特開 2024-124692 化合物とそれを用いたフルクトース検出プローブおよびフルクトース検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024124692

(43)【公開日】2024-09-13

(54)【発明の名称】化合物とそれを用いたフルクトース検出プローブおよびフルクトース検出方法

(51)【国際特許分類】

   C07F 5/02 20060101AFI20240906BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20240906BHJP

【ＦＩ】

C07F5/02 D CSP

G01N21/64 F

【審査請求】未請求

【請求項の数】3

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023032556

(22)【出願日】2023-03-03

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 掲載年月日：２０２２年５月１８日 掲載アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｓ．ｒｓｃ．ｏｒｇ／ｅｎ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ａｒｔｉｃｌｅｈｔｍｌ／２０２２／ｒａ／ｄ２ｒａ０１５６９ｂ ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｓ．ｒｓｃ．ｏｒｇ／ｅｎ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ａｒｔｉｃｌｅｌａｎｄｉｎｇ／２０２２／ＲＡ／Ｄ２ＲＡ０１５６９Ｂ

(71)【出願人】

【識別番号】000125347

【氏名又は名称】学校法人近畿大学

(71)【出願人】

【識別番号】507157045

【氏名又は名称】公立大学法人福井県立大学

(74)【代理人】

【識別番号】100118924

【弁理士】

【氏名又は名称】廣幸 正樹

(72)【発明者】

【氏名】北山 隆

(72)【発明者】

【氏名】柏▲崎▼ 玄伍

(72)【発明者】

【氏名】日▲び▼ 隆雄

【テーマコード（参考）】

2G043

4H048

【Ｆターム（参考）】

2G043AA01

2G043BA14

2G043DA02

2G043EA01

2G043FA06

2G043KA02

2G043NA01

2G043NA11

4H048AA01

4H048AA03

4H048AB92

4H048VA11

4H048VA20

4H048VA32

4H048VA75

(57)【要約】      （修正有）

【課題】フルクトースと高い選択性で迅速に結合する上、発光強度も高く、好適なフルクトース検出プローブとなる新規化合物、および該化合物を利用したフルクトースの迅速簡便な検出方法を提供する。
【解決手段】選択図中、化合物６で示されるＢＯＤＩＰＹ（ｂｏｒｏｎ－ｄｉｐｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅ）誘導体は、果糖と高い選択性で迅速に結合する上、発光強度も高く、好適な果糖検出プローブである。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（化１）式で表される構造を有する化合物。

【化100】

【請求項2】

（化１）式で表される構造を有する化合物を用いたフルクトースの検出プローブ。

【化101】

【請求項3】

（化１）式で表される構造を有する化合物のフルクトース濃度に対する発光強度検量線を得る工程と、
被検査液に前記（化１）式で表される構造を有する化合物を投入し発光強度を測定する工程と、
前記測定された発光強度と前記発光強度検量線から前記被検査液中のフルクトース濃度を求める工程を有するフルクトースの検出方法。

【化102】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は新規化合物と、それを用いたフルクトースの検出プローブおよび、その検出プローブを用いたフルクトースの検出方法に関する。

【背景技術】

【0002】

果糖は果物（フルクトース）に広く含まれる天然単糖で、甘味が強く、他の糖に比べて満腹感を阻害しないことから、食品産業への利用が進んでいる。当初、果糖は血中でブドウ糖を生成せず、高脂肪食が主な原因と想定される肥満や非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）とは無縁であることから、ショ糖よりも安全な甘味料であると考えられていた。

【0003】

しかし、その後の研究で、現在ではフルクトースは、強力な還元糖であり老化、動脈硬化、糖尿病の血管・腎臓・眼科合併症の発症に関与していると考えられている。したがって、フルクトースを迅速に検出する簡便な方法は有益であると言える。

【0004】

検出の迅速および簡便性のためには、蛍光色素が好適と考えられる。例えば、アレイ解析に用いられることが多い蛍光色素ｃｙ３は、定量性には優れる。しかし、量子収率が０．０４と低く、蛍光色素としては明るくないため、検出感度に課題があった。

【0005】

一方、タンパク質の疎水性表面検出用の傾向プローブとしてＮ．Ｄｏｒｈら（非特許文献１）が開発したＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ（ＨＰ）Ｓｅｎｓｏｒは、ｃｙ３より非極性溶媒中で高い量子収率と蛍光強度を示し、水溶液中では十分に消光した。

【0006】

また、特許文献１では、タンパク質の解析に用いる蛍光色素の一種であるＢＯＤＩＰＹ（ｂｏｒｏｎ－ｄｉｐｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅ）の母骨格に水溶性を増大する置換基を導入し、更にジピロメテン骨格の５位に置換アリール基を導入することで、水溶液中ではほとんど蛍光を発しないことで知られたＢＯＤＩＰＹが、オリゴ糖と結合することにより分子周辺で極性低下が生じ、その極性低下に応じて、水溶液中で強く飛躍的に安定な蛍光を発する蛍光プローブが開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特開２０２０－１３９７８２号公報

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】（２０１５）Ｓｃｉ．Ｒｅｐｏｒｔｓ，５，１８３３７

【非特許文献2】Ｄｕｂｏｉｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．：Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２８，３５０ （１９５６）．

【非特許文献3】Ｐ．Ａ．Ｓｈａｆｆｅｒ，Ｍ．Ｓｏｍｅｇｙｉ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１００，６９５ （１９３３）．

【非特許文献4】Ｎｅｌｓｏｎ，Ｎ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１５３，３７５ （１９４４）．

【非特許文献5】Ｊ．－Ｂ．Ｇｉｇｕｅｒｅ，Ｄ．Ｔｈｉｂｅａｕｌｔ，Ｆ．Ｃｒｏｎｉｅｒ，Ｊ．－Ｓ．Ｍａｒｏｉｓ，Ｍ．Ａｕｇｅｒ ａｎｄ Ｊ．－Ｆ．Ｍｏｒｉｎ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， ２００９，５０，５４９７-５５００．

【非特許文献6】Ｔ．Ｒｏｈａｎｄ，Ｅ．Ｄｏｌｕｓｉｃ，Ｔ．Ｈ．Ｎｇｏ，Ｗ．Ｍａｅｓ ａｎｄ Ｗ．Ｄｅｈａｅｎ，ＡＲＫＩＶＯＣ，２００７，２００７，３０７－３２４．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

しかしながら、溶液中での蛍光の安定性に課題があり、精密な蛍光定量には好適とは言えなかった。また、フルクトースの検出プローブとしての選択性も不十分であった。

【0010】

糖類の検出や定量には、（１）フェノール－硫酸法（非特許文献２）のように強酸と処理し、色素化合物に導く比色定量法、（２）Ｓｏｍｏｇｙｉ－Ｎｅｌｓｏｎ法（非特許文献３、非特許文献４）のように、糖による還元で色素を発色させる比色定量法、（３）グルコースバイオセンサーとして普及する酵素法、（４）ＨＰＬＣなどクロマトグラフィー法を示差屈折率（ＲＩ）検出法など各種検出法と組み合わせた分離検出法が用いられてきた。

【0011】

しかし、いずれもハイスループットアッセイには適していないことから、高感度かつ選択的な検出方法の開発が望まれてきた。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明は上記の課題に鑑みて想到されたものであり、蛍光色素の一種であるＢＯＤＩＰＹ（ｂｏｒｏｎ－ｄｉｐｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅ）の母骨格に水溶性を増大する置換基を導入し、さらに８位の置換アリール基について誘導体化を検討した。その結果、クリック反応により形成されるトリアゾールを介し、糖と共有結合が可能なフェニルボロン酸を有した（化１）式で表される構造を有する化合物を得た。以後（化１）式の化合物をＰＢ－ＢＯＤＩＰＹと呼ぶ。

【0013】

【化1】

【0014】

また、本発明は（化１）式の構造を有する化合物を用いたフルクトース検出プローブを提供する。

【発明の効果】

【0015】

本発明に係るＰＢ－ＢＯＤＩＰＹは中性ｐＨにおいてアルドースに対してフルクトースと特異的に相互作用し、フルクトースに対する選択的な蛍光プローブとして優れた特性を示す（後述する図７参照）。１ｍｍｏｌ・Ｌ^－１のＤ－フルクトースに対する蛍光強度は、同濃度のＤ－グルコースやＤ－ガラクトースに対して４３倍および１１倍であり、これまでに報告されたフルクトースに対する蛍光プローブよりも優れた選択性を示した。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】ＰＢ－ＢＯＤＩＰＹの合成手順を説明した図である。

【図2】複数の溶媒におけるＰＢ－ＢＯＤＩＰＹの蛍光発光スペクトルを示す図である。

【図3】ＰＢ－ＢＯＤＩＰＹの蛍光強度と各溶媒のＥ_Ｔ ^Ｎ値の相関図を示す図である。

【図4】ＰＢ－ＢＯＤＩＰＹのｐＨ変化に伴う蛍光強度の変化を示す図である。

【図5】ｐＨ７．４、２５℃におけるＰＢ－ＢＯＤＩＰＹの蛍光強度を糖類の濃度の関数として示す図である。

【図6】溶液中でのＰＢ－ＢＯＤＩＰＹの平衡状態を表す図である。

【図7】糖類の濃度を変化させた時の蛍光反応を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下に本発明に係る新規化合物およびフルクトースの検出プローブについて図面および実施例を示し説明を行う。なお、以下の説明は、本発明の一実施形態および一実施例を例示するものであり、本発明が以下の説明に限定されるものではない。以下の説明は本発明の趣旨を逸脱しない範囲で改変することができる。なお、以下の説明で「～」は以上、以下を表すものとする。

【実施例0018】

＜物質の合成＞
フルクトース、マンノース、ガラクトースはナカライテスク株式会社（日本、京都）から入手した。グルコース、アラビノース、スクロース、ノルビキシン標準品は富士フイルム和光純薬株式会社（日本、大阪）より入手した。アロースとプシコースは東京化成工業株式会社（日本、東京）より入手した。これらをまとめてサッカライドとも呼ぶ。

【0019】

その他の化学物質はすべて分析試薬グレードで、さらに精製することなく使用した。すべての水溶液は、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ ｓｙｓｔｅｍ （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）から得た水を用いて調製した。

【0020】

カラムクロマトグラフィーはシリカゲル（７０－２３０メッシュ）を用いて実施した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、Ｍｅｒｃｋ ６０ Ｆ２５４シリカゲルプレートで行った。ＮＭＲスペクトルは、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）を内部標準とし、１Ｈについては４００ＭＨｚ、１３Ｃについて１００ＭＨｚをＢｒｕｋｅｒ社製装置（ＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ Ｎａｎｏｂａｙ ４００）、若しくはＢｒｕｋｅｒ社製装置（Ｎａｎｏｂａｙ ５００ＭＨｚスペクトロメータ）で測定された。化学シフト（ｄ）はＴＭＳからの共鳴周波数のずれ（ｐｐｍ）で求めた。

【0021】

１Ｈ ＮＭＲの多重度は、ｓ＝ｓｉｎｇｌｅｔ、ｄ＝ｄｏｕｂｌｅｔ、ｔ＝ｔｒｉｐｌｅｔ、ｑ＝ｑｕａｒｔｅｔ、ｍ＝ｍｕｌｔｉｐｌｅｔ、そしてｂｒ＝ｂｒｏａｄとして表した。赤外スペクトルは、島津製作所製分光光度計（ＩＲＡｆｆｉｎｉｔｙ－１Ｓ）で測定した。

【0022】

高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）測定はＷａｔｅｒｓ社製の装置（Ｑ－ＴＯＦ Ｐｒｅｍｉｅｒ）で測定した。化学物質は市販の試薬グレードを使用し、精製せずに使用した。ピロールは使用前にバキュオで蒸留した。以下化合物２から化合物６までの合成手順を説明する。また図１に合成手順を図示する。

【0023】

＜化合物２：４－プロパルギルオキシベンズアルデヒドの合成＞
非特許文献５による手順で４－ヒドロキシベンズアルデヒド（化合物１）から４－プロパルギルオキシベンズアルデヒドを収率７５％、白色の固体として得た。

【0024】

ＮＭＲのスペクトルを以下に示す。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）：δ９．９１（１Ｈ，ｓ，ＣＨＯ），７．８６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，ＣＨ ａｔ Ｃ３，Ｃ７），７．１０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，ＣＨ ａｔ Ｃ４，Ｃ６），４．７８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，ＣＨ_２ ａｔ Ｃ８），２．５７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，ＣＨ ａｔ Ｃ１０）．以上のように図１の化合物２であることを確認した。

【0025】

＜化合物３：５－（４－プロパルギルオキシフェニル）ジピロメテンの合成＞
非特許文献６に報告されている条件に従って、化合物３を合成した。０．１８ＭのＨＣｌａｑ．（５０ｍＬ）、ピロール（１．２９ｍＬ，１８．７ｍｍｏｌ、化合物２（１．００ｇ，６．２４ｍｍｏｌ）を３００ｍＬ三口ナスフラスコに加え、室温で４時間攪拌した。

【0026】

飽和ＮａＨＣＯ_３ａｑ．を加えた後、溶液を酢酸エチル（３×２００ｍＬ）で抽出し、有機層をブライン（飽和食塩水）で洗浄し、有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、続いて蒸発乾固させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｈｅｘａｎｅ／ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ＝８／１）で精製し、化合物３（１．０１ｇ，３．６６ｍｍｏｌ，５９％）を黄色の油状物として得た。

【0027】

ＮＭＲのスペクトルを以下に示す。^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）：δ７．９２（２Ｈ，ｂｒ ｓ，ＮＨ ａｔ Ｎ１，Ｎ２），７．１５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ＣＨ ａｔ Ｃ１２，Ｃ１４），６．９３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，ＣＨ ａｔ Ｃ１１，Ｃ１５），６．７０（２Ｈ，ｍ，ＣＨ ａｔ Ｃ１，Ｃ９），６．１６（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，ＣＨ ａｔ Ｃ２，Ｃ８），５．９１（２Ｈ，ｍ，ＣＨ ａｔ Ｃ３，Ｃ７），５．４４（１Ｈ， ｓ，ＣＨ ａｔ Ｃ５），４．６８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，ＣＨ_２ ａｔ Ｃ１６），２．５２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，ＣＨ ａｔ Ｃ１８）．以上のように図１の化合物３であることを確認した。

【0028】

＜化合物４：３，７－ジクロロ－５，５－ジフルオロ－１０－（４－（プロパ－２－イン－１－イルオキシ）フェニル）－５Ｈ－４λ^４，５λ^４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニンの合成＞
５．０ｍＬの乾燥ＴＨＦ中の化合物３（２７０ｍｇ，０．９８ｍｍｏｌ）を１００ｍＬ三つ口フラスコに加え、Ｎ_２でパージし、－７８℃に冷却した。

【0029】

２５ｍＬのＴＨＦ中のＮ－クロロスクシンイミド（２８７ｍｇ，２．１５ｍｍｏｌ）を冷却した溶液に滴下して加えた。混合物を－７８℃で１５分間攪拌し、それをさらに室温で２時間攪拌した。水を加え、残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２（３×１５０ｍＬ）で抽出した。有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾液を蒸発乾固させた。

【0030】

その後、精製せずに酸化を直ちに行った。具体的には、蒸発乾固させたものを２００ｍＬナスフラスコ中で３０ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２溶液とし、そこに２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－１，４－ベンゾキノン（２６６ｍｇ，１．１７ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を室温で２時間攪拌した。

【0031】

Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１．００ｍＬ，５．８６ｍｍｏｌ）および三フッ化ホウ素－ジエチルエーテル錯体８．０ｅｑ．（０．９８５ｍＬ，７．８２ｍｍｏｌ）を攪拌した混合物に滴下し、室温で２４時間攪拌した。

【0032】

混合物に水を加えた後、残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２（３×１５０ｍＬ）で抽出した。有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾液を蒸発乾固させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ｈｅｘａｎｅ／ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ＝５／１）で精製して、化合物４（１５０ｍｇ，０．３８ｍｍｏｌ，３９％）を赤褐色固体として得た。

【0033】

ＮＭＲのスペクトルを以下に示す。Ｍｐ：２０１－２０４℃。^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）：δ７．４６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，ＣＨ ａｔ Ｃ１２，Ｃ１４），７．１２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，ＣＨ ａｔ Ｃ１１，Ｃ１５），６．８９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，ＣＨ ａｔ Ｃ２，Ｃ８），６．４４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，ＣＨ ａｔ Ｃ３，Ｃ７），４．７９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，ＣＨ_２ ａｔ Ｃ１６），２．６０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，ＣＨ ａｔ Ｃ１８）．^１３Ｃ｛^１Ｈ｝ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，１００ＭＨｚ）：δ１５９．９（Ｃ１３），１４４．４（Ｃ１，Ｃ９），１４３．７（Ｃ５），１３３．７（Ｃ４，Ｃ６），１３２．２（Ｃ１２，Ｃ１４），１３１．５（Ｃ２，Ｃ８），１２５．６（Ｃ１０），１１８．７（Ｃ３，Ｃ７），１１５．０（Ｃ１１，Ｃ１５），７７．８（Ｃ１７），７６．３（Ｃ１８），５６．０（Ｃ１６）．以上のように図１の化合物４であることを確認した。

【0034】

これらのピークは、Ｈ－Ｈ相関分光法（ＣＯＳＹ）、ヘテロ核多重量子コヒーレンス（ＨＭＱＣ）、ヘテロ核多重結合コヒーレンス（ＨＭＢＣ）により決定された。ＨＲＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｎａ］^＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_１８Ｈ_１１ＢＦ_２ ^－Ｎ_２ＯＣｌ_２ ４１３．０２０７；ｆｏｕｎｄ４１３．０１８７。

【0035】

＜化合物５：５，５－ジフルオロ－Ｎ^３，Ｎ^７－ビス（２－メトオキシエチル）－１０－（４－（プロパ－２－イン－１－イルオキシ）フェニル）－５Ｈ－４λ^４，５λ^４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３，７－ジアミンの合成＞
化合物４（１．５ｇ，３．８４ｍｍｏｌ），２－メトキシエチルアミン（２．６７ｍＬ，３０．７ｍｍｏｌ）およびＣＨ_３ＣＮ（５．０ｍＬ）を１０．２ｃｍのエース高耐圧チューブに加え、１００℃で１６時間撹拌した後、この溶液を蒸発乾固させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｈｅｘａｎｅ／ＣＨ_２Ｃｌ_２／ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ＝３／２／１）で精製して、化合物５（１．０４ｇ，２．２ｍｍｏｌ，５８％）を紫色の固体として得た。

【0036】

以下にＮＭＲスペクトルを示す。Ｙｉｅｌｄ （５８％：ｖｉｏｌｅｔ ｓｏｌｉｄ）．Ｍｐ：１５９－１６２℃．ＩＲ（ＫＢｒ）：３４０４，３２８３，２９２４，１５９７，１５４７，１４７０，１４３３，１３４２，１２４０ｃｍ^－１．^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）：δ７．３９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，ＣＨ ａｔ Ｃ１２，Ｃ１４），７．０２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，ＣＨ ａｔ Ｃ１１，Ｃ１５），６．５６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，ＣＨ ａｔ Ｃ２，Ｃ８），５．７４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，ＣＨ ａｔ Ｃ３，Ｃ７），５．７２（２Ｈ，ｂｒ ｓ，ＮＨ ａｔ Ｎ３，Ｎ４），４．７４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，ＣＨ_２ ａｔ Ｃ２２），３．５９（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，ＣＨ_２ ａｔ Ｃ１７，Ｃ２０），３．４４（４Ｈ，ｍ，ＣＨ_２ ａｔ Ｃ１６，Ｃ１９），３．４０（６Ｈ，ｓ，ＣＨ_３ ａｔ Ｃ１８，Ｃ２１），２．５７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，ＣＨ ａｔ Ｃ２４）．^１３Ｃ｛^１Ｈ｝ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３，１００ＭＨｚ）：δ １５８．０（Ｃ１３），１５６．５（Ｃ１，Ｃ９），１３１．６（Ｃ１２，Ｃ１４），１３１．５（Ｃ５），１３０．９（Ｃ４，Ｃ６），１２９．０（Ｃ２，Ｃ８），１２８．４（Ｃ１０），１１４．３（Ｃ１１，Ｃ１５），１０１．０（Ｃ３，Ｃ７），７８．４（Ｃ２３），７５．８（Ｃ２４），７１．１（Ｃ１７，Ｃ２０），５９．０（Ｃ１８，Ｃ２１），５５．９（Ｃ２２），４４．３（Ｃ１６，Ｃ１９）．。

【0037】

これらのピークは、Ｈ－Ｈ相関分光法（ＣＯＳＹ、，ヘテロ核多重量子コヒーレンス（ＨＭＱＣ）、ヘテロ核多重結合コヒーレンス（ＨＭＢＣ）により決定された。ＨＲＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｎａ］^＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_２４Ｈ_２７ＢＦ_２Ｎ_４Ｏ_３ ４９１．２０４２； ｆｏｕｎｄ ４９１．２０３６であった。以上のように図１の化合物５であることを確認した。

【0038】

＜化合物６：（４－（４－（（４－（５，５－ジフルオロ－３，７－ビス（（２－メトキシエチル）アミノ）－５Ｈ－４λ^４，５λ^４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－１０－イル）フェノキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）フェニル）ボロン酸の合成＞
ヨウ化銅（Ｉ）（４．０ｍｇ，２１ｍｍｏｌ），Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（７．４ｍＬ，４３ｍｍｏｌ），酢酸（２．４ｍＬ，４３ｍｍｏｌ），化合物５（１００ｍｇ，２１４ｍｍｏｌ），２－（４－アジドフェニル）－５，５－ジメチル－１，３，２－ジオキサボリナン（５９．０ｍｇ，２５６ｍｍｏｌ）およびＣＨ_２Ｃｌ_２（０．５ｍＬ）をマイクロチューブに加え、混合物を室温にて３０分間攪拌した。この溶液を蒸発乾固した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｈｅｘａｎｅ／ａｃｅｔｏｎｅ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ＝２／１／１）で精製し、化合物６（６６．２ｍｇ，１０５ｍｍｏｌ，４８％） 紫色の固体として得た。

【0039】

ＮＭＲスペクトルを示す。Ｙｉｅｌｄ（４８％：ｖｉｏｌｅｔ ｓｏｌｉｄ）．Ｍｐ：３９－４１℃．ＩＲ（ＫＢｒ）：３３９４，１６０５，１５５１，１４２７，１３４２，１２４２，１１７２，１０９６ｃｍ^－１．^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３，５００ＭＨｚ）：δ ８．１４（１Ｈ，ｓ，ＣＨ ａｔ Ｃ２４），７．９４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，ＣＨ ａｔ Ｃ２７，Ｃ２９），７．８１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，ＣＨ ａｔ Ｃ２６，Ｃ３０），７．４０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，ＣＨ ａｔ Ｃ１２，Ｃ１４），７．０７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，ＣＨ ａｔ Ｃ１１，Ｃ１５），６．５６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，ＣＨ ａｔ Ｃ２，Ｃ８），５．７４（２Ｈ，ｂｒ ｓ，ＮＨ ａｔ Ｎ３，Ｎ４），５．７４（２Ｈ，ｂｒ ｓ，ＣＨ ａｔ Ｃ３，Ｃ７），５．３７（２Ｈ，ｓ，ＣＨ_２ ａｔ Ｃ２２），４．８６（２Ｈ，ｓ，ＯＨ ａｔ Ｏ４，Ｏ５），３．５９（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，ＣＨ_２ ａｔ Ｃ１７，Ｃ２０），３．４４（４Ｈ，ｂｒ ｓ，ＣＨ_２ ａｔ Ｃ１６，Ｃ１９），３．４０（６Ｈ，ｓ，ＣＨ_３ ａｔ Ｃ１８，Ｃ２１）．^１３Ｃ｛１Ｈ｝ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３，１２５ＭＨｚ）：δ １５８．６（Ｃ１３），１５６．５（Ｃ１，Ｃ９），１４５．０（Ｃ２３），１３８．９（Ｃ２８），１３５．３（Ｃ２７，Ｃ２９），１３２．５（Ｃ２５），１３１．７（Ｃ１２，Ｃ１４），１２９．０（Ｃ５），１２８．４（Ｃ２，Ｃ８），１２８．２（Ｃ４，Ｃ６），１２０．８（Ｃ２４），１１９．８（Ｃ２６，Ｃ３０），１１４．３（Ｃ１１，Ｃ１５），１１４．０（Ｃ１０），１０１．０（Ｃ３，Ｃ７），７１．２（Ｃ１７，Ｃ２０），６２．１（Ｃ２２），５９．０（Ｃ１８，Ｃ２１），４４．２（Ｃ１６，Ｃ１９）．。

【0040】

これらのピークは、Ｈ－Ｈ相関分光法（ＣＯＳＹ、，ヘテロ核多重量子コヒーレンス（ＨＭＱＣ）、ヘテロ核多重結合コヒーレンス（ＨＭＢＣ）により決定された。ＨＲＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｎａ］^＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_３０Ｈ_３３Ｂ_２Ｆ_２Ｎ_７Ｏ_５， ６５４．２５９５；
ｆｏｕｎｄ， ６５４．２６２３であった。以上のように図１の化合物６（ＰＢ－ＢＯＤＩＰＹ）であることを確認した。

【0041】

＜特性評価＞
＜装置＞
上記の様に合成したＰＢ－ＢＯＤＩＰＹ（化合物６：（化１）式）の蛍光特性を調べた。吸収スペクトルの測定には紫外可視分光光度計Ｕ－２９００（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈｉｇｈ－Ｔｅｃｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｊａｐａｎ）を用いた。蛍光スペクトルは蛍光分光器Ｆ－７０００（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈｉｇｈ－Ｔｅｃｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｊａｐａｎ）を用いて測定した。

【0042】

＜スペクトル測定結果＞
アセトン中のＰＢ－ＢＯＤＩＰＹ染料溶液の吸収スペクトルを、３４０ｎｍから６４０ｎｍまで１ｎｍ間隔で測定した。蛍光色素溶液は使用前に新鮮な状態で調製した。ＰＢ－ＢＯＤＩＰＹ色素の相対蛍光量子収率Φ_ｆは，Ｐａｒｋｅｒ－Ｒｅｅｓの関係を用いた方法によって求めた。

【0043】

蛍光標準物質としてローダミンＢ色素（エタノール中で励起波長５４３ｎｍを使用、Φ_ｆ＝０．９７）を使用した。蛍光色素の発光スペクトルは、励起波長５６４ｎｍ、励起および発光のバンド幅２．５ｎｍを用いて、１ｎｍ間隔で測定した。特に記述のない限り、すべての実験は２５℃で行った。

【0044】

＜サッカライド濃度の測定＞
すべての糖質試料（フルクトース、マンノース、ガラクトース、グルコース，アラビノース，スクロース，ノルビキシン、アロース、プシコース）を秤量し、水で溶解し、十分に振盪し、０．１ｍｏｌ・Ｌ^－１のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈し検液とした。糖の検出には、アセトン中のＰＢ－ＢＯＤＩＰＹ（５０μｍｏｌ・Ｌ^－１）を０．１ｍｏｌ・Ｌ^－１のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈し、最終的に０．５μｍｏｌ・Ｌ^－１の色素溶液とした。

【0045】

回収率測定には，既知濃度のフルクトース標準溶液５００ｍＬに検液５００μＬを加え、リン酸ナトリウム緩衝液４ｍＬを加えて試料混合液を調製した後、色素溶液を添加した。リン酸緩衝液中の各濃度の異なる検液をそれぞれ色素溶液と混合した後、石英キュベットに移し、蛍光分光器Ｆ－７０００（λ_ｅｘ＝５５９ｎｍ，λ_ｅｍ＝５８０ｎｍ，励起スリット幅２．５ｎｍ，発光スリット幅２．５ｎｍ，走査速度７２０ｎｍ・ｍｉｎ^－１）で蛍光を測定した。

【0046】

ｐＨ応答は，ＰＢ－ＢＯＤＩＰＹアセトン溶液を異なるｐＨ値の緩衝液（ｐＨ４－６，０．１ｍｏｌ・Ｌ^－１の酢酸ナトリウムバッファ；ｐＨ６．５－７．８，０．１ｍｏｌ・Ｌ^－１のリン酸ナトリウムバッファ；ｐＨ８－９，０．１ｍｏｌ・Ｌ^－１のホウ酸ナトリウムバッファ；ｐＨ９．５－１０．５，０．１ｍｏｌ・Ｌ^－１の炭酸ナトリウムバッファ）で希釈し、０．５μｍｏｌ・Ｌ^－１のＰＢ－ＢＯＤＩＰＹ溶液とした。

【0047】

なお、ホウ酸エステルの生成を阻害しないように、ｐＨ８～９の範囲では、ホウ酸緩衝液の代わりに０．１ｍｏｌ・Ｌ^－１のＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液を用いて糖類の検出を行った。

【0048】

Ｄ－フルクトースの酵素アッセイは、フルクトース比色／蛍光測定キット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、メーカーの説明書に従って行った。

【0049】

＜結果＞
＜ＰＢ－ＢＯＤＩＰＹの合成と特性評価＞
化合物６として合成されたＰＢ－ＢＯＤＩＰＹ（（化１）式）のモル吸光係数と量子収率を測定したところ、アセトン中で１．０５×１０^５Ｍ^－１ｃｍ^－１（λ_ａｂｓ＝５６５ｎｍ）および０．３９であった。

【0050】

図２に、複数の溶媒におけるＰＢ－ＢＯＤＩＰＹの蛍光発光スペクトルを示す。図２を参照し、横軸は波長（ｎｍ）、縦軸は発光強度（任意単位）を表す。ＰＢ－ＢＯＤＩＰＹは、極性の異なる溶媒中でわずかな（１０ｎｍ以下）発光ピークのシフトを示すだけであった。また、無極性溶媒から極性溶媒への移行に伴うストークスシフトの変化も５ｎｍ未満であった。

【0051】

溶媒の極性とスペクトル特性の関係を推定するために、選択した溶媒の極性を表す標準的なＥ_Ｔ ^Ｎ値と蛍光強度を比較した。ＰＢ－ＢＯＤＩＰＹの蛍光強度と各溶媒のＥ_Ｔ ^Ｎ値の相関図を図３に示す。

【0052】

図３を参照し、横軸はＥ_Ｔ ^Ｎ値であり、縦軸は最大発光強度（Ｆ_ｍａｘ：任意単位）を示す。なお、Ｅ_Ｔ ^Ｎ値は、標準化合物２，６－ジフェニル－４－（２’，４’，６’－トリフェニル－ｌ－ピリジニウム）フェノラートを溶媒に溶解した際の蛍光波長の変化（ソルバトクロミズム）に基づいて求めたもので、溶媒の極性を表す経験的パラメーターである。Ｅ_Ｔ ^Ｎ値は、１に近づくほど溶媒の極性が大きく、０に近づくほど極性が小さいことを示す。

【0053】

最大発光強度とＥ_Ｔ ^Ｎ値の相関関係を線形回帰でフィッティングしたところ，モノアルコール（Ａ：細線）とその他の溶媒（Ｂ：太線）のフィッティング関係は，それぞれｙ＝５６７５－５３２３ｘ，ｒ^２＝０．９２およびｙ＝３１２３－３５２２ｘ，ｒ^２＝０．９２となった。

【0054】

図３から、エチレングリコール（丸で囲んで表示）の蛍光発光強度は、同じＥ_Ｔ ^Ｎ値のモノアルコール（Ａ：細線）や他の溶媒（Ｂ：太線）よりも高くなる可能性があることが示唆された。なお、ボロン酸基を持たないＨＰｓｅｎｓｏｒ２色素も同様の相関関係の傾向を示したことを確認している。

【0055】

＜蛍光強度のｐＨ依存性＞
水溶液中ではフェニルボロン酸は水と反応してボロン酸アニオンを形成し、フェニルボロン酸の酸乖離定数ｐＫａ値は約８．８である。ボロン酸基は糖類と高速かつ可逆的な共有結合を形成する。

【0056】

ボロン酸が糖類と複合化すると、糖類の酸乖離定数ｐＫａが低下し、特定のｐＨでボロン酸基のアニオン型が誘導される。ボロン酸に蛍光体を結合させると、中性型のボロン酸基は電子吸引基として働き、アニオン型のボロン酸基は電子供与基として働く。このボロン酸基の電子的性質の変化により、蛍光体のスペクトルが変化することがある。

【0057】

図４は、ＰＢ－ＢＯＤＩＰＹのｐＨ変化に伴う蛍光強度の変化を示したものである。図４を参照して、横軸はｐＨであり、縦軸は発光強度（任意単位）である。黒四角（■）はＤ－グルコース、白四角（□）はＤ－フルクトース、白丸（〇）は糖類なしの場合を示す。発光ピークのシフトは無視できるほど小さいが、ｐＨの上昇に伴い発光強度が大きく増加することが確認された。滴定曲線に理論的なフィットを行うと、酸乖離定数ｐＫａは８．４であった。

【0058】

ボロン酸－糖鎖複合体の酸乖離定数ｐＫａは、遊離のボロン酸より低いことが知られている。図４の滴定曲線をフィッティングすると、０．２ｍｏｌ・Ｌ^－１のフルクトースとグルコースの存在下で、それぞれ６．８と８．１の酸乖離定数ｐＫａが得られていることがわかる。ｐＨ７．２－７．８では，フルクトースの有無による滴定曲線の変化が最大となり、フルクトース非存在下ではＰＢ－ＢＯＤＩＰＹの中性型が、フルクトース存在下では色素－フルクトース複合体のアニオン型が優位であることが示唆された。

【0059】

一方、グルコースを添加してもこのｐＨ領域では蛍光強度にあまり変化はなく、グルコースとの複合体は形成されないことが示唆された。以下に特に記述がない限り、測定はすべての糖類についてｐＨ７．４で行った。

【0060】

＜糖類に対する選択性＞
図５はｐＨ７．４、２５℃におけるＰＢ－ＢＯＤＩＰＹの蛍光強度を糖類の濃度の関数として示したものである（滴定曲線）。ボロン酸－ジオール複合体形成が図６のスキーム１に従うと仮定すると、ボロン酸－ジオール複合体の会合定数（Ｋ）は、糖類と色素の滴定により推定することが可能である。
この場合、滴定曲線は式（１）に従う。

【0061】

【数1】

【0062】

ここで、ｃ_０とｃ_Ｓ（ｃ_０＜＜ｃ_Ｓ）はＰＢ－ＢＯＤＩＰＹと糖質の初期濃度、ｆは蛍光強度の比例係数、Ｃは糖質を含まない蛍光強度である。

【0063】

ジオール部位が蛍光強度を変化させる程度は、ボロン酸とジオールの結合親和性に依存する。会合定数はＤ－フルクトース（ｌｏｇＫ＝２．６）、ソルビトール（ｌｏｇＫ＝２．９）、Ｄ－グルコース（ｌｏｇ＝０．７５）、Ｄ－アラビノース（ｌｏｇＫ＝１．６）、Ｄ－マンノース（ｌｏｇＫ＝１．２）そしてＤ－ガラクトース（ｌｏｇＫ＝１．３）（スクロースは検出限界以下）であった。

【0064】

相対安定度順位はすべてのモノボロン酸に固有の選択性を示すが、Ｄ－フルクトースとＤ－グルコースのｌｏｇＫ差は約１．９であり、知られている限り既知のモノボロン酸誘導体の中で最高値の一つと考えられた。これらの結果から，ＰＢ－ＢＯＤＩＰＹを用いたＤ－フルクトースの滴定は，１ｍｍｏｌ・Ｌ^－１のアルドース存在下でも影響を受けないことが示唆された。

【0065】

なお、式（１）のＫｃ_Ｓが１より十分小さい糖濃度では、式（１）は式（１’）のように近似される。

【0066】

【数2】

【0067】

実際、ケトースであるＤ－フルクトースとＤ－プシコース、糖アルコールであるＤ－ソルビトールでは、１００μｍｏｌ・Ｌ^－１～１ｍｍｏｌ・Ｌ^－１の範囲で蛍光強度が糖濃度にほぼ比例していたが、アルドース４種では調べた濃度範囲で直線性を確認できるほどの蛍光強度はなかった。

【0068】

図７はこのことを示す結果である。図７は、糖類の濃度を変化させた時の蛍光反応を示す。横軸は糖類の濃度（μｍｏｌ・Ｌ^－１）であり、縦軸は最大変化発光量（任意単位）である。グラフ中、黒丸（●）はＤ－フルクトース、白四角（□）はＤ－プシコース、白菱形は（◇）Ｄ－ソルビトール、黒菱形（◆）はＤ－グルコース、黒三角（▲）はＤ－ガラクトース、プラス（＋）はＤ－マンノース、バツ印（×）は、Ｄ－アロースを表す。

【0069】

Ｄ－フルクトース、Ｄ－プシコース、Ｄ－ソルビトールの蛍光直線性と検出限界は、ＰＢ－ＢＯＤＩＰＹが０．５μｍｏｌ・Ｌ^－１、２５℃の条件で求めた。Ｄ－フルクトースは１００から１０００μｍｏｌ・Ｌ^－１（ｎ＝５）まで測定され、最小二乗法による直線勾配は０．１５２±０．００２，切片は１１．０±１．３，相関係数は０．９９９７、検出限界は３２μｍｏｌ・Ｌ^－１であった。

【0070】

Ｄ－プシコースは１００から１０００μｍｏｌ・Ｌ^－１（ｎ＝５）まで測定し、最小二乗直線勾配は０．３９０＋０．００８、切片は２４．０±４．６、相関係数は０．９９９５、検出限界は４３μｍｏｌ・Ｌ^－１であった。

【0071】

Ｄ－ソルビトールは，１００～１０００μｍｏｌ・Ｌ^－１（ｎ＝５）で０．２４１±０．０１０の最小二乗直線勾配、１２．０±５．９の切片、０．９９７６の相関係数、８５μｍｏｌ・Ｌ^－１の検出限界であった。

【0072】

回収率測定は，本法の全体的な精度を評価するために実施した。濃度既知のベース試料に、最終濃度が低濃度、中濃度、高濃度をカバーするように一連の標準フルクトース溶液をスパイクした。表１に結果を示す。表１より、回収率は９６．９～９９．９％であった。

【0073】

【表1】

【0074】

次に各Ｄ－フルクトース溶液の濃度を３００、７００、１０００μｍｏｌ・Ｌ^－１として分析を行い、本法の日内および日間信頼性を評価した。
日内精度は同日に５回測定を繰り返して得られた標準偏差（ＳＤ（μｍｏｌ Ｌ^－１））および変動係数（ＣＶ（％））の値を算出することにより評価し、日間信頼性の評価については、３つのフルクトースサンプルを用い、各サンプルにつき２回の測定を異なる５日で実施した。その結果を表２に示す。

【0075】

【表2】

【0076】

また、日内および日間ＣＶ値はすべての濃度で３および７以下であり、本法によるフルクトース測定の日内再現性および回収率は十分であることが示唆された。
一般に、市販の食品や生体試料中のＤ－フルクトースの測定には、還元剤、アルコール、タンパク質など、いくつかの物質による干渉がある。２ｍｍｏｌ・Ｌ^－１のＤ－フルクトースの回収率を干渉物質の存在下で検討した（表３）。その結果、０．２ｍｏｌ・Ｌ^－１のＮａＨＣＯ_３、０．２ｍｏｌ・Ｌ^－１のＣＨ_３ＣＯＯＮａ、０．２ｍｍｏｌ・Ｌ^－１の尿酸は有意な干渉を示さなかった。

【0077】

【表3】

【0078】

一方、２％（ｖ／ｖ）エタノールと２μｇ・ｍＬ^－１ノルビキシンの存在下では、それぞれ１９．１％と８．９％の増加が観察された。これらの増加は、干渉物質の疎水性に起因すると考えられた。アスコルビン酸は、ポリオール構造の炭素数６の糖酸であるためか、１００％以上の高い陽性干渉を示した。オボアルブミンは顕著な陽性干渉を示したことから、ＰＢ－ＢＯＤＩＰＹをフルクトースアッセイに適用するためには脱タンパク前処理が必要であると考えられる。

【0079】

以上の様に、本発明に係るＰＢ－ＢＯＤＩＰＹとフルクトースを混合すると、低Ｄ－フルクトース濃度に対して線形な蛍光応答が得られた。Ｄ－フルクトース濃度は１００から１０００μｍｏｌ・Ｌ^－１まで測定され、検出限界は３２μｍｏｌ・Ｌ^－１であった。したがって、ＰＢ－ＢＯＤＩＰＹはフルクトース濃度を高感度かつ簡便に測定するために有利な蛍光プローブである。

【0080】

また、本発明に係るＰＢ－ＢＯＤＩＰＹのフルクトースの濃度に対する検量線（例えば図７）を予め作成しておき、被検査液にＰＢ－ＢＯＤＩＰＹを投入し、最大変化蛍光量を測定することで、被検査液中のフルクトースの濃度を測定することができる。なお、この方法はプシコースに対しても行うことができる。

【産業上の利用可能性】

【0081】

本発明に係るＰＢ－ＢＯＤＩＰＹは、フルクトースの検出に好適に利用することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】