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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024125191
(43)【公開日】2024-09-13
(54)【発明の名称】カルバクロールを含有する抗アニサキス組成物
(51)【国際特許分類】
A23L 33/105 20160101AFI20240906BHJP
A61P 33/10 20060101ALI20240906BHJP
A61K 31/05 20060101ALI20240906BHJP
A61K 36/53 20060101ALI20240906BHJP
【ＦＩ】
A23L33/105
A61P33/10
A61K31/05
A61K36/53
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024029093
(22)【出願日】2024-02-28
(31)【優先権主張番号】P 2023032571
(32)【優先日】2023-03-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【新規性喪失の例外の表示】新規性喪失の例外適用申請有り
(71)【出願人】
【識別番号】519057081
【氏名又は名称】学校法人北海道科学大学
(74)【代理人】
【識別番号】110002480
【氏名又は名称】弁理士法人ＩＰアシスト
(72)【発明者】
【氏名】丁野 純男
(72)【発明者】
【氏名】戸上 紘平
(72)【発明者】
【氏名】中谷 日向子
【テーマコード（参考）】
4B018
4C088
4C206
【Ｆターム（参考）】
4B018LB10
4B018LE05
4B018MD08
4B018MD15
4B018MD66
4B018ME11
4B018MF01
4B018MF02
4B018MF14
4C088AB38
4C088BA08
4C088CA03
4C088MA02
4C088MA17
4C088MA22
4C088MA52
4C088NA14
4C088ZB39
4C206AA01
4C206AA02
4C206CA17
4C206KA01
4C206KA18
4C206MA01
4C206MA02
4C206MA03
4C206MA04
4C206MA05
4C206MA37
4C206MA42
4C206MA72
4C206NA14
4C206ZB39
4C206ZC75
(57)【要約】
【課題】アニサキス症の予防又は症状緩和に有用な手段、特に、胃内環境下でアニサキスを殺滅する又はその運動性を低減させる効果を発揮することができる、胃アニサキス症の予防又は症状緩和に有用な手段を提供する。
【解決手段】本発明は、経口摂取によるアニサキス症の予防又は症状緩和のための、カルバクロールを含む水混和性液体又はエマルションである、抗アニサキス組成物に関する。本発明の抗アニサキス組成物は、経口的に摂取することで、アニサキス症、とりわけ胃アニサキス症を予防し、また付随する症状を緩和することができる。
【選択図】図１
【解決手段】本発明は、経口摂取によるアニサキス症の予防又は症状緩和のための、カルバクロールを含む水混和性液体又はエマルションである、抗アニサキス組成物に関する。本発明の抗アニサキス組成物は、経口的に摂取することで、アニサキス症、とりわけ胃アニサキス症を予防し、また付随する症状を緩和することができる。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
経口摂取によるアニサキス症の予防又は症状緩和のための、カルバクロールを含む水混和性液体又はエマルションである、抗アニサキス組成物。
【請求項2】
カルバクロールを含む水混和性液体であって、水混和性液体がエタノール及び／又はプロピレングリコールと水との混合物である、請求項１に記載の抗アニサキス組成物。
【請求項3】
カルバクロールと油性成分と乳化剤と水とを含む、水中油型のエマルションである、請求項１に記載の抗アニサキス組成物。
【請求項4】
オレガノ抽出物を含む水混和性液体又はエマルションである、請求項１に記載の抗アニサキス組成物。
【請求項5】
胃アニサキス症の予防又は症状緩和のための、請求項１に記載の抗アニサキス組成物。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載の抗アニサキス組成物を含む、飲食品。
【請求項7】
請求項１～５のいずれか一項に記載の抗アニサキス組成物を含む、医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アニサキス症の予防又は症状緩和のための、カルバクロールを含有する抗アニサキス組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
アニサキスは、回虫目アニサキス科のアニサキス属及びシュードテラノパ属に分類される線虫で、その幼虫は、待機宿主であるサバ、アジ、サンマ、カツオ、イワシ、サケ、イカなどの魚介類に寄生する。アニサキス幼虫（以下、単にアニサキスと表す）が寄生している生鮮魚介類を生（不十分な冷凍又は加熱のものを含む）で食べることで、アニサキスが胃壁や腸壁に刺入して食中毒（アニサキス症）が引き起こされる。
【0003】
アニサキス症の有病率が最も高い国は日本である。また、アニサキスの感染は生魚を食べる食習慣と関連しており、世界においても日本食の浸透によって寿司や刺身を食べる機会が増えていることから、アニサキス症の患者数は増加しつつある。
【0004】
アニサキス症は、アニサキスが寄生する消化器官の部位により、胃アニサキス症、腸アニサキス症および異所性アニサキス症の３つに分類され、胃アニサキス症の症例が９５％を占める。胃アニサキス症は、アニサキスがヒトの胃に到達してから数時間以内に発症し、激しい心窩部痛、嘔吐、下痢、および微熱を引き起こす。
【0005】
アニサキス症の処置は、内視鏡を用いてアニサキスを摘出する外科的処置がほとんどである。一方、化学的処置として、エキノコックス症治療薬であるアルベンダゾールが腸アニサキス症に対して効果的であることが示唆されている（非特許文献１及び２）。このほか、特許文献１はクレオソートを有効成分として含有する消化器アニサキス症用薬剤を、特許文献２は木香から単離されるコスツノライド、デヒドロコスタスラクトンまたはその誘導体を有効成分として含むアニサキス症予防剤を、特許文献３は［６］－ショウガオールおよび／または［６］－ジンゲロールを有効成分とする抗寄生虫剤を開示している。
【0006】
アニサキス症の感染部位はほとんどの症例で胃壁であり、またアニサキスは低ｐＨ条件下においてその成長が促進され、運動性が亢進することが知られている（非特許文献３）。さらに、胃アニサキス症は経口感染後、数時間以内という短時間で発症することから、発症を未然に防ぐ、あるいは発症後に症状を速やかに緩和するためには、化学的処置としては短時間で奏功するものが好ましい。このように、消化管内で、特に胃内で、かつ好ましくは短時間で、アニサキスを殺滅可能あるいはアニサキスの運動性を低減可能な、効果的かつ容易な手段が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】特開２０１２－０１７２７６
【特許文献2】特開平４－１４５０７６
【特許文献3】特開平２－００４７１１
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Moore DA., et al., Lancet, 360(9326), 54, 2002.
【非特許文献2】Pacios E., et al., Clin. Infect. Dis., 41(12),1825-1826, 2005.
【非特許文献3】Dziekonska-Rynko J., et al., Wiad. Parazytol., 47(3), 317-322, 2001.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、アニサキス症の予防又は症状緩和に有用な手段を提供すること、特に、胃内環境下でアニサキスを殺滅する又はその運動性を低減させる効果を発揮することができる、胃アニサキス症の予防又は症状緩和に有用な手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、カルバクロールが広いｐＨ範囲にわたってアニサキスに対する殺滅活性を有すること、また、カルバクロールを溶解した水混和性液体、及びカルバクロールを乳化したエマルションが胃内のアニサキスを殺滅する効果を示すことを見出した。
【0011】
本開示は以下の発明を提供する。
［項１］経口摂取によるアニサキス症の予防又は症状緩和のための、カルバクロールを含む水混和性液体又はエマルションである、抗アニサキス組成物。
［項２］カルバクロールを含む水混和性液体であって、水混和性液体がエタノール及び／又はプロピレングリコールと水との混合物である、項１に記載の抗アニサキス組成物。
［項３］カルバクロールと油性成分と乳化剤と水とを含む、水中油型のエマルションである、項１に記載の抗アニサキス組成物。
［項４］オレガノ抽出物を含む水混和性液体又はエマルションである、項１～３に記載の抗アニサキス組成物。
［項５］胃アニサキス症の予防又は症状緩和のための、項１～４のいずれか一項に記載の抗アニサキス組成物。
［項６］項１～５のいずれか一項に記載の抗アニサキス組成物を含む、飲食品。
［項７］項１～５のいずれか一項に記載の抗アニサキス組成物を含む、医薬。
［項１］経口摂取によるアニサキス症の予防又は症状緩和のための、カルバクロールを含む水混和性液体又はエマルションである、抗アニサキス組成物。
［項２］カルバクロールを含む水混和性液体であって、水混和性液体がエタノール及び／又はプロピレングリコールと水との混合物である、項１に記載の抗アニサキス組成物。
［項３］カルバクロールと油性成分と乳化剤と水とを含む、水中油型のエマルションである、項１に記載の抗アニサキス組成物。
［項４］オレガノ抽出物を含む水混和性液体又はエマルションである、項１～３に記載の抗アニサキス組成物。
［項５］胃アニサキス症の予防又は症状緩和のための、項１～４のいずれか一項に記載の抗アニサキス組成物。
［項６］項１～５のいずれか一項に記載の抗アニサキス組成物を含む、飲食品。
［項７］項１～５のいずれか一項に記載の抗アニサキス組成物を含む、医薬。
【発明の効果】
【0012】
本発明の抗アニサキス組成物は、胃内の低ｐＨ環境下でも腸内の中性ｐＨ環境下でもアニサキスを殺滅する、又はその運動性を低減させる効果を有することから、経口的に摂取することで、アニサキス症、とりわけ胃アニサキス症を予防し、また付随する症状を緩和することができる。また、本発明の抗アニサキス組成物によると、胃又は小腸に滞留している数時間の間にカルバクロールをアニサキス虫体に浸透させることができるため、カルバクロールの有効濃度を維持するために連続的に投与することは必要なく、通常の飲食品、サプリメント等の形態で摂取すればよいという簡便性も有する。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】ｐＨ１．２、３．０及び６．８における、クレオソート、カルバクロール、レバミゾール、ブロメライン、パパイン、ゲラニオール及びベルベリン存在下でのアニサキスの運動性を示すグラフである。なお、図１、２、５、６、１５、１６、１９及び２０において、＋＋＋～－はアニサキスの運動性レベル（＋＋＋：「自発的に運動している又はピンセットで刺激するとすぐ丸まる、＋＋：ピンセットで刺激すると丸まらないが動く、＋：ピンセットで刺激してもわずかにしか動かない、－：反応なし又は虫体が壊れている）であり、縦軸は各レベルについて判定された虫体数を表す。
【図2】ｐＨ３．０における、クレオソート、ブロメライン、カルバクロール及びゲラニオールの濃度に応じたアニサキスの運動性を示すグラフである。
【図3】ｐＨ３．０における、クレオソート、ブロメライン、カルバクロール及びゲラニオールの処理時間に応じたアニサキスの死滅数を示すグラフである。なお、図３、７、８、１７及び２１において、横軸は時間を、縦軸は運動性－と判定された虫体数を表す。
【図4】クレオソート、ブロメライン、カルバクロール及びゲラニオール存在下でのＣａｃｏ－２細胞の生存率を示すグラフである。
【図5】ｐＨ１．２及び６．８における、カルバクロールのエマルション（カルバクロール－エマルション）の濃度に応じたアニサキスの運動性を示すグラフである。
【図6】ｐＨ１．２及び６．８における、カルバクロールのエタノール水溶液（カルバクロール－水混和性液体）の濃度に応じたアニサキスの運動性を示すグラフである。
【図7】ｐＨ１．２及び６．８における、カルバクロール－エマルションの処理時間に応じたアニサキスの死滅数を示すグラフである。
【図8】ｐＨ１．２及び６．８における、カルバクロール－水混和性液体の処理時間に応じたアニサキスの死滅数を示すグラフである。
【図9】ｐＨ１．２及び６．８における、カルバクロール－エマルションの処理時間に応じたアニサキス虫体内へのカルバクロール送達量を示すグラフである。
【図10】ｐＨ１．２及び６．８における、カルバクロール－水混和性液体の処理時間に応じたアニサキス虫体内へのカルバクロール送達量を示すグラフである。
【図11】カルバクロール－エマルション存在下でのＣａｃｏ－２細胞の生存率を示すグラフである。
【図12】カルバクロール－水混和性液体存在下でのＣａｃｏ－２細胞の生存率を示すグラフである。
【図13】カルバクロール－エマルション又はカルバクロール－水混和性液体を投与したアニサキス感染ラットにおける消化管内のアニサキスの死滅率を示すグラフである。図中、縦軸は、投与した全虫体数に対する、運動性－と判定された虫体数の割合を表す。
【図14】カルバクロール－エマルション又はカルバクロール－水混和性液体を投与したラットの消化管の画像を示す。図中、△は傷害が観察された箇所を示す。
【図15】ｐＨ１．２、３．０及び６．８におけるチモール存在下でのアニサキスの運動性を示すグラフである。
【図16】ｐＨ３．０におけるチモールの濃度に応じたアニサキスの運動性を示すグラフである。
【図17】ｐＨ３．０におけるチモールの処理時間に応じたアニサキスの死滅数を示すグラフである。
【図18】チモール存在下でのＣａｃｏ－２細胞の生存率を示すグラフである。
【図19】ｐＨ１．２、３．０及び６．８におけるオレガノ抽出物存在下でのアニサキスの運動性を示すグラフである。
【図20】ｐＨ３．０におけるオレガノ抽出物の濃度に応じたアニサキスの運動性を示すグラフである。
【図21】ｐＨ３．０におけるオレガノ抽出物の処理時間に応じたアニサキスの死滅数を示すグラフである。
【図22】オレガノ抽出物のエマルション又は水混和性液体を投与したアニサキス感染ラットにおける消化管内のアニサキスの死滅率を示すグラフである。図中、縦軸は、投与した全虫体数に対する、運動性－と判定された虫体数の割合を表す。
【図23】オレガノ抽出物のエマルション又は水混和性液体を投与したラットの消化管の画像を示す。図中、△は傷害が観察された箇所を示す。
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下に示す説明は、代表的な実施形態又は具体例に基づくことがあるが、本発明はそのような実施形態又は具体例に限定されるものではない。本明細書において示される各数値範囲の上限値及び下限値は、任意に組み合わせることができる。また、本明細書において「～」又は「-」を用いて表される数値範囲は、特に断りがない場合、その両端の数値を上限値及び下限値として含む範囲を意味する。
【0015】
本発明は、経口摂取によるアニサキス症の予防又は症状緩和のための、カルバクロールを含む水混和性液体又はエマルションである、抗アニサキス組成物を提供する。抗アニサキス組成物は、消化管内環境下で、とりわけ胃内環境下でアニサキスを殺滅する又はその運動性を低減させるための組成物である。
【0016】
カルバクロール（Ｃａｒｖａｃｒｏｌ）は、以下の式で表される常温で液状のモノテルペン誘導体であり、食用ハーブの一種であるオレガノ（Ｏｒｉｇａｎｕｍ ｖｕｌｇａｌｅ）の香り成分として知られている。
【化1】
【0017】
カルバクロールは、オレガノの他、タイム（Ｔｈｙｍｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ウインターセイボリー（Ｓａｔｕｒｅｊａ ｍｏｎｔａｎａ）、サマーセイボリー（Ｓａｔｕｒｅｊａ ｈｏｒｔｅｎｓｉｓ）、アジョワン（Ｔｒａｃｈｙｓｐｅｒｍｕｍ ａｍｍｉ）、タイマツバナ（Ｍｏｎａｒｄａ ｄｉｄｙｍａ）、ヤグルマハッカ（Ｍｏｎａｒｄａ ｆｉｓｔｕｌｏｓａ）、ヤマジソ（Ｍｏｓｌａ ｊａｐｏｎｉｃａ）などにも含まれている。本発明の抗アニサキス組成物は、単離精製されたカルバクロールを用いて製造してもよく、上に例示したようなカルバクロールを含有する植物からの抽出物を用いて製造してもよい。抽出物の例としては、精油や食品添加物であるオレガノ抽出物等を挙げることができる。
【0018】
抽出物は、カルバクロールを含有する植物の葉、花、幹、樹皮、種子、根等の任意の部分から、蒸留又は溶媒抽出等の公知の方法により調製することができる。抽出物は、カルバクロールの他に、植物由来のエステル、アルデヒド、アルコール、ケトン、テルペン、モノテルペン、セスキテルペン、フェノール、オキシド等を含んでいてもよい。
【0019】
本発明の抗アニサキス組成物は、抗アニサキス効果を有する。抗アニサキス効果とは、経口的に摂取されたとき、消化管内に、とりわけ胃内に存在するアニサキスを殺滅する又はその運動性を低減させる効果を意味する。抗アニサキス効果は、例えば、消化管内環境を模した溶液中にアニサキスと組成物とを共存させた後、アニサキスの運動性を評価することで、確認することができる。
【0020】
抗アニサキス組成物中のカルバクロール含量は、組成物が抗アニサキス効果を発揮できるかぎり制限はなく、所望のカルバクロール摂取量、組成物の形態や容量といった要因に応じて適宜設定することができる。
【0021】
一つの実施形態において、抗アニサキス組成物は、カルバクロールを溶解した水混和性液体である。水混和性液体は、カルバクロールを溶解することができ、かつ水に混和する液体であればよく、その例としては、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、常温で液体のポリエチレングリコール（マクロゴール）、及びこれらと水との混合物等を挙げることができる。水混和性液体の好ましい例は、エタノール、又はエタノールと水の混合物（エタノール水溶液）である。水混和性液体の別の好ましい例は、プロピレングリコール、又はプロピレングリコールと水との混合物（プロピレングリコール水溶液）である。水混和性液体のまた別の好ましい例は、エタノールとプロピレングリコールとの混合物、又はエタノールとプロピレングリコールと水との混合物である。
【0022】
エタノールを含む水混和性液体のエタノール濃度は、所望量のカルバクロールを溶解できるかぎり制限はなく、例えば５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上であり得て、また９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下であり得る。また、プロピレングリコールを含む水混和性液体のプロピレングリコール濃度は、所望量のカルバクロールを溶解できるかぎり制限はなく、例えば５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上であり得て、また９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下であり得る。
【0023】
一つの実施形態において、抗アニサキス組成物は、カルバクロールを乳化したエマルション（エマルション組成物）である。エマルション組成物は、好ましくは、カルバクロールと油性成分と乳化剤と水とを含む、水中油型のエマルションである。
【0024】
エマルション組成物において用いられ得る油性成分は、好ましくは、中鎖脂肪酸トリグリセライド及び動植物性油脂からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む。中鎖脂肪酸トリグリセライドの例としては、トリグリセライドを構成する脂肪酸の炭素数が８～１０である中鎖脂肪酸トリグリセリドが挙げられる。動植物性油脂の例としては、大豆油、菜種油、綿実油、ひまわり油、サフラワー油、やし油、小麦胚芽油、コーン胚芽油、オリーブ油、米ぬか油、ココナッツ油等の植物性、油脂、肝油、魚油、鯨油等の動物性油脂が挙げられる。油性成分は、１種のみであってもよいし、２種以上を組み合わせてもよい。エマルション組成物の全質量に対する油性成分の含有比率は、所望量のカルバクロールを乳化したエマルションを形成できるかぎり制限はなく、例えば５～５０質量％、５～３０質量％、又は５～２０質量％であり得る。
【0025】
エマルション組成物において用いられ得る乳化剤としては、例えば、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル（例としてＴｗｅｅｎ８０等）、ショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、レシチン、サポニン、ステロール等を挙げることができる。乳化剤は、１種のみであってもよいし、２種以上を組み合わせてもよい。エマルション組成物の全質量に対する乳化剤の含有比率は、所望量のカルバクロールを乳化したエマルションを形成できるかぎり制限はなく、例えば０．００１～１０質量％、０．０１～５質量％、又は０．０５～２質量％であり得る。
【0026】
エマルションは、一般的な方法により、カルバクロールと水とを又はカルバクロールと油性成分と水とを乳化剤の存在下で混合、乳化することにより、製造することができる。水は他の任意の水溶性成分を含んでいてもよく、また油性成分は他の油溶性成分を含んでいてもよい。エマルションは、各成分を一括に混合して又は逐次混合することで製造してもよい。混合、乳化は、例えば、超音波処理装置、スターラー、インペラー式撹拌機、ホモミキサーその他の通常の乳化装置を用いて行うことができる。エマルションの粒子径の均一化を図る目的で、乳化は複数回行ってもよい。
【0027】
エマルション組成物の平均粒子径は、特に限定されず、例えば１０ｎｍ～４００ｎｍ、２０ｎｍ～３００ｎｍ、５０ｎｍ～２５０ｎｍ、又は１００ｎｍ～２５０ｎｍであり得る。ここで平均粒子径とは、散乱光強度基準の調和平均粒子径（直径）を意味し、動的光散乱（ＤＬＳ）法による測定及びキュムラント解析により得ることができる。動的光散乱法による測定及びキュムラント解析は、市販のＤＬＳ装置等を用いて、ＪＩＳ Ｚ ８８２８：２０１９、ＩＳＯ ２２４１２：２０１７等に記載される方法によって行うことができる。
【0028】
エマルション組成物は、多分散指数（ＰｄＩ）が０．４以下、０．３５以下、０．３以下、又は０．２５以下であり得て、また０．０５以上、０．１以上、０．１５以上、０．２以上であり得る。ＰｄＩは、ＤＬＳ法による測定及びキュムラント解析により得ることができる。
【0029】
本発明の抗アニサキス組成物は、必要に応じて任意の他の成分を１種又は２種以上含有していてもよい。他の成分は、飲食品、医薬に使用可能なものであれば、特に制限されない。他の成分の例としては、カルバクロール以外の抗アニサキス成分その他の生理活性成分、緩衝剤、安定剤、保存剤、賦形剤等が挙げられる。
【0030】
カルバクロールは比重が０．９７６と低く、水に不溶であることから、直に経口摂取しても胃液又は胃内容物の上面にしか到達せず、十分な抗アニサキス効果を期待することは困難である。一方、本発明の抗アニサキス組成物は、水混和性液体又はエマルションの形態であることから、消化管内に広がってアニサキスを有効量のカルバクロールに暴露させ、結果として高い抗アニサキス効果を発揮することができる。また、本発明の抗アニサキス組成物は、胃内の低ｐＨ環境下、腸内の中性ｐＨ環境下のいずれにおいても、短い滞留時間のうちに抗アニサキス効果を示すことができる。
【0031】
以上から、アニサキスに汚染された食材、典型的には生の又は調理不十分な魚介類を食してアニサキス症を発症した際に、本発明の抗アニサキス組成物を摂取すれば、アニサキスが死滅する又はその運動性が低減されることにより、アニサキス症の諸症状を消失又は緩和することができると期待される。また、アニサキスに汚染された又はそのおそれのある食材を食する前、食事中又は食後に本発明の抗アニサキス組成物を摂取することで、アニサキス症の発症を予防したり、発症時の症状を軽くしたりすることができると期待される。
【0032】
抗アニサキス組成物は、飲食品及び医薬の形態で利用することができる。ここで飲食品とは、飲料（飲料の濃縮原液を含む）、調味料を含む一般的な加工食品、サプリメント、健康食品（機能性飲食品）、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品）を幅広く含むものとして理解される。
【0033】
抗アニサキス組成物を含む飲食品及び医薬の形態は、経口摂取に適したものであればよい。一つの実施形態において、飲食品及び医薬は、例えば、カプセル剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ剤等の経口剤の形態であり得る。
【0034】
また、本発明者らは、カルバクロールに加えて、チモール、ゲラニオール、ブロメライン及びパパインもアニサキスに対する殺滅活性を有することを見出した。本発明は、経口摂取によるアニサキス症の予防又は症状緩和のための、チモール、ゲラニオール、ブロメライン及びパパインよりなる群から選択される少なくとも１つを含む抗アニサキス組成物を提供する。
【0035】
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の理解を助けるためのものであって、本発明の技術的範囲を限定するものではない。
【実施例0036】
［試験材料及び方法］
（１）材料
クレオソート、カルバクロール、レバミゾール、ブロメライン、パパイン及び大豆油は、富士フイルム和光純薬株式会社より、ベルベリンは東京化成工業株式会社より、ゲラニオールはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈより、Ｔｗｅｅｎ ８０は関東化学株式会社より、チモールは富士フイルム和光純薬株式会社より、オレガノ抽出物はＮＡＴＵＲＡＬ ＦＡＣＴＯＲＳ（米国）より、それぞれ購入した。その他の試薬は、市販特級品及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用を用いた。
（１）材料
クレオソート、カルバクロール、レバミゾール、ブロメライン、パパイン及び大豆油は、富士フイルム和光純薬株式会社より、ベルベリンは東京化成工業株式会社より、ゲラニオールはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈより、Ｔｗｅｅｎ ８０は関東化学株式会社より、チモールは富士フイルム和光純薬株式会社より、オレガノ抽出物はＮＡＴＵＲＡＬ ＦＡＣＴＯＲＳ（米国）より、それぞれ購入した。その他の試薬は、市販特級品及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用を用いた。
【0037】
アニサキスは、北海道沿岸海域で捕獲されたホッケ及びニシンの内臓から採取し、生理食塩水中に4℃で保存した。採取後７日以内のアニサキスを実験に用いた。
【0038】
（２）アニサキスの運動性試験
各被験物質の抗アニサキス効果は、被験物質との共存下でのアニサキスの運動性を指標として評価した。被験物質を溶解させる等張食塩水として、ｐＨ１．２及び３．０での試験の場合は１４０ｍＭ 塩化ナトリウムを含む塩酸水溶液を、ｐＨ６．８での試験の場合は１４０ｍＭ 塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ ２－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＭＥＳ）緩衝液を用いた。なお、ｐＨ１．２の等張食塩水は人工胃液、ｐＨ６．８の等張食塩水は人工腸液とも表す。
各被験物質の抗アニサキス効果は、被験物質との共存下でのアニサキスの運動性を指標として評価した。被験物質を溶解させる等張食塩水として、ｐＨ１．２及び３．０での試験の場合は１４０ｍＭ 塩化ナトリウムを含む塩酸水溶液を、ｐＨ６．８での試験の場合は１４０ｍＭ 塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ ２－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＭＥＳ）緩衝液を用いた。なお、ｐＨ１．２の等張食塩水は人工胃液、ｐＨ６．８の等張食塩水は人工腸液とも表す。
【0039】
等張食塩水に所定濃度の被験物質を添加して調製した試験液２ｍＬを１２ウェル細胞培養プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに分注し、アニサキスを１匹／ウェル入れ、３７℃でインキュベートした（ｎ＝１２）。アニサキスの運動性は、ピンセットで刺激したときのアニサキスの反応を観察し、以下に示す４段階で評価した。
＋＋＋：自発的に運動している又はピンセットで刺激するとすぐ丸まる
＋＋ ：ピンセットで刺激すると丸まらないが動く
＋ ：ピンセットで刺激してもわずかにしか動かない
－ ：反応なし又は虫体が壊れている（死滅とみなした）
＋＋＋：自発的に運動している又はピンセットで刺激するとすぐ丸まる
＋＋ ：ピンセットで刺激すると丸まらないが動く
＋ ：ピンセットで刺激してもわずかにしか動かない
－ ：反応なし又は虫体が壊れている（死滅とみなした）
【0040】
（３）ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性試験
理化学研究所Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋから購入したヒト結腸癌由来細胞Ｃａｃｏ－２を、培養液として１％ Ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（Ｂｉｏｗｅｓｔ）及び４０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（ＭＳＤ株式会社）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ改変培地（富士フイルム和光純薬）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。９０％コンフルエントに達した細胞を０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡを用いて回収、継代培養し、５４－６１代目のＣａｃｏ－２細胞を実験に使用した。
理化学研究所Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋから購入したヒト結腸癌由来細胞Ｃａｃｏ－２を、培養液として１％ Ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（Ｂｉｏｗｅｓｔ）及び４０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（ＭＳＤ株式会社）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ改変培地（富士フイルム和光純薬）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。９０％コンフルエントに達した細胞を０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡを用いて回収、継代培養し、５４－６１代目のＣａｃｏ－２細胞を実験に使用した。
【0041】
９６ウェル細胞培養プレートにＣａｃｏ－２細胞を２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ウェル播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で９０－１００％コンフルエントまで培養した。培養液を除去した後、所定濃度の被験物質を添加した新たな培養液１００μＬを添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。培養後、ＭＴＴ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いてＭＴＴ ａｓｓａｙを行った。
【0042】
（４）カルバクロールの定量
試料中のカルバクロール濃度は、ＨＰＬＣ－紫外吸光測定法によって測定した。ＨＰＬＣ条件を以下に示す。検量線は０．２－１２．８μｇ／ｍＬの範囲で良好な直線性を示した。
移動相：１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）：アセトニトリル＝５０：５０（ｖ／ｖ）
注入量：２０μＬ
流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８、５μｍ、３．０×２５０ｍｍ
（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ．）
ガードカラム：Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｇｕａｒｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｅ、
ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｓｗｉｆｔ Ｃ１８ ５μｍ
Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（３．０×１０ｍｍ）（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ）
カラム温度：４０℃
ポンプ：ＬＣ２０－ＡＴ（島津製作所）
検出器：ＳＰＤ－４０Ｖ（島津製作所）
検出波長：２７５ｎｍ
試料中のカルバクロール濃度は、ＨＰＬＣ－紫外吸光測定法によって測定した。ＨＰＬＣ条件を以下に示す。検量線は０．２－１２．８μｇ／ｍＬの範囲で良好な直線性を示した。
移動相：１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）：アセトニトリル＝５０：５０（ｖ／ｖ）
注入量：２０μＬ
流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８、５μｍ、３．０×２５０ｍｍ
（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ．）
ガードカラム：Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｇｕａｒｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｅ、
ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｓｗｉｆｔ Ｃ１８ ５μｍ
Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（３．０×１０ｍｍ）（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ）
カラム温度：４０℃
ポンプ：ＬＣ２０－ＡＴ（島津製作所）
検出器：ＳＰＤ－４０Ｖ（島津製作所）
検出波長：２７５ｎｍ
【0043】
エマルション中のカルバクロール濃度を測定する場合は、エマルションを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２５００倍希釈し、希釈液１５０μＬに内標準物質としてｐ－安息香酸ブチルのアセトニトリル溶液（５μｇ／ｍＬ）１５０μＬを加えることでＨＰＬＣ試料を調製した。
【0044】
カルバクロールの虫体への取り込み実験におけるアニサキス虫体中のカルバクロール量を測定する場合は、虫体抽出液１５０μＬにｐ－安息香酸ブチルのアセトニトリル溶液（５μｇ／ｍＬ）１５０μＬを加え、遠心分離（１０，０００×ｇ、５分、４℃）後に上清を回収し、０．４５μｍフィルターのＭｉｌｌｅｘ（登録商標）－ＨＶ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過することでＨＰＬＣ試料を調製した。
【0045】
（５）統計解析
統計解析にはＳＰＳＳ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２７（ＩＢＭ）を用いた。得られたデータは全て平均値±標準偏差（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．）で示した。Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ－ｔｅｓｔを、また多重比較にはＤｕｎｎｅｔｔの方法を用い、ｐ＜０．０５を統計学的に有意とした。
統計解析にはＳＰＳＳ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２７（ＩＢＭ）を用いた。得られたデータは全て平均値±標準偏差（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．）で示した。Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ－ｔｅｓｔを、また多重比較にはＤｕｎｎｅｔｔの方法を用い、ｐ＜０．０５を統計学的に有意とした。
【0046】
［実施例１．カルバクロールの抗アニサキス効果に対するｐＨの影響］
クレオソート１０００μｇ／ｍＬ、カルバクロール１００μｇ／ｍＬ、レバミゾール５０μｇ／ｍＬ、ブロメライン２００μＭ、パパイン２００μＭ、ゲラニオール１００μｇ／ｍＬ、又はベルベリン５００μｇ／ｍＬを含むｐＨ１．２、３．０又は６．８の試験液を用いてアニサキスを２４時間インキュベートし、運動性を評価した。結果を図１に示す。レバミゾール及びベルベリンはいずれのｐＨにおいてもアニサキスを全く又はほとんど死滅させることはできなかった。また、ブロメライン及びゲラニオールはｐＨ３．０以上の場合に、パパインはｐＨ６．８の場合のみ、アニサキスを死滅させた。一方、クレオソート及びカルバクロールは、いずれのｐＨにおいてもアニサキスを死滅させ、ｐＨ１．２という低ｐＨ環境下でも抗アニサキス効果を示すことが確認された。
クレオソート１０００μｇ／ｍＬ、カルバクロール１００μｇ／ｍＬ、レバミゾール５０μｇ／ｍＬ、ブロメライン２００μＭ、パパイン２００μＭ、ゲラニオール１００μｇ／ｍＬ、又はベルベリン５００μｇ／ｍＬを含むｐＨ１．２、３．０又は６．８の試験液を用いてアニサキスを２４時間インキュベートし、運動性を評価した。結果を図１に示す。レバミゾール及びベルベリンはいずれのｐＨにおいてもアニサキスを全く又はほとんど死滅させることはできなかった。また、ブロメライン及びゲラニオールはｐＨ３．０以上の場合に、パパインはｐＨ６．８の場合のみ、アニサキスを死滅させた。一方、クレオソート及びカルバクロールは、いずれのｐＨにおいてもアニサキスを死滅させ、ｐＨ１．２という低ｐＨ環境下でも抗アニサキス効果を示すことが確認された。
【0047】
［実施例２．カルバクロールの抗アニサキス効果の濃度依存性］
１０～１０００μｇ／ｍＬのクレオソート、３．１２５～８００μＭのブロメライン、３～３００μｇ／ｍＬのカルバクロール、又は３～３００μｇ／ｍＬのゲラニオールを含むｐＨ３．０の試験液を用いてアニサキスを２４時間インキュベートし、運動性を評価した。
１０～１０００μｇ／ｍＬのクレオソート、３．１２５～８００μＭのブロメライン、３～３００μｇ／ｍＬのカルバクロール、又は３～３００μｇ／ｍＬのゲラニオールを含むｐＨ３．０の試験液を用いてアニサキスを２４時間インキュベートし、運動性を評価した。
【0048】
結果を図２に示す。クレオソートは１０００μｇ／ｍＬで、ブロメラインは５０μＭ以上で、カルバクロールは１００μｇ／ｍＬ以上で、ゲラニオールは３００μｇ／ｍＬで、大半もしくは全てのアニサキスを死滅させた。ブロメラインによって死滅したアニサキスは、虫体が破壊され形状が保たれていなかった。カルバクロール及びゲラニオールによって死滅したアニサキスは、虫体が白濁し、不自然な姿勢のまま硬直していた。
【0049】
［実施例３．カルバクロールの抗アニサキス効果の時間依存性］
クレオソート１０００μｇ／ｍＬ、ブロメライン８００μＭ、カルバクロール３００μｇ／ｍＬ又はゲラニオール３００μｇ／ｍＬを含むｐＨ３．０の試験液を用いてアニサキスを０．５、１、２、６又は２４時間インキュベートして運動性を評価し、－と判定された虫体数を計測した。
クレオソート１０００μｇ／ｍＬ、ブロメライン８００μＭ、カルバクロール３００μｇ／ｍＬ又はゲラニオール３００μｇ／ｍＬを含むｐＨ３．０の試験液を用いてアニサキスを０．５、１、２、６又は２４時間インキュベートして運動性を評価し、－と判定された虫体数を計測した。
【0050】
結果を図３に示す。カルバクロールでは０．５時間後に、ゲラニオールでは６時間後に、クレオソート及びブロメラインでは２４時間後に全アニサキスが死滅した。カルバクロールはきわめて短時間で抗アニサキス効果を示すことが確認された。
【0051】
［実施例４．消化管細胞に対するカルバクロールの細胞毒性］
３～１０００μｇ／ｍＬのクレオソート、３．１２５～８００μＭのブロメライン、３～３００μｇ／ｍＬのカルバクロール、又は３～３００μｇ／ｍＬのゲラニオールを含む培養液を用いてＣａｃｏ－２細胞を２４時間培養し、細胞毒性を評価した。
３～１０００μｇ／ｍＬのクレオソート、３．１２５～８００μＭのブロメライン、３～３００μｇ／ｍＬのカルバクロール、又は３～３００μｇ／ｍＬのゲラニオールを含む培養液を用いてＣａｃｏ－２細胞を２４時間培養し、細胞毒性を評価した。
【0052】
結果を図４に示す。クレオソートは１０００μｇ／ｍＬで、ブロメラインは３．１２５μＭ以上で、カルバクロールは１００μｇ／ｍＬ以上で、ゲラニオールは３００μｇ／ｍＬで、細胞生存率が有意に低下した。カルバクロールは、抗アニサキス効果を示す１００μｇ／ｍＬにおける細胞生存率は８０％であり、細胞毒性の程度は比較的弱いものであった。
【0053】
実施例１～４の結果から、カルバクロールは広いｐＨ範囲において短時間で抗アニサキス効果を発揮し、かつ有効性を示す濃度で著しい細胞毒性を示さないことが明らかになった。
【0054】
［実施例５．カルバクロールを含有するエマルション及び水混和性液体の調製］
（１）カルバクロール含有エマルションの調製
カルバクロール２５ｍｇ、大豆油２５０ｍｇ及び１０％Ｔｗｅｅｎ８０ ３００ｍｇに精製水を加えて全量２．５ｍＬとし、超音波処理（５０Ｗ、２０秒×３回）を行って、濃度１０ｍｇ／ｍＬのカルバクロール含有エマルション（以下、カルバクロール－エマルションと表す）を調製した。粒子径・ゼータ電位測定装置（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いて動的光散乱法にて測定したカルバクロール－エマルションの平均粒子径は約２３０ｎｍ、多分散指数は０．２５未満であった。また、メチレンブルーを用いた色素法にて乳剤型を判別したところ、分散媒が青色に着色され、水中油型（Ｏ／Ｗ型）であることが確認された。
（１）カルバクロール含有エマルションの調製
カルバクロール２５ｍｇ、大豆油２５０ｍｇ及び１０％Ｔｗｅｅｎ８０ ３００ｍｇに精製水を加えて全量２．５ｍＬとし、超音波処理（５０Ｗ、２０秒×３回）を行って、濃度１０ｍｇ／ｍＬのカルバクロール含有エマルション（以下、カルバクロール－エマルションと表す）を調製した。粒子径・ゼータ電位測定装置（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いて動的光散乱法にて測定したカルバクロール－エマルションの平均粒子径は約２３０ｎｍ、多分散指数は０．２５未満であった。また、メチレンブルーを用いた色素法にて乳剤型を判別したところ、分散媒が青色に着色され、水中油型（Ｏ／Ｗ型）であることが確認された。
【0055】
（２）カルバクロール含有エタノール水溶液の調製
カルバクロール３ｍｇを１００μＬの９９.５％エタノールに溶解した後、全量が１ｍＬとなるように精製水を添加して、濃度３ｍｇ／ｍＬのカルバクロール含有エタノール水溶液（以下、カルバクロール－水混和性液体と表す）を調製した。カルバクロール－水混和性液体は、透明な液体であった。
カルバクロール３ｍｇを１００μＬの９９.５％エタノールに溶解した後、全量が１ｍＬとなるように精製水を添加して、濃度３ｍｇ／ｍＬのカルバクロール含有エタノール水溶液（以下、カルバクロール－水混和性液体と表す）を調製した。カルバクロール－水混和性液体は、透明な液体であった。
【0056】
［実施例６．カルバクロール－エマルション及びカルバクロール－水混和性液体の評価（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）］
（１）抗アニサキス効果の濃度依存性
カルバクロールの最終濃度が１０～３００μｇ／ｍＬとなるようにカルバクロール－エマルション又はカルバクロール－水混和性液体を添加したｐＨ１．２の試験液（人工胃液）又はｐＨ６．８の試験液（人工腸液）を用いてアニサキスを２４時間インキュベートし、運動性を評価した。
（１）抗アニサキス効果の濃度依存性
カルバクロールの最終濃度が１０～３００μｇ／ｍＬとなるようにカルバクロール－エマルション又はカルバクロール－水混和性液体を添加したｐＨ１．２の試験液（人工胃液）又はｐＨ６．８の試験液（人工腸液）を用いてアニサキスを２４時間インキュベートし、運動性を評価した。
【0057】
【0058】
（２）抗アニサキス効果の時間依存性
カルバクロールの最終濃度が３００μｇ／ｍＬとなるようにエマルション又は水混和性液体を添加したｐＨ１．２の試験液（人工胃液）又はｐＨ６．８の試験液（人工腸液）を用いてアニサキスを０．５、１、２、６又は２４時間インキュベートして運動性を評価し、－と判定された虫体数を計測した。
カルバクロールの最終濃度が３００μｇ／ｍＬとなるようにエマルション又は水混和性液体を添加したｐＨ１．２の試験液（人工胃液）又はｐＨ６．８の試験液（人工腸液）を用いてアニサキスを０．５、１、２、６又は２４時間インキュベートして運動性を評価し、－と判定された虫体数を計測した。
【0059】
エマルションの結果を図７に、水混和性液体の結果を図８に示す。エマルションでは６時間後に、水混和性液体では１時間後に、いずれのｐＨにおいても大半のアニサキスが死滅した。両組成物は、きわめて短時間で抗アニサキス効果を示すことが確認された。
【0060】
（３）カルバクロールの虫体内送達能
カルバクロールの最終濃度が３０μｇ／ｍＬとなるようにエマルション又は水混和性液体を添加したｐＨ１．２の試験液（人工胃液）１．８ｍＬを、アニサキス１匹と共に２ｍＬマイクロチューブに入れ、３７℃で０．２５、０．５、１又は２時間インキュベートした。インキュベート後、アニサキスを回収し、生理食塩水で洗浄した。水気を切ったアニサキス３匹を生理食塩水０．６ｍＬを入れた試験管に加えてホモジネートし、得られたアニサキス虫体抽出液を－３０℃で保存した。虫体抽出液中のカルバクロール濃度は、ＨＰＬＣを用いて測定した。また、虫体抽出液中のＤＮＡ濃度は、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＤＮＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて測定し、アニサキスのＤＮＡ量あたりのカルバクロール送達量を算出することで、虫体内送達能を評価した。
カルバクロールの最終濃度が３０μｇ／ｍＬとなるようにエマルション又は水混和性液体を添加したｐＨ１．２の試験液（人工胃液）１．８ｍＬを、アニサキス１匹と共に２ｍＬマイクロチューブに入れ、３７℃で０．２５、０．５、１又は２時間インキュベートした。インキュベート後、アニサキスを回収し、生理食塩水で洗浄した。水気を切ったアニサキス３匹を生理食塩水０．６ｍＬを入れた試験管に加えてホモジネートし、得られたアニサキス虫体抽出液を－３０℃で保存した。虫体抽出液中のカルバクロール濃度は、ＨＰＬＣを用いて測定した。また、虫体抽出液中のＤＮＡ濃度は、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＤＮＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて測定し、アニサキスのＤＮＡ量あたりのカルバクロール送達量を算出することで、虫体内送達能を評価した。
【0061】
【0062】
（４）細胞毒性
カルバクロールの最終濃度が３０～５００μｇ／ｍＬとなるようにエマルション又は水混和性液体を添加した培養液を用いてＣａｃｏ－２細胞を２４時間培養し、細胞毒性を評価した。
カルバクロールの最終濃度が３０～５００μｇ／ｍＬとなるようにエマルション又は水混和性液体を添加した培養液を用いてＣａｃｏ－２細胞を２４時間培養し、細胞毒性を評価した。
【0063】
エマルションの結果を図１１に、水混和性液体の結果を図１２に示す。エマルションは３００μｇ／ｍＬで、水混和性液体は１００μｇ／ｍＬ以上で、細胞生存率が有意に低下した。エマルションは、抗アニサキス効果を示す１００μｇ／ｍＬ及びその２倍濃度の２００μｇ／ｍＬにおいても細胞生存率の低下を認めなかった。また水混和性液体は、１００μｇ／ｍＬにおける細胞生存率が約８５％であり、細胞毒性の程度は比較的弱いものであった。
【0064】
以上から、カルバクロールのエマルション及び水混和性液体は、胃内環境下でも腸内環境下でも短時間で抗アニサキス効果を発揮し、かつ有効性を示す濃度で著しい細胞毒性を示さないこと、特にエマルションは有効性を示す濃度の２倍の濃度であっても細胞毒性を示さないことが明らかになった。
【0065】
［実施例７．カルバクロール－エマルション及びカルバクロール－水混和性液体の評価（ｉｎ ｖｉｖｏ）］
（１）抗アニサキス効果
Ｗｉｓｔａｒ雌性ラット（９週齢、１４０ｇ）を１日絶食させた後、ラット１匹あたりアニサキス６匹／０．６ｍＬをゾンデで経口投与した（ｎ＝６／群）。アニサキス投与後直ちに、実施例５で調製したカルバクロール－エマルション１ｍＬ又は０．２５ｍＬ、あるいはカルバクロール－水混和性液体１ｍＬを、また比較例として生理食塩水１ｍＬ、１．６ｍｇの正露丸（大幸薬品）を生理食塩水に懸濁した液１ｍＬ、又はオリーブ油にカルバクロールを溶解して調製したオリーブ油賦形液体（３ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬをゾンデで経口投与した。１時間後、ラット消化管内のアニサキスを回収し、ピンセットで刺激を与えて運動性を判定し、－と判定された虫体数を計測して致死率を算出した。
（１）抗アニサキス効果
Ｗｉｓｔａｒ雌性ラット（９週齢、１４０ｇ）を１日絶食させた後、ラット１匹あたりアニサキス６匹／０．６ｍＬをゾンデで経口投与した（ｎ＝６／群）。アニサキス投与後直ちに、実施例５で調製したカルバクロール－エマルション１ｍＬ又は０．２５ｍＬ、あるいはカルバクロール－水混和性液体１ｍＬを、また比較例として生理食塩水１ｍＬ、１．６ｍｇの正露丸（大幸薬品）を生理食塩水に懸濁した液１ｍＬ、又はオリーブ油にカルバクロールを溶解して調製したオリーブ油賦形液体（３ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬをゾンデで経口投与した。１時間後、ラット消化管内のアニサキスを回収し、ピンセットで刺激を与えて運動性を判定し、－と判定された虫体数を計測して致死率を算出した。
【0066】
結果を図１３に示す。エマルションは０．２５ｍＬ（カルバクロール２．５ｍｇ）以上の投与で約７５％のアニサキスを死滅させた。また、水混和性液体は１ｍＬの投与で１００％のアニサキスを死滅させた。いずれの組成物を投与した場合も、アニサキスの大半は胃内で死んでいたが、腸内で死んでいるものも認められた。これに対し、オリーブ油賦形液体は、水混和性液体と同じカルバクロール含量であるにもかかわらず、アニサキスに対して弱い効果しか示さなかった。ラットに投与した液体の総量から算出されたカルバクロールのラット胃内濃度は、エマルション０．２５ｍＬ投与の場合は２．９４ｍｇ／ｍＬ、エマルション１ｍＬ投与の場合は６．２５ｍｇ／ｍＬ、水混和性液体１ｍＬ投与の場合は１．８７５ｍｇ／ｍＬであった。
【0067】
（２）消化管傷害性
Ｗｉｓｔａｒ雌性ラット（９週齢、１４０ｇ）を１日絶食させた後、ラット１匹あたりエマルション１ｍＬ又は水混和性液体１ｍＬを、また比較例として生理食塩水１ｍＬ、又は９９．５％エタノール１ｍＬをゾンデで経口投与した。６時間後、ラットから消化管を摘出し、内壁の様子を観察した。
Ｗｉｓｔａｒ雌性ラット（９週齢、１４０ｇ）を１日絶食させた後、ラット１匹あたりエマルション１ｍＬ又は水混和性液体１ｍＬを、また比較例として生理食塩水１ｍＬ、又は９９．５％エタノール１ｍＬをゾンデで経口投与した。６時間後、ラットから消化管を摘出し、内壁の様子を観察した。
【0068】
結果を図１４に示す。エマルションを投与したラット、水混和性液体を投与したラットのいずれも、ネガティブコントロールである生理食塩水を投与したラットと同様、消化管の傷害は認められなかった。一方、ポジティブコントロールであるエタノールを投与したラットでは、胃が赤くただれ、小腸でも傷害が確認された（図中、△で示す箇所）。
【0069】
以上から、カルバクロールのエマルション及び水混和性液体は、ラット胃内で短時間で抗アニサキス効果を発揮し、かつ消化管傷害性を示さないことが明らかになった。
【0070】
［実施例８．チモールの抗アニサキス効果］
（１）ｐＨ
チモール１００μｇ／ｍＬを含むｐＨ１．２、３．０又は６．８の試験液を用いてアニサキスを２４時間インキュベートし、運動性を評価した。結果を図１５に示す。チモールは、クレオソート及びカルバクロールと同様に、いずれのｐＨにおいてもアニサキスを死滅させ、ｐＨ１．２という低ｐＨ環境下でも抗アニサキス効果を示すことが確認された。
（１）ｐＨ
チモール１００μｇ／ｍＬを含むｐＨ１．２、３．０又は６．８の試験液を用いてアニサキスを２４時間インキュベートし、運動性を評価した。結果を図１５に示す。チモールは、クレオソート及びカルバクロールと同様に、いずれのｐＨにおいてもアニサキスを死滅させ、ｐＨ１．２という低ｐＨ環境下でも抗アニサキス効果を示すことが確認された。
【0071】
（２）濃度依存性
３～３００μｇ／ｍＬのチモールを含むｐＨ３．０の試験液を用いてアニサキスを２４時間インキュベートし、運動性を評価した。結果を図１６に示す。チモールは、カルバクロールと同様に、１００μｇ／ｍＬ以上で全てのアニサキスを死滅させた。
３～３００μｇ／ｍＬのチモールを含むｐＨ３．０の試験液を用いてアニサキスを２４時間インキュベートし、運動性を評価した。結果を図１６に示す。チモールは、カルバクロールと同様に、１００μｇ／ｍＬ以上で全てのアニサキスを死滅させた。
【0072】
（３）時間依存性
チモール３００μｇ／ｍＬを含むｐＨ３．０の試験液を用いてアニサキスを０．５、１、２、６又は２４時間インキュベートして運動性を評価し、－と判定された虫体数を計測した。結果を図１７に、実施例３の結果と合わせて示す。チモールは、カルバクロールと同様に、０．５時間後に全アニサキスを死滅させた。
チモール３００μｇ／ｍＬを含むｐＨ３．０の試験液を用いてアニサキスを０．５、１、２、６又は２４時間インキュベートして運動性を評価し、－と判定された虫体数を計測した。結果を図１７に、実施例３の結果と合わせて示す。チモールは、カルバクロールと同様に、０．５時間後に全アニサキスを死滅させた。
【0073】
（４）細胞毒性
３～３００μｇ／ｍＬのチモールを含む培養液を用いてＣａｃｏ－２細胞を２４時間培養し、細胞毒性を評価した。結果を図１８に示す。チモールは、３０μｇ／ｍＬ以上で細胞生存率を有意に低下させた。
３～３００μｇ／ｍＬのチモールを含む培養液を用いてＣａｃｏ－２細胞を２４時間培養し、細胞毒性を評価した。結果を図１８に示す。チモールは、３０μｇ／ｍＬ以上で細胞生存率を有意に低下させた。
【0074】
実施例８の結果から、チモールは、広いｐＨ範囲において短時間で抗アニサキス効果を発揮することが明らかになった。
【0075】
［実施例９．オレガノ抽出物の抗アニサキス効果］
実施例１～４と同様にして、以下のとおりにオレガノ抽出物の抗アニサキス効果を評価した。本実施例で用いたオレガノ抽出物は、カルバクロールを１６％、チモールを０．２１％含有する（いずれも乾燥質量ベース）。
実施例１～４と同様にして、以下のとおりにオレガノ抽出物の抗アニサキス効果を評価した。本実施例で用いたオレガノ抽出物は、カルバクロールを１６％、チモールを０．２１％含有する（いずれも乾燥質量ベース）。
【0076】
（１）ｐＨ
オレガノ抽出物１００μｇ／ｍＬを含むｐＨ１．２、３．０又は６．８の試験液を用いてアニサキスを２４時間インキュベートし、運動性を評価した。結果を図１９に示す。オレガノ抽出物は、いずれのｐＨにおいてもアニサキスを死滅させ、ｐＨ１．２という低ｐＨ環境下でも抗アニサキス効果を示すことが確認された。
オレガノ抽出物１００μｇ／ｍＬを含むｐＨ１．２、３．０又は６．８の試験液を用いてアニサキスを２４時間インキュベートし、運動性を評価した。結果を図１９に示す。オレガノ抽出物は、いずれのｐＨにおいてもアニサキスを死滅させ、ｐＨ１．２という低ｐＨ環境下でも抗アニサキス効果を示すことが確認された。
【0077】
（２）濃度依存性
１０～３００μｇ／ｍＬのオレガノ抽出物を含むｐＨ３．０の試験液を用いてアニサキスを２４時間インキュベートし、運動性を評価した。結果を図２０に示す。オレガノ抽出物は、１００μｇ／ｍＬ以上で全てのアニサキスを死滅させた。
１０～３００μｇ／ｍＬのオレガノ抽出物を含むｐＨ３．０の試験液を用いてアニサキスを２４時間インキュベートし、運動性を評価した。結果を図２０に示す。オレガノ抽出物は、１００μｇ／ｍＬ以上で全てのアニサキスを死滅させた。
【0078】
（３）時間依存性
オレガノ抽出物３００μｇ／ｍＬを含むｐＨ３．０の試験液を用いてアニサキスを０．５、１、２、６又は２４時間インキュベートして運動性を評価し、－と判定された虫体数を計測した。結果を図２１に示す。オレガノ抽出物は、６時間後に全アニサキスを死滅させた。
オレガノ抽出物３００μｇ／ｍＬを含むｐＨ３．０の試験液を用いてアニサキスを０．５、１、２、６又は２４時間インキュベートして運動性を評価し、－と判定された虫体数を計測した。結果を図２１に示す。オレガノ抽出物は、６時間後に全アニサキスを死滅させた。
【0079】
実施例９の結果から、オレガノ抽出物は、広いｐＨ範囲において短時間で抗アニサキス効果を発揮することが明らかになった。
【0080】
［実施例１０．オレガノ抽出物を含有するエマルション及び水混和性液体の調製］
（１）オレガノ抽出物含有エマルションの調製
カルバクロール換算で２５ｍｇのオレガノ抽出物、大豆油２５０ｍｇ及び１０％Ｔｗｅｅｎ８０ ３００ｍｇに精製水を加えて全量２．５ｍＬとし、超音波処理（５０Ｗ、２０秒×３回）を行って、カルバクロール濃度１０ｍｇ／ｍＬのオレガノ抽出物含有エマルション（以下、オレガノ抽出物－エマルションと表す）を調製した。粒子径・ゼータ電位測定装置（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いて動的光散乱法にて測定したオレガノ抽出物－エマルションの平均粒子径は約２３０ｎｍ、多分散指数は０．２５であった。また、メチレンブルーを用いた色素法にて乳剤型を判別したところ、分散媒が青色に着色され、水中油型（Ｏ／Ｗ型）であることが確認された。
（１）オレガノ抽出物含有エマルションの調製
カルバクロール換算で２５ｍｇのオレガノ抽出物、大豆油２５０ｍｇ及び１０％Ｔｗｅｅｎ８０ ３００ｍｇに精製水を加えて全量２．５ｍＬとし、超音波処理（５０Ｗ、２０秒×３回）を行って、カルバクロール濃度１０ｍｇ／ｍＬのオレガノ抽出物含有エマルション（以下、オレガノ抽出物－エマルションと表す）を調製した。粒子径・ゼータ電位測定装置（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いて動的光散乱法にて測定したオレガノ抽出物－エマルションの平均粒子径は約２３０ｎｍ、多分散指数は０．２５であった。また、メチレンブルーを用いた色素法にて乳剤型を判別したところ、分散媒が青色に着色され、水中油型（Ｏ／Ｗ型）であることが確認された。
【0081】
（２）オレガノ抽出物含有水混和性液体の調製
カルバクロール換算で３ｍｇのオレガノ抽出物を１００μＬの９９.５％エタノール及び２００μＬのプロピレングリコールの混合液に溶解した後、全量が１ｍＬとなるように精製水を添加して、カルバクロール濃度３ｍｇ／ｍＬのオレガノ抽出物溶液（以下、オレガノ抽出物－水混和性液体と表す）を調製した。オレガノ抽出物－水混和性液体は、透明な液体であった。
カルバクロール換算で３ｍｇのオレガノ抽出物を１００μＬの９９.５％エタノール及び２００μＬのプロピレングリコールの混合液に溶解した後、全量が１ｍＬとなるように精製水を添加して、カルバクロール濃度３ｍｇ／ｍＬのオレガノ抽出物溶液（以下、オレガノ抽出物－水混和性液体と表す）を調製した。オレガノ抽出物－水混和性液体は、透明な液体であった。
【0082】
［実施例１１．オレガノ抽出物を含有するエマルション及び水混和性液体の評価（ｉｎ ｖｉｖｏ）］
（１）抗アニサキス効果
Ｗｉｓｔａｒ雌性ラット（９週齢、１４０ｇ）を１日絶食させた後、ラット１匹あたりアニサキス６匹／０．６ｍＬをゾンデで経口投与した（ｎ＝６／群）。アニサキス投与後直ちに、実施例１０で調製したオレガノ抽出物－エマルション１ｍＬ又は０．２５ｍＬ、あるいはオレガノ抽出物－水混和性液体１ｍＬ、０．５ｍＬ又は０．２５ｍＬを、また比較例として生理食塩水１ｍＬ、又はオリーブ油にオレガノ抽出物を溶解して調製したオリーブ油賦形液体（カルバクロール換算で３ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬをゾンデで経口投与した。１時間後、ラット消化管内のアニサキスを回収し、ピンセットで刺激を与えて運動性を判定し、－と判定された虫体数を計測して致死率を算出した。
（１）抗アニサキス効果
Ｗｉｓｔａｒ雌性ラット（９週齢、１４０ｇ）を１日絶食させた後、ラット１匹あたりアニサキス６匹／０．６ｍＬをゾンデで経口投与した（ｎ＝６／群）。アニサキス投与後直ちに、実施例１０で調製したオレガノ抽出物－エマルション１ｍＬ又は０．２５ｍＬ、あるいはオレガノ抽出物－水混和性液体１ｍＬ、０．５ｍＬ又は０．２５ｍＬを、また比較例として生理食塩水１ｍＬ、又はオリーブ油にオレガノ抽出物を溶解して調製したオリーブ油賦形液体（カルバクロール換算で３ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬをゾンデで経口投与した。１時間後、ラット消化管内のアニサキスを回収し、ピンセットで刺激を与えて運動性を判定し、－と判定された虫体数を計測して致死率を算出した。
【0083】
結果を図２２に示す。エマルション、水混和性液体はいずれも約６０％以上のアニサキスを死滅させたのに対し、オリーブ油賦形液体は、水混和性液体と同じオレガノ抽出物含量であるにもかかわらず、アニサキスに対して弱い効果しか示さなかった。
【0084】
（２）消化管傷害性
Ｗｉｓｔａｒ雌性ラット（９週齢、１４０ｇ）を１日絶食させた後、ラット１匹あたりエマルション１ｍＬ又は水混和性液体１ｍＬを、また比較例として生理食塩水１ｍＬ、又は９９．５％エタノール１ｍＬをゾンデで経口投与した。６時間後、ラットから消化管を摘出し、内壁の様子を観察した。
Ｗｉｓｔａｒ雌性ラット（９週齢、１４０ｇ）を１日絶食させた後、ラット１匹あたりエマルション１ｍＬ又は水混和性液体１ｍＬを、また比較例として生理食塩水１ｍＬ、又は９９．５％エタノール１ｍＬをゾンデで経口投与した。６時間後、ラットから消化管を摘出し、内壁の様子を観察した。
【0085】
結果を図２３に示す。エマルションを投与したラット、水混和性液体を投与したラットのいずれも、ネガティブコントロールである生理食塩水を投与したラットと同様、消化管の傷害は認められなかった。一方、ポジティブコントロールであるエタノールを投与したラットでは、胃が赤くただれ、小腸でも傷害が確認された（図中、△で示す箇所）。
【0086】
以上から、オレガノ抽出物のエマルション及び水混和性液体は、ラット胃内で短時間で抗アニサキス効果を発揮し、かつ消化管傷害性を示さないことが明らかになった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
