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特開2024-12462ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１を使用する誘導性で調整可能な多重ヒト遺伝子制御
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024012462
(43)【公開日】2024-01-30
(54)【発明の名称】ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１を使用する誘導性で調整可能な多重ヒト遺伝子制御
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20240123BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240123BHJP
C07K 14/195 20060101ALI20240123BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20240123BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240123BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240123BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240123BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240123BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20240123BHJP
C12N 15/38 20060101ALI20240123BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240123BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240123BHJP
C07K 14/03 20060101ALI20240123BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K19/00 ZNA
C07K14/195
C07K14/47
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/31
C12N15/38
C12N15/12
C12N15/09 Z
C07K14/03
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023187484
(22)【出願日】2023-11-01
(62)【分割の表示】P 2019556605の分割
【原出願日】2018-04-23
(31)【優先権主張番号】62/488,585
(32)【優先日】2017-04-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】592017633
【氏名又は名称】ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(72)【発明者】
【氏名】タク，ユ ギョン
(72)【発明者】
【氏名】クレインスティバー，ベンジャミン
(72)【発明者】
【氏名】ジョン，ジェイ．キース
(57)【要約】 （修正有）
【課題】構成的に活性で化学的に誘導可能なｄＣｐｆ１ベースの転写活性化因子、およびそれらの使用方法を提供する。
【解決手段】薬物誘導性の調整可能で多重化可能なプレボテラ属およびフランシセラ属由来のクラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｐｆ１）ベースの活性化因子、およびそれらの使用を提供する。また、少なくとも１つの活性化ドメインに融合された触媒的に不活性なラクノスピラ科細菌ＮＤ２００６タンパク質Ｃｐｆ１（ｄＬｂＣｐｆ１）を含む融合タンパク質を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】薬物誘導性の調整可能で多重化可能なプレボテラ属およびフランシセラ属由来のクラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｐｆ１）ベースの活性化因子、およびそれらの使用を提供する。また、少なくとも１つの活性化ドメインに融合された触媒的に不活性なラクノスピラ科細菌ＮＤ２００６タンパク質Ｃｐｆ１（ｄＬｂＣｐｆ１）を含む融合タンパク質を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１つの活性化ドメインに融合された触媒的に不活性なラクノスピラ科細菌（
Lachnospiraceae bacterium）ＮＤ２００６タンパク質Ｃｐｆ１（ｄＬｂＣｐｆ１）を含
む融合タンパク質であって、好ましくは、前記活性化ドメインが、ＶＰ１６の４つのコピ
ー、ヒトＮＦ－ＫＢ ｐ６５活性化ドメイン、およびエプスタイン・バーウイルスＲトラ
ンス活性化因子（Ｒｔａ）を含む合成ＶＰＲ活性化因子である、融合タンパク質。
Lachnospiraceae bacterium）ＮＤ２００６タンパク質Ｃｐｆ１（ｄＬｂＣｐｆ１）を含
む融合タンパク質であって、好ましくは、前記活性化ドメインが、ＶＰ１６の４つのコピ
ー、ヒトＮＦ－ＫＢ ｐ６５活性化ドメイン、およびエプスタイン・バーウイルスＲトラ
ンス活性化因子（Ｒｔａ）を含む合成ＶＰＲ活性化因子である、融合タンパク質。
【請求項2】
条件付き二量化ドメインに融合された触媒的に不活性なラクノスピラ科細菌（Lachnosp
iraceae bacterium）ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１（ｄＬｂＣｐｆ１）を、任意選択の介在リ
ンカーと共に含む、融合タンパク質。
iraceae bacterium）ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１（ｄＬｂＣｐｆ１）を、任意選択の介在リ
ンカーと共に含む、融合タンパク質。
【請求項3】
前記条件付き二量化ドメインが、ＤｍｒＡまたはＤｍｒＣである、請求項２に記載の融
合タンパク質。
合タンパク質。
【請求項4】
請求項２に記載の融合タンパク質、および第２の融合タンパク質を含む組成物であって
、前記第２の融合タンパク質は、二量化剤の存在下で、請求項２に記載の融合タンパク質
において条件付き二量化で二量化する第２の条件付き二量化ドメインに融合された少なく
とも１つの活性化ドメインを、前記活性化ドメインおよび／または前記第２の二量化ドメ
インのそれぞれの間の任意選択の介在リンカーと共に含む、組成物。
、前記第２の融合タンパク質は、二量化剤の存在下で、請求項２に記載の融合タンパク質
において条件付き二量化で二量化する第２の条件付き二量化ドメインに融合された少なく
とも１つの活性化ドメインを、前記活性化ドメインおよび／または前記第２の二量化ドメ
インのそれぞれの間の任意選択の介在リンカーと共に含む、組成物。
【請求項5】
（ｉ）請求項２に記載の融合タンパク質における前記条件付き二量化がＤｍｒＡであり
、前記第２の条件付き二量化ドメインがＤｍｒＣであるか、または（ｉｉ）請求項２に記
載の融合タンパク質における前記条件付き二量化がＤｍｒＣであり、前記第２の条件付き
二量化ドメインがＤｍｒＡである、請求項４に記載の組成物。
、前記第２の条件付き二量化ドメインがＤｍｒＣであるか、または（ｉｉ）請求項２に記
載の融合タンパク質における前記条件付き二量化がＤｍｒＣであり、前記第２の条件付き
二量化ドメインがＤｍｒＡである、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
前記活性化ドメインが、ＶＰ６４、Ｒｔａ、ＮＦ－κＢ ｐ６５、またはＶＰＲである
、請求項４に記載の組成物。
、請求項４に記載の組成物。
【請求項7】
請求項１から３に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項8】
請求項２に記載の融合タンパク質、および第２の融合タンパク質をコードする核酸を含
むキットであって、前記第２の融合タンパク質は、二量化剤の存在下で、請求項２に記載
の融合タンパク質における前記条件付き二量化で二量化する第２の条件付き二量化ドメイ
ンに融合された活性化ドメインを、前記活性化ドメインと前記第２の二量化ドメインとの
間の任意選択の介在リンカーと共に含む、キット。
むキットであって、前記第２の融合タンパク質は、二量化剤の存在下で、請求項２に記載
の融合タンパク質における前記条件付き二量化で二量化する第２の条件付き二量化ドメイ
ンに融合された活性化ドメインを、前記活性化ドメインと前記第２の二量化ドメインとの
間の任意選択の介在リンカーと共に含む、キット。
【請求項9】
（ｉ）請求項２に記載の融合タンパク質における条件付き二量化がＤｍｒＡであり、前
記第２の条件付き二量化ドメインがＤｍｒＣであるか、または（ｉｉ）請求項２に記載の
融合タンパク質における条件付き二量化がＤｍｒＣであり、前記第２の条件付き二量化ド
メインがＤｍｒＡである、請求項８に記載のキット。
記第２の条件付き二量化ドメインがＤｍｒＣであるか、または（ｉｉ）請求項２に記載の
融合タンパク質における条件付き二量化がＤｍｒＣであり、前記第２の条件付き二量化ド
メインがＤｍｒＡである、請求項８に記載のキット。
【請求項10】
請求項１から３に記載の融合タンパク質を発現する細胞。
【請求項11】
請求項２に記載の融合タンパク質、および第２の融合タンパク質を発現する細胞であっ
て、第２の融合タンパク質は、二量化剤の存在下で、請求項２に記載の融合タンパク質に
おける前記条件付き二量化で二量化する第２の条件付き二量化ドメインに融合された活性
化ドメインを含む、細胞。
て、第２の融合タンパク質は、二量化剤の存在下で、請求項２に記載の融合タンパク質に
おける前記条件付き二量化で二量化する第２の条件付き二量化ドメインに融合された活性
化ドメインを含む、細胞。
【請求項12】
（ｉ）請求項２に記載の融合タンパク質における前記条件付き二量化がＤｍｒＡであり
、前記第２の条件付き二量化ドメインがＤｍｒＣであるか、または（ｉｉ）請求項２に記
載の融合タンパク質における前記条件付き二量化がＤｍｒＣであり、前記第２の条件付き
二量化ドメインがＤｍｒＡである、請求項１１に記載の細胞。
、前記第２の条件付き二量化ドメインがＤｍｒＣであるか、または（ｉｉ）請求項２に記
載の融合タンパク質における前記条件付き二量化がＤｍｒＣであり、前記第２の条件付き
二量化ドメインがＤｍｒＡである、請求項１１に記載の細胞。
【請求項13】
細胞における標的遺伝子の発現を増加させる方法であって、
（ｉ）請求項１に記載の融合タンパク質、および前記標的遺伝子の制御領域に前記融合タ
ンパク質を方向付ける少なくとも１つのｃｒＲＮＡ；
（ｉｉ）請求項２に記載の融合タンパク質、および二量化剤の存在下で、請求項２に記載
の融合タンパク質において前記条件付き二量化で二量化する第２の条件付き二量化ドメイ
ンに融合された活性化ドメインを、前記活性化ドメインと前記第２の二量化ドメインとの
間の任意選択の介在リンカーと共に含む第２の融合タンパク質、および前記標的遺伝子の
制御領域に前記融合タンパク質を方向付ける少なくとも１つのｃｒＲＮＡ
のうちの１つまたは複数と細胞を接触させる、またはそれらを細胞中で発現させることを
含む、方法。
（ｉ）請求項１に記載の融合タンパク質、および前記標的遺伝子の制御領域に前記融合タ
ンパク質を方向付ける少なくとも１つのｃｒＲＮＡ；
（ｉｉ）請求項２に記載の融合タンパク質、および二量化剤の存在下で、請求項２に記載
の融合タンパク質において前記条件付き二量化で二量化する第２の条件付き二量化ドメイ
ンに融合された活性化ドメインを、前記活性化ドメインと前記第２の二量化ドメインとの
間の任意選択の介在リンカーと共に含む第２の融合タンパク質、および前記標的遺伝子の
制御領域に前記融合タンパク質を方向付ける少なくとも１つのｃｒＲＮＡ
のうちの１つまたは複数と細胞を接触させる、またはそれらを細胞中で発現させることを
含む、方法。
【請求項14】
細胞における複数の標的遺伝子の発現を増加させる方法であって、
（ｉ）請求項１に記載の融合タンパク質、および前記標的遺伝子の１つの制御領域に前記
融合タンパク質をそれぞれ方向付ける複数のｃｒＲＮＡをコードする少なくとも１つの核
酸；
（ｉｉ）請求項２に記載の融合タンパク質、および二量化剤の存在下で、請求項２に記載
の融合タンパク質において前記条件付き二量化で二量化する第２の条件付き二量化ドメイ
ンに融合された活性化ドメインを、前記活性化ドメインと前記第２の二量化ドメインとの
間の任意選択の介在リンカーと共に含む第２の融合タンパク質、および前記標的遺伝子の
１つの制御領域に前記融合タンパク質をそれぞれ方向付ける複数のｃｒＲＮＡをコードす
る少なくとも１つの核酸
のうちの１つまたは複数と細胞を接触させる、またはそれらを細胞中で発現させることを
含む、方法。
（ｉ）請求項１に記載の融合タンパク質、および前記標的遺伝子の１つの制御領域に前記
融合タンパク質をそれぞれ方向付ける複数のｃｒＲＮＡをコードする少なくとも１つの核
酸；
（ｉｉ）請求項２に記載の融合タンパク質、および二量化剤の存在下で、請求項２に記載
の融合タンパク質において前記条件付き二量化で二量化する第２の条件付き二量化ドメイ
ンに融合された活性化ドメインを、前記活性化ドメインと前記第２の二量化ドメインとの
間の任意選択の介在リンカーと共に含む第２の融合タンパク質、および前記標的遺伝子の
１つの制御領域に前記融合タンパク質をそれぞれ方向付ける複数のｃｒＲＮＡをコードす
る少なくとも１つの核酸
のうちの１つまたは複数と細胞を接触させる、またはそれらを細胞中で発現させることを
含む、方法。
【請求項15】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項16】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記制御領域がプロモーター領域である、請求項１３または１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
優先権の主張
本出願は、２０１７年４月２１日に出願された米国特許出願第６２／４８８，５８５号
の優先権を主張する。上述の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１７年４月２１日に出願された米国特許出願第６２／４８８，５８５号
の優先権を主張する。上述の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
連邦政府支援の研究または開発
本発明は、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）によって付与され
た助成金番号ＧＭ１０７４２７およびＧＭ１１８１５８の下で政府支援によりなされた。
政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）によって付与され
た助成金番号ＧＭ１０７４２７およびＧＭ１１８１５８の下で政府支援によりなされた。
政府は本発明に一定の権利を有する。
【0003】
技術分野
本明細書において、薬物誘導性の調整可能で多重化可能なＣｐｆ１ベースの活性化因子
、およびそれらの使用方法が記載される。
本明細書において、薬物誘導性の調整可能で多重化可能なＣｐｆ１ベースの活性化因子
、およびそれらの使用方法が記載される。
【背景技術】
【0004】
ＲＮＡガイド型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、標的ＤＮＡ塩基配列を認識するための再
プログラミング性のそれらの容易さにより生物学および治療学の両方を革新した。広く使
用されているストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のＣａｓ
９（ＳｐＣａｓ９）は、ＮＧＧ型のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）も存在する
ことを条件として、関連する相補ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む特異的ＤＮＡ配列を標
的とすることができる。
プログラミング性のそれらの容易さにより生物学および治療学の両方を革新した。広く使
用されているストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のＣａｓ
９（ＳｐＣａｓ９）は、ＮＧＧ型のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）も存在する
ことを条件として、関連する相補ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む特異的ＤＮＡ配列を標
的とすることができる。
【発明の概要】
【0005】
本発明は、少なくとも一部において、構成的に活性で化学的に誘導可能なｄＣｐｆ１ベ
ースの転写活性化因子プラットフォームの開発、および多重Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡ発現を使
用してヒト細胞において内因性遺伝子の相乗的活性化または組合せ活性化を達成する方法
を含む、それらの使用方法に基づいている。
ースの転写活性化因子プラットフォームの開発、および多重Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡ発現を使
用してヒト細胞において内因性遺伝子の相乗的活性化または組合せ活性化を達成する方法
を含む、それらの使用方法に基づいている。
【0006】
したがって、本明細書では、少なくとも１つの活性化ドメイン（例えば１、２、３また
は４つ以上の活性化ドメイン）に融合された、触媒的に不活性な（すなわち、ＤＮＡエン
ドヌクレアーゼ活性に対して触媒的に不活性な）ラクノスピラ科細菌（Lachnospiraceae
bacterium）ＮＤ２００６由来のプレボテラ属およびフランシセラ属由来のクラスター化
された規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｐｆ１：Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕ
ｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅ
ａｔｓ ｆｒｏｍ Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １）のタ
ンパク質Ｃｐｆ１（ｄＬｂＣｐｆ１）を含む融合タンパク質であって、好ましくは、活性
化ドメインが合成ＶＰＲ活性化因子（すなわち、ＶＰ１６の４つのコピー、ヒトＮＦ－Ｋ
Ｂ ｐ６５活性化ドメイン、およびエプスタイン・バーウイルスＲトランス活性化因子（
Ｒｔａ）を含む）である、融合タンパク質が提供される。他の活性化ドメインは、ＶＰ６
４、Ｒｔａ、ＮＦ－κＢ ｐ６５、およびｐ３００を、Ｃｐｆ１および／または各活性化
ドメイン間の任意選択の介在リンカーと共に含む。
は４つ以上の活性化ドメイン）に融合された、触媒的に不活性な（すなわち、ＤＮＡエン
ドヌクレアーゼ活性に対して触媒的に不活性な）ラクノスピラ科細菌（Lachnospiraceae
bacterium）ＮＤ２００６由来のプレボテラ属およびフランシセラ属由来のクラスター化
された規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｐｆ１：Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕ
ｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅ
ａｔｓ ｆｒｏｍ Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １）のタ
ンパク質Ｃｐｆ１（ｄＬｂＣｐｆ１）を含む融合タンパク質であって、好ましくは、活性
化ドメインが合成ＶＰＲ活性化因子（すなわち、ＶＰ１６の４つのコピー、ヒトＮＦ－Ｋ
Ｂ ｐ６５活性化ドメイン、およびエプスタイン・バーウイルスＲトランス活性化因子（
Ｒｔａ）を含む）である、融合タンパク質が提供される。他の活性化ドメインは、ＶＰ６
４、Ｒｔａ、ＮＦ－κＢ ｐ６５、およびｐ３００を、Ｃｐｆ１および／または各活性化
ドメイン間の任意選択の介在リンカーと共に含む。
【0007】
さらに、本明細書では、条件付き二量化ドメイン（conditional dimerization domain
）に融合された触媒的に不活性なラクノスピラ科細菌（Lachnospiraceae bacterium）Ｎ
Ｄ２００６ Ｃｐｆ１（ｄＬｂＣｐｆ１）を、Ｃｐｆ１および／または各活性化ドメイン
間の任意選択の介在リンカーと共に含む融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形
態において、条件付き二量化ドメインは、ＤｍｒＡまたはＤｍｒＣである。これらの融合
タンパク質は、二量化剤の存在下で、請求項２に記載の融合タンパク質において条件付き
二量化で二量化する第２の条件付き二量化ドメインに融合された少なくとも１つの活性化
ドメイン（例えば１、２、３または４つ以上の活性化ドメイン）を、活性化ドメインおよ
び／または第２の二量化ドメインの各間の任意選択の介在リンカーと共に含む第２の融合
タンパク質をも含む組成物またはキットで提供することができる。いくつかの実施形態に
おいて、請求項２に記載の融合タンパク質における条件付き二量化はＤｍｒＡであり、第
２の条件付き二量化ドメインはＤｍｒＣであるか、または（ｉｉ）請求項２に記載の融合
タンパク質における条件付き二量化はＤｍｒＣであり、第２の条件付き二量化ドメインは
ＤｍｒＡである。いくつかの実施形態において、活性化ドメインは、ＶＰ６４、Ｒｔａ、
ＮＦ－κＢ ｐ６５、ＶＰＲまたはｐ３００である。
）に融合された触媒的に不活性なラクノスピラ科細菌（Lachnospiraceae bacterium）Ｎ
Ｄ２００６ Ｃｐｆ１（ｄＬｂＣｐｆ１）を、Ｃｐｆ１および／または各活性化ドメイン
間の任意選択の介在リンカーと共に含む融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形
態において、条件付き二量化ドメインは、ＤｍｒＡまたはＤｍｒＣである。これらの融合
タンパク質は、二量化剤の存在下で、請求項２に記載の融合タンパク質において条件付き
二量化で二量化する第２の条件付き二量化ドメインに融合された少なくとも１つの活性化
ドメイン（例えば１、２、３または４つ以上の活性化ドメイン）を、活性化ドメインおよ
び／または第２の二量化ドメインの各間の任意選択の介在リンカーと共に含む第２の融合
タンパク質をも含む組成物またはキットで提供することができる。いくつかの実施形態に
おいて、請求項２に記載の融合タンパク質における条件付き二量化はＤｍｒＡであり、第
２の条件付き二量化ドメインはＤｍｒＣであるか、または（ｉｉ）請求項２に記載の融合
タンパク質における条件付き二量化はＤｍｒＣであり、第２の条件付き二量化ドメインは
ＤｍｒＡである。いくつかの実施形態において、活性化ドメインは、ＶＰ６４、Ｒｔａ、
ＮＦ－κＢ ｐ６５、ＶＰＲまたはｐ３００である。
【0008】
また、融合タンパク質、および／または本明細書に記載の融合タンパク質をコードする
核酸を、任意選択で二量化剤と共に含むキットが提供される。
核酸を、任意選択で二量化剤と共に含むキットが提供される。
【0009】
また本明細書では、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸、核酸を含むベ
クター、ならびに核酸および／またはベクターを含み任意選択で融合タンパク質を発現す
る細胞が提供される。
クター、ならびに核酸および／またはベクターを含み任意選択で融合タンパク質を発現す
る細胞が提供される。
【0010】
さらに、細胞における標的遺伝子の発現を増加させる方法であって、
（ｉ）少なくとも１つの活性化ドメイン（例えば１、２、３、４つ以上の活性化ドメイン
）に融合された触媒的に不活性なラクノスピラ科細菌（Lachnospiraceae bacterium）Ｎ
Ｄ２００６タンパク質Ｃｐｆ１（ｄＬｂＣｐｆ１）を含む融合タンパク質、および標的遺
伝子の制御領域、例えばプロモーター領域に融合タンパク質を方向付ける少なくとも１つ
のｃｒＲＮＡ；および／または
（ｉｉ）条件付き二量化ドメインに融合された触媒的に不活性なラクノスピラ科細菌（La
chnospiraceae bacterium）ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１（ｄＬｂＣｐｆ１）を、Ｃｐｆ１お
よび／または各活性化ドメイン間の任意選択の介在リンカーと共に含む第１の融合タンパ
ク質、ならびに二量化剤の存在下で、第１の融合タンパク質において条件付き二量化で二
量化する第２の条件付き二量化ドメインに融合された活性化ドメインを（活性化ドメイン
と第２の二量化ドメイン間の任意選択の介在リンカーと共に）含む第２の融合タンパク質
、ならびに標的遺伝子の制御領域、例えばプロモーター領域に融合タンパク質を方向付け
る少なくとも１つのｃｒＲＮＡ
のうちの１つまたは複数と細胞を接触させる、またはそれらを細胞中で発現させることを
含む、方法を提供する。
（ｉ）少なくとも１つの活性化ドメイン（例えば１、２、３、４つ以上の活性化ドメイン
）に融合された触媒的に不活性なラクノスピラ科細菌（Lachnospiraceae bacterium）Ｎ
Ｄ２００６タンパク質Ｃｐｆ１（ｄＬｂＣｐｆ１）を含む融合タンパク質、および標的遺
伝子の制御領域、例えばプロモーター領域に融合タンパク質を方向付ける少なくとも１つ
のｃｒＲＮＡ；および／または
（ｉｉ）条件付き二量化ドメインに融合された触媒的に不活性なラクノスピラ科細菌（La
chnospiraceae bacterium）ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１（ｄＬｂＣｐｆ１）を、Ｃｐｆ１お
よび／または各活性化ドメイン間の任意選択の介在リンカーと共に含む第１の融合タンパ
ク質、ならびに二量化剤の存在下で、第１の融合タンパク質において条件付き二量化で二
量化する第２の条件付き二量化ドメインに融合された活性化ドメインを（活性化ドメイン
と第２の二量化ドメイン間の任意選択の介在リンカーと共に）含む第２の融合タンパク質
、ならびに標的遺伝子の制御領域、例えばプロモーター領域に融合タンパク質を方向付け
る少なくとも１つのｃｒＲＮＡ
のうちの１つまたは複数と細胞を接触させる、またはそれらを細胞中で発現させることを
含む、方法を提供する。
【0011】
また、細胞における複数の標的遺伝子（例えば２、３または４つ以上）の発現を増加さ
せる方法であって、
（ｉ）少なくとも１つの活性化ドメイン（例えば１、２、３、４つ以上の活性化ドメイン
）に融合された触媒的に不活性なラクノスピラ科細菌（Lachnospiraceae bacterium）Ｎ
Ｄ２００６タンパク質Ｃｐｆ１（ｄＬｂＣｐｆ１）を含む融合タンパク質、および標的遺
伝子の１つの制御領域、例えばプロモーター領域に融合タンパク質を方向付ける複数のｃ
ｒＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸；および／または
（ｉｉ）条件付き二量化ドメインに融合された触媒的に不活性なラクノスピラ科細菌（La
chnospiraceae bacterium）ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１（ｄＬｂＣｐｆ１）を、Ｃｐｆ１お
よび／または各活性化ドメイン間の任意選択の介在リンカーと共に含む第１の融合タンパ
ク質、ならびに二量化剤の存在下で、第１の融合タンパク質において条件付き二量化で二
量化する第２の条件付き二量化ドメインに融合された活性化ドメインを含む第２の融合タ
ンパク質、ならびに標的遺伝子のうちの１つの制御領域、例えばプロモーター領域に融合
タンパク質をそれぞれ方向付ける複数のｃｒＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸
のうちの１つまたは複数と細胞を接触させる、またはそれらを細胞中で発現させることを
含む、方法を提供する。
せる方法であって、
（ｉ）少なくとも１つの活性化ドメイン（例えば１、２、３、４つ以上の活性化ドメイン
）に融合された触媒的に不活性なラクノスピラ科細菌（Lachnospiraceae bacterium）Ｎ
Ｄ２００６タンパク質Ｃｐｆ１（ｄＬｂＣｐｆ１）を含む融合タンパク質、および標的遺
伝子の１つの制御領域、例えばプロモーター領域に融合タンパク質を方向付ける複数のｃ
ｒＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸；および／または
（ｉｉ）条件付き二量化ドメインに融合された触媒的に不活性なラクノスピラ科細菌（La
chnospiraceae bacterium）ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１（ｄＬｂＣｐｆ１）を、Ｃｐｆ１お
よび／または各活性化ドメイン間の任意選択の介在リンカーと共に含む第１の融合タンパ
ク質、ならびに二量化剤の存在下で、第１の融合タンパク質において条件付き二量化で二
量化する第２の条件付き二量化ドメインに融合された活性化ドメインを含む第２の融合タ
ンパク質、ならびに標的遺伝子のうちの１つの制御領域、例えばプロモーター領域に融合
タンパク質をそれぞれ方向付ける複数のｃｒＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸
のうちの１つまたは複数と細胞を接触させる、またはそれらを細胞中で発現させることを
含む、方法を提供する。
【0012】
いくつかの実施形態において、細胞は哺乳動物細胞、例えばヒト細胞である。
【0013】
特に定義されない限り、本明細書において使用されているすべての技術用語および科学
用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有す
る。本発明で使用するための方法および材料は本明細書に記載されている。当技術分野で
公知の他の適切な方法および材料も使用することができる。材料、方法、および例は単に
説明しているだけであり、限定することを意図したものではない。本明細書で言及されて
いるすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ－、および他の参考
文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細
書が優先される。
用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有す
る。本発明で使用するための方法および材料は本明細書に記載されている。当技術分野で
公知の他の適切な方法および材料も使用することができる。材料、方法、および例は単に
説明しているだけであり、限定することを意図したものではない。本明細書で言及されて
いるすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ－、および他の参考
文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細
書が優先される。
【0014】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範
囲から明白であろう。
囲から明白であろう。
【0015】
特許ファイルまたは出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む
。カラー図面を含む本特許または特許出願公報のコピーは、請求および手数料の支払いに
よって官庁により提供される。
。カラー図面を含む本特許または特許出願公報のコピーは、請求および手数料の支払いに
よって官庁により提供される。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1-1】図１Ａ～１Ｅは、個々のｃｒＲＮＡをｄＬｂＣｐｆ１ベースの活性化因子と共に使用する標的ヒト内因性遺伝子の制御を示す図である。 （Ａ）ダイレクトｄＬｂＣｐｆ１－ＶＰＲおよびｄＬｂＣｐｆ－ｐ６５活性化因子融合タンパク質を示す概略図である。（Ｂ）ヒトＨＥＫ２９３細胞の３つの内因性ヒト遺伝子（ＨＢＢ、ＡＲおよびＮＰＹ１Ｒ）で単一ｃｒＲＮＡを使用したｄＬｂＣｐｆ１－ｐ６５またはｄＬｂＣｐｆ１－ＶＰＲの活性を示す図である。示した遺伝子プロモーターの相対的活性化は、ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定した。３つの別個のｃｒＲＮＡは、各遺伝子の転写開始部位から１ｋｂ上流のプロモーター配列内で標的化された。相対的ｍＲＮＡ発現は、ｃｒＲＮＡが発現されない対照試料との比較によって計算される。（Ｃ）ヒトＣＤ５およびＣＤ２２プロモーターを標的とした各種ｃｒＲＮＡの分析を示す図である。３２個のｃｒＲＮＡ（各遺伝子に対し１６個）は、各遺伝子のＴＳＳの１ｋｂ上流または５００ｂｐ下流のプロモーター配列内に位置した部位を標的とするように設計された。反復配列は標的とされなかった。７２時間トランスフェクションした後、細胞をＣＤ５またはＣＤ２２タンパク質に対して蛍光標識抗体で染色し、蛍光陽性細胞をフローサイトメトリーにより定量した。エラーバーは、３つの生物学的複製物に対するｓ．ｅ．ｍを示す。黒丸は、ｃｒＲＮＡが発現しなかった対照と比較した場合に有意に異なる試料を示す（スチューデントｔ検定、等分散を仮定する両側検定、ｐ＜０．０５）。（Ｄ）薬物誘導性の２部から構成されるｄＬｂＣｐｆ１ベースの活性化因子融合タンパク質を示す概略図である。ｄＬｂＣｐｆ１は１～４つのＤｍｒＡドメインに融合され、ＶＰＲまたはｐ６５はＤｍｒＣドメインに融合される。ＤｍｒＡおよびＤｍｒＣはＡ／Ｃヘテロ二量化薬（赤色菱形）の存在下でのみ相互作用するので、２部から構成される活性化因子は薬物の存在下でのみ再構成される。（Ｅ）ヒトＨＥＫ２９３細胞の３つの内因性ヒト遺伝子（ＨＢＢ、ＡＲ、およびＮＰＹ１Ｒ）で単一ｃｒＲＮＡを使用した薬物誘導性の２部から構成されるｄＬｂＣｐｆ１ベースの活性化因子の活性を示す図である。示した遺伝子プロモーターの相対的活性化は、ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定した。各プロモーターで使用されたｃｒＲＮＡは、上記（Ｂ）で最も高い活性を示したものであった。（Ｂ）および（Ｅ）で示したデータは、３つの生物学的に独立した複製を表し、エラーバーは３つの技術的な複製の標準偏差（ＳＤ）を示す。
【図2-1】図２Ａ～２Ｉは、ｄＬｂＣｐｆ１ベースの活性化因子による内因性ヒト遺伝子の多重および相乗的な制御を示す図である。 （Ａ）単一転写産物にコードされている複数のｇＲＮＡを発現するように設計された発現カセットの概略図を示す図である。矢印は、ｄＬｂＣｐｆ１のＲＮａｓｅ活性によってプロセシングされる切断部位を示す。（Ｂ）単一細胞内の異なる内因性遺伝子プロモーターをそれぞれ標的とする３つのｃｒＲＮＡの多重発現を示す概略図である。（Ｃ）多重転写産物から発現された、または個々の転写産物から発現されたｃｒＲＮＡをｄＬｂＣｐｆ１－ＶＰＲダイレクト融合体（左図）、ｄＬｂＣｐｆ１－ＤｍｒＡ（×４）およびＤｍｒＣ－ＶＰＲ融合体（中央図）、ならびにｄＬｂＣｐｆ１－ＤｍｒＡ（×４）およびＤｍｒＣ－ｐ６５融合体（右図）と共に使用した３つの内因性ヒト遺伝子の同時活性化を示す図である。転写産物はＨＥＫ２９３細胞においてＲＴ－ｑＰＣＲを使用して測定し、ｃｒＲＮＡが発現していない対照試料と比較して相対的ｍＲＮＡ発現を計算した。（Ｄ）ヒトＵ２０Ｓ細胞における異なるｄＬｂＣｐｆ１ベースの活性化因子によるＭＳＴ ｃｒＲＮＡの活性を示す図である。グラフは、ｄＬｂＣｐｆ１－ＶＰＲダイレクト融合体、ｄＬｂＣｐｆ１ ＤｍｒＡ（×４）およびＤｍｒＣ－ｐ６５融合体、ならびにｄＬｂＣｐｆ１－ＤｍｒＡ（×４）およびＤｍｒＣ－ＶＰＲ融合体と、多重単一転写産物（ＭＳＴ）から発現された、または単一ｃｒＲＮＡをコードする転写産物から発現されたｃｒＲＮＡとによる３つの内因性ヒト遺伝子の活性化を示す。ＲＮＡ発現はＲＴ－ｑＰＣＲによって測定し、示した相対的発現はｃｒＲＮＡが発現されない対照試料との比較によって計算した。（Ｅ）同じ細胞において同じ内因性遺伝子プロモーターをそれぞれ標的とした３つのｃｒＲＮＡの多重発現を示す概略図である。（Ｆ）多重転写産物から発現された、または個々の転写産物から発現された３つのｃｒＲＮＡのセットを伴ったダイレクトｄＬｂＣｐｆ１－ｐ６５融合体またはｄＬｂＣｐｆ１－ＶＰＲ融合体のＨＢＢ、ＡＲまたはＮＰＹ１Ｒ内在性遺伝子プロモーターに対する活性を示す図である。転写産物はＨＥＫ２９３細胞においてＲＴ－ｑＰＣＲを使用して測定し、ｃｒＲＮＡが発現していない対照試料と比較して相対的ｍＲＮＡ発現を計算した。（Ｇ）多重転写産物から発現された、または個々の転写産物から発現された３つのｃｒＲＮＡのセットを伴ったｄＬｂＣｐｆ１－ＤｍｒＡ（×４）およびＤｍｒＣ－ＶＰＲの融合体またはｄＬｂＣｐｆ１－ＤｍｒＡ（×４）およびＤｍｒＣ－ｐ６５の融合体のＨＢＢ、ＡＲまたはＮＰＹ１Ｒ内因性遺伝子プロモーターに対する活性を示す図である。転写産物はＨＥＫ２９３細胞においてＲＴ－ｑＰＣＲを使用して測定し、ｃｒＲＮＡが発現していない対照試料と比較して相対的ｍＲＮＡ発現を計算した。（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｆ）、および（Ｇ）に示すデータは３つの生物学的に独立した複製を表し、エラーバーは３つの技術的複製の標準偏差（ＳＤ）を示す。ｈＵ６、ヒトＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター；ＤＲ；直列反復配列。（Ｈ）Ａ／Ｃヘテロ二量化薬で制御されたｄＬｂＣｐｆ１ベースの活性化因子の誘導性および可逆性を示す図である。活性化因子誘導の動態を測定するため、ＨＥＫ２９３細胞に、ｄＬｂＣｐｆ１－ＤｍｒＡ（×４）、ＤｍｒＣ－ｐ６５、およびヒトＨＢＢプロモーターまたはＡＲプロモーターを標的とするＭＳＴ ｃｒＲＮＡを発現するプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの３４時間後、これらの細胞を２つの培養物に分けた：１つはＡ／Ｃヘテロ二量化剤（５００ｕＭ）を含有する培地（上、黒色）、もう１つはＡ／Ｃヘテロ二量化剤を含まない培地（下、灰色）。細胞を様々な時点で回収し、相対的ｍＲＮＡ発現レベルをＲＴ－ｑＰＣＲにより陰性対照と比較して測定した。（Ｉ）可逆性の動態を測定するため、ＨＥＫ２９３細胞を（Ｈ）と同様にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、Ａ／Ｃヘテロ二量化剤（５００ｕＭ）を培地に加えた。１０時間後、これらの細胞を２つの培養物に分けた：１つはＡ／Ｃヘテロ二量化剤（５００ｕＭ）を含有する培地（上、青色）、もう１つはＡ／Ｃヘテロ二量化剤を含まない培地（下、紫色）。細胞を様々な時点で回収し、相対的ｍＲＮＡ発現レベルをＲＴ－ｑＰＣＲにより陰性対照と比較して測定した。エラーバーは、３つの生物学的複製物のｓ．ｅ．ｍを表す。
【発明を実施するための形態】
【0017】
詳細な説明
効率的活性化は単一プロモーターに動員される複数の制御ドメインを必要としていたが
５、ＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼの触媒的に不活性な形態（「デッド」ＳｐＣａｓ９または
ｄＳｐＣａｓ９）は、転写活性化因子ドメインまたはリプレッサードメインと融合されて
、哺乳動物細胞におけるライブラリースクリーニングの遺伝子発現を個々にまたはゲノム
ワイドに変えた１～４。また、低分子誘導性および光誘導性両方のｄＣａｓ９ベースの遺
伝子制御融合体も記載されており、追加の重要な能力をこのプラットフォームに提供する
６～１０。最近記載されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１ヌクレアーゼは、長さの短いｇＲＮＡ
、代替のＴリッチＰＡＭ配列を標的とする能力、およびＣｐｆ１ヌクレアーゼそれ自体に
よる単一転写産物からの複数のガイドＲＮＡのプロセッシングを含む、ＳｐＣａｓ９の能
力を超える重要な追加能力を付与する１１。しかし、本発明者らが知る限りでは、「デッ
ド」Ｃｐｆ１ベースの遺伝子制御因子は、現在まで、細菌１２および植物（シロイヌナズ
ナ（Arabidopsis））１３における遺伝子発現を抑制するのに使用されているのみであり
、哺乳動物細胞において、または標的遺伝子を活性化するために作用することは明らかに
されていない。本明細書では、本発明者らは、構成的に活性であり、化学的に誘導可能な
ｄＣｐｆ１ベースの転写活性化因子プラットフォームについて記載し、その多重Ｃｐｆ１
ｇＲＮＡ発現を利用して、ヒト細胞における内因性遺伝子の相乗的活性化または組合せ
活性化を達成できることを示す。
効率的活性化は単一プロモーターに動員される複数の制御ドメインを必要としていたが
５、ＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼの触媒的に不活性な形態（「デッド」ＳｐＣａｓ９または
ｄＳｐＣａｓ９）は、転写活性化因子ドメインまたはリプレッサードメインと融合されて
、哺乳動物細胞におけるライブラリースクリーニングの遺伝子発現を個々にまたはゲノム
ワイドに変えた１～４。また、低分子誘導性および光誘導性両方のｄＣａｓ９ベースの遺
伝子制御融合体も記載されており、追加の重要な能力をこのプラットフォームに提供する
６～１０。最近記載されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１ヌクレアーゼは、長さの短いｇＲＮＡ
、代替のＴリッチＰＡＭ配列を標的とする能力、およびＣｐｆ１ヌクレアーゼそれ自体に
よる単一転写産物からの複数のガイドＲＮＡのプロセッシングを含む、ＳｐＣａｓ９の能
力を超える重要な追加能力を付与する１１。しかし、本発明者らが知る限りでは、「デッ
ド」Ｃｐｆ１ベースの遺伝子制御因子は、現在まで、細菌１２および植物（シロイヌナズ
ナ（Arabidopsis））１３における遺伝子発現を抑制するのに使用されているのみであり
、哺乳動物細胞において、または標的遺伝子を活性化するために作用することは明らかに
されていない。本明細書では、本発明者らは、構成的に活性であり、化学的に誘導可能な
ｄＣｐｆ１ベースの転写活性化因子プラットフォームについて記載し、その多重Ｃｐｆ１
ｇＲＮＡ発現を利用して、ヒト細胞における内因性遺伝子の相乗的活性化または組合せ
活性化を達成できることを示す。
【0018】
本発明者らの知る限りでは、ここで報告された結果は、ＲＮＡガイド型Ｃｐｆ１ベース
の融合体を使用して、任意の細胞型で内因性遺伝子発現を活性化することできるという最
初の実証、およびヒト細胞におけるＣｐｆ１由来遺伝子制御タンパク質の最初の使用を提
供する。ＳｐＣａｓ９と比較したＬｂＣｐｆ１の直下ＰＡＭ認識特異性（ＴＴＴＮ対ＮＧ
Ｇ）は、ＲＮＡガイド型活性化因子タンパク質に関する新しい範囲の標的化可能な配列を
切り開く。ＳｐＣａｓ９と比較した場合に報告されたＬｂＣｐｆ１のゲノムワイドな特異
性が高いことを考えると１４、１５、ｄＬｂＣｐｆ１活性化因子は、ｄＳｐＣａｓ９活性
化因子に匹敵する特異性を有している可能性があり、これはＲＮＡ－ｓｅｑによりオフタ
ーゲット遺伝子活性化の事象を、たとえあったとしても、ほとんど引き起こさないことが
示された。
の融合体を使用して、任意の細胞型で内因性遺伝子発現を活性化することできるという最
初の実証、およびヒト細胞におけるＣｐｆ１由来遺伝子制御タンパク質の最初の使用を提
供する。ＳｐＣａｓ９と比較したＬｂＣｐｆ１の直下ＰＡＭ認識特異性（ＴＴＴＮ対ＮＧ
Ｇ）は、ＲＮＡガイド型活性化因子タンパク質に関する新しい範囲の標的化可能な配列を
切り開く。ＳｐＣａｓ９と比較した場合に報告されたＬｂＣｐｆ１のゲノムワイドな特異
性が高いことを考えると１４、１５、ｄＬｂＣｐｆ１活性化因子は、ｄＳｐＣａｓ９活性
化因子に匹敵する特異性を有している可能性があり、これはＲＮＡ－ｓｅｑによりオフタ
ーゲット遺伝子活性化の事象を、たとえあったとしても、ほとんど引き起こさないことが
示された。
【0019】
また本研究は、複数の方法において遺伝子制御の調節に使用することができる薬物誘導
性のｄＬｂＣｐｆ１活性化因子を確立した。これらの活性化因子は、対の融合タンパク質
である、条件付き二量化ドメインに融合された触媒的に不活性なラクノスピラ科細菌（La
chnospiraceae bacterium）ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１（ｄＬｂＣｐｆ１）を、Ｃｐｆ１お
よび／または各活性化ドメインの間の任意選択の介在リンカーと共に含む第１の融合タン
パク質、および第２の融合タンパク質を含み、第２の融合タンパク質は、二量化剤の存在
下で、第１の融合タンパク質中の条件付き二量化で二量化する第２の条件付き二量化ドメ
インに融合された活性化ドメインを、活性化ドメインと第２の二量化ドメインとの間の任
意選択の介在リンカーと共に含む。これらの活性化因子の２部から構成される性質によっ
て、細胞透過性のＡ／Ｃ二量化薬でそれらの活性をオンまたはオフにすることができ、こ
れは、実験系に有用な機能を提供する。さらに、所望する活性化のレベルはｄＬｂＣｐｆ
１に融合されたＤｍｒＡ二量化ドメインの数を増やすことにより調整することができ、お
そらくこれが、所定のプロモーターへのＤｍｒＣ活性化因子融合体の動員数をますます増
加させる。ＤｍｒＣ融合において使用される活性化ドメインの変更は、観察された活性化
の程度に影響を及ぼした。幾分驚いたことに、ＳｐＣａｓ９ベースの活性化因子の以前の
結果とは対照的に、ｐ６５ドメイン（個々のｃｒＲＮＡｓを有する）は、合成ＶＰＲ活性
化因子（６つの強力な活性化ドメインを含有する）よりも、試験した３つの遺伝子プロモ
ーターを一貫してより活性化した。標的プロモーターに方向付けられた複数のｃｒＲＮＡ
で、ｐ６５ドメインは、相乗作用が確認された２つの遺伝子に、より強力な活性化をもた
らした。合成ＶＰＲではなく天然に存在するｐ６５活性化ドメインを使用する能力は、非
常に強力な活性化因子によって引き起こされる望ましくない副作用（例えば、スケルチン
グ（squelching））を回避するので有利である１６、１７。遺伝子活性化のその有用性以
上に、この薬物誘導性の多重ｄＣｐｆ１ベースのプラットフォームを使用して、目的の任
意の内因性ゲノム遺伝子座への他の異種タンパク質または機能ドメインの標的動員が可能
となる。
性のｄＬｂＣｐｆ１活性化因子を確立した。これらの活性化因子は、対の融合タンパク質
である、条件付き二量化ドメインに融合された触媒的に不活性なラクノスピラ科細菌（La
chnospiraceae bacterium）ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１（ｄＬｂＣｐｆ１）を、Ｃｐｆ１お
よび／または各活性化ドメインの間の任意選択の介在リンカーと共に含む第１の融合タン
パク質、および第２の融合タンパク質を含み、第２の融合タンパク質は、二量化剤の存在
下で、第１の融合タンパク質中の条件付き二量化で二量化する第２の条件付き二量化ドメ
インに融合された活性化ドメインを、活性化ドメインと第２の二量化ドメインとの間の任
意選択の介在リンカーと共に含む。これらの活性化因子の２部から構成される性質によっ
て、細胞透過性のＡ／Ｃ二量化薬でそれらの活性をオンまたはオフにすることができ、こ
れは、実験系に有用な機能を提供する。さらに、所望する活性化のレベルはｄＬｂＣｐｆ
１に融合されたＤｍｒＡ二量化ドメインの数を増やすことにより調整することができ、お
そらくこれが、所定のプロモーターへのＤｍｒＣ活性化因子融合体の動員数をますます増
加させる。ＤｍｒＣ融合において使用される活性化ドメインの変更は、観察された活性化
の程度に影響を及ぼした。幾分驚いたことに、ＳｐＣａｓ９ベースの活性化因子の以前の
結果とは対照的に、ｐ６５ドメイン（個々のｃｒＲＮＡｓを有する）は、合成ＶＰＲ活性
化因子（６つの強力な活性化ドメインを含有する）よりも、試験した３つの遺伝子プロモ
ーターを一貫してより活性化した。標的プロモーターに方向付けられた複数のｃｒＲＮＡ
で、ｐ６５ドメインは、相乗作用が確認された２つの遺伝子に、より強力な活性化をもた
らした。合成ＶＰＲではなく天然に存在するｐ６５活性化ドメインを使用する能力は、非
常に強力な活性化因子によって引き起こされる望ましくない副作用（例えば、スケルチン
グ（squelching））を回避するので有利である１６、１７。遺伝子活性化のその有用性以
上に、この薬物誘導性の多重ｄＣｐｆ１ベースのプラットフォームを使用して、目的の任
意の内因性ゲノム遺伝子座への他の異種タンパク質または機能ドメインの標的動員が可能
となる。
【0020】
本研究はまた、Ｃｐｆ１プラットフォームの重要な利点である、単一転写産物上で複数
のｃｒＲＮＡをよりシンプルにコードする能力を利用して、同じ単一細胞内で内因性ヒト
遺伝子の多重活性化を実現できることを実証した。ｄＳｐＣａｓ９遺伝子制御タンパク質
を使用する多重制御は、ｇＲＮＡが個別のプロモーターから発現される場合１８にはプロ
モーター間の実質的な組換えのため、または複数のｇＲＮＡが単一転写産物から発現され
る場合には１９～２５、追加のアクセサリーＲＮＡ配列、プロモーターもしくはトランス
作用因子が必要なため、困難である。対照的に、Ｃｐｆ１により使用されるより短い約４
０ｎｔ長のｃｒＲＮＡは、単一オリゴヌクレオチド上で２つまたは３つのｃｒＲＮＡを容
易にコードすることができるので、目的の遺伝子を標的とするｃｒＲＮＡの正確なユーザ
ー指定の組合せを構築するためにチップベースの合成を利用することができる。ｄＳｐＣ
ａｓ９ ｇＲＮＡで同じことを実施する場合、長さがより長い（約１００ｎｔ）ガイドＲ
ＮＡが必要とされ、単一転写産物からのプロセッシングを可能にするためにはアクセサリ
ー配列および因子が必要とされるのでより困難である。したがって、これらの結果は、２
つ以上の遺伝子の発現が同時に制御される多重ライブラリースクリーニングを含む方法を
実施する実現可能性を実証しており、それにより、この手法を使用してより複雑な細胞表
現型の分析が可能になる。
のｃｒＲＮＡをよりシンプルにコードする能力を利用して、同じ単一細胞内で内因性ヒト
遺伝子の多重活性化を実現できることを実証した。ｄＳｐＣａｓ９遺伝子制御タンパク質
を使用する多重制御は、ｇＲＮＡが個別のプロモーターから発現される場合１８にはプロ
モーター間の実質的な組換えのため、または複数のｇＲＮＡが単一転写産物から発現され
る場合には１９～２５、追加のアクセサリーＲＮＡ配列、プロモーターもしくはトランス
作用因子が必要なため、困難である。対照的に、Ｃｐｆ１により使用されるより短い約４
０ｎｔ長のｃｒＲＮＡは、単一オリゴヌクレオチド上で２つまたは３つのｃｒＲＮＡを容
易にコードすることができるので、目的の遺伝子を標的とするｃｒＲＮＡの正確なユーザ
ー指定の組合せを構築するためにチップベースの合成を利用することができる。ｄＳｐＣ
ａｓ９ ｇＲＮＡで同じことを実施する場合、長さがより長い（約１００ｎｔ）ガイドＲ
ＮＡが必要とされ、単一転写産物からのプロセッシングを可能にするためにはアクセサリ
ー配列および因子が必要とされるのでより困難である。したがって、これらの結果は、２
つ以上の遺伝子の発現が同時に制御される多重ライブラリースクリーニングを含む方法を
実施する実現可能性を実証しており、それにより、この手法を使用してより複雑な細胞表
現型の分析が可能になる。
【0021】
Ｃｐｆ１
クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ：Ｃｌｕｓｔ
ｅｒｅｄ，ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ，ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒ
ｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）系は、細菌の適応免疫に不可欠なＲＮＡガイド型エンドヌクレ
アーゼをコードしている２６。ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼは、様々な生物
においてゲノム編集するために標的ＤＮＡ配列を切断するように容易にプログラムするこ
とができる２７～３０。Ｃａｓ９タンパク質と呼ばれるこれらのヌクレアーゼの１つのク
ラスは、２つの短いＲＮＡ：ｃｒＲＮＡおよびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲ
ＮＡ）と複合体を形成する３１、３２。最も一般的に使用されているＣａｓ９オルソログ
のＳｐＣａｓ９は、標的ＤＮＡ部位の「プロトスペーサー」領域に相補的な、２０ヌクレ
オチド（ｎｔ）をその５’末端に有するｃｒＲＮＡを使用する。また効果的な切断には、
ＳｐＣａｓ９がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識することを必要とする。
ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、通常、ＳｐＣａｓ９のＤＮＡ切断活性を導く単一
の約１００ｎｔガイド型ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）３１、３３～３５に組み合わされる。異なる
ｇＲＮＡと対になったＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼのゲノムワイドな特異性は、多くの異な
る手法を使用して特徴付けられている３６～３９。またゲノムワイドな特異性が実質的に
改善されたＳｐＣａｓ９変異体も設計されている４０、４１。
クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ：Ｃｌｕｓｔ
ｅｒｅｄ，ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ，ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒ
ｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）系は、細菌の適応免疫に不可欠なＲＮＡガイド型エンドヌクレ
アーゼをコードしている２６。ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼは、様々な生物
においてゲノム編集するために標的ＤＮＡ配列を切断するように容易にプログラムするこ
とができる２７～３０。Ｃａｓ９タンパク質と呼ばれるこれらのヌクレアーゼの１つのク
ラスは、２つの短いＲＮＡ：ｃｒＲＮＡおよびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲ
ＮＡ）と複合体を形成する３１、３２。最も一般的に使用されているＣａｓ９オルソログ
のＳｐＣａｓ９は、標的ＤＮＡ部位の「プロトスペーサー」領域に相補的な、２０ヌクレ
オチド（ｎｔ）をその５’末端に有するｃｒＲＮＡを使用する。また効果的な切断には、
ＳｐＣａｓ９がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識することを必要とする。
ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、通常、ＳｐＣａｓ９のＤＮＡ切断活性を導く単一
の約１００ｎｔガイド型ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）３１、３３～３５に組み合わされる。異なる
ｇＲＮＡと対になったＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼのゲノムワイドな特異性は、多くの異な
る手法を使用して特徴付けられている３６～３９。またゲノムワイドな特異性が実質的に
改善されたＳｐＣａｓ９変異体も設計されている４０、４１。
【0022】
最近、標的ＤＮＡ配列を切断するようにもプログラムされ得るＣｐｆ１という名称のＣ
ａｓタンパク質が同定された４２～４５。ＳｐＣａｓ９とは異なり、Ｃｐｆ１は単一の４
２ｎｔのｃｒＲＮＡだけを必要とし、これは標的ＤＮＡ配列のプロトスペーサーに相補的
である２３ｎｔをその３’末端に有している４４。さらに、ＳｐＣａｓ９はプロトスペー
サーの３’にあるＮＧＧ ＰＡＭシーケンスを認識するが、それに対しＡｓＣｐｆ１およ
びＬｂＣｐ１はプロトスペーサーの５’で確認されるＴＴＴＮ ＰＡＭを認識する４４。
ＡｓＣｐｆ１およびＬｂＣｐｆ１の初期の実験では、これらのヌクレアーゼはヒト細胞の
標的部位を編集するようにプログラムされ得ることが示されたが４４、それらは少数の部
位に対してしか試験されていない。ＡｓＣｐｆ１およびＬｂＣｐｆ１の両方のオンターゲ
ット活性およびゲノムワイドな特異性は、Kleinstiver & Tsai et al., Nature Biotechn
ology 2016で特徴付けられている。
ａｓタンパク質が同定された４２～４５。ＳｐＣａｓ９とは異なり、Ｃｐｆ１は単一の４
２ｎｔのｃｒＲＮＡだけを必要とし、これは標的ＤＮＡ配列のプロトスペーサーに相補的
である２３ｎｔをその３’末端に有している４４。さらに、ＳｐＣａｓ９はプロトスペー
サーの３’にあるＮＧＧ ＰＡＭシーケンスを認識するが、それに対しＡｓＣｐｆ１およ
びＬｂＣｐ１はプロトスペーサーの５’で確認されるＴＴＴＮ ＰＡＭを認識する４４。
ＡｓＣｐｆ１およびＬｂＣｐｆ１の初期の実験では、これらのヌクレアーゼはヒト細胞の
標的部位を編集するようにプログラムされ得ることが示されたが４４、それらは少数の部
位に対してしか試験されていない。ＡｓＣｐｆ１およびＬｂＣｐｆ１の両方のオンターゲ
ット活性およびゲノムワイドな特異性は、Kleinstiver & Tsai et al., Nature Biotechn
ology 2016で特徴付けられている。
【0023】
本明細書ではＬｂＣｐｆ１を含む融合タンパク質が提供される。ＬｂＣｐｆ１野生型タ
ンパク質の配列は以下のとおりである：
ンパク質の配列は以下のとおりである：
【0024】
ＬｂＣｐｆ１－Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質Ｃｐｆ１［ラクノスピラ科細菌（Lach
nospiraceae bacterium）ＮＤ２００６］、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ番号 ＷＰ＿０５１
６６６１２８．１
nospiraceae bacterium）ＮＤ２００６］、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ番号 ＷＰ＿０５１
６６６１２８．１
【0025】
【化1】
【0026】
１８アミノ酸のシグナル配列のない成熟ＬｂＣｐｆ１：
【0027】
【化2】
【0028】
本明細書に記載のＬｂＣｐｆ１変異体は、表Ａの１つまたは複数の位置で変異を有する
（すなわち、天然アミノ酸の異なるアミノ酸、例えばアラニン、グリシン、またはセリン
との置換）、配列番号１のアミノ酸配列、例えば、少なくとも配列番号１のアミノ酸２３
～１２４６を含み得る；配列番号１のアミノ酸１９～１２４６は、配列番号２のアミノ酸
１～１２２８と同一である（配列番号１のアミノ酸１～１２４６は、本明細書ではＬｂＣ
ＰＦ１（＋１８）と呼ばれる）。いくつかの実施形態において、ＬｂＣｐｆ１変異体は、
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％、また
は９５％同一であり、例えば、本明細書に記載の変異に加えて、例えば保存的変異で置換
された配列番号２の最大５％、１０％、１５％、または２０％の残基に差異を有する。好
ましい実施形態において、変異体は、所望する親の活性、例えばヌクレアーゼ活性（親が
ニッカーゼもしくはデッドＣｐｆ１である場合を除く）、および／またはガイドＲＮＡお
よび標的ＤＮＡと相互作用する能力を保持する。本実施例で使用されたＬｂＣｐｆ１のバ
ージョンは配列番号２であり、Zetsche et al. Cell 163, 759-771 (2015)で記載されて
いるように上記の枠で囲んだ最初の１８アミノ酸が除かれている。
（すなわち、天然アミノ酸の異なるアミノ酸、例えばアラニン、グリシン、またはセリン
との置換）、配列番号１のアミノ酸配列、例えば、少なくとも配列番号１のアミノ酸２３
～１２４６を含み得る；配列番号１のアミノ酸１９～１２４６は、配列番号２のアミノ酸
１～１２２８と同一である（配列番号１のアミノ酸１～１２４６は、本明細書ではＬｂＣ
ＰＦ１（＋１８）と呼ばれる）。いくつかの実施形態において、ＬｂＣｐｆ１変異体は、
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％、また
は９５％同一であり、例えば、本明細書に記載の変異に加えて、例えば保存的変異で置換
された配列番号２の最大５％、１０％、１５％、または２０％の残基に差異を有する。好
ましい実施形態において、変異体は、所望する親の活性、例えばヌクレアーゼ活性（親が
ニッカーゼもしくはデッドＣｐｆ１である場合を除く）、および／またはガイドＲＮＡお
よび標的ＤＮＡと相互作用する能力を保持する。本実施例で使用されたＬｂＣｐｆ１のバ
ージョンは配列番号２であり、Zetsche et al. Cell 163, 759-771 (2015)で記載されて
いるように上記の枠で囲んだ最初の１８アミノ酸が除かれている。
【0029】
いくつかの実施形態において、Ｃｐｆ１変異体はまた、表Ａに挙げた以下の変異体のう
ちの１つを含み、これらはＣｐｆ１のヌクレアーゼ活性を低減または破壊する（すなわち
、それらを触媒的に不活性化する）：
ちの１つを含み、これらはＣｐｆ１のヌクレアーゼ活性を低減または破壊する（すなわち
、それらを触媒的に不活性化する）：
【0030】
【表1】
【0031】
例えば、Yamano et al., Cell. 2016 May 5; 165(4):949-62；Fonfara et al., Nature
. 2016 Apr 28; 532(7600):517-21；Dong et al., Nature. 2016 Apr 28; 532(7600):522
-6；およびZetsche et al., Cell. 2015 Oct 22; 163(3):759-71を参照されたい。「Ｌｂ
Ｃｐｆ１（＋１８）」は、配列番号１のアミノ酸１～１２４６の完全配列を意味し、一方
、ＬｂＣｐｆ１は、本明細書で配列番号２のアミノ酸１～１２２８および配列番号１のア
ミノ酸１９～１２４６としても示されているＺｅｔｓｃｈｅらのＬｂＣｐｆ１の配列を意
味することに注意されたい。したがって、いくつかの実施形態において、ＬｂＣｐｆ１に
関して、触媒活性を破壊する変異がＤ８３２およびＥ９２５で作製されており、例えば、
Ｄ８３２ＡおよびＥ９２５Ａである。
. 2016 Apr 28; 532(7600):517-21；Dong et al., Nature. 2016 Apr 28; 532(7600):522
-6；およびZetsche et al., Cell. 2015 Oct 22; 163(3):759-71を参照されたい。「Ｌｂ
Ｃｐｆ１（＋１８）」は、配列番号１のアミノ酸１～１２４６の完全配列を意味し、一方
、ＬｂＣｐｆ１は、本明細書で配列番号２のアミノ酸１～１２２８および配列番号１のア
ミノ酸１９～１２４６としても示されているＺｅｔｓｃｈｅらのＬｂＣｐｆ１の配列を意
味することに注意されたい。したがって、いくつかの実施形態において、ＬｂＣｐｆ１に
関して、触媒活性を破壊する変異がＤ８３２およびＥ９２５で作製されており、例えば、
Ｄ８３２ＡおよびＥ９２５Ａである。
【0032】
好ましくは１つまたは複数のヌクレアーゼ低減変異または死滅変異を含むＣｐｆ１変異
体は、Ｃｐｆ１のＮ末端またはＣ末端で、転写活性化ドメイン（例えば、単純ヘルペスウ
イルスのＶＰ１６ドメイン（Sadowski et al., 1988, Nature, 335:563-564）もしくはＶ
Ｐ６４由来の転写活性化ドメイン；細胞転写因子ＮＦ－κＢ由来のｐ６５ドメイン細胞転
写因子（Ruben et al., 1991, Science, 251:1490-93）；タンデムに連結された活性化因
子ＶＰ６４、ｐ６５およびＲｔａ（ＶＰＲ）から構成された、ｄＣａｓ９に融合された三
種エフェクター、Chavez et al., Nat Methods. 2015 Apr;12(4):326-8；またはｐ３００
ＨＡＴドメインに融合され得る。ｐ３００／ＣＢＰはヒストンアセチルトランスフェラ
ーゼ（ＨＡＴ）であって、その機能は哺乳類細胞における遺伝子発現の制御にとって重要
である。ｐ３００ ＨＡＴドメイン（１２８４～１６７３）は触媒的に活性であり、標的
エピゲノム編集用のヌクレアーゼに融合させることができる。Hilton et al., Nat Biote
chnol. 2015 May; 33(5):510-7を参照されたい。
体は、Ｃｐｆ１のＮ末端またはＣ末端で、転写活性化ドメイン（例えば、単純ヘルペスウ
イルスのＶＰ１６ドメイン（Sadowski et al., 1988, Nature, 335:563-564）もしくはＶ
Ｐ６４由来の転写活性化ドメイン；細胞転写因子ＮＦ－κＢ由来のｐ６５ドメイン細胞転
写因子（Ruben et al., 1991, Science, 251:1490-93）；タンデムに連結された活性化因
子ＶＰ６４、ｐ６５およびＲｔａ（ＶＰＲ）から構成された、ｄＣａｓ９に融合された三
種エフェクター、Chavez et al., Nat Methods. 2015 Apr;12(4):326-8；またはｐ３００
ＨＡＴドメインに融合され得る。ｐ３００／ＣＢＰはヒストンアセチルトランスフェラ
ーゼ（ＨＡＴ）であって、その機能は哺乳類細胞における遺伝子発現の制御にとって重要
である。ｐ３００ ＨＡＴドメイン（１２８４～１６７３）は触媒的に活性であり、標的
エピゲノム編集用のヌクレアーゼに融合させることができる。Hilton et al., Nat Biote
chnol. 2015 May; 33(5):510-7を参照されたい。
【0033】
例えば、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）、例えば、Rollins et al., Proc Nat
l Acad Sci USA. 2000 Jun 20; 97(13): 7096-7101を参照；目的のタンパク質がそれぞれ
ＤｍｒＡおよびＤｍｒＣ結合ドメインに融合され、二量化がＡ／Ｃヘテロ二量化剤（ＡＰ
２１９６７）を添加することにより誘導されるＣｌｏｎｔｅｃｈ／Ｔａｋａｒａ製のｉＤ
ＥＶＩＥＲＩＺＥ（商標）誘導性二量化系に基づく、任意の誘導可能なタンパク質二量化
系を使用することができる。また他に、ＣｙＰ－ＦａｓおよびＦＫＣｓＡ二量化剤を用い
るＦＫＢＰ（Belshaw et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of t
he United States of America. 93 (10): 4604-7 (1996)を参照）；ラパマイシン二量化
剤を用いるｍＴＯＲのＦＫＢＰおよびＦＲＢドメイン（Rivera et al., Nature Medicine
. 2 (9): 1028-32 (1996)）；クーママイシン二量化剤を用いるＧｙｒＢドメイン（Farra
r et al., Nature. 383 (6596): 178-81 (1996)）；ジベレリン誘導性二量化（Miyamoto
et al., Nature Chemical Biology. 8 (5): 465-70 (2012)；Miyamoto et al., Nature C
hemical Biology. 8 (5): 465-70 (2012)を参照）；ならびにＨａｌｏＴａｇおよびＳＮ
ＡＰ－ｔａｇに由来の小分子交差結合融合タンパク質に基づくタンパク質ヘテロ二量化系
（Erhart et al., Chemistry and Biology. 20 (4): 549-57 (2013)）などが知られてい
る。
l Acad Sci USA. 2000 Jun 20; 97(13): 7096-7101を参照；目的のタンパク質がそれぞれ
ＤｍｒＡおよびＤｍｒＣ結合ドメインに融合され、二量化がＡ／Ｃヘテロ二量化剤（ＡＰ
２１９６７）を添加することにより誘導されるＣｌｏｎｔｅｃｈ／Ｔａｋａｒａ製のｉＤ
ＥＶＩＥＲＩＺＥ（商標）誘導性二量化系に基づく、任意の誘導可能なタンパク質二量化
系を使用することができる。また他に、ＣｙＰ－ＦａｓおよびＦＫＣｓＡ二量化剤を用い
るＦＫＢＰ（Belshaw et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of t
he United States of America. 93 (10): 4604-7 (1996)を参照）；ラパマイシン二量化
剤を用いるｍＴＯＲのＦＫＢＰおよびＦＲＢドメイン（Rivera et al., Nature Medicine
. 2 (9): 1028-32 (1996)）；クーママイシン二量化剤を用いるＧｙｒＢドメイン（Farra
r et al., Nature. 383 (6596): 178-81 (1996)）；ジベレリン誘導性二量化（Miyamoto
et al., Nature Chemical Biology. 8 (5): 465-70 (2012)；Miyamoto et al., Nature C
hemical Biology. 8 (5): 465-70 (2012)を参照）；ならびにＨａｌｏＴａｇおよびＳＮ
ＡＰ－ｔａｇに由来の小分子交差結合融合タンパク質に基づくタンパク質ヘテロ二量化系
（Erhart et al., Chemistry and Biology. 20 (4): 549-57 (2013)）などが知られてい
る。
【0034】
２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するため、最適に比較する目的で配列をアラ
インする（例えば、最適なアラインメントのためにギャップを第１および第２のアミノ酸
または核酸配列の一方または両方に導入することができ、非相同配列は比較目的において
無視することができる）。比較目的でアラインされた参照配列の長さは、参照配列の長さ
の少なくとも８０％であり、いくつかの実施形態においては、少なくとも９０％または１
００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のヌクレオチドが
比較される。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドによ
って占有されている場合、その分子はその位置で同一である（本明細書で使用される場合
、核酸「同一性」は核酸「相同性」と同等である）。２つの配列間の同一性パーセントは
、それらの配列により共有される同一の位置の数の関数であり、２つの配列の最適なアラ
インメントに導入することが必要とされるギャップの数、およびそれぞれのギャップの長
さを考慮に入れる。２つのポリペプチドまたは核酸配列間の同一性パーセントは、当技術
分野の技能の範囲内の様々な手段において、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフ
トウェア、例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（Smith,T.F. a
nd M.S. Waterman (1981) J Mol Biol 147: 195-7）；ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ Ｐｌｕ
ｓ（商標）に組み込まれた「ＢｅｓｔＦｉｔ」（Smith and Waterman, Advances in Appl
ied Mathematics, 482-489(1981)）、Schwarz and Dayhof (1979) Atlas of Protein Seq
uence and Structure, Dayhof, M.O., Ed, pp 353-358；ＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓ
ｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）；（Altschul, S.F.
, W.Gish, et al. (1990) J Mol Biol 215:403-10）、ＢＬＡＳＴ－２、ＢＬＡＳＴ－Ｐ
、ＢＬＡＳＴ－Ｎ、ＢＬＡＳＴ－Ｘ、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－
２、ＣＬＵＳＴＡＬ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用し
て決定される。さらに、当業者は、比較される配列の長さにわたる最大アラインメントを
達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントの測定に適切な
パラメーターを決定することができる。一般に、タンパク質または核酸については、比較
の長さは、完全長以下の任意の長さ（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、
５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％）であり得る。本組
成物および方法の目的のために、配列の完全長の少なくとも８０％がアラインされる。
インする（例えば、最適なアラインメントのためにギャップを第１および第２のアミノ酸
または核酸配列の一方または両方に導入することができ、非相同配列は比較目的において
無視することができる）。比較目的でアラインされた参照配列の長さは、参照配列の長さ
の少なくとも８０％であり、いくつかの実施形態においては、少なくとも９０％または１
００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のヌクレオチドが
比較される。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドによ
って占有されている場合、その分子はその位置で同一である（本明細書で使用される場合
、核酸「同一性」は核酸「相同性」と同等である）。２つの配列間の同一性パーセントは
、それらの配列により共有される同一の位置の数の関数であり、２つの配列の最適なアラ
インメントに導入することが必要とされるギャップの数、およびそれぞれのギャップの長
さを考慮に入れる。２つのポリペプチドまたは核酸配列間の同一性パーセントは、当技術
分野の技能の範囲内の様々な手段において、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフ
トウェア、例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（Smith,T.F. a
nd M.S. Waterman (1981) J Mol Biol 147: 195-7）；ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ Ｐｌｕ
ｓ（商標）に組み込まれた「ＢｅｓｔＦｉｔ」（Smith and Waterman, Advances in Appl
ied Mathematics, 482-489(1981)）、Schwarz and Dayhof (1979) Atlas of Protein Seq
uence and Structure, Dayhof, M.O., Ed, pp 353-358；ＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓ
ｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）；（Altschul, S.F.
, W.Gish, et al. (1990) J Mol Biol 215:403-10）、ＢＬＡＳＴ－２、ＢＬＡＳＴ－Ｐ
、ＢＬＡＳＴ－Ｎ、ＢＬＡＳＴ－Ｘ、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－
２、ＣＬＵＳＴＡＬ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用し
て決定される。さらに、当業者は、比較される配列の長さにわたる最大アラインメントを
達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントの測定に適切な
パラメーターを決定することができる。一般に、タンパク質または核酸については、比較
の長さは、完全長以下の任意の長さ（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、
５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％）であり得る。本組
成物および方法の目的のために、配列の完全長の少なくとも８０％がアラインされる。
【0035】
本発明の目的のために、２つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、
Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリングマトリックスを、ギャップペナルティ１２、ギャップ
伸長ペナルティ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５で使用して達成すること
ができる。
Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリングマトリックスを、ギャップペナルティ１２、ギャップ
伸長ペナルティ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５で使用して達成すること
ができる。
【0036】
保存的置換としては、典型的には、以下の群：グリシン、アラニン；バリン、イソロイ
シン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、
トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン内の置換が挙げら
れる。
シン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、
トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン内の置換が挙げら
れる。
【0037】
いくつかの実施形態において、変異体は、野生型アミノ酸の代わりにアラニンを有する
。いくつかの実施形態において、変異体は、アルギニンまたはリジン（または天然アミノ
酸）以外の任意のアミノ酸を有する。
。いくつかの実施形態において、変異体は、アルギニンまたはリジン（または天然アミノ
酸）以外の任意のアミノ酸を有する。
【0038】
また本明細書では、任意選択で、変異タンパク質を発現するための１つまたは複数の制
御ドメインに作動可能に連結されている、Ｃｐｆ１融合タンパク質をコードする単離核酸
、その単離核酸を含むベクター、ならびにその核酸を含み、任意選択で変異タンパク質を
発現する宿主細胞、例えば哺乳動物宿主細胞も提供される。
御ドメインに作動可能に連結されている、Ｃｐｆ１融合タンパク質をコードする単離核酸
、その単離核酸を含むベクター、ならびにその核酸を含み、任意選択で変異タンパク質を
発現する宿主細胞、例えば哺乳動物宿主細胞も提供される。
【0039】
本明細書に記載された融合タンパク質は、細胞のゲノムを変更するために使用すること
ができる。本方法は、一般に、細胞において変異タンパク質を、細胞のゲノムの選択部分
に相補的な領域を有するガイドＲＮＡと共に発現させることを含む。細胞のゲノムを選択
的に変更する方法は当技術分野においては公知であり、例えば、米国特許第８，９９３，
２３３号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１８６９５８号明細書；米国特許第９，
０２３，６４９号明細書；国際公開第２０１４／０９９７４４号パンフレット；国際公開
第２０１４／０８９２９０号パンフレット；国際公開第２０１４／１４４５９２号パンフ
レット；国際公開第１４４２８８号パンフレット；国際公開第２０１４／２０４５７８号
パンフレット；国際公開第２０１４／１５２４３２号パンフレット；国際公開第２１１５
／０９９８５０号パンフレット；米国特許第８，６９７，３５９号明細書；米国特許出願
公開第２０１６００２４５２９号明細書；米国特許出願公開第２０１６００２４５２４号
明細書；米国特許出願公開第２０１６００２４５２３号明細書；米国特許出願公開第２０
１６００２４５１０号明細書；米国特許出願公開第２０１６００１７３６６号明細書；米
国特許出願公開第２０１６００１７３０１号明細書；米国特許出願公開第２０１５０３７
６６５２号明細書；米国特許出願公開第２０１５０３５６２３９号明細書；米国特許出願
公開第２０１５０３１５５７６号明細書；米国特許出願公開第２０１５０２９１９６５号
明細書；米国特許出願公開第２０１５０２５２３５８号明細書；米国特許出願公開第２０
１５０２４７１５０号明細書；米国特許出願公開第２０１５０２３２８８３号明細書；米
国特許出願公開第２０１５０２３２８８２号明細書；米国特許出願公開第２０１５０２０
３８７２号明細書；米国特許出願公開第２０１５０１９１７４４号明細書；米国特許出願
公開第２０１５０１８４１３９号明細書；米国特許出願公開第２０１５０１７６０６４号
明細書；米国特許出願公開第２０１５０１６７０００号明細書；米国特許出願公開第２０
１５０１６６９６９号明細書；米国特許出願公開第２０１５０１５９１７５号明細書；米
国特許出願公開第２０１５０１５９１７４号明細書；米国特許出願公開第２０１５００９
３４７３号明細書；米国特許出願公開第２０１５００７９６８１号明細書；米国特許出願
公開第２０１５００６７９２２号明細書；米国特許出願公開第２０１５００５６６２９号
明細書；米国特許出願公開第２０１５００４４７７２号明細書；米国特許出願公開第２０
１５００２４５００号明細書；米国特許出願公開第２０１５００２４４９９号明細書；米
国特許出願公開第２０１５００２０２２３号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３５
６８６７号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２９５５５７号明細書；米国特許出願
公開第２０１４０２７３２３５号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２７３２２６号
明細書；米国特許出願公開第２０１４０２７３０３７号明細書；米国特許出願公開第２０
１４０１８９８９６号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１１３３７６号明細書；米
国特許出願公開第２０１４００９３９４１号明細書；米国特許出願公開第２０１３０３３
０７７８号明細書；米国特許出願公開第２０１３０２８８２５１号明細書；米国特許出願
公開第２０１２００８８６７６号明細書；米国特許出願公開第２０１１０３００５３８号
明細書；米国特許出願公開第２０１１０２３６５３０号明細書；米国特許出願公開第２０
１１０２１７７３９号明細書；米国特許出願公開第２０１１０００２８８９号明細書；米
国特許出願公開第２０１０００７６０５７号明細書；米国特許出願公開第２０１１０１８
９７７６号明細書；米国特許出願公開第２０１１０２２３６３８号明細書；米国特許出願
公開第２０１３０１３０２４８号明細書；米国特許出願公開第２０１５００５０６９９号
明細書；米国特許出願公開第２０１５００７１８９９号明細書；米国特許出願公開第２０
１５００４５５４６号明細書；米国特許出願公開第２０１５００３１１３４号明細書；米
国特許出願公開第２０１５００２４５００号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３７
７８６８号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３５７５３０号明細書；米国特許出願
公開第２０１４０３４９４００号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３３５６２０号
明細書；米国特許出願公開第２０１４０３３５０６３号明細書；米国特許出願公開第２０
１４０３１５９８５号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３１０８３０号明細書；米
国特許出願公開第２０１４０３１０８２８号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３０
９４８７号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３０４８５３号明細書；米国特許出願
公開第２０１４０２９８５４７号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２９５５５６号
明細書；米国特許出願公開第２０１４０２９４７７３号明細書；米国特許出願公開第２０
１４０２８７９３８号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２７３２３４号明細書；米
国特許出願公開第２０１４０２７３２３２号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２７
３２３１号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２７３２３０号明細書；米国特許出願
公開第２０１４０２７１９８７号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２５６０４６号
明細書；米国特許出願公開第２０１４０２４８７０２号明細書；米国特許出願公開第２０
１４０２４２７０２号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２４２７００号明細書；米
国特許出願公開第２０１４０２４２６９９号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２４
２６６４号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２３４９７２号明細書；米国特許出願
公開第２０１４０２２７７８７号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２１２８６９号
明細書；米国特許出願公開第２０１４０２０１８５７号明細書；米国特許出願公開第２０
１４０１９９７６７号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１８９８９６号明細書；米
国特許出願公開第２０１４０１８６９５８号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１８
６９１９号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１８６８４３号明細書；米国特許出願
公開第２０１４０１７９７７０号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１７９００６号
明細書；米国特許出願公開第２０１４０１７０７５３号明細書；国際公開第２００８／１
０８９８９号パンフレット；国際公開第２０１０／０５４１０８号パンフレット；国際公
開第２０１２／１６４５６５号パンフレット；国際公開第２０１３／０９８２４４号パン
フレット；国際公開第２０１３／１７６７７２号パンフレット；Makarova et al., ”Evo
lution and classification of the CRISPR-Cas systems” 9(6) Nature Reviews Microb
iology 467-477 (1-23) (Jun. 2011)；Wiedenheft et al., ”RNA-guided genetic silen
cing systems in bacteria and archaea” 482 Nature 331-338 (Feb. 16, 2012)；Gasiu
nas et al., ”Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavag
e for adaptive immunity in bacteria” 109(39) Proceedings of the National Academ
y of Sciences USA E2579-E2586 (Sep. 4, 2012)；Jinek et al., ”A Programmable Dua
l-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity” 337 Science 816-8
21 (Aug. 17, 2012)；Carroll, ”A CRISPR Approach to Gene Targeting” 20(9) Molec
ular Therapy 1658-1660 (Sep. 2012)；２０１２年５月２５日に出願された米国特許出願
第６１／６５２，０８６号明細書；Al-Attar et al., Clustered Regularly Interspaced
Short Palindromic Repeats (CRISPRs): The Hallmark of an Ingenious Antiviral Def
ense Mechanism in Prokaryotes, Biol Chem. (2011) vol. 392, Issue 4, pp. 277-289
；Hale et al., Essential Features and Rational Design of CRISPR RNAs That Functi
on With the Cas RAMP Module Complex to Cleave RNAs, Molecular Cell, (2012) vol.
45, Issue 3, 292-302を参照されたい。
ができる。本方法は、一般に、細胞において変異タンパク質を、細胞のゲノムの選択部分
に相補的な領域を有するガイドＲＮＡと共に発現させることを含む。細胞のゲノムを選択
的に変更する方法は当技術分野においては公知であり、例えば、米国特許第８，９９３，
２３３号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１８６９５８号明細書；米国特許第９，
０２３，６４９号明細書；国際公開第２０１４／０９９７４４号パンフレット；国際公開
第２０１４／０８９２９０号パンフレット；国際公開第２０１４／１４４５９２号パンフ
レット；国際公開第１４４２８８号パンフレット；国際公開第２０１４／２０４５７８号
パンフレット；国際公開第２０１４／１５２４３２号パンフレット；国際公開第２１１５
／０９９８５０号パンフレット；米国特許第８，６９７，３５９号明細書；米国特許出願
公開第２０１６００２４５２９号明細書；米国特許出願公開第２０１６００２４５２４号
明細書；米国特許出願公開第２０１６００２４５２３号明細書；米国特許出願公開第２０
１６００２４５１０号明細書；米国特許出願公開第２０１６００１７３６６号明細書；米
国特許出願公開第２０１６００１７３０１号明細書；米国特許出願公開第２０１５０３７
６６５２号明細書；米国特許出願公開第２０１５０３５６２３９号明細書；米国特許出願
公開第２０１５０３１５５７６号明細書；米国特許出願公開第２０１５０２９１９６５号
明細書；米国特許出願公開第２０１５０２５２３５８号明細書；米国特許出願公開第２０
１５０２４７１５０号明細書；米国特許出願公開第２０１５０２３２８８３号明細書；米
国特許出願公開第２０１５０２３２８８２号明細書；米国特許出願公開第２０１５０２０
３８７２号明細書；米国特許出願公開第２０１５０１９１７４４号明細書；米国特許出願
公開第２０１５０１８４１３９号明細書；米国特許出願公開第２０１５０１７６０６４号
明細書；米国特許出願公開第２０１５０１６７０００号明細書；米国特許出願公開第２０
１５０１６６９６９号明細書；米国特許出願公開第２０１５０１５９１７５号明細書；米
国特許出願公開第２０１５０１５９１７４号明細書；米国特許出願公開第２０１５００９
３４７３号明細書；米国特許出願公開第２０１５００７９６８１号明細書；米国特許出願
公開第２０１５００６７９２２号明細書；米国特許出願公開第２０１５００５６６２９号
明細書；米国特許出願公開第２０１５００４４７７２号明細書；米国特許出願公開第２０
１５００２４５００号明細書；米国特許出願公開第２０１５００２４４９９号明細書；米
国特許出願公開第２０１５００２０２２３号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３５
６８６７号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２９５５５７号明細書；米国特許出願
公開第２０１４０２７３２３５号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２７３２２６号
明細書；米国特許出願公開第２０１４０２７３０３７号明細書；米国特許出願公開第２０
１４０１８９８９６号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１１３３７６号明細書；米
国特許出願公開第２０１４００９３９４１号明細書；米国特許出願公開第２０１３０３３
０７７８号明細書；米国特許出願公開第２０１３０２８８２５１号明細書；米国特許出願
公開第２０１２００８８６７６号明細書；米国特許出願公開第２０１１０３００５３８号
明細書；米国特許出願公開第２０１１０２３６５３０号明細書；米国特許出願公開第２０
１１０２１７７３９号明細書；米国特許出願公開第２０１１０００２８８９号明細書；米
国特許出願公開第２０１０００７６０５７号明細書；米国特許出願公開第２０１１０１８
９７７６号明細書；米国特許出願公開第２０１１０２２３６３８号明細書；米国特許出願
公開第２０１３０１３０２４８号明細書；米国特許出願公開第２０１５００５０６９９号
明細書；米国特許出願公開第２０１５００７１８９９号明細書；米国特許出願公開第２０
１５００４５５４６号明細書；米国特許出願公開第２０１５００３１１３４号明細書；米
国特許出願公開第２０１５００２４５００号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３７
７８６８号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３５７５３０号明細書；米国特許出願
公開第２０１４０３４９４００号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３３５６２０号
明細書；米国特許出願公開第２０１４０３３５０６３号明細書；米国特許出願公開第２０
１４０３１５９８５号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３１０８３０号明細書；米
国特許出願公開第２０１４０３１０８２８号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３０
９４８７号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３０４８５３号明細書；米国特許出願
公開第２０１４０２９８５４７号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２９５５５６号
明細書；米国特許出願公開第２０１４０２９４７７３号明細書；米国特許出願公開第２０
１４０２８７９３８号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２７３２３４号明細書；米
国特許出願公開第２０１４０２７３２３２号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２７
３２３１号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２７３２３０号明細書；米国特許出願
公開第２０１４０２７１９８７号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２５６０４６号
明細書；米国特許出願公開第２０１４０２４８７０２号明細書；米国特許出願公開第２０
１４０２４２７０２号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２４２７００号明細書；米
国特許出願公開第２０１４０２４２６９９号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２４
２６６４号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２３４９７２号明細書；米国特許出願
公開第２０１４０２２７７８７号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２１２８６９号
明細書；米国特許出願公開第２０１４０２０１８５７号明細書；米国特許出願公開第２０
１４０１９９７６７号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１８９８９６号明細書；米
国特許出願公開第２０１４０１８６９５８号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１８
６９１９号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１８６８４３号明細書；米国特許出願
公開第２０１４０１７９７７０号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１７９００６号
明細書；米国特許出願公開第２０１４０１７０７５３号明細書；国際公開第２００８／１
０８９８９号パンフレット；国際公開第２０１０／０５４１０８号パンフレット；国際公
開第２０１２／１６４５６５号パンフレット；国際公開第２０１３／０９８２４４号パン
フレット；国際公開第２０１３／１７６７７２号パンフレット；Makarova et al., ”Evo
lution and classification of the CRISPR-Cas systems” 9(6) Nature Reviews Microb
iology 467-477 (1-23) (Jun. 2011)；Wiedenheft et al., ”RNA-guided genetic silen
cing systems in bacteria and archaea” 482 Nature 331-338 (Feb. 16, 2012)；Gasiu
nas et al., ”Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavag
e for adaptive immunity in bacteria” 109(39) Proceedings of the National Academ
y of Sciences USA E2579-E2586 (Sep. 4, 2012)；Jinek et al., ”A Programmable Dua
l-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity” 337 Science 816-8
21 (Aug. 17, 2012)；Carroll, ”A CRISPR Approach to Gene Targeting” 20(9) Molec
ular Therapy 1658-1660 (Sep. 2012)；２０１２年５月２５日に出願された米国特許出願
第６１／６５２，０８６号明細書；Al-Attar et al., Clustered Regularly Interspaced
Short Palindromic Repeats (CRISPRs): The Hallmark of an Ingenious Antiviral Def
ense Mechanism in Prokaryotes, Biol Chem. (2011) vol. 392, Issue 4, pp. 277-289
；Hale et al., Essential Features and Rational Design of CRISPR RNAs That Functi
on With the Cas RAMP Module Complex to Cleave RNAs, Molecular Cell, (2012) vol.
45, Issue 3, 292-302を参照されたい。
【0040】
本明細書に記載の融合タンパク質は、前述の参照文献に記載されたＣａｓ９またはＣｐ
ｆ１タンパク質のいずれかに代えて、もしくはそれらに加えて、またはそれらに記載され
た類似の変異体との組合せで、選択されたＣｐｆ１に適切なガイドＲＮＡと共に、すなわ
ち選択された配列を標的とするガイドＲＮＡと共に、使用することができる。
ｆ１タンパク質のいずれかに代えて、もしくはそれらに加えて、またはそれらに記載され
た類似の変異体との組合せで、選択されたＣｐｆ１に適切なガイドＲＮＡと共に、すなわ
ち選択された配列を標的とするガイドＲＮＡと共に、使用することができる。
【0041】
さらに、本明細書に記載の融合タンパク質は、当技術分野において公知の野生型Ｃａｓ
９、Ｃｐｆ１、または他のＣａｓ９もしくはＣｐｆ１変異体（例えばｄＣｐｆ１またはＣ
ｐｆ１ニッカーゼ）、例えば、米国特許第８，９９３，２３３号明細書；米国特許出願公
開第２０１４０１８６９５８号明細書；米国特許第９，０２３，６４９号明細書；国際公
開第２０１４／０９９７４４号パンフレット；国際公開第２０１４／０８９２９０号パン
フレット；国際公開第２０１４／１４４５９２号パンフレット；国際公開第１４４２８８
号パンフレット；国際公開第２０１４／２０４５７８号パンフレット；国際公開第２０１
４／１５２４３２号パンフレット；国際公開第２１１５／０９９８５０号パンフレット；
米国特許第８，６９７，３５９号明細書；米国特許出願公開第２０１０／００７６０５７
号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０１８９７７６号明細書；米国特許出願公開第
２０１１／０２２３６３８号明細書；米国特許出願公開第２０１３／０１３０２４８号明
細書；国際公開第２００８／１０８９８９号パンフレット；国際公開第２０１０／０５４
１０８号パンフレット；国際公開第２０１２／１６４５６５号パンフレット；国際公開第
２０１３／０９８２４４号パンフレット；国際公開第２０１３／１７６７７２号パンフレ
ット；米国特許出願公開第２０１５００５０６９９号明細書；米国特許出願公開第２０１
５００７１８９９号明細書、および国際公開第２０１４／１２４２８４号パンフレットに
記載されているような異種機能性ドメインを有する融合タンパク質に代えて使用すること
ができる。
９、Ｃｐｆ１、または他のＣａｓ９もしくはＣｐｆ１変異体（例えばｄＣｐｆ１またはＣ
ｐｆ１ニッカーゼ）、例えば、米国特許第８，９９３，２３３号明細書；米国特許出願公
開第２０１４０１８６９５８号明細書；米国特許第９，０２３，６４９号明細書；国際公
開第２０１４／０９９７４４号パンフレット；国際公開第２０１４／０８９２９０号パン
フレット；国際公開第２０１４／１４４５９２号パンフレット；国際公開第１４４２８８
号パンフレット；国際公開第２０１４／２０４５７８号パンフレット；国際公開第２０１
４／１５２４３２号パンフレット；国際公開第２１１５／０９９８５０号パンフレット；
米国特許第８，６９７，３５９号明細書；米国特許出願公開第２０１０／００７６０５７
号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０１８９７７６号明細書；米国特許出願公開第
２０１１／０２２３６３８号明細書；米国特許出願公開第２０１３／０１３０２４８号明
細書；国際公開第２００８／１０８９８９号パンフレット；国際公開第２０１０／０５４
１０８号パンフレット；国際公開第２０１２／１６４５６５号パンフレット；国際公開第
２０１３／０９８２４４号パンフレット；国際公開第２０１３／１７６７７２号パンフレ
ット；米国特許出願公開第２０１５００５０６９９号明細書；米国特許出願公開第２０１
５００７１８９９号明細書、および国際公開第２０１４／１２４２８４号パンフレットに
記載されているような異種機能性ドメインを有する融合タンパク質に代えて使用すること
ができる。
【0042】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、Ｃｐｆ１変異体と異種機能性ドメイ
ンの間にリンカーを含む。これらの融合タンパク質で（または連結構造の融合タンパク質
間で）使用することができるリンカーは、融合タンパク質の機能を妨げない任意の配列を
含み得る。好ましい実施形態において、リンカーは短く、例えば、２～２０アミノ酸であ
り、典型的には、フレキシブルである（すなわち、自由度の高いアミノ酸、例えばグリシ
ン、アラニン、およびセリンを含む）。いくつかの実施形態において、リンカーは、ＧＧ
ＧＳ（配列番号３）またはＧＧＧＧＳ（配列番号４）からなる１つまたは複数の単位、例
えば、ＧＧＧＳ（配列番号３）またはＧＧＧＧＳ（配列番号４）単位の２、３、４つ、ま
たはそれより多いリピートを含む。また、他のリンカー配列も使用することができる。
ンの間にリンカーを含む。これらの融合タンパク質で（または連結構造の融合タンパク質
間で）使用することができるリンカーは、融合タンパク質の機能を妨げない任意の配列を
含み得る。好ましい実施形態において、リンカーは短く、例えば、２～２０アミノ酸であ
り、典型的には、フレキシブルである（すなわち、自由度の高いアミノ酸、例えばグリシ
ン、アラニン、およびセリンを含む）。いくつかの実施形態において、リンカーは、ＧＧ
ＧＳ（配列番号３）またはＧＧＧＧＳ（配列番号４）からなる１つまたは複数の単位、例
えば、ＧＧＧＳ（配列番号３）またはＧＧＧＧＳ（配列番号４）単位の２、３、４つ、ま
たはそれより多いリピートを含む。また、他のリンカー配列も使用することができる。
【0043】
いくつかの実施形態において、変異タンパク質は、細胞内空間への送達を促進する細胞
透過性ペプチド配列、例えば、ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、ペネトラチン、トランスポー
タン、またはｈＣＴ由来細胞透過性ペプチドを含み、例えば、Caron et al., (2001) Mol
Ther. 3(3):310-8；Langel, Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications
(CRC Press, Boca Raton FL 2002)；El-Andaloussi et al., (2005) Curr Pharm Des. 1
1(28):3597-611；およびDeshayes et al., (2005) Cell Mol Life Sci. 62(16):1839-49
を参照されたい。
透過性ペプチド配列、例えば、ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、ペネトラチン、トランスポー
タン、またはｈＣＴ由来細胞透過性ペプチドを含み、例えば、Caron et al., (2001) Mol
Ther. 3(3):310-8；Langel, Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications
(CRC Press, Boca Raton FL 2002)；El-Andaloussi et al., (2005) Curr Pharm Des. 1
1(28):3597-611；およびDeshayes et al., (2005) Cell Mol Life Sci. 62(16):1839-49
を参照されたい。
【0044】
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、細胞膜を通過して細胞質または他の細胞小器官、例
えば、ミトコンドリアおよび核への広範囲の生体分子移動を促進する短鎖ペプチドである
。ＣＰＰにより送達することができる分子の例としては、治療薬、プラスミドＤＮＡ、オ
リゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、タンパク質、ペプチド、ナノ
粒子、およびリポソームが挙げられる。ＣＰＰは、一般に、３０アミノ酸以下であり、天
然または非天然のタンパク質またはキメラ配列に由来し、相対存在量の高い正荷電アミノ
酸、例えばリジンもしくはアルギニン、または交互パターンの極性および非極性アミノ酸
のいずれかを含有する。当技術分野において一般に使用されるＣＰＰとしては、Ｔａｔ（
Frankel et al., (1988) Cell. 55:1189-1193、Vives et al., (1997) J. Biol. Chem. 2
72:16010-16017）、ペネトラチン（Derossi et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:10444-
10450）、ポリアルギニンペプチド配列（Wender et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 97:13003-13008、Futaki et al., (2001) J. Biol. Chem. 276:5836-5840）、およ
びトランスポータン（Pooga et al., (1998) Nat. Biotechnol. 16:857-861）が挙げられ
る。
えば、ミトコンドリアおよび核への広範囲の生体分子移動を促進する短鎖ペプチドである
。ＣＰＰにより送達することができる分子の例としては、治療薬、プラスミドＤＮＡ、オ
リゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、タンパク質、ペプチド、ナノ
粒子、およびリポソームが挙げられる。ＣＰＰは、一般に、３０アミノ酸以下であり、天
然または非天然のタンパク質またはキメラ配列に由来し、相対存在量の高い正荷電アミノ
酸、例えばリジンもしくはアルギニン、または交互パターンの極性および非極性アミノ酸
のいずれかを含有する。当技術分野において一般に使用されるＣＰＰとしては、Ｔａｔ（
Frankel et al., (1988) Cell. 55:1189-1193、Vives et al., (1997) J. Biol. Chem. 2
72:16010-16017）、ペネトラチン（Derossi et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:10444-
10450）、ポリアルギニンペプチド配列（Wender et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 97:13003-13008、Futaki et al., (2001) J. Biol. Chem. 276:5836-5840）、およ
びトランスポータン（Pooga et al., (1998) Nat. Biotechnol. 16:857-861）が挙げられ
る。
【0045】
ＣＰＰは、共有または非共有結合手段によってそれらのカーゴと結合させることができ
る。ＣＰＰおよびそのカーゴを共有結合させる方法は当技術分野においては公知であり、
例えば、化学的架橋（Stetsenko et al., (2000) J. Org. Chem. 65:4900-4909、Gait et
al. (2003) Cell. Mol. Life. Sci. 60:844-853）または融合タンパク質のクローニング
（Nagahara et al., (1998) Nat. Med. 4:1449-1453）である。カーゴと、極性および非
極性ドメインを含む短鎖両親媒性ＣＰＰとの間の非共有結合のカップリングは、静電およ
び疎水性相互作用を介して確立される。
る。ＣＰＰおよびそのカーゴを共有結合させる方法は当技術分野においては公知であり、
例えば、化学的架橋（Stetsenko et al., (2000) J. Org. Chem. 65:4900-4909、Gait et
al. (2003) Cell. Mol. Life. Sci. 60:844-853）または融合タンパク質のクローニング
（Nagahara et al., (1998) Nat. Med. 4:1449-1453）である。カーゴと、極性および非
極性ドメインを含む短鎖両親媒性ＣＰＰとの間の非共有結合のカップリングは、静電およ
び疎水性相互作用を介して確立される。
【0046】
ＣＰＰは、当技術分野において、治療上の可能性のある生体分子を細胞に送達するため
に利用されてきた。例としては、免疫抑制のためのポリアルギニンに結合されたシクロス
ポリン（Rothbard et al., (2000) Nature Medicine 6(11):1253-1257）、腫瘍形成を阻
害するためのＭＰＧと呼ばれるＣＰＰに結合されたサイクリンＢ１に対するｓｉＲＮＡ（
Crombez et al., (2007) Biochem Soc. Trans. 35:44-46）、がん細胞増殖を低減させる
ためのＣＰＰに結合された腫瘍抑制因子ｐ５３ペプチド（Takenobu et al., (2002) Mol.
Cancer Ther. 1(12):1043-1049、Snyder et al., (2004) PLoS Biol. 2:E36）、および
喘息を治療するためのＴａｔに融合されたＲａｓまたはホスホイノシトール３キナーゼ（
ＰＩ３Ｋ）のドミナントネガティブ型（Myou et al., (2003) J. Immunol. 171:4399-440
5）が挙げられる。
に利用されてきた。例としては、免疫抑制のためのポリアルギニンに結合されたシクロス
ポリン（Rothbard et al., (2000) Nature Medicine 6(11):1253-1257）、腫瘍形成を阻
害するためのＭＰＧと呼ばれるＣＰＰに結合されたサイクリンＢ１に対するｓｉＲＮＡ（
Crombez et al., (2007) Biochem Soc. Trans. 35:44-46）、がん細胞増殖を低減させる
ためのＣＰＰに結合された腫瘍抑制因子ｐ５３ペプチド（Takenobu et al., (2002) Mol.
Cancer Ther. 1(12):1043-1049、Snyder et al., (2004) PLoS Biol. 2:E36）、および
喘息を治療するためのＴａｔに融合されたＲａｓまたはホスホイノシトール３キナーゼ（
ＰＩ３Ｋ）のドミナントネガティブ型（Myou et al., (2003) J. Immunol. 171:4399-440
5）が挙げられる。
【0047】
ＣＰＰは、当技術分野において、画像化およびバイオセンシングに適用するため造影剤
の細胞への輸送に利用されてきた。例えば、Ｔａｔに付着されている緑色蛍光タンパク質
（ＧＦＰ）は、がん細胞の標識に使用されてきた（Shokolenko et al., (2005) DNA Repa
ir 4(4):511-518）。量子ドットにコンジュゲートされているＴａｔは、ラット脳の可視
化において血液脳関門をうまく通過させるために使用されてきた（Santra et al., (2005
) Chem. Commun. 3144-3146）。またＣＰＰは、細胞画像化において磁気共鳴画像化技術
と組み合わせることができる（Liu et al., (2006) Biochem. and Biophys. Res. Comm.
347(1):133-140）。また、Ramsey and Flynn, Pharmacol Ther. 2015 Jul 22. pii: S016
3-7258 (15) 00141-2も参照されたい。
の細胞への輸送に利用されてきた。例えば、Ｔａｔに付着されている緑色蛍光タンパク質
（ＧＦＰ）は、がん細胞の標識に使用されてきた（Shokolenko et al., (2005) DNA Repa
ir 4(4):511-518）。量子ドットにコンジュゲートされているＴａｔは、ラット脳の可視
化において血液脳関門をうまく通過させるために使用されてきた（Santra et al., (2005
) Chem. Commun. 3144-3146）。またＣＰＰは、細胞画像化において磁気共鳴画像化技術
と組み合わせることができる（Liu et al., (2006) Biochem. and Biophys. Res. Comm.
347(1):133-140）。また、Ramsey and Flynn, Pharmacol Ther. 2015 Jul 22. pii: S016
3-7258 (15) 00141-2も参照されたい。
【0048】
その代わりに、またはそれに加えて、変異タンパク質は、核局在化配列、例えば、ＳＶ
４０ラージＴ抗原ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号５））およびヌクレオプラスミンＮ
ＬＳ（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号６））を含むことができる。他のＮ
ＬＳは、当技術分野において公知である。例えば、Cokol et al., EMBO Rep. 2000 Nov 1
5; 1(5): 411-415；Freitas and Cunha, Curr Genomics. 2009 Dec; 10(8): 550-557を参
照されたい。
４０ラージＴ抗原ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号５））およびヌクレオプラスミンＮ
ＬＳ（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号６））を含むことができる。他のＮ
ＬＳは、当技術分野において公知である。例えば、Cokol et al., EMBO Rep. 2000 Nov 1
5; 1(5): 411-415；Freitas and Cunha, Curr Genomics. 2009 Dec; 10(8): 550-557を参
照されたい。
【0049】
いくつかの実施形態において、変異体は、リガンドに対して高い親和性を有する部分、
例えば、ＧＳＴ、ＦＬＡＧ、またはヘキサヒスチジン配列を含む。そのような親和性タグ
は、組換え変異タンパク質の精製を促進することができる。
例えば、ＧＳＴ、ＦＬＡＧ、またはヘキサヒスチジン配列を含む。そのような親和性タグ
は、組換え変異タンパク質の精製を促進することができる。
【0050】
変異タンパク質を細胞に送達する方法については、タンパク質は、当技術分野において
公知の任意の方法を使用して、例えば、変異タンパク質をコードする核酸からのインビト
ロ翻訳、または適切な宿主細胞における発現により産生することができる。タンパク質産
生については、当技術分野において多数の方法が公知である。例えば、タンパク質は、酵
母、大腸菌（E.coli）、昆虫細胞系、植物、トランスジェニック動物、または培養哺乳動
物細胞中で産生され、精製することができる。例えば、Palomares et al., ”Production
of Recombinant Proteins: Challenges and Solutions,” Methods Mol Biol. 2004;267
:15-52を参照されたい。さらに、変異タンパク質は、細胞中への導入を容易にする成分、
例えば、脂質ナノ粒子に、任意選択でタンパク質が細胞内に存在したら切断されるリンカ
ーと共に結合させることができる。例えば、LaFountaine et al., Int J Pharm. 2015 Au
g 13; 494(1):180-194を参照されたい。
公知の任意の方法を使用して、例えば、変異タンパク質をコードする核酸からのインビト
ロ翻訳、または適切な宿主細胞における発現により産生することができる。タンパク質産
生については、当技術分野において多数の方法が公知である。例えば、タンパク質は、酵
母、大腸菌（E.coli）、昆虫細胞系、植物、トランスジェニック動物、または培養哺乳動
物細胞中で産生され、精製することができる。例えば、Palomares et al., ”Production
of Recombinant Proteins: Challenges and Solutions,” Methods Mol Biol. 2004;267
:15-52を参照されたい。さらに、変異タンパク質は、細胞中への導入を容易にする成分、
例えば、脂質ナノ粒子に、任意選択でタンパク質が細胞内に存在したら切断されるリンカ
ーと共に結合させることができる。例えば、LaFountaine et al., Int J Pharm. 2015 Au
g 13; 494(1):180-194を参照されたい。
【0051】
発現系
本明細書に記載のＣｐｆ１融合タンパク質を使用するため、それらをコードする核酸か
らそれらを発現させることが望ましい場合がある。これは、様々な方法で実施することが
できる。例えば、Ｃｐｆ１融合タンパク質をコードする核酸を、複製および／または発現
用の原核細胞または真核細胞へ形質転換するための中間ベクターにクローニングすること
ができる。中間ベクターは、典型的には、Ｃｐｆ１融合タンパク質を産生するＣｐｆ１融
合タンパク質をコードする核酸を貯蔵または操作するための原核生物ベクター、例えば、
プラスミド、もしくはシャトルベクター、または昆虫ベクターである。またＣｐｆ１融合
タンパク質をコードする核酸は、植物細胞、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞またはヒ
ト細胞、真菌細胞、細菌細胞、または原虫細胞に投与するための発現ベクターにクローニ
ングすることもできる。
本明細書に記載のＣｐｆ１融合タンパク質を使用するため、それらをコードする核酸か
らそれらを発現させることが望ましい場合がある。これは、様々な方法で実施することが
できる。例えば、Ｃｐｆ１融合タンパク質をコードする核酸を、複製および／または発現
用の原核細胞または真核細胞へ形質転換するための中間ベクターにクローニングすること
ができる。中間ベクターは、典型的には、Ｃｐｆ１融合タンパク質を産生するＣｐｆ１融
合タンパク質をコードする核酸を貯蔵または操作するための原核生物ベクター、例えば、
プラスミド、もしくはシャトルベクター、または昆虫ベクターである。またＣｐｆ１融合
タンパク質をコードする核酸は、植物細胞、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞またはヒ
ト細胞、真菌細胞、細菌細胞、または原虫細胞に投与するための発現ベクターにクローニ
ングすることもできる。
【0052】
発現を得るため、Ｃｐｆ１融合タンパク質をコードする配列は、典型的には、転写を指
示するプロモーターを含有する発現ベクターにサブクローニングされる。適切な細菌およ
び真核生物のプロモーターは、当技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al
., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed. 2001)；Kriegler, Gene Transfer
and Expression: A Laboratory Manual (1990)；およびCurrent Protocols in Molecula
r Biology (Ausubel et al., eds., 2010)に開示されている。遺伝子操作したタンパク質
を発現させるための細菌発現系は、例えば、大腸菌（E.coli）、バチルス属種（Bacillus
sp.）、およびサルモネラ（Salmonella）において利用可能である（Palva et al., 1983
, Gene 22:229-235）。そのような発現系用のキットは市販されている。哺乳動物細胞、
酵母、および昆虫細胞のための真核生物発現系も当技術分野において周知であって、それ
らも市販されている。
示するプロモーターを含有する発現ベクターにサブクローニングされる。適切な細菌およ
び真核生物のプロモーターは、当技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al
., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed. 2001)；Kriegler, Gene Transfer
and Expression: A Laboratory Manual (1990)；およびCurrent Protocols in Molecula
r Biology (Ausubel et al., eds., 2010)に開示されている。遺伝子操作したタンパク質
を発現させるための細菌発現系は、例えば、大腸菌（E.coli）、バチルス属種（Bacillus
sp.）、およびサルモネラ（Salmonella）において利用可能である（Palva et al., 1983
, Gene 22:229-235）。そのような発現系用のキットは市販されている。哺乳動物細胞、
酵母、および昆虫細胞のための真核生物発現系も当技術分野において周知であって、それ
らも市販されている。
【0053】
核酸の発現の指示に使用されるプロモーターは、特定の適用に依存する。例えば、強力
な構成的プロモーターは、典型的には、融合タンパク質の発現および精製に使用される。
対照的に、Ｃｐｆ１融合タンパク質が遺伝子制御のためにインビボ投与される場合、Ｃｐ
ｆ１融合タンパク質の特定の使用に応じて、構成的プロモーターまたは誘導性プロモータ
ーのいずれかを使用することができる。さらに、Ｃｐｆ１融合タンパク質の投与に対する
好ましいプロモーターは、弱いプロモーター、例えば、ＨＳＶ ＴＫまたは類似の活性を
有するプロモーターであり得る。またプロモーターは、トランス活性化に応答性のエレメ
ント、例えば、低酸素応答エレメント、Ｇａｌ４応答エレメント、ｌａｃリプレッサー応
答エレメント、ならびに小分子制御系、例えばテトラサイクリン制御系およびＲＵ－４８
６系を含み得る（例えば、Gossen & Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:55
47；Oligino et al., 1998, Gene Ther., 5:491-496；Wang et al., 1997, Gene Ther.,
4:432-441；Neering et al., 1996, Blood, 88:1147-55；およびRendahl et al., 1998,
Nat. Biotechnol., 16:757-761を参照されたい）。
な構成的プロモーターは、典型的には、融合タンパク質の発現および精製に使用される。
対照的に、Ｃｐｆ１融合タンパク質が遺伝子制御のためにインビボ投与される場合、Ｃｐ
ｆ１融合タンパク質の特定の使用に応じて、構成的プロモーターまたは誘導性プロモータ
ーのいずれかを使用することができる。さらに、Ｃｐｆ１融合タンパク質の投与に対する
好ましいプロモーターは、弱いプロモーター、例えば、ＨＳＶ ＴＫまたは類似の活性を
有するプロモーターであり得る。またプロモーターは、トランス活性化に応答性のエレメ
ント、例えば、低酸素応答エレメント、Ｇａｌ４応答エレメント、ｌａｃリプレッサー応
答エレメント、ならびに小分子制御系、例えばテトラサイクリン制御系およびＲＵ－４８
６系を含み得る（例えば、Gossen & Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:55
47；Oligino et al., 1998, Gene Ther., 5:491-496；Wang et al., 1997, Gene Ther.,
4:432-441；Neering et al., 1996, Blood, 88:1147-55；およびRendahl et al., 1998,
Nat. Biotechnol., 16:757-761を参照されたい）。
【0054】
プロモーターに加えて、発現ベクターは、典型的には、原核生物または真核生物のいず
れかの宿主細胞における核酸の発現に必要とされるすべての追加のエレメントを含有する
転写単位または発現カセットを含む。したがって、典型的な発現カセットは、例えば、Ｃ
ｐｆ１融合タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に結合されたプロモーター、およ
び、例えば、転写産物の効率的なポリアデニル化、転写終止、リボソーム結合部位、また
は翻訳終止に必要とされる任意のシグナルを含有する。カセットの追加エレメントとして
は、例えば、エンハンサー、および異種スプライシングイントロンシグナルを挙げること
ができる。
れかの宿主細胞における核酸の発現に必要とされるすべての追加のエレメントを含有する
転写単位または発現カセットを含む。したがって、典型的な発現カセットは、例えば、Ｃ
ｐｆ１融合タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に結合されたプロモーター、およ
び、例えば、転写産物の効率的なポリアデニル化、転写終止、リボソーム結合部位、また
は翻訳終止に必要とされる任意のシグナルを含有する。カセットの追加エレメントとして
は、例えば、エンハンサー、および異種スプライシングイントロンシグナルを挙げること
ができる。
【0055】
遺伝子情報の細胞への輸送に使用される特定の発現ベクターは、Ｃｐｆ１融合タンパク
質の目的とする使用、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原生動物などにおける発現に関
して選択される。標準的な細菌発現ベクターとしては、プラスミド、例えばｐＢＲ３２２
ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ、ならびに市販のタグ融合発現系、例えば
ＧＳＴおよびＬａｃＺが挙げられる。
質の目的とする使用、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原生動物などにおける発現に関
して選択される。標準的な細菌発現ベクターとしては、プラスミド、例えばｐＢＲ３２２
ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ、ならびに市販のタグ融合発現系、例えば
ＧＳＴおよびＬａｃＺが挙げられる。
【0056】
真核生物ウイルス由来の制御エレメントを含有する発現ベクターは、多くの場合、真核
細胞発現ベクター、例えばＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプ
スタイン・バーウイルス由来のベクターで使用される。他の例示的な真核生物ベクターと
しては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ－５、バ
キュロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモータ
ー、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫
ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞における発現に有効
であることが示された他のプロモーターの指示下でタンパク質を発現させることができる
他の任意のベクターが挙げられる。
細胞発現ベクター、例えばＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプ
スタイン・バーウイルス由来のベクターで使用される。他の例示的な真核生物ベクターと
しては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ－５、バ
キュロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモータ
ー、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫
ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞における発現に有効
であることが示された他のプロモーターの指示下でタンパク質を発現させることができる
他の任意のベクターが挙げられる。
【0057】
Ｃｐｆ１融合タンパク質を発現させるためのベクターは、ガイドＲＮＡの発現を駆動す
るＲＮＡ ＰｏｌＩＩＩプロモーター、例えば、Ｈ１、Ｕ６または７ＳＫプロモーターを
含み得る。これらのヒトプロモーターは、プラスミドのトランスフェクション後に哺乳動
物細胞においてＣｐｆ１融合タンパク質を発現させることができる。
るＲＮＡ ＰｏｌＩＩＩプロモーター、例えば、Ｈ１、Ｕ６または７ＳＫプロモーターを
含み得る。これらのヒトプロモーターは、プラスミドのトランスフェクション後に哺乳動
物細胞においてＣｐｆ１融合タンパク質を発現させることができる。
【0058】
いくつかの実施形態において、例えば以下のような、複数のＣｐｆ１ ｇＲＮＡをコー
ドする単一核酸が使用される。
ドする単一核酸が使用される。
【0059】
【化3】
【0060】
ｈＵ６プロモーターは上記において太字で示されている。
【0061】
Ｌｂ ｃｒＲＮＡの直列反復配列は、ＡＡＴＴＴＣＴＡＣＴＡＡＧＴＧＴＡＧＡＴ（配
列番号３８、上記において斜体で示されている）である。Ｃｐｆ１を標的遺伝子に方向付
ける１７～２０ｎｔ（好ましくは２０）のスペーサー配列は、スペーサー配列１、２、ま
たは３として示されている。
列番号３８、上記において斜体で示されている）である。Ｃｐｆ１を標的遺伝子に方向付
ける１７～２０ｎｔ（好ましくは２０）のスペーサー配列は、スペーサー配列１、２、ま
たは３として示されている。
【0062】
いくつかの発現系は、安定的にトランスフェクトされた細胞系を選択するためのマーカ
ー、例えば、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、および
ジヒドロ葉酸レダクターゼを有する。また高収率の発現系は、例えば、バキュロウイルス
ベクターを昆虫細胞において、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイ
ルスプロモーターの指示下でｇＲＮＡコード配列と共に使用するのに適切である。
ー、例えば、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、および
ジヒドロ葉酸レダクターゼを有する。また高収率の発現系は、例えば、バキュロウイルス
ベクターを昆虫細胞において、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイ
ルスプロモーターの指示下でｇＲＮＡコード配列と共に使用するのに適切である。
【0063】
また、発現ベクターに典型的に含まれるエレメントとしては、大腸菌（E.coli）で機能
するレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌を選択することができる抗生物質耐性
をコードする遺伝子、および組換え配列を挿入することができるプラスミドの非必須領域
中の特有の制限部位が挙げられる。
するレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌を選択することができる抗生物質耐性
をコードする遺伝子、および組換え配列を挿入することができるプラスミドの非必須領域
中の特有の制限部位が挙げられる。
【0064】
標準的なトランスフェクション方法を使用して、多量のタンパク質を発現する細菌、哺
乳動物、酵母または昆虫の細胞系を産生し、次いでそのタンパク質を標準的な技術を使用
して精製する（例えば、Colley et al., 1989, J. Biol. Chem., 264:17619-22；Guide t
o Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990
)を参照されたい）。真核細胞および原核細胞の形質転換は、標準的な技術に従って実施
される（例えば、Morrison, 1977, J. Bacteriol. 132:349-351；Clark-Curtiss & Curti
ss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983)を参照されたい）。
乳動物、酵母または昆虫の細胞系を産生し、次いでそのタンパク質を標準的な技術を使用
して精製する（例えば、Colley et al., 1989, J. Biol. Chem., 264:17619-22；Guide t
o Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990
)を参照されたい）。真核細胞および原核細胞の形質転換は、標準的な技術に従って実施
される（例えば、Morrison, 1977, J. Bacteriol. 132:349-351；Clark-Curtiss & Curti
ss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983)を参照されたい）。
【0065】
宿主細胞内に外来ヌクレオチド配列を導入するためのいずれかの公知の手順を使用する
ことができる。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロ
トプラスト融合、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポソーム、マイク
ロインジェクション、ネイキッドＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター、エピ
ソーム型および組込み型の両方、ならびにクローン化ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮ
Ａまたは他の外来遺伝子材料を宿主細胞内に導入する他の周知の方法のいずれかの使用が
含まれる（例えば、Sambrook et al.、前掲を参照されたい）。使用される特定の遺伝子
操作手順には、Ｃｐｆ１変異体を発現し得る宿主細胞に少なくとも１つの遺伝子をうまく
導入され得ることが唯一必要なことである。
ことができる。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロ
トプラスト融合、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポソーム、マイク
ロインジェクション、ネイキッドＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター、エピ
ソーム型および組込み型の両方、ならびにクローン化ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮ
Ａまたは他の外来遺伝子材料を宿主細胞内に導入する他の周知の方法のいずれかの使用が
含まれる（例えば、Sambrook et al.、前掲を参照されたい）。使用される特定の遺伝子
操作手順には、Ｃｐｆ１変異体を発現し得る宿主細胞に少なくとも１つの遺伝子をうまく
導入され得ることが唯一必要なことである。
【0066】
また本発明は、ベクター、ベクターを含む細胞、ならびに融合タンパク質を発現する細
胞およびトランスジェニック動物を含む。
胞およびトランスジェニック動物を含む。
【実施例0067】
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、それらは特許請求の範囲に記載され
ている本発明の範囲を限定しない。
ている本発明の範囲を限定しない。
【0068】
方法
以下の材料および方法を下記の実施例において使用した。
以下の材料および方法を下記の実施例において使用した。
【0069】
プラスミドおよびオリゴヌクレオチド。
この研究において使用されたプラスミドおよび関連配列のリストは、以下の配列の項目
で確認される；ＬｂＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡの情報は表１にある。
この研究において使用されたプラスミドおよび関連配列のリストは、以下の配列の項目
で確認される；ＬｂＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡの情報は表１にある。
【0070】
【表2】
【0071】
ｄＬｂＣｐｆ１－ｐ６５およびｄＬｂＣｐｆ１－ＶＰＲプラスミド（それぞれ、ＪＧ１
２０２およびＪＧ１２１１）は、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを介してＢｓｔＺ１７Ｉ部位お
よびＮｏｔＩ部位を使用し、ｐ６５およびＶＰＲをｄＬｂＣｐｆ１（ＭＭＷ１５７８）に
クローニングすることにより構築した。ＶＰＲは、Ｇｅｏｒｇｅ Ｃｈｕｒｃｈから寄贈
されたＳＰ－ｄＣａｓ９－ＶＰＲから増幅した（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号６３７９
８）４６。ｄＬｂＣｐｆ１－ＤｍｒＡ（Ｘ１）からｄＬｂＣｐｆ１－ＤｍｒＡ（×４）（
それぞれ、ＪＧ６７４、ＪＧ６７６、ＪＧ６９３およびＹＥＴ１０００）は、Ｇｉｂｓｏ
ｎクローニング法を使用して、異なる数のＤｍｒＡドメインを有するＡｇｅＩおよびＸｈ
ｏＩで消化された構築物（それぞれ、ｄＣａｓ９－ＤｍｒＡ（×４）からｄＣａｓ９－Ｄ
ｍｒＡ（×４）についてＢＰＫ１０１９、ＢＰＫ１０３３、ＢＰＫ１１４０、ＢＰＫ１１
７９）にｄＬｂＣｐｆ１を挿入することによって作製した。ＤｍｒＣをコードする前述の
プラスミドをＮｒｕｌで消化し、ｐ６５またはＶＰＲをＧ４Ｓ－リンカーを共にＧｉｂｓ
ｏｎアセンブリを介してＤｍｒＣ－Ｐ６５（ＢＰＫ１１６９）およびＤｍｒＣ－ＶＰＲ（
ＭＭＷ９４８）に対して加えた。単一ｃｒＲＮＡプラスミドを構築するため、ｃｒＲＮＡ
スペーサーのオリゴヌクレオチド対をアニールし、ＢｓｍＢＩで消化したＬｂＣｐｆ１
ｃｒＲＮＡバックボーンプラスミド、ＢＰＫ３０８２（Ａｄｄｇｅｎｅ番号７８７４２）
１４に連結した。この研究で使用した多重化ｃｒＲＮＡをクローニングするため、３対の
オリゴヌクレオチドを、オーバーハングを有するように設計した。各オリゴヌクレオチド
対をＴ４ ＰＮＫの存在下でアニーリングし、３つのすべてのオリゴ対を、ＢｓｍＢＩお
よびＨｉｎｄＩＩＩで消化したＬｂＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡバックボーンプラスミドＢＰＫ
３０８２に一反応で連結させる。すべてのオリゴ対についての配列を表２Ａ～Ｂに挙げる
。
２０２およびＪＧ１２１１）は、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを介してＢｓｔＺ１７Ｉ部位お
よびＮｏｔＩ部位を使用し、ｐ６５およびＶＰＲをｄＬｂＣｐｆ１（ＭＭＷ１５７８）に
クローニングすることにより構築した。ＶＰＲは、Ｇｅｏｒｇｅ Ｃｈｕｒｃｈから寄贈
されたＳＰ－ｄＣａｓ９－ＶＰＲから増幅した（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号６３７９
８）４６。ｄＬｂＣｐｆ１－ＤｍｒＡ（Ｘ１）からｄＬｂＣｐｆ１－ＤｍｒＡ（×４）（
それぞれ、ＪＧ６７４、ＪＧ６７６、ＪＧ６９３およびＹＥＴ１０００）は、Ｇｉｂｓｏ
ｎクローニング法を使用して、異なる数のＤｍｒＡドメインを有するＡｇｅＩおよびＸｈ
ｏＩで消化された構築物（それぞれ、ｄＣａｓ９－ＤｍｒＡ（×４）からｄＣａｓ９－Ｄ
ｍｒＡ（×４）についてＢＰＫ１０１９、ＢＰＫ１０３３、ＢＰＫ１１４０、ＢＰＫ１１
７９）にｄＬｂＣｐｆ１を挿入することによって作製した。ＤｍｒＣをコードする前述の
プラスミドをＮｒｕｌで消化し、ｐ６５またはＶＰＲをＧ４Ｓ－リンカーを共にＧｉｂｓ
ｏｎアセンブリを介してＤｍｒＣ－Ｐ６５（ＢＰＫ１１６９）およびＤｍｒＣ－ＶＰＲ（
ＭＭＷ９４８）に対して加えた。単一ｃｒＲＮＡプラスミドを構築するため、ｃｒＲＮＡ
スペーサーのオリゴヌクレオチド対をアニールし、ＢｓｍＢＩで消化したＬｂＣｐｆ１
ｃｒＲＮＡバックボーンプラスミド、ＢＰＫ３０８２（Ａｄｄｇｅｎｅ番号７８７４２）
１４に連結した。この研究で使用した多重化ｃｒＲＮＡをクローニングするため、３対の
オリゴヌクレオチドを、オーバーハングを有するように設計した。各オリゴヌクレオチド
対をＴ４ ＰＮＫの存在下でアニーリングし、３つのすべてのオリゴ対を、ＢｓｍＢＩお
よびＨｉｎｄＩＩＩで消化したＬｂＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡバックボーンプラスミドＢＰＫ
３０８２に一反応で連結させる。すべてのオリゴ対についての配列を表２Ａ～Ｂに挙げる
。
【0072】
【表3】
【0073】
【表4】
【0074】
ヒト細胞培養およびトランスフェクション。
ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎仔血清ならびに１％ペニシリンおよびストレプトマ
イシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、３７℃、５％ＣＯ２で増殖
させた。７５０ｎｇのｄＬｂＣｐｆ１－ｐ６５／ＶＰＲを２５０ｎｇのＬｂＣｐｆ１ ｃ
ｒＲＮＡと共に、３ｕｌのＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－ＬＴ１トランスフェクション試
薬（Ｍｉｎｉｓ、カタログ番号ＭＩＲ２３００）を使用して、１２ウェルプレート中のＨ
ＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクトした。異なる数のＤｍｒＡと融合させた４００ｎ
ｇのｄＬｂＣｐｆ１、２００ｎｇのＤｍｒＣ－ｐ６５／ＶＰＲ、および４００ｎｇのＬｂ
Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡを、３ｕｌのＬＴ－１を使用して、１２ウェルプレート中のＨＥＫ
２９３細胞に同時トランスフェクトした。
ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎仔血清ならびに１％ペニシリンおよびストレプトマ
イシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、３７℃、５％ＣＯ２で増殖
させた。７５０ｎｇのｄＬｂＣｐｆ１－ｐ６５／ＶＰＲを２５０ｎｇのＬｂＣｐｆ１ ｃ
ｒＲＮＡと共に、３ｕｌのＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－ＬＴ１トランスフェクション試
薬（Ｍｉｎｉｓ、カタログ番号ＭＩＲ２３００）を使用して、１２ウェルプレート中のＨ
ＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクトした。異なる数のＤｍｒＡと融合させた４００ｎ
ｇのｄＬｂＣｐｆ１、２００ｎｇのＤｍｒＣ－ｐ６５／ＶＰＲ、および４００ｎｇのＬｂ
Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡを、３ｕｌのＬＴ－１を使用して、１２ウェルプレート中のＨＥＫ
２９３細胞に同時トランスフェクトした。
【0075】
逆転写定量的ＰＣＲ。
全ＲＮＡをトランスフェクション７２時間後のトランスフェクトされた細胞からＮｕｃ
ｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ Ｐｌｕｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号７４０
９８４．２５０）を使用して抽出し、２５０ｎｇの精製ＲＮＡを、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃ
ｉｔｙ ＲＮＡ－ｃＤＮＡキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号４３８７４
０６）を使用するｃＤＮＡ合成に使用した。ｃＤＮＡを１：２０に希釈し、３ｕｌのｃＤ
ＮＡを定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に使用した。ｑＰＣＲ反応の試料は、ｃＤＮＡ、ＳＹＢ
Ｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号４３８５６１２）、および各標的転写産物
を検出するプライマーを使用して調製した。プライマー配列は表３に示す。ｑＰＣＲは、
Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０を使用して実施した。Ｃｔ値は超低発現転写
産物について変動するので、Ｃｔ値が３５を超える場合、本発明者らはそれらを３５と見
なした。ＬｂＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡバックボーンプラスミドのＢＰＫ３０８２でトランス
フェクトした試料を陰性対照として使用し、陰性対照に対する活性化倍数レベルをＨＰＲ
Ｔ１の発現に対して正規化した。
全ＲＮＡをトランスフェクション７２時間後のトランスフェクトされた細胞からＮｕｃ
ｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ Ｐｌｕｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号７４０
９８４．２５０）を使用して抽出し、２５０ｎｇの精製ＲＮＡを、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃ
ｉｔｙ ＲＮＡ－ｃＤＮＡキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号４３８７４
０６）を使用するｃＤＮＡ合成に使用した。ｃＤＮＡを１：２０に希釈し、３ｕｌのｃＤ
ＮＡを定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に使用した。ｑＰＣＲ反応の試料は、ｃＤＮＡ、ＳＹＢ
Ｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号４３８５６１２）、および各標的転写産物
を検出するプライマーを使用して調製した。プライマー配列は表３に示す。ｑＰＣＲは、
Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０を使用して実施した。Ｃｔ値は超低発現転写
産物について変動するので、Ｃｔ値が３５を超える場合、本発明者らはそれらを３５と見
なした。ＬｂＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡバックボーンプラスミドのＢＰＫ３０８２でトランス
フェクトした試料を陰性対照として使用し、陰性対照に対する活性化倍数レベルをＨＰＲ
Ｔ１の発現に対して正規化した。
【0076】
【表5】
【0077】
[実施例１]
個々のｃｒＲＮＡをｄＬｂＣｐｆ１ベースの活性化因子と共に使用する標的化ヒト内因
性遺伝子制御
個々のｃｒＲＮＡをｄＬｂＣｐｆ１ベースの活性化因子と共に使用する標的化ヒト内因
性遺伝子制御
【0078】
最初の実験において、本発明者らは、触媒的に不活性なＣｐｆ１ヌクレアーゼの転写活
性化ドメインへのダイレクト融合体（図１Ａ）が内因性ヒト遺伝子プロモーターを活性化
することができるか否かについて試験した。本発明者らは、各プロモーターに対し３つの
ｃｒＲＮＡを設計することによって、ヒトＨＥＫ２９３細胞において発現しない３つの異
なる内因性遺伝子（ＨＢＢ、ＡＲ、およびＮＰＹ１Ｒ）のプロモーターを標的とした（表
２Ａ～Ｂを参照されたい）。本発明者らは、ラクノスピラ科細菌（Lachnospiraceae bact
erium）ＮＤ２００６由来のＣｐｆ１の触媒的に不活性なヌクレアーゼ－デッドバージョ
ン（ｄＬｂＣｐｆ１）を使用した。その理由は、ヒト細胞において活性であることが報告
されている他のＣｐｆ１ヌクレアーゼ（アシドアミノコックス属種（Acidaminococcus sp
.）ＢＶ３Ｌ６由来のＡｓＣｐｆ１）１４、３６、４４と比較して、これがより高いヌク
レアーゼ活性を有することが本発明者ら他により示されたからである。９つの別個のｃｒ
ＲＮＡを用いて試験した単一ヒトＮＦ－ＫＢ ｐ６５活性化ドメインへのｄＬｂＣｐｆ１
融合は、３つのヒト遺伝子標的プロモーターからの転写を増加させなかいか、わずかに増
加させただけであり（図１Ｂ）、ｄＳｐＣａｓ９への単一活性化ドメインの融合に関する
以前に公表された結果と一致している４６。対照的に、合成多量体化ＶＰＲ活性化因子（
ウイルス系のＶＰ１６活性化因子の４つのコピー、ヒトＮＦ－ＫＢ ｐ６５活性化ドメイ
ン、およびエプスタイン・バーウイルスＲトランス活性化因子Ｒｔａから構成される）へ
のｄＬｂＣｐｆ１融合は、３つのそれぞれの標的遺伝子に対して少なくとも１つのｃｒＲ
ＮＡで転写を活性化することができる（図１Ｂ）。この結果は、標的遺伝子プロモーター
活性の効率的なアップレギュレーションを達成するために複数の転写活性化ドメインを動
員する必要性を実証した、ｄＳｐＣａｓ９活性化因子を用いた以前の実験と類似している
４６、４７。
性化ドメインへのダイレクト融合体（図１Ａ）が内因性ヒト遺伝子プロモーターを活性化
することができるか否かについて試験した。本発明者らは、各プロモーターに対し３つの
ｃｒＲＮＡを設計することによって、ヒトＨＥＫ２９３細胞において発現しない３つの異
なる内因性遺伝子（ＨＢＢ、ＡＲ、およびＮＰＹ１Ｒ）のプロモーターを標的とした（表
２Ａ～Ｂを参照されたい）。本発明者らは、ラクノスピラ科細菌（Lachnospiraceae bact
erium）ＮＤ２００６由来のＣｐｆ１の触媒的に不活性なヌクレアーゼ－デッドバージョ
ン（ｄＬｂＣｐｆ１）を使用した。その理由は、ヒト細胞において活性であることが報告
されている他のＣｐｆ１ヌクレアーゼ（アシドアミノコックス属種（Acidaminococcus sp
.）ＢＶ３Ｌ６由来のＡｓＣｐｆ１）１４、３６、４４と比較して、これがより高いヌク
レアーゼ活性を有することが本発明者ら他により示されたからである。９つの別個のｃｒ
ＲＮＡを用いて試験した単一ヒトＮＦ－ＫＢ ｐ６５活性化ドメインへのｄＬｂＣｐｆ１
融合は、３つのヒト遺伝子標的プロモーターからの転写を増加させなかいか、わずかに増
加させただけであり（図１Ｂ）、ｄＳｐＣａｓ９への単一活性化ドメインの融合に関する
以前に公表された結果と一致している４６。対照的に、合成多量体化ＶＰＲ活性化因子（
ウイルス系のＶＰ１６活性化因子の４つのコピー、ヒトＮＦ－ＫＢ ｐ６５活性化ドメイ
ン、およびエプスタイン・バーウイルスＲトランス活性化因子Ｒｔａから構成される）へ
のｄＬｂＣｐｆ１融合は、３つのそれぞれの標的遺伝子に対して少なくとも１つのｃｒＲ
ＮＡで転写を活性化することができる（図１Ｂ）。この結果は、標的遺伝子プロモーター
活性の効率的なアップレギュレーションを達成するために複数の転写活性化ドメインを動
員する必要性を実証した、ｄＳｐＣａｓ９活性化因子を用いた以前の実験と類似している
４６、４７。
【0079】
また、本発明者らは、細胞表面タンパク質をコードする２つの追加の内因性遺伝子ＣＤ
５およびＣＤ２２のＴＳＳの１ｋｂ上流または５００ｂｐ下流内に配置されたより大きな
一連の３２のｃｒＲＮＡを試験した。試験した３２のｃｒＲＮＡの大部分は、ＴＳＳの約
６００ｂｐ上流と約４００ｂｐ下流の間に配置された場合、標的遺伝子プロモーターを有
意に活性化することができ（図１Ｃ）、ｄＳｐＣａｓ９活性化因子を使用して得られた結
果と一致する３。ｄＬｂＣｐｆ１ベースの活性化因子で観察された活性化のレベルは、天
然の生物系で観察され得るレベルに匹敵し、また類似のｄＣａｓ９ベースの活性化因子に
関して以前に報告されているレベルと同等である５。
５およびＣＤ２２のＴＳＳの１ｋｂ上流または５００ｂｐ下流内に配置されたより大きな
一連の３２のｃｒＲＮＡを試験した。試験した３２のｃｒＲＮＡの大部分は、ＴＳＳの約
６００ｂｐ上流と約４００ｂｐ下流の間に配置された場合、標的遺伝子プロモーターを有
意に活性化することができ（図１Ｃ）、ｄＳｐＣａｓ９活性化因子を使用して得られた結
果と一致する３。ｄＬｂＣｐｆ１ベースの活性化因子で観察された活性化のレベルは、天
然の生物系で観察され得るレベルに匹敵し、また類似のｄＣａｓ９ベースの活性化因子に
関して以前に報告されているレベルと同等である５。
【0080】
次に、本発明者らは、化学的に誘導可能な２部から構成されるｄＬｂＣｐｆ１ベースの
転写活性化因子を開発しようと試みた。本発明者らは、それぞれＤｍｒＡドメインおよび
ＤｍｒＣドメインとして知られるＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）およびＦＫＢＰ
－ラパマイシン結合タンパク質（ＦＲＢ）の断片の二量化系を使用することを構想したが
、これらドメインはＡ／Ｃヘテロ二量化剤４８として知られているラパマイシン類似体の
存在下でのみ、ｄＬｂＣｐｆ１活性化因子をＡ／Ｃ薬物の存在下で構築し得る２つの部分
に分割するよう相互作用する（図１Ｄ）。ＮＦ－ＫＢ ｐ６５またはＶＰＲのいずれかと
融合したＤｍｒＣドメインと一緒に単一のＤｍｒＡドメインに融合したｄＬｂＣｐｆ１は
、これらのプロモーターでダイレクトｄＬｂＣｐｆ１活性化因子融合体と効果的に作用す
るいずれかの単一ｃｒＲＮＡと共にＨＢＢ、ＡＲまたはＮＰＹＩＲ遺伝子の転写を活性化
することはできなかった（図１Ｅ）。本発明者らは、ｄＬｂＣｐｆ１に連結されたＤｍｒ
Ａドメインの数を増やすことによって遺伝子活性化の効率を増加させることができる可能
性があると推論し、２、３、または４つのＤｍｒＡドメインを保有する融合体を構築した
。単一ｃｒＲＮＡを伴うＤｍｒＣ－ＶＰＲとのこれらの融合の試験から、３つの内因性遺
伝子プロモーターのうち２つでの活性化が示され（ＨＢＢおよびＮＰＹ１Ｒ；図ＩＥ）、
数多くのＤｍｒＡドメインで効果が増大したことが観察され、最大レベルはダイレクトｄ
ＬｂＣｐｆ１－ＶＰＲ融合体で観察されたレベルの半分に達した。この活性化の最大レベ
ルは、Ａ／Ｃヘテロ二量化薬の存在に依存していたが（図１Ｅ）、このことはこの系が薬
物誘導性であることを示唆している。
転写活性化因子を開発しようと試みた。本発明者らは、それぞれＤｍｒＡドメインおよび
ＤｍｒＣドメインとして知られるＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）およびＦＫＢＰ
－ラパマイシン結合タンパク質（ＦＲＢ）の断片の二量化系を使用することを構想したが
、これらドメインはＡ／Ｃヘテロ二量化剤４８として知られているラパマイシン類似体の
存在下でのみ、ｄＬｂＣｐｆ１活性化因子をＡ／Ｃ薬物の存在下で構築し得る２つの部分
に分割するよう相互作用する（図１Ｄ）。ＮＦ－ＫＢ ｐ６５またはＶＰＲのいずれかと
融合したＤｍｒＣドメインと一緒に単一のＤｍｒＡドメインに融合したｄＬｂＣｐｆ１は
、これらのプロモーターでダイレクトｄＬｂＣｐｆ１活性化因子融合体と効果的に作用す
るいずれかの単一ｃｒＲＮＡと共にＨＢＢ、ＡＲまたはＮＰＹＩＲ遺伝子の転写を活性化
することはできなかった（図１Ｅ）。本発明者らは、ｄＬｂＣｐｆ１に連結されたＤｍｒ
Ａドメインの数を増やすことによって遺伝子活性化の効率を増加させることができる可能
性があると推論し、２、３、または４つのＤｍｒＡドメインを保有する融合体を構築した
。単一ｃｒＲＮＡを伴うＤｍｒＣ－ＶＰＲとのこれらの融合の試験から、３つの内因性遺
伝子プロモーターのうち２つでの活性化が示され（ＨＢＢおよびＮＰＹ１Ｒ；図ＩＥ）、
数多くのＤｍｒＡドメインで効果が増大したことが観察され、最大レベルはダイレクトｄ
ＬｂＣｐｆ１－ＶＰＲ融合体で観察されたレベルの半分に達した。この活性化の最大レベ
ルは、Ａ／Ｃヘテロ二量化薬の存在に依存していたが（図１Ｅ）、このことはこの系が薬
物誘導性であることを示唆している。
【0081】
驚いたことに、これらのＤｍｒＣ－ｐ６５を伴うｄＬｂＣｐｆ１融合体は、単一ｃｒＲ
ＮＡを使用して、３つの標的遺伝子プロモーターすべてから転写を強力に活性化すること
ができたが（図１Ｅ）、同じｃｒＲＮＡを用いたダイレクトｄＬｂＣｐｆ１－ｐ６５融合
体では、活性化が欠如することが観察される予期せぬ知見を得た（図１Ｂ）。ＡＲプロモ
ーターについては、ＤｍｒＣ－ｐ６５は、ＤｍｒＣ－ＶＰＲによる効果の欠如と比べて、
転写を約２５倍まで活性化することができる。ＨＢＢおよびＮＰＹＩＲプロモーターにつ
いては、ＤｍｒＣ－ｐ６５で観察された活性化レベルは、ＤｍｒＣ－ＶＰＲで得られた活
性化レベルよりも若干低いが（それぞれ約５０％および約３０％）、しかし依然として定
数項では強力である（約２０倍および約１０倍の活性化）。ＤｍｒＣ－ｐ６５融合体によ
る最大活性化は、これもＡ／Ｃヘテロ二量化薬の存在に依存した。総合すると、これらの
知見は、ｐ６５が、薬物誘導性ｄＬｂＣｐｆ１活性化因子プラットフォームにおいてＶＰ
Ｒに対する重要な選択肢を提供し得ることを示唆している。
ＮＡを使用して、３つの標的遺伝子プロモーターすべてから転写を強力に活性化すること
ができたが（図１Ｅ）、同じｃｒＲＮＡを用いたダイレクトｄＬｂＣｐｆ１－ｐ６５融合
体では、活性化が欠如することが観察される予期せぬ知見を得た（図１Ｂ）。ＡＲプロモ
ーターについては、ＤｍｒＣ－ｐ６５は、ＤｍｒＣ－ＶＰＲによる効果の欠如と比べて、
転写を約２５倍まで活性化することができる。ＨＢＢおよびＮＰＹＩＲプロモーターにつ
いては、ＤｍｒＣ－ｐ６５で観察された活性化レベルは、ＤｍｒＣ－ＶＰＲで得られた活
性化レベルよりも若干低いが（それぞれ約５０％および約３０％）、しかし依然として定
数項では強力である（約２０倍および約１０倍の活性化）。ＤｍｒＣ－ｐ６５融合体によ
る最大活性化は、これもＡ／Ｃヘテロ二量化薬の存在に依存した。総合すると、これらの
知見は、ｐ６５が、薬物誘導性ｄＬｂＣｐｆ１活性化因子プラットフォームにおいてＶＰ
Ｒに対する重要な選択肢を提供し得ることを示唆している。
【0082】
[実施例２]
ｄＬｂＣｐｆ１ベースの活性化因子による内因性ヒト遺伝子の多重および相乗的制御
ｄＬｂＣｐｆ１ベースの活性化因子による内因性ヒト遺伝子の多重および相乗的制御
【0083】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼと比較したＣｐｆ１ヌクレアーゼの主な利点は、多重適用のため
の複数のガイドＲＮＡをより容易に発現できる能力である。これまでの研究では、Ｕ６プ
ロモーターによって駆動される単一転写産物にコードされている複数のｃｒＲＮＡがＣｐ
ｆ１自体によって個々のｃｒＲＮＡにプロセッシングされ（図２Ａ）、変異原性ゲノム編
集イベントの多重誘導を可能にすることが示されている４９。本発明者らは、ｄＬｂＣｐ
ｆ１ベースの系を使用して、３つの異なる内在性ヒト遺伝子が、既にそれぞれｄＬｂＣｐ
ｆ１ベースの活性化因子と共に活性され、単一転写産物上にすべてがコードされているこ
とが示されている３つのｃｒＲＮＡを用いて活性化できるかどうかを試験した（図２Ｂ）
。これらの多重ｃｒＲＮＡ転写産物の試験によれば、ｄＬｂＣｐｆ１－ＶＰＲダイレクト
融合体、ｄＬｂＣｐｆ１－ＤｍｒＡ（×４）およびＤｍｒＣ－ＶＰＲの融合体、ｄＬｂＣ
ｐｆ１－ＤｍｒＡ（×４）およびＤｍｒＣ－ｐ６５の融合体と一緒にこれらを使用して、
ヒトＨＥＫ２９３細胞における複数の内因性遺伝子プロモーターの転写活性化を媒介する
ことができることが明らかになった（図２Ｃ）。多重ｃｒＲＮＡで観察された活性化の程
度は、単一ｃｒＲＮＡの発現で観察された活性化よりも若干低かった（約１８～５５％）
。この違いについての可能性のある１つの説明は、ｄＬｂＣｐｆ１融合タンパク質への結
合に対する大きな競合によるものであり、推定で３倍高いレベルのｃｒＲＮＡが多重転写
産物を発現する細胞に存在するためであり得る。それにもかかわらず、これらの結果は、
ｄＬｂＣｐｆ１ベースの活性化因子を用いて複数の遺伝子標的の転写を活性化するために
、より大きな多重転写産物にコードされている３つものｃｒＲＮＡを使用することができ
ることを示唆している。
の複数のガイドＲＮＡをより容易に発現できる能力である。これまでの研究では、Ｕ６プ
ロモーターによって駆動される単一転写産物にコードされている複数のｃｒＲＮＡがＣｐ
ｆ１自体によって個々のｃｒＲＮＡにプロセッシングされ（図２Ａ）、変異原性ゲノム編
集イベントの多重誘導を可能にすることが示されている４９。本発明者らは、ｄＬｂＣｐ
ｆ１ベースの系を使用して、３つの異なる内在性ヒト遺伝子が、既にそれぞれｄＬｂＣｐ
ｆ１ベースの活性化因子と共に活性され、単一転写産物上にすべてがコードされているこ
とが示されている３つのｃｒＲＮＡを用いて活性化できるかどうかを試験した（図２Ｂ）
。これらの多重ｃｒＲＮＡ転写産物の試験によれば、ｄＬｂＣｐｆ１－ＶＰＲダイレクト
融合体、ｄＬｂＣｐｆ１－ＤｍｒＡ（×４）およびＤｍｒＣ－ＶＰＲの融合体、ｄＬｂＣ
ｐｆ１－ＤｍｒＡ（×４）およびＤｍｒＣ－ｐ６５の融合体と一緒にこれらを使用して、
ヒトＨＥＫ２９３細胞における複数の内因性遺伝子プロモーターの転写活性化を媒介する
ことができることが明らかになった（図２Ｃ）。多重ｃｒＲＮＡで観察された活性化の程
度は、単一ｃｒＲＮＡの発現で観察された活性化よりも若干低かった（約１８～５５％）
。この違いについての可能性のある１つの説明は、ｄＬｂＣｐｆ１融合タンパク質への結
合に対する大きな競合によるものであり、推定で３倍高いレベルのｃｒＲＮＡが多重転写
産物を発現する細胞に存在するためであり得る。それにもかかわらず、これらの結果は、
ｄＬｂＣｐｆ１ベースの活性化因子を用いて複数の遺伝子標的の転写を活性化するために
、より大きな多重転写産物にコードされている３つものｃｒＲＮＡを使用することができ
ることを示唆している。
【0084】
また本発明者らの知見を別のヒト細胞株に拡大するため、本発明者らは、ヒトＵ２０Ｓ
細胞においてダイレクトＶＰＲ活性化因子融合体と薬物制御ＶＰＲおよびｐ６５活性化因
子も試験し、ＭＳＴ ｃｒＲＮＡおよび単一ｃｒＲＮＡで同じ遺伝子（ＨＢＢ、ＡＲ、お
よびＮＰＹ１Ｒ）を標的とした（図２Ｄ）。本発明者らは、ＨＢＢおよびＮＰＹ１Ｒが高
度にアップレギュレートされること、ならびにＤｍｒＣ－ｐ６５によるＨＢＢの活性化が
ＨＥＫ２９３よりもさらに大きいことを観察した。本発明者らは、ＡＲ遺伝子の活性化は
観察しなかったが、それはそのベースライン発現がＵ２０Ｓ細胞において既に高く上昇し
ていたからである（ベースの適量的ＲＴ－ＰＣＲ Ｃｔ値は約２８である）。単独でまた
はＭＳＴで発現されたｃｒＲＮＡの効果の相対的な差異は、本発明者らがＨＥＫ２９３で
観察したものと類似していた。
細胞においてダイレクトＶＰＲ活性化因子融合体と薬物制御ＶＰＲおよびｐ６５活性化因
子も試験し、ＭＳＴ ｃｒＲＮＡおよび単一ｃｒＲＮＡで同じ遺伝子（ＨＢＢ、ＡＲ、お
よびＮＰＹ１Ｒ）を標的とした（図２Ｄ）。本発明者らは、ＨＢＢおよびＮＰＹ１Ｒが高
度にアップレギュレートされること、ならびにＤｍｒＣ－ｐ６５によるＨＢＢの活性化が
ＨＥＫ２９３よりもさらに大きいことを観察した。本発明者らは、ＡＲ遺伝子の活性化は
観察しなかったが、それはそのベースライン発現がＵ２０Ｓ細胞において既に高く上昇し
ていたからである（ベースの適量的ＲＴ－ＰＣＲ Ｃｔ値は約２８である）。単独でまた
はＭＳＴで発現されたｃｒＲＮＡの効果の相対的な差異は、本発明者らがＨＥＫ２９３で
観察したものと類似していた。
【0085】
また本発明者らは、単一の構築物から発現された複数のｃｒＲＮＡが同一細胞において
実際に活性であるかどうかを判定することを試みた。本発明者らの実験は発現ベクターの
一時的なトランスフェクションにより細胞集団で実施されるので、本発明者らが上記で観
察した多重遺伝子活性化は、形式的には、トランスフェクト細胞集団内の異なる細胞にお
いて異なるｃｒＲＮＡが活性化されることによる可能性がある。この可能性を排除するた
め、本発明者らは、同じ遺伝子プロモーター内の部位に対して設計された多重ｃｒＲＮＡ
が単一細胞内の同じ転写産物から発現される場合、これは標的遺伝子プロモーターからの
転写で相乗的増加に結びつくものと推論した（図２Ｅ）（相乗的活性化は、相加効果また
は同じプロモーターに対する２つ以上の活性化因子の作用よりも大きいものと定義される
２）。ＶＰＲのｄＬｂＣｐｆ１へのダイレクト融合体により、本発明者らは、本発明者ら
が試験した３つの内因性遺伝子プロモーターのうちの２つについて、単一転写産物におい
て発現された３つのｃｒＲＮＡを使用して相乗的活性化を観察した（ＨＢＢおよびＡＲ；
図２Ｆ）。第３の遺伝子プロモーター（ＮＰＹ１Ｒ）については、本発明者らは、同じ転
写産物から発現された場合、３つのｃｒＲＮＡによる相乗的な活性化は観察しなかったが
、同時に導入された個別のＲＮＡとして発現された場合の対照実験において相乗効果が確
認された（図２Ｆ）。また本発明者らは、同じ転写産物または個別の転写産物のいずれか
から発現された３つのｃｒＲＮＡを用いた場合、３つの遺伝子のいずれにおいても、ｐ６
５のｄＬｂＣｐｆ１へのダイレクト融合体による相乗的活性化は観察されなかった（図２
Ｆ）。薬物誘導性のｄＬｂＣｐｆ１とＶＰＲ活性化因子系では、本発明者らは、ＮＰＢ１
Ｒプロモーターで個別に発現された転写産物とのみ、ＨＢＢおよびＡＲプロモーターで相
乗効果を観察した（図２Ｇ）。同様の結果パターンは、薬物誘導性のＬｂＣｐｆ１とｐ６
５系で観察された（図２Ｇ）。重要なことには、ＨＢＢ遺伝子およびＡＲ遺伝子上のｐ６
５活性化ドメインで観察された相乗的活性化レベルもまた、ＶＰＲ活性化因子で実施され
た同等の実験よりも高かった（図２Ｇ）。総合すると、複数の活性ｃｒＲＮＡは、複数の
個別の発現ベクターから発現される場合よりも若干活性は低いものの、同じ細胞で単一転
写産物から発現され得ると本発明者らは結論付けた。
実際に活性であるかどうかを判定することを試みた。本発明者らの実験は発現ベクターの
一時的なトランスフェクションにより細胞集団で実施されるので、本発明者らが上記で観
察した多重遺伝子活性化は、形式的には、トランスフェクト細胞集団内の異なる細胞にお
いて異なるｃｒＲＮＡが活性化されることによる可能性がある。この可能性を排除するた
め、本発明者らは、同じ遺伝子プロモーター内の部位に対して設計された多重ｃｒＲＮＡ
が単一細胞内の同じ転写産物から発現される場合、これは標的遺伝子プロモーターからの
転写で相乗的増加に結びつくものと推論した（図２Ｅ）（相乗的活性化は、相加効果また
は同じプロモーターに対する２つ以上の活性化因子の作用よりも大きいものと定義される
２）。ＶＰＲのｄＬｂＣｐｆ１へのダイレクト融合体により、本発明者らは、本発明者ら
が試験した３つの内因性遺伝子プロモーターのうちの２つについて、単一転写産物におい
て発現された３つのｃｒＲＮＡを使用して相乗的活性化を観察した（ＨＢＢおよびＡＲ；
図２Ｆ）。第３の遺伝子プロモーター（ＮＰＹ１Ｒ）については、本発明者らは、同じ転
写産物から発現された場合、３つのｃｒＲＮＡによる相乗的な活性化は観察しなかったが
、同時に導入された個別のＲＮＡとして発現された場合の対照実験において相乗効果が確
認された（図２Ｆ）。また本発明者らは、同じ転写産物または個別の転写産物のいずれか
から発現された３つのｃｒＲＮＡを用いた場合、３つの遺伝子のいずれにおいても、ｐ６
５のｄＬｂＣｐｆ１へのダイレクト融合体による相乗的活性化は観察されなかった（図２
Ｆ）。薬物誘導性のｄＬｂＣｐｆ１とＶＰＲ活性化因子系では、本発明者らは、ＮＰＢ１
Ｒプロモーターで個別に発現された転写産物とのみ、ＨＢＢおよびＡＲプロモーターで相
乗効果を観察した（図２Ｇ）。同様の結果パターンは、薬物誘導性のＬｂＣｐｆ１とｐ６
５系で観察された（図２Ｇ）。重要なことには、ＨＢＢ遺伝子およびＡＲ遺伝子上のｐ６
５活性化ドメインで観察された相乗的活性化レベルもまた、ＶＰＲ活性化因子で実施され
た同等の実験よりも高かった（図２Ｇ）。総合すると、複数の活性ｃｒＲＮＡは、複数の
個別の発現ベクターから発現される場合よりも若干活性は低いものの、同じ細胞で単一転
写産物から発現され得ると本発明者らは結論付けた。
【0086】
さらに、本発明者らは、Ａ／Ｃヘテロ二量化剤の添加および中止に対する活性化因子効
果の動態を評価した。本発明者らは、ＨＢＢ遺伝子およびＡＲ遺伝子の最大の活性化が、
薬物を添加した約２５時間から３５時間後に観察されるが（図２Ｈ）、活性化された遺伝
子発現のベースラインへの復帰は、薬物の中止から約３５時間から４５時間後に発生する
ことを確認した（図２Ｉ）。本発明者らは、薬物誘導性が他のオルソログにも容易に拡大
できることを予見し、同じこれらの方策を使用してｄＳｐＣａｓ９ベースの活性化因子を
制御および調整することに成功した。
果の動態を評価した。本発明者らは、ＨＢＢ遺伝子およびＡＲ遺伝子の最大の活性化が、
薬物を添加した約２５時間から３５時間後に観察されるが（図２Ｈ）、活性化された遺伝
子発現のベースラインへの復帰は、薬物の中止から約３５時間から４５時間後に発生する
ことを確認した（図２Ｉ）。本発明者らは、薬物誘導性が他のオルソログにも容易に拡大
できることを予見し、同じこれらの方策を使用してｄＳｐＣａｓ９ベースの活性化因子を
制御および調整することに成功した。
【0087】
【表6】
【0088】
１． ＭＭＷ１５７８：ＣＡＧ－ヒトｄＬｂＣｐｆ１（Ｄ８３２Ａ）－ＮＬＳ－３ｘＨ
Ａ
ヒトコドン最適化ｄＬｂＣｐｆ１：太字、ＮＬＳ：斜体、３ｘＨＡ：小文字
Ａ
ヒトコドン最適化ｄＬｂＣｐｆ１：太字、ＮＬＳ：斜体、３ｘＨＡ：小文字
【0089】
【化4-1】
【0090】
【化4-2】
【0091】
２． ＢＰＫ１１６９：ＣＡＧ－ＤｍｒＣ－ＮＬＳ－ＦＬＡＧ－Ｐ６５
ＤｍｒＣ：太字、ＮＬＳ－Ｆｌａｇ：斜体、Ｐ６５：小文字
ＤｍｒＣ：太字、ＮＬＳ－Ｆｌａｇ：斜体、Ｐ６５：小文字
【0092】
【化5】
【0093】
３． ＭＭＷ９４８：ＣＡＧ－ＤｍｒＣ－ＮＬＳ－ＦＬＡＧ－ＶＰＲ
ＤｍｒＣ：太字、ＮＬＳ－Ｆｌａｇ：斜体、ＶＰＲ：小文字
ＤｍｒＣ：太字、ＮＬＳ－Ｆｌａｇ：斜体、ＶＰＲ：小文字
【0094】
【化6】
【0095】
４． ＪＧ１２０２：ＣＡＧ－ヒトｄＬｂＣｐｆ１（Ｄ８３２Ａ）－ＮＬＳ－３ｘＨＡ
－Ｐ６５
ヒトコドン最適化ｄＬｂＣｐｆ１：太字、ＮＬＳ：斜体、３ｘＨＡ：小文字、Ｐ６５：
小文字および太字
－Ｐ６５
ヒトコドン最適化ｄＬｂＣｐｆ１：太字、ＮＬＳ：斜体、３ｘＨＡ：小文字、Ｐ６５：
小文字および太字
【0096】
【化7-1】
【0097】
【化7-2】
【0098】
５． ＪＧ１２１１：ＣＡＧ－ヒトｄＬｂＣｐｆ１（Ｄ８３２Ａ）－ＮＬＳ－３ｘＨＡ
－ＶＰＲ
ヒトコドン最適化ｄＬｂＣｐｆ１：太字、ＮＬＳ：斜体、３ｘＨＡ：小文字、ＶＰＲ：
小文字および太字
－ＶＰＲ
ヒトコドン最適化ｄＬｂＣｐｆ１：太字、ＮＬＳ：斜体、３ｘＨＡ：小文字、ＶＰＲ：
小文字および太字
【0099】
【化8-1】
【0100】
【化8-2】
【0101】
【化8-3】
【0102】
６． ＪＧ６７４：ＣＡＧ－ヒトｄＬｂＣｐｆ１（Ｄ８３２Ａ）－ＮＬＳ－３ｘＨＡ－
ＤｍｒＡ（×１）
ヒトコドン最適化ｄＬｂＣｐｆ１：太字、ＮＬＳ：斜体、３ｘＨＡ：小文字、ＤｍｒＡ
：小文字および太字
ＤｍｒＡ（×１）
ヒトコドン最適化ｄＬｂＣｐｆ１：太字、ＮＬＳ：斜体、３ｘＨＡ：小文字、ＤｍｒＡ
：小文字および太字
【0103】
【化9-1】
【0104】
【化9-2】
【0105】
７． ＪＧ６７６：ＣＡＧ－ヒトｄＬｂＣｐｆ１（Ｄ８３２Ａ）－ＮＬＳ－３ｘＨＡ－
ＤｍｒＡ（×２）
ヒトコドン最適化ｄＬｂＣｐｆ１：太字、ＮＬＳ：斜体、３ｘＨＡ：小文字、ＤｍｒＡ
：小文字および太字
ＤｍｒＡ（×２）
ヒトコドン最適化ｄＬｂＣｐｆ１：太字、ＮＬＳ：斜体、３ｘＨＡ：小文字、ＤｍｒＡ
：小文字および太字
【0106】
【化10-1】
【0107】
【化10-2】
【0108】
８． ＪＧ６９３：ＣＡＧ－ヒトｄＬｂＣｐｆ１（Ｄ８３２Ａ）－ＮＬＳ－３ｘＨＡ－
ＤｍｒＡ（×３）
ヒトコドン最適化ｄＬｂＣｐｆ１：太字、ＮＬＳ：斜体、３ｘＨＡ：小文字、ＤｍｒＡ
：小文字および太字
ＤｍｒＡ（×３）
ヒトコドン最適化ｄＬｂＣｐｆ１：太字、ＮＬＳ：斜体、３ｘＨＡ：小文字、ＤｍｒＡ
：小文字および太字
【0109】
【化11-1】
【0110】
【化11-2】
【0111】
【化11-3】
【0112】
９． ＹＥＴ１０００：ＣＡＧ－ヒトｄＬｂＣｐｆ１（Ｄ８３２Ａ）－ＮＬＳ－３ｘＨ
Ａ－ＤｍｒＡ（×４）
ヒトコドン最適化ｄＬｂＣｐｆ１：太字、ＮＬＳ：斜体、３ｘＨＡ：小文字、ＤｍｒＡ
：小文字および太字
Ａ－ＤｍｒＡ（×４）
ヒトコドン最適化ｄＬｂＣｐｆ１：太字、ＮＬＳ：斜体、３ｘＨＡ：小文字、ＤｍｒＡ
：小文字および太字
【0113】
【化12-1】
【0114】
【化12-2】
【0115】
【化12-3】
【0116】
１０． ＢＰＫ３０８２：Ｕ６－Ｌｂ－ｃｒＲＮＡ－ＢｓｍＢＩカセット
Ｕ６プロモーター：太字、Ｌｂ ｃｒＲＮＡ：斜体、ＢｓｍＢＩサイト：小文字、Ｕ６
ターミネーター：斜体および太字
Ｕ６プロモーター：太字、Ｌｂ ｃｒＲＮＡ：斜体、ＢｓｍＢＩサイト：小文字、Ｕ６
ターミネーター：斜体および太字
【0117】
【化13】
【0118】
１１．図２ｂ＿配列
ｈＵ６プロモーター：太字、Ｌｂ ｃｒＲＮＡ直列反復：斜体、ｃｒＲＮＡ１＿ＨＢＢ
スペーサー配列：小文字、ｃｒＲＮＡ３＿ＡＲスペーサー配列：小文字および太字、ｃｒ
ＲＮＡ１＿ＮＰＹ１ Ｒスペーサー配列：小文字、太字および斜体、ターミネーター：太
字および斜体
ｈＵ６プロモーター：太字、Ｌｂ ｃｒＲＮＡ直列反復：斜体、ｃｒＲＮＡ１＿ＨＢＢ
スペーサー配列：小文字、ｃｒＲＮＡ３＿ＡＲスペーサー配列：小文字および太字、ｃｒ
ＲＮＡ１＿ＮＰＹ１ Ｒスペーサー配列：小文字、太字および斜体、ターミネーター：太
字および斜体
【0119】
【化14】
【0120】
参考文献
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【0121】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて記載したが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲に
よって定義される本発明の範囲を例示するものであって、限定するものではないことを理
解されたい。他の態様、利点、および修正は、以下の特許請求の範囲内にある。
本発明をその詳細な説明と併せて記載したが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲に
よって定義される本発明の範囲を例示するものであって、限定するものではないことを理
解されたい。他の態様、利点、および修正は、以下の特許請求の範囲内にある。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図2-4】
【図2-5】
【図2-6】
【図2-7】
【図2-8】
【手続補正書】
【提出日】2023-12-01
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書に記載の発明。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0121】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて記載したが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示するものであって、限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および修正は、以下の特許請求の範囲内にある。
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載の発明を列挙する。
［発明１］
少なくとも１つの活性化ドメインに融合された触媒的に不活性なラクノスピラ科細菌（Lachnospiraceae bacterium）ＮＤ２００６タンパク質Ｃｐｆ１（ｄＬｂＣｐｆ１）を含む融合タンパク質であって、好ましくは、前記活性化ドメインが、ＶＰ１６の４つのコピー、ヒトＮＦ－ＫＢ ｐ６５活性化ドメイン、およびエプスタイン・バーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）を含む合成ＶＰＲ活性化因子である、融合タンパク質。
［発明２］
条件付き二量化ドメインに融合された触媒的に不活性なラクノスピラ科細菌（Lachnospiraceae bacterium）ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１（ｄＬｂＣｐｆ１）を、任意選択の介在リンカーと共に含む、融合タンパク質。
［発明３］
前記条件付き二量化ドメインが、ＤｍｒＡまたはＤｍｒＣである、発明２に記載の融合タンパク質。
［発明４］
発明２に記載の融合タンパク質、および第２の融合タンパク質を含む組成物であって、前記第２の融合タンパク質は、二量化剤の存在下で、発明２に記載の融合タンパク質において条件付き二量化で二量化する第２の条件付き二量化ドメインに融合された少なくとも１つの活性化ドメインを、前記活性化ドメインおよび／または前記第２の二量化ドメインのそれぞれの間の任意選択の介在リンカーと共に含む、組成物。
［発明５］
（ｉ）発明２に記載の融合タンパク質における前記条件付き二量化がＤｍｒＡであり、前記第２の条件付き二量化ドメインがＤｍｒＣであるか、または（ｉｉ）発明２に記載の融合タンパク質における前記条件付き二量化がＤｍｒＣであり、前記第２の条件付き二量化ドメインがＤｍｒＡである、発明４に記載の組成物。
［発明６］
前記活性化ドメインが、ＶＰ６４、Ｒｔａ、ＮＦ－κＢ ｐ６５、またはＶＰＲである、発明４に記載の組成物。
［発明７］
発明１から３に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
［発明８］
発明２に記載の融合タンパク質、および第２の融合タンパク質をコードする核酸を含むキットであって、前記第２の融合タンパク質は、二量化剤の存在下で、発明２に記載の融合タンパク質における前記条件付き二量化で二量化する第２の条件付き二量化ドメインに融合された活性化ドメインを、前記活性化ドメインと前記第２の二量化ドメインとの間の任意選択の介在リンカーと共に含む、キット。
［発明９］
（ｉ）発明２に記載の融合タンパク質における条件付き二量化がＤｍｒＡであり、前記第２の条件付き二量化ドメインがＤｍｒＣであるか、または（ｉｉ）発明２に記載の融合タンパク質における条件付き二量化がＤｍｒＣであり、前記第２の条件付き二量化ドメインがＤｍｒＡである、発明８に記載のキット。
［発明１０］
発明１から３に記載の融合タンパク質を発現する細胞。
［発明１１］
発明２に記載の融合タンパク質、および第２の融合タンパク質を発現する細胞であって、第２の融合タンパク質は、二量化剤の存在下で、発明２に記載の融合タンパク質における前記条件付き二量化で二量化する第２の条件付き二量化ドメインに融合された活性化ドメインを含む、細胞。
［発明１２］
（ｉ）発明２に記載の融合タンパク質における前記条件付き二量化がＤｍｒＡであり、前記第２の条件付き二量化ドメインがＤｍｒＣであるか、または（ｉｉ）発明２に記載の融合タンパク質における前記条件付き二量化がＤｍｒＣであり、前記第２の条件付き二量化ドメインがＤｍｒＡである、発明１１に記載の細胞。
［発明１３］
細胞における標的遺伝子の発現を増加させる方法であって、
（ｉ）発明１に記載の融合タンパク質、および前記標的遺伝子の制御領域に前記融合タンパク質を方向付ける少なくとも１つのｃｒＲＮＡ；
（ｉｉ）発明２に記載の融合タンパク質、および二量化剤の存在下で、発明２に記載の融合タンパク質において前記条件付き二量化で二量化する第２の条件付き二量化ドメインに融合された活性化ドメインを、前記活性化ドメインと前記第２の二量化ドメインとの間の任意選択の介在リンカーと共に含む第２の融合タンパク質、および前記標的遺伝子の制御領域に前記融合タンパク質を方向付ける少なくとも１つのｃｒＲＮＡ
のうちの１つまたは複数と細胞を接触させる、またはそれらを細胞中で発現させることを含む、方法。
［発明１４］
細胞における複数の標的遺伝子の発現を増加させる方法であって、
（ｉ）発明１に記載の融合タンパク質、および前記標的遺伝子の１つの制御領域に前記融合タンパク質をそれぞれ方向付ける複数のｃｒＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸；
（ｉｉ）発明２に記載の融合タンパク質、および二量化剤の存在下で、発明２に記載の融合タンパク質において前記条件付き二量化で二量化する第２の条件付き二量化ドメインに融合された活性化ドメインを、前記活性化ドメインと前記第２の二量化ドメインとの間の任意選択の介在リンカーと共に含む第２の融合タンパク質、および前記標的遺伝子の１つの制御領域に前記融合タンパク質をそれぞれ方向付ける複数のｃｒＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸
のうちの１つまたは複数と細胞を接触させる、またはそれらを細胞中で発現させることを含む、方法。
［発明１５］
前記細胞が哺乳動物細胞である、発明１３または１４に記載の方法。
［発明１６］
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、発明１５に記載の方法。
［発明１７］
前記制御領域がプロモーター領域である、発明１３または１４に記載の方法。
本発明をその詳細な説明と併せて記載したが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示するものであって、限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および修正は、以下の特許請求の範囲内にある。
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載の発明を列挙する。
［発明１］
少なくとも１つの活性化ドメインに融合された触媒的に不活性なラクノスピラ科細菌（Lachnospiraceae bacterium）ＮＤ２００６タンパク質Ｃｐｆ１（ｄＬｂＣｐｆ１）を含む融合タンパク質であって、好ましくは、前記活性化ドメインが、ＶＰ１６の４つのコピー、ヒトＮＦ－ＫＢ ｐ６５活性化ドメイン、およびエプスタイン・バーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）を含む合成ＶＰＲ活性化因子である、融合タンパク質。
［発明２］
条件付き二量化ドメインに融合された触媒的に不活性なラクノスピラ科細菌（Lachnospiraceae bacterium）ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１（ｄＬｂＣｐｆ１）を、任意選択の介在リンカーと共に含む、融合タンパク質。
［発明３］
前記条件付き二量化ドメインが、ＤｍｒＡまたはＤｍｒＣである、発明２に記載の融合タンパク質。
［発明４］
発明２に記載の融合タンパク質、および第２の融合タンパク質を含む組成物であって、前記第２の融合タンパク質は、二量化剤の存在下で、発明２に記載の融合タンパク質において条件付き二量化で二量化する第２の条件付き二量化ドメインに融合された少なくとも１つの活性化ドメインを、前記活性化ドメインおよび／または前記第２の二量化ドメインのそれぞれの間の任意選択の介在リンカーと共に含む、組成物。
［発明５］
（ｉ）発明２に記載の融合タンパク質における前記条件付き二量化がＤｍｒＡであり、前記第２の条件付き二量化ドメインがＤｍｒＣであるか、または（ｉｉ）発明２に記載の融合タンパク質における前記条件付き二量化がＤｍｒＣであり、前記第２の条件付き二量化ドメインがＤｍｒＡである、発明４に記載の組成物。
［発明６］
前記活性化ドメインが、ＶＰ６４、Ｒｔａ、ＮＦ－κＢ ｐ６５、またはＶＰＲである、発明４に記載の組成物。
［発明７］
発明１から３に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
［発明８］
発明２に記載の融合タンパク質、および第２の融合タンパク質をコードする核酸を含むキットであって、前記第２の融合タンパク質は、二量化剤の存在下で、発明２に記載の融合タンパク質における前記条件付き二量化で二量化する第２の条件付き二量化ドメインに融合された活性化ドメインを、前記活性化ドメインと前記第２の二量化ドメインとの間の任意選択の介在リンカーと共に含む、キット。
［発明９］
（ｉ）発明２に記載の融合タンパク質における条件付き二量化がＤｍｒＡであり、前記第２の条件付き二量化ドメインがＤｍｒＣであるか、または（ｉｉ）発明２に記載の融合タンパク質における条件付き二量化がＤｍｒＣであり、前記第２の条件付き二量化ドメインがＤｍｒＡである、発明８に記載のキット。
［発明１０］
発明１から３に記載の融合タンパク質を発現する細胞。
［発明１１］
発明２に記載の融合タンパク質、および第２の融合タンパク質を発現する細胞であって、第２の融合タンパク質は、二量化剤の存在下で、発明２に記載の融合タンパク質における前記条件付き二量化で二量化する第２の条件付き二量化ドメインに融合された活性化ドメインを含む、細胞。
［発明１２］
（ｉ）発明２に記載の融合タンパク質における前記条件付き二量化がＤｍｒＡであり、前記第２の条件付き二量化ドメインがＤｍｒＣであるか、または（ｉｉ）発明２に記載の融合タンパク質における前記条件付き二量化がＤｍｒＣであり、前記第２の条件付き二量化ドメインがＤｍｒＡである、発明１１に記載の細胞。
［発明１３］
細胞における標的遺伝子の発現を増加させる方法であって、
（ｉ）発明１に記載の融合タンパク質、および前記標的遺伝子の制御領域に前記融合タンパク質を方向付ける少なくとも１つのｃｒＲＮＡ；
（ｉｉ）発明２に記載の融合タンパク質、および二量化剤の存在下で、発明２に記載の融合タンパク質において前記条件付き二量化で二量化する第２の条件付き二量化ドメインに融合された活性化ドメインを、前記活性化ドメインと前記第２の二量化ドメインとの間の任意選択の介在リンカーと共に含む第２の融合タンパク質、および前記標的遺伝子の制御領域に前記融合タンパク質を方向付ける少なくとも１つのｃｒＲＮＡ
のうちの１つまたは複数と細胞を接触させる、またはそれらを細胞中で発現させることを含む、方法。
［発明１４］
細胞における複数の標的遺伝子の発現を増加させる方法であって、
（ｉ）発明１に記載の融合タンパク質、および前記標的遺伝子の１つの制御領域に前記融合タンパク質をそれぞれ方向付ける複数のｃｒＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸；
（ｉｉ）発明２に記載の融合タンパク質、および二量化剤の存在下で、発明２に記載の融合タンパク質において前記条件付き二量化で二量化する第２の条件付き二量化ドメインに融合された活性化ドメインを、前記活性化ドメインと前記第２の二量化ドメインとの間の任意選択の介在リンカーと共に含む第２の融合タンパク質、および前記標的遺伝子の１つの制御領域に前記融合タンパク質をそれぞれ方向付ける複数のｃｒＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸
のうちの１つまたは複数と細胞を接触させる、またはそれらを細胞中で発現させることを含む、方法。
［発明１５］
前記細胞が哺乳動物細胞である、発明１３または１４に記載の方法。
［発明１６］
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、発明１５に記載の方法。
［発明１７］
前記制御領域がプロモーター領域である、発明１３または１４に記載の方法。