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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024127458
(43)【公開日】2024-09-20
(54)【発明の名称】キメラタンパク質
(51)【国際特許分類】
C12N 15/55 20060101AFI20240912BHJP
C12N 9/20 20060101ALI20240912BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240912BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240912BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240912BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240912BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240912BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240912BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240912BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240912BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240912BHJP
【ＦＩ】
C12N15/55
C12N9/20 ZNA
C12N15/12
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12Q1/02
C07K19/00
【審査請求】未請求
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023036623
(22)【出願日】2023-03-09
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和４年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構「脳とこころの研究推進プログラム／細胞内シグナル伝達系の光操作による革新的シナプス可塑性介入技術の研究開発」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】304023994
【氏名又は名称】国立大学法人山梨大学
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100107515
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(72)【発明者】
【氏名】金 然正
(72)【発明者】
【氏名】大塚 稔久
(72)【発明者】
【氏名】濱田 駿
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QQ13
4B063QQ79
4B063QR51
4B063QS05
4B063QS38
4B063QS40
4B065AA91Y
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BC48
4B065CA24
4B065CA46
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA89
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築するための分子を提供すること。
【解決手段】ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、ＳｓｐＢドメイン、及びホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインを有することを特徴とする、キメラタンパク質である。
【選択図】なし
【解決手段】ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、ＳｓｐＢドメイン、及びホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインを有することを特徴とする、キメラタンパク質である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、ＳｓｐＢドメイン、及びホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインを有することを特徴とする、キメラタンパク質。
【請求項2】
ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、ＳｓｐＢドメイン、及びホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインを、この順で有する、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項3】
ホスホリパーゼＣのＸ－Ｙリンカー配列を有さない、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項4】
請求項１から３のいずれかに記載のキメラタンパク質をコードする塩基配列を含むことを特徴とする核酸。
【請求項5】
請求項４に記載の核酸を含むことを特徴とするベクター。
【請求項6】
請求項４に記載の核酸を含むことを特徴とする細胞。
【請求項7】
ＳｓｒＡをコードする塩基配列を含む核酸を含む、請求項６に記載の細胞。
【請求項8】
請求項６に記載の細胞を培養する工程を含むことを特徴とするキメラタンパク質の製造方法。
【請求項9】
請求項６に記載の細胞に青色光を照射することを含むホスホリパーゼＣの制御方法。
【請求項10】
請求項６に記載の細胞に青色光を照射することを含むホスホリパーゼＣを介したシグナル伝達の解析方法。
【請求項11】
請求項６に記載の細胞に青色光を照射することを含む化合物のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、キメラタンパク質及びその製造方法、核酸、ベクター、細胞、ホスホリパーゼＣの制御方法、ホスホリパーゼＣを介したシグナル伝達の解析方法、並びに化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）は、生体のシグナル伝達経路において重要な役割を果たし、細胞内で様々な反応に関与することが知られている。
内在性ＰＬＣは、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、成長因子受容体（ＲＴＫ）、及び低分子量Ｇタンパク質の一種であるＲａｃとＲｈｏなどにより活性化されることが知られているが、ＰＬＣの自発的な活性化機構は未だ知られていない。
内在性ＰＬＣは、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、成長因子受容体（ＲＴＫ）、及び低分子量Ｇタンパク質の一種であるＲａｃとＲｈｏなどにより活性化されることが知られているが、ＰＬＣの自発的な活性化機構は未だ知られていない。
【0003】
近年光遺伝学の発展により光駆動型システムが開発されている。光駆動型システムを使用することにより、タンパク質の活性化を光を用いて制御することが可能である。前記光駆動型システムとして、非特許文献１には、エンバクのＬＯＶ２ドメインにＳｓｒＡペプチドを埋め込んだ、改良光誘導性二量体（ｉＬＩＤ）が記載されている。前記ｉＬＩＤは、青色光で活性化されると、ＬＯＶ２ドメインのＣ末端ヘリックスがタンパク質から切り離され、ＳｓｒＡペプチドがＳｓｐＢに結合できるようになる。
ＰＬＣを活性化する光駆動型システムとしては、Ｏｐｔｏ－α１ＡＲ、Ｎｅｕｒｏｐｓｉｎ、Ｍａｇｎｅｔ－Ｇｑ、Ｏｐｔｏ－ＲＴＫ、ＰＡ－Ｒａｃ、ＰＡ－Ｒｈｏなどが報告されている（非特許文献２～４など）。しかしながら、これらのＰＬＣを活性化する光駆動型システムは、ＰＬＣのシグナル伝達の上流に位置するタンパク質を標的としており、ＰＬＣの特異性は低かった。
ＰＬＣを活性化する光駆動型システムとしては、Ｏｐｔｏ－α１ＡＲ、Ｎｅｕｒｏｐｓｉｎ、Ｍａｇｎｅｔ－Ｇｑ、Ｏｐｔｏ－ＲＴＫ、ＰＡ－Ｒａｃ、ＰＡ－Ｒｈｏなどが報告されている（非特許文献２～４など）。しかしながら、これらのＰＬＣを活性化する光駆動型システムは、ＰＬＣのシグナル伝達の上流に位置するタンパク質を標的としており、ＰＬＣの特異性は低かった。
【0004】
したがって、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築するための分子が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】ＰＮＡＳ ２０１５ １１２：１１２－１１７
【非特許文献2】Ｎａｔｕｒｅ ２００９ ４５８：１０２５－１０２９
【非特許文献3】Ｐｒｏｃ Ｒ Ｓｏｃ Ｂ ２０１３ ２８０：２０１２２９８７
【非特許文献4】Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１６ ６：３５７７７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築するための分子を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らが、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、ＳｓｐＢドメイン、及びホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインを有するキメラタンパク質、前記キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、前記核酸を含むベクター及び細胞、並びに、前記細胞を培養する工程を含むことを特徴とするキメラタンパク質の製造方法により、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築するための分子が提供でき、これらを用いたホスホリパーゼＣの制御方法、ホスホリパーゼＣを介したシグナル伝達の解析方法、及び化合物のスクリーニング方法が提供できることを知見した。
【0008】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては以下のとおりである。即ち、
＜１＞ ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、ＳｓｐＢドメイン、及びホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインを有することを特徴とする、キメラタンパク質である。
＜２＞ 前記＜１＞に記載のキメラタンパク質をコードする塩基配列を含むことを特徴とする核酸である。
＜３＞ 前記＜２＞に記載の核酸を含むことを特徴とするベクターである。
＜４＞ 前記＜２＞記載の核酸を含むことを特徴とする細胞である。
＜５＞ 前記＜４＞に記載の細胞を培養する工程を含むことを特徴とするキメラタンパク質の製造方法である。
＜６＞ 前記＜４＞に記載の細胞に青色光を照射することを含むホスホリパーゼＣの制御方法である。
＜７＞ 前記＜４＞に記載の細胞に青色光を照射することを含むホスホリパーゼＣを介したシグナル伝達の解析方法である。
＜８＞ 前記＜４＞に記載の細胞に青色光を照射することを含む化合物のスクリーニング方法である。
＜１＞ ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、ＳｓｐＢドメイン、及びホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインを有することを特徴とする、キメラタンパク質である。
＜２＞ 前記＜１＞に記載のキメラタンパク質をコードする塩基配列を含むことを特徴とする核酸である。
＜３＞ 前記＜２＞に記載の核酸を含むことを特徴とするベクターである。
＜４＞ 前記＜２＞記載の核酸を含むことを特徴とする細胞である。
＜５＞ 前記＜４＞に記載の細胞を培養する工程を含むことを特徴とするキメラタンパク質の製造方法である。
＜６＞ 前記＜４＞に記載の細胞に青色光を照射することを含むホスホリパーゼＣの制御方法である。
＜７＞ 前記＜４＞に記載の細胞に青色光を照射することを含むホスホリパーゼＣを介したシグナル伝達の解析方法である。
＜８＞ 前記＜４＞に記載の細胞に青色光を照射することを含む化合物のスクリーニング方法である。
【発明の効果】
【0009】
本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築するための分子を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【発明を実施するための形態】
【0011】
（キメラタンパク質）
前記キメラタンパク質は、ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、ＳｓｐＢドメイン、及びホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインを有し、さらにその他の配列を有することができる。
これらの中でも、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、前記キメラタンパク質は、ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、ＳｓｐＢドメイン、及びホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインを、この順で有するものが好ましく、ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、ＳｓｐＢドメイン、及びホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインを、Ｎ末端側からこの順で有するものがより好ましい。
前記キメラタンパク質は、ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、ＳｓｐＢドメイン、及びホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインを有し、さらにその他の配列を有することができる。
これらの中でも、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、前記キメラタンパク質は、ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、ＳｓｐＢドメイン、及びホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインを、この順で有するものが好ましく、ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、ＳｓｐＢドメイン、及びホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインを、Ｎ末端側からこの順で有するものがより好ましい。
【0012】
－ホスホリパーゼＣ－
ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣとも称する）、生体膜の主要成分であるリン脂質のグリセロールとリン酸の間のエステル結合を加水分解する酵素である。
前記リン脂質としては、例えば、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリンなどが挙げられる。
ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣとも称する）、生体膜の主要成分であるリン脂質のグリセロールとリン酸の間のエステル結合を加水分解する酵素である。
前記リン脂質としては、例えば、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリンなどが挙げられる。
【0013】
前記ホスファチジルイノシトールには、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトール一リン酸（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）が含まれる。
前記ホスファチジルイノシトール一リン酸（ＰＩＰ）としては、ＰＩ（３）Ｐ（ホスファチジルイノシトール－３－一リン酸）、ＰＩ（４）Ｐ（ホスファチジルイノシトール－４－一リン酸）、ＰＩ（５）Ｐ（ホスファチジルイノシトール－５－一リン酸）が挙げられる。
前記ホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）としては、ＰＩ（３，４）Ｐ２（ホスファチジルイノシトール－３，４－二リン酸）、ＰＩ（３，５）Ｐ２（ホスファチジルイノシトール－３，５－二リン酸）ＰＩ（４，５）Ｐ２（ホスファチジルイノシトール－４，５－ビスリン酸）が挙げられる。
前記ホスファチジルイノシトール一リン酸（ＰＩＰ）としては、ＰＩ（３）Ｐ（ホスファチジルイノシトール－３－一リン酸）、ＰＩ（４）Ｐ（ホスファチジルイノシトール－４－一リン酸）、ＰＩ（５）Ｐ（ホスファチジルイノシトール－５－一リン酸）が挙げられる。
前記ホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）としては、ＰＩ（３，４）Ｐ２（ホスファチジルイノシトール－３，４－二リン酸）、ＰＩ（３，５）Ｐ２（ホスファチジルイノシトール－３，５－二リン酸）ＰＩ（４，５）Ｐ２（ホスファチジルイノシトール－４，５－ビスリン酸）が挙げられる。
【0014】
前記ホスホリパーゼＣは、前記ＰＩ（４，５）Ｐ２（ホスファチジルイノシトール－４，５－ビスリン酸）を、セカンドメッセンジャーである、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）とイノシトール３リン酸（ＩＰ３）に分解する。
【0015】
前記ホスホリパーゼＣとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＰＬＣβ１、ＰＬＣβ２、ＰＬＣβ３、ＰＬＣβ４等のＰＬＣβ、ＰＬＣγ１、ＰＬＣγ２等のＰＬＣγ、ＰＬＣδ１、ＰＬＣδ３、ＰＬＣδ４等のＰＬＣδ、ＰＬＣε１等のＰＬＣε、ＰＬＣη１、ＰＬＣη２等のＰＬＣη、ＰＬＣζ１等のＰＬＣζなどが挙げられる。
これらの中でも、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、ＰＬＣβが好ましく、ＰＬＣＢβ３がより好ましい。
これらの中でも、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、ＰＬＣβが好ましく、ＰＬＣＢβ３がより好ましい。
【0016】
前記ホスホリパーゼＣは、ＥＦハンドモチーフドメイン、ＴＩＭドメイン（Ｘドメインとも称する）、バレルドメイン（Ｙドメインとも称する）、及びＣ２ドメインを有する。
前記ＴＩＭドメイン（Ｘドメインとも称する）とバレルドメイン（Ｙドメインとも称する）の間の配列をＸ－Ｙリンカー配列と称する。
前記ホスホリパーゼＣは、ＰＬＣζを除き、ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ（ＰＨ）ドメインを有する。
前記ＴＩＭドメイン（Ｘドメインとも称する）とバレルドメイン（Ｙドメインとも称する）の間の配列をＸ－Ｙリンカー配列と称する。
前記ホスホリパーゼＣは、ＰＬＣζを除き、ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ（ＰＨ）ドメインを有する。
【0017】
前記ホスホリパーゼＣの由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真核生物、原核生物が挙げられる。
これらの中でも、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、真核生物が好ましい。
前記真核生物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、動物、植物、菌類、原生生物などが挙げられる。
これらの中でも、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、動物が好ましく、哺乳類動物がより好ましい。
これらの中でも、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、真核生物が好ましい。
前記真核生物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、動物、植物、菌類、原生生物などが挙げられる。
これらの中でも、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、動物が好ましく、哺乳類動物がより好ましい。
【0018】
【0019】
＜ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン＞
前記ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメインのアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、配列番号１で表されるアミノ酸配列と、８０％以上の配列同一性を有するものが好ましく、８５％以上の配列同一性を有するものがより好ましく、９０％以上の配列同一性を有するものがさらに好ましく、９５％以上の配列同一性を有するものがよりさらに好ましく、９７％以上の配列同一性を有するものが特に好ましく、９９％以上の配列同一性を有するものが最も好ましい。
前記ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメインのアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、配列番号１で表されるアミノ酸配列と、８０％以上の配列同一性を有するものが好ましく、８５％以上の配列同一性を有するものがより好ましく、９０％以上の配列同一性を有するものがさらに好ましく、９５％以上の配列同一性を有するものがよりさらに好ましく、９７％以上の配列同一性を有するものが特に好ましく、９９％以上の配列同一性を有するものが最も好ましい。
【0020】
＜ＳｓｐＢドメイン＞
前記ＳｓｐＢは、ＳｓｒＡ（ＳｓｒＡ標識とも称する）ペプチドに結合するアダプター分子である。
前記ＳｓｐＢは、ＳｓｒＡ（ＳｓｒＡ標識とも称する）ペプチドに結合するアダプター分子である。
【0021】
前記ＳｓｐＢの由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真核生物、原核生物が挙げられる。
これらの中でも、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、原核生物が好ましい。
前記原核生物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、古細菌、細菌などが挙げられる。
これらの中でも、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、細菌が好ましく、大腸菌がより好ましい。
これらの中でも、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、原核生物が好ましい。
前記原核生物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、古細菌、細菌などが挙げられる。
これらの中でも、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、細菌が好ましく、大腸菌がより好ましい。
【0022】
前記ＳｓｐＢドメインのアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、配列番号２で表されるアミノ酸配列と、８０％以上の配列同一性を有するものが好ましく、８５％以上の配列同一性を有するものがより好ましく、９０％以上の配列同一性を有するものがさらに好ましく、９５％以上の配列同一性を有するものがよりさらに好ましく、９７％以上の配列同一性を有するものが特に好ましく、９９％以上の配列同一性を有するものが最も好ましい。
【0023】
＜ホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメイン＞
前記ホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインのアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、配列番号３で表されるアミノ酸配列と、８０％以上の配列同一性を有するものが好ましく、８５％以上の配列同一性を有するものがより好ましく、９０％以上の配列同一性を有するものがさらに好ましく、９５％以上の配列同一性を有するものがよりさらに好ましく、９７％以上の配列同一性を有するものが特に好ましく、９９％以上の配列同一性を有するものが最も好ましい。
前記ホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインのアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、配列番号３で表されるアミノ酸配列と、８０％以上の配列同一性を有するものが好ましく、８５％以上の配列同一性を有するものがより好ましく、９０％以上の配列同一性を有するものがさらに好ましく、９５％以上の配列同一性を有するものがよりさらに好ましく、９７％以上の配列同一性を有するものが特に好ましく、９９％以上の配列同一性を有するものが最も好ましい。
【0024】
＜その他の配列＞
前記その他の配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ（ＰＨ）ドメイン、ＥＦハンドモチーフドメイン、Ｘ－Ｙリンカー配列、Ｃ２ドメイン、近位Ｃ末端ドメイン（近位ＣＴＤ）、遠位Ｃ末端ドメイン（遠位ＣＴＤ）、タグ配列などが挙げられる。
これらの中でも、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、前記キメラタンパク質は、前記ＥＦハンドモチーフドメイン、及び前記Ｃ２ドメインを有するものが好ましく、前記ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ（ＰＨ）ドメイン、前記ＥＦハンドモチーフドメイン、及び前記Ｃ２ドメインを有するものがより好ましく、前記ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ（ＰＨ）ドメイン、前記ＥＦハンドモチーフドメイン、前記Ｃ２ドメイン、及び前記タグ配列を有するものがより好ましい。
前記その他の配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ（ＰＨ）ドメイン、ＥＦハンドモチーフドメイン、Ｘ－Ｙリンカー配列、Ｃ２ドメイン、近位Ｃ末端ドメイン（近位ＣＴＤ）、遠位Ｃ末端ドメイン（遠位ＣＴＤ）、タグ配列などが挙げられる。
これらの中でも、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、前記キメラタンパク質は、前記ＥＦハンドモチーフドメイン、及び前記Ｃ２ドメインを有するものが好ましく、前記ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ（ＰＨ）ドメイン、前記ＥＦハンドモチーフドメイン、及び前記Ｃ２ドメインを有するものがより好ましく、前記ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ（ＰＨ）ドメイン、前記ＥＦハンドモチーフドメイン、前記Ｃ２ドメイン、及び前記タグ配列を有するものがより好ましい。
【0025】
前記キメラタンパク質が、前記ＥＦハンドモチーフドメイン、及び前記Ｃ２ドメインを有する場合は、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、前記キメラタンパク質は、前記ＥＦハンドモチーフドメイン、前記ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、前記ＳｓｐＢドメイン、前記ホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメイン、及び前記Ｃ２ドメインを、この順で有するものが好ましく、前記ＥＦハンドモチーフドメイン、前記ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、前記ＳｓｐＢドメイン、前記ホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメイン、及び前記Ｃ２ドメインを、Ｎ末端側からこの順で有するものがより好ましい。
【0026】
前記キメラタンパク質が、前記ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ（ＰＨ）ドメイン、前記ＥＦハンドモチーフドメイン、及び前記Ｃ２ドメインを有する場合は、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、前記キメラタンパク質は、前記ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ（ＰＨ）ドメイン、前記ＥＦハンドモチーフドメイン、前記ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、前記ＳｓｐＢドメイン、前記ホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメイン、及び前記Ｃ２ドメインを、この順で有するものが好ましく、前記キメラタンパク質は、前記ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ（ＰＨ）ドメイン、前記ＥＦハンドモチーフドメイン、前記ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、前記ＳｓｐＢドメイン、前記ホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメイン、及び前記Ｃ２ドメインを、Ｎ末端側からこの順で有するものがより好ましい。
【0027】
前記キメラタンパク質が、前記ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ（ＰＨ）ドメイン、前記ＥＦハンドモチーフドメイン、前記Ｃ２ドメイン、及び前記タグ配列を有する場合は、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、前記キメラタンパク質は、前記ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ（ＰＨ）ドメイン、前記ＥＦハンドモチーフドメイン、前記ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、前記ＳｓｐＢドメイン、前記ホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメイン、前記Ｃ２ドメイン、及び前記タグ配列を、この順で有するものが好ましく、前記ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ（ＰＨ）ドメイン、前記ＥＦハンドモチーフドメイン、前記ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、前記ＳｓｐＢドメイン、前記ホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメイン、前記Ｃ２ドメイン、及び前記タグ配列を、Ｎ末端側からこの順で有するものがより好ましい。
【0028】
前記キメラタンパク質は、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、前記Ｘ－Ｙリンカー配列、前記近位Ｃ末端ドメイン（近位ＣＴＤ）、及び前記遠位Ｃ末端ドメイン（遠位ＣＴＤ）の少なくともいずれかを有さないものが好ましく、前記Ｘ－Ｙリンカー配列、前記近位Ｃ末端ドメイン（近位ＣＴＤ）、及び前記遠位Ｃ末端ドメイン（遠位ＣＴＤ）を有さないものがより好ましい。
【0029】
前記Ｘ－Ｙリンカー配列を有さないものの具体例としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有さないものが好ましく、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有さないものがより好ましい。
【0030】
＜＜ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ（ＰＨ）ドメイン＞＞
前記ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ（ＰＨ）ドメインとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、前記ホスホリパーゼＣのｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ（ＰＨ）ドメインが好ましい。
前記ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ（ＰＨ）ドメインとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、前記ホスホリパーゼＣのｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ（ＰＨ）ドメインが好ましい。
【0031】
＜＜ＥＦハンドモチーフドメイン＞＞
前記ＥＦハンドモチーフドメインとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、前記ホスホリパーゼＣのＥＦハンドモチーフドメインが好ましい。
前記ＥＦハンドモチーフドメインとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、前記ホスホリパーゼＣのＥＦハンドモチーフドメインが好ましい。
【0032】
＜＜Ｃ２ドメイン＞＞
前記Ｃ２ドメインとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、前記ホスホリパーゼＣのＣ２ドメインが好ましい。
前記Ｃ２ドメインとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、前記ホスホリパーゼＣのＣ２ドメインが好ましい。
【0033】
＜＜タグ配列＞＞
前記タグ配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｆｌａｇタグ、ヒスチジンタグ、Ｍｙｃタグ、蛍光タンパク質などが挙げられる。
前記タグ配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｆｌａｇタグ、ヒスチジンタグ、Ｍｙｃタグ、蛍光タンパク質などが挙げられる。
【0034】
前記キメラタンパク質のアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、配列番号６で表されるアミノ酸配列と、８０％以上の配列同一性を有するものが好ましく、８５％以上の配列同一性を有するものがより好ましく、９０％以上の配列同一性を有するものがさらに好ましく、９５％以上の配列同一性を有するものがよりさらに好ましく、９７％以上の配列同一性を有するものが特に好ましく、９９％以上の配列同一性を有するものが最も好ましい。
【0035】
（核酸）
前記核酸は、前記キメラタンパク質をコードする塩基配列を含み、さらにその他の塩基配列を含むことができる。
前記キメラタンパク質は、上述の（キメラタンパク質）に記載のとおりである。
前記核酸は、前記キメラタンパク質をコードする塩基配列を含み、さらにその他の塩基配列を含むことができる。
前記キメラタンパク質は、上述の（キメラタンパク質）に記載のとおりである。
【0036】
＜キメラタンパク質をコードする塩基配列＞
前記キメラタンパク質をコードする塩基配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、配列番号７で表される塩基配列と、８０％以上の配列同一性を有するものが好ましく、８５％以上の配列同一性を有するものがより好ましく、９０％以上の配列同一性を有するものがさらに好ましく、９５％以上の配列同一性を有するものがよりさらに好ましく、９７％以上の配列同一性を有するものが特に好ましく、９９％以上の配列同一性を有するものが最も好ましい。
前記キメラタンパク質をコードする塩基配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、配列番号７で表される塩基配列と、８０％以上の配列同一性を有するものが好ましく、８５％以上の配列同一性を有するものがより好ましく、９０％以上の配列同一性を有するものがさらに好ましく、９５％以上の配列同一性を有するものがよりさらに好ましく、９７％以上の配列同一性を有するものが特に好ましく、９９％以上の配列同一性を有するものが最も好ましい。
【0037】
＜その他の塩基配列＞
前記その他の塩基配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プロモーター配列、抗生物質耐性タンパク質をコードする塩基配列などが挙げられる。
前記その他の塩基配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プロモーター配列、抗生物質耐性タンパク質をコードする塩基配列などが挙げられる。
【0038】
（ベクター）
前記ベクターは、前記核酸を含むことができる。
前記核酸は、上述の（核酸）に記載のとおりである。
前記ベクターは、前記核酸を含むことができる。
前記核酸は、上述の（核酸）に記載のとおりである。
【0039】
前記ベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プラスミド、コスミド、ラムダファージ、人工染色体などが挙げられる。
【0040】
（細胞）
前記細胞は、前記核酸を含み、さらにその他の要素を含むことができる。
前記核酸は、上述の（核酸）に記載のとおりである。
前記細胞は、前記核酸を含み、さらにその他の要素を含むことができる。
前記核酸は、上述の（核酸）に記載のとおりである。
【0041】
＜その他の要素＞
前記その他の要素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記核酸以外のその他の核酸などが挙げられる。
前記その他の要素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記核酸以外のその他の核酸などが挙げられる。
【0042】
前記その他の核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＳｓｒＡをコードする塩基配列を含む核酸などが挙げられる。
【0043】
＜＜ＳｓｒＡをコードする塩基配列を含む核酸＞＞
前記ＳｓｒＡの由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真核生物、原核生物が挙げられる。
これらの中でも、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、原核生物が好ましい。
前記原核生物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、古細菌、細菌などが挙げられる。
前記ＳｓｒＡの由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真核生物、原核生物が挙げられる。
これらの中でも、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、原核生物が好ましい。
前記原核生物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、古細菌、細菌などが挙げられる。
【0044】
前記ＳｓｒＡのアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、配列番号８で表されるアミノ酸配列と、７０％以上の配列同一性を有するものが好ましく、７５％以上の配列同一性を有するものがより好ましく、８０％以上の配列同一性を有するものがさらに好ましく、８５％以上の配列同一性を有するものがよりさらに好ましく、９０％以上の配列同一性を有するものが特に好ましく、９５％以上の配列同一性を有するものが最も好ましい。
【0045】
前記ＳｓｒＡとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、エンバクのＬＯＶ２ドメインにＳｓｒＡペプチドが埋め込まれた配列（ｉＬＩＤ）であることが好ましい。
【0046】
前記エンバクのＬＯＶ２ドメインにＳｓｒＡペプチドが埋め込まれた配列（ｉＬＩＤ）のアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、配列番号９で表されるアミノ酸配列と、８０％以上の配列同一性を有するものが好ましく、８５％以上の配列同一性を有するものがより好ましく、９０％以上の配列同一性を有するものがさらに好ましく、９５％以上の配列同一性を有するものがよりさらに好ましく、９７％以上の配列同一性を有するものが特に好ましく、９９％以上の配列同一性を有するものが最も好ましい。
【0047】
前記ＳｓｒＡをコードする塩基配列を含む核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、プレニル化ペプチドであるＣＡＡＸをコードする塩基配列を含むものが好ましい。
【0048】
前記ＣＡＡＸのアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、配列番号１０で表されるアミノ酸配列と、７０％以上の配列同一性を有するものが好ましく、７５％以上の配列同一性を有するものがより好ましく、８０％以上の配列同一性を有するものがさらに好ましく、８５％以上の配列同一性を有するものがよりさらに好ましく、９０％以上の配列同一性を有するものが特に好ましく、９５％以上の配列同一性を有するものが最も好ましい。
【0049】
前記ＳｓｒＡをコードする塩基配列を含む核酸は、タグ配列をコードする塩基配列を含むことが好ましい。
前記タグ配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｆｌａｇタグ、ヒスチジンタグ、Ｍｙｃタグ、蛍光タンパク質などが挙げられる。
前記タグ配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｆｌａｇタグ、ヒスチジンタグ、Ｍｙｃタグ、蛍光タンパク質などが挙げられる。
【0050】
前記細胞は、前記核酸を含むベクターを、宿主細胞に導入することで得ることができる。
【0051】
前記宿主細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、真核細胞が好ましく、動物細胞がより好ましく、哺乳類細胞がさらに好ましい。
【0052】
（キメラタンパク質の製造方法）
前記キメラタンパク質の製造方法は、細胞を培養する工程を含み、さらにその他の工程を含むことができる。
前記細胞は、上述の（細胞）に記載のとおりである。
前記キメラタンパク質の製造方法は、細胞を培養する工程を含み、さらにその他の工程を含むことができる。
前記細胞は、上述の（細胞）に記載のとおりである。
【0053】
＜細胞を培養する工程＞
前記細胞を培養する工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記細胞を培養培地にて培養する工程などが挙げられる。
前記細胞を培養する工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記細胞を培養培地にて培養する工程などが挙げられる。
【0054】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記細胞を培養する工程で得られた培養細胞から、前記キメラタンパク質を抽出する工程、前記キメラタンパク質を精製する工程などが挙げられる。
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記細胞を培養する工程で得られた培養細胞から、前記キメラタンパク質を抽出する工程、前記キメラタンパク質を精製する工程などが挙げられる。
【0055】
（ホスホリパーゼＣの制御方法）
前記ホスホリパーゼＣの制御方法は、前記細胞に青色光を照射することを含む。
前記細胞は、上述の（細胞）に記載のとおりである。これらの中でも、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、前記細胞は、前記ＳｓｒＡをコードする塩基配列を含む核酸を含む細胞が好ましい。
前記ホスホリパーゼＣの制御方法は、前記細胞に青色光を照射することを含む。
前記細胞は、上述の（細胞）に記載のとおりである。これらの中でも、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、前記細胞は、前記ＳｓｒＡをコードする塩基配列を含む核酸を含む細胞が好ましい。
【0056】
＜青色光＞
前記青色光としては、一般に青色光と呼ばれる波長域（例えば、３８０ｎｍから５３０ｎｍなど）を含む光である限り、特に制限はなく、前記波長域内の単波長光でもよいし、前記波長域の少なくとも一部乃至全部を含む光（例えば、太陽光など）でもよい。
前記青色光としては、一般に青色光と呼ばれる波長域（例えば、３８０ｎｍから５３０ｎｍなど）を含む光である限り、特に制限はなく、前記波長域内の単波長光でもよいし、前記波長域の少なくとも一部乃至全部を含む光（例えば、太陽光など）でもよい。
【0057】
前記青色光の照射時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１秒間以上３０分間以下が好ましく、１秒間以上２０分間以下がより好ましく、１秒間以上１０分間以下がさらに好ましく、５秒間以上１５分間以下が特に好ましい。
【0058】
前記青色光の照射強度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１μＷ／ｍｍ２以上１００μＷ／ｍｍ２以下が好ましく、１μＷ／ｍｍ２以上５０μＷ／ｍｍ２以下がより好ましく、５μＷ／ｍｍ２以上３０μＷ／ｍｍ２以下がさらに好ましく、１０μＷ／ｍｍ２以上３０μＷ／ｍｍ２以下が特に好ましい。
【0059】
（ホスホリパーゼＣを介したシグナル伝達の解析方法）
前記ホスホリパーゼＣを介したシグナル伝達の解析方法は、前記細胞に青色光を照射することを含む。
前記細胞は、上述の（細胞）に記載のとおりである。これらの中でも、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、前記細胞は、前記ＳｓｒＡをコードする塩基配列を含む核酸を含む細胞が好ましい。
前記青色光は、上述の、（ホスホリパーゼＣの制御方法）に記載のとおりである。
前記ホスホリパーゼＣを介したシグナル伝達の解析方法は、前記細胞に青色光を照射することを含む。
前記細胞は、上述の（細胞）に記載のとおりである。これらの中でも、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、前記細胞は、前記ＳｓｒＡをコードする塩基配列を含む核酸を含む細胞が好ましい。
前記青色光は、上述の、（ホスホリパーゼＣの制御方法）に記載のとおりである。
【0060】
（化合物のスクリーニング方法）
前記化合物のスクリーニング方法は、前記細胞に青色光を照射することを含む。
前記細胞は、上述の（細胞）に記載のとおりである。これらの中でも、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、前記細胞は、前記ＳｓｒＡをコードする塩基配列を含む核酸を含む細胞が好ましい。
前記青色光は、上述の、（ホスホリパーゼＣの制御方法）に記載のとおりである。
前記化合物のスクリーニング方法は、前記細胞に青色光を照射することを含む。
前記細胞は、上述の（細胞）に記載のとおりである。これらの中でも、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築する点から、前記細胞は、前記ＳｓｒＡをコードする塩基配列を含む核酸を含む細胞が好ましい。
前記青色光は、上述の、（ホスホリパーゼＣの制御方法）に記載のとおりである。
【0061】
前記化合物のスクリーニング方法により、ＰＬＣシグナルが介在する疾患において、治療薬の探索を行うことができ、脳神経科学、アレルギー、骨髄増殖、免疫、癌などを標的とした医学・生命科学分野の研究および創薬に有用である。
【0062】
本発明により、ＰＬＣが関わるシグナル伝達を時空間的に顕密に制御することが可能となる。この利点は、特定の細胞及び組織に光駆動型ＰＬＣを選択的に発現させることはもちろん、青色光を用いた厳密な刺激時間を制御することが可能であることを意味する。自然界のＰＬＣ関連シグナル経路は受容体を起点とするためシグナル間のクロストークが発生するが、光駆動型ＰＬＣを利用することによりシグナルクロストークからＰＬＣの経路を切り離すことが可能となる。これらの利点を踏まえ、ＰＬＣの生理的意義を究明する研究に応用できることはもちろん、ＰＬＣ関連の細胞モデル及び動物モデルの作製が可能となり、アレルギー、骨髄増殖、免疫疾患、癌、神経変性疾患、運動系疾患など、幅広い疾患モデルへの応用と治療技術の開発に繋がる。
【実施例0063】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【0064】
＜参考例１ マウスＰＬＣβ３の活性中心の立体構造＞
マウスＰＬＣβ３の活性中心の立体構造は、すでに報告されている（ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｎｋ ＰＢＤ： ７ＳＱ２）。
マウスＰＬＣβ３の活性中心の立体構造を図１Ａに示した。
マウスＰＬＣβ３の活性中心の立体構造は、すでに報告されている（ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｎｋ ＰＢＤ： ７ＳＱ２）。
マウスＰＬＣβ３の活性中心の立体構造を図１Ａに示した。
【0065】
＜参考例２ ＳｓｐＢドメインを付加したマウスＰＬＣβ３の活性中心の立体構造＞
ＳｓｐＢドメインを付加したマウスＰＬＣβ３（配列番号６で表されるアミノ酸配列）の活性中心の立体構造を予測した。
立体構造は、人工知能基盤のＡｌｐｈａｆｏｌｄ２ （ＣｏｌａｂＦｏｌｄ ｖ１．５．２．ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｌａｂ．ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｇｏｏｇｌｅ．ｃｏｍ／ｇｉｔｈｕｂ／ｓｏｋｒｙｐｔｏｎ／ＣｏｌａｂＦｏｌｄ／ｂｌｏｂ／ｍａｉｎ／ＡｌｐｈａＦｏｌｄ２．ｉｐｙｎｂ＃ｓｃｒｏｌｌＴｏ＝ｋＯｂｌＡｏ－ｘｅｔｇｘにより予測した。詳細なパラメーターは、ｔｅｍｐｌａｔｅ ｍｏｄｅ： ｐｄｂ７０， ｍｓａ： ｍｍｓｅｑ２＿ｕｎｉｒｅｆ＿ｅｎｖとし、予測データの最もランクが高い立体構造を採用した。
青色光照射時の、ＳｓｐＢドメインを付加したマウスＰＬＣβ３の活性中心の立体構造の予測図を図１Ｂに示した。
ＳｓｐＢドメインを付加したマウスＰＬＣβ３（配列番号６で表されるアミノ酸配列）の活性中心の立体構造を予測した。
立体構造は、人工知能基盤のＡｌｐｈａｆｏｌｄ２ （ＣｏｌａｂＦｏｌｄ ｖ１．５．２．ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｌａｂ．ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｇｏｏｇｌｅ．ｃｏｍ／ｇｉｔｈｕｂ／ｓｏｋｒｙｐｔｏｎ／ＣｏｌａｂＦｏｌｄ／ｂｌｏｂ／ｍａｉｎ／ＡｌｐｈａＦｏｌｄ２．ｉｐｙｎｂ＃ｓｃｒｏｌｌＴｏ＝ｋＯｂｌＡｏ－ｘｅｔｇｘにより予測した。詳細なパラメーターは、ｔｅｍｐｌａｔｅ ｍｏｄｅ： ｐｄｂ７０， ｍｓａ： ｍｍｓｅｑ２＿ｕｎｉｒｅｆ＿ｅｎｖとし、予測データの最もランクが高い立体構造を採用した。
青色光照射時の、ＳｓｐＢドメインを付加したマウスＰＬＣβ３の活性中心の立体構造の予測図を図１Ｂに示した。
【0066】
【0067】
１．ｏｐｔｏ－α１ＡＲ
（比較例１ ｏｐｔｏ－α１－ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｏｐｔｏ－α１ＡＲ）発現ベクターの製造）
ｏｐｔｏ－α１ＡＲ発現ベクターは、Ａｄｄｇｅｎｅから購入したｐｃＤＮＡ３．１／ｏｐｔｏ－ａ１ＡＲ－ＥＹＦＰプラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ ＃２０９４７． Ａｉｒａｎ， Ｒａａｇ Ｄ．， ｅｔ ａｌ． “Ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ ｐｒｅｃｉｓｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．” Ｎａｔｕｒｅ ４５８．７２４１（２００９）：１０２５－１０２９．）のｏｐｔｏ－ａ１ＡＲコード領域をＰＣＲで増幅し、ｐｃＤＮＡ５に挿入した。挿入する際、Ｃ末端領域にＦｌａｇタグを付加した。ＤＮＡ断片の挿入にはＩｎ－ｆｕｓｉｏｎシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。
（比較例１ ｏｐｔｏ－α１－ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｏｐｔｏ－α１ＡＲ）発現ベクターの製造）
ｏｐｔｏ－α１ＡＲ発現ベクターは、Ａｄｄｇｅｎｅから購入したｐｃＤＮＡ３．１／ｏｐｔｏ－ａ１ＡＲ－ＥＹＦＰプラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ ＃２０９４７． Ａｉｒａｎ， Ｒａａｇ Ｄ．， ｅｔ ａｌ． “Ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ ｐｒｅｃｉｓｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．” Ｎａｔｕｒｅ ４５８．７２４１（２００９）：１０２５－１０２９．）のｏｐｔｏ－ａ１ＡＲコード領域をＰＣＲで増幅し、ｐｃＤＮＡ５に挿入した。挿入する際、Ｃ末端領域にＦｌａｇタグを付加した。ＤＮＡ断片の挿入にはＩｎ－ｆｕｓｉｏｎシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。
【0068】
２．ｏｐｔｏ－ｐｌｃｂ３
光駆動型ＰＬＣの作製おいて、ＰＬＣと細胞形質膜との相互作用及び自己抑制をどのように制御するかが重要である。
内在性ＰＬＣβ３は三量体Ｇタンパク質のなかでαサブユニットのＧｑ及びＧβγ複合体との相互作用により活性化される。Ｇｑは、ＰＬＣの立体構造を変動させるだけでなく、ＰＬＣと細胞形質膜との相互作用を媒介する。Ｇｑは近位Ｃ末端ドメイン（近位ＣＴＤ）に結合する。この際、遠位Ｃ末端ドメイン（遠位ＣＴＤ）はＰＬＣと細胞膜の相互作用およびＧｑ結合を助ける。
光駆動型ＰＬＣの作製おいて、ＰＬＣと細胞形質膜との相互作用及び自己抑制をどのように制御するかが重要である。
内在性ＰＬＣβ３は三量体Ｇタンパク質のなかでαサブユニットのＧｑ及びＧβγ複合体との相互作用により活性化される。Ｇｑは、ＰＬＣの立体構造を変動させるだけでなく、ＰＬＣと細胞形質膜との相互作用を媒介する。Ｇｑは近位Ｃ末端ドメイン（近位ＣＴＤ）に結合する。この際、遠位Ｃ末端ドメイン（遠位ＣＴＤ）はＰＬＣと細胞膜の相互作用およびＧｑ結合を助ける。
【0069】
本発明の光駆動型ＰＬＣでは、ＰＬＣを細胞膜へ動員させるために、ｉＬＩＤ－ＳｓｐＢのモジュール（ＰＮＡＳ ２０１５ １１２：１１２－１１７）を用いた。ｉＬＩＤにはＲａｓ４ＢのＣＡＡＸモチーフをＣ末端に付加し、光照射によりＳｓｐＢを有するＰＬＣの膜への局在を誘導できるよう設計した。内在性Ｇｑによる活性化を防ぐため、近位ＣＴＤ及び遠位ＣＴＤを欠失させた。
【0070】
（比較例２ ｐｌｃｂ３Δ８４７発現ベクターの製造）
ｐｌｃｂ３Δ８４７は近位ＣＴＤ及び遠位ＣＴＤが欠失された領域である。ｐｌｃｂ３Δ８４７のコード領域（アミノ酸１－８４７）を、Ｃ末端Ｆｌａｇタグつきのプライマーを用い、ＰＣＲで増幅し、ｐｃＤＮＡ５ ＦＲＴ ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入し、ｐｌｃｂ３Δ８４７発現ベクターを製造した。ＤＮＡ断片の挿入にはＩｎ－ｆｕｓｉｏｎシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。
図２の１段目にＰＬＣβ３タンパク質のドメイン構造を示し、図２の２段目にｐｌｃｂ３Δ８４７タンパク質のドメイン構造を示した。
図４Ａの１段目にＰＬＣβ３タンパク質のドメイン構造を示し、図４Ａの２段目にｐｌｃｂ３Δ８４７タンパク質のドメイン構造を示した。
ｐｌｃｂ３Δ８４７は近位ＣＴＤ及び遠位ＣＴＤが欠失された領域である。ｐｌｃｂ３Δ８４７のコード領域（アミノ酸１－８４７）を、Ｃ末端Ｆｌａｇタグつきのプライマーを用い、ＰＣＲで増幅し、ｐｃＤＮＡ５ ＦＲＴ ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入し、ｐｌｃｂ３Δ８４７発現ベクターを製造した。ＤＮＡ断片の挿入にはＩｎ－ｆｕｓｉｏｎシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。
図２の１段目にＰＬＣβ３タンパク質のドメイン構造を示し、図２の２段目にｐｌｃｂ３Δ８４７タンパク質のドメイン構造を示した。
図４Ａの１段目にＰＬＣβ３タンパク質のドメイン構造を示し、図４Ａの２段目にｐｌｃｂ３Δ８４７タンパク質のドメイン構造を示した。
【0071】
（実施例１ ｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ発現ベクターの製造）
光駆動型ＰＬＣの製造において、ＳｓｐＢを付加する場所は、形質膜へ動員する役割と自己抑制、又は活性を損なわないために、極めて重要である。Ｘ－Ｙリンカー配列は構造を持たない天然変性領域であるがｂａｒｒｅｌ側には酸性アミノ酸のパッチ領域（ａｃｉｄ）と活性中心を蓋のように被っているヘリックス構造（ＴＤＥＧＴ配列、Ｌｉｄ）を有する。
比較例２のｐｌｃｂ３Δ８４７遺伝子に代えて、ｐｌｃｂ３Δ８４７遺伝子のＸ－Ｙリンカー配列を全て削除しＳｓｐＢを挿入した、ｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ遺伝子を使用した以外は、比較例１と同様の方法で、ｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ発現ベクター（配列番号１１）を製造した。
ＳｓｐＢ遺伝子は、配列番号２で表されるＳｓｐＢのアミノ酸配列に相当する遺伝子配列を化学合成した（ｇＢｌｏｃｋ， ＩＤＴ）。
図２の１段目にＰＬＣβ３タンパク質のドメイン構造を示し、図２の３段目にｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢタンパク質のドメイン構造を示した。
図４Ａの１段目にＰＬＣβ３タンパク質のドメイン構造を示し、図４Ａの４段目にｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢタンパク質のドメイン構造を示した。
光駆動型ＰＬＣの製造において、ＳｓｐＢを付加する場所は、形質膜へ動員する役割と自己抑制、又は活性を損なわないために、極めて重要である。Ｘ－Ｙリンカー配列は構造を持たない天然変性領域であるがｂａｒｒｅｌ側には酸性アミノ酸のパッチ領域（ａｃｉｄ）と活性中心を蓋のように被っているヘリックス構造（ＴＤＥＧＴ配列、Ｌｉｄ）を有する。
比較例２のｐｌｃｂ３Δ８４７遺伝子に代えて、ｐｌｃｂ３Δ８４７遺伝子のＸ－Ｙリンカー配列を全て削除しＳｓｐＢを挿入した、ｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ遺伝子を使用した以外は、比較例１と同様の方法で、ｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ発現ベクター（配列番号１１）を製造した。
ＳｓｐＢ遺伝子は、配列番号２で表されるＳｓｐＢのアミノ酸配列に相当する遺伝子配列を化学合成した（ｇＢｌｏｃｋ， ＩＤＴ）。
図２の１段目にＰＬＣβ３タンパク質のドメイン構造を示し、図２の３段目にｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢタンパク質のドメイン構造を示した。
図４Ａの１段目にＰＬＣβ３タンパク質のドメイン構造を示し、図４Ａの４段目にｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢタンパク質のドメイン構造を示した。
【0072】
（比較例３ ｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ－ｌｉｄ発現ベクターの製造）
実施例１において、Ｘ－Ｙリンカー配列のＣ末端（ｂａｒｒｅｌ側）の１１アミノ酸（配列番号４：活性中心を蓋のように被っているヘリックス構造（ＴＤＥＧＴ配列、Ｌｉｄ））を残した以外は、実施例１と同様の方法で、ｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ－ｌｉｄ発現ベクターを製造した。
図２の１段目にＰＬＣβ３タンパク質のドメイン構造を示し、図２の４段目にｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ－ｌｉｄタンパク質のドメイン構造を示した。
実施例１において、Ｘ－Ｙリンカー配列のＣ末端（ｂａｒｒｅｌ側）の１１アミノ酸（配列番号４：活性中心を蓋のように被っているヘリックス構造（ＴＤＥＧＴ配列、Ｌｉｄ））を残した以外は、実施例１と同様の方法で、ｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ－ｌｉｄ発現ベクターを製造した。
図２の１段目にＰＬＣβ３タンパク質のドメイン構造を示し、図２の４段目にｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ－ｌｉｄタンパク質のドメイン構造を示した。
【0073】
（比較例４ ｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ－ａｃｉｄ発現ベクターの製造）
実施例１において、Ｘ－Ｙリンカー配列のＣ末端（ｂａｒｒｅｌ側）の２１アミノ酸（配列番号５：酸性アミノ酸のパッチ領域（ａｃｉｄ）及び活性中心を蓋のように被っているヘリックス構造（ＴＤＥＧＴ配列、Ｌｉｄ））を残した以外は、実施例１と同様の方法で、ｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ－ａｃｉｄ発現ベクターを製造した。
図２の１段目にＰＬＣβ３タンパク質のドメイン構造を示し、図２の５段目にｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ－ａｃｉｄタンパク質のドメイン構造を示した。
実施例１において、Ｘ－Ｙリンカー配列のＣ末端（ｂａｒｒｅｌ側）の２１アミノ酸（配列番号５：酸性アミノ酸のパッチ領域（ａｃｉｄ）及び活性中心を蓋のように被っているヘリックス構造（ＴＤＥＧＴ配列、Ｌｉｄ））を残した以外は、実施例１と同様の方法で、ｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ－ａｃｉｄ発現ベクターを製造した。
図２の１段目にＰＬＣβ３タンパク質のドメイン構造を示し、図２の５段目にｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ－ａｃｉｄタンパク質のドメイン構造を示した。
【0074】
（比較例５ ｐｌｃｂ３ΔＸ－Ｙ発現ベクターの製造）
実施例１において、ＳｓｐＢを挿入しなかった以外は、実施例１と同様の方法で、ｐｌｃｂ３ΔＸ－Ｙ発現ベクターを製造した。
図４Ａの１段目にＰＬＣβ３タンパク質のドメイン構造を示し、図４Ａの３段目にｐｌｃｂ３ΔＸ－Ｙタンパク質のドメイン構造を示した。
実施例１において、ＳｓｐＢを挿入しなかった以外は、実施例１と同様の方法で、ｐｌｃｂ３ΔＸ－Ｙ発現ベクターを製造した。
図４Ａの１段目にＰＬＣβ３タンパク質のドメイン構造を示し、図４Ａの３段目にｐｌｃｂ３ΔＸ－Ｙタンパク質のドメイン構造を示した。
【0075】
（製造例１ ｍｕＧＦＰ－ｉＬＩＤ－ＣＡＡＸ発現ベクターの製造）
ｉＬＩＤ－ＳｓｐＢのモジュールのｉＬＩＤ用に、ｍｕＧＦＰ－ｉＬＩＤ－ＣＡＡＸ発現ベクターを作製した。
ＣＭＶプロモーター配列と、ｍｕＧＦＰ－ｉＬＩＤ－ＣＡＡＸ配列（配列番号１２で表されるアミノ酸配列に相当する遺伝子配列：ＰＮＡＳ ２０１５ １１２：１１２－１１７に記載される蛍光タンパク質領域をＶｅｎｕｓからｍｕＧＦＰに置換したもの）と、を含む配列を、ｐｃＤＮＡ５ ＦＲＴ ｖｅｃｔｏｒ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入し、ｍｕＧＦＰ－ｉＬＩＤ－ＣＡＡＸ発現ベクター（配列番号１３）を製造した。
ＣＡＡＸは、Ｒａｓ４ＢのＣＡＡＸモチーフを用いた。
ｍｕＧＦＰ－ｉＬＩＤ－ＣＡＡＸ配列は、配列番号１２で表されるアミノ酸配列に相当する遺伝子配列を化学合成した（ｇＢｌｏｃｋ， ＩＤＴ）。
図２の６段目にｍｕＧＦＰ－ｉＬＩＤ－ＣＡＡＸ配列の構造を示した。
ｉＬＩＤ－ＳｓｐＢのモジュールのｉＬＩＤ用に、ｍｕＧＦＰ－ｉＬＩＤ－ＣＡＡＸ発現ベクターを作製した。
ＣＭＶプロモーター配列と、ｍｕＧＦＰ－ｉＬＩＤ－ＣＡＡＸ配列（配列番号１２で表されるアミノ酸配列に相当する遺伝子配列：ＰＮＡＳ ２０１５ １１２：１１２－１１７に記載される蛍光タンパク質領域をＶｅｎｕｓからｍｕＧＦＰに置換したもの）と、を含む配列を、ｐｃＤＮＡ５ ＦＲＴ ｖｅｃｔｏｒ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入し、ｍｕＧＦＰ－ｉＬＩＤ－ＣＡＡＸ発現ベクター（配列番号１３）を製造した。
ＣＡＡＸは、Ｒａｓ４ＢのＣＡＡＸモチーフを用いた。
ｍｕＧＦＰ－ｉＬＩＤ－ＣＡＡＸ配列は、配列番号１２で表されるアミノ酸配列に相当する遺伝子配列を化学合成した（ｇＢｌｏｃｋ， ＩＤＴ）。
図２の６段目にｍｕＧＦＰ－ｉＬＩＤ－ＣＡＡＸ配列の構造を示した。
【0076】
＜試験例１：タンパク質のリン酸化の検出＞
図３Ａに示したとおり、ＰＬＣは、ホスファチジルイノシトールを、セカンドメッセンジャーである、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）とイノシトール３リン酸（ＩＰ３）に分解する酵素である。ＰＬＣにより産生されるジアシルグリセロールとイノシトール３リン酸はＰＫＣを活性化し、その基質であるＰＫＤ１のリン酸化とＥＲＫの活性化を促す。これらのシグナル伝達経路を利用して、ＰＬＣの活性をウェスタンブロット法で検出した。
図３Ａに示したとおり、ＰＬＣは、ホスファチジルイノシトールを、セカンドメッセンジャーである、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）とイノシトール３リン酸（ＩＰ３）に分解する酵素である。ＰＬＣにより産生されるジアシルグリセロールとイノシトール３リン酸はＰＫＣを活性化し、その基質であるＰＫＤ１のリン酸化とＥＲＫの活性化を促す。これらのシグナル伝達経路を利用して、ＰＬＣの活性をウェスタンブロット法で検出した。
【0077】
（製造例２ ＨＡタグ付加ＰＫＤ１（ＨＡ－ＰＫＤ１）発現ベクターの製造）
ＨＡタグ付加ＰＫＤ１（ＨＡ－ＰＫＤ１）発現ベクターは、マウス脳のｃＤＮＡを鋳型としＰＫＤ１をコードする領域をＰＣＲ増幅し、ｐＣＭＶ－ＨＡベクター（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入し、取得した。ＤＮＡ断片の挿入にはＩｎ－ｆｕｓｉｏｎシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。
ＨＡタグ付加ＰＫＤ１（ＨＡ－ＰＫＤ１）発現ベクターは、マウス脳のｃＤＮＡを鋳型としＰＫＤ１をコードする領域をＰＣＲ増幅し、ｐＣＭＶ－ＨＡベクター（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入し、取得した。ＤＮＡ断片の挿入にはＩｎ－ｆｕｓｉｏｎシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。
【0078】
＜＜試験例１－１＞＞
比較例１で製造したｏｐｔｏ－α１ＡＲ発現ベクター、及び製造例２で製造したＨＡ－ＰＫＤ１発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入して共発現させた。
２４時間後に、暗所に静置した細胞（青色ＬＥＤ光を照射しなかった細胞：暗状態）、及び２０．３μＷ／ｍｍ２強度の青色ＬＥＤ光を５分間照射した細胞（明状態）から、タンパク質抽出液を調製し、ウェスタンブロット法により、リン酸化ＰＫＤ１（ｐＳ７４４／７４８：Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＰＫＤ（Ｓ７４４／７４８）抗体＃２０５４、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、ＨＡ－ＰＫＤ１（ＨＡ－Ｔａｇ 抗体＃３７２４、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、リン酸化ＥＲＫ（ｐＴ２０２／ｐＹ２０４：Ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ４４／ｐ４２ ＭＡＰＫ 抗体＃４３７０、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、ＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ抗体＃４６９５、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、Ｆｌａｇ（ＤＤＤＤＫ－ｔａｇ抗体Ｍ１８５－３Ｌ、ＭＢＬ社）、及びｍｕＧＦＰ－ｉＬＩＤ－ＣＡＡＸ（ＧＦＰ抗体５９８、ＭＢＬ社）を検出した。
比較例１で製造したｏｐｔｏ－α１ＡＲ発現ベクター、及び製造例２で製造したＨＡ－ＰＫＤ１発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入して共発現させた。
２４時間後に、暗所に静置した細胞（青色ＬＥＤ光を照射しなかった細胞：暗状態）、及び２０．３μＷ／ｍｍ２強度の青色ＬＥＤ光を５分間照射した細胞（明状態）から、タンパク質抽出液を調製し、ウェスタンブロット法により、リン酸化ＰＫＤ１（ｐＳ７４４／７４８：Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＰＫＤ（Ｓ７４４／７４８）抗体＃２０５４、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、ＨＡ－ＰＫＤ１（ＨＡ－Ｔａｇ 抗体＃３７２４、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、リン酸化ＥＲＫ（ｐＴ２０２／ｐＹ２０４：Ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ４４／ｐ４２ ＭＡＰＫ 抗体＃４３７０、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、ＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ抗体＃４６９５、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、Ｆｌａｇ（ＤＤＤＤＫ－ｔａｇ抗体Ｍ１８５－３Ｌ、ＭＢＬ社）、及びｍｕＧＦＰ－ｉＬＩＤ－ＣＡＡＸ（ＧＦＰ抗体５９８、ＭＢＬ社）を検出した。
【0079】
結果を図３Ｂの左から１番目のレーン（暗状態）及び左から２番目のレーン（明状態）に示した。
図３Ｃの左から１番目のバー（暗状態）及び左から２番目のバー（明状態）に、リン酸化ＰＫＤ１についてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、明状態におけるリン酸化ＰＫＤ１のバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
図３Ｄの左から１番目のバー（暗状態）及び左から２番目のバー（明状態）に、リン酸化ＥＲＫについてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、明状態におけるリン酸化ＥＲＫのバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
図３Ｃの左から１番目のバー（暗状態）及び左から２番目のバー（明状態）に、リン酸化ＰＫＤ１についてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、明状態におけるリン酸化ＰＫＤ１のバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
図３Ｄの左から１番目のバー（暗状態）及び左から２番目のバー（明状態）に、リン酸化ＥＲＫについてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、明状態におけるリン酸化ＥＲＫのバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
【0080】
＜＜試験例１－２＞＞
比較例１で製造したｏｐｔｏ－α１ＡＲ発現ベクターに代えて、比較例２で製造したｐｌｃｂ３Δ８４７発現ベクター、及び製造例１で製造したｍｕＧＦＰ－ｉＬＩＤ－ＣＡＡＸ発現ベクターを使用した以外は、試験例１－１と同様の方法で、ウェスタンブロットを行った。
比較例１で製造したｏｐｔｏ－α１ＡＲ発現ベクターに代えて、比較例２で製造したｐｌｃｂ３Δ８４７発現ベクター、及び製造例１で製造したｍｕＧＦＰ－ｉＬＩＤ－ＣＡＡＸ発現ベクターを使用した以外は、試験例１－１と同様の方法で、ウェスタンブロットを行った。
【0081】
結果を図３Ｂの左から３番目のレーン（暗状態）及び左から４番目のレーン（明状態）に示した。
図３Ｃの左から３番目のバー（暗状態）及び左から４番目のバー（明状態）に、リン酸化ＰＫＤ１についてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、試験例１－１（ｏｐｔｏ－α１ＡＲ発現ベクター）の明状態におけるリン酸化ＰＫＤ１のバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
図３Ｄの左から３番目のバー（暗状態）及び左から４番目のバー（明状態）に、リン酸化ＥＲＫについてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、試験例１－１（ｏｐｔｏ－α１ＡＲ発現ベクター）の明状態におけるリン酸化ＥＲＫのバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
図３Ｃの左から３番目のバー（暗状態）及び左から４番目のバー（明状態）に、リン酸化ＰＫＤ１についてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、試験例１－１（ｏｐｔｏ－α１ＡＲ発現ベクター）の明状態におけるリン酸化ＰＫＤ１のバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
図３Ｄの左から３番目のバー（暗状態）及び左から４番目のバー（明状態）に、リン酸化ＥＲＫについてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、試験例１－１（ｏｐｔｏ－α１ＡＲ発現ベクター）の明状態におけるリン酸化ＥＲＫのバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
【0082】
＜＜試験例１－３＞＞
比較例１で製造したｏｐｔｏ－α１ＡＲ発現ベクターに代えて、実施例１で製造したｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ発現ベクター、及び製造例１で製造したｍｕＧＦＰ－ｉＬＩＤ－ＣＡＡＸ発現ベクターを使用した以外は、試験例１－１と同様の方法で、ウェスタンブロットを行った。
比較例１で製造したｏｐｔｏ－α１ＡＲ発現ベクターに代えて、実施例１で製造したｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ発現ベクター、及び製造例１で製造したｍｕＧＦＰ－ｉＬＩＤ－ＣＡＡＸ発現ベクターを使用した以外は、試験例１－１と同様の方法で、ウェスタンブロットを行った。
【0083】
結果を図３Ｂの左から５番目のレーン（暗状態）及び左から６番目のレーン（明状態）に示した。
図３Ｃの左から５番目のバー（暗状態）及び左から６番目のバー（明状態）に、リン酸化ＰＫＤ１についてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、試験例１－１（ｏｐｔｏ－α１ＡＲ発現ベクター）の明状態におけるリン酸化ＰＫＤ１のバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
図３Ｄの左から５番目のバー（暗状態）及び左から６番目のバー（明状態）に、リン酸化ＥＲＫについてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、試験例１－１（ｏｐｔｏ－α１ＡＲ発現ベクター）の明状態におけるリン酸化ＥＲＫのバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
図３Ｃの左から５番目のバー（暗状態）及び左から６番目のバー（明状態）に、リン酸化ＰＫＤ１についてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、試験例１－１（ｏｐｔｏ－α１ＡＲ発現ベクター）の明状態におけるリン酸化ＰＫＤ１のバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
図３Ｄの左から５番目のバー（暗状態）及び左から６番目のバー（明状態）に、リン酸化ＥＲＫについてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、試験例１－１（ｏｐｔｏ－α１ＡＲ発現ベクター）の明状態におけるリン酸化ＥＲＫのバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
【0084】
＜＜試験例１－４＞＞
比較例１で製造したｏｐｔｏ－α１ＡＲ発現ベクターに代えて、比較例３で製造したｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ－ｌｉｄ発現ベクター、及び製造例１で製造したｍｕＧＦＰ－ｉＬＩＤ－ＣＡＡＸ発現ベクターを使用した以外は、試験例１－１と同様の方法で、ウェスタンブロットを行った。
比較例１で製造したｏｐｔｏ－α１ＡＲ発現ベクターに代えて、比較例３で製造したｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ－ｌｉｄ発現ベクター、及び製造例１で製造したｍｕＧＦＰ－ｉＬＩＤ－ＣＡＡＸ発現ベクターを使用した以外は、試験例１－１と同様の方法で、ウェスタンブロットを行った。
【0085】
結果を図３Ｂの左から７番目のレーン（暗状態）及び左から８番目のレーン（明状態）に示した。
図３Ｃの左から７番目のバー（暗状態）及び左から８番目のバー（明状態）に、リン酸化ＰＫＤ１についてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、試験例１－１（ｏｐｔｏ－α１ＡＲ発現ベクター）の明状態におけるリン酸化ＰＫＤ１のバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
図３Ｄの左から７番目のバー（暗状態）及び左から８番目のバー（明状態）に、リン酸化ＥＲＫについてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、試験例１－１（ｏｐｔｏ－α１ＡＲ発現ベクター）の明状態におけるリン酸化ＥＲＫのバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
図３Ｃの左から７番目のバー（暗状態）及び左から８番目のバー（明状態）に、リン酸化ＰＫＤ１についてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、試験例１－１（ｏｐｔｏ－α１ＡＲ発現ベクター）の明状態におけるリン酸化ＰＫＤ１のバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
図３Ｄの左から７番目のバー（暗状態）及び左から８番目のバー（明状態）に、リン酸化ＥＲＫについてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、試験例１－１（ｏｐｔｏ－α１ＡＲ発現ベクター）の明状態におけるリン酸化ＥＲＫのバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
【0086】
＜＜試験例１－５＞＞
比較例１で製造したｏｐｔｏ－α１ＡＲ発現ベクターに代えて、比較例４で製造したｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ－ａｃｉｄ発現ベクター、及び製造例１で製造したｍｕＧＦＰ－ｉＬＩＤ－ＣＡＡＸ発現ベクターを使用した以外は、試験例１－１と同様の方法で、ウェスタンブロットを行った。
比較例１で製造したｏｐｔｏ－α１ＡＲ発現ベクターに代えて、比較例４で製造したｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ－ａｃｉｄ発現ベクター、及び製造例１で製造したｍｕＧＦＰ－ｉＬＩＤ－ＣＡＡＸ発現ベクターを使用した以外は、試験例１－１と同様の方法で、ウェスタンブロットを行った。
【0087】
結果を図３Ｂの左から９番目のレーン（暗状態）及び左から１０番目のレーン（明状態）に示した。
図３Ｃの左から９番目のバー（暗状態）及び左から１０番目のバー（明状態）に、リン酸化ＰＫＤ１についてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、試験例１－１（ｏｐｔｏ－α１ＡＲ発現ベクター）の明状態におけるリン酸化ＰＫＤ１のバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
図３Ｄの左から９番目のバー（暗状態）及び左から１０番目のバー（明状態）に、リン酸化ＥＲＫについてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、試験例１－１（ｏｐｔｏ－α１ＡＲ発現ベクター）の明状態におけるリン酸化ＥＲＫのバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
図３Ｃの左から９番目のバー（暗状態）及び左から１０番目のバー（明状態）に、リン酸化ＰＫＤ１についてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、試験例１－１（ｏｐｔｏ－α１ＡＲ発現ベクター）の明状態におけるリン酸化ＰＫＤ１のバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
図３Ｄの左から９番目のバー（暗状態）及び左から１０番目のバー（明状態）に、リン酸化ＥＲＫについてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、試験例１－１（ｏｐｔｏ－α１ＡＲ発現ベクター）の明状態におけるリン酸化ＥＲＫのバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
【0088】
図３Ｂ、図３Ｃ及び図３Ｄの結果より、実施例１で製造した、Ｘ－Ｙリンカー配列の代わりにＳｓｐＢを挿入した発現ベクター（ｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ）を導入した細胞において、顕著なＰＫＤ及びＥＲＫのリン酸化が検出された。一方、比較例２で製造した、ＳｓｐＢをコードする塩基配列を含まない発現ベクター（ｐｌｃｂ３Δ８４７）や、比較例３及び比較例４で製造した、Ｘ－Ｙリンカー配列のＣ末端側アミノ酸配列の一部をコードする塩基配列を含む発現ベクター（ｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ－ｌｉｄ及びｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ－ａｃｉｄ）を導入した細胞では、光依存的ＰＬＣ活性の顕著な上昇は見られなかった。この結果から、ｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢをｏｐｔｏ－ｐｌｃｂ３と命名した。
以上より、ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、ＳｓｐＢドメイン、及びホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインを有するキメラタンパク質により、ホスホリパーゼＣの下流の分子の活性を光依存的に制御できることが分かった。
以上より、ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、ＳｓｐＢドメイン、及びホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインを有するキメラタンパク質により、ホスホリパーゼＣの下流の分子の活性を光依存的に制御できることが分かった。
【0089】
＜試験例２：ＰＬＣの自己抑制の検出＞
ＰＬＣの自己抑制は活性制御において重要な指標である。Ｘ－Ｙリンカー配列はＰＬＣ活性の自己抑制に必要な天然変性領域であり、Ｘ－Ｙリンカー配列を欠失させたＰＬＣ変異体は恒常活性を示すことが知られている。
ＳｓｐＢの付加による自己抑制を解析するために、ＰＬＣにより産生されるジアシルグリセロールとイノシトール３リン酸により活性化されるＰＫＣの基質であるＰＫＤ１とＥＲＫの、基底活性をウェスタンブロット法で検出した。
ＰＬＣの自己抑制は活性制御において重要な指標である。Ｘ－Ｙリンカー配列はＰＬＣ活性の自己抑制に必要な天然変性領域であり、Ｘ－Ｙリンカー配列を欠失させたＰＬＣ変異体は恒常活性を示すことが知られている。
ＳｓｐＢの付加による自己抑制を解析するために、ＰＬＣにより産生されるジアシルグリセロールとイノシトール３リン酸により活性化されるＰＫＣの基質であるＰＫＤ１とＥＲＫの、基底活性をウェスタンブロット法で検出した。
【0090】
＜＜試験例２－１＞＞
比較例５で製造したｐｌｃｂ３ΔＸ－Ｙ発現ベクター、及び製造例２で製造したＨＡ－ＰＫＤ１発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入して共発現させた。
２４時間後に、タンパク質抽出液を調製し、ウェスタンブロット法により、リン酸化ＰＫＤ１（ｐＳ７４４／７４８：Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＰＫＤ（Ｓ７４４／７４８）抗体＃２０５４、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、ＨＡ－ＰＫＤ１（ＨＡ－Ｔａｇ 抗体＃３７２４、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、リン酸化ＥＲＫ（ｐＴ２０２／ｐＹ２０４：Ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ４４／ｐ４２ ＭＡＰＫ 抗体＃４３７０、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、ＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ抗体＃４６９５、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、及びＦｌａｇ（ＤＤＤＤＫ－ｔａｇ抗体Ｍ１８５－３Ｌ、ＭＢＬ社）を検出した。
比較例５で製造したｐｌｃｂ３ΔＸ－Ｙ発現ベクター、及び製造例２で製造したＨＡ－ＰＫＤ１発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入して共発現させた。
２４時間後に、タンパク質抽出液を調製し、ウェスタンブロット法により、リン酸化ＰＫＤ１（ｐＳ７４４／７４８：Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＰＫＤ（Ｓ７４４／７４８）抗体＃２０５４、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、ＨＡ－ＰＫＤ１（ＨＡ－Ｔａｇ 抗体＃３７２４、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、リン酸化ＥＲＫ（ｐＴ２０２／ｐＹ２０４：Ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ４４／ｐ４２ ＭＡＰＫ 抗体＃４３７０、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、ＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ抗体＃４６９５、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、及びＦｌａｇ（ＤＤＤＤＫ－ｔａｇ抗体Ｍ１８５－３Ｌ、ＭＢＬ社）を検出した。
【0091】
結果を図４Ｂの左から２番目のレーンに示した。
図４Ｃの左から２番目のバーに、リン酸化ＰＫＤ１についてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、試験例２－１におけるリン酸化ＰＫＤ１のバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
図４Ｄの左から２番目のバーに、リン酸化ＥＲＫについてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、試験例２－１におけるリン酸化ＥＲＫのバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
図４Ｃの左から２番目のバーに、リン酸化ＰＫＤ１についてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、試験例２－１におけるリン酸化ＰＫＤ１のバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
図４Ｄの左から２番目のバーに、リン酸化ＥＲＫについてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、試験例２－１におけるリン酸化ＥＲＫのバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
【0092】
＜＜試験例２－２＞＞
比較例５で製造したｐｌｃｂ３ΔＸ－Ｙ発現ベクターに代えて、比較例２で製造したｐｌｃｂ３Δ８４７発現ベクターを使用した以外は、試験例２－１と同様の方法で、ウェスタンブロットを行った。
比較例５で製造したｐｌｃｂ３ΔＸ－Ｙ発現ベクターに代えて、比較例２で製造したｐｌｃｂ３Δ８４７発現ベクターを使用した以外は、試験例２－１と同様の方法で、ウェスタンブロットを行った。
【0093】
結果を図４Ｂの左から１番目のレーンに示した。
図４Ｃの左から１番目のバーに、リン酸化ＰＫＤ１についてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、試験例２－１におけるリン酸化ＰＫＤ１のバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
図４Ｄの左から１番目のバーに、リン酸化ＥＲＫについてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、試験例２－１におけるリン酸化ＥＲＫのバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
図４Ｃの左から１番目のバーに、リン酸化ＰＫＤ１についてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、試験例２－１におけるリン酸化ＰＫＤ１のバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
図４Ｄの左から１番目のバーに、リン酸化ＥＲＫについてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、試験例２－１におけるリン酸化ＥＲＫのバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
【0094】
＜＜試験例２－３＞＞
比較例５で製造したｐｌｃｂ３ΔＸ－Ｙ発現ベクターに代えて、実施例１で製造したｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ発現ベクターを使用した以外は、試験例２－１と同様の方法で、ウェスタンブロットを行った。
比較例５で製造したｐｌｃｂ３ΔＸ－Ｙ発現ベクターに代えて、実施例１で製造したｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ発現ベクターを使用した以外は、試験例２－１と同様の方法で、ウェスタンブロットを行った。
【0095】
結果を図４Ｂの左から３番目のレーンに示した。
図４Ｃの左から３番目のバーに、リン酸化ＰＫＤ１についてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、試験例２－１におけるリン酸化ＰＫＤ１のバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
図４Ｄの左から３番目のバーに、リン酸化ＥＲＫについてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、試験例２－１におけるリン酸化ＥＲＫのバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
図４Ｃの左から３番目のバーに、リン酸化ＰＫＤ１についてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、試験例２－１におけるリン酸化ＰＫＤ１のバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
図４Ｄの左から３番目のバーに、リン酸化ＥＲＫについてのウェスタンブロットのバンド強度を示した。バンド強度は、試験例２－１におけるリン酸化ＥＲＫのバンド強度を１００％とした相対値を示した（ｎ＝４）。
【0096】
図４Ｂ、図４Ｃ及び図４Ｄの結果より、比較例５で製造した、Ｘ－Ｙリンカー配列を削除した変異体をコードする塩基配列を含む発現ベクター（ｐｌｃｂ３ΔＸ－Ｙ）を導入した細胞（恒常活性体）において、自己抑制の機能不全により、その母体である、比較例２で製造した発現ベクター（ｐｌｃｂ３Δ８４７）を導入した細胞と比較して、顕著なＰＫＤ及びＥＲＫのリン酸化が検出された。一方、実施例１で製造した、Ｘ－Ｙリンカー配列の代わりにＳｓｐＢを挿入した発現ベクター（ｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ）を導入した細胞では、恒常活性体に比べ、基底活性が著しく低下し、比較例２で製造した発現ベクター（ｐｌｃｂ３Δ８４７）を導入した細胞と同等のリン酸化が検出された。
以上より、ＳｓｐＢの付加がＸ－Ｙリンカー配列の自己抑制機能を代替し、ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、ＳｓｐＢドメイン、及びホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインを有するキメラタンパク質により、ホスホリパーゼＣの自己抑制機能が再現されたことが分かった。
以上より、ＳｓｐＢの付加がＸ－Ｙリンカー配列の自己抑制機能を代替し、ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、ＳｓｐＢドメイン、及びホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインを有するキメラタンパク質により、ホスホリパーゼＣの自己抑制機能が再現されたことが分かった。
【0097】
＜試験例３：細胞質カルシウムイオンの検出＞
図３Ａに示したとおり、ＰＬＣは、ホスファチジルイノシトールを、セカンドメッセンジャーである、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）とイノシトール３リン酸（ＩＰ３）に分解する酵素である。ＰＬＣにより産生されるイノシトール３リン酸は、小胞体のイノシトール３リン酸受容体に結合し、細胞質にカルシウムイオンを放出する。従って、ＰＬＣ活性による細胞内カルシウムイオンの上昇は酵素活性の重要な指標である。
図３Ａに示したとおり、ＰＬＣは、ホスファチジルイノシトールを、セカンドメッセンジャーである、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）とイノシトール３リン酸（ＩＰ３）に分解する酵素である。ＰＬＣにより産生されるイノシトール３リン酸は、小胞体のイノシトール３リン酸受容体に結合し、細胞質にカルシウムイオンを放出する。従って、ＰＬＣ活性による細胞内カルシウムイオンの上昇は酵素活性の重要な指標である。
【0098】
（製造例３ ｊＲＣａＭＰ１ｂ発現ベクターの製造）
細胞内カルシウムイオンの変動を観察するための、ｊＲＣａＭＰ１ｂ（カルシウムセンサー）発現ベクターを作製した。
ｊＲＣａＭＰ１ｂ発現ベクターは、Ａｄｄｇｅｎｅから購入したｐＡＡＶ．Ｓｙｎ．ＮＥＳ．ｊＲＣａＭＰ１ｂ．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ ＃１００８５１． Ｄａｎａ， Ｈｏｄ， ｅｔ ａｌ． “Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ｆｏｒ ｉｍａｇｉｎｇ ｎｅｕｒａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．” ｅｌｉｆｅ ５ （２０１６）： ｅ１２７２７．）のＮＥＳ－ｊＲＣａＭＰ１ｂのコード領域をＰＣＲで増幅し、ｐｃＤＮＡ５に挿入する方法で取得した。ＤＮＡ断片の挿入にはＩｎ－ｆｕｓｉｏｎシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。
細胞内カルシウムイオンの変動を観察するための、ｊＲＣａＭＰ１ｂ（カルシウムセンサー）発現ベクターを作製した。
ｊＲＣａＭＰ１ｂ発現ベクターは、Ａｄｄｇｅｎｅから購入したｐＡＡＶ．Ｓｙｎ．ＮＥＳ．ｊＲＣａＭＰ１ｂ．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ ＃１００８５１． Ｄａｎａ， Ｈｏｄ， ｅｔ ａｌ． “Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ｆｏｒ ｉｍａｇｉｎｇ ｎｅｕｒａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．” ｅｌｉｆｅ ５ （２０１６）： ｅ１２７２７．）のＮＥＳ－ｊＲＣａＭＰ１ｂのコード領域をＰＣＲで増幅し、ｐｃＤＮＡ５に挿入する方法で取得した。ＤＮＡ断片の挿入にはＩｎ－ｆｕｓｉｏｎシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。
【0099】
＜＜試験例３＞＞
実施例１で製造したｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ発現ベクター、及び製造例３で製造したｊＲＣａＭＰ１ｂ発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入して共発現させた。
２４時間後に、暗所に静置した細胞（青色光を照射しなかった細胞）、及び２０．３μＷ／ｍｍ２強度の青色光（４７３ｎｍ）を１０秒間照射（１０秒から２０秒まで）した細胞について、１３５秒間、撮影した。蛍光輝度はｉｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて計測した。ｊＲＣａＭＰ１ｂの蛍光を撮影するために、５５９ｎｍのレーザー光を利用した。
実施例１で製造したｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ発現ベクター、及び製造例３で製造したｊＲＣａＭＰ１ｂ発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入して共発現させた。
２４時間後に、暗所に静置した細胞（青色光を照射しなかった細胞）、及び２０．３μＷ／ｍｍ２強度の青色光（４７３ｎｍ）を１０秒間照射（１０秒から２０秒まで）した細胞について、１３５秒間、撮影した。蛍光輝度はｉｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて計測した。ｊＲＣａＭＰ１ｂの蛍光を撮影するために、５５９ｎｍのレーザー光を利用した。
【0100】
結果を図５Ａ（照射前の蛍光輝度を示した写真）、及び図５Ｂ（照射３６．５秒後の蛍光輝度を示した写真）に示した。
蛍光輝度（ΔＦ／Ｆ）の経時変化を図５Ｃに示した。ΔＦ／Ｆは、蛍光輝度の変動量を標準化したものである。ΔＦはＦ－Ｆ０（特定時間の蛍光輝度－初期蛍光輝度）であり、これを特定時間の蛍光輝度で割ることで蛍光輝度が異なる細胞の反応を標準化し検出することができる。したがって、ΔＦ／Ｆは（特定時間の蛍光輝度－初期蛍光輝度）／特定時間の蛍光輝度を意味する。図５Ｃにおいて、「０μＷ／ｍｍ２」は青色光（４７３ｎｍ）照射なしの細胞の経時変化を表し、「２０．３」は２０．３μＷ／ｍｍ２強度の青色光（４７３ｎｍ）を１０秒間照射した細胞の経時変化を表す（ｎ＝２２）。
蛍光輝度（ΔＦ／Ｆ）の経時変化を図５Ｃに示した。ΔＦ／Ｆは、蛍光輝度の変動量を標準化したものである。ΔＦはＦ－Ｆ０（特定時間の蛍光輝度－初期蛍光輝度）であり、これを特定時間の蛍光輝度で割ることで蛍光輝度が異なる細胞の反応を標準化し検出することができる。したがって、ΔＦ／Ｆは（特定時間の蛍光輝度－初期蛍光輝度）／特定時間の蛍光輝度を意味する。図５Ｃにおいて、「０μＷ／ｍｍ２」は青色光（４７３ｎｍ）照射なしの細胞の経時変化を表し、「２０．３」は２０．３μＷ／ｍｍ２強度の青色光（４７３ｎｍ）を１０秒間照射した細胞の経時変化を表す（ｎ＝２２）。
【0101】
図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃの結果より、実施例１で製造した、Ｘ－Ｙリンカー配列の代わりにＳｓｐＢを挿入した発現ベクター（ｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ）を導入した細胞では、光照射により著しいカルシウム上昇が観察されることが分かった。
試験例３では、ｊＲＣａＭＰ１ｂがカルシウムイオンと結合することで蛍光輝度が増加することを利用した。ｊＲＣａＭＰ１ｂの蛍光を撮影するために、５５９ｎｍのレーザー光を利用しているが、４７３ｎｍ青色光の照射をしない状態で５５９ｎｍによる撮影だけではカルシウムイオンの上昇は見られなかったことから、ｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢの光波長選択性が示された。
以上より、ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、ＳｓｐＢドメイン、及びホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインを有するキメラタンパク質により、細胞内カルシウム濃度を光依存的に、又、時空間的に制御できることが分かった。
試験例３では、ｊＲＣａＭＰ１ｂがカルシウムイオンと結合することで蛍光輝度が増加することを利用した。ｊＲＣａＭＰ１ｂの蛍光を撮影するために、５５９ｎｍのレーザー光を利用しているが、４７３ｎｍ青色光の照射をしない状態で５５９ｎｍによる撮影だけではカルシウムイオンの上昇は見られなかったことから、ｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢの光波長選択性が示された。
以上より、ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、ＳｓｐＢドメイン、及びホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインを有するキメラタンパク質により、細胞内カルシウム濃度を光依存的に、又、時空間的に制御できることが分かった。
【0102】
＜試験例４：脂質組成の変動の検出＞
図６Ａに示したとおり、ＰＬＣは、ホスファチジルイノシトール４，５ビスリン酸（ＰＩＰ２）を、セカンドメッセンジャーである、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）とイノシトール３リン酸（ＩＰ３）に分解する酵素である。
ＰＬＣｄｅｌｔａのＰＨドメインに蛍光タンパク質であるｍＳｃａｒｌｅｔを付加したものをＰＩＰ２センサーとして使用し、ＰＫＣｇａｍｍａのＣ１Ａドメインに蛍光タンパク質であるｍＳｃａｒｌｅｔを付加したものをＤＡＧセンサーとして使用し、ＰＬＣ活性による脂質組成の変動を可視化した。
図６Ａに示したとおり、ＰＬＣは、ホスファチジルイノシトール４，５ビスリン酸（ＰＩＰ２）を、セカンドメッセンジャーである、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）とイノシトール３リン酸（ＩＰ３）に分解する酵素である。
ＰＬＣｄｅｌｔａのＰＨドメインに蛍光タンパク質であるｍＳｃａｒｌｅｔを付加したものをＰＩＰ２センサーとして使用し、ＰＫＣｇａｍｍａのＣ１Ａドメインに蛍光タンパク質であるｍＳｃａｒｌｅｔを付加したものをＤＡＧセンサーとして使用し、ＰＬＣ活性による脂質組成の変動を可視化した。
【0103】
（製造例４ ＰＩＰ２センサー発現ベクターの製造）
ＰＩＰ２の変動を観察するための、ＰＩＰ２センサー発現ベクターを作製した。
ＰＩＰ２センサー発現ベクターは、ＰＬＣｄｅｌｔａのＰＨドメインに蛍光タンパク質であるｍＳｃａｒｌｅｔを付加したアミノ酸配列（配列番号１４）に対応するＤＮＡ配列を化学合成（ｇＢｌｏｃｋ， ＩＤＴ）し、ｐｃＤＮＡ５ ｖｅｃｔｏｒに挿入する方法で取得した。
ＰＩＰ２の変動を観察するための、ＰＩＰ２センサー発現ベクターを作製した。
ＰＩＰ２センサー発現ベクターは、ＰＬＣｄｅｌｔａのＰＨドメインに蛍光タンパク質であるｍＳｃａｒｌｅｔを付加したアミノ酸配列（配列番号１４）に対応するＤＮＡ配列を化学合成（ｇＢｌｏｃｋ， ＩＤＴ）し、ｐｃＤＮＡ５ ｖｅｃｔｏｒに挿入する方法で取得した。
【0104】
（製造例５ ＤＡＧセンサー発現ベクターの製造）
ＤＡＧの変動を観察するための、ＤＡＧセンサー発現ベクターを作製した。
ＤＡＧセンサー発現ベクターは、ＰＫＣｇａｍｍａのＣ１Ａドメインに蛍光タンパク質であるｍＳｃａｒｌｅｔを付加したアミノ酸配列（配列番号１５）に対するＤＮＡ配列を化学合成し、ｐＥＧＦＰ－Ｃ１のＮｈｅＩとＢａｍＨＩサイトに挿入する方法で取得した。
ＤＡＧの変動を観察するための、ＤＡＧセンサー発現ベクターを作製した。
ＤＡＧセンサー発現ベクターは、ＰＫＣｇａｍｍａのＣ１Ａドメインに蛍光タンパク質であるｍＳｃａｒｌｅｔを付加したアミノ酸配列（配列番号１５）に対するＤＮＡ配列を化学合成し、ｐＥＧＦＰ－Ｃ１のＮｈｅＩとＢａｍＨＩサイトに挿入する方法で取得した。
【0105】
＜＜試験例４－１＞＞
実施例１で製造したｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ発現ベクター、及び製造例４で製造したＰＩＰ２センサー発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入して共発現させた。
２４時間後に、２０．３μＷ／ｍｍ２強度の青色光（４７３ｎｍ）を１０秒間照射（１０秒から２０秒まで）した細胞について、共焦点顕微鏡で１３５秒間、細胞質側の蛍光輝度を計測した。蛍光輝度はｉｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて計測した。
実施例１で製造したｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ発現ベクター、及び製造例４で製造したＰＩＰ２センサー発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入して共発現させた。
２４時間後に、２０．３μＷ／ｍｍ２強度の青色光（４７３ｎｍ）を１０秒間照射（１０秒から２０秒まで）した細胞について、共焦点顕微鏡で１３５秒間、細胞質側の蛍光輝度を計測した。蛍光輝度はｉｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて計測した。
【0106】
結果を図６Ｂ（照射前の蛍光輝度を示した写真）、及び図６Ｃ（照射３１．８９２秒後の蛍光輝度を示した写真）に示した。
細胞質側の蛍光輝度（ΔＦ／Ｆ）の経時変化を図６Ｊに示した（◎：ｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ ＰＨ－ＰＬＣδ－ｍＳｃａｒｌｅｔ（ＰＩＰ２センサー）。ΔＦ／Ｆは、蛍光輝度の変動量を標準化したものである。ΔＦはＦ－Ｆ０（特定時間の蛍光輝度－初期蛍光輝度）であり、これを特定時間の蛍光輝度で割ることで蛍光輝度が異なる細胞の反応を標準化し検出することができる。したがって、ΔＦ／Ｆは（特定時間の蛍光輝度－初期蛍光輝度）／特定時間の蛍光輝度を意味する。
細胞質側の蛍光輝度（ΔＦ／Ｆ）の経時変化を図６Ｊに示した（◎：ｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ ＰＨ－ＰＬＣδ－ｍＳｃａｒｌｅｔ（ＰＩＰ２センサー）。ΔＦ／Ｆは、蛍光輝度の変動量を標準化したものである。ΔＦはＦ－Ｆ０（特定時間の蛍光輝度－初期蛍光輝度）であり、これを特定時間の蛍光輝度で割ることで蛍光輝度が異なる細胞の反応を標準化し検出することができる。したがって、ΔＦ／Ｆは（特定時間の蛍光輝度－初期蛍光輝度）／特定時間の蛍光輝度を意味する。
【0107】
＜＜試験例４－２＞＞
実施例１で製造したｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ発現ベクターに代えて、比較例２で製造したｐｌｃｂ３Δ８４７発現ベクターを使用した以外は、試験例４－１と同様の方法で、細胞質側の蛍光輝度を計測した。
実施例１で製造したｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ発現ベクターに代えて、比較例２で製造したｐｌｃｂ３Δ８４７発現ベクターを使用した以外は、試験例４－１と同様の方法で、細胞質側の蛍光輝度を計測した。
【0108】
結果を図６Ｄ（照射前の蛍光輝度を示した写真）、及び図６Ｅ（照射３１．８９２秒後の蛍光輝度を示した写真）に示した。
細胞質側の蛍光輝度の経時変化を図６Ｊに示した（△：ｐｌｃｂ３Δ８４７ ＰＨ－ＰＬＣδ－ｍＳｃａｒｌｅｔ（ＰＩＰ２センサー）。
細胞質側の蛍光輝度の経時変化を図６Ｊに示した（△：ｐｌｃｂ３Δ８４７ ＰＨ－ＰＬＣδ－ｍＳｃａｒｌｅｔ（ＰＩＰ２センサー）。
【0109】
＜＜試験例４－３＞＞
製造例４で製造したＰＩＰ２センサー発現ベクターに代えて、製造例５で製造したＤＡＧセンサー発現ベクターを使用した以外は、試験例４－１と同様の方法で、細胞質側の蛍光輝度を計測した。
製造例４で製造したＰＩＰ２センサー発現ベクターに代えて、製造例５で製造したＤＡＧセンサー発現ベクターを使用した以外は、試験例４－１と同様の方法で、細胞質側の蛍光輝度を計測した。
【0110】
結果を図６Ｆ（照射前の蛍光輝度を示した写真）、及び図６Ｇ（照射３１．８９２秒後の蛍光輝度を示した写真）に示した。
細胞質側の蛍光輝度の経時変化を図６Ｊに示した（○：ｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ ＣＡ１－ＰＫＣγ－ｍＳｃａｒｌｅｔ（ＤＡＧセンサー）。
細胞質側の蛍光輝度の経時変化を図６Ｊに示した（○：ｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ ＣＡ１－ＰＫＣγ－ｍＳｃａｒｌｅｔ（ＤＡＧセンサー）。
【0111】
＜＜試験例４－４＞＞
実施例１で製造したｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ発現ベクターに代えて、比較例２で製造したｐｌｃｂ３Δ８４７発現ベクターを使用した以外は、試験例４－３と同様の方法で、細胞質側の蛍光輝度を計測した。
実施例１で製造したｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ発現ベクターに代えて、比較例２で製造したｐｌｃｂ３Δ８４７発現ベクターを使用した以外は、試験例４－３と同様の方法で、細胞質側の蛍光輝度を計測した。
【0112】
結果を図６Ｈ（照射前の蛍光輝度を示した写真）、及び図６Ｉ（照射３１．８９２秒後の蛍光輝度を示した写真）に示した。
細胞質側の蛍光輝度の経時変化を図６Ｊに示した（ｎ＝４８、□：ｐｌｃｂ３Δ８４７ ＣＡ１－ＰＫＣγ－ｍＳｃａｒｌｅｔ（ＤＡＧセンサー））。
細胞質側の蛍光輝度の経時変化を図６Ｊに示した（ｎ＝４８、□：ｐｌｃｂ３Δ８４７ ＣＡ１－ＰＫＣγ－ｍＳｃａｒｌｅｔ（ＤＡＧセンサー））。
【0113】
図６Ｂから図６Ｊの結果より、実施例１で製造した、Ｘ－Ｙリンカー配列の代わりにＳｓｐＢを挿入した発現ベクター（ｐｌｃｂ３（ΔＸ－Ｙ）－ＳｓｐＢ）を導入した細胞では、光照射によりＰＩＰ２センサーは形質膜から細胞質へ移動し、ＤＡＧセンサーは細胞質から形質膜へ移動することが分かり、さらにこれらの脂質組成の変動は一過性であり、再配置も確認できた。一方、比較例２で製造した、ＳｓｐＢをコードする塩基配列を含まない発現ベクター（ｐｌｃｂ３Δ８４７）を導入した細胞では、光照射による脂質組成の変動は観察されなかった。
以上より、ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、ＳｓｐＢドメイン、及びホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインを有するキメラタンパク質により、脂質組成を光依存的に、又、時空間的に制御できることが分かった。
以上より、ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、ＳｓｐＢドメイン、及びホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインを有するキメラタンパク質により、脂質組成を光依存的に、又、時空間的に制御できることが分かった。
【0114】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞ ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、ＳｓｐＢドメイン、及びホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインを有することを特徴とする、キメラタンパク質である。
＜２＞ ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、ＳｓｐＢドメイン、及びホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインを、この順で有する、前記＜１＞に記載のキメラタンパク質である。
＜３＞ ホスホリパーゼＣのＸ－Ｙリンカー配列を有さない、前記＜１＞又は＜２＞に記載のキメラタンパク質である。
＜４＞ 前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のキメラタンパク質をコードする塩基配列を含むことを特徴とする核酸である。
＜５＞ 前記＜４＞に記載の核酸を含むことを特徴とするベクターである。
＜６＞ 前記＜４＞記載の核酸を含むことを特徴とする細胞である。
＜７＞ ＳｓｒＡをコードする塩基配列を含む核酸を含む、前記＜６＞に記載の細胞である。
＜８＞ 前記＜６＞に記載の細胞を培養する工程を含むことを特徴とするキメラタンパク質の製造方法である。
＜９＞ 前記＜６＞又は＜７＞に記載の細胞に青色光を照射することを含むホスホリパーゼＣの制御方法である。
＜１０＞ 前記＜６＞又は＜７＞に記載の細胞に青色光を照射することを含むホスホリパーゼＣを介したシグナル伝達の解析方法である。
＜１１＞ 前記＜６＞又は＜７＞に記載の細胞に青色光を照射することを含む化合物のスクリーニング方法である。
＜１＞ ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、ＳｓｐＢドメイン、及びホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインを有することを特徴とする、キメラタンパク質である。
＜２＞ ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、ＳｓｐＢドメイン、及びホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインを、この順で有する、前記＜１＞に記載のキメラタンパク質である。
＜３＞ ホスホリパーゼＣのＸ－Ｙリンカー配列を有さない、前記＜１＞又は＜２＞に記載のキメラタンパク質である。
＜４＞ 前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のキメラタンパク質をコードする塩基配列を含むことを特徴とする核酸である。
＜５＞ 前記＜４＞に記載の核酸を含むことを特徴とするベクターである。
＜６＞ 前記＜４＞記載の核酸を含むことを特徴とする細胞である。
＜７＞ ＳｓｒＡをコードする塩基配列を含む核酸を含む、前記＜６＞に記載の細胞である。
＜８＞ 前記＜６＞に記載の細胞を培養する工程を含むことを特徴とするキメラタンパク質の製造方法である。
＜９＞ 前記＜６＞又は＜７＞に記載の細胞に青色光を照射することを含むホスホリパーゼＣの制御方法である。
＜１０＞ 前記＜６＞又は＜７＞に記載の細胞に青色光を照射することを含むホスホリパーゼＣを介したシグナル伝達の解析方法である。
＜１１＞ 前記＜６＞又は＜７＞に記載の細胞に青色光を照射することを含む化合物のスクリーニング方法である。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図6G】
【図6H】
【図6I】
【図6J】
【配列表】