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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024126680
(43)【公開日】2024-09-20
(54)【発明の名称】ＡＭＰＫ活性化組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/121 20060101AFI20240912BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240912BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20240912BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20240912BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20240912BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240912BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20240912BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240912BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240912BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240912BHJP
A61K 36/73 20060101ALI20240912BHJP
A23L 33/105 20160101ALI20240912BHJP
【ＦＩ】
A61K31/121
A61P43/00 111
A61P21/00
A61P3/04
A61P3/06
A61P3/10
A61P9/12
A61P9/10 101
A61P25/28
A61P43/00
A61P17/00
A61K36/73
A23L33/105
【審査請求】未請求
【請求項の数】3
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023035239
(22)【出願日】2023-03-08
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】593106918
【氏名又は名称】株式会社ファンケル
(74)【代理人】
【識別番号】100162396
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 泰之
(74)【代理人】
【識別番号】100194803
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 理弘
(72)【発明者】
【氏名】渡邉 知倫
(72)【発明者】
【氏名】伊藤 美里
【テーマコード（参考）】
4B018
4C088
4C206
【Ｆターム（参考）】
4B018LB01
4B018LB08
4B018LB10
4B018MD08
4B018MD61
4B018ME14
4B018MF01
4B018MF06
4C088AB51
4C088AC01
4C088BA10
4C088CA08
4C088MA02
4C088NA14
4C088ZA02
4C088ZA15
4C088ZA42
4C088ZA45
4C088ZA70
4C088ZA89
4C088ZA94
4C088ZC21
4C088ZC33
4C088ZC35
4C088ZC52
4C206AA01
4C206AA02
4C206CB19
4C206KA01
4C206MA01
4C206MA04
4C206NA14
4C206ZA02
4C206ZA15
4C206ZA42
4C206ZA45
4C206ZA70
4C206ZA89
4C206ZA94
4C206ZC21
4C206ZC33
4C206ZC35
4C206ZC52
(57)【要約】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アグリモールＢを含有することを特徴とするＡＭＰＫ活性化組成物。
【請求項2】
前記アグリモールＢが、植物由来であることを特徴とする請求項１に記載のＡＭＰＫ活性化組成物。
【請求項3】
前記アグリモールＢが、キンミズヒキ由来であることを特徴とする請求項１または２に記載のＡＭＰＫ活性化組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＡＭＰＫの活性化組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
ＡＭＰＫ（ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ：ＡＭＰ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）は、細胞のエネルギー代謝の調節因子として知られている。ＡＭＰＫは、細胞内のＡＴＰレベル（ＡＭＰ：ＡＴＰ比）が低下すると活性化し、ＡＴＰの合成を促す。
ＡＭＰＫの活性化により、代謝が促進されるため、糖尿病やがん等の代謝性疾患の治療効果が期待されている（非特許文献１）。また、ＡＭＰＫの活性化により、筋肉量・筋力の増強による健康増進、肥満、高脂血症、糖尿病、高血圧、動脈硬化等の予防、シワやたるみの改善等の美容効果が期待されている（特許文献１～４）。また、糖尿病薬として使用されているメトホルミンは、寿命の延長や加齢に伴う生体機能の低下を抑制するが、この作用はＡＭＰＫの活性化を介してることが報告され、ＡＭＰＫの活性化は抗老化の標的として注目されている。
ＡＭＰＫの活性化により、代謝が促進されるため、糖尿病やがん等の代謝性疾患の治療効果が期待されている（非特許文献１）。また、ＡＭＰＫの活性化により、筋肉量・筋力の増強による健康増進、肥満、高脂血症、糖尿病、高血圧、動脈硬化等の予防、シワやたるみの改善等の美容効果が期待されている（特許文献１～４）。また、糖尿病薬として使用されているメトホルミンは、寿命の延長や加齢に伴う生体機能の低下を抑制するが、この作用はＡＭＰＫの活性化を介してることが報告され、ＡＭＰＫの活性化は抗老化の標的として注目されている。
【0003】
一方、本発明者等は、アグリモール及びそれを含有するキンミズヒキ抽出物の作用機序について着目して継続して探求し、抗ヘリコバクターピロリ用組成物（特許文献５）、神経活性化用組成物（特許文献６）、免疫老化改善機能（特許文献７）などを既に提案している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開２００５－２２５８０４号公報
【特許文献2】特開２００７－６３２４１号公報
【特許文献3】特開２００８－２４７８５６号公報
【特許文献4】特開２０１９－３４９０２号公報
【特許文献5】特開２００３－３４２１９０号公報
【特許文献6】特開２０１８－８８８８号公報
【特許文献7】特開２０２２－６２５９号公報
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Curr Opin Cell Biol. 2017; 45: 31-37.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、新規なＡＭＰＫ活性化組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の課題を解決するための手段は、以下の通りである。
１．アグリモールＢを含有することを特徴とするＡＭＰＫ活性化組成物。
２．前記アグリモールＢが、植物由来であることを特徴とする１．に記載のＡＭＰＫ活性化組成物。
３．前記アグリモールＢが、キンミズヒキ由来であることを特徴とする１．または２．に記載のＡＭＰＫ活性化組成物。
１．アグリモールＢを含有することを特徴とするＡＭＰＫ活性化組成物。
２．前記アグリモールＢが、植物由来であることを特徴とする１．に記載のＡＭＰＫ活性化組成物。
３．前記アグリモールＢが、キンミズヒキ由来であることを特徴とする１．または２．に記載のＡＭＰＫ活性化組成物。
【発明の効果】
【0008】
本発明の組成物により、ＡＭＰＫを活性化することができる。本発明の組成物により、ＡＭＰＫ活性化がもたらす生体機能を改善し、筋肉量・筋力の増強による健康増進、肥満、高脂血症、糖尿病、高血圧、動脈硬化、認知症をはじめとする神経変性疾患、サルコペニア等の代謝性疾患、老化関連疾患の予防、改善、シワやたるみの改善等の美容効果等が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【発明を実施するための形態】
【0010】
本明細書において「Ａ～Ｂ」との表記（Ａ、Ｂは数値）は、その両端を含む数値範囲を意味する。
本発明は、アグリモールＢを含有するＡＭＰＫ活性化組成物に関する。
本発明は、アグリモールＢを含有するＡＭＰＫ活性化組成物に関する。
【0011】
＜アグリモールＢ＞
アグリモールＢは、下記の化学式１に示す化合物である（分子量：６８２．７５ｇ／ｍｏｌ）。アグリモールＢは、化学合成したもの、あるいは植物などの天然物から抽出、分離し、必要に応じて精製したものを用いることができる。また、市販品を用いることもできる。
アグリモールＢは、下記の化学式１に示す化合物である（分子量：６８２．７５ｇ／ｍｏｌ）。アグリモールＢは、化学合成したもの、あるいは植物などの天然物から抽出、分離し、必要に応じて精製したものを用いることができる。また、市販品を用いることもできる。
【0012】
【化1】
【0013】
アグリモールＢの化学合成としては、フロログルシノール等を出発原料として合成することができる。例えば、Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ １９８９，２４（６）：４３１～４３７頁に記載の方法、あるいは特開平１１－３３５２５６号公報に開示された方法で合成することができる。
なお、合成で得られるアグリモールＢとして、（Ｓ）－（＋）－アグリモールＢとその光学異性体である（Ｒ）－（－）－アグリモールＢの２種類が挙げられるが、アグリモールＢとしては、これらのいずれか１種からなる単一化合物であってもよく、２種からなる混合物であってもよい。
なお、合成で得られるアグリモールＢとして、（Ｓ）－（＋）－アグリモールＢとその光学異性体である（Ｒ）－（－）－アグリモールＢの２種類が挙げられるが、アグリモールＢとしては、これらのいずれか１種からなる単一化合物であってもよく、２種からなる混合物であってもよい。
【0014】
アグリモールＢは、安全性の観点から植物由来のものが好ましい。
アグリモールＢを含む植物としては、アグリモールＢを含有するものであれば特に制限されないが、キンミズヒキ（学名：Ａｇｒｉｍｏｎｉａ ｐｉｌｏｓａ、別名：龍牙草）が好ましい。キンミズヒキは、バラ科キンミズヒキ属の多年草であり、日本国の本州、四国、九州などの林の縁、原野、路傍に自生している。キンミズヒキとしては、自生あるいは栽培された全草を採取し、これを自然乾燥又は加熱乾燥させたものを使用することができ、また、漢方生薬、民間療法薬、健康食品（ハーブティー）原料として市販されているキンミズヒキの乾燥物を使用することもできる。なお、キンミズヒキの全草を乾燥させたものは、仙鶴草の生薬名で市販されている。
アグリモールＢを含む植物としては、アグリモールＢを含有するものであれば特に制限されないが、キンミズヒキ（学名：Ａｇｒｉｍｏｎｉａ ｐｉｌｏｓａ、別名：龍牙草）が好ましい。キンミズヒキは、バラ科キンミズヒキ属の多年草であり、日本国の本州、四国、九州などの林の縁、原野、路傍に自生している。キンミズヒキとしては、自生あるいは栽培された全草を採取し、これを自然乾燥又は加熱乾燥させたものを使用することができ、また、漢方生薬、民間療法薬、健康食品（ハーブティー）原料として市販されているキンミズヒキの乾燥物を使用することもできる。なお、キンミズヒキの全草を乾燥させたものは、仙鶴草の生薬名で市販されている。
【0015】
アグリモールＢが植物由来である場合、抽出液、抽出液を精製・濃縮等した抽出エキス、水蒸気蒸留により得られる蒸留物、アグリモールＢを含有する植物を擦りおろしたもの、この擦りおろしたものから絞ったジュース、あるいは、これらのアグリモールＢを含む液体を液分減圧濃縮、スプレードライまたは凍結乾燥等の方法で固体化した粉末等を使用することができる。これらの中で、アグリモールＢを高濃度で含むことから、水又は有機溶媒による抽出液、あるいはこの抽出液から得られる抽出エキス、乾燥エキスが好ましい。
【0016】
抽出は、抽出溶媒として、水、各種有機溶媒、これらの混合溶媒を用い、公知の抽出方法で行うことができる。
抽出操作を行う前に、原料をそのまま、または粗く細断したものを、疎水性溶媒、親水性溶媒、混合溶媒で洗浄し、色素等の不要物を除去してもよい。洗浄に用いる有機溶媒としては、低級アルコール（例、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソブチルまたはブチルアルコールなど）、アセトンやメチルエチルケトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類、ジクロロメタンやクロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン石、油エーテルなどのエーテル類、酢酸エチル、ヘキサン、シクロヘキサン、トルエン、ベンゼンなどが挙げられる。
また、抽出操作を行う前に、原料に水を適宜加え、湿潤させることもできる。
抽出操作を行う前に、原料をそのまま、または粗く細断したものを、疎水性溶媒、親水性溶媒、混合溶媒で洗浄し、色素等の不要物を除去してもよい。洗浄に用いる有機溶媒としては、低級アルコール（例、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソブチルまたはブチルアルコールなど）、アセトンやメチルエチルケトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類、ジクロロメタンやクロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン石、油エーテルなどのエーテル類、酢酸エチル、ヘキサン、シクロヘキサン、トルエン、ベンゼンなどが挙げられる。
また、抽出操作を行う前に、原料に水を適宜加え、湿潤させることもできる。
【0017】
抽出溶媒としては、水、上記した有機溶媒、およびこれらの混合溶媒を使用することができ、これらの中で、水、低級アルコール、水と低級アルコールの混合溶媒が好ましく、また、低級アルコールとしてはエタノールが好ましい。
水で抽出を行うには、例えば、原料１重量部に対し、水０．５～１０重量部を加え、４０～１２０℃で、５分～２時間、好ましくは１０～６０分間、さらに好ましくは１０～２０分間抽出を行うことができる。このとき、撹拌により抽出効率を高めることもできる。また、抽出は、加熱還流により行うこともできる。抽出後、濾布、フィルターまたはメッシュ金網などを用いて濾過または圧搾を行う。この場合、加圧して作業効率を高めてもよい。また、別法として、遠心分離（１０００～２００００ｒｐｍ）により抽出物を得ることもできる。回収率を高めるために、この抽出・濾過工程を１～５回繰り返すことができる。
水で抽出を行うには、例えば、原料１重量部に対し、水０．５～１０重量部を加え、４０～１２０℃で、５分～２時間、好ましくは１０～６０分間、さらに好ましくは１０～２０分間抽出を行うことができる。このとき、撹拌により抽出効率を高めることもできる。また、抽出は、加熱還流により行うこともできる。抽出後、濾布、フィルターまたはメッシュ金網などを用いて濾過または圧搾を行う。この場合、加圧して作業効率を高めてもよい。また、別法として、遠心分離（１０００～２００００ｒｐｍ）により抽出物を得ることもできる。回収率を高めるために、この抽出・濾過工程を１～５回繰り返すことができる。
【0018】
有機溶媒で抽出を行うには、例えば、原料１重量部に対し、有機溶媒０．５～１０重量部を加え、水での抽出と同様にして抽出物を得ることができる。用いる溶媒としては上記した有機溶媒を単独で、または２種以上を組み合わせて使用することができ、含水溶媒も使用できる。特に、抽出前に原料を疎水性溶媒で洗浄して色素等の不要物を除去する場合、および下記のように抽出後の粗抽出物を疎水性溶媒で洗浄する場合において、抽出に用いる溶媒としては、水、低級アルコール、５０～８０％（ｖ／ｖ）含水低級アルコールが好ましく、低級アルコールとしてはエタノールが好ましい。溶媒の除去は、濾過、遠心分離、蒸留などの常法に従って行うことができる。
【0019】
キンミズヒキからの好ましい抽出方法は、例えば、以下のように行うことができる。
自生あるいは栽培された全草を採取し、これを自然乾燥又は加熱乾燥させたものを使用する。そして、これを細切し、約１０倍量の水または、含水濃度０～９９．５％（ｖ／ｖ）エチルアルコール、好ましくは含水濃度１～５０％エタノール、特に好ましくは含水濃度５～１０％エタノールに３～５日間浸漬して室温で抽出するか、あるいは還流冷却器を付して５０～８０℃で５～２４時間抽出し、濾過して抽出液を回収する。この抽出液は、ロータリーエバポレーターなどの減圧真空乾燥装置、又は凍結乾燥装置によって、水及びエタノールを除去して乾燥エキスとする。
自生あるいは栽培された全草を採取し、これを自然乾燥又は加熱乾燥させたものを使用する。そして、これを細切し、約１０倍量の水または、含水濃度０～９９．５％（ｖ／ｖ）エチルアルコール、好ましくは含水濃度１～５０％エタノール、特に好ましくは含水濃度５～１０％エタノールに３～５日間浸漬して室温で抽出するか、あるいは還流冷却器を付して５０～８０℃で５～２４時間抽出し、濾過して抽出液を回収する。この抽出液は、ロータリーエバポレーターなどの減圧真空乾燥装置、又は凍結乾燥装置によって、水及びエタノールを除去して乾燥エキスとする。
【0020】
次に乾燥エキスを濃縮する。濃縮工程では、０～４０％エチルアルコールで洗浄し、０～４０％エチルアルコール可溶性成分を除去することにより濃縮する。具体的には、乾燥エキスを０～４０％エタノール、特に好ましくは１０～３０％エタノールで洗浄し、０～４０％エタノール、特に好ましくは１０～３０％エタノール可溶性成分をろ過等の手段で除去した後、ろ過残渣をロータリーエバポレーターなどの減圧真空乾燥装置、又は凍結乾燥装置を用いて、水及びエタノールを除去することで、アグリモールＢがより濃縮された乾燥エキスを得ることができる。濃縮された乾燥エキスは、５０～９９．５％エタノール、特に好ましくは７０～９０％エタノールに再溶解し、製剤化に用いる賦形剤を添加して凍結乾燥することで、所望する濃度の濃縮された粉体を得ることができる。
【0021】
＜ＡＭＰＫ活性化組成物＞
本発明のＡＭＰＫ活性化組成物は、アグリモールＢを含有する。本発明の組成物は、アグリモールＢを含有すれば良く、その他の成分を含有することができる。本発明のＡＭＰＫ活性化組成物におけるアグリモールＢの含有量は、特に制限されないが、例えば０．００１～１００質量％である。下限値は、好ましくは０．００５質量％以上であり、より好ましくは０．０２質量％以上であり、上限値は、好ましくは９９．５質量％以下であり、より好ましくは９８質量％以下である。含有量を上記範囲内とすることにより、ＡＭＰＫを活性化することができる。
本発明のＡＭＰＫ活性化組成物は、アグリモールＢを含有する。本発明の組成物は、アグリモールＢを含有すれば良く、その他の成分を含有することができる。本発明のＡＭＰＫ活性化組成物におけるアグリモールＢの含有量は、特に制限されないが、例えば０．００１～１００質量％である。下限値は、好ましくは０．００５質量％以上であり、より好ましくは０．０２質量％以上であり、上限値は、好ましくは９９．５質量％以下であり、より好ましくは９８質量％以下である。含有量を上記範囲内とすることにより、ＡＭＰＫを活性化することができる。
【0022】
本発明の組成物は、ＡＭＰＫを活性化することにより、筋肉増強剤、体脂肪の燃焼促進剤、高脂血症、糖尿病、高血圧、動脈硬化、認知症をはじめとする神経変性疾患、サルコペニア等の代謝性異常、老化関連の症状若しくは疾患の予防剤、改善剤、治療剤として使用することができる。
本発明の組成物は、経口投与、経皮投与、直腸内投与、注射などの投与方法に適した剤形で投与することができる。これらの中で、投与が容易なため、経口投与が好ましく、具体的には、飲食品、飼料、医薬品、動物用薬品等として使用可能である。
本発明の組成物は、経口投与、経皮投与、直腸内投与、注射などの投与方法に適した剤形で投与することができる。これらの中で、投与が容易なため、経口投与が好ましく、具体的には、飲食品、飼料、医薬品、動物用薬品等として使用可能である。
【0023】
ＡＭＰＫ活性化組成物を食品・飲料として使用する場合、例えば、果汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、乳飲料、アルコール飲料、清涼飲料、栄養ドリンク等の飲料、ゼリー状食品や各種スナック類、焼き菓子、ケーキ類、チョコレート、ガム、飴、スープ類等、あらゆる食品・飲料形態とすることができる。また、飲食品としては、通常の飲食品の他、栄養補助食品、機能性食品、健康食品、特定保健用食品等に上記の効果を目的として本発明の組成物を添加して用いることができる。
【0024】
ＡＭＰＫ活性化組成物を、サプリメント、医薬品、動物用薬品として使用する場合、例えば、糖衣錠、バッカル錠、コーティング錠、チュアブル錠などの錠剤、丸剤、散剤、ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤、顆粒剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤などの液剤、トローチ剤等の経口用液体製剤として利用することができる。その他、外用剤として使用することができる。
【実施例0025】
以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらの実施例のみに制限されるものではなく、本発明の技術的思想内において様々な変形が可能である。
（１）試験試料の調製
キンミズヒキエキスは以下の手順で調製した。
キンミズヒキ（仙鶴草、福田龍株式会社）１００ｇに、９０％エタノール１０倍量（１ｋｇ）を加え、還流抽出を２回繰り返した。得られた抽出液を、常法により珪藻土ろ過、減圧濃縮、凍結乾燥し、キンミズヒキ抽出物を得た。
得られたキンミズヒキ抽出物を、６０℃に加温した２０％エタノールに溶解・懸濁させ、珪藻土ろ過により不溶性画分を残渣として回収した。残渣を９０％エタノールに再溶解し、活性炭処理、珪藻土ろ過、減圧濃縮、凍結乾燥し、キンミズヒキ濃縮抽出物を得た。
得られたキンミズヒキ濃縮抽出物は、粗精製のキンミズヒキ抽出物から２０％エタノール可溶性成分を除去することで、アグリモールＢを含む脂溶性成分が濃縮される。この濃縮抽出物を、キンミズヒキエキスとして下記の実験に使用した。
（１）試験試料の調製
キンミズヒキエキスは以下の手順で調製した。
キンミズヒキ（仙鶴草、福田龍株式会社）１００ｇに、９０％エタノール１０倍量（１ｋｇ）を加え、還流抽出を２回繰り返した。得られた抽出液を、常法により珪藻土ろ過、減圧濃縮、凍結乾燥し、キンミズヒキ抽出物を得た。
得られたキンミズヒキ抽出物を、６０℃に加温した２０％エタノールに溶解・懸濁させ、珪藻土ろ過により不溶性画分を残渣として回収した。残渣を９０％エタノールに再溶解し、活性炭処理、珪藻土ろ過、減圧濃縮、凍結乾燥し、キンミズヒキ濃縮抽出物を得た。
得られたキンミズヒキ濃縮抽出物は、粗精製のキンミズヒキ抽出物から２０％エタノール可溶性成分を除去することで、アグリモールＢを含む脂溶性成分が濃縮される。この濃縮抽出物を、キンミズヒキエキスとして下記の実験に使用した。
【0026】
（キンミズヒキエキス中のアグリモールＢの含有量の測定）
得られたキンミズヒキエキスについて、ＨＰＬＣによりアグリモールＢの含有量を測定した。その結果、０．３３２質量％のアグリモールＢが含有されていた。
測定に用いたＨＰＬＣの条件を下記に示す。
カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ－ｌｌ５Ｃ１８ ＡＲ ４．６ｍｍ×１５０ｍｍ
移動相：Ａ液 ０．１％リン酸、Ｂ液 ０．１％リン酸含有アセトニトリル
グラジエンドＢ液：５０％（０－１０分） ５０％→９５％（１０分－５５分）
９５％（５５分－７０分） ５０％（７０分－８０分）
カラム温度：４０℃
流速 ：１．２ｍＬ／ｍｉｎ
検出 ：ＵＶ２８８ｎｍ
注入量：１０μＬ
得られたキンミズヒキエキスについて、ＨＰＬＣによりアグリモールＢの含有量を測定した。その結果、０．３３２質量％のアグリモールＢが含有されていた。
測定に用いたＨＰＬＣの条件を下記に示す。
カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ－ｌｌ５Ｃ１８ ＡＲ ４．６ｍｍ×１５０ｍｍ
移動相：Ａ液 ０．１％リン酸、Ｂ液 ０．１％リン酸含有アセトニトリル
グラジエンドＢ液：５０％（０－１０分） ５０％→９５％（１０分－５５分）
９５％（５５分－７０分） ５０％（７０分－８０分）
カラム温度：４０℃
流速 ：１．２ｍＬ／ｍｉｎ
検出 ：ＵＶ２８８ｎｍ
注入量：１０μＬ
【0027】
（２）培養および処置方法
ＨＥＫ２９３細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）で縣濁し、４８ウエルプレート（住友ベークライト）に３５０μｌずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培養１８時間後に、キンミズヒキエキスを終濃度１５μｇ／ｍｌ（アグリモールＢ：０．０７μＭ）、アグリモールＢを終濃度１μＭになるように添加し、１８時間培養した。
なお、図１のＣｏｎｔｒｏｌは、溶媒コントロールとしてジメチルスルホキシドを添加したものである。
ＨＥＫ２９３細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）で縣濁し、４８ウエルプレート（住友ベークライト）に３５０μｌずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培養１８時間後に、キンミズヒキエキスを終濃度１５μｇ／ｍｌ（アグリモールＢ：０．０７μＭ）、アグリモールＢを終濃度１μＭになるように添加し、１８時間培養した。
なお、図１のＣｏｎｔｒｏｌは、溶媒コントロールとしてジメチルスルホキシドを添加したものである。
【0028】
（３）リン酸化ＡＭＰＫ測定
培養後に上清を除去し、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で細胞を洗浄後、プロテアーゼ阻害剤、フォスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を加えたＲＩＰＡ溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＳＤＳ、０．５％ ＤＯＣ、１％ ＮＰ－４０）１５０μｌを加え細胞抽出液を調製した。ＢＣＡ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）でタンパク質定量を行った後、調製した細胞抽出液に４ｘＬａｅｍｍｌｉ ｓａｍｐｌｅ溶液（Ｂｉｏ－ｒａｄ）、終濃度５０ｍＭ ＤＴＴ（和光純薬）を加え９５℃、５分加熱し、電気泳動用のサンプルを調製した。調製したサンプルをＭｉｎｉ ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ Ｇｅｌｓ（４－２０％：１５レーン、Ｂｉｏ－ｒａｄ）にロードし、電気泳動を行った後、トランスブロットＴｕｒｂｏミディＰＶＤＦ転写パック（Ｂｉｏ－ｒａｄ）を用いて１Ａ、２５Ｖ、３０分の条件で転写反応を行った。
培養後に上清を除去し、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で細胞を洗浄後、プロテアーゼ阻害剤、フォスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を加えたＲＩＰＡ溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＳＤＳ、０．５％ ＤＯＣ、１％ ＮＰ－４０）１５０μｌを加え細胞抽出液を調製した。ＢＣＡ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）でタンパク質定量を行った後、調製した細胞抽出液に４ｘＬａｅｍｍｌｉ ｓａｍｐｌｅ溶液（Ｂｉｏ－ｒａｄ）、終濃度５０ｍＭ ＤＴＴ（和光純薬）を加え９５℃、５分加熱し、電気泳動用のサンプルを調製した。調製したサンプルをＭｉｎｉ ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ Ｇｅｌｓ（４－２０％：１５レーン、Ｂｉｏ－ｒａｄ）にロードし、電気泳動を行った後、トランスブロットＴｕｒｂｏミディＰＶＤＦ転写パック（Ｂｉｏ－ｒａｄ）を用いて１Ａ、２５Ｖ、３０分の条件で転写反応を行った。
【0029】
転写させたメンブレンをＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（Ｎａｋａｌａｉ）に浸し、室温で１時間振盪させながらブロッキングした後、１０％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ－ＴＢＳ－Ｔ（０．１％ Ｔｗｅｅｎを含むＴＢＳ溶液）溶液で１／１０００倍に希釈した抗リン酸化ＡＭＰＫ（Ｔｈｒ１７２）α抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に浸し、４℃で１８時間振盪させながら反応させた。ＴＢＳ－Ｔ溶液で３回洗浄後、１０％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ－ＴＢＳ溶液で１／１００００倍に希釈したＨＲＰ標識抗ラビットＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で浸し、室温で振盪させながら１時間反応させた。ＴＢＳ－Ｔ溶液で３回洗浄した後、ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で５分反応させ発光量をＣｈｅｍｉＤｏｃ（Ｂｉｏ－ｒａｄ）にて測定した。
【0030】
測定したメンブレンは、リプローブ溶液（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．７）、２％ ＳＤＳ、１００ｍＭ ３－メルカプト－１，２－プロパンジオール）で６０℃、３０分反応後、ＴＢＳ－Ｔ溶液で洗浄した。その後、上記記載と同様な方法でＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅでブロッキング後、抗ＡＭＰＫα抗体（１／１０００希釈、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＨＲＰ標識抗ラビットＩｇＧ抗体（１／１００００希釈）で反応後、ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔで反応させ、得られたウエスタンブロッティングのバンドの発光強度をＩｍａｇｅ ｌａｂソフトを使用して測定し、リン酸化ＡＭＰＫαの発光強度をＡＭＰＫαの発光強度で補正を行った。結果を図１、２に示す。
【0031】
・結果
図１に示すように、キンミズヒキエキス、およびアグリモールＢ添加により、ＡＭＰＫαの１７２番目のスレオニンのリン酸化亢進が確認できた。ＡＭＰＫαは、１７２番目のスレオニンがリン酸化されることで活性化されることが知られていることから、キンミズヒキエキスおよびアグリモールＢにより、ＡＭＰＫαが活性化されることが確かめられた。
図１に示すように、キンミズヒキエキス、およびアグリモールＢ添加により、ＡＭＰＫαの１７２番目のスレオニンのリン酸化亢進が確認できた。ＡＭＰＫαは、１７２番目のスレオニンがリン酸化されることで活性化されることが知られていることから、キンミズヒキエキスおよびアグリモールＢにより、ＡＭＰＫαが活性化されることが確かめられた。
【図1】
【図2】
