔ分析システムを利用し、抗体間の結合能を分析した。Ｏｃｔｅｔプログラムテンプレートにおける最初段階は、基線（baseline）１であり、２番目段階は、積載とし、閾値を０．３ｎｍに固定した。３番目段階は、基線（baseline）とした。４番目及び５番目の段階は、それぞれの抗体を反応させ、時間は１０分に設定した。Ｏｃｔｅｔプログラムテンプレートに合わせ、新たな９６ウェルブラックマイクロプレートに準備された緩衝液を、順序に合うように入れた。基線（baseline）１として使用される１ＸＫＢを、２００μｌ入れた。積載する抗原である組み換えヒトＢＣＭＡ（Ｆｃタグ及びＨｉｓタグを融合）を５μｇ／ｍｌに希釈し、２００μｌずつ入れた。基線（baseline）２として使用される１ＸＫＢ ２００μｌを入れた。抗原と最初に結合する抗体を２００μｌずつ入れた。２番目抗体を２００μｌずつ入れた。実験プレートの温度は、３０℃に固定した。試料をいずれも入れた後、機器を作動させた。実験終了後、Ｏｃｔｅｔ analysis ９．０ソフトウェアで、最初抗体と２番目抗体との競争を分析し、その結果を、図５Ａないし図５Ｄに示した（Ｒｅｆ．Ａｂ：Ｊ６ＭＯ抗体）。
図５Ａないし図５Ｄから分かるように、Ｂ５８抗体と５Ａ６抗体は、抗原に対する結合部位、すなわち、エピトープが異なっており、５Ｂ５抗体と５Ｄ５抗体は、エピトープが同一であると確認された。また、５Ｂ５抗体と５Ｄ５抗体とのエピトープは、Ｂ５８のエピトープと部分的に同一であると確認された。従って、選別された４種の抗体は、抗原であるＢＣＭＡに結合する部位が多様であるということを確認した。
実施例３．抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体の癌細胞に対する効果
１．抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体の中和効果
選別された抗ＢＣＭＡ抗体が、ＢＣＭＡとリガンド（ＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦ）との結合を妨害することができるか否かということを、ＥＬＩＳＡ基盤溶液競争試験で確認した。
具体的には、ヒトＢＣＭＡ－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Systems、１９３－ＢＣ－０５０）を、ＰＢＳバッファを利用して希釈した後、ＥＬＩＳＡプレートに、ウェル当たり１００ｎｇずつコーティングした。コーティング後、プレートを空にし、１％ ＢＳＡが含まれたＰＢＳＴを、各ウェル当たり１００μｌずつ加え、３７℃で２時間インキュベーションした。５０μｇ／ｍｌないし０．０００２８μｇ／ｍｌの濃度に希釈された抗体と、１０ｎｇ／ｍｌのＡＰＲＩＬタンパク質（Ｒ＆Ｄ、５８６０－ＡＰ－０１０／ＣＦ）、または２００ｎｇ／ｍｌのＢＡＦＦ（Ｒ＆Ｄ、２１４９－ＢＦ－０１０／ＣＦ）とを混合した。陰性対照群として、ＩｇＧ１抗体を使用し、比較群として、Ｊ６ＭＯ抗体を使用した。
二次抗体として、抗ＨＡ－ＨＲＰ（Roche、１２０１３８１９００１）または抗Ｈｉｓ－ＨＲＰ（Roche、１１９６５０８５００１）を使用し、実施例１．４（１）に記載されているように、ＥＬＩＳＡ分析法を遂行した。比較群として、抗ＢＣＭＡモノクローン抗体Ｊ６ＭＯ（ＧＳＫ）を使用した。４５０ｎｍでの吸光度を測定し、その結果を図６Ａ及び図６Ｂに示した。
図６Ａ及び図６Ｂから分かるように、Ｂ５８抗体は、ＢＣＭＡとＢＡＦＦとの結合を効果的に阻害し、ＢＣＭＡとＡＰＲＩＬとの結合も妨害するということで確認した。５Ａ６抗体、５Ｂ５抗体及び５Ｄ５抗体は、ＢＣＭＡに対するＡＰＲＩＬの結合能を阻害することができないが、ＢＡＦＦの結合能は、一部阻害すると確認された。従って、選別された抗体は、ターゲット抗原ＢＣＭＡに対する結合部位が異なっており、ＢＣＭＡリガンド結合能阻害程度に違いがあるが、リガンド結合を調節して抑制し、癌細胞成長を効果的に抑制する可能性があるということが確認された。
２．抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体の抗体依存性細胞毒性評価（ＡＤＣＣ：antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）
ＡＤＣＣ bioassay core kit（Promega、Ｇ０７１８）を使用し、選別された抗体の抗体依存性細胞毒性を測定した。
具体的には、ヒトＢＣＭＡを多く発現しているＨ９２９（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－９０６８ＴＭ）と、少なく発現するＲａｊｉ（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－８６ＴＭ）とを標的細胞として使用した。抗ＢＣＭＡ抗体として、Ｂ５８抗体、５Ａ６抗体、５Ｄ５抗体及び５Ｂ５抗体を準備した。
また、抗体依存性細胞毒性に関与するＦｃ部分に機能阻害を誘発し、陰性対照群として使用するために、５Ａ６Ｆｃ部分の２６５番のアスパラギン酸のアミノ酸残基をアラニンで置換（「Ｄ２６５Ａ」）し、２９７番のアスパラギン残基をアラニンで置換（「Ｎ２９７Ａ」）した５Ａ６ ＤＡＮＡ突然変異抗体を準備した（Cancer Cell, vol.19, issue 1, pp. 101-113）。
ＡＤＣＣ分析緩衝液は、ＲＰＭＩ／１６４０（Promega、Ｇ７０８Ａ）及び４％低ＩｇＧ血清（Promega、ＡＸ２０Ａ）を添加して製造した。ＡＤＣＣ分析緩衝液に再懸濁したＨ９２９細胞株とＲａｊｉ細胞株とを、９６ウェルプレート（白、平底、Corning、ＣＬＳ３９１７）に、ウェル当たり５，０００個の細胞（２５μｌ）で添加した。抗ＢＣＭＡ抗体は、ＡＤＣＣ分析緩衝液で、１３３．３ｎＭ（２０μｇ／ｍｌ）から１／８ずつ順次希釈して準備した。準備された抗体を、各ウェル当たり２５μｌずつ添加した。３．６ｍｌのＡＤＣＣ分析緩衝液を１５ｍｌチューブに入れた後、液化窒素タンクから、ＡＤＣＣ Bioassay Effector cell（Promega、Ｇ７０１Ａ）を取り出し、３７℃槽で迅速に溶かした後、ＡＤＣＣ分析緩衝液が入れられた１５ｍｌチューブに流し込んだ。Effector cellを十分に混ぜた後、２５μｌずつチューブに慎重に加え、３７℃、５％ ＣＯ２の条件で、細胞を約６時間培養した。その間、Ｂｉｏ－ＧｌｏＴＭルシフェラーゼ分析緩衝液（Promega、Ｇ７２０Ａ）を常温で溶かした後、Ｂｉｏ－ＧｌｏＴＭルシフェラーゼ分析基質（Promega、Ｇ７１９Ａ）に入れて十分に混ぜ、Ｂｉｏ－ＧｌｏＴＭルシフェラーゼ分析試薬を製造した。細胞培養後、９６ウェルプレートを、常温で約１０分間放置した後、各ウェルに、２５μｌのＢｉｏ－ＧｌｏＴＭルシフェラーゼ分析試薬を慎重に加えた。常温で５分間放置した後、ＰＨＥＲＡstar ＦＳ ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ機器で発光強度を測定した。結果値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Prismを利用し、非線形回帰分析法（curve fit）で分析し、その結果を図７に示した。
図７から分かるように、ＢＣＭＡの発現が高いＨ９２９細胞において、選別された抗ＢＣＭＡ抗体が、濃度依存的に抗体依存性細胞毒性を誘発した（Ｂ５８＞５Ａ６＝５Ｄ５＞５Ｂ５）。Ｆｃ領域の機能阻害を誘発した５Ａ６ ＤＡＮＡ突然変異抗体の場合、ＡＤＣＣが誘発されず、ＡＤＣＣは、抗体のＦｃ領域によって引き起こされるということを確認した。一方、ＢＣＭＡ発現が観察されていないＲａｊｉについては、ＡＤＣＣが誘発されなていない。従って、選別されたＢ５８抗体、５Ａ６抗体、５Ｄ５抗体及び５Ｂ５抗体は、ＢＣＭＡが発現された癌細胞にだけ特異的に結合し、Ｆｃ機能による抗体細胞毒性を誘発することができるということを確認した。
３．抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体の癌細胞株移植マウスモデルでの腫瘍成長抑制評価
（１）多発性骨髄腫癌細胞株Ｈ９２９－移植マウスモデルでの腫瘍成長抑制評価
６週齢雄ＣＢ１７－ＳＣＩＤマウスを、７日間馴化期間を通過させた後、動物実験に使用した。細胞移植前、マウス細胞移植部位の除毛を進め、耳には、個体識別のための耳タグを付着させた。
細胞移植日、条件に合うように培養された多発性骨髄腫癌細胞株Ｈ９２９を収集し、ＰＢＳで、ベックマン・コールター（Beckman coulter）で細胞数／生存度を測定した。最終的に、１００μｌの、ＰＢＳ当たり投与細胞数（１ｘ１０７細胞／匹）になるように準備した。細胞懸濁液と同一体積でマトリゲル（Matrigel）（ＢＤ）を加え、ピペットで混合した。マウスに対して、イソフルラン吸入麻酔を施した後、除毛されている右側背中側皮下に、２００μｌの細胞懸濁液を投与した。マウスをケージに入れ、麻酔から覚めた後、活動に問題がないか否かということを最終確認した。腫瘍サイズは、ノギス（callipers）を使用し、腫瘍の長軸と短軸とを測定した、下記数式１を利用し、最終腫瘍サイズを計算した。
（数１）
腫瘍サイズ（ｍｍ３）＝（０．５）ｘ（長軸）ｘ（短軸）２
薬物投与は、腫瘍サイズが平均２６９ｍｍ３であるときから投与を始めた。投与薬物は、対照群（ＰＢＳ）及び抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体４種（Ｂ５８、５Ａ６、５Ｄ５及び５Ｂ５）の５グループ（各ｎ＝７）で進めた。薬物は、２ｍｇ／ｍｌ（２０ｇ基準：１００μｌ／head）で準備した。投与用量は、１０ｍｇ／ｋｇであり、週２回ずつ総５回、尾に静脈投与した。体重は、動物用体重計を使用して測定した。体重及び腫瘍サイズは、週２回測定した。薬物投与後の２１日目、体重及び腫瘍サイズの測定後、安楽死させた後、各個体別腫瘍を摘出し、重さを測定した。
腫瘍注射後、経時的（時間：日）な腫瘍サイズ（ｍｍ３）、抗体別腫瘍サイズ（ｍｍ３）、及び抗体別腫瘍の重さ（ｇ）を示したグラフを、図８Ａないし図８Ｃに示した（矢印：薬物投与時点）。各抗体の対照群対比の体積減少率（％）及び重さ減少率（％）を表１０に示した（ｐ＜０．００１）。
【表10】
図８Ａないし図８Ｃ、及び表１０から分かるように、Ｈ９２９移植マウスモデルにおいて、対照群（ＰＢＳ）に比べ、抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体４種（Ｂ５８、５Ａ６、５Ｄ５及び５Ｂ５）を投与した群において、腫瘍成長抑制効果が示された。各群の腫瘍サイズを最終分析した結果、対照群の腫瘍サイズ対比での、本願抗体処理群の腫瘍が、約５１．７％ないし約６７．４％減少した。一元配置分散分析結果、対照群（ＰＢＳ）対比の、抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体４種における統計学的有意性が示された（ｐ＜０．００１）。従って、多発性骨髄腫に選別された抗体を処理する場合、有意的に、腫瘍成長を抑制することができるということを証明した。また、５Ｄ５と５Ａ６との場合、抗体依存性細胞毒性評価ないしＢＣＭＡ関連リガンド結合妨害結果において、Ｂ５８抗体対比で、低活性を示したが、生体内（in vivo）活性評価において、Ｂ５８と同等以上の効果を示した。それは、前記２つの抗体が、腫瘍成長阻害に有利なエピトープを認知するか、あるいは抗体自体の物性にすぐれているということを意味する。
（２）多発性骨髄腫癌細胞株ＯＰＭ－２－移植マウスモデルにおける腫瘍成長抑制評価
実施例３．３（１）に記載されているように、マウスに、多発性骨髄腫癌細胞株ＯＰＭ２を移植し、抗体投与による腫瘍成長抑制を評価した。
薬物投与は、腫瘍サイズが平均１７２ｍｍ３であるときから投与を始めた。投与薬物は、対照群（ＰＢＳ）及び抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体４種（Ｂ５８、５Ａ６及び５Ｄ５）の４グループ（各ｎ＝９）で進めた。投与用量が１０ｍｇ／ｋｇになるように、投与薬物を２ｍｇ／ｍｌ（２０ｇ基準：１００μｌ／head）で準備した。投与用量は、１０ｍｇ／ｋｇであり、週２回ずつ総５回、尾に静脈投与した。薬物投与後の２７日目、体重及び腫瘍サイズを測定して安楽死させた後、各個体から腫瘍を摘出して重さを測定した。
腫瘍注射後、経時的（時間：日）な腫瘍サイズ（ｍｍ３）、抗体別腫瘍サイズ（ｍｍ３）、及び抗体別腫瘍の重さ（ｇ）を示したグラフを、図９Ａないし図９Ｃに示した（矢印：薬物投与時点）。各抗体の対照群対比の腫瘍の体積減少率（％）及び重さ減少率（％）を表１１に示した（ｐ＜０．００１）。
【表11】
図９Ａないし図９Ｃ、及び表１１から分かるように、ＯＰＭ－２移植マウスモデルにおいて、対照群（ＰＢＳ）に比べ、抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ抗体３種（Ｂ５８、５Ａ６及び５Ｄ５）を投与した群において、腫瘍成長抑制効果が示された。各群の腫瘍サイズを最終分析した結果、各群の対照群対比の腫瘍抑制程度は、それぞれＢ５８ ４２．５％、５Ａ６ ３５．４％、５Ｄ５ ３８．５％と測定され、重さ測定時、対照群対比で、それぞれＢ５８ ４１．４％、５Ａ６ ３５．１％、５Ｄ５ ４０．５％の重さ減少率を示した。一元配置分散分析結果、対照群対比の、抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ３種の抗腫瘍効果は、統計的に有意性が示され（ｐ＜０．００１）、３種抗体間の腫瘍サイズ及び腫瘍重さの差は、統計学的に有意的な差が観察されていない。図６及び図７から分かるように、５Ｄ５と５Ａ６との場合、抗体依存性細胞毒性評価ないしＢＣＭＡ関連リガンド結合妨害分析結果において、Ｂ５８抗体対比で低い活性を示したが、生体内（in vivo）効能評価において、Ｂ５８と同等程度の効果を示した。それは、前記２つの抗体が腫瘍成長阻害に有利なエピトープを認知するか、あるいは抗体自体の物性すぐれている可能性があるということを意味する。
４．突然変異導入５Ａ６と５Ｄ５のターゲット抗原に対する結合力確認
（１）野生型５Ａ６，５Ｄ５と突然変異５Ａ６，５Ｄ５との組み換えＢＣＭＡに対する結合力確認
実施例１．５に記載された内容のように、抗ＢＣＭＡ抗体５Ａ６と抗ＢＣＭＡ抗体５Ｄ５とに突然変異を導入し、５Ａ６からの８種突然変異抗体、及び５Ｄ５からの５種突然変異抗体を製造して精製した。それらに対して、それぞれの野生型抗体と共に、組み換えタンパク質に対する結合力を分析し、その結果を図１０Ａ及び図１０Ｂに示した。
図１０Ａ及び図１０Ｂから分かるように、５Ａ６からの８種突然変異抗体のうち６種の抗体（５Ａ６ ＬＭ１、５Ａ６ ＬＭ３、５Ａ６ ＬＭ４、５Ａ６ ＬＭ５、５Ａ６ ＬＭ７及び５Ａ６ ＬＭ８）は、野生型に比べ、結合活性が同等であるか、それよりも低くなったが、２種の抗体（５Ａ６ ＬＭ２及び５Ａ６ ＬＭ６）は、野生型に比べ、上昇された抗原結合力を示した。５Ｄ５の場合、５種の突然変異抗体のうち２種の抗体（５Ｄ５ ＬＭ１及び５Ｄ５ ＬＭ２）は、野生型５Ｄ５に比べ、抗原結合活性が低下したが、残り３種（５Ｄ５ ＬＭ３、５Ｄ５ ＬＭ４及び５Ｄ５ ＬＭ５）は、野生型５Ｄ５と同等な抗原結合活性を示した。各抗体の５０％最大有効濃度（ＥＣ５０：half maximal effective concentration）（ｎＭ）を表１２に示した。
【表12】
（２）野生型５Ａ６、野生型５Ｄ５、及びそれらの突然変異の細胞表面ＢＣＭＡに対する結合力確認
野生型抗体とその突然変異抗体との細胞表面抗原に対する結合力を比較した。
ＢＣＭＡが高発現された多発性骨髄腫癌細胞Ｈ９２９（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－９０６８ＴＭ）に、野生型５Ａ６抗体、野生型５Ｄ５抗体、及びそれらの突然変異抗体を加え、抗体の細胞表面結合レベルを、ＦＡＣＳ分析を介して測定した。細胞表面の蛍光強度を測定し、その結果を図１０Ｃ及び図１０Ｄに示し、各抗体の平均蛍光強度（ＭＦＩ：mean fluorescence intensity）価格は表１３に示した。
【表13】
図１０Ｃ、図１０Ｄ及び表１３から分かるように、５Ａ６の場合、５種の突然変異抗体（５Ａ６ ＬＭ１、５Ａ６ ＬＭ３、５Ａ６ ＬＭ４、５Ａ６ ＬＭ５及び５Ａ６ ＬＭ６）の細胞結合力は、野生型５Ａ６抗体の細胞結合力に比べ、上昇された細胞結合力を示した。また、５Ｄ５の２種の突然変異抗体（５Ｄ５ ＬＭ４及び５Ｄ５ ＬＭ５）の細胞結合力は、野生型５Ｄ５抗体の細胞結合力に比べ、確実に上昇した。従って、野生型抗体のＣＤＲアミノ酸の一部変更により、組み換えＢＣＭＡ及び細胞表面ＢＣＭＡに対する結合力が一部改善されているということを確認した。
（３）５Ａ６ ＬＭ６と５Ｄ５ ＬＭ４とのヒトＢＣＭＡに対する親和度分析
単量体（monomer）ヒトＢＣＭＡ抗原に結合する５Ａ６ ＬＭ６及び５Ｄ５ ＬＭ４と、それぞれの野生型抗体との標的抗原結合親和度を分析した。
具体的には、１ｘ ＨＰＳ－ＥＰ緩衝液（ＧＥ Healthcare、ＢＲ－１００６－６９）を使用して準備された抗体を希釈した。標的抗原結合親和度分析は、Biacore Ｔ２００（ＧＥ Healthcare）を使用した。接触時間６０秒、安定化時間３０秒、及び３０μｌ／分の流速で、タンパク質Ａチップに流し、キャプチャレベルが１２８ＲＵ（response unit）に逹するようにし、抗体がキャプチャされたタンパク質Ａチップを準備した。
抗原は、１ｘ ＨＰＳ－ＥＰ緩衝液を使用し、１００ｎＭから６．２５ｎＭまで、２倍ずつ順次に希釈し、総６個の試料を準備し、陰性対照群（blank）として、１ｘ ＨＰＳ－ＥＰ緩衝液を利用した。
抗体がキャプチャされたタンパク質Ａチップに準備された抗原を、３０μｌ／分の流速で、結合時間６０秒及び解離時間１８０秒で流した。再生（regeneration）は、１０ｍＭグリシン－ＨＣＬ、ｐＨ１．５緩衝液（ＧＥ Healthcare、ＢＲ－１００３－５４）を使用し、流速３０μｌ／分、接触時間３０秒で行った。
反応時間（秒）による反応（ＲＵ：response unit）を示したグラフを図１１に示し、そこから算出された抗体の標的抗原結合親和度を表１４に示した。
【表14】
図１１及び表１４から分かるように、５Ａ６ ＬＭ６は、野生型５Ａ６に比べ、ＢＣＭＡに結合した後で解離される速度（dissociation rate）が低くなった。５Ｄ５ ＬＭ４は、野生型５Ａ６に比べ、ＢＣＭＡに結合する速度（association rate）が上昇した。従って、５Ａ６ ＬＭ６抗体と５Ｄ５ ＬＭ４抗体は、それぞれの野生型抗体に比べ、改善された標的抗原親和度を有するということを確認した。
５．５Ａ６ ＬＭ６と５Ｄ５ ＬＭ４との抗体依存性細胞毒性評価（ＡＤＣＣ）
５Ａ６ ＬＭ６と５Ｄ５ ＬＭ４との抗体依存性細胞毒性評価を、それぞれの野生型抗体と比較測定するために、実施例３．２に記載された方法で測定し、測定された抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）結果を図１２に示した。
図１２から分かるように、５Ａ６ ＬＭ６抗体と５Ｄ５ ＬＭ４抗体は、ＢＣＭＡ高発現細胞株であるＨ９２９に対し、野生型抗体より上昇された抗体依存性細胞毒性程度を示した（図１２左側）。一方、５Ａ６ＷＴ抗体及び５Ｄ５ＷＴ抗体だけではなく、それらの突然変異抗体も、ＢＣＭＡ未発現Jurkat細胞株については、抗体依存性細胞毒性を引き起こすことができなかった（図１２右側）。
また、野生型抗体からＦｃ領域の機能阻害を誘発した突然変異抗体である５Ａ６ＮＡ突然変異及び５Ｄ５ＮＡ突然変異の場合、ＢＣＭＡ高発現Ｈ９２９細胞株に対し、抗体依存性細胞毒性が引き起こされていない（図１２左側）。
従って、５Ａ６ ＬＭ６抗体及び５Ｄ５ ＬＭ４抗体は、それぞれの野生型抗体に比べ、上昇されたＢＣＭＡ依存的な細胞毒性誘発能を示しながら、それは、実施例３．４で証明された抗原結合改善による上昇と一致する結果である。それにより、突然変異５Ａ６ ＬＭ６抗体と５Ｄ５ ＬＭ４抗体は、それぞれの野生型抗体に比べ、効果的な癌細胞成長阻害能を引き起こすことができるということを示す。
６．５Ａ６ ＬＭ６抗体または５Ｄ５ ＬＭ４の癌細胞株移植マウスモデルにおける腫瘍成長抑制評価
重症免疫複合免疫欠乏症（ＳＣＩＤ：severe combined immunodeficiency）マウスモデルに、ＢＣＭＡを高発現するヒト骨髄腫ＮＩＨ－Ｈ９２９細胞株を、マウスのわき腹に、１ｘ１０７細胞／headずつ移植し、ヒト癌移植腫瘍マウスを作製した。移植後、腫瘍サイズが平均１８０ｍｍ３に逹したとき、群分離を実施した（初日）。
突然変異が導入された５Ａ６ ＬＭ６抗体及び５Ｄ５ ＬＭ４抗体と、それぞれの野生型抗体５Ａ６ＷＴ，５Ｄ５ＷＴ、陰性対照群であるヒトＩｇＧ１（ＩｎＶｉｖｏ Ｐｌｕｓ human ＩｇＧ１ isotype control、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）の総５種抗体を、週２回、１０ｍｇ／ｋｇずつ、総４回１ｍＬシリンジを利用し、尾静脈に投与した（初日、第４日、第７日及び第１１日）。マウスに移植された腫瘍サイズと、体重は、初投与後、週２回、デジタルノギスと動物用秤とを利用して測定した（初日、第４日、第７日、第１１日、第１８日、第２２日及び第２５日）。
実験物質投与終了２週間後（第２５日）、マウスを、ＣＯ２ガスを利用して犠牲にし、腫瘍を摘出した後、摘出された腫瘍の体積及び重さを測定した。経時的な腫瘍体積を、図１３に示し、陰性対照群対比の投与群の腫瘍体積減少率（％）及び腫瘍重さ減少率（％）を表１５に示した。
【表15】
図１３から分かるように、抗ＢＣＭＡ抗体４種（５Ａ６ＷＴ、５Ａ６ ＬＭ６、５Ｄ５ＷＴ及び５Ｄ５ ＬＭ４）は、陰性対照群であるヒトＩｇＧ１抗体対比で、腫瘍成長を顕著に低下させた。また、表１５から分かるように、投与された抗ＢＣＭＡ抗体４種は、陰性対照群対比で、癌細胞成長阻害率（ＴＧＩ％：％ of tumor growth inhibition）について、統計学的有意性を示した（一元配置分散分析、Ｐ値＜０．０５）。ただし、野生型抗体とその突然変異抗体との間（５Ａ６ＷＴ対５Ａ６ ＬＭ６、及び５Ｄ５ＷＴ対５Ｄ５ ＬＭ４）には、腫瘍サイズ減少が同等な程度であると分析され、群間に統計学的有意性は、なかった。
それにより、突然変異５Ａ６ ＬＭ６抗体と５Ｄ５ ＬＭ４抗体は、それぞれの野生型抗体に比べ、上昇された試験管内（in vitro）活性（標的抗原結合能及び抗体依存性細胞毒性誘発）を示したが、生体内（in vivo）活性評価については、それぞれの野生型抗体と同一レベルの癌細胞成長阻害能があるということを確認した。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】