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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024126029
(43)【公開日】2024-09-19
(54)【発明の名称】循環腫瘍核酸分子のマルチモーダル分析
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6869 20180101AFI20240911BHJP
G16B 30/00 20190101ALI20240911BHJP
C12Q 1/6886 20180101ALI20240911BHJP
C12Q 1/6806 20180101ALI20240911BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6869 Z
G16B30/00
C12Q1/6886 Z
C12Q1/6806 Z
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024099692
(22)【出願日】2024-06-20
(62)【分割の表示】P 2022577358の分割
【原出願日】2021-06-18
(31)【優先権主張番号】63/041,151
(32)【優先日】2020-06-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】507148294
【氏名又は名称】ユニバーシティー ヘルス ネットワーク
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】ブラットマン，スコット・ヴィクター
(72)【発明者】
【氏名】バーゲナー，ジャスティン・マシュー
(72)【発明者】
【氏名】ディニーズ・デ・カルヴァロ，ダニエル
(57)【要約】 （修正有）
【課題】対象のがん細胞からｃｔＤＮＡが存在することを検出する方法を提供する。
【解決手段】方法は、対象からセルフリーＤＮＡの試料を得る工程と、試料をライブラリ調製に供して、セルフリーメチル化ＤＮＡのその後の配列決定を可能にする工程と、メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を用いたセルフリーメチル化ＤＮＡを捕捉する工程と、捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡを配列決定する工程と、健常な個体およびがんの個体由来の対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列を用いて、捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの配列を比較する工程と、捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの１つ以上の配列とがんの個体由来のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合、がん細胞由来のＤＮＡの存在を同定する工程と、を含み、対象のセルフリーメチル化ＤＮＡは、断片の長さのメトリックに従って亜集団に限定される。
【選択図】図４
【解決手段】方法は、対象からセルフリーＤＮＡの試料を得る工程と、試料をライブラリ調製に供して、セルフリーメチル化ＤＮＡのその後の配列決定を可能にする工程と、メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を用いたセルフリーメチル化ＤＮＡを捕捉する工程と、捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡを配列決定する工程と、健常な個体およびがんの個体由来の対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列を用いて、捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの配列を比較する工程と、捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの１つ以上の配列とがんの個体由来のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合、がん細胞由来のＤＮＡの存在を同定する工程と、を含み、対象のセルフリーメチル化ＤＮＡは、断片の長さのメトリックに従って亜集団に限定される。
【選択図】図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象のがん細胞から循環腫瘍デオキシリボ核酸（ｃｔＤＮＡ）が存在することを検出す
る方法であって、
（ａ）前記対象からセルフリーデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の試料を得る工程、
（ｂ）前記試料をライブラリ調製に供して、前記セルフリーメチル化ＤＮＡのその後の
配列決定を可能にする工程、
（ｃ）メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を用いたセルフリーメチル化ＤＮＡ
を捕捉する工程、
（ｄ）前記捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡを配列決定する工程、
（ｅ）健常な個体およびがんの個体由来の対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列を用い
て、前記捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの前記配列をコンピュータ処理する工程、
および
（ｆ）前記捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの１つ以上の配列とがんの個体由来の
セルフリーメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合、がん細胞由来
のＤＮＡの前記存在を同定する工程を含み、
（ｄ）、（ｆ）および（ｇ）の少なくとも１つにおいて、前記対象のセルフリーメチル
化ＤＮＡは、断片の長さのメトリックに従って亜集団に限定される、方法。
る方法であって、
（ａ）前記対象からセルフリーデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の試料を得る工程、
（ｂ）前記試料をライブラリ調製に供して、前記セルフリーメチル化ＤＮＡのその後の
配列決定を可能にする工程、
（ｃ）メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を用いたセルフリーメチル化ＤＮＡ
を捕捉する工程、
（ｄ）前記捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡを配列決定する工程、
（ｅ）健常な個体およびがんの個体由来の対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列を用い
て、前記捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの前記配列をコンピュータ処理する工程、
および
（ｆ）前記捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの１つ以上の配列とがんの個体由来の
セルフリーメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合、がん細胞由来
のＤＮＡの前記存在を同定する工程を含み、
（ｄ）、（ｆ）および（ｇ）の少なくとも１つにおいて、前記対象のセルフリーメチル
化ＤＮＡは、断片の長さのメトリックに従って亜集団に限定される、方法。
【請求項2】
第１の量のフィラーＤＮＡを前記試料に添加することをさらに含み、前記フィラーＤＮ
Ａの少なくとも一部がメチル化され、次いでさらに前記試料を変性させていてもよい、請
求項１に記載の方法。
Ａの少なくとも一部がメチル化され、次いでさらに前記試料を変性させていてもよい、請
求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記断片の長さのメトリックが断片の長さである、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡが、＜１７０塩基対（ｂｐ）、＜１６５ｂｐ、＜
１６０ｂｐ、＜１５５ｂｐ、＜１５０ｂｐ、＜１４５ｂｐ、＜１４０ｂｐ、＜１３５ｂｐ
、＜１３０ｂｐ、＜１２５ｂｐ、＜１２０ｂｐ、＜１１５ｂｐ、＜１１０ｂｐ、＜１０５
ｂｐ、または＜１００ｂｐの長さを有する断片に限定される、請求項２に記載の方法。
１６０ｂｐ、＜１５５ｂｐ、＜１５０ｂｐ、＜１４５ｂｐ、＜１４０ｂｐ、＜１３５ｂｐ
、＜１３０ｂｐ、＜１２５ｂｐ、＜１２０ｂｐ、＜１１５ｂｐ、＜１１０ｂｐ、＜１０５
ｂｐ、または＜１００ｂｐの長さを有する断片に限定される、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡが、約１００～約１５０ｂｐ、１１０～１４０ｂ
ｐまたは１２０～１３０ｂｐの長さを有する断片に限定される、請求項２に記載の方法。
ｐまたは１２０～１３０ｂｐの長さを有する断片に限定される、請求項２に記載の方法。
【請求項6】
前記断片の長さのメトリックが、前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡの前記断片の長
さの分布である、請求項１に記載の方法。
さの分布である、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡが、長さに基づいて下位５０、４５、４０、３５
、３０、２５、２０、１５または１０パーセンタイル内の断片に限定される、請求項５に
記載の方法。
、３０、２５、２０、１５または１０パーセンタイル内の断片に限定される、請求項５に
記載の方法。
【請求項8】
前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡが、差次的メチル化領域（ＤＭＲ）内の断片にさ
らに限定される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
らに限定される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡがさらに制限される、前記捕捉する工程の間であ
る、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
る、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡがさらに制限される、前記比較する工程の間であ
る、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
る、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記限定することが、前記同定することの間である、請求項１～７のいずれか一項に記
載の方法。
載の方法。
【請求項12】
前記試料が前記対象の血液または血漿に由来する、請求項１～１０のいずれか一項に記
載の方法。
載の方法。
【請求項13】
（ｆ）が統計的分類器を使用することを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の
方法。
方法。
【請求項14】
前記分類器が機械学習によって導出される、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
健常な個体およびがんの個体由来の前記対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列は、健常
な個体とがんの個体との間の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）のデータベースに含まれる、
請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
な個体とがんの個体との間の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）のデータベースに含まれる、
請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
健常な個体およびがんの個体由来の前記対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列が、セル
フリーＤＮＡに由来するＤＮＡにおいて健常な個体とがんの個体との間として差次的にメ
チル化されているその対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列に限定される、請求項１～１
５のいずれか一項に記載の方法。
フリーＤＮＡに由来するＤＮＡにおいて健常な個体とがんの個体との間として差次的にメ
チル化されているその対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列に限定される、請求項１～１
５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列が、血漿に由来するＤＮＡにおいて健常な個
体とがんの個体との間として差次的にメチル化される、請求項１６に記載の方法。
体とがんの個体との間として差次的にメチル化される、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記試料が、１００ｎｇ、７５ｎｇまたは５０ｎｇ未満のセルフリーＤＮＡを有する、
請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記フィラーＤＮＡの第１の量は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０
％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のメチル化フィ
ラーＤＮＡを含み、残りは非メチル化フィラーＤＮＡであり、好ましくは５％～５０％、
１０％～４０％、または１５％～３０％のメチル化フィラーＤＮＡである、請求項１～１
８のいずれか一項に記載の方法。
％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のメチル化フィ
ラーＤＮＡを含み、残りは非メチル化フィラーＤＮＡであり、好ましくは５％～５０％、
１０％～４０％、または１５％～３０％のメチル化フィラーＤＮＡである、請求項１～１
８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記フィラーＤＮＡの第１の量が、２０ｎｇ～１００ｎｇ、好ましくは３０ｎｇ～１０
０ｎｇ、より好ましくは５０ｎｇ～１００ｎｇである、請求項１～１８のいずれか一項に
記載の方法。
０ｎｇ、より好ましくは５０ｎｇ～１００ｎｇである、請求項１～１８のいずれか一項に
記載の方法。
【請求項21】
前記試料から得た前記セルフリーＤＮＡおよび前記第１の量のフィラーＤＮＡは、合わ
せて少なくとも５０ｎｇの総ＤＮＡ、好ましくは少なくとも１００ｎｇの総ＤＮＡを含む
、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
せて少なくとも５０ｎｇの総ＤＮＡ、好ましくは少なくとも１００ｎｇの総ＤＮＡを含む
、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記フィラーＤＮＡが、５０ｂｐ～８００ｂｐの長さ、好ましくは１００ｂｐ～６００
ｂｐの長さ、より好ましくは２００ｂｐ～６００ｂｐの長さである、請求項１～２１のい
ずれか一項に記載の方法。
ｂｐの長さ、より好ましくは２００ｂｐ～６００ｂｐの長さである、請求項１～２１のい
ずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記フィラーＤＮＡが二本鎖である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記フィラーＤＮＡがジャンクＤＮＡである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の
方法。
方法。
【請求項25】
前記フィラーＤＮＡが内因性または外因性ＤＮＡである、請求項１～１２のいずれか一
項に記載の方法。
項に記載の方法。
【請求項26】
前記フィラーＤＮＡが非ヒトＤＮＡ、好ましくはλＤＮＡである、請求項２５に記載の
方法。
方法。
【請求項27】
前記フィラーＤＮＡがヒトＤＮＡとアライメントしていない、請求項１～２６のいずれ
か一項に記載の方法。
か一項に記載の方法。
【請求項28】
前記結合剤が、メチル－ＣｐＧ結合ドメインを含むタンパク質である、請求項１～２７
のいずれか一項に記載の方法。
のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記タンパク質がＭＢＤ２タンパク質である、請求項１～２８のいずれか一項に記載の
方法。
方法。
【請求項30】
（ｄ）が、抗体を使用して前記セルフリーメチル化ＤＮＡを免疫沈降させることを含む
、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
免疫沈降のために少なくとも０．０５μｇ、好ましくは少なくとも０．１６μｇの前記
抗体を前記試料に添加することを含む、請求項３０に記載の方法。
抗体を前記試料に添加することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記抗体が５－ＭｅＣ抗体である、請求項３０に記載の方法。
【請求項33】
前記免疫沈降反応を確認するために、（ｃ）の後に第２の量の対照ＤＮＡを前記試料に
添加することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
添加することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項34】
セルフリーメチル化ＤＮＡの前記捕捉を確認するために、（ｃ）の後に第２の量の対照
ＤＮＡを前記試料に添加することをさらに含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の
方法。
ＤＮＡを前記試料に添加することをさらに含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の
方法。
【請求項35】
がん細胞由来のＤＮＡが前記存在することを同定することは、がん細胞の起源の組織を
同定することをさらに含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
同定することをさらに含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
前記がん細胞の起源の組織を同定することは、がんのサブタイプを同定することをさら
に含む、請求項３５に記載の方法。
に含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記がんのサブタイプが、ステージ、組織学、遺伝子発現パターン、コピー数異常、再
編成、または点変異状態に基づいて前記がんを区別する、請求項３６に記載の方法。
編成、または点変異状態に基づいて前記がんを区別する、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
（ｆ）がゲノムワイドに行われる、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
（ｆ）がゲノムワイドから特定の調節領域に制限される、請求項１～３７のいずれか一
項に記載の方法。
項に記載の方法。
【請求項40】
前記調節領域が、ＦＡＮＴＯＭ５エンハンサー、ＣｐＧアイランド、ＣｐＧショア、Ｃ
ｐＧ Ｓｈｅｌｆ、または前述物の任意の組み合わせである、請求項３９に記載の方法。
ｐＧ Ｓｈｅｌｆ、または前述物の任意の組み合わせである、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
工程（ｆ）および（ｇ）がコンピュータプロセッサによって実行される、請求項１～４
０のいずれか一項に記載の方法。
０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
前記がんが、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳／ＣＮＳ腫瘍、乳
がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユー
イングファミリーの腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍
（ｇｉｓｔ）、妊娠性栄養膜疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭および下咽
頭がん、白血病（急性リンパ球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、慢性骨髄
単球性）、肝臓がん、肺がん（非小細胞、小細胞、肺カルチノイド腫瘍）、リンパ腫、皮
膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔がん、
鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口腔咽頭がん、骨肉腫、卵
巣がん、陰茎がん、下垂体がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、
肉腫－成人軟部組織がん、皮膚がん（基底細胞および扁平上皮細胞、黒色腫、メルケル細
胞）、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰が
ん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍からなる群から選択さ
れる、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユー
イングファミリーの腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍
（ｇｉｓｔ）、妊娠性栄養膜疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭および下咽
頭がん、白血病（急性リンパ球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、慢性骨髄
単球性）、肝臓がん、肺がん（非小細胞、小細胞、肺カルチノイド腫瘍）、リンパ腫、皮
膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔がん、
鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口腔咽頭がん、骨肉腫、卵
巣がん、陰茎がん、下垂体がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、
肉腫－成人軟部組織がん、皮膚がん（基底細胞および扁平上皮細胞、黒色腫、メルケル細
胞）、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰が
ん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍からなる群から選択さ
れる、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項43】
前記がんが頭頸部扁平上皮癌である、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項44】
前記がんの前記検出に使用するための、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
前記がんの治療のモニタリングに使用するための、請求項１～４３のいずれか一項に記
載の方法。
載の方法。
【請求項46】
対象が疾患を有するか、または疾患を有するリスクがあるかどうかを判定するための方
法であって、
（ａ）（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断
片の長さプロファイルからなる群から選択される少なくとも１つのプロファイルを生成す
るために前記対象から得られたセルフリー核酸試料に由来する複数の核酸分子をシーケン
シングに供する工程、および
（ｂ）前記対象が前記疾患を有するかまたは前記疾患のリスクがあるかどうかを少なく
とも８０％の感度または少なくとも約９０％の特異度で判定するために前記少なくとも１
つのプロファイルを処理する工程であって、前記セルフリー核酸試料が３０ナノグラム（
ｎｇ）／ミリリットル（ｍｌ）未満の前記複数の核酸分子を含む、処理する工程を含む、
方法。
法であって、
（ａ）（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断
片の長さプロファイルからなる群から選択される少なくとも１つのプロファイルを生成す
るために前記対象から得られたセルフリー核酸試料に由来する複数の核酸分子をシーケン
シングに供する工程、および
（ｂ）前記対象が前記疾患を有するかまたは前記疾患のリスクがあるかどうかを少なく
とも８０％の感度または少なくとも約９０％の特異度で判定するために前記少なくとも１
つのプロファイルを処理する工程であって、前記セルフリー核酸試料が３０ナノグラム（
ｎｇ）／ミリリットル（ｍｌ）未満の前記複数の核酸分子を含む、処理する工程を含む、
方法。
【請求項47】
前記セルフリー核酸試料が１０ｎｇ／ｍｌ未満の前記複数の核酸分子を含む、請求項４
６に記載の方法。
６に記載の方法。
【請求項48】
前記セルフリー核酸試料が５ｎｇ／ｍｌ未満の前記複数の核酸分子を含む、請求項４６
に記載の方法。
に記載の方法。
【請求項49】
前記セルフリー核酸試料が１ｎｇ／ｍｌ未満の前記複数の核酸分子を含む、請求項４６
に記載の方法。
に記載の方法。
【請求項50】
（ａ）に前記供する工程が、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）からなる群から選択さ
れる少なくとも２つのプロファイルを生成する、請求項４６に記載の方法。
れる少なくとも２つのプロファイルを生成する、請求項４６に記載の方法。
【請求項51】
前記少なくとも２つのプロファイルが、前記メチル化プロファイルおよび前記断片の長
さプロファイルを含む、請求項５０に記載の方法。
さプロファイルを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項52】
前記少なくとも２つのプロファイルが、前記変異プロファイルおよび前記断片の長さプ
ロファイルを含む、請求項５０に記載の方法。
ロファイルを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項53】
前記少なくとも２つのプロファイルが、前記メチル化プロファイルおよび前記変異プロ
ファイルを含む、請求項５０に記載の方法。
ファイルを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項54】
（ａ）を前記供する工程が、前記メチル化プロファイル、前記変異プロファイルおよび
前記断片の長さプロファイルを生成する、請求項４６に記載の方法。
前記断片の長さプロファイルを生成する、請求項４６に記載の方法。
【請求項55】
対象のセルフリー核酸試料を処理して、前記対象が疾患を有するかまたは疾患を有する
リスクがあるかどうかを判定する方法であって、
（ａ）複数の核酸分子を含む前記セルフリー核酸試料を得る工程、
（ｂ）前記複数の核酸分子またはその誘導体を配列決定に供して、複数の配列決定リー
ドを生成する工程、
（ｃ）前記複数の配列決定リードをコンピュータ処理して、前記複数の核酸分子につい
て、（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の
長さプロファイルを同定する工程、および
（ｄ）前記対象が前記疾患を有するかまたは有するリスクがあるかどうかを判定するた
めに、少なくとも前記メチル化プロファイル、前記変異プロファイルおよび前記断片の長
さプロファイルを使用する工程を含む、方法。
リスクがあるかどうかを判定する方法であって、
（ａ）複数の核酸分子を含む前記セルフリー核酸試料を得る工程、
（ｂ）前記複数の核酸分子またはその誘導体を配列決定に供して、複数の配列決定リー
ドを生成する工程、
（ｃ）前記複数の配列決定リードをコンピュータ処理して、前記複数の核酸分子につい
て、（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の
長さプロファイルを同定する工程、および
（ｄ）前記対象が前記疾患を有するかまたは有するリスクがあるかどうかを判定するた
めに、少なくとも前記メチル化プロファイル、前記変異プロファイルおよび前記断片の長
さプロファイルを使用する工程を含む、方法。
【請求項56】
前記疾患ががんを含む、請求項４６～５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項57】
前記がんが、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳／ＣＮＳ腫瘍、乳
がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユー
イングファミリーの腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍
（ｇｉｓｔ）、妊娠性栄養膜疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭および下咽
頭がん、白血病（急性リンパ球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、慢性骨髄
単球性）、肝臓がん、肺がん（非小細胞、小細胞、肺カルチノイド腫瘍）、リンパ腫、皮
膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔がん、
鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口腔咽頭がん、骨肉腫、卵
巣がん、陰茎がん、下垂体がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、
肉腫－成人軟部組織がん、皮膚がん（基底細胞および扁平上皮細胞、黒色腫、メルケル細
胞）、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰が
ん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、扁平上皮癌、および
頭頸部扁平上皮癌からなる群から選択される前記がんからなる群から選択される、請求項
５６に記載の方法。
がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユー
イングファミリーの腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍
（ｇｉｓｔ）、妊娠性栄養膜疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭および下咽
頭がん、白血病（急性リンパ球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、慢性骨髄
単球性）、肝臓がん、肺がん（非小細胞、小細胞、肺カルチノイド腫瘍）、リンパ腫、皮
膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔がん、
鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口腔咽頭がん、骨肉腫、卵
巣がん、陰茎がん、下垂体がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、
肉腫－成人軟部組織がん、皮膚がん（基底細胞および扁平上皮細胞、黒色腫、メルケル細
胞）、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰が
ん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、扁平上皮癌、および
頭頸部扁平上皮癌からなる群から選択される前記がんからなる群から選択される、請求項
５６に記載の方法。
【請求項58】
前記がんが扁平上皮癌である、請求項５７に記載の方法。
【請求項59】
前記がんが頭頸部扁平上皮癌である、請求項５８に記載の方法。
【請求項60】
前記複数のセルフリー核酸分子が循環腫瘍核酸分子を含む、請求項４６～５６のいずれ
か一項に記載の方法。
か一項に記載の方法。
【請求項61】
前記循環腫瘍核酸が循環腫瘍ＤＮＡを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項62】
前記循環腫瘍核酸が循環腫瘍ＲＮＡを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項63】
前記メチル化プロファイルが、複数の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）を含む、請求項４
６～６２のいずれかに記載の方法。
６～６２のいずれかに記載の方法。
【請求項64】
前記複数のＤＭＲがｃｔＤＮＡ由来である、請求項６３に記載の方法。
【請求項65】
末梢血白血球に由来する複数のＤＭＲが前記メチル化プロファイルから除去される、請
求項６３に記載の方法。
求項６３に記載の方法。
【請求項66】
前記複数のＤＭＲが、正常で健常な対象からの対応するゲノム領域と比較して低メチル
化レベルを有する少なくとも約５６のゲノム領域を含む、請求項６３に記載の方法。
化レベルを有する少なくとも約５６のゲノム領域を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項67】
前記複数のＤＭＲが、正常で健常な対象からの対応するゲノム領域と比較して、過剰メ
チル化レベルを有する少なくとも約９４１のゲノム領域を含む、請求項５４に記載の方法
。
チル化レベルを有する少なくとも約９４１のゲノム領域を含む、請求項５４に記載の方法
。
【請求項68】
ＤＭＲが少なくとも約３００ｂｐのサイズを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項69】
ＤＭＲが、少なくとも約１００ｂｐ～少なくとも約２００ｂｐのサイズを含む、請求項
６８に記載の方法。
６８に記載の方法。
【請求項70】
ＤＭＲが、少なくとも約１００ｂｐ～少なくとも約１５０ｂｐのサイズを含む、請求項
６８に記載の方法。
６８に記載の方法。
【請求項71】
ＤＭＲが少なくとも８のＣｐＧゲノムアイランドを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項72】
前記正常で健常な対象が、前記対象と同じリスク因子のセットを含む、請求項６６また
は６７のいずれかに記載の方法。
は６７のいずれかに記載の方法。
【請求項73】
前記変異プロファイルが、ミスセンス変異体、ナンセンス変異体、欠失変異体、挿入変
異体、重複変異体、逆位変異体、フレームシフト変異体、または反復伸長変異体を含む、
請求項４５～７２のいずれかに記載の方法。
異体、重複変異体、逆位変異体、フレームシフト変異体、または反復伸長変異体を含む、
請求項４５～７２のいずれかに記載の方法。
【請求項74】
複数の末梢血白血球から得られたゲノムＤＮＡ試料に存在する任意の変異体であって、
前記複数の末梢血白血球が前記対象から得られ、前記変異プロファイルから除去される、
請求項４５～７２のいずれかに記載の方法。
前記複数の末梢血白血球が前記対象から得られ、前記変異プロファイルから除去される、
請求項４５～７２のいずれかに記載の方法。
【請求項75】
クローン造血に由来するいずれかの変異体が前記変異プロファイルから除去される、請
求項４５～７２のいずれかに記載の方法。
求項４５～７２のいずれかに記載の方法。
【請求項76】
前記変異プロファイルが、遺伝子ＤＮＭＴ３Ａ、ＴＥＴ２、またはＡＳＸＬ１の変異体
を含まない、請求項７５に記載の方法。
を含まない、請求項７５に記載の方法。
【請求項77】
前記変異プロファイルが標準的がんドライバ遺伝子を含まない、請求項７５に記載の方
法。
法。
【請求項78】
前記変異プロファイルが非標準的がんドライバ遺伝子を含み、前記非標準的遺伝子がＧ
ＲＩＮ３ＡまたはＭＹＣである、請求項７５に記載の方法。
ＲＩＮ３ＡまたはＭＹＣである、請求項７５に記載の方法。
【請求項79】
前記断片の長さプロファイルが、少なくとも約８０ｂｐ～１７０ｂｐの断片の長さの範
囲に基づいてセルフリー核酸分子を選択することを含む、請求項４６～７８のいずれかに
記載の方法。
囲に基づいてセルフリー核酸分子を選択することを含む、請求項４６～７８のいずれかに
記載の方法。
【請求項80】
前記断片の長さプロファイルが、少なくとも約１００ｂｐ～１５０ｂｐの断片の長さの
範囲に基づいてセルフリー核酸分子を選択することを含む、請求項４６～７８のいずれか
に記載の方法。
範囲に基づいてセルフリー核酸分子を選択することを含む、請求項４６～７８のいずれか
に記載の方法。
【請求項81】
前記循環腫瘍核酸分子が濃縮されている、請求項７９または８０のいずれかに記載の方
法。
法。
【請求項82】
前記セルフリー核酸試料をフィラーＤＮＡ分子と混合してＤＮＡ混合物を生じることを
さらに含む、請求項４６～８１のいずれかに記載の方法。
さらに含む、請求項４６～８１のいずれかに記載の方法。
【請求項83】
前記フィラーＤＮＡ分子が約５０ｂｐ～８００ｂｐの長さを含む、請求項８２に記載の
方法。
方法。
【請求項84】
前記フィラーＤＮＡ分子が約１００ｂｐ～６００ｂｐの長さを含む、請求項８２に記載
の方法。
の方法。
【請求項85】
前記フィラーＤＮＡ分子が、少なくとも約５％のメチル化フィラーＤＮＡ分子を含む、
請求項８２に記載の方法。
請求項８２に記載の方法。
【請求項86】
前記フィラーＤＮＡ分子が、少なくとも約２０％のメチル化フィラーＤＮＡを含む、請
求項８２に記載の方法。
求項８２に記載の方法。
【請求項87】
前記フィラーＤＮＡ分子が、少なくとも約３０％のメチル化フィラーＤＮＡを含む、請
求項８２に記載の方法。
求項８２に記載の方法。
【請求項88】
前記フィラーＤＮＡ分子が、少なくとも約５０％のメチル化フィラーＤＮＡを含む、請
求項８２に記載の方法。
求項８２に記載の方法。
【請求項89】
前記ＤＮＡ混合物を、メチル化ヌクレオチドに結合するように構成された結合剤とイン
キュベートして濃縮試料を生成することをさらに含む、請求項４６～８８のいずれかに記
載の方法。
キュベートして濃縮試料を生成することをさらに含む、請求項４６～８８のいずれかに記
載の方法。
【請求項90】
前記結合剤が、メチル－ＣｐＧ結合ドメインを含むタンパク質を含む、請求項８９に記
載の方法。
載の方法。
【請求項91】
前記タンパク質がＭＢＤ２タンパク質である、請求項８９に記載の方法。
【請求項92】
前記結合剤が抗体を含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項93】
前記抗体が５－ＭｅＣ抗体である、請求項８９に記載の方法。
【請求項94】
前記抗体が５－ヒドロキシメチルシトシン抗体である、請求項８９に記載の方法。
【請求項95】
前記配列決定が亜硫酸水素塩配列決定を含まない、請求項４６～９４のいずれかに記載
の方法。
の方法。
【請求項96】
前記セルフリー核酸試料が血液試料を含む、請求項４６～９４のいずれかに記載の方法
。
。
【請求項97】
前記血液試料が血漿試料を含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項98】
がん組織の起源を検出することをさらに含む、請求項４６～９７のいずれかに記載の方
法。
法。
【請求項99】
前記対象の生存率の予後を含む報告を生成することをさらに含む、請求項４６～９７の
いずれかに記載の方法。
いずれかに記載の方法。
【請求項100】
前記対象に治療を与えることをさらに含む、請求項４６～９７のいずれかに記載の方法
。
。
【請求項101】
前記疾患の治療に続いて、前記治療が有効であるかどうかを示す第２の報告を与えるこ
とをさらに含む、請求項４６～９７のいずれかに記載の方法。
とをさらに含む、請求項４６～９７のいずれかに記載の方法。
【請求項102】
対象が状態を有するか、または状態を有するリスクがあるかどうかを判定するための方
法であって、
（ａ）前記対象からの試料の少なくとも一部から得たセルフリー核酸分子をアッセイす
る工程、
（ｂ）表５に列挙される差次的メチル化領域（ＤＭＲ）に含まれる前記セルフリー核酸
分子の少なくとも一部のメチル化レベルを検出する工程、および
（ｃ）少なくとも１つのコンピュータプロセッサを使用して、（ｂ）で検出された前記
メチル化レベルを、前記表５に列挙されたＤＭＲに含まれる前記セルフリー核酸分子の対
応する（１つまたは複数の）部分のメチル化レベルと比較する工程を含む、方法。
法であって、
（ａ）前記対象からの試料の少なくとも一部から得たセルフリー核酸分子をアッセイす
る工程、
（ｂ）表５に列挙される差次的メチル化領域（ＤＭＲ）に含まれる前記セルフリー核酸
分子の少なくとも一部のメチル化レベルを検出する工程、および
（ｃ）少なくとも１つのコンピュータプロセッサを使用して、（ｂ）で検出された前記
メチル化レベルを、前記表５に列挙されたＤＭＲに含まれる前記セルフリー核酸分子の対
応する（１つまたは複数の）部分のメチル化レベルと比較する工程を含む、方法。
【請求項103】
前記セルフリー核酸分子がｃｔＤＮＡを含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項104】
前記配列決定分析を実施することを含み、前記配列決定分析がｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ Ｍ
ｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ ＩｍｍｕｎｏＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ（ｃｆＭｅＤＩ
Ｐ）配列決定を含む、請求項１０２に記載の方法。
ｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ ＩｍｍｕｎｏＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ（ｃｆＭｅＤＩ
Ｐ）配列決定を含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項105】
前記検出する工程が、表５に列挙される６つ以上、１０以上、１５以上、２０以上、３
０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、または１００
以上のＤＭＲに含まれる前記核酸分子の少なくとも一部のメチル化レベルを測定すること
を含む、請求項１０２に記載の方法。
０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、または１００
以上のＤＭＲに含まれる前記核酸分子の少なくとも一部のメチル化レベルを測定すること
を含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項106】
対象が疾患の治療を受けた後により高い生存率を有するかどうかを判定する方法であっ
て、
（ａ）前記対象からの試料の少なくとも一部から得たセルフリー核酸分子をアッセイす
る工程、
（ｂ）表６に列挙される差次的メチル化領域（ＤＭＲ）に含まれる前記セルフリー核酸
分子の少なくとも一部のメチル化レベルを検出する工程、および
（ｃ）少なくとも１つのコンピュータプロセッサを使用して、（ｂ）で検出された前記
メチル化レベルを、前記表６に列挙されたＤＭＲに含まれる前記セルフリー核酸分子の対
応する（１つまたは複数の）部分のメチル化レベルと処理する工程を含む、方法。
て、
（ａ）前記対象からの試料の少なくとも一部から得たセルフリー核酸分子をアッセイす
る工程、
（ｂ）表６に列挙される差次的メチル化領域（ＤＭＲ）に含まれる前記セルフリー核酸
分子の少なくとも一部のメチル化レベルを検出する工程、および
（ｃ）少なくとも１つのコンピュータプロセッサを使用して、（ｂ）で検出された前記
メチル化レベルを、前記表６に列挙されたＤＭＲに含まれる前記セルフリー核酸分子の対
応する（１つまたは複数の）部分のメチル化レベルと処理する工程を含む、方法。
【請求項107】
前記セルフリー核酸分子がｃｔＤＮＡを含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項108】
前記検出する工程が、複合体メチル化スコア（ＣＭＳ）を提示することを含む、請求項
１０６に記載の方法。
１０６に記載の方法。
【請求項109】
前記ＣＭＳが、表６に列挙されたＤＭＲのβ値の合計を含む、請求項１０７に記載の方
法。
法。
【請求項110】
ＣＭＳがより高いことが、前記対象の生存率がより低いことを示す、請求項１０７に記
載の方法。
載の方法。
【請求項111】
前記ＣＭＳがｃｔＤＮＡの存在量に依存しない、請求項１０７に記載の方法。
【請求項112】
前記疾患が扁平上皮癌である、請求項１０２～１１１のいずれかに記載の方法。
【請求項113】
前記がんが頭頸部扁平上皮癌である、請求項１１２に記載の方法。
【請求項114】
少なくとも約８０ｂｐ～１７０ｂｐの断片の長さの範囲に基づいてセルフリー核酸分子
を選択することをさらに含む、請求項１０２～１１３のいずれか一項に記載の方法。
を選択することをさらに含む、請求項１０２～１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項115】
対象が疾患を有するか、または疾患を有するリスクがあるかどうかを判定するためのシ
ステムであって、
（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長
さプロファイルのうちの少なくとも１つのプロファイルを生成するために前記対象から得
られたセルフリー核酸試料に由来する複数の核酸分子をシーケンシングに供する工程、お
よび
前記対象が前記疾患を有するかまたは前記疾患のリスクがあるかどうかを少なくとも８
０％の感度または少なくとも約９０％の特異度で判定するために前記少なくとも１つのプ
ロファイルを処理する工程であって、前記セルフリー核酸試料が３０ｎｇ／ｍｌ未満の前
記複数の核酸分子を含む、処理する工程
を含むプロセスを実施するように個別にまたは集合的にプログラムされた１つまたは複
数のコンピュータプロセッサを含む、システム。
ステムであって、
（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長
さプロファイルのうちの少なくとも１つのプロファイルを生成するために前記対象から得
られたセルフリー核酸試料に由来する複数の核酸分子をシーケンシングに供する工程、お
よび
前記対象が前記疾患を有するかまたは前記疾患のリスクがあるかどうかを少なくとも８
０％の感度または少なくとも約９０％の特異度で判定するために前記少なくとも１つのプ
ロファイルを処理する工程であって、前記セルフリー核酸試料が３０ｎｇ／ｍｌ未満の前
記複数の核酸分子を含む、処理する工程
を含むプロセスを実施するように個別にまたは集合的にプログラムされた１つまたは複
数のコンピュータプロセッサを含む、システム。
【請求項116】
対象のセルフリー核酸試料を処理して、前記対象が疾患を有するかまたは疾患を有する
リスクがあるかどうかを判定するシステムであって、
（ａ）複数の核酸分子を含む前記セルフリー核酸試料を得る工程、
（ｂ）前記複数の核酸分子またはその誘導体を配列決定に供して、複数の配列決定リー
ドを生成する工程、
（ｃ）前記複数の配列決定リードをコンピュータ処理して、前記複数の核酸分子につい
て、（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の
長さプロファイルを同定する工程、および
（ｄ）前記対象が前記疾患を有するかまたは有するリスクがあるかどうかを判定するた
めに、少なくとも前記メチル化プロファイル、前記変異プロファイルおよび前記断片の長
さプロファイルを使用する工程を含むプロセスを実施するように個別にまたは集合的にプ
ログラムされた１つまたは複数のコンピュータプロセッサを含む、システム。
リスクがあるかどうかを判定するシステムであって、
（ａ）複数の核酸分子を含む前記セルフリー核酸試料を得る工程、
（ｂ）前記複数の核酸分子またはその誘導体を配列決定に供して、複数の配列決定リー
ドを生成する工程、
（ｃ）前記複数の配列決定リードをコンピュータ処理して、前記複数の核酸分子につい
て、（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の
長さプロファイルを同定する工程、および
（ｄ）前記対象が前記疾患を有するかまたは有するリスクがあるかどうかを判定するた
めに、少なくとも前記メチル化プロファイル、前記変異プロファイルおよび前記断片の長
さプロファイルを使用する工程を含むプロセスを実施するように個別にまたは集合的にプ
ログラムされた１つまたは複数のコンピュータプロセッサを含む、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
本願は、２０２０年６月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／０４１，１５１号
の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本願は、２０２０年６月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／０４１，１５１号
の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）は、日常的な臨床的な使用のための非侵襲的な腫瘍特異
的バイオマーカーとしての可能性をいっそう実証している。ｃｔＤＮＡは、主に細胞死を
経ている腫瘍細胞に由来し、血液を含む様々な体液の循環に放出される。ほとんどのがん
患者において、血液由来のセルフリーＤＮＡの大部分は末梢血白血球（ＰＢＬ）に由来す
る。したがって、ｃｔＤＮＡの検出および定量には、腫瘍由来の遺伝的およびエピジェネ
ティックな変化の同定が必要である。さらに、観察されたｃｔＤＮＡの画分は、腫瘍の原
発部位および疾患の負荷を含むいくつかの因子に応じて、診断時の全セルフリーＤＮＡの
０．１％未満～９０％の範囲であり得る。ｃｔＤＮＡは、腫瘍の分子状況および疾患の負
荷に対する非侵襲的なアクセスをもたらしている。特に、低い存在量のｃｔＤＮＡを有す
る対象において、高感度でｃｔＤＮＡを検出する方法が、必要である。
的バイオマーカーとしての可能性をいっそう実証している。ｃｔＤＮＡは、主に細胞死を
経ている腫瘍細胞に由来し、血液を含む様々な体液の循環に放出される。ほとんどのがん
患者において、血液由来のセルフリーＤＮＡの大部分は末梢血白血球（ＰＢＬ）に由来す
る。したがって、ｃｔＤＮＡの検出および定量には、腫瘍由来の遺伝的およびエピジェネ
ティックな変化の同定が必要である。さらに、観察されたｃｔＤＮＡの画分は、腫瘍の原
発部位および疾患の負荷を含むいくつかの因子に応じて、診断時の全セルフリーＤＮＡの
０．１％未満～９０％の範囲であり得る。ｃｔＤＮＡは、腫瘍の分子状況および疾患の負
荷に対する非侵襲的なアクセスをもたらしている。特に、低い存在量のｃｔＤＮＡを有す
る対象において、高感度でｃｔＤＮＡを検出する方法が、必要である。
【0003】
参照による組み込み
個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれること
を示しているかのように、それと同程度に、本明細書にて言及されるすべての刊行物、特
許、および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれること
を示しているかのように、それと同程度に、本明細書にて言及されるすべての刊行物、特
許、および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
態様において、対象のがん細胞からｃｔＤＮＡが存在することを検出する方法であって
、
（ａ）対象からセルフリーＤＮＡの試料を得る工程、
（ｂ）試料をライブラリ調製に供して、セルフリーメチル化ＤＮＡのその後の配列決定
を可能にする工程、
（ｃ）第１の量のフィラーＤＮＡが試料に添加されていてもよく、フィラーＤＮＡの少
なくとも一部がメチル化され、次いで、さらに、試料を変性されていてもよい工程、
（ｄ）メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を用いたセルフリーメチル化ＤＮＡ
を捕捉する工程、
（ｅ）捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡを配列決定する工程、
（ｆ）健常な個体およびがんの個体由来の対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列を用い
て、捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの配列を比較する工程、
（ｇ）捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの１つ以上の配列とがんの個体由来のセル
フリーメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合、がん細胞由来のＤ
ＮＡの存在を同定する工程
を含み、捕捉する工程、比較する工程または同定する工程の少なくとも１つにおいて、
対象のセルフリーメチル化ＤＮＡは、断片の長さのメトリックに従って亜集団に限定され
る、方法が提供される。
、
（ａ）対象からセルフリーＤＮＡの試料を得る工程、
（ｂ）試料をライブラリ調製に供して、セルフリーメチル化ＤＮＡのその後の配列決定
を可能にする工程、
（ｃ）第１の量のフィラーＤＮＡが試料に添加されていてもよく、フィラーＤＮＡの少
なくとも一部がメチル化され、次いで、さらに、試料を変性されていてもよい工程、
（ｄ）メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を用いたセルフリーメチル化ＤＮＡ
を捕捉する工程、
（ｅ）捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡを配列決定する工程、
（ｆ）健常な個体およびがんの個体由来の対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列を用い
て、捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの配列を比較する工程、
（ｇ）捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの１つ以上の配列とがんの個体由来のセル
フリーメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合、がん細胞由来のＤ
ＮＡの存在を同定する工程
を含み、捕捉する工程、比較する工程または同定する工程の少なくとも１つにおいて、
対象のセルフリーメチル化ＤＮＡは、断片の長さのメトリックに従って亜集団に限定され
る、方法が提供される。
【0005】
態様として、本開示は、対象が疾患を有するか、または疾患を有するリスクがあるかど
うかを判定する方法を提供する。方法は、（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プ
ロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルからなる群から選択される少なく
とも１つのプロファイルを生成するために対象から得られたセルフリー核酸試料に由来す
る複数の核酸分子をシーケンシングに供する工程、および前記対象が前記疾患を有するか
または疾患のリスクがあるかどうかを少なくとも８０％の感度または少なくとも約９０％
の特異度で判定するために前記少なくとも１つのプロファイルを処理する工程であって、
前記セルフリー核酸試料が３０ナノグラム（ｎｇ）／ミリリットル（ｍｌ）未満の複数の
核酸分子を含む、処理する工程を含む。
うかを判定する方法を提供する。方法は、（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プ
ロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルからなる群から選択される少なく
とも１つのプロファイルを生成するために対象から得られたセルフリー核酸試料に由来す
る複数の核酸分子をシーケンシングに供する工程、および前記対象が前記疾患を有するか
または疾患のリスクがあるかどうかを少なくとも８０％の感度または少なくとも約９０％
の特異度で判定するために前記少なくとも１つのプロファイルを処理する工程であって、
前記セルフリー核酸試料が３０ナノグラム（ｎｇ）／ミリリットル（ｍｌ）未満の複数の
核酸分子を含む、処理する工程を含む。
【0006】
いくつかの実施形態では、セルフリー核酸試料は、１０ｎｇ／ｍｌ未満の前記複数の核
酸分子を含む。いくつかの実施形態では、セルフリー核酸試料は、５ｎｇ／ｍｌ未満の前
記複数の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、セルフリー核酸試料は、１ｎｇ／ｍ
ｌ未満の前記複数の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）に供する工程が、
（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）からなる群から選択される少なくとも２つのプロファ
イルを生成する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのプロファイルは、前記メチ
ル化プロファイルおよび前記断片の長さプロファイルを含む。
酸分子を含む。いくつかの実施形態では、セルフリー核酸試料は、５ｎｇ／ｍｌ未満の前
記複数の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、セルフリー核酸試料は、１ｎｇ／ｍ
ｌ未満の前記複数の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）に供する工程が、
（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）からなる群から選択される少なくとも２つのプロファ
イルを生成する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのプロファイルは、前記メチ
ル化プロファイルおよび前記断片の長さプロファイルを含む。
【0007】
いくつかの実施形態では、少なくとも２つのプロファイルは、前記変異プロファイルお
よび前記断片の長さプロファイルを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのプ
ロファイルは、前記メチル化プロファイルおよび前記変異プロファイルを含む。いくつか
の実施形態では、（ａ）を供する工程が、前記メチル化プロファイル、前記変異プロファ
イルおよび前記断片の長さプロファイルを生成する。
よび前記断片の長さプロファイルを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのプ
ロファイルは、前記メチル化プロファイルおよび前記変異プロファイルを含む。いくつか
の実施形態では、（ａ）を供する工程が、前記メチル化プロファイル、前記変異プロファ
イルおよび前記断片の長さプロファイルを生成する。
【0008】
別の態様では、本開示は、対象のセルフリー核酸試料を処理して、前記対象が疾患を有
するかまたは疾患を有するリスクがあるかどうかを判定する方法を提供する。方法は、複
数の核酸分子を含む前記セルフリー核酸試料を得る工程、前記複数の核酸分子またはその
誘導体を配列決定に供して、複数の配列決定リードを生成する工程、前記複数の配列決定
リードをコンピュータ処理して、前記複数の核酸分子について、（ｉ）メチル化プロファ
イル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルを同定する
工程、および前記対象が前記疾患を有するかまたは有するリスクがあるかどうかを判定す
るために、少なくとも前記メチル化プロファイル、前記変異プロファイルおよび前記断片
の長さプロファイルを使用する工程を含む。
するかまたは疾患を有するリスクがあるかどうかを判定する方法を提供する。方法は、複
数の核酸分子を含む前記セルフリー核酸試料を得る工程、前記複数の核酸分子またはその
誘導体を配列決定に供して、複数の配列決定リードを生成する工程、前記複数の配列決定
リードをコンピュータ処理して、前記複数の核酸分子について、（ｉ）メチル化プロファ
イル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルを同定する
工程、および前記対象が前記疾患を有するかまたは有するリスクがあるかどうかを判定す
るために、少なくとも前記メチル化プロファイル、前記変異プロファイルおよび前記断片
の長さプロファイルを使用する工程を含む。
【0009】
いくつかの実施形態では、疾患はがんを含む。いくつかの実施形態では、がんが、副腎
がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳／ＣＮＳ腫瘍、乳がん、キャッスルマ
ン病、子宮頸がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリーの
腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、妊娠
性栄養膜疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭および下咽頭がん、白血病（急
性リンパ球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、慢性骨髄単球性）、肝臓がん
、肺がん（非小細胞、小細胞、肺カルチノイド腫瘍）、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、悪性
中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽
細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、陰茎がん、
下垂体がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫－成人軟部組織
がん、皮膚がん（基底細胞および扁平上皮細胞、黒色腫、メルケル細胞）、小腸がん、胃
がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュト
レームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、扁平上皮癌、および頭頸部扁平上皮癌か
らなる群から選択されるがんからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、がん
は扁平上皮癌である。いくつかの実施形態では、がんは頭頸部扁平上皮癌である。
がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳／ＣＮＳ腫瘍、乳がん、キャッスルマ
ン病、子宮頸がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリーの
腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、妊娠
性栄養膜疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭および下咽頭がん、白血病（急
性リンパ球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、慢性骨髄単球性）、肝臓がん
、肺がん（非小細胞、小細胞、肺カルチノイド腫瘍）、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、悪性
中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽
細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、陰茎がん、
下垂体がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫－成人軟部組織
がん、皮膚がん（基底細胞および扁平上皮細胞、黒色腫、メルケル細胞）、小腸がん、胃
がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュト
レームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、扁平上皮癌、および頭頸部扁平上皮癌か
らなる群から選択されるがんからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、がん
は扁平上皮癌である。いくつかの実施形態では、がんは頭頸部扁平上皮癌である。
【0010】
いくつかの実施形態では、複数のセルフリー核酸分子は、循環腫瘍核酸分子を含む。い
くつかの実施形態では、循環腫瘍核酸は循環腫瘍ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では
、循環腫瘍核酸は循環腫瘍ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、メチル化プロファイ
ルは、複数の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）を含む。いくつかの実施形態では、複数のＤ
ＭＲはｃｔＤＮＡ由来である。いくつかの実施形態では、末梢血白血球に由来する複数の
ＤＭＲがメチル化プロファイルから除去される。いくつかの実施形態では、複数のＤＭＲ
が、正常で健常な対象からの対応するゲノム領域と比較して低メチル化レベルを有する少
なくとも約５６のゲノム領域を含む。いくつかの実施形態では、複数のＤＭＲは、正常で
健常な対象からの対応するゲノム領域と比較して、過剰メチル化レベルを有する少なくと
も約９４１のゲノム領域を含む。いくつかの実施形態では、ＤＭＲは、少なくとも約３０
０ｂｐのサイズを含む。いくつかの実施形態では、ＤＭＲは、少なくとも約１００ｂｐ～
少なくとも約２００ｂｐのサイズを含む。いくつかの実施形態では、ＤＭＲは、少なくと
も約１００ｂｐ～少なくとも約１５０ｂｐのサイズを含む。いくつかの実施形態では、Ｄ
ＭＲが少なくとも８のＣｐＧゲノムアイランドを含む。いくつかの実施形態では、正常で
健常な対象は、前記対象と同じリスク因子のセットを含む。
くつかの実施形態では、循環腫瘍核酸は循環腫瘍ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では
、循環腫瘍核酸は循環腫瘍ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、メチル化プロファイ
ルは、複数の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）を含む。いくつかの実施形態では、複数のＤ
ＭＲはｃｔＤＮＡ由来である。いくつかの実施形態では、末梢血白血球に由来する複数の
ＤＭＲがメチル化プロファイルから除去される。いくつかの実施形態では、複数のＤＭＲ
が、正常で健常な対象からの対応するゲノム領域と比較して低メチル化レベルを有する少
なくとも約５６のゲノム領域を含む。いくつかの実施形態では、複数のＤＭＲは、正常で
健常な対象からの対応するゲノム領域と比較して、過剰メチル化レベルを有する少なくと
も約９４１のゲノム領域を含む。いくつかの実施形態では、ＤＭＲは、少なくとも約３０
０ｂｐのサイズを含む。いくつかの実施形態では、ＤＭＲは、少なくとも約１００ｂｐ～
少なくとも約２００ｂｐのサイズを含む。いくつかの実施形態では、ＤＭＲは、少なくと
も約１００ｂｐ～少なくとも約１５０ｂｐのサイズを含む。いくつかの実施形態では、Ｄ
ＭＲが少なくとも８のＣｐＧゲノムアイランドを含む。いくつかの実施形態では、正常で
健常な対象は、前記対象と同じリスク因子のセットを含む。
【0011】
いくつかの実施形態では、変異プロファイルは、ミスセンス変異体、ナンセンス変異体
、欠失変異体、挿入変異体、重複変異体、逆位変異体、フレームシフト変異体、または反
復伸長変異体を含む。いくつかの実施形態では、複数の末梢血白血球から得られたゲノム
ＤＮＡ試料に存在する任意の変異体であって、前記複数の末梢血白血球が前記対象から得
られ、前記変異プロファイルから除去される、変異体。いくつかの実施形態では、クロー
ン造血に由来する任意の変異体が前記変異プロファイルから除去される。いくつかの実施
形態では、変異プロファイルが、遺伝子ＤＮＭＴ３Ａ、ＴＥＴ２、またはＡＳＸＬ１の変
異体を含まない。いくつかの実施形態では、変異プロファイルは、標準的ながんドライバ
遺伝子を含まない。いくつかの実施形態では、変異プロファイルが非標準的がんドライバ
遺伝子を含み、前記非標準的遺伝子がＧＲＩＮ３ＡまたはＭＹＣである。
、欠失変異体、挿入変異体、重複変異体、逆位変異体、フレームシフト変異体、または反
復伸長変異体を含む。いくつかの実施形態では、複数の末梢血白血球から得られたゲノム
ＤＮＡ試料に存在する任意の変異体であって、前記複数の末梢血白血球が前記対象から得
られ、前記変異プロファイルから除去される、変異体。いくつかの実施形態では、クロー
ン造血に由来する任意の変異体が前記変異プロファイルから除去される。いくつかの実施
形態では、変異プロファイルが、遺伝子ＤＮＭＴ３Ａ、ＴＥＴ２、またはＡＳＸＬ１の変
異体を含まない。いくつかの実施形態では、変異プロファイルは、標準的ながんドライバ
遺伝子を含まない。いくつかの実施形態では、変異プロファイルが非標準的がんドライバ
遺伝子を含み、前記非標準的遺伝子がＧＲＩＮ３ＡまたはＭＹＣである。
【0012】
いくつかの実施形態では、断片の長さプロファイルは、少なくとも約８０ｂｐ～１７０
ｂｐの断片の長さの範囲に基づいてセルフリー核酸分子を選択することを含む。いくつか
の実施形態では、断片の長さプロファイルは、少なくとも約１００ｂｐ～１５０ｂｐの断
片の長さの範囲に基づいてセルフリー核酸分子を選択することを含む。いくつかの実施形
態では、循環腫瘍核酸分子が濃縮される。
ｂｐの断片の長さの範囲に基づいてセルフリー核酸分子を選択することを含む。いくつか
の実施形態では、断片の長さプロファイルは、少なくとも約１００ｂｐ～１５０ｂｐの断
片の長さの範囲に基づいてセルフリー核酸分子を選択することを含む。いくつかの実施形
態では、循環腫瘍核酸分子が濃縮される。
【0013】
いくつかの実施形態では、方法は、前記セルフリー核酸試料をフィラーＤＮＡ分子と混
合してＤＮＡ混合物を生じることをさらに含む。いくつかの実施形態では、フィラーＤＮ
Ａ分子は、約５０ｂｐ～８００ｂｐの長さを含む。いくつかの実施形態では、フィラーＤ
ＮＡ分子は、約１００ｂｐ～６００ｂｐの長さを含む。いくつかの実施形態では、フィラ
ーＤＮＡ分子は、少なくとも約５％のメチル化フィラーＤＮＡ分子を含む。いくつかの実
施形態では、フィラーＤＮＡ分子は、少なくとも約２０％のメチル化フィラーＤＮＡを含
む。いくつかの実施形態では、フィラーＤＮＡ分子は、少なくとも約３０％のメチル化フ
ィラーＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、フィラーＤＮＡ分子は、少なくとも約５
０％のメチル化フィラーＤＮＡを含む。
合してＤＮＡ混合物を生じることをさらに含む。いくつかの実施形態では、フィラーＤＮ
Ａ分子は、約５０ｂｐ～８００ｂｐの長さを含む。いくつかの実施形態では、フィラーＤ
ＮＡ分子は、約１００ｂｐ～６００ｂｐの長さを含む。いくつかの実施形態では、フィラ
ーＤＮＡ分子は、少なくとも約５％のメチル化フィラーＤＮＡ分子を含む。いくつかの実
施形態では、フィラーＤＮＡ分子は、少なくとも約２０％のメチル化フィラーＤＮＡを含
む。いくつかの実施形態では、フィラーＤＮＡ分子は、少なくとも約３０％のメチル化フ
ィラーＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、フィラーＤＮＡ分子は、少なくとも約５
０％のメチル化フィラーＤＮＡを含む。
【0014】
いくつかの実施形態では、方法は、前記ＤＮＡ混合物を、メチル化ヌクレオチドに結合
するように構成された結合剤とインキュベートして濃縮試料を生成することをさらに含む
。いくつかの実施形態では、結合剤は、メチル－ＣｐＧ結合ドメインを含むタンパク質を
含む。いくつかの実施形態では、タンパク質はＭＢＤ２タンパク質である。いくつかの実
施形態では、結合剤は抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体は５－ＭｅＣ抗体であ
る。いくつかの実施形態では、抗体は５－ヒドロキシメチルシトシン抗体である。いくつ
かの実施形態では、配列決定は亜硫酸水素塩配列決定を含まない。いくつかの実施形態で
は、セルフリー核酸試料は血液試料を含む。いくつかの実施形態では、血液試料は血漿試
料を含む。いくつかの実施形態では、方法は、がん組織の起源を検出することをさらに含
む。
するように構成された結合剤とインキュベートして濃縮試料を生成することをさらに含む
。いくつかの実施形態では、結合剤は、メチル－ＣｐＧ結合ドメインを含むタンパク質を
含む。いくつかの実施形態では、タンパク質はＭＢＤ２タンパク質である。いくつかの実
施形態では、結合剤は抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体は５－ＭｅＣ抗体であ
る。いくつかの実施形態では、抗体は５－ヒドロキシメチルシトシン抗体である。いくつ
かの実施形態では、配列決定は亜硫酸水素塩配列決定を含まない。いくつかの実施形態で
は、セルフリー核酸試料は血液試料を含む。いくつかの実施形態では、血液試料は血漿試
料を含む。いくつかの実施形態では、方法は、がん組織の起源を検出することをさらに含
む。
【0015】
いくつかの実施形態では、方法は、前記対象の生存率の予後を含む報告を生成すること
をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、前記対象に治療を与えることをさらに
含む。いくつかの実施形態では、前記疾患の治療に続いて、方法は、前記治療が有効であ
るかどうかを示す第２の報告を与えることをさらに含む。
をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、前記対象に治療を与えることをさらに
含む。いくつかの実施形態では、前記疾患の治療に続いて、方法は、前記治療が有効であ
るかどうかを示す第２の報告を与えることをさらに含む。
【0016】
別の態様において、本開示は、対象が状態を有するか、または状態を有するリスクがあ
るかどうかを判定するための方法であって、前記対象からの試料の少なくとも一部から得
たセルフリー核酸分子をアッセイする工程、表５に列挙される差次的メチル化領域（ＤＭ
Ｒ）に含まれる前記セルフリー核酸分子の少なくとも一部のメチル化レベルを検出する工
程、および少なくとも１つのコンピュータプロセッサを使用して、（ｂ）で検出された前
記メチル化レベルを、前記表５に列挙されたＤＭＲに含まれる前記セルフリー核酸分子の
対応する（１つまたは複数の）部分のメチル化レベルと比較する工程を含む、方法を提供
する。
るかどうかを判定するための方法であって、前記対象からの試料の少なくとも一部から得
たセルフリー核酸分子をアッセイする工程、表５に列挙される差次的メチル化領域（ＤＭ
Ｒ）に含まれる前記セルフリー核酸分子の少なくとも一部のメチル化レベルを検出する工
程、および少なくとも１つのコンピュータプロセッサを使用して、（ｂ）で検出された前
記メチル化レベルを、前記表５に列挙されたＤＭＲに含まれる前記セルフリー核酸分子の
対応する（１つまたは複数の）部分のメチル化レベルと比較する工程を含む、方法を提供
する。
【0017】
いくつかの実施形態では、セルフリー核酸分子はｃｔＤＮＡを含む。いくつかの実施形
態では、方法は、配列決定分析を実施することを含み、前記配列決定分析がｃｅｌｌ－ｆ
ｒｅｅ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ ＩｍｍｕｎｏＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ（ｃ
ｆＭｅＤＩＰ）配列決定を含む。いくつかの実施形態では、検出する工程が、表５に列挙
される６つ以上、１０以上、１５以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０
以上、７０以上、８０以上、９０以上、または１００以上のＤＭＲに含まれる前記核酸分
子の少なくとも一部のメチル化レベルを測定することを含む。
態では、方法は、配列決定分析を実施することを含み、前記配列決定分析がｃｅｌｌ－ｆ
ｒｅｅ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ ＩｍｍｕｎｏＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ（ｃ
ｆＭｅＤＩＰ）配列決定を含む。いくつかの実施形態では、検出する工程が、表５に列挙
される６つ以上、１０以上、１５以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０
以上、７０以上、８０以上、９０以上、または１００以上のＤＭＲに含まれる前記核酸分
子の少なくとも一部のメチル化レベルを測定することを含む。
【0018】
別の態様では、本開示は、対象が疾患の治療を受けた後により高い生存率を有するかど
うかを判定する方法であって、前記対象からの試料の少なくとも一部からのセルフリー核
酸分子をアッセイする工程、表６に列挙される差次的メチル化領域（ＤＭＲ）に含まれる
前記セルフリー核酸分子の少なくとも一部のメチル化レベルを検出する工程、および少な
くとも１つのコンピュータプロセッサを使用して、（ｂ）で検出された前記メチル化レベ
ルを、表６に列挙される前記ＤＭＲに含まれる前記セルフリー核酸分子の対応する（１つ
または複数の）部分のメチル化レベルに処理することを含む方法を提供する。
うかを判定する方法であって、前記対象からの試料の少なくとも一部からのセルフリー核
酸分子をアッセイする工程、表６に列挙される差次的メチル化領域（ＤＭＲ）に含まれる
前記セルフリー核酸分子の少なくとも一部のメチル化レベルを検出する工程、および少な
くとも１つのコンピュータプロセッサを使用して、（ｂ）で検出された前記メチル化レベ
ルを、表６に列挙される前記ＤＭＲに含まれる前記セルフリー核酸分子の対応する（１つ
または複数の）部分のメチル化レベルに処理することを含む方法を提供する。
【0019】
いくつかの実施形態では、セルフリー核酸分子はｃｔＤＮＡを含む。いくつかの実施形
態では、検出する工程は、複合体メチル化スコア（ＣＭＳ）を提供することを含む。いく
つかの実施形態では、ＣＭＳは、表６に列挙されたＤＭＲのβ値の合計を含む。いくつか
の実施形態では、より高いＣＭＳは、前記対象の生存率がより低いことを示す。いくつか
の実施形態では、ＣＭＳは、ｃｔＤＮＡの存在量に依存しない。いくつかの実施形態では
、疾患は扁平上皮癌である。いくつかの実施形態では、がんは頭頸部扁平上皮癌である。
態では、検出する工程は、複合体メチル化スコア（ＣＭＳ）を提供することを含む。いく
つかの実施形態では、ＣＭＳは、表６に列挙されたＤＭＲのβ値の合計を含む。いくつか
の実施形態では、より高いＣＭＳは、前記対象の生存率がより低いことを示す。いくつか
の実施形態では、ＣＭＳは、ｃｔＤＮＡの存在量に依存しない。いくつかの実施形態では
、疾患は扁平上皮癌である。いくつかの実施形態では、がんは頭頸部扁平上皮癌である。
【0020】
別の態様では、本開示は、対象が疾患を有するか、または疾患を有するリスクがあるか
どうかを判定するためのシステムであって、（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異
プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルのうちの少なくとも１つのプロ
ファイルを生成するために前記対象から得られたセルフリー核酸試料に由来する複数の核
酸分子をシーケンシングに供する工程、および前記対象が前記疾患を有するかまたは前記
疾患のリスクがあるかどうかを少なくとも８０％の感度または少なくとも約９０％の特異
度で判定するために前記少なくとも１つのプロファイルを処理する工程であって、前記セ
ルフリー核酸試料が３０ｎｇ／ｍｌ未満の前記複数の核酸分子を含む、処理する工程を含
むプロセスを実施するように個別にまたは集合的にプログラムされた１つまたは複数のコ
ンピュータプロセッサを含むシステムを提供する。
どうかを判定するためのシステムであって、（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異
プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルのうちの少なくとも１つのプロ
ファイルを生成するために前記対象から得られたセルフリー核酸試料に由来する複数の核
酸分子をシーケンシングに供する工程、および前記対象が前記疾患を有するかまたは前記
疾患のリスクがあるかどうかを少なくとも８０％の感度または少なくとも約９０％の特異
度で判定するために前記少なくとも１つのプロファイルを処理する工程であって、前記セ
ルフリー核酸試料が３０ｎｇ／ｍｌ未満の前記複数の核酸分子を含む、処理する工程を含
むプロセスを実施するように個別にまたは集合的にプログラムされた１つまたは複数のコ
ンピュータプロセッサを含むシステムを提供する。
【0021】
別の態様では、本開示は、対象のセルフリー核酸試料を処理して、前記対象が疾患を有
するかまたは疾患を有するリスクがあるかどうかを判定するシステムであって、複数の核
酸分子を含む前記セルフリー核酸試料を得る工程、前記複数の核酸分子またはその誘導体
を配列決定に供して、複数の配列決定リードを生成する工程、前記複数の配列決定リード
をコンピュータ処理して、前記複数の核酸分子について、（ｉ）メチル化プロファイル、
（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルを同定する工程、
および前記対象が前記疾患を有するかまたは有するリスクがあるかどうかを判定するため
に、少なくとも前記メチル化プロファイル、前記変異プロファイルおよび前記断片の長さ
プロファイルを使用する工程を含むプロセスを実施するように個別にまたは集合的にプロ
グラムされた１つまたは複数のコンピュータプロセッサを含む、システムを提供する。
するかまたは疾患を有するリスクがあるかどうかを判定するシステムであって、複数の核
酸分子を含む前記セルフリー核酸試料を得る工程、前記複数の核酸分子またはその誘導体
を配列決定に供して、複数の配列決定リードを生成する工程、前記複数の配列決定リード
をコンピュータ処理して、前記複数の核酸分子について、（ｉ）メチル化プロファイル、
（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルを同定する工程、
および前記対象が前記疾患を有するかまたは有するリスクがあるかどうかを判定するため
に、少なくとも前記メチル化プロファイル、前記変異プロファイルおよび前記断片の長さ
プロファイルを使用する工程を含むプロセスを実施するように個別にまたは集合的にプロ
グラムされた１つまたは複数のコンピュータプロセッサを含む、システムを提供する。
【0022】
本発明の好ましい実施形態のこれらおよび他の特徴は、添付の図面を参照する以下の詳
細な説明においてより明らかになるであろう。
細な説明においてより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】ＣＡＰＰ－ＳｅｑによるｃｔＤＮＡの検出のためのＰＢＬフィルタリングの利用。Ａ）一致した患者の血漿および／またはＰＢＬにおいて同定された候補のＳＮＶの変異対立遺伝子画分。ピアソンの相関を、一致した患者の血漿およびＰＢＬの両方に厳密に見出されるＳＮＶに対して行った。患者の血漿にのみ見られる候補ＳＮＶを破線の赤い箱の内部に示す。Ｂ）一致した患者の血漿およびＰＢＬの両方において同定された候補ＳＮＶの発症。上段のヒストグラムは、患者ごとのＳＮＶの数を示し、右側のヒストグラムは、特定の遺伝子が変異している患者の数を示す。Ｃ）ＰＢＬ関連ＳＮＶの除去前後のＨＮＳＣＣ患者のｃｆＤＮＡ（赤色円）およびＰＢＬ（青色円）にわたる候補ＳＮＶの平均ＭＡＦ。ＰＢＬフィルタリング後に存在しないＳＮＶを有する患者は、ｃｔＤＮＡの偽陽性検出を示す。Ｅ）２０／３２のＨＮＳＣＣ患者において同定された選択されたＰＢＬフィルタリングされたＳＮＶの発症。上のヒストグラムおよび右のヒストグラムは、（Ｂ）で前述したようなヒストグラムを示す。Ｆ）すべてのＨＮＳＣＣ患者にわたるＰＢＬ濾過されたＳＮＶの平均変異対立遺伝子のパーセンテージ。患者ごとの各ＳＮＶについて、変異対立遺伝子のパーセンテージを、ＳＮＶ塩基対の位置と重複するネイティブ配列を含むリードと比較して、目的のＳＮＶを含むリードの画分によって計算した。
【図2】ＣＡＰＰ－ＳｅｑによるｃｔＤＮＡの検出のためのＰＢＬフィルタリングの利用。Ｂ）一致した患者の血漿および／またはＰＢＬにおいて同定された候補のＳＮＶの変異対立遺伝子画分。ピアソンの相関を、一致した患者の血漿およびＰＢＬの両方に厳密に見出されるＳＮＶに対して行った。患者の血漿にのみ見られる候補ＳＮＶを破線の赤い箱の内部に示す。Ｃ）一致した患者の血漿およびＰＢＬの両方において同定された候補ＳＮＶの発症。上段のヒストグラムは、患者ごとのＳＮＶの数を示し、右側のヒストグラムは、特定の遺伝子が変異している患者の数を示す。Ｄ）ＰＢＬ関連ＳＮＶの除去前後のＨＮＳＣＣ患者のｃｆＤＮＡ（赤色円）およびＰＢＬ（青色円）にわたる候補ＳＮＶの平均ＭＡＦ。ＰＢＬフィルタリング後に存在しないＳＮＶを有する患者は、ｃｔＤＮＡの偽陽性検出を示す。Ｅ）２０／３２のＨＮＳＣＣ患者において同定された選択されたＰＢＬフィルタリングされたＳＮＶの発症。上のヒストグラムおよび右のヒストグラムは、（Ｂ）で前述したようなヒストグラムを示す。Ｆ）すべてのＨＮＳＣＣ患者にわたるＰＢＬ濾過されたＳＮＶの平均変異対立遺伝子のパーセンテージ。患者ごとの各ＳＮＶについて、変異対立遺伝子のパーセンテージを、ＳＮＶ塩基対の位置と重複するネイティブ配列を含むリードと比較して、目的のＳＮＶを含むリードの画分によって、計算した。
【図3】ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによるｃｔＤＮＡの検出のための情報領域の同定。Ｂ）ＦａＤｕゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）［１×１×５２の比較］、一致しないＰＢＬのｇＤＮＡ［１×５１×５２の比較］、および一致するＰＢＬのｇＤＮＡ［１×１×５２の比較］ＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルに対する、患者および健常なドナー由来の８以上のＣｐＧとの３００ｂｐの非重複ウィンドウのピアソンの相関（ｎ＝５２）。Ｃ）健常なドナー（右）およびＨＮＳＣＣ（左）のＰＢＬ ＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルにおけるインシリコのＰＢＬ枯渇のパフォーマンス。絶対的なメチル化スコアを、ＭｅＤＩＰ－ｓｅｑカウントからＭｅＤＥＳｔｒａｎｄ（方法）によって計算した。ＰＢＬ枯渇前の３００ｂｐの非重複ウィンドウ（青色）は、８以上のＣｐＧを有する１番染色体から２２番染色体までのすべてのウィンドウに対応する（ｎ＝７０２，４８８）。ＰＢＬ枯渇後の３００ｂｐの非重複ウィンドウ（赤色）は、健常なドナーのＰＢＬにわたる絶対的なメチル化の中央値が＜０．１である追加のフィルターを含む（ｎ＝９９，９９７）。Ｄ）ＨＮＳＣＣおよび健常なドナーのｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルの差次的メチル化分析によるｃｔＤＮＡ検出のワークフロー。ＨＮＳＣＣ関連ｃｆＤＮＡメチル化を同定するために、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ（すなわち、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性、ｎ＝２０）による検出可能なＳＮＶを有するＨＮＳＣＣ患者からのｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルを、ＰＢＬ枯渇ウィンドウ内で健常なドナー（ｎ＝２０）と比較した。過剰メチル化領域および低メチル化領域は、ＦＤＲ＜１０％で健常なドナーと比較して、ＨＮＳＣＣコホートにおいてメチル化がより高いまたはより低い領域として示される。Ｅ）ＣｐＧ部位によって注釈付けされた過剰メチル化領域の順列分析（ｎ＝１０，０００の全順列）。有意な濃縮／枯渇は、０．０５未満のｐ値により観察されたｚスコアとして示される。Ｆ、ＴＣＧＡ由来の腫瘍特異的メチル化シトシン内の過剰メチル化領域の順列分析（ｎ＝合計１０００の順列）。有意な濃縮／枯渇は、０．０５未満のｐ値により観察されたｚスコアとして示される。
【図4】ＣＡＰＰ－ＳｅｑプロファイルとｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルとの間のｃｔＤＮＡ検出および存在量の一致。Ａ）ＣＡＰＰ－ｓｅｑによるＨＮＳＣＣ患者にわたる検出されたＳＮＶの断片の長さの中央値。各患者について、各ＳＮＶおよび一致する参照対立遺伝子の断片の長さの中央値を測定した。各変異または一致した参照対立遺伝子についての断片の長さの中央値の分布を患者ごとに示す。箱および中心線の端部は、それぞれ上側および下側の四分位および中央値を定義する。単一のＳＮＶを有する場合、色付きの線は、それぞれＳＮＶまたは一致した参照対立遺伝子を含む断片の長さの中央値を示す。Ｂ）ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによるＨＮＳＣＣ過剰メチル化領域内の断片の長さの分布。健常なドナー由来の断片の長さを分析前にプールし、その後の各箱は個々のＨＮＳＣＣのｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルを示す。箱および中心線の端部は、それぞれ上側および下側の四分位および中央値を定義する。個々のＨＮＳＣＣ試料は、過剰メチル化領域内のメチル化（ＲＰＫＭ）の平均の増加に基づいて並べられる。破線の青色線は、すべての健常なドナーにわたる断片の長さの中央値を定義する。Ｃ）１００～２２０ｂｐの断片による過剰ＤＭＲ領域の濃縮と比較した、１００～１５０ｂｐの断片による過剰ＤＭＲ領域の濃縮の比。比率は、解釈を容易にするために増加／減少パーセントに変換した。Ｄ）１００～２２０ｂｐの断片による過剰ＤＭＲ領域の濃縮と比較した、１００～１５０ｂｐの断片による過剰ＤＭＲ領域の濃縮の比。＋の符号は、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑによって検出可能なｃｔＤＮＡを有するＨＮＳＣＣ患者を示す（ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性）。Ｅ）ＨＮＳＣＣの過剰メチル化領域にわたる対数変換されたＲＰＫＭの値による、１００ｂｐ～１５０ｂｐに限定されたｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルの教師あり階層的分類。各ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルのＲＰＫＭの値を、ユークリッド変換の前にｌｏｇ２変換し、Ｗａｒｄの方法を使用してクラスター化した。メチル化クラスターは、ｋ＝４の閾値で定義された。Ｆ）それぞれＣＡＰＰ－ｓｅｑおよびｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ（１００～１５０ｂｐに限定）による、同定されたＳＮＶおよび過剰メチル化領域からの変異対立遺伝子頻度の平均およびＲＰＫＭの平均の関係。点は、ＨＮＳＣＣまたは健常なドナーの血漿由来の個々の試料を示す。実線の赤色線および影付きの灰色領域は、それぞれフィッティングされた線形回帰モデルおよび関連する９５％信頼区間を示す。Ｇ）ＨＮＳＣＣを健常なドナーのｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルと比較する、ＨＮＳＣＣの過剰メチル化領域内のメチル化の値（１００～１５０ｂｐに限定）に基づくＡＵＲＯＣ分析。ｃｔＤＮＡの検出は、メチル化の平均が健常なドナーにわたる最大値を超えた場合と定義した。Ｈ）メチル化クラスター４と比較した、メチル化クラスター１＋２＋３内の患者の全生存のカプラン・マイヤー曲線分析。Ｉ＋Ｊ）ＣＡＰＰ－ＳｅｑおよびｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルからの断片の長さの中央値（Ｉ）と、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑからの断片の長さの中央値と、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルからの１００～１５０：１５１～２２０ｂｐの比（Ｊ）との比較。点は、メチル化クラスター１および２内部の個々のＨＮＳＣＣ試料を定義した。実線の赤色線および網掛けの灰色領域は、それぞれフィッティングされた線形回帰モデルおよび９５％信頼区間を示す。
【図5】ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによって検出されるｃｔＤＮＡ内の特定のメチル化領域の予後の有用性。Ａ）それぞれＣＡＰＰ－ｓｅｑおよびｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ（１００～１５０ｂｐに限定）による、同定された変異および過剰メチル化領域からの変異対立遺伝子画分の平均およびＲＰＫＭの平均の関係。点は、ＨＮＳＣＣまたは健常対照血漿からの個々の試料を示す。実線の赤線：フィッティングされた線形回帰モデル。灰色の境界：９５％信頼区間。Ｂ）ＣＡＰＰ－ＳｅｑおよびｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑの両方による検出可能なｃｔＤＮＡを有する患者の全生存を示すカプラン・マイヤー解析（過剰ＤＭＲ内での健常対照を上回るメチル化の平均）Ｃ）ＴＣＧＡによって提示されるＨＮＳＣＣ原発腫瘍にわたる多変量コックス比例ハザード回帰分析による疾患特異的生存に基づく予後領域の同定（ｎ＝５２０）。領域は、前述のように３００ｂｐウィンドウとして定義した。ヒトメチル化の４５０ＫのデータをＴＣＧＡから得て、各領域と重複するプローブＩＤからのβ値を平均した。予後解析のための候補領域を、固形の隣接する正常組織（ｎ＝５０）と比較した原発腫瘍（ｎ＝５２０）にわたるメチル化の上昇に基づいて選択した（ウィルコクソン検定、調整されたｐ値＜０．０５、ｌｏｇ２ＦＣ＞１）。Ｇ～Ｈ）特定の３００ｂｐ領域（箱）のメチル化から特定の転写産物のＲＮＡ発現までのスピアマンの相関。絶対的なＲ値が０．３以上の領域（灰色の破線で示す）を有意な関連性としてラベル付けした。ＴＣＧＡによって提示されるＨＮＳＣＣ患者の疾患特異的生存についての予後予測であったメチル化領域（ｎ＝５２０）は、赤い輪郭で示されている。ＲＮＡ発現にさらに関連した予後領域を実線の赤色で示す。ＲＮＡ発現に関連する予後メチル化領域の例；（Ｇ）ＯＳＲ１、（Ｈ）ＬＩＮＣ０１３９１を備える。Ｅ）それぞれＺＮＦ３２３／ＺＳＣＡＮ１、ＬＩＮＣ０１３９１、ＧＡＴＡ－ＡＳ１、ＯＳＲ１、およびＳＴＫ３／ＭＳＴ２の発現に影響を及ぼす５つの領域にわたる全メチル化に基づくＨＮＳＣＣ－ＴＣＧＡ患者の全生存期間のカプラン・マイヤー曲線。すべての原発腫瘍にわたって（Ｄ）で以前に同定された５つの領域の全メチル化の中央値より下（Ｂｌｗ ｍｅｄ．青）または上（Ａｂｖ ｍｅｄ．赤）のいずれかであることに基づいて、患者を層別化した。Ｆ）ＣＡＰＰ－Ｓｅｑによる検出可能なｃｔＤＮＡを有するＨＮＳＣＣ血漿コホートについての（Ｅ）に記載されるような全生存のカプラン・マイヤー曲線。予後との関連性を有する５つの遺伝子にわたる総メチル化を計算するために、ＲＰＫＭの値を、生存分析の前に先行して同定されたすべての過剰ＤＭＲ領域にわたって適宜スケーリングした。
【図6】長期モニタリングのためのｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによるｃｔＤＮＡ検出の臨床的有用性。Ａ）ｃｔＤＮＡ動態は、典型的には、治療全体を通して患者にわたって観察される。完全なクリアランスを、診断時の検出されたｃｔＤＮＡから、最初に利用可能な治療中／治療後の時点での検出閾値（すなわち、０．２％）未満のｃｔＤＮＡ存在量の減少への変化と定義した。部分クリアランスは、診断時の検出されたｃｔＤＮＡから、最初に利用可能な治療中／治療後の時点で検出閾値を超えるｃｔＤＮＡ存在量の減少（９０％以上）への変化と定義した。クリアランスなしは、診断時と比較した、治療中／治療後試料におけるｃｔＤＮＡ存在量の増加と定義した。ｌａｓｔＦＵ＝最後のフォローアップ時の試料採取、ＲＴ＝放射線療法。Ｂ）診断時のｃｔＤＮＡ存在量の、ＨＮＳＣＣ患者にわたる最初に利用可能な治療中／治療後の時点までの変化（ｎ＝３０）。赤い線はクリアランスなしの動態を示した患者、灰色の線はクリアランス／部分クリアランスの動態を有する患者を表示する。Ｃ、無再発生存のカプラン・マイヤー曲線。クリアランスの動態（すなわち、クリアランスなし対クリアランス／部分クリアランス）に基づいて患者を層別化した。
【図7】すべてのまたはｃｔＤＮＡが濃縮された断片に対して行われたｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ分析の比較。ｃｔＤＮＡ濃縮断片は、長さが１００～１５０ｂｐの範囲の断片として定義される。Ａ）すべての断片（左）またはｃｔＤＮＡ濃縮断片（右）を含むｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルにおける以前に同定されたＨＮＳＣＣの過剰ＤＭＲのＣＡＰＰ－Ｓｅｑ対ＲＰＫＭの平均値によって同定された変異の変異対立遺伝子頻度。Ｂ）健常なドナーに対するＨＮＳＣＣのｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイル（ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性のみ：赤色、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性および陰性：青色）におけるｃｔＤＮＡ検出についての曲線下面積分析（ＡＵＲＯＣ）。ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性患者を用いた交差検証分析の結果も示す（反復＝５０）。すべての断片（左）またはｃｔＤＮＡ濃縮断片（右）を用いたｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルについて分析を示す。Ｃ）すべての断片（左）またはｃｔＤＮＡ濃縮断片を用いた縦断的ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイリングに基づく無再発生存のカプラン・マイヤー分析。患者は、以前に同定された０．２％を超える過剰ＤＭＲ内のメチル化存在量を実証した場合、治療後のｃｔＤＮＡについて陽性であると分類された。
【図8】本明細書で提供される方法を実施するようにプログラムさもなければ構成することができるコンピュータシステムを示す。
【図9】ＨＮＳＣＣおよび健常なドナーから単離されたセルフリーＤＮＡの試料の特性。Ａ）血液単離の時点を定義する概略図。Ｂ）ＨＮＳＣＣ患者ならびに健常なドナー（すなわち、「正常」）についての諸時点にわたる（血漿１ｍＬあたりに対して正規化された）ｃｆＤＮＡ収量。
【図10】ＣＡＰＰ－ＳｅｑセレクタによってカバーされるＨＮＳＣＣ患者ごとのＳＮＶの数の分析であって、ＨＮＳＣのＴＣＧＡコホートにおける３６４名すべての患者の中で評価されるか（青色の菱形）、または一個抜き交差検証（ＬＯＯＣＶ；赤い四角）を使用して評価される分析。
【図12】情報領域を同定するための関連性のある図である（図３Ｂおよび図３Ｃに関連）。Ａ）ｎ個以上のＣｐＧに基づくゲノムワイド（染色体１～２２）３００ｂｐの重複しないビンのＲＰＫＭの中央値。Ｂ）図２Ｂおよび方法に記載されるようなＰＢＬ枯渇ウィンドウ内のＨＮＳＣＣと健常なドナーのＰＢＬとの間における差次的メチル化分析。低メチル化領域（すなわち、健常なドナーのＰＢＬにおいてメチル化が上昇している領域）を青色で示す。
【図13】ＰＢＬ枯渇ウィンドウ内のＨＮＳＣＣと健常なドナーのｃｆＤＮＡ試料との間の差次的メチル化分析の結果に関連する図（図２Ｄ）。Ａ）ＤＭＲは、初期分析に使用した元の３００ｂｐの非重複ウィンドウに基づいて定義した。互いに直接隣接するＤＭＲをそれぞれの幅（すなわち、２つの３００ｂｐウィンドウは、それぞれ独立して、６００ｂｐの長さを有すると定義される）にビニングした。Ｂ）低メチル化領域に基づく、図２Ｅに定義されるＣｐＧ特徴の順列分析。
【図14】がん特異的な差次的メチル化シトシンの同定に基づくＴＣＧＡ原発腫瘍の教師あり階層的クラスター化。Ｃａｎｃｅｒ＿ｔｙｐｅ（列）は、各原発腫瘍またはＰＢＬ試料の分類を指し、ｃａｎｃｅｒ＿ＤＭＣｓ（行）は、各がんタイプについて同定されたがん特異的な差次的メチル化シトシン（ＰＢＬは除外される）を指す。
【図15】図４と関連性のある図である。Ａ）平均変異対立遺伝子画分と比較した、患者ごとのＣＡＰＰ－Ｓｅｑによる同定されたＳＮＶＳの断片の長さの中央値。Ｂ）過剰ＤＭＲのＲＰＫＭの平均と比較した、患者ごとのｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによる過剰ＤＭＲＳ内の断片の長さの中央値。
【図16】ＣＡＰＰ－ＳｅｑおよびｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ一致分析の関連性のある図である（図４Ｅ）。Ａ）ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性ＨＮＳＣＣのｃｆＤＮＡ試料と健常なドナーとの間の差次的メチル化領域呼び出しの交差検証分析（ｎ＝５０）から得られた曲線下面積の値。Ｂ）ＣＡＰＰ－ＳｅｑによるｃｔＤＮＡの検出に基づくＨＮＳＣＣ患者の全生存のカプラン－ミール分析。Ｃ）およびＤ）メチル化クラスターに基づいて層別化されたＨＮＳＣＣ患者の試料のＲＰＫＭの平均および変異対立遺伝子画分の平均（図４Ｄ）。
【図17】潜在的な臨床的有用性の領域の同定（図６に関連）。Ａ）ＴＣＧＡ内のＨＮＳＣＣ原発腫瘍ならびに本発明者らのＨＮＳＣＣコホートからの血漿由来過剰ＤＭＲと重複する市販の液体生検試験で現在使用されている遺伝子のゲノムトラック。矢印を有する下の濃い青色のバーは、特定の遺伝子の転写の方向を示す。赤色のバーは、本発明者らのＨＮＳＣＣコホートの血漿由来の過剰ＤＭＲならびにＴＣＧＡ由来の原発性腫瘍と重複する３００ｂｐのウィンドウの位置を示す。Ｂ～Ｄ）特定の３００ｂｐ領域（箱）のメチル化から特定の転写産物のＲＮＡ発現までのスピアマンの相関。絶対的なＲ値が０．３以上の領域（灰色の破線で示す）を有意な関連性としてラベル付けした。ＴＣＧＡによって提示されるＨＮＳＣＣ患者の疾患特異的生存についての予後予測であったメチル化領域（ｎ＝５２０）は、赤い輪郭で示されている。ＲＮＡ発現にさらに関連した予後領域を実線の赤色で示す。ＲＮＡ発現に関連する、予後メチル化領域を含む５つすべての遺伝子について図を作成した。（Ｂ）ＧＡＴＡ２－ＡＳ１、（Ｃ）ＺＮＦ３２３、（Ｄ）、ＳＴＫ３。
【発明を実施するための形態】
【0024】
以下の説明では、本発明の完全な理解をもたらすために、多数の具体的な詳細が記載さ
れる。しかし、本発明は、これらの具体的な詳細がなくとも実施され得ることが理解され
る。
れる。しかし、本発明は、これらの具体的な詳細がなくとも実施され得ることが理解され
る。
【0025】
本開示は、高感度および／または高い特異度で、対象ががんを有する可能性を判定する
際のｃｔＤＮＡのマルチモーダル分析のための方法、システムおよびキットを提供する。
さらに、本開示は、がんの治療後の微小残存病変（ＭＲＤ）を検出し、そのようながんの
治療が治療上有効であるかどうかを評価するための方法、システムおよびキットを提供す
る。
際のｃｔＤＮＡのマルチモーダル分析のための方法、システムおよびキットを提供する。
さらに、本開示は、がんの治療後の微小残存病変（ＭＲＤ）を検出し、そのようながんの
治療が治療上有効であるかどうかを評価するための方法、システムおよびキットを提供す
る。
【0026】
治療前にｃｔＤＮＡから特定の分子的特徴を同定することは、予後について知らせるこ
とができ、および／または治療に対する予測応答であり得るが、治療後のｃｔＤＮＡの検
出は、ＭＲＤの同定を促し、再発および／または死亡のリスクが高い患者の同定を補助し
得る。安定した感度を成し遂げるために、ほとんどの臨床研究は、少数の領域を調べるｃ
ｔＤＮＡ検出方法、一致した腫瘍プロファイリング、および／または高いｃｔＤＮＡ存在
量の事例を利用している。しかし、低レベルのｃｔＤＮＡを有するか、または患者全体で
共通する／既知の異常を欠くがんについては、似た程度の感受性を達成するために、追加
の戦略を利用し得る。ゲノムワイドなプロファイリング技術は、極めて多くの領域を網羅
することにより、感度を改善するのに役立ち得る。しかし、１％未満の断片の検出を達成
するために必要なセルフリーＤＮＡの量および配列決定深度は、法外なコストを要してき
た。
とができ、および／または治療に対する予測応答であり得るが、治療後のｃｔＤＮＡの検
出は、ＭＲＤの同定を促し、再発および／または死亡のリスクが高い患者の同定を補助し
得る。安定した感度を成し遂げるために、ほとんどの臨床研究は、少数の領域を調べるｃ
ｔＤＮＡ検出方法、一致した腫瘍プロファイリング、および／または高いｃｔＤＮＡ存在
量の事例を利用している。しかし、低レベルのｃｔＤＮＡを有するか、または患者全体で
共通する／既知の異常を欠くがんについては、似た程度の感受性を達成するために、追加
の戦略を利用し得る。ゲノムワイドなプロファイリング技術は、極めて多くの領域を網羅
することにより、感度を改善するのに役立ち得る。しかし、１％未満の断片の検出を達成
するために必要なセルフリーＤＮＡの量および配列決定深度は、法外なコストを要してき
た。
【0027】
高感度のｃｔＤＮＡ検出が可能な２つの個別化ゲノムワイドプロファイリング技術が記
載されている。１つ目のＣＡｎｃｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ
ｂｙ ｄｅｅｐ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ）は、１００を超える遺伝
子を標的とする広範なハイブリッド捕捉プローブを利用して、対立遺伝子の低頻度変異を
同定する。第２の、ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ Ｉｍｍｕｎｏ
Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ）は、抗
５－メチルシトシン（抗５ｍＣ）抗体を使用することによって、メチル化ｃｆＤＮＡ断片
を濃縮する。これらのそれぞれの方法による変異または高メチル化事象の同定は、それぞ
れの利点を有する。適切なエラー抑制ツールが使用され、クローン造血からの変異のいず
れかの寄与が考慮されるならば、変異は、それらの不可逆的な性質のためにｃｔＤＮＡを
セルフリーＤＮＡの健常な源と区別することができる。ＤＮＡ高メチル化事象は、潜在的
に、がんにおけるより多い数の再発性ゲノム領域に影響を及ぼし、セルフリーＤＮＡ分析
によって腫瘍の起源を知らせるそれらの能力に寄与する。さらに、がんドライバ遺伝子の
近傍での高メチル化事象は、それらの発現に影響を及ぼし、それによって潜在的にがんの
挙動を反映し、予後の値を提示し得る。現在までのところ、変異に基づく方法とメチル化
に基づく方法との両方の組み合わせを、限局性のがんにおけるｃｔＤＮＡの腫瘍ナイーブ
での検出および特性評価の改善に利用した研究はない。
載されている。１つ目のＣＡｎｃｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ
ｂｙ ｄｅｅｐ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ）は、１００を超える遺伝
子を標的とする広範なハイブリッド捕捉プローブを利用して、対立遺伝子の低頻度変異を
同定する。第２の、ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ Ｉｍｍｕｎｏ
Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ）は、抗
５－メチルシトシン（抗５ｍＣ）抗体を使用することによって、メチル化ｃｆＤＮＡ断片
を濃縮する。これらのそれぞれの方法による変異または高メチル化事象の同定は、それぞ
れの利点を有する。適切なエラー抑制ツールが使用され、クローン造血からの変異のいず
れかの寄与が考慮されるならば、変異は、それらの不可逆的な性質のためにｃｔＤＮＡを
セルフリーＤＮＡの健常な源と区別することができる。ＤＮＡ高メチル化事象は、潜在的
に、がんにおけるより多い数の再発性ゲノム領域に影響を及ぼし、セルフリーＤＮＡ分析
によって腫瘍の起源を知らせるそれらの能力に寄与する。さらに、がんドライバ遺伝子の
近傍での高メチル化事象は、それらの発現に影響を及ぼし、それによって潜在的にがんの
挙動を反映し、予後の値を提示し得る。現在までのところ、変異に基づく方法とメチル化
に基づく方法との両方の組み合わせを、限局性のがんにおけるｃｔＤＮＡの腫瘍ナイーブ
での検出および特性評価の改善に利用した研究はない。
【0028】
予後の判定、リスク層別化、および疾患の監視のための流体ベースのバイオマーカーの
利用は、侵襲的腫瘍サンプリングを必要とせずに治療の決定を導くことによって、患者の
転帰を改善し得る。循環腫瘍（ｃｔ）ＤＮＡは、特に液体生検ツールとして有望であるこ
とが示されているが、限局性非転移性がんを有する患者などの疾患の負荷が低い患者では
、対の腫瘍プロファイリングが頻繁に必要とされる。本発明者らは、血漿のセルフリーＤ
ＮＡ由来の遺伝的およびエピジェネティックな特徴のマルチモーダル解析が、腫瘍ナイー
ブｃｔＤＮＡプロファイリングの広範な適用を可能にし得ると仮定した。変異およびメチ
ル化に基づくプロファイリングにより、限局性頭頸部がん患者の６５％において、ｃｔＤ
ＮＡが同定された。両方のアプローチからの結果は定量的であり、強く相関しており、そ
れらを組み合わせた分析により、腫瘍由来ＤＮＡ断片の共通の特徴が明らかになった。さ
らに、ｃｔＤＮＡメチルームは、腫瘍組織学、推定予後バイオマーカー、および治療の応
答の動的なパターンを明らかにした。これらの知見は、将来の非侵襲的バイオマーカー発
見の取り組みを助け、限局性のがんに対するｃｔＤＮＡの臨床的実施について知らせる。
利用は、侵襲的腫瘍サンプリングを必要とせずに治療の決定を導くことによって、患者の
転帰を改善し得る。循環腫瘍（ｃｔ）ＤＮＡは、特に液体生検ツールとして有望であるこ
とが示されているが、限局性非転移性がんを有する患者などの疾患の負荷が低い患者では
、対の腫瘍プロファイリングが頻繁に必要とされる。本発明者らは、血漿のセルフリーＤ
ＮＡ由来の遺伝的およびエピジェネティックな特徴のマルチモーダル解析が、腫瘍ナイー
ブｃｔＤＮＡプロファイリングの広範な適用を可能にし得ると仮定した。変異およびメチ
ル化に基づくプロファイリングにより、限局性頭頸部がん患者の６５％において、ｃｔＤ
ＮＡが同定された。両方のアプローチからの結果は定量的であり、強く相関しており、そ
れらを組み合わせた分析により、腫瘍由来ＤＮＡ断片の共通の特徴が明らかになった。さ
らに、ｃｔＤＮＡメチルームは、腫瘍組織学、推定予後バイオマーカー、および治療の応
答の動的なパターンを明らかにした。これらの知見は、将来の非侵襲的バイオマーカー発
見の取り組みを助け、限局性のがんに対するｃｔＤＮＡの臨床的実施について知らせる。
【0029】
セルフリーメチル化ＤＮＡを捕捉する特定の方法は、本出願人の国際公開第２０１７／
１９０２１５号パンフレットおよび国際公開第２０１９／０１０５６４号パンフレットに
記載されており、両方とも参照により組み込まれる。
１９０２１５号パンフレットおよび国際公開第２０１９／０１０５６４号パンフレットに
記載されており、両方とも参照により組み込まれる。
【0030】
具体的には、本発明者らは、ＣＡＰＰ－ＳｅｑおよびｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑの両方を
利用して、限局性頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）患者のコホート内で、腫瘍ナイーブｃ
ｔＤＮＡ検出を行う。ＨＮＳＣＣは、根治的治療後に頻繁に再発する臨床的に不均一な疾
患であり、治療の決定および疾患の管理をより良く知らせるために、ｃｔＤＮＡ検出から
大きく利益を得ることができる３３。本発明者らは、両方の方法を並行して利用すること
、ならびに一致したＰＢＬプロファイリングが、高信頼性の腫瘍ナイーブｃｔＤＮＡ検出
を達成し得ることを実証する。さらに、本発明者らは、組み合わせせた分析が腫瘍由来の
ＤＮＡ断片の共通する分子的な特徴を明らかにすることを示す。最後に、本発明者らは、
ｃｔＤＮＡメチルームが腫瘍組織学、推定予後バイオマーカー、および治療反応の動的な
パターンを明らかにし、他の疾患の状況での将来のバイオマーカー研究のための青写真を
授けることを示す。
利用して、限局性頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）患者のコホート内で、腫瘍ナイーブｃ
ｔＤＮＡ検出を行う。ＨＮＳＣＣは、根治的治療後に頻繁に再発する臨床的に不均一な疾
患であり、治療の決定および疾患の管理をより良く知らせるために、ｃｔＤＮＡ検出から
大きく利益を得ることができる３３。本発明者らは、両方の方法を並行して利用すること
、ならびに一致したＰＢＬプロファイリングが、高信頼性の腫瘍ナイーブｃｔＤＮＡ検出
を達成し得ることを実証する。さらに、本発明者らは、組み合わせせた分析が腫瘍由来の
ＤＮＡ断片の共通する分子的な特徴を明らかにすることを示す。最後に、本発明者らは、
ｃｔＤＮＡメチルームが腫瘍組織学、推定予後バイオマーカー、および治療反応の動的な
パターンを明らかにし、他の疾患の状況での将来のバイオマーカー研究のための青写真を
授けることを示す。
【0031】
態様において、対象のがん細胞からｃｔＤＮＡが存在することを検出する方法であって
、
（ａ）対象からセルフリーＤＮＡの試料を得る工程、
（ｂ）試料をライブラリ調製に供して、セルフリーメチル化ＤＮＡのその後の配列決定
を可能にする工程、
（ｃ）第１の量のフィラーＤＮＡが試料に添加されていてもよく、フィラーＤＮＡの少
なくとも一部がメチル化され、次いで、さらに、試料を変性されていてもよい工程、
（ｄ）メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を用いたセルフリーメチル化ＤＮＡ
を捕捉する工程、
（ｅ）捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡを配列決定する工程、
（ｆ）健常な個体およびがんの個体由来の対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列を用い
て、捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの配列を比較する工程、
（ｇ）捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの１つ以上の配列とがんの個体由来のセル
フリーメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合、がん細胞由来のＤ
ＮＡの存在を同定する工程
を含み、捕捉する工程、比較する工程または同定する工程の少なくとも１つにおいて、
対象のセルフリーメチル化ＤＮＡは、断片の長さのメトリックに従って亜集団に限定され
る、方法が提供される。
、
（ａ）対象からセルフリーＤＮＡの試料を得る工程、
（ｂ）試料をライブラリ調製に供して、セルフリーメチル化ＤＮＡのその後の配列決定
を可能にする工程、
（ｃ）第１の量のフィラーＤＮＡが試料に添加されていてもよく、フィラーＤＮＡの少
なくとも一部がメチル化され、次いで、さらに、試料を変性されていてもよい工程、
（ｄ）メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を用いたセルフリーメチル化ＤＮＡ
を捕捉する工程、
（ｅ）捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡを配列決定する工程、
（ｆ）健常な個体およびがんの個体由来の対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列を用い
て、捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの配列を比較する工程、
（ｇ）捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの１つ以上の配列とがんの個体由来のセル
フリーメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合、がん細胞由来のＤ
ＮＡの存在を同定する工程
を含み、捕捉する工程、比較する工程または同定する工程の少なくとも１つにおいて、
対象のセルフリーメチル化ＤＮＡは、断片の長さのメトリックに従って亜集団に限定され
る、方法が提供される。
【0032】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）やそれに続くサンガーシーケンシングなどの様々なシ
ーケンシング技術が当業者に公知である。また、ハイスループット配列決定としても知ら
れる次世代配列決定（ＮＧＳ）技術も利用可能であり、これには様々な配列決定技術が含
まれる、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）配列決定、Ｒｏｃｈｅ ４５４配列決定、Ｉ
ｏｎ ｔｏｒｒｅｎｔ：Ｐｒｏｔｏｎ／ＰＧＭ配列決定、ＳＯＬｉＤ配列決定、ロングリ
ードシーケンシング（Ｏｘｆｏｒｄ ＮａｎｏｐｏｒｅおよびＰａｃｔｂｉｏ）が含まれ
る。ＮＧＳは、以前に使用されていたサンガー配列決定よりもはるかに迅速かつ安価にＤ
ＮＡおよびＲＮＡの配列決定を可能にする。いくつかの実施形態では、前記配列決定は、
ショートリードシーケンシングのために最適化される。
ーケンシング技術が当業者に公知である。また、ハイスループット配列決定としても知ら
れる次世代配列決定（ＮＧＳ）技術も利用可能であり、これには様々な配列決定技術が含
まれる、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）配列決定、Ｒｏｃｈｅ ４５４配列決定、Ｉ
ｏｎ ｔｏｒｒｅｎｔ：Ｐｒｏｔｏｎ／ＰＧＭ配列決定、ＳＯＬｉＤ配列決定、ロングリ
ードシーケンシング（Ｏｘｆｏｒｄ ＮａｎｏｐｏｒｅおよびＰａｃｔｂｉｏ）が含まれ
る。ＮＧＳは、以前に使用されていたサンガー配列決定よりもはるかに迅速かつ安価にＤ
ＮＡおよびＲＮＡの配列決定を可能にする。いくつかの実施形態では、前記配列決定は、
ショートリードシーケンシングのために最適化される。
【0033】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。
したがって、方法および本明細書に記載されるのは、ヒトおよび獣医学疾患ならびに動物
モデルの両方に適用可能である。好ましい対象は、「患者」、すなわち、疾患または状態
のために治療または医療が必要であるかどうかを判定するために調査されている、または
疾患もしくは状態（例えば、がん）のための医療を受けている、生きているヒトである。
したがって、方法および本明細書に記載されるのは、ヒトおよび獣医学疾患ならびに動物
モデルの両方に適用可能である。好ましい対象は、「患者」、すなわち、疾患または状態
のために治療または医療が必要であるかどうかを判定するために調査されている、または
疾患もしくは状態（例えば、がん）のための医療を受けている、生きているヒトである。
【0034】
本明細書で使用される場合、「ゲノム」という用語は、一般に、例えば、対象の遺伝情
報の少なくとも一部または全体であり得る、対象由来のゲノム情報を指す。ゲノムは、Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡのいずれかにコードされ得る。ゲノムは、コード領域（例えば、タンパ
ク質をコードする）ならびに非コード領域を含み得る。ゲノムは、生物においてすべての
染色体の配列を一緒に含むことができる。例えば、ヒトゲノムは、通常、合計４６本の染
色体を有する。これらのすべての配列が一緒になってヒトゲノムを構成し得る。
報の少なくとも一部または全体であり得る、対象由来のゲノム情報を指す。ゲノムは、Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡのいずれかにコードされ得る。ゲノムは、コード領域（例えば、タンパ
ク質をコードする）ならびに非コード領域を含み得る。ゲノムは、生物においてすべての
染色体の配列を一緒に含むことができる。例えば、ヒトゲノムは、通常、合計４６本の染
色体を有する。これらのすべての配列が一緒になってヒトゲノムを構成し得る。
【0035】
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、２つ以上のヌクレオチド、すなわ
ちデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）もしくはリボヌクレオチド（ｒＮＴＰ）のいず
れか、またはそれらの類似体の任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含むポリヌク
レオチドを指す。核酸の非限定的な例としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸
（ＲＮＡ）、遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定
義される遺伝子座、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トラン
スファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮ
Ａ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換え核酸
、分枝核酸、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離
されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーが挙げられる。核酸は、メチル化ヌクレオ
チドおよびヌクレオチド類似体などの１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含み得る。存
在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、核酸の構築の前または後に行われ得る。
核酸のヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断される場合がある。核酸
は、重合後に、例えばレポーター因子とのコンジュゲーションまたは結合によってさらに
修飾され得る。「変異体」核酸は、少なくとも１つのヌクレオチドがそれぞれ修飾、例え
ば欠失、挿入または置換されていることを除いて、その元の核酸と同一のヌクレオチド配
列を有するポリヌクレオチドである。変異体は、元の核酸のヌクレオチド配列に対し少な
くとも約８０％、９０％、９５％、または９９％の同一性のヌクレオチド配列を有し得る
。
ちデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）もしくはリボヌクレオチド（ｒＮＴＰ）のいず
れか、またはそれらの類似体の任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含むポリヌク
レオチドを指す。核酸の非限定的な例としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸
（ＲＮＡ）、遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定
義される遺伝子座、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トラン
スファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮ
Ａ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換え核酸
、分枝核酸、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離
されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーが挙げられる。核酸は、メチル化ヌクレオ
チドおよびヌクレオチド類似体などの１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含み得る。存
在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、核酸の構築の前または後に行われ得る。
核酸のヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断される場合がある。核酸
は、重合後に、例えばレポーター因子とのコンジュゲーションまたは結合によってさらに
修飾され得る。「変異体」核酸は、少なくとも１つのヌクレオチドがそれぞれ修飾、例え
ば欠失、挿入または置換されていることを除いて、その元の核酸と同一のヌクレオチド配
列を有するポリヌクレオチドである。変異体は、元の核酸のヌクレオチド配列に対し少な
くとも約８０％、９０％、９５％、または９９％の同一性のヌクレオチド配列を有し得る
。
【0036】
セルフリーメチル化ＤＮＡは、血流を自由に循環するＤＮＡであり、ＤＮＡの様々な領
域でメチル化されている。試料、例えば血漿試料を採取して、セルフリーメチル化ＤＮＡ
を分析し得る。諸研究が、血液の循環核酸の多くが壊死細胞またはアポトーシス細胞から
生じ、アポトーシスからの核酸のレベルの大幅な上昇が、がんなどの疾患で観察されるこ
とを明らかにしている。特に、循環ＤＮＡががん遺伝子の変異を含む疾患の特徴となる証
を有するがんの場合、マイクロサテライト変化、および特定のがんの場合、血漿のウイル
スゲノム配列、ＤＮＡまたはＲＮＡは、疾患の潜在的なバイオマーカーとしていっそう研
究されるようになっている。例えば、全循環ＤＮＡ中の低レベルの循環腫瘍ＤＮＡの定量
的アッセイは、臨床的に使用される標準的なバイオマーカーであるがん胎児性抗原と比較
して、結腸直腸がんの再発を検出するためのより良好なマーカーとして役立ち得る。循環
ｃｆＤＮＡは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含み得る。
域でメチル化されている。試料、例えば血漿試料を採取して、セルフリーメチル化ＤＮＡ
を分析し得る。諸研究が、血液の循環核酸の多くが壊死細胞またはアポトーシス細胞から
生じ、アポトーシスからの核酸のレベルの大幅な上昇が、がんなどの疾患で観察されるこ
とを明らかにしている。特に、循環ＤＮＡががん遺伝子の変異を含む疾患の特徴となる証
を有するがんの場合、マイクロサテライト変化、および特定のがんの場合、血漿のウイル
スゲノム配列、ＤＮＡまたはＲＮＡは、疾患の潜在的なバイオマーカーとしていっそう研
究されるようになっている。例えば、全循環ＤＮＡ中の低レベルの循環腫瘍ＤＮＡの定量
的アッセイは、臨床的に使用される標準的なバイオマーカーであるがん胎児性抗原と比較
して、結腸直腸がんの再発を検出するためのより良好なマーカーとして役立ち得る。循環
ｃｆＤＮＡは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含み得る。
【0037】
本明細書で使用される場合、「ライブラリ調製」は、リスト末端修復、Ａテーリング、
アダプターライゲーション、またはＤＮＡのその後の配列決定を可能にするためにセルフ
リーＤＮＡに対して行われる任意の他の調製を含む。
アダプターライゲーション、またはＤＮＡのその後の配列決定を可能にするためにセルフ
リーＤＮＡに対して行われる任意の他の調製を含む。
【0038】
本明細書で使用される場合、「フィラーＤＮＡ」は非コードＤＮＡであり得るか、また
はアンプリコンからなり得る。
はアンプリコンからなり得る。
【0039】
いくつかの実施形態では、断片の長さのメトリックは断片の長さである。いくつかの好
ましい実施形態では、対象のセルフリーメチル化ＤＮＡは、＜１７０ｂｐ、＜１６５ｂｐ
、＜１６０ｂｐ、＜１５５ｂｐ、＜１５０ｂｐ、＜１４５ｂｐ、＜１４０ｂｐ、＜１３５
ｂｐ、＜１３０ｂｐ、＜１２５ｂｐ、＜１２０ｂｐ、＜１１５ｂｐ、＜１１０ｂｐ、＜１
０５ｂｐ、または＜１００ｂｐの長さを有する断片に限定される。他の好ましい実施形態
では、対象のセルフリーメチル化ＤＮＡは、約１００～約１５０ｂｐ、１１０～１４０ｂ
ｐまたは１２０～１３０ｂｐの長さを有する断片に限定される。
ましい実施形態では、対象のセルフリーメチル化ＤＮＡは、＜１７０ｂｐ、＜１６５ｂｐ
、＜１６０ｂｐ、＜１５５ｂｐ、＜１５０ｂｐ、＜１４５ｂｐ、＜１４０ｂｐ、＜１３５
ｂｐ、＜１３０ｂｐ、＜１２５ｂｐ、＜１２０ｂｐ、＜１１５ｂｐ、＜１１０ｂｐ、＜１
０５ｂｐ、または＜１００ｂｐの長さを有する断片に限定される。他の好ましい実施形態
では、対象のセルフリーメチル化ＤＮＡは、約１００～約１５０ｂｐ、１１０～１４０ｂ
ｐまたは１２０～１３０ｂｐの長さを有する断片に限定される。
【0040】
いくつかの実施形態では、断片の長さのメトリックは、対象のセルフリーメチル化ＤＮ
Ａの断片の長さの分布である。いくつかの好ましい実施形態では、対象のセルフリーメチ
ル化ＤＮＡは、長さに基づいて下位５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５ま
たは１０パーセンタイル内の断片に限定される。
Ａの断片の長さの分布である。いくつかの好ましい実施形態では、対象のセルフリーメチ
ル化ＤＮＡは、長さに基づいて下位５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５ま
たは１０パーセンタイル内の断片に限定される。
【0041】
いくつかの実施形態では、対象のセルフリーメチル化ＤＮＡは、差次的メチル化領域（
ＤＭＲ）の断片にさらに限定される。
ＤＭＲ）の断片にさらに限定される。
【0042】
いくつかの実施形態では、対象のセルフリーメチル化ＤＮＡの制限は、捕捉工程の間で
ある。
ある。
【0043】
いくつかの実施形態では、対象のセルフリーメチル化ＤＮＡの限定は、比較工程の間で
ある。
ある。
【0044】
いくつかの実施形態では、対象のセルフリーメチル化ＤＮＡの制限は、同定工程の間で
ある。
ある。
【0045】
いくつかの実施形態では、比較工程は、統計的分類器を使用した適合に基づく。ＤＮＡ
メチル化データを使用する統計的分類器は、試料をがんのタイプまたはサブタイプなどの
特定の疾患状態に割り当てるために使用され得る。がんのタイプまたはサブタイプの分類
という目的のために、分類器は、統計的モデル内の１つまたは複数のＤＮＡメチル化変数
（すなわち、特徴）からなり、統計的モデルの出力は、異なる疾患状態を区別するための
１つまたは複数の閾値を有する。統計的分類器で使用される特定の（１つまたは複数の）
特徴および（１つまたは複数の）閾値は、がんのタイプまたはサブタイプの事前の知識か
ら、最も情報がある可能性が高い特徴の事前の知識から、機械学習から、またはこれらの
アプローチの２つ以上の組み合わせから導出され得る。
メチル化データを使用する統計的分類器は、試料をがんのタイプまたはサブタイプなどの
特定の疾患状態に割り当てるために使用され得る。がんのタイプまたはサブタイプの分類
という目的のために、分類器は、統計的モデル内の１つまたは複数のＤＮＡメチル化変数
（すなわち、特徴）からなり、統計的モデルの出力は、異なる疾患状態を区別するための
１つまたは複数の閾値を有する。統計的分類器で使用される特定の（１つまたは複数の）
特徴および（１つまたは複数の）閾値は、がんのタイプまたはサブタイプの事前の知識か
ら、最も情報がある可能性が高い特徴の事前の知識から、機械学習から、またはこれらの
アプローチの２つ以上の組み合わせから導出され得る。
【0046】
いくつかの実施形態では、分類器は機械学習によって導出される。好ましくは、分類器
は、弾性ネット分類器、ラッソ、サポートベクターマシン、ランダムフォレスト、または
ニューラルネットワークである。
は、弾性ネット分類器、ラッソ、サポートベクターマシン、ランダムフォレスト、または
ニューラルネットワークである。
【0047】
分析されるゲノム空間は、ゲノムワイドであり得るか、または好ましくは調節領域（す
なわち、ＦＡＮＴＯＭ５エンハンサー、ＣｐＧアイランド、ＣｐＧショア、およびＣｐＧ
Ｓｈｅｌｆ）に限定され得る。
なわち、ＦＡＮＴＯＭ５エンハンサー、ＣｐＧアイランド、ＣｐＧショア、およびＣｐＧ
Ｓｈｅｌｆ）に限定され得る。
【0048】
好ましくは、回収されたスパイクインメチル化ＤＮＡのパーセンテージは、プルダウン
効率変動を制御するための共変量として含まれる。
効率変動を制御するための共変量として含まれる。
【0049】
複数のがんのタイプ（またはサブタイプ）を互いに区別することができる分類器の場合
、分類器は、好ましくは、目的の各タイプ（またはサブタイプ）の対の比較に由来する差
次的メチル化領域からなる。
、分類器は、好ましくは、目的の各タイプ（またはサブタイプ）の対の比較に由来する差
次的メチル化領域からなる。
【0050】
いくつかの実施形態では、健常な個体およびがんの個体由来の対照のセルフリーメチル
化ＤＮＡ配列は、健常な個体とがんの個体との間の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）のデー
タベースに含まれる。
化ＤＮＡ配列は、健常な個体とがんの個体との間の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）のデー
タベースに含まれる。
【0051】
いくつかの実施形態では、健常な個体およびがんの個体由来の対照のセルフリーメチル
化ＤＮＡ配列は、血清、脳脊髄液、尿便、痰、胸水、腹水、涙、汗、パップスメア液、内
視鏡ブラシリング液など、好ましくは血漿由来の体液から得たセルフリーＤＮＡに由来す
るＤＮＡにおいて、健常な個体とがんの個体との間として、差次的にメチル化される対照
セルフリーメチル化ＤＮＡ配列に限定される。
化ＤＮＡ配列は、血清、脳脊髄液、尿便、痰、胸水、腹水、涙、汗、パップスメア液、内
視鏡ブラシリング液など、好ましくは血漿由来の体液から得たセルフリーＤＮＡに由来す
るＤＮＡにおいて、健常な個体とがんの個体との間として、差次的にメチル化される対照
セルフリーメチル化ＤＮＡ配列に限定される。
【0052】
試料
試料は、対象から単離された任意の生物学的試料であり得る。例えば、試料は、限定さ
れないが、体液、全血、血小板、血清、血漿、便、赤血球、白血球、内皮細胞、組織生検
物、滑液、リンパ液、腹水液、間質液または細胞外液、細胞間の空間の流体、例えば歯肉
縁液、骨髄、脳脊髄液、唾液、粘液、痰、精液、汗、尿、鼻ブラッシングからの液、ペッ
プスミアからの液、または任意の他の体液を含み得る。体液は、唾液、血液、または血清
を含み得る。試料はまた、腫瘍試料であり得、これは、静脈穿刺、排泄、射精、マッサー
ジ、生検、針吸引、洗浄、掻き取り、外科的切開、または介入もしくは他のアプローチを
含むがこれらに限定されない様々なアプローチによって、対象から得ることができる。試
料はセルフリー試料（例えば、細胞を実質的に含まない）であり得る。ＤＮＡ試料は、例
えば、十分な熱を使用して変性させることができる。
試料は、対象から単離された任意の生物学的試料であり得る。例えば、試料は、限定さ
れないが、体液、全血、血小板、血清、血漿、便、赤血球、白血球、内皮細胞、組織生検
物、滑液、リンパ液、腹水液、間質液または細胞外液、細胞間の空間の流体、例えば歯肉
縁液、骨髄、脳脊髄液、唾液、粘液、痰、精液、汗、尿、鼻ブラッシングからの液、ペッ
プスミアからの液、または任意の他の体液を含み得る。体液は、唾液、血液、または血清
を含み得る。試料はまた、腫瘍試料であり得、これは、静脈穿刺、排泄、射精、マッサー
ジ、生検、針吸引、洗浄、掻き取り、外科的切開、または介入もしくは他のアプローチを
含むがこれらに限定されない様々なアプローチによって、対象から得ることができる。試
料はセルフリー試料（例えば、細胞を実質的に含まない）であり得る。ＤＮＡ試料は、例
えば、十分な熱を使用して変性させることができる。
【0053】
いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の生物学的試料を含むかまたは使用する
システム、方法、またはキットを提供する。本明細書で使用される１つ以上の試料は、核
酸を含有するかまたは含有すると推定される任意の物質を含み得る。試料は、対象から得
られた生物学的試料を含み得る。いくつかの実施形態では、生物学的試料は液体試料であ
る。
システム、方法、またはキットを提供する。本明細書で使用される１つ以上の試料は、核
酸を含有するかまたは含有すると推定される任意の物質を含み得る。試料は、対象から得
られた生物学的試料を含み得る。いくつかの実施形態では、生物学的試料は液体試料であ
る。
【0054】
いくつかの実施形態では、試料は、約１００ｎｇ、９０ｎｇ、８０ｎｇ、７５ｎｇ、７
０ｎｇ、６０ｎｇ、５０ｎｇ、４０ｎｇ、３０ｎｇ、２０ｎｇ、１０ｎｇ、５ｎｇ、１ｎ
ｇ未満、またはセルフリー核酸分子の数の間の任意の量を含む。さらに、いくつかの実施
形態では、試料は、約１ｐｇ未満、約５ｐｇ未満、約１０ｐｇ未満、約２０ｐｇ未満、約
３０ｐｇ未満、約４０ｐｇ未満、約５０ｐｇ未満、約１００ｐｇ未満、約２００ｐｇ未満
、約５００ｐｇ未満、約１ｎｇ未満、約５ｎｇ未満、約１０ｎｇ未満、約２０ｎｇ未満、
約３０ｎｇ未満、約４０ｎｇ未満、約５０ｎｇ未満、約１００ｎｇ未満、約２００ｎｇ未
満、約５００ｎｇ未満、約１０００ｎｇ未満、またはセルフリー核酸分子の数の間の任意
の量を含む。
０ｎｇ、６０ｎｇ、５０ｎｇ、４０ｎｇ、３０ｎｇ、２０ｎｇ、１０ｎｇ、５ｎｇ、１ｎ
ｇ未満、またはセルフリー核酸分子の数の間の任意の量を含む。さらに、いくつかの実施
形態では、試料は、約１ｐｇ未満、約５ｐｇ未満、約１０ｐｇ未満、約２０ｐｇ未満、約
３０ｐｇ未満、約４０ｐｇ未満、約５０ｐｇ未満、約１００ｐｇ未満、約２００ｐｇ未満
、約５００ｐｇ未満、約１ｎｇ未満、約５ｎｇ未満、約１０ｎｇ未満、約２０ｎｇ未満、
約３０ｎｇ未満、約４０ｎｇ未満、約５０ｎｇ未満、約１００ｎｇ未満、約２００ｎｇ未
満、約５００ｎｇ未満、約１０００ｎｇ未満、またはセルフリー核酸分子の数の間の任意
の量を含む。
【0055】
いくつかの実施形態では、本開示は、試料にある量のフィラーＤＮＡを充填して混合物
試料を生成するための方法およびシステムを含み、混合物試料は、少なくとも約５０ｎｇ
、５５ｎｇ、６０ｎｇ、６５ｎｇ、７０ｎｇ、７５ｎｇ、８０ｎｇ、８５ｎｇ、９０ｎｇ
、９５ｎｇ、１００ｎｇ、１２０ｎｇ、１４０ｎｇ、１６０ｎｇ、１８０ｎｇ、２００ｎ
ｇ、または核酸混合物の総量の数の間にある任意の量を含む。いくつかの実施形態では、
フィラーＤＮＡは、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０
％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のメチル化フィラーＤＮＡを含み
、残りは非メチル化フィラーＤＮＡであり、好ましくは５％～５０％、１０％～４０％、
または１５％～３０％のメチル化フィラーＤＮＡである。いくつかの実施形態では、混合
物試料は、２０ｎｇ～１００ｎｇ、好ましくは３０ｎｇ～１００ｎｇ、より好ましくは５
０ｎｇ～１００ｎｇの量のフィラーＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、試料から得
たセルフリーＤＮＡおよび第１の量のフィラーＤＮＡは、合わせて少なくとも５０ｎｇの
総ＤＮＡ、好ましくは少なくとも１００ｎｇの総ＤＮＡを含む。
試料を生成するための方法およびシステムを含み、混合物試料は、少なくとも約５０ｎｇ
、５５ｎｇ、６０ｎｇ、６５ｎｇ、７０ｎｇ、７５ｎｇ、８０ｎｇ、８５ｎｇ、９０ｎｇ
、９５ｎｇ、１００ｎｇ、１２０ｎｇ、１４０ｎｇ、１６０ｎｇ、１８０ｎｇ、２００ｎ
ｇ、または核酸混合物の総量の数の間にある任意の量を含む。いくつかの実施形態では、
フィラーＤＮＡは、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０
％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のメチル化フィラーＤＮＡを含み
、残りは非メチル化フィラーＤＮＡであり、好ましくは５％～５０％、１０％～４０％、
または１５％～３０％のメチル化フィラーＤＮＡである。いくつかの実施形態では、混合
物試料は、２０ｎｇ～１００ｎｇ、好ましくは３０ｎｇ～１００ｎｇ、より好ましくは５
０ｎｇ～１００ｎｇの量のフィラーＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、試料から得
たセルフリーＤＮＡおよび第１の量のフィラーＤＮＡは、合わせて少なくとも５０ｎｇの
総ＤＮＡ、好ましくは少なくとも１００ｎｇの総ＤＮＡを含む。
【0056】
いくつかの実施形態では、フィラーＤＮＡは、５０ｂｐ～８００ｂｐの長さ、好ましく
は１００ｂｐ～６００ｂｐの長さ、より好ましくは２００ｂｐ～６００ｂｐの長さである
。いくつかの実施形態では、フィラーＤＮＡは二本鎖である。フィラーＤＮＡは二本鎖で
ある。例えば、フィラーＤＮＡはジャンクＤＮＡであり得る。また、フィラーＤＮＡは、
内因性または外因性のＤＮＡであってもよい。例えば、フィラーＤＮＡは非ヒトＤＮＡで
あり、好ましい実施形態ではλＤＮＡである。本明細書で使用される場合、「λＤＮＡ」
は、腸内細菌ファージλＤＮＡを指す。いくつかの実施形態では、フィラーＤＮＡは、ヒ
トＤＮＡと整合していない。
は１００ｂｐ～６００ｂｐの長さ、より好ましくは２００ｂｐ～６００ｂｐの長さである
。いくつかの実施形態では、フィラーＤＮＡは二本鎖である。フィラーＤＮＡは二本鎖で
ある。例えば、フィラーＤＮＡはジャンクＤＮＡであり得る。また、フィラーＤＮＡは、
内因性または外因性のＤＮＡであってもよい。例えば、フィラーＤＮＡは非ヒトＤＮＡで
あり、好ましい実施形態ではλＤＮＡである。本明細書で使用される場合、「λＤＮＡ」
は、腸内細菌ファージλＤＮＡを指す。いくつかの実施形態では、フィラーＤＮＡは、ヒ
トＤＮＡと整合していない。
【0057】
いくつかの実施形態では、試料は、疾患または障害を有する対象の治療の前および／ま
たは後に採取され得る。試料は、治療または治療レジメンの最中に対象から得ることがで
きる。治療の効果を経時的にモニターするために、対象から複数の試料を得ることができ
る。試料は、臨床試験によって確定的な陽性または陰性の診断が得られない疾患または障
害を有することが知られているまたは疑われる対象から採取され得る。試料は、疾患また
は障害を有すると疑われる対象から採取され得る。試料は、疲労、吐き気、体重減少、痛
みおよび疼痛、衰弱または出血などの説明できない症状を経験している対象から採取され
得る。試料は、説明されている症状を有する対象から採取され得る。試料は、家族歴、年
齢、高血圧または高血圧前症、糖尿病または糖尿病前症、過体重または肥満、環境への曝
露、生活習慣リスク因子（例えば、喫煙、アルコール摂取、または薬物使用）、または他
のリスク因子の存在などの因子によって疾患または障害を発症するリスクがある対象から
採取され得る。
たは後に採取され得る。試料は、治療または治療レジメンの最中に対象から得ることがで
きる。治療の効果を経時的にモニターするために、対象から複数の試料を得ることができ
る。試料は、臨床試験によって確定的な陽性または陰性の診断が得られない疾患または障
害を有することが知られているまたは疑われる対象から採取され得る。試料は、疾患また
は障害を有すると疑われる対象から採取され得る。試料は、疲労、吐き気、体重減少、痛
みおよび疼痛、衰弱または出血などの説明できない症状を経験している対象から採取され
得る。試料は、説明されている症状を有する対象から採取され得る。試料は、家族歴、年
齢、高血圧または高血圧前症、糖尿病または糖尿病前症、過体重または肥満、環境への曝
露、生活習慣リスク因子（例えば、喫煙、アルコール摂取、または薬物使用）、または他
のリスク因子の存在などの因子によって疾患または障害を発症するリスクがある対象から
採取され得る。
【0058】
いくつかの実施形態では、試料は、第１の時点で採取され、配列決定され得、次いで、
別の試料が、その後の時点で採取され、配列決定され得る。そのような方法は、例えば、
疾患の発症または進行を追跡するため長期モニタリングする目的のために使用され得る。
いくつかの実施形態では、治療の有効性を判定するために、治療前、治療後、または治療
の経過中に疾患の進行を追跡することができる。例えば、本明細書に記載の方法は、医学
的治療に応じて疾患の進行または退縮を測定するために、医学的治療の前および後に対象
に対して実施され得る。
別の試料が、その後の時点で採取され、配列決定され得る。そのような方法は、例えば、
疾患の発症または進行を追跡するため長期モニタリングする目的のために使用され得る。
いくつかの実施形態では、治療の有効性を判定するために、治療前、治療後、または治療
の経過中に疾患の進行を追跡することができる。例えば、本明細書に記載の方法は、医学
的治療に応じて疾患の進行または退縮を測定するために、医学的治療の前および後に対象
に対して実施され得る。
【0059】
対象から試料を得た後、試料を処理して、対象の疾患または障害を示すデータセットを
生成することができる。例えば、がん関連ゲノム遺伝子座または微生物関連遺伝子座のパ
ネルでの試料のセルフリー核酸分子（例えば、ｃｔＤＮＡ分子）の有無または定量的評価
は、対象のがんを示し得る。対象から得られた試料を処理することは、（ｉ）複数のセル
フリー核酸分子を単離、濃縮または抽出するのに十分な条件に試料を供すること、および
（ｉｉ）データセット（例えば、核酸配列）を生成するために複数のセルフリー核酸分子
をアッセイすることを含み得る。いくつかの実施形態では、複数のセルフリー核酸分子が
試料から抽出され、配列決定に供されて、複数の配列決定リードが生成される。
生成することができる。例えば、がん関連ゲノム遺伝子座または微生物関連遺伝子座のパ
ネルでの試料のセルフリー核酸分子（例えば、ｃｔＤＮＡ分子）の有無または定量的評価
は、対象のがんを示し得る。対象から得られた試料を処理することは、（ｉ）複数のセル
フリー核酸分子を単離、濃縮または抽出するのに十分な条件に試料を供すること、および
（ｉｉ）データセット（例えば、核酸配列）を生成するために複数のセルフリー核酸分子
をアッセイすることを含み得る。いくつかの実施形態では、複数のセルフリー核酸分子が
試料から抽出され、配列決定に供されて、複数の配列決定リードが生成される。
【0060】
いくつかの実施形態では、セルフリー核酸分子は、セルフリーリボ核酸（ｃｆＲＮＡ）
またはセルフリーデオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）を含み得る。セルフリー核酸分子（例
えば、ｃｆＲＮＡまたはｃｆＤＮＡ）は、様々な方法によって試料から抽出され得る。セ
ルフリー核酸分子は、がん関連ゲノム遺伝子座のパネルに対応する核酸（例えば、ＲＮＡ
またはＤＮＡ）分子を濃縮するように構成された複数のプローブによって濃縮され得る。
プローブは、がん関連ゲノム遺伝子座のパネルの１つ以上からの核酸配列との配列相補性
を有し得る。がん関連ゲノム遺伝子座のパネルは、少なくとも２、少なくとも３、少なく
とも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少
なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少
なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少
なくとも２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約
４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少
なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも
約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、またはそれより多
く、異なるがん関連ゲノム遺伝子座を含み得る。プローブは、１つまたは複数のゲノム遺
伝子座（例えば、がん関連ゲノム遺伝子座）の核酸配列（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）
と配列相補性を有する核酸分子（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）であり得る。これらの核
酸分子は、プライマーまたは濃縮配列であり得る。１つまたは複数のゲノム遺伝子座（例
えば、がん関連ゲノム遺伝子座または微生物関連遺伝子座）に対して選択的なプローブを
使用する試料のアッセイは、アレイハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）または核酸配列決定（例えば、ＲＮＡ配列決定またはＤＮＡ配列決定）の使用を含
み得る。
またはセルフリーデオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）を含み得る。セルフリー核酸分子（例
えば、ｃｆＲＮＡまたはｃｆＤＮＡ）は、様々な方法によって試料から抽出され得る。セ
ルフリー核酸分子は、がん関連ゲノム遺伝子座のパネルに対応する核酸（例えば、ＲＮＡ
またはＤＮＡ）分子を濃縮するように構成された複数のプローブによって濃縮され得る。
プローブは、がん関連ゲノム遺伝子座のパネルの１つ以上からの核酸配列との配列相補性
を有し得る。がん関連ゲノム遺伝子座のパネルは、少なくとも２、少なくとも３、少なく
とも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少
なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少
なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少
なくとも２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約
４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少
なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも
約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、またはそれより多
く、異なるがん関連ゲノム遺伝子座を含み得る。プローブは、１つまたは複数のゲノム遺
伝子座（例えば、がん関連ゲノム遺伝子座）の核酸配列（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）
と配列相補性を有する核酸分子（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）であり得る。これらの核
酸分子は、プライマーまたは濃縮配列であり得る。１つまたは複数のゲノム遺伝子座（例
えば、がん関連ゲノム遺伝子座または微生物関連遺伝子座）に対して選択的なプローブを
使用する試料のアッセイは、アレイハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）または核酸配列決定（例えば、ＲＮＡ配列決定またはＤＮＡ配列決定）の使用を含
み得る。
【0061】
核酸分子の配列決定
本開示は、１つまたは複数のポリヌクレオチドのヌクレオチド塩基の配列を決定するた
めの方法および技術を提供する。ポリヌクレオチドは、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などの核酸分子であり得、その変異体または誘導体（例え
ば、一本鎖ＤＮＡ）を含む。配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）、Ｐａｃｉｆｉ
ｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＰａｃＢｉｏ（登録商標））、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐ
ｏｒｅ（登録商標）またはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎ
ｔ（登録商標））による配列決定システムなどの現在利用可能な様々なシステムによって
行うことができるが、これらに限定されない。さらに、対の末端の配列決定といった断片
の長さを示す任意の配列決定方法を利用することができる。これに代えて、またはこれに
加えて、配列決定は、核酸増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、デジタルＰ
ＣＲ、定量的ＰＣＲ、またはリアルタイムＰＣＲ）、または等温増幅を用いて行われ得る
。そのようなシステムは、対象により与えられた試料からシステムによって生成されるよ
うに、対象の遺伝情報（例えば、ヒト）に対応する複数の生の遺伝データを提供すること
ができる。いくつかの例において、そのようなシステムは、配列決定リード（本明細書で
は「リード」とも）を提供する。リードは、配列決定された核酸分子の配列に対応する一
連の核酸塩基を含み得る。いくつかの状況では、本明細書で提供されるシステムおよび方
法は、プロテオームの情報と共に使用され得る。
本開示は、１つまたは複数のポリヌクレオチドのヌクレオチド塩基の配列を決定するた
めの方法および技術を提供する。ポリヌクレオチドは、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などの核酸分子であり得、その変異体または誘導体（例え
ば、一本鎖ＤＮＡ）を含む。配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）、Ｐａｃｉｆｉ
ｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＰａｃＢｉｏ（登録商標））、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐ
ｏｒｅ（登録商標）またはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎ
ｔ（登録商標））による配列決定システムなどの現在利用可能な様々なシステムによって
行うことができるが、これらに限定されない。さらに、対の末端の配列決定といった断片
の長さを示す任意の配列決定方法を利用することができる。これに代えて、またはこれに
加えて、配列決定は、核酸増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、デジタルＰ
ＣＲ、定量的ＰＣＲ、またはリアルタイムＰＣＲ）、または等温増幅を用いて行われ得る
。そのようなシステムは、対象により与えられた試料からシステムによって生成されるよ
うに、対象の遺伝情報（例えば、ヒト）に対応する複数の生の遺伝データを提供すること
ができる。いくつかの例において、そのようなシステムは、配列決定リード（本明細書で
は「リード」とも）を提供する。リードは、配列決定された核酸分子の配列に対応する一
連の核酸塩基を含み得る。いくつかの状況では、本明細書で提供されるシステムおよび方
法は、プロテオームの情報と共に使用され得る。
【0062】
いくつかの実施形態では、配列決定リードは、次世代配列決定法または次・次世代配列
決定法によって得られる。いくつかの実施形態では、配列決定法は、がんの循環ＤＮＡ（
ｃｔＤＮＡ）を定量化するために使用される次世代配列決定ベースの方法である、ＣＡｎ
ｃｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｂｙ ｄｅｅｐ Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｉｎｇ（ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ）を含む。この方法は、再発性変異を有することが知られ
ている任意のがんのタイプに対して一般化され得、１０，０００分子の健常なＤＮＡの変
異体ＤＮＡの一分子を検出し得る。いくつかの実施形態では、配列決定法は、その全体が
本明細書に組み込まれる、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｐｌａｓｍ
ａ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｏｍｅｓ，（２０１８）Ｎａｔｕｒｅに
よって記載されているようなｃｆＭｅＤＩＰ配列決定を含む。いくつかの実施形態では、
配列決定は亜硫酸水素塩配列決定を含む。
決定法によって得られる。いくつかの実施形態では、配列決定法は、がんの循環ＤＮＡ（
ｃｔＤＮＡ）を定量化するために使用される次世代配列決定ベースの方法である、ＣＡｎ
ｃｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｂｙ ｄｅｅｐ Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｉｎｇ（ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ）を含む。この方法は、再発性変異を有することが知られ
ている任意のがんのタイプに対して一般化され得、１０，０００分子の健常なＤＮＡの変
異体ＤＮＡの一分子を検出し得る。いくつかの実施形態では、配列決定法は、その全体が
本明細書に組み込まれる、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｐｌａｓｍ
ａ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｏｍｅｓ，（２０１８）Ｎａｔｕｒｅに
よって記載されているようなｃｆＭｅＤＩＰ配列決定を含む。いくつかの実施形態では、
配列決定は亜硫酸水素塩配列決定を含む。
【0063】
いくつかの実施形態では、配列決定は、例えばバーコード、固有の分子識別子（ＵＭＩ
）、または別のタグを核酸分子またはその断片にライゲーションすることによる、核酸分
子またはその断片の修飾を含む。核酸分子またはその断片の一端にバーコード、ＵＭＩま
たはタグをライゲーションすることにより、配列決定後の核酸分子またはその断片の分析
を容易にすることができる。いくつかの実施形態では、バーコードは固有のバーコード（
例えば、ＵＭＩ）である。いくつかの実施形態では、バーコードは固有ではなく、バーコ
ードの配列は、標的核酸の開始配列および停止配列などの内因性配列情報に関連して使用
され得る（例えば、標的核酸はバーコードに隣接し、バーコードの配列は、標的核酸の開
始部および終了部の配列に関連して、固有にタグ付けされた分子を生成する）。バーコー
ド、ＵＭＩ、またはタグは、ポリヌクレオチドまたはその断片を入力または標的核酸分子
またはその断片と関連付けるために使用される既知の配列であり得る。バーコード、ＵＭ
Ｉ、またはタグは、天然ヌクレオチドまたは非天然（例えば、修飾された）ヌクレオチド
（例えば、本明細書に記載されるようなもの）を含み得る。バーコードの配列は、バーコ
ードの配列が配列決定リード内に含まれ得るように、アダプター配列内に含まれ得る。バ
ーコードの配列は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４
、１５、１６個、またはそれを超えるヌクレオチドの長さを含み得る。場合によっては、
バーコードの配列は、十分な長さであってもよく、関連するバーコードの配列に基づいて
試料の識別を可能にするために別のバーコードの配列と十分に異なっていてもよい。バー
コードの配列、またはバーコードの配列の組み合わせを使用して、「元の」核酸分子また
はその断片（例えば、対象から得た試料に存在する核酸分子またはその断片）をタグ付け
し、続いて識別することができる。いくつかの場合、バーコードの配列またはバーコード
の配列の組み合わせを内因性配列情報と併せて使用して、元の核酸分子またはその断片を
同定する。例えば、バーコードの配列、またはバーコードの配列の組み合わせを、バーコ
ード、ＵＭＩ、またはタグ（例えば、内因性配列の開始および終了）に隣接する内因性配
列と共に使用することができる。
）、または別のタグを核酸分子またはその断片にライゲーションすることによる、核酸分
子またはその断片の修飾を含む。核酸分子またはその断片の一端にバーコード、ＵＭＩま
たはタグをライゲーションすることにより、配列決定後の核酸分子またはその断片の分析
を容易にすることができる。いくつかの実施形態では、バーコードは固有のバーコード（
例えば、ＵＭＩ）である。いくつかの実施形態では、バーコードは固有ではなく、バーコ
ードの配列は、標的核酸の開始配列および停止配列などの内因性配列情報に関連して使用
され得る（例えば、標的核酸はバーコードに隣接し、バーコードの配列は、標的核酸の開
始部および終了部の配列に関連して、固有にタグ付けされた分子を生成する）。バーコー
ド、ＵＭＩ、またはタグは、ポリヌクレオチドまたはその断片を入力または標的核酸分子
またはその断片と関連付けるために使用される既知の配列であり得る。バーコード、ＵＭ
Ｉ、またはタグは、天然ヌクレオチドまたは非天然（例えば、修飾された）ヌクレオチド
（例えば、本明細書に記載されるようなもの）を含み得る。バーコードの配列は、バーコ
ードの配列が配列決定リード内に含まれ得るように、アダプター配列内に含まれ得る。バ
ーコードの配列は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４
、１５、１６個、またはそれを超えるヌクレオチドの長さを含み得る。場合によっては、
バーコードの配列は、十分な長さであってもよく、関連するバーコードの配列に基づいて
試料の識別を可能にするために別のバーコードの配列と十分に異なっていてもよい。バー
コードの配列、またはバーコードの配列の組み合わせを使用して、「元の」核酸分子また
はその断片（例えば、対象から得た試料に存在する核酸分子またはその断片）をタグ付け
し、続いて識別することができる。いくつかの場合、バーコードの配列またはバーコード
の配列の組み合わせを内因性配列情報と併せて使用して、元の核酸分子またはその断片を
同定する。例えば、バーコードの配列、またはバーコードの配列の組み合わせを、バーコ
ード、ＵＭＩ、またはタグ（例えば、内因性配列の開始および終了）に隣接する内因性配
列と共に使用することができる。
【0064】
核酸分子またはその断片を処理することは、核酸の増幅を行うことを含み得る。例えば
、任意のタイプの核酸増幅反応を使用して、標的核酸分子またはその断片を増幅し、増幅
産物を生成することができる。核酸増幅方法の非限定的な例としては、逆転写、プライマ
ー伸長、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、非対称増幅、ローリング
サークル増幅、および多置換増幅（ＭＤＡ）が挙げられる。ＰＣＲの例としては、限定さ
れずに、定量的ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、エマルジョンＰＣＲ、ホ
ットスタートＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、およ
びアセンブリＰＣＲが挙げられる。核酸の増幅は、１つ以上のプライマー、プローブ、ポ
リメラーゼ、緩衝液、酵素、およびデオキシリボヌクレオチドなどの１つ以上の試薬を含
み得る。核酸の増幅は等温であってもよく、または熱サイクルを含んでもよい。および／
または内因性配列の長さを有する。
、任意のタイプの核酸増幅反応を使用して、標的核酸分子またはその断片を増幅し、増幅
産物を生成することができる。核酸増幅方法の非限定的な例としては、逆転写、プライマ
ー伸長、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、非対称増幅、ローリング
サークル増幅、および多置換増幅（ＭＤＡ）が挙げられる。ＰＣＲの例としては、限定さ
れずに、定量的ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、エマルジョンＰＣＲ、ホ
ットスタートＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、およ
びアセンブリＰＣＲが挙げられる。核酸の増幅は、１つ以上のプライマー、プローブ、ポ
リメラーゼ、緩衝液、酵素、およびデオキシリボヌクレオチドなどの１つ以上の試薬を含
み得る。核酸の増幅は等温であってもよく、または熱サイクルを含んでもよい。および／
または内因性配列の長さを有する。
【0065】
メチル化プロファイル
本開示は、疾患／状態を有するかまたはそのような疾患／状態を有すると疑われる対象
のメチル化プロファイルを生成するための方法、システムおよびキットを提供し、メチル
化プロファイルは、対象が疾患／状態を有するかまたは疾患／状態を有するリスクがある
かどうかを判定するために使用され得る。ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑを使用する前に、本明
細書に開示される試料をライブラリ調製に供する。手短に言えば、末端修復およびＡテー
リングの後、試料を核酸アダプターにライゲートし、酵素を用いて消化する。試料の項で
上述したように、調製したライブラリをフィラー核酸（例えば、フィラーλＤＮＡ）と組
み合わせて、調製したライブラリの低い存在量のｃｔＤＮＡの影響を最小限に抑え、混合
試料を作製することができる。いくつかの実施形態では、疾患／状態が局所的な（非転移
性）がんである場合、ｃｔＤＮＡの量は少なく、容易かつ正確に測定および定量化され得
ない。混合試料を少なくとも約５０ｎｇ、８０ｎｇ、１００ｎｇ、１２０ｎｇ、１５０ｎ
ｇまたは２００ｎｇにして、さらなる濃縮に供する。
本開示は、疾患／状態を有するかまたはそのような疾患／状態を有すると疑われる対象
のメチル化プロファイルを生成するための方法、システムおよびキットを提供し、メチル
化プロファイルは、対象が疾患／状態を有するかまたは疾患／状態を有するリスクがある
かどうかを判定するために使用され得る。ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑを使用する前に、本明
細書に開示される試料をライブラリ調製に供する。手短に言えば、末端修復およびＡテー
リングの後、試料を核酸アダプターにライゲートし、酵素を用いて消化する。試料の項で
上述したように、調製したライブラリをフィラー核酸（例えば、フィラーλＤＮＡ）と組
み合わせて、調製したライブラリの低い存在量のｃｔＤＮＡの影響を最小限に抑え、混合
試料を作製することができる。いくつかの実施形態では、疾患／状態が局所的な（非転移
性）がんである場合、ｃｔＤＮＡの量は少なく、容易かつ正確に測定および定量化され得
ない。混合試料を少なくとも約５０ｎｇ、８０ｎｇ、１００ｎｇ、１２０ｎｇ、１５０ｎ
ｇまたは２００ｎｇにして、さらなる濃縮に供する。
【0066】
本明細書に記載の方法、システム、およびキットは、それだけに限ることなく、副腎が
ん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳／ＣＮＳ腫瘍、乳がん、キャッスルマン
病、子宮頸がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリーの腫
瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、妊娠性
栄養膜疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭および下咽頭がん、白血病（急性
リンパ球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、慢性骨髄単球性）、肝臓がん、
肺がん（非小細胞、小細胞、肺カルチノイド腫瘍）、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、悪性中
皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細
胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、陰茎がん、下
垂体がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫－成人軟部組織が
ん、皮膚がん（基底細胞および扁平上皮細胞、黒色腫、メルケル細胞）、小腸がん、胃が
ん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトレ
ームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍を含む様々ながんに適用できる。実施形態で
は、がんは頭頸部扁平上皮癌である。
ん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳／ＣＮＳ腫瘍、乳がん、キャッスルマン
病、子宮頸がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリーの腫
瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、妊娠性
栄養膜疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭および下咽頭がん、白血病（急性
リンパ球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、慢性骨髄単球性）、肝臓がん、
肺がん（非小細胞、小細胞、肺カルチノイド腫瘍）、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、悪性中
皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細
胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、陰茎がん、下
垂体がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫－成人軟部組織が
ん、皮膚がん（基底細胞および扁平上皮細胞、黒色腫、メルケル細胞）、小腸がん、胃が
ん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトレ
ームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍を含む様々ながんに適用できる。実施形態で
は、がんは頭頸部扁平上皮癌である。
【0067】
結合剤を使用して混合試料を濃縮することができる。いくつかの実施形態では、結合剤
は、メチル－ＣｐＧ結合ドメインを含むタンパク質である。そのような例示的なタンパク
質の１つは、ＭＢＤ２タンパク質である。本明細書で使用される場合、「メチル－ＣｐＧ
結合ドメイン（ＭＢＤ）」は、約７０残基の長さであり、１つまたは複数の対称的にメチ
ル化されたＣｐＧを含むＤＮＡに結合するタンパク質および酵素の特定のドメインを指す
。ＭｅＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ４およびＢＡＺ２のＭＢＤは、ＤＮＡへの結
合を媒介し、ＭｅＣＰ２、ＭＢＤ１およびＭＢＤ２の場合、優先的にはメチル化ＣｐＧへ
の結合を媒介する。ヒトタンパク質ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、および
ＭＢＤ４は、メチル－ＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）のそれぞれに存在することによって
関連する核タンパク質のファミリーを含む。これらのタンパク質の各々は、ＭＢＤ３を除
いて、メチル化ＤＮＡに特異的に結合することができる。
は、メチル－ＣｐＧ結合ドメインを含むタンパク質である。そのような例示的なタンパク
質の１つは、ＭＢＤ２タンパク質である。本明細書で使用される場合、「メチル－ＣｐＧ
結合ドメイン（ＭＢＤ）」は、約７０残基の長さであり、１つまたは複数の対称的にメチ
ル化されたＣｐＧを含むＤＮＡに結合するタンパク質および酵素の特定のドメインを指す
。ＭｅＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ４およびＢＡＺ２のＭＢＤは、ＤＮＡへの結
合を媒介し、ＭｅＣＰ２、ＭＢＤ１およびＭＢＤ２の場合、優先的にはメチル化ＣｐＧへ
の結合を媒介する。ヒトタンパク質ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、および
ＭＢＤ４は、メチル－ＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）のそれぞれに存在することによって
関連する核タンパク質のファミリーを含む。これらのタンパク質の各々は、ＭＢＤ３を除
いて、メチル化ＤＮＡに特異的に結合することができる。
【0068】
他の実施形態では、結合剤は抗体であり、セルフリーメチル化ＤＮＡを捕捉することは
、抗体を使用してセルフリーメチル化ＤＮＡを免疫沈降させることを含む。本明細書で使
用される場合、「免疫沈降」は、その特定の抗原に特異的に結合する抗体を使用して抗原
（ポリペプチドおよびヌクレオチドなど）を溶液から沈殿させる技術を指す。このプロセ
スは、試料から特定のタンパク質またはＤＮＡを単離および濃縮するために使用され得、
手順のある時点で抗体が固体の基材に結合されることを必要とする。固体の基材は、例え
ばビーズ、例えば磁気ビーズを含む。他の種類のビーズおよび固体の基材を使用してもよ
い。
、抗体を使用してセルフリーメチル化ＤＮＡを免疫沈降させることを含む。本明細書で使
用される場合、「免疫沈降」は、その特定の抗原に特異的に結合する抗体を使用して抗原
（ポリペプチドおよびヌクレオチドなど）を溶液から沈殿させる技術を指す。このプロセ
スは、試料から特定のタンパク質またはＤＮＡを単離および濃縮するために使用され得、
手順のある時点で抗体が固体の基材に結合されることを必要とする。固体の基材は、例え
ばビーズ、例えば磁気ビーズを含む。他の種類のビーズおよび固体の基材を使用してもよ
い。
【0069】
１つの例示的抗体は５－ＭｅＣ抗体である。免疫沈降手順のために、いくつかの実施形
態では、少なくとも０．０５μｇの抗体を試料に添加する。一方、より好ましい実施形態
では、少なくとも０．１６μｇの抗体を試料に添加する。免疫沈降反応を確認するために
、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、第２の量の対照ＤＮＡを試料に添
加する工程をさらに含む。
態では、少なくとも０．０５μｇの抗体を試料に添加する。一方、より好ましい実施形態
では、少なくとも０．１６μｇの抗体を試料に添加する。免疫沈降反応を確認するために
、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、第２の量の対照ＤＮＡを試料に添
加する工程をさらに含む。
【0070】
濃縮された試料をさらに増幅し、精製し、配列決定して、複数の配列リードを生成する
。複数の配列リードを分析して、複数の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）を同定する。いく
つかの実施形態では、複数のＤＭＲは、末梢血白血球（ＰＢＬ）に由来するセルフリー核
酸分子に由来するＤＭＲを含む。いくつかの実施形態では、複数のＤＭＲは、少なくとも
約７５万個の重複しない約３００ｂｐの核酸断片ウィンドウを含む。これらの断片は、８
個以上のＣｐＧアイランドを含む。いくつかの実施形態では、ＤＭＲは、疾患／状態を有
する患者から得られた試料から生成された配列リードを、健常な対照から得られた試料か
ら生成された配列リードと比較することによって、同定される。いくつかの実施形態では
、健常な対照は、疾患／状態を発症するための同じリスク因子のセットを含む。いくつか
の実施形態では、複数のＤＭＲは、少なくとも約９９７個のＤＭＲ、ＨＮＳＣＣにおける
約９４１個の過剰メチル化およびＨＮＳＣＣにおける５６個の低メチル化を含む（表５）
。本明細書において同じ開示のアプローチを使用して、過剰メチル化ＤＭＲを異なるがん
（例えば、肺がん、膵臓がん、結腸直腸がん）について検出することができ、低メチル化
ＤＭＲを異なるがんについて検出することができる。
。複数の配列リードを分析して、複数の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）を同定する。いく
つかの実施形態では、複数のＤＭＲは、末梢血白血球（ＰＢＬ）に由来するセルフリー核
酸分子に由来するＤＭＲを含む。いくつかの実施形態では、複数のＤＭＲは、少なくとも
約７５万個の重複しない約３００ｂｐの核酸断片ウィンドウを含む。これらの断片は、８
個以上のＣｐＧアイランドを含む。いくつかの実施形態では、ＤＭＲは、疾患／状態を有
する患者から得られた試料から生成された配列リードを、健常な対照から得られた試料か
ら生成された配列リードと比較することによって、同定される。いくつかの実施形態では
、健常な対照は、疾患／状態を発症するための同じリスク因子のセットを含む。いくつか
の実施形態では、複数のＤＭＲは、少なくとも約９９７個のＤＭＲ、ＨＮＳＣＣにおける
約９４１個の過剰メチル化およびＨＮＳＣＣにおける５６個の低メチル化を含む（表５）
。本明細書において同じ開示のアプローチを使用して、過剰メチル化ＤＭＲを異なるがん
（例えば、肺がん、膵臓がん、結腸直腸がん）について検出することができ、低メチル化
ＤＭＲを異なるがんについて検出することができる。
【表1】
【0071】
ゲノム変異プロファイル
本開示は、疾患／状態を有するかまたはそのような疾患／状態を有すると疑われる対象
の変異プロファイルを生成するための方法、システムおよびキットを提供し、メチル化プ
ロファイルは、対象が疾患／状態を有するかまたは疾患／状態を有するリスクがあるかど
うかを判定するために使用され得る。本明細書に開示される試料は、ライブラリ調製およ
び次世代ディープシーケンシング（例えば、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ）に供される。複数の配列
決定リードが生成され、分析される。いくつかの実施形態では、ディープシーケンシング
は、疾患／状態に関連するゲノム変異の同定を最大化するように構成され得る。例えば、
限定することを意図するものではないが、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）については、
標準的なＨＮＳＣＣドライバ遺伝子のパネルをＣＡＰＰ－ｓｅｑのセレクタに含めること
ができる。さらに、肺がんの場合、肺がん駆動遺伝子のパネルがＣＡＰＰ－ｓｅｑのセレ
クタに含まれ得る。さらに、膵臓がんの場合、膵臓がん駆動遺伝子のパネルは、ＣＡＰＰ
－ｓｅｑのためのセレクタに含まれ得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＰＰ－ｓｅｑの
セレクタに特定のがんのタイプにおける既知のドライバ効果のない遺伝子を含めることに
より、ｃｔＤＮＡ検出の感度を高めることができる。
本開示は、疾患／状態を有するかまたはそのような疾患／状態を有すると疑われる対象
の変異プロファイルを生成するための方法、システムおよびキットを提供し、メチル化プ
ロファイルは、対象が疾患／状態を有するかまたは疾患／状態を有するリスクがあるかど
うかを判定するために使用され得る。本明細書に開示される試料は、ライブラリ調製およ
び次世代ディープシーケンシング（例えば、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ）に供される。複数の配列
決定リードが生成され、分析される。いくつかの実施形態では、ディープシーケンシング
は、疾患／状態に関連するゲノム変異の同定を最大化するように構成され得る。例えば、
限定することを意図するものではないが、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）については、
標準的なＨＮＳＣＣドライバ遺伝子のパネルをＣＡＰＰ－ｓｅｑのセレクタに含めること
ができる。さらに、肺がんの場合、肺がん駆動遺伝子のパネルがＣＡＰＰ－ｓｅｑのセレ
クタに含まれ得る。さらに、膵臓がんの場合、膵臓がん駆動遺伝子のパネルは、ＣＡＰＰ
－ｓｅｑのためのセレクタに含まれ得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＰＰ－ｓｅｑの
セレクタに特定のがんのタイプにおける既知のドライバ効果のない遺伝子を含めることに
より、ｃｔＤＮＡ検出の感度を高めることができる。
【0072】
いくつかの実施形態では、ｃｔＤＮＡ存在量の相対的な尺度は、平均変異対立遺伝子画
分（ＭＡＦ）から計算される。いくつかの実施形態では、変異の平均ＭＡＦは、対象を同
定し、その変異プロファイルに含まれるのは、少なくとも約０．０１％～少なくとも約１
０％の範囲である。本明細書に開示される試料のｃｔＤＮＡ画分は、少なくとも約０．０
１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０
．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．５％、１％、１．５％、
２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、
７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、またはその間の任意の割合
である。
分（ＭＡＦ）から計算される。いくつかの実施形態では、変異の平均ＭＡＦは、対象を同
定し、その変異プロファイルに含まれるのは、少なくとも約０．０１％～少なくとも約１
０％の範囲である。本明細書に開示される試料のｃｔＤＮＡ画分は、少なくとも約０．０
１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０
．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．５％、１％、１．５％、
２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、
７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、またはその間の任意の割合
である。
【0073】
いくつかの実施形態では、対象の生成された変異プロファイルは、ＰＢＬに由来するセ
ルフリー核酸分子に由来する変異の変異体を含まない。いくつかの実施形態では、変異プ
ロファイルは、ミスセンス変異体、ナンセンス変異体、欠失変異体、挿入変異体、重複変
異体、逆位変異体、フレームシフト変異体、または反復伸長変異体などの遺伝子多型を含
む。いくつかの実施形態では、変異プロファイルは、特定のサイズ範囲のセルフリー核酸
分子の画分に由来する変異の変異体を含み得る。
ルフリー核酸分子に由来する変異の変異体を含まない。いくつかの実施形態では、変異プ
ロファイルは、ミスセンス変異体、ナンセンス変異体、欠失変異体、挿入変異体、重複変
異体、逆位変異体、フレームシフト変異体、または反復伸長変異体などの遺伝子多型を含
む。いくつかの実施形態では、変異プロファイルは、特定のサイズ範囲のセルフリー核酸
分子の画分に由来する変異の変異体を含み得る。
【0074】
断片の長さプロファイル
いくつかの実施形態では、ｃｔＤＮＡ断片の長さは、健常な対象に由来するセルフリー
核酸分子よりも短い。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異を含むｃｔＤＮＡ
の長さは、対応する参照対立遺伝子を含むセルフリー核酸分子の長さよりも短い。いくつ
かの実施形態では、少なくとも１つのＤＭＲを含有するｃｔＤＮＡ断片の長さは、対応す
るゲノム領域を含有するセルフリー核酸分子の断片よりも短い。
いくつかの実施形態では、ｃｔＤＮＡ断片の長さは、健常な対象に由来するセルフリー
核酸分子よりも短い。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異を含むｃｔＤＮＡ
の長さは、対応する参照対立遺伝子を含むセルフリー核酸分子の長さよりも短い。いくつ
かの実施形態では、少なくとも１つのＤＭＲを含有するｃｔＤＮＡ断片の長さは、対応す
るゲノム領域を含有するセルフリー核酸分子の断片よりも短い。
【0075】
いくつかの実施形態では、配列決定は、ｃｔＤＮＡ断片の分解を引き起こし、ｃｔＤＮ
Ａの長さの分布の保存を妨げるので、亜硫酸水素塩配列を利用しない。いくつかの実施形
態では、ｃｔＤＮＡの断片の長さは、少なくとも６０～５００ｂｐ、８０～３００ｂｐ、
９０～２５０ｂｐ、８０～１７０ｂｐ、または１００～１５０ｂｐである。いくつかの実
施形態では、本開示は、特定のサイズのセルフリー分子の選択に基づいて、セルフリー核
酸試料の濃縮をもたらす。いくつかの実施形態では、マルチモーダル解析は、複数の核酸
分子をそれらの断片の長さに基づいて変異プロファイルに選択的に含めることによって、
本明細書に記載の変異プロファイルおよび断片の長さプロファイルを利用することを含む
。いくつかの実施形態では、マルチモーダル解析は、複数の核酸分子をそれらの断片の長
さに基づいてメチル化プロファイルに選択的に含めることによって、本明細書に記載のメ
チル化プロファイルおよび断片の長さプロファイルを利用することを含む。いくつかの実
施形態では、マルチモーダル解析は、複数の核酸分子をそれらの断片の長さに基づいて変
異プロファイルに選択的に含めることによって、および複数の核酸分子をそれらの断片の
長さにそれぞれ基づいてメチル化プロファイルに選択的に含めることによって、変異プロ
ファイル、メチル化プロファイル、および断片の長さプロファイルを一緒に利用すること
を含む。
Ａの長さの分布の保存を妨げるので、亜硫酸水素塩配列を利用しない。いくつかの実施形
態では、ｃｔＤＮＡの断片の長さは、少なくとも６０～５００ｂｐ、８０～３００ｂｐ、
９０～２５０ｂｐ、８０～１７０ｂｐ、または１００～１５０ｂｐである。いくつかの実
施形態では、本開示は、特定のサイズのセルフリー分子の選択に基づいて、セルフリー核
酸試料の濃縮をもたらす。いくつかの実施形態では、マルチモーダル解析は、複数の核酸
分子をそれらの断片の長さに基づいて変異プロファイルに選択的に含めることによって、
本明細書に記載の変異プロファイルおよび断片の長さプロファイルを利用することを含む
。いくつかの実施形態では、マルチモーダル解析は、複数の核酸分子をそれらの断片の長
さに基づいてメチル化プロファイルに選択的に含めることによって、本明細書に記載のメ
チル化プロファイルおよび断片の長さプロファイルを利用することを含む。いくつかの実
施形態では、マルチモーダル解析は、複数の核酸分子をそれらの断片の長さに基づいて変
異プロファイルに選択的に含めることによって、および複数の核酸分子をそれらの断片の
長さにそれぞれ基づいてメチル化プロファイルに選択的に含めることによって、変異プロ
ファイル、メチル化プロファイル、および断片の長さプロファイルを一緒に利用すること
を含む。
【0076】
がんを検出し、腫瘍の起源の組織を決定し、予後を提供するための方法およびシステム
本開示は、対象が疾患を有するか、または疾患を有するリスクがあるかどうかを判定す
るための方法およびシステムを提供し、この方法およびシステムは、（ｉ）メチル化プロ
ファイル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルのうち
の少なくとも１つのプロファイルを生成するために前記対象から得られたセルフリー核酸
試料に由来する複数の核酸分子をシーケンシングに供する工程、および前記対象が前記疾
患を有するかまたは前記疾患のリスクがあるかどうかを少なくとも８０％の感度または少
なくとも約９０％の特異度で判定するために前記少なくとも１つのプロファイルを処理す
る工程であって、前記セルフリー核酸試料が３０ｎｇ／ｍｌ未満の前記複数の核酸分子を
含む、処理する工程を含む。いくつかの実施形態では、感度は、少なくとも約８０％、８
１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９
１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％
、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または数字の間の任意のパーセン
テージである。いくつかの実施形態では、特異度は、少なくとも約９０％、９１％、９２
％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２
％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９
．９％、または数字の間の任意のパーセンテージである。
本開示は、対象が疾患を有するか、または疾患を有するリスクがあるかどうかを判定す
るための方法およびシステムを提供し、この方法およびシステムは、（ｉ）メチル化プロ
ファイル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルのうち
の少なくとも１つのプロファイルを生成するために前記対象から得られたセルフリー核酸
試料に由来する複数の核酸分子をシーケンシングに供する工程、および前記対象が前記疾
患を有するかまたは前記疾患のリスクがあるかどうかを少なくとも８０％の感度または少
なくとも約９０％の特異度で判定するために前記少なくとも１つのプロファイルを処理す
る工程であって、前記セルフリー核酸試料が３０ｎｇ／ｍｌ未満の前記複数の核酸分子を
含む、処理する工程を含む。いくつかの実施形態では、感度は、少なくとも約８０％、８
１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９
１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％
、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または数字の間の任意のパーセン
テージである。いくつかの実施形態では、特異度は、少なくとも約９０％、９１％、９２
％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２
％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９
．９％、または数字の間の任意のパーセンテージである。
【0077】
いくつかの実施形態では、方法およびシステムは、前記対象から得られたセルフリー核
酸試料に由来する複数の核酸分子を配列決定に供して、（ｉ）メチル化プロファイル、（
ｉｉ）変異プロファイルおよび（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルのうちの少なくとも２
つのプロファイルを生成させる工程を含む。方法は、少なくとも約８０％、８１％、８２
％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２
％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６
％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または数字の間の任意のパーセンテージの感
度をもたらす。いくつかの実施形態では、２つのプロファイルを使用する場合の感度は、
１つのプロファイルを使用する場合の感度と比較して、任意の数字の間で少なくとも約０
．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、またはパー
センテージだけ増加する。いくつかの実施形態では、３つのプロファイルを使用する場合
の感度は、２つのプロファイルを使用する場合の感度と比較して、任意の数字の間で少な
くとも約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、
またはパーセンテージだけ増加する。
酸試料に由来する複数の核酸分子を配列決定に供して、（ｉ）メチル化プロファイル、（
ｉｉ）変異プロファイルおよび（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルのうちの少なくとも２
つのプロファイルを生成させる工程を含む。方法は、少なくとも約８０％、８１％、８２
％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２
％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６
％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または数字の間の任意のパーセンテージの感
度をもたらす。いくつかの実施形態では、２つのプロファイルを使用する場合の感度は、
１つのプロファイルを使用する場合の感度と比較して、任意の数字の間で少なくとも約０
．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、またはパー
センテージだけ増加する。いくつかの実施形態では、３つのプロファイルを使用する場合
の感度は、２つのプロファイルを使用する場合の感度と比較して、任意の数字の間で少な
くとも約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、
またはパーセンテージだけ増加する。
【0078】
さらに、方法は、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９
６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９
９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または数字の間の任意の
パーセンテージの特異度をもたらす。いくつかの実施形態では、２つのプロファイルを使
用する場合の特異度は、１つのプロファイルを使用する場合の特異度と比較して、任意の
数字の間で少なくとも約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、
９％、１０％、またはパーセンテージだけ増加する。いくつかの実施形態では、３つのプ
ロファイルを使用する場合の特異度は、２つのプロファイルを使用する場合の特異度と比
較して、任意の数字の間で少なくとも約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％
、７％、８％、９％、１０％、またはパーセンテージだけ増加する。
６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９
９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または数字の間の任意の
パーセンテージの特異度をもたらす。いくつかの実施形態では、２つのプロファイルを使
用する場合の特異度は、１つのプロファイルを使用する場合の特異度と比較して、任意の
数字の間で少なくとも約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、
９％、１０％、またはパーセンテージだけ増加する。いくつかの実施形態では、３つのプ
ロファイルを使用する場合の特異度は、２つのプロファイルを使用する場合の特異度と比
較して、任意の数字の間で少なくとも約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％
、７％、８％、９％、１０％、またはパーセンテージだけ増加する。
【0079】
本開示は、対象のセルフリー核酸試料を処理して、前記対象が疾患を有するかまたは疾
患を有するリスクがあるかどうかを判定する方法およびシステムであって、複数の核酸分
子を含む前記セルフリー核酸試料を得る工程、前記複数の核酸分子またはその誘導体を配
列決定に供して、複数の配列決定リードを生成する工程、前記複数の配列決定リードをコ
ンピュータ処理して、前記複数の核酸分子について、（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉ
ｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルを同定する工程、およ
び前記対象が前記疾患を有するかまたは有するリスクがあるかどうかを判定するために、
少なくとも前記メチル化プロファイル、前記変異プロファイルおよび前記断片の長さプロ
ファイルを使用する工程を含む、方法およびシステムを提供する。いくつかの実施形態で
は、方法は、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、
８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、
９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９
％、または数字の間の任意のパーセンテージの感度をもたらす。方法は、少なくとも約９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９
９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％
、９９．８％、９９．９％、または数字の間の任意のパーセンテージの特異度をもたらす
。
患を有するリスクがあるかどうかを判定する方法およびシステムであって、複数の核酸分
子を含む前記セルフリー核酸試料を得る工程、前記複数の核酸分子またはその誘導体を配
列決定に供して、複数の配列決定リードを生成する工程、前記複数の配列決定リードをコ
ンピュータ処理して、前記複数の核酸分子について、（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉ
ｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルを同定する工程、およ
び前記対象が前記疾患を有するかまたは有するリスクがあるかどうかを判定するために、
少なくとも前記メチル化プロファイル、前記変異プロファイルおよび前記断片の長さプロ
ファイルを使用する工程を含む、方法およびシステムを提供する。いくつかの実施形態で
は、方法は、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、
８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、
９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９
％、または数字の間の任意のパーセンテージの感度をもたらす。方法は、少なくとも約９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９
９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％
、９９．８％、９９．９％、または数字の間の任意のパーセンテージの特異度をもたらす
。
【0080】
本開示は、複数の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）を同定することを含む、腫瘍の組織の
起源を決定するための方法およびシステムを提供し、複数のＤＭＲは、特定のがん（例え
ば、乳がん、結腸がん、前立腺がん、ＨＳＮＣＣ）に特異的であり、セルフリー核酸分子
の画分に由来する。いくつかの実施形態では、セルフリー核酸分子の画分はｃｔＤＮＡに
由来する。いくつかの実施形態では、方法は少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３
％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３
％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９
．７％、９９．８％、９９．９％、または数字の間の任意のパーセンテージの感度をもた
らす。方法は、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％
、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．
５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または数字の間の任意のパー
センテージの特異度をもたらす。
起源を決定するための方法およびシステムを提供し、複数のＤＭＲは、特定のがん（例え
ば、乳がん、結腸がん、前立腺がん、ＨＳＮＣＣ）に特異的であり、セルフリー核酸分子
の画分に由来する。いくつかの実施形態では、セルフリー核酸分子の画分はｃｔＤＮＡに
由来する。いくつかの実施形態では、方法は少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３
％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３
％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９
．７％、９９．８％、９９．９％、または数字の間の任意のパーセンテージの感度をもた
らす。方法は、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％
、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．
５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または数字の間の任意のパー
センテージの特異度をもたらす。
【0081】
本開示は、疾患／状態の治療を受けた後に対象に対して予後を得るための方法およびシ
ステムを記載する。例えば、治療は、腫瘍の外科的除去、特定の種類のがんのために設計
された化学療法、放射線療法、または免疫療法（例えば、ＴＣＲ、ＣＡＲなど）を含む。
いくつかの実施形態では、方法またはシステムは、前記対象から得られたセルフリー核酸
試料に由来する複数の核酸分子を配列決定に供して、（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉ
ｉ）変異プロファイルおよび（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルのうちの少なくとも１つ
のプロファイルを生成させること、および少なくとも１つのプロファイルに少なくとも基
づいて微小残存病変（ＭＲＤ）をモニタリングまたは検出することを含む。
ステムを記載する。例えば、治療は、腫瘍の外科的除去、特定の種類のがんのために設計
された化学療法、放射線療法、または免疫療法（例えば、ＴＣＲ、ＣＡＲなど）を含む。
いくつかの実施形態では、方法またはシステムは、前記対象から得られたセルフリー核酸
試料に由来する複数の核酸分子を配列決定に供して、（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉ
ｉ）変異プロファイルおよび（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルのうちの少なくとも１つ
のプロファイルを生成させること、および少なくとも１つのプロファイルに少なくとも基
づいて微小残存病変（ＭＲＤ）をモニタリングまたは検出することを含む。
【0082】
本開示は、対象からの試料の少なくとも一部からのセルフリー核酸分子をアッセイする
ことによって、前記対象が疾患／状態を有するかどうかを判定するため、表５に列挙され
る差次的メチル化領域（ＤＭＲ）に含まれる前記セルフリー核酸分子の少なくとも一部の
メチル化レベルを検出するため、また少なくとも１つのコンピュータプロセッサを使用し
て、（ｂ）で検出された前記メチル化レベルを、前記表５に列挙されたＤＭＲに含まれる
前記セルフリー核酸分子の対応する（１つまたは複数の）部分のメチル化レベルと比較す
るための方法およびシステムを提供する。いくつかの実施形態では、表５に列挙される少
なくとも約６個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、
５０個以上、６０個以上、７０個以上、８０個以上、９０個以上、または１００個以上、
２００個以上、３００個以上、４００個以上、５００個以上、６００個以上、または７０
０個以上のＤＭＲのメチル化レベルが測定され、本明細書で論じられる健常な対象の対応
するＤＭＲのメチル化レベルと比較される。
ことによって、前記対象が疾患／状態を有するかどうかを判定するため、表５に列挙され
る差次的メチル化領域（ＤＭＲ）に含まれる前記セルフリー核酸分子の少なくとも一部の
メチル化レベルを検出するため、また少なくとも１つのコンピュータプロセッサを使用し
て、（ｂ）で検出された前記メチル化レベルを、前記表５に列挙されたＤＭＲに含まれる
前記セルフリー核酸分子の対応する（１つまたは複数の）部分のメチル化レベルと比較す
るための方法およびシステムを提供する。いくつかの実施形態では、表５に列挙される少
なくとも約６個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、
５０個以上、６０個以上、７０個以上、８０個以上、９０個以上、または１００個以上、
２００個以上、３００個以上、４００個以上、５００個以上、６００個以上、または７０
０個以上のＤＭＲのメチル化レベルが測定され、本明細書で論じられる健常な対象の対応
するＤＭＲのメチル化レベルと比較される。
【0083】
対象が正確に診断され、外科的除去、化学療法、放射線療法などのがんを治療するため
の治療を受けるたら、治療の有効性をモニタリングし、患者の生存率を予測することが重
要である。さらに、がん細胞の最小限の残存疾患を検出することが重要である。本開示は
、前記対象が疾患の治療を受けた後に生存率が高いかどうかを判定するための方法および
システムを提供し、この方法およびシステムは、前記対象からの試料の少なくとも一部か
らのセルフリー核酸分子をアッセイすること、表６に列挙される差次的メチル化領域（Ｄ
ＭＲ）に含まれる前記セルフリー核酸分子の少なくとも一部のメチル化レベルを検出する
こと、また少なくとも１つのコンピュータプロセッサを使用して、（ｂ）で検出された前
記メチル化レベルを、表６に列挙された前記ＤＭＲに含まれる前記セルフリー核酸分子の
対応する（１つまたは複数の）部分のメチル化レベルと比較することを含む。いくつかの
実施形態では、表６に列挙されるＤＭＲは、遺伝子ＺＳＣＡＮ３１、ＬＩＮＣ０１３９１
、ＧＡＴＡ２－ＡＳ１、ＳＴＫ３、およびＯＳＲ１に関連する領域を表す。
の治療を受けるたら、治療の有効性をモニタリングし、患者の生存率を予測することが重
要である。さらに、がん細胞の最小限の残存疾患を検出することが重要である。本開示は
、前記対象が疾患の治療を受けた後に生存率が高いかどうかを判定するための方法および
システムを提供し、この方法およびシステムは、前記対象からの試料の少なくとも一部か
らのセルフリー核酸分子をアッセイすること、表６に列挙される差次的メチル化領域（Ｄ
ＭＲ）に含まれる前記セルフリー核酸分子の少なくとも一部のメチル化レベルを検出する
こと、また少なくとも１つのコンピュータプロセッサを使用して、（ｂ）で検出された前
記メチル化レベルを、表６に列挙された前記ＤＭＲに含まれる前記セルフリー核酸分子の
対応する（１つまたは複数の）部分のメチル化レベルと比較することを含む。いくつかの
実施形態では、表６に列挙されるＤＭＲは、遺伝子ＺＳＣＡＮ３１、ＬＩＮＣ０１３９１
、ＧＡＴＡ２－ＡＳ１、ＳＴＫ３、およびＯＳＲ１に関連する領域を表す。
【表2】
【0084】
いくつかの実施形態では、方法は、免疫沈降反応を確認するために第２の量の対照ＤＮ
Ａを試料に添加する工程をさらに含む。
Ａを試料に添加する工程をさらに含む。
【0085】
本明細書で使用される場合、「対照」は、陽性対照と陰性対照の両方、または少なくと
も陽性対照を含み得る。
も陽性対照を含み得る。
【0086】
いくつかの実施形態では、方法は、セルフリーメチル化ＤＮＡの捕捉を確認するために
、第２の量の対照ＤＮＡを試料に添加する工程をさらに含む。
、第２の量の対照ＤＮＡを試料に添加する工程をさらに含む。
【0087】
いくつかの実施形態では、がん細胞由来のＤＮＡが存在することを同定することは、が
ん細胞の起源の組織を同定することをさらに含む。
ん細胞の起源の組織を同定することをさらに含む。
【0088】
いくつかの例では、腫瘍組織サンプリングは困難であるか、または重大なリスクを伴う
可能性があり、その場合、腫瘍組織サンプリングを必要とせずにがんを診断および／また
はサブタイプに分けることが望ましい場合がある。例えば、肺腫瘍組織サンプリングは、
縦隔鏡検査、開胸、または経皮的針生検などの侵襲的処置を必要とし得る。これらの処置
は、入院、胸腔チューブ、機械での換気、抗生物質、または他の医学的介入の必要性をも
たらし得る。一部の個体は、医学的併存症のために、または優先度のために、腫瘍組織サ
ンプリングに必要な侵襲的処置を受けないことがある。いくつかの例では、腫瘍組織調達
の実際の手順は、疑われているがんのサブタイプに依存し得る。他の例では、がんのサブ
タイプは、同じ個体の体内で経時的に進展し得、侵襲性腫瘍組織サンプリング処置による
連続的な評価は、多くの場合非現実的であり、患者が十分に忍容できない。したがって、
血液検査による非侵襲性がんのサブタイプ分類は、臨床腫瘍学の実施において多くの有利
な用途を有し得る。
可能性があり、その場合、腫瘍組織サンプリングを必要とせずにがんを診断および／また
はサブタイプに分けることが望ましい場合がある。例えば、肺腫瘍組織サンプリングは、
縦隔鏡検査、開胸、または経皮的針生検などの侵襲的処置を必要とし得る。これらの処置
は、入院、胸腔チューブ、機械での換気、抗生物質、または他の医学的介入の必要性をも
たらし得る。一部の個体は、医学的併存症のために、または優先度のために、腫瘍組織サ
ンプリングに必要な侵襲的処置を受けないことがある。いくつかの例では、腫瘍組織調達
の実際の手順は、疑われているがんのサブタイプに依存し得る。他の例では、がんのサブ
タイプは、同じ個体の体内で経時的に進展し得、侵襲性腫瘍組織サンプリング処置による
連続的な評価は、多くの場合非現実的であり、患者が十分に忍容できない。したがって、
血液検査による非侵襲性がんのサブタイプ分類は、臨床腫瘍学の実施において多くの有利
な用途を有し得る。
【0089】
したがって、いくつかの実施形態では、がん細胞の起源の組織を同定することは、がん
のサブタイプを同定することをさらに含む。好ましくは、がんのサブタイプは、ステージ
（例えば、外科手術で治療された早期肺がん対化学療法で治療された後期肺がん）、組織
学（例えば、肺がんにおける小細胞癌対腺癌対扁平上皮癌）、遺伝子発現パターンまたは
転写因子活性（例えば、乳がんにおけるＥＲ状態）、コピー数の異常（例えば、乳がんに
おけるＨＥＲ２の状態）、特異的再編成（例えば、ＡＭＬにおけるＦＬＴ３）、特異的遺
伝子点変異状態（例えば、ＩＤＨ遺伝子点変異）、およびＤＮＡのメチル化パターン（例
えば、脳がんにおけるＭＧＭＴ遺伝子プロモーターのメチル化）に基づいてがんを区別す
る。
のサブタイプを同定することをさらに含む。好ましくは、がんのサブタイプは、ステージ
（例えば、外科手術で治療された早期肺がん対化学療法で治療された後期肺がん）、組織
学（例えば、肺がんにおける小細胞癌対腺癌対扁平上皮癌）、遺伝子発現パターンまたは
転写因子活性（例えば、乳がんにおけるＥＲ状態）、コピー数の異常（例えば、乳がんに
おけるＨＥＲ２の状態）、特異的再編成（例えば、ＡＭＬにおけるＦＬＴ３）、特異的遺
伝子点変異状態（例えば、ＩＤＨ遺伝子点変異）、およびＤＮＡのメチル化パターン（例
えば、脳がんにおけるＭＧＭＴ遺伝子プロモーターのメチル化）に基づいてがんを区別す
る。
【0090】
いくつかの実施形態では、工程（ｆ）における比較は、ゲノムワイドで行われる。
【0091】
他の実施形態では、工程（ｆ）における比較は、ゲノムワイドから、限定されないが、
ＦＡＮＴＯＭ５エンハンサー、ＣｐＧアイランド、ＣｐＧショア、ＣｐＧ Ｓｈｅｌｆま
たは前述の任意の組み合わせなどの特定の調節領域に制限される。
ＦＡＮＴＯＭ５エンハンサー、ＣｐＧアイランド、ＣｐＧショア、ＣｐＧ Ｓｈｅｌｆま
たは前述の任意の組み合わせなどの特定の調節領域に制限される。
【0092】
いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、がんの検出に使用するためのものである
。
。
【0093】
いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、がんの治療のモニタリングに使用するた
めのものである。
めのものである。
【0094】
データ分析システムおよび方法
本明細書に開示される方法およびシステムは、アルゴリズムまたはその使用を含むこと
ができる。１つまたは複数のアルゴリズムは、１つまたは複数の対象から１つまたは複数
の試料を分類するために使用され得る。１つまたは複数のアルゴリズムは、１つまたは複
数の試料からのデータに適用され得る。データはバイオマーカー発現データを含み得る。
本明細書に開示される方法は、１人または複数の対象からの１つまたは複数の試料に分類
を割り当てることを含み得る。分類を試料に割り当てることは、メチル化プロファイル、
変異プロファイルおよび断片の長さプロファイルにアルゴリズムを適用することを含み得
る。場合によっては、少なくとも１つのプロファイルは、対象から得られた試料を疾患ま
たは軽微な損傷を有すると分類するための訓練されたアルゴリズムを含むデータ分析シス
テムに入力される。
本明細書に開示される方法およびシステムは、アルゴリズムまたはその使用を含むこと
ができる。１つまたは複数のアルゴリズムは、１つまたは複数の対象から１つまたは複数
の試料を分類するために使用され得る。１つまたは複数のアルゴリズムは、１つまたは複
数の試料からのデータに適用され得る。データはバイオマーカー発現データを含み得る。
本明細書に開示される方法は、１人または複数の対象からの１つまたは複数の試料に分類
を割り当てることを含み得る。分類を試料に割り当てることは、メチル化プロファイル、
変異プロファイルおよび断片の長さプロファイルにアルゴリズムを適用することを含み得
る。場合によっては、少なくとも１つのプロファイルは、対象から得られた試料を疾患ま
たは軽微な損傷を有すると分類するための訓練されたアルゴリズムを含むデータ分析シス
テムに入力される。
【0095】
データ分析システムは、訓練されたアルゴリズムであってもよい。アルゴリズムは、線
形分類器を含み得る。場合によっては、線形分類器は、線形判別分析、フィッシャー線形
判別、ナイーブベイズ分類器、ロジスティック回帰、パーセプトロン、サポートベクター
マシン、またはそれらの組み合わせのうちの１つまたは複数を含む。線形分類器は、サポ
ートベクターマシン（ＳＶＭ）のアルゴリズムであってもよい。アルゴリズムは、双方向
分類器を含み得る。双方向分類器は、１つまたは複数の決定木、ランダムフォレスト、ベ
イジアンネットワーク、サポートベクターマシン、ニューラルネットワーク、またはロジ
スティック回帰アルゴリズムを含み得る。
形分類器を含み得る。場合によっては、線形分類器は、線形判別分析、フィッシャー線形
判別、ナイーブベイズ分類器、ロジスティック回帰、パーセプトロン、サポートベクター
マシン、またはそれらの組み合わせのうちの１つまたは複数を含む。線形分類器は、サポ
ートベクターマシン（ＳＶＭ）のアルゴリズムであってもよい。アルゴリズムは、双方向
分類器を含み得る。双方向分類器は、１つまたは複数の決定木、ランダムフォレスト、ベ
イジアンネットワーク、サポートベクターマシン、ニューラルネットワーク、またはロジ
スティック回帰アルゴリズムを含み得る。
【0096】
アルゴリズムは、１つまたは複数の線形判別分析（ＬＤＡ）、基本パーセプトロン、弾
性ネット、ロジスティック回帰、（カーネル）サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、対角
線形判別分析（ＤＬＤＡ）、ゴルビン分類器、パーゼンベース、（カーネル）フィッシャ
ー判別分類器、ｋ近傍法、反復ＲＥＬＩＥＦ、分類木、最尤分類器、ランダムフォレスト
、最近接重心、マイクロアレイの予測分析（ＰＡＭ）、ｋ中間クラスタリング、ファジー
Ｃ平均クラスタリング、ガウス混合モデル、勾配応答（ＧＲ）、勾配ブースティング法（
ＧＢＭ）、楕円ネットロジスティック回帰、ロジスティック回帰、またはそれらの組み合
わせを含み得る。アルゴリズムは、対角線形判別分析（ＤＬＤＡ）のアルゴリズムを含み
得る。アルゴリズムは、最近接重心のアルゴリズムを含み得る。アルゴリズムは、ランダ
ムフォレストのアルゴリズムを含み得る。いくつかの実施形態では、子癇前症および非子
癇前症を識別するために、ロジスティック回帰、ランダムフォレスト、および勾配ブース
ティング法（ＧＢＭ）のパフォーマンスは、線形判別分析（ＬＤＡ）、ニューラルネット
ワーク、およびサポートベクターマシン（ＳＶＭ）のパフォーマンスよりも優れている。
性ネット、ロジスティック回帰、（カーネル）サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、対角
線形判別分析（ＤＬＤＡ）、ゴルビン分類器、パーゼンベース、（カーネル）フィッシャ
ー判別分類器、ｋ近傍法、反復ＲＥＬＩＥＦ、分類木、最尤分類器、ランダムフォレスト
、最近接重心、マイクロアレイの予測分析（ＰＡＭ）、ｋ中間クラスタリング、ファジー
Ｃ平均クラスタリング、ガウス混合モデル、勾配応答（ＧＲ）、勾配ブースティング法（
ＧＢＭ）、楕円ネットロジスティック回帰、ロジスティック回帰、またはそれらの組み合
わせを含み得る。アルゴリズムは、対角線形判別分析（ＤＬＤＡ）のアルゴリズムを含み
得る。アルゴリズムは、最近接重心のアルゴリズムを含み得る。アルゴリズムは、ランダ
ムフォレストのアルゴリズムを含み得る。いくつかの実施形態では、子癇前症および非子
癇前症を識別するために、ロジスティック回帰、ランダムフォレスト、および勾配ブース
ティング法（ＧＢＭ）のパフォーマンスは、線形判別分析（ＬＤＡ）、ニューラルネット
ワーク、およびサポートベクターマシン（ＳＶＭ）のパフォーマンスよりも優れている。
【0097】
キット
本開示は、対象の疾患または障害（例えば、がん）を同定またはモニタリングするため
のキットを提供する。キットは、対象の試料のがん関連ゲノム遺伝子座のパネルの各々に
おける配列の定量的尺度（例えば、存在、非存在、または相対的な量を示す）を同定する
ためのプローブを含み得る。試料のがん関連ゲノム遺伝子座のパネルの各々における配列
の定量的尺度（例えば、存在、非存在、または相対的な量を示す）は、対象の疾患または
障害（例えば、がん）を示し得る。プローブは、試料のがん関連ゲノム遺伝子座（例えば
、表３、５および６に列挙されるＤＭＲ）のパネルにおける配列に対して選択的であり得
る。キットは、プローブを使用して試料を処理し、対象の試料のがん関連ゲノム遺伝子座
のパネルのそれぞれにおける配列の定量的尺度（例えば、存在、非存在、または相対的な
量を示す）を示すデータセットを生成するための説明書を含み得る。
本開示は、対象の疾患または障害（例えば、がん）を同定またはモニタリングするため
のキットを提供する。キットは、対象の試料のがん関連ゲノム遺伝子座のパネルの各々に
おける配列の定量的尺度（例えば、存在、非存在、または相対的な量を示す）を同定する
ためのプローブを含み得る。試料のがん関連ゲノム遺伝子座のパネルの各々における配列
の定量的尺度（例えば、存在、非存在、または相対的な量を示す）は、対象の疾患または
障害（例えば、がん）を示し得る。プローブは、試料のがん関連ゲノム遺伝子座（例えば
、表３、５および６に列挙されるＤＭＲ）のパネルにおける配列に対して選択的であり得
る。キットは、プローブを使用して試料を処理し、対象の試料のがん関連ゲノム遺伝子座
のパネルのそれぞれにおける配列の定量的尺度（例えば、存在、非存在、または相対的な
量を示す）を示すデータセットを生成するための説明書を含み得る。
【0098】
キットにあるプローブは、試料のがん関連ゲノム遺伝子座のパネルにおける配列に対し
て選択的であり得る。キットにあるプローブは、がん関連ゲノム遺伝子座のパネルに対応
する核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）分子を選択的に濃縮するように構成され得る。
キットにあるプローブは核酸プライマーであり得る。キットにあるプローブは、がん関連
ゲノム遺伝子座またはゲノム領域のパネルの１つ以上からの核酸配列との配列相補性を有
し得る。がん関連ゲノム遺伝子座または微生物関連ゲノム遺伝子座またはゲノム領域のパ
ネルは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少
なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくと
も１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくと
も１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、またはそれより異なるがん
関連ゲノム遺伝子座またはゲノム領域のパネルを含み得る。
て選択的であり得る。キットにあるプローブは、がん関連ゲノム遺伝子座のパネルに対応
する核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）分子を選択的に濃縮するように構成され得る。
キットにあるプローブは核酸プライマーであり得る。キットにあるプローブは、がん関連
ゲノム遺伝子座またはゲノム領域のパネルの１つ以上からの核酸配列との配列相補性を有
し得る。がん関連ゲノム遺伝子座または微生物関連ゲノム遺伝子座またはゲノム領域のパ
ネルは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少
なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくと
も１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくと
も１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、またはそれより異なるがん
関連ゲノム遺伝子座またはゲノム領域のパネルを含み得る。
【0099】
キットの説明書は、セルフリー生物学的試料のがん関連ゲノム遺伝子座のパネルにおけ
る配列に対して選択的であるプローブを使用して、試料をアッセイするための説明書を含
み得る。これらのプローブは、がん関連ゲノム遺伝子座の複数のパネルのうちの１つ以上
由来の核酸配列（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）との配列相補性を有する核酸分子（例え
ば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）であり得る。これらの核酸分子は、プライマーまたは濃縮配列
であり得る。セルフリー生物試料をアッセイするための説明書は、アレイハイブリダイゼ
ーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または核酸の配列決定（例えば、ＤＮＡの
配列決定またはＲＮＡの配列決定）を実施して試料を処理し、試料のがん関連ゲノム遺伝
子座のパネルのそれぞれにおける配列の定量的尺度を示す（例えば、存在、非存在、また
は相対的な量を示す）データセットを生成するための導入を含み得る。試料のがん関連ゲ
ノム遺伝子座のパネルの各々における配列の定量的尺度（例えば、存在、非存在、または
相対的な量を示す）は、疾患または障害（例えば、がん）を示し得る。
る配列に対して選択的であるプローブを使用して、試料をアッセイするための説明書を含
み得る。これらのプローブは、がん関連ゲノム遺伝子座の複数のパネルのうちの１つ以上
由来の核酸配列（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）との配列相補性を有する核酸分子（例え
ば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）であり得る。これらの核酸分子は、プライマーまたは濃縮配列
であり得る。セルフリー生物試料をアッセイするための説明書は、アレイハイブリダイゼ
ーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または核酸の配列決定（例えば、ＤＮＡの
配列決定またはＲＮＡの配列決定）を実施して試料を処理し、試料のがん関連ゲノム遺伝
子座のパネルのそれぞれにおける配列の定量的尺度を示す（例えば、存在、非存在、また
は相対的な量を示す）データセットを生成するための導入を含み得る。試料のがん関連ゲ
ノム遺伝子座のパネルの各々における配列の定量的尺度（例えば、存在、非存在、または
相対的な量を示す）は、疾患または障害（例えば、がん）を示し得る。
【0100】
キットの説明書は、アッセイ読み出し値を測定および解釈するための説明書を含み得、
それは、試料のがん関連ゲノム遺伝子座のパネルの各々における配列の定量的尺度を示す
（例えば、存在、非存在、または相対的な量を示す）データセットを生成するために、が
ん関連ゲノム遺伝子座のパネルの１つまたは複数において定量化され得る。例えば、がん
関連ゲノム遺伝子座のパネルに対応するアレイハイブリダイゼーションまたはポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の定量化は、試料のがん関連ゲノム遺伝子座のパネルの各々におけ
る配列の定量的尺度を示す（例えば、存在、非存在、または相対的な量を示す）データセ
ットを生成し得る。アッセイ読み取り値は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）値、デジタルＰＣ
Ｒ（ｄＰＣＲ）値、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）値、蛍光の値など、またはそれら
の正規化された値を含み得る。
それは、試料のがん関連ゲノム遺伝子座のパネルの各々における配列の定量的尺度を示す
（例えば、存在、非存在、または相対的な量を示す）データセットを生成するために、が
ん関連ゲノム遺伝子座のパネルの１つまたは複数において定量化され得る。例えば、がん
関連ゲノム遺伝子座のパネルに対応するアレイハイブリダイゼーションまたはポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の定量化は、試料のがん関連ゲノム遺伝子座のパネルの各々におけ
る配列の定量的尺度を示す（例えば、存在、非存在、または相対的な量を示す）データセ
ットを生成し得る。アッセイ読み取り値は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）値、デジタルＰＣ
Ｒ（ｄＰＣＲ）値、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）値、蛍光の値など、またはそれら
の正規化された値を含み得る。
【0101】
コンピュータシステム
いくつかの実施形態では、特定の工程は、コンピュータプロセッサによって実行される
。本システムおよび方法は、様々な実施形態で実施することができる。適切に構成された
コンピュータデバイス、ならびに関連する通信ネットワーク、デバイス、ソフトウェアお
よびファームウェアは、上述の１つまたは複数の実施形態を可能にするためのプラットフ
ォームを提供することができる。例として、図８は、記憶ユニット１０４およびランダム
アクセスメモリ１０６に接続された中央処理装置（「ＣＰＵ」）１０２を含むことができ
る汎用コンピュータデバイス１００を示す。ＣＰＵ１０２は、オペレーティングシステム
１０１、アプリケーションプログラム１０３、およびデータ１２３を処理することができ
る。必要に応じて、オペレーティングシステム１０１、アプリケーションプログラム１０
３、およびデータ１２３を記憶ユニット１０４に格納し、メモリ１０６にロードすること
ができる。コンピュータデバイス１００は、ＣＰＵ１０２およびメモリ１０６に動作可能
に接続され、ＣＰＵ１０２からの集中的な画像処理計算をオフロードし、ＣＰＵ１０２と
並列にこれらの計算を実行するグラフィック処理ユニット（ＧＰＵ）１２２を、さらに含
むことができる。オペレータ１０７は、ビデオインターフェース１０５によって接続され
たビデオディスプレイ１０８、およびＩ／Ｏインターフェース１０９によって接続された
キーボード１１５、マウス１１２、およびディスクドライブまたはソリッドステートドラ
イブ１１４などの様々な入出力デバイスを使用して、コンピュータデバイス１００と対話
することができる。マウス１１２は、ビデオディスプレイ１０８のカーソルの移動を制御
し、マウスのボタンでビデオディスプレイ１０８に表示される様々なグラフィカルユーザ
インターフェース（ＧＵＩ）の制御を操作するように構成することができる。ディスクド
ライブまたはソリッドステートドライブ１１４は、コンピュータ可読媒体１１６を受け入
れるように構成され得る。コンピュータデバイス１００は、ネットワークインターフェー
ス１１１を介してネットワークの一部を形成することができ、コンピュータデバイス１０
０が他の適切に構成されたデータ処理システム（図示せず）と通信することを可能にする
。様々なソースからの入力を受信するために、１つまたは複数の異なるタイプのセンサ１
３５を使用することができる。
いくつかの実施形態では、特定の工程は、コンピュータプロセッサによって実行される
。本システムおよび方法は、様々な実施形態で実施することができる。適切に構成された
コンピュータデバイス、ならびに関連する通信ネットワーク、デバイス、ソフトウェアお
よびファームウェアは、上述の１つまたは複数の実施形態を可能にするためのプラットフ
ォームを提供することができる。例として、図８は、記憶ユニット１０４およびランダム
アクセスメモリ１０６に接続された中央処理装置（「ＣＰＵ」）１０２を含むことができ
る汎用コンピュータデバイス１００を示す。ＣＰＵ１０２は、オペレーティングシステム
１０１、アプリケーションプログラム１０３、およびデータ１２３を処理することができ
る。必要に応じて、オペレーティングシステム１０１、アプリケーションプログラム１０
３、およびデータ１２３を記憶ユニット１０４に格納し、メモリ１０６にロードすること
ができる。コンピュータデバイス１００は、ＣＰＵ１０２およびメモリ１０６に動作可能
に接続され、ＣＰＵ１０２からの集中的な画像処理計算をオフロードし、ＣＰＵ１０２と
並列にこれらの計算を実行するグラフィック処理ユニット（ＧＰＵ）１２２を、さらに含
むことができる。オペレータ１０７は、ビデオインターフェース１０５によって接続され
たビデオディスプレイ１０８、およびＩ／Ｏインターフェース１０９によって接続された
キーボード１１５、マウス１１２、およびディスクドライブまたはソリッドステートドラ
イブ１１４などの様々な入出力デバイスを使用して、コンピュータデバイス１００と対話
することができる。マウス１１２は、ビデオディスプレイ１０８のカーソルの移動を制御
し、マウスのボタンでビデオディスプレイ１０８に表示される様々なグラフィカルユーザ
インターフェース（ＧＵＩ）の制御を操作するように構成することができる。ディスクド
ライブまたはソリッドステートドライブ１１４は、コンピュータ可読媒体１１６を受け入
れるように構成され得る。コンピュータデバイス１００は、ネットワークインターフェー
ス１１１を介してネットワークの一部を形成することができ、コンピュータデバイス１０
０が他の適切に構成されたデータ処理システム（図示せず）と通信することを可能にする
。様々なソースからの入力を受信するために、１つまたは複数の異なるタイプのセンサ１
３５を使用することができる。
【0102】
本システムおよび方法は、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、タ
ブレットコンピュータ、またはワイヤレスハンドヘルドを含む実質的に任意の方式のコン
ピュータデバイスで実施することができる。本システムおよび方法はまた、１つまたは複
数のコンピュータデバイスが本発明による方法における様々なプロセス工程の各々を実施
することを可能にするためのコンピュータプログラムコードを含むコンピュータ可読／使
用可能媒体として実施されてもよい。複数のコンピュータデバイスが動作全体を実行する
場合、コンピュータデバイスはネットワーク接続されて動作の様々な工程を分配する。コ
ンピュータ可読媒体またはコンピュータ使用可能媒体という用語は、プログラムコードの
任意のタイプの物理的実施形態の１つまたは複数を含むことが理解される。特に、コンピ
ュータ可読／使用可能媒体は、１つまたは複数の可搬型記憶製品（例えば、光ディスク、
磁気ディスク、テープなど）、コンピュータおよび／または記憶システムに関連するメモ
リなどのコンピューティングデバイスの１つまたは複数のデータ記憶部に組み込まれたプ
ログラムコードを含むことができる。
ブレットコンピュータ、またはワイヤレスハンドヘルドを含む実質的に任意の方式のコン
ピュータデバイスで実施することができる。本システムおよび方法はまた、１つまたは複
数のコンピュータデバイスが本発明による方法における様々なプロセス工程の各々を実施
することを可能にするためのコンピュータプログラムコードを含むコンピュータ可読／使
用可能媒体として実施されてもよい。複数のコンピュータデバイスが動作全体を実行する
場合、コンピュータデバイスはネットワーク接続されて動作の様々な工程を分配する。コ
ンピュータ可読媒体またはコンピュータ使用可能媒体という用語は、プログラムコードの
任意のタイプの物理的実施形態の１つまたは複数を含むことが理解される。特に、コンピ
ュータ可読／使用可能媒体は、１つまたは複数の可搬型記憶製品（例えば、光ディスク、
磁気ディスク、テープなど）、コンピュータおよび／または記憶システムに関連するメモ
リなどのコンピューティングデバイスの１つまたは複数のデータ記憶部に組み込まれたプ
ログラムコードを含むことができる。
【0103】
本明細書で使用される場合、「プロセッサ」は、任意のタイプのプロセッサ、例えば、
任意のタイプの汎用マイクロプロセッサまたはマイクロコントローラ（例えば、Ｉｎｔｅ
ｌ（商標）ｘ８６、ＰｏｗｅｒＰＣ（商標）、ＡＲＭ（商標）プロセッサなど）、デジタ
ル信号処理（ＤＳＰ）プロセッサ、集積回路、フィールドプログラマブルゲートアレイ（
ＦＰＧＡ）、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。
任意のタイプの汎用マイクロプロセッサまたはマイクロコントローラ（例えば、Ｉｎｔｅ
ｌ（商標）ｘ８６、ＰｏｗｅｒＰＣ（商標）、ＡＲＭ（商標）プロセッサなど）、デジタ
ル信号処理（ＤＳＰ）プロセッサ、集積回路、フィールドプログラマブルゲートアレイ（
ＦＰＧＡ）、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。
【0104】
本明細書で使用される場合、「メモリ」は、例えば、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ
）、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）、コンパクトディスク読み出し専用メモリ（ＣＤＲＯ
Ｍ）、電気光学メモリ、光磁気メモリ、消去可能プログラマブル読み出し専用メモリ（Ｅ
ＰＲＯＭ）、および電気的消去可能プログラマブル読み出し専用メモリ（ＥＥＰＲＯＭ）
など、内部または外部のいずれかに配置された任意のタイプのコンピュータメモリの適切
な組み合わせを含むことができる。メモリ１０２の一部は、従来のファイルシステムを使
用して編成され、デバイスの全体的な動作を管理するオペレーティングシステムによって
制御および管理され得る。
）、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）、コンパクトディスク読み出し専用メモリ（ＣＤＲＯ
Ｍ）、電気光学メモリ、光磁気メモリ、消去可能プログラマブル読み出し専用メモリ（Ｅ
ＰＲＯＭ）、および電気的消去可能プログラマブル読み出し専用メモリ（ＥＥＰＲＯＭ）
など、内部または外部のいずれかに配置された任意のタイプのコンピュータメモリの適切
な組み合わせを含むことができる。メモリ１０２の一部は、従来のファイルシステムを使
用して編成され、デバイスの全体的な動作を管理するオペレーティングシステムによって
制御および管理され得る。
【0105】
本明細書で使用される場合、「コンピュータ可読記憶媒体」（機械可読媒体、プロセッ
サ可読媒体、またはコンピュータ可読プログラムコードが具現化されたコンピュータ使用
可能媒体とも呼ばれる）は、コンピュータまたは機械によって読み取り可能なフォーマッ
トで、データを記憶することができる媒体である。機械可読媒体は、ディスケット、コン
パクトディスク読み出し専用メモリ（ＣＤ－ＲＯＭ）、メモリデバイス（揮発性または不
揮発性）、または同様の記憶機構を含む磁気、光学、または電気記憶媒体を含む、任意の
適切な有形の非一時的媒体であってもよい。コンピュータ可読記憶媒体は、実行されると
き、プロセッサに、本開示の実施形態による方法の工程を実行させる様々な命令セット、
コードシーケンス、構成情報、または他のデータを含むことができる。当業者は、記載さ
れた実施態様を実施するために必要な他の命令および動作がまた、コンピュータ可読記憶
媒体に記憶され得ることを理解するであろう。コンピュータ可読記憶媒体に記憶された命
令は、プロセッサまたは他の適切な処理デバイスによって実行され得て、記載されたタス
クを実行するための回路とインターフェースすることができる。
サ可読媒体、またはコンピュータ可読プログラムコードが具現化されたコンピュータ使用
可能媒体とも呼ばれる）は、コンピュータまたは機械によって読み取り可能なフォーマッ
トで、データを記憶することができる媒体である。機械可読媒体は、ディスケット、コン
パクトディスク読み出し専用メモリ（ＣＤ－ＲＯＭ）、メモリデバイス（揮発性または不
揮発性）、または同様の記憶機構を含む磁気、光学、または電気記憶媒体を含む、任意の
適切な有形の非一時的媒体であってもよい。コンピュータ可読記憶媒体は、実行されると
き、プロセッサに、本開示の実施形態による方法の工程を実行させる様々な命令セット、
コードシーケンス、構成情報、または他のデータを含むことができる。当業者は、記載さ
れた実施態様を実施するために必要な他の命令および動作がまた、コンピュータ可読記憶
媒体に記憶され得ることを理解するであろう。コンピュータ可読記憶媒体に記憶された命
令は、プロセッサまたは他の適切な処理デバイスによって実行され得て、記載されたタス
クを実行するための回路とインターフェースすることができる。
【0106】
本明細書で使用される場合、「データ構造」は、コンピュータのデータを編成してそれ
が効率的に使用され得るようにする特定の方法である。データ構造は、１つまたは複数の
特定の抽象データ型（ＡＤＴ）を実装することができ、それは、データ構造に対して実行
され得る操作、およびそれらの操作の計算の複雑度を明示する。比較すると、データ構造
は、ＡＤＴにより得られる仕様の具体的な実装である。
が効率的に使用され得るようにする特定の方法である。データ構造は、１つまたは複数の
特定の抽象データ型（ＡＤＴ）を実装することができ、それは、データ構造に対して実行
され得る操作、およびそれらの操作の計算の複雑度を明示する。比較すると、データ構造
は、ＡＤＴにより得られる仕様の具体的な実装である。
【0107】
本発明の利点は、以下の実施例によってさらに説明される。本明細書に記載の実施例お
よびそれらの特定の細部は、例示のために提示されているにすぎず、本発明の特許請求の
範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
よびそれらの特定の細部は、例示のために提示されているにすぎず、本発明の特許請求の
範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0108】
［実施例］
材料および方法
ＨＮＳＣＣおよび健常なドナーの末梢血白血球（ＰＢＬ）ならびに血漿の獲得
２０１４年～２０１６年の間にＨＮＳＣＣと診断された患者が、前向きなＡｎｔｈｏｌ
ｏｇｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ（Ｗｏｎｇ Ｋ．ｅｔ ａｌ．２０
１０）から同定された。すべての研究は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎｅｔ
ｗｏｒｋのＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｂｏａｒｄによって承認された。ＨＮＳＣ
Ｃ患者の試料は、以下の基準、１）診断時の限局性疾患の提示、２）診断時、および少な
くとも１つの処置後の時点での血液の採取、３）診断後２年の最小フォローアップ時間に
基づいて、Ｐｒｉｎｃｅｓｓ Ｍａｒｇａｒｅｔ Ｃａｎｃｅｒ ＣｅｎｔｒｅのＨＮＣ
Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈプログラムから得た。すべての患者は
、アジュバント放射線療法を伴うまたは伴わない手術からなる、治癒を意図した治療を受
けた。年齢、性別および現在の喫煙状態が一致する健常なドナーを、前向き肺がんスクリ
ーニングプログラムから同定した。５～１０ｍＬの血液をエチレン－ジアミン－四酢酸（
ＥＤＴＡ）チューブに採取した。ＨＮＳＣＣ患者については、血液を、診断時（ベースラ
イン、ＢＬ）ならびに一次手術の３ヶ月後（３Ｍ）に採取した。適用可能な場合、追加の
血液を、補助放射線療法（ＰｒｅＲＴ）、中間補助放射線療法（ＭｉｄＲＴ）の前、およ
び／または一次手術の１２ヶ月後（１２Ｍ）に採取した。血漿を採取の１時間以内に血液
から単離し、さらなる処理まで－８０℃で保存した。診断時のＨＮＳＣＣ患者または健常
なドナーに対する同じ採血から、末梢血白血球がまた単離された。
材料および方法
ＨＮＳＣＣおよび健常なドナーの末梢血白血球（ＰＢＬ）ならびに血漿の獲得
２０１４年～２０１６年の間にＨＮＳＣＣと診断された患者が、前向きなＡｎｔｈｏｌ
ｏｇｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ（Ｗｏｎｇ Ｋ．ｅｔ ａｌ．２０
１０）から同定された。すべての研究は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎｅｔ
ｗｏｒｋのＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｂｏａｒｄによって承認された。ＨＮＳＣ
Ｃ患者の試料は、以下の基準、１）診断時の限局性疾患の提示、２）診断時、および少な
くとも１つの処置後の時点での血液の採取、３）診断後２年の最小フォローアップ時間に
基づいて、Ｐｒｉｎｃｅｓｓ Ｍａｒｇａｒｅｔ Ｃａｎｃｅｒ ＣｅｎｔｒｅのＨＮＣ
Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈプログラムから得た。すべての患者は
、アジュバント放射線療法を伴うまたは伴わない手術からなる、治癒を意図した治療を受
けた。年齢、性別および現在の喫煙状態が一致する健常なドナーを、前向き肺がんスクリ
ーニングプログラムから同定した。５～１０ｍＬの血液をエチレン－ジアミン－四酢酸（
ＥＤＴＡ）チューブに採取した。ＨＮＳＣＣ患者については、血液を、診断時（ベースラ
イン、ＢＬ）ならびに一次手術の３ヶ月後（３Ｍ）に採取した。適用可能な場合、追加の
血液を、補助放射線療法（ＰｒｅＲＴ）、中間補助放射線療法（ＭｉｄＲＴ）の前、およ
び／または一次手術の１２ヶ月後（１２Ｍ）に採取した。血漿を採取の１時間以内に血液
から単離し、さらなる処理まで－８０℃で保存した。診断時のＨＮＳＣＣ患者または健常
なドナーに対する同じ採血から、末梢血白血球がまた単離された。
【0109】
細胞培養
ＨＰＶ陰性ＨＮＳＣＣ細胞株ＦａＤｕは、Ｂｒａｄｌｙ Ｗｏｕｔｅｒｓ博士（Ｐｒｉ
ｎｃｅｓｓ Ｍａｒｇａｒｅｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）の厚意により提供され、
１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭ（
Ｇｉｂｃｏ）で培養された。ＦａＤｕ細胞培養物を、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気に
おいて３７℃でインキュベートした。ＳＴＲプロファイリングにより、ＦａＤｕ細胞の同
一性を確認した。使用前に細胞をマイコプラズマ試験ｅ－ＭｙｃｏＴＭＶＡＬｉＤ Ｍｙ
ｃｏｐｌａｓｍａ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｉｎｔｒｏｎ Ｂｉｏ）に供
した。
ＨＰＶ陰性ＨＮＳＣＣ細胞株ＦａＤｕは、Ｂｒａｄｌｙ Ｗｏｕｔｅｒｓ博士（Ｐｒｉ
ｎｃｅｓｓ Ｍａｒｇａｒｅｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）の厚意により提供され、
１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭ（
Ｇｉｂｃｏ）で培養された。ＦａＤｕ細胞培養物を、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気に
おいて３７℃でインキュベートした。ＳＴＲプロファイリングにより、ＦａＤｕ細胞の同
一性を確認した。使用前に細胞をマイコプラズマ試験ｅ－ＭｙｃｏＴＭＶＡＬｉＤ Ｍｙ
ｃｏｐｌａｓｍａ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｉｎｔｒｏｎ Ｂｉｏ）に供
した。
【0110】
セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）およびＰＢＬゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の単離
製造業者の指示に従ってＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、総血漿からｃｆＤＮＡを単離した。ゲノム
ＤＮＡをＰＢＬから単離し、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｍ２２０集束超音波処理装置を用いて１５
０～２００塩基対に剪断し、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌ
ｔｅｒ）によってサイズ選択して、３００塩基対を超える断片を除去した。単離されたｃ
ｆＤＮＡおよび剪断されたＰＢＬゲノムＤＮＡを、ライブラリ生成前にＱｕｂｉｔによっ
て定量した（図９Ａおよび図９Ｂ）。
製造業者の指示に従ってＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、総血漿からｃｆＤＮＡを単離した。ゲノム
ＤＮＡをＰＢＬから単離し、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｍ２２０集束超音波処理装置を用いて１５
０～２００塩基対に剪断し、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌ
ｔｅｒ）によってサイズ選択して、３００塩基対を超える断片を除去した。単離されたｃ
ｆＤＮＡおよび剪断されたＰＢＬゲノムＤＮＡを、ライブラリ生成前にＱｕｂｉｔによっ
て定量した（図９Ａおよび図９Ｂ）。
【0111】
配列決定ライブラリの調製
それぞれ５～１０ｎｇまたは１０～２０ｎｇのＤＮＡをｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑまたは
ＣＡＰＰ－ｓｅｑのインプットとして使用した。いくつかの改変を加えたＫＡＰＡ Ｈｙ
ｐｅｒＰｒｅｐ Ｋｉｔ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ライブラリ生
成のためにインプットＤＮＡを調製した。ライゲーション時にインプットＤＮＡの両鎖に
隣接するランダムな２ｂｐの配列とそれに続く一定の１ｂｐのＴ配列５’とを組み込むラ
イブラリアダプターを利用した。ライゲーション中のアダプター二量体化を最小限に抑え
るために、ライブラリアダプターを１００：１というアダプター：ＤＮＡのモル比（１０
ｎｇのｃｆＤＮＡあたり約０．０７ｕＭ）で添加し、４℃で１７時間一晩インキュベート
した。ライゲーション後の浄化後、ライブラリ生成の前に、インプットＤＮＡを４０μＬ
の溶出緩衝液（ＥＢ、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０～８．５）で溶出した。
それぞれ５～１０ｎｇまたは１０～２０ｎｇのＤＮＡをｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑまたは
ＣＡＰＰ－ｓｅｑのインプットとして使用した。いくつかの改変を加えたＫＡＰＡ Ｈｙ
ｐｅｒＰｒｅｐ Ｋｉｔ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ライブラリ生
成のためにインプットＤＮＡを調製した。ライゲーション時にインプットＤＮＡの両鎖に
隣接するランダムな２ｂｐの配列とそれに続く一定の１ｂｐのＴ配列５’とを組み込むラ
イブラリアダプターを利用した。ライゲーション中のアダプター二量体化を最小限に抑え
るために、ライブラリアダプターを１００：１というアダプター：ＤＮＡのモル比（１０
ｎｇのｃｆＤＮＡあたり約０．０７ｕＭ）で添加し、４℃で１７時間一晩インキュベート
した。ライゲーション後の浄化後、ライブラリ生成の前に、インプットＤＮＡを４０μＬ
の溶出緩衝液（ＥＢ、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０～８．５）で溶出した。
【0112】
ＣＡＰＰ－ｓｅｑライブラリの生成
ＣＡＰＰ－ｓｅｑライブラリの作製を、いくつかの修正を加えてＮｅｗｍａｎ ｅｔ
ａｌ．２０１４に記載されているように行った。ライブラリを１０サイクルでＰＣＲ増幅
し、最大１２のインデックス付き増幅ライブラリを５００～１０００ｎｇで一緒にプール
した。ＣＯＴ ＤＮＡおよびブロッキングオリゴを添加した後、プールしたライブラリを
ＳｐｅｅｄＶａｃ処理してすべての液体を蒸発させ、１３μＬの再懸濁混合物（８．５μ
Ｌの２Ｘハイブリダイゼーション緩衝液、３．４μＬのハイブリダイゼーション成分Ａ、
１．１μＬのヌクレアーゼ非含有水）に再懸濁した。ハイブリダイゼーションの前に、４
μＬのハイブリダイゼーションプローブ（すなわち、ＨＮＳＣＣセレクタ）を合計１７μ
Ｌにわたって再懸濁混合物に添加した。ハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ増幅／浄化
の後、ライブラリを３０μＬのＩＤＴＥ、ｐＨ８．０（１×ＴＥ溶液）で溶出した。多重
化ライブラリを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ／ＮｏｖａＳｅｑ／ＨｉＳｅｑ４０
００でそれぞれ２×７５／１００／１２５の対の試行で配列決定した。ＨＮＳＣＣセレク
タの設計は、ＣＯＳＭＩＣデータベースからのＨＮＳＣＣならびにＨＰＶ－１６ゲノムの
Ｅ６およびＥ７領域における頻繁に繰り返されるゲノム変化を組み込んだ（図１１）。
ＣＡＰＰ－ｓｅｑライブラリの作製を、いくつかの修正を加えてＮｅｗｍａｎ ｅｔ
ａｌ．２０１４に記載されているように行った。ライブラリを１０サイクルでＰＣＲ増幅
し、最大１２のインデックス付き増幅ライブラリを５００～１０００ｎｇで一緒にプール
した。ＣＯＴ ＤＮＡおよびブロッキングオリゴを添加した後、プールしたライブラリを
ＳｐｅｅｄＶａｃ処理してすべての液体を蒸発させ、１３μＬの再懸濁混合物（８．５μ
Ｌの２Ｘハイブリダイゼーション緩衝液、３．４μＬのハイブリダイゼーション成分Ａ、
１．１μＬのヌクレアーゼ非含有水）に再懸濁した。ハイブリダイゼーションの前に、４
μＬのハイブリダイゼーションプローブ（すなわち、ＨＮＳＣＣセレクタ）を合計１７μ
Ｌにわたって再懸濁混合物に添加した。ハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ増幅／浄化
の後、ライブラリを３０μＬのＩＤＴＥ、ｐＨ８．０（１×ＴＥ溶液）で溶出した。多重
化ライブラリを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ／ＮｏｖａＳｅｑ／ＨｉＳｅｑ４０
００でそれぞれ２×７５／１００／１２５の対の試行で配列決定した。ＨＮＳＣＣセレク
タの設計は、ＣＯＳＭＩＣデータベースからのＨＮＳＣＣならびにＨＰＶ－１６ゲノムの
Ｅ６およびＥ７領域における頻繁に繰り返されるゲノム変化を組み込んだ（図１１）。
【0113】
ＣＡＰＰ－ｓｅｑライブラリのアライメントおよび質の管理
組み込まれたランダムの分子バーコードに対応する、アラインメントされていない対に
なったリードの各５’末端の最初の２塩基対を抽出し、照合して４ｂｐ分子識別子（ＵＭ
Ｉ）を生成した。第３のＴ塩基対スペーサーもアライメント前に除去した。対になったリ
ードを、ＢＷＡ－ｍｅｍによってヒトゲノム（ゲノムアセンブリＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９
）にアラインメントし、ＳＡＭｔｏｏｌｓ（ｖ １．３．１）によってソートおよびイン
デックス付けし、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＴｏｏｌＫｉｔ（ＧＡＴＫ）Ｂａｓ
ｅＲｅｃａｌｉｂｒａｔｏｒ（ｖ ３．８）を使用して、最良の実践（参照）に従って、
塩基の質のスコアについて再較正した。ＢＡＭファイルから得た重複配列をそれらのＵＭ
Ｉに基づいて折り畳み、ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＣｒｕｎｃｈｅｒによってシングルトン、単
一鎖コンセンサス配列（ＳＳＣＳ）または重複コンセンサス配列（ＤＣＳ）として標識し
た４４。各ライブラリの質の管理を、ＦａｓｔＱＣ（Ｂａｂｒａｈａｍ Ｂｉｏｉｎｆｏ
ｒｍａｔｉｃｓ）から得られた様々なメトリック、ならびに捕捉効率（ＣｏｌｌｅｃｔＨ
ｓＭｅｔｒｉｃｓ、Ｐｉｃａｒｄ ２．１０．９）、カバレッジの深度（ＤｅｐｔｈＯｆ
Ｃｏｖｅｒａｇｅ、ＧＡＴＫ ３．８）および塩基対位置誤り率（ｉｄｅｓ－ｂｇｒｅｐ
ｏｒｔ．ｐｌ、Ｎｅｗｍａｎら、２０１６）を得るための様々なスクリプトによって評価
した。
組み込まれたランダムの分子バーコードに対応する、アラインメントされていない対に
なったリードの各５’末端の最初の２塩基対を抽出し、照合して４ｂｐ分子識別子（ＵＭ
Ｉ）を生成した。第３のＴ塩基対スペーサーもアライメント前に除去した。対になったリ
ードを、ＢＷＡ－ｍｅｍによってヒトゲノム（ゲノムアセンブリＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９
）にアラインメントし、ＳＡＭｔｏｏｌｓ（ｖ １．３．１）によってソートおよびイン
デックス付けし、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＴｏｏｌＫｉｔ（ＧＡＴＫ）Ｂａｓ
ｅＲｅｃａｌｉｂｒａｔｏｒ（ｖ ３．８）を使用して、最良の実践（参照）に従って、
塩基の質のスコアについて再較正した。ＢＡＭファイルから得た重複配列をそれらのＵＭ
Ｉに基づいて折り畳み、ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＣｒｕｎｃｈｅｒによってシングルトン、単
一鎖コンセンサス配列（ＳＳＣＳ）または重複コンセンサス配列（ＤＣＳ）として標識し
た４４。各ライブラリの質の管理を、ＦａｓｔＱＣ（Ｂａｂｒａｈａｍ Ｂｉｏｉｎｆｏ
ｒｍａｔｉｃｓ）から得られた様々なメトリック、ならびに捕捉効率（ＣｏｌｌｅｃｔＨ
ｓＭｅｔｒｉｃｓ、Ｐｉｃａｒｄ ２．１０．９）、カバレッジの深度（ＤｅｐｔｈＯｆ
Ｃｏｖｅｒａｇｅ、ＧＡＴＫ ３．８）および塩基対位置誤り率（ｉｄｅｓ－ｂｇｒｅｐ
ｏｒｔ．ｐｌ、Ｎｅｗｍａｎら、２０１６）を得るための様々なスクリプトによって評価
した。
【0114】
体細胞ヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）の検出およびｃｔＤＮＡの定量
Ｎｅｗｍａｎら２０１６に記載されているように、統合デジタルエラー抑制（ｉＤＥＳ
）によって潜在的な配列決定エラーの除去を行った。バックグラウンド研磨を、２０名の
健常なドナーのｃｆＤＮＡの試料を訓練コホートとして利用することによって、行った（
図１２）。下流の分析に外れ値が影響を与えるのを防ぐために、ＨＮＳＣＣ ｃｆＤＮＡ
またはＰＢＬ ｇＤＮＡ試料にわたる配列決定の深度（１５００倍以下、５０００倍以上
）の下位１５または上位８５パーセンタイルの候補ＳＮＶ、ならびに平均の配列決定の深
度が５００倍以下の遺伝子を分析から除外した。クローン造血を説明するために、非生殖
系列変異は、血漿に１０％未満の変異対立遺伝子画分を有すると定義された。ＨＮＳＣＣ
のｃｆＤＮＡ試料の候補ＳＮＶは、一致したＰＢＬのｇＤＮＡ試料の二重鎖のサポートお
よび完全な非存在でリードをサポートする、３以上の基準に基づいて同定された。同定さ
れたＳＮＶの変異対立遺伝子画分（ＭＡＦ）を、代替対立遺伝子に対応するリードの数を
、代替対立遺伝子および参照対立遺伝子に対応するリードの合計で割ることによって計算
した。同定可能なＳＮＶを有するＨＮＳＣＣのｃｆＤＮＡの試料各々について、ＳＮＶに
わたる平均ＭＡＦを計算し、ｃｔＤＮＡの存在量の尺度として使用した。１つのみの同定
可能なＳＮＶを有するｃｆＤＮＡ試料では、計算されたＭＡＦを使用した。検出可能なが
ん由来の変異の多くはホモ接合性でなくても、腫瘍の内部でクローン性でなくてもよく、
これらの理由から、平均ＭＡＦはセルフリーＤＮＡ内の真のｃｔＤＮＡの存在量を過小評
価したものであり得る。
Ｎｅｗｍａｎら２０１６に記載されているように、統合デジタルエラー抑制（ｉＤＥＳ
）によって潜在的な配列決定エラーの除去を行った。バックグラウンド研磨を、２０名の
健常なドナーのｃｆＤＮＡの試料を訓練コホートとして利用することによって、行った（
図１２）。下流の分析に外れ値が影響を与えるのを防ぐために、ＨＮＳＣＣ ｃｆＤＮＡ
またはＰＢＬ ｇＤＮＡ試料にわたる配列決定の深度（１５００倍以下、５０００倍以上
）の下位１５または上位８５パーセンタイルの候補ＳＮＶ、ならびに平均の配列決定の深
度が５００倍以下の遺伝子を分析から除外した。クローン造血を説明するために、非生殖
系列変異は、血漿に１０％未満の変異対立遺伝子画分を有すると定義された。ＨＮＳＣＣ
のｃｆＤＮＡ試料の候補ＳＮＶは、一致したＰＢＬのｇＤＮＡ試料の二重鎖のサポートお
よび完全な非存在でリードをサポートする、３以上の基準に基づいて同定された。同定さ
れたＳＮＶの変異対立遺伝子画分（ＭＡＦ）を、代替対立遺伝子に対応するリードの数を
、代替対立遺伝子および参照対立遺伝子に対応するリードの合計で割ることによって計算
した。同定可能なＳＮＶを有するＨＮＳＣＣのｃｆＤＮＡの試料各々について、ＳＮＶに
わたる平均ＭＡＦを計算し、ｃｔＤＮＡの存在量の尺度として使用した。１つのみの同定
可能なＳＮＶを有するｃｆＤＮＡ試料では、計算されたＭＡＦを使用した。検出可能なが
ん由来の変異の多くはホモ接合性でなくても、腫瘍の内部でクローン性でなくてもよく、
これらの理由から、平均ＭＡＦはセルフリーＤＮＡ内の真のｃｔＤＮＡの存在量を過小評
価したものであり得る。
【0115】
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリの生成
「Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ」に記載されてい
るようにライブラリ調製工程を変更して、Ｓｈｅｎら２０１９に記載されているように、
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロトコルを実施した。多重化ライブラリを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ
ＮｅｘｔＳｅｑ／ＮｏｖａＳｅｑ／ＨｉＳｅｑ４０００でそれぞれ２×７５／１００／
１２５の対の試行で配列決定した。一般化の可能性のために、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑラ
イブラリは、供給源（すなわち、ｃｆＤＮＡ、ｇＤＮＡ）にかかわりなく、５～１０ｎｇ
のインプットＤＮＡを利用する任意のＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ調製方法として記載されている
。
「Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ」に記載されてい
るようにライブラリ調製工程を変更して、Ｓｈｅｎら２０１９に記載されているように、
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロトコルを実施した。多重化ライブラリを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ
ＮｅｘｔＳｅｑ／ＮｏｖａＳｅｑ／ＨｉＳｅｑ４０００でそれぞれ２×７５／１００／
１２５の対の試行で配列決定した。一般化の可能性のために、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑラ
イブラリは、供給源（すなわち、ｃｆＤＮＡ、ｇＤＮＡ）にかかわりなく、５～１０ｎｇ
のインプットＤＮＡを利用する任意のＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ調製方法として記載されている
。
【0116】
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリのアラインメントおよび質の管理
ＣＡＰＰ－ｓｅｑライブラリのアラインメントおよび質の管理において、前に記載され
たように、アラインメントされていない対のリードを処理し、アラインメントし、ソート
し、インデックス付けした。ＢＡＭファイルからの重複配列をＳＡＭｔｏｏｌｓによって
崩壊させた。各ライブラリの質の管理は、ＦａｓｔＱＣ（Ｂａｂｒａｈａｍ Ｂｉｏｉｎ
ｆｏｒｍａｔｉｃｓ）から得られた様々なメトリック、ならびにＣｐＧカバレッジ（ＭＥ
ＤＩＰＳ．ｓｅｑＣｏｖｅｒａｇｅ）および濃縮（ＭＥＤＩＰＳ．ＣｐＧｅｎｒｉｃｈ）
を含むＲパッケージＭＥＤＩＰＳ（参照）から得られた様々なメトリックによって評価し
た。
ＣＡＰＰ－ｓｅｑライブラリのアラインメントおよび質の管理において、前に記載され
たように、アラインメントされていない対のリードを処理し、アラインメントし、ソート
し、インデックス付けした。ＢＡＭファイルからの重複配列をＳＡＭｔｏｏｌｓによって
崩壊させた。各ライブラリの質の管理は、ＦａｓｔＱＣ（Ｂａｂｒａｈａｍ Ｂｉｏｉｎ
ｆｏｒｍａｔｉｃｓ）から得られた様々なメトリック、ならびにＣｐＧカバレッジ（ＭＥ
ＤＩＰＳ．ｓｅｑＣｏｖｅｒａｇｅ）および濃縮（ＭＥＤＩＰＳ．ＣｐＧｅｎｒｉｃｈ）
を含むＲパッケージＭＥＤＩＰＳ（参照）から得られた様々なメトリックによって評価し
た。
【0117】
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルにおける情報領域の選択
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリのペアリードから生成された断片を、ＭＥＤＩＰＳ
（ＭＥＤＩＰＳ．ｃｒｅａｔｅＳｅｔ）によって重複しない３００塩基対ウィンドウ内で
カウントし、Ｒｅａｄｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ（ＲＰＫ
Ｍ）によってスケーリングし、ＷＩＧフォーマット（ＭＥＤＩＰＳ．ｅｘｐｏｒｔＷＩＧ
）としてエクスポートした。各試料から得たＷＩＧファイルをＲによってインポートし、
マトリックスとして照合した。分析は、非疾患状況の中での適用を可能にするために、２
０人の健常なドナーの試料から得たｃｆＤＮＡおよびＰＢＬの試料に限定された。情報領
域は、ＣｐＧの密度、およびｃｆＤＮＡと一致したＰＢＬとの間でのＲＰＫＭ値の相関の
基準に基づいた。ＣｐＧの密度（≧ｎのＣｐＧ）に基づくスライディングウィンドウを使
用して、≧８個のＣｐＧの最小閾値を選択した。
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリのペアリードから生成された断片を、ＭＥＤＩＰＳ
（ＭＥＤＩＰＳ．ｃｒｅａｔｅＳｅｔ）によって重複しない３００塩基対ウィンドウ内で
カウントし、Ｒｅａｄｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ（ＲＰＫ
Ｍ）によってスケーリングし、ＷＩＧフォーマット（ＭＥＤＩＰＳ．ｅｘｐｏｒｔＷＩＧ
）としてエクスポートした。各試料から得たＷＩＧファイルをＲによってインポートし、
マトリックスとして照合した。分析は、非疾患状況の中での適用を可能にするために、２
０人の健常なドナーの試料から得たｃｆＤＮＡおよびＰＢＬの試料に限定された。情報領
域は、ＣｐＧの密度、およびｃｆＤＮＡと一致したＰＢＬとの間でのＲＰＫＭ値の相関の
基準に基づいた。ＣｐＧの密度（≧ｎのＣｐＧ）に基づくスライディングウィンドウを使
用して、≧８個のＣｐＧの最小閾値を選択した。
【0118】
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリからの絶対的なメチル化の計算
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリの対にしたリードから得た断片を、Ｓｅｌｅｃｔｉ
ｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ
Ｐｒｏｆｉｌｅｓに以前に記載されたようにカウントし、ＭｅＤＥＳｔｒａｎｄ Ｒパ
ッケージによって絶対的なメチル化レベルにスケーリングした。カウントから絶対的なメ
チル化を計算するために、ロジスティック回帰モデルを使用して、ＣｐＧの密度（すなわ
ち、ＣｐＧ密度バイアス）に基づいてＤＮＡプルダウンのバイアスを推定した（ＭｅＤＥ
Ｓｔｒａｎｄ．ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎＣｕｒｖｅ）。推定されたＣｐＧ密度バイアスに
基づいて、各ウィンドウ内部のメチル化を、陽性および陰性のＤＮＡ鎖からの断片につい
て補正した。補正された断片を有するウィンドウを対数変換し、絶対的なメチル化（Ｍｅ
ＤＥＳｔｒａｎｄ．ｂｉｎＭｅｔｈｙｌ）を表すために、０～１の値にスケーリングした
。各ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ試料からの絶対的なメチル化レベルを、ＷＩＧ様ファイル（
すなわち、トラックラインのないＷＩＧファイルフォーマット）としてエクスポートした
。
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリの対にしたリードから得た断片を、Ｓｅｌｅｃｔｉ
ｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ
Ｐｒｏｆｉｌｅｓに以前に記載されたようにカウントし、ＭｅＤＥＳｔｒａｎｄ Ｒパ
ッケージによって絶対的なメチル化レベルにスケーリングした。カウントから絶対的なメ
チル化を計算するために、ロジスティック回帰モデルを使用して、ＣｐＧの密度（すなわ
ち、ＣｐＧ密度バイアス）に基づいてＤＮＡプルダウンのバイアスを推定した（ＭｅＤＥ
Ｓｔｒａｎｄ．ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎＣｕｒｖｅ）。推定されたＣｐＧ密度バイアスに
基づいて、各ウィンドウ内部のメチル化を、陽性および陰性のＤＮＡ鎖からの断片につい
て補正した。補正された断片を有するウィンドウを対数変換し、絶対的なメチル化（Ｍｅ
ＤＥＳｔｒａｎｄ．ｂｉｎＭｅｔｈｙｌ）を表すために、０～１の値にスケーリングした
。各ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ試料からの絶対的なメチル化レベルを、ＷＩＧ様ファイル（
すなわち、トラックラインのないＷＩＧファイルフォーマット）としてエクスポートした
。
【0119】
インシリコのＰＢＬ枯渇の設計およびパフォーマンスの評価
疾患状況内のウィンドウを濃縮するために、ＰＢＬからのメチル化を「インシリコのＰ
ＢＬ枯渇」と呼ばれるプロセスによって除去した。分析は、非がん特異的状況の中での適
用を可能にするために、２０人の健常なドナーの試料のコホートから得たＰＢＬ試料に限
定された。インシリコのＰＢＬ枯渇のための本発明者らの戦略を以下のように実行した：
１．ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルにおける情報領域の選択において記載される
各情報ウィンドウについて、健常なドナーのＰＢＬ試料にわたる絶対的なメチル化の中央
値を計算する。
疾患状況内のウィンドウを濃縮するために、ＰＢＬからのメチル化を「インシリコのＰ
ＢＬ枯渇」と呼ばれるプロセスによって除去した。分析は、非がん特異的状況の中での適
用を可能にするために、２０人の健常なドナーの試料のコホートから得たＰＢＬ試料に限
定された。インシリコのＰＢＬ枯渇のための本発明者らの戦略を以下のように実行した：
１．ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルにおける情報領域の選択において記載される
各情報ウィンドウについて、健常なドナーのＰＢＬ試料にわたる絶対的なメチル化の中央
値を計算する。
【0120】
２．絶対的なメチル化の中央値＜０．１の基準に基づいて、ＰＢＬ枯渇ウィンドウを定
義する。
義する。
【0121】
３．ＰＢＬ枯渇ウィンドウ内部のｃｆＤＮＡ試料の分析を制限する。
【0122】
インシリコのＰＢＬ枯渇戦略のパフォーマンスを、訓練セットとして使用した健常なド
ナーのコホートから得た枯渇前後のＰＢＬ試料の絶対的なメチル化分布を検証セットとし
て使用したＨＮＳＣＣコホートと比較することによって、評価した。
ナーのコホートから得た枯渇前後のＰＢＬ試料の絶対的なメチル化分布を検証セットとし
て使用したＨＮＳＣＣコホートと比較することによって、評価した。
【0123】
差次的メチル化分析
ＨＮＳＣＣ関連の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）のロバストな検出を可能にするために
、分析を、ＣＡＰＰ－ｓｅｑによる血漿の検出可能なＳＮＶを有するＨＮＳＣＣ患者に限
定した（ｎ＝２０／３２）。差次的メチル化分析は、インシリコのＰＢＬ枯渇後の情報領
域に限定された。ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルにおける情報領域の選択において
前に記載されたように作製された、ＨＮＳＣＣおよび健常なドナーｃｆＤＮＡ試料からの
ビニングされた断片数の照合されたマトリックスを、ＤＥＳｅｑ２ Ｒパッケージによる
ＤＭＲの同定のために利用した。すべてのｃｆＤＮＡ試料にわたって＜１０カウントの領
域を除去することによってプレフィルタリングを行った。条件（ＨＮＳＣＣ対健常なドナ
ー）として定義される単一因子を、差次的メチル化分析中のコントラストに使用した。簡
潔には、サイズ因子および分散推定値に基づいて試料をスケーリングし、続いて負の二項
一般線形モデルをフィッティングすることによって、差次的メチル化分析を行った。各ウ
ィンドウについて、Ｗａｌｄ検定によってＨＮＳＣＣと健常なドナーの状態との間でＰ値
を計算した。デフォルトのＣｏｏｋの距離カットオフを超える領域内のＰ値は、調整され
たＰ値の計算から省かれた（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ）。ＨＮＳＣＣのｃ
ｆＤＮＡ試料の有意な過剰メチル化または低メチル化領域（過剰ＤＭＲ／低ＤＭＲ）は、
調整されたＰ値＜０．１を有するウィンドウとして定義される。
ＨＮＳＣＣ関連の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）のロバストな検出を可能にするために
、分析を、ＣＡＰＰ－ｓｅｑによる血漿の検出可能なＳＮＶを有するＨＮＳＣＣ患者に限
定した（ｎ＝２０／３２）。差次的メチル化分析は、インシリコのＰＢＬ枯渇後の情報領
域に限定された。ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルにおける情報領域の選択において
前に記載されたように作製された、ＨＮＳＣＣおよび健常なドナーｃｆＤＮＡ試料からの
ビニングされた断片数の照合されたマトリックスを、ＤＥＳｅｑ２ Ｒパッケージによる
ＤＭＲの同定のために利用した。すべてのｃｆＤＮＡ試料にわたって＜１０カウントの領
域を除去することによってプレフィルタリングを行った。条件（ＨＮＳＣＣ対健常なドナ
ー）として定義される単一因子を、差次的メチル化分析中のコントラストに使用した。簡
潔には、サイズ因子および分散推定値に基づいて試料をスケーリングし、続いて負の二項
一般線形モデルをフィッティングすることによって、差次的メチル化分析を行った。各ウ
ィンドウについて、Ｗａｌｄ検定によってＨＮＳＣＣと健常なドナーの状態との間でＰ値
を計算した。デフォルトのＣｏｏｋの距離カットオフを超える領域内のＰ値は、調整され
たＰ値の計算から省かれた（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ）。ＨＮＳＣＣのｃ
ｆＤＮＡ試料の有意な過剰メチル化または低メチル化領域（過剰ＤＭＲ／低ＤＭＲ）は、
調整されたＰ値＜０．１を有するウィンドウとして定義される。
【0124】
ＨＮＳＣＣのｃｆＤＮＡ過剰メチル化領域内のＣｐＧ特徴の濃縮
アイランド、ショア、ｓｈｅｌｆ、およびｏｐｅｎ ｓｅａ（ｉｎｔｅｒＣＧＩ）など
のＣｐＧ特徴は、ＡｎｎｏｔａｔｉｏｎＨｕｂ Ｒパッケージ（参照）（ｈｇ１９＿ｃｐ
ｇｓアノテーション）に定義されている。「ａｎｎｏｔａｔｒ」および「Ｇｅｎｏｍｉｃ
Ｒａｎｇｅｓ」Ｒパッケージを利用する社内Ｒパッケージを使用して、ＰＢＬ枯渇領域内
の各過剰メチル化ウィンドウ（すなわち、「ｃｈｒ．ｓｔａｒｔ．ｅｎｄ」）のＩＤ座標
を、重複するＣｐＧ特徴でラベル付けした（図１３）。
アイランド、ショア、ｓｈｅｌｆ、およびｏｐｅｎ ｓｅａ（ｉｎｔｅｒＣＧＩ）など
のＣｐＧ特徴は、ＡｎｎｏｔａｔｉｏｎＨｕｂ Ｒパッケージ（参照）（ｈｇ１９＿ｃｐ
ｇｓアノテーション）に定義されている。「ａｎｎｏｔａｔｒ」および「Ｇｅｎｏｍｉｃ
Ｒａｎｇｅｓ」Ｒパッケージを利用する社内Ｒパッケージを使用して、ＰＢＬ枯渇領域内
の各過剰メチル化ウィンドウ（すなわち、「ｃｈｒ．ｓｔａｒｔ．ｅｎｄ」）のＩＤ座標
を、重複するＣｐＧ特徴でラベル付けした（図１３）。
【0125】
観察された特徴の重なり対ヌル分布の濃縮確率を判定するために、１０００回のランダ
ムサンプリングを行った。各サンプリングについて、ＣｐＧの同一の分布を維持しながら
、過剰メチル化ウィンドウの数に基づいて、等しい数のビンを選択した。サンプリング全
体の各ＣｐＧ特徴について、観察された重複数を使用して、それぞれのヌル分布を生成し
、続いてｚスコアスケールに変換した。各ＣｐＧ特徴について観察された過剰メチル化領
域の重複もｚスコア化変換し、ヌル分布から略式の統計を導出した。過剰メチル化ウィン
ドウから得た観察された重複の推定されるＰ値を、ヌル分布の観察された重複以上／以下
の重複を有するランダムサンプリングの数として、計算した。
ムサンプリングを行った。各サンプリングについて、ＣｐＧの同一の分布を維持しながら
、過剰メチル化ウィンドウの数に基づいて、等しい数のビンを選択した。サンプリング全
体の各ＣｐＧ特徴について、観察された重複数を使用して、それぞれのヌル分布を生成し
、続いてｚスコアスケールに変換した。各ＣｐＧ特徴について観察された過剰メチル化領
域の重複もｚスコア化変換し、ヌル分布から略式の統計を導出した。過剰メチル化ウィン
ドウから得た観察された重複の推定されるＰ値を、ヌル分布の観察された重複以上／以下
の重複を有するランダムサンプリングの数として、計算した。
【0126】
腫瘍がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）からのがん特異的過剰メチル化シトシンによるｃ
ｆＤＮＡ過剰メチル化領域のＨＮＳＣＣの濃縮
乳房（ＢＲＣＡ）、結腸直腸（ＣＯＡＤ）、頭頸部（ＨＮＳＣ）、前立腺（ＰＲＡＤ）
、膵臓（ＰＡＡＤ）、肺アデノ（ＬＵＡＤ）、および肺扁平上皮（ＬＵＳＣ）からのすべ
ての原発腫瘍の公的に利用可能なｈｍ４５０ｋのプロファイル由来のファイル情報をＴＣ
ＧＡからダウンロードした。本発明者らのＨＮＳＣＣコホートの大部分が口腔の腫瘍を呈
することに起因して、ＨＮＳＣ群からのファイルは、「口腔底部」に原発部位を有する患
者に限定された（ｎ＝５５）。同数のｈｍ４５０ｋファイルを、残りのがんのタイプのそ
れぞれから、ならびに健常なＰＢＬの別個のデータベース（ＧＥＯシリーズＧＳＥ６７３
９３）からランダムに選択した。ダウンロードされたファイルのマニフェストが、（図１
４）に提供される。
ｆＤＮＡ過剰メチル化領域のＨＮＳＣＣの濃縮
乳房（ＢＲＣＡ）、結腸直腸（ＣＯＡＤ）、頭頸部（ＨＮＳＣ）、前立腺（ＰＲＡＤ）
、膵臓（ＰＡＡＤ）、肺アデノ（ＬＵＡＤ）、および肺扁平上皮（ＬＵＳＣ）からのすべ
ての原発腫瘍の公的に利用可能なｈｍ４５０ｋのプロファイル由来のファイル情報をＴＣ
ＧＡからダウンロードした。本発明者らのＨＮＳＣＣコホートの大部分が口腔の腫瘍を呈
することに起因して、ＨＮＳＣ群からのファイルは、「口腔底部」に原発部位を有する患
者に限定された（ｎ＝５５）。同数のｈｍ４５０ｋファイルを、残りのがんのタイプのそ
れぞれから、ならびに健常なＰＢＬの別個のデータベース（ＧＥＯシリーズＧＳＥ６７３
９３）からランダムに選択した。ダウンロードされたファイルのマニフェストが、（図１
４）に提供される。
【0127】
「腫瘍特異的」過剰メチル化シトシンを生成するために、ｌｉｍｍａによる差次的メチ
ル化分析を各々のがんのタイプについて行い、他のがんのタイプならびにＰＢＬ（すなわ
ち、造影剤）と個々に比較した。所与のコントラストについて、残差分散および試料β値
を組み込んだ各プローブ対象シトシンについて線形モデルをフィッティングし、次いで、
コントラスト間の観察された差のＰ値を、経験的ベイズ平滑化によって計算する。個々の
比較に対して所与のがんのタイプにおいてメチル化が上昇した過剰メチル化シトシンを、
対数倍率変化０．２５以上および調整Ｐ値（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ）０
．０１未満によって定義した。個々のがんのタイプに固有の過剰メチル化シトシンを「腫
瘍特異的」と命名した。ＬＵＳＣ、ＬＵＡＤおよびＰＡＡＤの場合については、腫瘍特異
的な過剰メチル化シトシンが全くまたはほとんど同定されなかったので（０、１５、１８
）、その後の分析から省いた。ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリとの比較のために、腫
瘍特異的過剰メチル化シトシンからの塩基対の位置を、Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｉｎ－ｓｉ
ｌｉｃｏ ＰＢＬ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｒ
ｆｏｒｍａｎｃｅに記載されているように、インシリコのＰＢＬ枯渇後の情報ウィンドウ
と重ねた。
ル化分析を各々のがんのタイプについて行い、他のがんのタイプならびにＰＢＬ（すなわ
ち、造影剤）と個々に比較した。所与のコントラストについて、残差分散および試料β値
を組み込んだ各プローブ対象シトシンについて線形モデルをフィッティングし、次いで、
コントラスト間の観察された差のＰ値を、経験的ベイズ平滑化によって計算する。個々の
比較に対して所与のがんのタイプにおいてメチル化が上昇した過剰メチル化シトシンを、
対数倍率変化０．２５以上および調整Ｐ値（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ）０
．０１未満によって定義した。個々のがんのタイプに固有の過剰メチル化シトシンを「腫
瘍特異的」と命名した。ＬＵＳＣ、ＬＵＡＤおよびＰＡＡＤの場合については、腫瘍特異
的な過剰メチル化シトシンが全くまたはほとんど同定されなかったので（０、１５、１８
）、その後の分析から省いた。ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリとの比較のために、腫
瘍特異的過剰メチル化シトシンからの塩基対の位置を、Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｉｎ－ｓｉ
ｌｉｃｏ ＰＢＬ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｒ
ｆｏｒｍａｎｃｅに記載されているように、インシリコのＰＢＬ枯渇後の情報ウィンドウ
と重ねた。
【0128】
ＴＣＧＡ由来の腫瘍特異的領域とのＨＮＳＣＣ ｃｆＤＮＡ過剰メチル化領域について
の重複の濃縮を、ＨＮＳＣＣのｃｆＤＮＡ過剰メチル化領域内のＣｐＧ特徴の濃縮に記載
されているのと同じ方法を使用した１０，０００回のランダムサンプリングによって評価
した。
の重複の濃縮を、ＨＮＳＣＣのｃｆＤＮＡ過剰メチル化領域内のＣｐＧ特徴の濃縮に記載
されているのと同じ方法を使用した１０，０００回のランダムサンプリングによって評価
した。
【0129】
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによるｃｔＤＮＡ検出の感度および特異度
３２個のＨＮＳＣＣおよび２０個の健常なドナーのｃｆＤＮＡ試料のコホートからのｃ
ｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリについて、ｃｔＤＮＡ検出を、健常なドナーのｃｆＤＮ
Ａ試料にわたる最大ＲＰＫＭの平均値よりも大きい個々のＨＮＳＣＣのｃｆＤＮＡ試料の
ＨＮＳＣＣのｃｆＤＮＡ過剰メチル化領域にわたるＲＰＫＭの平均値の観察に基づいて、
定義した。この定義に基づくｃｔＤＮＡ検出の感度および特異度を、受信者動作特性（Ｒ
ＯＣ）曲線分析によって評価した。患者のサブセットにおけるｃｔＤＮＡ放出の潜在的な
欠如に起因するいかなる交絡的な結果も最小限に抑えるために、ＲＯＣ曲線分析がまた、
ＣＡＰＰ－ｓｅｑによる検出可能なｃｔＤＮＡを有する３２個のＨＮＳＣＣ ｃｆＤＮＡ
試料のうちの２０個のみにおいて行われた。ＤＭＲ分析によるｃｔＤＮＡ検出の精度を評
価するための交差検証を行った。手短に言えば、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性患者および健常な
ドナーを、訓練セット（６０％、ｎ＝２４）および検証セット（４０％、ｎ＝１６）に無
作為に割り当て、一方、両方のセットの間で同様のｃｔＤＮＡの存在量（ＣＡＰＰ－Ｓｅ
ｑによって決定される）を維持した。訓練セットの中のＨＮＳＣＣと健常なドナーの試料
との間の差次的メチル化分析によって、過剰ＤＭＲを同定した。これらの過剰ＤＭＲ内の
ｃｔＤＮＡ検出の感度を、ＡＵＲＯＣの値を得るために検証セット内で前述のように評価
した（図２Ｃ）。ランダムサンプリングを合計５０回行った。
３２個のＨＮＳＣＣおよび２０個の健常なドナーのｃｆＤＮＡ試料のコホートからのｃ
ｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリについて、ｃｔＤＮＡ検出を、健常なドナーのｃｆＤＮ
Ａ試料にわたる最大ＲＰＫＭの平均値よりも大きい個々のＨＮＳＣＣのｃｆＤＮＡ試料の
ＨＮＳＣＣのｃｆＤＮＡ過剰メチル化領域にわたるＲＰＫＭの平均値の観察に基づいて、
定義した。この定義に基づくｃｔＤＮＡ検出の感度および特異度を、受信者動作特性（Ｒ
ＯＣ）曲線分析によって評価した。患者のサブセットにおけるｃｔＤＮＡ放出の潜在的な
欠如に起因するいかなる交絡的な結果も最小限に抑えるために、ＲＯＣ曲線分析がまた、
ＣＡＰＰ－ｓｅｑによる検出可能なｃｔＤＮＡを有する３２個のＨＮＳＣＣ ｃｆＤＮＡ
試料のうちの２０個のみにおいて行われた。ＤＭＲ分析によるｃｔＤＮＡ検出の精度を評
価するための交差検証を行った。手短に言えば、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性患者および健常な
ドナーを、訓練セット（６０％、ｎ＝２４）および検証セット（４０％、ｎ＝１６）に無
作為に割り当て、一方、両方のセットの間で同様のｃｔＤＮＡの存在量（ＣＡＰＰ－Ｓｅ
ｑによって決定される）を維持した。訓練セットの中のＨＮＳＣＣと健常なドナーの試料
との間の差次的メチル化分析によって、過剰ＤＭＲを同定した。これらの過剰ＤＭＲ内の
ｃｔＤＮＡ検出の感度を、ＡＵＲＯＣの値を得るために検証セット内で前述のように評価
した（図２Ｃ）。ランダムサンプリングを合計５０回行った。
【0130】
ＣＡＰＰ－ｓｅｑおよびｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによって検出されたｃｔＤＮＡの断片
の長さの分析
各ＨＮＳＣＣ ｃｆＤＮＡ ＣＡＰＰ－ｓｅｑライブラリについて、明示されたＳＮＶ
（すなわち、シングルトン、ＳＣＳ、ＤＣＳ）のすべてのサポート対リードおよび参照対
立遺伝子を含む対のリードからの断片の長さの中央値を測定した。断片の長さの中央値が
、１を超えるＳＮＶの患者について報告された場合、各ＳＮＶからの断片の長さの中央値
にわたる中央値を計算した。各ＨＮＳＣＣのｃｆＤＮＡ、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブ
ラリについて、以前に決定されたＨＮＳＣＣのｃｆＤＮＡ過剰メチル化領域にマッピング
するすべての断片からの断片の長さの中央値を計算した。２０人の健常なドナーのコホー
トの中にメチル化が相対的に存在しないため、各健常なドナーのｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ
ライブラリの断片の長さを、いずれかの計算の前に照合した。両方のタイプのライブラリ
において、断片の長さの分析は、１番目のピーク内のｃｆＤＮＡに限定された（すなわち
、＜２２０塩基対）。
の長さの分析
各ＨＮＳＣＣ ｃｆＤＮＡ ＣＡＰＰ－ｓｅｑライブラリについて、明示されたＳＮＶ
（すなわち、シングルトン、ＳＣＳ、ＤＣＳ）のすべてのサポート対リードおよび参照対
立遺伝子を含む対のリードからの断片の長さの中央値を測定した。断片の長さの中央値が
、１を超えるＳＮＶの患者について報告された場合、各ＳＮＶからの断片の長さの中央値
にわたる中央値を計算した。各ＨＮＳＣＣのｃｆＤＮＡ、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブ
ラリについて、以前に決定されたＨＮＳＣＣのｃｆＤＮＡ過剰メチル化領域にマッピング
するすべての断片からの断片の長さの中央値を計算した。２０人の健常なドナーのコホー
トの中にメチル化が相対的に存在しないため、各健常なドナーのｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ
ライブラリの断片の長さを、いずれかの計算の前に照合した。両方のタイプのライブラリ
において、断片の長さの分析は、１番目のピーク内のｃｆＤＮＡに限定された（すなわち
、＜２２０塩基対）。
【0131】
過剰ＤＭＲ内の断片（１００～１５０ｂｐまたは１００～２２０ｂｐ）の濃縮を以下の
ように計算した。以前に設計したＰＢＬ枯渇ウィンドウ内のランダムな３００ｂｐビンか
ら、合計３０回のサンプリングから、同一の数およびＣｐＧ密度分布で、予想されるカウ
ントのヌル分布を生成した。各試料について観察されたカウントを、過剰ＤＭＲにわたる
リードカウントに基づいて決定した。各試料について、平均観察数を平均予想数で割るこ
とに基づいて、濃縮度を計算した。
ように計算した。以前に設計したＰＢＬ枯渇ウィンドウ内のランダムな３００ｂｐビンか
ら、合計３０回のサンプリングから、同一の数およびＣｐＧ密度分布で、予想されるカウ
ントのヌル分布を生成した。各試料について観察されたカウントを、過剰ＤＭＲにわたる
リードカウントに基づいて決定した。各試料について、平均観察数を平均予想数で割るこ
とに基づいて、濃縮度を計算した。
【0132】
教師付き階層クラスタリング
クラスタリングの前に、ｌｏｇ２変換を可能にするために、０．１の擬似カウントをｃ
ｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリのすべてのＲＰＫＭ値に追加した。値をユークリッド変
換によってスケーリングし、ウォードの方法によってクラスタリングした。３つの別個の
クラスターの任意の数を選択し（ｋ＝３）、メチル化クラスター１～３と命名し、その後
の分析に使用した。
クラスタリングの前に、ｌｏｇ２変換を可能にするために、０．１の擬似カウントをｃ
ｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリのすべてのＲＰＫＭ値に追加した。値をユークリッド変
換によってスケーリングし、ウォードの方法によってクラスタリングした。３つの別個の
クラスターの任意の数を選択し（ｋ＝３）、メチル化クラスター１～３と命名し、その後
の分析に使用した。
【0133】
ＨＮＳＣＣ患者の臨床転帰に対するｃｔＤＮＡ検出および定量化のメトリック
ｃｔＤＮＡ検出の潜在的な臨床的有用性を、３つのメトリックによって評価した。１）
ＣＡＰＰ－ｓｅｑによるＳＮＶの検出、２）ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによる過剰メチル化
領域における増加した平均ＲＰＫＭの検出。比較分析のために、患者を以下の基準に基づ
いて層別化した。１）ＳＮＶの有無、２）メチル化クラスター１対メチル化クラスター２
＋３。患者の特徴を表１に記載する。
ｃｔＤＮＡ検出の潜在的な臨床的有用性を、３つのメトリックによって評価した。１）
ＣＡＰＰ－ｓｅｑによるＳＮＶの検出、２）ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによる過剰メチル化
領域における増加した平均ＲＰＫＭの検出。比較分析のために、患者を以下の基準に基づ
いて層別化した。１）ＳＮＶの有無、２）メチル化クラスター１対メチル化クラスター２
＋３。患者の特徴を表１に記載する。
【表3】
【表4】
【0134】
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ分析によるｃｔＤＮＡ由来メチル化の交差検証
ｃｔＤＮＡ由来メチル化を同定するためのｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑのロバスト性を評価
するために、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析を行った。ｃｔＤＮＡ低／欠如に起因し
た交絡する結果を最小限に抑えるために、分析を、ＣＡＰＰ－ｓｅｑによる検出可能なｃ
ｔＤＮＡを有するＨＮＳＣＣ患者に限定した。患者および健常対照のｃｆＭｅＤＩＰ－ｓ
ｅｑプロファイルを訓練セット（ＨＮＳＣＣ：ｎ＝１２／２０；健常対照：ｎ＝１２／２
０）および試験セット（ＨＮＳＣＣ：ｎ＝８／２０；健常対照：ｎ＝８／２０）に分割し
た。訓練セットおよび試験セットは、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ分析によって判定されるｃｔＤＮ
Ａの存在量についてバランスを取るようにした。各反復で実行されたＲＯＣ曲線分析を用
いて、合計５０回の分割を実行した。
ｃｔＤＮＡ由来メチル化を同定するためのｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑのロバスト性を評価
するために、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析を行った。ｃｔＤＮＡ低／欠如に起因し
た交絡する結果を最小限に抑えるために、分析を、ＣＡＰＰ－ｓｅｑによる検出可能なｃ
ｔＤＮＡを有するＨＮＳＣＣ患者に限定した。患者および健常対照のｃｆＭｅＤＩＰ－ｓ
ｅｑプロファイルを訓練セット（ＨＮＳＣＣ：ｎ＝１２／２０；健常対照：ｎ＝１２／２
０）および試験セット（ＨＮＳＣＣ：ｎ＝８／２０；健常対照：ｎ＝８／２０）に分割し
た。訓練セットおよび試験セットは、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ分析によって判定されるｃｔＤＮ
Ａの存在量についてバランスを取るようにした。各反復で実行されたＲＯＣ曲線分析を用
いて、合計５０回の分割を実行した。
【0135】
ＴＣＧＡ分析によるＨＮＳＣＣの予後領域の同定
一致したレガシーｈｍ４５０ｋおよびＲＮＡ発現データを有するＴＣＧＡからのすべて
の利用可能なＨＮＳＣＣの症例を選択した（ｎ＝５２０）。生存データをＪｉａｎｆａｎ
ｇらから得た。ｈｍ４５０ｋのデータに関して、特定の領域のプローブＩＤ間で平均β値
を計算することによって、前述のようにメチル化を３００ｂｐ領域にまとめた。隣接する
正常組織と比較してＨＮＳＣＣ原発腫瘍において過剰メチル化された領域を同定するため
に、独立したウィルコクソン検定を各領域について行った。隣接する正常組織と比較して
、原発腫瘍において、調整されたｐ値＜０．０５（Ｈｏｌｍｓ法）ならびにｌｏｇ倍数変
化１以上である領域を、その後の分析のために選択した。予後と関連する過剰メチル化領
域を同定するために、年齢、性別および臨床病期を考慮して、ｐ値＜０．０５の領域を選
択して、多変量Ｃｏｘ回帰を行った。生存分析は、ＨＮＳＣＣ ｃｆＤＮＡコホート内で
観察されたことを反映して、診断後５年の最大追跡期間に限定された。遺伝子発現の変化
に関連する予後の領域をさらに同定するために、スピアマンの相関を、各領域のｈｍ４５
０ｋ原発性腫瘍プロファイルについて、２Ｋｂウィンドウ内の転写物の一致したＲＮＡ発
現プロファイルに対して計算した。絶対的なＲｈｏ値＞０．３および偽発見率＜０．０５
を有する領域を選択し、ＺＮＦ３２３／ＺＳＣＡＮ３１、ＬＩＮＣ０１３９５、ＧＡＴＡ
２－ＡＳ１、ＯＳＲ１、およびＳＴＫ３／ＭＳＴ２の発現に関連する５つの予後領域の最
終的な同定をもたらした。ＴＣＧＡ患者プロファイルについては、複合メチル化スコア（
ＣＭＳ）を、５つすべての予後領域にわたるβ値の合計を計算することによって得た。ｃ
ｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルの場合、９４３個すべての過剰ＤＭＲにわたるＲＰＫ
Ｍ値を合計１にスケーリングし、ＣＭＳを、５つすべての予後領域にわたるこれらのスケ
ーリングされたＲＰＫＭ値の合計を計算することによって得た。
一致したレガシーｈｍ４５０ｋおよびＲＮＡ発現データを有するＴＣＧＡからのすべて
の利用可能なＨＮＳＣＣの症例を選択した（ｎ＝５２０）。生存データをＪｉａｎｆａｎ
ｇらから得た。ｈｍ４５０ｋのデータに関して、特定の領域のプローブＩＤ間で平均β値
を計算することによって、前述のようにメチル化を３００ｂｐ領域にまとめた。隣接する
正常組織と比較してＨＮＳＣＣ原発腫瘍において過剰メチル化された領域を同定するため
に、独立したウィルコクソン検定を各領域について行った。隣接する正常組織と比較して
、原発腫瘍において、調整されたｐ値＜０．０５（Ｈｏｌｍｓ法）ならびにｌｏｇ倍数変
化１以上である領域を、その後の分析のために選択した。予後と関連する過剰メチル化領
域を同定するために、年齢、性別および臨床病期を考慮して、ｐ値＜０．０５の領域を選
択して、多変量Ｃｏｘ回帰を行った。生存分析は、ＨＮＳＣＣ ｃｆＤＮＡコホート内で
観察されたことを反映して、診断後５年の最大追跡期間に限定された。遺伝子発現の変化
に関連する予後の領域をさらに同定するために、スピアマンの相関を、各領域のｈｍ４５
０ｋ原発性腫瘍プロファイルについて、２Ｋｂウィンドウ内の転写物の一致したＲＮＡ発
現プロファイルに対して計算した。絶対的なＲｈｏ値＞０．３および偽発見率＜０．０５
を有する領域を選択し、ＺＮＦ３２３／ＺＳＣＡＮ３１、ＬＩＮＣ０１３９５、ＧＡＴＡ
２－ＡＳ１、ＯＳＲ１、およびＳＴＫ３／ＭＳＴ２の発現に関連する５つの予後領域の最
終的な同定をもたらした。ＴＣＧＡ患者プロファイルについては、複合メチル化スコア（
ＣＭＳ）を、５つすべての予後領域にわたるβ値の合計を計算することによって得た。ｃ
ｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルの場合、９４３個すべての過剰ＤＭＲにわたるＲＰＫ
Ｍ値を合計１にスケーリングし、ＣＭＳを、５つすべての予後領域にわたるこれらのスケ
ーリングされたＲＰＫＭ値の合計を計算することによって得た。
【0136】
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによる治療後の血漿試料の長期モニタリング
３０／３２の患者についてｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリの生成に成功した（図１
７Ａ～図１７Ｄ）。残りの２人の患者については、不十分な材料が血漿から単離され、お
よび／または質のメトリックを満たさなかった。治療後のｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブ
ラリのｃｔＤＮＡ定量化を前述のように行い、差次的メチル化分析によって同定された過
剰メチル化領域にわたるＲＰＫＭの平均値を計算した。解釈を容易にするために、処理前
および処理後の両方のｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリを、一致したＣＡＰＰ－Ｓｅｑ
プロファイルによって計算された平均ＭＡＦに対する線形回帰に基づいて、パーセントの
ＤＮＡの値に変換した。残留疾患の高い信頼性の検出を達成するために、０．２％の最小
ｃｔＤＮＡ画分が、治療後の試料で必要であり、これはすべての健常対照にわたって観察
されたＲＰＫＭの平均値の最大値に対応した。
３０／３２の患者についてｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリの生成に成功した（図１
７Ａ～図１７Ｄ）。残りの２人の患者については、不十分な材料が血漿から単離され、お
よび／または質のメトリックを満たさなかった。治療後のｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブ
ラリのｃｔＤＮＡ定量化を前述のように行い、差次的メチル化分析によって同定された過
剰メチル化領域にわたるＲＰＫＭの平均値を計算した。解釈を容易にするために、処理前
および処理後の両方のｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリを、一致したＣＡＰＰ－Ｓｅｑ
プロファイルによって計算された平均ＭＡＦに対する線形回帰に基づいて、パーセントの
ＤＮＡの値に変換した。残留疾患の高い信頼性の検出を達成するために、０．２％の最小
ｃｔＤＮＡ画分が、治療後の試料で必要であり、これはすべての健常対照にわたって観察
されたＲＰＫＭの平均値の最大値に対応した。
【0137】
結果および考察
局在化したＨＮＳＣＣにおけるセルフリーＤＮＡのマルチモーダルプロファイリング
限局性がんの状況においてｃｔＤＮＡを特性評価するためのマルチモーダルプロファイ
リングの能力を調べるために、本発明者らは、末梢血試料を連続した時点で収集した前向
き観察試験に、３２人のＨＮＳＣＣ患者を募集した（図９Ａ、表１）。すべての患者は手
術で治療され、サブセットはアジュバント放射線療法（ｎ＝１４）または化学放射線療法
（ｎ＝１１）を受けた。追跡調査の中央値が４３．２ヶ月で、９／３２の患者（２８％）
が再発をした（保険統計２年の無再発生存率：８８％）。
局在化したＨＮＳＣＣにおけるセルフリーＤＮＡのマルチモーダルプロファイリング
限局性がんの状況においてｃｔＤＮＡを特性評価するためのマルチモーダルプロファイ
リングの能力を調べるために、本発明者らは、末梢血試料を連続した時点で収集した前向
き観察試験に、３２人のＨＮＳＣＣ患者を募集した（図９Ａ、表１）。すべての患者は手
術で治療され、サブセットはアジュバント放射線療法（ｎ＝１４）または化学放射線療法
（ｎ＝１１）を受けた。追跡調査の中央値が４３．２ヶ月で、９／３２の患者（２８％）
が再発をした（保険統計２年の無再発生存率：８８％）。
【0138】
大部分の患者は、体細胞組織のゲノム／エピゲノムランドスケープを変化させ、前がん
病変に寄与することが十分に記載されている重度の喫煙歴を示したので、本発明者らはま
た、以前に肺がんスクリーニングプログラムに登録された２０人のリスクが適合する健常
なドナーからの血液試料を分析した３４～３７。血漿由来のセルフリーＤＮＡおよびＰＢ
Ｌ由来のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を血液から共単離し、定量および分析に供した（補足
図１Ａ）。健常対照と比較して、転移性疾患における総血漿のセルフリーＤＮＡの有意に
上昇したレベルを実証した他の研究とは対照的に、ＨＮＳＣＣコホートと健常なドナーと
の間に有意差は認められなかった３８～４１（補足図１Ｂ）。
病変に寄与することが十分に記載されている重度の喫煙歴を示したので、本発明者らはま
た、以前に肺がんスクリーニングプログラムに登録された２０人のリスクが適合する健常
なドナーからの血液試料を分析した３４～３７。血漿由来のセルフリーＤＮＡおよびＰＢ
Ｌ由来のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を血液から共単離し、定量および分析に供した（補足
図１Ａ）。健常対照と比較して、転移性疾患における総血漿のセルフリーＤＮＡの有意に
上昇したレベルを実証した他の研究とは対照的に、ＨＮＳＣＣコホートと健常なドナーと
の間に有意差は認められなかった３８～４１（補足図１Ｂ）。
【0139】
患者および健常対照からのセルフリーＤＮＡおよびＰＢＬのｇＤＮＡのマルチモーダル
プロファイリングを行った（図１）。同じ試料を変異およびメチロームプロファイリング
の両方に供することによって、本発明者らは、ｃｔＤＮＡの腫瘍ナイーブ検出および特性
評価へのそれらの寄与を評価することができた。変異およびメチル化を、それぞれＣＡｎ
ｃｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｂｙ ｄｅｅｐ Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｉｎｇ（ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ）およびｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｄ
ＮＡ ＩｍｍｕｎｏＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎおよびハイスループットシーケンシング
（ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ）を使用して独立してプロファイリングした。さらに、配列決
定されたセルフリーＤＮＡ断片の長さを得るために、ペアードエンドシーケンシングを両
方の方法論に利用した。
プロファイリングを行った（図１）。同じ試料を変異およびメチロームプロファイリング
の両方に供することによって、本発明者らは、ｃｔＤＮＡの腫瘍ナイーブ検出および特性
評価へのそれらの寄与を評価することができた。変異およびメチル化を、それぞれＣＡｎ
ｃｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｂｙ ｄｅｅｐ Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｉｎｇ（ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ）およびｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｄ
ＮＡ ＩｍｍｕｎｏＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎおよびハイスループットシーケンシング
（ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ）を使用して独立してプロファイリングした。さらに、配列決
定されたセルフリーＤＮＡ断片の長さを得るために、ペアードエンドシーケンシングを両
方の方法論に利用した。
【0140】
治療前の血漿からの変異ベースのｃｔＤＮＡの腫瘍ナイーブ検出
本発明者らは、最初に、一致した腫瘍試料内での確認なしでの変異ベースのｃｔＤＮＡ
検出の信頼性を改善するためのアプローチを評価した。最近の研究は、ＴＰ５３などのｃ
ｔＤＮＡ検出のために頻繁に標的化される遺伝子が、クローンで拡大されたＰＢＬに由来
する変異を有し得ることを示している。さらに、ｃｔＤＮＡは腫瘍の遺伝的特徴およびエ
ピジェネティックの特徴の両方を含むので、本発明者らは、患者のセルフリーＤＮＡにお
ける両方の特徴の直交解析がｃｔＤＮＡ検出の信頼性を高め得ると推論した。したがって
、低い存在量のｃｔＤＮＡの腫瘍ナイーブ検出を高い信頼性で達成するために、ｃｆＤＮ
Ａおよび一致したＰＢＬの両方について、ＣＡＰＰ－ＳｅｑおよびｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅ
ｑによってそれぞれ変異およびメチル化を独立してプロファイリングした。
本発明者らは、最初に、一致した腫瘍試料内での確認なしでの変異ベースのｃｔＤＮＡ
検出の信頼性を改善するためのアプローチを評価した。最近の研究は、ＴＰ５３などのｃ
ｔＤＮＡ検出のために頻繁に標的化される遺伝子が、クローンで拡大されたＰＢＬに由来
する変異を有し得ることを示している。さらに、ｃｔＤＮＡは腫瘍の遺伝的特徴およびエ
ピジェネティックの特徴の両方を含むので、本発明者らは、患者のセルフリーＤＮＡにお
ける両方の特徴の直交解析がｃｔＤＮＡ検出の信頼性を高め得ると推論した。したがって
、低い存在量のｃｔＤＮＡの腫瘍ナイーブ検出を高い信頼性で達成するために、ｃｆＤＮ
Ａおよび一致したＰＢＬの両方について、ＣＡＰＰ－ＳｅｑおよびｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅ
ｑによってそれぞれ変異およびメチル化を独立してプロファイリングした。
【0141】
腫瘍から得る事前の知識なしにＨＰＶ陰性ＨＮＳＣＣにおけるｃｔＤＮＡ検出の感度を
評価するために、本発明者らはまず、ベースライン血漿試料における変異の存在量を測定
した（図２Ａ）。ＣＡＰＰ－Ｓｅｑを、ＨＮＳＣＣ関連変異の数を最大化するように設計
された配列決定パネルを用いて行った（表３および図１０）。本発明者らはまた、バック
グラウンド塩基置換エラーを除去するために、確立されたエラー抑制方法論を採用した。
評価するために、本発明者らはまず、ベースライン血漿試料における変異の存在量を測定
した（図２Ａ）。ＣＡＰＰ－Ｓｅｑを、ＨＮＳＣＣ関連変異の数を最大化するように設計
された配列決定パネルを用いて行った（表３および図１０）。本発明者らはまた、バック
グラウンド塩基置換エラーを除去するために、確立されたエラー抑制方法論を採用した。
【表5】
【0142】
１０～３０ｎｇのインプットＤＮＡを利用する、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑによる診断時のＨＮ
ＳＣＣ患者および健常なドナーからの血漿およびＰＢＬ試料をプロファイリングした。低
い存在量でのｃｔＤＮＡの高感度検出を達成するために、本発明者らは、ＨＮＳＣＣにお
ける検出された変異の数を最大化するように最適化されたＣＡＰＰ－Ｓｅｑセレクタを適
用した（表２および図１０）。本発明者らは、統合デジタルエラー抑制（ｉＤＥＳ）によ
って分析感度をさらに改善し、カスタム分子バーコードを組み込み、健常なドナー血漿試
料（方法）内で同定されたバックグラウンド塩基置換エラーを除去した。
ＳＣＣ患者および健常なドナーからの血漿およびＰＢＬ試料をプロファイリングした。低
い存在量でのｃｔＤＮＡの高感度検出を達成するために、本発明者らは、ＨＮＳＣＣにお
ける検出された変異の数を最大化するように最適化されたＣＡＰＰ－Ｓｅｑセレクタを適
用した（表２および図１０）。本発明者らは、統合デジタルエラー抑制（ｉＤＥＳ）によ
って分析感度をさらに改善し、カスタム分子バーコードを組み込み、健常なドナー血漿試
料（方法）内で同定されたバックグラウンド塩基置換エラーを除去した。
【表6】
【0143】
血漿プロファイリングおよび可能性のある生殖系列変異の除去に基づいて候補の体細胞
一塩基変異体（ＳＮＶ）を選択した後、本発明者らは、適合したＰＢＬプロファイルとの
比較によってクローン造血（ＣＨ）による潜在的偽陽性を特性評価した。同定可能な候補
のＳＮＶを有する２４人の患者のうち、１０人が、高度に相関する変異対立遺伝子画分（
ＭＡＦ）を有する一致したＰＢＬプロファイル内で同一のＳＮＶを示した（Ｒ＝０．９４
、ｐ＝１．３９２ｅ－０７、図２Ｂ）。ＰＩＫ３ＣＡを除いて、これらのＳＮＶを有する
遺伝子は各患者に固有であった（図２Ｃ）。ＤＮＭＴ３Ａ、ＴＥＴ２、およびＡＳＸＬ１
などのＣＨによって一般に影響を受ける遺伝子はＣＡＰＰ－Ｓｅｑセレクタ内に含まれな
かったので、一致したｃｆＤＮＡおよびＰＢＬ試料内の患者固有のＳＮＶの本発明者らの
知見は、遺伝子レベルフィルタリングよりもこのアプローチの利点をさらに強調する。４
人の患者から得た血漿試料は、ＣＨに由来するＳＮＶについて厳密に陽性であり（図２Ｄ
）、一致したＰＢＬプロファイリングが、低い存在量のｃｔＤＮＡの偽陽性検出を大幅に
最小化し得ることを示唆している。
一塩基変異体（ＳＮＶ）を選択した後、本発明者らは、適合したＰＢＬプロファイルとの
比較によってクローン造血（ＣＨ）による潜在的偽陽性を特性評価した。同定可能な候補
のＳＮＶを有する２４人の患者のうち、１０人が、高度に相関する変異対立遺伝子画分（
ＭＡＦ）を有する一致したＰＢＬプロファイル内で同一のＳＮＶを示した（Ｒ＝０．９４
、ｐ＝１．３９２ｅ－０７、図２Ｂ）。ＰＩＫ３ＣＡを除いて、これらのＳＮＶを有する
遺伝子は各患者に固有であった（図２Ｃ）。ＤＮＭＴ３Ａ、ＴＥＴ２、およびＡＳＸＬ１
などのＣＨによって一般に影響を受ける遺伝子はＣＡＰＰ－Ｓｅｑセレクタ内に含まれな
かったので、一致したｃｆＤＮＡおよびＰＢＬ試料内の患者固有のＳＮＶの本発明者らの
知見は、遺伝子レベルフィルタリングよりもこのアプローチの利点をさらに強調する。４
人の患者から得た血漿試料は、ＣＨに由来するＳＮＶについて厳密に陽性であり（図２Ｄ
）、一致したＰＢＬプロファイリングが、低い存在量のｃｔＤＮＡの偽陽性検出を大幅に
最小化し得ることを示唆している。
【0144】
ＣＨを潜在的に反映する候補のＳＮＶを除去した後、ｃｔＤＮＡを２０人の患者の血漿
内で検出した（中央値［範囲］：患者１人あたり３［１～１０］のＳＮＶ）。これらのＳ
ＮＶの妥当性を評価するために、本発明者らは、結果を、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ
ｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）によって公表された２７９個のＨＮＳＣＣ腫瘍からの全
エクソーム解析データと比較して４５、ＴＰ５３（６５％対７２％）、ＰＩＫ３ＣＡ（２
０％対２１％）、ＦＡＴ１（１５％対２３％）およびＮＯＴＣＨ１（１０％対１９％）を
含む高頻度変異遺伝子における類似性を観察した（図２Ｅ）。興味深いことに、２人の患
者は、これらの遺伝子の中で見られない単一のＳＮＶを示し（ＧＲＩＮ３ＡおよびＭＹＣ
、図１１）、ｃｔＤＮＡの検出感度を高めるための未知／非ドライバ効果の遺伝子プロフ
ァイリングの付加的な有用性を実証した。
内で検出した（中央値［範囲］：患者１人あたり３［１～１０］のＳＮＶ）。これらのＳ
ＮＶの妥当性を評価するために、本発明者らは、結果を、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ
ｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）によって公表された２７９個のＨＮＳＣＣ腫瘍からの全
エクソーム解析データと比較して４５、ＴＰ５３（６５％対７２％）、ＰＩＫ３ＣＡ（２
０％対２１％）、ＦＡＴ１（１５％対２３％）およびＮＯＴＣＨ１（１０％対１９％）を
含む高頻度変異遺伝子における類似性を観察した（図２Ｅ）。興味深いことに、２人の患
者は、これらの遺伝子の中で見られない単一のＳＮＶを示し（ＧＲＩＮ３ＡおよびＭＹＣ
、図１１）、ｃｔＤＮＡの検出感度を高めるための未知／非ドライバ効果の遺伝子プロフ
ァイリングの付加的な有用性を実証した。
【0145】
ＳＮＶの平均ＭＡＦに基づいてｃｔＤＮＡ存在量を計算すると、ｃｔＤＮＡレベルは０
．１４％～４．８３％の範囲であった（図２Ｆ）。この検出下限は、約０．１４％と推定
される、腫瘍ナイーブＣＡＰＰ－Ｓｅｑ分析を利用する他の者によって以前に記載された
ものと類似している。検出不能なｃｔＤＮＡを有する患者を含めて、本発明者らのＨＮＳ
ＣＣコホートにわたるｃｔＤＮＡ存在量の中央値は０．４９％であり、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ
によって限局性ＮＳＣＬＣにおいて観察されたものと類似していた。
．１４％～４．８３％の範囲であった（図２Ｆ）。この検出下限は、約０．１４％と推定
される、腫瘍ナイーブＣＡＰＰ－Ｓｅｑ分析を利用する他の者によって以前に記載された
ものと類似している。検出不能なｃｔＤＮＡを有する患者を含めて、本発明者らのＨＮＳ
ＣＣコホートにわたるｃｔＤＮＡ存在量の中央値は０．４９％であり、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ
によって限局性ＮＳＣＬＣにおいて観察されたものと類似していた。
【0146】
ベースライン血漿からのメチル化ベースのｃｔＤＮＡの腫瘍ナイーブ検出
次に、本発明者らは、ＨＮＳＣＣおよび健常対照試料におけるｃｔＤＮＡ関連メチル化
パターンを定義しようとした。ＣＡＰＰ－Ｓｅｑの結果は、ＰＢＬから生じる偽陽性変異
の影響を示したので、本発明者らは、偽陽性ｃｔＤＮＡ関連メチル化の減少が、ＰＢＬ由
来のＤＮＡメチル化シグナルの除去によって達成され得ると推論した。したがって、本発
明者らは、セルフリーＤＮＡメチル化シグナルへの寄与を抑制するために、ＨＮＳＣＣお
よび健常対照試料からの一致したＰＢＬ ＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルを使用し（図
３Ａ）、一致したＰＢＬの分析がまた、メチル化ベースのｃｔＤＮＡ検出も可能にし得る
かどうかを評価した（図３Ａ）。治療前のＨＮＳＣＣおよび健常なドナーの血漿ならびに
ＰＢＬを、５～１０ｎｇのインプットＤＮＡを利用し、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによって
、プロファイリングした。前に記載されたように、メチル化の存在量を、１００万あたり
のキロベース（ＲＰＫＭ）（方法）のリードに対して正規化されたリードカウントで、染
色体１～２２にわたる重複しない３００ｂｐウィンドウ（ｎ＝９，６０３，４５４ウィン
ドウ）で定義した。
次に、本発明者らは、ＨＮＳＣＣおよび健常対照試料におけるｃｔＤＮＡ関連メチル化
パターンを定義しようとした。ＣＡＰＰ－Ｓｅｑの結果は、ＰＢＬから生じる偽陽性変異
の影響を示したので、本発明者らは、偽陽性ｃｔＤＮＡ関連メチル化の減少が、ＰＢＬ由
来のＤＮＡメチル化シグナルの除去によって達成され得ると推論した。したがって、本発
明者らは、セルフリーＤＮＡメチル化シグナルへの寄与を抑制するために、ＨＮＳＣＣお
よび健常対照試料からの一致したＰＢＬ ＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルを使用し（図
３Ａ）、一致したＰＢＬの分析がまた、メチル化ベースのｃｔＤＮＡ検出も可能にし得る
かどうかを評価した（図３Ａ）。治療前のＨＮＳＣＣおよび健常なドナーの血漿ならびに
ＰＢＬを、５～１０ｎｇのインプットＤＮＡを利用し、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによって
、プロファイリングした。前に記載されたように、メチル化の存在量を、１００万あたり
のキロベース（ＲＰＫＭ）（方法）のリードに対して正規化されたリードカウントで、染
色体１～２２にわたる重複しない３００ｂｐウィンドウ（ｎ＝９，６０３，４５４ウィン
ドウ）で定義した。
【0147】
メチル化プルダウンのために利用される抗５ｍＣ抗体は、ＣｐＧアイランドを含む増加
するＣｐＧ密度でＤＮＡ断片に優先的に結合するので、本発明者らは、この相互作用を最
初に特性評価して、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑデータ内で高度に表される可能性が高い領域
を同定した。本発明者らはまた、ＭｅＤＩＰ－ｓｅｑをＨＮＳＣＣ細胞株ＦａＤｕに適用
して、がん由来メチル化ＤＮＡ断片の優先的な結合を評価した。様々な数のＣｐＧを有す
るウィンドウにわたってＤＮＡ断片プルダウン存在量（ＲＰＫＭの中央値）を比較すると
、本発明者らは、ＰＢＬおよびＦａＤｕの両方について最大８ＣｐＧ以上の濃縮の増加を
観察した（図１２Ａおよび図１２Ｂ）。ＦａＤｕは、３００ｂｐウィンドウあたり８Ｃｐ
Ｇ以上で、ＰＢＬと比較してより大きな濃縮を示した。この結果は、ＦａＤｕを含むがん
細胞におけるＣｐＧアイランドの過剰メチル化の確立された現象と一致している。これら
の観察に基づいて、本発明者らは、８以上のＣｐＧ（ｎ＝７０２，４８８）を有するウィ
ンドウがｃｔＤＮＡ検出に最も情報があり得、そのためその後のすべての分析に利用され
たと判定した。
するＣｐＧ密度でＤＮＡ断片に優先的に結合するので、本発明者らは、この相互作用を最
初に特性評価して、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑデータ内で高度に表される可能性が高い領域
を同定した。本発明者らはまた、ＭｅＤＩＰ－ｓｅｑをＨＮＳＣＣ細胞株ＦａＤｕに適用
して、がん由来メチル化ＤＮＡ断片の優先的な結合を評価した。様々な数のＣｐＧを有す
るウィンドウにわたってＤＮＡ断片プルダウン存在量（ＲＰＫＭの中央値）を比較すると
、本発明者らは、ＰＢＬおよびＦａＤｕの両方について最大８ＣｐＧ以上の濃縮の増加を
観察した（図１２Ａおよび図１２Ｂ）。ＦａＤｕは、３００ｂｐウィンドウあたり８Ｃｐ
Ｇ以上で、ＰＢＬと比較してより大きな濃縮を示した。この結果は、ＦａＤｕを含むがん
細胞におけるＣｐＧアイランドの過剰メチル化の確立された現象と一致している。これら
の観察に基づいて、本発明者らは、８以上のＣｐＧ（ｎ＝７０２，４８８）を有するウィ
ンドウがｃｔＤＮＡ検出に最も情報があり得、そのためその後のすべての分析に利用され
たと判定した。
【0148】
限局性がんを有する患者の場合、血漿のセルフリーＤＮＡの大部分はＰＢＬに由来する
。したがって、本発明者らは、セルフリーＤＮＡシグナルへのこの寄与を生物情報学的に
抑制するためにＰＢＬ ＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルを利用しようとした。本発明者
らは、ＨＮＳＣＣおよび健常なドナーｃｆＤＮＡから作製されたｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ
プロファイル内の各ウィンドウについてのＲＰＫＭの値を、ＦａＤｕ（１×１の比較）、
対になっていないＰＢＬ（１×５１の比較）または対になったＰＢＬ（１×１の比較）か
ら作製されたＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルと比較した。血漿のセルフリーＤＮＡの主
な寄与因子であるＰＢＬによれば、ゲノムワイドのメチル化プロファイルは、血漿のセル
フリーＤＮＡと、対になったまたは対になっていないＰＢＬとの間で高度に相関していた
（それぞれ最頻値Ｒ＝０．９２およびＲ＝０．９１）。これらの相関の強さは、血漿のｃ
ｆＤＮＡに対するＰＢＬの既知のサイズ外の寄与を反映している可能性が高い。対照的に
、血漿のセルフリーＤＮＡとＦａＤｕとの間の相関はより弱かった（最頻値Ｒ＝０．７８
）（図３Ｂ）。
。したがって、本発明者らは、セルフリーＤＮＡシグナルへのこの寄与を生物情報学的に
抑制するためにＰＢＬ ＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルを利用しようとした。本発明者
らは、ＨＮＳＣＣおよび健常なドナーｃｆＤＮＡから作製されたｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ
プロファイル内の各ウィンドウについてのＲＰＫＭの値を、ＦａＤｕ（１×１の比較）、
対になっていないＰＢＬ（１×５１の比較）または対になったＰＢＬ（１×１の比較）か
ら作製されたＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルと比較した。血漿のセルフリーＤＮＡの主
な寄与因子であるＰＢＬによれば、ゲノムワイドのメチル化プロファイルは、血漿のセル
フリーＤＮＡと、対になったまたは対になっていないＰＢＬとの間で高度に相関していた
（それぞれ最頻値Ｒ＝０．９２およびＲ＝０．９１）。これらの相関の強さは、血漿のｃ
ｆＤＮＡに対するＰＢＬの既知のサイズ外の寄与を反映している可能性が高い。対照的に
、血漿のセルフリーＤＮＡとＦａＤｕとの間の相関はより弱かった（最頻値Ｒ＝０．７８
）（図３Ｂ）。
【0149】
優先的プルダウンを考慮しながら、ＰＢＬにわたるメチル化の減少の閾値を選択するた
めに、本発明者らは、ＭｅＤＥＳｔｒａｎｄ Ｒパッケージ（方法）によるロジスティッ
ク回帰モデリングに基づいて、ＰＢＬ ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルを絶対的な
メチル化レベル（０～１）にスケーリングおよび正規化した。本発明者らは、健常なドナ
ーのＰＢＬにわたって０．１未満の絶対的なメチル化の中央値を示す９９，９９７個のウ
ィンドウを選択した。これらのウィンドウを、除外されたＨＮＳＣＣ ＰＢＬに適用した
とき、本発明者らは、利用された健常なドナーのＰＢＬの絶対的なメチル化分布と同様の
絶対的なメチル化分布を観察し（図３Ｂ）、このアプローチの一般化の可能性を実証した
。同様に、これらのウィンドウのいずれも個々には、健常なドナーのＰＢＬと比較してＨ
ＮＳＣＣのＰＢＬにわたって有意に高いメチル化を示さず（図３Ｃおよび図１２Ｂ）、ｃ
ｔＤＮＡ検出を混乱させ得るＨＮＳＣＣ特異的ＰＢＬメチル化のあらゆる供給源を制限し
た。換言すれば、これらの結果は、対照および局所的に限定されたＨＰＶ陰性ＨＮＳＣＣ
血漿の両方におけるｃｆＤＮＡメチル化の主な源がＰＢＬに由来し、ＰＢＬ由来のメチル
化の生物情報学的除去がｃｔＤＮＡの定量化を混乱させたシグナルを制限し得ることを確
認する。
めに、本発明者らは、ＭｅＤＥＳｔｒａｎｄ Ｒパッケージ（方法）によるロジスティッ
ク回帰モデリングに基づいて、ＰＢＬ ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルを絶対的な
メチル化レベル（０～１）にスケーリングおよび正規化した。本発明者らは、健常なドナ
ーのＰＢＬにわたって０．１未満の絶対的なメチル化の中央値を示す９９，９９７個のウ
ィンドウを選択した。これらのウィンドウを、除外されたＨＮＳＣＣ ＰＢＬに適用した
とき、本発明者らは、利用された健常なドナーのＰＢＬの絶対的なメチル化分布と同様の
絶対的なメチル化分布を観察し（図３Ｂ）、このアプローチの一般化の可能性を実証した
。同様に、これらのウィンドウのいずれも個々には、健常なドナーのＰＢＬと比較してＨ
ＮＳＣＣのＰＢＬにわたって有意に高いメチル化を示さず（図３Ｃおよび図１２Ｂ）、ｃ
ｔＤＮＡ検出を混乱させ得るＨＮＳＣＣ特異的ＰＢＬメチル化のあらゆる供給源を制限し
た。換言すれば、これらの結果は、対照および局所的に限定されたＨＰＶ陰性ＨＮＳＣＣ
血漿の両方におけるｃｆＤＮＡメチル化の主な源がＰＢＬに由来し、ＰＢＬ由来のメチル
化の生物情報学的除去がｃｔＤＮＡの定量化を混乱させたシグナルを制限し得ることを確
認する。
【0150】
治療前のメチル化ベースのｃｔＤＮＡの腫瘍ナイーブ検出
ＨＮＳＣＣコホート内の一般的なｃｔＤＮＡ由来の過剰メチル化領域を同定するために
、本発明者らは、ＨＮＳＣＣ患者と、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑによる検出可能なｃｔＤＮＡ（ｎ
＝２０）とを、健常なドナーと比較する、差次的メチル化分析を行った。ＰＢＬにおける
メチル化のために枯渇される９９，９９４個の３００ｂｐウィンドウを利用して、本発明
者らは、２０人のＨＮＳＣＣ患者をＣＡＰＰ－Ｓｅｑ－検出可能なｃｔＤＮＡと２０人の
健常対照と比較することによって、ｃｔＤＮＡ由来の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）を同
定した。総じて、本発明者らは、ＨＮＳＣＣ試料全体で９９７個の差次的メチル化領域（
ＤＭＲ）（過剰メチル化：９４１、低メチル化：５６）を同定した（図３Ｃ）。過剰メチ
ル化領域（過剰ＤＭＲ）の半分程度が互いに直接隣接していることが見出され、過剰メチ
ル化のブロックは最大１８００塩基対の長さに及んだ（図１３Ａ）。これらのデータは、
同定された過剰ＤＭＲ内のＣｐＧアイランドが存在することを示唆している。逆に、隣接
する低メチル化領域（低ＤＭＲ）は観察されなかった。３００ｂｐの過剰ＤＭＲのうち、
４７．５％は、長さが１８００ｂｐにまで及ぶ過剰メチル化シグナルの連続したブロック
に存在し（図１３Ａ）、典型的には長さが３００～３０００ｂｐに及ぶＣｐＧアイランド
を示した。実際、ＣｐＧアイランドは、過剰ＤＭＲについて有意に濃縮されていた（図３
Ｅ）。対照的に、低ＤＭＲについてはＣｐＧアイランドが有意に枯渇した（図１３Ｂ）。
ＨＮＳＣＣコホート内の一般的なｃｔＤＮＡ由来の過剰メチル化領域を同定するために
、本発明者らは、ＨＮＳＣＣ患者と、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑによる検出可能なｃｔＤＮＡ（ｎ
＝２０）とを、健常なドナーと比較する、差次的メチル化分析を行った。ＰＢＬにおける
メチル化のために枯渇される９９，９９４個の３００ｂｐウィンドウを利用して、本発明
者らは、２０人のＨＮＳＣＣ患者をＣＡＰＰ－Ｓｅｑ－検出可能なｃｔＤＮＡと２０人の
健常対照と比較することによって、ｃｔＤＮＡ由来の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）を同
定した。総じて、本発明者らは、ＨＮＳＣＣ試料全体で９９７個の差次的メチル化領域（
ＤＭＲ）（過剰メチル化：９４１、低メチル化：５６）を同定した（図３Ｃ）。過剰メチ
ル化領域（過剰ＤＭＲ）の半分程度が互いに直接隣接していることが見出され、過剰メチ
ル化のブロックは最大１８００塩基対の長さに及んだ（図１３Ａ）。これらのデータは、
同定された過剰ＤＭＲ内のＣｐＧアイランドが存在することを示唆している。逆に、隣接
する低メチル化領域（低ＤＭＲ）は観察されなかった。３００ｂｐの過剰ＤＭＲのうち、
４７．５％は、長さが１８００ｂｐにまで及ぶ過剰メチル化シグナルの連続したブロック
に存在し（図１３Ａ）、典型的には長さが３００～３０００ｂｐに及ぶＣｐＧアイランド
を示した。実際、ＣｐＧアイランドは、過剰ＤＭＲについて有意に濃縮されていた（図３
Ｅ）。対照的に、低ＤＭＲについてはＣｐＧアイランドが有意に枯渇した（図１３Ｂ）。
【0151】
これらの過剰ＤＭＲが実際にＣｐＧアイランドについて濃縮されているかどうかを判定
するために、本発明者らは次に、置換分析（方法）によってＣｐＧアイランド、ショア、
ｓｈｅｌｆ、およびｏｐｅｎ ｓｅａについて、過剰ＤＭＲの濃縮を評価した。予想され
るように、ＣｐＧアイランドの有意な濃縮、ならびにショアおよびｏｐｅｎ ｓｅａの有
意な枯渇が、過剰ＤＭＲ内で観察された（図３Ｅ）。対照的に、低ＤＭＲは、がん全体で
頻繁に観察されるＣｐＧ－スパース領域の低メチル化に従って、ｏｐｅｎ ｓｅａが有意
に濃縮され、ＣｐＧアイランドが枯渇していた（補足図５Ｂ）。
するために、本発明者らは次に、置換分析（方法）によってＣｐＧアイランド、ショア、
ｓｈｅｌｆ、およびｏｐｅｎ ｓｅａについて、過剰ＤＭＲの濃縮を評価した。予想され
るように、ＣｐＧアイランドの有意な濃縮、ならびにショアおよびｏｐｅｎ ｓｅａの有
意な枯渇が、過剰ＤＭＲ内で観察された（図３Ｅ）。対照的に、低ＤＭＲは、がん全体で
頻繁に観察されるＣｐＧ－スパース領域の低メチル化に従って、ｏｐｅｎ ｓｅａが有意
に濃縮され、ＣｐＧアイランドが枯渇していた（補足図５Ｂ）。
【0152】
最後に、特定の領域のメチル化は、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑを使用して以前に記載され
たように起源の組織を区別し得るので、本発明者らはまた、過剰ＤＭＲがＨＮＳＣＣまた
は他のがんに特異的な領域を含むかどうかを調べた。腫瘍特異的メチル化領域を同定する
ために、本発明者らは、ＴＣＧＡ（方法）によってもたらされる原発腫瘍から生成された
ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０Ｋ（ｈｍ４５０ｋ）のデータを利用した。浸潤
性乳癌（ＢＲＣＡ）、結腸腺癌（ＣＯＡＤ）、肺扁平上皮癌（ＬＵＳＣ）、前立腺腺癌（
ＰＲＡＤ）、ＨＮＳＣＣ、膵臓腺癌（ＰＡＡＤ）、およびＰＢＬ由来の原発腫瘍を比較し
て、本発明者らは、ＢＲＣＡ、ＣＯＡＤ、ＰＲＡＤ、およびＨＮＳＣＣ（方法）に特異的
な十分な過剰メチル化ＣｐＧ（≧５０）を同定した（図１４）。予想通り、本発明者らは
、ＨＮＳＣ特異的過剰メチル化ＣｐＧと重複する血漿由来ＤＭＲの有意な濃縮、ならびに
ＢＲＣＡ、ＣＯＡＤおよびＰＲＡＤ特異的過剰メチル化ＣｐＧにわたる重複の有意な枯渇
を観察し（図３Ｆ）、このことは、過剰ＤＭＲが、様々な他のがんのタイプと比較した場
合にＨＮＳＣＣ起源に特異的な領域を含むことを示唆している。
たように起源の組織を区別し得るので、本発明者らはまた、過剰ＤＭＲがＨＮＳＣＣまた
は他のがんに特異的な領域を含むかどうかを調べた。腫瘍特異的メチル化領域を同定する
ために、本発明者らは、ＴＣＧＡ（方法）によってもたらされる原発腫瘍から生成された
ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０Ｋ（ｈｍ４５０ｋ）のデータを利用した。浸潤
性乳癌（ＢＲＣＡ）、結腸腺癌（ＣＯＡＤ）、肺扁平上皮癌（ＬＵＳＣ）、前立腺腺癌（
ＰＲＡＤ）、ＨＮＳＣＣ、膵臓腺癌（ＰＡＡＤ）、およびＰＢＬ由来の原発腫瘍を比較し
て、本発明者らは、ＢＲＣＡ、ＣＯＡＤ、ＰＲＡＤ、およびＨＮＳＣＣ（方法）に特異的
な十分な過剰メチル化ＣｐＧ（≧５０）を同定した（図１４）。予想通り、本発明者らは
、ＨＮＳＣ特異的過剰メチル化ＣｐＧと重複する血漿由来ＤＭＲの有意な濃縮、ならびに
ＢＲＣＡ、ＣＯＡＤおよびＰＲＡＤ特異的過剰メチル化ＣｐＧにわたる重複の有意な枯渇
を観察し（図３Ｆ）、このことは、過剰ＤＭＲが、様々な他のがんのタイプと比較した場
合にＨＮＳＣＣ起源に特異的な領域を含むことを示唆している。
【0153】
変異ベースとメチル化ベースのｃｔＤＮＡ検出は特に一致している
いっそう多くの研究が、血漿のセルフリーＤＮＡの健常な源と比較して、減少した断片
の長さに関連するｃｔＤＮＡを記載しており、ロバストな腫瘍ナイーブ検出のためのさら
なるメトリックが得られている。標的化された配列決定が、低下した断片の長さでｃｔＤ
ＮＡを検出することが以前に示されているので、本発明者らはまず、本発明者らのＣＡＰ
Ｐ－Ｓｅｑプロファイルを利用して、本発明者らがＨＮＳＣＣ患者において同様の傾向を
観察し得るかどうかを判定した。患者ごとに同定された各ＳＮＶ（図２Ｅ）について、Ｓ
ＮＶ対立遺伝子ならびに重複する参照対立遺伝子を含む断片の長さの中央値を測定した。
患者の試料の中で複数のＳＮＶが同定された場合については、すべてのＳＮＶおよびそれ
らの参照対立遺伝子にわたる中央値を使用した。以前の知見によれば、本発明者らは、患
者全体で健常なセルフリーＤＮＡと比較してｃｔＤＮＡ断片のサイズの一貫した減少を観
察した（中央値［範囲］Δ＝－１７．５［１～５８］ｂｐ）（図４Ａ）。これらの変異の
平均ＭＡＦと断片の長さとの間に有意な関連はなかった（図１５Ａ）。
いっそう多くの研究が、血漿のセルフリーＤＮＡの健常な源と比較して、減少した断片
の長さに関連するｃｔＤＮＡを記載しており、ロバストな腫瘍ナイーブ検出のためのさら
なるメトリックが得られている。標的化された配列決定が、低下した断片の長さでｃｔＤ
ＮＡを検出することが以前に示されているので、本発明者らはまず、本発明者らのＣＡＰ
Ｐ－Ｓｅｑプロファイルを利用して、本発明者らがＨＮＳＣＣ患者において同様の傾向を
観察し得るかどうかを判定した。患者ごとに同定された各ＳＮＶ（図２Ｅ）について、Ｓ
ＮＶ対立遺伝子ならびに重複する参照対立遺伝子を含む断片の長さの中央値を測定した。
患者の試料の中で複数のＳＮＶが同定された場合については、すべてのＳＮＶおよびそれ
らの参照対立遺伝子にわたる中央値を使用した。以前の知見によれば、本発明者らは、患
者全体で健常なセルフリーＤＮＡと比較してｃｔＤＮＡ断片のサイズの一貫した減少を観
察した（中央値［範囲］Δ＝－１７．５［１～５８］ｂｐ）（図４Ａ）。これらの変異の
平均ＭＡＦと断片の長さとの間に有意な関連はなかった（図１５Ａ）。
【0154】
亜硫酸水素塩ベースのＤＮＡメチル化アプローチとは異なり、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ
はＤＮＡの分解を引き起こさず、したがって元の断片サイズ分布を維持する。これは、Ｄ
ＮＡメチル化および断片の長さを同時にマッピングする新規な機会を提供する。各患者に
ついて以前に同定された血漿由来過剰ＤＭＲ内の断片の長さの分布を評価した。これらの
領域が本発明者らの健常なドナーにわたる低いメチル化を有するという性質のために、ド
ナーにわたるＤＮＡ断片を、比較のために組み合わせた。変異に基づく分析と同様に、本
発明者らは、グループ化された健常対照と比較して、１９／２０のＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性
患者からの断片の長さの減少を観察した（中央値［範囲］Δ＝－７［１～２１］ｂｐ）（
図４Ｂ）。これは、おそらく過剰ＤＭＲ内のセルフリーＤＮＡ断片の健常な組織による部
分的な寄与のために、変異ベースの分析と比較して断片の長さの減少が小さいことを示し
た。この考えを裏付けて、最も短い過剰ＤＭＲ断片を有する試料は、より高いメチル化ｃ
ｔＤＮＡ存在量（ピアソンｒ＝－０．６４、ｐ＝０．００２）を示した（図１５Ｂ）。小
さい断片（１００ｂｐ～１５０ｂｐ）対大きい断片（１５１ｂｐ～２２０ｂｐ）の比を本
発明者らの過剰ＤＭＲ、ｃｔＤＮＡを濃縮するための以前に記載されたアプローチ、のた
めに使用したとき、本発明者らは、大部分のＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性ＨＮＳＣＣ試料にわた
ってｃｔＤＮＡの濃縮の同様の傾向を観察した（中央値［範囲］＝２８［－８～６３］％
）（図４Ｃ）。
はＤＮＡの分解を引き起こさず、したがって元の断片サイズ分布を維持する。これは、Ｄ
ＮＡメチル化および断片の長さを同時にマッピングする新規な機会を提供する。各患者に
ついて以前に同定された血漿由来過剰ＤＭＲ内の断片の長さの分布を評価した。これらの
領域が本発明者らの健常なドナーにわたる低いメチル化を有するという性質のために、ド
ナーにわたるＤＮＡ断片を、比較のために組み合わせた。変異に基づく分析と同様に、本
発明者らは、グループ化された健常対照と比較して、１９／２０のＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性
患者からの断片の長さの減少を観察した（中央値［範囲］Δ＝－７［１～２１］ｂｐ）（
図４Ｂ）。これは、おそらく過剰ＤＭＲ内のセルフリーＤＮＡ断片の健常な組織による部
分的な寄与のために、変異ベースの分析と比較して断片の長さの減少が小さいことを示し
た。この考えを裏付けて、最も短い過剰ＤＭＲ断片を有する試料は、より高いメチル化ｃ
ｔＤＮＡ存在量（ピアソンｒ＝－０．６４、ｐ＝０．００２）を示した（図１５Ｂ）。小
さい断片（１００ｂｐ～１５０ｂｐ）対大きい断片（１５１ｂｐ～２２０ｂｐ）の比を本
発明者らの過剰ＤＭＲ、ｃｔＤＮＡを濃縮するための以前に記載されたアプローチ、のた
めに使用したとき、本発明者らは、大部分のＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性ＨＮＳＣＣ試料にわた
ってｃｔＤＮＡの濃縮の同様の傾向を観察した（中央値［範囲］＝２８［－８～６３］％
）（図４Ｃ）。
【0155】
本発明者らのＨＮＳＣＣコホートにおいて同定された血漿のセルフリーＤＮＡ過剰ＤＭ
Ｒがこれらの小さな断片（１００～１５０ｂｐ）内の個体にわたりどのように異なり得る
かを評価するために、本発明者らは最初に階層的クラスタリングを行った。４つの主要な
クラスターがＣｏｎｓｅｎｓｕｓＣｌｕｓｔｅｒＰｌｕｓ Ｒパッケージを利用して出現
し、それぞれが過剰ＤＭＲにわたって異なるレベルのメチル化を有した（図４Ｅおよび図
１６Ｃ）。同様に、３つのクラスターは、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ（図１６Ｄ）によって判定さ
れるような別個のｃｔＤＮＡ存在量によって定義され、これは、過剰ＤＭＲメチル化の平
均と変異に基づくｃｔＤＮＡの存在量との間の潜在的な関係を示唆している。
Ｒがこれらの小さな断片（１００～１５０ｂｐ）内の個体にわたりどのように異なり得る
かを評価するために、本発明者らは最初に階層的クラスタリングを行った。４つの主要な
クラスターがＣｏｎｓｅｎｓｕｓＣｌｕｓｔｅｒＰｌｕｓ Ｒパッケージを利用して出現
し、それぞれが過剰ＤＭＲにわたって異なるレベルのメチル化を有した（図４Ｅおよび図
１６Ｃ）。同様に、３つのクラスターは、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ（図１６Ｄ）によって判定さ
れるような別個のｃｔＤＮＡ存在量によって定義され、これは、過剰ＤＭＲメチル化の平
均と変異に基づくｃｔＤＮＡの存在量との間の潜在的な関係を示唆している。
【0156】
次に、本発明者らは、断片の長さがＣＡＰＰ－ＳｅｑおよびｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑの
両方によって同定されたｃｔＤＮＡ分子間で一致するかどうかを調査し、本発明者らのマ
ルチモーダルアプローチに対する検証のさらなる層を潜在的にもたらす。バックグラウン
ドＤＮＡ断片がｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイル内のｃｔＤＮＡの計算された断片の
長さを混同させる可能性を最小限に抑えるために、本発明者らは、過剰ＤＭＲ全体でメチ
ル化レベルの中央値を超える患者（ｎ＝１０人のＨＮＳＣＣ患者）に分析を限定した。驚
くべきことに、完全に異なるゲノム領域がこれらの２つのプロファイリング手法を用いて
表されているにもかかわらず、ｃｔＤＮＡ断片の長さは、各患者についての対となったＣ
ＡＰＰ－ＳｅｑプロファイルとｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルとの間で非常に一致
していた（図４Ｃ）（ピアソンｒ＝０．８６、ｐ＝０．００１６）（ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ：
４３個の異なる変異、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ：９４１個の過剰ＤＭＲ）。
両方によって同定されたｃｔＤＮＡ分子間で一致するかどうかを調査し、本発明者らのマ
ルチモーダルアプローチに対する検証のさらなる層を潜在的にもたらす。バックグラウン
ドＤＮＡ断片がｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイル内のｃｔＤＮＡの計算された断片の
長さを混同させる可能性を最小限に抑えるために、本発明者らは、過剰ＤＭＲ全体でメチ
ル化レベルの中央値を超える患者（ｎ＝１０人のＨＮＳＣＣ患者）に分析を限定した。驚
くべきことに、完全に異なるゲノム領域がこれらの２つのプロファイリング手法を用いて
表されているにもかかわらず、ｃｔＤＮＡ断片の長さは、各患者についての対となったＣ
ＡＰＰ－ＳｅｑプロファイルとｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルとの間で非常に一致
していた（図４Ｃ）（ピアソンｒ＝０．８６、ｐ＝０．００１６）（ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ：
４３個の異なる変異、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ：９４１個の過剰ＤＭＲ）。
【0157】
過剰ＤＭＲメチル化レベルと変異ベースのｃｔＤＮＡ存在量との間の関係をさらに特性
評価するために、本発明者らは、９４１の過剰ＤＭＲにわたるＲＰＫＭの平均値を、各患
者についてＣＡＰＰ－Ｓｅｑによって判定されたＭＡＦの平均値と比較した。メチル化ク
ラスター間で観察された傾向と同様に、本発明者らは有意な正の相関（ピアソン相関、Ｒ
＝０．８５、ｐ＝５ｅ－１０）を観察した（図４Ｆ）。ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによるこ
れらの過剰ＤＭＲ内のｃｔＤＮＡ検出の感度を評価するために、本発明者らは、本発明者
らのＨＮＳＣＣコホートと健常なドナーとの間のＲＰＫＭの平均値を比較した。ＣＡＰＰ
－Ｓｅｑ陽性患者（ｎ＝２０）については、ｃｔＤＮＡ検出は特に一致しており（ＡＵＣ
＝０．９９８）、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陰性患者（ｎ＝１２）の組み込み時にパフォーマンス
がわずかに低下した（ＡＵＣ＝０．９４４）（図４Ｇ）。ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性患者およ
び健常なドナーにわたる交差検証（ｎ＝５０サンプリング）の結果、０．９８４のＡＵＣ
中央値がもたらされ（図１６Ａ）、本明細書に開示されるアプローチのロバスト性が実証
された。
評価するために、本発明者らは、９４１の過剰ＤＭＲにわたるＲＰＫＭの平均値を、各患
者についてＣＡＰＰ－Ｓｅｑによって判定されたＭＡＦの平均値と比較した。メチル化ク
ラスター間で観察された傾向と同様に、本発明者らは有意な正の相関（ピアソン相関、Ｒ
＝０．８５、ｐ＝５ｅ－１０）を観察した（図４Ｆ）。ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによるこ
れらの過剰ＤＭＲ内のｃｔＤＮＡ検出の感度を評価するために、本発明者らは、本発明者
らのＨＮＳＣＣコホートと健常なドナーとの間のＲＰＫＭの平均値を比較した。ＣＡＰＰ
－Ｓｅｑ陽性患者（ｎ＝２０）については、ｃｔＤＮＡ検出は特に一致しており（ＡＵＣ
＝０．９９８）、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陰性患者（ｎ＝１２）の組み込み時にパフォーマンス
がわずかに低下した（ＡＵＣ＝０．９４４）（図４Ｇ）。ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性患者およ
び健常なドナーにわたる交差検証（ｎ＝５０サンプリング）の結果、０．９８４のＡＵＣ
中央値がもたらされ（図１６Ａ）、本明細書に開示されるアプローチのロバスト性が実証
された。
【0158】
これらの観察に基づいて、本発明者らは、短縮された長さのセルフリーＤＮＡ断片に分
析を限定することによって、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイル内でｃｔＤＮＡを濃縮
し得るかどうかを評価した。本発明者らは、非メチル化ベースのアプローチを使用してｃ
ｔＤＮＡを濃縮する同様の方法が記載されているので、小さい（１００～１５０ｂｐ）断
片からなる過剰ＤＭＲ内のセルフリーＤＮＡ断片の割合を評価した。実際、これにより、
ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性ＨＮＳＣＣ試料の大部分（中央値［範囲］＝２８［－８～６３］％
）にわたってｃｔＤＮＡ濃縮がもたらされたが、健常対照のいずれについてももたらされ
なかった（図４Ｄ）。したがって、セルフリーＤＮＡ断片のインシリコのサイズ選択は、
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリ内のｃｔＤＮＡを濃縮し、腫瘍ナイーブマルチモーダ
ルｃｔＤＮＡ分析に寄与し得る。
析を限定することによって、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイル内でｃｔＤＮＡを濃縮
し得るかどうかを評価した。本発明者らは、非メチル化ベースのアプローチを使用してｃ
ｔＤＮＡを濃縮する同様の方法が記載されているので、小さい（１００～１５０ｂｐ）断
片からなる過剰ＤＭＲ内のセルフリーＤＮＡ断片の割合を評価した。実際、これにより、
ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性ＨＮＳＣＣ試料の大部分（中央値［範囲］＝２８［－８～６３］％
）にわたってｃｔＤＮＡ濃縮がもたらされたが、健常対照のいずれについてももたらされ
なかった（図４Ｄ）。したがって、セルフリーＤＮＡ断片のインシリコのサイズ選択は、
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリ内のｃｔＤＮＡを濃縮し、腫瘍ナイーブマルチモーダ
ルｃｔＤＮＡ分析に寄与し得る。
【0159】
限局性非転移性がんを有する患者において、診断時のＣＡＰＰ－ＳｅｑによるｃｔＤＮ
Ａの検出は、予後不良に関連することが以前に記載されている。同様に、ＳＨＯＸ２およ
びＳＥＰＴ９のメチル化によって評価されるｃｔＤＮＡのレベルは、ＨＮＳＣＣにおける
予後不良と関連している。したがって、本発明者らは、診断時のＣＡＰＰ－Ｓｅｑおよび
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによるｃｔＤＮＡの検出または定量化が本発明者らのＨＮＳＣＣ
コホート内の臨床転帰と関連するかどうかを尋ねた。実際、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ（すなわち
、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性対ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陰性）によるｃｔＤＮＡの検出（ハザード比
［ＨＲ］＝７．６、ログランクｐ＝０．０２６；補足図８Ｄ）、ならびに本発明者らが以
前に同定した過剰ＤＭＲ内のメチル化の増加（すなわち、メチル化クラスター１＋２＋３
対メチル化クラスター４）（ＨＲ＝４．５１、ｐ＝０．０３８；図４Ｇ）は、生存期間の
短縮と相関していた。この知見と一致して、過剰ＤＭＲにわたる平均ＲＰＫＭは、がんの
ステージと相関した（補足図８Ｅ）。
Ａの検出は、予後不良に関連することが以前に記載されている。同様に、ＳＨＯＸ２およ
びＳＥＰＴ９のメチル化によって評価されるｃｔＤＮＡのレベルは、ＨＮＳＣＣにおける
予後不良と関連している。したがって、本発明者らは、診断時のＣＡＰＰ－Ｓｅｑおよび
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによるｃｔＤＮＡの検出または定量化が本発明者らのＨＮＳＣＣ
コホート内の臨床転帰と関連するかどうかを尋ねた。実際、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ（すなわち
、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性対ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陰性）によるｃｔＤＮＡの検出（ハザード比
［ＨＲ］＝７．６、ログランクｐ＝０．０２６；補足図８Ｄ）、ならびに本発明者らが以
前に同定した過剰ＤＭＲ内のメチル化の増加（すなわち、メチル化クラスター１＋２＋３
対メチル化クラスター４）（ＨＲ＝４．５１、ｐ＝０．０３８；図４Ｇ）は、生存期間の
短縮と相関していた。この知見と一致して、過剰ＤＭＲにわたる平均ＲＰＫＭは、がんの
ステージと相関した（補足図８Ｅ）。
【0160】
次に、本発明者らは、変異またはメチル化に基づくプロファイリングのいずれかによっ
て同定されたｃｔＤＮＡの断片の長さの中央値を比較した。バックグラウンドＤＮＡ断片
がｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイル内のｃｔＤＮＡの計算された断片の長さを混同さ
せる可能性を最小限に抑えるために、本発明者らは、階層的クラスタリングによって定義
されるように高いｃｔＤＮＡ存在量を有する患者を選択した（すなわち、メチル化クラス
ター１および２、図４Ｄ、補足図８Ａ～Ｂ）。このアプローチでは、完全に異なるゲノム
領域がこれらの２つのプロファイリング手法を用いて表されているにもかかわらず、ｃｔ
ＤＮＡ断片の長さは、各患者について対となったＣＡＰＰ－ＳｅｑプロファイルとｃｆＭ
ｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルとの間で特に一致していた（Ｒ＝０．８３、ｐ＝０．００
１６）（図４Ｈ）。さらに、すべての長さの断片を用いた本発明者らの分析と同様に、本
発明者らは、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ（Ｒ＝－０．７９、ｐ＝０．００３８）による小さい断片
比とｃｔＤＮＡ断片の長さとの間で同じ関係を観察した（図４Ｉ）。
て同定されたｃｔＤＮＡの断片の長さの中央値を比較した。バックグラウンドＤＮＡ断片
がｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイル内のｃｔＤＮＡの計算された断片の長さを混同さ
せる可能性を最小限に抑えるために、本発明者らは、階層的クラスタリングによって定義
されるように高いｃｔＤＮＡ存在量を有する患者を選択した（すなわち、メチル化クラス
ター１および２、図４Ｄ、補足図８Ａ～Ｂ）。このアプローチでは、完全に異なるゲノム
領域がこれらの２つのプロファイリング手法を用いて表されているにもかかわらず、ｃｔ
ＤＮＡ断片の長さは、各患者について対となったＣＡＰＰ－ＳｅｑプロファイルとｃｆＭ
ｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルとの間で特に一致していた（Ｒ＝０．８３、ｐ＝０．００
１６）（図４Ｈ）。さらに、すべての長さの断片を用いた本発明者らの分析と同様に、本
発明者らは、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ（Ｒ＝－０．７９、ｐ＝０．００３８）による小さい断片
比とｃｔＤＮＡ断片の長さとの間で同じ関係を観察した（図４Ｉ）。
【0161】
これらの結果は、ＣＡＰＰ－ＳｅｑおよびｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによって検出される
ｃｔＤＮＡから観察される断片の長さの同様の減少が、ゲノム領域によるのではなく、腫
瘍の固有の特性の結果であり得ること、およびより短い断片の長さを利用することがｃｔ
ＤＮＡのより特異的な同定に寄与し得ることを示唆している。
ｃｔＤＮＡから観察される断片の長さの同様の減少が、ゲノム領域によるのではなく、腫
瘍の固有の特性の結果であり得ること、およびより短い断片の長さを利用することがｃｔ
ＤＮＡのより特異的な同定に寄与し得ることを示唆している。
【0162】
予後の判定のためのマルチモーダルｃｔＤＮＡ検出の適用
腫瘍ナイーブマルチモーダルｃｔＤＮＡ分析の潜在的な臨床応用を評価するために、本
発明者らは、ＨＮＳＣＣコホートにおいてｃｔＤＮＡを臨床転帰と比較した。断片の長さ
の情報に基づくｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルは、一致したＣＡＰＰ－Ｓｅｑプロ
ファイルにおいてＭＡＦと強く関連し（ピアソンｒ＝０．８５、ｐ＝３×１０－９）、９
４１個の過剰ＤＭＲ内のメチル化強度が実際にｃｔＤＮＡの存在量を反映していることを
示唆した（図５Ｃ）。重要なことに、交差検証分析により、ｃｔＤＮＡを検出するための
これらの過剰ＤＭＲのロバスト性が確認された（図１６Ｃ）。変異およびメチル化に基づ
く方法の両方によってベースラインの血漿において検出されたｃｔＤＮＡを有する患者（
ｎ＝１９）は、検出可能なｃｔＤＮＡを有していない患者（ｎ＝８／１３）と比較した場
合、進行した疾患（すなわち、ステージＩＩＩ－ＩＶＡ）を有する可能性が有意に高く（
ｎ＝１８／１９）（フィッシャーの正確検定ｐ＝０．０２８）、劇的に不良な全生存率を
示した（ハザード比［ＨＲ］＝７．５５、９５％信頼区間［ＣＩ］＝［０．９５～５９．
９４］、ログランクｐ＝０．０２５）（図５Ｇ）。比較すると、ステージのみでは、より
不良な全生存（ＨＲ＝２．５９、９５％ＣＩ＝［０．３２～２０．４６］、ログランクｐ
＝０．３５）の患者を予測することができず（図１６Ｄ）、マルチモーダルｃｔＤＮＡプ
ロファイリングの潜在的な臨床的有用性がさらに実証された。
腫瘍ナイーブマルチモーダルｃｔＤＮＡ分析の潜在的な臨床応用を評価するために、本
発明者らは、ＨＮＳＣＣコホートにおいてｃｔＤＮＡを臨床転帰と比較した。断片の長さ
の情報に基づくｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルは、一致したＣＡＰＰ－Ｓｅｑプロ
ファイルにおいてＭＡＦと強く関連し（ピアソンｒ＝０．８５、ｐ＝３×１０－９）、９
４１個の過剰ＤＭＲ内のメチル化強度が実際にｃｔＤＮＡの存在量を反映していることを
示唆した（図５Ｃ）。重要なことに、交差検証分析により、ｃｔＤＮＡを検出するための
これらの過剰ＤＭＲのロバスト性が確認された（図１６Ｃ）。変異およびメチル化に基づ
く方法の両方によってベースラインの血漿において検出されたｃｔＤＮＡを有する患者（
ｎ＝１９）は、検出可能なｃｔＤＮＡを有していない患者（ｎ＝８／１３）と比較した場
合、進行した疾患（すなわち、ステージＩＩＩ－ＩＶＡ）を有する可能性が有意に高く（
ｎ＝１８／１９）（フィッシャーの正確検定ｐ＝０．０２８）、劇的に不良な全生存率を
示した（ハザード比［ＨＲ］＝７．５５、９５％信頼区間［ＣＩ］＝［０．９５～５９．
９４］、ログランクｐ＝０．０２５）（図５Ｇ）。比較すると、ステージのみでは、より
不良な全生存（ＨＲ＝２．５９、９５％ＣＩ＝［０．３２～２０．４６］、ログランクｐ
＝０．３５）の患者を予測することができず（図１６Ｄ）、マルチモーダルｃｔＤＮＡプ
ロファイリングの潜在的な臨床的有用性がさらに実証された。
【0163】
がんドライバの遺伝子発現および結果として生じる機能活性に対するＤＮＡメチル化の
既知の効果のために、本発明者らは、特定の遺伝子座におけるｃｔＤＮＡメチル化パター
ンがｃｔＤＮＡ存在量とは無関係に予後の有意性を有し得ると推論した。本発明者らの以
前に同定された過剰ＤＭＲが、ｃｔＤＮＡ存在量とは無関係に予後と関連する特定の領域
を含むかどうかを評価するために、本発明者らは、入手可能なすべてのＨＮＳＣＣ患者（
ｎ＝５２０）についてＴＣＧＡによって得られるＤＮＡメチル化、ＲＮＡ発現および臨床
転帰データを調べた（図５Ｃ）。最初に、本発明者らは、ＴＣＧＡ ｈｍ４５０ｋメチル
化アレイデータから異なる３００ｂｐウィンドウ内に含まれるすべてのＣｐＧにわたるβ
の平均値を計算した。分析を、血漿由来過剰ＤＭＲと重複するプローブｈｍ４５０ｋ領域
（ｎ＝７６４／９４１）に限定して、本発明者らが隣接する正常組織（ｎ＝５０）と比較
して原発腫瘍（ｎ＝５２０）の４８３個の過剰メチル化領域を同定した（ウィルコクソン
検定、ＦＤＲ＜０．０５、ｌｏｇ２ＦＣ＞１）。本発明者らは、ＨＮＳＣＣならびにＴＷ
ＩＳＴ１およびＯＮＥＣＵＴ２で以前に評価されたＳＥＰＴ９およびＳＨＯＸ２を含む、
市販のメチル化ベースのｃｔＤＮＡ診断試験によってプロファイリングされた遺伝子内の
ＣｐＧの近くに、これらの過剰メチル化領域のいくつかが重複しているかまたは位置して
いることを観察した（図１７Ａ）。これらの結果から、本発明者らの血漿由来過剰ＤＭＲ
の潜在的な臨床的関連性を支持するさらなる証拠が得られる。
既知の効果のために、本発明者らは、特定の遺伝子座におけるｃｔＤＮＡメチル化パター
ンがｃｔＤＮＡ存在量とは無関係に予後の有意性を有し得ると推論した。本発明者らの以
前に同定された過剰ＤＭＲが、ｃｔＤＮＡ存在量とは無関係に予後と関連する特定の領域
を含むかどうかを評価するために、本発明者らは、入手可能なすべてのＨＮＳＣＣ患者（
ｎ＝５２０）についてＴＣＧＡによって得られるＤＮＡメチル化、ＲＮＡ発現および臨床
転帰データを調べた（図５Ｃ）。最初に、本発明者らは、ＴＣＧＡ ｈｍ４５０ｋメチル
化アレイデータから異なる３００ｂｐウィンドウ内に含まれるすべてのＣｐＧにわたるβ
の平均値を計算した。分析を、血漿由来過剰ＤＭＲと重複するプローブｈｍ４５０ｋ領域
（ｎ＝７６４／９４１）に限定して、本発明者らが隣接する正常組織（ｎ＝５０）と比較
して原発腫瘍（ｎ＝５２０）の４８３個の過剰メチル化領域を同定した（ウィルコクソン
検定、ＦＤＲ＜０．０５、ｌｏｇ２ＦＣ＞１）。本発明者らは、ＨＮＳＣＣならびにＴＷ
ＩＳＴ１およびＯＮＥＣＵＴ２で以前に評価されたＳＥＰＴ９およびＳＨＯＸ２を含む、
市販のメチル化ベースのｃｔＤＮＡ診断試験によってプロファイリングされた遺伝子内の
ＣｐＧの近くに、これらの過剰メチル化領域のいくつかが重複しているかまたは位置して
いることを観察した（図１７Ａ）。これらの結果から、本発明者らの血漿由来過剰ＤＭＲ
の潜在的な臨床的関連性を支持するさらなる証拠が得られる。
【0164】
本発明者らのＨＮＳＣＣコホートおよびＴＣＧＡのＨＮＳＣ ｈｍ４５０ｋのプロファ
イルによって共通して保持されるこれらの過剰メチル化領域の潜在的な臨床的有用性をさ
らに調べるために、本発明者らは、利用可能なｈｍ４５０ｋのプロファイルおよび疾患特
異的生存（ＤＳＳ）転帰であるすべてのＴＣＧＡのＨＮＳＣＣ患者にわたって単変量コッ
クス比例ハザード回帰を行った（ｎ＝４９３／５２０）。本発明者らは、ＤＳＳと有意に
関連する３３の領域を同定した（ｐ＜０．０５）。腫瘍形成において機能的役割を有する
可能性が高い予後領域をさらに選択するために、本発明者らは、各領域（ｎ＝３３）のメ
チル化レベルを２ｋｂ内の周囲の遺伝子転写物の発現と比較した。次に、本発明者らは、
ＴＣＧＡのＨＮＳＣＣコホートを使用して、（１）多変量Ｃｏｘ回帰における予後および
（２）隣接遺伝子転写物の発現に関連する４８３個のＤＭＲのサブセットを同定した。５
つの領域が両方の基準を満たすように同定され、各領域のメチル化が増加すると、ＺＮＦ
３２３／ＺＳＣＡＮ３１、ＬＩＮＣ０１３９１、およびＧＡＴＡ２－ＡＳ１のより高い発
現がもたらされ（図５Ｇ、図１７Ａ～図１７Ｃ、またＳＴＫ３／ＭＳＴ２およびＯＳＲ１
のそれぞれのより低い発現がもたらされた（図５Ｈ）（図５Ｄ）。メチル化の結果として
の発現の減少および増加に関連する領域は、それぞれプロモーターまたは第１のエクソン
／イントロンおよび遺伝子本体内に存在することが見出された。本発明者らは、これらの
５つの領域から複合メチル化スコア（ＣＭＳ）を構築し（表６）、このスコアに従ってＴ
ＣＧＡのＨＮＳＣＣコホートを層別化した（図５Ｅ）。より高いＣＭＳは、劣った生存転
帰と有意に関連していた（ＨＲ＝１．６７、９５％ＣＩ＝［１．２５，２．２１］、ログ
ランクｐ＝３．４×１０－４）。
イルによって共通して保持されるこれらの過剰メチル化領域の潜在的な臨床的有用性をさ
らに調べるために、本発明者らは、利用可能なｈｍ４５０ｋのプロファイルおよび疾患特
異的生存（ＤＳＳ）転帰であるすべてのＴＣＧＡのＨＮＳＣＣ患者にわたって単変量コッ
クス比例ハザード回帰を行った（ｎ＝４９３／５２０）。本発明者らは、ＤＳＳと有意に
関連する３３の領域を同定した（ｐ＜０．０５）。腫瘍形成において機能的役割を有する
可能性が高い予後領域をさらに選択するために、本発明者らは、各領域（ｎ＝３３）のメ
チル化レベルを２ｋｂ内の周囲の遺伝子転写物の発現と比較した。次に、本発明者らは、
ＴＣＧＡのＨＮＳＣＣコホートを使用して、（１）多変量Ｃｏｘ回帰における予後および
（２）隣接遺伝子転写物の発現に関連する４８３個のＤＭＲのサブセットを同定した。５
つの領域が両方の基準を満たすように同定され、各領域のメチル化が増加すると、ＺＮＦ
３２３／ＺＳＣＡＮ３１、ＬＩＮＣ０１３９１、およびＧＡＴＡ２－ＡＳ１のより高い発
現がもたらされ（図５Ｇ、図１７Ａ～図１７Ｃ、またＳＴＫ３／ＭＳＴ２およびＯＳＲ１
のそれぞれのより低い発現がもたらされた（図５Ｈ）（図５Ｄ）。メチル化の結果として
の発現の減少および増加に関連する領域は、それぞれプロモーターまたは第１のエクソン
／イントロンおよび遺伝子本体内に存在することが見出された。本発明者らは、これらの
５つの領域から複合メチル化スコア（ＣＭＳ）を構築し（表６）、このスコアに従ってＴ
ＣＧＡのＨＮＳＣＣコホートを層別化した（図５Ｅ）。より高いＣＭＳは、劣った生存転
帰と有意に関連していた（ＨＲ＝１．６７、９５％ＣＩ＝［１．２５，２．２１］、ログ
ランクｐ＝３．４×１０－４）。
【0165】
最後に、本発明者らは、ｃｔＤＮＡに適用した場合にＣＭＳかた同様の予後情報が得ら
れるかどうかも評価した。ｃｔＤＮＡを濃縮するために、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブ
ラリの分析を、上記のように１００～１５０ｂｐの長さの断片に限定した（図４Ｅ）。５
つの推定予後マーカーによって得られるｃｔＤＮＡメチル化レベルの相対的な寄与を説明
するために、本発明者らは、これらの領域からのｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑのＲＰＫＭの値
を９４１個の過剰ＤＭＲ全体に正規化した。これは、より高いＣＭＳがより不良な生存と
わずかに関連するという同様の傾向をもたらし（ログランクｐ＝０．１；ＨＲ＝３．０６
）（図５Ｆ）、このことは、ＴＣＧＡから同定されたこれらの推定予後領域のメチル化の
増加がまた、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイル内で情報があり得ることを示唆してい
る。さらに、これらの結果は、バイオマーカー発見のために、血漿のセルフリーＤＮＡメ
チロームプロファイリングを既存のマルチオミックのがんデータベースと組み合わせてど
のように活用できるかを強調している。
れるかどうかも評価した。ｃｔＤＮＡを濃縮するために、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブ
ラリの分析を、上記のように１００～１５０ｂｐの長さの断片に限定した（図４Ｅ）。５
つの推定予後マーカーによって得られるｃｔＤＮＡメチル化レベルの相対的な寄与を説明
するために、本発明者らは、これらの領域からのｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑのＲＰＫＭの値
を９４１個の過剰ＤＭＲ全体に正規化した。これは、より高いＣＭＳがより不良な生存と
わずかに関連するという同様の傾向をもたらし（ログランクｐ＝０．１；ＨＲ＝３．０６
）（図５Ｆ）、このことは、ＴＣＧＡから同定されたこれらの推定予後領域のメチル化の
増加がまた、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイル内で情報があり得ることを示唆してい
る。さらに、これらの結果は、バイオマーカー発見のために、血漿のセルフリーＤＮＡメ
チロームプロファイリングを既存のマルチオミックのがんデータベースと組み合わせてど
のように活用できるかを強調している。
【0166】
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによる最終治療後の疾患の監視
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑがＨＮＳＣＣ患者において高感度かつ定量的なｃｔＤＮＡ検出
を達成したので、本発明者らは、ＣＡＰＰ－ｓｅｑと同様に、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑも
ｃｔＤＮＡ存在量の治療関連変化をモニタリングすることができる可能性があると推論し
た。治療後のｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイル内のｃｔＤＮＡのパーセントを定量す
るために、本発明者らは、以前に同定された血漿由来の過剰ＤＭＲ（ｎ＝９４１）にわた
って平均ＲＰＫＭの線形変換を適用し、ｃｔＤＮＡをさらに濃縮するために１００～１５
０ｂｐの間の断片のサイズを制限した。すべての健常対照にわたって観察されたＲＰＫＭ
の平均値の最大値に基づいて、０．２％のｃｔＤＮＡの検出閾値を計算した。１つまたは
複数の利用可能な治療後試料のＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性のＨＮＳＣＣ患者（ｎ＝２０）につ
いては、１０ｎｇのインプットｃｆＤＮＡを利用してｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑを行った。
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑがＨＮＳＣＣ患者において高感度かつ定量的なｃｔＤＮＡ検出
を達成したので、本発明者らは、ＣＡＰＰ－ｓｅｑと同様に、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑも
ｃｔＤＮＡ存在量の治療関連変化をモニタリングすることができる可能性があると推論し
た。治療後のｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイル内のｃｔＤＮＡのパーセントを定量す
るために、本発明者らは、以前に同定された血漿由来の過剰ＤＭＲ（ｎ＝９４１）にわた
って平均ＲＰＫＭの線形変換を適用し、ｃｔＤＮＡをさらに濃縮するために１００～１５
０ｂｐの間の断片のサイズを制限した。すべての健常対照にわたって観察されたＲＰＫＭ
の平均値の最大値に基づいて、０．２％のｃｔＤＮＡの検出閾値を計算した。１つまたは
複数の利用可能な治療後試料のＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性のＨＮＳＣＣ患者（ｎ＝２０）につ
いては、１０ｎｇのインプットｃｆＤＮＡを利用してｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑを行った。
【0167】
治療全体にわたるｃｔＤＮＡ存在量の変化を測定すると、本発明者らは、完全クリアラ
ンス（ＣＣ）、部分クリアランス（ＰＣ；９０％を超える低下）またはクリアランスなし
（ＮＣ）を示す様々な動態を観察した（図６Ａ 補足図１０）。１８人の適格患者のうち
、５人（２８％）がクリアランスなしを示した（図６Ｂ）。クリアランスなしの患者は、
完全または部分的クリアランスの患者と比較して、疾患の再発を経験する可能性が高かっ
た（ＨＲ＝８．７３、９５％ＣＩ＝［１．５、５０．９２］、ログランクｐ＝０．００４
６）（図６Ｃ）。興味深いことに、診断時と比較して、最後の試料採取時にｃｔＤＮＡ存
在量がより多いすべての患者が、疾患の再発を示した。さらに、この群内で疾患の再発が
実証されなかった唯一の患者が、追跡不能になったが、原因不明で治療後１年以内に死亡
した。ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによる検出不能な処置後ｃｔＤＮＡを有する１３名の患者
については、９名が無病のままであり、追跡調査の中央値は４４．４ヶ月であった（最低
値＝１２．２、最大値＝５８．７）。他の４人の患者のうち、一人は所属リンパ節内に持
続性疾患を有し、他の人は最後の採取後３．５～７．７ヶ月（中央値７．４ヶ月）で再発
を経験した。注目すべきことに、検出不能な治療後ｃｔＤＮＡを有する患者間のこれらの
再発は、最後の収集後に検出可能な治療後ｃｔＤＮＡ（中央値［範囲］：３．０［１．７
～５．２］ヶ月）を有する患者間の４つの再発と比較してかなり遅延した。まとめると、
これらの結果は、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによる血漿のセルフリーＤＮＡメチロームプロ
ファイリングを使用して、根治的治療に対する応答を評価し、急速な再発のリスクが高い
患者を同定することができることを実証している。
ンス（ＣＣ）、部分クリアランス（ＰＣ；９０％を超える低下）またはクリアランスなし
（ＮＣ）を示す様々な動態を観察した（図６Ａ 補足図１０）。１８人の適格患者のうち
、５人（２８％）がクリアランスなしを示した（図６Ｂ）。クリアランスなしの患者は、
完全または部分的クリアランスの患者と比較して、疾患の再発を経験する可能性が高かっ
た（ＨＲ＝８．７３、９５％ＣＩ＝［１．５、５０．９２］、ログランクｐ＝０．００４
６）（図６Ｃ）。興味深いことに、診断時と比較して、最後の試料採取時にｃｔＤＮＡ存
在量がより多いすべての患者が、疾患の再発を示した。さらに、この群内で疾患の再発が
実証されなかった唯一の患者が、追跡不能になったが、原因不明で治療後１年以内に死亡
した。ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによる検出不能な処置後ｃｔＤＮＡを有する１３名の患者
については、９名が無病のままであり、追跡調査の中央値は４４．４ヶ月であった（最低
値＝１２．２、最大値＝５８．７）。他の４人の患者のうち、一人は所属リンパ節内に持
続性疾患を有し、他の人は最後の採取後３．５～７．７ヶ月（中央値７．４ヶ月）で再発
を経験した。注目すべきことに、検出不能な治療後ｃｔＤＮＡを有する患者間のこれらの
再発は、最後の収集後に検出可能な治療後ｃｔＤＮＡ（中央値［範囲］：３．０［１．７
～５．２］ヶ月）を有する患者間の４つの再発と比較してかなり遅延した。まとめると、
これらの結果は、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによる血漿のセルフリーＤＮＡメチロームプロ
ファイリングを使用して、根治的治療に対する応答を評価し、急速な再発のリスクが高い
患者を同定することができることを実証している。
【0168】
考察
臨床現場におけるｃｔＤＮＡの広範な実施は、患者全体におよび腫瘍物質の非存在下で
適用することができる方法によって加速され得る。記載される研究において、本発明者ら
は、低ｃｔＤＮＡのＨＮＳＣＣ患者の探索コホート内でのｃｔＤＮＡの腫瘍ナイーブ検出
のためのマルチモーダルゲノムワイドセルフリーＤＮＡプロファイリング技術の能力を評
価した。本発明者らは、一致したＰＢＬの取り込みが、両方の変異（すなわち、ＣＡＰＰ
－Ｓｅｑ）ならびにＤＮＡメチル化（すなわち、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ）を使用してｃ
ｔＤＮＡ検出を改善することを示す。さらに、検出可能および検出不可能なｃｔＤＮＡを
有する患者を層別化するために、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑを利用することによって、本発明者ら
は、ｃｔＤＮＡ由来のメチル化パターンのロバストな同定を達成した。本発明者らは、腫
瘍起源（すなわち、断片の長さの短縮）を反映する血漿のセルフリーＤＮＡの生物物理学
的特性が分子異常および検出プラットフォームにわたって保存されていることを初めて示
した。腫瘍ナイーブｃｔＤＮＡ検出および定量化は複数の臨床用途を見出し、ｃｔＤＮＡ
の存在量およびメチル化パターンの予後関連を調査する。
臨床現場におけるｃｔＤＮＡの広範な実施は、患者全体におよび腫瘍物質の非存在下で
適用することができる方法によって加速され得る。記載される研究において、本発明者ら
は、低ｃｔＤＮＡのＨＮＳＣＣ患者の探索コホート内でのｃｔＤＮＡの腫瘍ナイーブ検出
のためのマルチモーダルゲノムワイドセルフリーＤＮＡプロファイリング技術の能力を評
価した。本発明者らは、一致したＰＢＬの取り込みが、両方の変異（すなわち、ＣＡＰＰ
－Ｓｅｑ）ならびにＤＮＡメチル化（すなわち、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ）を使用してｃ
ｔＤＮＡ検出を改善することを示す。さらに、検出可能および検出不可能なｃｔＤＮＡを
有する患者を層別化するために、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑを利用することによって、本発明者ら
は、ｃｔＤＮＡ由来のメチル化パターンのロバストな同定を達成した。本発明者らは、腫
瘍起源（すなわち、断片の長さの短縮）を反映する血漿のセルフリーＤＮＡの生物物理学
的特性が分子異常および検出プラットフォームにわたって保存されていることを初めて示
した。腫瘍ナイーブｃｔＤＮＡ検出および定量化は複数の臨床用途を見出し、ｃｔＤＮＡ
の存在量およびメチル化パターンの予後関連を調査する。
【0169】
腫瘍ナイーブｃｔＤＮＡ検出は、現在、低いｃｔＤＮＡ存在量のためにいくつかの制限
に遭遇する。最近の研究では、ｃｔＤＮＡの偽陽性検出の主な原因であるクローン造血に
由来する変異を同定するために、対になったＰＢＬおよび／または健常対照血漿がプロフ
ァイリングされている。しかし、直交メトリックの組み込みは、精度および臨床適用性を
さらに改善することができる。ここで、本発明者らは、低いｃｔＤＮＡ存在量を有するＨ
ＮＳＣＣ患者のコホート内での腫瘍ナイーブｃｔＤＮＡ検出のためのマルチモーダルゲノ
ムワイドセルフリーＤＮＡプロファイリング技術の能力を評価した。本発明者らは、変異
ベースおよびメチル化ベースのプロファイリング方法によって検出されたｃｔＤＮＡメト
リック（存在量および断片の長さ）間の高度な一致を実証した。さらに、本発明者らは、
腫瘍ナイーブマルチモーダルｃｔＤＮＡプロファイリングが、ｃｔＤＮＡ存在量とは無関
係の推定予後バイオマーカーを同定することによって、ならびに連続試料中のｃｔＤＮＡ
存在量をモニタリングすることによって値を提示し得ることを示した。
に遭遇する。最近の研究では、ｃｔＤＮＡの偽陽性検出の主な原因であるクローン造血に
由来する変異を同定するために、対になったＰＢＬおよび／または健常対照血漿がプロフ
ァイリングされている。しかし、直交メトリックの組み込みは、精度および臨床適用性を
さらに改善することができる。ここで、本発明者らは、低いｃｔＤＮＡ存在量を有するＨ
ＮＳＣＣ患者のコホート内での腫瘍ナイーブｃｔＤＮＡ検出のためのマルチモーダルゲノ
ムワイドセルフリーＤＮＡプロファイリング技術の能力を評価した。本発明者らは、変異
ベースおよびメチル化ベースのプロファイリング方法によって検出されたｃｔＤＮＡメト
リック（存在量および断片の長さ）間の高度な一致を実証した。さらに、本発明者らは、
腫瘍ナイーブマルチモーダルｃｔＤＮＡプロファイリングが、ｃｔＤＮＡ存在量とは無関
係の推定予後バイオマーカーを同定することによって、ならびに連続試料中のｃｔＤＮＡ
存在量をモニタリングすることによって値を提示し得ることを示した。
【0170】
ｃｔＤＮＡの腫瘍ナイーブ検出は、研究および臨床の両方の状況において多くの実用的
な利点を有する。最近の研究では、感度を改善するために、初期疾患における低い存在量
で同定されたｃｔＤＮＡ由来領域の検証のために一致した腫瘍プロファイリングが利用さ
れている。しかし、これらのアプローチの１つの制限は、腫瘍のサンプリング不均一性に
起因して失われる情報領域の数であり、これは、以前にサンプリングされていないサブク
ローンに由来する処置後ｃｔＤＮＡに適用された場合にさらに悪化し得る。さらに、これ
らの腫瘍の情報に基づく検出方法の臨床的利点は、非侵襲性液体生検の主な強度の１つを
回避して、生検によって容易に入手可能ながんに限定される。腫瘍ナイーブマルチモーダ
ルプロファイリング戦略を利用することによって、本発明者らは、腫瘍の情報に基づく方
法の欠点なしに早期がんにおいて同様の結果を達成した。
な利点を有する。最近の研究では、感度を改善するために、初期疾患における低い存在量
で同定されたｃｔＤＮＡ由来領域の検証のために一致した腫瘍プロファイリングが利用さ
れている。しかし、これらのアプローチの１つの制限は、腫瘍のサンプリング不均一性に
起因して失われる情報領域の数であり、これは、以前にサンプリングされていないサブク
ローンに由来する処置後ｃｔＤＮＡに適用された場合にさらに悪化し得る。さらに、これ
らの腫瘍の情報に基づく検出方法の臨床的利点は、非侵襲性液体生検の主な強度の１つを
回避して、生検によって容易に入手可能ながんに限定される。腫瘍ナイーブマルチモーダ
ルプロファイリング戦略を利用することによって、本発明者らは、腫瘍の情報に基づく方
法の欠点なしに早期がんにおいて同様の結果を達成した。
【0171】
これは、限局性がん患者のコホートからのｃｔＤＮＡの包括的検出のために変異および
メチル化プロファイリングを利用する最初の研究である。このマルチモーダルプロファイ
リングアプローチを他のがんのタイプおよび疾患状況に拡張することは、液体生検の継続
的な開発にとって重要である。さらに、ＨＮＳＣＣにおける多数のｃｔＤＮＡ研究が、変
異、メチル化またはＨＰＶプロファイリングに基づく検出方法を利用して記載されている
が、本発明者らは、これまでに知られている標的（すなわち、ＴＰ５３変異またはＳＥＰ
Ｔ９／ＳＨＯＸ２メチル化）を同定するゲノムワイド変異／メチル化プロファイリング法
の最初の適用を、より少ない／未調査の標的に加えて記載した。
メチル化プロファイリングを利用する最初の研究である。このマルチモーダルプロファイ
リングアプローチを他のがんのタイプおよび疾患状況に拡張することは、液体生検の継続
的な開発にとって重要である。さらに、ＨＮＳＣＣにおける多数のｃｔＤＮＡ研究が、変
異、メチル化またはＨＰＶプロファイリングに基づく検出方法を利用して記載されている
が、本発明者らは、これまでに知られている標的（すなわち、ＴＰ５３変異またはＳＥＰ
Ｔ９／ＳＨＯＸ２メチル化）を同定するゲノムワイド変異／メチル化プロファイリング法
の最初の適用を、より少ない／未調査の標的に加えて記載した。
【0172】
ｃｔＤＮＡの腫瘍ナイーブ検出は、研究および臨床の両方の状況において多くの実用的
な利点を有している。腫瘍変異プロファイリングは、低い存在量でｃｔＤＮＡ検出のため
の患者特異的マーカーを同定することができるが、そのような個別化アプローチは、十分
な変異の負荷を有するがんのタイプから得る高純度腫瘍試料に依存する。個別化アッセイ
設計のための変異プロファイリングは、費用および時間がかかる可能性があり、また、原
発腫瘍内または転移性クローンにわたるゲノム不均一性の説明をとなることがまれである
。さらに、腫瘍組織へのアクセスに依存するｃｔＤＮＡ検出方法は、非侵襲性液体生検の
重要な利点を減少させる。独立したセルフリーＤＮＡ特性を統合することにより、本発明
者らは、腫瘍の情報に基づく方法の欠点なしに、初期段階のがんにおける高感度のｃｔＤ
ＮＡの検出を達成した。
な利点を有している。腫瘍変異プロファイリングは、低い存在量でｃｔＤＮＡ検出のため
の患者特異的マーカーを同定することができるが、そのような個別化アプローチは、十分
な変異の負荷を有するがんのタイプから得る高純度腫瘍試料に依存する。個別化アッセイ
設計のための変異プロファイリングは、費用および時間がかかる可能性があり、また、原
発腫瘍内または転移性クローンにわたるゲノム不均一性の説明をとなることがまれである
。さらに、腫瘍組織へのアクセスに依存するｃｔＤＮＡ検出方法は、非侵襲性液体生検の
重要な利点を減少させる。独立したセルフリーＤＮＡ特性を統合することにより、本発明
者らは、腫瘍の情報に基づく方法の欠点なしに、初期段階のがんにおける高感度のｃｔＤ
ＮＡの検出を達成した。
【0173】
本発明者らの分析では、本発明者らは、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑを使用してｃｔＤＮＡ
由来のメチル化パターンを同定するために、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑによって、検出可能なｃｔ
ＤＮＡを有する患者を選択した。このアプローチにより、本発明者らのコホートにおける
血漿のセルフリーＤＮＡの腫瘍由来の性質のさらなる検証がなされた。ｃｔＤＮＡメチル
化パターンは、ｃｔＤＮＡ変異と同様の方法でｃｔＤＮＡの存在量を定量することができ
た。さらに、メチル化パターンは、腫瘍起源を明らかにし、推定予後および動的バイオマ
ーカーを同定した。ＣＡＰＰ－ＳｅｑとｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑとの組み合わせは、低い
存在量ｃｔＤＮＡの詳細な分子的な特性評価を可能にした。変異に基づくｃｔＤＮＡ定量
化は、血漿中のＨＮＳＣＣ特異的過剰ＤＭＲの発見に寄与し、その一部はｃｔＤＮＡ存在
量を調整した後でも予後であることが確認された。したがって、変異およびメチル化の同
時プロファイリングは、定量的、組織特異的、および予後のｃｔＤＮＡバイオマーカーを
明らかにすることによって、互いに補完することができる。さらに、メチロームプロファ
イリングは、再発性またはクローン性変異がほとんどないがんのタイプにおいて特に有用
であることを判明し得る。
由来のメチル化パターンを同定するために、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑによって、検出可能なｃｔ
ＤＮＡを有する患者を選択した。このアプローチにより、本発明者らのコホートにおける
血漿のセルフリーＤＮＡの腫瘍由来の性質のさらなる検証がなされた。ｃｔＤＮＡメチル
化パターンは、ｃｔＤＮＡ変異と同様の方法でｃｔＤＮＡの存在量を定量することができ
た。さらに、メチル化パターンは、腫瘍起源を明らかにし、推定予後および動的バイオマ
ーカーを同定した。ＣＡＰＰ－ＳｅｑとｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑとの組み合わせは、低い
存在量ｃｔＤＮＡの詳細な分子的な特性評価を可能にした。変異に基づくｃｔＤＮＡ定量
化は、血漿中のＨＮＳＣＣ特異的過剰ＤＭＲの発見に寄与し、その一部はｃｔＤＮＡ存在
量を調整した後でも予後であることが確認された。したがって、変異およびメチル化の同
時プロファイリングは、定量的、組織特異的、および予後のｃｔＤＮＡバイオマーカーを
明らかにすることによって、互いに補完することができる。さらに、メチロームプロファ
イリングは、再発性またはクローン性変異がほとんどないがんのタイプにおいて特に有用
であることを判明し得る。
【0174】
以前の研究と同様に、本発明者らはまた、変異およびメチル化ベースのアプローチの両
方を使用して、健常なドナーのセルフリーＤＮＡと比較しながら、ｃｔＤＮＡ断片の長さ
の減少を観察した。一貫して平均的な約１６６～１６７ｂｐである健常なセルフリーＤＮ
Ａとは異なり、患者間のｃｔＤＮＡの長さは非常に可変であり得る。ｃｔＤＮＡ断片の長
さに影響を及ぼす因子としては、位置依存的断片化４９、転移性疾患対非転移性疾患７３
、ならびに健常なセルフリーＤＮＡ断片化に関与する様々な細胞内／細胞外ＤＮａｓｅの
調節不全動態７４が挙げられ得る。興味深いことに、本発明者らは、両方の技術が異なる
領域および腫瘍由来の異常を探査しているにもかかわらず、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑおよびｃｆ
ＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによって同定されたｃｔＤＮＡの断片の長さ間の高い一致を、適格な
患者について観察した。これらの説得力のあるデータで、がん患者における血漿のセルフ
リーＤＮＡ断片化の関連性および再現性に関するさらなる証拠が得られる。
方を使用して、健常なドナーのセルフリーＤＮＡと比較しながら、ｃｔＤＮＡ断片の長さ
の減少を観察した。一貫して平均的な約１６６～１６７ｂｐである健常なセルフリーＤＮ
Ａとは異なり、患者間のｃｔＤＮＡの長さは非常に可変であり得る。ｃｔＤＮＡ断片の長
さに影響を及ぼす因子としては、位置依存的断片化４９、転移性疾患対非転移性疾患７３
、ならびに健常なセルフリーＤＮＡ断片化に関与する様々な細胞内／細胞外ＤＮａｓｅの
調節不全動態７４が挙げられ得る。興味深いことに、本発明者らは、両方の技術が異なる
領域および腫瘍由来の異常を探査しているにもかかわらず、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑおよびｃｆ
ＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによって同定されたｃｔＤＮＡの断片の長さ間の高い一致を、適格な
患者について観察した。これらの説得力のあるデータで、がん患者における血漿のセルフ
リーＤＮＡ断片化の関連性および再現性に関するさらなる証拠が得られる。
【0175】
本発明者らは、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑによる検出可能なｃｔＤＮＡまたはｃｆＭｅＤＩＰ－
ｓｅｑによる上昇したｃｔＤＮＡ存在量が、本発明者らのＨＮＳＣＣコホート内の予後不
良と関連することを観察した。これらの結果は、メチル化によるｃｔＤＮＡの検出５６、
ならびにコピー数収差による存在量の増加７５またはＨＰＶ検出７６が高いリスクの患者
を同定した以前のＨＮＳＣＣ ｃｔＤＮＡ研究に従っている。腫瘍病期との不完全な関連
があり、腫瘍生物学の他の測定されていない特徴がｃｔＤＮＡ存在量に寄与し得ることを
示唆している。
ｓｅｑによる上昇したｃｔＤＮＡ存在量が、本発明者らのＨＮＳＣＣコホート内の予後不
良と関連することを観察した。これらの結果は、メチル化によるｃｔＤＮＡの検出５６、
ならびにコピー数収差による存在量の増加７５またはＨＰＶ検出７６が高いリスクの患者
を同定した以前のＨＮＳＣＣ ｃｔＤＮＡ研究に従っている。腫瘍病期との不完全な関連
があり、腫瘍生物学の他の測定されていない特徴がｃｔＤＮＡ存在量に寄与し得ることを
示唆している。
【0176】
本発明者らの知る限りでは、ｃｔＤＮＡ検出／存在量とは無関係に、おそらく部分的に
は一般的に使用されるｃｔＤＮＡ検出方法の制限のために、ＨＮＳＣＣのセルフリーＤＮ
Ａにおける予後領域を以前に同定した研究はない。本発明者らは、セルフリーＤＮＡメチ
ロームプロファイルが、ＴＣＧＡデータと併せて、ＨＮＳＣＣにおける新規予後メチル化
バイオマーカーを同定する発見ツールとして役立ち得ることを実証した。５つのＤＭＲか
ら構成される複合体メチル化スコアは、メチル化検出プラットフォーム（ｈｍ４５０ｋお
よびｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ）およびバイオスペシメンタイプ（腫瘍組織および血漿のセ
ルフリーＤＮＡ）にわたって一貫した予後関連性を実証した。本発明者らの知見を検証す
るためには将来より大きなコホートが必要であるが、この研究は、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅ
ｑによるメチル化領域のゲノムワイドな同定が、新規の予後バイオマーカーの発見を可能
にし得ることを示している。
は一般的に使用されるｃｔＤＮＡ検出方法の制限のために、ＨＮＳＣＣのセルフリーＤＮ
Ａにおける予後領域を以前に同定した研究はない。本発明者らは、セルフリーＤＮＡメチ
ロームプロファイルが、ＴＣＧＡデータと併せて、ＨＮＳＣＣにおける新規予後メチル化
バイオマーカーを同定する発見ツールとして役立ち得ることを実証した。５つのＤＭＲか
ら構成される複合体メチル化スコアは、メチル化検出プラットフォーム（ｈｍ４５０ｋお
よびｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ）およびバイオスペシメンタイプ（腫瘍組織および血漿のセ
ルフリーＤＮＡ）にわたって一貫した予後関連性を実証した。本発明者らの知見を検証す
るためには将来より大きなコホートが必要であるが、この研究は、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅ
ｑによるメチル化領域のゲノムワイドな同定が、新規の予後バイオマーカーの発見を可能
にし得ることを示している。
【0177】
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑのパフォーマンスを、疾患の予後と関連して評価した。治療後
約０．２％超のｃｔＤＮＡのストリンジェントな閾値を検出可能な疾患として適用するこ
とにより、本発明者らは９人の患者のうち４人について疾患の再発を予測することができ
た。検出可能なｃｔＤＮＡを治療後に有することができなかった再発した（ｎ＝４）また
は持続性疾患を有した（ｎ＝１）残りの５人の患者について、本発明者らは典型的には再
発までの時間がより長いことを観察し、これらの時点でのｃｔＤＮＡの画分がｃｆＭｅＤ
ＩＰ－ｓｅｑの検出の下限を下回っていた可能性があることを示唆した。腫瘍ナイーブ疾
患の監視のためにｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑを利用するその後の研究では、治療後のより頻
繁な血漿の収集が、これらの限界に対処するのに役立ち得る。
約０．２％超のｃｔＤＮＡのストリンジェントな閾値を検出可能な疾患として適用するこ
とにより、本発明者らは９人の患者のうち４人について疾患の再発を予測することができ
た。検出可能なｃｔＤＮＡを治療後に有することができなかった再発した（ｎ＝４）また
は持続性疾患を有した（ｎ＝１）残りの５人の患者について、本発明者らは典型的には再
発までの時間がより長いことを観察し、これらの時点でのｃｔＤＮＡの画分がｃｆＭｅＤ
ＩＰ－ｓｅｑの検出の下限を下回っていた可能性があることを示唆した。腫瘍ナイーブ疾
患の監視のためにｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑを利用するその後の研究では、治療後のより頻
繁な血漿の収集が、これらの限界に対処するのに役立ち得る。
【0178】
本発明者らは、限局性疾患およびＨＮＳＣＣにおけるマルチモーダルプロファイリング
の潜在的な臨床的有用性を実証しているので、これらの方法は、様々ながんのタイプを有
する患者のための将来のバイオマーカー発見および最終的には臨床的有用性に寄与する。
この研究は、複数の顕著な貢献をしている。第１に、セルフリーＤＮＡ変異、メチル化お
よび断片の長さの分析を組み合わせていることである。さらに、本発明者らは、ＨＮＳＣ
Ｃ患者およびリスクが一致する健常対照の両方からの血漿試料および対にされたＰＢＬを
、体系的にプロファイリングした。これらの分析は、ｃｔＤＮＡの検出および特性評価の
ためのマルチモーダルプロファイリングの最適な取り扱いに関する重要な洞察を明らかに
した。例えば、寄与するメチル化シグナルを白血球から除去し、断片の長さの特性を使用
して腫瘍由来のメチル化を濃縮する本発明者らの独自のアプローチは、将来の研究にとっ
て有用なものであることが判明するであろう。
の潜在的な臨床的有用性を実証しているので、これらの方法は、様々ながんのタイプを有
する患者のための将来のバイオマーカー発見および最終的には臨床的有用性に寄与する。
この研究は、複数の顕著な貢献をしている。第１に、セルフリーＤＮＡ変異、メチル化お
よび断片の長さの分析を組み合わせていることである。さらに、本発明者らは、ＨＮＳＣ
Ｃ患者およびリスクが一致する健常対照の両方からの血漿試料および対にされたＰＢＬを
、体系的にプロファイリングした。これらの分析は、ｃｔＤＮＡの検出および特性評価の
ためのマルチモーダルプロファイリングの最適な取り扱いに関する重要な洞察を明らかに
した。例えば、寄与するメチル化シグナルを白血球から除去し、断片の長さの特性を使用
して腫瘍由来のメチル化を濃縮する本発明者らの独自のアプローチは、将来の研究にとっ
て有用なものであることが判明するであろう。
【0179】
結論として、本発明者らは、ｃｔＤＮＡの腫瘍ナイーブＣＡＰＰ－Ｓｅｑプロファイリ
ングが、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによるｃｔＤＮＡ由来のメチル化の高い信頼性の同定を
可能にすることを実証する。ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによるエピジェネティックプロファ
イリングの強度を利用して、本発明者らはさらに、これらのｃｔＤＮＡ由来メチル化領域
が腫瘍の起源、予後、および治療の反応のマーカーとしての可能性を実証することを示す
。本発明者らがＨＮＳＣＣにおけるｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによるｃｔＤＮＡ検出の改善
された感度について記載したいくつかのアプローチ、例えばＰＢＬ枯渇ウィンドウおよび
短い断片への分析の制限を組み込むことがまた、臨床的利益のために、様々な他の限局性
がんに適用され得る。開示されたフレームワークは、腫瘍組織の利用可能性が制限される
他の臨床状況に広く適用可能である。
ングが、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによるｃｔＤＮＡ由来のメチル化の高い信頼性の同定を
可能にすることを実証する。ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによるエピジェネティックプロファ
イリングの強度を利用して、本発明者らはさらに、これらのｃｔＤＮＡ由来メチル化領域
が腫瘍の起源、予後、および治療の反応のマーカーとしての可能性を実証することを示す
。本発明者らがＨＮＳＣＣにおけるｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによるｃｔＤＮＡ検出の改善
された感度について記載したいくつかのアプローチ、例えばＰＢＬ枯渇ウィンドウおよび
短い断片への分析の制限を組み込むことがまた、臨床的利益のために、様々な他の限局性
がんに適用され得る。開示されたフレームワークは、腫瘍組織の利用可能性が制限される
他の臨床状況に広く適用可能である。
【0180】
本発明の好ましい実施形態を本明細書で説明したが、本発明の精神または添付の特許請
求の範囲から逸脱することなく、本発明に変更を加えることができることは当業者には理
解されよう。以下の参考文献にあるものを含む、本明細書に開示されるすべての文書は、
参照により組み込まれる。
求の範囲から逸脱することなく、本発明に変更を加えることができることは当業者には理
解されよう。以下の参考文献にあるものを含む、本明細書に開示されるすべての文書は、
参照により組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【手続補正書】
【提出日】2024-07-19
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象のがん細胞から循環腫瘍デオキシリボ核酸（ｃｔＤＮＡ）が存在することを検出す
る方法であって、
（ａ）前記対象からセルフリーデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の試料を得る工程、
（ｂ）前記試料をライブラリ調製に供して、前記セルフリーメチル化ＤＮＡのその後の
配列決定を可能にする工程、
（ｃ）メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を用いたセルフリーメチル化ＤＮＡ
を捕捉する工程、
（ｄ）前記捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡを配列決定する工程、
（ｅ）健常な個体およびがんの個体由来の対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列を用い
て、前記捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの前記配列をコンピュータ処理する工程、
および
（ｆ）前記捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの１つ以上の配列とがんの個体由来の
セルフリーメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合、がん細胞由来
のＤＮＡの前記存在を同定する工程を含み、
（ｄ）、（ｆ）および（ｇ）の少なくとも１つにおいて、前記対象のセルフリーメチル
化ＤＮＡは、断片の長さのメトリックに従って亜集団に限定される、方法。
る方法であって、
（ａ）前記対象からセルフリーデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の試料を得る工程、
（ｂ）前記試料をライブラリ調製に供して、前記セルフリーメチル化ＤＮＡのその後の
配列決定を可能にする工程、
（ｃ）メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を用いたセルフリーメチル化ＤＮＡ
を捕捉する工程、
（ｄ）前記捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡを配列決定する工程、
（ｅ）健常な個体およびがんの個体由来の対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列を用い
て、前記捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの前記配列をコンピュータ処理する工程、
および
（ｆ）前記捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの１つ以上の配列とがんの個体由来の
セルフリーメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合、がん細胞由来
のＤＮＡの前記存在を同定する工程を含み、
（ｄ）、（ｆ）および（ｇ）の少なくとも１つにおいて、前記対象のセルフリーメチル
化ＤＮＡは、断片の長さのメトリックに従って亜集団に限定される、方法。
【外国語明細書】