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特開2024-124396核酸分子を検出するための方法、キット及びカートリッジ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024124396
(43)【公開日】2024-09-12
(54)【発明の名称】核酸分子を検出するための方法、キット及びカートリッジ
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6869 20180101AFI20240905BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20240905BHJP
G16B 30/00 20190101ALI20240905BHJP
G16B 25/00 20190101ALI20240905BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6869 Z ZNA
C12M1/00 A
G16B30/00
G16B25/00
【審査請求】有
【請求項の数】21
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024031732
(22)【出願日】2024-03-01
(31)【優先権主張番号】63/449,284
(32)【優先日】2023-03-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】518210052
【氏名又は名称】體學生物科技股▲ふん▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｔａｉｗａｎ， Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】100204490
【弁理士】
【氏名又は名称】三上 葉子
(72)【発明者】
【氏名】邱 創汎
(72)【発明者】
【氏名】陳 柏樺
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029AA23
4B029BB20
4B029FA15
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA17
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR32
4B063QR62
4B063QR66
4B063QR84
4B063QS15
4B063QS34
4B063QS39
4B063QX02
(57)【要約】 （修正有）
【課題】検出ステップを簡素化し、検出時間を短縮し、検出精度を向上させながら、豊富な情報を提供可能な、核酸分子検出方法、キット及びカートリッジを提供する。
【解決手段】第１の捕捉プライマーを第１の標的核酸分子にハイブリダイズさせて複合体を形成することと、新生鎖合成反応を実行して第１の鋳型分子‐第１の標的核酸分子複合体を形成することと、第１の鋳型分子を解離することと、第１のシーケンスプライマーを解離した第１の鋳型分子にハイブリダイズさせて単一分子配列決定によって第１の鋳型分子を配列決定し、第１の生配列を取得することと、第１の生配列と第１の標的配列を比較して各第１の生配列の第１の配列類似度を算出することと、第１の配列類似度が所定の閾値に達する第１の生配列を収集して第１のクラスタを取得することと、第１のクラスタをバイオインフォマティクスによって分析して第１のコンセンサス配列を取得することを含む。
【選択図】図１
【解決手段】第１の捕捉プライマーを第１の標的核酸分子にハイブリダイズさせて複合体を形成することと、新生鎖合成反応を実行して第１の鋳型分子‐第１の標的核酸分子複合体を形成することと、第１の鋳型分子を解離することと、第１のシーケンスプライマーを解離した第１の鋳型分子にハイブリダイズさせて単一分子配列決定によって第１の鋳型分子を配列決定し、第１の生配列を取得することと、第１の生配列と第１の標的配列を比較して各第１の生配列の第１の配列類似度を算出することと、第１の配列類似度が所定の閾値に達する第１の生配列を収集して第１のクラスタを取得することと、第１のクラスタをバイオインフォマティクスによって分析して第１のコンセンサス配列を取得することを含む。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数の第１の標的核酸分子を含むサンプルを提供することと、
複数の第１の捕捉プライマーを前記複数の第１の標的核酸分子にハイブリダイズさせて、複数の第１の捕捉プライマー-第１の標的核酸分子複合体を形成することと、
新生鎖合成反応を実行して、複数の第１の鋳型分子‐第１の標的核酸分子複合体を形成することと、
複数の第１の鋳型分子を解離することと、
複数の第１のシーケンスプライマーを解離した前記複数の第１の鋳型分子にハイブリダイズさせて、単一分子配列決定によって前記複数の第１の鋳型分子を配列決定して、複数の第１の生配列を取得することと、
前記複数の第１の生配列と第１の標的配列を比較して、各前記複数の第１の生配列の第１の配列類似度を算出することと、
第１の配列類似度が所定の閾値に達する複数の第１の生配列を収集して、第１のクラスタを取得することと、
前記第１のクラスタをバイオインフォマティクスによって分析して、第１のコンセンサス配列を取得すると、
を含み、
前記複数の第１の捕捉プライマーはリンカーを有し、前記リンカーは、配列決定チップ上で別のリンカーとペアリングされる、
核酸分子の検出方法。
複数の第１の捕捉プライマーを前記複数の第１の標的核酸分子にハイブリダイズさせて、複数の第１の捕捉プライマー-第１の標的核酸分子複合体を形成することと、
新生鎖合成反応を実行して、複数の第１の鋳型分子‐第１の標的核酸分子複合体を形成することと、
複数の第１の鋳型分子を解離することと、
複数の第１のシーケンスプライマーを解離した前記複数の第１の鋳型分子にハイブリダイズさせて、単一分子配列決定によって前記複数の第１の鋳型分子を配列決定して、複数の第１の生配列を取得することと、
前記複数の第１の生配列と第１の標的配列を比較して、各前記複数の第１の生配列の第１の配列類似度を算出することと、
第１の配列類似度が所定の閾値に達する複数の第１の生配列を収集して、第１のクラスタを取得することと、
前記第１のクラスタをバイオインフォマティクスによって分析して、第１のコンセンサス配列を取得すると、
を含み、
前記複数の第１の捕捉プライマーはリンカーを有し、前記リンカーは、配列決定チップ上で別のリンカーとペアリングされる、
核酸分子の検出方法。
【請求項2】
前記サンプルは未精製又は粗精製であり、複数の非標的核酸分子をさらに含み、前記複数の非標的核酸分子は、前記複数の第１の捕捉プライマー又は前記複数の第１のシーケンスプライマーによってハイブリダイズしない、
請求項１に記載の方法。
請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記複数の第１の標的核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅されない、
請求項１に記載の方法。
請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記複数の第１の標的核酸分子は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｍｉｎｉＲＮＡを含む、
請求項１に記載の方法。
請求項１に記載の方法。
【請求項5】
ペアリング方法は、ビオチン－ストレプトアビジン結合、核酸ハイブリダイゼーション又は化学結合を含む、
請求項１に記載の方法。
請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記前記複数の第１の鋳型分子は、一本鎖の直鎖核酸である、
請求項１に記載の方法。
請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記複数の第１の鋳型分子は、２５から１０，０００のヌクレオチドを有する、
請求項１に記載の方法。
請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記複数の第１の鋳型分子‐第１の標的核酸分子複合体を形成した後、洗浄プロセス及び精製プロセスを実行すること、
をさらに備える、請求項１に記載の方法。
をさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記複数の第１の鋳型分子を解離させた後、かつ、前記複数の第１のシーケンスプライマーを解離した前記複数の第１の鋳型分子にハイブリダイズさせる前に、解離した前記複数の第１の鋳型分子を配列決定チップ上に固定化すること、
をさらに備える、請求項１に記載の方法。
をさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記複数の第１の捕捉プライマーを前記複数の第１の標的核酸分子にハイブリダイズさせる前に、前記複数の第１の捕捉プライマーを配列決定チップ上に固定化すること、
をさらに備える、請求項１に記載の方法。
をさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記複数の第１の鋳型分子は、第１の末端及び第２の末端を含み、前記第１の末端は、前記第１の捕捉プライマーを含み、前記第２の末端は、前記複数の第１のシーケンスプライマーによってハイブリダイズされる、
請求項１に記載の方法。
請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記第１のコンセンサス配列中の各ヌクレオチドのエラーモード分布を算出して、前記複数の第１の標的核酸分子が変異を有するかどうかを判定すること、
をさらに備える、請求項１に記載の方法。
をさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記変異は、ヌクレオチド挿入、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド置換、遺伝子組換え及び／又はメチル化部位を含む、
請求項１２に記載の方法。
請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記所定の閾値は、８０％よりも大きい、
請求項１に記載の方法。
請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記サンプルは、複数の第２の標的核酸分子をさらに含み、
前記方法はさらに、
複数の第２の捕捉プライマーを前記複数の第２の標的核酸分子にハイブリダイズさせて、複数の第２の捕捉プライマー-第２の標的核酸分子複合体を形成することと、
新生鎖合成反応を実行して、複数の第２の鋳型分子‐第２の標的核酸分子複合体を形成することと、
複数の第２の鋳型分子を解離させることと、
複数の第２のシーケンスプライマーを解離した前記複数の第２の鋳型分子にハイブリダイズさせて、単一分子配列決定によって前記複数の第２の鋳型分子を配列決定して、複数の第２の生配列を取得することと、
複数の第２の生配列と第２の標的配列とを比較して、各前記複数の第２の生配列の第２の配列類似度を算出することと、
第２の配列類似度が所定の閾値に達する複数の第２の生配列を収集して第２のクラスタを取得することと、
前記第２のクラスタをバイオインフォマティクスによって分析して、第２のコンセンサス配列を取得することと、
を含む、請求項１に記載の方法。
前記方法はさらに、
複数の第２の捕捉プライマーを前記複数の第２の標的核酸分子にハイブリダイズさせて、複数の第２の捕捉プライマー-第２の標的核酸分子複合体を形成することと、
新生鎖合成反応を実行して、複数の第２の鋳型分子‐第２の標的核酸分子複合体を形成することと、
複数の第２の鋳型分子を解離させることと、
複数の第２のシーケンスプライマーを解離した前記複数の第２の鋳型分子にハイブリダイズさせて、単一分子配列決定によって前記複数の第２の鋳型分子を配列決定して、複数の第２の生配列を取得することと、
複数の第２の生配列と第２の標的配列とを比較して、各前記複数の第２の生配列の第２の配列類似度を算出することと、
第２の配列類似度が所定の閾値に達する複数の第２の生配列を収集して第２のクラスタを取得することと、
前記第２のクラスタをバイオインフォマティクスによって分析して、第２のコンセンサス配列を取得することと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
前記複数の第１の標的核酸分子と前記複数の第２の標的核酸分子を同時に検出すること、
をさらに備える、請求項１５に記載の方法。
をさらに備える、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記方法は、前記クラスタ内の前記複数の第１の生配列の数をカウントし、前記複数の第１の標的核酸分子のコピー数及び発現量を決定する、
請求項１に記載の方法。
請求項１に記載の方法。
【請求項18】
請求項１に記載の方法を使用して、サンプル中の複数の第１の標的核酸分子及び複数の第２の標的核酸分子を同時に検出し、
複数の第１の捕捉プライマー及び複数の第２の捕捉プライマーの混合物、複数の第１のシーケンスプライマー及び複数の第２のシーケンスプライマーの混合物、新生鎖合成反応を実行するための第１の試薬、配列決定チップ及び単一分子配列決定用の第２の試薬を含む、
核酸分子の検出用のキット。
複数の第１の捕捉プライマー及び複数の第２の捕捉プライマーの混合物、複数の第１のシーケンスプライマー及び複数の第２のシーケンスプライマーの混合物、新生鎖合成反応を実行するための第１の試薬、配列決定チップ及び単一分子配列決定用の第２の試薬を含む、
核酸分子の検出用のキット。
【請求項19】
前記捕捉プライマー及び前記シーケンスプライマーは事前に提供されず、代わりに、検出すべき前記複数の第１の標的核酸分子が確認された後、必要な複数の捕捉プライマー及び必要な複数のシーケンスプライマーがキットに追加される、
請求項１８に記載のキット。
請求項１８に記載のキット。
【請求項20】
請求項１に記載の方法を使用して、サンプル中の複数の第１の標的核酸分子及び複数の第２の標的核酸分子を同時に検出し、
検出中に前記サンプルを添加する第１のチャンバと、複数の第１の捕捉プライマー及び複数の第２の捕捉プライマーの混合物と配列決定チップを含む第２のチャンバと、複数の第１のシーケンスプライマー及び複数の第２のシーケンスプライマーの混合物を含む第３のチャンバと、新生鎖合成反応を実行するための第１の試薬を含む第４のチャンバと、単一分子配列決定用の第２の試薬を含む第５のチャンバと、を含み、前記複数の第１の捕捉プライマー及び前記複数の第２の捕捉プライマーは、前記配列決定チップ上に固定化される、
核酸分子の検出用のカートリッジ。
検出中に前記サンプルを添加する第１のチャンバと、複数の第１の捕捉プライマー及び複数の第２の捕捉プライマーの混合物と配列決定チップを含む第２のチャンバと、複数の第１のシーケンスプライマー及び複数の第２のシーケンスプライマーの混合物を含む第３のチャンバと、新生鎖合成反応を実行するための第１の試薬を含む第４のチャンバと、単一分子配列決定用の第２の試薬を含む第５のチャンバと、を含み、前記複数の第１の捕捉プライマー及び前記複数の第２の捕捉プライマーは、前記配列決定チップ上に固定化される、
核酸分子の検出用のカートリッジ。
【請求項21】
前記捕捉プライマー及び前記シーケンスプライマーは事前に提供されず、代わりに、検出すべき前記複数の第１の標的核酸分子が確認された後、必要な複数の捕捉プライマー及び必要な複数のシーケンスプライマーが前記チャンバに追加される、
請求項２０に記載のカートリッジ。
請求項２０に記載のカートリッジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
配列表の参照
本願は、提出済みの配列表を含む。XMLファイルで電子的に保存され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２４年３月１日に作成された前記ＸＭＬコピーは、１３１８８０－ＵＳ－配列リストと名付けられ、サイズは６，１８９バイトである。
本願は、提出済みの配列表を含む。XMLファイルで電子的に保存され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２４年３月１日に作成された前記ＸＭＬコピーは、１３１８８０－ＵＳ－配列リストと名付けられ、サイズは６，１８９バイトである。
【0002】
本発明は、検出方法、検出キット及び検出カートリッジに関し、特に、核酸分子を検出するための方法、検出キット及び検出カートリッジに関する。
【背景技術】
【0003】
連続的単一分子配列決定技術（ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、核酸増幅工程を必要とせずに、生の核酸分子の配列を直接読み取ることができる。単一分子配列決定のシークエンス速度は、１秒あたり５塩基に達し、単一塩基の読み取りに通常２分以上かかる次世代シークエンス（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＮＧＳ）よりも大幅に高速であるが、生のシークエンシングリードの読取精度は依然として課題であり、８５％に達しているにすぎない。このレベルの精度では、多くの応用、特に医療診断やヘルスケアの分野では不十分である。
【0004】
シークエンスの精度を向上させる取り組みには、上流と下流の両方の手順の開発が含まれる。よく知られている方法の１つは、シーケンス用の環状鋳型の構築であり、これにより鋳型の繰り返しの読み取りおよび生のシークエンシングリード（ｒａｗ ｒｅａｄｓ）とのアライメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を可能にして、より正確なコンセンサス結果を生成する。この環状鋳型法は、応用の要件を満たすためにシーケンスの精度を効果的に向上させることができるが、その複雑な操作手順と長い操作時間により、その適用性が制限される。単一分子シークエンシングの精度要件を満たし、その適用範囲を拡大するための、シンプルかつ迅速なプロトコルを開発することが急務となっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、検出ステップを簡素化し、検出時間を短縮し、検出精度を向上させながら、豊富な情報を提供することのできる、核酸分子を検出するための方法、キット及びカートリッジを提供する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、核酸分子を検出するための方法を提供する。本方法は、以下のステップを含む。第１の標的核酸分子を含むサンプルを提供するステップと、第１の捕捉プライマーを第１の標的核酸分子にハイブリダイズさせて、第１の捕捉プライマー-第１の標的核酸分子複合体を形成することと、新生鎖合成反応を実行して、第１の鋳型分子‐第１の標的核酸分子複合体を形成することと、第１の鋳型分子を解離することと、第１のシーケンスプライマーを解離した第１の鋳型分子にハイブリダイズさせて、単一分子配列決定によって第１の鋳型分子を配列決定して、第１の生配列（生のリード配列）を取得することと、第１の生配列と第１の標的配列を比較して、各第１の生配列の第１の配列類似度を算出することと、第１の配列類似度が所定の閾値に達する第１の生配列を収集して、第１のクラスタを取得することと、第１のクラスタをバイオインフォマティクスによって分析して、第１のコンセンサス配列を取得することと、を含む。複数の第１の捕捉プライマーはリンカーを有し、リンカーは、配列決定チップ上で別のリンカーとペアリングされる。
【0007】
本発明の一実施形態において、サンプルは、未精製又は粗精製であり、複数の非標的核酸分子をさらに含み、複数の非標的核酸分子は、複数の第１の捕捉プライマー又は複数の第１のシーケンスプライマーによってハイブリダイズしない。
【0008】
本発明の一実施形態において、複数の第１の標的核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅されない。
【0009】
本発明の一実施形態において、複数の第１の標的核酸分子は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｍｉｎｉＲＮＡを含む。
【0010】
本発明の一実施形態において、ペアリング方法は、ビオチン－ストレプトアビジン結合、核酸ハイブリダイゼーション又は化学結合を含む。
【0011】
本発明の一実施形態において、複数の第１の鋳型分子は、一本鎖の直鎖核酸である。
【0012】
本発明の一実施形態において、複数の第１の鋳型分子は、２５から１０，０００のヌクレオチドを有する。
【0013】
本発明の一実施形態において、本方法はさらに、複数の第１の鋳型分子‐第１の標的核酸分子複合体を形成した後、洗浄プロセス及び精製プロセスを実行することを含む。
【0014】
本発明の一実施形態において、本方法はさらに、複数の第１の鋳型分子を解離させた後、複数の第１のシーケンスプライマーを解離した複数の第１の鋳型分子にハイブリダイズさせる前に、解離した複数の第１の鋳型分子を配列決定チップ上に固定化することを含む。
【0015】
本発明の一実施形態において、本方法はさらに、複数の第１の捕捉プライマーを複数の第１の標的核酸分子にハイブリダイズさせる前に、複数の第１の捕捉プライマーを配列決定チップ上に固定化することを含む。
【0016】
本発明の一実施形態において、複数の第１の鋳型分子は、第１の末端及び第２の末端を含み、第１の末端は、第１の捕捉プライマーを含み、第２の末端は、複数の第１のシーケンスプライマーによってハイブリダイズされる。
【0017】
本発明の一実施形態において、本方法はさらに、第１のコンセンサス配列中の各ヌクレオチドのエラーモード分布を算出して、複数の第１の標的核酸分子が変異を有するかどうかを判定することを含む。
【0018】
本発明の一実施形態において、変異は、ヌクレオチド挿入、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド置換、遺伝子組換え及び／又はメチル化部位を含む。
【0019】
本発明の一実施形態において、所定の閾値は、８０％よりも大きい。
【0020】
本発明の一実施形態において、サンプルはさらに、複数の第２の標的核酸分子を含み、本方法はさらに、複数の第２の捕捉プライマーを複数の第２の標的核酸分子にハイブリダイズさせて、複数の第２の捕捉プライマー-第２の標的核酸分子複合体を形成することと、新生鎖合成反応を実行して、複数の第２の鋳型分子‐第２の標的核酸分子複合体を形成することと、複数の第２の鋳型分子を解離させることと、複数の第２のシーケンスプライマーを解離した複数の第２の鋳型分子にハイブリダイズさせて、単一分子配列決定によって複数の第２の鋳型分子を配列決定して、複数の第２の生配列を取得することと、複数の第２の生配列と第２の標的配列とを比較して、各複数の第２の生配列の第２の配列類似度を算出することと、第２の配列類似度が所定の閾値に達する複数の第２の生配列を収集して、第２のクラスタを取得することと、第２のクラスタをバイオインフォマティクスによって分析して、第２のコンセンサス配列を取得することと、を含む。
【0021】
本発明の一実施形態において、本方法はさらに、複数の第１の標的核酸分子と複数の第２の標的核酸分子を同時に検出することを含む。
【0022】
本発明の一実施形態において、クラスタ内の複数の第１の生配列の数をカウントし、複数の第１の標的核酸分子のコピー数及び発現量を決定する。
【0023】
本発明は、核酸分子を検出するためのキットを提供する。キットは、前述の方法を使用して、サンプル中の複数の第１の標的核酸分子及び複数の第２の標的核酸分子を同時に検出する。キットは、複数の第１の捕捉プライマー及び複数の第２の捕捉プライマーの混合物、複数の第１のシーケンスプライマー及び複数の第２のシーケンスプライマーの混合物、新生鎖合成反応を実行するための第１の試薬、配列決定チップ及び単一分子配列決定用の第２の試薬を含む。
【0024】
上述のキットにおいて、捕捉プライマーの混合物とシーケンスプライマーの混合物は、ユーザによって提供されても良い。
【0025】
本発明の一実施形態において、捕捉プライマー及びシーケンスプライマーは事前に提供されず、代わりに、検出すべき複数の第１の標的核酸分子が確認された後、必要な複数の捕捉プライマー及び必要な複数のシーケンスプライマーがキットに追加される。
【0026】
本発明は、核酸分子を検出するためのカートリッジを提供する。カートリッジは、前述の方法を使用して、サンプル内の複数の第１の標的核酸分子及び複数の第２の標的核酸分子を同時に検出する。カートリッジは、検出中にサンプルを添加する第１のチャンバと、複数の第１の捕捉プライマー及び複数の第２の捕捉プライマーの混合物と配列決定チップを含む第２のチャンバと、複数の第１のシーケンスプライマー及び複数の第２のシーケンスプライマーの混合物を含む第３のチャンバと、新生鎖合成反応を実行するための第１の試薬を含む第４のチャンバと、単一分子配列決定用の第２の試薬を含む第５のチャンバと、を含む。複数の第１の捕捉プライマー及び複数の第２の捕捉プライマーは、配列決定チップ上に固定化される。
【0027】
前述のカートリッジにおいて、捕捉プライマーの混合物及びシーケンスプライマーの混合物は、ユーザによって提供されても良い。
【0028】
本発明の一実施形態において、捕捉プライマー及びシーケンスプライマーは事前に提供されず、代わりに、検出される複数の第１の標的核酸分子が確認された後、必要な複数の捕捉プライマー及び必要な複数のシーケンスプライマーがカートリッジのチャンバに追加される。
【発明の効果】
【0029】
以上を踏まえ、本発明の一実施形態に係る核酸分子を検出するための方法、キット及びカートリッジでは、特定の一連のステップを使用することで、検出ステップが簡素化され、検出時間が短縮され、検出精度が向上する。特定の一連のステップは、少なくとも、まず、捕捉プライマーを未精製又は粗精製サンプル中の標的核酸分子にハイブリダイズさせて、次に、新生鎖合成反応によって鋳型分子を取得し、次に、シーケンスプライマーを鋳型分子にハイブリダイズさせて、次に、単一分子配列決定により鋳型分子の生配列（ｏｒｉｇｉｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を取得し、次に、配列類似度が所定の閾値に達した生配列を分析して、コンセンサス配列を取得することを含む。本実施形態において、特定の一連のステップは、簡易な調製方法とバイオインフォマティクスを組み合わせたものである。簡易な調製方法では、単一分子シークエンシング中に標的核酸断片を読み取り、サンプル中の複数のゲノムにわたる核酸断片を読み取る。バイオインフォマティクスでは、個別に読み取られた各核酸断片から得られた低精度の生配列を組み立てて、応用要件を満たす高精度の結果を生成する。
【0030】
前述の内容をより理解しやすくするために、図面を参照していくつかの実施形態を以下に詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0031】
添付の図面は、本開示のさらなる理解を提供するために含まれており、本明細書に組み込まれ、その一部を構成する。図面は、本開示の例示的な実施形態を示し、説明とともに、本開示の原理を説明するのに役立つ。
【図1】本発明の一実施形態に係る核酸分子の検出方法のフローチャートである。
【図2A】本発明の一実施形態に係る核酸分子の検出方法の概略図である。
【図2B】本発明の一実施形態に係る核酸分子の検出方法の概略図である。
【図2C】本発明の一実施形態に係る核酸分子の検出方法の概略図である。
【図2D】本発明の一実施形態に係る核酸分子の検出方法の概略図である。
【図2E】本発明の一実施形態に係る核酸分子の検出方法の概略図である。
【図2F】本発明の一実施形態に係る核酸分子の検出方法の概略図である。
【図2G】本発明の一実施形態に係る核酸分子の検出方法の概略図である。
【図2H】本発明の一実施形態に係る核酸分子の検出方法の概略図である。
【図2I】本発明の一実施形態に係る核酸分子の検出方法の概略図である。
【図3】本発明の別の実施形態に係る核酸分子の検出方法の概略図である。
【図4A】配列類似度が所定の閾値に達する生配列を使用してコンセンサス配列を生成した結果を示す。
【図4B】コンセンサス配列と参照配列とを比較した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0032】
図１は、本発明の一実施形態に係る核酸分子の検出方法のフローチャートである。図２Ａから図２Ｉ は、本発明の一実施形態に係る核酸分子の検出方法の概略図である。本実施形態における核酸分子の検出方法は、以下のステップを含んで良い。
【0033】
まず、まず、図１及び図２Ａを同時に参照すると、ステップＳ１において、サンプルＳが提供される。本実施形態において、サンプルＳは、血液、細胞株、組織、微生物（ウイルス、細菌など）等の生体物質に由来するものであって良いが、本発明はこれに限定されるものではない。サンプルＳは、生体材料から抽出された未精製抽出物、生体材料から抽出され粗精製された粗精製抽出物、又は生体材料から抽出され精製された精製核酸分子であって良いが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0034】
本実施形態において、サンプルＳは、複数の第１の標的核酸分子１１０及び複数の非標的核酸分子１２０を含んで良い。第１の標的核酸分子１１０は、後続の検出ステップで使用される第１の捕捉プライマー及び第１のシーケンスプライマーによってハイブリダイズされて良く、第１の標的配列と高い配列類似度を有し得る核酸分子として定義することができる。非標的核酸分子１２０は、第１の捕捉プライマー及び後続の検出ステップで使用される第１のシーケンスプライマーによってハイブリダイズされず、第１の標的配列と低い配列類似度を有し得る核酸分子として定義することができる。第１の標的配列は、既知の配列であって良く、第１の標的配列は、例えば、データベース（ＧｅｎＢａｎｋ又はＧｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅなど）内の参照配列（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であって良いが、本発明はこれに限定されるものではない。本実施形態において、本実施形態において、第１の標的核酸分子１１０はＤＮＡであって良く、非標的核酸分子１２０もＤＮＡであって良いが、本発明はこれに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、第１の標的核酸分子は、さまざまな種類のＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｍｉｎｉＲＮＡなど）又は他の種類のＤＮＡ（メチル化修飾を有するＤＮＡなど）であっても良い。いくつかの実施形態において、非標的核酸分子は、さまざまな種類のＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｍｉｎｉＲＮＡなど）又は他の形態のＤＮＡ（メチル化修飾を有するＤＮＡなど）であっても良い。
【0035】
ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）によって増幅された核酸分子を検出に使用する一般的な検出方法と比較して、本実施形態で使用される第１の標的核酸分子１１０は、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅されていない生の核酸分子であり、これにより検出された第１の標的核酸分子の配列が増幅によって歪むことが防止される。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅された核酸分子の配列は、通常、一定の確率でエラー（突然変異など）が発生し、そのエラー（突然変異）も連続的なポリメラーゼ連鎖反応によって増幅され、その結果、増幅された核酸分子の配列が歪む可能性がある。さらに、ポリメラーゼ連鎖反応を実行する場合、プライマーの特異性が低いために、非標的核酸分子が誤って増幅され、増幅された核酸分子の配列が歪む可能性がある。
【0036】
次に、図１及び図２Ｂを同時に参照すると、ステップＳ２において、第１の捕捉プライマー１３０は、第１の標的核酸分子１１０にハイブリダイズされて、第１の捕捉プライマー-第１の標的核酸分子複合体Ｃ１を形成する。本実施形態において、第１の捕捉プライマー１３０は、第１の標的核酸分子１１０と相補的な核酸配列を有するため、第１の捕捉プライマー１３０は、第１の標的核酸分子１１０にアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）されて、第１の捕捉プライマー－第１の標的核酸分子複合体Ｃ１を形成することができる。第１の捕捉プライマー１３０は、例えば、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）であって良いが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0037】
本実施形態において、第１の捕捉プライマー１３０は、リンカー１３２を有する。リンカー１３２は、後続のステップで配列決定チップ２００の他のリンカー２１０とペアリングするために使用されて良く、これにより、図2Fに示すように、リンカー１３２を他のリンカー２１０とペアリングすることによって、第１の捕捉プライマー１３０を配列決定チップ２００上に固定化することができる。
【0038】
次に、図１及び図２Ｃを同時に参照すると、ステップＳ３では、新生鎖合成反応（ｎａｓｃｅｎｔ ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を実行して、第１の鋳型分子‐第１の標的核酸分子複合体Ｃ２を形成する。具体的には、第１の捕捉プライマー-第１の標的核酸分子複合体Ｃ１が形成された後、第１の標的核酸分子１１０の核酸配列を鋳型として使用し、ポリメラーゼＰ１を使用して、適切なデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｄＮＴＰ）Ｎ１を第１の捕捉プライマー-第１の標的核酸分子複合体Ｃ１の第１の捕捉プライマー１３０の３’末端に順次接続し、新生鎖（つまり、第１の鋳型分子１４０）を含む第１の鋳型分子‐第１の標的核酸分子複合体Ｃ２を形成する。
【0039】
いくつかの実施形態において、第１の標的核酸分子が各種ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｍｉｎｉＲＮＡなど）の場合、ステップＳ３では、ポリメラーゼＰ１の代わりに逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を使用して、新生鎖合成反応を実行する。逆転写酵素は、例えば、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴａｓｅであって良いが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0040】
次に、図１及び図２Ｄを同時に参照すると、第１の鋳型分子‐第１の標的核酸分子複合体Ｃ２を形成した後、洗浄プロセス及び精製プロセスが実行される。洗浄プロセスは、不純物（非標的核酸分子１２０、未反応の第１の捕捉プライマー１３０、ポリメラーゼＰ１、未反応のデオキシリボヌクレオシド三リン酸Ｎ１など）を除去するために用いることができ、精製プロセスは、第１の鋳型分子１４０の濃度を増加させるために使用することができ、それにより不純物によって引き起こされる干渉が低減され、後続の配列決定チップ上での第１の鋳型分子の固定化の効率を改善し、シークエンシングの効率を改善することができる。
【0041】
次に、図１及び図２Ｅを同時に参照すると、ステップＳ４において、第１の鋳型分子１４０が解離される。具体的には、第１の鋳型分子‐第１の標的核酸分子複合体Ｃ２が形成された後、加熱などの変性条件（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を使用して、第１の鋳型分子‐第１の標的核酸分子複合体Ｃ２中の第１の鋳型分子１４０を解離させ、解離した第１の鋳型分子１４０中のリンカー１３２を露出させる。本実施形態において、第１の鋳型分子１４０は、一本鎖の直鎖状の核酸であって良い。第１の鋳型分子１４０は、例えば、２５～１０，０００のヌクレオチドを有するが、本発明はこれに限定されるものではない。第１の鋳型分子１４０は、互いに対向する第１の末端１４１及び第２の末端１４２を含む。第１の末端１４１は、第１の捕捉プライマー１３０を含み、第２の末端１４２は、後続のステップで第１のシーケンスプライマー１５０によってハイブリダイズするために使用される。
【0042】
配列決定のために環状鋳型（環状核酸など）の準備に複雑なステップを必要とする一般的な検出方法と比較して、本実施形態において配列決定に使用される第１の鋳型分子１４０は一本鎖の直鎖状の核酸であるため、検出ステップが簡略化され、検出時間が短縮される。
【0043】
配列決定のために短い断片（例えば、１０００ヌクレオチド未満）を有する鋳型分子を使用し、標的配列を組み換えるためにより多くの配列決定結果を提供する必要がある一般的な検出方法と比較して、本実施形態において配列決定に使用される第１の鋳型分子１４０は、最大１０，０００ヌクレオチドの長い断片であるため、標的配列の数十倍のサイズの配列決定結果を提供することなく標的配列を組み換えることができ、それにより検出ステップが簡略化され、検出時間が短縮される。
【0044】
次に、図１及び図２Ｆを同時に参照すると、ステップＳ５において、解離した第１の鋳型分子１４０は、配列決定チップ２００上に固定化される。具体的には、第１の鋳型分子１４０は、第１の鋳型分子１４０のリンカー１３２と配列決定チップ２００の他のリンカー２１０とのペアリングによって、配列決定チップ２００上に固定化される。本実施形態において、リンカー１３２は、例えばビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）であって良く、他のリンカー２１０は、例えばストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）であって良い。リンカー１３２は、ビオチン－ストレプトアビジン結合（ｂｉｏｔｉｎ－ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）によって他のリンカー２１０とペアリングすることができるが、本発明はこれに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、リンカーと他のリンカーはそれぞれビオチンとストレプトアビジンではなく、ペアリング方法は核酸ハイブリダイゼーション（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）又は化学結合（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｏｎｄｉｎｇ）であっても良い。
【0045】
本実施形態において、第１の捕捉プライマー１３０を含む第１の鋳型分子１４０は、第１の鋳型分子１４０が解離した後、かつ、第１のシーケンスプライマー１５０が解離した第１の鋳型分子１４０にハイブリダイズされる前に、配列決定チップ２００上に固定化されるが、本発明はこれに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、第１の捕捉プライマーは、第１の捕捉プライマーが第１の標的核酸分子にハイブリダイズされる前に配列決定チップ上に固定化されても良い。
【0046】
次に、図１及び図２Ｇを同時に参照すると、ステップＳ６において、第１のシーケンスプライマー１５０は、解離した第１の鋳型分子１４０にハイブリダイズされる。本実施形態において、解離した第１の鋳型分子１４０が配列決定チップ２００上に固定化された後、任意で、別の洗浄プロセスを実行して、配列決定チップ２００上に固定化されていない第１の鋳型分子１４０を除去し、その後、第１のシーケンスプライマー１５０を添加しても良い。本実施形態において、第１のシーケンスプライマー１５０は、第１の鋳型分子１４０と相補的な核酸配列を有するので、第１のシーケンスプライマー１５０は、第１の鋳型分子１４０にアニーリングされて、第１のシーケンスプライマー-第１の鋳型分子複合体Ｃ３を形成することができる。第１のシーケンスプライマー１５０は、例えば、オリゴヌクレオチドであって良いが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0047】
次に、図１及び図２Ｈを同時に参照すると、ステップＳ６において、単一分子配列決定（ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって第１の鋳型分子１４０を配列決定して、第１の生配列を取得する。具体的には、第１のシーケンスプライマー-第１の鋳型分子複合体Ｃ３が形成された後、第１の鋳型分子１４０の核酸配列を鋳型として使用し、及びポリメラーゼＰ２を使用して、適切な蛍光標識ヌクレオチド類似体（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ｌａｂｅｌｌｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇ）Ｎ２を第１のシーケンスプライマー-第１の鋳型分子複合体Ｃ３の第１のシーケンスプライマー１５０の３’末端に順次接続し、図２Ｉに示すように、第１の鋳型分子１４０の核酸配列を配列決定し、第１の生配列１６０、１６１、１６２、１６３を取得することができる。
【0048】
次に、図１及び図２Ｉを同時に参照すると、ステップＳ７において、第１の生配列１６０、１６１、１６２、１６３は、第１の標的配列と比較されて、第１の生配列１６０、１６１、１６２、１６３の第１の配列類似度（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）が算出される。例えば、第１の生配列１６０の第１の配列類似度は約６５％であり、第１の生配列１６１の第１の配列類似度は約７０％であり、第１の生配列１６２の第１の配列類似度は約７９％であり、第１の生配列１６３の第１のシーケンス類似性は約８８％である。第１の生配列１６０（又は第１の生配列１６１、又は第１の生配列１６２、又は第１の生配列１６３）における各生配列は、同一であっても異なっていても良い。
【0049】
次に、図１及び図２Ｉを同時に参照すると、ステップＳ８において、第１の配列類似度が所定の閾値に達しない第１の生配列１６０、１６１、１６２は除外され、第１の配列類似度が所定の閾値に達する第１の生配列１６３が収集されて、第１のクラスタ１７０が取得される。本実施形態において、所定の閾値は、後続のステップで取得される第１のコンセンサス配列１８０の精度を向上させるために、例えば８０％より大きいが、本発明はこれに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、所定の閾値は、後続のステップで取得される第１のコンセンサス配列１８０の精度をさらに向上させるために、８０％、８５％、又は９５％より大きくても良い。いくつかの実施形態において、所定の閾値は、使用された単一分子配列決定法のエラー率に基づいて決定されて良い。例えば、単一分子配列決定法のエラー率が１５％（すなわち、精度８５％）である場合、所定の閾値は８０％（８５％－５％＝８０％）であって良い。
【0050】
次に、図１及び図２Ｉを同時に参照すると、ステップＳ９において、第１のクラスタ１７０は、高精度で第１のコンセンサス配列１８０を取得するために、バイオインフォマティクス（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）によって分析される。
【0051】
ハイブリダイゼーションプローブのみで核酸分子を同定するために誤判定が起こりやすい一般的な検出法と比べ、本実施形態は、単一分子配列決定及びバイオインフォマティクスを使用して、収集された第１の鋳型分子１４０の第１の生配列が第１の標的核酸分子に由来することを保証し、それにより誤判定の可能性を低減し、検出精度を向上させる。例えば、非標的核酸分子が第１の捕捉プライマー１３０によって誤って捕捉され、第１のシーケンスプライマー１５０によって誤ってハイブリダイズされ、シーケンスされて生配列が取得された場合、単一分子配列決定及びバイオインフォマティクスを使用することで、生配列が標的核酸分子ではなく非標的核酸分子に由来することが明確に分かり（つまり、非標的核酸分子に由来する生配列の配列類似度は８０％未満であることが分かる）、それにより非標的核酸分子に由来する生配列が除外される。
【0052】
次に、図１を参照すると、ステップＳ１０において、第１のコンセンサス配列１８０内の各ヌクレオチドのエラーモード分布（ｅｒｒｏｒ ｍｏｄｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を算出して、第１の標的核酸分子が変異（ｖａｒｉａｎｔ）又は突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）を有するかどうかを判定する。具体的には、第１のコンセンサス配列１８０の各ヌクレオチドが、第１のクラスタ１７０の各第１の生配列１６３の対応する各ヌクレオチドと同じであるか異なるかをアライメントして確認し、次に、第１のコンセンサス配列１８０中の各ヌクレオチドのエラーモード分布を算出する。
【0053】
配列決定のサンプル内で複数の種類の突然変異を含む標的核酸断片に遭遇した場合、コンセンサス配列を生成し、その配列情報を分析することで、特定の突然変異の種類とその頻度を検出して決定することができる。
【0054】
単一分子配列決定技術では、所定の確率でランダムなエラーが発生する。エラー確率はシステムに相関しており、各配列決定プラットフォームは、一貫したエラー確率の分布を生成する。
【0055】
以下、多型（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）の検出とそれぞれの比率の推定を示す包括的な例を提供する。
【0056】
単一分子配列決定プラットフォームの精度が９０％、各塩基読み取りのエラー率が１０％であると仮定する。エラーモードとその確率は次のように分類される。Ｎ（正確な読み取り）９０％、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３（塩基を他の３つの塩基のいずれかと誤って読み取る）それぞれ２％、Ｏ（塩基をスキップして読み取らない）４％である。これらのパーセンテージは、各エラーモードが発生する可能性を示す。
【0057】
１つのクラスタ内に１０００個の生配列リードが集まっていると仮定する。いかなる種類の特別変異も有さないサンプルの場合、読み取られる分子の１０２位の塩基が「Ａ」であると仮定する。したがって、クラスタ内の１０００個の生のリードのうち、１０２位の結果は、約９００回の「Ａ」、約２０回の「Ｔ」、約２０回の「Ｃ」、約２０回の「Ｇ」、及び約４０回の「Ｏ」（スキップされた塩基）を含み、これは、「Ａ」が１０００ ｘ ９０％ ＝ ９００の計算から求めることができる。したがって、１０２位の読み取り結果（エラーモード分布）は、約（Ａ ９００、Ｔ ２０、Ｃ ２０、Ｇ ２０、Ｏ ４０）となる。
【0058】
ここで、サンプルが１０２位に一塩基多型を示し、「Ａ」型が７５％、「Ｔ」型が２５％であると仮定する。捕捉プライマーがサンプル断片にランダムに、各多型について等しい確率でハイブリダイズすると仮定すると、結果として得られるクラスタ内の生のリードは、「Ａ」及び「Ｔ」多型を７５％対２５％の比率で反映する。
【0059】
その結果、クラスタ内の１０００個の生のリードのうち、約７５０個は「Ａ」多型に由来し、約２５０個は「Ｔ」に由来する。７５０個の「Ａ」型では、約（Ａ ６７５、Ｔ １５、Ｃ １５、Ｇ １５、Ｏ ３０）の結果が得られる。２５０個の「Ｔ」型では、約（Ａ ５、Ｔ ２２５、Ｃ ５、Ｇ ５、Ｏ １０）の結果が得られる。これらの結果の合計エラーモード分布（ｓｕｍｍａｔｉｏｎ ｅｒｒｏｒ ｍｏｄｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）は、約（Ａ ６８０、Ｔ ２４０、Ｃ ２０、Ｇ ２０、Ｏ ４０）である。
【0060】
この合計エラーモード分布分布結果を、多型が欠如している（約Ａ ９００、Ｔ ２０、Ｃ ２０、Ｇ ２０、Ｏ ４０）場合と比較すると、「Ａ」多型と「Ｔ」多型の両方がサンプル中に共存していることがはっきりと分かる。これらの多型タイプの推定比率は、「Ａ」の場合は約７３．９％（６８０／（６８０＋２４０））、「Ｔ」の場合は２６．１％（２４０／（６８０＋２４０））であり、想定される比率７５％対２５％とほぼ一致する。
【0061】
前述したように、エラーモードとその確率分布は、単一分子配列決定プラットフォームによって異なる可能性があることに注意することが重要である。ただし、前述の方法論は、なおもすべてのプラットフォームに適用することができる。
【0062】
多型検出の感度と精度は、クラスタ内で収集された生配列リードの量とともに増加する。例えば、１０００の生のリードのクラスタでは、５％という低いレベルで存在する多型を検出ですることができる。１０，０００個の生のリードのクラスタでは、多型検出の感度は約０．５％に増加する。
【0063】
本方法では、挿入、欠失、置換などのさまざまなタイプの多型を検出することができる。さらに、単一のアッセイで複数の多型位置を同定することができる。
【0064】
本方法を使用した配列決定の対象となる試験断片は、最初に捕捉プライマーによって補足された断片であり、配列の相補性を示す。続いて、これらの断片は、正常にシーケンスプライマーとハイブリダイズし、結果として得られる配列決定されたリードの参照配列に対する類似性は、所定の閾値を満たさなければならない。このプロセスにより、テストサンプル内で確実に標的を検出することができる。配列決定標的と参照配列間の配列の不一致は、多型の存在を示す。さらに、配列リードで検出された多型の比率は、テストサンプルに存在する多型の比率を正確に反映している。
【0065】
鋳型分子は、サンプル中の捕捉プライマーと相補的標的核酸分子間のハイブリダイゼーション後にのみ生成され、生配列は、鋳型分子を取得した後にのみ生成されるため、クラスタ内の生配列の数は、サンプル内の標的核酸分子の数に比例するはずである。検出される標的核酸分子がｍＲＮＡの場合、生配列の数は、遺伝子の発現量に比例するはずである。つまり、本実施形態の方法は、複数の遺伝子の数、濃度、発現量を同時に検出することができる。
【0066】
本方法を利用すると、試験サンプル内に存在する特定の遺伝子のコピー数を効果的に測定することができる。例えば、サンプルＡとサンプルＢはどちらも、同じサンプル量、手順、及び同じ単一分子配列条件を使用した方法により、同じ標的断片が検出される。サンプルＡがクラスタ内の１００個の適格な生配列のリードを収集し、サンプルＢが５００個の適格な生配列のリードを収集した場合、サンプルＢにはサンプルＡよりも多くの標的ＤＮＡ分子が含まれていると言える。
【0067】
さらに、遺伝子発現量は、ＲＮＡサンプルを配列決定材料として使用して取得することができる。例えば、サンプル中の遺伝子Ａと遺伝子Ｂの両方のＲＮＡが本方法で検査される。遺伝子Ａ収集されたクラスタは２０００個の適格な生配列を有し、遺伝子Ｂは３０個の適格な生配列を有する。次に、適格な生配列の数（この場合は２０００～３０）によって、遺伝子Ａと遺伝子Ｂの相対的な発現量を算出することができる。この方法により、単一分子配列決定技術の複雑で時間のかかるプロセスを簡素化し、迅速化することができ、それにより、生物学的プロセスと疾患メカニズムの理解と対処への適用範囲を拡大することができる。
【0068】
本実施形態における核酸分子の検出方法は、サンプル中に第１の標的核酸分子が存在するか否か、第１の標的核酸分子の数、第１の標的核酸分子に変異があるか否か、第１の標的核酸分子における変異の割合及び種類を検出することができるが、本発明はこれに限定されるものではない。例えば、第１のクラスタ内の第１の生配列の数を使用して、サンプル中の第１の標的核酸分子の数を推定することができる。
【0069】
いくつかの実施形態において、第１の標的核酸分子がメチル化修飾を有するＤＮＡである場合、第１の標的核酸分子の一部を直接配列決定することができ、第１の標的核酸分子の他の部分は、まず重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）によって変換され、その後配列決定することができる。いくつかの実施形態において、第１の標的核酸分子がメチル化修飾されたＤＮＡである場合、第１の標的核酸分子の一部と重亜硫酸塩により変換された第１の標的核酸分子の他の部分とをまず混合し、その後配列決定しても良い。
【0070】
いくつかの実施形態において、サンプルは、第１の標的核酸分子とは異なる核酸配列を有する複数の第２の標的核酸分子をさらに含んでも良く、本方法は、さらに以下のステップを含んで良い。複数の第２の捕捉プライマーを複数の第２の標的核酸分子にハイブリダイズさせて、複数の第２の捕捉プライマー-第２の標的核酸分子複合体を形成することと、新生鎖合成反応を実行して、複数の第２の鋳型分子‐第２の標的核酸分子複合体を形成することと、複数の第２の鋳型分子を解離させることと、複数の第２の鋳型分子を配列決定チップ上に固定化することと、複数の第２のシーケンスプライマーを解離した複数の第２の鋳型分子にハイブリダイズさせて、単一分子配列決定によって複数の第２の鋳型分子を配列決定して、複数の第２の生配列を取得することと、複数の第２の生配列と第２の標的配列とを比較して、各複数の第２の生配列の第２の配列類似度を算出することと、第２の配列類似度が所定の閾値に達する複数の第２の生配列を収集して第２のクラスタを取得することと、第２のクラスタをバイオインフォマティクスによって分析して、第２のコンセンサス配列を取得することと、を含む。つまり、いくつかの実施形態において、本方法は、サンプル中の第１の標的核酸分子と第２の標的核酸分子を同時に検出するために使用されて良い。いくつかの実施形態において、本方法は、同じサンプルから２つ以上の異なる標的核酸分子を同時に検出するために使用することもでき、これにより、本方法は多重検出（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）又は多重アッセイ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ａｓｓａｙ）の効果を有することができる。
【0071】
本実施形態における核酸分子検出用のキット（図示せず）は、上記方法を利用して、サンプルＳ中の複数の第１の標的核酸分子１１０及び複数の第２の標的核酸分子を同時に検出することができる。キットは、複数の第１の捕捉プライマー１３０と複数の第２の捕捉プライマーの混合物、複数の第１のシーケンスプライマー１５０と複数の第２のシーケンスプライマーの混合物、新生鎖合成反応の実行に用いられる第１の試薬（ポリメラーゼＰ１やデオキシリボヌクレオシド三リン酸Ｎ１など）、配列決定チップ２００、及び単一分子配列決定の実行に用いられる第２の試薬（ポリメラーゼＰ２や蛍光標識ヌクレオチド類似体Ｎ２など）を含んで良い。複数の第１の標的核酸分子１１０及び複数の第２の標的核酸分子は、それぞれ異なる核酸配列を有する。本実施形態における核酸分子検出用のキットは、複数のタイプの標的核酸分子（第１の標的核酸分子１１０や第２の標的核酸分子などであるが、本発明はこれに限定されるものではない）を同時に検出することができ、多重検出又は多重アッセイの効果を有する。
【0072】
本実施形態における核酸分子検出用のカートリッジ（図示せず）は、上記方法を利用して、サンプルＳ中の複数の第１の標的核酸分子１１０と複数の第２標的核酸分子を同時に検出することができる。カートリッジは、検出中にサンプルＳを添加するための第１のチャンバと、複数の第１の捕捉プライマー１３０及び複数の第２の捕捉プライマー及びの混合物と配列決定チップ２００を含む第２のチャンバと、複数の第１のシーケンスプライマー１５０と複数の第２のシーケンスプライマーの混合物を含む第３のチャンバと、新生鎖合成反応を実行するための第１の試薬（ポリメラーゼＰ１やデオキシリボヌクレオシド三リン酸Ｎ１など）を含む第４のチャンバと、単一分子配列決定を実行するための第２の試薬（ポリメラーゼＰ２や蛍光標識ヌクレオチド類似体Ｎ２など）を含む第５のチャンバと、を含み、複数の第１の捕捉プライマー１３０及び複数の第２の捕捉プライマーは、配列決定チップ２００上に固定化される。複数の第１の標的核酸分子１１０及び複数の第２の標的核酸分子は、それぞれ異なる核酸配列を有する。本実施形態における核酸分子検出用のカートリッジは、複数のタイプの標的核酸分子（ｓ第１の標的核酸分子１１０や第２の標的核酸分子などであるが、本発明はこれに限定されるものではない）を同時に検出することができ、多重検出又は多重アッセイの効果を有する。
【0073】
核酸分子の検出用のカートリッジに係るいくつかの実施形態において、複数の第１の捕捉プライマー及び複数の第１のシーケンスプライマーは、それぞれ第２のチャンバ及び第３のチャンバに事前に添加されなくても良い。代わりに、最初に検出すべき第１の標的核酸分子が確認された後、必要な複数の第１の捕捉プライマー及び必要な複数の第１のシーケンスプライマーは、検出中に第２のチャンバ及び第３のチャンバに添加されても良い（カスタマイズアッセイ）。
【0074】
他の実施形態が提供され、以下に説明される。なお、上記実施形態の符号及び説明の一部は、以下の実施形態にも適用される。なお、同一又は類似の構成要素には同一の符号を付し、同一の技術内容の説明は省略する。省略された内容の説明については、上記の実施形態を参照することができ、以下の実施形態では繰り返さない。
【0075】
図３は、本発明の別の実施形態に係る核酸分子の検出方法の概略図である。図３は、図２に続き、図２Ｃと置換されるステップである。同一の材料または方法を図３の実施形態および図２Ａから図２Ｉの実施形態の同一又は類似の構成要素に適用することができるので、以下では、２つの実施形態において同一又は類似の説明は省略し、２つの実施形態の相違点を中心に説明する。
【0076】
具体的には、図３を参照すると、図２Ｃと類似のステップに従い、新生鎖合成反応を実行して、第１の鋳型分子‐第１の標的核酸分子複合体Ｃ２ｂを形成する。ただし、本実施形態で使用する第１の標的核酸分子の量は検出に十分ではない可能性があるため、第１の鋳型分子‐第１の標的核酸分子複合体Ｃ２ｂを形成した後、線形増幅（ｌｉｎｅａｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を行うことにより、第１の鋳型分子の数を増やすことができ、検出感度を向上させることができる。
【0077】
本実施形態において、線形増幅では、非対称的ポリメラーゼ連鎖反応（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ＰＣＲ）を使用して、初期鎖合成反応のサイクルを複数回実行する。各サイクルは、以下のステップを含んで良い。まず、加熱により、第１の鋳型分子‐第１の標的核酸分子複合体Ｃ２ｂ中の第１の鋳型分子１４０と第１の標的核酸分子１１０ｂを解離し、次に、未反応の第１の捕捉プライマー１３０を解離した第１の標的核酸分子１１０ｂにアニーリングさせ、次に、ポリメラーゼＰ１とデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）Ｎ１を用いて、新生鎖合成反応を実行する。
【0078】
従来のポリメラーゼ連鎖反応（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ）により指数関数的に増幅される（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）鋳型分子を検出に用いる一般的な検出方法と比較して、本実施形態では、非対称的ポリメラーゼ連鎖反応により直線的に増幅される第１の鋳型分子を用いて直線的に増幅して検出し、それにより検出される第１の鋳型分子の配列が指数関数的増幅により歪むことが防止される。例えば、従来のポリメラーゼ連鎖反応によって指数関数的に増幅された鋳型分子の配列には、通常、一定の確率でエラー（突然変異など）が発生し、このエラー（突然変異）は、従来のポリメラーゼ連鎖反応の継続によって指数関数的に増幅され、その結果、指数関数的に増幅された鋳型分子の配列に歪みが生じる可能性がある。
【0079】
以下、上記実施形態における核酸分子の検出方法を実験例を挙げて詳細に説明する。ただし、以下の実験例は本発明を限定するものではない。
【0080】
［実験例１］ ウイルスの検出
【0081】
ウイルス ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ のＳ遺伝子（Ｓ ｇｅｎｅ）の突然変異により、懸念される複数の変異株（ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ ｃｏｎｃｅｒｎ，ＶＯＣ）が出現し、感染が継続する可能性がある。したがって、新しいウイルスの亜種を迅速に検出できる方法の開発が急務となっている。
【0082】
本実験例では、まず、ビオチンを含む捕捉プライマー（Ｂｉｏｔｉｎ－Ｓ－ＶＯＣ－Ｆ）及びシーケンスプライマー（Ｓ－ＶＯＣ－Ｒ）を設計した。ビオチンを含む捕捉プライマー（Ｂｉｏｔｉｎ－Ｓ－ＶＯＣ－Ｆ）の核酸配列は、5'-TTGGAACAGGAAGAGAATCAGC-3' (SEQ ID NO: 1)であり、シーケンスプライマー（Ｓ－ＶＯＣ－Ｒ）の核酸配列は、5'-TGACACCACCAAAAGAACATGG-3' (SEQ ID NO: 2)である。ビオチンを含む捕捉プライマー（Ｂｉｏｔｉｎ－Ｓ－ＶＯＣ－Ｆ）及びシーケンスプライマー（Ｓ－ＶＯＣ－Ｒ）を使用して、Ｓ遺伝子内のＳタンパク質のアミノ酸３６０位からアミノ酸５８８位をコードする核酸配列を検出することができる。Ｓタンパク質のアミノ酸３６０～５８８位は、Ｓタンパク質の最も重要な突然変異が発生する受容体結合ドメイン（ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ，ＲＢＤ）に位置している。
【0083】
次に、陽性の鼻咽頭ぬぐい液サンプル（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｓｗａｂ ｓａｍｐｌｅｓ）から採取したウイルスからＲＮＡを抽出した後、上記図１のフローチャート及び図２Ａから図２Ｉの概略図に従ってウイルス中のＲＮＡを検出することにより、ウイルスが既知のウイルス株であるか、新しいウイルス変異株であるかを迅速に識別する。
【0084】
［実験例２］ 細菌の検出
【0085】
敗血症の治療では、通常、適切な抗生物質を使用して病原菌を殺すことができるように、血液中の病原菌を特定する必要がある。現在、血液中の病原菌を同定する臨床手法は、主に細菌培養と分子診断（ＰＣＲなど）である。しかしながら、細菌の培養には時間がかかり（少なくとも２４時間から ７２時間）、一部の細菌は培養が容易ではない。ＰＣＲを用いた分子診断では、偽陽性結果（ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｕｌｔ）（予期せぬ核酸分子が増幅されるなど）や偽陰性結果（ｆａｌｓｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｓｕｌｔ）（プライマーがアニーリングするはずの核酸分子に変異が生じるなど）が生じることが良くある。
【0086】
本実験例では、まず、ビオチンを含む捕捉プライマー（１６Ｓ－Ｆ）及びシーケンスプライマー（１６Ｓ－Ｒ）を設計した。ビオチンを含む捕捉プライマー（１６Ｓ－Ｆ）の核酸配列は、5'-CAGACTCCTACGGGGAGGCAGCAGT-3' (SEQ ID NO: 3)であり、シーケンスプライマー（１６Ｓ－Ｒ）の核酸配列は、5'-ACTTAACCCAACATCTCACGACAC-3' (SEQ ID NO: 4)である。ビオチンを含む捕捉プライマー（１６Ｓ－Ｆ）及びシーケンスプライマー（１６Ｓ－Ｒ）を使用して、細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の保存領域（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）にある７６２ヌクレオチドを有する核酸分子を検出することができる。
【0087】
【0088】
［実験例３］ ヒト白血球抗原遺伝子の検出
【0089】
ヒト白血球抗原（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ，ＨＬＡ）遺伝子によってコードされる主要組織適合性複合体（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ，ＭＨＣ）は、免疫応答及び薬物過敏症反応の重要な調節因子である。近年、ヒト白血球抗原遺伝子の遺伝子型解析は、主要組織適合性複合体の抗原提示（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）と免疫認識（ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）を理解するために使用されており、これを利用して個別化免疫療法（ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）の開発を促進し、それにより患者の治療結果を改善することができる可能性がある。通常、染色体の対では、一方の染色体上のＨＬＡ遺伝子座の対立遺伝子型は、もう一方の染色体上のＨＬＡ遺伝子座の対立遺伝子型と異なり、２つの異なる対立遺伝子型間の配列の違いは４％未満である。ここで、各対立遺伝子タイプのＨＬＡ遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１などの複数の異なる遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）を含んで良い。
【0090】
本実験例では、まず、ＨＬＡ－Ａ 遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ： ＯＱ１０４６０９．１）の参照配列に基づいて、ビオチンを含む捕捉プライマー（ＨＬＡ－Ａ＿Ｆ－２６７）及びシーケンスプライマー（ＨＬＡ－Ａ＿Ｒ－５９２）を設計した。ビオチンを含む捕捉プライマー（ＨＬＡ－Ａ＿Ｆ－２６７）の核酸配列は、5'-CCACCGGGACTCAGATTCTC-3' (SEQ ID NO: 5)であり、シーケンスプライマー（ＨＬＡ－Ａ＿Ｒ－５９２）の核酸配列は、5'-TGTCGTCCACGTAGCCCAC-3' (SEQ ID NO: 6)である。ビオチンを含む捕捉プライマー（ＨＬＡ－Ａ＿Ｆ－２６７）及びシーケンスプライマー（ＨＬＡ－Ａ＿Ｒ－５９２）を使用して、一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）を有さないＨＬＡ－Ａ遺伝子の保存領域にある３２５位のヌクレオチドを有する核酸分子を検出するために使用することができる。
【0091】
次に、ゲノムＤＮＡを抽出した後、非対称的ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、鋳型分子の数を増幅した。具体的には、１μｇのゲノムＤＮＡ、０．５μＭの捕捉プライマー（ＨＬＡ－Ａ＿Ｆ－２６７）、及び０．００５μＭ増幅プライマーを用いて、５０μｌの反応溶液中で、非対称的ポリメラーゼ連鎖反応を実行した。非対称的非対称的的ポリメラーゼ連鎖反応のサイクル条件は、９８℃３０秒、（９８℃１０秒、６０℃１０秒、７２℃１０秒）を３５サイクル、７２℃６０秒とした。非対称的非対称的的ポリメラーゼ連鎖反応の反応時間は、約３３分から４２分である。
【0092】
次に、ポリメラーゼ連鎖反応を実行した後、スピンカラム（ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ）を使用して、未反応の捕捉プライマー（ＨＬＡ－Ａ＿Ｆ－２６７）を除去し、増幅された鋳型分子を精製した。
【0093】
次に、図１のフローチャート及び図２Ａから図２Ｉの概略図に従ってＨＬＡ－Ａ遺伝子を検出した。具体的には、本実験例における単一分子配列決定の実行方法は、以下のステップを含む。５０μｌの１０ｎＭストレプトアビジンをカバースリップ上に適用し、３０分間反応させて、ストレプトアビジンでコーティングされたカバースリップを取得した。次に、ストレプトアビジンでコーティングされたカバースリップを緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＯＡｃ、及び１ｍＭ ＤＴＴを含む）で３回洗浄する。次に、２０μｌの１００ｎＭ鋳型分子「ビオチン－ＨＬＡＡ－３２５」をストレプトアビジンでコーティングされたカバースリップ上に固定化する。次に、鋳型分子を固定化したカバースリップを加熱プレート上に置き、２０μｌの１００ｎＭシーケンスプライマー（ＨＬＡ－Ａ＿Ｒ－５９２）を添加して、カバースリップ上の鋳型分子とアニーリングした。５分間の反応後、ポリメラーゼ及び蛍光標識ヌクレオチド類似体を添加して、配列決定反応を開始する。次に、光学イメージングシステム（全反射蛍光顕微鏡（ｔｏｔａｌ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＴＩＲＦＭ）、レーザー、フィルター、及び画像レコーダーを含む）を使用して、配列決定反応における蛍光シグナルをリアルタイムで記録する。配列決定反応は約３０分である。
【0094】
本実験例において、コンセンサス配列を取得する方法は、以下のステップを含む。ベースコールアルゴリズム（ｂａｓｅ ｃａｌｌｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｓｍ）を使用して蛍光シグナルを分析し、蛍光シグナルを対応するヌクレオチドに変換して４２１９個の生配列を取得する。次に、ＢｉｏｅｄｉｔソフトウェアのＣｌｕｓｔａｌＷツールを使用して、４２１９個の生配列をＨＬＡ－Ａ参照配列と比較し、４２１９個の生配列の配列類似度を算出する。次に、４２１９個の生配列から、配列類似度が８２％を超え、配列長が８０％を超えるＨＬＡ－Ａ参照配列の２０個の生配列を収集し、クラスタを取得する。次に、クラスタ内の２０個の生配列をバイオインフォマティクスによって分析し、コンセンサス配列を取得する。図４Ａに示されるように、８２．０５％から８６．０６％の範囲の配列類似度を有する２０個の生配列をアラインメントさせて分析することによってコンセンサス配列を生成する。次に、図４Ｂに示されるように、コンセンサス配列をＨＬＡ－Ａ参照配列と比較し、コンセンサス配列の配列類似度又は精度を算出する。結果は、コンセンサス配列の配列類似度又は精度が約９９．５％まで改善され得ることを示す。
【0095】
まとめると、本方法において、本発明の核酸分子検出用キット及びカートリッジでは、特定の一連のステップを使用することで、検出ステップが簡素化され、検出時間が短縮され、検出精度が向上する。特定の一連のステップは、少なくとも次のステップを含む。まず、捕捉プライマーを未精製又は粗精製サンプル中の標的核酸分子にハイブリダイズさせて、次に、新生鎖合成反応によって鋳型分子を取得し、次に、シーケンスプライマーを鋳型分子にハイブリダイズさせて、次に、単一分子配列決定により鋳型分子の生配列を取得し、次に、配列類似度が所定の閾値に達した生配列を分析して、コンセンサス配列を取得することを含む。本実施形態において、特定の一連のステップは、簡易な調製方法とバイオインフォマティクスを組み合わせたものである。簡易な調製方法では、単一分子シークエンシング中に標的核酸断片を読み取り、サンプル中の複数のゲノムにわたる核酸断片を読み取る。バイオインフォマティクスでは、個別に読み取られた各核酸断片から得られた低精度の生配列を組み立てて、ｉ応用要件を満たす高精度の結果を生成する。
【0096】
本開示の範囲又は精神から逸脱することなく、開示された実施形態に対してさまざまな修正及び変形を行うことができることは、当業者には明らかである。上記を考慮して、本開示は、特許請求の範囲及びその均等物の範囲内にある限り、修正及び変形を包含することが意図されている。
【産業上の利用可能性】
【0097】
本発明の核酸分子の検出方法、キット及びカートリッジは、検出ステップの簡略化、検出時間の短縮、検出精度の向上に適用することができる。
【符号の説明】
【0098】
１１０、１１０ｂ： 第１の標的核酸分子
１２０： 非標的核酸分子
１３０： 第１の捕捉プライマー
１３２、２１０： リンカー
１４０： 第１の鋳型分子
１４１： 第１の末端
１４２： 第２の末端
１５０： 第１のシーケンスプライマー
１６０、１６１、１６２、１６３： 第１の生配列
１７０： 第１のクラスタ
１８０： 第１のコンセンサス配列
２００：配列決定チップ
Ｃ１： 第１の捕捉プライマー-第１の標的核酸分子複合体
Ｃ２、Ｃ２ｂ： 第１の鋳型分子‐第１の標的核酸分子複合体
Ｃ３： 第１のシーケンスプライマー-第１の鋳型分子複合体
Ｎ１： デオキシリボヌクレオシド三リン酸
Ｎ２： 蛍光標識ヌクレオチド類似体
Ｐ１、Ｐ２： ポリメラーゼ
Ｓ： サンプル
Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８、Ｓ９、Ｓ１０： ステップ
１２０： 非標的核酸分子
１３０： 第１の捕捉プライマー
１３２、２１０： リンカー
１４０： 第１の鋳型分子
１４１： 第１の末端
１４２： 第２の末端
１５０： 第１のシーケンスプライマー
１６０、１６１、１６２、１６３： 第１の生配列
１７０： 第１のクラスタ
１８０： 第１のコンセンサス配列
２００：配列決定チップ
Ｃ１： 第１の捕捉プライマー-第１の標的核酸分子複合体
Ｃ２、Ｃ２ｂ： 第１の鋳型分子‐第１の標的核酸分子複合体
Ｃ３： 第１のシーケンスプライマー-第１の鋳型分子複合体
Ｎ１： デオキシリボヌクレオシド三リン酸
Ｎ２： 蛍光標識ヌクレオチド類似体
Ｐ１、Ｐ２： ポリメラーゼ
Ｓ： サンプル
Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８、Ｓ９、Ｓ１０： ステップ
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図2H】
【図2I】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【配列表】
【外国語明細書】