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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024126464
(43)【公開日】2024-09-20
(54)【発明の名称】－ＳＨ基含有化合物検出型ラマンプローブ
(51)【国際特許分類】
G01N 21/65 20060101AFI20240912BHJP
C09B 11/28 20060101ALI20240912BHJP
C07F 7/10 20060101ALI20240912BHJP
【ＦＩ】
G01N21/65
C09B11/28 E CSP
C07F7/10 V
C07F7/10 Q
【審査請求】未請求
【請求項の数】15
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023034848
(22)【出願日】2023-03-07
(71)【出願人】
【識別番号】304021417
【氏名又は名称】国立大学法人東京工業大学
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100172683
【弁理士】
【氏名又は名称】綾 聡平
(74)【代理人】
【識別番号】100219265
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 崇大
(74)【代理人】
【識別番号】100203208
【弁理士】
【氏名又は名称】小笠原 洋平
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】神谷 真子
(72)【発明者】
【氏名】村尾 侑大
(72)【発明者】
【氏名】藤岡 礼任
(72)【発明者】
【氏名】河谷 稔
【テーマコード（参考）】
2G043
4H049
【Ｆターム（参考）】
2G043AA01
2G043BA14
2G043CA03
2G043DA02
2G043EA04
2G043KA01
2G043KA02
4H049VN01
4H049VP01
4H049VQ67
4H049VQ84
4H049VR24
4H049VW02
(57)【要約】
【解決課題】
新規な－ＳＨ基含有化合物（例えば、グルタチオン）検出型ラマンプローブを提供すること。
【解決手段】
－ＳＨ基を含有する化合物を検出する方法であって、
（ａ）以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を、－ＳＨ基を含有する化合物と接触させる工程、及び
（ｂ）一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩が－ＳＨ基を含有する化合物と反応することにより変化するラマン散乱光を測定する工程
を含む、当該方法。
新規な－ＳＨ基含有化合物（例えば、グルタチオン）検出型ラマンプローブを提供すること。
【解決手段】
－ＳＨ基を含有する化合物を検出する方法であって、
（ａ）以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を、－ＳＨ基を含有する化合物と接触させる工程、及び
（ｂ）一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩が－ＳＨ基を含有する化合物と反応することにより変化するラマン散乱光を測定する工程
を含む、当該方法。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
－ＳＨ基を含有する化合物を検出する方法であって、
（ａ）以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を、－ＳＨ基を含有する化合物と接触させる工程、及び
（ｂ）一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩が－ＳＨ基を含有する化合物と反応することにより変化するラマン散乱光を測定する工程
を含む、
当該方法。
（式中、
Ｒ１は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＰ（＝Ｏ）Ｒｃから選択され、
ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
Ｒｃは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基である。）
（ａ）以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を、－ＳＨ基を含有する化合物と接触させる工程、及び
（ｂ）一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩が－ＳＨ基を含有する化合物と反応することにより変化するラマン散乱光を測定する工程
を含む、
当該方法。
Ｒ１は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＰ（＝Ｏ）Ｒｃから選択され、
ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
Ｒｃは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基である。）
【請求項2】
Ｒ１の一価の置換基は、芳香族環における２位又は６位の位置に置換基を有しないか、あるいは、２位及び６位の位置に置換基を有しない、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
Ｒ１の一価の置換基は、ベンゼン環における２位及び６位の位置に置換基を有しない、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
一般式（Ｉ）のキサンテン骨格の３位、６位の窒素原子の少なくとも一方の窒素原子上で環構造が形成されている、請求項１に記載の検出方法。
【請求項5】
（ａ）の工程において、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩、以下の一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩、及び－ＳＨ基を含有する化合物を接触させる、請求項１に記載の方法。
（式中、
Ｒ１は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、又は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒａは、芳香族環上の２位及び６位の少なくとも１つの位置に結合している一価の置換基であり；
Ｙは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒｄ）（Ｒｅ）、Ｃ（Ｒｄ）（Ｒｅ）又はＰ（＝Ｏ）Ｒｆから選択され、
ここで、Ｒｄ及びＲｅは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
Ｒｆは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基である。）
Ｒ１は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、又は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒａは、芳香族環上の２位及び６位の少なくとも１つの位置に結合している一価の置換基であり；
Ｙは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒｄ）（Ｒｅ）、Ｃ（Ｒｄ）（Ｒｅ）又はＰ（＝Ｏ）Ｒｆから選択され、
ここで、Ｒｄ及びＲｅは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
Ｒｆは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基である。）
【請求項6】
－ＳＨ基を含有する化合物の濃度を定量的に検出することができる、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
－ＳＨ基を含有する化合物がシステイン残基を有する化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
－ＳＨ基を含有する化合物がグルタチオンである、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、－ＳＨ基を含有する化合物検出用ラマンプローブ。
（式中、
Ｒ１は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＰ（＝Ｏ）Ｒｃから選択され、
ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
Ｒｃは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基である。
Ｒ１は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＰ（＝Ｏ）Ｒｃから選択され、
ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
Ｒｃは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基である。
【請求項10】
以下の一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩を更に含む、請求項９に記載のラマンプローブ。
（式中、
Ｒ１は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、又は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒａは、芳香族環上の２位及び６位の少なくとも１つの位置に結合している一価の置換基であり；
Ｙは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒｄ）（Ｒｅ）、Ｃ（Ｒｄ）（Ｒｅ）又はＰ（＝Ｏ）Ｒｆから選択され、
ここで、Ｒｄ及びＲｅは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
Ｒｆは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基である。）
Ｒ１は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、又は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒａは、芳香族環上の２位及び６位の少なくとも１つの位置に結合している一価の置換基であり；
Ｙは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒｄ）（Ｒｅ）、Ｃ（Ｒｄ）（Ｒｅ）又はＰ（＝Ｏ）Ｒｆから選択され、
ここで、Ｒｄ及びＲｅは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
Ｒｆは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基である。）
【請求項11】
ｅｐｒ－ＳＲＳ法に利用可能な請求項１０に記載のラマンプローブ。
【請求項12】
請求項９又は１０に記載のラマンプローブを含む、－ＳＨ基を含有する化合物の検出用キット。
【請求項13】
請求項９又は１０に記載のラマンプローブを備える、－ＳＨ基を含有する化合物の検出用装置。
【請求項14】
以下の式で表される化合物又はその塩。
【請求項15】
以下の一般式（ＩＩＩ）で表される化合物又はその塩。
（式中、
Ｒ１は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＰ（＝Ｏ）Ｒｃから選択され、
ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
Ｒｃは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基であり；
Ｒ１は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、又は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒａは、芳香族環上の２位及び６位の少なくとも１つの位置に結合している一価の置換基であり；
Ｙは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒｄ）（Ｒｅ）、Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）又はＰ（＝Ｏ）Ｒｆから選択され、
ここで、Ｒｄ及びＲｅは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
Ｒｆは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基であり；
Ｌは、リンカーである。）
Ｒ１は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＰ（＝Ｏ）Ｒｃから選択され、
ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
Ｒｃは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基であり；
Ｒ１は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、又は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒａは、芳香族環上の２位及び６位の少なくとも１つの位置に結合している一価の置換基であり；
Ｙは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒｄ）（Ｒｅ）、Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）又はＰ（＝Ｏ）Ｒｆから選択され、
ここで、Ｒｄ及びＲｅは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
Ｒｆは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基であり；
Ｌは、リンカーである。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は新規な－ＳＨ基含有化合物検出型ラマンプローブに関わる。
【背景技術】
【0002】
生体内の酸化還元レベルを調節する分子としてグルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ、ＧＳＨ）が知られている。ＧＳＨは細胞内に０．５－１０ｍＭで存在しており、生きた細胞でその濃度を迅速に定量する手法が望まれてきた。
【0003】
本発明者らは、これまでに、特定のローダミン誘導体がＧＳＨと可逆的に反応して吸収・蛍光特性を変化させる特性を見出し、生きた細胞で迅速にＧＳＨ濃度を定量可能なＱＧプローブの開発に成功してきた（非特許文献１）。しかしながら、ＧＳＨ濃度を定量するために２つの蛍光色素の蛍光ｒａｔｉｏ値を測定する必要があり、細胞イメージングに汎用される可視光領域を大きく占有してしまうことが課題の１つであった。
【0004】
一方で、分子振動を検出するラマンイメージングは、蛍光イメージングと比べて多色イメージングに秀でたイメージング手法として注目を浴びている。本発明者らが所属する研究室ではこれまでに、ｓｉｌｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎ（１８００―２８００ｃｍ－１）で強いラマン信号を示す９ＣＮ－ｐｙｒｏｎｉｎ（非特許文献２，３）の誘導体がＧＳＨとの反応性を示すことを見出したため、これらがＧＳＨプローブとして利用可能かどうかを評価してきた。その結果，先述したローダミン類のようなＧＳＨとの可逆的な反応が起こるものの、一部不可逆的な分解も起こることが明らかとなり、９ＣＮ－ｐｙｒｏｎｉｎ誘導体を用いて可逆的にＧＳＨ濃度を定量するのは困難であることが示唆されていた（図１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Umezawa, K.; Yoshida, M.; Kamiya, M.; Yamasoba, T.; Urano, Y. Rational Design of Reversible Fluorescent Probes for Live-Cell Imaging and Quantification of Fast Glutathione Dynamics. Nat. Chem. 2017, 9 (3), 279-286.
【非特許文献2】Miao, Y.; Qian, N.; Shi, L.; Hu, F.; Min, W. 9-Cyanopyronin Probe Palette for Super-Multiplexed Vibrational Imaging. Nat. Commun. 2021, 12 (1), 4518.
【非特許文献3】Fujioka, H.; Shou, J.; Kojima, R.; Urano, Y.; Ozeki, Y.; Kamiya, M. Multicolor Activatable Raman Probes for Simultaneous Detection of Plural Enzyme Activities. J. Am. Chem. Soc. 2020, 142 (49), 20701-20707.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、新規な－ＳＨ基含有化合物（例えば、グルタチオン）検出型ラマンプローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
そのような中、本発明者らは前期共鳴（electronic pre-resonance、ＥＰＲ）ラマン条件下におけるキサンテン色素の指紋（fingerprint、ＦＰ）領域の振動が比較的シャープなｓｉｎｇｌｅピークとして検出できることを見出した。さらに、１０位元素の置換を行った誘導体間で当該ピークのラマンシフト値が大きく変化することが実測・計算スペクトルから明らかとなった。以上のことから、１０位元素の置換などの構造展開によって、異なるｒｈｏｄａｍｉｎｅ類をＦＰ領域で分離検出可能であることが示唆された。
【0008】
本発明者らは、これらの知見も勘案して、新規ＧＳＨ定量型ラマンプローブの開発をするために検討したところ、ローダミン骨格の３，６位のＮ原子上の置換基や９位のベンゼン環上の置換基の構造展開によって最適な吸収波長、ＧＳＨ応答性を有する色素母核を得ることができるのではないかと着想して、鋭意検討した結果、ＧＳＨ応答性のローダミン誘導体とＧＳＨ非応答性のローダミン誘導体を開発することができ、本発明を完成した。
【0009】
即ち、本発明は以下の構成を有するものである。
［１］－ＳＨ基を含有する化合物を検出する方法であって、
（ａ）以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を、－ＳＨ基を含有する化合物と接触させる工程、及び
（ｂ）一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩が－ＳＨ基を含有する化合物と反応することにより変化するラマン散乱光を測定する工程
を含む、当該方法。
（式中、
Ｒ１は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＰ（＝Ｏ）Ｒｃから選択され、
ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
Ｒｃは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基である。）
［２］Ｒ１の一価の置換基は、芳香族環における２位又は６位の位置に置換基を有しないか、あるいは、２位及び６位の位置に置換基を有しない、［１］に記載の方法。
［３］Ｒ１の一価の置換基は、ベンゼン環における２位及び６位の位置に置換基を有しない、［２］に記載の方法。
［４］一般式（Ｉ）のキサンテン骨格の３位、６位の窒素原子の少なくとも一方の窒素原子上で環構造が形成されている、［１］～［３］のいずれか１項に記載の検出方法。
［５］（ａ）の工程において、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩、以下の一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩、及び－ＳＨ基を含有する化合物を接触させる、［１］～［４］のいずれか１項に記載の方法。
（式中、
Ｒ１は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、又は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒａは、芳香族環上の２位及び６位の少なくとも１つの位置に結合している一価の置換基であり；
Ｙは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒｄ）（Ｒｅ）、Ｃ（Ｒｄ）（Ｒｅ）又はＰ（＝Ｏ）Ｒｆから選択され、
ここで、Ｒｄ及びＲｅは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
Ｒｆは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基である。）
［６］－ＳＨ基を含有する化合物の濃度を定量的に検出することができる、［１］～［５］のいずれか１項に記載の方法。
［７］－ＳＨ基を含有する化合物がシステイン残基を有する化合物である、［１］～［６］のいずれか１項に記載の方法。
［８］－ＳＨ基を含有する化合物がグルタチオンである、［７］に記載の方法。
［９］以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、－ＳＨ基を含有する化合物検出用ラマンプローブ。
（式中、
Ｒ１は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＰ（＝Ｏ）Ｒｃから選択され、
ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
Ｒｃは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基である。
［１０］以下の一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩を更に含む、［９］に記載のラマンプローブ。
（式中、
Ｒ１は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、又は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒａは、芳香族環上の２位及び６位の少なくとも１つの位置に結合している一価の置換基であり；
Ｙは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒｄ）（Ｒｅ）、Ｃ（Ｒｄ）（Ｒｅ）又はＰ（＝Ｏ）Ｒｆから選択され、
ここで、Ｒｄ及びＲｅは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
Ｒｆは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基である。）
［１１］ｅｐｒ－ＳＲＳ法に利用可能な［１０］に記載のラマンプローブ。
［１２］［９］又は［１０］に記載のラマンプローブを含む、－ＳＨ基を含有する化合物の検出用キット。
［１３］［９］又は［１０］に記載のラマンプローブを備える、－ＳＨ基を含有する化合物の検出用装置。
［１４］以下の式で表される化合物又はその塩。
［１５］以下の一般式（ＩＩＩ）で表される化合物又はその塩。
（式中、
Ｒ１は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＰ（＝Ｏ）Ｒｃから選択され、
ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
Ｒｃは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基であり；
Ｒ１は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、又は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒａは、芳香族環上の２位及び６位の少なくとも１つの位置に結合している一価の置換基であり；
Ｙは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒｄ）（Ｒｅ）、Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）又はＰ（＝Ｏ）Ｒｆから選択され、
ここで、Ｒｄ及びＲｅは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
Ｒｆは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基であり；
Ｌは、リンカーである。）
［１］－ＳＨ基を含有する化合物を検出する方法であって、
（ａ）以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を、－ＳＨ基を含有する化合物と接触させる工程、及び
（ｂ）一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩が－ＳＨ基を含有する化合物と反応することにより変化するラマン散乱光を測定する工程
を含む、当該方法。
Ｒ１は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＰ（＝Ｏ）Ｒｃから選択され、
ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
Ｒｃは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基である。）
［２］Ｒ１の一価の置換基は、芳香族環における２位又は６位の位置に置換基を有しないか、あるいは、２位及び６位の位置に置換基を有しない、［１］に記載の方法。
［３］Ｒ１の一価の置換基は、ベンゼン環における２位及び６位の位置に置換基を有しない、［２］に記載の方法。
［４］一般式（Ｉ）のキサンテン骨格の３位、６位の窒素原子の少なくとも一方の窒素原子上で環構造が形成されている、［１］～［３］のいずれか１項に記載の検出方法。
［５］（ａ）の工程において、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩、以下の一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩、及び－ＳＨ基を含有する化合物を接触させる、［１］～［４］のいずれか１項に記載の方法。
Ｒ１は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、又は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒａは、芳香族環上の２位及び６位の少なくとも１つの位置に結合している一価の置換基であり；
Ｙは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒｄ）（Ｒｅ）、Ｃ（Ｒｄ）（Ｒｅ）又はＰ（＝Ｏ）Ｒｆから選択され、
ここで、Ｒｄ及びＲｅは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
Ｒｆは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基である。）
［６］－ＳＨ基を含有する化合物の濃度を定量的に検出することができる、［１］～［５］のいずれか１項に記載の方法。
［７］－ＳＨ基を含有する化合物がシステイン残基を有する化合物である、［１］～［６］のいずれか１項に記載の方法。
［８］－ＳＨ基を含有する化合物がグルタチオンである、［７］に記載の方法。
［９］以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、－ＳＨ基を含有する化合物検出用ラマンプローブ。
Ｒ１は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＰ（＝Ｏ）Ｒｃから選択され、
ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
Ｒｃは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基である。
［１０］以下の一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩を更に含む、［９］に記載のラマンプローブ。
Ｒ１は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、又は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒａは、芳香族環上の２位及び６位の少なくとも１つの位置に結合している一価の置換基であり；
Ｙは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒｄ）（Ｒｅ）、Ｃ（Ｒｄ）（Ｒｅ）又はＰ（＝Ｏ）Ｒｆから選択され、
ここで、Ｒｄ及びＲｅは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
Ｒｆは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基である。）
［１１］ｅｐｒ－ＳＲＳ法に利用可能な［１０］に記載のラマンプローブ。
［１２］［９］又は［１０］に記載のラマンプローブを含む、－ＳＨ基を含有する化合物の検出用キット。
［１３］［９］又は［１０］に記載のラマンプローブを備える、－ＳＨ基を含有する化合物の検出用装置。
［１４］以下の式で表される化合物又はその塩。
Ｒ１は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＰ（＝Ｏ）Ｒｃから選択され、
ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
Ｒｃは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基であり；
Ｒ１は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、又は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒａは、芳香族環上の２位及び６位の少なくとも１つの位置に結合している一価の置換基であり；
Ｙは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒｄ）（Ｒｅ）、Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）又はＰ（＝Ｏ）Ｒｆから選択され、
ここで、Ｒｄ及びＲｅは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
Ｒｆは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基であり；
Ｌは、リンカーである。）
【発明の効果】
【0010】
本発明により、新規な－ＳＨ基含有化合物検出型ラマンプローブを提供することが可能である。
また、本発明により、－ＳＨ基含有化合物、例えばグルタチオン（ＧＳＨ）応答性のローダミン誘導体とＧＳＨ非応答性のローダミン誘導体とを併用することにより、グルタチオンの濃度を定量的に検出することが可能である。
また、本発明により、－ＳＨ基含有化合物、例えばグルタチオン（ＧＳＨ）応答性のローダミン誘導体とＧＳＨ非応答性のローダミン誘導体とを併用することにより、グルタチオンの濃度を定量的に検出することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】９ＣＮ－ｐｙｒｏｎｉｎの誘導体のＧＳＨとの反応性を模式的に示す。
【図2】一般式（Ｉ）の化合物又はその塩と一般式（ＩＩ）の化合物又はその塩本を併用する発明の検出方法の模式図を示す。
【図3】６種類のＳｉＰ誘導体の化学構造を示す。
【図4】ＤＭＳＯ中で測定したＳｉＰ誘導体の正規化した吸収スペクトル（ａ）及び蛍光スペクトル（ｂ）を示す。
【図5】ＤＭＳＯ中で測定したＳｉＰ誘導体の正規化したＳＲＳスぺクトルを示す。
【図6】Ｋｄ，ＧＳＨ値を最適化するためのＩＳｉＰおよびＴＭＳｉＰの構造進化（構造設計）を示す。
【図7】吸収スペクトルとＳＲＳスペクトルに基づく４ＣＯＯＨ－ＳｉＲ７００による［ＧＳＨ］分析結果を示す。
【図8】吸収スペクトルとＳＲＳスペクトルに基づく４ＣＯＯＨ－２，６ｄｉＭｅ－ＳｉＲ６５０による［ＧＳＨ］分析結果を示す。
【図9】ＳｉＲ７００とＧＳＨの可逆反応の結果を示す。
【図10】ｐＨ７．４の０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中で、４ＣＯＯＨ－ＳｉＲ７００と４ＣＯＯＨ－２，６ｄｉＭｅ－ＳｉＲ６５０のＳＲＳスペクトルの同時検出を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本明細書中において、「アルキル」は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなる脂肪族炭化水素基のいずれであってもよい。アルキル基の炭素数は特に限定されないが、例えば、炭素数１～６個（Ｃ１～６）、炭素数１～１０個（Ｃ１～１０）、炭素数１～１５個（Ｃ１～１５）、炭素数１～２０個（Ｃ１～２０）である。炭素数を指定した場合は、その数の範囲の炭素数を有する「アルキル」を意味する。例えば、Ｃ１～８アルキルには、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ｎｅｏ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、イソヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル等が含まれる。本明細書において、アルキル基は任意の置換基を1個以上有していてもよい。そのような置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシルなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アルキル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アルキル部分を含む他の置換基（例えばアルコシ基、アリールアルキル基など）のアルキル部分についても同様である。
【0013】
本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。
【0014】
本明細書において、ある官能基について「置換されていてもよい」と定義されている場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の個数は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの置換基にはさらに置換基が存在していてもよい。このような例として、例えば、ハロゲン化アルキル基、ジアルキルアミノ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【0015】
本明細書中において、「アリール」は単環式又は縮合多環式の芳香族炭化水素基のいずれであってもよく、環構成原子としてヘテロ原子（例えば、酸素原子、窒素原子、又は硫黄原子など）を１個以上含む芳香族複素環であってもよい。この場合、これを「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族」と呼ぶ場合もある。アリールが単環および縮合環のいずれである場合も、すべての可能な位置で結合しうる。単環式のアリールの非限定的な例としては、フェニル基（Ｐｈ）、チエニル基（２－又は３－チエニル基）、ピリジル基、フリル基、チアゾリル基、オキサゾリル基、ピラゾリル基、２－ピラジニル基、ピリミジニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピリダジニル基、３－イソチアゾリル基、３－イソオキサゾリル基、１，２，４－オキサジアゾール－５－イル基又は１，２，４－オキサジアゾール－３－イル基等が挙げられる。縮合多環式のアリールの非限定的な例としては、１－ナフチル基、２－ナフチル基、１－インデニル基、２－インデニル基、２，３－ジヒドロインデン－１－イル基、２，３－ジヒドロインデン－２－イル基、２－アンスリル基、インダゾリル基、キノリル基、イソキノリル基、１，２－ジヒドロイソキノリル基、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリル基、インドリル基、イソインドリル基、フタラジニル基、キノキサリニル基、ベンゾフラニル基、２，３－ジヒドロベンゾフラン－１－イル基、２，３－ジヒドロベンゾフラン－２－イル基、２，３－ジヒドロベンゾチオフェン－１－イル基、２，３－ジヒドロベンゾチオフェン－２－イル基、ベンゾチアゾリル基、ベンズイミダゾリル基、フルオレニル基又はチオキサンテニル基等が挙げられる。本明細書において、アリール基はその環上に任意の置換基を１個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシルなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アリール基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アリール部分を含む他の置換基（例えばアリールオキシ基やアリールアルキル基など）のアリール部分についても同様である。
【0016】
本明細書中において、「アリールアルキル」は、上記アリールで置換されたアルキルを表す。アリールアルキルは、任意の置換基を１個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシル基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アシル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アリールアルキルの非限定的な例としては、ベンジル基、２－チエニルメチル基、３－チエニルメチル基、２－ピリジルメチル基、３－ピリジルメチル基、４－ピリジルメチル基、２－フリルメチル基、３－フリルメチル基、２－チアゾリルメチル基、４－チアゾリルメチル基、５－チアゾリルメチル基、２－オキサゾリルメチル基、４－オキサゾリルメチル基、５－オキサゾリルメチル基、１－ピラゾリルメチル基、３－ピラゾリルメチル基、４－ピラゾリルメチル基、２－ピラジニルメチル基、２－ピリミジニルメチル基、４－ピリミジニルメチル基、５－ピリミジニルメチル基、１－ピロリルメチル基、２－ピロリルメチル基、３－ピロリルメチル基、１－イミダゾリルメチル基、２－イミダゾリルメチル基、４－イミダゾリルメチル基、３－ピリダジニルメチル基、４－ピリダジニルメチル基、３－イソチアゾリルメチル基、３－イソオキサゾリルメチル基、１，２，４－オキサジアゾール－５－イルメチル基又は１，２，４－オキサジアゾール－３－イルメチル基等が挙げられる。
【0017】
本明細書中において、「アルコキシ基」とは、前記アルキル基が酸素原子に結合した構造であり、例えば直鎖状、分枝状、環状又はそれらの組み合わせである飽和アルコキシ基が挙げられる。例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、イソプロポキシ基、シクロプロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓ－ブトキシ基、ｔ－ブトキシ基、シクロブトキシ基、シクロプロピルメトキシ基、ｎ－ペンチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロプロピルエチルオキシ基、シクロブチルメチルオキシ基、ｎ－ヘキシルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、シクロプロピルプロピルオキシ基、シクロブチルエチルオキシ基又はシクロペンチルメチルオキシ基等が好適な例として挙げられる。
【0018】
１．－ＳＨ基を含有する化合物を検出する方法
本発明の１つの実施態様は、－ＳＨ基を含有する化合物を検出する方法であって、
（ａ）以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を、－ＳＨ基を含有する化合物と接触させる工程、及び
（ｂ）一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩が－ＳＨ基を含有する化合物と反応することにより変化するラマン散乱光を測定する工程
を含む、
当該方法である（以下「本発明の検出方法」とも言う）。
本発明の１つの実施態様は、－ＳＨ基を含有する化合物を検出する方法であって、
（ａ）以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を、－ＳＨ基を含有する化合物と接触させる工程、及び
（ｂ）一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩が－ＳＨ基を含有する化合物と反応することにより変化するラマン散乱光を測定する工程
を含む、
当該方法である（以下「本発明の検出方法」とも言う）。
【0019】
【0020】
本発明の検出方法においては、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩が－ＳＨ基を含有する化合物と反応することにより変化するラマン散乱光を測定する。本発明の検出方法においては、好ましくは、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩が－ＳＨ基を含有する化合物と反応することにより、減弱するラマン散乱光を測定する。
【0021】
一般式（Ｉ）において、Ｒ１は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよい。
【0022】
Ｒ１が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルケニル基、炭素数１～６個のアルキニル基、炭素数１～６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、アミノ基、アミド基、アルキルアミド基からなる群から選ばれることが好ましい。
これらの一価の置換基は更に任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒ１が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ１が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。また、例えばＲ１が示すアミノ基には１個又は２個のアルキル基が存在していてもよく、Ｒ１が示すアミノ基はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基であってもよい。更に、Ｒが示すアルコキシ基が置換基を有する場合としては、例えば、カルボキシ置換アルコキシ基又はアルコキシカルボニル置換アルコキシ基などが挙げられ、より具体的には４－カルボキシブトキシ基又は４－アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基などを挙げることができる。
これらの一価の置換基は更に任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒ１が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ１が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。また、例えばＲ１が示すアミノ基には１個又は２個のアルキル基が存在していてもよく、Ｒ１が示すアミノ基はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基であってもよい。更に、Ｒが示すアルコキシ基が置換基を有する場合としては、例えば、カルボキシ置換アルコキシ基又はアルコキシカルボニル置換アルコキシ基などが挙げられ、より具体的には４－カルボキシブトキシ基又は４－アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基などを挙げることができる。
【0023】
本発明の検出方法においては、ラマンスペクトルの測定は、好適には、ｅｐｒ－ＳＲＳ法によるＳＲＳ測定が行われ、その測定では水中で高濃度（１００μＭ程度）の色素を用いる必要があるため、ベンゼン環上にＲ１として水溶性官能基を導入することが好ましい。水溶性官能基としては、好ましくは、カルボキシ基、スルホ基等が挙げられる。
【0024】
また、式（Ｉ）で表される化合物又はその塩が、－ＳＨ基を含有する化合物との間で求核付加－解離平衡反応を行うことが好ましい。
かかる特性を有するために、式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、９位のベンゼン環上の置換基Ｒ１が特定の位置に導入されることが好ましい。
１つの好ましい態様においては、Ｒ１の一価の置換基は、芳香族環における２位又は６位の位置に置換基を有しない。
また、もう１つの好ましい態様においては、２位及び６位の位置に置換基を有しない。
９位のベンゼン環が置換基Ｒ１との関係で上記のような構造を有することにより、当該ベンゼン環上の置換基の立体障害が減少するため、－ＳＨ基が９位のベンゼン環が結合する位置に求核付加することができ、－ＳＨ基を含有する化合物を有効に検出することができる。また、更に、ラマンスペクトルの強度変化により－ＳＨ基を含有する化合物の濃度を定量的に検出することが可能である。
かかる特性を有するために、式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、９位のベンゼン環上の置換基Ｒ１が特定の位置に導入されることが好ましい。
１つの好ましい態様においては、Ｒ１の一価の置換基は、芳香族環における２位又は６位の位置に置換基を有しない。
また、もう１つの好ましい態様においては、２位及び６位の位置に置換基を有しない。
９位のベンゼン環が置換基Ｒ１との関係で上記のような構造を有することにより、当該ベンゼン環上の置換基の立体障害が減少するため、－ＳＨ基が９位のベンゼン環が結合する位置に求核付加することができ、－ＳＨ基を含有する化合物を有効に検出することができる。また、更に、ラマンスペクトルの強度変化により－ＳＨ基を含有する化合物の濃度を定量的に検出することが可能である。
【0025】
一般式（Ｉ）において、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子である。
Ｒ２及びＲ３の少なくとも１つがアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。例えば、Ｒ２及びＲ３が示すアルキル基は、ハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。
Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ２及びＲ３がともに水素原子である場合、又はＲ２及びＲ３がともにフッ素原子又は塩素原子である場合がより好ましい。
Ｒ２及びＲ３の少なくとも１つがアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。例えば、Ｒ２及びＲ３が示すアルキル基は、ハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。
Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ２及びＲ３がともに水素原子である場合、又はＲ２及びＲ３がともにフッ素原子又は塩素原子である場合がより好ましい。
【0026】
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子である。
Ｒ４及びＲ５の少なくとも１つがアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。例えば、Ｒ４及びＲ５が示すアルキル基は、ハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。
Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ４及びＲ５がともに水素原子である場合、又はＲ４及びＲ５がともにフッ素原子又は塩素原子である場合がより好ましい。
Ｒ４及びＲ５の少なくとも１つがアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。例えば、Ｒ４及びＲ５が示すアルキル基は、ハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。
Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ４及びＲ５がともに水素原子である場合、又はＲ４及びＲ５がともにフッ素原子又は塩素原子である場合がより好ましい。
【0027】
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基である。
また、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基である。
ここで、本発明の検出方法において、好ましくは、一般式（Ｉ）のキサンテン骨格の３位、６位の窒素原子の少なくとも一方の窒素原子上で環構造が形成されている。ＧＳＨ応答性の色素として、キサンテン骨格でこのような環構造を形成することにより、吸収波長がより長くなるため、検出系のノイズなどの影響を受けづらく、検出感度が高く精度よくＧＳＨなどの－ＳＨ基含有化合物を検出することが可能である。
また、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基である。
ここで、本発明の検出方法において、好ましくは、一般式（Ｉ）のキサンテン骨格の３位、６位の窒素原子の少なくとも一方の窒素原子上で環構造が形成されている。ＧＳＨ応答性の色素として、キサンテン骨格でこのような環構造を形成することにより、吸収波長がより長くなるため、検出系のノイズなどの影響を受けづらく、検出感度が高く精度よくＧＳＨなどの－ＳＨ基含有化合物を検出することが可能である。
【0028】
本発明の検出方法の１つの好ましい側面は、一般式（Ｉ）の化合物又はその塩は以下の（１）～（４）のいずれかの構造を有する。
（１）Ｒ６又はＲ７は、Ｒ２又はＲ４と一緒になって、Ｒ６又はＲ７が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成しているか、
（２）Ｒ６及びＲ７は、夫々、Ｒ２及びＲ４と一緒になって、Ｒ６及びＲ７が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成しており、
該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、
（３）Ｒ８又はＲ９は、Ｒ３又はＲ５と一緒になって、Ｒ８又はＲ９が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成しているか、あるいは
（４）Ｒ８及びＲ９は、夫々、Ｒ３及びＲ５と一緒になって、Ｒ８及びＲ９が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成しており、又は
該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよい、
（１）Ｒ６又はＲ７は、Ｒ２又はＲ４と一緒になって、Ｒ６又はＲ７が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成しているか、
（２）Ｒ６及びＲ７は、夫々、Ｒ２及びＲ４と一緒になって、Ｒ６及びＲ７が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成しており、
該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、
（３）Ｒ８又はＲ９は、Ｒ３又はＲ５と一緒になって、Ｒ８又はＲ９が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成しているか、あるいは
（４）Ｒ８及びＲ９は、夫々、Ｒ３及びＲ５と一緒になって、Ｒ８及びＲ９が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成しており、又は
該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよい、
【0029】
本発明の検出方法の１つのより好ましい側面は、一般式（Ｉ）の化合物又はその塩は以下の構造を有する。
（１）Ｒ６又はＲ７は、Ｒ２又はＲ４と一緒になって、Ｒ６又はＲ７が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成しているか、あるいは
（２）Ｒ６及びＲ７は、夫々、Ｒ２及びＲ４と一緒になって、Ｒ６及びＲ７が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成しており、
該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、
及び
（３）Ｒ８又はＲ９は、Ｒ３又はＲ５と一緒になって、Ｒ８又はＲ９が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成しているか、あるいは
（４）Ｒ８及びＲ９は、夫々、Ｒ３及びＲ５と一緒になって、Ｒ８及びＲ９が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成しており、
該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよい。
（１）Ｒ６又はＲ７は、Ｒ２又はＲ４と一緒になって、Ｒ６又はＲ７が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成しているか、あるいは
（２）Ｒ６及びＲ７は、夫々、Ｒ２及びＲ４と一緒になって、Ｒ６及びＲ７が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成しており、
該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、
及び
（３）Ｒ８又はＲ９は、Ｒ３又はＲ５と一緒になって、Ｒ８又はＲ９が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成しているか、あるいは
（４）Ｒ８及びＲ９は、夫々、Ｒ３及びＲ５と一緒になって、Ｒ８及びＲ９が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成しており、
該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよい。
【0030】
本発明の検出方法の１つの更に好ましい側面は、一般式（Ｉ）の化合物又はその塩は以下の構造を有する。
（２）Ｒ６及びＲ７は、夫々、Ｒ２及びＲ４と一緒になって、Ｒ６及びＲ７が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成しており、
該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、
及び
（４）Ｒ８及びＲ９は、夫々、Ｒ３及びＲ５と一緒になって、Ｒ８及びＲ９が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成しており、
該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよい。
（２）Ｒ６及びＲ７は、夫々、Ｒ２及びＲ４と一緒になって、Ｒ６及びＲ７が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成しており、
該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、
及び
（４）Ｒ８及びＲ９は、夫々、Ｒ３及びＲ５と一緒になって、Ｒ８及びＲ９が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成しており、
該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよい。
【0031】
上記のヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。
また、このようにして形成されるヘテロシクリル又はヘテロアリールとしては、例えば、ピロリジン、ピペリジン、ヘキサメチレンイミン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、チアゾールなどが挙げられるが、これらに限定されない。
また、このようにして形成されるヘテロシクリル又はヘテロアリールとしては、例えば、ピロリジン、ピペリジン、ヘキサメチレンイミン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、チアゾールなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0032】
一般式（Ｉ）において、Ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＰ（＝Ｏ）Ｒｃから選択される。
ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又は置換基を有していてもよいアリール基である。
また、Ｒｃは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基である。
ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又は置換基を有していてもよいアリール基である。
また、Ｒｃは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基である。
【0033】
本発明の検出方法の好ましい態様においては、（ａ）の工程において、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩、以下の一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩、及び－ＳＨ基を含有する化合物を接触させる。
【0034】
【0035】
一般式（ＩＩ）の化合物又はその塩においては、Ｒａは、芳香族環上の２位及び６位の少なくとも１つの位置に結合しており、好ましくは、香族環上の２位及び６位の両方の位置に結合している。これにより、９位のベンゼン環上の置換基の立体障害が増大するため、－ＳＨ基が９位のベンゼン環が結合する位置に求核付加することができず、－ＳＨ基を含有する化合物と非反応性（非応答性）となす。その結果、一般式（ＩＩ）の化合物又はその塩は、－ＳＨ基を含有する化合物の存在に関わらず、そのラマン強度が一定になる。そして、前述した一般式（Ｉ）の化合物又はその塩が、－ＳＨ基を含有する化合物の存在（好ましくは、その濃度）によってラマン強度が変化するため、両化合物のラマン強度を対比することにより、－ＳＨ基を含有する化合物の濃度の定量的な検出が可能となる。一般式（Ｉ）の化合物又はその塩と一般式（ＩＩ）の化合物又はその塩を併用する場合の本発明の検出方法の模式図を図２に示す。
【0036】
一般式（ＩＩ）において、Ｒ１は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよい。
【0037】
Ｒ１が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルケニル基、炭素数１～６個のアルキニル基、炭素数１～６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、アミノ基、アミド基、アルキルアミド基からなる群から選ばれることが好ましい。
これらの一価の置換基は更に任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒ１が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ１が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。また、例えばＲ１が示すアミノ基には１個又は２個のアルキル基が存在していてもよく、Ｒ１が示すアミノ基はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基であってもよい。更に、Ｒが示すアルコキシ基が置換基を有する場合としては、例えば、カルボキシ置換アルコキシ基又はアルコキシカルボニル置換アルコキシ基などが挙げられ、より具体的には４－カルボキシブトキシ基又は４－アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基などを挙げることができる。
これらの一価の置換基は更に任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒ１が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ１が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。また、例えばＲ１が示すアミノ基には１個又は２個のアルキル基が存在していてもよく、Ｒ１が示すアミノ基はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基であってもよい。更に、Ｒが示すアルコキシ基が置換基を有する場合としては、例えば、カルボキシ置換アルコキシ基又はアルコキシカルボニル置換アルコキシ基などが挙げられ、より具体的には４－カルボキシブトキシ基又は４－アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基などを挙げることができる。
【0038】
本発明の検出方法においては、ラマンスペクトルの測定は、好適には、ｅｐｒ－ＳＲＳ法によるＳＲＳ測定が行われ、その測定では水中で高濃度（１００μＭ程度）の色素を用いる必要があるため、ベンゼン環上にＲ１として水溶性官能基を導入することが好ましい。水溶性官能基としては、好ましくは、カルボキシ基、スルホ基等が挙げられる。
【0039】
また、上記したように、式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩においては、Ｒａの一価の置換基が、芳香族環上の２位及び６位の少なくとも１つの位置に結合しており、好ましくは、香族環上の２位及び６位の両方の位置に結合している。これにより、９位のベンゼン環上の置換基の立体障害が増大する。
Ｒａの一価の置換基としては、炭素数１～６の置換又は無置換のアルキル基、炭素数１～６の置換又は無置換のアルコキシ基、ニトリル基、ハロゲン原子（好ましくは、フッ素原子、塩素原子）等が好ましい。また、当該アルキル基、アルコキシ基が有することができる置換基としては、ハロゲン原子等が挙げられる。
Ｒａの一価の置換基としては、炭素数１～６の置換又は無置換のアルキル基、炭素数１～６の置換又は無置換のアルコキシ基、ニトリル基、ハロゲン原子（好ましくは、フッ素原子、塩素原子）等が好ましい。また、当該アルキル基、アルコキシ基が有することができる置換基としては、ハロゲン原子等が挙げられる。
【0040】
一般式（Ｉ）において、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子である。
Ｒ２及びＲ３の少なくとも１つがアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。例えば、Ｒ２及びＲ３が示すアルキル基は、ハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。
Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ２及びＲ３がともに水素原子である場合、又はＲ２及びＲ３がともにフッ素原子又は塩素原子である場合がより好ましい。
Ｒ２及びＲ３の少なくとも１つがアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。例えば、Ｒ２及びＲ３が示すアルキル基は、ハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。
Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ２及びＲ３がともに水素原子である場合、又はＲ２及びＲ３がともにフッ素原子又は塩素原子である場合がより好ましい。
【0041】
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子である。
Ｒ４及びＲ５の少なくとも１つがアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。例えば、Ｒ４及びＲ５が示すアルキル基は、ハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。
Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ４及びＲ５がともに水素原子である場合、又はＲ４及びＲ５がともにフッ素原子又は塩素原子である場合がより好ましい。
Ｒ４及びＲ５の少なくとも１つがアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。例えば、Ｒ４及びＲ５が示すアルキル基は、ハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。
Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ４及びＲ５がともに水素原子である場合、又はＲ４及びＲ５がともにフッ素原子又は塩素原子である場合がより好ましい。
【0042】
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基である。
また、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基である。
また、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基である。
【0043】
Ｙは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒｄ）（Ｒｅ）、Ｃ（Ｒｄ）（Ｒｅ）又はＰ（＝Ｏ）Ｒｆから選択される。
ここで、Ｒｄ及びＲｅは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基である。
また、Ｒｆは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基である。
ここで、Ｒｄ及びＲｅは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基である。
また、Ｒｆは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基である。
【0044】
本発明の検出方法においては、好ましくは、－ＳＨ基を含有する化合物の濃度を定量的に検出することができる。
【0045】
一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、本発明においては、これらの物質も用いることができる。
【0046】
一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される化合物は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、本発明においては、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体なども用いることができる。
【0047】
一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される化合物の代表的化合物の製造方法を本明細書の実施例に具体的に示した。従って、当業者は、これらの説明をもとにして、反応原料、反応条件、及び反応試薬などを適宜選択して、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることにより、一般式（Ｉ）、（ＩＩ）で表される化合物を製造することができる。
【0048】
本発明の検出方法は、好ましくはｅｐｒ－ＳＲＳ法を利用して行われる。ｅｐｒ－ＳＲＳ法とは、前期共鳴 (electronic pre-resonance; epr)効果と誘導ラマン散乱 (stimulated Raman scattering; SRS) を組み合わせたラマンイメージング法である。
この方法では、分子の電子吸収帯よりやや長波長側の光によって励起する（前期共鳴条件）ため、光褪色や蛍光によるバックグラウンド上昇を抑えることができ、ストークス光による誘導放出によってさらに高感度なイメージングが実現できる。従来のＳＲＳ顕微鏡ではストークス光の波長変化に秒オーダーの時間がかかるため、スペクトル解析やスペクトルイメージングを行う際には測定時間が長くなってしまうのが課題の１つであったが、東京大学大学院工学系研究科電気系工学専攻の小関研究室で開発された高速ＳＲＳ分光顕微鏡では１秒当たり３０波数分変化させる高速イメージングが可能である（Ozeki, Y., Biological Imaging Based on Stimulated Raman Scattering. Seibutsu Butsuri, 2014. 54(6): p. 311-314）。
高速ＳＲＳ分光顕微鏡を用いるラマンイメージング法は、上記のOzekiの論文を参照して行うことができる。また、高速ＳＲＳ分光顕微鏡でイメージングを行うに際しては、信号対雑音比を高めるため、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの測定ではデータを５～１０回程度、ｉｎ ｃｅｌｌｕｌｏでの測定ではデータを１００～１０００回程度取得して、平均化を行うことが好ましい。
この方法では、分子の電子吸収帯よりやや長波長側の光によって励起する（前期共鳴条件）ため、光褪色や蛍光によるバックグラウンド上昇を抑えることができ、ストークス光による誘導放出によってさらに高感度なイメージングが実現できる。従来のＳＲＳ顕微鏡ではストークス光の波長変化に秒オーダーの時間がかかるため、スペクトル解析やスペクトルイメージングを行う際には測定時間が長くなってしまうのが課題の１つであったが、東京大学大学院工学系研究科電気系工学専攻の小関研究室で開発された高速ＳＲＳ分光顕微鏡では１秒当たり３０波数分変化させる高速イメージングが可能である（Ozeki, Y., Biological Imaging Based on Stimulated Raman Scattering. Seibutsu Butsuri, 2014. 54(6): p. 311-314）。
高速ＳＲＳ分光顕微鏡を用いるラマンイメージング法は、上記のOzekiの論文を参照して行うことができる。また、高速ＳＲＳ分光顕微鏡でイメージングを行うに際しては、信号対雑音比を高めるため、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの測定ではデータを５～１０回程度、ｉｎ ｃｅｌｌｕｌｏでの測定ではデータを１００～１０００回程度取得して、平均化を行うことが好ましい。
【0049】
本発明の検出方法においては、キサンテン色素の指紋領域（fingerprint region；１４００－１７００ｃｍ－１）において検出を行うことから、これに対する励起光は８８８ｎｍであるため、当該ｅｐｒ－ＳＲＳ法の装置を用いる場合は、前期共鳴がかかる波長域がおよそ６５０～７９０ｎｍであるラマンプローブを用いるのが好ましい。
本発明のラマンプローブを用いる検出方法には、上記の高速ＳＲＳ分光顕微鏡を好適に用いることができるが、当該高速ＳＲＳ分光顕微鏡を用いた方法に限定されるものではない。
本発明のラマンプローブを用いる検出方法には、上記の高速ＳＲＳ分光顕微鏡を好適に用いることができるが、当該高速ＳＲＳ分光顕微鏡を用いた方法に限定されるものではない。
【0050】
本発明の検出方法においては、－ＳＨ基を含有する化合物は、好ましくはシステイン残基を有する化合物である。
－ＳＨ基を含有する化合物としては、グルタチオン、タンパク質中のシステイン残基、ホモシステイン、グルタチオンパースルフィド等が挙げられ、好ましくはグルタチオン（ＧＳＨ）である。
－ＳＨ基を含有する化合物としては、グルタチオン、タンパク質中のシステイン残基、ホモシステイン、グルタチオンパースルフィド等が挙げられ、好ましくはグルタチオン（ＧＳＨ）である。
【0051】
細胞内のＧＳＨ濃度は０．５－１０ｍＭとされており、本発明の検出方法においてはこの濃度範囲に対して適切な応答性を有するローダミン色素を使用することが好ましい。ＧＳＨとの応答性の尺度として、Ｋｄ，ＧＳＨを用いると、ＧＳＨ応答性色素である一般式（Ｉ）の化合物又はその塩のＫｄ，ＧＳＨは、好ましくは０．５～１０ｍＭであり、ＧＳＨ非応答性色素である一般式（ＩＩ）の化合物又はその塩のＫｄ，ＧＳＨは、好ましくは＞１０ｍＭである。
【0052】
本発明の検出方法において、通常は、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに上記式（Ｉ）で表される化合物又はそれらの塩、及び、場合により式（ＩＩ）で表される化合物又はそれらの塩を溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、ラマンスペクトルを測定すればよい。本発明のラマンプローブを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤などの添加物と組み合わせることができる。
【0053】
また、本発明の検出方法においては、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む溶液を、細胞又は組織の試料に散布すること等により行うこともできる。この場合、一般式（ＩＩ）で表される化合物又はそれらの塩を、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩と一緒に溶解した溶液を細胞又は組織の試料に散布してもよく、また、一般式（ＩＩ）で表される化合物又はそれらの塩を含む溶液を別に調製して、当該溶液を細胞又は組織の試料に散布してもよい。
【0054】
２．－ＳＨ基を含有する化合物検出用ラマンプローブ
本発明のもう１つの実施形態は、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、－ＳＨ基を含有する化合物検出用ラマンプローブである（以下「本発明のラマンプローブ」とも言う）。
本発明のもう１つの実施形態は、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、－ＳＨ基を含有する化合物検出用ラマンプローブである（以下「本発明のラマンプローブ」とも言う）。
【0055】
【0056】
一般式（Ｉ）の化合物又はその塩の詳細については、本発明の検出方法で詳述した通りである。
【0057】
本発明のラマンプローブは、好ましくは、以下の一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩を更に含む。
【0058】
一般式（ＩＩ）の化合物又はその塩の詳細については、本発明の検出方法で詳述した通りである。
【0059】
本発明のラマンプローブは、好ましくは、ｅｐｒ－ＳＲＳ法に利用可能である。
【0060】
本発明のラマンプローブの使用方法は特に限定されず、従来公知のラマンプローブと同様に用いることが可能である。通常は、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに上記式（Ｉ）で表される化合物又はそれらの塩、式（ＩＩ）で表される化合物又はそれらの塩を溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、ラマンスペクトルを測定すればよい。本発明のラマンプローブを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤などの添加物と組み合わせることができる。
【0061】
本発明のもう１つの実施態様は、本発明のラマンプローブを含む、－ＳＨ基を含有する化合物の検出用キットである。
【0062】
当該キットにおいて、通常、本発明のラマンプローブは溶液として調製されているが、例えば、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供され、使用時に注射用蒸留水や適宜の緩衝液に溶解して適用することもできる。
【0063】
また、当該キットには、必要に応じてそれ以外の試薬等を適宜含んでいてもよい。例えば、添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。
【0064】
本発明のもう１つの実施態様は、本発明のラマンプローブを備える、－ＳＨ基を含有する化合物の検出用装置である。
【0065】
－ＳＨ基を含有する化合物の検出用装置としては、好ましくは、前記した高速ＳＲＳ分光顕微鏡などが挙げられる。
【0066】
３．本発明の化合物
本発明のもう１つの実施形態は、以下の式で表される化合物又はその塩である（以下「本発明の化合物１」とも言う）。
本発明のもう１つの実施形態は、以下の式で表される化合物又はその塩である（以下「本発明の化合物１」とも言う）。
【0067】
また、本発明のもう１つの実施形態は、以下の一般式（ＩＩＩ）で表される化合物又はその塩である（以下「本発明の化合物２」とも言う）。
【0068】
【0069】
一般式（ＩＩＩ）で表される化合物又はその塩は、上記した一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩と、一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩をリンカーで結合した構造を有する。
ここで、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩に関わる構成と、一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩に関わる構成は、本発明の検出方法で詳述した通りである。
ここで、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩に関わる構成と、一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩に関わる構成は、本発明の検出方法で詳述した通りである。
【0070】
リンカーとしては、種々のものを使用することができるが、例えば、アルキレン基（但し、アルキレン基の１以上の－ＣＨ２－は、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、又は－ＣＯ－で置換されていてもよい。）、アリーレン（ヘテロアリーレンを含む）、シクロアルキレン、アルコキシル基、ポリエチレングリコール鎖、及び、これらの基から選択される２種以上の基が任意に結合して構成される基からなる群から選択される。
【0071】
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩と一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩とをリンカーを介して結合させることで，細胞内のGSH濃度を定量可能なラマンプローブの提供が可能となる。
【0072】
本発明の化合物１及び２は、酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。本発明の化合物１及び２は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、本発明においては、これらの物質も用いることができる。
【0073】
本発明の化合物１及び２は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、本発明においては、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体なども用いることができる。
【実施例0074】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0075】
［原料］
合成に使用した全ての化学物質は、東京化成工業（株）、和光純薬工業（株）、シグマアルドリッチ（株）から購入した。 さらに精製することなく使用した。
合成に使用した全ての化学物質は、東京化成工業（株）、和光純薬工業（株）、シグマアルドリッチ（株）から購入した。 さらに精製することなく使用した。
【0076】
［測定機器］
ＮＭＲスペクトルは、重水素化溶媒中を用い、ＪＥＯＬ ＪＮＭ－ＥＣＺＬ４００Ｓ［１Ｈ ４００ＭＨｚ、１３Ｃ １０１ＭＨｚ］で得た。
高分解能ＥＳＩ質量スペクトルは，Ｂｒｕｋｅｒ ｍｉｃｒｏＴＯＦ ＩＩ（ＥＳＩ）で得た。
ＨＰＬＣ精製は、Ｉｎｅｒｔｓｔｉｌ－ＯＤＳ－３カラム（Φ１０×２５０ｍｍ（セミ分取）およびΦ２０×２５０ｍｍ（分取））を備えたＪＡＳＣＯ ＰＵ－２０８０ Ｐｌｕｓポンプ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．、Ｌｔｄ．）およびＭＤ－２０１５検出器（ＪＡＳＣＯ）で行った。
ＨＰＬＣに使用した溶媒は、和光（株）より入手した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、中圧分取液体クロマトグラフＹＦＬＣ－Ａｌ５６０（山善株式会社）を用いて行った。
ＴＬＣは、シリカゲルプレートＦ２５４（０．２５ｍｍ（分析）；Ｍｅｒｃｋ、ＡＫＧ）で行った。
ＵＶ－ｖｉｓスペクトルは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ－１８００分光光度計で得た。
蛍光スペクトルは、Ｆ－７０００ (日立)で取得した。
ＳＲＳスペクトルおよびＳＲＳ像は、東京大学大学院工学系研究科電気系工学専攻小関研究室で開発された高速ＳＲＳ分光顕微鏡で取得した。ポンプ光パルスおよびストークス光パルスの波長は８８８ｎｍおよび１０１４－１０４６ｎｍ、パルス時間幅は約５ピコ秒、スペクトル分解能は５／ｃｍである。水浸対物レンズを用い、その開口数は１．０５である。フレームごとにストークス光パルスの波長を変化させ、５００×５００ピクセルの画像を毎秒３０フレーム取得した。信号対雑音比を高めるためにデータをｉｎ ｖｉｔｒｏで５回取得し、平均化を行った。
ＮＭＲスペクトルは、重水素化溶媒中を用い、ＪＥＯＬ ＪＮＭ－ＥＣＺＬ４００Ｓ［１Ｈ ４００ＭＨｚ、１３Ｃ １０１ＭＨｚ］で得た。
高分解能ＥＳＩ質量スペクトルは，Ｂｒｕｋｅｒ ｍｉｃｒｏＴＯＦ ＩＩ（ＥＳＩ）で得た。
ＨＰＬＣ精製は、Ｉｎｅｒｔｓｔｉｌ－ＯＤＳ－３カラム（Φ１０×２５０ｍｍ（セミ分取）およびΦ２０×２５０ｍｍ（分取））を備えたＪＡＳＣＯ ＰＵ－２０８０ Ｐｌｕｓポンプ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．、Ｌｔｄ．）およびＭＤ－２０１５検出器（ＪＡＳＣＯ）で行った。
ＨＰＬＣに使用した溶媒は、和光（株）より入手した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、中圧分取液体クロマトグラフＹＦＬＣ－Ａｌ５６０（山善株式会社）を用いて行った。
ＴＬＣは、シリカゲルプレートＦ２５４（０．２５ｍｍ（分析）；Ｍｅｒｃｋ、ＡＫＧ）で行った。
ＵＶ－ｖｉｓスペクトルは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ－１８００分光光度計で得た。
蛍光スペクトルは、Ｆ－７０００ (日立)で取得した。
ＳＲＳスペクトルおよびＳＲＳ像は、東京大学大学院工学系研究科電気系工学専攻小関研究室で開発された高速ＳＲＳ分光顕微鏡で取得した。ポンプ光パルスおよびストークス光パルスの波長は８８８ｎｍおよび１０１４－１０４６ｎｍ、パルス時間幅は約５ピコ秒、スペクトル分解能は５／ｃｍである。水浸対物レンズを用い、その開口数は１．０５である。フレームごとにストークス光パルスの波長を変化させ、５００×５００ピクセルの画像を毎秒３０フレーム取得した。信号対雑音比を高めるためにデータをｉｎ ｖｉｔｒｏで５回取得し、平均化を行った。
【0077】
１．ＳｉＰ誘導体の開発検討
キサンテン環の構造によってラマンシフト値が変化しうる可能性（計算でのスペクトル予測など）を考えて、図３に示すような６種類の異なるＳｉＰ骨格を用意してこれらの実測スペクトルを比較することで分離検出可能な色素ペアの探索を行った。
ここで、図３に示す化合物ＱＳｉＰ１の合成手順、化合物ＪＳｉＰ１及びＪＳｉＰ２の機器データを以下に示す。
キサンテン環の構造によってラマンシフト値が変化しうる可能性（計算でのスペクトル予測など）を考えて、図３に示すような６種類の異なるＳｉＰ骨格を用意してこれらの実測スペクトルを比較することで分離検出可能な色素ペアの探索を行った。
ここで、図３に示す化合物ＱＳｉＰ１の合成手順、化合物ＪＳｉＰ１及びＪＳｉＰ２の機器データを以下に示す。
【0078】
［合成例１］
ＱＳｉＰ１の合成
以下のスキームでＱＳｉＰ１を合成した。
ＱＳｉＰ１の合成
以下のスキームでＱＳｉＰ１を合成した。
【0079】
化合物1は既報（Nie, H.; Jing, J.; Tian, Y.; Yang, W.; Zhang, R.; Zhang, X. Reversible and Dynamic Fluorescence Imaging of Cellular Redox Self-Regulation Using Fast-Responsive Near-Infrared Ge-Pyronines. ACS Appl. Mater. Interfaces 2016, 8 (14), 8991-8997.）に基づいて合成した。
【0080】
ＱＳｉＰ１の合成
化合物１（７９．９ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を脱水テトラヒドロフラン５ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気化、－７８℃で攪拌した。１．２Ｍｓｅｃ－ブチルリチウムシクロヘキサン、ｎ－ヘキサン溶液（０．２９ｍＬ、０．３４ｍｍｏｌ、２ ｅｑ）をゆっくり加え、１時間攪拌した。脱水テトラヒドロフラン５ｍＬに溶解させたジクロロジメチルシラン（２２．２ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ、２ｅｑ）をゆっくり添加し、室温に戻して４時間攪拌した。２Ｎ塩酸水溶液を加え、１０分間攪拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えジクロロメタンで３回抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝９７／３→７６／２４）により精製し，ｃｒｕｄｅの化合物２（１９．９ ｍｇ）を得た。得られたｃｒｕｄｅの一部（６．８ｍｇ）をジクロロメタン２ｍＬとメタノール２ｍＬに溶解し，十分量のクロラニルを加え室温で２０分間攪拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ Ａ （Ｈ２Ｏ ｗｉｔｈ １％ ＭｅＣＮ ａｎｄ ０．１％ ＴＦＡ）ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（ＭｅＣＮ ｗｉｔｈ １％ Ｈ２Ｏ））（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ ０／１００ ｆｏｒ ４０ ｍｉｎ）で精製し、ＱＳｉＰ１（４．１ｍｇ、１９％ ｉｎ ２ ｓｔｅｐｓ）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.68 (s, 1H), 7.33 (s, 2H), 7.24 (s, 2H), 3.56 (t, J = 5.6 Hz, 4H), 3.26 (s, 6H), 2.67 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 1.87 (quin, J = 2.0 Hz, 4H), 0.44 (s, 6H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 361.20945, Found, 361.21075 (-1.3 mDa).
化合物１（７９．９ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を脱水テトラヒドロフラン５ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気化、－７８℃で攪拌した。１．２Ｍｓｅｃ－ブチルリチウムシクロヘキサン、ｎ－ヘキサン溶液（０．２９ｍＬ、０．３４ｍｍｏｌ、２ ｅｑ）をゆっくり加え、１時間攪拌した。脱水テトラヒドロフラン５ｍＬに溶解させたジクロロジメチルシラン（２２．２ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ、２ｅｑ）をゆっくり添加し、室温に戻して４時間攪拌した。２Ｎ塩酸水溶液を加え、１０分間攪拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えジクロロメタンで３回抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝９７／３→７６／２４）により精製し，ｃｒｕｄｅの化合物２（１９．９ ｍｇ）を得た。得られたｃｒｕｄｅの一部（６．８ｍｇ）をジクロロメタン２ｍＬとメタノール２ｍＬに溶解し，十分量のクロラニルを加え室温で２０分間攪拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ Ａ （Ｈ２Ｏ ｗｉｔｈ １％ ＭｅＣＮ ａｎｄ ０．１％ ＴＦＡ）ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（ＭｅＣＮ ｗｉｔｈ １％ Ｈ２Ｏ））（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ ０／１００ ｆｏｒ ４０ ｍｉｎ）で精製し、ＱＳｉＰ１（４．１ｍｇ、１９％ ｉｎ ２ ｓｔｅｐｓ）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.68 (s, 1H), 7.33 (s, 2H), 7.24 (s, 2H), 3.56 (t, J = 5.6 Hz, 4H), 3.26 (s, 6H), 2.67 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 1.87 (quin, J = 2.0 Hz, 4H), 0.44 (s, 6H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 361.20945, Found, 361.21075 (-1.3 mDa).
【0081】
化合物ＪＳｉＰ１の機器データ
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.48 (s, 1H), 7.20 (s, 2H), 3.49 (t, J = 6.0 Hz, 8H), 2.81 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 2.65 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 1.95-1.84 (m, 8H), 0.54 (s, 6H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 413.24075, Found, 413.24137 (-0.6 mDa).
【0082】
化合物ＪＳｉＰ２の機器データ
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.73 (s, 1H), 7.25 (d, 2H), 5.57 (d, J = 1.2 Hz, 2H), 3.60 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 2.85 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 1.46-1.41 (m, 16H), 1.19 (s, 6H), 0.58 (s, 6H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 493.30335, Found, 493.30187 (1.5 mDa).
【0083】
これら誘導体の吸収・蛍光スペクトルの測定を行った結果を図４に示す。
図４は、ＤＭＳＯ中で測定したＳｉＰ誘導体の正規化した吸収スペクトル（ａ）及び蛍光スペクトル（ｂ）を示す。また、ＳｉＰ誘導体光物理特性を以下の表１に示す。
図４は、ＤＭＳＯ中で測定したＳｉＰ誘導体の正規化した吸収スペクトル（ａ）及び蛍光スペクトル（ｂ）を示す。また、ＳｉＰ誘導体光物理特性を以下の表１に示す。
【0084】
【表1】
【0085】
６種類のＳｉＰ誘導体に対してＦＰ領域におけるＳＲＳスペクトルの測定を行った。結果は図５に示す通りである。図５は、ＤＭＳＯ中で測定したＳｉＰ誘導体の正規化したＳＲＳスペクトルを示す。また、ＳｉＰ誘導体光物理特性を以下の表１に示す。
これらの誘導体の中から，分離検出可能な色素母核のペアとしてラマンシフト値が十分離れていてかつＳ／Ｂが優れていたＴＭＳｉＰとＩＳｉＰを選択してプローブ化を行うこととした。
これらの誘導体の中から，分離検出可能な色素母核のペアとしてラマンシフト値が十分離れていてかつＳ／Ｂが優れていたＴＭＳｉＰとＩＳｉＰを選択してプローブ化を行うこととした。
【0086】
（２）ＳｉＲ誘導体の開発検討
ＳｉＰ誘導体のＳＲＳ測定の結果から、プローブの母核構造としてＴＭＳｉＰとＩＳｉＰを選定した。これらの骨格を組み合わせてＧＳＨ定量を可能とするために、それぞれの骨格をＧＳＨ応答性・ＧＳＨ非応答性のローダミン色素へと構造展開することにした。ここで、ＧＳＨ応答性の色素としてはより波長が長く検出感度が高いＩＳｉＰ母核を用いることとし、残りのＴＭＳｉＰ母核をＧＳＨ非応答性とすることした。
ここで化合物ＳｉＲ７００、４ＣＯＯＨ－ＳｉＲ７００及び４ＣＯＯＨ－２，６ｄｉＭｅ－ＳｉＲ６５０は、以下の手順で合成した。
ＳｉＰ誘導体のＳＲＳ測定の結果から、プローブの母核構造としてＴＭＳｉＰとＩＳｉＰを選定した。これらの骨格を組み合わせてＧＳＨ定量を可能とするために、それぞれの骨格をＧＳＨ応答性・ＧＳＨ非応答性のローダミン色素へと構造展開することにした。ここで、ＧＳＨ応答性の色素としてはより波長が長く検出感度が高いＩＳｉＰ母核を用いることとし、残りのＴＭＳｉＰ母核をＧＳＨ非応答性とすることした。
ここで化合物ＳｉＲ７００、４ＣＯＯＨ－ＳｉＲ７００及び４ＣＯＯＨ－２，６ｄｉＭｅ－ＳｉＲ６５０は、以下の手順で合成した。
【0087】
［合成実施例１］
化合物ＳｉＲ７００の合成
以下のスキームでＳｉＲ７００を合成した。
化合物ＳｉＲ７００の合成
以下のスキームでＳｉＲ７００を合成した。
【0088】
【0089】
化合物３は既報（Kushida, Y.; Hanaoka, K.; Komatsu, T.; Terai, T.; Ueno, T.; Yoshida, K.; Uchiyama, M.; Nagano, T. Red Fluorescent Scaffold for Highly Sensitive Protease Activity Probes. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2012, 22 (12), 3908-3911.）に基づいて合成した。
【0090】
ＳｉＲ７００の合成
ブロモベンゼン（１２２ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ、１０ｅｑ）を脱水テトラヒドロフラン５ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気化、－７８℃で攪拌した。１．２Ｍｓｅｃ－ブチルリチウムシクロヘキサン、ｎ－ヘキサン溶液（０．６５ｍＬ、０．７８ｍｍｏｌ、１０ｅｑ）をゆっくり加え、３０分間攪拌した。脱水テトラヒドロフラン１０ｍＬに溶解させた化合物３（２７．１ ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を添加し、室温に戻して２時間攪拌した。その後２Ｎ塩酸水溶液を加えた。水で希釈した後ジクロロメタンで３回抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（Ｈ２Ｏ ｗｉｔｈ １％ＭｅＣＮ ａｎｄ ０．１％ ＴＦＡ）ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（ＭｅＣＮ ｗｉｔｈ １％Ｈ２Ｏ））（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ ０／１００ ｆｏｒ ６０ ｍｉｎ） で精製し、ＳｉＲ７００（２１．５ｍｇ、６８％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.54-7.52 (m, 3H), 7.21-7.18 (m, 2H), 7.12 (s, 2H), 6.71 (t, J = 1.6 Hz, 2H), 3.79 (t, J = 8.0 Hz, 4H), 3.20 (s, 6H), 2.90 (t, J = 8.0 Hz, 4H), 0.53 (s, 6H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 409.20945, Found, 409.20899 (0.5 mDa).
ブロモベンゼン（１２２ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ、１０ｅｑ）を脱水テトラヒドロフラン５ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気化、－７８℃で攪拌した。１．２Ｍｓｅｃ－ブチルリチウムシクロヘキサン、ｎ－ヘキサン溶液（０．６５ｍＬ、０．７８ｍｍｏｌ、１０ｅｑ）をゆっくり加え、３０分間攪拌した。脱水テトラヒドロフラン１０ｍＬに溶解させた化合物３（２７．１ ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を添加し、室温に戻して２時間攪拌した。その後２Ｎ塩酸水溶液を加えた。水で希釈した後ジクロロメタンで３回抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（Ｈ２Ｏ ｗｉｔｈ １％ＭｅＣＮ ａｎｄ ０．１％ ＴＦＡ）ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（ＭｅＣＮ ｗｉｔｈ １％Ｈ２Ｏ））（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ ０／１００ ｆｏｒ ６０ ｍｉｎ） で精製し、ＳｉＲ７００（２１．５ｍｇ、６８％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.54-7.52 (m, 3H), 7.21-7.18 (m, 2H), 7.12 (s, 2H), 6.71 (t, J = 1.6 Hz, 2H), 3.79 (t, J = 8.0 Hz, 4H), 3.20 (s, 6H), 2.90 (t, J = 8.0 Hz, 4H), 0.53 (s, 6H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 409.20945, Found, 409.20899 (0.5 mDa).
【0091】
［合成実施例２］
化合物４ＣＯＯＨ－ＳｉＲ７００の合成
以下のスキームで４ＣＯＯＨ－ＳｉＲ７００を合成した。
化合物４ＣＯＯＨ－ＳｉＲ７００の合成
以下のスキームで４ＣＯＯＨ－ＳｉＲ７００を合成した。
【0092】
化合物５は既報（Numasawa, K.; Hanaoka, K.; Ikeno, T.; Echizen, H.; Ishikawa, T.; Morimoto, M.; Komatsu, T.; Ueno, T.; Ikegaya, Y.; Nagano, T.; Urano, Y. A Cytosolically Localized Far-Red to near-Infrared Rhodamine-Based Fluorescent Probe for Calcium Ions. Analyst 2020, 145 (23), 7736-7740.）に基づいて合成した。
【0093】
４ＣＯＯＨ－ＳｉＲ７００の合成
化合物５（２４８ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ、１０ｅｑ）を脱水テトラヒドロフラン８ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気化、－７８℃で攪拌した。１．２Ｍｓｅｃ－ブチルリチウムシクロヘキサン、ｎ－ヘキサン溶液（０．８０ｍＬ、０．９６ｍｍｏｌ、１０ｅｑ）をゆっくり加え、３０分間攪拌した。脱水テトラヒドロフラン５ｍＬに溶解させた化合物３（３１．３ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を添加し、室温に戻して２時間攪拌した。その後２Ｎ塩酸水溶液を加えた。水で希釈した後ジクロロメタンで３回抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し，溶媒を減圧留去した。残渣をトリフルオロ酢酸３ｍＬに溶解し、室温で１時間攪拌した。水で希釈した後ジクロロメタンで３回抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（Ｈ２Ｏ ｗｉｔｈ １％ ＭｅＣＮ ａｎｄ ０．１％ＴＦＡ）ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（ＭｅＣＮ ｗｉｔｈ １％ Ｈ２Ｏ））（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ ０／１００ ｆｏｒ ４０ ｍｉｎ）で精製し、４ＣＯＯＨ－ＳｉＲ７００（２３．６ｍｇ、５４％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.15 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.31 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.14 (s, 2H), 6.63 (s, 2H), 3.80 (t, J = 8.0 Hz, 4H), 3.21 (s, 6H), 2.89 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 0.54 (s, 6H); 13C NMR (101 MHz, CD3OD): δ 167.7, 164.4, 157.0, 150.4, 145.1, 133.1, 132.8, 130.7, 129.4, 129.2, 128.3, 114.7, 54.2, 48.3, 48.1, 47.9, 47.7, 47.5, 47.2, 47.0, 32.4, 25.8, -2.6; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 453.19928, Found, 453.19900 (0.3 mDa).
化合物５（２４８ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ、１０ｅｑ）を脱水テトラヒドロフラン８ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気化、－７８℃で攪拌した。１．２Ｍｓｅｃ－ブチルリチウムシクロヘキサン、ｎ－ヘキサン溶液（０．８０ｍＬ、０．９６ｍｍｏｌ、１０ｅｑ）をゆっくり加え、３０分間攪拌した。脱水テトラヒドロフラン５ｍＬに溶解させた化合物３（３１．３ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を添加し、室温に戻して２時間攪拌した。その後２Ｎ塩酸水溶液を加えた。水で希釈した後ジクロロメタンで３回抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し，溶媒を減圧留去した。残渣をトリフルオロ酢酸３ｍＬに溶解し、室温で１時間攪拌した。水で希釈した後ジクロロメタンで３回抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（Ｈ２Ｏ ｗｉｔｈ １％ ＭｅＣＮ ａｎｄ ０．１％ＴＦＡ）ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（ＭｅＣＮ ｗｉｔｈ １％ Ｈ２Ｏ））（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ ０／１００ ｆｏｒ ４０ ｍｉｎ）で精製し、４ＣＯＯＨ－ＳｉＲ７００（２３．６ｍｇ、５４％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.15 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.31 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.14 (s, 2H), 6.63 (s, 2H), 3.80 (t, J = 8.0 Hz, 4H), 3.21 (s, 6H), 2.89 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 0.54 (s, 6H); 13C NMR (101 MHz, CD3OD): δ 167.7, 164.4, 157.0, 150.4, 145.1, 133.1, 132.8, 130.7, 129.4, 129.2, 128.3, 114.7, 54.2, 48.3, 48.1, 47.9, 47.7, 47.5, 47.2, 47.0, 32.4, 25.8, -2.6; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 453.19928, Found, 453.19900 (0.3 mDa).
【0094】
［合成実施例３］
化合物４ＣＯＯＨ－２，６ｄｉＭｅ－ＳｉＲ６５０の合成
以下のスキームで４ＣＯＯＨ－２，６ｄｉＭｅ－ＳｉＲ６５０を合成した。
化合物４ＣＯＯＨ－２，６ｄｉＭｅ－ＳｉＲ６５０の合成
以下のスキームで４ＣＯＯＨ－２，６ｄｉＭｅ－ＳｉＲ６５０を合成した。
【0095】
化合物８、９は既報（Takahashi, S.; Kagami, Y.; Hanaoka, K.; Terai, T.; Komatsu, T.; Ueno, T.; Uchiyama, M.; Koyama-Honda, I.; Mizushima, N.; Taguchi, T.; Arai, H.; Nagano, T.; Urano, Y. Development of a Series of Practical Fluorescent Chemical Tools To Measure PH Values in Living Samples. J. Am. Chem. Soc. 2018, 140 (18), 5925-5933.、及び、Koide, Y.; Urano, Y.; Hanaoka, K.; Terai, T.; Nagano, T. Evolution of Group 14 Rhodamines as Platforms for Near-Infrared Fluorescence Probes Utilizing Photoinduced Electron Transfer. ACS Chem. Biol. 2011, 6 (6), 600-608）に基づいて合成した。
【0096】
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.87 (s, 2H), 7.36 (d, J = 2.8 Hz, 2H), 7.01 (d, J = 9.6 Hz, 2H), 6.77 (dd, J = 9.6, 2.8 Hz, 2H), 3.33 (s, 12H), 2.03 (s, 6H), 0.59 (s, 6H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 457.23058, Found, 457.23170 (-1.1 mDa).
【0097】
［実施例１］
細胞内のＧＳＨ濃度は０．５～１０ｍＭとされており、この濃度範囲に対して適切な応答性を有するローダミン色素を開発するべく上記の合成を行った。９位のベンゼン環上の置換基の立体障害を減少・増大させることでＧＳＨ応答性を最適化し、Ｋｄ， ＧＳＨが４．１ｍＭのＧＳＨ応答性色素ＳｉＲ７００と２５ｍＭ以上の非応答性色素２，６ｄｉＭｅ－ＳｉＲ６５０の開発に成功した。
ＳＲＳ測定では水中で高濃度（１００μＭ）の色素を用いる必要があるため，ベンゼン環上に水溶性官能基であるカルボキシ基を導入した誘導体４ＣＯＯＨ－ＳｉＲ７００および４ＣＯＯＨ－２，６ｄｉＭｅ－ＳｉＲ６５０の開発も行い、このような官能基導入ではＫｄ，ＧＳＨが大きく変化しないことを確認した。
図６に、Ｋｄ，ＧＳＨ値を最適化するためのＩＳｉＰおよびＴＭＳｉＰの構造進化（構造設計）を示す。
細胞内のＧＳＨ濃度は０．５～１０ｍＭとされており、この濃度範囲に対して適切な応答性を有するローダミン色素を開発するべく上記の合成を行った。９位のベンゼン環上の置換基の立体障害を減少・増大させることでＧＳＨ応答性を最適化し、Ｋｄ， ＧＳＨが４．１ｍＭのＧＳＨ応答性色素ＳｉＲ７００と２５ｍＭ以上の非応答性色素２，６ｄｉＭｅ－ＳｉＲ６５０の開発に成功した。
ＳＲＳ測定では水中で高濃度（１００μＭ）の色素を用いる必要があるため，ベンゼン環上に水溶性官能基であるカルボキシ基を導入した誘導体４ＣＯＯＨ－ＳｉＲ７００および４ＣＯＯＨ－２，６ｄｉＭｅ－ＳｉＲ６５０の開発も行い、このような官能基導入ではＫｄ，ＧＳＨが大きく変化しないことを確認した。
図６に、Ｋｄ，ＧＳＨ値を最適化するためのＩＳｉＰおよびＴＭＳｉＰの構造進化（構造設計）を示す。
【0098】
開発した誘導体とＧＳＨとの反応を実際にラマンスペクトルで評価可能か検討を行った。まずＧＳＨ応答性の４ＣＯＯＨ－ＳｉＲ７００の水溶液に様々な濃度のＧＳＨを添加したサンプルのＳＲＳ測定を行ったところ、ＳＲＳスペクトルでも吸収スペクトルと同様にＧＳＨの添加濃度に応じてピークの信号強度が低下していく様子が観測された。ＧＳＨ濃度とＳＲＳ信号強度のプロットをフィッティングしたシグモイド曲線は，吸収によって得られたシグモイド曲線とよく一致し、Ｋｄ，ＧＳＨは３．０ ｍＭと算出された。
図７に、吸収スペクトルとＳＲＳスペクトルに基づく４ＣＯＯＨ－ＳｉＲ７００による［ＧＳＨ］分析結果を示す。
図７に、吸収スペクトルとＳＲＳスペクトルに基づく４ＣＯＯＨ－ＳｉＲ７００による［ＧＳＨ］分析結果を示す。
【0099】
一方でＧＳＨ非応答性の４ＣＯＯＨ－２，６ｄｉＭｅ－ＳｉＲ６５０ではＧＳＨ濃度に関わらず信号強度がほぼ一定であることがＳＲＳスペクトルからも確認された。
図８に、吸収スペクトルとＳＲＳスペクトルに基づく４ＣＯＯＨ－２，６ｄｉＭｅ－ＳｉＲ６５０による［ＧＳＨ］分析結果を示す。
図８に、吸収スペクトルとＳＲＳスペクトルに基づく４ＣＯＯＨ－２，６ｄｉＭｅ－ＳｉＲ６５０による［ＧＳＨ］分析結果を示す。
【0100】
なお，ＧＳＨ応答性色素であるＳｉＲ７００はＧＳＨ添加後にスカベンジャーであるＮＥＭを添加することで吸収が回復することが確認され、ＧＳＨと可逆的に応答可能であることが示唆された。
図９に、ＳｉＲ７００とＧＳＨの可逆反応の結果を示す。
実験条件としては以下の通りである。
左の吸収スペクトル：ＳｉＲ７００を０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に終濃度１μＭになるように希釈した水溶液の吸収スペクトルを測定（ｂｅｆｏｒｅ）した後、終濃度５ｍＭになるようにＧＳＨ溶液を添加して吸収スペクトルを測定（＋５ｍＭ ＧＳＨ）し、ＧＳＨ添加によって吸光度が低下することを確認した。その後終濃度５ｍＭになるようにＮＥＭ溶液を添加して吸収スペクトルを測定（＋５ｍＭ ＧＳＨ ＋ ５ｍＭ ＮＥＭ）し、ＮＥＭ添加によって吸光度がＢｅｆｏｒｅと同程度に回復することを確認した。
右の経時変化：色素・溶液・添加物の条件は上と同じ（１μＭ ＳｉＲ７００／０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）である。６９０ｎｍの吸光度の時間変化を測定しており、３０秒後に終濃度５ｍＭになるようにＧＳＨを添加、９０秒後に終濃度５ｍＭになるようにＮＥＭを添加した。
図９に、ＳｉＲ７００とＧＳＨの可逆反応の結果を示す。
実験条件としては以下の通りである。
左の吸収スペクトル：ＳｉＲ７００を０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に終濃度１μＭになるように希釈した水溶液の吸収スペクトルを測定（ｂｅｆｏｒｅ）した後、終濃度５ｍＭになるようにＧＳＨ溶液を添加して吸収スペクトルを測定（＋５ｍＭ ＧＳＨ）し、ＧＳＨ添加によって吸光度が低下することを確認した。その後終濃度５ｍＭになるようにＮＥＭ溶液を添加して吸収スペクトルを測定（＋５ｍＭ ＧＳＨ ＋ ５ｍＭ ＮＥＭ）し、ＮＥＭ添加によって吸光度がＢｅｆｏｒｅと同程度に回復することを確認した。
右の経時変化：色素・溶液・添加物の条件は上と同じ（１μＭ ＳｉＲ７００／０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）である。６９０ｎｍの吸光度の時間変化を測定しており、３０秒後に終濃度５ｍＭになるようにＧＳＨを添加、９０秒後に終濃度５ｍＭになるようにＮＥＭを添加した。
【0101】
開発した２種類の誘導体を混合した水溶液のＳＲＳスペクトルを取得したところ、混合溶液中でもそれぞれのピークを同定することができた。
図１０は、ｐＨ７．４の０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中で、４ＣＯＯＨ－ＳｉＲ７００と４ＣＯＯＨ－２，６ｄｉＭｅ－ＳｉＲ６５０のＳＲＳスペクトルの同時検出を測定した結果を示す。
図１０は、ｐＨ７．４の０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中で、４ＣＯＯＨ－ＳｉＲ７００と４ＣＯＯＨ－２，６ｄｉＭｅ－ＳｉＲ６５０のＳＲＳスペクトルの同時検出を測定した結果を示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
