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特開2024-12775細胞デバイス、デバイス、細胞群培養用デバイス、及び神経筋接合部情報取得方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024012775
(43)【公開日】2024-01-31
(54)【発明の名称】細胞デバイス、デバイス、細胞群培養用デバイス、及び神経筋接合部情報取得方法
(51)【国際特許分類】
C12M 1/34 20060101AFI20240124BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20240124BHJP
C12N 5/0793 20100101ALI20240124BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240124BHJP
C12N 5/077 20100101ALI20240124BHJP
【ＦＩ】
C12M1/34 B
C12M1/00 A
C12M1/34 A
C12N5/0793
C12Q1/02
C12N5/077
【審査請求】未請求
【請求項の数】16
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022114503
(22)【出願日】2022-07-19
(71)【出願人】
【識別番号】515135778
【氏名又は名称】株式会社幹細胞＆デバイス研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100152331
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 拓
(72)【発明者】
【氏名】長垣 良和
(72)【発明者】
【氏名】加藤 謙介
(72)【発明者】
【氏名】中辻 憲夫
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029AA08
4B029BB11
4B029CC02
4B029FA12
4B029FA15
4B029GA01
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QR77
4B063QS39
4B065AA93X
4B065AC20
4B065CA46
(57)【要約】
【課題】神経筋接合部を評価可能であり得る、新規の細胞デバイス等を提供すること。
【解決手段】第１の収容ユニット１１０と、第２の収容ユニット１２０と、を備え、前記第１の収容ユニット１１０は、筋細胞を含む第１の細胞群３１０を培養している第１の培養部を備え、前記第２の収容ユニット１２０は、運動神経細胞を含む第２の細胞群３２０を培養している第２の培養部と、前記第２の培養部と前記第１の培養部とを接続する流路１２４と、を備え、前記流路１２４の前記第１の培養部側の開口端において、前記流路の底面の接線方向に前記底面を仮想的に延長させた仮想延長面が、前記第１の細胞群３１０と交差し、前記第１の細胞群３１０及び前記第２の細胞群３２０は、前記運動神経細胞から前記流路の底面に沿って延出し、前記流路の開口端から突出して前記第１の培養部に突入している軸索３３０により接合されている細胞デバイス３００。
【選択図】 図５
【解決手段】第１の収容ユニット１１０と、第２の収容ユニット１２０と、を備え、前記第１の収容ユニット１１０は、筋細胞を含む第１の細胞群３１０を培養している第１の培養部を備え、前記第２の収容ユニット１２０は、運動神経細胞を含む第２の細胞群３２０を培養している第２の培養部と、前記第２の培養部と前記第１の培養部とを接続する流路１２４と、を備え、前記流路１２４の前記第１の培養部側の開口端において、前記流路の底面の接線方向に前記底面を仮想的に延長させた仮想延長面が、前記第１の細胞群３１０と交差し、前記第１の細胞群３１０及び前記第２の細胞群３２０は、前記運動神経細胞から前記流路の底面に沿って延出し、前記流路の開口端から突出して前記第１の培養部に突入している軸索３３０により接合されている細胞デバイス３００。
【選択図】 図５
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１の収容ユニットと、第２の収容ユニットと、を備え、
前記第１の収容ユニットは、筋細胞を含む第１の細胞群を培養している第１の培養部を備え、
前記第２の収容ユニットは、運動神経細胞を含む第２の細胞群を培養している第２の培養部と、前記第２の培養部と前記第１の培養部とを接続する流路と、を備え、
前記流路の前記第１の培養部側の開口端において、前記流路の底面の接線方向に前記底面を仮想的に延長させた仮想延長面が、前記第１の細胞群と交差し、
前記第１の細胞群及び前記第２の細胞群は、前記運動神経細胞から前記流路の底面に沿って延出し前記流路の開口端から突出して前記第１の培養部に突入している軸索により接合されている、
細胞デバイス。
前記第１の収容ユニットは、筋細胞を含む第１の細胞群を培養している第１の培養部を備え、
前記第２の収容ユニットは、運動神経細胞を含む第２の細胞群を培養している第２の培養部と、前記第２の培養部と前記第１の培養部とを接続する流路と、を備え、
前記流路の前記第１の培養部側の開口端において、前記流路の底面の接線方向に前記底面を仮想的に延長させた仮想延長面が、前記第１の細胞群と交差し、
前記第１の細胞群及び前記第２の細胞群は、前記運動神経細胞から前記流路の底面に沿って延出し前記流路の開口端から突出して前記第１の培養部に突入している軸索により接合されている、
細胞デバイス。
【請求項2】
前記流路の前記第１の培養部側の開口端の底面部と前記第１の細胞群の上面との高さの差が、前記第２の培養部の底面と前記第１の細胞群の上面との高さの差より小さい、
請求項１に記載の細胞デバイス。
請求項１に記載の細胞デバイス。
【請求項3】
前記流路の前記第１の培養部側の開口端の底面部が、前記第１の細胞群と接触している、
請求項１に記載の細胞デバイス。
請求項１に記載の細胞デバイス。
【請求項4】
前記流路の前記第１の培養部側の先端部が、前記第１の細胞群に対して、連続的に又は段階的に近接している、
請求項１に記載の細胞デバイス。
請求項１に記載の細胞デバイス。
【請求項5】
前記第１の培養部が、１対の細胞支持体と、前記１対の細胞支持体を収容する収容部とを備え、
前記第１の細胞群が、前記１対の細胞支持体に跨って形成されている、
請求項１に記載の細胞デバイス。
前記第１の細胞群が、前記１対の細胞支持体に跨って形成されている、
請求項１に記載の細胞デバイス。
【請求項6】
第１の収容ユニットと、第２の収容ユニットと、を備え、
前記第１の収容ユニットは、第１の細胞群を培養する第１の培養部を備え、
前記第２の収容ユニットは、第２の細胞群を培養する第２の培養部と、前記第２の培養部と前記第１の培養部とを接続する流路と、を備え、
前記流路の前記第１の培養部側の開口端において、前記流路の底面の接線方向に前記底面を仮想的に延長させた仮想延長面が、前記第１の細胞群が培養される仮想平面と交差する、
デバイス。
前記第１の収容ユニットは、第１の細胞群を培養する第１の培養部を備え、
前記第２の収容ユニットは、第２の細胞群を培養する第２の培養部と、前記第２の培養部と前記第１の培養部とを接続する流路と、を備え、
前記流路の前記第１の培養部側の開口端において、前記流路の底面の接線方向に前記底面を仮想的に延長させた仮想延長面が、前記第１の細胞群が培養される仮想平面と交差する、
デバイス。
【請求項7】
前記流路の前記第１の培養部側の開口端の底面部と前記第１の細胞群が培養される仮想平面との高さの差が、前記第２の培養部の底面と前記第１の細胞群が培養される仮想平面との高さの差より小さい、
請求項６に記載のデバイス。
請求項６に記載のデバイス。
【請求項8】
前記流路の前記第１の培養部側の開口端の底面部が、前記第１の細胞群が培養される仮想平面と略同一平面上に位置する、
請求項６又は７に記載のデバイス。
請求項６又は７に記載のデバイス。
【請求項9】
前記流路の前記第１の培養部側の先端部が、前記第１の細胞群が培養される仮想平面方向に対して、連続的に又は段階的に近接している、
請求項６又は７に記載のデバイス。
請求項６又は７に記載のデバイス。
【請求項10】
前記流路が、前記第２の細胞群から延出する軸索の成長方向が前記第１の細胞群が培養される仮想平面に向かう方向に誘導されるように構成されている、
請求項６又は７に記載のデバイス。
請求項６又は７に記載のデバイス。
【請求項11】
前記第１の培養部が、前記第１の細胞群を形成させるための１対の細胞支持体と、前記１対の細胞支持体を収容する収容部と、を備える、
請求項６又は７に記載のデバイス。
請求項６又は７に記載のデバイス。
【請求項12】
細胞群を培養する培養部と、前記培養部を外部に接続する流路と、を備えた細胞群培養用デバイスであって、
前記流路の前記外部側の開口端において、前記流路の底面の接線方向に前記底面を仮想的に延長させた仮想延長面が、前記デバイスの底面を仮想的に延長させた仮想底面と交差する、
細胞群培養用デバイス。
前記流路の前記外部側の開口端において、前記流路の底面の接線方向に前記底面を仮想的に延長させた仮想延長面が、前記デバイスの底面を仮想的に延長させた仮想底面と交差する、
細胞群培養用デバイス。
【請求項13】
前記流路の前記外部側の開口端の底面部が、前記デバイスの底面と略同一平面上に位置する、
請求項１２に記載の細胞群培養用デバイス。
請求項１２に記載の細胞群培養用デバイス。
【請求項14】
請求項１～５のいずれか１項に記載のデバイスにおける前記第１の細胞群と前記第２の細胞群との神経筋接合部に関する情報を取得することを含む、情報取得方法。
【請求項15】
前記第１の細胞群及び／又は前記第２の細胞群を、被験物質を含む培地で培養することと、
前記被験物質が前記神経筋接合部に与える影響に関する情報を取得することと、を含む、
請求項１４に記載の情報取得方法。
前記被験物質が前記神経筋接合部に与える影響に関する情報を取得することと、を含む、
請求項１４に記載の情報取得方法。
【請求項16】
前記神経筋接合部に関する情報を取得することが、前記第１の細胞群の収縮弛緩運動及び／又は前記第２の細胞群が発する電気信号を検出することを含む、
請求項１４に記載の情報取得方法。
請求項１４に記載の情報取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞デバイス、デバイス、細胞群培養用デバイス、及び神経筋接合部情報取得方法に関する。
【背景技術】
【0002】
筋萎縮性側索硬化症や球脊髄性筋萎縮症をはじめとする神経筋疾患を対象とする創薬において、神経筋接合部を評価するためのシステムが要求されている。これまで、神経筋接合部をｉｎ ｖｉｔｒｏで作製し、その機能や特性を評価することなどを目的として、種々の３次元培養デバイスか報告されている。
【0003】
例えば特許文献１は、筋細胞と神経細胞とを共培養させるためのマイクロ流体デバイスを開示している。特許文献１のデバイスでは、筋細胞と神経細胞とが同一面内で共培養されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】米国特許出願公開第２０１７／０３５５９４５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、特許文献１のような筋細胞と神経細胞とを共培養させるシステムでは、筋細胞のための培地と神経細胞のための培地が混合しやすく、筋細胞及び神経細胞のいずれかのみに被験物質を投与することが難しい等の問題がある。このように神経筋接合部を適切に評価するためのシステムは未だに確立されていない。
【0006】
そこで、本発明は、神経筋接合部を評価可能であり得る、新規の細胞デバイス、デバイス、細胞群培養用デバイス、及びそれらを用いた神経筋接合部情報取得方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の一実施形態に係る細胞デバイスは、第１の収容ユニットと、第２の収容ユニットと、を備え、前記第１の収容ユニットは、筋細胞を含む第１の細胞群を培養している第１の培養部を備え、前記第２の収容ユニットは、運動神経細胞を含む第２の細胞群を培養している第２の培養部と、前記第２の培養部と前記第１の培養部とを接続する流路と、を備え、前記流路の前記第１の培養部側の開口端において、前記流路の底面の接線方向に前記底面を仮想的に延長させた仮想延長面が、前記第１の細胞群と交差し、前記第１の細胞群及び前記第２の細胞群は、前記運動神経細胞から前記流路の底面に沿って延出し、前記流路の開口端から突出して前記第１の培養部に突入している軸索により接合されている。
【0008】
このような細胞デバイスは、第１の培養部を備える第１の収容ユニットと、第２の培養部を備える第２の収容ユニットとが流路により接続されているため、第１の培養部及び第２の培養部に培養されている細胞群が適切な距離を保つことができ、両者が軸索により接合されていることを容易に確認することができ、さらに、第１の細胞群と第２の細胞群とを別々の培養液で培養することができる。また、第１の培養部と第２の培養部とを接続する流路が上記のように構成されていることにより、第２の細胞群から延出する軸索が第１の細胞群に好適に接合することができるため、第１の細胞群及び第２の細胞群は多数の神経筋接合部が形成され、神経筋接合部の評価に有利である。
【0009】
前記流路の前記第１の培養部側の開口端の底面部と前記第１の細胞群の上面との高さの差は、前記第２の培養部の底面と前記第１の細胞群の上面との高さの差より小さくてよい。この態様によれば、第２の細胞群から延出する軸索をより効率よく第１の細胞群と接合させることができるため、第１の細胞群及び第２の細胞群はより多数の神経筋接合部を形成する。
【0010】
前記流路の前記第１の培養部側の開口端の底面部は、好ましくは、前記第１の細胞群と接触している。この態様によれば、第２の細胞群から延出する軸索をより効率よく第１の細胞群と接合させることができるため、第１の細胞群及び第２の細胞群はより多数の神経筋接合部を形成する。
【0011】
前記流路の前記第１の培養部側の先端部は、好ましくは、前記第１の細胞群に対して、連続的に又は段階的に近接している。この態様によれば、第２の細胞群から延出する軸索をより効率よく第１の細胞群と接合させることができるため、第１の細胞群及び第２の細胞群はより多数の神経筋接合部を形成する。
【0012】
前記第１の培養部は、好ましくは、１対の細胞支持体と、前記１対の細胞支持体を収容する収容部とを備え、前記第１の細胞群が、前記１対の細胞支持体に跨って形成されている。この態様によれば、第１の細胞群が３次元的に培養された細胞群とすることができ、生体内の筋組織の状況をよりよく再現できる。
【0013】
本発明の一実施形態に係るデバイスは、第１の収容ユニットと、第２の収容ユニットと、を備え、前記第１の収容ユニットは、第１の細胞群を培養する第１の培養部を備え、前記第２の収容ユニットは、第２の細胞群を培養する第２の培養部と、前記第２の培養部と前記第１の培養部とを接続する流路と、を備え、前記流路の前記第１の培養部側の開口端において、前記流路の底面の接線方向に前記底面を仮想的に延長させた仮想延長面が、前記第１の細胞群が培養される仮想平面と交差する。
【0014】
このようなデバイスは、第１の培養部を備える第１の収容ユニットと、第２の培養部を備える第２の収容ユニットとが流路により接続されているため、第１の培養部及び第２の培養部において適切な距離を保ちながら細胞群を培養することができ、両者が軸索により接合された構造を容易に得ることができる。さらに、第１の細胞群と第２の細胞群とを別々の培養液で培養することができる。また、第１の培養部と第２の培養部とを接続する流路が上記のように構成されていることにより、第２の細胞群から延出する軸索が第１の細胞群に好適に接合することができるため、第１の細胞群及び第２の細胞群において多数の神経筋接合部を形成させることができ、神経筋接合部の評価に有利である。
【0015】
前記流路の前記第１の培養部側の開口端の底面部と前記第１の細胞群が培養される仮想平面との高さの差は、前記第２の培養部の底面と前記第１の細胞群が培養される仮想平面との高さの差より小さくてよい。この態様によれば、第２の細胞群から延出する軸索をより効率よく第１の細胞群と接合させることができるため、第１の細胞群及び第２の細胞群においてより多数の神経筋接合部を形成させることができる。
【0016】
前記流路の前記第１の培養部側の開口端の底面部は、好ましくは、前記第１の細胞群が培養される仮想平面と略同一平面上に位置する。この態様によれば、第２の細胞群から延出する軸索をより効率よく第１の細胞群と接合させることができるため、第１の細胞群及び第２の細胞群においてより多数の神経筋接合部を形成させることができる。
【0017】
前記流路の前記第１の培養部側の先端部は、好ましくは、前記第１の細胞群が培養される仮想平面方向に対して、連続的に又は段階的に近接している。この態様によれば、第２の細胞群から延出する軸索をより効率よく第１の細胞群と接合させることができるため、第１の細胞群及び第２の細胞群においてより多数の神経筋接合部を形成させることができる。
【0018】
前記流路は、好ましくは、前記第２の細胞群から延出する軸索の成長方向が前記第１の細胞群が培養される仮想平面に向かう方向に誘導されるように構成されている。この態様によれば、第２の細胞群から延出する軸索をより効率よく第１の細胞群と接合させることができるため、第１の細胞群及び第２の細胞群においてより多数の神経筋接合部を形成させることができる。
【0019】
前記第１の培養部は、好ましくは、前記第１の細胞群を形成させるための１対の細胞支持体と、前記１対の細胞支持体を収容する収容部と、を備える。この態様によれば、第１の細胞群を３次元的に培養することができ、生体内の筋組織の状況をよりよく再現できる。
【0020】
本発明の一実施形態に係る細胞群培養用デバイスは、細胞群を培養する培養部と、前記培養部を外部に接続する流路と、を備え、前記流路の前記外部側の開口端において、前記流路の底面の接線方向に前記底面を仮想的に延長させた仮想延長面が、前記デバイスの底面を仮想的に延長させた仮想底面と交差する。
【0021】
このようなデバイスは、培養部と外部とを接続する流路が上記のように構成されていることにより、神経細胞（例えば運動神経細胞）を含む細胞群（例えば運動神経細胞スフェロイド）を培養すると、培養に伴い細胞群から軸索が延出し、デバイス外部に誘導され、流路の開口端から突出し、デバイスの底面方向に伸長することが誘導される。したがって、本実施形態の細胞群培養用デバイスを任意の細胞群の直上に設置し、神経細胞（例えば運動神経細胞）を含む細胞群（例えば運動神経細胞スフェロイド）を培養することにより、当該任意の細胞群と、神経細胞を含む細胞群とを軸索により接合した構造を得ることができる。
【0022】
前記流路の前記外部側の開口端の底面部は、好ましくは、前記デバイスの底面と略同一平面上に位置する。この態様によれば、細胞群から延出する軸索をより効率よく誘導させることができる。
【0023】
本発明の一実施形態に係る神経筋接合部情報取得方法は、前記細胞デバイスにおける前記第１の細胞群と前記第２の細胞群との神経筋接合部に関する情報を取得することを含む。
【0024】
このような方法によれば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで任意の筋細胞と任意の運動神経細胞との神経筋接合部を評価することができる。したがって、例えば、筋細胞及び／又は運動神経細胞として、所定の疾患を有する対象に由来する細胞を用いれば、当該疾患の原因因子の特定や、当該疾患の治療又は予防に有効な薬剤をスクリーニングすることができる。
【0025】
前記方法は、前記第１の細胞群及び／又は前記第２の細胞群を、被験物質を含む培地で培養することと、前記被験物質が前記神経筋接合部に与える影響に関する情報を取得することと、を含んでいてもよい。この態様によれば、被験物質の疾患の治療又は予防に対する有効性や毒性を評価することができる。
【0026】
前記神経筋接合部に関する情報を取得することが、前記第１の細胞群の収縮弛緩運動及び／又は前記第２の細胞群が発する電気信号を検出することを含んでいてもよい。
【発明の効果】
【0027】
本発明によれば、神経筋接合部を評価可能であり得る、新規の細胞デバイス、デバイス、細胞群培養用デバイス、及びそれらを用いた神経筋接合部情報取得方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】本発明の一実施形態に係るデバイスの（Ａ）概略斜視図、（Ｂ）概略平面図、及び（Ｃ）概略断面図（Ｘ－Ｘ断面図）である。
【図2】本発明の一実施形態に係るデバイスの流路付近における（Ａ）概略拡大斜視図、及び（Ｂ）概略拡大断面図（Ｘ－Ｘ断面図）である。
【図3】本発明の一実施形態に係るデバイスの流路付近における（Ａ）概略拡大斜視図、及び（Ｂ）概略拡大断面図（Ｘ－Ｘ断面図）、並びに流路の先端部における（Ｃ）概略拡大斜視図である。
【図4】本発明の別の一実施形態に係るデバイスの流路付近における（Ａ）概略拡大斜視図、及び（Ｂ）概略拡大断面図（Ｘ－Ｘ断面図）、並びに流路の先端部における（Ｃ）概略拡大斜視図である。
【図5】本発明の一実施形態に係る細胞デバイスの（Ａ）概略斜視図、及び（Ｂ）概略拡大斜視図である。
【図6】本発明の一実施形態に係る細胞群培養用デバイスの（Ａ）概略斜視図、及び（Ｂ）概略拡大斜視図である。
【図7】本発明の一実施形態に係る細胞群培養用デバイスの作製方法の一工程の一例を示す図である。
【図8】実施例で製造したデバイスの部材４００ａの（Ａ）平面図、（Ｂ）底面図、（Ｃ）Ｘ－Ｘ断面図、及び（Ｄ）Ｘ－Ｘ断面図の部分拡大図における寸法を示す。
【図9】実施例で製造したデバイスの部材４００ｂの（Ａ）平面図、及び（Ｂ）Ｙ－Ｙ断面図における寸法を示す。
【図10】実施例で製造したデバイスの第１の収容ユニット１１０の（Ａ）平面図、及び（Ｂ）Ｚ－Ｚ断面図における寸法を示す。
【図11】本発明の一実施形態に係る細胞デバイスにおいて観察された、運動神経細胞の自発的な発火に応答した、筋細胞を含む細胞群の自発的な収縮弛緩運動の様子を示す図である。
【図12】本発明の一実施形態に係る細胞デバイスにおいて観察された、運動神経細胞を含む細胞群のみに電気刺激を与えた時の、筋細胞を含む細胞群の当該電気刺激に応答した収縮弛緩運動の様子を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0029】
以下、図面を参照して本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号を付して表している。図面は模式的なものであり、必ずしも実際の寸法や比率等とは一致しない。図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることがある。
【0030】
［デバイス］
（第１実施形態）
図１は本実施形態のデバイスを示す（Ａ）概略斜視図、（Ｂ）概略平面図及び（Ｃ）概略断面図（Ｘ－Ｘ断面図）である。図１に示すように、デバイス１００は、第１の収容ユニット１１０と、第２の収容ユニット１２０と、を備え、第１の収容ユニット１１０は、第１の細胞群を培養する第１の培養部１１２を備え、第２の収容ユニット１２０は、第２の細胞群を培養する第２の培養部１２２と、第２の培養部１２２と第１の培養部１１２とを接続する流路１２４とを備える。
（第１実施形態）
図１は本実施形態のデバイスを示す（Ａ）概略斜視図、（Ｂ）概略平面図及び（Ｃ）概略断面図（Ｘ－Ｘ断面図）である。図１に示すように、デバイス１００は、第１の収容ユニット１１０と、第２の収容ユニット１２０と、を備え、第１の収容ユニット１１０は、第１の細胞群を培養する第１の培養部１１２を備え、第２の収容ユニット１２０は、第２の細胞群を培養する第２の培養部１２２と、第２の培養部１２２と第１の培養部１１２とを接続する流路１２４とを備える。
【0031】
第１の収容ユニット１１０は、第１の培養部１１２において第１の細胞群（例えば筋細胞（例えば骨格筋細胞）を含む細胞群（例えば骨格筋組織））を培養できるように構成されている。図１に示すように、第１の培養部１１２は、細胞群を形成させるための１対の細胞支持体１１４ａ及び１１４ｂと、それら１対の細胞支持体を収容する収容部１１６とを備える。収容部１１６は、細胞支持体１１４ａ及び１１４ｂの周囲及びそれらを連結する部分において形成されている空洞部からなる。第１の培養部１１２において、細胞群は、細胞支持体１１４ａ及び１１４ｂに跨って形成される。収容部１１６は、かかる細胞群の形成を補助し、形成された細胞群を培養液中に浸漬する。図１において、第１の培養部１１２は、上方に開口しているが、開口部に別の部材（蓋部）を取り付けて、開口部を覆うこともできる。
【0032】
第１の収容ユニット１１０は、第１の培養部１１２に隣接して、第２の収容ユニット１２０を設置するための設置部１１８を備える。設置部１１８は第２の収容ユニット１２０を安定して設置できるように構成されている。設置部１１８の上面には、第２の収容ユニット１２０を適切な位置に設置するための位置決め手段が備えられていてもよい。位置決め手段としては、第２の収容ユニット１２０の輪郭を縁取った凹部又は凸部であってよく、第２の収容ユニット１２０の底面に形成される凸部又は凹部と篏合する凹部又は凸部であってよい。
【0033】
１対の細胞支持体のうち、第２の収容ユニット１２０から遠い細胞支持体である細胞支持体１１４ａは、細胞支持体の最上部にディスク部１１５をさらに備える。ディスク部１１５と細胞支持体１１４ａとは一体的に構成されていてもよく、細胞支持体１１４ａに別部材としてディスク部１１５が取り付けられていてもよい。すなわち、ディスク部１１５は、細胞支持体１１４ａから着脱可能であってもよく、一体不可分的に構成されていてもよい。また、ディスク部１１５と細胞支持体１１４ａとは、同一材料で構成されていてもよく、互いに異なる材料で構成されていてもよい。
【0034】
１対の細胞支持体のうち、第２の収容ユニット１２０側にある細胞支持体である細胞支持体１１４ｂは、開口部側の端部（上端部）においてディスク部を備えない。したがって、細胞支持体１１４ａ及び１１４ｂに細胞群を形成したとき、第２の収容ユニット１２０と細胞群とを近接又は接触させることができ、後述するように第２の培養部１２２に培養される第２の細胞群と、第１の培養部１１２に培養される第１の細胞群との神経筋接合部をより好適に形成することができる。
【0035】
図１（Ｃ）に示されるように、細胞支持体１１４ｂの端面は、第２の収容ユニットの底面と近接しているか、接触するように構成されている。例えば設置部１１８の上面と、細胞支持体１１４ｂの端面とが略同一平面上に位置していてよい。これにより、第２の収容ユニット１２０の直下に第１の細胞群を形成することができる。
【0036】
第１の収容ユニット１１０の寸法は、細胞支持体に細胞群を形成できる程度であれば特に限定されない。例えば、１対の細胞支持体間の距離（細胞支持体の中心間の距離）は、例えば１．０ｍｍ以上１０ｍｍ以下であってよい。細胞支持体１１４ａ及び１１４ｂは、例えば直径０．１０ｍｍ以上１．０ｍｍ以下の円柱であってよい。収容部１１６の深さは、例えば２．０ｍｍ以上９．０ｍｍ以下であってよい。
【0037】
後述するように、第１の細胞群は例えば筋細胞（例えば骨格筋細胞）を含む細胞群（例えば骨格筋組織）であり、自発的に又は電気刺激を受けることによって収縮弛緩運動を行う細胞群であってよい。第１の細胞群の収縮弛緩運動を評価できるように、細胞支持体１１４ａ及び１１４ｂの少なくともいずれか一方は、第１の細胞群の動きに応じて可動なように構成されていることが好ましい。細胞支持体の少なくとも一方は、変形可能な材料により構成されていることが好ましく、弾性体であることがより好ましい。このような態様によれば、第１の細胞群が収縮する際に、１対の細胞支持体を接近させる方向の力が働き、少なくとも一方の細胞支持体が変形する。この細胞支持体の変形や変位を観測することで、第１の細胞群の収縮力を算出することができる。細胞支持体１１４ａ及び１１４ｂの両方が第１の細胞群の動きに応じて可動なように構成されていてもよい。
【0038】
細胞支持体１１４ａ及び１１４ｂは、どちらかが第１の細胞群の動きに応じて可動なように構成されていればよいが、より好ましくは細胞支持体１１４ａのみが可動であり、細胞支持体１１４ｂは固定されている。この態様によれば、細胞支持体１１４ｂは変形しないため、細胞支持体１１４ｂ付近において第２の収容ユニット１２０との位置関係が変化することがなく、細胞支持体１１４ｂが動くことによって第１の細胞群と第２の細胞群との神経筋接合部が欠損することを確実に防ぐことができる。
【0039】
細胞支持体が変形可能である場合、その細胞支持体の機械特性は、形成予定の細胞群の運動特性に応じて調整すればよい。例えば細胞群の収縮弛緩運動に応じて細胞支持体の上部端面の中心軸（細胞支持体１１４ａにおいてはディスク部１１５の中心軸）が細胞群の運動方向（すなわち、細胞支持体の長さ方向に対して垂直な方向であって、１対の細胞支持体を結ぶ方向）に対して０．１μｍ以上１．０ｍｍ以下の範囲で運動するような機械特性であってよい。そのような機械特性としては、細胞群が形成される部分において細胞支持体の長さ方向に対してほぼ垂直に応力を印加した際のバネ定数が挙げられる。当該バネ定数の好適な範囲は、例えば０．０５０μＮ／μｍ以上１．００μＮ／μｍ以下であり、より好ましくは０．１００μＮ／μｍ以上０．８００μＮ／μｍ以下である。
【0040】
細胞支持体１１４ａ及び１１４ｂ、並びにディスク部１１５を含む第１の収容ユニット１１０は、各部分が同一又は互いに異なる材料により構成されていてよい。また、細胞支持体１１４ａ及び１１４ｂは、同一又は互いに異なる材料により構成されていてよい。細胞支持体１１４ａ及びディスク部１１５も同一又は互いに異なる材料により構成されていてよい。細胞支持体１１４ａ及び１１４ｂは、例えば円柱状、多角形状等であってよい。
【0041】
第１の収容ユニット１１０を構成する材料は特に限定されず、金属、セラミック、ポリマー、ガラス、及びゴム等の種々の材料を含んでいてよい。第１の収容ユニット１１０は、製造が容易である観点からポリマー又はゴムであると好ましい。
【0042】
細胞支持体が第１の細胞群の動きに応じて可動なように構成されている場合、細胞支持体は例えばポリマー及び／又はゴムで構成されていることが好ましい。ここで、好適なポリマーとしてはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が挙げられる。
細胞支持体が固定されている場合、細胞支持体は例えば金属、セラミック、ポリマー、又はガラスで構成されていることが好ましい。
細胞支持体が固定されている場合、細胞支持体は例えば金属、セラミック、ポリマー、又はガラスで構成されていることが好ましい。
【0043】
ディスク部１１５を構成する材料は特に限定されず、金属、セラミック、ポリマー、ガラス、及びゴム等の種々の材料を含んでいてよい。ディスク部１１５は、製造が容易である観点から細胞支持体１１４ａと同じ材料により構成され、細胞支持体１１４ａと一体化していることが好ましい。
【0044】
図１に戻ると、第２の収容ユニット１２０は、第１の収容ユニット１１０の設置部１１８上に設置されている。第１の収容ユニット１１０と第２の収容ユニット１２０とは、一体不可分であってもよく、分離可能であってもよい。第１の収容ユニット１１０及び第２の収容ユニット１２０が一体不可分である場合、両者は、接着剤等で接合されていてもよく、分子接合で接合されていてもよく、３Ｄプリンティング等により一体として作製されたものであってもよい。
【0045】
第２の収容ユニットは、第２の細胞群（例えば神経細胞（例えば運動神経細胞）を含む細胞群（例えば運動神経細胞スフェロイド））を培養するための第２の培養部１２２と、第２の培養部１２２と第１の培養部１１２とを接続する流路１２４とを備える。
【0046】
図１において、第２の培養部１２２は、位置決め部１２２ａと、位置決め部１２２ａの上部に接続された液浴部１２２ｂとからなる。第２の培養部１２２は、液浴部１２２ｂの底面に位置決め部１２２ａが形成されてなるということもできる。このように第２の収容ユニットが位置決め部１２２ａを有することにより、第２の細胞群を流路１２４付近で培養することができ、後述の第１の細胞群と第２の細胞群との神経筋接合部がより好適に形成しやすくなる。
【0047】
第２の培養部１２２の寸法は、特に限定されない。液浴部１２２ｂは、例えば深さ２．０ｍｍ以上９．０ｍｍ以下の凹部であってよい。位置決め部１２２ａは、例えば直径０．５０ｍｍ以上３．０ｍｍ以下の円柱状凹部であってよい。位置決め部１２２ａの深さは、例えば０．５０ｍｍ以上３．０ｍｍ以下であってよい。位置決め部１２２ａは、多角柱状凹部及び楕円状凹部等の任意の形状であってよい。
【0048】
図１において、流路１２４は、位置決め部１２２ａの底部から第１の培養部１１２における第１の細胞群が形成される場所に向かって形成されている。これにより、第２の培養部１２２において、第２の細胞群として神経細胞（特に運動神経細胞）を含む細胞群を培養すると、当該細胞群から軸索が延出し、軸索は流路内を通過して第１の培養部１１２における第１の細胞群方向に伸長することができる。したがって、本実施形態のデバイスによれば、第２の細胞群から延出した軸索を第１の細胞群に誘導することができ、第２の細胞群の軸索が第１の細胞群と接合した構造を得ることができる。ここで、第２の細胞群が神経細胞であり、第１の細胞群が筋細胞であるとき、神経筋接合部が得られる。
【0049】
図２は、デバイス１００の、流路１２４付近における（Ａ）概略拡大斜視図、及び（Ｂ）概略拡大断面図（Ｘ－Ｘ断面図）である。流路１２４は、位置決め部１２２ａから第１の培養部１１２に向かって、領域１２４ａ、１２４ｂ、１２４ｃ及び１２４Ｒから構成され、第１の培養部１１２側には開口端１２４Ｅが形成されている。ここで、領域１２４Ｒは流路の先端部である。流路１２４は、第１の細胞群及び第２の細胞群が通過不可能、かつ第２の細胞群から延出する軸索が通過可能なように構成されている。
【0050】
領域１２４ａ及び１２４ｂは高さが等しく、幅が異なるように構成されている。領域１２４ａ及び１２４ｂの流路高さは、例えば２０μｍ以上２００μｍ以下であり、好ましくは４０μｍ以上１００μｍ以下である。領域１２４ａの流路幅は、例えば０．１０ｍｍ以上２．０ｍｍ以下であり、好ましくは０．２０ｍｍ以上１．０ｍｍ以下である。領域１２４ｂの流路幅は、領域１２４ａの流路幅より大きく、例えば０．５０ｍｍ以上４．０ｍｍ以下であり、好ましくは０．７０ｍｍ以上３．０ｍｍ以下である。このように、領域１２４ａの流路幅を一定の範囲とすることにより、位置決め部１２２ａに培養される第２の細胞群から流路１２４内に侵入する軸索の数を増加させることができる傾向にある。また、細胞群から延出する軸索は平面視で扇状に延出する傾向にあるため、領域１２４ｂは領域１２４ａより幅広に設計されている。
【0051】
領域１２４ｃは、領域１２４ｂに対して、幅が等しく、高さが異なるように構成されている。領域１２４ｃの流路高さは、領域１２４ｂの流路高さより小さく、例えば１．０μｍ以上１００μｍ以下であり、好ましくは５．０μｍ以上５０μｍ以下である。このように、領域１２４ｃの流路高さを一定の範囲とすることにより、第２の培養部１２２における培養液が流路１２４を通過して第１の培養部１１２に漏れ出すことを確実に抑制できる傾向にある。また、位置決め部１２２ａに培養される第２の細胞群から流路１２４内に侵入する軸索の数を増加させるため、領域１２４ａの流路高さは領域１２４ｃの流路高さより高く設計されている。
【0052】
領域１２４Ｒ（先端部１２４Ｒ）は、領域１２４ｃと等しい流路幅を有し、図２に示されるように、流路底面が流路の長さ方向、開口端１２４Ｅに向けて下方に湾曲し、連続的に流路高さが大きくなるように構成されている。先端部１２４Ｒには、開口端１２４Ｅが形成されている。開口端１２４Ｅの幅は先端部１２４Ｒの流路幅と等しく、開口端１２４Ｅの高さは、例えば０．１０ｍｍ以上１．０ｍｍ以下、好ましくは０．２５ｍｍ以上０．７５ｍｍ以下である。開口端１２４Ｅは、第１の細胞群が形成される仮想平面Ｓ２の直上に位置していることが好ましい。
なお、上記の流路１２４の構成は一例である。流路１２４は、上記の態様以外に、位置決め部１２２ａから第１の培養部１１２に向かって、流路高さ及び／又は流路幅が連続的に変化する態様、流路高さのみが段階的又は連続的に変化する態様、流路幅のみが段階的又は連続的に変化する態様、並びに流路高さ及び流路幅が一定である態様等であってもよい。流路１２４の底面は、例えばポリマー及び／又はゴムで構成されていることが好ましい。好適なポリマーとしてはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が挙げられる。
なお、上記の流路１２４の構成は一例である。流路１２４は、上記の態様以外に、位置決め部１２２ａから第１の培養部１１２に向かって、流路高さ及び／又は流路幅が連続的に変化する態様、流路高さのみが段階的又は連続的に変化する態様、流路幅のみが段階的又は連続的に変化する態様、並びに流路高さ及び流路幅が一定である態様等であってもよい。流路１２４の底面は、例えばポリマー及び／又はゴムで構成されていることが好ましい。好適なポリマーとしてはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が挙げられる。
【0053】
図３に示すように、本実施形態では、開口端１２４Ｅにおいて、流路の底面の接線方向に当該底面を仮想的に延長させた仮想延長面Ｓ１が第１の細胞群が培養される仮想平面Ｓ２と交差するように、先端部１２４Ｒの底面が湾曲している。このように、仮想延長面Ｓ１が仮想平面Ｓ２と交差するように先端部１２４Ｒが構成されていると、第２の細胞群から延出する軸索が効率よく第１の細胞群と接合される。これは、軸索の伸長が、その先端に存在する葉状仮足及び糸状仮足が数μｍ～数十μｍ先の足場を検知しながら行われるためであると本発明者らは推測している。
【0054】
すなわち、先端部１２４Ｒが湾曲していなく、略直角である場合、第２の細胞群の軸索が開口端１２４Ｅから突出し、第１の培養部１１２に突入しようとするには、軸索が開口端１２４Ｅにおいて略９０°進行方向を変えるか、足場に依らないで一時的に浮遊して伸長する必要があり、そのような態様では、軸索が第１の培養部１１２に突入するのに大きな障壁があると考えられる。一方、本実施形態のように開口端１２４Ｅにおける流路の底面の接線方向に流路の底面を仮想的に延長させた仮想延長面Ｓ１が第１の細胞群が培養される仮想平面Ｓ２と交差するように先端部１２４Ｒが構成されていると、第２の細胞群の軸索が開口端１２４Ｅから突出し、第１の培養部１１２に突入する場合でも、軸索が開口端１２４Ｅにおいて進行方向をほとんど変える必要がないため、軸索が第１の培養部１１２に突入する障壁が小さくなり、その結果より多くの軸索が第１の細胞群と接合できると考えられる。
【0055】
なお、図３（Ｃ）に示すように、先端部１２４Ｒが湾曲底面部１２４Ｒｒと端面部１２４Ｒｅとからなる場合、仮想延長面Ｓ１は、湾曲底面部１２４Ｒｒを、湾曲底面部１２４Ｒｒと端面部１２４Ｒｅとの交線における湾曲底面部１２４Ｒｒの接線方向（図３（Ｃ）中のｎベクトル方向）において仮想的に延長させた面を意味する。ここで、端面部１２４Ｒｅは、開口端１２４Ｅにおける仮想平面Ｓ２に対して略垂直な面、又は第２の収容ユニット１２０の底面に対して略垂直な面として定義される。
【0056】
また、仮想平面Ｓ２は、第１の細胞群が培養されることが予定されている仮想的な平面であり、より詳細には、培養された第１の細胞群の上面が位置することが予定されている仮想的な平面である。仮想平面Ｓ２は、細胞支持体１１４ｂ及び第２の収容ユニットの底面の接面（細胞支持体１１４ｂ及び第２の収容ユニットの底面が接していない場合は細胞支持体１１４ｂの上端面）と、ディスク部１１５の裏面とを通る平面であってよい。
【0057】
図１（Ｃ）に示されるように、設置部１１８の上面と、細胞支持体１１４ｂの端面と、細胞支持体１１４ａの端面（すなわち、ディスク部１１５の裏面）とが略同一平面上に位置している場合、仮想平面Ｓ２は、図３（Ｂ）に示されるように第２の収容ユニット１２０の底面直下に位置することとなる。したがって、本実施形態の一態様において、流路の底面の接線方向に底面を仮想的に延長させた仮想延長面Ｓ１は、第２の収容ユニットの底面の仮想延長面と交差してもよい。
【0058】
第２の細胞群から延出する軸索をより効率よく第１の細胞群と接合させる観点から、仮想延長面Ｓ１と仮想平面Ｓ２とのなす角度は、好ましくは６０°以上１２０°以下であり、より好ましくは６５°以上１００°以下であり、さらに好ましくは７０°以上９０°以下である。
【0059】
図３において、開口端１２４Ｅにおける流路の底面部と仮想平面Ｓ２との高さの差ｈ２は、第２の培養部１２２の底面と仮想平面Ｓ２との高さの差ｈ１より小さい。これは、第２の細胞群の軸索が、第２の培養部１２２から流路１２４を通過して、開口端１２４Ｅから突出するまでに、第１の細胞群が培養される仮想平面に接近することを意味する。なお、図３において、ｈ２は端面部１２４Ｒｅの高さと略等しい。なお、高さの差ｈ２は、開口端１２４Ｅにおける流路の底面部と仮想平面Ｓ２との最短距離であり、高さの差ｈ１は、第２の培養部１２２の底面と仮想平面Ｓ２との最短距離である。
【0060】
ｈ２はｈ１に対して、例えば８０％以下であり、好ましくは６０％以下であり、より好ましくは５０％以下であり、さらに好ましくは４０％以下であり、さらにより好ましくは２０％以下である。
【0061】
第２の細胞群から延出する軸索をより効率よく第１の細胞群と接合させる観点から、ｈ２は、好ましくは３００μｍ以下であり、より好ましくは１００μｍ以下であり、さらに好ましくは５０μｍ以下であり、さらにより好ましくは１０μｍ以下である。ｈ２の下限は特に限定されず、例えば０μｍ又は１μｍである。
【0062】
図２に示されるように、流路１２４は、領域１２４ａ、１２４ｂ、１２４ｃ及び１２４Ｒから構成されている。これら各領域の長さを合計した流路１２４の流路長さは、例えば０．１０ｍｍ以上１０ｍｍ以下であり、好ましくは０．３０ｍｍ以上８．０ｍｍ以下であり、より好ましくは０．４０ｍｍ以上５．０ｍｍ以下であり、さらに好ましくは０．５０ｍｍ以上３．０ｍｍ以下である。
【0063】
領域１２４ａ及び１２４ｂの合計流路長さ：領域１２４ｃ及び１２４Ｒ（先端部１２４Ｒ）の合計流路長さは、例えば１：２～２：１であってよく、好ましくは１：１．５～１．５：１である（いずれの範囲も両端値を含む）。先端部１２４Ｒの流路長さは、流路１２４の全体の長さに対して、例えば５．０％以上５０％以下であってよく、好ましくは１０％以上４０%以下である。
【0064】
第２の収容ユニット１２０を構成する材料は特に限定されず、金属、セラミック、ポリマー、ガラス、及びゴム等の種々の材料を含んでいてよい。第２の収容ユニット１２０は、シクロオレフィンポリマー及びシクロオレフィンコポリマーのようなタンパク質等の生体物質の非特異吸着が生じにくい材料を含むと好ましい。
また、第２の収容ユニット１２０は、流路底面を構成する部材とその他の部材とが異なる材料で構成されていてもよい。第２の収容ユニット１２０は、互いに異なる材料により形成されていてよい後述の部材４００ａ及び４００ｂからなっていてよい。
また、第２の収容ユニット１２０は、流路底面を構成する部材とその他の部材とが異なる材料で構成されていてもよい。第２の収容ユニット１２０は、互いに異なる材料により形成されていてよい後述の部材４００ａ及び４００ｂからなっていてよい。
【0065】
このように、本実施形態のデバイスでは、第２の培養部から第１の培養部に至るまで、軸索の伸長を妨げる段差等がなく、特に第２の収容ユニット１２０と第１の収容ユニット１１０との境界である先端部１２４Ｒ及び開口端１２４Ｅにおいても軸索が第１の細胞群方向（仮想平面Ｓ２に向かう方向）に誘導されるように構成されているため、第２の細胞群から延出する軸索が効率よく第１の細胞群と接合される。
【0066】
（第２実施形態）
図４は本実施形態の別の態様に係るデバイスの流路付近における（Ａ）概略拡大斜視図、及び（Ｂ）概略拡大断面図（Ｘ－Ｘ断面図）である。第２実施形態のデバイス２００は、第１の培養部及び第２の培養部を接続する流路２２４の先端部２２４Ｒが、湾曲底面部２２４Ｒｒのみから構成され、端面部を有していない点のみにおいて、第１実施形態のデバイス１００と異なる。図４において、第２の培養部１２２、及び細胞支持体１１４ｂは、デバイス１００と同一の構成を有する。また、流路２２４は、先端部２２４Ｒ以外はデバイス１００と同一の構成を有する。
図４は本実施形態の別の態様に係るデバイスの流路付近における（Ａ）概略拡大斜視図、及び（Ｂ）概略拡大断面図（Ｘ－Ｘ断面図）である。第２実施形態のデバイス２００は、第１の培養部及び第２の培養部を接続する流路２２４の先端部２２４Ｒが、湾曲底面部２２４Ｒｒのみから構成され、端面部を有していない点のみにおいて、第１実施形態のデバイス１００と異なる。図４において、第２の培養部１２２、及び細胞支持体１１４ｂは、デバイス１００と同一の構成を有する。また、流路２２４は、先端部２２４Ｒ以外はデバイス１００と同一の構成を有する。
【0067】
デバイス２００において、先端部２２４Ｒが端面部を有していないため、流路２２４の底面が開口端２２４Ｅにおいて第２の収容デバイスの底面と交差する。したがって、この態様において、開口端２２４Ｅにおける流路２２４の底面部が、第１の細胞群が培養される仮想平面Ｓ２と略同一平面上に位置するため、第２の細胞群から延出する軸索をより効率よく第１の細胞群と接合させることができる。
【0068】
（変形例）
本実施形態のデバイスは、第１の収容ユニットと、第２の収容ユニットと、を備え、第１の収容ユニットが、第１の細胞群を培養する第１の培養部を備え、第２の収容ユニットが、第２の細胞群を培養する第２の培養部と、第２の培養部と第１の培養部とを接続する流路と、を備え、流路の第１の培養部側の開口端において、流路の底面の接線方向に底面を仮想的に延長させた仮想延長面が、第１の細胞群が培養される仮想平面と交差する限りにおいて、上述したデバイス１００及び２００を適宜変更することができる。
本実施形態のデバイスは、第１の収容ユニットと、第２の収容ユニットと、を備え、第１の収容ユニットが、第１の細胞群を培養する第１の培養部を備え、第２の収容ユニットが、第２の細胞群を培養する第２の培養部と、第２の培養部と第１の培養部とを接続する流路と、を備え、流路の第１の培養部側の開口端において、流路の底面の接線方向に底面を仮想的に延長させた仮想延長面が、第１の細胞群が培養される仮想平面と交差する限りにおいて、上述したデバイス１００及び２００を適宜変更することができる。
【0069】
例えば、デバイス１００において、第２の培養部１２２は位置決め部１２２ａ及び液浴部１２２ｂからなるが、位置決め部１２２ａは細胞群を位置決めすることができる適当な手段に代えてよく、デバイス１００は液浴部１２２ｂを有していなくてもよい。また、細胞支持体は必ずしも２つ必要ではなく、本実施形態のデバイスは、１つの細胞支持体、あるいは３つ以上の細胞支持体を備えていてもよい。
【0070】
また、デバイス１００では、第１の培養部１１２において、１対の細胞支持体１１４ａ及び１１４ｂに第１の細胞群を保持させているが、第１の培養部１１２は、例えば筋細胞を含む細胞群を２次元的に培養する培養シートであってもよい。この場合、当該培養シート、筋細胞を含む細胞群の運動に応じて可動なように構成することが好ましい。
【0071】
デバイス１００及び２００において、流路の先端部１２４Ｒ及び２２４Ｒの少なくとも一部が円弧状に湾曲することで流路底面が第１の細胞群が培養される仮想平面方向に対して連続的に近接しているが、流路底面は必ずしも円弧状に湾曲している必要はなく、例えば流路底面の傾きを段階的に変化させることで、流路底面を第１の細胞群が培養される仮想平面方向に対して段階的に近接させてもよい。この場合、流路底面の流路の長さ方向（第１の培養部と第２の培養部を結ぶ方向）の断面は多角形状である。
【0072】
さらに、デバイス１００において、第２の収容ユニットは第１の収容ユニット上に配置されているが、第１の収容ユニットを第２の収容ユニット上に配置してもよいし、第１の収容ユニットと第２の収容ユニットとを隣接させて配置してもよい。その場合、流路及び流路の開口端を適宜調整することで第２の培養部に培養される第２の細胞群から延出する軸索が第１の細胞群に接合されるようにすればよい。
【0073】
また、第１の培養部と第２の培養部とを接続する流路の断面形状は、長方形状に限られず、例えば台形状、三角形状、円状、楕円状等であってよい。
【0074】
（用途）
本実施形態のデバイスによれば、例えば第１の培養部に第１の細胞群を培養させ、第２の培養部に神経細胞を含む第２の細胞群を培養させることで、第２の細胞群から延出する軸索が第１の培養部に接合した構造を得ることができる。ここで、第１の細胞群が筋細胞を含む場合、神経筋接合部が形成される。したがって、本実施形態のデバイスは、神経細胞と任意の細胞群との接合部に関する情報を取得するために用いることができ、特に神経筋接合部に関する情報を取得するために好適に用いることができる。
本実施形態のデバイスによれば、例えば第１の培養部に第１の細胞群を培養させ、第２の培養部に神経細胞を含む第２の細胞群を培養させることで、第２の細胞群から延出する軸索が第１の培養部に接合した構造を得ることができる。ここで、第１の細胞群が筋細胞を含む場合、神経筋接合部が形成される。したがって、本実施形態のデバイスは、神経細胞と任意の細胞群との接合部に関する情報を取得するために用いることができ、特に神経筋接合部に関する情報を取得するために好適に用いることができる。
【0075】
第１の培養部に培養される細胞群としては、特に限定されず、例えば筋細胞を含む細胞群が挙げられる。筋細胞としては、特に限定されず、例えば骨格筋細胞、心筋細胞、及び平滑筋細胞であってよい。筋細胞は、随意筋細胞であってよく、不随意筋細胞であってよい。筋細胞は、多能性幹細胞又は初代培養細胞に由来する筋細胞であってよく、株化細胞であってよい。
【0076】
第２の培養部に培養される細胞群としては、特に限定されず、例えば神経細胞を含む細胞群が挙げられる。神経細胞としては、特に限定されず、例えば運動神経細胞であり、アセチルコリンを神経伝達物質とする神経細胞であってよい。神経細胞は、多能性幹細胞又は初代培養細胞に由来する筋細胞であってよく、株化細胞であってよい。
【0077】
本実施形態のデバイスは、以下に詳述する本実施形態の細胞デバイスとして用いることができる。また、本実施形態の神経筋接合部情報取得方法に用いることができる。
【0078】
［細胞デバイス］
本実施形態の細胞デバイスは、第１の収容ユニットと、第２の収容ユニットと、を備え、第１の収容ユニットは、筋細胞を含む第１の細胞群を培養している第１の培養部を備え、第２の収容ユニットは、運動神経細胞を含む第２の細胞群を培養している第２の培養部と、第２の培養部と第１の培養部とを接続する流路と、を備え、流路の第１の培養部側の開口端において、流路の底面の接線方向に底面を仮想的に延長させた仮想延長面が、第１の細胞群と交差し、第１の細胞群及び第２の細胞群は、運動神経細胞から流路の底面に沿って延出し、流路の開口端から突出して第１の培養部に突入している軸索により接合されている。
すなわち、本実施形態の細胞デバイスは、上述した本実施形態のデバイスにおいて、第１の培養部、及び第２の培養部で、それぞれ、筋細胞を含む第１の細胞群、及び運動神経細胞を含む第２の細胞群を培養し、第１の細胞群及び第２の細胞群を第２の細胞群から延出する軸索により接合させた細胞デバイスである。
本実施形態の細胞デバイスは、第１の収容ユニットと、第２の収容ユニットと、を備え、第１の収容ユニットは、筋細胞を含む第１の細胞群を培養している第１の培養部を備え、第２の収容ユニットは、運動神経細胞を含む第２の細胞群を培養している第２の培養部と、第２の培養部と第１の培養部とを接続する流路と、を備え、流路の第１の培養部側の開口端において、流路の底面の接線方向に底面を仮想的に延長させた仮想延長面が、第１の細胞群と交差し、第１の細胞群及び第２の細胞群は、運動神経細胞から流路の底面に沿って延出し、流路の開口端から突出して第１の培養部に突入している軸索により接合されている。
すなわち、本実施形態の細胞デバイスは、上述した本実施形態のデバイスにおいて、第１の培養部、及び第２の培養部で、それぞれ、筋細胞を含む第１の細胞群、及び運動神経細胞を含む第２の細胞群を培養し、第１の細胞群及び第２の細胞群を第２の細胞群から延出する軸索により接合させた細胞デバイスである。
【0079】
図５は、図１に示すデバイス１００を用いて作製した本実施形態の細胞デバイスの（Ａ）概略斜視図及び（Ｂ）流路付近における概略拡大図である。細胞デバイス３００は、上述のデバイス１００と比較して、第１の培養部１１２において第１の細胞群３１０が培養され、第２の培養部１２２において第２の細胞群３２０が培養され、さらに第１の細胞群３１０と第２の細胞群３２０とが、第２の細胞群から延出した軸索３３０によって接合されている点以外は同様の構成を有する。
【0080】
第１の細胞群３１０は、細胞支持体１１４ａ及び１１４ｂに跨って形成されている。より詳細には、第１の細胞群３１０は、細胞支持体１１４ａ及び１１４ｂの最上端において形成され、第１の細胞群３１０の上面は、ディスク部１１５の裏面及び第２の収容ユニット１２０の底面と接触しているか、又は極めて近接している。
【0081】
本実施形態のデバイスでは、流路の底面の接線方向に底面を仮想的に延長させた仮想延長面Ｓ１が第１の細胞群が培養される仮想平面Ｓ２と交差していたが、本実施形態の細胞デバイスでは仮想平面Ｓ２に実際に第１の細胞群３１０が培養されている。したがって、本実施形態の細胞デバイスでは、開口端１２４Ｅにおいて、流路の底面の接線方向に底面を仮想的に延長させた仮想延長面Ｓ１が、第１の細胞群３１０（より好ましくは第１の細胞群の上面）と交差している。
【0082】
仮想延長面Ｓ１と第１の細胞群３１０の上面とのなす角度は、好ましくは６０°以上１２０°以下であり、より好ましくは６５°以上１００°以下であり、さらに好ましくは７０°以上９０°以下である。
【0083】
また、開口端１２４Ｅにおける流路の底面部と第１の細胞群３１０の上面との高さの差Ｈ２は、第２の培養部１２２の底面と第１の細胞群３１０の上面との高さの差Ｈ１より小さい。Ｈ２とＨ１の関係及びそれぞれの数値範囲は、上述のｈ２とｈ１の関係及びそれぞれの数値範囲と同様であってよい。なお、高さの差Ｈ２は、開口端１２４Ｅにおける流路の底面部と第１の細胞群３１０の上面との最短距離であり、高さの差Ｈ１は、第２の培養部１２２の底面と第１の細胞群３１０の上面との最短距離である。
【0084】
第１の細胞群３１０は、筋細胞を含む細胞群である。筋細胞としては、特に限定されず、例えば骨格筋細胞、心筋細胞、及び平滑筋細胞であってよい。筋細胞は、随意筋細胞であってよく、不随意筋細胞であってよい。筋細胞は、多能性幹細胞又は初代培養細胞に由来する筋細胞であってよく、株化細胞であってよい。第１の細胞群３１０は、筋芽細胞を含んでいてもよい。
【0085】
初代培養細胞は、生体内において本来有する細胞機能を多く保持しているため、生体内における薬物等の影響を評価する系として好適に用いられる。多能性幹細胞は、特定の対象から所望の細胞を作製することができる点で、ヒトの筋細胞を評価する場合等に好適に用いられる。
初代培養細胞としては、哺乳類（例えばマウス及びラット等のげっ歯類、又はサル及びヒト等の霊長類等）の筋組織由来の細胞が挙げられる。
初代培養細胞を調製及び培養するに際し、動物の解剖方法、組織の採取方法、細胞の分離・単離方法、培養培地、及び培養条件等は、培養する細胞の種類に応じて、公知の方法から選択することができる。
多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、及びｉＰＳ細胞が挙げられる。公知の分化誘導方法を用いて、多能性幹細胞を分化誘導することにより、様々なタイプの筋細胞を得ることができる。ｉＰＳ細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞が好ましい。
初代培養細胞としては、哺乳類（例えばマウス及びラット等のげっ歯類、又はサル及びヒト等の霊長類等）の筋組織由来の細胞が挙げられる。
初代培養細胞を調製及び培養するに際し、動物の解剖方法、組織の採取方法、細胞の分離・単離方法、培養培地、及び培養条件等は、培養する細胞の種類に応じて、公知の方法から選択することができる。
多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、及びｉＰＳ細胞が挙げられる。公知の分化誘導方法を用いて、多能性幹細胞を分化誘導することにより、様々なタイプの筋細胞を得ることができる。ｉＰＳ細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞が好ましい。
【0086】
第１の細胞群３１０は、神経筋疾患を有する対象に由来する筋芽細胞及び筋細胞の少なくとも１種を用いて作製される細胞群であってよい。あるいは、形質転換された筋芽細胞及び筋細胞の少なくとも１種を用いて作製される細胞群であってもよい。
そのような細胞群を備えることで、細胞デバイス３００は神経筋疾患患者における神経筋接合部を再現することができ、当該疾患の因子の特定や、当該疾患の治療又は予防に有効な薬剤のスクリーニングに好適に用いることができる。
そのような細胞群を備えることで、細胞デバイス３００は神経筋疾患患者における神経筋接合部を再現することができ、当該疾患の因子の特定や、当該疾患の治療又は予防に有効な薬剤のスクリーニングに好適に用いることができる。
【0087】
第２の細胞群３２０は、第２の培養部１２２、特に位置決め部１２２ａにおいて培養されている。第２の細胞群３２０からは軸索が延出している。軸索３３０は流路１２４の底面に沿って伸長し、開口端１２４Ｅから突出して、第１の細胞群３１０の上面に接合し、その結果第１の細胞群及び第２の細胞群は、神経筋接合部を形成している。
【0088】
第２の細胞群３２０は、運動神経細胞を含む細胞群である。運動神経細胞は、アセチルコリンを神経伝達物質とする神経細胞であってよく、多能性幹細胞又は初代培養細胞に由来する神経細胞であってよく、株化細胞であってよい。
【0089】
第２の細胞群３２０は、神経筋疾患を有する対象に由来する多能性幹細胞、又は初代培養細胞を用いて作製される細胞群（神経細胞スフェロイド）であってよい。あるいは、形質転換された運動神経細胞を用いて作製される細胞群であってもよい。
そのような細胞群を備えることで、神経筋疾患患者における神経筋接合部を再現することができ、当該疾患の因子の特定や、当該疾患の治療又は予防に有効な薬剤をスクリーニングすることができる。
そのような細胞群を備えることで、神経筋疾患患者における神経筋接合部を再現することができ、当該疾患の因子の特定や、当該疾患の治療又は予防に有効な薬剤をスクリーニングすることができる。
【0090】
第２の細胞群３２０は運動神経細胞以外の細胞を含んでいてもよい。そのような細胞としては、例えば運動神経細胞以外の神経細胞や、グリア細胞が挙げられる。グリア細胞の例としては、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、上衣細胞、シュワン細胞、及びミクログリア等が挙げられる。これらの細胞が細胞群において占める割合は特に限定されない。
また、第２の細胞群３２０のサイズは、流路１２４を通過しないサイズであればよい。第２の細胞群３２０は、例えば、直径１００μｍ以上５００μｍ以下の略球状、略楕円球状又は扁平状であってよい。
また、第２の細胞群３２０のサイズは、流路１２４を通過しないサイズであればよい。第２の細胞群３２０は、例えば、直径１００μｍ以上５００μｍ以下の略球状、略楕円球状又は扁平状であってよい。
【0091】
本実施形態の細胞デバイスは、以下に詳述する本実施形態の神経筋接合部情報取得方法に用いることができる。
なお、細胞デバイス３００は、上述のデバイス１００を用いて作製されるものであるが、デバイス２００やデバイス１００及び２００を適宜変更したデバイスを用いて作製することができることはいうまでもない。
なお、細胞デバイス３００は、上述のデバイス１００を用いて作製されるものであるが、デバイス２００やデバイス１００及び２００を適宜変更したデバイスを用いて作製することができることはいうまでもない。
【0092】
（作製方法）
本実施形態の細胞デバイスは、本実施形態のデバイスの第１の培養部及び第２の培養部において、それぞれ筋細胞を含む第１の細胞群及び運動神経細胞を含む第２の細胞群を形成し、さらにその後第２の細胞群の軸索が第１の細胞群に接合されるまで共培養することにより作製すればよい。
本実施形態の細胞デバイスは、本実施形態のデバイスの第１の培養部及び第２の培養部において、それぞれ筋細胞を含む第１の細胞群及び運動神経細胞を含む第２の細胞群を形成し、さらにその後第２の細胞群の軸索が第１の細胞群に接合されるまで共培養することにより作製すればよい。
【0093】
筋細胞を含む第１の細胞群を１対の細胞支持体に跨って形成させる方法としては、例えば２本の細胞支持体の少なくとも一部を囲うように筋細胞及び／又は筋芽細胞とヒドロゲルとを含む培養培地を配置し、その後当該ヒドロゲルを固化させる方法が挙げられる。より具体的には、細胞支持体を収容する収容部に筋細胞及び／又は筋芽細胞とヒドロゲルとを含む培養培地を播種した後、例えば３７℃程度に加熱することでヒドロゲルを固化させることで形成すればよい。
【0094】
運動神経細胞を含む第２の細胞群は、運動神経細胞を含む細胞塊を培養することで作製すればよい。培養する細胞塊としては、例えば胎仔を含む動物生体から摘出された組織片や、細胞を培養して得られる運動神経細胞スフェロイド等が挙げられる。運動神経細胞スフェロイドとは、運動神経細胞を含むスフェロイドを意味する。ここで、スフェロイドは当業界における通常の意味で用いられ、例えば複数の細胞の３次元的な集合体を包含する。
【0095】
好適に用いられる組織片としては、例えば脊髄前角から得られた組織片、及び運動神経又は運動神経組織から得られた組織片等が挙げられる。ここで、組織片は、例えば哺乳類から得てもよく、具体的には、マウス及びラット等のげっ歯類、又はサル及びヒト等の霊長類から得てもよい。
培養する組織片は、各片が例えば１００μｍ以上１０００μｍ以下のサイズであってもよい。
培養する組織片は、各片が例えば１００μｍ以上１０００μｍ以下のサイズであってもよい。
【0096】
運動神経細胞スフェロイドとしては、例えば運動神経細胞を培養して得られるものを用いることができる。好適に用いられる運動神経細胞スフェロイドとしては、初代培養細胞を培養して得られる運動神経細胞スフェロイド、及び多能性幹細胞由来の運動神経細胞を培養して得られる運動神経細胞スフェロイドが挙げられる。ここで、初代培養細胞としては、脊髄前角から得られた組織片、及び運動神経又は運動神経組織から得られた組織片から解離して得られた初代培養細胞が好適に用いられる。また、多能性幹細胞由来の運動神経細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞由来の運動神経細胞が好適に用いられる。
【0097】
運動神経細胞スフェロイドは、運動神経細胞（好ましくは、初代培養細胞又は多能性幹細胞由来の運動神経細胞）を、例えば２日以上、好ましくは４日以上、より好ましくは５日以上、更に好ましくは１週間以上、又は例えば２週間以上培養することにより得られるものであってよい。かかる培養期間の上限は特に限定されないが、２週間、３週間、４週間、又は５週間であってもよい。培養期間は、上記の上限値及び下限値を任意に組み合わせた範囲であってもよい。
培養条件は、使用する細胞に合わせて適宜選択すればよく、市販の神経細胞を用いる場合は、添付の培養液を用いてもよい。培養条件としては、例えば５％ＣＯ２、３７℃のインキュベータ中の培養であってもよい。培養の際、培養液は、例えば、１～７日間隔で交換してもよい。
培養条件は、使用する細胞に合わせて適宜選択すればよく、市販の神経細胞を用いる場合は、添付の培養液を用いてもよい。培養条件としては、例えば５％ＣＯ２、３７℃のインキュベータ中の培養であってもよい。培養の際、培養液は、例えば、１～７日間隔で交換してもよい。
【0098】
運動神経細胞を含む細胞塊を第２の培養部１２２で培養することにより、細胞塊を成熟させると共に、運動神経細胞の軸索を成長させ、第１の細胞群に接合させることができる。運動神経細胞を含む細胞塊の第２の培養部１２２における培養期間は、例えば２日以上、好ましくは３日以上、より好ましくは５日以上、更に好ましくは７日以上、又は例えば９日以上である。かかる培養期間の上限は特に限定されないが、４週間、５週間、又は６週間であってもよい。培養期間は、上記の上限値及び下限値を任意に組み合わせた範囲であってもよい。筋細胞を含む第１の細胞群及び運動神経細胞を含む第２の細胞群の共培養期間は、例えば１日以上、好ましくは３日以上、より好ましくは５日以上である。かかる培養期間の上限は特に限定されないが、４週間、５週間、又は６週間であってもよい。培養期間は、上記の上限値及び下限値を任意に組み合わせた範囲であってもよい。
培養条件は、使用する細胞に合わせて適宜選択すればよく、市販の神経細胞を用いる場合は、添付の培養液を用いてもよい。培養条件としては、例えば５％ＣＯ２、３７℃のインキュベータ中の培養であってもよい。培養の際、培養液は、例えば、１～７日間隔で交換してもよい。
培養条件は、使用する細胞に合わせて適宜選択すればよく、市販の神経細胞を用いる場合は、添付の培養液を用いてもよい。培養条件としては、例えば５％ＣＯ２、３７℃のインキュベータ中の培養であってもよい。培養の際、培養液は、例えば、１～７日間隔で交換してもよい。
【0099】
第１の細胞群及び第２の細胞群の培養期間、及び培養条件等は、国際公開第２０２０／１７１０５２号を参照してもよい。
【0100】
［神経筋接合部情報取得方法］
本実施形態の一態様は、本実施形態の細胞デバイスにおける第１の細胞群と第２の細胞群との神経筋接合部に関する情報を取得することを含む方法である。
かかる方法によれば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで任意の筋細胞と任意の運動神経細胞との神経筋接合部を評価することができる。筋細胞と運動神経細胞との神経筋接合部の評価としては、神経筋接合部の形成度合い、及びかかる神経筋接合部により筋細胞と運動神経細胞との間でどの程度情報のやり取りを行うことが可能であるか等が含まれてよい。したがって、例えば、筋細胞及び／又は運動神経細胞として、所定の疾患を有する対象に由来する細胞を用いれば、当該疾患の原因因子の特定や、当該疾患の治療又は予防に有効な薬剤のスクリーニングをすることができる。あるいは、例えば、筋細胞及び／又は運動神経細胞として、形質転換させた細胞を用いれば、疾患と遺伝子との関係を調べることができる。本実施形態の方法は、神経筋接合部の情報を取得する方法であり、神経筋接合部の評価方法でもある。
本実施形態の一態様は、本実施形態の細胞デバイスにおける第１の細胞群と第２の細胞群との神経筋接合部に関する情報を取得することを含む方法である。
かかる方法によれば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで任意の筋細胞と任意の運動神経細胞との神経筋接合部を評価することができる。筋細胞と運動神経細胞との神経筋接合部の評価としては、神経筋接合部の形成度合い、及びかかる神経筋接合部により筋細胞と運動神経細胞との間でどの程度情報のやり取りを行うことが可能であるか等が含まれてよい。したがって、例えば、筋細胞及び／又は運動神経細胞として、所定の疾患を有する対象に由来する細胞を用いれば、当該疾患の原因因子の特定や、当該疾患の治療又は予防に有効な薬剤のスクリーニングをすることができる。あるいは、例えば、筋細胞及び／又は運動神経細胞として、形質転換させた細胞を用いれば、疾患と遺伝子との関係を調べることができる。本実施形態の方法は、神経筋接合部の情報を取得する方法であり、神経筋接合部の評価方法でもある。
【0101】
神経筋接合部に関する情報を取得する方法としては、特に限定されず、例えば、神経筋接合部を構造的に評価すること（例えば、免疫染色法による組織染色）、神経筋接合部にのみに発現する遺伝子及び／又はタンパク質を評価すること（例えば、ＰＣＲ法によるＲＮＡの検出や、ウエスタンブロット法によるタンパク質の検出）、第１の細胞群の収縮弛緩運動を評価すること、並びに第２の細胞群が発する電気信号を検出すること等が挙げられる。これらの中でも、第１の細胞群の収縮弛緩運動及び／又は第２の細胞群が発する電気信号を検出することを含むと好ましい。
【0102】
第１の細胞群の収縮弛緩運動を評価するには、例えば第１の細胞群の収縮弛緩運動を撮影デバイスにより撮影し、第１の細胞群の収縮変位を検出すればよい。この際、細胞支持体の動きを検出することで、間接的に第１の細胞群の収縮変位を算出してもよい。撮影デバイスとしては、例えば顕微鏡及び顕微鏡に取り付けられたカメラであってよい。また、取得した第１の細胞群の収縮変位と、細胞支持体の機械特性（例えばバネ定数）とから、第１の細胞群の収縮力を算出してもよい。第１の細胞群の収縮変位は、適当なアルゴリズムを用いて撮影データから自動で取得してもよい。
【0103】
第２の細胞群が発する電気信号を検出するには、例えば微小な電極を細胞群に近接させて電極周辺の電位の変化を検出する方法が挙げられる。かかる方法において、好ましくは、少なくとも２つの電極が用いられる。
【0104】
また、本実施形態の神経筋接合部情報取得方法において、第２の細胞群が自発的に発する電気信号に応答して第１の細胞群が収縮弛緩運動することを検出してもよい。あるいは、第２の細胞群に外部から電気刺激を与えて、当該電気刺激に応答して第１の細胞群が収縮弛緩運動することを検出してもよい。
（スクリーニング方法）
本実施形態の神経筋接合部情報取得方法の一態様は、疾患の治療又は予防に有効な薬剤のスクリーニング方法である。かかるスクリーニング方法は、第１の細胞群及び／又は第２の細胞群を、被験物質を含む培地で培養することと、被験物質が神経筋接合部に与える影響に関する情報を取得することと、を含む。
（スクリーニング方法）
本実施形態の神経筋接合部情報取得方法の一態様は、疾患の治療又は予防に有効な薬剤のスクリーニング方法である。かかるスクリーニング方法は、第１の細胞群及び／又は第２の細胞群を、被験物質を含む培地で培養することと、被験物質が神経筋接合部に与える影響に関する情報を取得することと、を含む。
【0105】
神経筋接合部に与える影響に関する情報を取得することは、被験物質の投与前後において第１の細胞群と第２の細胞群との神経筋接合部に関する情報を取得し、被験物質の投与が神経筋接合部に与える影響を評価することを含んでよい。これにより、被験物質の疾患に対する有効性や、神経毒性を評価することができ、疾患の治療又は予防に有効な薬剤をスクリーニングすることができる。
【0106】
［細胞群培養用デバイス］
本実施形態の細胞群培養用デバイスは、細胞群を培養する培養部と、培養部を外部に接続する流路と、を備え、流路の外部側の開口端において、流路の底面の接線方向に底面を仮想的に延長させた仮想延長面が、デバイスの底面を仮想的に延長させた仮想底面と交差する。
本実施形態の細胞群培養用デバイスは、細胞群を培養する培養部と、培養部を外部に接続する流路と、を備え、流路の外部側の開口端において、流路の底面の接線方向に底面を仮想的に延長させた仮想延長面が、デバイスの底面を仮想的に延長させた仮想底面と交差する。
【0107】
図６は、本実施形態の細胞群培養用デバイスの一態様を示す（Ａ）概略斜視図、及び（Ｂ）流路付近における概略拡大図である。細胞群培養用デバイス４００は、上述のデバイス１００の第２の収容ユニット１２０のみを取り出したデバイスである。すなわち、細胞群培養用デバイス４００は、細胞群を培養するための培養部１２２と、培養部１２２とデバイス外部とを接続する流路１２４とを備える。培養部１２２は、位置決め部１２２ａと、位置決め部１２２ａの上部に接続された液浴部１２２ｂとからなる。流路１２４は、位置決め部１２２ａからデバイス外部に向かって、領域１２４ａ、１２４ｂ、１２４ｃ及び１２４Ｒから構成され、デバイスの外部側には開口端１２４Ｅが形成されている。ここで、領域１２４Ｒは流路の先端部である。
デバイス１００と同一の符号を付した構成についての重複する説明は省略する。
デバイス１００と同一の符号を付した構成についての重複する説明は省略する。
【0108】
細胞群培養用デバイス４００は、流路１２４が特定のユニットに接続されていない点で、図１～３に示す第２の収容ユニット１２０とは異なる。細胞群培養用デバイス４００において、流路１２４は、位置決め部１２２ａをデバイス外部に接続する。また、開口端１２４Ｅにおいて、流路の底面の接線方向に底面を仮想的に延長させた仮想延長面は、デバイスの底面を仮想的に延長させた仮想底面と交差する。
【0109】
仮想延長面と仮想底面とのなす角度は、好ましくは６０°以上１２０°以下であり、より好ましくは６５°以上１００°以下であり、さらに好ましくは７０°以上９０°以下である。
【0110】
開口端１２４Ｅにおける流路の底面部とデバイスの底面との高さの差Ｈ’２は、培養部１２２の底面とデバイスの底面との高さの差Ｈ’１より小さい。これは、培養部に培養される細胞群の軸索が、培養部１２２から流路１２４を通過して、開口端１２４Ｅから突出するまでに、デバイスの底面に接近することを意味する。
【0111】
Ｈ’２はＨ’１に対して、例えば８０％以下であり、好ましくは６０％以下であり、より好ましくは５０％以下であり、さらに好ましくは３０％以下であり、さらにより好ましくは１０％以下である。
【0112】
Ｈ’２は、好ましくは３００μｍ以下であり、より好ましくは１００μｍ以下であり、さらに好ましくは５０μｍ以下であり、さらにより好ましくは１０μｍ以下である。Ｈ’２の下限は特に限定されず、例えば０μｍ又は１μｍである。
【0113】
流路１２４は、培養部１２２に培養される細胞群から延出する軸索の成長方向が所定の方向に誘導されるように構成されていてもよい。
【0114】
本実施形態の細胞群培養用デバイスの別の一態様において、培養部を外部に接続する流路は、デバイス２００の流路２２４と同様の構成を有していてもよい。この態様において、流路のデバイスの外部側の開口端の底面部は、デバイスの底面と略同一平面上に位置する。
【0115】
（用途）
本実施形態の細胞群培養用デバイスは、培養部（特に位置決め部）において、細胞群を培養するために用いることができる。本実施形態の細胞群培養用デバイスを用いて、神経細胞（例えば運動神経細胞）を含む細胞群（例えば運動神経細胞スフェロイド）を培養すると、培養に伴い細胞群から軸索が延出する。細胞群培養用デバイスは、培養部から外部に通じる流路を備えるため、当該軸索はデバイス外部に誘導され、流路の開口端から突出する。また、流路の開口端において、流路の底面の接線方向に底面を仮想的に延長させた仮想延長面が、デバイスの底面を仮想的に延長させた仮想底面と交差するように構成されているため、開口端から突出した軸索は、さらにデバイスの底面方向に伸長することが誘導される。
本実施形態の細胞群培養用デバイスは、培養部（特に位置決め部）において、細胞群を培養するために用いることができる。本実施形態の細胞群培養用デバイスを用いて、神経細胞（例えば運動神経細胞）を含む細胞群（例えば運動神経細胞スフェロイド）を培養すると、培養に伴い細胞群から軸索が延出する。細胞群培養用デバイスは、培養部から外部に通じる流路を備えるため、当該軸索はデバイス外部に誘導され、流路の開口端から突出する。また、流路の開口端において、流路の底面の接線方向に底面を仮想的に延長させた仮想延長面が、デバイスの底面を仮想的に延長させた仮想底面と交差するように構成されているため、開口端から突出した軸索は、さらにデバイスの底面方向に伸長することが誘導される。
【0116】
したがって、本実施形態の細胞群培養用デバイスを任意の細胞群の直上に設置し、神経細胞（例えば運動神経細胞）を含む細胞群（例えば運動神経細胞スフェロイド）を培養部で培養することにより、当該任意の細胞群と、神経細胞を含む細胞群とを軸索により接合した構造を得ることができる。当該任意の細胞群が筋細胞を含む細胞群である場合、神経筋接合部が得られる。
【0117】
（作製方法）
本実施形態の細胞群培養用デバイスは、従来公知の方法により作製することができる。例えば、注型成型、射出成形、圧縮成形、真空成形、パウダースラッシュ成形、及び積層成形等の種々の成形方法や、３Ｄプリンティング等を用いてよい。流路底面をより精密に設計する観点からは、図７に示すように、先端部１２４Ｒの湾曲底面に対応する曲面を形成した底面部材４００ｂと、それ以外の構成を備える部材４００ａとをそれぞれ作製し、両者を接合する方法で細胞群培養用デバイスを作製してもよい。底面部材４００ｂにおける流路部分は、特に成形後、切削加工や研磨加工をしてもよい。
本実施形態の細胞群培養用デバイスは、従来公知の方法により作製することができる。例えば、注型成型、射出成形、圧縮成形、真空成形、パウダースラッシュ成形、及び積層成形等の種々の成形方法や、３Ｄプリンティング等を用いてよい。流路底面をより精密に設計する観点からは、図７に示すように、先端部１２４Ｒの湾曲底面に対応する曲面を形成した底面部材４００ｂと、それ以外の構成を備える部材４００ａとをそれぞれ作製し、両者を接合する方法で細胞群培養用デバイスを作製してもよい。底面部材４００ｂにおける流路部分は、特に成形後、切削加工や研磨加工をしてもよい。
【0118】
部材４００ａ及び４００ｂは、互いに異なる材料により形成されていてよい。部材４００ａはシクロオレフィンポリマー及びシクロオレフィンコポリマーのようなタンパク質等の生体物質の非特異吸着が生じにくい材料により形成されていることが好ましい。部材４００ｂは特に限定されないが、成形が容易である観点からポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）により形成されていることが好ましい。部材４００ａ及び４００ｂの接合方法としては、接着剤等による接合であってよく、分子接合であってもよい。
分子接合は、例えば部材４００ａがシクロオレフィンポリマー及び／又はシクロオレフィンコポリマーにより形成され、部材４００ｂがＰＤＭＳにより形成されている場合は、部材４００ａの接合面にシラン処理を行い、部材４００ａ及び４００ｂの接合面にプラズマ処理を行うことで実施すればよい。なお、部材４００ａがＰＤＭＳにより形成されている場合は、上記のシラン処理は省略してよい。本実施形態の細胞群培養用デバイス及びデバイスの作製方法については、国際公開第２０２０／１７１０５２号に記載の方法を適宜参照することができる。
分子接合は、例えば部材４００ａがシクロオレフィンポリマー及び／又はシクロオレフィンコポリマーにより形成され、部材４００ｂがＰＤＭＳにより形成されている場合は、部材４００ａの接合面にシラン処理を行い、部材４００ａ及び４００ｂの接合面にプラズマ処理を行うことで実施すればよい。なお、部材４００ａがＰＤＭＳにより形成されている場合は、上記のシラン処理は省略してよい。本実施形態の細胞群培養用デバイス及びデバイスの作製方法については、国際公開第２０２０／１７１０５２号に記載の方法を適宜参照することができる。
【0119】
［付記］
［１］
第１の収容ユニットと、第２の収容ユニットと、を備え、
前記第１の収容ユニットは、筋細胞を含む第１の細胞群を培養している第１の培養部を備え、
前記第２の収容ユニットは、運動神経細胞を含む第２の細胞群を培養している第２の培養部と、前記第２の培養部と前記第１の培養部とを接続する流路と、を備え、
前記流路の前記第１の培養部側の開口端において、前記流路の底面の接線方向に前記底面を仮想的に延長させた仮想延長面が、前記第１の細胞群と交差し、
前記第１の細胞群及び前記第２の細胞群は、前記運動神経細胞から前記流路の底面に沿って延出し前記流路の開口端から突出して前記第１の培養部に突入している軸索により接合されている、
細胞デバイス。
［２］
前記流路の前記第１の培養部側の開口端の底面部と前記第１の細胞群の上面との高さの差が、前記第２の培養部の底面と前記第１の細胞群の上面との高さの差より小さい、
［１］に記載の細胞デバイス。
［３］
前記流路の前記第１の培養部側の開口端の底面部が、前記第１の細胞群と接触している、
［１］又は［２］に記載の細胞デバイス。
［４］
前記流路の前記第１の培養部側の先端部が、前記第１の細胞群に対して、連続的に又は段階的に近接している、
［１］～［３］のいずれか１つに記載の細胞デバイス。
［５］
前記第１の培養部が、１対の細胞支持体と、前記１対の細胞支持体を収容する収容部とを備え、
前記第１の細胞群が、前記１対の細胞支持体に跨って形成されている、
［１］～［４］のいずれか１つに記載の細胞デバイス。
［６］
第１の収容ユニットと、第２の収容ユニットと、を備え、
前記第１の収容ユニットは、第１の細胞群を培養する第１の培養部を備え、
前記第２の収容ユニットは、第２の細胞群を培養する第２の培養部と、前記第２の培養部と前記第１の培養部とを接続する流路と、を備え、
前記流路の前記第１の培養部側の開口端において、前記流路の底面の接線方向に前記底面を仮想的に延長させた仮想延長面が、前記第１の細胞群が培養される仮想平面と交差する、
デバイス。
［７］
前記流路の前記第１の培養部側の開口端の底面部と前記第１の細胞群が培養される仮想平面との高さの差が、前記第２の培養部の底面と前記第１の細胞群が培養される仮想平面との高さの差より小さい、
［６］に記載のデバイス。
［８］
前記流路の前記第１の培養部側の開口端の底面部が、前記第１の細胞群が培養される仮想平面と略同一平面上に位置する、
［６］又は［７］に記載のデバイス。
［９］
前記流路の前記第１の培養部側の先端部が、前記第１の細胞群が培養される仮想平面方向に対して、連続的に又は段階的に近接している、
［６］～［８］のいずれか１つに記載のデバイス。
［１０］
前記流路が、前記第２の細胞群から延出する軸索の成長方向が前記第１の細胞群が培養される仮想平面に向かう方向に誘導されるように構成されている、
［６］～［９］のいずれか１つに記載のデバイス。
［１１］
前記第１の培養部が、前記第１の細胞群を形成させるための１対の細胞支持体と、前記１対の細胞支持体を収容する収容部と、を備える、
［６］～［１０］のいずれか１つに記載のデバイス。
［１２］
細胞群を培養する培養部と、前記培養部を外部に接続する流路と、を備えた細胞群培養用デバイスであって、
前記流路の前記外部側の開口端において、前記流路の底面の接線方向に前記底面を仮想的に延長させた仮想延長面が、前記デバイスの底面を仮想的に延長させた仮想底面と交差する、
細胞群培養用デバイス。
［１３］
前記流路の前記外部側の開口端の底面部が、前記デバイスの底面と略同一平面上に位置する、
［１２］に記載の細胞群培養用デバイス。
［１４］
［１］～［５］のいずれか１つに記載のデバイスにおける前記第１の細胞群と前記第２の細胞群との神経筋接合部に関する情報を取得することを含む、情報取得方法。
［１５］
前記第１の細胞群及び／又は前記第２の細胞群を、被験物質を含む培地で培養することと、
前記被験物質が前記神経筋接合部に与える影響に関する情報を取得することと、を含む、
［１４］に記載の情報取得方法。
［１６］
前記神経筋接合部に関する情報を取得することが、前記第１の細胞群の収縮弛緩運動及び／又は前記第２の細胞群が発する電気信号を検出することを含む、
［１４］又は［１５］に記載の情報取得方法。
［１］
第１の収容ユニットと、第２の収容ユニットと、を備え、
前記第１の収容ユニットは、筋細胞を含む第１の細胞群を培養している第１の培養部を備え、
前記第２の収容ユニットは、運動神経細胞を含む第２の細胞群を培養している第２の培養部と、前記第２の培養部と前記第１の培養部とを接続する流路と、を備え、
前記流路の前記第１の培養部側の開口端において、前記流路の底面の接線方向に前記底面を仮想的に延長させた仮想延長面が、前記第１の細胞群と交差し、
前記第１の細胞群及び前記第２の細胞群は、前記運動神経細胞から前記流路の底面に沿って延出し前記流路の開口端から突出して前記第１の培養部に突入している軸索により接合されている、
細胞デバイス。
［２］
前記流路の前記第１の培養部側の開口端の底面部と前記第１の細胞群の上面との高さの差が、前記第２の培養部の底面と前記第１の細胞群の上面との高さの差より小さい、
［１］に記載の細胞デバイス。
［３］
前記流路の前記第１の培養部側の開口端の底面部が、前記第１の細胞群と接触している、
［１］又は［２］に記載の細胞デバイス。
［４］
前記流路の前記第１の培養部側の先端部が、前記第１の細胞群に対して、連続的に又は段階的に近接している、
［１］～［３］のいずれか１つに記載の細胞デバイス。
［５］
前記第１の培養部が、１対の細胞支持体と、前記１対の細胞支持体を収容する収容部とを備え、
前記第１の細胞群が、前記１対の細胞支持体に跨って形成されている、
［１］～［４］のいずれか１つに記載の細胞デバイス。
［６］
第１の収容ユニットと、第２の収容ユニットと、を備え、
前記第１の収容ユニットは、第１の細胞群を培養する第１の培養部を備え、
前記第２の収容ユニットは、第２の細胞群を培養する第２の培養部と、前記第２の培養部と前記第１の培養部とを接続する流路と、を備え、
前記流路の前記第１の培養部側の開口端において、前記流路の底面の接線方向に前記底面を仮想的に延長させた仮想延長面が、前記第１の細胞群が培養される仮想平面と交差する、
デバイス。
［７］
前記流路の前記第１の培養部側の開口端の底面部と前記第１の細胞群が培養される仮想平面との高さの差が、前記第２の培養部の底面と前記第１の細胞群が培養される仮想平面との高さの差より小さい、
［６］に記載のデバイス。
［８］
前記流路の前記第１の培養部側の開口端の底面部が、前記第１の細胞群が培養される仮想平面と略同一平面上に位置する、
［６］又は［７］に記載のデバイス。
［９］
前記流路の前記第１の培養部側の先端部が、前記第１の細胞群が培養される仮想平面方向に対して、連続的に又は段階的に近接している、
［６］～［８］のいずれか１つに記載のデバイス。
［１０］
前記流路が、前記第２の細胞群から延出する軸索の成長方向が前記第１の細胞群が培養される仮想平面に向かう方向に誘導されるように構成されている、
［６］～［９］のいずれか１つに記載のデバイス。
［１１］
前記第１の培養部が、前記第１の細胞群を形成させるための１対の細胞支持体と、前記１対の細胞支持体を収容する収容部と、を備える、
［６］～［１０］のいずれか１つに記載のデバイス。
［１２］
細胞群を培養する培養部と、前記培養部を外部に接続する流路と、を備えた細胞群培養用デバイスであって、
前記流路の前記外部側の開口端において、前記流路の底面の接線方向に前記底面を仮想的に延長させた仮想延長面が、前記デバイスの底面を仮想的に延長させた仮想底面と交差する、
細胞群培養用デバイス。
［１３］
前記流路の前記外部側の開口端の底面部が、前記デバイスの底面と略同一平面上に位置する、
［１２］に記載の細胞群培養用デバイス。
［１４］
［１］～［５］のいずれか１つに記載のデバイスにおける前記第１の細胞群と前記第２の細胞群との神経筋接合部に関する情報を取得することを含む、情報取得方法。
［１５］
前記第１の細胞群及び／又は前記第２の細胞群を、被験物質を含む培地で培養することと、
前記被験物質が前記神経筋接合部に与える影響に関する情報を取得することと、を含む、
［１４］に記載の情報取得方法。
［１６］
前記神経筋接合部に関する情報を取得することが、前記第１の細胞群の収縮弛緩運動及び／又は前記第２の細胞群が発する電気信号を検出することを含む、
［１４］又は［１５］に記載の情報取得方法。
【実施例0120】
以下、本発明を実施例及び比較例を用いてより具体的に説明する。本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【0121】
［細胞デバイスの作製］
（デバイスの作製）
以下のようにして図１～３に示すようなデバイスを作製した。まず、図７に示す部材４００ａ、図７に示す部材４００ｂ、及び図１に示す第１の収容ユニット１１０を、それぞれ図８～１０に示す寸法（図中の数値の単位はｍｍである。）にて作製した。第１の収容ユニット１１０、及び部材４００ｂは、ＰＤＭＳを原料として、樹脂型を用いた注型成型により作製し、部材４００ａは、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）プレートを切削することにより作製した。次いで部材４００ａの接合面（底面）にシラン処理を行い、部材４００ａ及び４００ｂの接合面にプラズマ処理を行った後、両者を接合して、第２の収容ユニット１２０を作製した。このようにして得られた第２の収容ユニット１２０及び第１の収容ユニット１１０の接合面にプラズマ処理を行った後、両者を接合した。
（デバイスの作製）
以下のようにして図１～３に示すようなデバイスを作製した。まず、図７に示す部材４００ａ、図７に示す部材４００ｂ、及び図１に示す第１の収容ユニット１１０を、それぞれ図８～１０に示す寸法（図中の数値の単位はｍｍである。）にて作製した。第１の収容ユニット１１０、及び部材４００ｂは、ＰＤＭＳを原料として、樹脂型を用いた注型成型により作製し、部材４００ａは、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）プレートを切削することにより作製した。次いで部材４００ａの接合面（底面）にシラン処理を行い、部材４００ａ及び４００ｂの接合面にプラズマ処理を行った後、両者を接合して、第２の収容ユニット１２０を作製した。このようにして得られた第２の収容ユニット１２０及び第１の収容ユニット１１０の接合面にプラズマ処理を行った後、両者を接合した。
【0122】
（デバイスのコーティング）
次に、得られたデバイスの培養部をコーティングした。
デバイスをｄｉｓｈ上に表向きにして並べ、フタを開けた状態でオゾンガス＋ＵＶ殺菌装置（Genlantis社製、CoolCLAVETM Plus Ozone and UV Sterilizer）に入れオゾンガス及びＵＶによる殺菌を行った。次に、デバイスをクリーンベンチ内で２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移し、図１に示す培養部１１２にのみ２％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ溶液（Thermo Fisher Scientific社製）１５０μＬを加え、一晩４℃冷蔵庫内又は室温で１時間コーティングを行った。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ溶液をアスピレータで除去し、デバイスを２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅから取り出し、６０ｍｍ ｄｉｓｈに並べた後、プラズマ発生装置によりプラズマ処理を行った。デバイスを２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移し、コーティング液（無血清培地で１００倍に希釈したＭａｔｒｉｇｅｌ溶液（Corning社製））を各デバイスの神経ポート（図１の培養部１２２）に１２０μＬ、筋肉ポート（図１の培養部１１２）に７００μＬ入れた。ｐｌａｔｅの蓋をして、遠心（１０００ｒｐｍ、３０ｓｅｃ）してデバイスを沈めた。デシケータに入れ、アスピレータ（－０．０６ＭＰａ程度）で脱気を３０分行った。３０分後、デシケータから取り出し、遠心（１０００ｒｐｍ、１分）で脱泡した。
次に、得られたデバイスの培養部をコーティングした。
デバイスをｄｉｓｈ上に表向きにして並べ、フタを開けた状態でオゾンガス＋ＵＶ殺菌装置（Genlantis社製、CoolCLAVETM Plus Ozone and UV Sterilizer）に入れオゾンガス及びＵＶによる殺菌を行った。次に、デバイスをクリーンベンチ内で２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移し、図１に示す培養部１１２にのみ２％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ溶液（Thermo Fisher Scientific社製）１５０μＬを加え、一晩４℃冷蔵庫内又は室温で１時間コーティングを行った。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ溶液をアスピレータで除去し、デバイスを２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅから取り出し、６０ｍｍ ｄｉｓｈに並べた後、プラズマ発生装置によりプラズマ処理を行った。デバイスを２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移し、コーティング液（無血清培地で１００倍に希釈したＭａｔｒｉｇｅｌ溶液（Corning社製））を各デバイスの神経ポート（図１の培養部１２２）に１２０μＬ、筋肉ポート（図１の培養部１１２）に７００μＬ入れた。ｐｌａｔｅの蓋をして、遠心（１０００ｒｐｍ、３０ｓｅｃ）してデバイスを沈めた。デシケータに入れ、アスピレータ（－０．０６ＭＰａ程度）で脱気を３０分行った。３０分後、デシケータから取り出し、遠心（１０００ｒｐｍ、１分）で脱泡した。
【0123】
（運動神経細胞を含む細胞群の調製及び培養）
運動神経細胞を含む細胞群（以下、「運動神経細胞スフェロイド」という。）は、以下のようにして調製した。
運動神経細胞の凍結ストックを３７℃の温浴で解凍した。温めておいたＮＢ２７培地（表１の組成を有する。以下同様である。）に全量を移し、１０００ｒｐｍで３分遠心分離した。適量のＭＮ培地（表２の組成を有する。以下同様である。）で再懸濁した後、セルカウントし、運動神経細胞スフェロイド作製用細胞懸濁液の調製量を算出した。この際、運動神経細胞スフェロイド１個当たりの細胞数は２．５×１０４ｃｅｌｌｓ、１ウェル当たりの液量は１５０μＬとした。算出した細胞懸濁液にＭＮ培地を添加し運動神経細胞スフェロイド作製用細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液をＵ底９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１５０μＬずつ播種し、周りに乾燥防止のため蒸留水を適量入れた。プレートを２００ｇ、３分遠心した後、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベータで培養することで運動神経細胞スフェロイドを調製した。１週間後、培養中のｗｅｌｌ ｐｌａｔｅから培養培地を７５μＬ除去し、ＭＮ維持培地（表３の組成を有する。以下同様である。）を７５μＬ添加した。
運動神経細胞を含む細胞群（以下、「運動神経細胞スフェロイド」という。）は、以下のようにして調製した。
運動神経細胞の凍結ストックを３７℃の温浴で解凍した。温めておいたＮＢ２７培地（表１の組成を有する。以下同様である。）に全量を移し、１０００ｒｐｍで３分遠心分離した。適量のＭＮ培地（表２の組成を有する。以下同様である。）で再懸濁した後、セルカウントし、運動神経細胞スフェロイド作製用細胞懸濁液の調製量を算出した。この際、運動神経細胞スフェロイド１個当たりの細胞数は２．５×１０４ｃｅｌｌｓ、１ウェル当たりの液量は１５０μＬとした。算出した細胞懸濁液にＭＮ培地を添加し運動神経細胞スフェロイド作製用細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液をＵ底９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１５０μＬずつ播種し、周りに乾燥防止のため蒸留水を適量入れた。プレートを２００ｇ、３分遠心した後、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベータで培養することで運動神経細胞スフェロイドを調製した。１週間後、培養中のｗｅｌｌ ｐｌａｔｅから培養培地を７５μＬ除去し、ＭＮ維持培地（表３の組成を有する。以下同様である。）を７５μＬ添加した。
【0124】
上記の培養開始から７～１４日後の運動神経細胞スフェロイドを上記でコーティングしたデバイスに播種し、培養した。まず、デバイスの神経ポート（図１の培養部１２２）にＭＮ維持培地を１２０μＬ加えた。運動神経細胞スフェロイドをデバイスの神経ポート（図１の培養部１２２）にゆっくり播種した後、運動神経細胞スフェロイドが図１に示す位置決め部１２２ａに播種されているかを顕微鏡で確認した。運動神経細胞スフェロイドを神経ポートに播種した日を培養０日目とした。以後２日に１回、神経ポートの培地を６０μＬ除去し、新しいＭＮ維持培地を６０μＬ加えた。
【0125】
【表1】
【0126】
【表2】
【0127】
【表3】
【0128】
（筋細胞を含む細胞群の形成及び培養）
骨格筋細胞を含む細胞群は、以下のようにして培養２日目にデバイスに形成した。
骨格筋細胞（ＨＳＭＭ細胞（Ｌｏｎｚａ社））が播かれた１０ｃｍ ｄｉｓｈの培地をアスピレータで全て除去し、１０ｍｌのＰＢＳ（－）で１回洗浄した。ＰＢＳ（－）をアスピレータで除去し、２ｍｌの０．０５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ ＥＤＴＡ（ナカライテスク株式会社）をｄｉｓｈ上に均一に拡げ、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベータ内に３分静置した。４ｍｌの２０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（表４の組成を有する。）をｄｉｓｈ内に加え、Ｔｒｙｐｓｉｎの働きを止めた後、ピペットで細胞を剥がすようにｄｉｓｈ上を洗浄し、細胞懸濁液をチューブに回収した。１０００ｒｐｍ、５分、２５℃で遠心し、アスピレータで上清を可能な限り除去した。残った細胞塊に１ｍｌの増殖培地（ＨＳＭＭ増殖培地（Lonza社、SkGMTM-2 BulletKitTMMedium））を加えピペッティングでよく懸濁し、セルカウントを行った。セルカウントの結果から、２．８６×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように希釈培地量を計算した。１０００ｒｐｍ、５分、２５℃で遠心し、アスピレータで上清を除去し、細胞塊に計算量の２×ＤＭＥＭ（Merck KGaA社）を添加してピペッティングで均一に懸濁した。得られた細胞懸濁液を用いて、ヒドロゲルを含む細胞ＭＩＸを調製した。デバイスの筋肉ポート（図１の培養部１１２）から培地を除去した後、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ（ナカライテスク株式会社）を加えよく懸濁した細胞ＭＩＸを、筋肉ポート内の溝に３０μＬずつ静かに均等に加えた。インキュベータ内で１５分静置しゲルを固めることにより、筋肉ポート内に筋細胞を含む細胞群を形成した。筋肉ポートにＨＳＭＭ増殖培地を７００μＬ加えた後、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベータで培養した。
骨格筋細胞を含む細胞群は、以下のようにして培養２日目にデバイスに形成した。
骨格筋細胞（ＨＳＭＭ細胞（Ｌｏｎｚａ社））が播かれた１０ｃｍ ｄｉｓｈの培地をアスピレータで全て除去し、１０ｍｌのＰＢＳ（－）で１回洗浄した。ＰＢＳ（－）をアスピレータで除去し、２ｍｌの０．０５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ ＥＤＴＡ（ナカライテスク株式会社）をｄｉｓｈ上に均一に拡げ、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベータ内に３分静置した。４ｍｌの２０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（表４の組成を有する。）をｄｉｓｈ内に加え、Ｔｒｙｐｓｉｎの働きを止めた後、ピペットで細胞を剥がすようにｄｉｓｈ上を洗浄し、細胞懸濁液をチューブに回収した。１０００ｒｐｍ、５分、２５℃で遠心し、アスピレータで上清を可能な限り除去した。残った細胞塊に１ｍｌの増殖培地（ＨＳＭＭ増殖培地（Lonza社、SkGMTM-2 BulletKitTMMedium））を加えピペッティングでよく懸濁し、セルカウントを行った。セルカウントの結果から、２．８６×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように希釈培地量を計算した。１０００ｒｐｍ、５分、２５℃で遠心し、アスピレータで上清を除去し、細胞塊に計算量の２×ＤＭＥＭ（Merck KGaA社）を添加してピペッティングで均一に懸濁した。得られた細胞懸濁液を用いて、ヒドロゲルを含む細胞ＭＩＸを調製した。デバイスの筋肉ポート（図１の培養部１１２）から培地を除去した後、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ（ナカライテスク株式会社）を加えよく懸濁した細胞ＭＩＸを、筋肉ポート内の溝に３０μＬずつ静かに均等に加えた。インキュベータ内で１５分静置しゲルを固めることにより、筋肉ポート内に筋細胞を含む細胞群を形成した。筋肉ポートにＨＳＭＭ増殖培地を７００μＬ加えた後、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベータで培養した。
【0129】
【表4】
【0130】
（共培養）
培養４日目に、筋細胞を含む細胞群を１対の細胞支持体の上部に持ち上げ、運動神経細胞スフェロイドと筋細胞を含む細胞群とを近接させて共培養を開始した。筋細胞を含む細胞群の持ち上げは、ピンセットや注射針を用いて、デバイスを傾けないように少しずつ行い、当該細胞群が図１のディスク部１１５及び第２の収容ユニット１２０の底面に接触するようにした。筋肉ポートの培地を全量除去し、ＨＳＭＭ分化培地（表５の組成を有する。）を７００μＬ添加した。神経ポートの培地を半量（６０μＬ）新しいＭＮ維持培地に交換し、培養を継続した。同様の培地交換を２日に１回実施した。共培養を開始して５日目（培養９日目に対応）前後から筋細胞を含む細胞群の自発的収縮が確認され始めた。
培養４日目に、筋細胞を含む細胞群を１対の細胞支持体の上部に持ち上げ、運動神経細胞スフェロイドと筋細胞を含む細胞群とを近接させて共培養を開始した。筋細胞を含む細胞群の持ち上げは、ピンセットや注射針を用いて、デバイスを傾けないように少しずつ行い、当該細胞群が図１のディスク部１１５及び第２の収容ユニット１２０の底面に接触するようにした。筋肉ポートの培地を全量除去し、ＨＳＭＭ分化培地（表５の組成を有する。）を７００μＬ添加した。神経ポートの培地を半量（６０μＬ）新しいＭＮ維持培地に交換し、培養を継続した。同様の培地交換を２日に１回実施した。共培養を開始して５日目（培養９日目に対応）前後から筋細胞を含む細胞群の自発的収縮が確認され始めた。
【0131】
【表5】
【0132】
［神経筋接合部の評価］
以上のようにして作製した細胞デバイスを用いて神経筋接合部の評価を行った。
筋細胞を含む細胞群の収縮弛緩運動を顕微鏡に接続したカメラで撮影し、収縮変位を経時的に測定した。図１１に示すように、運動神経細胞の自発的な発火に応答して、筋細胞を含む細胞群が自発的に収縮弛緩運動する様子が観察された。この際の最大収縮変位は１４２．０６μｍであり、予め測定した細胞支持体のバネ定数０．１４９μＮ／μｍから、最大収縮力が２１．１７μＮであることがわかった。
以上のようにして作製した細胞デバイスを用いて神経筋接合部の評価を行った。
筋細胞を含む細胞群の収縮弛緩運動を顕微鏡に接続したカメラで撮影し、収縮変位を経時的に測定した。図１１に示すように、運動神経細胞の自発的な発火に応答して、筋細胞を含む細胞群が自発的に収縮弛緩運動する様子が観察された。この際の最大収縮変位は１４２．０６μｍであり、予め測定した細胞支持体のバネ定数０．１４９μＮ／μｍから、最大収縮力が２１．１７μＮであることがわかった。
【0133】
また、第２の培養部に培養されている運動神経細胞を含む細胞群のみに２本の電極を用いて電気刺激を与えたところ、図１２に示すように、当該電気刺激に応答して筋細胞を含む細胞群の収縮弛緩運動が観察された。この際の最大収縮変位は１７７．５８μｍであり、予め測定した細胞支持体のバネ定数０．１４９μＮ／μｍから、最大収縮力が２６．４６μＮであることがわかった。なお、図１１及び１２の結果は、共培養開始からそれぞれ２３及び２５日目に取得した。
【0134】
以上の結果から、別々に培養した筋細胞を含む細胞群と運動神経細胞を含む細胞群とが、効率よく神経筋接合部を形成し、多数の軸索が筋細胞に結合した細胞デバイスが得られたことが示された。
【符号の説明】
【0135】
１００，２００…デバイス、１１０…第１の収容ユニット、１１２…第１の培養部、１１４ａ，１１４ｂ…細胞支持体、１１５…ディスク部、１１６…収容部、１１８…設置部、１２０…第２の収容ユニット、１２２…第２の培養部、１２２ａ…位置決め部、１２２ｂ…液浴部、１２４，２２４…流路、１２４Ｅ，２２４Ｅ…開口端、１２４Ｒ，２２４Ｒ…先端部、１２４Ｒｅ…端面部、１２４Ｒｒ，２２４Ｒｒ…湾曲底面部、３００…細胞デバイス、３１０…第１の細胞群、３２０…第２の細胞群、３３０…軸索、４００…細胞群培養用デバイス、Ｓ１…仮想延長面、Ｓ２…仮想平面。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
