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特開2024-125354ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する治療用抗体を生成するための遺伝子改変非ヒト動物、ならびにその作製方法および使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024125354
(43)【公開日】2024-09-18
(54)【発明の名称】ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する治療用抗体を生成するための遺伝子改変非ヒト動物、ならびにその作製方法および使用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20240910BHJP
A01K 67/0275 20240101ALI20240910BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240910BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240910BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20240910BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240910BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240910BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240910BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20240910BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
A01K67/0275 ZNA
C12N15/12
C12N15/62 Z
C12N15/54
C12N5/10
C12P21/08
C07K16/46
C07K16/18
A01K67/0275
C12N15/13 ZNA
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024100480
(22)【出願日】2024-06-21
(62)【分割の表示】P 2023070884の分割
【原出願日】2019-03-22
(31)【優先権主張番号】62/647,720
(32)【優先日】2018-03-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/647,724
(32)【優先日】2018-03-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】597160510
【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(72)【発明者】
【氏名】アンドリュー ジェイ． マーフィー
(57)【要約】
【課題】ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する治療用抗体を生成するための遺伝子改変非ヒト動物、ならびにその作製方法および使用方法の提供。
【解決手段】非ヒト動物は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子をコードする配列、または例えばβ２マイクログロブリンなどの関連分子をコードする配列、で遺伝子改変され、そして当該非ヒト動物が当該配列を発現させることで、当該ヒトまたはヒトＭＨＣ分子が誘導される対応するヒトＨＬＡに対する寛容が誘導される。これら非ヒト動物により呈される寛容は、そうしたＨＬＡが、当該非ヒト動物に対して抗原性のあるペプチドを提示するときに、対応するヒトＨＬＡに対して、これら動物が特異的抗体反応を生じさせることを可能にする。
【選択図】図３
【解決手段】非ヒト動物は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子をコードする配列、または例えばβ２マイクログロブリンなどの関連分子をコードする配列、で遺伝子改変され、そして当該非ヒト動物が当該配列を発現させることで、当該ヒトまたはヒトＭＨＣ分子が誘導される対応するヒトＨＬＡに対する寛容が誘導される。これら非ヒト動物により呈される寛容は、そうしたＨＬＡが、当該非ヒト動物に対して抗原性のあるペプチドを提示するときに、対応するヒトＨＬＡに対して、これら動物が特異的抗体反応を生じさせることを可能にする。
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
図面に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書において、ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子（例えば限定されないが、空のヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子）またはそのペプチド結合部分（例えばＭＨＣ分子のペプチド結合溝（ｇｒｏｏｖｅ））に対して寛容であり、それにより当該非ヒト動物に対して外来性のペプチドと、ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子が複合体化されるなどで提示されるとき、例えばペプチド／ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体の一部であるとき、当該ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子に対して当該非ヒト動物が安定的なＢ細胞反応を生じさせ得る遺伝子改変非ヒト動物（例えば齧歯類（例えばラット、マウスなど））が開示され、この場合において当該ペプチドは、当該非ヒト動物に対して異種である。そうした動物は、例えばヒトＨＬＡを背景として提示される自己免疫原性のヒト自己ペプチドなどの病原性ｐＭＨＣ複合体に対する治療用抗原結合タンパク質の生成に有用であり得る。
【0002】
関連出願
本出願は、２０１８年３月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／６４７，７２０号明細書、および２０１８年３月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／６４７，７２４号明細書の優先権の利益を主張するものであり、それら各文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、２０１８年３月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／６４７，７２０号明細書、および２０１８年３月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／６４７，７２４号明細書の優先権の利益を主張するものであり、それら各文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
【0003】
本明細書は、「１０１１６ＷＯ０１＿ＳＴ２５＿ＡｓＦｉｌｅｄ」という名称のａｓｃｉｉ．ｔｘｔファイルとして電子的に提出された配列表に対する参照を行うものであり、当該ファイルは、２０１９年３月２２日に作成され、３８．９キロバイトのファイルサイズを有し、その内容はその全体で参照により組み込まれる。
【背景技術】
【0004】
Ｔ細胞は、適応型の抗感染反応および抗腫瘍反応において重要な役割を果たすが、例えば自己免疫反応や移植片拒絶反応などの不適切な免疫反応でも機能する。一般的に、Ｔ細胞介在性の免疫反応は、Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）の間に密接な接触を伴う。Ｔ細胞の活性を誘発する免疫シナプスの形成には、限定されないが以下をはじめとするいくつかの分子対が関与する：（ａ）ＡＰＣ上の主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子のペプチド結合溝に提示されたペプチドに特異的に結合するＴ細胞上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、および（ｂ）ＡＰＣ上のＢ７分子と対形成する（Ｔ細胞上の）ＣＤ２８。ＴＣＲはＣＤ３分子と共にＴＣＲ複合体を形成し、ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体とＴＣＲが対形成するとシグナルがＣＤ３を通じて送られる。Ｔ細胞上のＴＣＲ複合体とＣＤ２８の両方を通じたシグナル伝達により、Ｔ細胞の活性化が生じる。
【0005】
疾患を治療する免疫療法は、例えば、自己免疫反応や移植片拒絶反応を下方制御するために、インビボでＴ細胞の活性を制御するよう作用する。しかし多くの免疫療法はＣＤ３、および／または共刺激性分子の対に結合することによりＴＣＲ複合体のシグナル伝達を標的とすることから、そうした方法は多くの場合、特異性を欠いている。そうした方法はしばしば、例えば過剰な免疫反応または全身性の免疫抑制などの望ましくない副作用をもたらしてしまう。したがって、ＴＣＲとｐＭＨＣ複合体との間の固有の相互作用を活用する治療法は、特定のＴ細胞の活性をインビボで調節する能力を提供し、そしてＴ細胞の調節に基づく新たな治療を提供し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
遺伝子改変され、ヒトＨＬＡ分子および／またはβ２マイクログロブリンに対して寛容であり、そしてヒト抗体またはヒト化抗体を産生する能力を有する非ヒト動物（例えば哺乳動物、例えば齧歯類、例えばラットまたはマウス）が開示される。（１）ヒトＨＬＡ分子に対する、これら非ヒト動物の寛容性、および（２）これら非ヒト動物の、ヒト化抗原結合タンパク質を提供する能力、の両方によって、例えば同種反応などのインビボ実験で有用であり得る細胞の単離のためのユニークなプラットフォーム、および／または対象のペプチド－ＭＨＣ複合体に特異的に結合するヒトまたはヒト化抗原結合タンパク質の産生ためのユニークなプラットフォームとして使用することが可能となり、当該抗原結合タンパク質は、独自で有用な治療剤となる準備が整った状態となる。したがって本明細書において、本明細書に開示される非ヒト動物の作製方法および使用方法、ならびに当該動物から単離された細胞、組織、核酸および抗原結合タンパク質も提供される。
【0007】
一部の実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、（ａ）ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子、または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列、および（ｂ）（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位、および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位、を含み、任意で当該（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位のうちの少なくとも一つは、再構成されておらず、当該遺伝子改変非ヒト動物は、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分を発現し、当該遺伝子改変非ヒト動物は、ヒトもしくはヒト化重鎖可変ドメインおよび／またはヒトもしくはヒト化軽鎖可変ドメインを含有する免疫グロブリンを発現し、そして当該非ヒト動物は、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分に対して寛容であり、それによって、（ｉｉ）当該ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子が誘導されるヒトＨＬＡ分子、またはその一部、（ｉ）（ｉｉ）と複合体化された、当該非ヒト動物に対して異種であるペプチド、を含有する抗原性ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体で免疫化されたときに、特異的Ｂ細胞反応を生じさせる。一部の実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子が誘導されるヒトＨＬＡ分子と関連付けられた、当該非ヒト動物に対して異種であるペプチドを含有する抗原性ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体をさらに含有する。一部の実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物はさらに、（ｃ）（ｉｉ）ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子が誘導されるＨＬＡ分子、またはその一部、（ｉ）（ｉｉ）と関連付けられた、非ヒト動物に対して異種であるペプチド、を含む抗原性ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体、および（ｄ）当該抗原性ｐＭＨＣに特異的に結合し、当該ヒトまたはヒト化ＭＨＣが誘導されるヒトＨＬＡ分子には結合しない、ヒトまたはヒト化抗原結合タンパク質、を含有する。
【0008】
一部の実施形態では、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子は、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣクラスＩ分子、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣクラスＩＩα分子、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣクラスＩＩβ分子、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態では、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣクラスＩ分子である。一部の実施形態では、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子は、ＨＬＡ－Ａ分子、ＨＬＡ－Ｂ分子、ＨＬＡ－Ｃ分子、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＨＬＡクラスＩ分子から誘導される。一部の実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物はさらに、ヒトまたはヒト化β２マイクログロブリンをコードするヌクレオチド配列を、自身のゲノム中、任意で内因性β２マイクログロブリン座位で含有し、この場合において当該非ヒト動物は、当該ヒトまたはヒト化β２マイクログロブリンを発現し、それにより当該非ヒト動物は、当該β２マイクログロブリンそれ自体、またはヒトもしくはヒト化クラスＩ分子と関連付けられたβ２マイクログロブリンに対して寛容となる。
【0009】
一部の実施形態では、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣクラスＩＩ分子であり、任意で当該ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子は、ＨＬＡ－ＤＰ分子、ＨＬＡ－ＤＱ分子、ＨＬＡ－ＤＲ分子およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＨＬＡクラスＩＩ分子のα鎖および／もしくはβ鎖、または少なくともそのペプチド結合溝から誘導される。
【0010】
一部の実施形態では、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子は、ヒトＨＬＡ分子である。一部の実施形態では、非ヒト動物は、内因性ＭＨＣ座位で、ヒトＨＬＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含有し、任意で当該ヌクレオチド配列は、内因性ＭＨＣ分子をコードする内因性核酸配列を置換する。一部の実施形態では、非ヒト動物は、異所性の座位で、ヒトＨＬＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含有する。一部の実施形態では、非ヒト動物は、ＲＯＳＡ２６座位で、ヒトＨＬＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含有する。一部の実施形態では、非ヒト動物は、内因性ＭＨＣ座位、異所性の座位、またはＲＯＳＡ２６座位で、ヌクレオチド配列に関してホモ接合性である。一部の実施形態では、非ヒト動物は、内因性ＭＨＣ座位、異所性の座位、またはＲＯＳＡ２６座位で、ヌクレオチド配列に関してヘテロ接合性である。
【0011】
一部の実施形態では、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子は、例えばキメラＭＨＣ分子などのヒト化ＭＨＣ分子である。一部の実施形態では、非ヒト動物は、内因性ＭＨＣ座位で、キメラＭＨＣ分子をコードするヌクレオチド配列を含有し、任意で当該ヌクレオチド配列は、内因性ＭＨＣ分子をコードする内因性核酸配列を置換する。一部の実施形態では、非ヒト動物は、異所性の座位で、キメラＭＨＣ分子をコードするヌクレオチド配列を含有する。一部の実施形態では、非ヒト動物は、ＲＯＳＡ２６座位で、キメラＭＨＣ分子をコードするヌクレオチド配列を含有する。一部の実施形態では、非ヒト動物は、内因性ＭＨＣ座位、異所性の座位、またはＲＯＳＡ２６座位で、キメラＭＨＣ分子をコードするヌクレオチド配列に関してホモ接合性である。一部の実施形態では、非ヒト動物は、内因性ＭＨＣ座位、異所性の座位、またはＲＯＳＡ２６座位で、キメラＭＨＣ分子をコードするヌクレオチド配列に関してヘテロ接合性である。
【0012】
一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、内因性ＭＨＣ分子の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに動作可能に連結されたヒトＨＬＡ分子の細胞外ドメインを含む、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ分子をコードする。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、（ｉ）例えば内因性マウスＨ－２Ｋポリペプチド、内因性マウスＨ－２Ｄポリペプチドまたは内因性マウスＨ－ＤＬポリペプチドなどの内因性非ヒトＭＨＣクラス分子の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに動作可能に連結されたＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃからなる群から選択されるヒトＭＨＣクラスＩ分子のα１ドメイン、α２ドメインおよびα３ドメインを含むキメラヒト／非ヒトＭＨＣクラスＩ分子、ならびに／または（ｉｉ）例えば内因性マウスＨ－２Ａαポリペプチドまたは内因性マウスＨ－２Ｅαポリペプチドなどの内因性非ヒトＭＨＣクラスＩＩα分子の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに動作可能に連結されたヒトＨＬＡクラスＩＩαポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメイン、ならびに／または例えば内因性マウスＨ－２Ａαポリペプチドもしくは内因性マウスＨ－２Ｅαポリペプチドなどの内因性非ヒトＭＨＣクラスＩＩβ分子の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに動作可能に連結されたヒトＨＬＡクラスＩβポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメイン、を含むキメラヒト／非ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子、をコードする。
【0013】
一部の実施形態では、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子をコードするヌクレオチド配列は、内因性非ヒトＭＨＣ座位を破壊しない。一部の実施形態では、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子をコードするヌクレオチド配列は、内因性ＭＨＣ座位の外側の座位に統合される。一部の実施形態では、当該統合は、他のすべての内因性遺伝子の機能を破壊しない。一つの実施形態では、ヌクレオチド配列は、内因性ＲＯＳＡ２６座位内に配置される。
【0014】
一部の実施形態では、非ヒト動物は、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列に関してヘテロ接合性である。
【0015】
一部の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変領域を、内因性重鎖座位で含有する。一部の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された拘束（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域を、内因性重鎖座位で含有する。一部の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、共通重鎖コード配列を、内因性重鎖座位で含有する。一部の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、内因性重鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域を、内因性重鎖座位で含有する。一部の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、重鎖のみの免疫グロブリンコード配列を、内因性重鎖座位で含有する。一部の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、ハイブリッド免疫グロブリン鎖をコードする非再構成ヒト（ヒト化）ハイブリッド重鎖配列を、内因性重鎖座位で含有する。一部の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域を、内因性軽鎖座位で含有する。一部の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、共通軽鎖コード配列を、内因性軽鎖座位で含有する。一部の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域を、内因性軽鎖座位で含有する。一部の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域を、内因性軽鎖座位で含有する。一部の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域を、内因性軽鎖座位で含有する。
【0016】
一部の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、機能性ＡＤＡＭ６遺伝子を含有し、任意で当該機能性ＡＤＡＭ６遺伝子は、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子である。
【0017】
一部の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を発現する。
【0018】
一部の実施形態では、前述の請求項のいずれかの遺伝子改変非ヒト動物を作製する方法は、（ａ）ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列、ならびに（ｂ）（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位、を含有する非ヒト動物のゲノムを改変することを含み、任意で当該（非）再構成ヒトまたはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または当該（非）再構成ヒトまたはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位のうちの少なくとも一つは、再構成されておらず、当該遺伝子改変非ヒト動物は、
ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分に対して寛容であり、それにより、（ｉｉ）当該ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子が誘導されるヒトＨＬＡ分子、またはその一部、（ｉ）（ｉｉ）と複合体化された、当該非ヒト動物に対して異種であるペプチド、を含有するペプチド－ＭＨＣ複合体で免疫化されたときに、特異的Ｂ細胞反応を生じさせ、そしてヒトもしくはヒト化重鎖可変ドメインおよび／またはヒトもしくはヒト化軽鎖可変ドメインを含有するヒトまたはヒト化抗原結合タンパク質を提供する能力を有する。一部の実施形態では、方法は、
（ａ）
（ｉ）ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列を、第一の異所性座位に挿入すること、または
（ｉｉ）非ヒト動物ＭＨＣ Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、ヒト（ヒト化）ＭＨＣ Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを、内因性非ヒト動物ＭＨＣ Ｉ座位で置換し、および／または非ヒト動物ＭＨＣ ＩＩ分子をコードするヌクレオチド配列と、ヒト（ヒト化）ＭＨＣ ＩＩ分子をコードするヌクレオチド配列とを、内因性非ヒト動物ＭＨＣ ＩＩ座位で置換することであって、
任意で、当該ヒト（ヒト化）ＭＨＣ Ｉ分子は、ヒトＭＨＣ Ｉのα１ドメイン、α２ドメインおよびα３ドメイン、ならびに内因性非ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、を含有し、
任意で、当該ヒト（ヒト化）ＭＨＣ ＩＩ分子は、ヒトＭＨＣ ＩＩのα１ドメイン、α２ドメイン、β１ドメインおよびβ２ドメイン、ならびに内因性齧歯類ＭＨＣ ＩＩポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、を含有する、置換すること、ならびに
（ｂ）
（ｉ）（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位、および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を、第二の異所性座位に挿入すること、または
（ｉｉ）
（Ａ）内因性非ヒト重鎖座位で、内因性非ヒト免疫グロブリン可変（ＶＨ）遺伝子セグメントと、非再構成ヒト免疫グロブリン可変（ＶＨ）遺伝子セグメントとを、置換すること、ならびに任意で内因性非ヒト免疫グロブリン多様性（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）（ＤＨ）遺伝子セグメントおよび／または内因性非ヒト結合（ｊｏｉｎｉｎｇ）（ＪＨ）遺伝子セグメントと、非再構成ヒト免疫グロブリン多様性（ＤＨ）遺伝子セグメントおよび／または非再構成ヒト免疫グロブリン結合（ＪＨ）遺伝子セグメントとを、それぞれ置換することであって、当該非再構成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ならびに任意でＤＨ遺伝子およびＪＨ遺伝子セグメントは、内因性重鎖定常領域遺伝子配列に動作可能に連結される、置換すること、および／または
（Ｂ）内因性非ヒト軽鎖座位で、内因性非ヒト軽鎖可変（ＶＬ）遺伝子セグメントおよび内因性非ヒト軽鎖結合（ＪＬ）遺伝子セグメントと、ヒト軽鎖可変（ＶＬ）遺伝子セグメントおよびヒト軽鎖結合（ＪＬ）遺伝子セグメントとを、置換することであって、それらは任意で再構成されてＶＬ／ＪＬ遺伝子配列を形成し、当該ヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび結合ＪＬ遺伝子セグメントは、内因性軽鎖定常領域遺伝子配列に動作可能に連結される、置換すること、を含み、
（ａ）それぞれ、非ヒトＭＨＣ Ｉ分子および／または非ヒトＭＨＣ ＩＩ分子をコードするヌクレオチド配列、ならびに（ｂ）ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、ＶＬ、およびＪＬ遺伝子セグメントは、
（Ｉ）一つの非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞中で、連続相同組み換えにより挿入もしくは置換され、または
（ＩＩ）第一のＥＳ細胞および第二のＥＳ細胞においてそれぞれ使用され、第一の非ヒト動物および第二の非ヒト動物が作製され、および当該方法は、当該第一および第二の非ヒト動物を交配させることをさらに含む。
ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分に対して寛容であり、それにより、（ｉｉ）当該ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子が誘導されるヒトＨＬＡ分子、またはその一部、（ｉ）（ｉｉ）と複合体化された、当該非ヒト動物に対して異種であるペプチド、を含有するペプチド－ＭＨＣ複合体で免疫化されたときに、特異的Ｂ細胞反応を生じさせ、そしてヒトもしくはヒト化重鎖可変ドメインおよび／またはヒトもしくはヒト化軽鎖可変ドメインを含有するヒトまたはヒト化抗原結合タンパク質を提供する能力を有する。一部の実施形態では、方法は、
（ａ）
（ｉ）ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列を、第一の異所性座位に挿入すること、または
（ｉｉ）非ヒト動物ＭＨＣ Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、ヒト（ヒト化）ＭＨＣ Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを、内因性非ヒト動物ＭＨＣ Ｉ座位で置換し、および／または非ヒト動物ＭＨＣ ＩＩ分子をコードするヌクレオチド配列と、ヒト（ヒト化）ＭＨＣ ＩＩ分子をコードするヌクレオチド配列とを、内因性非ヒト動物ＭＨＣ ＩＩ座位で置換することであって、
任意で、当該ヒト（ヒト化）ＭＨＣ Ｉ分子は、ヒトＭＨＣ Ｉのα１ドメイン、α２ドメインおよびα３ドメイン、ならびに内因性非ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、を含有し、
任意で、当該ヒト（ヒト化）ＭＨＣ ＩＩ分子は、ヒトＭＨＣ ＩＩのα１ドメイン、α２ドメイン、β１ドメインおよびβ２ドメイン、ならびに内因性齧歯類ＭＨＣ ＩＩポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、を含有する、置換すること、ならびに
（ｂ）
（ｉ）（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位、および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を、第二の異所性座位に挿入すること、または
（ｉｉ）
（Ａ）内因性非ヒト重鎖座位で、内因性非ヒト免疫グロブリン可変（ＶＨ）遺伝子セグメントと、非再構成ヒト免疫グロブリン可変（ＶＨ）遺伝子セグメントとを、置換すること、ならびに任意で内因性非ヒト免疫グロブリン多様性（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）（ＤＨ）遺伝子セグメントおよび／または内因性非ヒト結合（ｊｏｉｎｉｎｇ）（ＪＨ）遺伝子セグメントと、非再構成ヒト免疫グロブリン多様性（ＤＨ）遺伝子セグメントおよび／または非再構成ヒト免疫グロブリン結合（ＪＨ）遺伝子セグメントとを、それぞれ置換することであって、当該非再構成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ならびに任意でＤＨ遺伝子およびＪＨ遺伝子セグメントは、内因性重鎖定常領域遺伝子配列に動作可能に連結される、置換すること、および／または
（Ｂ）内因性非ヒト軽鎖座位で、内因性非ヒト軽鎖可変（ＶＬ）遺伝子セグメントおよび内因性非ヒト軽鎖結合（ＪＬ）遺伝子セグメントと、ヒト軽鎖可変（ＶＬ）遺伝子セグメントおよびヒト軽鎖結合（ＪＬ）遺伝子セグメントとを、置換することであって、それらは任意で再構成されてＶＬ／ＪＬ遺伝子配列を形成し、当該ヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび結合ＪＬ遺伝子セグメントは、内因性軽鎖定常領域遺伝子配列に動作可能に連結される、置換すること、を含み、
（ａ）それぞれ、非ヒトＭＨＣ Ｉ分子および／または非ヒトＭＨＣ ＩＩ分子をコードするヌクレオチド配列、ならびに（ｂ）ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、ＶＬ、およびＪＬ遺伝子セグメントは、
（Ｉ）一つの非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞中で、連続相同組み換えにより挿入もしくは置換され、または
（ＩＩ）第一のＥＳ細胞および第二のＥＳ細胞においてそれぞれ使用され、第一の非ヒト動物および第二の非ヒト動物が作製され、および当該方法は、当該第一および第二の非ヒト動物を交配させることをさらに含む。
【0019】
一部の実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物を作製する方法は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子が誘導されるヒトＨＬＡ分子と関連付けられた、当該非ヒト動物に対して異種であるペプチドを含有する抗原性ｐＭＨＣ複合体を当該非ヒト動物に投与することを含む。一部の実施形態では、抗原性ｐＭＨＣ複合体は、ヘルパーＴ細胞エピトープに連結される。一部の実施形態では、ヘルパーＴ細胞エピトープは、例えば配列番号２８に記載されるＰＡＤＲＥを含む。
【0020】
一部の実施形態では、対象の抗原性ｐＭＨＣ複合体に特異的に結合する抗原結合タンパク質、または同タンパク質をコードする核酸配列を作製する方法は、本明細書に記載される遺伝子改変非ヒト動物を、対象の抗原性ｐＭＨＣ複合体に対する免疫反応を当該非ヒト動物が開始するのに充分な条件下に維持することを含み、この場合において当該対象の抗原性ｐＭＨＣ複合体は、当該非ヒト動物に対して異種であり、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子が誘導されるヒトＨＬＡ、またはその一部を背景として提示されるペプチドを含む。一部の実施形態では、方法は、第一の工程として、当該非ヒト動物を、対象の抗原性ｐＭＨＣ複合体で免疫化し、任意で当該免疫化非ヒト動物の免疫反応をブーストすることを含み、任意でこの場合において免疫化および／またはブーストは、当該非ヒト動物に、例えばＰＡＤＲＥ（配列番号２８）などのヘルパーＴ細胞エピトープに連結された対象のｐＭＨＣ複合体を投与することを含む。
【0021】
一部の実施形態では、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび／またはヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする核酸を取得する方法は、本明細書に記載の非ヒト動物から、当該非ヒト動物のリンパ球または当該リンパ球から作製されたハイブリドーマにより発現されたヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列を含む核酸を単離すること、を含み、この場合において当該リンパ球または当該リンパ球から作製されたハイブリドーマにより発現されたヒト免疫グロブリン可変ドメインは、その同系可変ドメインと関連付けられて、抗原性ｐＭＨＣ複合体に特異的な抗原結合ドメインを形成する。一部の実施形態では、方法は、当該非ヒト動物を、対象の抗原性ｐＭＨＣ複合体で免疫化すること、および当該非ヒト動物に、当該抗原に対する免疫反応を開始させ、その後に核酸を取得すること、をさらに含む。一部の実施形態では、取得された再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列は、少なくとも一つの体細胞超変異を含む。
【0022】
一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸は、再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列に動作可能に連結されたヒト定常領域遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、５．５～６．０の範囲のｐＨで、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する、ＩｇＧ重鎖定常領域アミノ酸配列のＣＨ２－ＣＨ３領域のアフィニティを増加させる改変を含み、この場合において当該改変は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、Ｎ４３４Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５０Ｑ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるＩｇＧ重鎖定常領域アミノ酸配列における変異である。さらに本明細書において、例えば、抗原性ｐＭＨＣ複合体に特異的なヒト免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖をコードする核酸を発現するための哺乳動物宿主細胞が記載される。
【0023】
一部の実施形態では、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび／またはヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを発現する細胞を取得する方法は、本明細書に記載の非ヒト動物からリンパ球を単離することを含み、この場合において当該リンパ球は、抗原性ｐＭＨＣ複合体に特異的な抗原結合ドメインを形成するヒト免疫グロブリン可変ドメインを発現する。一部の実施形態では、方法は、当該単離リンパ球からハイブリドーマを作製することを含む。
【0024】
一部の実施形態では、本明細書に記載の例えば生殖細胞、胚性幹細胞、体細胞（例えば、Ｂ細胞）などの単離細胞は、（ａ）ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列、ならびに（ｂ）（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位、を含む。一部の実施形態では、（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位のうちの少なくとも一つは、再構成されていない。一部の実施形態では、単離細胞は、本明細書に記載の方法に従い取得される。
【0025】
一部の実施形態では、ヒト免疫グロブリン可変ドメインをインビトロで作製する方法は、本明細書に記載の非ヒト動物のリンパ球または当該リンパ球から作製されたハイブリドーマにより発現されたヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列を含む第一の核酸を細胞中で発現させること、を含み、この場合において当該リンパ球または当該リンパ球から作製されたハイブリドーマにより発現されたヒト免疫グロブリン可変ドメインは、その同系可変ドメインと関連付けられて、抗原性ｐＭＨＣ複合体に特異的な抗原結合ドメインを形成する。一部の実施形態では、第一の核酸は、再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列に動作可能に連結されたヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列をさらに含む。一部の実施形態では、ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列は、重鎖定常領域遺伝子配列であり、５．５～６．０の範囲のｐＨで、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する、ＩｇＧ重鎖定常領域アミノ酸配列のＣＨ２－ＣＨ３領域のアフィニティを増加させる改変を含み、この場合において当該改変は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、Ｎ４３４Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５０Ｑ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるＩｇＧ重鎖定常領域アミノ酸配列における変異である。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】図１Ａ～１Ｃは、本発明の例示的な実施形態であり、例えば内因性Ｈ－２Ｋ座位でのキメラＨＬＡ－Ａ２／Ｈ－２ＫなどのキメラＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩの座位（図１Ａ）、例えば内因性Ｈ－２Ｅ座位でのキメラＨＬＡ－ＤＲ２／Ｈ－２Ｅ座位（図１Ｂ）、および例えば内因性β２Ｍ座位でのヒト化β２Ｍ座位（図１Ｃ）の概略図（正確な縮尺ではない）を提示する。別段の示唆が無い限り、ヒト配列は、白抜きで示され、マウス配列は黒塗りで示される。縞模様は、内因性座位とは異なるマウス系統由来のＨ－２Ｅ遺伝子配列のエクソン１およびその下流のイントロンの一部を示す。Ｃｒｅ介在性にカセットを除去する前（図１Ｃ）およびＣｒｅによりカセットが除去された後（図１Ａおよび１Ｂ）のＦｌｏｘ化ネオマイシンホスホトランスフェラーゼカセットは、適宜ラベリングされた矢印で示されている。
【0027】
【図2】図２は、 ＲＯＳＡ２６（Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６ Ｓｏｒ）座位でヒトβ２マイクログロブリン（Ｂ２ｍ）と関連付けられた成熟ＨＬＡ－Ａ２（Ａ２）ポリペプチド（例えば、ＨＬＡ－Ａ２のアミノ酸２５～３６５）の全長を含む一本鎖ＭＨＣ分子（配列番号２３）をコードする本発明の例示的な導入遺伝子（配列番号２２）の概略図（正確な縮尺ではない）を提示する。別段の示唆が無い限り、ヒト配列は、白抜きで示され、マウス配列は黒塗りで示され、そしてヒト配列でもマウス配列でもない配列は様々なパターンで示されている。黒塗りの矢印は、内因性マウスＲＯＳＡ２６座位のエクソンを示す。５’ＨＢおよび３’ＨＢ：相同組み換えによる、一本鎖ＨＬＡ－Ａ２／β２Ｍ複合体（配列番号２３）をコードするＢ２ｍ－Ｇ４Ｓｘ４－ＨＬＡ－Ａ２導入遺伝子（配列番号２２）の挿入に使用されるＲＯＳＡ２６遺伝子の相同ボックス。ＳＡ：コンセンサススプライスアクセプター。ＲＯＲ：マウスＲＯＲシグナル配列。Ｇ４Ｓｘ４：ＧＧＧＳリンカー（配列番号２１）、ＳＶ４０ＰＡ：ＳＶ４０ウイルス由来のポリアデニル化シグナル。ＬｏｘＰ－Ｎｅｗ－ＬｏｘＰ：カセットがＣｒｅ介在性に除去される前のｆｌｏｘ化ネオマイシンホスホトランスフェラーゼカセット。
【0028】
【図3】図３は、本発明の例示的な実施形態の結果を示すものであり、ヒトβ２マイクログロブリンと関連付けられたＨＬＡ－Ａのペプチド結合溝で提示されるペプチドＢを含む免疫原をコードするヌクレオチド配列で免疫化された、被験マウス（ヒト化ＭＨＣ Ｉ分子（ＨＬＡ－Ａ２／Ｈ－２Ｋ）、ヒト化β２マイクログロブリン、非再構成ヒト化免疫グロブリン重鎖座位、およびヒト化共通軽鎖座位Ｖκ１－３９／Ｊκをコードするヌクレオチド配列を含む；●）または対照マウス（機能性（例えばマウス）ＡＤＡＭ６遺伝子ならびにヒト化重鎖座位およびヒト化軽鎖座位を含む；■）の血清が、一本鎖ｐＭＨＣ複合体としてヒトβ２マイクログロブリンと関連付けられたＨＬＡ－Ａのペプチド結合溝において提示された非関連ペプチドまたは関連ペプチド（ペプチドＡ（非関連）、ペプチドＢ（関連）またはペプチドＣ（非関連））に結合する抗体の力価（ｙ軸）に関して検証された。個々のｐＭＨＣ複合体に結合する血清中の抗体の力価は、結合シグナルがバックグラウンドの２倍である、補間血清希釈因子として算出される。
【0029】
【図4】図４は、本発明の例示的な実施形態の結果を示すものであり、ヒトβ２マイクログロブリンと関連付けられたＨＬＡ－Ａのペプチド結合溝で提示されるペプチドＢを含む一本鎖ｐＭＨＣ複合体免疫原で免疫化された、被験マウス（ヒト化ＭＨＣ Ｉ分子（ＨＬＡ－Ａ２／Ｈ－２Ｋ）、ヒト化β２マイクログロブリン、非再構成ヒト化免疫グロブリン重鎖座位、およびヒト化共通軽鎖座位Ｖκ１－３９／Ｊκをコードするヌクレオチド配列を含む；●）または対照マウス（機能性（例えばマウス）ＡＤＡＭ６遺伝子ならびにヒト化重鎖座位およびヒト化軽鎖座位を含む；■）の血清が、一本鎖ｐＭＨＣ複合体としてヒトβ２マイクログロブリンと関連付けられたＨＬＡ－Ａのペプチド結合溝において提示された非関連ペプチド、または関連ペプチド（ペプチドＡ（非関連）、ペプチドＢ（関連）またはペプチドＣ（非関連））に結合する抗体の力価（ｙ軸）に関して検証された。個々のｐＭＨＣ複合体に結合する血清中の抗体の力価（ｙ軸）は、結合シグナルがバックグラウンドの２倍である、補間血清希釈因子として算出される。
【0030】
【図5】図５は、本発明の例示的な実施形態の結果を示すものであり、ヒトβ２マイクログロブリンと関連付けられたＨＬＡ－Ａのペプチド結合溝で提示されるペプチドＢを含む免疫原で免疫化され、ヒトβ２マイクログロブリンおよびヘルパーＴ細胞エピトープ（ＰＡＤＲＥ）と関連付けられたＨＬＡ－Ａのペプチド結合溝で提示されるペプチドＢを含む別の組み換えポリペプチドでブーストされた被験マウス（ヒト化ＭＨＣ Ｉ分子（ＨＬＡ－Ａ２／Ｈ－２Ｋ）、ヒト化β２マイクログロブリン、非再構成ヒト化免疫グロブリン重鎖座位、およびヒト化共通軽鎖座位Ｖκ１－３９／Ｊκをコードするヌクレオチド配列を含む）の血清が、一本鎖ｐＭＨＣ複合体としてヒトβ２マイクログロブリンと関連付けられたＨＬＡ－Ａのペプチド結合溝において提示された非関連ペプチド、または関連ペプチド（ペプチドＡ（非関連）、ペプチドＢ（関連）またはペプチドＣ（非関連））への結合に関して検証された。個々のｐＭＨＣ複合体に結合する血清中の抗体の抗体力価（ｙ軸）は、結合シグナルがバックグラウンドの２倍である、補間血清希釈倍数として算出される。
【発明を実施するための形態】
【0031】
本明細書に示されるように、ヒトＨＬＡおよびヒトβ２マイクログロブリン分子に対して寛容ではないが、ＨＬＡ分子を背景として提示される対象ペプチド、すなわち対象ｐＭＨＣ複合体で免疫化された対照非ヒト動物は、対象のｐＭＨＣ複合体に対して抗体力価を惹起させる。図３～４（正方形シンボル）。しかしながら、非寛容で、免疫化された対照動物の血清は、当該非ヒト動物が免疫化されなかった非関連ｐＭＨＣ複合体（例えば同じ背景で提示される非関連ペプチド）に対しても同等の抗体力価を保有していた。このことから、対象のｐＭＨＣ複合体に対して生じた反応は、特異的反応ではないことが示唆される。図３～４（正方形シンボル）を参照のこと。
【0032】
対照的に、ヒトＨＬＡおよびヒトβ２マイクログロブリン分子、または少なくともそのペプチド結合溝（例えば、その細胞外部分）に対して寛容であり、ヒトＨＬＡ分子から誘導された対象のｐＭＨＣ複合体で免疫化された非ヒト動物は、非関連ｐＭＨＣ複合体よりも高い抗体力価を対象のｐＭＨＣ複合体に対して惹起した。図３～５を参照のこと。従って本明細書において、ヒトＨＬＡおよびヒトβ２マイクログロブリン分子（またはその少なくともそのペプチド結合溝（例えば、その細胞外部分））に対して寛容である非ヒト動物は、対象のｐＭＨＣに対する特異的免疫反応の発生のためのインビボプラットフォームを提供し、そこからリード化合物が選択され得ることが示される。当該プラットフォームは、対象のｐＭＨＣに非特異的な免疫反応を生じさせる非寛容動物を伴うプラットフォームを上回る改善がなされている。したがって本明細書において、ヒトＨＬＡ分子に対して寛容であるように遺伝子改変された非ヒト動物は、当該ヒトＨＬＡ分子を背景として提示された対象ペプチドを含む対象ｐＭＨＣ複合体で免疫化されたとき、対象ｐＭＨＣ複合体に対し特異的なＢ細胞反応を生じさせることができる。
【0033】
例示的な実施形態では、非ヒト動物は、ヒトＨＬＡ分子、その一部、および／またはその一本鎖誘導体に対して寛容であるが、当該非ヒト動物が寛容化されたヒトＨＬＡ分子と関連付けられた（例えば、当該ヒトＨＬＡ分子により提示された）抗原性ペプチド（例えば当該遺伝子改変非ヒト動物に対して異種であるペプチド）を含む抗原性ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体に対しては寛容ではないように遺伝子改変される。当該非ヒト動物は、当該抗原性ｐＭＨＣ複合体に対して寛容ではないため、本明細書に開示されるように遺伝子改変された動物は、例えばインビトロ実験を目的とした、ヒトＨＬＡ分子、その一部、および／またはその一本鎖誘導体に対して非反応性である免疫細胞の単離に有用であるのみならず、対象の抗原性ｐＭＨＣ複合体に特異的に結合する特にヒトまたはヒト化抗原結合タンパク質などの抗原結合タンパク質の生成にも有用であり得る。当該特異的（ヒトまたはヒト化）抗原結合タンパク質は、ヒト疾患の治療のための療法、例えば自己反応性ＴＣＲと、自己反応性抗原を含むｐＭＨＣ複合体の間の免疫シナプスの形成の予防（例えば、自己免疫性障害、移植片対宿主病、移植片拒絶などの予防および／または治療）、病原体（例えばウイルス）に感染した細胞の標的化、および細胞表面上に発現されたｐＭＨＣ複合体を介したウイルスペプチドの提示に有用であり得る。ヒトもしくはヒト化ＨＬＡ分子、その一部、および／またはその一本鎖誘導体に対して寛容である非ヒト動物、および当該非ヒト動物の作製方法の記載に加えて、抗ｐＭＨＣ抗体反応を生じさせるために当該非ヒト動物に抗原性ｐＭＨＣ複合体を投与する方法、ならびに当該抗原性ｐＭＨＣ複合体を作製する方法も開示される。
【0034】
用語の定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当分野の当業者により普遍的に理解される意味と同一の意味を有する。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当分野の当業者により普遍的に理解される意味と同一の意味を有する。
【0035】
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈で別途明確に指示されない限り、複数への言及を含む。したがって、例えば、「一つの方法」への言及は、本明細書に記載され、かつ／または当業者には本開示の閲読により明らかになるであろう種類の一つ以上の方法および／または工程を含む。
【0036】
「約」または「およそ」という用語は、意義のある値の範囲内であることを含む。「約」または「およそ」という用語によって包含される許容可能な変動は、研究中の特定の系に依存し、当業者によって容易に理解され得る。
【0037】
「主要組織適合性遺伝子複合体」および「ＭＨＣ」という用語は、「ヒト白血球抗原」または「ＨＬＡ」（後者二つは一般的に、ヒトＭＨＣ分子に対するものである）、天然ＭＨＣ分子、ＭＨＣ分子の個々の鎖（例えばＭＨＣクラスＩα（重）鎖、β２マイクログロブリン、ＭＨＣクラスＩＩα鎖、およびＭＨＣクラスＩＩβ鎖）、ＭＨＣ分子のそうした鎖の個々のサブユニット（例えば、ＭＨＣクラスＩα鎖のα１、α２および／またはα３サブユニット、ＭＨＣクラスＩＩα鎖のα１－α２サブユニット、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖のβ１－β２サブユニット）、ならびにその一部（例えば、ペプチド結合部分、例えば、ペプチド結合溝）、その変異体および様々な誘導体（融合タンパク質を含む）といった用語を包含するものであり、この場合において当該部分、変異体および誘導体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば抗原特異的ＴＣＲによる認識のために抗原性ペプチドを提示する能力を保持している。ＭＨＣクラスＩ分子は、約８～１０アミノ酸のペプチドを収容することができるα重鎖のα１ドメインおよびα２ドメインにより形成されるペプチド結合溝を含む。両方のクラスのＭＨＣとも、ペプチド内の約９アミノ酸（例えば、５～１７アミノ酸）のコアに結合するという事実にもかかわらず、ＭＨＣクラスＩＩペプチド結合溝（ＭＨＣクラスＩＩ βポリペプチドのβ１ドメインと関連付けられたＭＨＣクラスＩＩのαポリペプチドのα１ドメイン）が末端開放している性質によって、より広範な範囲のペプチド長が可能となる。ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドは通常、１３～１７アミノ酸の長さの間で変化するが、それより短いまたは長いアミノ酸の長さも珍しくはない。その結果として、ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩのペプチド結合溝内でシフトする場合があり、任意の所与の時点で溝内に直接存在する９ｍｅｒは変化する。特定のＭＨＣバリアントの従来的な識別法を本明細書で使用する。一部の実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、少なくともヒトペプチド結合溝（例えば、ペプチド結合部分）を含むヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子をコードするヌクレオチドを含み、さらなる実施形態では、少なくともヒトＨＬＡクラスＩ／ヒトβ２マイクログロブリン分子、および／またはヒトＨＬＡクラスＩＩ分子の細胞外ドメインをコードするヌクレオチドを含む。
【0038】
「寛容化された」、「寛容」、「寛容化」などの用語は、例えば本明細書に開示される遺伝子改変非ヒト動物などの動物が、物質に対する免疫反応を開始させる能力がないこと、または能力が低下していることを指す。概して動物は、胚発生中および／または出生時に発現される自己のタンパク質または自己の分子に対して、寛容化され、寛容を呈し、寛容化を経る。例えば、自身の生殖細胞系列ゲノムなど、自身のゲノムから発現された自己タンパク質または自己分子に対する免疫反応を動物は開始させない、または開始させる可能性は低い。例えば生殖細胞系列ゲノムなど、自身のゲノム中にヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子を含有するよう動物を遺伝子改変することにより、「空の」ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子が発現された際に、当該動物は、当該ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子が自己のタンパク質であるように、当該空のヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子に対し寛容となり、寛容を呈し、寛容化を経る。ＨＬＡ分子、ＭＨＣ分子、ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子などの文脈において、「空」とは、ペプチド結合溝内にペプチドを伴わずに発現された、または当該ＨＬＡ分子、ＭＨＣ分子、ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子などを発現する動物に対して内因性であるペプチドを伴い発現された、ＨＬＡ分子、ＭＨＣ分子、ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子などを含む。例えば、空のＭＨＣ分子は、動物において、当該動物の例えば生殖細胞系列ゲノムなどのゲノムから発現され、内因性動物自己タンパク質またはその一部を提示するヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子を含み得る。
【0039】
非ヒト動物のゲノムは、「体細胞ゲノム」とみなされ得る。例えば、当該非ヒト動物の体細胞中に存在するゲノムであってもよい。または非ヒト動物のゲノムは、「生殖細胞系列ゲノム」とみなされる場合もある。例えば、当該非ヒト動物の生殖細胞中に存在し、当該非ヒト動物の子孫に受け継がれるゲノムでもあり得る。当業者であれば、生殖細胞系列ゲノム中の再構成されていない免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖の可変領域座位は、当該非ヒト動物の体細胞（例えばＢ細胞）中で再構成され、免疫グロブリン可変ドメインをコードする再構成免疫グロブリン可変領域座位を形成する能力を有することを容易に認識するであろう。したがって、例示的な実施形態において、再構成されていない重鎖座位および／または軽鎖座位は、非ヒト動物の生殖細胞系列ゲノム中に存在してもよく、およびそれから誘導された再構成配列は、当該非ヒト動物の例えばＢ細胞などに存在してもよい。
【0040】
「非ヒト動物」などの用語は、ヒトではない任意の脊椎生物を指す。一部の実施形態では、非ヒト動物は、円口類、硬骨魚、軟骨魚（例えば、サメまたはエイ）、両生類、は虫類、哺乳類、および鳥である。一部の実施形態では、非ヒト動物は哺乳類である。一部の実施形態では、非ヒト哺乳類は、霊長類、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウシ、または齧歯類である。一部の実施形態では、非ヒト動物はラットまたはマウスなどの齧歯類である。
【0041】
「ヒト化された」、「キメラ」、「ヒト／非ヒト」などの用語は、起源は非ヒトであり、それに対する部分が、改変（例えばヒト化、キメラ、ヒト／非ヒトなど）分子が、その生物学的機能を保持し、および／または当該保持された生物学的機能を遂行する構造が維持されるように、対応するヒト分子の対応する部分で置換された分子（例えば、核酸、タンパク質など）を指す。ヒト化分子は、ヒト分子から誘導されたとみなされてもよく、この場合、当該ヒト化分子は、ヒト分子（またはその一部）をコードする核酸配列を含むヌクレオチドによりコードされる。対照的に、「ヒト」などは、ヒト起源のみ、例えば、ヒトのヌクレオチドおよびアミノ酸配列のみをそれぞれ含有するヒトのヌクレオチドまたはタンパク質を有する分子を包含する。「ヒト（ヒト化）」という用語は、当該ヒト（ヒト化）分子が、（ａ）ヒト分子であり得る、または（ｂ）ヒト化された分子であり得ることを反映するために使用される。
【0042】
一部の実施形態では、ヒトＨＬＡ分子の少なくともヒトペプチド－結合溝を含有するヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子を、ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子は含有し、または非ヒト動物は発現し、および当該分子に対して非ヒト動物は寛容化される。この場合において当該ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子は、ヒトペプチド－結合溝において抗原を提示する能力を保持し、および／または当該ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子は、ヒトＨＬＡ分子のヒトペプチド－結合溝の構造を維持する。一部の実施形態では、ヒトＨＬＡ分子の少なくともヒト細胞外ドメインを含有するヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子を、ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子は含有し、または非ヒト動物は発現し、および当該分子に対して非ヒト動物は寛容化される。この場合において当該ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子は、抗原を提示する能力を保持し、および／または当該ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子は、ヒトＨＬＡ分子のヒト細胞外ドメインの構造を維持し、ペプチド結合溝を形成させる。一部の実施形態では、ヒトＨＬＡクラスＩポリペプチドのヒトペプチド－結合溝（例えば、ヒトＨＬＡクラスＩポリペプチドの少なくともα１ドメインおよびα２ドメイン、例えば少なくとも全長成熟ヒトＨＬＡクラスＩポリペプチドなどのヒトＨＬＡクラスＩポリペプチドの細胞外部分）を含有するヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子を、ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子は含有し、または非ヒト動物は発現し、および当該分子に対して非ヒト動物は寛容化される。この場合において当該ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩポリペプチドは、抗原を提示する能力を保持し、および／または当該ヒトペプチド結合溝中で抗原を提示するために必要な構造を保持する。一部の実施形態では、ヒトＨＬＡクラスＩポリペプチドのヒトペプチド－結合溝（例えば、ヒトＨＬＡクラスＩポリペプチドの少なくともα１ドメインおよびα２ドメイン、例えば少なくとも全長成熟ヒトＨＬＡクラスＩポリペプチドなどのヒトＨＬＡクラスＩポリペプチドの細胞外部分）を含有するヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子を、ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子は含有し、または非ヒト動物は発現し、および当該分子に対して非ヒト動物は寛容化される。この場合において当該ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ分子は、抗原を提示する能力を保持し、および／または当該ヒトペプチド結合溝中で抗原を提示するために必要な構造を保持し、ならびにこの場合において当該ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ分子は、当該ＭＨＣクラスＩ分子を安定化させるヒトまたはヒト化β２マイクログロブリンをさらに含有する。
【0043】
「抗原」という用語は、免疫能力を有する宿主に導入されたときに、当該宿主の免疫系によって認識され、当該宿主による免疫反応を惹起させる任意の物質（例えばタンパク質、ペプチド、多糖類、糖タンパク質、糖脂質、ヌクレオチド、それらの一部、またはそれらの組み合わせ）を指す。Ｔ細胞受容体は、免疫シナプスの一部として、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）を背景として提示されるペプチドを認識する。ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体はＴＣＲによって認識され、当該ペプチド（抗原決定基）とＴＣＲイディオタイプが、当該相互作用の特異性をもたらす。したがって、「抗原」という用語は、例えば、ｐＭＨＣ複合体などのペプチド－ＭＨＣ複合体などのＭＨＣを背景として提示されるペプチドを包含する。ＭＨＣ上で提示されるペプチドは、「エピトープ」または「抗原決定基」と呼称される場合もある。「ペプチド」、「抗原決定基」、「エピトープ」などの用語は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）により自然に提示されるものを包含するだけでなく、例えば免疫系の細胞に適切に提示されたときに遺伝子改変非ヒト動物の免疫細胞により認識される限り、任意の所望のペプチドであってもよい。例えば、人工的に調製されたアミノ酸配列を有するペプチドも、エピトープとして使用され得る。
【0044】
「ペプチド－ＭＨＣ複合体」、「ｐＭＨＣ複合体」、「溝中のペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ－ｉｎ－ｇｒｏｏｖｅ）」などは、
（ｉ）ＭＨＣ分子、例えば、ヒトおよび／またはヒト化された（例えば、ヒト（ヒト化））ＭＨＣ分子、またはその一部（例えば、そのペプチド結合溝、および例えばその細胞外部分）、および
（ｉｉ）抗原性ペプチド、を含み、
この場合において当該ＭＨＣ分子および抗原性ペプチドは複合体化されて、当該ｐＭＨＣ複合体は、Ｔ細胞受容体に特異的に結合することができる。ｐＭＨＣ複合体は、細胞表面で発現されたｐＭＨＣ複合体、および可溶性ｐＭＨＣ複合体を包含する。例示的な実施形態では、例えば生殖細胞系列ゲノムなどの自身のゲノム中に、ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子または少なくともそのヒトペプチド結合溝をコードするヌクレオチド配列を含む非ヒト動物は、空のヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子に対して寛容となり、またはその空のヒトペプチド結合溝に対して寛容となる。非ヒト動物に抗原性ｐＭＨＣ複合体を投与した際に、例えばｐＭＨＣ複合体が投与される宿主非ヒト動物に対して外来性であるペプチドと複合体化されたヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子を含む複合体を非ヒト動物に投与した際に、当該非ヒト動物は、当該抗原性ｐＭＨＣ複合体に対する抗体反応を生じさせる能力を有する。次いでそうした特異的抗原結合タンパク質を単離し、抗原性ｐＭＨＣと特異的Ｔ細胞受容体の相互作用を特異的に調節する治療剤として使用してもよい。例示的な実施形態では、非ヒト動物が寛容化されたＭＨＣ分子と複合体化されたペプチド（ｐＭＨＣ複合体が投与される宿主非ヒト動物に対して外来性）を含む可溶性ｐＭＨＣ複合体は、投与されたｐＭＨＣ複合体の可溶性の性質によって、Ｔ細胞免疫反応を惹起させない場合がある。しかし、そうした可溶性ｐＭＨＣ複合体でも、当該ｐＭＨＣ複合体に特異的に結合する抗原結合タンパク質を生成するＢ細胞介在性免疫反応を惹起させ得るという点で、抗原性であるとみなされ得る。
（ｉ）ＭＨＣ分子、例えば、ヒトおよび／またはヒト化された（例えば、ヒト（ヒト化））ＭＨＣ分子、またはその一部（例えば、そのペプチド結合溝、および例えばその細胞外部分）、および
（ｉｉ）抗原性ペプチド、を含み、
この場合において当該ＭＨＣ分子および抗原性ペプチドは複合体化されて、当該ｐＭＨＣ複合体は、Ｔ細胞受容体に特異的に結合することができる。ｐＭＨＣ複合体は、細胞表面で発現されたｐＭＨＣ複合体、および可溶性ｐＭＨＣ複合体を包含する。例示的な実施形態では、例えば生殖細胞系列ゲノムなどの自身のゲノム中に、ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子または少なくともそのヒトペプチド結合溝をコードするヌクレオチド配列を含む非ヒト動物は、空のヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子に対して寛容となり、またはその空のヒトペプチド結合溝に対して寛容となる。非ヒト動物に抗原性ｐＭＨＣ複合体を投与した際に、例えばｐＭＨＣ複合体が投与される宿主非ヒト動物に対して外来性であるペプチドと複合体化されたヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子を含む複合体を非ヒト動物に投与した際に、当該非ヒト動物は、当該抗原性ｐＭＨＣ複合体に対する抗体反応を生じさせる能力を有する。次いでそうした特異的抗原結合タンパク質を単離し、抗原性ｐＭＨＣと特異的Ｔ細胞受容体の相互作用を特異的に調節する治療剤として使用してもよい。例示的な実施形態では、非ヒト動物が寛容化されたＭＨＣ分子と複合体化されたペプチド（ｐＭＨＣ複合体が投与される宿主非ヒト動物に対して外来性）を含む可溶性ｐＭＨＣ複合体は、投与されたｐＭＨＣ複合体の可溶性の性質によって、Ｔ細胞免疫反応を惹起させない場合がある。しかし、そうした可溶性ｐＭＨＣ複合体でも、当該ｐＭＨＣ複合体に特異的に結合する抗原結合タンパク質を生成するＢ細胞介在性免疫反応を惹起させ得るという点で、抗原性であるとみなされ得る。
【0045】
「遺伝子セグメント」または「セグメント」という文言は、可変（Ｖ）遺伝子セグメント（例えば、免疫グロブリン軽鎖可変（ＶＬ）遺伝子セグメントまたは免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）遺伝子セグメント）、免疫グロブリン重鎖多様性（ＤＨ）遺伝子セグメント、または結合（Ｊ）遺伝子セグメント、例えば免疫グロブリン軽鎖結合（ＪＬ）遺伝子セグメントまたは免疫グロブリン重鎖結合（ＪＬ）遺伝子セグメントに対する参照を含み、これらは、（例えば内因性リコンビナーゼにより介在される）再構成に関与して、再構成軽鎖ＶＬ／ＪＬ配列を形成し得る、または再構成重鎖ＶＨ／ＤＨ／ＪＨ配列を形成し得る免疫グロブリン座位で、非再構成配列を含む。別段の示唆が無い限り、非再構成Ｖ、Ｄ、およびＪセグメントは、１２／２３ルールに従うＶＬ／ＪＬ組み換え、またはＶＨ／ＤＨ／ＪＨ組み換えを可能にする組み換えシグナル配列（ＲＳＳ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含有する。
【0046】
「抗原結合タンパク質」、「免疫グロブリン」、「抗体」、「結合タンパク質」などの用語は、モノクローナル抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、イントラボディ、ミニボディ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば抗原特異的ＴＣＲに対する抗Ｉｄ抗体を含む）、ならびに上記のうちのいずれかのエピトープ結合断片を指す。「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」および「抗体ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語はまた、米国特許２００７０００４９０９に開示される共有結合ダイアボディ、および例えば米国特許２００９００６０９１０に開示されるＩｇ－ＤＡＲＴＳなども指し、それら出願公開は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。ｐＭＨＣ結合タンパク質とは、ｐＭＨＣ複合体に特異的に結合する抗原結合タンパク質、免疫グロブリン、抗体などを指す。
【0047】
「特異的に結合する」、「特異的な様式で結合する」、「抗原特異的」などの用語は、特異的結合に関与する分子が、（１）生理学的条件下で、安定的に結合することができる、例えば安定的に関連することができる、例えば安定的に分子間非共有結合を形成することができること、および（２）生理学的条件下で、特定の結合対以外の他の分子と安定的な結合を形成することができないことを示す。したがって特異的な様式でｐＭＨＣ複合体と結合する抗原結合タンパク質（例えば免疫グロブリン、抗体など）とは、当該ｐＭＨＣ結合タンパク質が、当該ｐＭＨＣ複合体と安定的な分子間非共有結合を形成することを示唆する。したがって第一のＭＨＣ分子と複合体化された第一のペプチドを含む特定のｐＭＨＣ複合体と特異的に結合する、例えば特異的な様式で結合するｐＭＨＣ結合タンパク質は、
（ｉ）生理学的条件下で、第一のＭＨＣ分子の背景化で提示される第二のペプチドを含むｐＭＨＣ複合体とは安定的に結合せず、この場合において当該第一および第二のペプチドは同一ではなく、例えば第一のＭＨＣ分子のペプチド結合溝と関連付けられた際に異なるイディオタイプ（立体構造）を呈し、
（ｉｉ）（ａ）第一のＭＨＣ分子を背景として提示される第一のペプチドを特異的に認識する第一のＴＣＲと、（ｂ）当該第一のペプチドと第一のＭＨＣ分子を含むｐＭＨＣ複合体の間の相互作用に干渉（例えば妨害）し得るが、
（ｉｉｉ）（ａ）第一のＭＨＣ分子を背景として提示される第二のペプチドを特異的に認識する第二のＴＣＲ、または（ｂ）第一のＭＨＣ分子を背景として提示される第二のペプチドを含むｐＭＨＣ複合体の間の相互作用には干渉せず、この場合において当該第一および第二のペプチドは異なっており、例えば第一のＭＨＣ分子のペプチド結合溝と関連付けられた際に異なるイディオタイプ（立体構造）を呈する。第一のペプチドと第一のＭＨＣ分子を含むｐＭＨＣ複合体に特異的に結合するｐＭＨＣ結合タンパク質はさらに、または独立して、第一のＭＨＣ分子を背景とした第一のペプチドを提示する第一の細胞に結合し得るが、第一のＭＨＣ分子を背景とした第二のペプチドを提示する第二の細胞には結合せず、この場合において当該第一および第二のペプチドは異なっており、ＭＨＣ分子のペプチド結合溝と関連付けられた際に異なるイディオタイプ（立体構造）を呈する。特異的結合はまた、低いマイクロモル～ピコモルの範囲の平衡解離定数（ＫＤ）により特徴付けることもできる。特異性が高ければ、低いナノモル範囲であり得、非常に高い特異性であれば、ピコモル範囲内となる。二つの分子が特異的に結合するかどうかを判定するための方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。
（ｉ）生理学的条件下で、第一のＭＨＣ分子の背景化で提示される第二のペプチドを含むｐＭＨＣ複合体とは安定的に結合せず、この場合において当該第一および第二のペプチドは同一ではなく、例えば第一のＭＨＣ分子のペプチド結合溝と関連付けられた際に異なるイディオタイプ（立体構造）を呈し、
（ｉｉ）（ａ）第一のＭＨＣ分子を背景として提示される第一のペプチドを特異的に認識する第一のＴＣＲと、（ｂ）当該第一のペプチドと第一のＭＨＣ分子を含むｐＭＨＣ複合体の間の相互作用に干渉（例えば妨害）し得るが、
（ｉｉｉ）（ａ）第一のＭＨＣ分子を背景として提示される第二のペプチドを特異的に認識する第二のＴＣＲ、または（ｂ）第一のＭＨＣ分子を背景として提示される第二のペプチドを含むｐＭＨＣ複合体の間の相互作用には干渉せず、この場合において当該第一および第二のペプチドは異なっており、例えば第一のＭＨＣ分子のペプチド結合溝と関連付けられた際に異なるイディオタイプ（立体構造）を呈する。第一のペプチドと第一のＭＨＣ分子を含むｐＭＨＣ複合体に特異的に結合するｐＭＨＣ結合タンパク質はさらに、または独立して、第一のＭＨＣ分子を背景とした第一のペプチドを提示する第一の細胞に結合し得るが、第一のＭＨＣ分子を背景とした第二のペプチドを提示する第二の細胞には結合せず、この場合において当該第一および第二のペプチドは異なっており、ＭＨＣ分子のペプチド結合溝と関連付けられた際に異なるイディオタイプ（立体構造）を呈する。特異的結合はまた、低いマイクロモル～ピコモルの範囲の平衡解離定数（ＫＤ）により特徴付けることもできる。特異性が高ければ、低いナノモル範囲であり得、非常に高い特異性であれば、ピコモル範囲内となる。二つの分子が特異的に結合するかどうかを判定するための方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。
【0048】
「個体」または「対象」または「動物」とは、ヒト、獣医動物（例えば、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、など）および疾患の実験動物モデル（例えば、マウス、ラット）を指す。一つの実施形態では、対象はヒトである。
【0049】
本明細書において使用される「タンパク質」という用語は、すべての種類の天然タンパク質および合成タンパク質を包含するものであり、すべての長さのタンパク質断片、融合タンパク質、および限定されないが糖タンパク質をはじめとする改変タンパク質を含み、ならびに他のすべての種類の改変タンパク質（例えば、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、パルミトイル化、グリコシル化、酸化、ホルミル化、アミド化、ポリグルタミル化、ＡＤＰ－リボシル化、ペグ化、ビオチニル化から生じるタンパク質）を含む。
【0050】
「核酸」および「ヌクレオチド」という用語は、別段の指定がない限り、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を包含する。
【0051】
「力価」、「抗体力価」、「抗体の力価」などの用語は、特異的または非特異的な様式で抗原に結合する例えばアイソタイプなどの特徴的な能力を共有する（例えば、対象から取得された血清中の）抗体サンプルの能力を指す。対象から採取された血清中の抗体の力価の決定方法は、当分野で公知である。一部の実施形態では、対象から採取された血清中の抗体の力価は、結合シグナルがバックグラウンドの２倍である、補間血清希釈倍数として算出される。一部の実施形態では、ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子を発現し、これに対して寛容である非ヒト動物は、対象のｐＭＨＣ複合体（例えば、当該ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子が誘導されたＨＬＡ分子を背景として提示される対象ペプチド）で免疫化されたとき、特異的反応（例えば、特異的抗体反応などの特異的Ｂ細胞反応などの特異的免疫反応）を生じさせることができ、または生じさせる。一部の実施形態では、反応は、「特異的反応」またはそれに類するものとみなされる。この場合において当該非ヒト動物は、対象のｐＭＨＣ複合体で免疫化されたときに、非関連ｐＭＨＣ複合体に対する抗体価よりも、対象ｐＭＨＣ複合体に対して高い抗体価を生じさせる。一部の実施形態では、反応は、特異的反応またはそれに類するものとみなされる。この場合において当該非ヒト動物は、対象のｐＭＨＣ複合体で免疫化されたときに、非関連ｐＭＨＣ複合体に対する抗体価よりも、対象ｐＭＨＣ複合体に対して、少なくとも２倍高い抗体価を生じさせる。一部の実施形態では、反応は、特異的反応またはそれに類するものとみなされる。この場合において当該非ヒト動物は、対象のｐＭＨＣ複合体で免疫化されたときに、非関連ｐＭＨＣ複合体に対する抗体価よりも、対象ｐＭＨＣ複合体に対して、少なくとも５倍高い抗体価を生じさせる。一部の実施形態では、反応は、特異的反応またはそれに類するものとみなされる。この場合において当該非ヒト動物は、対象のｐＭＨＣ複合体で免疫化されたときに、非関連ｐＭＨＣ複合体に対する抗体価よりも、対象ｐＭＨＣ複合体に対して、少なくとも１０倍高い抗体価を生じさせる。一部の実施形態では、反応は、特異的反応またはそれに類するものとみなされる。この場合において当該非ヒト動物は、対象のｐＭＨＣ複合体で免疫化されたときに、非関連ｐＭＨＣ複合体に対する抗体価よりも、対象ｐＭＨＣ複合体に対して、有意に高い抗体価を生じさせる。
【0052】
「動作可能に連結した」などの用語は、記載される構成要素が、それらが意図された様式で機能することができるような関係にある並置を意味する。例えば、再構成されていない可変領域遺伝子セグメントが再構成されて、再構成済み可変領域遺伝子を形成することができ、そして当該再構成済み可変領域が、定常領域遺伝子と連結されて抗原結合タンパク質のポリペプチド鎖として発現される場合は、当該再構成されていない可変領域遺伝子セグメントは、連続的な定常領域遺伝子に「動作可能に連結されている」。コード配列に「動作可能に連結した」対照配列は、対照配列に適合する条件下でコード配列の発現が達成されるように結合されている。「動作可能に連結した」配列には、対象の遺伝子と連続する発現制御配列と、トランスで、または離れて作用して対象の遺伝子（または対象の配列）を制御する発現制御配列の両方を含む。「発現制御配列」という用語は、ポリヌクレオチド配列を含み、それらが結合されるコード配列の発現およびプロセッシングに作用するために必要である。「発現制御配列」には、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的ＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳効率を強化する配列（すなわち、コザック配列）、ポリペプチド安定性を強化する配列、および望ましい場合には、ポリペプチド分泌を強化する配列を含む。このような制御配列の性質は、宿主生物によって異なる。例えば、原核生物では、かかる制御配列としては、概して、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列が挙げられる一方、真核生物では、かかる制御配列としては、概して、プロモーターおよび転写終結配列が挙げられる。「制御配列」という用語は、その存在が発現およびプロセシングのために必須である要素を含むことを意図しており、その存在が有利である追加的要素、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含むことができる。
【0053】
「投与」などの用語は、対象またはシステム（たとえば、細胞、臓器、組織、生物体、または関連構成要素もしくはその構成要素のセット）に対する組成物の投与を指し、これを含む。当業者であれば、投与経路は、例えば、その組成物が投与される対象またはシステム、組成物の性質、投与目的などに応じて異なり得ることを認識するであろう。例えば、特定の実施形態では、動物対象（例えば、ヒトまたは齧歯類）への投与は、気管支投与（気管支注入を含む）、口腔投与、腸内投与、皮間投与、動脈内投与、皮内投与、胃内投与、髄内投与、筋肉内投与、鼻内投与、腹腔内投与、髄腔内投与、静脈内投与、心室内投与、粘膜投与、経鼻投与、経口投与、直腸投与、皮下投与、舌下投与、局所投与、気管投与（気管内注入を含む）、経皮投与、膣投与、および／または硝子体投与であってもよい。一部の実施形態では、投与は、間欠投薬を含み得る。一部の実施形態では、投与は、少なくとも選択された期間にわたる連続投薬（例えば、かん流）を含み得る。
【0054】
「～から誘導された」という用語は、非再構成可変領域および／または非再構成可変領域遺伝子セグメント「から誘導された」再構成可変領域遺伝子または再構成可変ドメインに関して使用される場合、当該再構成可変領域遺伝子または当該再構成可変ドメインの配列を、再構成された非再構成可変領域遺伝子セグメント群まで遡り、可変ドメインを発現する再構成可変領域遺伝子を形成させる能力を指す（適応可能な場合には、スプライス差異、および体細胞変異の原因となる）。例えば、体細胞変異を経た再構成済み可変領域遺伝子は、再構成されていない可変領域遺伝子セグメントから誘導されたという事実は変わらない。
【0055】
「内因性座位」または「内因性遺伝子」という用語は、本明細書に記載される破壊、削除、置換、変化、または改変の導入前に、親または基準生物において存在する遺伝子座位を指す。一部の実施形態では、内因性座位は自然界に存在する配列を有する。一部の実施形態では、内因性座位は野生型座位である。一部の実施形態では、内因性座位は操作された座位である。
【0056】
「異種」という用語は、異なる供給源からの物質または実体を意味する。例えば、特定の細胞もしくは生物体に存在するポリペプチド、遺伝子、または遺伝子産物に関連して使用されるとき、当該用語は、関連ポリペプチド、遺伝子、または遺伝子産物が、１）ヒトの手によって遺伝子操作されたこと、２）ヒトの手によって（例えば、遺伝子操作によって）細胞または生物（またはその前駆体）に導入されたこと、および／または３）関連細胞または生物（例えば、関連細胞タイプまたは生物タイプ）によって自然には生成されない、またはその中に存在しないことを明確にする。「異種」は、たとえば天然では関連していない、および一部の実施形態では非内因性の制御因子（たとえばプロモーター）の制御下にある、特定の天然の細胞または生物中に通常存在するが、突然変異または置換により変化する、または改変されるポリペプチド、遺伝子、または遺伝子産物も含む。
【0057】
【0058】
本明細書の開示内容に従い、当分野の技術範囲内にある従来からの分子生物学、微生物学、および組み換えＤＮＡ技術が採用されてもよい。そうした技術は、文献内で完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９（本明細書において、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９」）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５）］；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）］；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６）］；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ ［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９４を参照のこと。それら各公表文献は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。これらの技術には、部位指向性突然変異誘導が含まれ、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８－ ４９２（１９８５）、米国特許第５，０７１，７４３号、Ｆｕｋｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６３：３５７－３６０（１９９９）；Ｋｉｍ ａｎｄ Ｍａａｓ，ＢｉｏＴｅｃｈ．２８：１９６－１９８（２０００）；Ｐａｒｉｋｈ ａｎｄ Ｇｕｅｎｇｅｒｉｃｈ，ＢｉｏＴｅｃｈ．２４：４ ２８－４３１（１９９８）；Ｒａｙ ａｎｄ Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，ＢｉｏＴｅｃｈ．１３：３４２－３４６（１９９２）；Ｗａｎｇ ｅｔ
ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈ．１９：５５６－５５９（１９９５）；Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｍａｌｃｏｌｍ，ＢｉｏＴｅｃｈ．２６：６８０－６８２（１９９９）；Ｘｕ ａｎｄ Ｇｏｎｇ，ＢｉｏＴｅｃｈ．２６：６３９－６４１（１９９９）、米国特許第５，７８９，１６６号および第５，９３２，４１９号、Ｈｏｇｒｅｆｅ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｌ４．３：７４－７５（２００１）、米国特許第５，７０２，９３１号、第５，７８０，２７０号および第６，２４２，２２２号、Ａｎｇａｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｔｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．３０：４８６－４８８（２００１），Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：９７６－９７８（２０００），Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：４４－４６（１９９６），Ｏｇｅｌ ａｎｄ ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．５：４６７－４６８（１９９２），Ｋｉｒｓｃｈ ａｎｄ
Ｊｏｌｙ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２６：１８４８－１８５０（１９９８），Ｒｈｅｍ ａｎｄ Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：３３４６－３３４９（１９９６），Ｂｏｌｅｓ ａｎｄ Ｍｉｏｇｓａ，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２８：１９７－１９８（１９９５），Ｂａｒｒｅｎｔｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２２：５４１－５４２（１９９３），Ｔｅｓｓｉｅｒ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，Ｍｅｔｈｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．５７：２２９－２３７，ならびにＰｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．６７：２０９－２１８を参照のこと。それら各公表文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。
ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈ．１９：５５６－５５９（１９９５）；Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｍａｌｃｏｌｍ，ＢｉｏＴｅｃｈ．２６：６８０－６８２（１９９９）；Ｘｕ ａｎｄ Ｇｏｎｇ，ＢｉｏＴｅｃｈ．２６：６３９－６４１（１９９９）、米国特許第５，７８９，１６６号および第５，９３２，４１９号、Ｈｏｇｒｅｆｅ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｌ４．３：７４－７５（２００１）、米国特許第５，７０２，９３１号、第５，７８０，２７０号および第６，２４２，２２２号、Ａｎｇａｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｔｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．３０：４８６－４８８（２００１），Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：９７６－９７８（２０００），Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：４４－４６（１９９６），Ｏｇｅｌ ａｎｄ ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．５：４６７－４６８（１９９２），Ｋｉｒｓｃｈ ａｎｄ
Ｊｏｌｙ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２６：１８４８－１８５０（１９９８），Ｒｈｅｍ ａｎｄ Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：３３４６－３３４９（１９９６），Ｂｏｌｅｓ ａｎｄ Ｍｉｏｇｓａ，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２８：１９７－１９８（１９９５），Ｂａｒｒｅｎｔｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２２：５４１－５４２（１９９３），Ｔｅｓｓｉｅｒ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，Ｍｅｔｈｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．５７：２２９－２３７，ならびにＰｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．６７：２０９－２１８を参照のこと。それら各公表文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。
【0059】
ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子の寛容化
例示的実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物、例えば、哺乳動物、例えば、齧歯類、例えば、ラットまたはマウスは、少なくとも一つの空のヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子、または少なくともその空のヒトペプチド結合溝を発現し、これらに対して寛容である。しかしながら、例えば異種などの抗原性のペプチドと複合体化されたときに、ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子に対する、例えばヒトまたはヒト化可変ドメインを含む抗原結合タンパク質などの抗原結合タンパク質を生成することができる。一部の実施形態では、空のヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子に対する非ヒト動物の寛容は、当該非ヒト動物を、そのゲノム中に、当該ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子または少なくともそのヒトペプチド結合溝をコードするヌクレオチド配列を含有するように遺伝子改変して、当該非ヒト動物が、当該ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子または少なくともそのヒトペプチド結合溝を、空のヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子として、またはその空のヒトペプチド結合溝として発現することにより実現される。ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子をコードするヌクレオチドを含有するよう遺伝子改変された当該動物をさらに改変して、ヒト化免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖の座位を含有させて、ヒトまたはヒト化された抗原結合タンパク質、例えばヒトまたはヒト化可変ドメインを有する抗原結合タンパク質を発現させてもよい。
例示的実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物、例えば、哺乳動物、例えば、齧歯類、例えば、ラットまたはマウスは、少なくとも一つの空のヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子、または少なくともその空のヒトペプチド結合溝を発現し、これらに対して寛容である。しかしながら、例えば異種などの抗原性のペプチドと複合体化されたときに、ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子に対する、例えばヒトまたはヒト化可変ドメインを含む抗原結合タンパク質などの抗原結合タンパク質を生成することができる。一部の実施形態では、空のヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子に対する非ヒト動物の寛容は、当該非ヒト動物を、そのゲノム中に、当該ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子または少なくともそのヒトペプチド結合溝をコードするヌクレオチド配列を含有するように遺伝子改変して、当該非ヒト動物が、当該ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子または少なくともそのヒトペプチド結合溝を、空のヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子として、またはその空のヒトペプチド結合溝として発現することにより実現される。ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子をコードするヌクレオチドを含有するよう遺伝子改変された当該動物をさらに改変して、ヒト化免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖の座位を含有させて、ヒトまたはヒト化された抗原結合タンパク質、例えばヒトまたはヒト化可変ドメインを有する抗原結合タンパク質を発現させてもよい。
【0060】
ＭＨＣ分子は一般的に、クラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ分子の二つのカテゴリに分類される。ＭＨＣクラスＩ分子は、本明細書においてα鎖とも呼称される、糖タンパク質重鎖を含有する統合型膜タンパク質であり、当該α鎖は、三つの細胞外ドメイン（すなわち、α１、α２、およびα３）と二つの細胞内ドメイン（すなわち、膜貫通ドメイン（ＴＭ）および細胞質ドメイン（ＣＹＴ））を有する。重鎖は、β２マイクログロブリン（β２ｍまたはβ２Ｍ）と呼ばれる可溶性サブユニットと非共有結合している。ＭＨＣクラスＩＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩタンパク質は、ヘテロ二量体統合型膜タンパク質であり、非共有結合した一つのα鎖と一つのβ鎖を含む。α鎖は、二つの細胞外ドメイン（α１およびα２）と、二つの細胞内ドメイン（ＴＭドメインおよびＣＹＴドメイン）を有する。β鎖は、二つの細胞外ドメイン（β１およびβ２）と、二つの細胞内ドメイン（ＴＭドメインおよびＣＹＴドメイン）を含有する。
【0061】
クラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ分子のドメイン構造は、ＭＨＣ分子の抗原決定性結合部位、例えば、ペプチド結合部分またはペプチド結合溝を形成する。ペプチド結合溝は、例えば抗原決定基などのペプチドが結合することができる空洞を形成するＭＨＣタンパク質部分を指す。ペプチド結合溝の構造は、ペプチド結合の際に変化する能力を有し、ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体へのＴＣＲの結合に重要なアミノ酸残基を適切にアライメントすることができる。
【0062】
一部の実施形態では、ＭＨＣ分子は、ペプチド結合溝を形成するのに充分なＭＨＣ鎖の断片を含む。例えば、クラスＩタンパク質のペプチド結合溝は、重鎖のα１ドメインとα２ドメインの部分を含有し、二つのβプリーツ型のシートと、二つのαヘリックスを形成することができる。β２マイクログロブリン鎖の一部を含めることで、ＭＨＣクラスＩ分子が安定化する。ＭＨＣクラスＩＩ分子の最も多くのバージョンについては、α鎖とβ鎖の相互作用はペプチドの非存在下でも起こり得る一方で、ＭＨＣクラスＩの二つの鎖の分子は、結合溝がペプチドで満たされるまで不安定である。クラスＩＩタンパク質のペプチド結合溝は、α１ドメインとβ１ドメインの部分を含有し、二つのβプリーツ型シートと、二つのαヘリックスを形成することができる。α１ドメインの第一の部分は、第一のβプリーツ型シートを形成し、α１ドメインの第二の部分は第一のαヘリックスを形成する。β１ドメインの第一の部分は、第二のβプリーツ型シートを形成し、β１ドメインの第二の部分は第二のαヘリックスを形成する。タンパク質の結合溝に会合したペプチドを有するクラスＩＩタンパク質のＸ線結晶構造解析から、会合したペプチドの一つの末端または両方の末端が、ＭＨＣタンパク質を超えて突出し得ることが示されている（Ｂｒｏｗｎ
ｅｔ ａｌ．，ｐｐ．３３－３９，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３６４、その全体で参照により本明細書に組み込まれる）。したがって、クラスＩＩのα１およびβ１のαヘリックスの末端は、開放空洞を形成し、結合溝に結合されたペプチドの末端は、空洞内に埋もれていない。さらに、クラスＩＩタンパク質のＸ線結晶構造解析により、ＭＨＣ
β鎖のＮ末端は、体系化されていない様式でＭＨＣタンパク質の側面から明白に突出しており、β鎖の最初の４アミノ酸残基は、Ｘ線結晶解析に割り当てることができなかったことが示されている。
ｅｔ ａｌ．，ｐｐ．３３－３９，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３６４、その全体で参照により本明細書に組み込まれる）。したがって、クラスＩＩのα１およびβ１のαヘリックスの末端は、開放空洞を形成し、結合溝に結合されたペプチドの末端は、空洞内に埋もれていない。さらに、クラスＩＩタンパク質のＸ線結晶構造解析により、ＭＨＣ
β鎖のＮ末端は、体系化されていない様式でＭＨＣタンパク質の側面から明白に突出しており、β鎖の最初の４アミノ酸残基は、Ｘ線結晶解析に割り当てることができなかったことが示されている。
【0063】
多くのヒトおよび他の哺乳動物のＭＨＣが、当分野で公知である。
【0064】
一部の実施形態では、非ヒト動物は、第一、第二、および／または第三のヌクレオチド配列のうち少なくとも一つを含有し、それら各々は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ ＩＩαポリペプチド、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ ＩＩβポリペプチド、およびヒトまたはヒト化ＭＨＣ Ｉαポリペプチドからなる群から選択される様々なヒトまたはヒト化ＭＨＣポリペプチドをコードする。非ヒト動物はさらに、例えばヒトまたはヒト化ＭＨＣ Ｉαポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する実施形態においては、ヒトまたはヒト化β２マイクログロブリンを含有してもよい。本明細書において第一、第二、および第三という指定の使用は、任意の特定の順序で三つのヌクレオチド配列のすべてを必要とする、または任意の特定の順序でヒトまたはヒト化ＭＨＣポリペプチドのいずれかの存在を必要とするとして、本明細書に開示の非ヒト動物を限定するとは解釈されないものとする。
【0065】
本明細書の様々な実施形態において、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／またはヒトもしくはヒト化ＭＨＣ ＩＩタンパク質、または少なくともそのヒトペプチド結合溝をコードするヌクレオチド配列を、そのゲノム中に含有する遺伝子改変非ヒト動物、例えば哺乳動物、例えば齧歯類（例えばマウスまたはラット）が提供される。ＭＨＣ Ｉヌクレオチド配列は、完全にヒトであるＭＨＣ Ｉポリペプチド（例えば、ヒトＨＬＡクラスＩ分子）、または部分的にヒトであり、部分的に非ヒトであるヒト化ＭＨＣ Ｉポリペプチド（例えば、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチド）をコードしてもよく、およびＭＨＣ ＩＩヌクレオチド配列は、完全にヒトであるＭＨＣ ＩＩタンパク質（例えば、ヒトＨＬＡクラスＩＩ分子）、または部分的にヒトであり、部分的に非ヒトであるヒト化ＭＨＣクラスＩＩタンパク質（例えば、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ ＩＩタンパク質、例えばキメラヒト／非ヒトＭＨＣ ＩＩαおよびβポリペプチドを含む）をコードしてもよい。
【0066】
本明細書の実施例において、内因性座位から、非ヒトＭＨＣ Ｉ分子の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに動作可能に連結されたヒトＨＬＡクラスＩ分子のヒト細胞外部分（ヒトペプチド結合ドメインを含有する）を含むキメラヒト／非ヒトＭＨＣ Ｉ分子を発現する遺伝子改変動物が、空であるときのヒトＨＬＡクラスＩ分子の例えばヒトペプチド結合ドメインなどのヒト細胞外ドメインに対して寛容であること、および例えば当該非ヒト動物に対して異種であるペプチドなどの抗原と複合体化されたときのヒトペプチド結合ドメインに対し、特異的免疫反応を生じさせ得ることを示す。例えば、実施例を参照のこと。したがって一部の実施形態では、例えばラットまたはマウスなどのげっ歯類などの非ヒト動物は、
（１）例えば、内因性ＭＨＣ座位から、（ｂ）非ヒトＭＨＣ Ｉ分子の非ヒト膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、（ａ）（ｂ）に動作可能に連結されたヒトＨＬＡ分子の少なくともヒトペプチド－結合溝、例えばヒト細胞外部分、を含有するキメラヒト／非ヒトＭＨＣ分子を発現し、および
（２）ヒトＨＬＡ分子の少なくとも細胞外部分に対して寛容である。
（１）例えば、内因性ＭＨＣ座位から、（ｂ）非ヒトＭＨＣ Ｉ分子の非ヒト膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、（ａ）（ｂ）に動作可能に連結されたヒトＨＬＡ分子の少なくともヒトペプチド－結合溝、例えばヒト細胞外部分、を含有するキメラヒト／非ヒトＭＨＣ分子を発現し、および
（２）ヒトＨＬＡ分子の少なくとも細胞外部分に対して寛容である。
【0067】
そのゲノム中に、例えば内因性座位で、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変非ヒト動物は、米国特許第９，５９１，８３５号および第９，６１５，５５０号に開示されており、各公表文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。そのゲノム中に、例えば内因性座位で、ヒト化、例えばキメラヒト／非ヒトのＭＨＣ ＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変非ヒト動物は、米国特許第８，８４７，００５号および第９，０４３，９９６号に開示されており、各公表文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。そのゲノム中に、例えば内因性座位で、ヒト化、例えばキメラヒト／非ヒトのＭＨＣ Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、およびそのゲノム中に、例えば内因性座位で、ヒト化、例えばキメラヒト／非ヒトＭＨＣ ＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変非ヒト動物は、米国特許第１０，１５４，６５８号に開示されており、当該特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0068】
様々な本明細書の実施形態において、そのゲノム中、例えば、その生殖細胞系列ゲノム中、例えば一つまたは複数の内因性ＭＨＣ座位で、
（ｉ）非ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチド、例えば内因性ＭＨＣ Ｉポリペプチドの膜貫通ドメインと細胞質ドメインを含む非ヒト部分に動作可能に連結された、ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチドの細胞外部分（またはその一部。例えば、一つまたは複数の細胞外ドメイン、例えば、ペプチド結合溝）を含むヒト部分を含む、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチドをコードする第一のヌクレオチド配列、ならびに／または
（ｉｉ）非ヒト部分に動作可能に連結されたヒト部分を含むキメラヒト／非ヒトＭＨＣ ＩＩαポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列であって、当該キメラＭＨＣ ＩＩαポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子のαポリペプチドの細胞外部分（またはその一部。例えば、一つまたは複数の細胞外ドメイン、例えば、α１ドメイン）を含む、第二のヌクレオチド配列、および非ヒト部分に動作可能に連結されたヒト部分を含むキメラヒト／非ヒトＭＨＣ ＩＩβポリペプチドをコードする第三のヌクレオチド配列であって、当該キメラＭＨＣ ＩＩβポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子のβポリペプチドの細胞外部分（またはその一部。例えば、一つまたは複数の細胞外ドメイン、例えば少なくともβ１ドメイン）を含む、第三のヌクレオチド配列、を含む遺伝子改変非ヒト動物が提供され、
当該非ヒト動物は、キメラヒト／非ヒトのＭＨＣ Ｉタンパク質および／またはＭＨＣ
ＩＩタンパク質を発現し、当該キメラヒト／非ヒトのＭＨＣ Ｉタンパク質および／またはＭＨＣ ＩＩタンパク質に対して寛容である。一つの実施形態では、第一、第二、および／または第三のヌクレオチド配列はそれぞれ、内因性非ヒトＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩαおよびＭＨＣ ＩＩβ座位に位置する。一つの実施形態では、非ヒト動物はマウスであり、第一、第二、および／または第三のヌクレオチド配列は、マウスの１７番染色体上の内因性マウスＭＨＣ座位に位置する。一つの実施形態では、第一のヌクレオチド配列は、内因性非ヒトＭＨＣ Ｉ座位に位置する。一つの実施形態では、第二のヌクレオチド配列は、内因性非ヒトＭＨＣ ＩＩα座位に位置する。一つの実施形態では、第三のヌクレオチド配列は、内因性非ヒトＭＨＣ ＩＩβ座位に位置する。
（ｉ）非ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチド、例えば内因性ＭＨＣ Ｉポリペプチドの膜貫通ドメインと細胞質ドメインを含む非ヒト部分に動作可能に連結された、ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチドの細胞外部分（またはその一部。例えば、一つまたは複数の細胞外ドメイン、例えば、ペプチド結合溝）を含むヒト部分を含む、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチドをコードする第一のヌクレオチド配列、ならびに／または
（ｉｉ）非ヒト部分に動作可能に連結されたヒト部分を含むキメラヒト／非ヒトＭＨＣ ＩＩαポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列であって、当該キメラＭＨＣ ＩＩαポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子のαポリペプチドの細胞外部分（またはその一部。例えば、一つまたは複数の細胞外ドメイン、例えば、α１ドメイン）を含む、第二のヌクレオチド配列、および非ヒト部分に動作可能に連結されたヒト部分を含むキメラヒト／非ヒトＭＨＣ ＩＩβポリペプチドをコードする第三のヌクレオチド配列であって、当該キメラＭＨＣ ＩＩβポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子のβポリペプチドの細胞外部分（またはその一部。例えば、一つまたは複数の細胞外ドメイン、例えば少なくともβ１ドメイン）を含む、第三のヌクレオチド配列、を含む遺伝子改変非ヒト動物が提供され、
当該非ヒト動物は、キメラヒト／非ヒトのＭＨＣ Ｉタンパク質および／またはＭＨＣ
ＩＩタンパク質を発現し、当該キメラヒト／非ヒトのＭＨＣ Ｉタンパク質および／またはＭＨＣ ＩＩタンパク質に対して寛容である。一つの実施形態では、第一、第二、および／または第三のヌクレオチド配列はそれぞれ、内因性非ヒトＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩαおよびＭＨＣ ＩＩβ座位に位置する。一つの実施形態では、非ヒト動物はマウスであり、第一、第二、および／または第三のヌクレオチド配列は、マウスの１７番染色体上の内因性マウスＭＨＣ座位に位置する。一つの実施形態では、第一のヌクレオチド配列は、内因性非ヒトＭＨＣ Ｉ座位に位置する。一つの実施形態では、第二のヌクレオチド配列は、内因性非ヒトＭＨＣ ＩＩα座位に位置する。一つの実施形態では、第三のヌクレオチド配列は、内因性非ヒトＭＨＣ ＩＩβ座位に位置する。
【0069】
一つの実施形態では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチドは、非ヒト部分に動作可能に連結されたヒト部分を含み、この場合において当該ヒト部分は、ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチドの少なくともペプチド結合溝を含む。一つの実施形態では、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ Ｉ分子の細胞外部分を含む。本実施形態では、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ Ｉ分子のα鎖の細胞外ドメインを含む。一つの実施形態では、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ Ｉ分子のα１ドメインおよびα２ドメインを含む。別の実施形態では、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ Ｉ分子のα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインを含む。
【0070】
一つの実施形態では、キメラＭＨＣ ＩＩαポリペプチドのヒト部分、および／またはキメラＭＨＣ ＩＩβポリペプチドのヒト部分は、それぞれヒトＭＨＣ ＩＩαポリペプチドおよび／またはヒトＭＨＣ ＩＩβポリペプチド、例えばヒトＭＨＣ ＩＩタンパク質のＭＨＣ ＩＩαおよびβポリペプチドのペプチド結合ドメインを含む。一つの実施形態では、キメラＭＨＣ ＩＩαおよび／またはβポリペプチドのヒト部分は、それぞれヒトＭＨＣ ＩＩαおよび／またはβポリペプチド、例えばヒトＭＨＣ ＩＩタンパク質のＭＨＣ ＩＩαおよびβポリペプチドの細胞外部分を含む。一つの実施形態では、キメラＭＨＣ ＩＩαポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ ＩＩαポリペプチドのα１ドメインを含み、別の実施形態では、キメラＭＨＣ ＩＩαポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ ＩＩαポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインを含む。追加的な実施形態では、キメラＭＨＣ ＩＩβポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ ＩＩβポリペプチドのβ１ドメインを含み、別の実施形態では、キメラＭＨＣ ＩＩβポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ ＩＩβポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインを含む。
【0071】
例示的実施形態における非ヒト動物は、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ分子を発現し、これに対して寛容である。一つの実施形態では、ヒト部分はそれぞれ、ヒトＭＨＣ Ｉ分子、ＭＨＣ ＩＩα分子、および／またはＭＨＣ ＩＩβ分子の細胞外ドメインを含み、ヒト部分は、非ヒト部分に動作可能に連結され、当該キメラヒト／非ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチド、ＭＨＣ ＩＩαポリペプチドおよび／またはＭＨＣ ＩＩβポリペプチドの非ヒト部分は、それぞれ内因性非ヒト（例えば齧歯類、例えばマウス、ラット）ＭＨＣ Ｉポリペプチド、ＭＨＣ ＩＩαポリペプチド、および／もしくはＭＨＣ ＩＩβポリペプチドの膜貫通ドメインならびに／または細胞質ドメインを含む。したがって、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチドの非ヒト部分は、内因性非ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチドの膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインを含み得る。キメラＭＨＣ ＩＩαポリペプチドの非ヒト部分は、内因性非ヒトＭＨＣ ＩＩαポリペプチドの膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインを含み得る。キメラヒト／非ヒトＭＨＣ ＩＩβポリペプチドの非ヒト部分は、内因性非ヒトＭＨＣ ＩＩβポリペプチドの膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインを含み得る。一つの実施形態では、非ヒト動物は、マウスであり、キメラＭＨＣ Ｉポリペプチドの非ヒト部分は、マウスＨ－２Ｋタンパク質から誘導される。一つの実施形態では、非ヒト動物は、マウスであり、キメラＭＨＣ ＩＩαおよびβポリペプチドの非ヒト部分は、マウスＨ－２Ｅタンパク質から誘導される。したがって、キメラＭＨＣ Ｉポリペプチドの非ヒト部分は、マウスＨ－２Ｋから誘導された膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み得、およびキメラＭＨＣ ＩＩαおよびβポリペプチドの非ヒト部分は、マウスＨ－２Ｅタンパク質から誘導された膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み得る。特定のＨ－２Ｋ配列およびＨ－２Ｅ配列が本実施例において予期されるが、任意の適切な配列、例えば、多型バリアント、保存的／非保存的アミノ酸置換などが本明細書に包含される。
【0072】
一つの実施形態では、キメラヒト／マウスＭＨＣ Ｉポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ Ｉ（例えば、ヒトＨＬＡ－Ａ、例えばヒトＨＬＡ－Ａ２、例えばヒトＨＬＡ－Ａ２．１）のペプチド結合ドメインまたは細胞外ドメインを含む。ヒトＭＨＣ Ｉのペプチド結合溝は、α１ドメインとα２ドメインを含み得る。あるいはヒトＭＨＣ Ｉのペプチド結合溝は、αドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインを含み得る。一つの実施形態では、ヒトＭＨＣ Ｉの細胞外ドメインは、ヒトＭＨＣ Ｉα鎖の細胞外ドメインを含む。一つの実施形態では、内因性マウスＭＨＣ Ｉ座位は、Ｈ－２Ｋ（例えば、Ｈ－２Ｋｂ）座位であり、キメラＭＨＣ Ｉポリペプチドのマウス部分は、マウスＨ－２Ｋ（例えば、Ｈ－２Ｋｂ）ポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。したがって一つの実施形態では、本発明のマウスは、その内因性マウスＭＨＣ Ｉ座位で、キメラヒト／マウスＭＨＣ Ｉをコードするヌクレオチド配列を含み、この場合において当該キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＨＬＡ－Ａ２（例えば、ＨＬＡ－Ａ２．１）ポリペプチドの細胞外ドメインを含み、ならびにマウス部分は、マウスＨ－２Ｋ（例えば、Ｈ－２Ｋｂ）ポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み（例えば、配列番号２４を参照のこと）、そしてマウスはキメラヒト／マウスのＨＬＡ－Ａ２／Ｈ－２Ｋタンパク質を発現する。他の実施形態では、キメラＭＨＣ Ｉポリペプチドのマウス部分は、他のマウスＭＨＣ Ｉ、例えば、Ｈ－２Ｄ、Ｈ－２Ｌなどから誘導されてもよく、キメラＭＨＣ Ｉポリペプチドのヒト部分は、他のヒトＭＨＣ Ｉ、例えば、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃから誘導されてもよい。
【0073】
一つの実施形態では、キメラヒト／マウスＭＨＣ ＩＩαポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ ＩＩαのペプチド結合ドメインまたは細胞外ドメインを含み、キメラヒト／マウスＭＨＣＩＩβポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ ＩＩβのペプチド結合ドメインまたは細胞外ドメインを含む。ヒトＭＨＣ ＩＩαポリペプチドのペプチド結合ドメインは、α１ドメインを含んでもよく、ヒトＭＨＣ ＩＩβポリペプチドのペプチド結合ドメインは、β１ドメインを含んでもよい。したがって、キメラＭＨＣ ＩＩ分子のペプチド結合ドメインは、ヒトα１ドメインおよびβ１ドメインを含んでもよい。ヒトＭＨＣ
ＩＩαポリペプチドの細胞外ドメインは、α１ドメインおよびα２ドメインを含んでもよく、ヒトＭＨＣ ＩＩβポリペプチドの細胞外ドメインは、β１ドメインおよびβ２ドメインを含んでもよい。したがって、キメラＭＨＣ ＩＩ分子の細胞外ドメインは、ヒトα１ドメイン、α２ドメイン、β１ドメイン、およびβ２ドメインを含んでもよい。一つの実施形態では、キメラＭＨＣ ＩＩ分子のマウス部分は、マウスＭＨＣ ＩＩ、例えばマウスＨ－２Ｅの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン（例えば、マウスＨ－２Ｅαおよびβ鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン）を含む。したがって一つの実施形態では、本発明のマウスは、その内因性マウスＭＨＣ ＩＩ座位で、キメラヒト／マウスＭＨＣ
ＩＩαをコードするヌクレオチド配列を含み、この場合において当該キメラＭＨＣ ＩＩαポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ ＩＩのα鎖（例えば、ＨＬＡ－ＤＲ２のα鎖）から誘導された細胞外ドメインを含み、マウス部分は、マウスＭＨＣ ＩＩ（例えば、Ｈ－２Ｅ）のα鎖から誘導された膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。そしてマウスは、その内因性マウスＭＨＣ ＩＩ座位で、キメラヒト／マウスＭＨＣ ＩＩβをコードするヌクレオチド配列を含み、この場合において当該キメラＭＨＣ ＩＩβポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ ＩＩのβ鎖（例えば、ＨＬＡ－ＤＲ２のβ鎖）から誘導された細胞外ドメインを含み、マウス部分は、マウスＭＨＣ ＩＩ（例えば、Ｈ－２Ｅ）のβ鎖から誘導された膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。例えば、この場合において当該マウスは、キメラヒト／マウスのＨＬＡ－ＤＲ２／Ｈ－２Ｅタンパク質を発現する。他の実施形態では、キメラＭＨＣ ＩＩタンパク質のマウス部分は、他のマウスＭＨＣ ＩＩ、例えば、Ｈ－２Ａなどから誘導されてもよく、キメラＭＨＣ ＩＩタンパク質のヒト部分は、他のヒトＭＨＣ ＩＩ、例えば、ＨＬＡ－ＤＱなどから誘導されてもよい。
ＩＩαポリペプチドの細胞外ドメインは、α１ドメインおよびα２ドメインを含んでもよく、ヒトＭＨＣ ＩＩβポリペプチドの細胞外ドメインは、β１ドメインおよびβ２ドメインを含んでもよい。したがって、キメラＭＨＣ ＩＩ分子の細胞外ドメインは、ヒトα１ドメイン、α２ドメイン、β１ドメイン、およびβ２ドメインを含んでもよい。一つの実施形態では、キメラＭＨＣ ＩＩ分子のマウス部分は、マウスＭＨＣ ＩＩ、例えばマウスＨ－２Ｅの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン（例えば、マウスＨ－２Ｅαおよびβ鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン）を含む。したがって一つの実施形態では、本発明のマウスは、その内因性マウスＭＨＣ ＩＩ座位で、キメラヒト／マウスＭＨＣ
ＩＩαをコードするヌクレオチド配列を含み、この場合において当該キメラＭＨＣ ＩＩαポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ ＩＩのα鎖（例えば、ＨＬＡ－ＤＲ２のα鎖）から誘導された細胞外ドメインを含み、マウス部分は、マウスＭＨＣ ＩＩ（例えば、Ｈ－２Ｅ）のα鎖から誘導された膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。そしてマウスは、その内因性マウスＭＨＣ ＩＩ座位で、キメラヒト／マウスＭＨＣ ＩＩβをコードするヌクレオチド配列を含み、この場合において当該キメラＭＨＣ ＩＩβポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ ＩＩのβ鎖（例えば、ＨＬＡ－ＤＲ２のβ鎖）から誘導された細胞外ドメインを含み、マウス部分は、マウスＭＨＣ ＩＩ（例えば、Ｈ－２Ｅ）のβ鎖から誘導された膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。例えば、この場合において当該マウスは、キメラヒト／マウスのＨＬＡ－ＤＲ２／Ｈ－２Ｅタンパク質を発現する。他の実施形態では、キメラＭＨＣ ＩＩタンパク質のマウス部分は、他のマウスＭＨＣ ＩＩ、例えば、Ｈ－２Ａなどから誘導されてもよく、キメラＭＨＣ ＩＩタンパク質のヒト部分は、他のヒトＭＨＣ ＩＩ、例えば、ＨＬＡ－ＤＱなどから誘導されてもよい。
【0074】
一部の実施形態では、キメラヒト／非ヒトポリペプチドは、ヒトまたは非ヒトのリーダー（シグナル）配列を含むものであってもよい。一つの実施形態では、キメラＭＨＣ Ｉポリペプチドは、内因性ＭＨＣ Ｉポリペプチドの非ヒトリーダー配列を含む。一つの実施形態では、キメラＭＨＣ ＩＩαポリペプチドは、内因性ＭＨＣ ＩＩαポリペプチドの非ヒトリーダー配列を含む。一つの実施形態では、キメラＭＨＣ ＩＩβポリペプチドは、内因性ＭＨＣ ＩＩβポリペプチドの非ヒトリーダー配列を含む。別の実施形態では、キメラＭＨＣ Ｉポリペプチド、ＭＨＣ ＩＩαポリペプチド、および／またはＭＨＣ
ＩＩβポリペプチドは、それぞれ、別の非ヒト動物、例えば別のげっ歯類または別のマウス系統由来のＭＨＣ Ｉポリペプチド、ＭＨＣ ＩＩαポリペプチド、および／またはＭＨＣ ＩＩβポリペプチドの非ヒトリーダー配列を含む。したがって、キメラＭＨＣ Ｉポリペプチド、ＭＨＣ ＩＩαポリペプチド、および／またはＭＨＣ ＩＩβポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ非ヒトＭＨＣ Ｉリーダー配列、ＭＨＣ
ＩＩαリーダー配列、および／またはＭＨＣ ＩＩβリーダー配列をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結されてもよい。さらに別の実施形態では、キメラＭＨＣ Ｉポリペプチド、ＭＨＣ ＩＩαポリペプチド、および／またはＭＨＣ ＩＩβポリペプチドは、それぞれ、ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチド、ヒトＭＨＣＩＩαポリペプチド、および／またはヒトＭＨＣ ＩＩβポリペプチドのヒトリーダー配列を含む（例えば、それぞれ、ヒトＨＬＡ－Ａ２、ヒトＨＬＡ－ＤＲα、および／またはヒトＨＬＡ－ＤＲβ１＊１５０１のリーダー配列）。
ＩＩβポリペプチドは、それぞれ、別の非ヒト動物、例えば別のげっ歯類または別のマウス系統由来のＭＨＣ Ｉポリペプチド、ＭＨＣ ＩＩαポリペプチド、および／またはＭＨＣ ＩＩβポリペプチドの非ヒトリーダー配列を含む。したがって、キメラＭＨＣ Ｉポリペプチド、ＭＨＣ ＩＩαポリペプチド、および／またはＭＨＣ ＩＩβポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ非ヒトＭＨＣ Ｉリーダー配列、ＭＨＣ
ＩＩαリーダー配列、および／またはＭＨＣ ＩＩβリーダー配列をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結されてもよい。さらに別の実施形態では、キメラＭＨＣ Ｉポリペプチド、ＭＨＣ ＩＩαポリペプチド、および／またはＭＨＣ ＩＩβポリペプチドは、それぞれ、ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチド、ヒトＭＨＣＩＩαポリペプチド、および／またはヒトＭＨＣ ＩＩβポリペプチドのヒトリーダー配列を含む（例えば、それぞれ、ヒトＨＬＡ－Ａ２、ヒトＨＬＡ－ＤＲα、および／またはヒトＨＬＡ－ＤＲβ１＊１５０１のリーダー配列）。
【0075】
一部の実施形態では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチド、ＭＨＣ ＩＩαポリペプチド、および／またはＭＨＣ ＩＩβポリペプチドは、そのヒト部分に、それぞれ、ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチド、ヒトＭＨＣ ＩＩαポリペプチド、および／またはヒトＭＨＣ ＩＩβポリペプチドの完全な、または実質的に完全な細胞外ドメインを含んでもよい。したがって、ヒト部分は、ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチド、ヒトＭＨＣ ＩＩαポリペプチド、および／またはヒトＭＨＣ ＩＩβポリペプチド（例えば、ヒトＨＬＡ－Ａ２、ヒトＨＬＡ－ＤＲα、および／またはヒトＨＬＡ－ＤＲβ１＊１５０１）の細胞外ドメインをコードするアミノ酸の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、例えば９５％以上を含んでもよい。一つの例では、ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチド、ヒトＭＨＣ ＩＩαポリペプチド、および／またはヒトＭＨＣ ＩＩβポリペプチドの実質的に完全な細胞外ドメインは、ヒトリーダー配列を欠く。別の例では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチド、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ ＩＩαポリペプチド、および／またはキメラヒト／非ヒトＭＨＣ ＩＩβポリペプチドは、ヒトリーダー配列を含む。
【0076】
さらに、一部の実施形態では、キメラＭＨＣ Ｉポリペプチド、ＭＨＣ ＩＩαポリペプチド、および／またはＭＨＣ ＩＩβポリペプチドは、それぞれ、例えば、マウスのＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩα、および／またはＭＨＣ ＩＩβの制御エレメントなどの内因性非ヒトプロモーターおよび制御エレメントに動作可能に連結されてもよい（制御下で発現されてもよい）。そうした配置によって、例えば非ヒト動物における免疫反応中の当該非ヒト動物におけるキメラＭＨＣ Ｉポリペプチド、および／またはキメラＭＨＣ ＩＩポリペプチドの適切な発現が促進される。
【0077】
本明細書に提供される実施例は、内因性ＭＨＣ座位から発現されたキメラヒト／非ヒトＭＨＣ分子のヒトペプチド結合ドメインに対する寛容を示すが、そうした寛容は、異所性座位からヒトＭＨＣ分子（またはその機能性ペプチド結合ドメイン）を発現する非ヒト動物でも発生する（データは示さず）。さらに、異所性座位から空のヒトＭＨＣ分子（またはその空のペプチド結合ドメイン）を発現し、これに対して寛容化された非ヒト動物は、当該非ヒト動物が、例えば当該非ヒト動物に対して異種であるペプチドなどの抗原性ペプチドと複合体化されたヒトＨＬＡ分子（またはそのペプチド結合ドメイン、および／またはその誘導体）で免疫化されたとき、発現されるヒトＭＨＣ分子が誘導されるヒトＨＬＡ分子（またはそのペプチド結合ドメイン、またはその誘導体）に対して特異的免疫反応を生じさせることができる。
【0078】
理論に束縛されることは望まないが、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子の発現の際に、当該非ヒト動物の寛容が発生すると考えられる。そのため、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子は、必ずしも内因性座位から発現される必要はない。したがって、本明細書の様々な実施形態では、自身のゲノム中に、ヒト（ヒト化）ＭＨＣ Ｉポリペプチド（またはその一部および／もしくは誘導体）をコードする第一のヌクレオチド配列、ヒト（ヒト化）ＭＨＣ ＩＩαポリペプチド（またはその一部および／もしくは誘導体）をコードする第二のヌクレオチド配列、および／またはヒト（ヒト化）ＭＨＣ ＩＩβポリペプチド（またはその一部および／もしくは誘導体）をコードする第三のヌクレオチド配列、を含む遺伝子改変非ヒト動物が提供され、この場合において当該非ヒト動物は、ヒト（ヒト化）ＭＨＣ Ｉポリペプチド、ＭＨＣ ＩＩ αポリペプチド、および／またはＭＨＣ ＩＩ βポリペプチド（またはその一部および／もしくは誘導体）を発現し、当該ヒト（ヒト化）ポリペプチドまたはその一部および／もしくは誘導体に対して寛容である。一つの実施形態では、第一、第二、および／または第三のヌクレオチド配列はそれぞれ、内因性の非ヒトＭＨＣ
Ｉ座位、ＭＨＣ ＩＩα座位およびＭＨＣ ＩＩβ座位を破壊しない。例えば、それらは例えばＲＯＳＡ２６座位などの異所性座位に位置する。一部の実施形態では、遺伝子改変マウスは、例えばＲＯＳＡ２６座位などの異所性座位で、キメラヒト／マウスＭＨＣ Ｉをコードするヌクレオチド配列を含み、この場合において当該キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＨＬＡ－Ａ２（例えば、ＨＬＡ－Ａ２．１）ポリペプチドの細胞外ドメインを含み、ならびにマウス部分は、マウスＨ－２Ｋ（例えば、Ｈ－２Ｋｂ）ポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み（例えば、配列番号２４を参照のこと）、そしてマウスはキメラヒト／マウスのＨＬＡ－Ａ２／Ｈ－２Ｋタンパク質を発現し、これに対して寛容である。
Ｉ座位、ＭＨＣ ＩＩα座位およびＭＨＣ ＩＩβ座位を破壊しない。例えば、それらは例えばＲＯＳＡ２６座位などの異所性座位に位置する。一部の実施形態では、遺伝子改変マウスは、例えばＲＯＳＡ２６座位などの異所性座位で、キメラヒト／マウスＭＨＣ Ｉをコードするヌクレオチド配列を含み、この場合において当該キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＨＬＡ－Ａ２（例えば、ＨＬＡ－Ａ２．１）ポリペプチドの細胞外ドメインを含み、ならびにマウス部分は、マウスＨ－２Ｋ（例えば、Ｈ－２Ｋｂ）ポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み（例えば、配列番号２４を参照のこと）、そしてマウスはキメラヒト／マウスのＨＬＡ－Ａ２／Ｈ－２Ｋタンパク質を発現し、これに対して寛容である。
【0079】
さらに、異所性座位からである場合、完全ヒトＭＨＣ分子、もしくは完全ヒト部分、および／またはその誘導体が発現されてもよい。したがって、本明細書の様々な実施形態では、自身のゲノム中に、完全ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチド（またはその完全ヒトの部分および／もしくは誘導体）をコードする第一のヌクレオチド配列、完全ヒトＭＨＣ ＩＩαポリペプチド（またはその完全ヒトの部分および／もしくは誘導体）をコードする第二のヌクレオチド配列、および／または完全ヒトＭＨＣ ＩＩβポリペプチド（またはその完全ヒトの部分および／もしくは誘導体）をコードする第三のヌクレオチド配列、を含む遺伝子改変非ヒト動物が提供され、この場合において当該非ヒト動物は、完全ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチド、ＭＨＣ ＩＩ αポリペプチド、および／またはＭＨＣ ＩＩ βポリペプチド（またはその完全ヒトの部分および／もしくは誘導体）を発現し、当該ポリペプチドまたはその完全ヒトの部分および／もしくは誘導体に対して寛容である。一つの実施形態では、第一、第二、および／または第三のヌクレオチド配列はそれぞれ、内因性の非ヒトＭＨＣ Ｉ座位、ＭＨＣ ＩＩα座位およびＭＨＣ ＩＩβ座位を破壊せず、任意で、いずれの内因性座位も破壊せず、例えばＲＯＳＡ２６座位などの異所性座位に位置する。
【0080】
一部の実施形態では、例えばＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される機能性ヒトＨＬＡ分子をコードするヌクレオチド配列の一部をコードするか、またはそれを含む核酸によってヒトまたはヒト化ＭＨＣ Ｉポリペプチドがコードされるなど、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ Ｉポリペプチドは、それらから誘導されてもよい。ヒトまたはヒト化ＭＨＣ ＩＩのαポリペプチドまたはβポリペプチドは、ＨＬＡ－ＤＰ座位、ＨＬＡ－ＤＱ座位、およびＨＬＡ－ＤＲ座位のいずれかによりコードされる機能性ヒトＨＬＡ分子のαポリペプチドまたはβポリペプチドから誘導されてもよい。普遍的に使用されるＨＬＡ抗原およびアレルのリストは、Ｓｈａｎｋａｒｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．（（２００４）Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４（２）：９１－１０３）に記載されており、当該文献は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。Ｓｈａｎｋａｒｋｕｍａｒらは、当分野で使用されるＨＬＡの用語体系に関する簡単な説明も提示している。ＨＬＡの用語体系および様々なＨＬＡアレルに関する追加情報は、Ｈｏｌｄｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｔｈｅ ＨＬＡ ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ２００８：ａ ｓｕｍｍａｒｙ ｏｆ ＨＬＡ－Ａ，－Ｂ，－Ｃ，－ＤＲＢ１／３／４／５，ａｎｄ ＤＱＢ１ ａｌｌｅｌｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ＨＬＡ－Ａ，－Ｂ，－Ｃ，－ＤＲ，ａｎｄ －ＤＱ ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ７３：９５－１７０に見出すことができ、およびＭａｒｓｈら（２０１０）Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＨＬＡ ｓｙｓｔｅｍ，２０１０，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ７５：２９１－４５５によって近年にアップデートされている。それら公表文献は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ＭＨＣ ＩポリペプチドまたはＭＨＣ ＩＩポリペプチドは、任意の機能性のヒトＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤＲ、またはＤＱ分子から誘導されてもよい。したがって、ヒトもしくヒト化されたＭＨＣ Ｉポリペプチドおよび／またはＭＨＣ ＩＩポリペプチドは、例示的な実施形態において、任意の機能性ヒトＨＬＡ分子から誘導されてもよい。一部の実施形態では、細胞表面上で発現されるすべてのＭＨＣ ＩポリペプチドおよびＭＨＣ ＩＩポリペプチドは、ヒトＨＬＡ分子から誘導された部分を含む。
【0081】
特に興味深いのは、多型ヒトＨＬＡアレルであり、例えばヒトの自己免疫性疾患など、多くのヒト疾患と関連することが知られている。実際に、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、グレーブス病、全身性紅斑性狼瘡、セリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、および他の自己免疫性障害の発症と相関するＨＬＡ座位中の特有の多型が同定されている。例えば、Ｗｏｎｇ ａｎｄ Ｗｅｎ（２００４）Ｗｈａｔ ｃａｎ ｔｈｅ ＨＬＡ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｔｅｌｌ ｕｓ
ａｂｏｕｔ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉａｂｅｔｅｓ？，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ
４７：１４７６－８７；Ｔａｎｅｊａ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ（１９９８）ＨＬＡ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ ａｓ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：９２１－２６；Ｂａｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ａ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ＨＬＡ ａｎｄ ＳＮＰ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｍａｐ ｆｏｒ ｄｉｓｅａｓｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｔｅｎｄｅｄ
ｈｕｍａｎ ＭＨＣ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３８：１１６６－７２、および捕捉情報；ならびにＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＭＨＣ ａｎｄ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ（２００９）Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ＭＨＣ ｒｅｇｉｏｎ ｆｏｒ ７ ｉｍｍｕｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６：１８６８０－８５を参照のこと。それら各公表文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。したがって、一部の実施形態では、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ Ｉポリペプチドおよび／またはＭＨＣ ＩＩポリペプチドは、例えば自己免疫性疾患などの特定の疾患と関連していることが公知のヒトＨＬＡ分子から誘導されてもよい。
ａｂｏｕｔ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉａｂｅｔｅｓ？，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ
４７：１４７６－８７；Ｔａｎｅｊａ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ（１９９８）ＨＬＡ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ ａｓ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：９２１－２６；Ｂａｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ａ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ＨＬＡ ａｎｄ ＳＮＰ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｍａｐ ｆｏｒ ｄｉｓｅａｓｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｔｅｎｄｅｄ
ｈｕｍａｎ ＭＨＣ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３８：１１６６－７２、および捕捉情報；ならびにＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＭＨＣ ａｎｄ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ（２００９）Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ＭＨＣ ｒｅｇｉｏｎ ｆｏｒ ７ ｉｍｍｕｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６：１８６８０－８５を参照のこと。それら各公表文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。したがって、一部の実施形態では、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ Ｉポリペプチドおよび／またはＭＨＣ ＩＩポリペプチドは、例えば自己免疫性疾患などの特定の疾患と関連していることが公知のヒトＨＬＡ分子から誘導されてもよい。
【0082】
一つの個別の実施形態では、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ Ｉポリペプチドは、ヒトＨＬＡ－Ａから誘導される。個別の実施形態では、ＨＬＡ－Ａポリペプチドは、ＨＬＡ－Ａ２ポリペプチド（例えば、ＨＬＡ－Ａ２．１ポリペプチド）である。一つの実施形態では、ＨＬＡ－Ａポリペプチドは、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１アレル、例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１：０１アレルによりコードされるポリペプチドである。ＨＬＡ－Ａ＊０２０１アレルは、北米の集団の間で広く使用されている。本実施例は、この特定のＨＬＡ配列について記載しているが、任意の適切なＨＬＡ－Ａ配列も本明細書に包含される。例えば、ヒト集団で示されるＨＬＡ－Ａ２の多型バリアント、一つもしくは複数の保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換を有する配列、遺伝子コードの縮重に起因して本明細書の例示的実施形態の配列とは異なるヌクレオチド配列などが包含される。
【0083】
別の個別の実施形態では、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ Ｉポリペプチドは、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃから選択されるヒトＭＨＣ Ｉから誘導される。一つの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ、例えば、ＨＬＡ－Ｂ２７から誘導される。別の実施形態では、ＨＬＡ－Ａ３、ＨＬＡ－Ｂ７、ＨＬＡ－Ｃｗ６から誘導される。
【0084】
一つの個別の実施形態では、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ ＩＩαポリペプチド、およびβポリペプチドは、ヒトＨＬＡ－ＤＲ、例えば、ＨＬＡ－ＤＲ２から誘導される。典型的には、ＨＬＡ－ＤＲα鎖は、単型である。例えば、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質のα鎖は、ＨＬＡ－ＤＲＡ遺伝子（例えば、ＨＬＡ－ＤＲα＊０１遺伝子）によりコードされる。他方で、ＨＬＡ－ＤＲβ鎖は、多型である。したがって、ＨＬＡ－ＤＲ２は、ＨＬＡ－ＤＲＡ遺伝子によりコードされるβ鎖、およびＨＬＡ－ＤＲ１β＊１５０１遺伝子によりコードされるβ鎖を含む。任意の適切なＨＬＡ－ＤＲ配列が本明細書に包含され、例えば、ヒト集団で示される多型バリアント、一つもしくは複数の保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換を有する配列が包含される。
【0085】
一部の実施形態では、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ ＩＩαポリペプチド、および／またはβポリペプチドは、普遍的なヒト疾患と関連することが知られているＨＬＡアレルのヌクレオチド配列、またはその一部によりコードされてもよい。そうしたＨＬＡアレルとしては限定されないが、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１、－ＤＲＢ１＊０３０１、－ＤＱＡ１＊０５０１、－ＤＱＢ１＊０２０１、ＤＲＢ１＊１５０１、－ＤＲＢ１＊１５０２、－ＤＱＢ１＊０６０２、－ＤＱＡ１＊０１０２、－ＤＱＡ１＊０２０１、－ＤＱＢ１＊０２０２、－ＤＱＡ１＊０５０１およびそれらの組み合わせが挙げられる。ＨＬＡアレル／疾病の関連性の概要については、上記のＢａｋｋｅｒら（２００６）を参照のこと。当該文献は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。
【0086】
さらなる実施形態では、本発明の非ヒト動物、例えば、齧歯類、例えば、ラットまたはマウスは、（例えば、内因性β２マイクログロブリン座位で）、ヒトまたはヒト化β２マイクログロブリンをコードするヌクレオチド配列を含む。ＭＨＣクラスＩタンパク質のβ２マイクログロブリンまたは軽鎖（「β２Ｍ」とも略される）は、小さな（１２ｋＤａ）非グリコシル化タンパク質であり、主にＭＨＣ Ｉα鎖を安定化するよう機能する。ヒトまたはヒト化β２マイクログロブリン動物の作製は、米国特許第９，６１５，５５０号に詳述されており、当該文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。
【0087】
一部の実施形態では、ヒトまたはヒト化β２マイクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ヒトβ２マイクログロブリン遺伝子の一部のみに対応するヌクレオチド残基、例えば、少なくともヒト（ヒト化）ＭＨＣ Ｉ分子の安定化を補助する部分のみに対応するヌクレオチド残基を含有してもよい。一部の実施形態では、ヒトβ２マイクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ヒトβ２マイクログロブリン遺伝子全体を含む。あるいは一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ヒトβ２マイクログロブリンタンパク質のアミノ酸２１～１１９に記載されるアミノ酸配列（すなわち、成熟ヒトβ２マイクログロブリンに対応するアミノ酸残基）をコードするヌクレオチド残基を含んでもよい。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ヒトβ２マイクログロブリンタンパク質のアミノ酸２３～１１５に記載されるアミノ酸配列、例えば、ヒトβ２マイクログロブリンタンパク質のアミノ酸２３～１１９に記載されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド残基を含んでもよい。ヒトβ２マイクログロブリンの核酸配列およびアミノ酸配列は、Ｇｕｓｓｏｗ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｔｈｅ β２－Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅ．Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｔ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３１３１－３８に記載されており、当該文献は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。
【0088】
したがって、一部の実施形態では、ヒトまたはヒト化β２マイクログロブリンポリペプチドは、ヒトβ２マイクログロブリンポリペプチドのアミノ酸２３～１１５に記載されるアミノ酸配列、例えば、ヒトβ２マイクログロブリンポリペプチドのアミノ酸２３～１１９に記載されるアミノ酸配列、例えば、ヒトβ２マイクログロブリンポリペプチドのアミノ酸２１～１１９に記載されるアミノ酸配列を含んでもよい。あるいは、ヒトβ２マイクログロブリンは、ヒトβ２マイクログロブリンポリペプチドのアミノ酸１～１１９を含んでもよい。
【0089】
一部の実施形態では、ヒトまたはヒト化β２マイクログロブリンをコードするヌクレオチド配列は、ヒトβ２マイクログロブリン遺伝子のエクソン２～エクソン４に記載されるヌクレオチド配列を含む。あるいは、ヌクレオチド配列は、ヒトβ２マイクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４に記載されるヌクレオチド配列を含む。この実施形態において、エクソン２、３、および４に記載されるヌクレオチド配列は、遺伝子の正常な転写および翻訳を可能にするように動作可能に連結される。したがって、一つの実施形態では、ヒト配列は、ヒトβ２マイクログロブリン遺伝子のエクソン２～エクソン４に対応するヌクレオチド配列を含む。個別の実施形態では、ヒト配列は、ヒトβ２マイクログロブリン遺伝子のエクソン２～エクソン４後の約２６７ｂｐに対応するヌクレオチド配列を含む。個別の実施形態では、ヒト配列は、約２．８ｋｂのヒトβ２マイクログロブリン遺伝子を含む。
【0090】
したがって、一部の実施形態では、ヒトまたはヒト化β２マイクログロブリンポリペプチドは、ヒトβ２マイクログロブリンのエクソン２～エクソン４に記載されるヌクレオチド配列、例えばヒトβ２マイクログロブリン遺伝子のエクソン２～エクソン４に対応するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によりコードされてもよい。あるいは、一部の実施形態では、ポリペプチドは、ヒトβ２マイクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４に記載されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によりコードされてもよい。個別の実施形態では、ヒトまたはヒト化β２マイクログロブリンポリペプチドは、ヒトβ２マイクログロブリン遺伝子のエクソン２～エクソン４後の約２６７ｂｐに対応するヌクレオチド配列によりコードされる。別の特定の実施形態では、ヒトまたはヒト化ポリペプチドは、約２．８ｋｂのヒトβ２マイクログロブリン遺伝子を含むヌクレオチド配列によりコードされる。β２マイクログロブリン遺伝子のエクソン４が、５’非翻訳領域を含有する場合、ヒトまたはヒト化ポリペプチドは、β２マイクログロブリン遺伝子のエクソン２および３を含むヌクレオチド配列によりコードされてもよい。
【0091】
さらに一部の実施形態では、ヒトまたはヒト化β２マイクログロブリンをコードするヌクレオチド配列を含む非ヒト動物は、非ヒトβ２マイクログロブリン遺伝子のエクソン１に記載されるヌクレオチド配列も含む。したがって、個別の実施形態では、非ヒト動物は、そのゲノム中に、ヒトまたはヒト化β２マイクログロブリンをコードするヌクレオチド配列を含み、この場合において当該ヌクレオチド配列は、非ヒトβ２マイクログロブリンのエクソン１、ならびにヒトβ２マイクログロブリン遺伝子のエクソン２、３および４を含む。したがって、ヒトまたはヒト化β２マイクログロブリンポリペプチドは、非ヒトβ２マイクログロブリン遺伝子のエクソン１、ならびにヒトβ２マイクログロブリン遺伝子のエクソン２、３および４（例えば、ヒトβ２マイクログロブリン遺伝子のエクソン２および３）によりコードされる。
【0092】
一部の実施形態では、ヒトまたはヒト化β２マイクログロブリンをコードするヌクレオチド配列は、内因性非ヒト動物β２マイクログロブリン座位にある。一部の実施形態では、ヒトβ２マイクログロブリンのヌクレオチド配列は、内因性非ヒト動物β２マイクログロブリン座位で、内因性非ヒトβ２マイクログロブリンをコードする対応ヌクレオチド配列を置換する。たとえば一部の実施形態では、ヒトβ２マイクログロブリン遺伝子のエクソン２～エクソン４に対応するヌクレオチド配列は、マウスβ２マイクログロブリン遺伝子のエクソン２～エクソン４に対応する内因性マウス配列を、内因性マウスβ２マイクログロブリン座位で、置換する（図１Ｃを参照）。一部の実施形態では、ヒトβ２マイクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４に記載されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列は、マウスβ２マイクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４に記載されるヌクレオチド配列を置換する。
【0093】
一部の実施形態では、ヒトまたはヒト化β２マイクログロブリンをコードするヌクレオチド配列は、内因性非ヒト動物β２マイクログロブリン座位を破壊せず、例えば、ＲＯＳＡ２６座位などの異所性座位に位置する。
【0094】
一部の実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、自身のゲノム中に、例えばＲＯＳＡ２６座位などの異所性座位で、第一のヌクレオチド配列および／または第二のヌクレオチド配列を含み、この場合において当該第一のヌクレオチド配列は、任意でヒトまたはヒト化されたβ２マイクログロブリン（またはその一部）に動作可能に連結、例えば融合された、ＨＬＡクラスＩ分子の機能性ペプチド結合部分（例えば少なくともヒトＭＨＣクラスＩ分子のα１ドメインおよびα２ドメイン）を含む一本鎖ポリペプチドをコードし、およびこの場合において当該第二のヌクレオチド配列は、ＨＬＡクラスＩＩ分子の機能性ペプチド結合部分（例えば、少なくともヒトＭＨＣクラスＩＩ分子のα１ドメインおよびβ１ドメイン）を含む一本鎖ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、例えば異所性座位で、ヒトβ２マイクログロブリンと融合されたヒトＨＬＡ－Ａ２ポリペプチド（例えば全長成熟型ＨＬＡ－Ａ２ポリペプチド）の少なくとも機能性ペプチド結合部分を含む一本鎖ポリペプチドをコードする第一のヌクレオチド配列を含む（例えば、図２を参照のこと）。一部の実施形態では、ヒトβ２マイクログロブリンと融合されたヒトＨＬＡ－Ａ２ポリペプチド（例えば、全長成熟型ＨＬＡ－Ａ２ポリペプチド）の少なくとも機能性ペプチド結合部分を含む一本鎖ポリペプチドは、配列番号１８、配列番号２０、または配列番号２３に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変非ヒト動物は、例えばＲＯＳＡ２６座位などの異所性座位で、ヒト（ヒト化）β２マイクログロブリンと融合されたヒトＨＬＡ－Ａ２分子の少なくとも機能性ペプチド結合部分を含むヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ分子をコードするヌクレオチド配列、例えば配列番号１７、配列番号１９、配列番号２２、またはそれらの縮重バリアントとして記載されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変非ヒト動物は、異所性座位として例えばＲＯＳＡ２６座位で、キメラＭＨＣポリペプチド、例えば配列番号２４として記載されるＨＬＡ－Ａ２／Ｈ２－Ｋポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【0095】
当業者であれば、一部の実施形態において遺伝子操作動物を作製するための特定のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が含まれているが、一つもしくは複数の保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換の配列、または遺伝子コードの縮重に起因して本明細書に記載の実施形態から異なる配列も、本発明の範囲内とみなされることを理解するであろう。
【0096】
したがって、一部の実施形態では、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩαポリペプチドの核酸配列を発現する非ヒト動物が提供されているが、当該ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩαポリペプチドの核酸配列またはその一部は、遺伝子コードの縮重に起因して、ヒトＭＨＣクラスＩαポリペプチドの核酸配列と同一ではなく、しかし少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。個別の実施形態では、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩαポリペプチドの核酸配列は、本明細書に例示される実施形態のヒトＭＨＣクラスＩαポリペプチドの核酸配列に対し、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。一つの実施形態では、発現されたヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩαポリペプチドの配列は、一つまたは複数の保存的置換を含む。一つの実施形態では、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩαポリペプチドの配列は、一つまたは複数の非保存的置換を含む。
【0097】
さらに一部の実施形態では、ヒト（ヒト化）β２マイクログロブリン配列を発現する非ヒト動物が提供されているが、当該ヒト（ヒト化）β２マイクログロブリン配列またはその一部は、遺伝子コードの縮重に起因して、ヒトβ２マイクログロブリン配列と同一ではなく、しかし少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。個別の実施形態では、ヒト（ヒト化）β２マイクログロブリン配列は、本明細書に例示される実施形態のヒトβ２マイクログロブリン配列と、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。一つの実施形態では、ヒト（ヒト化）β２マイクログロブリン配列は、一つまたは複数の保存的置換を含む。一つの実施形態では、ヒト（ヒト化）β２マイクログロブリン配列は、一つまたは複数の非保存的置換を含む。
【0098】
一部の実施形態では、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩＩαポリペプチドの核酸配列を発現する非ヒト動物が提供されているが、当該ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩＩαポリペプチドの核酸配列またはその一部は、遺伝子コードの縮重に起因して、ヒトＭＨＣクラスＩαポリペプチドの核酸配列と同一ではなく、しかし少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。一つの実施形態では、発現されたヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩＩαポリペプチドの配列は、一つまたは複数の保存的置換を含む。一つの実施形態では、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩＩαポリペプチドの配列は、一つまたは複数の非保存的置換を含む。
【0099】
一部の実施形態では、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩＩβポリペプチドの核酸配列を発現する非ヒト動物が提供されているが、当該ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩＩβポリペプチドの核酸配列またはその一部は、遺伝子コードの縮重に起因して、ヒトＭＨＣクラスＩαポリペプチドの核酸配列と同一ではなく、しかし少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。一つの実施形態では、発現されたヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩＩαポリペプチドの配列は、一つまたは複数の保存的置換を含む。一つの実施形態では、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩＩαポリペプチドの配列は、一つまたは複数の非保存的置換を含む。
【0100】
一部の実施形態では、非ヒト動物は、第一、第二、および／または第三のヌクレオチド配列に関してヘテロ接合性であり、各配列は、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ ＩＩαポリペプチド、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ ＩＩβポリペプチド、およびヒトもしくはヒト化ＭＨＣ Ｉαポリペプチド、またはそれらの一部からなる群から選択される異なるヒトまたはヒト化ＭＨＣポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、非ヒト動物は、第一、第二、および／または第三のヌクレオチド配列に関してホモ接合性であり、各配列は、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ ＩＩαポリペプチド、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ ＩＩβポリペプチド、およびヒトもしくはヒト化ＭＨＣ Ｉαポリペプチド、またはそれらの一部からなる群から選択される異なるヒトまたはヒト化ＭＨＣポリペプチドをコードする。
【0101】
ヒトまたはヒト化Ｂ細胞の免疫反応
一部の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、各配列が、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ ＩＩαポリペプチド、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ ＩＩβポリペプチド、およびヒトもしくはヒト化ＭＨＣ Ｉαポリペプチド、またはそれらの一部からなる群から選択される異なるヒトまたはヒト化ＭＨＣポリペプチドをコードする第一、第二および／または第三のヌクレオチド配列を含むことに加え、例えばヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖の座位も含み、それにより当該非ヒト動物は、例えばヒトまたはヒト化可変ドメインなどのヒトまたはヒト化抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗原結合タンパク質を提供する能力を有する。
一部の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、各配列が、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ ＩＩαポリペプチド、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ ＩＩβポリペプチド、およびヒトもしくはヒト化ＭＨＣ Ｉαポリペプチド、またはそれらの一部からなる群から選択される異なるヒトまたはヒト化ＭＨＣポリペプチドをコードする第一、第二および／または第三のヌクレオチド配列を含むことに加え、例えばヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖の座位も含み、それにより当該非ヒト動物は、例えばヒトまたはヒト化可変ドメインなどのヒトまたはヒト化抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗原結合タンパク質を提供する能力を有する。
【0102】
ヒト可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン座位は、当分野で公知であり、例えば、米国特許第５，６３３，４２５号、第５，７７０，４２９号、第５，８１４，３１８号、第６，０７５，１８１号、第６，１１４，５９８号、第６，１５０，５８４号、第６，９９８，５１４号、第７，７９５，４９４号、第７，９１０，７９８号、第８，２３２，４４９号、第８，５０２，０１８号、第８，６９７，９４０号、第８，７０３，４８５号、第８，７５４，２８７号、第８，７９１，３２３号、第８，８０９，０５１号、第８，９０７，１５７号、第９，０３５，１２８号、第９，１４５，５８８号、第９，２０６，２６３号、第９，４４７，１７７号、第９，５５１，１２４号、第９，５８０，４９１号、および第９，４７５，５５９号に見出すことができ、これら各特許は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれ、ならびに米国特許出願公開２０１００１４６６４７、２０１１０１９５４５４、２０１３０１６７２５６、２０１３０２１９５３５、２０１３０３２６６４７、２０１３００９６２８７、および２０１５／０１１３６６８にも見出すことができ、これら特許出願公開は、その全体で参照により本明細書に組み込まれ、ならびにＰＣＴ出願公開ＷＯ２００７１１７４１０、ＷＯ２００８１５１０８１、ＷＯ２００９１５７７７１、ＷＯ２０１００３９９００、ＷＯ２０１１００４１９２、ＷＯ２０１１１２３７０８、およびＷＯ２０１４０９３９０８にも見出すことができ、これらＰＣＴ出願公開は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。
【0103】
一部の実施形態では、本明細書に開示される非ヒト動物は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子をコードするヌクレオチド配列に加えて、外因的に導入される完全ヒト免疫グロブリン導入遺伝子を含み、当該遺伝子は、マウスのＢ細胞前駆体において再構成することができる（Ａｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １：２３１－２３６。その全体で参照により本明細書に組み込まれる）。これらの実施形態では、完全ヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、（無作為に）挿入されてもよく、および内因性免疫グロブリン遺伝子は、ノックアウトされてもよい（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｍｉｃｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ Ｉｇ ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ＹＡＣｓ，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ７：１３－２１；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｍｉｃｅ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｆｏｕｒ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６－８５９；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｆｒｏｍ ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｏ ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ，ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｆｕｌｌｙ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５：１１３４－１１４３。これら各公表文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる）。例えばこの場合において内因性免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖の座位は、例えば各内因性座位の小さいが必須の部分を標的化欠失させ、その後に、無作為統合される巨大導入遺伝子、またはミニ染色体としてヒト免疫グロブリン遺伝子座位を導入することにより不活化される（Ｔｏｍｉｚｕｋａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｄｏｕｂｌｅ ｔｒａｎｓ－ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｉｃ ｍｉｃｅ：ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ
Ｉｇ ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｋａｐｐａ ｌｏｃｉ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌｙ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９７：７２２－７２７。その全体で参照により本明細書に組み込まれる）。
Ｉｇ ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｋａｐｐａ ｌｏｃｉ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌｙ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９７：７２２－７２７。その全体で参照により本明細書に組み込まれる）。
【0104】
一部の実施形態では、ヒトまたはヒト化免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の座位は、それぞれ内因性免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の座位にある。マウスが子孫を残す能力を維持しつつ、マウス生殖細胞系列の免疫グロブリン可変遺伝子座位と、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン可変遺伝子座位を大規模にｉｎ ｓｉｔｕ遺伝子置換する方法は、過去に報告されている。例えば、米国特許第６，５９６，５４１号および第８，６９７，９４０号を参照のこと。これら特許は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。具体的には、マウスの定常領域をそのまま残しながらの、マウス重鎖とκ軽鎖の両方の免疫グロブリン可変遺伝子座位の６メガ塩基と、そのヒトのカウンターパートとの正確な置換が記載されている。結果として、マウス定常領域を維持しながら、生殖細胞系列の免疫グロブリン可変レパートリー全体と、同等のヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン可変配列が正確に置換されたマウスが生成された。ヒト可変領域はマウス定常領域に連結され、生理学的に適切なレベルで再構成および発現するキメラヒト－マウスの免疫グロブリン座位が形成される。発現された抗体は、「逆キメラ」である。すなわち、抗体は、ヒト可変領域配列とマウス定常領域配列を含んでいる。ヒトまたはヒト化された可変領域とマウス定常領域を有する抗体を発現する、免疫グロブリン可変領域がヒト化されたこれらのマウスは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスと呼ばれる。
【0105】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスは、野生型マウスと本質的に識別不可能な完全に機能性の液性免疫系を呈する。これらマウスは、Ｂ細胞発生のすべての段階で正常な細胞集団を呈する。これらマウスは、正常なリンパ器官形態を呈する。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスの抗体配列は、正常なＶ（Ｄ）Ｊ再構成、および正常な体細胞超変異頻度を呈する。これらのマウスにおける抗体群は、正常なクラススイッチ（例えば、正常なアイソタイプのシス－スイッチ）から生じるアイソタイプ分布を反映している。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを免疫化することで、安定的な液性免疫反応が生じ、治療候補物質としての使用に適したヒト免疫グロブリン可変ドメインを有する大規模で多様な抗体レパートリーを生成する。このプラットフォームは、薬学的に許容可能な抗体および他の抗原結合タンパク質の作製を目的とした、天然アフィニティ成熟したヒト免疫グロブリン可変領域配列の豊富な供給源を提供する。また、一つの内因性ＶＨ遺伝子セグメントと、ヒトＶＨ遺伝子セグメントの置換であっても、ヒト化免疫グロブリン可変ドメインを含む免疫反応が生じ得ることも示されている。例えば、Ｔｉｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｃｅｌｌ １６６：１４７１－８４を参照のこと。当該文献は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。マウス免疫グロブリン可変配列と、ヒト免疫グロブリン可変配列を正確に置換することによって、当該ヒト免疫グロブリン可変配列は、逆キメラの様式で内因性非ヒト定常領域遺伝子配列と動作可能に連結され、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスが作製される。
【0106】
逆キメラ様式で改変されたマウスには、内因性免疫グロブリン座位で、内因性定常領域に動作可能に連結されたヒト（ヒト化）可変領域（例えば、（Ｄ）、Ｊ、および一つまたは複数のヒトＶ遺伝子セグメントを含む）を含むように改変されたマウスが含まれ、例えば、
（ａ）内因性重鎖座位で、
（ｉ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変領域であって、当該非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変領域は、複数の非再構成ヒト重鎖可変領域ＶＨ遺伝子セグメント（例えば、すべて機能性のヒト非再構成非ＶＨ遺伝子セグメント）、一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメント、および一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメントを含み、
任意で、当該一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメント、および一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメントは、一つもしくは複数の非再構成ヒト免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメント（例えば、すべて機能性のヒトＤＨ遺伝子セグメント）および／または一つもしくは複数の非再構成ヒト免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメント（例えば、すべて機能性のヒトＪＨ遺伝子セグメント）であり、
（ｉｉ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域であって、当該拘束非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域は、一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメントと動作可能に連結された一つの非再構成ヒト重鎖可変領域ＶＨ遺伝子セグメントから本質的になり、任意で、当該一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメント、および一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメントは、それぞれ、一つもしくは複数の非再構成ヒト免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメント、および／または一つもしくは複数の非再構成ヒト免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメントであり、
（ｉｉｉ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域配列を含む共通重鎖コード配列であって、当該再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域配列は、免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメントと再構成され、免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメントと再構成される、ヒト重鎖可変領域ＶＨ遺伝子セグメントを含み、
任意で、当該免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメント、または免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメントは、それぞれ、ヒト免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメント、および／またはヒト免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメントであり、
（ｉｖ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域であって、当該ヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域は、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード配列に、少なくとも一つの非ヒスチジンコドンとヒスチジンコドンの置換、または少なくとも一つのヒスチジンコドンの挿入を含む、非再構成免疫グロブリン重鎖可変遺伝子配列を含み、
（ｖ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域を含む、重鎖のみの免疫グロブリンコード配列であって、当該内因性重鎖定常領域は、（１）軽鎖と関連するＩｇＭアイソタイプをコードするインタクトな内因性ＩｇＭ遺伝子、および（２）機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く例えばＩｇＧ遺伝子などの非ＩｇＭ遺伝子、を含み、この場合において、当該非ＩｇＭ遺伝子は、軽鎖定常ドメインと共有結合することができるＣＨ１ドメインを欠く非ＩｇＭアイソタイプをコードし、または
（ｖｉ）ハイブリッド免疫グロブリン鎖をコードする非再構成ヒト（ヒト化）ハイブリッド重鎖配列であって、当該非再構成ヒト（ヒト化）ハイブリッド重鎖配列は、内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト軽鎖可変（ＶＬ）遺伝子セグメントおよび非再構成結合（ＪＬ）遺伝子セグメントを含み、
任意で、当該内因性重鎖定常領域は、（１）軽鎖と関連するＩｇＭアイソタイプをコードするインタクトな内因性ＩｇＭ遺伝子、および（２）機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く例えばＩｇＧ遺伝子などの非ＩｇＭ遺伝子、を含み、この場合において、当該非ＩｇＭ遺伝子は、軽鎖定常ドメインと共有結合することができるＣＨ１ドメインを欠く非ＩｇＭアイソタイプをコードし、
および／または
（ｂ）内因性軽鎖座位で、
（ｉ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域であって、当該非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、複数の非再構成ヒト軽鎖可変領域ＶＬ遺伝子セグメント（例えば、すべて機能性のヒト非再構成非ＶＬ遺伝子セグメント）、および一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン軽鎖ＪＬ遺伝子セグメントを含み、
任意で、当該一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン軽鎖ＪＬ遺伝子セグメントは、一つまたは複数の非再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖ＪＬ遺伝子セグメント（例えば、すべて機能性のヒトＪＨＬ遺伝子セグメント）であり、
任意で、当該内因性免疫グロブリン軽鎖座位は、内因性免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）座位であり、当該非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、ヒト可変κ（Ｖκ）遺伝子セグメントおよび結合κ（Ｊκ）遺伝子セグメントを含み、およびこの場合において当該内因性軽鎖定常領域は、内因性κ鎖定常領域配列であり、および／または当該内因性免疫グロブリン軽鎖軽鎖座位は、内因性免疫グロブリン軽鎖ラムダ（λ）であり、当該非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、ヒト可変λ（Ｖλ）遺伝子セグメントおよび結合λ（Ｊλ）遺伝子セグメントを含み、および内因性軽鎖定常領域は、内因性λ鎖定常領域配列であり、任意でこの場合において当該内因性免疫グロブリン軽鎖λ座位は、（ａ）一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメント、（ｂ）一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメント、および（ｃ）一つまたは複数のヒトＣλ遺伝子セグメントを含み、この場合において（ａ）および（ｂ）は、（ｃ）および齧歯類免疫グロブリン軽鎖定常（Ｃλ遺伝子セグメント）に動作可能に連結され、およびこの場合において当該内因性免疫グロブリンλ軽鎖座位はさらに、一つまたは複数のげっ歯類免疫グロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ、および一つまたは複数のヒト免疫グロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）を含み、任意で三つのヒトＥλを含み、
（ｉｉ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域配列を含む共通軽鎖コード配列であって、当該再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域配列は、免疫グロブリン軽鎖ＪＬ遺伝子セグメントと再構成された、ヒト軽鎖可変領域ＶＬ遺伝子セグメントを含み、
（ｉｉｉ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域であって、当該拘束非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域は、一つまたは複数の非再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖結合（ＪＬ）遺伝子セグメントに動作可能に連結された２個以下の非再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変（ＶＬ）遺伝子セグメントを含み、
（ｉｖ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域であって、当該ヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域は、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード配列に、少なくとも一つの非ヒスチジンコドンとヒスチジンコドンの置換、または少なくとも一つのヒスチジンコドンの挿入を含む、非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子配列を含み、または
（ｖ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域であって、当該ヒスチジン改変再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域は、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード配列に、少なくとも一つの非ヒスチジンコドンとヒスチジンコドンの置換、または少なくとも一つのヒスチジンコドンの挿入を含む、再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子配列を含む、を含むように改変されたマウスが過去に報告されており、
任意で、当該マウスはさらに、
（ｉ）機能性ＡＤＡＭ６遺伝子を含むヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖座位を含み、それにより当該マウスは、非ヒト動物の野生型の生殖能力を呈し、および／または
（ｉｉ）抗原受容体の多様性を増すために外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含み、任意でそれにより再構成可変領域遺伝子の少なくとも１０％は、鋳型には無い付加を含む。
例えば、米国特許第８，６９７，９４０号、第８，７５４，２８７号、第９，２０４，６２４号、第９，３３４，３３４号、第９，８０１，３６２号、第９，３３２，７４２号、および第９，５１６，８６８号、米国特許出願公開２０１１０１９５４５４、２０１２００２１４０９、２０１２０１９２３００、２０１３００４５４９２、２０１５０２８９４８９、２０１８０１２５０４３、２０１８０２４４８０４、ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２０１７２１０５８６およびＷＯ２０１１１６３３１４、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２：３５６を参照のこと。それら各公表文献は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる
（ａ）内因性重鎖座位で、
（ｉ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変領域であって、当該非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変領域は、複数の非再構成ヒト重鎖可変領域ＶＨ遺伝子セグメント（例えば、すべて機能性のヒト非再構成非ＶＨ遺伝子セグメント）、一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメント、および一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメントを含み、
任意で、当該一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメント、および一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメントは、一つもしくは複数の非再構成ヒト免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメント（例えば、すべて機能性のヒトＤＨ遺伝子セグメント）および／または一つもしくは複数の非再構成ヒト免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメント（例えば、すべて機能性のヒトＪＨ遺伝子セグメント）であり、
（ｉｉ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域であって、当該拘束非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域は、一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメントと動作可能に連結された一つの非再構成ヒト重鎖可変領域ＶＨ遺伝子セグメントから本質的になり、任意で、当該一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメント、および一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメントは、それぞれ、一つもしくは複数の非再構成ヒト免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメント、および／または一つもしくは複数の非再構成ヒト免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメントであり、
（ｉｉｉ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域配列を含む共通重鎖コード配列であって、当該再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域配列は、免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメントと再構成され、免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメントと再構成される、ヒト重鎖可変領域ＶＨ遺伝子セグメントを含み、
任意で、当該免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメント、または免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメントは、それぞれ、ヒト免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメント、および／またはヒト免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメントであり、
（ｉｖ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域であって、当該ヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域は、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード配列に、少なくとも一つの非ヒスチジンコドンとヒスチジンコドンの置換、または少なくとも一つのヒスチジンコドンの挿入を含む、非再構成免疫グロブリン重鎖可変遺伝子配列を含み、
（ｖ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域を含む、重鎖のみの免疫グロブリンコード配列であって、当該内因性重鎖定常領域は、（１）軽鎖と関連するＩｇＭアイソタイプをコードするインタクトな内因性ＩｇＭ遺伝子、および（２）機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く例えばＩｇＧ遺伝子などの非ＩｇＭ遺伝子、を含み、この場合において、当該非ＩｇＭ遺伝子は、軽鎖定常ドメインと共有結合することができるＣＨ１ドメインを欠く非ＩｇＭアイソタイプをコードし、または
（ｖｉ）ハイブリッド免疫グロブリン鎖をコードする非再構成ヒト（ヒト化）ハイブリッド重鎖配列であって、当該非再構成ヒト（ヒト化）ハイブリッド重鎖配列は、内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト軽鎖可変（ＶＬ）遺伝子セグメントおよび非再構成結合（ＪＬ）遺伝子セグメントを含み、
任意で、当該内因性重鎖定常領域は、（１）軽鎖と関連するＩｇＭアイソタイプをコードするインタクトな内因性ＩｇＭ遺伝子、および（２）機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く例えばＩｇＧ遺伝子などの非ＩｇＭ遺伝子、を含み、この場合において、当該非ＩｇＭ遺伝子は、軽鎖定常ドメインと共有結合することができるＣＨ１ドメインを欠く非ＩｇＭアイソタイプをコードし、
および／または
（ｂ）内因性軽鎖座位で、
（ｉ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域であって、当該非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、複数の非再構成ヒト軽鎖可変領域ＶＬ遺伝子セグメント（例えば、すべて機能性のヒト非再構成非ＶＬ遺伝子セグメント）、および一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン軽鎖ＪＬ遺伝子セグメントを含み、
任意で、当該一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン軽鎖ＪＬ遺伝子セグメントは、一つまたは複数の非再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖ＪＬ遺伝子セグメント（例えば、すべて機能性のヒトＪＨＬ遺伝子セグメント）であり、
任意で、当該内因性免疫グロブリン軽鎖座位は、内因性免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）座位であり、当該非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、ヒト可変κ（Ｖκ）遺伝子セグメントおよび結合κ（Ｊκ）遺伝子セグメントを含み、およびこの場合において当該内因性軽鎖定常領域は、内因性κ鎖定常領域配列であり、および／または当該内因性免疫グロブリン軽鎖軽鎖座位は、内因性免疫グロブリン軽鎖ラムダ（λ）であり、当該非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、ヒト可変λ（Ｖλ）遺伝子セグメントおよび結合λ（Ｊλ）遺伝子セグメントを含み、および内因性軽鎖定常領域は、内因性λ鎖定常領域配列であり、任意でこの場合において当該内因性免疫グロブリン軽鎖λ座位は、（ａ）一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメント、（ｂ）一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメント、および（ｃ）一つまたは複数のヒトＣλ遺伝子セグメントを含み、この場合において（ａ）および（ｂ）は、（ｃ）および齧歯類免疫グロブリン軽鎖定常（Ｃλ遺伝子セグメント）に動作可能に連結され、およびこの場合において当該内因性免疫グロブリンλ軽鎖座位はさらに、一つまたは複数のげっ歯類免疫グロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ、および一つまたは複数のヒト免疫グロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）を含み、任意で三つのヒトＥλを含み、
（ｉｉ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域配列を含む共通軽鎖コード配列であって、当該再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域配列は、免疫グロブリン軽鎖ＪＬ遺伝子セグメントと再構成された、ヒト軽鎖可変領域ＶＬ遺伝子セグメントを含み、
（ｉｉｉ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域であって、当該拘束非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域は、一つまたは複数の非再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖結合（ＪＬ）遺伝子セグメントに動作可能に連結された２個以下の非再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変（ＶＬ）遺伝子セグメントを含み、
（ｉｖ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域であって、当該ヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域は、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード配列に、少なくとも一つの非ヒスチジンコドンとヒスチジンコドンの置換、または少なくとも一つのヒスチジンコドンの挿入を含む、非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子配列を含み、または
（ｖ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域であって、当該ヒスチジン改変再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域は、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード配列に、少なくとも一つの非ヒスチジンコドンとヒスチジンコドンの置換、または少なくとも一つのヒスチジンコドンの挿入を含む、再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子配列を含む、を含むように改変されたマウスが過去に報告されており、
任意で、当該マウスはさらに、
（ｉ）機能性ＡＤＡＭ６遺伝子を含むヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖座位を含み、それにより当該マウスは、非ヒト動物の野生型の生殖能力を呈し、および／または
（ｉｉ）抗原受容体の多様性を増すために外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含み、任意でそれにより再構成可変領域遺伝子の少なくとも１０％は、鋳型には無い付加を含む。
例えば、米国特許第８，６９７，９４０号、第８，７５４，２８７号、第９，２０４，６２４号、第９，３３４，３３４号、第９，８０１，３６２号、第９，３３２，７４２号、および第９，５１６，８６８号、米国特許出願公開２０１１０１９５４５４、２０１２００２１４０９、２０１２０１９２３００、２０１３００４５４９２、２０１５０２８９４８９、２０１８０１２５０４３、２０１８０２４４８０４、ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２０１７２１０５８６およびＷＯ２０１１１６３３１４、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２：３５６を参照のこと。それら各公表文献は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる
【0107】
一部の実施形態では、本発明は、例えば生殖細胞系列ゲノムなどの自身のゲノムが、
ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤＨ遺伝子セグメント、およびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む内因性免疫グロブリン座位であって、当該免疫グロブリン重鎖可変領域は、定常領域に動作可能に連結される座位、および／または
ヒトＶＬ遺伝子セグメント、およびヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む内因性鎖座位であって、当該免疫グロブリン軽鎖可変領域は、定常領域に動作可能に連結される座位、を含む、遺伝子改変非ヒト動物を含む。
ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤＨ遺伝子セグメント、およびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む内因性免疫グロブリン座位であって、当該免疫グロブリン重鎖可変領域は、定常領域に動作可能に連結される座位、および／または
ヒトＶＬ遺伝子セグメント、およびヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む内因性鎖座位であって、当該免疫グロブリン軽鎖可変領域は、定常領域に動作可能に連結される座位、を含む、遺伝子改変非ヒト動物を含む。
【0108】
一部の実施形態では、本発明は、例えば生殖細胞系列ゲノムなどの自身のゲノムが、
ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤＨ遺伝子セグメント、およびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む内因性免疫グロブリン重鎖座位であって、当該免疫グロブリン重鎖可変領域は、定常領域に動作可能に連結される座位、および／または
ヒトＶＬ遺伝子セグメント、およびヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む内因性免疫グロブリン軽鎖座位であって、当該免疫グロブリン軽鎖可変領域は、定常領域に動作可能に連結される座位、を含む、遺伝子改変非ヒト動物を含む。
ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤＨ遺伝子セグメント、およびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む内因性免疫グロブリン重鎖座位であって、当該免疫グロブリン重鎖可変領域は、定常領域に動作可能に連結される座位、および／または
ヒトＶＬ遺伝子セグメント、およびヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む内因性免疫グロブリン軽鎖座位であって、当該免疫グロブリン軽鎖可変領域は、定常領域に動作可能に連結される座位、を含む、遺伝子改変非ヒト動物を含む。
【0109】
一部の実施形態では、例えば齧歯類、例えばラットまたはマウスなどの非ヒト動物は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣをコードするヌクレオチド配列に加えて、自身のゲノム中に、内因性免疫グロブリン重鎖座位で、一つまたは複数の内因性ＶＨ、ＤＨ、およびＪＨセグメントと、一つまたは複数のヒトＶＨ、ＤＨ、およびＪＨセグメントの置換を含み、この場合において当該一つまたは複数のヒトＶＨ、ＤＨ、およびＪＨセグメントは、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子に動作可能に連結されており、および任意で、非再構成または再構成されたヒトＶＬセグメントおよびヒトＪＬセグメントは、例えばマウスもしくはラットなどのげっ歯類などの非ヒト、またはヒトの免疫グロブリン軽鎖定常（ＣＬ）領域遺伝子に、例えば内因性非ヒト軽鎖座位で、動作可能に連結され、それにより当該非ヒト動物は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子に対して寛容であり、例えば抗原性ｐＭＨＣ複合体などの免疫原に反応して逆キメラ抗体を産生する。
【0110】
特定の実施形態では、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子を発現し、これに寛容である遺伝子改変非ヒト動物は、例えば生殖細胞系列ゲノムなどの自身のゲノム中に、一つまたは複数の非再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン可変領域、および免疫グロブリン定常領域遺伝子を含む免疫グロブリン定常領域、を含有する免疫グロブリン座位（外因性または内因性）をさらに含み、および当該座位において、一つまたは複数の非再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、当該免疫グロブリン定常領域遺伝子に動作可能に連結される。一部の実施形態では、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子を発現し、これに寛容である非ヒト動物は、例えば生殖細胞系列ゲノムなどの自身のゲノム中に、複数のそうした免疫グロブリン座位を含む。例えば、一部の実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、例えば生殖細胞系列ゲノムなどの自身のゲノム中に、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子、および一つまたは複数の免疫グロブリン座位（遺伝子改変された再構成または非再構成免疫グロブリン座位を含む）をコードするヌクレオチド配列を含み、それにより当該マウスは、ヒト抗体、ヒト化抗体、部分的ヒト抗体および／または逆キメラ抗体（ヒト可変領域と非ヒト定常領域）を作製する。
【0111】
概して遺伝子改変免疫グロブリン座位は、免疫グロブリン定常領域に動作可能に連結された免疫グロブリン可変領域（免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントを含む）を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変免疫グロブリン座位は、重鎖定常領域遺伝子に動作可能に連結された一つまたは複数のヒト非再構成免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、遺伝子改変免疫グロブリン座位は、重鎖定常領域遺伝子に動作可能に連結された例えばκ遺伝子セグメントなどのヒト非再構成免疫グロブリン軽鎖を含む。例えば、米国特許第９，５１６，８６８号を参照のこと。当該特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、遺伝子改変免疫グロブリン座位は、κ鎖定常領域遺伝子に動作可能に連結されたヒト非再構成免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、遺伝子改変免疫グロブリン座位は、κ鎖定常領域遺伝子に動作可能に連結されたヒト非再構成免疫グロブリン可変領域κ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、遺伝子改変免疫グロブリン座位は、κ鎖定常領域遺伝子に動作可能に連結されたヒト非再構成免疫グロブリン可変領域λ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、遺伝子改変免疫グロブリン座位は、λ鎖定常領域遺伝子に動作可能に連結されたヒト非再構成免疫グロブリン可変領域λ遺伝子セグメントを含む。
【0112】
特定の実施形態では、非ヒト動物は、内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変領域を、内因性重鎖座位で含有し、この場合において免疫グロブリン可変領域は、一つまたは複数の非再構成ヒトＩｇ重鎖可変領域遺伝子セグメントを含有する。一部の実施形態では、一つまたは複数の非再構成ヒトＩｇ可変領域遺伝子セグメントは、少なくとも一つのヒト免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）セグメント、一つまたは複数の免疫グロブリン重鎖多様性（ＤＨ）セグメント（任意で一つまたは複数の非再構成ヒトＤＨセグメント）、および一つまたは複数の免疫グロブリン重鎖結合（ＪＨ）セグメント（任意で一つまたは複数の非再構成ヒトＪＨセグメント）を含む。一部の実施形態では、非再構成ヒトＩｇ可変領域遺伝子セグメントは、複数の非再構成ヒトＶＨセグメント、一つまたは複数の非再構成（ヒト）ＤＨセグメント、および一つまたは複数の非再構成（ヒト）ＪＨセグメントを含む。一部の実施形態では、非再構成ヒトＩｇ可変領域遺伝子セグメントは、少なくとも３個のＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも１８個のＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも２０個のＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも３０個のＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも４０個のＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも５０個のＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも６０個のＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも７０個のＶＨ遺伝子セグメント、または少なくとも８０個のＶＨ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、非再構成ヒトＩｇ遺伝子セグメントは、機能性ヒトＤＨ遺伝子セグメントのすべてを含む。一部の実施形態では、非再構成ヒトＩｇ遺伝子セグメントは、機能性ヒトＪＨ遺伝子セグメントのすべてを含む。Ｉｇ重鎖遺伝子セグメントを含む例示的な可変領域は、例えば、Ｍａｃｄｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１１ ：５１４７－５２および補足情報に提示されており、当該文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。
【0113】
一部の実施形態では、本明細書に提供される非ヒト動物は、内因性重鎖座位で、少なくとも非ヒトＩｇＭ遺伝子を含む、内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域を含み、この場合において当該拘束非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域は、一つのヒトＶＨ遺伝子セグメント、複数のＤＨ遺伝子セグメント（例えば、ヒトＤＨ遺伝子セグメント）、および複数のＪＨ遺伝子セグメント（例えば、ヒトＪＨ遺伝子セグメント）により特徴付けられ、この場合において当該拘束免疫グロブリン重鎖座位は、再構成を行うことができ、および複数の別個の再配列を形成することができ、この場合において各再配列は、一つのヒトＶＨ遺伝子セグメント、ＤＨセグメントのうちの一つ、およびＪＨセグメントのうちの一つから誘導され、およびこの場合において各再配列は、異なる重鎖可変ドメインをコードする（例えば、米国特許出願公開２０１３００９６２８７に記載される。当該出願公開は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、一つのヒトＶＨ遺伝子セグメントはは、ＶＨ１－２またはＶＨ１－６９である。
【0114】
特定の実施形態では、非ヒト動物は、内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域を、内因性軽鎖座位で含有する。一部の実施形態では、非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、非再構成ヒトＩｇ κ可変領域遺伝子セグメントを含有する。一部の実施形態では、非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン可変領域は、複数の非再構成ヒトＶκセグメント、および一つまたは複数の非再構成ヒトＪκセグメントを含む。一部の実施形態では、非再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、ヒトＪκセグメントのすべてを含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、４個の機能性Ｖκセグメント、およびすべてのヒトＪκセグメントを含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、１６個の機能性Ｖκセグメント、およびすべてのヒトＪκセグメント（例えば、すべての機能性ヒトＶκセグメントおよびＪκセグメント）を含む。一部の実施形態では、非再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、ヒトＪκセグメントのすべて、およびすべてのヒトＪκセグメントを含む。Ｉｇκ遺伝子セグメントを含む例示的な可変領域は、例えば、Ｍａｃｄｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １ １１ ：５１４７－５２および補足情報に提示されており、当該文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。
【0115】
一部の実施形態では、内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域は、当該非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域が、２個以下のヒトＶＬ遺伝子セグメント、および複数のＪＬ遺伝子セグメントを含むという点で特徴付けられる（例えば、米国特許第９，７９６，７８８号に記載される、デュアル軽鎖マウス、またはＤＬＣなど。当該特許は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、ＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖκ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、ＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖλ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、Ｖκ遺伝子セグメントは、ＩＧＫＶ３－２０およびＩＧＫＶ１－３９である。一部の実施形態では、非ヒト動物は厳密に、マウスの内因性κ軽鎖座位で、マウス軽鎖定常領域に動作可能に連結された２個の非再構成ヒトＶκ遺伝子セグメントと、５個の非再構成ヒトＪκ遺伝子セグメントを含み、任意でこの場合において当該厳密な２個の非再構成ヒトＶκ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１－３９遺伝子セグメントとヒトＶκ３－２０遺伝子セグメントであり、当該５個の非再構成ヒトＪκ遺伝子セグメントは、ヒトＪκ１遺伝子セグメント、ヒトＪκ２遺伝子セグメント、ヒトＪκ３遺伝子セグメント、ヒトＪκ４遺伝子セグメント、およびヒトＪκ５遺伝子セグメントであり、当該非再構成ヒトカッパ軽鎖遺伝子セグメントは、抗体のヒト可変ドメインを再構成およびコードする能力があり、および任意でさらに、当該非ヒト動物は、免疫グロブリン軽鎖可変領域が形成されるよう再構成する能力を有する内因性Ｖκ遺伝子セグメントを含まない。
【0116】
特定の実施形態では、内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、非再構成ヒトＩｇλ可変領域遺伝子セグメントを含有する。一部の実施形態では、非再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、複数のヒトＶλセグメント、および一つまたは複数のヒトＪλセグメントを含む。一部の実施形態では、非再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、一つまたは複数のヒトＶλセグメント、一つまたは複数のヒトＪλセグメント、および一つまたは複数のヒトＣλ定常領域配列を含む。一部の実施形態では、非再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、ヒトＶλセグメントのすべてを含む。一部の実施形態では、非再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、ヒトＪλセグメントのすべてを含む。Ｉｇλ遺伝子セグメントを含む例示的な可変領域は、例えば、米国特許第９，０３５，１２８号および第６，９９８，５１４号に提供されている。それら各特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、（ａ）一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメント、（ｂ）一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメント、および（ｃ）一つまたは複数のヒトＣλ遺伝子セグメントを含み、この場合において、（ａ）および（ｂ）は、（ｃ）および内因性（例えば齧歯類）Ｃλ遺伝子セグメントに動作可能に連結され、およびこの場合において当該内因性免疫グロブリンλ軽鎖座位はさらに、一つまたは複数のげっ歯類免疫グロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）、および一つまたは複数のヒト免疫グロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）を含み、任意で３個のヒトＥλを含む。
【0117】
特定の実施形態では、内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、内因性（例えば、齧歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子に動作可能に連結された非再構成ヒトＩｇλ可変領域遺伝子セグメントを含み、それにより、当該非ヒト動物は、内因性κ定常ドメインと融合されたＶλおよびＪλ遺伝子セグメントから誘導されたヒトλ可変ドメイン配列を含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。例えば、米国特許第９，２２６，４８４号を参照のこと。当該特許は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。
【0118】
一部の実施形態では、非再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン可変領域は、ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子間配列も含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン可変領域は、非ヒト（例えば、齧歯類、ラット、マウス）Ｉｇ可変領域遺伝子間配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子間配列は、内因性の種起源の遺伝子間配列である。
【0119】
一部の実施形態では、免疫グロブリン可変領域は、再構成された重鎖可変領域（ユニバーサル重鎖可変領域、または共通重鎖コード配列）である。一部の実施形態では、再構成されたＩｇ重鎖可変領域遺伝子は、ヒト再構成Ｉｇ重鎖可変領域遺伝子である。再構成Ｉｇ重鎖可変領域の例は、米国特許公開２０１４０２４５４６８、ならびに米国特許第９，２０４，６２４号および第９，９３０，８７１号に提供されている。それら各特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ユニバーサル重鎖可変領域を含む非ヒト生物体を使用して、二特異性抗体が産生される。一部の実施形態では、非ヒト動物は、内因性免疫グロブリン重鎖座位で、例えば内因性免疫グロブリン定常領域遺伝子配列に動作可能に連結された再構成ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列、例えば内因性重鎖定常領域遺伝子配列に動作可能に連結された再構成ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列などの共通重鎖コード配列を含み、この場合において当該再構成重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ＶＨ３－２３／Ｘ１Ｘ２／ＪＨの配列をコードし、この場合においてＸ１は、任意のアミノ酸であり、およびＸ２は、任意のアミノ酸であり、この場合において当該非ヒト動物は、内因性重鎖定常領域遺伝子配列に連結された再構成ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列、例えばＶＨ３－２３／Ｘ１Ｘ２／ＪＨ 遺伝子から誘導され、および任意でヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと同系である、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現する。
【0120】
一部の実施形態では、免疫グロブリン可変領域は、再構成された軽鎖可変領域（ユニバーサル軽鎖可変領域）である。一部の実施形態では、再構成されたＩｇ軽鎖可変領域遺伝子は、ヒト再構成Ｉｇ軽鎖可変領域遺伝子である。再構成されたＩｇ軽鎖可変領域の例は、例えば、米国特許第９，９６９，８１４号、第１０，１３０，１８１号、および第１０，１４３，１８６号、ならびに米国特許出願公開２０１２００２１４０９、２０１２０１９２３００、２０１３００４５４９２、２０１３０１８５８２１、２０１３０３０２８３６、および２０１５０３１３１９３に提供されている。それら各特許文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ユニバーサル軽鎖可変領域を含む非ヒト生物体（「ユニバーサル軽鎖」生物体）を使用して、二特異性抗体が産生される。一部の実施形態では、共通軽鎖コード配列は、内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された一つの再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖκ／Ｊκ配列を含み、この場合において当該一つの再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖκ／Ｊκ配列は、（ｉ）ヒトＪκ５遺伝子セグメントに融合されたヒトＶκ１－３９遺伝子セグメントを含むヒトＶκ１－３９／Ｊκ５配列、または（ｉｉ）ヒトＪκ１遺伝子セグメントに融合されたヒトＶκ３－２０遺伝子セグメントを含むヒトＶκ３－２０／Ｊκ１配列のいずれかである。
【0121】
一部の実施形態では、免疫グロブリン可変領域は、そうした非ヒト生物体において産生された抗体に、ｐＨ依存性の結合特性を導入するために設計されたヒスチジンコドンの挿入および／または置換を含む、軽鎖および／または重鎖の免疫グロブリン可変領域である。当該実施形態の一部において、ヒスチジンコドンは、ＣＤＲ３をコードする核酸配列に挿入および／または置換される。様々なそうした軽鎖および／または重鎖免疫グロブリン座位が、米国特許第９，３０１，５１０号、第９，３３４，３３４号、および第９，８０１，３６２号、ならびに米国特許出願公開２０１４００１３４５６に提供されている。各特許文献は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域は、ヒトＶκセグメント配列およびヒトＪκセグメント配列を含む一つの再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含み、任意でこの場合において、当該Ｖκセグメント配列は、ヒトＶκ１－３９またはヒトＶκ３－２０遺伝子セグメントから誘導され、およびこの場合において当該一つの再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列は、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１およびそれらの組み合わせ（ＩＭＧＴナンバリングに準拠）からなる群から選択される位置で発現される、Ｖκセグメント配列の少なくとも一つの非ヒスチジンコドンと、ヒスチジンコドンとの置換を含む。一部の実施形態では、内因性重鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域は、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード配列に、少なくとも一つの非ヒスチジンコドンとヒスチジンコドンとの置換、または少なくとも一つのヒスチジンコドンの挿入を含む、非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変遺伝子配列は、非再構成ヒトＶＨ、非再構成ヒトＤＨ、または合成ＤＨ、および非再構成ヒトＪＨ遺伝子セグメントを含み、任意でこの場合において当該非再構成ヒトＤＨ、または合成ＤＨ遺伝子セグメントは、少なくとも一つの非ヒスチジンコドンとヒスチジンコドンとの置換、または少なくとも一つのヒスチジンコドンの挿入を含む。一部の実施形態では、内因性重鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域は、非再構成ＶＬ、および非再構成ＪＬ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、ヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域は、２個以下の非再構成ヒトＶＬ（例えば、２個以下のＶκ遺伝子セグメント）、および一つまたは複数の非再構成ヒトＪＬ（例えば、Ｊκ）遺伝子セグメントを含み、この場合において当該２個以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントの各々は、ＣＤＲ３コード配列中に、少なくとも一つの非ヒスチジンコドンとヒスチジンコドンとの置換、または少なくとも一つのヒスチジンコドンの挿入を含む。一部の実施形態では、当該２個以下の非再構成ヒトＶκ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１－３９およびヒトＶκ３－２０遺伝子セグメントであり、各々、一つまたは複数の非ヒスチジンコドンとヒスチジンコドンとの置換を含み、およびこの場合において当該ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、再構成を行う能力を有し、ならびにヒトＶκおよびヒトＪκ遺伝子セグメントは、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１（ＩＧＭＴナンバリングに準拠）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される位置で、一つまたは複数のヒスチジンを含むヒト軽鎖可変ドメインをコードし、この場合において当該一つまたは複数のヒスチジンは、当該一つまたは複数の置換から誘導される。
【0122】
一部の実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、重鎖定常領域遺伝子を含む。一部の実施形態では、重鎖定常領域は、ヒト重鎖定常領域遺伝子である。一部の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子は、内因性の種起源の重鎖定常領域遺伝子である。一部の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子は、マウス定常領域遺伝子またはラット定常領域遺伝子である。一部の実施形態では、定常領域遺伝子は、ヒトと非ヒトの配列の混合である。例えば、一部の実施形態では、定常領域遺伝子は、ヒトＣＨ１領域、ならびに非ヒト（例えば、内因性の種起源、マウス、ラット）のＣＨ２および／またはＣＨ３領域をコードする。一部の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子は、Ｃμ、Ｃδ、Ｃγ（Ｃγｌ、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４）、ＣαまたはＣεの定常領域遺伝子である。一部の実施形態では、定常領域遺伝子は、内因性定常領域遺伝子である。一部の実施形態では、定常領域遺伝子は、変異ＣＨ１領域をコードし、それによって、非ヒト動物は、重鎖のみの抗体を発現する（例えば、米国特許第８，７５４，２８７号、米国特許出願公開２０１５／０２８９４８９を参照のこと。それら公開文献の各々が、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。例えば、（ユニバーサルまたはデュアル軽鎖の生物体において）二特異性抗体を作製するための重鎖を生成することが目的である一部の実施形態では、重鎖のＦｃドメインは、重鎖のヘテロ二量体形成を促進する、および／または重鎖のホモ二量体形成を阻害する改変を含む。そのような改変は、例えば米国特許第５，７３１，１６８号、第５，８０７，７０６号、第５，８２１，３３３号、第７，６４２，２２８号、および第８，６７９，７８５号、ならびに米国特許出願公開２０１３／０１９５８４９に提供されており、それら特許文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。
【0123】
一部の実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、軽鎖定常領域遺伝子を含む。一部の実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子は、κ定常領域遺伝子である。一部の実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子は、λ定常領域遺伝子である。一部の実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子は、内因性の種起源の軽鎖定常領域遺伝子である。一部の実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子は、マウス定常領域遺伝子またはラット定常領域遺伝子である。一部の実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子は、ヒトと非ヒトの配列の混合である。
【0124】
一部の実施形態では、ヒト可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン可変領域と、当該可変領域遺伝子セグメントが動作可能に連結される免疫グロブリン定常領域遺伝子は、内因性免疫グロブリン座位に位置する。一部の実施形態では、内因性免疫グロブリン座位は、内因性重鎖の座位である。一部の実施形態では、内因性免疫グロブリン座位は、内因性κの座位である。一部の実施形態では、内因性免疫グロブリン座位は、内因性λの座位である。一部の実施形態では、ヒト可変領域遺伝子セグメントが動作可能に連結される定常領域遺伝子は、内因性定常領域遺伝子である。
【0125】
一部の実施形態では、本明細書において提供される非ヒト動物のゲノム中の内因性免疫グロブリン座位のうちの一つまたは複数、または当該一つまたは複数の内因性座位の一部（例えば、可変領域および／または定常領域）は、不活化される。内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座位およびその一部は、限定されないが、生物体のゲノムから座位またはその一部を削除すること、座位またはその一部を異なる核酸配列と置換すること、座位の一部を逆位にさせること、および／または座位の一部を当該非ヒト生物体のゲノム中の別の位置に移動させること、をはじめとする当分野に公知の任意の方法を使用して不活化され得る。一部の実施形態では、座位の不活化は、部分的な不活化のみである。一部の実施形態では、座位の可変領域は不活化されるが、定常領域は機能性を維持する（例えば、非内因性可変領域遺伝子セグメントに動作可能に連結されるため）。
【0126】
一部の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、不活化された内因性免疫グロブリン重鎖座位を含む。一部の実施形態では、内因性免疫グロブリン重鎖座位またはその一部は、当該内因性重鎖座位の内因性可変領域の少なくとも一部が削除、置換、移動および／または逆位されることにより、不活化される。一部の実施形態では、削除、置換、移動および／または逆位される内因性重鎖座位の可変領域の少なくとも一部は、可変領域のＪセグメントを含む。一部の実施形態では、内因性免疫グロブリン重鎖座位またはその一部は、当該内因性重鎖座位の内因性定常領域の少なくとも一部が削除、置換、移動および／または逆位されることにより、不活化される。一部の実施形態では、削除、置換、移動および／または逆位される内因性重鎖座位の定常領域の少なくとも一部は、内因性定常領域のＯμ遺伝子を含む。
【0127】
一部の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、不活化された内因性免疫グロブリンκ鎖座位を含む。一部の実施形態では、内因性免疫グロブリンκ鎖座位またはその一部は、当該内因性κ鎖座位の内因性可変領域の少なくとも一部が削除、置換、移動および／または逆位されることにより、不活化される。一部の実施形態では、削除、置換、移動および／または逆位される内因性κ鎖座位の可変領域の少なくとも一部は、可変領域のＪセグメントを含む。一部の実施形態では、内因性免疫グロブリンκ鎖座位またはその一部は、当該内因性κ鎖座位の内因性定常領域の少なくとも一部が削除、置換、移動および／または逆位されることにより、不活化される。一部の実施形態では、削除、置換、移動および／または逆位される内因性κ鎖座位の定常領域の少なくとも一部は、内因性定常領域のＣκ遺伝子を含む。
【0128】
一部の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、不活化された内因性免疫グロブリンλ鎖座位を含む。一部の実施形態では、内因性免疫グロブリンλ鎖座位またはその一部は、当該内因性λ鎖座位の内因性可変領域の少なくとも一部が削除、置換、移動および／または逆位されることにより、不活化される。一部の実施形態では、内因性λ鎖座位中の少なくとも一つのＶ－Ｊ－Ｃ遺伝子クラスターの少なくとも一部が、削除、置換、移動および／または逆位される。一部の実施形態では、内因性免疫グロブリンλ鎖座位またはその一部は、当該内因性λ鎖座位の内因性定常領域の少なくとも一部が削除、置換、移動および／または逆位されることにより、不活化される。一部の実施形態では、削除、置換、移動および／または逆位される内因性λ鎖座位の定常領域の少なくとも一部は、内因性定常領域のＣ遺伝子を含む。
【0129】
様々な実施形態では、免疫グロブリン座位の改変は、非ヒト動物の生殖能力に影響を与えない。一部の実施形態では、重鎖座位は、機能性の例えば内因性ＡＤＡＭ６ａ遺伝子、ＡＤＡＭ６ｂ遺伝子、またはその両方を含み、遺伝子改変は、当該内因性ＡＤＡＭ６ａ遺伝子、ＡＤＡＭ６ｂ遺伝子、もしくはその両方の発現および／または機能に影響を与えない。一部の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物のゲノムはさらに、異所性に位置づけられた機能性の例えば内因性ＡＤＡＭ６ａ遺伝子、ＡＤＡＭ６ｂ遺伝子、またはその両方を含む。外因性のＡＤＡＭ６ａおよび／またはＡＤＡＭ６ｂを発現する非ヒト動物の例は、米国特許第８，６４２，８３５号および第８，６９７，９４０号に記載されている。それら各文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。
【0130】
一部の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物はさらに、抗原受容体の多様性を増加させるために、外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含有および発現する。外因性ＴｄＴを発現する非ヒト動物の例は、ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２０１７２１０５８６に記載されており、当該公表文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0131】
一部の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子をコードするヌクレオチド配列を含有および発現し、ならびにヒト可変ドメイン（例えば、再構成ヒト可変領域遺伝子セグメントから誘導される（例えばコードされる）ヒト可変ドメイン）を有する抗体を発現するが、空のヒトまたはヒト化ＭＨＣに特異的に結合する抗体は欠く。一部の実施形態では、ヒトまたはヒト化可変ドメインは、ヒトまたはヒト化重鎖可変ドメインである。一部の実施形態では、抗体は、重鎖のみの抗体である。一部の実施形態では、ヒトまたはヒト化可変ドメインは、ヒトまたはヒト化軽鎖可変ドメインである。一部の実施形態では、非ヒト動物により産生される抗体は、ヒトまたはヒト化重鎖可変ドメイン、およびヒトまたはヒト化軽鎖可変ドメインの両方を有する。一部の実施形態では、抗体は、ヒトまたはヒト化重鎖定常ドメインを有する。一部の実施形態では、抗体は、ヒトまたはヒト化軽鎖定常ドメインを有する。一部の実施形態では、重鎖および／または軽鎖の定常ドメインは、非ヒト起源の定常ドメインである。例えば一部の実施形態では、重鎖定常ドメインは、内因性の種起源の重鎖定常ドメインである。一部の実施形態では、重鎖定常ドメインは、マウスまたはラット起源の重鎖定常ドメインである。一部の実施形態では、軽鎖定常ドメインは、内因性の種起源の軽鎖定常ドメインである。一部の実施形態では、軽鎖定常ドメインは、マウスまたはラット起源の軽鎖定常ドメインである。
【0132】
非ヒト動物、組織および細胞
一部の実施形態では、本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、乳牛、雄ウシ、水牛）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）からなる群から選択されてもよい。好適な遺伝子改変可能なＥＳ細胞が直ちに利用可能ではない非ヒト動物については、遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製するために他の方法が採用される。かかる方法としては、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞または誘発された多能性細胞）を改変すること、および核移植を利用して好適な細胞、例えば卵母細胞、に改変されたゲノムを導入すること、および改変された細胞（例えば、改変された卵母細胞）を胚の形成に好適な条件下で非ヒト動物に懐胎させることが挙げられる。
一部の実施形態では、本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、乳牛、雄ウシ、水牛）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）からなる群から選択されてもよい。好適な遺伝子改変可能なＥＳ細胞が直ちに利用可能ではない非ヒト動物については、遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製するために他の方法が採用される。かかる方法としては、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞または誘発された多能性細胞）を改変すること、および核移植を利用して好適な細胞、例えば卵母細胞、に改変されたゲノムを導入すること、および改変された細胞（例えば、改変された卵母細胞）を胚の形成に好適な条件下で非ヒト動物に懐胎させることが挙げられる。
【0133】
一実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物である。一実施形態では、非ヒト動物は、例えばトビネズミ上科またはネズミ上科の小さな哺乳動物である。一実施形態では、遺伝子改変動物は齧歯類である。一実施形態では、齧歯類は、マウス、ラット、およびハムスターから選択される。一実施形態では、齧歯類はネズミ上科から選択される。一実施形態では、遺伝子改変動物は、ヨルマウス科（例えば、マウス様のハムスター）、キヌゲネズミ科（例えば、ハムスター、Ｎｅｗ Ｗｏｒｌｄラット及びマウス、ハタネズミ）、ネズミ科（純種のマウス及びラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ）、アシナガマウス科（キノボリマウス、ロックマウス、オジロラット、マダガスカルラット及びマウス）、トゲヤマネ科（例えば、トゲヤマネ）、及びメクラネズミ科（例えば、メクラネズミ、タケネズミ、及び高原モグラネズミ）から選択された科からのものである。個別の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、純種のマウスまたはラット（ネズミ科）、アレチネズミ、トゲマウス、およびタテガミネズミから選択される。一実施形態では、遺伝子改変マウスはネズミ科のメンバー由来のものである。一実施形態では、非ヒト動物は齧歯類である。個別の実施形態では、齧歯類は、マウス、およびラットから選択される。一実施形態では、非ヒト動物はラットである。一実施形態では、非ヒト動物はマウスである。
【0134】
個別の実施形態では、非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、及びＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系のマウスである齧歯類である。別の実施形態では、マウスは１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２の系統からなる群から選択される１２９系統である（参照、 例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｒｅｖｉｓｅｄ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｓｔｒａｉｎ １２９ ｍｉｃｅ、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １０：８３６、Ａｕｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １２９／ＳｖＥｖ－ ａｎｄ Ｃ５７ＢＬ／６－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓも参照のこと）。ある実施形態では、遺伝子改変マウスは、前述の１２９系統と前述のＣ５７ＢＬ／６系統との混合である。別の個別の実施形態では、マウスは前述の１２９系統の混合、または前述のＢＬ／６系統の混合である。個別の実施形態では、上記混合の１２９系統は１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。別の実施形態では、マウスはＢＡＬＢ系統、例えばＢＡＬＢ／ｃ系統、である。さらに別の実施形態では、マウスはＢＡＬＢ系統と別の前述の系統との混合である。本明細書に提供される非ヒト動物は、前述の系統の任意の組み合わせに由来するマウスであってもよい。
【0135】
ラットＥＳ細胞における標的改変アレルの生殖細胞遺伝は、過去１０年において確立されている。例えば、米国特許出願公開２０１４０２３５９３３および２０１４０３１０８２８；Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ ４６７：２１１－２１５，Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．６（６）：ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１１．３３８。それら各文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。したがって一実施形態では、ラットは、Ｗｉｓｔａｒラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ３４４、Ｆ６、及びＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉから選択される。一実施形態では、ラット系統は、Ｗｉｓｔａｒ、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６、及びＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される二つ以上の系統のミックスである。
【0136】
ゆえに本発明の一つの実施形態では、遺伝子改変マウスが提供され、この場合において当該マウスは、例えば自身の生殖細胞系列ゲノムなど自身のゲノムにおいて、
（ａ）ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列、および
（ｂ）（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位であって、任意で当該（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位のうちの少なくとも一つは、再構成されていない座位、を含み、
当該遺伝子改変非ヒト動物は、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分を発現し、
当該遺伝子改変非ヒト動物は、ヒトもしくはヒト化重鎖可変ドメインおよび／またはヒトもしくはヒト化軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリンを発現し、および
当該非ヒト動物は、当該ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分に対して寛容であり、それにより、（ｉｉ）当該ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子が誘導されるヒトＨＬＡ分子またはその一部、（ｉ）（ｉｉ）と複合体化された当該非ヒト動物に対して異種であるペプチド、を含有する抗原性ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体で免疫化されたときに、特異的Ｂ細胞反応を生じさせる。
（ａ）ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列、および
（ｂ）（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位であって、任意で当該（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位のうちの少なくとも一つは、再構成されていない座位、を含み、
当該遺伝子改変非ヒト動物は、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分を発現し、
当該遺伝子改変非ヒト動物は、ヒトもしくはヒト化重鎖可変ドメインおよび／またはヒトもしくはヒト化軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリンを発現し、および
当該非ヒト動物は、当該ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分に対して寛容であり、それにより、（ｉｉ）当該ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子が誘導されるヒトＨＬＡ分子またはその一部、（ｉ）（ｉｉ）と複合体化された当該非ヒト動物に対して異種であるペプチド、を含有する抗原性ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体で免疫化されたときに、特異的Ｂ細胞反応を生じさせる。
【0137】
一部の実施形態では、マウスは、第一の完全ヒトまたはキメラヒト／マウスＭＨＣポリペプチド（例えばＭＨＣ ＩＩα）をコードする第一のヌクレオチド配列、第二の完全ヒトまたはキメラヒト／マウスＭＨＣポリペプチド（例えば、ＭＨＣ ＩＩβ）をコードする第二のヌクレオチド配列、および／または第三の完全ヒトまたはキメラヒト／マウスＭＨＣポリペプチド（例えば、ＭＨＣ Ｉ）をコードする第三のヌクレオチド配列、および任意でヒトまたはヒト化β２マイクログロブリンをコードするβ２マイクログロブリン座位、を含み、ならびに
（ａ）内因性重鎖座位で、
（ｉ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変領域、
（ｉｉ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域、
（ｉｉｉ）共通重鎖コード配列、
（ｉｖ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域、
（ｖ）重鎖のみの免疫グロブリンコード配列、または
（ｖｉ）ハイブリッド免疫グロブリン鎖をコードする非再構成ヒト（ヒト化）ハイブリッド重鎖配列、を含み、
および／または
（ｂ）内因性軽鎖座位で、
（ｉ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｉｉ）共通軽鎖コード配列、
（ｉｉｉ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域、
（ｉｖ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域、または
（ｖ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域、を含み、
任意で、当該マウスはさらに、
（ｉ）機能性ＡＤＡＭ６遺伝子を含むヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖座位を含み、それにより当該マウスは、野生型の生殖能力を呈し、および／または
（ｉｉ）抗原受容体の多様性を増すために外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含み、任意でそれにより再構成可変領域遺伝子の少なくとも１０％は、鋳型には無い付加を含む。
（ａ）内因性重鎖座位で、
（ｉ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変領域、
（ｉｉ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域、
（ｉｉｉ）共通重鎖コード配列、
（ｉｖ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域、
（ｖ）重鎖のみの免疫グロブリンコード配列、または
（ｖｉ）ハイブリッド免疫グロブリン鎖をコードする非再構成ヒト（ヒト化）ハイブリッド重鎖配列、を含み、
および／または
（ｂ）内因性軽鎖座位で、
（ｉ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｉｉ）共通軽鎖コード配列、
（ｉｉｉ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域、
（ｉｖ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域、または
（ｖ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域、を含み、
任意で、当該マウスはさらに、
（ｉ）機能性ＡＤＡＭ６遺伝子を含むヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖座位を含み、それにより当該マウスは、野生型の生殖能力を呈し、および／または
（ｉｉ）抗原受容体の多様性を増すために外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含み、任意でそれにより再構成可変領域遺伝子の少なくとも１０％は、鋳型には無い付加を含む。
【0138】
遺伝子改変動物（例えばマウスまたはラットなどのげっ歯類）に加えて、組織または細胞も提供され、この場合において当該組織または細胞は、一部の実施形態の非ヒト動物から誘導され、例えば当該組織または細胞は、（ａ）第一の完全ヒトまたはキメラヒト／マウスＭＨＣポリペプチド（例えば、ＭＨＣ ＩＩα）をコードする第一のヌクレオチド配列、第二の完全ヒトまたはキメラヒト／マウスＭＨＣポリペプチド（例えば、ＭＨＣ ＩＩβ）をコードする第二のヌクレオチド配列、および／または第三の完全ヒトまたはキメラヒト／マウスＭＨＣポリペプチド（例えば、ＭＨＣ Ｉ）をコードする第三のヌクレオチド配列、および任意でヒトまたはヒト化β２マイクログロブリンをコードするβ２マイクログロブリン座位、を含み、および（ｂ）当該細胞がＢ細胞ではないとき、（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位、を含み、任意でこの場合において当該（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位のうちの少なくとも一つは、再構成されていない。
【0139】
一部の実施形態では、組織または細胞は、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子、およびヒトもしくはヒト化抗原結合タンパク質、および／または当該ヒトもしくはヒト化抗原結合タンパク質の一つまたは複数の可変ドメインをコードする核酸を発現し、この場合において当該抗原結合タンパク質は、当該組織または細胞が誘導される非ヒト動物に対して抗原性であるｐＭＨＣ複合体に特異的に結合し、例えば当該ｐＭＨＣ複合体は、ヒトＭＨＣ（またはその一部）と複合体化された抗原性ペプチドを含み、そのヒトＭＨＣ（またはその一部）に対して、当該非ヒト動物は概して寛容である。一部の実施形態では、細胞は、Ｂ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、一部の実施形態の非ヒト動物から単離されたＢ細胞と、ミエローマ細胞の融合から誘導されたハイブリドーマまたはクアドローマである。一部の実施形態では、組織は、抗原結合タンパク質、または当該抗原結合タンパク質をコードする核酸配列であり、この場合において当該抗原結合タンパク質は、当該抗原結合タンパク質が誘導される非ヒト動物に対して抗原性であるｐＭＨＣ複合体に特異的に結合し、例えば当該ｐＭＨＣ複合体は、ヒトＭＨＣ（またはその一部）と複合体化された抗原性ペプチドを含み、そのヒトＭＨＣ（またはその一部）に対して、当該非ヒト動物は概して寛容である。
【0140】
遺伝子操作された非ヒト動物に加えて、非ヒト胚（例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラットの胚）も提供され、この場合において当該非ヒト胚は、例示的実施形態の非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット）を作製するために使用され得るドナーＥＳ細胞を含む。一つの実施形態では、非ヒト動物胚は、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ Ｉ（例えば、ＭＨＣ Ｉα）ヌクレオチド配列、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ ＩＩ（例えば、ＭＨＣ ＩＩαおよび／またはＭＨＣ ＩＩβ）ヌクレオチド配列、（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン座位（例えば、重鎖および／または軽鎖可変座位）、および／またはヒトもしくはヒト化β２マイクログロブリン遺伝子配列を含むＥＳドナー細胞、および宿主胚細胞を含む。
【0141】
一部の実施形態では、非ヒト動物（例えば齧歯類、例えば、ラットまたはマウス）の細胞またはゲノムは、非ヒト動物を作製するために使用され得る。例えば、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、生殖細胞などであり、この場合において当該細胞またはゲノムは、
（ａ）ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列、および
（ｂ）（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位であって、任意で当該（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位のうちの少なくとも一つは、再構成されていない座位、を含み、
その結果得られた遺伝子改変非ヒト動物は、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分を発現し、
その結果得られた遺伝子改変非ヒト動物は、ヒトもしくはヒト化重鎖可変ドメインおよび／またはヒトもしくはヒト化軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリンを発現し、およびその結果得られたヒト動物は、当該ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分に対して寛容であり、それにより、（ｉｉ）当該ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子が誘導されるヒトＨＬＡ分子またはその一部、（ｉ）（ｉｉ）と複合体化された当該非ヒト動物に対して異種であるペプチド、を含有する抗原性ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体で免疫化されたときに、特異的Ｂ細胞反応を生じさせる。
（ａ）ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列、および
（ｂ）（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位であって、任意で当該（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位のうちの少なくとも一つは、再構成されていない座位、を含み、
その結果得られた遺伝子改変非ヒト動物は、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分を発現し、
その結果得られた遺伝子改変非ヒト動物は、ヒトもしくはヒト化重鎖可変ドメインおよび／またはヒトもしくはヒト化軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリンを発現し、およびその結果得られたヒト動物は、当該ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分に対して寛容であり、それにより、（ｉｉ）当該ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子が誘導されるヒトＨＬＡ分子またはその一部、（ｉ）（ｉｉ）と複合体化された当該非ヒト動物に対して異種であるペプチド、を含有する抗原性ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体で免疫化されたときに、特異的Ｂ細胞反応を生じさせる。
【0142】
一部の例示的実施形態では、細胞またはゲノムは、第一の完全ヒトまたはキメラヒト／マウスＭＨＣポリペプチド（例えばＭＨＣ ＩＩα）をコードする第一のヌクレオチド配列、第二の完全ヒトまたはキメラヒト／マウスＭＨＣポリペプチド（例えば、ＭＨＣ ＩＩβ）をコードする第二のヌクレオチド配列、および／または第三の完全ヒトまたはキメラヒト／マウスＭＨＣポリペプチド（例えば、ＭＨＣ Ｉ）をコードする第三のヌクレオチド配列、および任意でヒトまたはヒト化β２マイクログロブリンをコードするβ２マイクログロブリン座位、を含み、ならびに
（ａ）内因性重鎖座位で、
（ｉ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変領域、
（ｉｉ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域、
（ｉｉｉ）共通重鎖コード配列、
（ｉｖ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域、
（ｖ）重鎖のみの免疫グロブリンコード配列、または
（ｖｉ）ハイブリッド免疫グロブリン鎖をコードする非再構成ヒト（ヒト化）ハイブリッド重鎖配列、を含み、
および／または
（ｂ）内因性軽鎖座位で、
（ｉ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｉｉ）共通軽鎖コード配列、
（ｉｉｉ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域、
（ｉｖ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域、または
（ｖ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域、を含み、
任意で、当該細胞またはゲノムはさらに、
（ｉ）機能性ＡＤＡＭ６遺伝子を含むヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖座位を含み、それにより当該マウスは、野生型の生殖能力を呈し、および／または
（ｉｉ）抗原受容体の多様性を増すために外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含み、それにより任意で、再構成可変領域遺伝子の少なくとも１０％は、鋳型には無い付加を含む。
（ａ）内因性重鎖座位で、
（ｉ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変領域、
（ｉｉ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域、
（ｉｉｉ）共通重鎖コード配列、
（ｉｖ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域、
（ｖ）重鎖のみの免疫グロブリンコード配列、または
（ｖｉ）ハイブリッド免疫グロブリン鎖をコードする非再構成ヒト（ヒト化）ハイブリッド重鎖配列、を含み、
および／または
（ｂ）内因性軽鎖座位で、
（ｉ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｉｉ）共通軽鎖コード配列、
（ｉｉｉ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域、
（ｉｖ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域、または
（ｖ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域、を含み、
任意で、当該細胞またはゲノムはさらに、
（ｉ）機能性ＡＤＡＭ６遺伝子を含むヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖座位を含み、それにより当該マウスは、野生型の生殖能力を呈し、および／または
（ｉｉ）抗原受容体の多様性を増すために外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含み、それにより任意で、再構成可変領域遺伝子の少なくとも１０％は、鋳型には無い付加を含む。
【0143】
以下の実施例は、自身のゲノムが、マウスＨ－２Ｋタンパク質をコードする核酸配列と、キメラヒト／マウスＨＬＡ－Ａ２／Ｈ－２Ｋをコードする核酸配列の置換を含む遺伝子操作動物を記載しているが、当業者であれば、同様の戦略を使用して、他のヒト（ヒト化）ＭＨＣ Ｉ遺伝子およびＭＨＣ ＩＩ遺伝子（他のＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子およびＨＬＡ－Ｃ遺伝子、ならびに他のＨＬＡ－ＤＲ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰ遺伝子およびＨＬＡ－ＤＱ遺伝子を、例えば内因性座位で、または異所性座位で、例えばＲＯＳＡ２６座位で）導入し得ることを理解するであろう。内因性ＭＨＣ座位で、複数のキメラヒト／非ヒト（例えば、ヒト／齧歯類、例えば、ヒト／マウス）ＭＨＣ Ｉ遺伝子およびＭＨＣ ＩＩ遺伝子を含むような動物も提供される。そうしたキメラＭＨＣ Ｉタンパク質およびＭＨＣ ＩＩタンパク質の例は、米国特許出願公開第２０１３０１１１６１７、２０１３０１８５８１９、２０１３０１８５８２０および２０１４０２４５４６７、ならびに米国特許第８，８４７，００５号に記載されており、各特許が参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。
【0144】
また、本発明の実施形態の非ヒト動物の染色体、またはその断片を含む非ヒト細胞も提供される。一つの実施形態では、非ヒト細胞は、本発明の非ヒト動物の実施形態の核を含む。一つの実施形態では、非ヒト細胞は、核移植の結果としての当該染色体またはその断片を含む。
【0145】
遺伝子改変非ヒト動物の作製
さらに遺伝子操作された非ヒト動物（例えば、遺伝子操作された齧歯類、例えば、マウスまたはラット）を作製する方法も提供される。概して、方法は、非ヒト細胞の例えば生殖細胞系列ゲノムなどのゲノムが、（ａ）第一のキメラヒト／非ヒトＭＨＣポリペプチドをコードする第一の核酸配列、第二のキメラヒト／非ヒトＭＨＣポリペプチドをコードする第二の核酸配列、第三のキメラヒト／非ヒトＭＨＣポリペプチドをコードする第三の核酸配列、および／またはヒトもしくはヒト化β２マイクログロブリンポリペプチドをコードするβ２マイクログロブリン座位、ならびに（ｂ）ヒトまたはヒト化抗体をコードする免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の座位、を含むように改変することを含む。一部の実施形態では、内因性ＭＨＣポリペプチド細胞外ドメイン、β２マイクログロブリンのすべてまたは一部、および免疫グロブリン可変領域、をコードする配列を標的化すること、ならびにそれらと、ヒトＭＨＣ細胞外ドメイン、ヒトβ２マイクログロブリンのすべてまたは一部、およびヒト免疫グロブリン可変領域とをそれぞれ置換させること、を含む。
さらに遺伝子操作された非ヒト動物（例えば、遺伝子操作された齧歯類、例えば、マウスまたはラット）を作製する方法も提供される。概して、方法は、非ヒト細胞の例えば生殖細胞系列ゲノムなどのゲノムが、（ａ）第一のキメラヒト／非ヒトＭＨＣポリペプチドをコードする第一の核酸配列、第二のキメラヒト／非ヒトＭＨＣポリペプチドをコードする第二の核酸配列、第三のキメラヒト／非ヒトＭＨＣポリペプチドをコードする第三の核酸配列、および／またはヒトもしくはヒト化β２マイクログロブリンポリペプチドをコードするβ２マイクログロブリン座位、ならびに（ｂ）ヒトまたはヒト化抗体をコードする免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の座位、を含むように改変することを含む。一部の実施形態では、内因性ＭＨＣポリペプチド細胞外ドメイン、β２マイクログロブリンのすべてまたは一部、および免疫グロブリン可変領域、をコードする配列を標的化すること、ならびにそれらと、ヒトＭＨＣ細胞外ドメイン、ヒトβ２マイクログロブリンのすべてまたは一部、およびヒト免疫グロブリン可変領域とをそれぞれ置換させること、を含む。
【0146】
一部の実施形態では、改変は、例えば育種など、同種の動物との交配を含んでもよい。他の実施形態では、改変は、一つまたは複数のＥＳ細胞における連続相同組み換えを含む。一部の実施形態では、ＥＳ細胞は、望ましい遺伝子改変のうちのすべてのではない一つまたは複数を含むように遺伝子改変された非ヒト動物から誘導され、当該ＥＳ細胞中における相同組み換えが、遺伝子改変を完了させる。他の実施形態では、改変は、例えば、動物と、同種の別（または複数の）動物を交配させるなどの交配と、ＥＳ細胞における相同組み換えの組み合わせを含んでもよく、この場合において当該非ヒト動物のうちの一部またはすべては、１回の相同組み換えを介して遺伝子改変された、または連続相同組み換え事象を介して遺伝子改変されたＥＳ細胞から作製されてもよく、およびこの場合において一部のＥＳ細胞は、本明細書に開示される遺伝子改変のうちの一つまたは複数を含む非ヒト動物から単離されてもよい。一部の実施形態では、改変は、単一ＥＳ細胞における連続相同組み換えを含む。
【0147】
一部の実施形態では、方法は、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用して作製された標的化構築体を利用し、当該構築体をＥＳ細胞に導入し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を使用して標的ＥＳ細胞クローンをマウス胚に導入する（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２５：９１－９９を参照のこと。各文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる）。標的化構築体は、置換される内因性配列を標的とする５’および／または３’相同アーム、（内因性配列を置換する）挿入配列、ならびに一つまたは複数の選択カセットを含んでもよい。選択カセットは、対象の構築体を統合した細胞（例えば、ＥＳ細胞）の選択を促進するために、標的化構築体に挿入されたヌクレオチド配列である。多くの適切な選択カセットが当分野に公知である。通常、選択カセットは、特定の抗生物質（例えば、Ｎｅｏ、Ｈｙｇ、Ｐｕｒ、ＣＭ、ＳＰＥＣなど）の存在下での陽性選択を可能とする。さらに、選択カセットは、組換え部位に隣接してもよく、これはリコンビナーゼ酵素で処理されると選択カセットの欠失を可能にする。一般的に使用される組換え部位は、それぞれＣｒｅ酵素およびＦｌｐ酵素によって認識されるｌｏｘＰおよびＦｒｔであるが、他も当技術分野で知られている。選択カセットは、コード領域の外側の構築物のどこにでも位置してもよい。一つの実施形態では、選択カセットは、ヒトＤＮＡ断片の５’末端に位置する。別の実施形態では、選択カセットは、ヒトＤＮＡ断片の３’末端に位置する。別の実施形態では、選択カセットは、ヒトＤＮＡ断片の内に位置する。別の実施形態では、選択カセットは、ヒトＤＮＡ断片のイントロン内に位置する。別の実施形態では、選択カセットは、ヒトおよびマウスのＤＮＡ断片の接合部に位置する。本質的に完全にドナー遺伝子標的ＥＳ細胞から誘導されるＦ０世代マウスであれば、直ちに表現型の解析が可能である。独立して、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣクラスＩ遺伝子、ヒトもしくはヒト化β２マイクログロブリン遺伝子、および／またはヒトもしくはヒト化ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子、ならびにヒト化免疫グロブリン座位を担持するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞から完全に誘導されたＦ０マウス）は、これら固有の遺伝子配列の存在を検出するアレルアッセイの改変型を使用して遺伝子型決定を行うことにより特定される（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ
ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２－６５９。当該文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる）。この方法により作製されたヘテロ接合性マウスを交配させて、ホモ接合性にしてもよい。
ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２－６５９。当該文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる）。この方法により作製されたヘテロ接合性マウスを交配させて、ホモ接合性にしてもよい。
【0148】
一部の実施形態では、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ Ｉ、β２マイクログロブリン、ＭＨＣ
ＩＩ分子を含む非ヒト動物は、同種の第二の非ヒト動物と交配され、この場合において当該第二の非ヒト動物は、非再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位、および／または非再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を含む。例えば、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ Ｉ、β２マイクログロブリン、ＭＨＣ ＩＩ分子を含むマウスは、以下を含む第二のマウスと交配されてもよい：
（ａ）内因性重鎖座位で、
（ｉ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変領域、
（ｉｉ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域、
（ｉｉｉ）共通重鎖コード配列、
（ｉｖ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域、
（ｖ）重鎖のみの免疫グロブリンコード配列、または
（ｖｉ）ハイブリッド免疫グロブリン鎖をコードする非再構成ヒト（ヒト化）ハイブリッド重鎖配列、
および／または
（ｂ）内因性軽鎖座位で、
（ｉ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｉｉ）共通軽鎖コード配列、
（ｉｉｉ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域、
（ｉｖ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域、または
（ｖ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域。
任意で、当該第二のマウスはさらに、
（ｉ）機能性ＡＤＡＭ６遺伝子を含むヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖座位を含み、それにより当該マウスは、野生型の生殖能力を呈し、および／または
（ｉｉ）抗原受容体の多様性を増すために外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含み、それにより任意で、再構成可変領域遺伝子の少なくとも１０％は、鋳型には無い付加を含む。
ＩＩ分子を含む非ヒト動物は、同種の第二の非ヒト動物と交配され、この場合において当該第二の非ヒト動物は、非再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位、および／または非再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を含む。例えば、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ Ｉ、β２マイクログロブリン、ＭＨＣ ＩＩ分子を含むマウスは、以下を含む第二のマウスと交配されてもよい：
（ａ）内因性重鎖座位で、
（ｉ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変領域、
（ｉｉ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域、
（ｉｉｉ）共通重鎖コード配列、
（ｉｖ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域、
（ｖ）重鎖のみの免疫グロブリンコード配列、または
（ｖｉ）ハイブリッド免疫グロブリン鎖をコードする非再構成ヒト（ヒト化）ハイブリッド重鎖配列、
および／または
（ｂ）内因性軽鎖座位で、
（ｉ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｉｉ）共通軽鎖コード配列、
（ｉｉｉ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域、
（ｉｖ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域、または
（ｖ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域。
任意で、当該第二のマウスはさらに、
（ｉ）機能性ＡＤＡＭ６遺伝子を含むヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖座位を含み、それにより当該マウスは、野生型の生殖能力を呈し、および／または
（ｉｉ）抗原受容体の多様性を増すために外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含み、それにより任意で、再構成可変領域遺伝子の少なくとも１０％は、鋳型には無い付加を含む。
【0149】
別の実施形態では、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩ、および／またはβ２マイクログロブリンを挿入する構築体は、非再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または非再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を含むように遺伝子改変された非ヒト動物ＥＳ細胞における（内因性ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩおよび／もしくはβ２マイクログロブリン座位での、または異所性座位での）相同組み換えに関与する。あるいは、挿入用構築体は、非再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または非再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を含み、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩおよび／またはβ２マイクログロブリンをコードするヌクレオチド配列を含むように遺伝子改変された非ヒト動物ＥＳ細胞における相同組み換えに関与する。一つの実施形態では、標的化、ならびに内因性ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩおよび／またはβ２マイクログロブリン配列と、キメラヒト／マウスＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩおよび／またはβ２マイクログロブリンをコードする核酸配列との置換を行うための構築体、または一本鎖ＭＨＣ Ｉ／β２マイクログロブリンタンパク質および／もしくは一本鎖ＭＨＣ ＩＩタンパク質の挿入用の構築体は、以下をさらに含み得るＥＳ細胞における相同組み換えに関与する：
（ａ）内因性重鎖座位で、
（ｉ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変領域、
（ｉｉ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域、
（ｉｉｉ）共通重鎖コード配列、
（ｉｖ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域、
（ｖ）重鎖のみの免疫グロブリンコード配列、または
（ｖｉ）ハイブリッド免疫グロブリン鎖をコードする非再構成ヒト（ヒト化）ハイブリッド重鎖配列、
および／または
（ｂ）内因性軽鎖座位で、
（ｉ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｉｉ）共通軽鎖コード配列、
（ｉｉｉ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域、
（ｉｖ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域、または
（ｖ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域。
任意で、当該ＥＳ細胞はさらに、
（ｉ）機能性ＡＤＡＭ６遺伝子を含むヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖座位、および／または
（ｉｉ）抗原受容体の多様性を増加させるための外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含む。
（ａ）内因性重鎖座位で、
（ｉ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変領域、
（ｉｉ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域、
（ｉｉｉ）共通重鎖コード配列、
（ｉｖ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域、
（ｖ）重鎖のみの免疫グロブリンコード配列、または
（ｖｉ）ハイブリッド免疫グロブリン鎖をコードする非再構成ヒト（ヒト化）ハイブリッド重鎖配列、
および／または
（ｂ）内因性軽鎖座位で、
（ｉ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｉｉ）共通軽鎖コード配列、
（ｉｉｉ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域、
（ｉｖ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域、または
（ｖ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域。
任意で、当該ＥＳ細胞はさらに、
（ｉ）機能性ＡＤＡＭ６遺伝子を含むヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖座位、および／または
（ｉｉ）抗原受容体の多様性を増加させるための外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含む。
【0150】
本発明の様々な実施形態では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ ＩポリペプチドおよびＭＨＣ ＩＩポリペプチドをコードする配列は、内因性非ヒトＭＨＣ座位（例えば、マウスＨ－２Ｋ座位および／またはＨ－２Ｅ座位）に位置する。一つの実施形態では、これによって、内因性ＭＨＣ遺伝子またはその一部と、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ Ｉポリペプチドをコードする核酸配列との置換などの配置が生じる。１匹の動物におけるＭＨＣ ＩとＭＨＣ ＩＩの両方のヒト化を最大限に実現させるよう、ＭＨＣ Ｉポリペプチド、ＭＨＣ ＩＩαポリペプチド、およびＭＨＣ ＩＩβポリペプチドをコードする核酸配列は、染色体上で互いに近接して配置されているため、所望の場合には、ＭＨＣ Ｉ座位とＭＨＣ ＩＩ座位は、連続して標的化されるものとする。したがって本明細書において、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチド、ＭＨＣ ＩＩαポリペプチドおよびＭＨＣ ＩＩβポリペプチドをコードする核酸配列を含む遺伝子改変非ヒト動物を作製する方法も提供される。
【0151】
したがって一部の実施形態では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣを含む遺伝子改変動物を作製するためのヌクレオチド構築体が提供される。一つの実施形態では、核酸構築体は、５’および３’非ヒト相同アーム、ヒトＭＨＣ遺伝子配列（例えばヒトＨＬＡ－Ａ２遺伝子配列またはヒトＨＬＡ－ＤＲ遺伝子配列）を含むヒトＤＮＡ断片、および組み換え部位に隣接した選択カセット、を含む。一つの実施形態では、ヒトＤＮＡ断片は、ヒトＭＨＣ遺伝子（例えば、ヒトＨＬＡ－Ａ２遺伝子またはＨＬＡ－ＤＲ２遺伝子）のイントロンとエクソンの両方を含むゲノム断片である。一つの実施形態では、非ヒト相同アームは、非ヒトＭＨＣ座位（例えば、ＭＨＣ Ｉ座位またはＭＨＣ ＩＩ座位）に対して相同である。
【0152】
一つの実施形態では、５’および３’非ヒト相同アームは、それぞれ、内因性非ヒト（例えば、マウス）のＭＨＣクラスＩ遺伝子座位またはクラスＩＩ遺伝子座位の５’位と３’位で、ゲノム配列を含む（例えば、第一のリーダー配列の５’とマウスＭＨＣ Ｉ遺伝子のα３エクソンの３’、またはマウスＨ－２Ａｂ１遺伝子の上流とマウスＨ－２Ｅａ遺伝子の下流）。一つの実施形態では、内因性ＭＨＣクラスＩ座位は、マウスのＨ－２Ｋ、Ｈ－２ＤおよびＨ－２Ｌから選択される。個別の実施形態では、内因性ＭＨＣクラスＩ座位は、マウスＨ－２Ｋである。一つの実施形態では、内因性ＭＨＣ ＩＩ座位は、マウスのＨ－２ＥおよびＨ－２Ａから選択される。一つの実施形態では、操作されたＭＨＣ ＩＩ構築体は、マウスＨ－２Ｅ遺伝子とマウスＨ－２Ａ遺伝子の両方を置換させる。一つの実施形態では、マウスは、そのＨ－２Ｄ座位から、機能性の内因性ＭＨＣポリペプチドを発現しない。一部の実施形態では、マウスは、内因性Ｈ－２Ｄ座位のすべてまたは一部を欠くように操作される。別の実施形態では、マウスは、細胞表面上に機能性の内因性ＭＨＣ ＩポリペプチドおよびＭＨＣ ＩＩポリペプチドをいずれも発現しない。一つの実施形態では、マウスにより細胞表面上に発現されるＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩのみが、キメラヒト／マウスＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩである。
【0153】
本開示はさらに、自身のゲノムが、ヒトまたはヒト化β２マイクログロブリンポリペプチドをコードするβ２マイクログロブリン座位を含む、遺伝子操作された非ヒト動物（例えば、遺伝子操作されたげっ歯類、例えばマウスまたはラット）を作製する方法も提供する。一つの実施形態では、この方法によって、自身のゲノムが、内因性β２マイクログロブリン座位で、ヒトまたはヒト化β２マイクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝子操作された例えばマウスなどのげっ歯類が得られる。いくつかの例では、マウスは、内因性マウスβ２マイクログロブリン座位から、機能性のマウスβ２マイクログロブリンを発現しない。
【0154】
遺伝子操作された非ヒト動物の作製に使用されるヌクレオチド構築体も提供される。一部の実施形態では、ヌクレオチド構築体は、５’および３’非ヒト相同アーム、ヒトβ２マイクログロブリン配列を含むヒトＤＮＡ断片、および組み換え部位に隣接した選択カセット、を含んでもよい。一つの実施形態では、ヒトＤＮＡ断片は、ヒトβ２マイクログロブリン遺伝子のイントロンとエクソンの両方を含むゲノム断片である。一つの実施形態では、非ヒト相同アームは、非ヒトβ２マイクログロブリン座位に対して相同である。ゲノム断片は、ヒトβ２マイクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４を含んでもよい。一つの例では、ゲノム断片は、５’から３’に向かって、エクソン２、イントロン、エクソン３、イントロン、およびエクソン４の、ヒトβ２マイクログロブリン配列のすべてを含む。選択カセットは、構築体において、β２マイクログロブリンコード領域の外側のいずれに配置されてもよく、例えば、ヒトβ２マイクログロブリンのエクソン４の３’側に配置されてもよい。５’および３’の非ヒト相同アームは、内因性非ヒトβ２マイクログロブリン遺伝子のそれぞれ５’側および３’側のゲノム配列を含んでもよい。別の実施形態では、５’および３’の非ヒト相同アームは、それぞれ内因性非ヒト遺伝子のエクソン２の５’側、およびエクソン４の３’側のゲノム配列を含む。
【0155】
本発明の別の実施形態は、非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えばマウスまたはラット）のβ２マイクログロブリン座位を改変して、ヒトまたはヒト化β２マイクログロブリンポリペプチドを発現させる方法に関連する。例えばマウスなどの非ヒト動物のβ２マイクログロブリン座位を改変して、ヒトまたはヒト化β２マイクログロブリンポリペプチドを発現させる方法の一つは、内因性β２マイクログロブリン座位で、マウスβ２マイクログロブリンをコードするヌクレオチド配列と、ヒトまたはヒト化β２マイクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを置換することを含む。そうした方法の一つの実施形態では、例えばマウスなどの非ヒト動物は、例えばマウスなどの内因性非ヒトβ２マイクログロブリン座位から機能性のβ２マイクログロブリンポリペプチドを発現しない。一部の個別の実施形態では、ヒトまたはヒト化されたβ２マイクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ヒトβ２マイクログロブリン遺伝子のエクソン２～エクソン４に記載されるヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、ヒトまたはヒト化されたβ２マイクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ヒトβ２マイクログロブリン遺伝子のエクソン２、エクソン３、およびエクソン４に記載されるヌクレオチド配列を含む。
【0156】
本開示はさらに、自身のゲノムが、例えばＲＯＳＡ２６座位などの異所性座位で、ヒト（ヒト化）β２マイクログロブリンおよびヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩαポリペプチド、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩαポリペプチドおよび／またはヒト（ヒト化）β２マイクログロブリンを含む一本鎖β２マイクログロブリン／ＭＨＣ複合体をコードする配列を含む、遺伝子操作された非ヒト動物（例えば遺伝子操作されたげっ歯類、例えばマウスまたはラット）を作製する方法も提供する。一つの実施形態では、この方法によって、自身のゲノムが、例えば内因性ＲＯＳＡ２６座位などの内因性のＭＨＣ Ｉ座位またはβ２マイクログロブリン座位ではない内因性座位で、ヒト（ヒト化）β２マイクログロブリンおよびヒト（ヒト化）ＭＨＣ複合体を含む一本鎖β２マイクログロブリン／ＭＨＣ複合体、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩαポリペプチドおよび／またはヒト（ヒト化）β２マイクログロブリンをコードするヌクレオチド配列を含む、例えばラットまたはマウスなどの遺伝子操作されたげっ歯類が得られる。ＲＯＳＡ座位を標的化する方法は、当分野で公知である。例えば、Ｓｔｅｆａｎｏ Ｃａｓｏｌａ，Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｍｉＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ｔｈｅ ＲＯＳＡ２６ Ｌｏｃｕｓ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．６６７：１４５－１６３（Ｓ．Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｉ ｅｄ．２０１０）を参照のこと。当該文献は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。
【0157】
遺伝子操作された非ヒト動物の作製に使用されるヌクレオチド構築体も提供される。一部の実施形態では、ヌクレオチド構築体は、５’および３’非ヒト相同アーム、ヒト（ヒト化）β２マイクログロブリンとヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩαポリペプチドを含む一本鎖β２マイクログロブリン／ＭＨＣ複合体（例えば、配列番号２３に記載される一本鎖β２マイクログロブリン／ＨＬＡ－Ａ２複合体）をコードするヌクレオチド配列、組み換え部位に隣接する選択カセット、を含んでもよい。一部の実施形態では、ヌクレオチド構築体は、５’および３’非ヒト相同アーム、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩαポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および組み換え部位に隣接する選択カセット、を含んでもよい。一部の実施形態では、ヌクレオチド構築体は、５’および３’非ヒト相同アーム、ヒト（ヒト化）β２マイクログロブリンをコードするヌクレオチド配列、および組み換え部位に隣接する選択カセット、を含んでもよい。５’および３’非ヒト相同アームは、内因性ＲＯＳＡ２６イントロンに隣接するゲノム配列を含んでもよい。
【0158】
一部の実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物（例えば、マウス）は、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ Ｉ、ヒトもしくはヒト化β２マイクログロブリン；ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ
ＩＩ（例えば、ＭＨＣ ＩＩαおよび／またはＭＨＣ ＩＩβ）；ならびにヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖および軽鎖を１コピーまたは２コピー、含んでもよい。したがって、一部の実施形態では、非ヒト動物は、これらの遺伝子のいずれか、またはすべてに対してヘテロ接合性またはホモ接合性であってもよい。ヒトまたはヒトＭＨＣ Ｉ、ヒトまたはヒト化β２マイクログロブリン；ヒトまたはヒト化ＭＨＣ ＩＩ（例えば、ＭＨＣ ＩＩαおよび／またはＭＨＣ ＩＩβ）を含むよう非ヒト動物を改変する非限定的な目的は、当該非ヒト動物を、当該ヒトまたはヒト化されたＭＨＣ分子に対して寛容化させることであるため、これら遺伝子のホモ接合性は必須ではない。したがって一部の実施形態では、非ヒト動物は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子をコードするヌクレオチド配列に関し、ヘテロ接合性であってもよい。対照的に、非ヒト動物の免疫グロブリン座位を改変する非限定的な目的は、対象の抗原性ｐＭＨＣ複合体に対するヒトまたはヒト化抗体を作製することであるため、一部の実施形態では、非ヒト動物は、当該改変免疫グロブリン座位に関し、ホモ接合性であってもよい。
ＩＩ（例えば、ＭＨＣ ＩＩαおよび／またはＭＨＣ ＩＩβ）；ならびにヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖および軽鎖を１コピーまたは２コピー、含んでもよい。したがって、一部の実施形態では、非ヒト動物は、これらの遺伝子のいずれか、またはすべてに対してヘテロ接合性またはホモ接合性であってもよい。ヒトまたはヒトＭＨＣ Ｉ、ヒトまたはヒト化β２マイクログロブリン；ヒトまたはヒト化ＭＨＣ ＩＩ（例えば、ＭＨＣ ＩＩαおよび／またはＭＨＣ ＩＩβ）を含むよう非ヒト動物を改変する非限定的な目的は、当該非ヒト動物を、当該ヒトまたはヒト化されたＭＨＣ分子に対して寛容化させることであるため、これら遺伝子のホモ接合性は必須ではない。したがって一部の実施形態では、非ヒト動物は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子をコードするヌクレオチド配列に関し、ヘテロ接合性であってもよい。対照的に、非ヒト動物の免疫グロブリン座位を改変する非限定的な目的は、対象の抗原性ｐＭＨＣ複合体に対するヒトまたはヒト化抗体を作製することであるため、一部の実施形態では、非ヒト動物は、当該改変免疫グロブリン座位に関し、ホモ接合性であってもよい。
【0159】
遺伝子標的化が完了したら、ＥＳ細胞または遺伝子改変非ヒト動物は、対象の外因性ヌクレオチド配列の組み込み、または外因性ポリペプチドの発現が成功したかを確認するためにスクリーニングされる。多数の技術が、当業者には公知であり、（限定されないが、）サザンブロッティング、ロングＰＣＲ、定量的 ＰＣＲ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）を使用するリアルタイムＰＣＲなど）、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、フローサイトメトリー、ウェスタン分析、免疫細胞化学、免疫組織化学などが挙げられる。一例では、対象の遺伝子改変を担持する非ヒト動物（例えば、マウス）は、上記のＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）に記載されるアレルアッセイの改変型を使用して、マウスアレルの消失および／またはヒトアレルの獲得に関しスクリーニングすることにより、特定され得る。遺伝子改変動物内の特定ヌクレオチドまたはアミノ酸配列を特定する他のアッセイは、当業者に公知である。
【0160】
対象の抗原性ペプチド－ＭＨＣ複合体
本明細書に記載されるＭＨＣタンパク質に対し寛容化されたマウスは、抗原性ペプチド－ＭＨＣ複合体で免疫化され、ｐＭＨＣ特異的抗原結合タンパク質を産生する。一部の実施形態では、抗原性ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体の一部として有用なＭＨＣとしては、天然型の全長ＭＨＣ、ならびにＭＨＣの個々の鎖（例えば、ＭＨＣクラスＩα（重）鎖、β２マイクログロブリン、ＭＨＣクラスＩＩα鎖、およびＭＨＣクラスＩＩβ鎖）、ＭＨＣのかかる鎖の個々のサブユニット（例えば、ＭＨＣクラスＩα鎖のα１～α３サブユニット、ＭＨＣクラスＩＩα鎖のα１～α２サブユニット、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖のβ１～β２サブユニット）、ならびにそれらの断片、変異体および様々な誘導体（融合タンパク質を含む）が挙げられ、この場合において当該断片、変異体および誘導体は、抗原特異的ＴＣＲにより認識されるための抗原決定基を提示する能力を保持している。
本明細書に記載されるＭＨＣタンパク質に対し寛容化されたマウスは、抗原性ペプチド－ＭＨＣ複合体で免疫化され、ｐＭＨＣ特異的抗原結合タンパク質を産生する。一部の実施形態では、抗原性ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体の一部として有用なＭＨＣとしては、天然型の全長ＭＨＣ、ならびにＭＨＣの個々の鎖（例えば、ＭＨＣクラスＩα（重）鎖、β２マイクログロブリン、ＭＨＣクラスＩＩα鎖、およびＭＨＣクラスＩＩβ鎖）、ＭＨＣのかかる鎖の個々のサブユニット（例えば、ＭＨＣクラスＩα鎖のα１～α３サブユニット、ＭＨＣクラスＩＩα鎖のα１～α２サブユニット、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖のβ１～β２サブユニット）、ならびにそれらの断片、変異体および様々な誘導体（融合タンパク質を含む）が挙げられ、この場合において当該断片、変異体および誘導体は、抗原特異的ＴＣＲにより認識されるための抗原決定基を提示する能力を保持している。
【0161】
天然型ＭＨＣは、ヒト６番染色体上の遺伝子クラスターによりコードされている。ＭＨＣには、限定されないが、例えばＡ（例えば、Ａ１～Ａ７４）、Ｂ（例えば、Ｂ１～Ｂ７７）、Ｃ（例えば、Ｃ１～Ｃ１１）、Ｄ（例えば、Ｄ１－Ｄ２６）、ＤＲ（例えば、ＤＲ１～ＤＲ８）、ＤＱ（例えば、ＤＱ１～ＤＱ９）およびＤＰ（例えば、ＤＰ１～ＤＰ６）などのＨＬＡ特異性が含まれる。ＨＬＡ特異性には、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ１１、Ａ２３、Ａ２４、Ａ２８、Ａ３０、Ａ３３、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ３５、Ｂ４４、Ｂ５３、Ｂ６０、Ｂ６２、ＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ７、ＤＲ８、およびＤＲ １１が含まれる。
【0162】
天然型ＭＨＣクラスＩ分子は、細胞によって、タンパク質分解により分解されたタンパク質、特に内因性に合成されたタンパク質から誘導されたペプチドに結合する。そうして得られた小さなペプチドは小胞体内に輸送され、そこで、初期ＭＨＣクラスＩ分子と関連付けられ、その後、ゴルジ装置を経由し、細胞表面上に提示されて、細胞傷害性Ｔリンパ球により認識される。
【0163】
天然型ＭＨＣクラスＩ分子は、β２マイクログロブリンと関連付けられたα（重鎖）鎖からなる。重鎖は、サブユニットα１－α３からなる。β２マイクログロブリンタンパク質、および重鎖のα３サブユニットが、関連付けられる。特定の実施形態では、β２マイクログロブリンとα３サブユニットは、共有結合によって関連付けられる。特定の実施形態では、β２マイクログロブリンとα３サブユニットは、非共有結合的に関連付けられる。重鎖のα１サブユニットとα２サブユニットは、フォールディングして、例えば抗原決定基などの、提示され、ＴＣＲにより認識されるペプチドのための溝を形成する。
【0164】
クラスＩ分子は概して、例えば、約８～９アミノ酸（例えば、７～１１アミノ酸）の長さのペプチドと関連付けられ、例えば、結合する。すべてのヒトは、３～６個の異なるクラスＩ分子を有し、各々が、多くの異なるタイプのペプチドに結合することができる。
【0165】
一部の実施形態では、ｐＭＨＣ複合体は、（ｉ）クラスＩ ＭＨＣポリペプチド、またはその断片、変異体もしくは誘導体、を含み、および任意で、（ｉｉ）β２マイクログロブリンポリペプチド、またはその断片、変異体もしくは誘導体を含む。一つの個別の実施形態では、クラスＩ ＭＨＣポリペプチドは、ペプチドリンカーによってβ２マイクログロブリンポリペプチドに関連付けられ、例えば、連結される。
【0166】
一つの個別の実施形態では、ＭＨＣクラスＩポリペプチドは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、およびＨＬＡ－Ｇからなる群から選択されるヒトＭＨＣクラスＩポリペプチドである。別の個別の実施形態では、ＭＨＣクラスＩポリペプチドは、Ｈ－２Ｋ、Ｈ－２Ｄ、Ｈ－２Ｌ、Ｈ２－ＩＡ、Ｈ２－ＩＢ、Ｈ２－ＩＪ、Ｈ２－ＩＥ、およびＨ２－ＩＣからなる群から選択されるマウスＭＨＣクラスＩポリペプチドである。
【0167】
一部の実施形態では、抗原性ｐＭＨＣ複合体のＭＨＣクラスＩα重鎖は、完全にヒトである。一部の実施形態では、抗原性ｐＭＨＣ複合体のＭＨＣクラスＩα重鎖は、ヒト化されている。ヒト化されたＭＨＣクラスＩα重鎖は、例えば、米国特許出願公開２０１３／０１１１６１７、２０１３／０１８５８１９、および２０１４／０２４５４６７に記載されている。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩα重鎖は、ヒト細胞外ドメイン（ヒトα１ドメイン、α２ドメイン、および／またはα３ドメイン）、および別の種の細胞質ドメインを含む。一部の実施形態では、クラスＩα重鎖ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｋ、またはＨＬＡ－Ｌである。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ａ配列は、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１配列であってもよい。様々な実施形態では、ペプチド－ＭＨＣは、ＭＨＣクラスＩ重鎖のすべてのドメインを含んでもよい。
【0168】
一部の実施形態では、抗原性ｐＭＨＣ複合体は、β２マイクログロブリンを含む。一部の実施形態では、β２マイクログロブリンは、完全にヒトである。一部の実施形態では、β２マイクログロブリンは、ヒト化されている。ヒト化されたβ２マイクログロブリンポリペプチドは、例えば、米国特許出願公開２０１３／０１１１６１７および２０１３／０１８５８１９に記載されている。それら各文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。
【0169】
一部の実施形態では、抗原性ｐＭＨＣ複合体のＭＨＣクラスＩ分子は、ヒト（ヒト化）β２マイクログロブリン（β２ｍまたはＢ２Ｍ）ポリペプチド中、およびヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩα重鎖中に変異を含み、それによって、当該ヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍとヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩα重鎖の間にジスルフィド結合が形成され得る。一部の実施形態では、ジスルフィド結合は、以下の残基対のうちの一つを連結させる：ヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍ残基１２、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ α重鎖残基２３６；ヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍ残基１２、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ α重鎖残基２３７；ヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍ残基８、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ α重鎖残基２３４；ヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍ残基１０、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ α重鎖残基２３５；ヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍ残基２４、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ α重鎖残基２３６；ヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍ残基２８、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ α重鎖残基２３２；ヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍ残基９８、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ α重鎖残基１９２；ヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍ残基９９、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ α重鎖残基２３４；ヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍ残基３、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ α重鎖残基１２０；ヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍ残基３１、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ α重鎖残基９６；ヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍ残基５３、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ α重鎖残基３５；ヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍ残基６０、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ α重鎖残基９６；ヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍ残基６０、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ α重鎖残基１２２；ヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍ残基６３、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ α重鎖残基２７；ヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍ残基Ａｒｇ３、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ α重鎖残基Ｇｌｙ １２０；ヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍ残基Ｈｉｓ３１、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ α重鎖残基Ｇｌｎ９６；ヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍ残基Ａｓｐ５３、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ α重鎖残基Ａｒｇ３５；ヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍ残基Ｔｒｐ６０、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ α重鎖残基Ｇｌｎ９６；ヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍ残基Ｔｒｐ６０、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ α重鎖残基Ａｓｐ １２２；ヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍ残基Ｔｙｒ６３、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ α重鎖残基Ｔｙｒ２７；ヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍ残基Ｌｙｓ６、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ α重鎖残基Ｇｌｕ２３２；ヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍ残基Ｇｌｎ８、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ α重鎖残基Ａｒｇ２３４；ヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍ残基Ｔｙｒ １０、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ α重鎖残基Ｐｒｏ２３５；ヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍ残基Ｓｅｒｌ ｌ、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ α重鎖残基Ｇｌｎ２４２；ヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍ残基Ａｓｎ２４、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ α重鎖残基Ａｌａ２３６；ヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍ残基Ｓｅｒ２８、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ α重鎖残基Ｇｌｕ２３２；ヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍ残基Ａｓｐ９８、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ α重鎖残基Ｈｉｓ １９２；ヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍ残基Ｍｅｔ９９、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ α重鎖残基Ａｒｇ２３４、および／またはヒト（ヒト化）Ｂ２Ｍ残基Ａｒｇ １２、ヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ α重鎖残基Ｇｌｙ２３７。例えば、国際特許出願公開ＷＯ／２０１５１９５５３１を参照のこと。当該文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。
【0170】
一部の実施形態では、抗原決定基のアミノ酸配列は、例えば、ＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるなど、ＭＨＣクラスＩ分子と関連付けられ得るペプチドのアミノ酸配列であってもよい。特定の実施形態では、配列は、６～２０個の連続アミノ酸を含んでもよい。特定の実施形態では、ペプチド配列は、タンパク質断片のペプチド配列であってもよく、この場合において当該タンパク質は、例えば自己免疫性障害と関連のあるタンパク質などの細胞タンパク質の一部から誘導され、この場合において当該ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ重鎖に結合されてもよい。
【0171】
一部の実施形態では、ＭＨＣの少なくとも一つの鎖、およびペプチドは、融合タンパク質として関連付けられている。一つの実施形態では、ＭＨＣとペプチドは、リンカー配列により関連付けられている。例えば、一本鎖分子は、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、抗原決定基、β２マイクログロブリン配列、およびクラスＩα（重）鎖配列を含んでもよい。あるいは一本鎖分子は、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、抗原決定基、クラスＩα（重）鎖配列、およびβ２マイクログロブリン配列を含んでもよい。一本鎖三量体としてのｐＭＨＣ複合体の作製および使用は、過去に報告されている。例えば、米国特許第８，８９５，０２０号、米国特許第８，９９２，９３７号；Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：３６３－６９；Ｔｒｕｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７８：６２８０－８９；Ｍｉｔａｋｓｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １４：９０９－２２を参照のこと。それら各文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一本鎖ｐＭＨＣ複合体は、アミノ末端でシグナルペプチド配列をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、ペプチド配列とβ２マイクログロブリン配列との間にリンカー配列があってもよい。特定の実施形態では、β２マイクログロブリン配列とクラスＩα（重）鎖配列との間にリンカー配列があってもよい。一本鎖分子は、アミノ末端でシグナルペプチド配列、ならびに当該ペプチド配列とβ２マイクログロブリン配列との間を伸長させる第一のリンカー配列、および／またはβ２マイクログロブリン配列とクラスＩ重鎖配列との間を伸長させる第二のリンカー配列をさらに含んでもよい。
【0172】
一部の実施形態では、一本鎖ｐＭＨＣ複合体は、ペプチドリガンドセグメントとβ２マイクログロブリン配列との間に第一の柔軟なリンカーを含んでもよい。例えばリンカーは、当該ペプチドリガンドセグメントのカルボキシル末端から伸長して、当該末端を、β２マイクログロブリンセグメントのアミノ末端に連結させてもよい。一部の実施形態では、リンカーは、連結されたペプチドリガンドが結合溝へとフォールディングされ、機能性ＭＨＣ－抗原ペプチドを生じるように構築される。一部の実施形態では、当該リンカーは、少なくとも３アミノ酸、最大で約１５アミノ酸（例えば、２０アミノ酸）を含んでもよい。一部の実施形態では、一本鎖分子は、β２マイクログロブリンセグメントとＭＨＣ Ｉ重鎖セグメントとの間に挿入される第二の柔軟なリンカーを含んでもよい。例えばリンカーは、当該β２マイクログロブリンセグメントのカルボキシル末端から伸長して、当該末端を、ＭＨＣ Ｉ重鎖セグメントのアミノ末端に連結させてもよい。特定の実施形態では、β２マイクログロブリンとＭＨＣ Ｉ重鎖は、結合溝へとフォールディングして、Ｔ細胞拡張の促進に機能し得る分子を生じさせる。
【0173】
ｐＭＨＣ複合体に使用される適切なリンカーは、例えば１アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）～２０アミノ酸、２アミノ酸～１５アミノ酸、３アミノ酸～１２アミノ酸などの、４アミノ酸～１０アミノ酸、５アミノ酸～９アミノ酸、６アミノ酸～８アミノ酸、または７アミノ酸～８アミノ酸を含む多数の適切な長さのうちのいずれかであってもよく、および１、２、３、４、５、６、または７アミノ酸であってもよい。例示的リンカーとしては、グリシンポリマー（Ｇｎ）、グリシン－セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）（配列番号１）、および（ＧＧＧＳ）（配列番号２）を含み、式中、ｎは、少なくとも１の整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、および当分野に公知のその他の柔軟なリンカーが挙げられる。グリシンポリマーおよびグリシン－セリンポリマーが使用されてもよい。ＧｌｙとＳｅｒの両方とも比較的非構造的であり、それゆえ構成要素間を中立に繋ぐ役割を果たし得る。グリシンポリマーが使用されてもよい。グリシンは、同等のアラニンよりも遥かに多くのφ－ψ空間にアクセスし、長い側鎖を有する残基よりもずっと制限が少ない（Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍ．１ １１７３－１４２（１９９２）を参照のこと。当該文献は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。例示的リンカーは、限定されないが、ＧＧＳＧ（配列番号３）、ＧＧＳＧＧ（配列番号４）、ＧＳＧＳＧ（配列番号５）、ＧＳＧＧＧ（配列番号６）、ＧＧＧＳＧ（配列番号７）、ＧＳＳＳＧ（配列番号８）、ＧＣＧＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９）、ＧＣＧＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１）、ＧＧＧＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３）、またはＧＧＧＡＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１６）、ＧＣＧＧＳ（配列番号２１）をはじめとするアミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態では、リンカーポリペプチドは、第二のポリペプチド中に存在するシステイン残基とジスルフィド結合を形成することができるシステイン残基を含む。
【0174】
特定の実施形態では、一本鎖ｐＭＨＣ複合体は、ジスルフィド結合（すなわち二つのシステイン間のジスルフィド結合）を介してＭＨＣクラスＩα（重）鎖に共有結合したペプチドを含んでもよい。例えば、米国特許第８，９９２，９３７号および第８，８９５，０２０号を参照のこと。各特許は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、ジスルフィド結合は、抗原ペプチドのカルボキシ末端から伸長するリンカー内に位置する第一のシステイン、およびＭＨＣクラスＩ重鎖（例えば、抗原ペプチドの共有結合部位を有するＭＨＣクラスＩα（重）鎖）内に位置する第二のシステインを含む。特定の実施形態では、第二のシステインは、ＭＨＣクラスＩα（重）鎖中の変異（付加または置換）であってもよい。特定の実施形態では、一本鎖分子は、一つの連続ポリペプチド鎖ならびにジスルフィド結合を含んでもよい。特定の実施形態では、一本鎖分子は、唯一の共有結合としてジスルフィド結合を介して結合した二つの連続ポリペプチド鎖を含んでもよい。一部の実施形態では、連結配列は、システインに加えて、一つもしくは複数のグリシン、一つもしくは複数のアラニン、および／または一つもしくは複数のセリンをはじめとする少なくとも一つのアミノ酸を含んでもよい。一部の実施形態では、一本鎖分子は、Ｎ末端からＣ末端に向けて、ＭＨＣクラスＩペプチド（例えば、抗原性ペプチド）は、第一のシステインを含む第一のリンカー、ヒト（ヒト化）β２マイクログロブリン配列、第二のリンカー、第二のシステインを含むヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ重鎖配列を含み、この場合において当該第一のシステインと当該第二のシステインは、ジスルフィド結合を含む。一部の実施形態では、第二のシステインは、Ｔ８０Ｃ、Ｙ８４ＣおよびＮ８６Ｃからなる群から選択されるヒト（ヒト化）ＭＨＣクラスＩ重鎖のアミノ酸の置換である（Ｙ８４Ｃとは、成熟タンパク質中の１０８位の変異を指し、成熟タンパク質とはシグナル配列を欠くものである。あるいはタンパク質が２４ｍｅｒのシグナル配列をまだ含んでいるときには、当該位置は代わりにＹ１０８Ｃと呼称される）。
【0175】
特定の実施形態では、ジスルフィド結合は、ｐＭＨＣ複合体が、ペプチドのＣ末端とβ２マイクログロブリンの間を伸長させるＧｌｙ－Ｓｅｒリンカー中に第一のシステインを含み、近接する重鎖の位置に第二のシステインを含む場合には、ｐＭＨＣ複合体のクラスＩの溝において抗原ペプチドを連結させてもよい。
【0176】
一部の実施形態では、β２マイクログロブリン配列は、全長（ヒトまたは非ヒト）β２マイクログロブリン配列を含んでもよい。特定の実施形態では、β２マイクログロブリン配列は、リーダーペプチド配列を欠いている。したがって、β２マイクログロブリン配列は、約９９アミノ酸を含んでもよく、およびヒトβ２マイクログロブリン配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＡＦ０７２０９７．１）であってもよい。
【0177】
一部の実施形態では、ｐＭＨＣ複合体は、ヒトβ２マイクログロブリンと融合したヒトＨＬＡクラスＩ分子を含む。一部の実施形態では、ヒトβ２マイクログロブリンと融合したヒトＨＬＡクラスＩ分子は、例えば当該ＨＬＡ分子と当該β２マイクログロブリンを連結させるリンカー、および／または当該ペプチドと、ヒトβ２マイクログロブリンと融合したヒトＨＬＡクラスＩ分子を連結させるリンカーなど、一つまたは複数のリンカーを含む。一部の実施形態では、ｐＭＨＣ複合体をコードするヌクレオチド配列は、ヒトＨＬＡおよびβ２マイクログロブリンをコードする配列を含み得る。一部の実施形態では、ｐＭＨＣ複合体をコードするヌクレオチド配列は、ヒトＨＬＡおよびβ２マイクログロブリン、ならびに一つまたは複数のリンカーをコードする配列を含み得る。一部の実施形態では、ｐＭＨＣ複合体をコードするヌクレオチド配列は、ヒトＨＬＡとβ２マイクログロブリンをコードする配列、および標識（例えば緑色蛍光タンパク質）またはタグ（例えばｃ－ｍｙｃ、ヒスチジンタグなど）をコードする配列を含み得る。一部の実施形態では、ｐＭＨＣ複合体をコードするヌクレオチド配列は、ヒトＨＬＡおよびβ２マイクログロブリンをコードする配列、リンカーをコードする配列、ならびに標識またはタグをコードする配列を含み得る。例示的なヒトＨＬＡおよびβ２マイクログロブリン、ならびに一つまたは複数のリンカーをコードするヌクレオチド配列の非限定的な例は、配列番号１７および配列番号１９として記載される。それからコードされるアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１８および配列番号２０として記載される。
【0178】
対象ペプチドは、配列番号１８および配列番号２０のＮ末端ＧＣＧＧＳリンカー配列（配列番号２１）に結合してもよく、この場合において当該リンカーのシステインは、ヒトＨＬＡ－Ａ２ポリペプチドのＹ１０８Ｃアミノ酸とジスルフィド結合を形成する。したがって、一部の実施形態では、非ヒト動物は、配列番号１８として記載される配列、または配列番号２０として記載される配列を含むアミノ酸配列を含むｐＭＨＣ複合体で免疫化、および／またはブーストされる。一部の実施形態では、非ヒト動物は、配列番号１８または配列番号２０として記載される配列を含むアミノ酸配列を有するｐＭＨＣ複合体をコードするＤＮＡで免疫化される。
【0179】
一部の実施形態では、例えばＰＡＤＲＥなどのヘルパーＴ細胞エピトープは、一本鎖ｐＭＨＣ複合体のＣ末端に連結されてもよい。例えば、米国特許第６，４１３，９３５号およびＡｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７５１－６１を参照のこと。それら各文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ＰＡＤＲＥは、一本鎖ｐＭＨＣ複合体のＣ末端に直接連結される。複数の実施形態では、ＰＡＤＲＥは、リンカーを介して一本鎖ｐＭＨＣ複合体のＣ末端に連結される。一部の実施形態では、本明細書に記載される免疫化プロトコールは、非ヒト動物に、Ｃ末端でＰＡＤＲＥが連結した一本鎖ｐＭＨＣ複合体を投与することを含む。一部の実施形態では、Ｃ末端でＰＡＤＲＥが連結した一本鎖ｐＭＨＣ複合体は、配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含む。
【0180】
一部の実施形態では、ｐＭＨＣ複合体は、米国特許第４，４７８，８２号、第６，０１１，１４６号、第８，８９５，０２０号、第８，９９２，９３７号、ＷＯ ９６／０４３１４、Ｍｏｔｔｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：４９３－５０２，１９９５、Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ７０：１０３５－１０４８，１９９２、Ｍａｔｓｕｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９２７－９３４，１９９２、Ｍａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０６５８－１０６６２，１９９２、Ｔｏｓｈｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：２３６－２４０，１９９６、Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：３６９９－３７０８，１９９９、Ｕｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｒｂｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１５９８－１６０５，１９９８、Ｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２，ｐｐ．６０２４－６０２８，１９９９、Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２６７１－２６７６，１９９９に記載されるｐＭＨＣ複合体であり得る。
【0181】
一部の実施形態では、ｐＭＨＣ複合体は、クラスＩＩ ＭＨＣポリペプチド、またはその断片、変異体もしくは誘導体を含む。一つの個別の実施形態では、ＭＨＣは、クラスＩＩ ＭＨＣ分子のαポリペプチドおよびβポリペプチド、またはその断片、変異体もしくは誘導体を含む。一つの個別の実施形態では、αポリペプチドおよびβポリペプチドは、ペプチドリンカーによって連結される。一つの個別の実施形態では、ＭＨＣは、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＭ、およびＨＬＡ－ＤＯからなる群から選択されるヒトクラスＩＩ ＭＨＣ分子のαポリペプチドおよびβポリペプチドを含む。
【0182】
ＭＨＣクラスＩＩ分子は概して、αおよびβの二つのポリペプチド鎖からなる。当該鎖は、ＤＰ、ＤＱまたはＤＲ遺伝子群に由来し得る。約４０個の公知の異なるヒトＭＨＣクラスＩＩ分子が存在している。全てが同じ基本構造を有しているが、その分子構造はわずかに異なっている。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、１３～１８アミノ酸の長さのペプチドに結合する。
【0183】
一部の実施形態では、抗原性ｐＭＨＣ複合体は、一つまたは複数のＭＨＣクラスＩＩα鎖を含む。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩα鎖は、完全にヒトである。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩα鎖は、ヒト化されている。ヒト化されたＭＨＣクラスＩＩα鎖は、例えば、米国特許第８，８４７，００５号および第９，０４３，９９６号、ならびに米国特許出願公開２０１４／０２４５４６７に記載されている。一部の実施形態では、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩα鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外ドメインと、別の種の細胞質ドメインを含む。一部の実施形態では、クラスＩＩα鎖は、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＱＡまたはＨＬＡ－ＤＲＡである。一部の実施形態では、クラスＩＩα鎖ポリペプチドは、ヒト化されたＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＱＡおよび／またはＨＬＡ－ＤＲＡである。
【0184】
一部の実施形態では、ウイルス粒子は、一つまたは複数のＭＨＣクラスＩＩβ鎖を含む。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖は、完全にヒトである。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖ポリペプチドは、ヒト化されている。ヒト化されたＭＨＣクラスＩＩβ鎖ポリペプチドは、例えば、米国特許第８，８４７，００５号および第９，０４３，９９６号、ならびに米国特許出願公開２０１４／０２４５４６７に記載されている。一部の実施形態では、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩβ鎖は、ヒト細胞外ドメインと、別の種の細胞質ドメインを含む。一部の実施形態では、クラスＩＩβ鎖は、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＰＢ、ＨＬＡ－ＤＱＢまたはＨＬＡ－ＤＲＢである。一部の実施形態では、クラスＩＩβ鎖は、ヒト化されたＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＰＢ、ＨＬＡ－ＤＱＢおよび／またはＨＬＡ－ＤＲＢである。
【0185】
一部の実施形態では、抗原性ｐＭＨＣ複合体中に含まれる例えばペプチドなどの抗原決定基は、当該ｐＭＨＣ複合体が、例えば特定の様式でＴＣＲに結合することができるよう、ＭＨＣタンパク質に結合する能力を有する任意のペプチドを含んでもよい。
【0186】
例としては、加水分解により生成されるペプチド、最も典型的には、合成で生成されたペプチドが挙げられ、無作為に生成されたペプチド、具体的に設計されたペプチド、およびアミノ酸位置の少なくともいくつかは一部のペプチド間で保存され、残りの位置は無作為であるペプチドが含まれる。
【0187】
自然界では、加水分解により生成されるペプチドは、加水分解を経て、ＭＨＣタンパク質に抗原が結合する。クラスＩ ＭＨＣは、典型的には、細胞の細胞質で能動的に合成されたタンパク質から誘導されたペプチドを提示する。対照的に、クラスＩＩ ＭＨＣは、典型的には、細胞のエンドサイトーシス経路に入る外因性タンパク質、またはＥＲで合成されたタンパク質のいずれかから誘導されたペプチドを提示する。細胞内輸送により、ペプチドは、ＭＨＣタンパク質と関連付けられる。
【0188】
ペプチドとＭＨＣペプチド結合溝の結合は、ＴＣＲにより認識されるＭＨＣおよび／またはペプチドのアミノ酸残基の空間的配置を制御することができ、または本明細書に開示される遺伝子改変動物により産生されるｐＭＨＣ結合タンパク質を制御することができる。そうした空間的制御は、部分的には、ペプチドとＭＨＣタンパク質との間に形成された水素結合に依存している。どのようにペプチドが様々なＭＨＣに結合するかについての知見に基づいて、主要ＭＨＣアンカーアミノ酸と、異なるペプチド間で変化する表面暴露アミノ酸が決定され得る。一部の実施形態では、ＭＨＣ結合ペプチドの長さは、５～４０アミノ酸残基、例えば６～３０アミノ酸残基、例えば、８～２０アミノ酸残基、例えば、９～１１アミノ酸残基であり、すべての整数増分での５～４０アミノ酸の間の任意の大きさのペプチドを含む（すなわち、５、６、７、８、９．．．４０）。天然型ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドは、約９～４０アミノ酸で変化する。一方で、ほぼすべての場合で、ペプチドは、ＭＨＣ結合能力またはＴ細胞認識を失うことなく、９～１１アミノ酸のコアへと短縮されることができる。
【0189】
ペプチドは、例えば、自己免疫性障害と関連するヒト自己タンパク質、感染性物質（例えば、細菌、ウイルス、寄生体）のタンパク質、アレルゲン、および腫瘍関連タンパク質からなる群から選択されるタンパク質の抗原決定基などの少なくとも一部を含むペプチドを含む。一つの実施形態では、ｐＭＨＣ複合体は、自己免疫性障害と関連するヒト自己タンパク質の抗原決定基を含む。別の実施形態では、ｐＭＨＣ複合体は、アレルゲンの抗原決定基を含む。別の実施形態では、ｐＭＨＣ複合体は、細菌の抗原決定基を含む。別の実施形態では、ｐＭＨＣ複合体は、ウイルスの抗原決定基を含む。別の実施形態では、ｐＭＨＣ複合体は、寄生虫の抗原決定基を含む。
【0190】
柔軟なリンカーを介してＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子にペプチドが結合することで、当該ペプチドが、生合成、輸送および提示の間、ＭＨＣを占有し、関連付けられて留まることが確保されるという利点がある。代替的なアプローチとして、一部の実施形態では、ＭＨＣとペプチドは別個に発現される。
【0191】
対象の抗原性ｐＭＨＣ複合体に特異的に結合する抗原結合タンパク質、同タンパク質を作製するための核酸構築体、細胞および方法。
一つの実施形態では、抗原性ｐＭＨＣ複合体に特異的に結合する抗原結合ドメインの可変ドメインをコードする核酸、および当該核酸を発現する細胞が提供される。
一つの実施形態では、抗原性ｐＭＨＣ複合体に特異的に結合する抗原結合ドメインの可変ドメインをコードする核酸、および当該核酸を発現する細胞が提供される。
【0192】
一つの実施形態では、ヒト用治療剤の製造のための細胞株を作製するための非ヒト動物由来の核酸配列の使用が提供される。一つの実施形態では、ヒト用治療剤は、ヒト抗原結合ドメインとヒトＦｃ領域を含む結合タンパク質である。
【0193】
一つの実施形態では、発現システムが提供され、当該システムは、ヒトＣＨ領域と融合した体細胞変異したヒト重鎖可変ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸、および／またはヒトＣＬ領域と融合した体細胞変異したヒト軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸、を含む哺乳動物宿主細胞を含み、この場合において当該ＶＨドメインとＶＬドメインは、同系である。
【0194】
一つの実施形態では、適切な宿主細胞は、Ｂ細胞、ハイブリドーマ、クアドローマ、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、およびウイルス核酸配列を発現するヒト網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ社））から選択される。
【0195】
一つの実施形態では、結合タンパク質を作製する方法が提供され、当該方法は、本明細書に開示される非ヒト動物から細胞または核酸を単離することを含み、この場合において当該細胞または核酸は、対象ｐＭＨＣ複合体に特異的に結合する抗原結合タンパク質を含む、またはコードする。一部の実施形態では、当該方法はさらに、ヒトの重鎖または軽鎖の可変領域配列（これはヒスチジン改変ヒト重鎖可変ドメインおよび／またはヒスチジン改変ヒト軽鎖可変ドメインをコードし得、また同時に、あるいは独立して、ユニバーサル軽鎖可変ドメインであり得る）を、ヒトのＣＨまたはＣＬ領域をコードする遺伝子とともにインフレームでコードするヌクレオチド配列をクローニングして、ヒト結合タンパク質配列を形成させること、および当該ヒト結合タンパク質配列を、適切な細胞中で発現させること、を含む。
【0196】
一つの実施形態では、非ヒト動物は、対象ｐＭＨＣ複合体で免疫化され、ヒト抗原結合ドメインは、対象ｐＭＨＣ複合体のエピトープに特異的に（マイクロモル、ナノモル、またはピコモルの範囲のＫＤで）結合する。一つの実施形態では、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列は、非ヒト動物中で体細胞変異される。
【0197】
一つの実施形態では、対象ｐＭＨＣ複合体に結合する抗原結合タンパク質を作製する方法が提供され、当該方法は、
（１）非ヒト動物を、対象ｐＭＨＣ複合体で免疫化することであって、この場合において当該非ヒト動物は、自身のゲノム中に、
（ｉ）ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列、および
（ｉｉ）（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位、を含み、それにより当該非ヒト動物は、例えばヒトまたはヒト化可変ドメインなどのヒトまたはヒト化抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗原結合タンパク質を提供する能力を有し、
任意で、この場合において当該（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位のうちの少なくとも一つは、再構成されていないこと、
（２）当該非ヒト動物に、対象ｐＭＨＣ複合体、または担体に連結された対象ｐＭＨＣ複合体に対する免疫反応を開始させること、
（３）当該免疫化非ヒト動物から細胞（例えばリンパ球）を単離させることであって、この場合において当該細胞は、対象ｐＭＨＣ複合体に特異的に結合する抗原結合ドメインを形成するヒト重鎖可変ドメインとヒト軽鎖可変ドメイン（それら各々が独立してヒスチジン改変されていてもよく、およびその軽鎖可変ドメインは、共通軽鎖可変ドメインであってもよい）をコードする第一および第二の免疫グロブリン可変領域核酸配列を含むこと、（４）対形成したときに、対象ｐＭＨＣ複合体に特異的に結合する、または担体に連結された対象ｐＭＨＣ複合体に特異的に結合する免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変ドメインをコードする免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域核酸配列を特定すること、および
（５）（ｄ）の核酸配列を、抗原結合タンパク質の発現に適した発現系で発現させ、対象ｐＭＨＣ複合体に結合する重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの二量体を含む抗原結合タンパク質を形成させること、を含む。
（１）非ヒト動物を、対象ｐＭＨＣ複合体で免疫化することであって、この場合において当該非ヒト動物は、自身のゲノム中に、
（ｉ）ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列、および
（ｉｉ）（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位、を含み、それにより当該非ヒト動物は、例えばヒトまたはヒト化可変ドメインなどのヒトまたはヒト化抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗原結合タンパク質を提供する能力を有し、
任意で、この場合において当該（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位のうちの少なくとも一つは、再構成されていないこと、
（２）当該非ヒト動物に、対象ｐＭＨＣ複合体、または担体に連結された対象ｐＭＨＣ複合体に対する免疫反応を開始させること、
（３）当該免疫化非ヒト動物から細胞（例えばリンパ球）を単離させることであって、この場合において当該細胞は、対象ｐＭＨＣ複合体に特異的に結合する抗原結合ドメインを形成するヒト重鎖可変ドメインとヒト軽鎖可変ドメイン（それら各々が独立してヒスチジン改変されていてもよく、およびその軽鎖可変ドメインは、共通軽鎖可変ドメインであってもよい）をコードする第一および第二の免疫グロブリン可変領域核酸配列を含むこと、（４）対形成したときに、対象ｐＭＨＣ複合体に特異的に結合する、または担体に連結された対象ｐＭＨＣ複合体に特異的に結合する免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変ドメインをコードする免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域核酸配列を特定すること、および
（５）（ｄ）の核酸配列を、抗原結合タンパク質の発現に適した発現系で発現させ、対象ｐＭＨＣ複合体に結合する重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの二量体を含む抗原結合タンパク質を形成させること、を含む。
【0198】
一部の実施形態では、対象ｐＭＨＣ複合体に結合する抗原結合タンパク質を作製する方法が提供され、当該方法は、
（１）非ヒト動物を、対象ｐＭＨＣ複合体で免疫化することであって、この場合において当該非ヒト動物は、自身のゲノム中に、
（ｉ）ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列、および
（ｉｉ）（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位、を含み、それにより当該非ヒト動物は、例えばヒトまたはヒト化可変ドメインなどのヒトまたはヒト化抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗原結合タンパク質を提供する能力を有し、
任意で、この場合において当該（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位のうちの少なくとも一つは、再構成されていないこと、
（２）対象ｐＭＨＣ複合体に特異的に結合する抗体のヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび／またはヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをそれぞれコードするヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変領域配列および／またはヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を取得すること、
（ｃ）当該ヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変領域配列および／またはヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を採用して、ｐＭＨＣに結合する抗体を生成すること、を含む。
（１）非ヒト動物を、対象ｐＭＨＣ複合体で免疫化することであって、この場合において当該非ヒト動物は、自身のゲノム中に、
（ｉ）ヒト（ヒト化）ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列、および
（ｉｉ）（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位、を含み、それにより当該非ヒト動物は、例えばヒトまたはヒト化可変ドメインなどのヒトまたはヒト化抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗原結合タンパク質を提供する能力を有し、
任意で、この場合において当該（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位のうちの少なくとも一つは、再構成されていないこと、
（２）対象ｐＭＨＣ複合体に特異的に結合する抗体のヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび／またはヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをそれぞれコードするヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変領域配列および／またはヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を取得すること、
（ｃ）当該ヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変領域配列および／またはヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を採用して、ｐＭＨＣに結合する抗体を生成すること、を含む。
【0199】
一部の実施形態では、細胞（例えばＢ細胞）は、非ヒト動物から（例えば脾臓またはリンパ節から）回収される。細胞を骨髄腫細胞株と融合させて不死化ハイブリドーマ細胞株を調製してもよく、そうしたハイブリドーマ細胞株をスクリーニングおよび選択して、免疫化に使用される抗原に特異的なハイブリッド重鎖を含有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を特定する。
【0200】
一つの実施形態では、免疫化は、非ヒト動物に、対象ｐＭＨＣ複合体を用いてプライミングすること（例えば、投与すること）、当該非ヒト動物に一定期間、休息させること、そして当該非ヒト動物を、対象ｐＭＨＣ複合体を用いて再免疫化する（例えば当該非ヒト動物の免疫反応をブーストする）ことを含む。一部の実施形態では、方法は、例えば汎ＤＲ Ｔヘルパーエピトープ（ＰＡＤＲＥ）などのヘルパーＴ細胞エピトープを併用して非ヒト動物を免疫化および／またはブーストすることを含む。例えば、米国特許第６，４１３，９３５号およびＡｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７５１－６１を参照のこと。それら各文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、方法は、非ヒト動物を、対象ｐＭＨＣ複合体でプライミングすること、および例えばＰＡＤＲＥなどのヘルパーＴ細胞エピトープと連結された対象ｐＭＨＣ複合体を用いて、当該免疫化動物をブーストすること、を含む。一部の実施形態では、方法は、非ヒト動物を、ヘルパーＴ細胞エピトープと連結された対象ｐＭＨＣ複合体を用いて、プライミングおよびブーストの両方を行うことを含む。ＰＡＤＲＥを用いてプライミングおよび／またはブーストを行うことを含む実施形態では、非ヒト動物は、Ｃ５７／Ｂｌ６の遺伝的背景を備えたマウスである。例えば、非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０ＣおよびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスであるか、または前述のＣ５７ＢＬ／６系統と別の系統の雑種、例えば１２９、ＢＡＬＢなどである。一部の実施形態では、非ヒト動物のプライミングと非ヒト動物のブーストの間の期間は、数日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、または少なくとも１カ月である。
【0201】
一つの実施形態では、非ヒト動物中で生成された免疫グロブリン可変領域（ＶＲ）（例えば、再構成されたヒトＶＨ／ＤＨ／ＪＨ遺伝子配列、または再構成されたヒトＶＬ／ＪＬ遺伝子配列を含み、それらは各々、および独立して、ヒスチジン改変された再構成ヒトＶＨ／ＤＨ／ＪＨ遺伝子配列または再構成ヒトＶＬ／ＪＬ遺伝子配列であってもよく、そして後者はさらに、または独立して、共通再構成ヒトＶＬ／ＪＬ遺伝子配列であってもよい）が提供される。一つの実施形態では、再構成ＶＨ／ＤＨ／ＪＨ遺伝子配列は、一つまたは複数のヒト重鎖定常領域配列（例えば、ヒトまたはマウスのＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびそれらの組み合わせ）と融合し、または再構成ＶＬ／ＪＬ遺伝子配列は、ヒト軽鎖定常領域配列と融合される。本明細書において、本発明の実施形態の非ヒト動物において生成される、および／または当該非ヒト動物から単離された核酸配列によりコードされる、結合タンパク質の免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列も提供される。
【0202】
一つの実施形態では、本発明の実施形態の非ヒト動物において生成される、または本発明の実施形態のマウスにおいて生成される配列から誘導された、結合タンパク質またはその抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ）が提供される。
【0203】
二特異性結合タンパク質
対象ｐＭＨＣ複合体に特異的に結合するヒト可変ドメインを含む免疫グロブリン様結合タンパク質が提供される。そうした結合タンパク質を発現する細胞、当該細胞を生成するマウス、ならびに関連の方法および組成物も提供される。
対象ｐＭＨＣ複合体に特異的に結合するヒト可変ドメインを含む免疫グロブリン様結合タンパク質が提供される。そうした結合タンパク質を発現する細胞、当該細胞を生成するマウス、ならびに関連の方法および組成物も提供される。
【0204】
一部の実施形態では、結合タンパク質、および当該結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を使用して、例えば二特異性結合タンパク質などの多特異性結合タンパク質が作製され得る。この実施形態では、第一の重鎖可変ドメインを含む第一のポリペプチドは、第二の重鎖可変ドメインを含む第二のポリペプチドと関連付けられ得る。第一の重鎖可変ドメインと第二の重鎖可変ドメインが、異なるエピトープに特異的に結合する場合、二特異性結合分子は、二つの重鎖可変ドメインを使用して作製され得る。ＣＨ領域は、同一であっても、異なっていてもよい。一つの実施形態では、例えばＣＨ領域の一つが改変されてプロテインＡ結合決定基が取り除かれてもよく、一方で、他の重鎖定常領域はそのようには改変されない（例えば、米国特許第８，５８６，７１３ Ｂ２号を参照のこと。当該特許は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる）。この固有配置により、例えばホモ二量体（例えば第一または第二のポリペプチドのホモ二量体）の混合物などからの二特異性結合タンパク質の単離が簡略化される。一部の実施形態では、二特異性ｐＭＨＣ結合タンパク質は、プロテインＡ結合に関してヘテロ二量体性であってもよく、および
ａ．Ｎ末端からＣ末端に向かって、第一のエピトープに選択的に結合する第一のエピトープ結合領域、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４から選択されるヒトＩｇＧの第一のＣＨ３領域を含む免疫グロブリン定常領域を含む第一のポリペプチドであって、当該第一のＣＨ３領域は、プロテインＡに結合するもの、および
ｂ．Ｎ末端からＣ末端に向かって、第二のエピトープに選択的に結合する第二のエピトープ結合領域、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４から選択されるヒトＩｇＧの第二のＣＨ３領域を含む免疫グロブリン定常領域を含む第二のポリペプチドであって、当該第二のＣＨ３領域は、プロテインＡに対する当該第二のＣＨ３領域の結合を低下させる、または抹消させる改変を含むもの、を含んでもよい。一部の実施形態では、改変は、ＩＭＧＴエクソンナンバリングシステムの（ａ）９５Ｒ、ならびに（ｂ）９５Ｒおよび９６Ｆ、またはＥＵナンバリングシステムの（ａ’）４３５Ｒ、ならびに（ｂ’）４３５Ｒおよび４３６Ｆ、からなる群から選択される。一部の実施形態では、第二のＣＨ３領域はさらに、ＩＭＧＴエクソンナンバリングシステムで、１６Ｅ、１８Ｍ、４４Ｓ、５２Ｎ、５７Ｍおよび８２Ｉ、またはＥＵナンバリングシステムで３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍおよび４２２Ｉからなる群から選択される改変を１～５個含む。
ａ．Ｎ末端からＣ末端に向かって、第一のエピトープに選択的に結合する第一のエピトープ結合領域、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４から選択されるヒトＩｇＧの第一のＣＨ３領域を含む免疫グロブリン定常領域を含む第一のポリペプチドであって、当該第一のＣＨ３領域は、プロテインＡに結合するもの、および
ｂ．Ｎ末端からＣ末端に向かって、第二のエピトープに選択的に結合する第二のエピトープ結合領域、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４から選択されるヒトＩｇＧの第二のＣＨ３領域を含む免疫グロブリン定常領域を含む第二のポリペプチドであって、当該第二のＣＨ３領域は、プロテインＡに対する当該第二のＣＨ３領域の結合を低下させる、または抹消させる改変を含むもの、を含んでもよい。一部の実施形態では、改変は、ＩＭＧＴエクソンナンバリングシステムの（ａ）９５Ｒ、ならびに（ｂ）９５Ｒおよび９６Ｆ、またはＥＵナンバリングシステムの（ａ’）４３５Ｒ、ならびに（ｂ’）４３５Ｒおよび４３６Ｆ、からなる群から選択される。一部の実施形態では、第二のＣＨ３領域はさらに、ＩＭＧＴエクソンナンバリングシステムで、１６Ｅ、１８Ｍ、４４Ｓ、５２Ｎ、５７Ｍおよび８２Ｉ、またはＥＵナンバリングシステムで３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍおよび４２２Ｉからなる群から選択される改変を１～５個含む。
【0205】
一つの実施形態では、方法および組成物を使用して、二特異性結合タンパク質が作製される。この実施形態では、ＣＨ領域に融合される第一のＶＨ、およびＣＨ領域に融合される第二のＶＨはそれぞれ独立して、同アイソタイプのヒトＩｇＧ配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４）とともにインフレームでクローニングされる。第一のＶＨは、第一のｐＭＨＣ複合体に特異的に結合し、第二のＶＨは、第二のｐＭＨＣ複合体に特異的に結合する。第一および第二のエピトープは、異なるｐＭＨＣ複合体上にあってもよく、または同じｐＭＨＣ複合体上にあってもよい。
【0206】
一つの実施形態では、第一のＶＨに融合されるＣＨ領域のＩｇＧアイソタイプ、および第二のＶＨに融合されるＣＨ領域のＩｇＧアイソタイプは、同じアイソタイプであるが、一つのＩｇＧアイソタイプは、少なくとも一つのアミノ酸置換を含むという点で異なっている。一つの実施形態では、当該少なくとも一つのアミノ酸置換によって、当該置換を担持する重鎖は、当該置換を欠く重鎖と比較して、プロテインＡに結合することができなくなるか、または実質的に結合することができなくなる。
【0207】
一つの実施形態では、第一のＣＨ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４から選択されるヒトＩｇＧの第一のＣＨ３ドメインを含み、第二のＣＨ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４から選択されるヒトＩｇＧの第二のＣＨ３ドメインを含み、この場合において当該第二のＣＨ３ドメインは、プロテインＡへの当該第二のＣＨ３ドメインの結合を低下させる、または消滅させる改変を含む（米国特許第８，５８６，７１３Ｂ２号を参照のこと。当該特許は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。
【0208】
一つの実施形態では、第二のＣＨ３ドメインは、ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされた４３５Ｒ改変を含む。別の実施形態では、第二のＣＨ３ドメインは、ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされた４３６Ｆ改変をさらに含む。
【0209】
一つの実施形態では、第二のＣＨ３ドメインは、ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされたＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉからなる群から選択される改変を含むヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインである。
【0210】
一つの実施形態では、第二のＣＨ３ドメインは、ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされたＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉからなる群から選択される改変を含むヒトＩｇＧ２のＣＨ３ドメインである。
【0211】
一つの実施形態では、第二のＣＨ３ドメインは、ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされたＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉからなる群から選択される改変を含むヒトＩｇＧ４のＣＨ３ドメインである。
【0212】
一つの実施形態では、結合タンパク質は、本明細書に列挙される改変を一つまたは複数有するＣＨ領域を含み、この場合において当該結合タンパク質の定常領域は、ヒトにおいて非免疫原性であるか、または実質的に非免疫原性である。個別の実施形態では、ＣＨ領域は、ヒトの免疫原性エピトープが存在しないアミノ酸配列を含む。別の個別の実施形態では、結合タンパク質は、野生型ヒト重鎖中には存在しないＣＨ領域を含み、および当該ＣＨ領域は、Ｔ細胞エピトープを生成する配列を含まない。
【0213】
一つの実施形態では、Ｆｃドメインを改変して、Ｆｃ受容体結合を変化させてもよく、その結果として、エフェクター機能が影響を受ける。Ｆｃドメインを含む操作された重鎖定常領域（ＣＨ）は、キメラであってもよい。したがってキメラＣＨ領域は、複数の免疫グロブリンアイソタイプから誘導されたＣＨドメインを組み合わせている。例えば、キメラＣＨ領域は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４分子から誘導されたＣＨ３ドメインの一部またはすべてと組み合わせられた、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４分子から誘導されたＣＨ２ドメインの一部またはすべてを含む。キメラＣＨ領域は、キメラヒンジ領域も含有し得る。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域から誘導された「下部ヒンジ」配列（ＥＵナンバリングに従う２２８位～２３６位のアミノ酸残基）と組み合わされた、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域から誘導された「上部ヒンジ」アミノ酸配列（ＥＵナンバリングに従う２１６位～２２７位のアミノ酸残基）を含んでもよい。一つの実施形態では、キメラヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４上部ヒンジから誘導されたアミノ酸残基と、ヒトＩｇＧ２下部ヒンジから誘導されたアミノ酸残基とを含む。
【0214】
特定の療法に関し、Ｆｃドメインは、Ｆｃ含有タンパク質（例えば、抗体）の所望の薬物動態特性に影響を与えることなく、正常なＦｃエフェクター機能のうちのすべて、一部を活性化するように、あるいはいずれをも活性化しないように作製され得る。キメラＣＨ領域を含み、エフェクター機能が改変されたタンパク質の例については、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，３５９，４３７号を参照のこと。一部の実施形態では、ｐＭＨＣ－結合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＣＨ１ドメイン、キメラヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む重鎖定常（ＣＨ）領域を含む組み換えポリペプチドを含み、この場合において、（ａ）当該ＣＨ１ドメインは、２１２位～２１５位（ＥＵナンバリング）にＤＫＫＶまたはＤＫＲＶのアミノ酸配列を含み、（ｂ）当該キメラヒンジは、２１６位～２２７位（ＥＵナンバリング）にヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４の上部ヒンジアミノ酸配列、および２２８位～２３６位（ＥＵナンバリング）にＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号２９）のヒトＩｇＧ２の下部ヒンジアミノ酸配列を含み、（ｃ）当該ＣＨ２ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む２３７位～３４０位（ＥＵナンバリング）にヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのアミノ酸配列を含み、および（ｄ）当該ＣＨ３ドメインは、３４１位～４４７位（ＥＵナンバリング）にヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４のＣＨ３ドメイン配列を含む。
【0215】
一部の実施形態では、二特異性抗体は、第一のＶＨおよび第二のＶＨを有してもよく、それぞれが、自身の同系ＶＬドメインと共通の軽鎖を有する。
【0216】
内因性ペプチドに対する寛容の破壊
抗原性ｐＭＨＣを用いた非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット）の免疫化による、特異的ｐＭＨＣ－結合タンパク質の獲得は、当該非ヒト動物の免疫系が、非自己（すなわち外因性）として対象ｐＭＨＣ複合体を認識することが可能となる、非ヒト動物中の内因性タンパク質と提示される異種タンパク質の間の配列の相違に依存する。自己ｐＭＨＣと高度な相同性を有するｐＭＨＣに対する抗体の生成は、自己ｐＭＨＣに対する免疫寛容によって、困難な課題となる可能性がある。対象ペプチドと相同な自己ペプチドに対する寛容を破壊する方法は、当業者に公知である。例えば、米国特許出願公開２０１７０３３２６１０を参照のこと。当該文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、内因性ペプチドに対する寛容を破壊する方法は、本明細書に記載の非ヒト動物を改変して、対象ペプチドと高度な相同性を有する自己ペプチドの削除、例えばノックアウト変異を含ませることを含む。
抗原性ｐＭＨＣを用いた非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット）の免疫化による、特異的ｐＭＨＣ－結合タンパク質の獲得は、当該非ヒト動物の免疫系が、非自己（すなわち外因性）として対象ｐＭＨＣ複合体を認識することが可能となる、非ヒト動物中の内因性タンパク質と提示される異種タンパク質の間の配列の相違に依存する。自己ｐＭＨＣと高度な相同性を有するｐＭＨＣに対する抗体の生成は、自己ｐＭＨＣに対する免疫寛容によって、困難な課題となる可能性がある。対象ペプチドと相同な自己ペプチドに対する寛容を破壊する方法は、当業者に公知である。例えば、米国特許出願公開２０１７０３３２６１０を参照のこと。当該文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、内因性ペプチドに対する寛容を破壊する方法は、本明細書に記載の非ヒト動物を改変して、対象ペプチドと高度な相同性を有する自己ペプチドの削除、例えばノックアウト変異を含ませることを含む。
【0217】
医薬組成物
特定の実施形態では、本明細書において、薬学的に許容可能な担体と共に製剤化された少なくとも一つのｐＭＨＣ－結合タンパク質を含有する組成物、例えば医薬組成物が提供される。
特定の実施形態では、本明細書において、薬学的に許容可能な担体と共に製剤化された少なくとも一つのｐＭＨＣ－結合タンパク質を含有する組成物、例えば医薬組成物が提供される。
【0218】
本明細書に提供される医薬組成物は、以下に対して適合された形態を含む、固形形態または液体形態での投与に対し、特に製剤化されてもよい：（１）経口投与、例えば、水薬（水性もしくは非水性の溶液または懸濁液）、錠剤、例えば口腔吸収、舌下吸収および全身吸収を目的とした錠剤、丸薬、粉末、顆粒、舌への適用のためのペースト、または（２）例えば滅菌溶液、または滅菌懸濁液、または滅菌徐放製剤として例えば皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、または硬膜外注射による非経口投与。
【0219】
一部の実施形態では、非経口投与に適した本明細書において提供される医薬組成物は、一つまたは複数の薬学的に許容可能な滅菌等張性の水溶液もしくは非水溶液、分散液、懸濁液もしくはエマルション、または使用直前に滅菌注射溶液または滅菌注射分散液へと再構成され得る滅菌粉末と組み合わされた、本発明の特定の実施形態の一つまたは複数の治療剤を含み、それらは糖類、アルコール類、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、意図されるレシピエントの血液と製剤を等張にさせる溶質、または懸濁剤もしくは増粘剤を含有してもよい。
【0220】
本明細書に提供される医薬組成物に採用され得る適切な水性担体および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば限定されないが、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物、例えばオリーブオイルなどの植物油、ならびに例えばオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル類が挙げられる。例えばレシチンなどのコーティング物質の使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズを維持することにより、および界面活性剤の使用により、適切な流動性が維持され得る。
【0221】
特定の実施形態では、組成物は、所望の投与に適したｗ／ｖを生じさせる濃度で、ｐＭＨＣ－結合タンパク質を含む。ｐＭＨＣ－結合タンパク質は、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも３０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも３５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも４０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも４５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも６０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも６５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも７０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも７５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも８０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも８５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも９０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも９５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１
１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１１５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１２０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１３０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１３５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１４０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２５０ ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも３００ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在してもよい。一部の実施形態では、ｐＭＨＣ－結合タンパク質は、１ｍｇ／ｍＬ～３００ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在してもよい。一部の実施形態では、ｐＭＨＣ－結合タンパク質は、５ｍｇ／ｍＬ～２５０ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在してもよい。一部の実施形態では、ｐＭＨＣ－結合タンパク質は、１０ｍｇ／ｍＬ～２００ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在してもよい。一部の実施形態では、ｐＭＨＣ－結合タンパク質は、１５ｍｇ／ｍＬ～１５０ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在してもよい。一部の実施形態では、ｐＭＨＣ－結合タンパク質は、２０ｍｇ／ｍＬ～１４０ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在してもよい。一部の実施形態では、ｐＭＨＣ－結合タンパク質は、２５ｍｇ／ｍＬ～１３５ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在してもよい。一部の実施形態では、ｐＭＨＣ－結合タンパク質は、３０ｍｇ／ｍＬ～１３０ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在してもよい。一部の実施形態では、ｐＭＨＣ－結合タンパク質は、３５ｍｇ／ｍＬ～１２５ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在してもよい。一部の実施形態では、ｐＭＨＣ－結合タンパク質は、４０ｍｇ／ｍＬ～１２０ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在してもよい。一部の実施形態では、ｐＭＨＣ－結合タンパク質は、４５ｍｇ／ｍＬ～１１５ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在してもよい。一部の実施形態では、ｐＭＨＣ－結合タンパク質は、５０ｍｇ／ｍＬ～１１０ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在してもよい。
１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１１５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１２０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１３０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１３５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１４０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２５０ ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも３００ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在してもよい。一部の実施形態では、ｐＭＨＣ－結合タンパク質は、１ｍｇ／ｍＬ～３００ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在してもよい。一部の実施形態では、ｐＭＨＣ－結合タンパク質は、５ｍｇ／ｍＬ～２５０ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在してもよい。一部の実施形態では、ｐＭＨＣ－結合タンパク質は、１０ｍｇ／ｍＬ～２００ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在してもよい。一部の実施形態では、ｐＭＨＣ－結合タンパク質は、１５ｍｇ／ｍＬ～１５０ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在してもよい。一部の実施形態では、ｐＭＨＣ－結合タンパク質は、２０ｍｇ／ｍＬ～１４０ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在してもよい。一部の実施形態では、ｐＭＨＣ－結合タンパク質は、２５ｍｇ／ｍＬ～１３５ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在してもよい。一部の実施形態では、ｐＭＨＣ－結合タンパク質は、３０ｍｇ／ｍＬ～１３０ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在してもよい。一部の実施形態では、ｐＭＨＣ－結合タンパク質は、３５ｍｇ／ｍＬ～１２５ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在してもよい。一部の実施形態では、ｐＭＨＣ－結合タンパク質は、４０ｍｇ／ｍＬ～１２０ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在してもよい。一部の実施形態では、ｐＭＨＣ－結合タンパク質は、４５ｍｇ／ｍＬ～１１５ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在してもよい。一部の実施形態では、ｐＭＨＣ－結合タンパク質は、５０ｍｇ／ｍＬ～１１０ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在してもよい。
【0222】
一部の実施形態では、治療される特定の症状に必要な一つまたは複数の活性化合物、典型的には、互いに有害な影響を与えない補完的な活性を有する化合物を一つまたは複数含む。そのような追加の活性化合物は、意図される目的に対し有効な量で併用されて適切に存在する。
一部の実施形態では、組成物は、ｐＭＨＣ－結合タンパク質と、限定されないが緩衝剤、糖類、塩類、界面活性剤、可溶化剤、ポリオール類、希釈剤、結合剤、安定剤、塩類、親油性溶媒、アミノ酸、キレーター、保存剤などをはじめとする任意の生理学的に許容可能な担体、賦形剤または安定剤を、所望の最終濃度で、凍結乾燥組成物の形態で、または水性溶液の形態で、混合させることにより調製される（Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１２ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌ．Ｂｒｕｎｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．ａｎｄ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ
ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９９９））。許容可能な担体、賦形剤または安定剤は、採用される用量および濃度でレシピエントに対し非毒性であり、例えばヒスチジン、リン酸塩、クエン酸塩、グリシン、酢酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンをはじめとする抗酸化剤；保存剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム；塩化ベンズエトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；例えばメチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（１０～１５残基未満）ポリペプチド；例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；例えばポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；トレハロース、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖、二糖および他の炭水化物；例えばＥＤＴＡなどのキレート剤；例えばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類；例えばナトリウムなどの塩形成カウンターイオン；金属錯体（例えばＺｎ－タンパク質錯体）；および／または例えばＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリソルベート８０、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
一部の実施形態では、組成物は、ｐＭＨＣ－結合タンパク質と、限定されないが緩衝剤、糖類、塩類、界面活性剤、可溶化剤、ポリオール類、希釈剤、結合剤、安定剤、塩類、親油性溶媒、アミノ酸、キレーター、保存剤などをはじめとする任意の生理学的に許容可能な担体、賦形剤または安定剤を、所望の最終濃度で、凍結乾燥組成物の形態で、または水性溶液の形態で、混合させることにより調製される（Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１２ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌ．Ｂｒｕｎｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．ａｎｄ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ
ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９９９））。許容可能な担体、賦形剤または安定剤は、採用される用量および濃度でレシピエントに対し非毒性であり、例えばヒスチジン、リン酸塩、クエン酸塩、グリシン、酢酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンをはじめとする抗酸化剤；保存剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム；塩化ベンズエトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；例えばメチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（１０～１５残基未満）ポリペプチド；例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；例えばポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；トレハロース、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖、二糖および他の炭水化物；例えばＥＤＴＡなどのキレート剤；例えばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類；例えばナトリウムなどの塩形成カウンターイオン；金属錯体（例えばＺｎ－タンパク質錯体）；および／または例えばＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリソルベート８０、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【0223】
一部の実施形態では、緩衝剤は、ヒスチジン、クエン酸塩、リン酸塩、グリシンまたは酢酸塩である。糖賦形剤は、トレハロース、スクロース、マンニトール、マルトースまたはラフィノースであってもよい。界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート８０、またはＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８であってもよい。塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、またはＣａＣｌ２であってもよい。
【0224】
一部の実施形態では、組成物は、ｐＨ制御の改善をもたらすための緩衝剤またはｐＨ調整剤を含む。そうした組成物は、約３．０～約９．０、約４．０～約８．０、約５．０～約８．０、約５．０～約７．０、約５．０～約６．５、約５．５～約８．０、約５．５～約７．０、または約５．５～約６．５のｐＨを有してもよい。さらなる実施形態では、そうした組成物は、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、または約９．０のｐＨを有する。個別の実施形態では、組成物は約６．０のｐＨを有する。
【0225】
一部の実施形態では、組成物は、ｐＨ制御の改善をもたらすための緩衝剤またはｐＨ調整剤を含む。そうした組成物は、３．０～９．０、４．０～８．０、５．０～８．０、５．０～７．０、５．０～６．５、５．５～８．０、５．５～７．０、または５．５～６．５のｐＨを有してもよい。さらなる実施形態では、そうした組成物は、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．５、８．０、８．５、または９．０のｐＨを有する。個別の実施形態では、組成物は、６．０のｐＨを有する。
【0226】
当業者であれば、組成物のｐＨは概して、当該組成物中で使用される特定のｐＭＨＣ－結合タンパク質の等電点と等しくはないことを理解する。典型的には、緩衝剤は、有機もしくは無機の酸または塩基から調製される塩である。代表的な緩衝剤としては限定されないが、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、またはフタル酸の塩などの有機酸塩、トリス、トロメタミン塩酸塩、またはリン酸塩の緩衝剤が挙げられる。加えて、アミノ酸成分も、緩衝能力において機能し得る。組成物中で緩衝剤として利用され得る代表的なアミノ酸成分としては限定されないが、グリシンおよびヒスチジンが挙げられる。特定の実施形態では、緩衝剤は、ヒスチジン、クエン酸塩、リン酸塩、グリシン、および酢酸塩から選択される。個別の実施形態では、緩衝剤は、ヒスチジンである。別の個別の実施形態では、緩衝剤は、クエン酸塩である。さらに別の個別の実施形態では、緩衝剤は、グリシンである。緩衝剤の純度は、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％でなければならない。本明細書において使用される場合、ヒスチジンおよびグリシンの文脈における「純度」という用語は、当分野において理解されるヒスチジンまたはグリシンの化学的純度を指し、例えば、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ，１３ｔｈ ｅｄ．，Ｏ’Ｎｅｉｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．，２００１）に記載されている。当該文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。
【0227】
特定の実施形態では、組成物は、緩衝剤としてヒスチジンを含む。特定の実施形態では、ヒスチジンは、少なくとも約１ｍＭ、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、少なくとも約２０ｍＭ、少なくとも約３０ｍＭ、少なくとも約４０ｍＭ、少なくとも約５０ｍＭ、少なくとも約７５ｍＭ、少なくとも約１００ｍＭ、少なくとも約１５０ｍＭ、または少なくとも約２００ｍＭのヒスチジン濃度で、組成物中に存在する。別の実施形態では、組成物は、約１ｍＭ～約２００ｍＭ、約１ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、約１ｍＭ～約７５ｍＭ、約１０ｍＭ～約２００ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、約１０ｍＭ～約７５ｍＭ、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、約２０ｍＭ～約７５ｍＭ、約２０ｍＭ～約５０ｍＭ、約２０ｍＭ～約４０ｍＭ、または約２０ｍＭ～約３０ｍＭのヒスチジンを含む。さらなる実施形態では、組成物は、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、または約２００ｍＭのヒスチジンを含む。個別の実施形態では、組成物は、約１０ｍＭまたは約２５ｍＭのヒスチジンを含んでもよく、またはヒスチジンを含まなくてもよい。
【0228】
特定の実施形態では、組成物は、緩衝剤としてヒスチジンを含む。特定の実施形態では、ヒスチジンは、少なくとも１ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも３０ｍＭ、少なくとも４０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも７５ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも１５０ｍＭ、または少なくとも２００ｍＭのヒスチジン濃度で、組成物中に存在する。別の実施形態では、組成物は、１ｍＭ～２００ｍＭ、１ｍＭ～１５０ｍＭ、１ｍＭ～１００ｍＭ、１ｍＭ～７５ｍＭ、１０ｍＭ～２００ｍＭ、１０ｍＭ～１５０ｍＭ、１０ｍＭ～１００ｍＭ、１０ｍＭ～７５ｍＭ、１０ｍＭ～５０ｍＭ、１０ｍＭ～４０ｍＭ、１０ｍＭ～３０ｍＭ、２０ｍＭ～７５ｍＭ、２０ｍＭ～５０ｍＭ、２０ｍＭ～４０ｍＭ、または２０ｍＭ～３０ｍＭのヒスチジンを含む。さらなる実施形態では、組成物は、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、または２００ｍＭのヒスチジンを含む。個別の実施形態では、組成物は、１０ｍＭまたは２５ｍＭのヒスチジンを含んでもよく、またはヒスチジンを含まなくてもよい。
【0229】
一部の実施形態では、組成物は、炭水化物賦形剤を含む。炭水化物賦形剤は、例えば、粘性強化剤、安定剤、増量剤、可溶化剤、および／またはこれに類するものとして作用し得る。炭水化物賦形剤は概して、体積または重量で約１％～約９９％、例えば、約０．１％～約２０％、約０．１％～約１５％、約０．１％～約５％、約１％～約２０％、約５％～約１５％、約８％～約１０％、約１０％～約１５％、約１５％～約２０％、０．１％～２０％、５％～１５％、８％～１０％、１０％～１５％、１５％～２０％、約０．１％～約５％、約５％～約１０％、または約１５％～約２０％で存在する。さらに他の個別の実施形態では、炭水化物賦形剤は、１％、または１．５％、または２％、または２．５％、または３％、または４％、または５％、または１０％、または１５％、または２０％で存在する。
【0230】
一部の実施形態では、組成物は、炭水化物賦形剤を含む。炭水化物賦形剤は、例えば、粘性強化剤、安定剤、増量剤、可溶化剤、および／またはこれに類するものとして作用し得る。炭水化物賦形剤は概して、体積または重量で１％～９９％、例えば、０．１％～２０％、０．１％～１５％、０．１％～５％、１％～２０％、５％～１５％、８％～１０％、１０％～１５％、１５％～２０％、０．１％～２０％、５％～１５％、８％～１０％、１０％～１５％、１５％～２０％、０．１％～５％、５％～１０％、または１５％～２０％で存在する。さらに他の個別の実施形態では、炭水化物賦形剤は、１％、または１．５％、または２％、または２．５％、または３％、または４％、または５％、または１０％、または１５％、または２０％で存在する。
【0231】
一部の実施形態では、組成物は、炭水化物賦形剤を含む。組成物中での使用に適した炭水化物賦形剤としては限定されないが、例えばフルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ－マンノース、ソルボースなどの単糖類；例えばラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなどの二糖類；例えばラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなどの多糖類；および例えばマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）などのアルジトールが挙げられる。特定の実施形態では、本明細書において提供される組成物中で使用するための炭水化物賦形剤は、スクロース、トレハロース、ラクトース、マンニトール、およびラフィノースから選択される。個別の実施形態では、炭水化物賦形剤は、トレハロースである。別の個別の実施形態では、炭水化物賦形剤は、マンニトールである。また別の個別の実施形態では、炭水化物賦形剤は、スクロースである。さらに別の個別の実施形態では、炭水化物賦形剤は、ラフィノースである。炭水化物賦形剤の純度は、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％でなければならない。
【0232】
一部の実施形態では、組成物は、トレハロースを含む。特定の実施形態では、組成物は、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約４％、少なくとも約８％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％のトレハロースを含む。別の実施形態では、組成物は、約１％～約４０％、約１％～約３０％、約１％～約２０％、約２％～約４０％、約２％～約３０％、約２％～約２０％、約４％～約４０％、約４％～約３０％、または約４％～約２０％のトレハロースを含む。さらなる実施形態では、組成物は、約１％、約２％、約４％、約６％、約８％、約１５％、約２０％、約３０％、または約４０％のトレハロースを含む。個別の実施形態では、組成物は、約４％、約６％、または約１５％のトレハロースを含む。
【0233】
一部の実施形態では、組成物は、トレハロースを含む。特定の実施形態では、組成物は、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも４％、少なくとも８％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、または少なくとも４０％のトレハロースを含む。別の実施形態では、組成物は、１％～４０％、１％～３０％、１％～２０％、２％～４０％、２％～３０％、２％～２０％、４％～４０％、４％～３０％、または４％～２０％のトレハロースを含む。さらなる実施形態では、組成物は、１％、２％、４％、６％、８％、１５％、２０％、３０％、または４０％のトレハロースを含む。個別の実施形態では、組成物は、４％、６％、または１５％のトレハロースを含む。
【0234】
特定の実施形態では、組成物は、賦形剤を含む。個別の実施形態では、組成物は、糖、塩、界面活性剤、アミノ酸、ポリオール、キレート剤、乳化剤および保存剤から選択される少なくとも一つの賦形剤を含む。特定の実施形態では、組成物は、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、およびＭｇＣｌ２から選択される塩などの塩を含む。個別の実施形態では、組成物は、ＮａＣｌを含む。
【0235】
一部の実施形態では、組成物は、例えば、リシン、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、またはアミノ酸塩などのアミノ酸を含む。組成物は、少なくとも約１ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、少なくとも約２５ｍＭ、少なくとも約５０ｍＭ、少なくとも約１００ｍＭ、少なくとも約１５０ｍＭ、少なくとも約２００ｍＭ、少なくとも約２５０ｍＭ、少なくとも約３００ｍＭ、少なくとも約３５０ｍＭ、または少なくとも約４００ｍＭのアミノ酸を含んでもよい。別の実施形態では、組成物は、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約２５ｍＭ～約２５０ｍＭ、約２５ｍＭ～約３００ｍＭ、約２５ｍＭ～約３５０ｍＭ、約２５ｍＭ～約４００ｍＭ、約５０ｍＭ～約２５０ｍＭ、約５０ｍＭ～約３００ｍＭ、約５０ｍＭ～約３５０ｍＭ、約５０ｍＭ～約４００ｍＭ、約１００ｍＭ～約２５０ｍＭ、約１００ｍＭ～約３００ｍＭ、約１００ｍＭ～約４００ｍＭ、約１５０ｍＭ～約２５０ｍＭ、約１５０ｍＭ～約３００ｍＭ、または約１５０ｍＭ～約４００ｍＭのアミノ酸を含んでもよい。さらなる実施形態では、組成物は、約１ｍＭ、１．６ｍＭ、２５ｍＭ、約５０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、または約４００ｍＭのアミノ酸を含む。
【0236】
一部の実施形態では、組成物は、例えば、リシン、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、またはアミノ酸塩などのアミノ酸を含む。組成物は、少なくとも１ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも２５ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも１５０ｍＭ、少なくとも２００ｍＭ、少なくとも２５０ｍＭ、少なくとも３００ｍＭ、少なくとも３５０ｍＭ、または少なくとも４００ｍＭのアミノ酸を含んでもよい。別の実施形態では、組成物は、１ｍＭ～１００ｍＭ、１０ｍＭ～１５０ｍＭ、２５ｍＭ～２５０ｍＭ、２５ｍＭ～３００ｍＭ、２５ｍＭ～３５０ｍＭ、２５ｍＭ～４００ｍＭ、５０ｍＭ～２５０ｍＭ、５０ｍＭ～３００ｍＭ、５０ｍＭ～３５０ｍＭ、５０ｍＭ～４００ｍＭ、１００ｍＭ～２５０ｍＭ、１００ｍＭ～３００ｍＭ、１００ｍＭ～４００ｍＭ、１５０ｍＭ～２５０ｍＭ、１５０ｍＭ～３００ｍＭ、または１５０ｍＭ～４００ｍＭのアミノ酸を含んでもよい。さらなる実施形態では、組成物は、１ｍＭ、１．６ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、または４００ｍＭのアミノ酸を含む。
【0237】
一部の実施形態では、組成物は、界面活性剤を含む。「界面活性剤」という用語は、本明細書で使用される場合、両親媒性の構造を有する有機物質を指す。すなわち、界面活性剤は、対立する溶解性傾向の群から構成され、典型的には、油溶性の炭化水素鎖と水溶性のイオン基から構成される。界面活性剤は、表面活性部分の荷電に応じて、陰イオン性、陽イオン性、および非イオン性の界面活性剤に分類することができる。界面活性剤は、多くの場合、生体材料の様々な医薬組成物および調製物のための湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、および分散剤として使用される。ポリソルベート類（例えばポリソルベート２０、または８０）；ポロキサマー類（例えばポロキサマー１８８）；トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）；ナトリウムオクチルグリコシド；ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、リノレイルスルホベタイン、またはステアリルスルホベタイン；ラウリルサルコシン、ミリスチルサルコシン、リノレイルサルコシン、またはステアリルサルコシン；リノレイルベタイン、ミリスチルベタイン、またはセチルベタイン；ラウロアミドプロピルベタイン、コカミドプロピルベタイン、リノレアミドプロピルベタイン、ミリストアミドプロピルベタイン、パルミドプロピルベタイン、またはイソステアロアミドプロピルベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル）；ミリストアミドプロピルジメチルアミン、パルミドプロピルジメチルアミン、またはイソステアロアミドプロピルジメチルアミン；ナトリウムメチルココイルタウレート、または二ナトリウムメチルオレイルタウレート；ならびにＭＯＮＡＱＵＡ（商標）シリーズ（Ｍｏｎａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ニュージャージー州パターソン）、ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、およびエチレンとプロピレングリコールのコポリマー（例えばＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）ＰＦ６８など）といった薬学的に許容可能な界面活性剤を任意で組成物に添加して、凝集を低下させることができる。特定の実施形態では、組成物は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、またはポリソルベート８０を含む。界面活性剤は、ポンプまたはプラスチック容器を使用して組成物が投与される場合に特に有用である。薬学的に許容可能な界面活性剤が存在することで、タンパク質の凝集傾向が軽減する。組成物は、約０．００１％～約１％、または約０．００１％～約０．１％、または約０．０１％～約０．１％の範囲の濃度のポリソルベートを含んでもよい。他の個別の実施形態では、組成物は、０．００１％、または０．００２％、または０．００３％、または０．００４％、または０．００５％、または０．００６％、または０．００７％、または０．００８％、または０．００９％、または０．０１％、または０．０１５％、または０．０２％の濃度のポリソルベートを含む。組成物は、０．００１％～１％、または０．００１％～０．１％、または０．０１％～０．１％の範囲の濃度のポリソルベートを含んでもよい。他の個別の実施形態では、組成物は、０．００１％、または０．００２％、または０．００３％、または０．００４％、または０．００５％、または０．００６％、または０．００７％、または０．００８％、または０．００９％、または０．０１％、または０．０１５％、または０．０２％の濃度のポリソルベートを含む。
【0238】
一部の実施形態では、組成物は、限定されないが、希釈剤、結合剤、安定剤、親油性溶媒、保存剤、アジュバント等をはじめとする他の賦形剤および／または添加剤を含む。薬学的に許容可能な賦形剤および／または添加剤は、本明細書に提供される組成物において使用されてもよい。例えば薬学的に許容可能なキレーター（例えば限定されないが、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡまたはＥＧＴＡ）などの普遍的に使用されている賦形剤／添加剤を任意で組成物に添加して、凝集を低下させることができる。これらの添加剤は、ポンプまたはプラスチック容器を使用して組成物が投与される場合に特に有用である。
【0239】
一部の実施形態では、組成物は、保存剤を含む。例えばフェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クレゾール、ｏ－クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、亜硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム（例えば限定されないが、六水和物）、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンズエトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、およびチメロサール、またはそれらの混合物などの保存剤を任意で、例えば０．００１％～５％またはその間の任意の範囲もしくは値などの任意の適切な濃度で組成物に添加することができる。組成物中で使用される保存剤の濃度は、微生物効果を生じさせるのに充分な濃度である。当該濃度は、選択された保存剤に依存し、当業者によって容易に決定される。
【0240】
一部の実施形態では、組成物は、ヒト血液と等張であり、この場合において当該組成物は、ヒト血液と本質的に同じ浸透圧を有する。そうした等張組成物は概して、２５０ｍＯＳｍ～３５０ｍＯＳｍの浸透圧を有する。等張性は、例えば蒸気圧または氷凍結型浸透圧計を使用して測定することができる。組成物の張性は、張性調節剤の使用によって調整される。「張性調節剤」は、組成物の等張性を提供するために、組成物に添加することができる薬学的に許容可能な不活性物質である。本明細書において提供される組成物に適した張性調節剤としては限定されないが、糖、塩およびアミノ酸が挙げられる。
【0241】
特定の実施形態では、組成物は、エンドトキシンおよび／または関連発熱性物質を実質的に含まない、発熱物質フリーの組成物である。エンドトキシンには、微生物内に封じ込められ、当該微生物が破壊または死亡した場合にのみ放出される毒素が含まれる。発熱性物質には、細菌および他の微生物の外膜に由来する発熱誘導性で耐熱性の物質も含まれる。これらの物質は両方とも、ヒトに投与されたときに発熱、低血圧、およびショックを生じさせる可能性がある。有害作用の可能性があるため、少量のエンドトキシンであっても静脈内投与される薬剤溶液からは取り除かれなければならない。食品医薬品局（ＦＤＡ）は、静脈内薬剤投与に対し、分割されていない１時間中、体重１キログラム当たり、５エンドトキシン単位（ＥＵ）の上限を定めている（Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｆｏｒｕｍ ２６（１）：２２３（２０００））。治療用タンパク質が、体重１キログラム当たり数百～数千ミリグラムの量で投与される場合、対象タンパク質（例えば抗体）の場合も同様であり得るが、ごく微量でも有害で危険なエンドトキシンは取り除かれなければならない。一部の実施形態では、組成物中のエンドトキシンおよび発熱物質レベルは、１０ＥＵｍｇ未満、または５ＥＵｍｇ未満、または１ＥＵｍｇ未満、または０．１ＥＵｍｇ未満、または０．０１ＥＵｍｇ未満、または０．００１ＥＵｍｇ未満である。
【0242】
一部の実施形態では、インビボ投与に使用される場合、医薬組成物は滅菌されていなければならない。組成物は、滅菌ろ過、放射線照射をはじめとする様々な滅菌法により滅菌されてもよい。特定の実施形態では、組成物は、前もって滅菌された０．２２ミクロンのフィルターでろ過滅菌される。注射用の滅菌組成物は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”，２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，（２００５）に記載される従来的な薬学的業務に従い、製剤化され得る。当該文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。
【0243】
本明細書に開示されるものなどのｐＭＨＣ－結合タンパク質を含む組成物は、通常、凍結乾燥型で、または溶液中で保存される。ｐＭＨＣ－結合タンパク質を含む滅菌組成物は、例えば皮下注射針により穿刺可能なストッパーなど、組成物の回収が可能なアダプターを有する例えば静脈溶液バッグまたはバイアルなど、滅菌アクセスポートを有する容器へと入れられる。特定の実施形態では、組成物は、予め充填されたシリンジとして提供される。
【0244】
特定の実施形態では、組成物は、凍結乾燥製剤である。「凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄまたはｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｉｅｄ）」という用語は、例えば凍結乾燥などの乾燥手順を受けた物質の状態を含み、少なくとも５０％の水分が取り除かれている。
【0245】
選択された投与経路に関わらず、適切な水和形態で使用され得る本明細書に提供される剤、および／または本明細書に提供される医薬組成物は、当業者に公知の従来的方法によって薬学的に許容可能な剤形に製剤化される。
【0246】
本発明は、多数の実施形態を参照して具体的に示され、記載されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に開示の様々な実施形態に対して、形式および詳細が変更され得、本明細書に開示の様々な実施形態は、特許請求の範囲を限定するように機能することを意図しないことを当業者は理解するであろう。
【実施例0247】
以下の実施例は、説明目的のみに提供され、本発明の範囲を制限することを意図していない。
実施例１
実施例１
【0248】
交配技術およびＥＳ細胞における連続相同組み換えのいずれか、または両方を使用して、（１）ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ Ｉ座位、ヒトもしくはヒト化β２マイクログロブリン座位、および／またはヒトもしくはヒト化ＭＨＣ ＩＩ座位（例えば、当該ヒト化座位の非限定的な例に関しては図１～２を参照）、ならびに（２）ヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または軽鎖座位、を含むマウスが生成される（例えば、Ｍａｃｄｏｎａｌｄ
ｅｔ ａｌ，（２０１４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１１ ：５１４７－５２を参照のこと。当該文献は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。これらのマウスは、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ Ｉ／β２マイクログロブリン分子、および／またはヒトもしくはヒト化ＭＨＣ ＩＩ分子を発現し、これらに対し寛容である。マウスは、マウスに対して抗原性のあるペプチド、および当該マウスが寛容なヒトまたはヒト化ＭＨＣを含む対象ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体で免疫化される。マウスは追加的に、および任意で、対象ｐＭＨＣ複合体でブーストされ、このブースターは任意でさらにヘルパーＴ細胞エピトープに連結される。ヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または軽鎖座位から発現されたヒトまたはヒト化抗体は、免疫化マウスの血清から単離され、ｐＭＨＣ複合体への結合特異性に関して検証される。
ｅｔ ａｌ，（２０１４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１１ ：５１４７－５２を参照のこと。当該文献は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。これらのマウスは、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ Ｉ／β２マイクログロブリン分子、および／またはヒトもしくはヒト化ＭＨＣ ＩＩ分子を発現し、これらに対し寛容である。マウスは、マウスに対して抗原性のあるペプチド、および当該マウスが寛容なヒトまたはヒト化ＭＨＣを含む対象ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体で免疫化される。マウスは追加的に、および任意で、対象ｐＭＨＣ複合体でブーストされ、このブースターは任意でさらにヘルパーＴ細胞エピトープに連結される。ヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または軽鎖座位から発現されたヒトまたはヒト化抗体は、免疫化マウスの血清から単離され、ｐＭＨＣ複合体への結合特異性に関して検証される。
【0249】
Ｃ５７ＢＬを背景として有し、ヒト化β２マイクログロブリンと関連付けられたヒト化ＭＨＣ Ｉ分子（ＨＬＡ－Ａ２／Ｈ－２Ｋ）（例えば、図１Ａ および１Ｃを参照のこと。さらに米国特許第９，５９１，８３５号および第９，６１５，５５０号を参照のこと。当該特許はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）、ヒト化免疫グロブリン重鎖座位（例えば、上記のＭａｃｄｏｎａｌｄ（２０１４）を参照のこと）、およびヒト化共通軽鎖座位（例えば、米国特許第１０，１４３，１８６号、第１０，１３０，０８１号、および第９，９６９，８１４号、米国特許出願公開２０１２００２１４０９、２０１２０１９２３００、２０１３００４５４９２、２０１３０１８５８２１、２０１３０３０２８３６、および２０１５０３１３１９３を参照のこと。各文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる）をコードするヌクレオチド配列を含有する被験マウスが作製された。これらの被験マウス、および機能性（例えば、マウス）ＡＤＡＭ６遺伝子（例えば、米国特許第８，６４２，８３５号および第８，６９７，９４０号を参照のこと。当該特許公開は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる）、ならびにヒト化免疫グロブリン重鎖座位および軽鎖座位を含む対照マウスは、ＨＬＡ－Ａ２／β２ｍ分子を背景として提示される異種ペプチド（ペプチドＢ）を含む一本鎖ｐＭＨＣ複合体で免疫化され、この場合において当該免疫原は、配列番号２６に記載されるタンパク質免疫原（図４）として、または配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含む一本鎖ｐＭＨＣ複合体をコードするＤＮＡ（図３）として、投与された。マウスは、標準アジュバントとともにｐＭＨＣ複合体を使用して（図３～４）、またはＴヘルパーペプチドに連結されたｐＭＨＣ複合体免疫原を使用して（ＰＡＤＲＥ、図５）、様々な間隔で、様々な経路を介してブーストされた。免疫前血清をマウスから採取し、その後、免疫化が開始された。マウスは定期的に採血され、各抗原に対する抗血清力価が分析された。
【0250】
ＨＬＡ－Ａ２を背景として提示される非関連抗原（ペプチドＡまたはペプチドＣ）および関連抗原に対する血清中の抗体力価は、ＥＬＩＳＡを使用して決定された。９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に、抗ｍｙｃ抗体のリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ、Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を一晩、５μｇ／ｍｌでコーティングした。プレートは、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ－Ｔ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）で洗浄され、２５０μｌの０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）ＰＢＳ溶液で、１時間、室温でブロッキングされた。プレートは、ＰＢＳ－Ｔで洗浄され、ＨＬＡ－Ａ２を背景として提示される関連ペプチドＢ、または非関連抗原ペプチドＡもしくはペプチドＣを含む２μｇ／ｍｌのｃ－ｍｙｃタグ化一本鎖ｐＭＨＣ複合体でコーティングされた。
【0251】
免疫前血清、および免疫抗血清を、０．５％ ＢＳＡ－ＰＢＳ中で連続３倍希釈し、プレートに１時間、室温で添加した。プレートを洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ－Ｆｃ－西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社）をプレートに加えて、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、メーカーの推奨手順に従い基質として３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）／Ｈ２Ｏ２を使用して発色させ、４５０ｎｍの吸光度を分光光度計（Ｖｉｃｔｏｒ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を使用して記録した。Ｇｒａｐｈｐａｄ ＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して、抗体力価を計算した。抗体力価は、結合シグナルがバックグラウンドの２倍である、補間血清希釈倍数として算出された。
【0252】
ＨＬＡ－Ａを背景とするペプチドＢをコードするＤＮＡ免疫原、または当該ペプチドを含むタンパク質免疫原のいずれかで免疫化されたときの対照マウスにおいて、ペプチドＢ含有一本鎖ｐＭＨＣに結合する抗体力価が惹起されていた。図３～４。キメラＨＬＡ－Ａ２／Ｈ－２Ｋポリペプチド、および／またはヒトもしくはヒト化β２マイクログロブリンに対して寛容ではない対照マウスがコホートに含まれた。しかしこれら対照マウスの血清は、ＨＬＡ－Ａを背景として提示される非関連ペプチド（ペプチドＡまたはペプチドＣ）に対する抗体力価も含んでおり、ペプチドＢ含有一本鎖ｐＭＨＣに対する抗体力価と同等であった（図３～４）。したがって、非寛容動物は対象ｐＭＨＣ複合体に対する免疫反応を発生させることができるが、ペプチドＢ含有一本鎖ｐＭＨＣに対する抗体力価と、非関連ペプチド含有一本鎖ｐＭＨＣに対する抗体力価が同等であることから、そうした免疫反応は非特異的免疫反応とみなされ得る。
【0253】
対照的に、ヒト（ヒト化）ＨＬＡ－Ａおよびβ２マイクログロブリン分子に対して寛容な被験マウスの血清は、一本鎖ペプチドＢ／ＨＬＡ－Ａ／β２Ｍ複合体で免疫化されており、ペプチドＢ含有一本鎖ｐＭＨＣに対する抗体力価を惹起していた。（図４）。ペプチドＢを含有するｐＭＨＣ複合体に対する抗体力価は、非関連ペプチドＡまたはＣを含有するＨＬＡ－Ａ／β２Ｍ複合体に対する抗体力価よりも高かった（図４）。同様に、ペプチドＢ／ＨＬＡ－Ａ／β２Ｍ複合体をコードするＤＮＡを免疫原として使用した場合も、関連ペプチドＢ一本鎖タンパク質に対する抗体力価は、（非関連ｐＭＨＣ複合体と比較して）高いことが観察された（図３）。免疫原に対する高力価は、第三のコホートでも惹起されていた。このコホートでは、被験マウスは、ペプチドＢを含有する一本鎖ｐＭＨＣ複合体のプライム注射を投与され、次いでＰＡＤＲＥヘルパーＴ細胞エピトープに連結されたペプチドＢを含有する一本鎖ｐＭＨＣ複合体でブーストが行われており、非関連ｐＭＨＣ複合体に対する抗体力価と比較された（図５）。さらに、ＲＯＳＡ２６座位から一本鎖ＨＬＡ－Ａ２／β２Ｍポリペプチド（配列番号２３）を発現するマウス（例えば、図２を参照）は、空のＨＬＡ－Ａ２／β２Ｍ分子に対して同様に寛容であり、ｐＭＨＣ／ペプチドＢ複合体タンパク質で免疫化およびブーストされたとき（ＰＡＤＲＥの存在下または非存在下）、非関連ペプチドを提示するｐＭＨＣ複合体に対する抗体力価と比較して、ペプチドＢを提示するｐＭＨＣ複合体に対し、高い抗体力価を生じさせた（データは示さず）。実施例２
【0254】
例えばＲＯＳＡ２６座位など、対応する内因性座位以外の座位からＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、および／またはβ２Ｍ分子を発現するマウスは、空のＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、および／またはβ２Ｍ分子に対して寛容であり、空のＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子および／またはβ２Ｍ分子に対して寛容ではないマウスと比較して、一本鎖ｐＭＨＣ複合体をコードするＤＮＡなどの免疫原に対し、高い抗体力価を生じさせる。。
【0255】
本明細書のデータは、ヒトＨＬＡクラスＩ分子およびヒトβ２マイクログロブリン分子またはそれらの一部に対して非ヒト動物を寛容化させることで、ヒトＨＬＡクラスＩ分子およびヒトβ２マイクログロブリン分子に対して寛容ではない対照非ヒト動物と比較して、対象ｐＭＨＣに対し、特異的な抗体反応を生じさせる当該改変非ヒト動物の能力を強化することを示している。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
遺伝子改変非ヒト動物であって、自身のゲノムが、
（ａ）ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列、および
（ｂ）（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位であって、任意で前記（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位のうちの少なくとも一つは、再構成されていない座位、を含み、
前記遺伝子改変非ヒト動物は、前記ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分を発現し、
前記遺伝子改変非ヒト動物は、ヒトもしくはヒト化重鎖可変ドメインおよび／またはヒトもしくはヒト化軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリンを発現し、および
前記非ヒト動物は、前記ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分に対して寛容であり、それにより、（ｉｉ）前記ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子が誘導されるヒトＨＬＡ分子またはその一部、（ｉ）（ｉｉ）と複合体化された前記非ヒト動物に対して異種であるペプチド、を含有する抗原性ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体で免疫化されたときに、特異的Ｂ細胞反応を生じさせる、遺伝子改変非ヒト動物。
（項目２）
前記ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子は、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣクラスＩ分子、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣクラスＩＩα分子、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣクラスＩＩβ分子、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、および／または
前記遺伝子改変非ヒト動物が、
（ａ）内因性重鎖座位で、
（ｉ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒトまたはヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域、
（ｉｉ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒトまたはヒト化重鎖可変領域、
（ｉｉｉ）共通重鎖コード配列、
（ｉｖ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒトまたはヒト化重鎖可変領域、
（ｖ）重鎖のみの免疫グロブリンコード配列、または
（ｖｉ）ハイブリッド免疫グロブリン鎖をコードする非再構成ヒトまたはヒト化ハイブリッド重鎖配列、を含み、
および／または
（ｂ）内因性軽鎖座位で、
（ｉ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒトまたはヒト化免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｉｉ）共通軽鎖コード配列、
（ｉｉｉ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒトまたはヒト化軽鎖可変領域、
（ｉｖ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒトまたはヒト化軽鎖可変領域、もしくは
（ｖ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変再構成ヒトまたはヒト化軽鎖可変領域、を含む、項目１に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目３）
前記非ヒト動物が、機能性ＡＤＡＭ６遺伝子をさらに含み、任意で前記機能性ＡＤＡＭ６遺伝子が、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子である、項目１または項目２に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目４）
前記非ヒト動物が、外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子をさらに発現する、項目１～３のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目５）
前記ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子が、ヒトまたはヒト化ＭＨＣクラスＩ分子であり、任意で、前記ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子は、ＨＬＡ－Ａ分子、ＨＬＡ－Ｂ分子、ＨＬＡ－Ｃ分子、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＨＬＡクラスＩ分子から誘導される、項目１～４のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目６）
自身のゲノム中、任意で内因性β２マイクログロブリン座位で、ヒトまたはヒト化β２マイクログロブリンをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、
前記非ヒト動物が、前記ヒトまたはヒト化β２マイクログロブリンを発現し、それによって、前記非ヒト動物は、前記β２マイクログロブリンそれ自体に対して寛容であり、または前記ヒトもしくはヒト化ＭＨＣクラスＩ分子と関連付けられた前記β２マイクログロブリンに対して寛容である、項目５に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目７）
前記ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣクラスＩＩ分子であり、任意で、前記ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子は、ＨＬＡ－ＤＰ分子、ＨＬＡ－ＤＱ分子、ＨＬＡ－ＤＲ分子、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＨＬＡクラスＩＩ分子のα鎖および／もしくはβ鎖、または少なくともそのペプチド結合溝から誘導される、項目１～４のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目８）
前記ヌクレオチド配列が、完全ヒトＨＬＡ分子をコードし、
任意で前記ヌクレオチド配列は、内因性非ヒトＭＨＣ座位を破壊せず、任意で前記ヌクレオチド配列は、内因性ＲＯＳＡ２６座位に配置される、項目１～７のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目９）
前記ヌクレオチド配列が、内因性ＭＨＣ分子の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに動作可能に連結されたヒトＨＬＡ分子の細胞外ドメインを含む、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ分子をコードし、任意で前記ヌクレオチド配列は、
（ｉ）内因性非ヒトＭＨＣクラスｉ分子、例えば内因性マウスＨ－２Ｋポリペプチド、内因性マウスＨ－２Ｄポリペプチド、または内因性マウスＨ－ＤＬポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインと動作可能に連結された、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃからなる群から選択されるヒトＭＨＣクラスＩ分子のα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインを含むキメラヒト／非ヒトＭＨＣクラスＩ分子、および／または
（ｉｉ）内因性非ヒトＭＨＣクラスＩＩα分子、例えば内因性マウスＨ－２Ａαポリペプチドまたは内因性マウスＨ－２Ｅαポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインと動作可能に連結されたヒトＨＬＡクラスＩＩαポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメイン、および／または内因性非ヒトＭＨＣクラスＩＩβ分子、例えば内因性マウスＨ－２Ａαポリペプチドまたは内因性マウスＨ－２Ｅαポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインと動作可能に連結されたヒトＨＬＡクラスＩβポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメイン、を含むキメラヒト／非ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子をコードする、項目１～７のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１０）
前記ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子が誘導されるヒトＨＬＡ分子と関連付けられた、前記非ヒト動物に対して異種であるペプチドを含有する抗原性ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体をさらに含む、項目１～９のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１１）
（ｃ）（ｉｉ）前記ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子が誘導されるヒトＨＬＡ分子またはその一部、（ｉ）（ｉｉ）と関連付けられた、前記非ヒト動物に対して異種であるペプチド、を含有する抗原性ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体、および
（ｄ）前記抗原性ペプチド－ＭＨＣに特異的に結合し、前記ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子が誘導される前記ヒトＨＬＡ分子には結合しない、ヒトまたはヒト化抗原結合タンパク質、をさらに含む、項目１～１０のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１２）
前記非ヒト動物が、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードする前記ヌクレオチド配列に関し、ヘテロ接合性である、項目１～１１のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１３）
前記非ヒト動物が、例えばラットまたはマウスなどの齧歯類である、項目１～１２のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１４）
前記非ヒト動物が、マウスである、項目１～１３のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１５）
項目１～１４のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物を作製する方法であって、
（ａ）ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列、および
（ｂ）（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位であって、任意で前記（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位のうちの少なくとも一つは再構成されていない、座位を含むよう自身のゲノムを改変すること、を含み、
前記遺伝子改変非ヒト動物は、
Ａ．前記ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分に対して寛容であり、それにより、（ｉｉ）前記ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子が誘導されるヒトＨＬＡ分子またはその一部、（ｉ）（ｉｉ）と複合体化された前記非ヒト動物に対して異種であるペプチド、を含むペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体で免疫化されたときに、特異的Ｂ細胞反応を生じさせ、および
Ｂ．ヒトもしくはヒト化重鎖可変ドメインおよび／またはヒトもしくはヒト化軽鎖可変ドメインを含む、ヒトまたはヒト化抗原結合タンパク質を提供する能力を有する、方法。（項目１６）
前記方法は、
（ａ）
（ｉ）ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列を、第一の異所性座位に挿入すること、または
（ｉｉ）非ヒト動物ＭＨＣ Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを、内因性非ヒト動物ＭＨＣ Ｉ座位で置換すること、および／もしくは非ヒト動物ＭＨＣ ＩＩ分子をコードするヌクレオチド配列と、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ ＩＩ分子をコードするヌクレオチド配列とを、内因性非ヒト動物ＭＨＣ ＩＩ座位で置換することであって、
前記キメラヒト／非ヒトＭＨＣ Ｉ分子は、ヒトＭＨＣ Ｉのα１ドメイン、α２ドメインおよびα３ドメイン、ならびに内因性非ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、を含有し、
前記キメラヒト／非ヒトＭＨＣ ＩＩ分子は、ヒトＭＨＣ ＩＩのα１ドメイン、α２ドメイン、β１ドメインおよびβ２ドメイン、ならびに内因性齧歯類ＭＨＣ ＩＩポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、を含有する、置換すること、および
（ｂ）
（ｉ）（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位、および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を、第二の異所性座位に挿入すること、または
（ｉｉ）
（Ａ）内因性非ヒト重鎖座位で、内因性非ヒト免疫グロブリン可変（ＶＨ）遺伝子セグメントと、非再構成ヒト免疫グロブリン可変（ＶＨ）遺伝子セグメントとを、置換すること、ならびに任意で内因性非ヒト免疫グロブリン多様性（ＤＨ）遺伝子セグメントおよび／または内因性非ヒト結合（ＪＨ）遺伝子セグメントと、非再構成ヒト免疫グロブリン多様性（ＤＨ）遺伝子セグメントおよび／または非再構成ヒト免疫グロブリン結合（ＪＨ）遺伝子セグメントとを、それぞれ置換することであって、前記非再構成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ならびに任意のＤＨ遺伝子セグメントおよびＪＨ遺伝子セグメントは、内因性重鎖定常領域遺伝子配列に動作可能に連結される、置換すること、および／または
（Ｂ）内因性非ヒト軽鎖座位で、内因性非ヒト軽鎖可変（ＶＬ）遺伝子セグメントおよび内因性非ヒト軽鎖結合（ＪＬ）遺伝子セグメントと、ヒト軽鎖可変（ＶＬ）遺伝子セグメントおよびヒト軽鎖結合（ＪＬ）遺伝子セグメントとを、置換することであって、それらは任意で再構成されてＶＬ／ＪＬ遺伝子配列を形成し、前記ヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび結合ＪＬ遺伝子セグメントは、内因性軽鎖定常領域遺伝子配列に動作可能に連結される、置換すること、を含み、
（ａ）それぞれ、非ヒトＭＨＣ Ｉ分子および／または非ヒトＭＨＣ ＩＩ分子をコードする前記ヌクレオチド配列、ならびに（ｂ）前記ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、ＶＬ、およびＪＬ遺伝子セグメントは、
（Ｉ）一つの非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞中で、連続相同組み換えにより挿入もしくは置換され、または
（ＩＩ）第一のＥＳ細胞および第二のＥＳ細胞においてそれぞれ使用され、第一の非ヒト動物および第二の非ヒト動物が作製され、および前記方法は、前記第一および第二の非ヒト動物を交配させることをさらに含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子が誘導されるヒトＨＬＡ分子と関連付けられた、前記非ヒト動物に対して異種であるペプチドを含む抗原性ｐＭＨＣ複合体を、前記非ヒト動物に投与することをさらに含み、任意で、前記抗原性ｐＭＨＣ複合体は、ヘルパーＴ細胞エピトープに連結され、任意で前記ヘルパーＴ細胞エピトープは、ＰＡＤＲＥである、項目１５または１６に記載の方法。
（項目１８）
対象の抗原性ｐＭＨＣ複合体に特異的に結合する抗原結合タンパク質、または前記タンパク質をコードする核酸配列を作製する方法であって、項目１～１４のいずれか１項に記載の非ヒト動物、または項目１５～１７のいずれか１項に記載の方法に従い作製された非ヒト動物を、前記非ヒト動物が、前記対象の抗原性ｐＭＨＣ複合体に対する免疫反応を開始するのに充分な条件下で維持することを含み、前記対象の抗原性ｐＭＨＣ複合体は、前記非ヒト動物に対して異種であり、前記ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子が誘導されるヒトＨＬＡ、またはその一部を背景として提示されるペプチドを含む、方法。
（項目１９）
第一の工程として、前記非ヒト動物を、前記対象の抗原性ｐＭＨＣ複合体で免疫化すること、および任意で前記免疫化非ヒト動物の免疫反応をブーストすることを含み、任意で免疫化および／またはブーストは、前記非ヒト動物に、ヘルパーＴ細胞エピトープに連結された前記対象のｐＭＨＣ複合体を投与することを含み、任意で前記ヘルパーＴ細胞エピトープは、配列番号２８に記載されるＰＡＤＲＥを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび／またはヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする核酸を取得する方法であって、
項目１０～１４のいずれか１項に記載の非ヒト動物から、前記非ヒト動物のリンパ球、または前記リンパ球から作製されたハイブリドーマにより発現されるヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列を含む核酸を単離すること、を含み、
前記リンパ球、または前記リンパ球から作製されたハイブリドーマにより発現される前記ヒト免疫グロブリン可変ドメインは、その同系可変ドメインと関連して、前記抗原性ｐＭＨＣ複合体に特異的な抗原結合ドメインを形成する、方法。
（項目２１）
前記非ヒト動物を、対象の抗原性ｐＭＨＣ複合体で免疫化すること、および前記非ヒト動物に、前記抗原に対する免疫反応を開始させ、その後に前記核酸を取得すること、をさらに含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記取得された再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列は、少なくとも一つの体細胞超変異を含む、項目２０または２１に記載の方法。
（項目２３）
項目２０～２２のいずれか１項に記載の方法により作製された再構成ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列を含む核酸。
（項目２４）
前記核酸は、前記再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列に動作可能に連結されたヒト定常領域遺伝子配列をさらに含む、項目２３に記載の核酸。
（項目２５）
前記ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、５．５～６．０の範囲のｐＨで、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する、ＩｇＧ重鎖定常領域アミノ酸配列のＣＨ２－ＣＨ３領域のアフィニティを増加させる改変を含み、前記改変は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、Ｎ４３４Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５０Ｑ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるＩｇＧ重鎖定常領域アミノ酸配列における変異である、項目２２または項目２４に記載の核酸。
（項目２６）
項目２３～２５のいずれか１項に記載の核酸を含む宿主細胞。
（項目２７）
ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび／またはヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを発現する細胞を取得する方法であって、
項目１０～１４のいずれか１項に記載の非ヒト動物からリンパ球を単離することを含み、前記リンパ球は、前記抗原性ｐＭＨＣ複合体に対し特異的な抗原結合ドメインを形成するヒト免疫グロブリン可変ドメインを発現する、方法。
（項目２８）
前記単離リンパ球からハイブリドーマを作製することをさらに含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
例えば生殖細胞、胚性幹細胞、体細胞（例えば、Ｂ細胞）などの単離細胞であって、
（ａ）ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列、および
（ｂ）（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位、を含み、前記非ヒト動物は、ヒトまたはヒト化抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗原結合タンパク質を提供する能力を有し、任意で前記ヒトまたはヒト化抗原結合ドメインは、ヒトまたはヒト化可変ドメインを含み、
任意で、前記（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位のうちの少なくとも一つは、再構成されておらず、
任意で、前記単離細胞は、項目２７または項目２８に記載の方法に従い取得される、単離細胞。
（項目３０）
ヒト免疫グロブリン可変ドメインをインビトロで作製する方法であって、
項目１０～１４のいずれか１項に記載の非ヒト動物のリンパ球、または前記リンパ球から作製されたハイブリドーマにより発現されるヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列を含む第一の核酸を、細胞中で発現させること、を含み、
前記リンパ球、または前記リンパ球から作製されたハイブリドーマにより発現される前記ヒト免疫グロブリン可変ドメインは、その同系可変ドメインと関連して、前記抗原性ｐＭＨＣ複合体に特異的な抗原結合ドメインを形成する、方法。
（項目３１）
前記第一の核酸は、前記再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列に動作可能に連結されたヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列をさらに含む、項目３０に記載の方法。（項目３２）
前記ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列は、重鎖定常領域遺伝子配列であり、５．５～６．０の範囲のｐＨで、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する、ＩｇＧ重鎖定常領域アミノ酸配列のＣＨ２－ＣＨ３領域のアフィニティを増加させる改変を含み、前記改変は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、Ｎ４３４Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５０Ｑ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるＩｇＧ重鎖定常領域アミノ酸配列における変異である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
項目３０～３２のいずれか１項に記載の方法に従って作製されたヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
遺伝子改変非ヒト動物であって、自身のゲノムが、
（ａ）ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列、および
（ｂ）（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位であって、任意で前記（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位のうちの少なくとも一つは、再構成されていない座位、を含み、
前記遺伝子改変非ヒト動物は、前記ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分を発現し、
前記遺伝子改変非ヒト動物は、ヒトもしくはヒト化重鎖可変ドメインおよび／またはヒトもしくはヒト化軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリンを発現し、および
前記非ヒト動物は、前記ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分に対して寛容であり、それにより、（ｉｉ）前記ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子が誘導されるヒトＨＬＡ分子またはその一部、（ｉ）（ｉｉ）と複合体化された前記非ヒト動物に対して異種であるペプチド、を含有する抗原性ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体で免疫化されたときに、特異的Ｂ細胞反応を生じさせる、遺伝子改変非ヒト動物。
（項目２）
前記ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子は、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣクラスＩ分子、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣクラスＩＩα分子、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣクラスＩＩβ分子、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、および／または
前記遺伝子改変非ヒト動物が、
（ａ）内因性重鎖座位で、
（ｉ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒトまたはヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域、
（ｉｉ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒトまたはヒト化重鎖可変領域、
（ｉｉｉ）共通重鎖コード配列、
（ｉｖ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒトまたはヒト化重鎖可変領域、
（ｖ）重鎖のみの免疫グロブリンコード配列、または
（ｖｉ）ハイブリッド免疫グロブリン鎖をコードする非再構成ヒトまたはヒト化ハイブリッド重鎖配列、を含み、
および／または
（ｂ）内因性軽鎖座位で、
（ｉ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒトまたはヒト化免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｉｉ）共通軽鎖コード配列、
（ｉｉｉ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒトまたはヒト化軽鎖可変領域、
（ｉｖ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒトまたはヒト化軽鎖可変領域、もしくは
（ｖ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変再構成ヒトまたはヒト化軽鎖可変領域、を含む、項目１に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目３）
前記非ヒト動物が、機能性ＡＤＡＭ６遺伝子をさらに含み、任意で前記機能性ＡＤＡＭ６遺伝子が、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子である、項目１または項目２に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目４）
前記非ヒト動物が、外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子をさらに発現する、項目１～３のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目５）
前記ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子が、ヒトまたはヒト化ＭＨＣクラスＩ分子であり、任意で、前記ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子は、ＨＬＡ－Ａ分子、ＨＬＡ－Ｂ分子、ＨＬＡ－Ｃ分子、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＨＬＡクラスＩ分子から誘導される、項目１～４のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目６）
自身のゲノム中、任意で内因性β２マイクログロブリン座位で、ヒトまたはヒト化β２マイクログロブリンをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、
前記非ヒト動物が、前記ヒトまたはヒト化β２マイクログロブリンを発現し、それによって、前記非ヒト動物は、前記β２マイクログロブリンそれ自体に対して寛容であり、または前記ヒトもしくはヒト化ＭＨＣクラスＩ分子と関連付けられた前記β２マイクログロブリンに対して寛容である、項目５に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目７）
前記ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣクラスＩＩ分子であり、任意で、前記ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子は、ＨＬＡ－ＤＰ分子、ＨＬＡ－ＤＱ分子、ＨＬＡ－ＤＲ分子、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＨＬＡクラスＩＩ分子のα鎖および／もしくはβ鎖、または少なくともそのペプチド結合溝から誘導される、項目１～４のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目８）
前記ヌクレオチド配列が、完全ヒトＨＬＡ分子をコードし、
任意で前記ヌクレオチド配列は、内因性非ヒトＭＨＣ座位を破壊せず、任意で前記ヌクレオチド配列は、内因性ＲＯＳＡ２６座位に配置される、項目１～７のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目９）
前記ヌクレオチド配列が、内因性ＭＨＣ分子の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに動作可能に連結されたヒトＨＬＡ分子の細胞外ドメインを含む、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ分子をコードし、任意で前記ヌクレオチド配列は、
（ｉ）内因性非ヒトＭＨＣクラスｉ分子、例えば内因性マウスＨ－２Ｋポリペプチド、内因性マウスＨ－２Ｄポリペプチド、または内因性マウスＨ－ＤＬポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインと動作可能に連結された、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃからなる群から選択されるヒトＭＨＣクラスＩ分子のα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインを含むキメラヒト／非ヒトＭＨＣクラスＩ分子、および／または
（ｉｉ）内因性非ヒトＭＨＣクラスＩＩα分子、例えば内因性マウスＨ－２Ａαポリペプチドまたは内因性マウスＨ－２Ｅαポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインと動作可能に連結されたヒトＨＬＡクラスＩＩαポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメイン、および／または内因性非ヒトＭＨＣクラスＩＩβ分子、例えば内因性マウスＨ－２Ａαポリペプチドまたは内因性マウスＨ－２Ｅαポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインと動作可能に連結されたヒトＨＬＡクラスＩβポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメイン、を含むキメラヒト／非ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子をコードする、項目１～７のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１０）
前記ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子が誘導されるヒトＨＬＡ分子と関連付けられた、前記非ヒト動物に対して異種であるペプチドを含有する抗原性ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体をさらに含む、項目１～９のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１１）
（ｃ）（ｉｉ）前記ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子が誘導されるヒトＨＬＡ分子またはその一部、（ｉ）（ｉｉ）と関連付けられた、前記非ヒト動物に対して異種であるペプチド、を含有する抗原性ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体、および
（ｄ）前記抗原性ペプチド－ＭＨＣに特異的に結合し、前記ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子が誘導される前記ヒトＨＬＡ分子には結合しない、ヒトまたはヒト化抗原結合タンパク質、をさらに含む、項目１～１０のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１２）
前記非ヒト動物が、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードする前記ヌクレオチド配列に関し、ヘテロ接合性である、項目１～１１のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１３）
前記非ヒト動物が、例えばラットまたはマウスなどの齧歯類である、項目１～１２のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１４）
前記非ヒト動物が、マウスである、項目１～１３のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１５）
項目１～１４のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物を作製する方法であって、
（ａ）ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列、および
（ｂ）（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位であって、任意で前記（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位のうちの少なくとも一つは再構成されていない、座位を含むよう自身のゲノムを改変すること、を含み、
前記遺伝子改変非ヒト動物は、
Ａ．前記ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分に対して寛容であり、それにより、（ｉｉ）前記ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子が誘導されるヒトＨＬＡ分子またはその一部、（ｉ）（ｉｉ）と複合体化された前記非ヒト動物に対して異種であるペプチド、を含むペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体で免疫化されたときに、特異的Ｂ細胞反応を生じさせ、および
Ｂ．ヒトもしくはヒト化重鎖可変ドメインおよび／またはヒトもしくはヒト化軽鎖可変ドメインを含む、ヒトまたはヒト化抗原結合タンパク質を提供する能力を有する、方法。（項目１６）
前記方法は、
（ａ）
（ｉ）ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列を、第一の異所性座位に挿入すること、または
（ｉｉ）非ヒト動物ＭＨＣ Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを、内因性非ヒト動物ＭＨＣ Ｉ座位で置換すること、および／もしくは非ヒト動物ＭＨＣ ＩＩ分子をコードするヌクレオチド配列と、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ ＩＩ分子をコードするヌクレオチド配列とを、内因性非ヒト動物ＭＨＣ ＩＩ座位で置換することであって、
前記キメラヒト／非ヒトＭＨＣ Ｉ分子は、ヒトＭＨＣ Ｉのα１ドメイン、α２ドメインおよびα３ドメイン、ならびに内因性非ヒトＭＨＣ Ｉポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、を含有し、
前記キメラヒト／非ヒトＭＨＣ ＩＩ分子は、ヒトＭＨＣ ＩＩのα１ドメイン、α２ドメイン、β１ドメインおよびβ２ドメイン、ならびに内因性齧歯類ＭＨＣ ＩＩポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、を含有する、置換すること、および
（ｂ）
（ｉ）（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位、および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を、第二の異所性座位に挿入すること、または
（ｉｉ）
（Ａ）内因性非ヒト重鎖座位で、内因性非ヒト免疫グロブリン可変（ＶＨ）遺伝子セグメントと、非再構成ヒト免疫グロブリン可変（ＶＨ）遺伝子セグメントとを、置換すること、ならびに任意で内因性非ヒト免疫グロブリン多様性（ＤＨ）遺伝子セグメントおよび／または内因性非ヒト結合（ＪＨ）遺伝子セグメントと、非再構成ヒト免疫グロブリン多様性（ＤＨ）遺伝子セグメントおよび／または非再構成ヒト免疫グロブリン結合（ＪＨ）遺伝子セグメントとを、それぞれ置換することであって、前記非再構成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ならびに任意のＤＨ遺伝子セグメントおよびＪＨ遺伝子セグメントは、内因性重鎖定常領域遺伝子配列に動作可能に連結される、置換すること、および／または
（Ｂ）内因性非ヒト軽鎖座位で、内因性非ヒト軽鎖可変（ＶＬ）遺伝子セグメントおよび内因性非ヒト軽鎖結合（ＪＬ）遺伝子セグメントと、ヒト軽鎖可変（ＶＬ）遺伝子セグメントおよびヒト軽鎖結合（ＪＬ）遺伝子セグメントとを、置換することであって、それらは任意で再構成されてＶＬ／ＪＬ遺伝子配列を形成し、前記ヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび結合ＪＬ遺伝子セグメントは、内因性軽鎖定常領域遺伝子配列に動作可能に連結される、置換すること、を含み、
（ａ）それぞれ、非ヒトＭＨＣ Ｉ分子および／または非ヒトＭＨＣ ＩＩ分子をコードする前記ヌクレオチド配列、ならびに（ｂ）前記ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、ＶＬ、およびＪＬ遺伝子セグメントは、
（Ｉ）一つの非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞中で、連続相同組み換えにより挿入もしくは置換され、または
（ＩＩ）第一のＥＳ細胞および第二のＥＳ細胞においてそれぞれ使用され、第一の非ヒト動物および第二の非ヒト動物が作製され、および前記方法は、前記第一および第二の非ヒト動物を交配させることをさらに含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子が誘導されるヒトＨＬＡ分子と関連付けられた、前記非ヒト動物に対して異種であるペプチドを含む抗原性ｐＭＨＣ複合体を、前記非ヒト動物に投与することをさらに含み、任意で、前記抗原性ｐＭＨＣ複合体は、ヘルパーＴ細胞エピトープに連結され、任意で前記ヘルパーＴ細胞エピトープは、ＰＡＤＲＥである、項目１５または１６に記載の方法。
（項目１８）
対象の抗原性ｐＭＨＣ複合体に特異的に結合する抗原結合タンパク質、または前記タンパク質をコードする核酸配列を作製する方法であって、項目１～１４のいずれか１項に記載の非ヒト動物、または項目１５～１７のいずれか１項に記載の方法に従い作製された非ヒト動物を、前記非ヒト動物が、前記対象の抗原性ｐＭＨＣ複合体に対する免疫反応を開始するのに充分な条件下で維持することを含み、前記対象の抗原性ｐＭＨＣ複合体は、前記非ヒト動物に対して異種であり、前記ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子が誘導されるヒトＨＬＡ、またはその一部を背景として提示されるペプチドを含む、方法。
（項目１９）
第一の工程として、前記非ヒト動物を、前記対象の抗原性ｐＭＨＣ複合体で免疫化すること、および任意で前記免疫化非ヒト動物の免疫反応をブーストすることを含み、任意で免疫化および／またはブーストは、前記非ヒト動物に、ヘルパーＴ細胞エピトープに連結された前記対象のｐＭＨＣ複合体を投与することを含み、任意で前記ヘルパーＴ細胞エピトープは、配列番号２８に記載されるＰＡＤＲＥを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび／またはヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする核酸を取得する方法であって、
項目１０～１４のいずれか１項に記載の非ヒト動物から、前記非ヒト動物のリンパ球、または前記リンパ球から作製されたハイブリドーマにより発現されるヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列を含む核酸を単離すること、を含み、
前記リンパ球、または前記リンパ球から作製されたハイブリドーマにより発現される前記ヒト免疫グロブリン可変ドメインは、その同系可変ドメインと関連して、前記抗原性ｐＭＨＣ複合体に特異的な抗原結合ドメインを形成する、方法。
（項目２１）
前記非ヒト動物を、対象の抗原性ｐＭＨＣ複合体で免疫化すること、および前記非ヒト動物に、前記抗原に対する免疫反応を開始させ、その後に前記核酸を取得すること、をさらに含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記取得された再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列は、少なくとも一つの体細胞超変異を含む、項目２０または２１に記載の方法。
（項目２３）
項目２０～２２のいずれか１項に記載の方法により作製された再構成ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列を含む核酸。
（項目２４）
前記核酸は、前記再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列に動作可能に連結されたヒト定常領域遺伝子配列をさらに含む、項目２３に記載の核酸。
（項目２５）
前記ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、５．５～６．０の範囲のｐＨで、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する、ＩｇＧ重鎖定常領域アミノ酸配列のＣＨ２－ＣＨ３領域のアフィニティを増加させる改変を含み、前記改変は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、Ｎ４３４Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５０Ｑ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるＩｇＧ重鎖定常領域アミノ酸配列における変異である、項目２２または項目２４に記載の核酸。
（項目２６）
項目２３～２５のいずれか１項に記載の核酸を含む宿主細胞。
（項目２７）
ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび／またはヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを発現する細胞を取得する方法であって、
項目１０～１４のいずれか１項に記載の非ヒト動物からリンパ球を単離することを含み、前記リンパ球は、前記抗原性ｐＭＨＣ複合体に対し特異的な抗原結合ドメインを形成するヒト免疫グロブリン可変ドメインを発現する、方法。
（項目２８）
前記単離リンパ球からハイブリドーマを作製することをさらに含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
例えば生殖細胞、胚性幹細胞、体細胞（例えば、Ｂ細胞）などの単離細胞であって、
（ａ）ヒトもしくはヒト化ＭＨＣ分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列、および
（ｂ）（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位、を含み、前記非ヒト動物は、ヒトまたはヒト化抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗原結合タンパク質を提供する能力を有し、任意で前記ヒトまたはヒト化抗原結合ドメインは、ヒトまたはヒト化可変ドメインを含み、
任意で、前記（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および／または（非）再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位のうちの少なくとも一つは、再構成されておらず、
任意で、前記単離細胞は、項目２７または項目２８に記載の方法に従い取得される、単離細胞。
（項目３０）
ヒト免疫グロブリン可変ドメインをインビトロで作製する方法であって、
項目１０～１４のいずれか１項に記載の非ヒト動物のリンパ球、または前記リンパ球から作製されたハイブリドーマにより発現されるヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列を含む第一の核酸を、細胞中で発現させること、を含み、
前記リンパ球、または前記リンパ球から作製されたハイブリドーマにより発現される前記ヒト免疫グロブリン可変ドメインは、その同系可変ドメインと関連して、前記抗原性ｐＭＨＣ複合体に特異的な抗原結合ドメインを形成する、方法。
（項目３１）
前記第一の核酸は、前記再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列に動作可能に連結されたヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列をさらに含む、項目３０に記載の方法。（項目３２）
前記ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列は、重鎖定常領域遺伝子配列であり、５．５～６．０の範囲のｐＨで、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する、ＩｇＧ重鎖定常領域アミノ酸配列のＣＨ２－ＣＨ３領域のアフィニティを増加させる改変を含み、前記改変は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、Ｎ４３４Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５０Ｑ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるＩｇＧ重鎖定常領域アミノ酸配列における変異である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
項目３０～３２のいずれか１項に記載の方法に従って作製されたヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【外国語明細書】