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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024126679
(43)【公開日】2024-09-20
(54)【発明の名称】Ｎａｍｐｔ発現増強用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/12 20060101AFI20240912BHJP
A61K 36/73 20060101ALI20240912BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240912BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20240912BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240912BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20240912BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20240912BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240912BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240912BHJP
A23L 33/105 20160101ALI20240912BHJP
【ＦＩ】
A61K31/12
A61K36/73
A61P3/10
A61P3/06
A61P1/16
A61P13/12
A61P21/00
A61P25/28
A61P43/00 107
A23L33/105
【審査請求】未請求
【請求項の数】3
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023035238
(22)【出願日】2023-03-08
(71)【出願人】
【識別番号】593106918
【氏名又は名称】株式会社ファンケル
(74)【代理人】
【識別番号】100162396
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 泰之
(74)【代理人】
【識別番号】100194803
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 理弘
(72)【発明者】
【氏名】渡邉 知倫
(72)【発明者】
【氏名】伊藤 美里
【テーマコード（参考）】
4B018
4C088
4C206
【Ｆターム（参考）】
4B018LB01
4B018LB07
4B018LB08
4B018LE01
4B018LE02
4B018LE03
4B018LE05
4B018MD08
4B018MD61
4B018ME14
4B018MF01
4C088AB51
4C088AC01
4C088BA32
4C088CA08
4C088CA11
4C088CA17
4C088MA52
4C088NA14
4C088ZA02
4C088ZA15
4C088ZA75
4C088ZA81
4C088ZA94
4C088ZB22
4C088ZC33
4C088ZC35
4C206AA01
4C206AA02
4C206CB19
4C206KA01
4C206KA18
4C206MA01
4C206MA04
4C206MA72
4C206NA14
4C206ZA02
4C206ZA15
4C206ZA75
4C206ZA81
4C206ZA94
4C206ZB22
4C206ZC35
(57)【要約】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アグリモールＢを含有することを特徴とするＮａｍｐｔ発現増強用組成物。
【請求項2】
前記アグリモールＢが、植物由来であることを特徴とする請求項１に記載のＮａｍｐｔ発現増強用組成物。
【請求項3】
前記アグリモールＢが、キンミズヒキ由来であることを特徴とする請求項１または２に記載のＮａｍｐｔ発現増強用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｎａｍｐｔの発現増強用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
ＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）は、酸化型（ＮＡＤ＋）と還元型（ＮＡＤＨ）の２つの状態が存在する。ＮＡＤは、生体内の種々の酸化還元反応における補酵素として機能し、好気呼吸（酸化的リン酸化）の中心的な役割を果たしており、ＮＡＤの減少は様々な組織における機能低下の一因である。
Ｎａｍｐｔ（ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ）は、生体内におけるＮＡＤ＋の合成の律速酵素であり、Ｎａｍｐｔの発現増強により、ＮＡＤ＋の合成が活性化する。加齢をはじめ、高脂肪食、炎症に曝されると、生体内のＮａｍｐｔ、及びその産生物であるＮＡＤの低下を生じ、これらの低下が代謝性疾患、老化に関連した様々な疾患を引き起こす原因の１つであることが明らかとなってきている。
Ｎａｍｐｔ（ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ）は、生体内におけるＮＡＤ＋の合成の律速酵素であり、Ｎａｍｐｔの発現増強により、ＮＡＤ＋の合成が活性化する。加齢をはじめ、高脂肪食、炎症に曝されると、生体内のＮａｍｐｔ、及びその産生物であるＮＡＤの低下を生じ、これらの低下が代謝性疾患、老化に関連した様々な疾患を引き起こす原因の１つであることが明らかとなってきている。
【0003】
Ｎａｍｐｔを過剰発現させたマウスや、Ｎａｍｐｔを含む細胞外小胞体をマウスに投与することにより、老化に伴う身体機能の改善、認知機能の改善、睡眠の質の改善、寿命延長効果が報告されている（非特許文献１）。また、Ｎａｍｐｔ活性化剤の投与により、ｄｂ/ｄｂマウスにおいてＩＩ型糖尿病様症状、筋肉機能が改善される（非特許文献２）。さらに、Ｎａｍｐｔにより合成されるＮＡＤ＋の中間体代謝物であるＮＭＮの投与により、高脂肪食負荷、老化に伴う耐糖能異常、インスリン抵抗性、脂質異常症が改善されることが明らかとなっている（非特許文献３）。
特許文献１には、ホエイタンパク質及びカゼインから選択されるタンパク質の加水分解物を含有するＮＡＭＰＴ発現促進用組成物が、ＮＡＤ＋の低下に起因する疾患又は状態の予防及び／又は改善剤として用いられることが記載されている。
特許文献１には、ホエイタンパク質及びカゼインから選択されるタンパク質の加水分解物を含有するＮＡＭＰＴ発現促進用組成物が、ＮＡＤ＋の低下に起因する疾患又は状態の予防及び／又は改善剤として用いられることが記載されている。
【0004】
一方、本発明者等は、アグリモール及びそれを含有するキンミズヒキ抽出物の作用機序について着目して継続して探求し、抗ヘリコバクターピロリ用組成物（特許文献２）、神経活性化用組成物（特許文献３）、免疫老化改善機能（特許文献４）などを既に提案している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２０２１－１２６０６７号公報
【特許文献2】特開２００３－３４２１９０号公報
【特許文献3】特開２０１８－８８８８号公報
【特許文献4】特開２０２２－６２５９号公報
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Cell Metab.2019; 30(2):339-342
【非特許文献2】ＪCachexia Sarcopenia Muscle. 2022; 13 (2):1177-1196
【非特許文献3】Cell Metab. 2011; 14: 528-536
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、新規なＮａｍｐｔの発現増強用組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明の課題を解決するための手段は、以下の通りである。
１．アグリモールＢを含有することを特徴とするＮａｍｐｔ発現増強用組成物。
２．前記アグリモールＢが、植物由来であることを特徴とする１．に記載のＮａｍｐｔ発現増強用組成物。
３．前記アグリモールＢが、キンミズヒキ由来であることを特徴とする１．または２．に記載のＮａｍｐｔ発現増強用組成物。
１．アグリモールＢを含有することを特徴とするＮａｍｐｔ発現増強用組成物。
２．前記アグリモールＢが、植物由来であることを特徴とする１．に記載のＮａｍｐｔ発現増強用組成物。
３．前記アグリモールＢが、キンミズヒキ由来であることを特徴とする１．または２．に記載のＮａｍｐｔ発現増強用組成物。
【発明の効果】
【0009】
本発明の組成物により、Ｎａｍｐｔの発現を増強することができる。本発明の組成物により、Ｎａｍｐｔが関与する生体機能を改善し、糖尿病、耐糖能異常、インスリン抵抗性、脂質異常症、脂肪肝などのメタボリックシンドローム、代謝性疾患の予防、改善、サルコペニア、認知機能低下をはじめとする神経変性疾患、腎臓疾患など老化関連疾患の予防、改善等が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】正常細胞と老化細胞における、キンミズヒキエキスおよびアグリモールＢ添加によるＮａｍｐｔ発現増強を示すグラフ。
【図2】老化細胞における、キンミズヒキエキス添加によるＮＡＤ＋量増加を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本明細書において「Ａ～Ｂ」との表記（Ａ、Ｂは数値）は、その両端を含む数値範囲を意味する。
本発明は、アグリモールＢを含有するＮａｍｐｔの発現増強用組成物に関する。
本発明は、アグリモールＢを含有するＮａｍｐｔの発現増強用組成物に関する。
【0012】
＜アグリモールＢ＞
アグリモールＢは、下記の化学式１に示す化合物である（分子量：６８２．７５ｇ／ｍｏｌ）。アグリモールＢは、化学合成したもの、あるいは植物などの天然物から抽出、分離し、必要に応じて精製したものを用いることができる。また、市販品を用いることもできる。
アグリモールＢは、下記の化学式１に示す化合物である（分子量：６８２．７５ｇ／ｍｏｌ）。アグリモールＢは、化学合成したもの、あるいは植物などの天然物から抽出、分離し、必要に応じて精製したものを用いることができる。また、市販品を用いることもできる。
【0013】
【化1】
【0014】
アグリモールＢの化学合成としては、フロログルシノール等を出発原料として合成することができる。例えば、Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ １９８９，２４（６）：４３１～４３７頁に記載の方法、あるいは特開平１１－３３５２５６号公報に開示された方法で合成することができる。
なお、合成で得られるアグリモールＢとして、（Ｓ）－（＋）－アグリモールＢとその光学異性体である（Ｒ）－（－）－アグリモールＢの２種類が挙げられるが、アグリモールＢとしては、これらのいずれか１種からなる単一化合物であってもよく、２種からなる混合物であってもよい。
なお、合成で得られるアグリモールＢとして、（Ｓ）－（＋）－アグリモールＢとその光学異性体である（Ｒ）－（－）－アグリモールＢの２種類が挙げられるが、アグリモールＢとしては、これらのいずれか１種からなる単一化合物であってもよく、２種からなる混合物であってもよい。
【0015】
アグリモールＢは、安全性の観点から植物由来のものが好ましい。
アグリモールＢを含む植物としては、アグリモールＢを含有するものであれば特に制限されないが、キンミズヒキ（学名：Ａｇｒｉｍｏｎｉａ ｐｉｌｏｓａ、別名：龍牙草）が好ましい。キンミズヒキは、バラ科キンミズヒキ属の多年草であり、日本国の本州、四国、九州などの林の縁、原野、路傍に自生している。キンミズヒキとしては、自生あるいは栽培された全草を採取し、これを自然乾燥又は加熱乾燥させたものを使用することができ、また、漢方生薬、民間療法薬、健康食品（ハーブティー）原料として市販されているキンミズヒキの乾燥物を使用することもできる。なお、キンミズヒキの全草を乾燥させたものは、仙鶴草の生薬名で市販されている。
アグリモールＢを含む植物としては、アグリモールＢを含有するものであれば特に制限されないが、キンミズヒキ（学名：Ａｇｒｉｍｏｎｉａ ｐｉｌｏｓａ、別名：龍牙草）が好ましい。キンミズヒキは、バラ科キンミズヒキ属の多年草であり、日本国の本州、四国、九州などの林の縁、原野、路傍に自生している。キンミズヒキとしては、自生あるいは栽培された全草を採取し、これを自然乾燥又は加熱乾燥させたものを使用することができ、また、漢方生薬、民間療法薬、健康食品（ハーブティー）原料として市販されているキンミズヒキの乾燥物を使用することもできる。なお、キンミズヒキの全草を乾燥させたものは、仙鶴草の生薬名で市販されている。
【0016】
アグリモールＢが植物由来である場合、抽出液、抽出液を精製・濃縮等した抽出エキス、水蒸気蒸留により得られる蒸留物、アグリモールＢを含有する植物を擦りおろしたもの、この擦りおろしたものから絞ったジュース、あるいは、これらのアグリモールＢを含む液体を液分減圧濃縮、スプレードライまたは凍結乾燥等の方法で固体化した粉末等を使用することができる。これらの中で、アグリモールＢを高濃度で含むことから、水又は有機溶媒による抽出液、あるいはこの抽出液から得られる抽出エキス、乾燥エキスが好ましい。
【0017】
抽出は、抽出溶媒として、水、各種有機溶媒、これらの混合溶媒を用い、公知の抽出方法で行うことができる。
抽出操作を行う前に、原料をそのまま、または粗く細断したものを、疎水性溶媒、親水性溶媒、混合溶媒で洗浄し、色素等の不要物を除去してもよい。洗浄に用いる有機溶媒としては、低級アルコール（例、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソブチルまたはブチルアルコールなど）、アセトンやメチルエチルケトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類、ジクロロメタンやクロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン石、油エーテルなどのエーテル類、酢酸エチル、ヘキサン、シクロヘキサン、トルエン、ベンゼンなどが挙げられる。
また、抽出操作を行う前に、原料に水を適宜加え、湿潤させることもできる。
抽出操作を行う前に、原料をそのまま、または粗く細断したものを、疎水性溶媒、親水性溶媒、混合溶媒で洗浄し、色素等の不要物を除去してもよい。洗浄に用いる有機溶媒としては、低級アルコール（例、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソブチルまたはブチルアルコールなど）、アセトンやメチルエチルケトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類、ジクロロメタンやクロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン石、油エーテルなどのエーテル類、酢酸エチル、ヘキサン、シクロヘキサン、トルエン、ベンゼンなどが挙げられる。
また、抽出操作を行う前に、原料に水を適宜加え、湿潤させることもできる。
【0018】
抽出溶媒としては、水、上記した有機溶媒、およびこれらの混合溶媒を使用することができ、これらの中で、水、低級アルコール、水と低級アルコールの混合溶媒が好ましく、また、低級アルコールとしてはエタノールが好ましい。
水で抽出を行うには、例えば、原料１重量部に対し、水０．５～１０重量部を加え、４０～１２０℃で、５分～２時間、好ましくは１０～６０分間、さらに好ましくは１０～２０分間抽出を行うことができる。このとき、撹拌により抽出効率を高めることもできる。また、抽出は、加熱還流により行うこともできる。抽出後、濾布、フィルターまたはメッシュ金網などを用いて濾過または圧搾を行う。この場合、加圧して作業効率を高めてもよい。また、別法として、遠心分離（１０００～２００００ｒｐｍ）により抽出物を得ることもできる。回収率を高めるために、この抽出・濾過工程を１～５回繰り返すことができる。
水で抽出を行うには、例えば、原料１重量部に対し、水０．５～１０重量部を加え、４０～１２０℃で、５分～２時間、好ましくは１０～６０分間、さらに好ましくは１０～２０分間抽出を行うことができる。このとき、撹拌により抽出効率を高めることもできる。また、抽出は、加熱還流により行うこともできる。抽出後、濾布、フィルターまたはメッシュ金網などを用いて濾過または圧搾を行う。この場合、加圧して作業効率を高めてもよい。また、別法として、遠心分離（１０００～２００００ｒｐｍ）により抽出物を得ることもできる。回収率を高めるために、この抽出・濾過工程を１～５回繰り返すことができる。
【0019】
有機溶媒で抽出を行うには、例えば、原料１重量部に対し、有機溶媒０．５～１０重量部を加え、水での抽出と同様にして抽出物を得ることができる。用いる溶媒としては上記した有機溶媒を単独で、または２種以上を組み合わせて使用することができ、含水溶媒も使用できる。特に、抽出前に原料を疎水性溶媒で洗浄して色素等の不要物を除去する場合、および下記のように抽出後の粗抽出物を疎水性溶媒で洗浄する場合において、抽出に用いる溶媒としては、水、低級アルコール、５０～８０％（ｖ／ｖ）含水低級アルコールが好ましく、低級アルコールとしてはエタノールが好ましい。溶媒の除去は、濾過、遠心分離、蒸留などの常法に従って行うことができる。
【0020】
キンミズヒキからの好ましい抽出方法は、例えば、以下のように行うことができる。
自生あるいは栽培された全草を採取し、これを自然乾燥又は加熱乾燥させたものを使用する。そして、これを細切し、約１０倍量の水または、含水濃度０～９９．５％（ｖ／ｖ）エチルアルコール、好ましくは含水濃度１～５０％エタノール、特に好ましくは含水濃度５～１０％エタノールに３～５日間浸漬して室温で抽出するか、あるいは還流冷却器を付して５０～８０℃で５～２４時間抽出し、濾過して抽出液を回収する。この抽出液は、ロータリーエバポレーターなどの減圧真空乾燥装置、又は凍結乾燥装置によって、水及びエタノールを除去して乾燥エキスとする。
自生あるいは栽培された全草を採取し、これを自然乾燥又は加熱乾燥させたものを使用する。そして、これを細切し、約１０倍量の水または、含水濃度０～９９．５％（ｖ／ｖ）エチルアルコール、好ましくは含水濃度１～５０％エタノール、特に好ましくは含水濃度５～１０％エタノールに３～５日間浸漬して室温で抽出するか、あるいは還流冷却器を付して５０～８０℃で５～２４時間抽出し、濾過して抽出液を回収する。この抽出液は、ロータリーエバポレーターなどの減圧真空乾燥装置、又は凍結乾燥装置によって、水及びエタノールを除去して乾燥エキスとする。
【0021】
次に乾燥エキスを濃縮する。濃縮工程では、０～４０％エチルアルコールで洗浄し、０～４０％エチルアルコール可溶性成分を除去することにより濃縮する。具体的には、乾燥エキスを０～４０％エタノール、特に好ましくは１０～３０％エタノールで洗浄し、０～４０％エタノール、特に好ましくは１０～３０％エタノール可溶性成分をろ過等の手段で除去した後、ろ過残渣をロータリーエバポレーターなどの減圧真空乾燥装置、又は凍結乾燥装置を用いて、水及びエタノールを除去することで、アグリモールＢがより濃縮された乾燥エキスを得ることができる。濃縮された乾燥エキスは、５０～９９．５％エタノール、特に好ましくは７０～９０％エタノールに再溶解し、製剤化に用いる賦形剤を添加して凍結乾燥することで、所望する濃度の濃縮された粉体を得ることができる。
【0022】
＜Ｎａｍｐｔ発現増強用組成物＞
本発明のＮａｍｐｔ発現増強用組成物は、アグリモールＢを含有する。本発明の組成物は、アグリモールＢを含有すれば良く、その他の成分を含有することができる。本発明のＮａｍｐｔ発現増強用組成物におけるアグリモールＢの含有量は、特に制限されないが、例えば０．００１～１００質量％である。下限値は、好ましくは０．００５質量％以上であり、より好ましくは０．０２質量％以上であり、上限値は、好ましくは９９．５質量％以下であり、より好ましくは９８質量％以下である。含有量を上記範囲内とすることにより、Ｎａｍｐｔの発現をより増強することができる。
本発明のＮａｍｐｔ発現増強用組成物は、アグリモールＢを含有する。本発明の組成物は、アグリモールＢを含有すれば良く、その他の成分を含有することができる。本発明のＮａｍｐｔ発現増強用組成物におけるアグリモールＢの含有量は、特に制限されないが、例えば０．００１～１００質量％である。下限値は、好ましくは０．００５質量％以上であり、より好ましくは０．０２質量％以上であり、上限値は、好ましくは９９．５質量％以下であり、より好ましくは９８質量％以下である。含有量を上記範囲内とすることにより、Ｎａｍｐｔの発現をより増強することができる。
【0023】
本発明の組成物は、Ｎａｍｐｔ発現を増強し、ＮＡＤ＋量の増加をもたらす。従って上記作用を有することにより、Ｎａｍｐｔ低下に伴うＮＡＤ＋の欠乏や不足に伴う糖尿病、耐糖能異常、インスリン抵抗性、脂質異常症、脂肪肝などのメタボリックシンドローム、代謝性疾患、サルコペニア、認知機能低下をはじめとする神経変性疾患、腎臓疾患など老化関連疾患の予防剤、改善剤、治療剤として使用することができる。
本発明の組成物は、経口投与、経皮投与、直腸内投与、注射などの投与方法に適した剤形で投与することができる。これらの中で、投与が容易なため、経口投与が好ましく、具体的には、飲食品、飼料、医薬品、動物用薬品等として使用可能である。
本発明の組成物は、経口投与、経皮投与、直腸内投与、注射などの投与方法に適した剤形で投与することができる。これらの中で、投与が容易なため、経口投与が好ましく、具体的には、飲食品、飼料、医薬品、動物用薬品等として使用可能である。
【0024】
Ｎａｍｐｔ発現増強用組成物を食品・飲料として使用する場合、例えば、果汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、乳飲料、アルコール飲料、清涼飲料、栄養ドリンク等の飲料、ゼリー状食品や各種スナック類、焼き菓子、ケーキ類、チョコレート、ガム、飴、スープ類等、あらゆる食品・飲料形態とすることができる。また、飲食品としては、通常の飲食品の他、栄養補助食品、機能性食品、健康食品、特定保健用食品等に上記の効果を目的として本発明の組成物を添加して用いることができる。
【0025】
Ｎａｍｐｔ発現増強用組成物を、サプリメント、医薬品、動物用薬品として使用する場合、例えば、糖衣錠、バッカル錠、コーティング錠、チュアブル錠などの錠剤、丸剤、散剤、ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤、顆粒剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤などの液剤、トローチ剤等の経口用液体製剤として利用することができる。その他、外用剤として使用することができる。
【実施例0026】
以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらの実施例のみに制限されるものではなく、本発明の技術的思想内において様々な変形が可能である。
（１）試験試料の調製
キンミズヒキエキスは以下の手順で調製した。
キンミズヒキ（仙鶴草、福田龍株式会社）１００ｇに、９０％エタノール１０倍量（１ｋｇ）を加え、還流抽出を２回繰り返した。得られた抽出液を、常法により珪藻土ろ過、減圧濃縮、凍結乾燥し、キンミズヒキ抽出物を得た。
得られたキンミズヒキ抽出物を、６０℃に加温した２０％エタノールに溶解・懸濁させ、珪藻土ろ過により不溶性画分を残渣として回収した。残渣を９０％エタノールに再溶解し、活性炭処理、珪藻土ろ過、減圧濃縮、凍結乾燥し、キンミズヒキ濃縮抽出物を得た。
得られたキンミズヒキ濃縮抽出物は、粗精製のキンミズヒキ抽出物から２０％エタノール可溶性成分を除去することで、アグリモールＢを含む脂溶性成分が濃縮される。この濃縮抽出物を、キンミズヒキエキスとして下記の実験に使用した。
（１）試験試料の調製
キンミズヒキエキスは以下の手順で調製した。
キンミズヒキ（仙鶴草、福田龍株式会社）１００ｇに、９０％エタノール１０倍量（１ｋｇ）を加え、還流抽出を２回繰り返した。得られた抽出液を、常法により珪藻土ろ過、減圧濃縮、凍結乾燥し、キンミズヒキ抽出物を得た。
得られたキンミズヒキ抽出物を、６０℃に加温した２０％エタノールに溶解・懸濁させ、珪藻土ろ過により不溶性画分を残渣として回収した。残渣を９０％エタノールに再溶解し、活性炭処理、珪藻土ろ過、減圧濃縮、凍結乾燥し、キンミズヒキ濃縮抽出物を得た。
得られたキンミズヒキ濃縮抽出物は、粗精製のキンミズヒキ抽出物から２０％エタノール可溶性成分を除去することで、アグリモールＢを含む脂溶性成分が濃縮される。この濃縮抽出物を、キンミズヒキエキスとして下記の実験に使用した。
【0027】
（キンミズヒキエキス中のアグリモールＢの含有量の測定）
得られたキンミズヒキエキスについて、ＨＰＬＣによりアグリモールＢの含有量を測定した。その結果、０．３３２質量％のアグリモールＢが含有されていた。
測定に用いたＨＰＬＣの条件を下記に示す。
カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ－ｌｌ５Ｃ１８ ＡＲ ４．６ｍｍ×１５０ｍｍ
移動相：Ａ液 ０．１％リン酸、Ｂ液 ０．１％リン酸含有アセトニトリル
グラジエンドＢ液：５０％（０－１０分） ５０％→９５％（１０分－５５分）
９５％（５５分－７０分） ５０％（７０分－８０分）
カラム温度：４０℃
流速 ：１．２ｍＬ／ｍｉｎ
検出 ：ＵＶ２８８ｎｍ
注入量：１０μＬ
得られたキンミズヒキエキスについて、ＨＰＬＣによりアグリモールＢの含有量を測定した。その結果、０．３３２質量％のアグリモールＢが含有されていた。
測定に用いたＨＰＬＣの条件を下記に示す。
カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ－ｌｌ５Ｃ１８ ＡＲ ４．６ｍｍ×１５０ｍｍ
移動相：Ａ液 ０．１％リン酸、Ｂ液 ０．１％リン酸含有アセトニトリル
グラジエンドＢ液：５０％（０－１０分） ５０％→９５％（１０分－５５分）
９５％（５５分－７０分） ５０％（７０分－８０分）
カラム温度：４０℃
流速 ：１．２ｍＬ／ｍｉｎ
検出 ：ＵＶ２８８ｎｍ
注入量：１０μＬ
【0028】
（２）培養および処置方法
ＷＩ３８細胞を１．２５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）、１％非必須アミノ酸溶液（Ｓｉｇｍａ）を含むＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ）で縣濁し、６ウエルプレートに２．５ｍｌずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培養２４時間後に、老化誘導のためドキソルビシンを終濃度１００ｎＭになるように添加し、２４時間培養後に培地交換を行い、さらに２日間培養を行い、老化細胞を得た。この老化細胞にキンミズヒキエキス１２．５μｇ／ｍｌ（アグリモールＢ：０．０６μＭ）、またはアグリモールＢ１μＭになるように添加し、２４時間培養した。
また、老化誘導していない正常ＷＩ３８細胞を３．７５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように２．５ｍｌずつ６ウエルプレートに播種し、２４時間培養後培地交換を行い、キンミズヒキエキス１２．５μｇ／ｍｌ、またはアグリモールＢ１μＭになるように添加し、さらに２４時間培養した。
なお、図１のＣｏｎｔｒｏｌは、溶媒コントロールとしてジメチルスルホキシドを添加したものである。
ＷＩ３８細胞を１．２５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）、１％非必須アミノ酸溶液（Ｓｉｇｍａ）を含むＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ）で縣濁し、６ウエルプレートに２．５ｍｌずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培養２４時間後に、老化誘導のためドキソルビシンを終濃度１００ｎＭになるように添加し、２４時間培養後に培地交換を行い、さらに２日間培養を行い、老化細胞を得た。この老化細胞にキンミズヒキエキス１２．５μｇ／ｍｌ（アグリモールＢ：０．０６μＭ）、またはアグリモールＢ１μＭになるように添加し、２４時間培養した。
また、老化誘導していない正常ＷＩ３８細胞を３．７５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように２．５ｍｌずつ６ウエルプレートに播種し、２４時間培養後培地交換を行い、キンミズヒキエキス１２．５μｇ／ｍｌ、またはアグリモールＢ１μＭになるように添加し、さらに２４時間培養した。
なお、図１のＣｏｎｔｒｏｌは、溶媒コントロールとしてジメチルスルホキシドを添加したものである。
【0029】
（３）Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲによる発現量定量
培養後の老化細胞と正常細胞をＰＢＳで洗浄後、７００μｌのＲＬＴ ｂｕｆｆｅｒを添加し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い添付の説明書に従ってＲＮＡを調製した。調製した４５０ｎｇのＲＮＡを用いて、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を使用し、添付の説明書に従いｃＤＮＡを作製した。
Ｎａｍｐｔ発現量は、１μｌ ｃＤＮＡ、ヒトＮａｍｐｔ ｔａｑ ｍａｎ ｐｒｏｂｅ（ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙｓ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とＰｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を混合し、Ｑｕａｎｔｉ Ｓｔｕｄｉｏ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、９５℃、３０秒、（９５℃、１秒→６０℃、２０秒）×４５サイクルの反応条件で測定を行った。内部標準としてβ－ａｃｔｉｎの発現量を使用し、上記と同様な反応で測定した。
測定により得られたＣｔ値からβ－ａｃｔｉｎを内部標準としてΔΔＣｔ法により、各サンプルの相対的遺伝子発現量を求めた。結果を図１に示す。
培養後の老化細胞と正常細胞をＰＢＳで洗浄後、７００μｌのＲＬＴ ｂｕｆｆｅｒを添加し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い添付の説明書に従ってＲＮＡを調製した。調製した４５０ｎｇのＲＮＡを用いて、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を使用し、添付の説明書に従いｃＤＮＡを作製した。
Ｎａｍｐｔ発現量は、１μｌ ｃＤＮＡ、ヒトＮａｍｐｔ ｔａｑ ｍａｎ ｐｒｏｂｅ（ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙｓ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とＰｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を混合し、Ｑｕａｎｔｉ Ｓｔｕｄｉｏ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、９５℃、３０秒、（９５℃、１秒→６０℃、２０秒）×４５サイクルの反応条件で測定を行った。内部標準としてβ－ａｃｔｉｎの発現量を使用し、上記と同様な反応で測定した。
測定により得られたＣｔ値からβ－ａｃｔｉｎを内部標準としてΔΔＣｔ法により、各サンプルの相対的遺伝子発現量を求めた。結果を図１に示す。
【0030】
（４）細胞内ＮＡＤ＋量測定
ＷＩ３８細胞を１．２５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）、１％非必須アミノ酸溶液（Ｓｉｇｍａ）を含むＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ）で縣濁し、６ウエルプレートに２．５ｍｌずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培養２４時間後に、老化誘導のためドキソルビシンを終濃度１００ｎＭになるように添加し、２４時間培養後に培地交換を行い、さらに２日間培養を行い老化細胞を得た。この老化細胞にキンミズヒキエキス７．５μｇ／ｍｌ（アグリモールＢ：０．０４μＭ）になるように添加し、４８時間培養した。細胞内のＮＡＤ＋量は、Ａｍｐｌｉｔｅ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＮＡＤ／ＮＡＤＨ Ｒａｔｉｏ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＡＴＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）を用い、添付の説明書に従って測定を行った。得られた細胞内ＮＡＤ＋量は、ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）で測定した各サンプルのタンパク量で補正を行った。結果を図２に示す。
ＷＩ３８細胞を１．２５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）、１％非必須アミノ酸溶液（Ｓｉｇｍａ）を含むＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ）で縣濁し、６ウエルプレートに２．５ｍｌずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培養２４時間後に、老化誘導のためドキソルビシンを終濃度１００ｎＭになるように添加し、２４時間培養後に培地交換を行い、さらに２日間培養を行い老化細胞を得た。この老化細胞にキンミズヒキエキス７．５μｇ／ｍｌ（アグリモールＢ：０．０４μＭ）になるように添加し、４８時間培養した。細胞内のＮＡＤ＋量は、Ａｍｐｌｉｔｅ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＮＡＤ／ＮＡＤＨ Ｒａｔｉｏ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＡＴＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）を用い、添付の説明書に従って測定を行った。得られた細胞内ＮＡＤ＋量は、ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）で測定した各サンプルのタンパク量で補正を行った。結果を図２に示す。
【0031】
【図1】
【図2】
