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特開2024-127776遊離脂肪酸生産藻類とその製造方法、および脂肪酸製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024127776
(43)【公開日】2024-09-20
(54)【発明の名称】遊離脂肪酸生産藻類とその製造方法、および脂肪酸製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/13 20060101AFI20240912BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20240912BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240912BHJP
C12P 7/40 20060101ALI20240912BHJP
C12R 1/89 20060101ALN20240912BHJP
【ＦＩ】
C12N1/13 ZNA
C12N15/55
C12N15/11 Z
C12P7/40
C12R1:89
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024020449
(22)【出願日】2024-02-14
(31)【優先権主張番号】P 2023036698
(32)【優先日】2023-03-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和４年度、国立研究開発法人新エネルギー・産業技術総合開発機構「カーボンリサイクル実現を加速するバイオ由来製品生産技術の開発 産業用物質生産システム実証」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】000206211
【氏名又は名称】大成建設株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】504190548
【氏名又は名称】国立大学法人埼玉大学
(71)【出願人】
【識別番号】500433225
【氏名又は名称】学校法人中部大学
(71)【出願人】
【識別番号】596175810
【氏名又は名称】公益財団法人かずさＤＮＡ研究所
(74)【代理人】
【識別番号】110004152
【氏名又は名称】弁理士法人お茶の水内外特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】山本 哲史
(72)【発明者】
【氏名】西山 佳孝
(72)【発明者】
【氏名】門脇 太朗
(72)【発明者】
【氏名】愛知 真木子
(72)【発明者】
【氏名】高谷 信之
(72)【発明者】
【氏名】小俣 達男
(72)【発明者】
【氏名】池田 和貴
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AD02
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA20
4B065AA83X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA10
4B065CA46
(57)【要約】
【課題】藻類が生来備える内在性遺伝子を高発現させた非遺伝子組換え型の遊離脂肪酸生産藻類とさらに光合成機能を強化した遺伝子組換え型遊離脂肪酸生産藻類、非遺伝子組換え型の遊離脂肪酸生産藻類の製造方法、遊離脂肪酸生産藻類を用いた遊離脂肪酸製造方法を提供すること。
【解決手段】藻類が生来備えるリパーゼをコードするＤＮＡ、生来備える遊離脂肪酸を細胞外に排出する輸送体をコードするＤＮＡからなる群から選ばれる１種以上を導入し、別種由来の遺伝子を有さない非遺伝子組換え型である遊離脂肪酸生産藻類、さらに、ｋａｔＧ遺伝子およびｓｏｄＢ遺伝子を導入した遺伝子組換え型の遊離脂肪酸生産藻類、藻類に生来備えるリパーゼをコードするＤＮＡ、生来備える遊離脂肪酸を細胞外に排出する輸送体をコードするＤＮＡからなる群から選ばれる１種以上を導入する非遺伝子組換え型の遊離脂肪酸生産藻類の製造方法、および、遊離脂肪酸生産藻類を用いる脂肪酸の製造方法。
【選択図】図１
【解決手段】藻類が生来備えるリパーゼをコードするＤＮＡ、生来備える遊離脂肪酸を細胞外に排出する輸送体をコードするＤＮＡからなる群から選ばれる１種以上を導入し、別種由来の遺伝子を有さない非遺伝子組換え型である遊離脂肪酸生産藻類、さらに、ｋａｔＧ遺伝子およびｓｏｄＢ遺伝子を導入した遺伝子組換え型の遊離脂肪酸生産藻類、藻類に生来備えるリパーゼをコードするＤＮＡ、生来備える遊離脂肪酸を細胞外に排出する輸送体をコードするＤＮＡからなる群から選ばれる１種以上を導入する非遺伝子組換え型の遊離脂肪酸生産藻類の製造方法、および、遊離脂肪酸生産藻類を用いる脂肪酸の製造方法。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
藻類が生来備えるリパーゼをコードするＤＮＡ、生来備える遊離脂肪酸を細胞外に排出する輸送体をコードするＤＮＡからなる群から選ばれる１種以上を導入し、
別種由来の遺伝子を有さない非遺伝子組換え型であることを特徴とする遊離脂肪酸生産藻類。
別種由来の遺伝子を有さない非遺伝子組換え型であることを特徴とする遊離脂肪酸生産藻類。
【請求項2】
シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２株（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ７９４２）を親株とすることを特徴とする請求項１に記載の遊離脂肪酸生産藻類。
【請求項3】
ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－２２４６３）であることを特徴とする請求項１に記載の遊離脂肪酸生産藻類。
【請求項4】
藻類に、生来備えるリパーゼをコードするＤＮＡ、生来備える遊離脂肪酸を細胞外に排出する輸送体をコードするＤＮＡからなる群から選ばれる１種以上を導入することを特徴とする非遺伝子組換え型の遊離脂肪酸生産藻類の製造方法。
【請求項5】
藻類が生来備えるリパーゼをコードするＤＮＡ、生来備える遊離脂肪酸を細胞外に排出する輸送体をコードするＤＮＡからなる群から選ばれる１種以上を導入し、
さらに、ｋａｔＧ遺伝子およびｓｏｄＢ遺伝子を導入し、
遺伝子組換え型であることを特徴とする遊離脂肪酸生産藻類。
さらに、ｋａｔＧ遺伝子およびｓｏｄＢ遺伝子を導入し、
遺伝子組換え型であることを特徴とする遊離脂肪酸生産藻類。
【請求項6】
ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ＿ＫＳ株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－２２４８９）であることを特徴とする請求項５に記載の遊離脂肪酸生産藻類。
【請求項7】
請求項１～３、５～６のいずれかに記載の遊離脂肪酸生産藻類を用いることを特徴とする脂肪酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、遊離脂肪酸生産藻類と、遊離脂肪酸生産藻類の製造方法、および、遊離脂肪酸生産藻類を用いた脂肪酸製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
化石燃料依存からの脱却を目指して、エネルギー物質の持続可能な生産技術の開発が世界中で進められている。その中で、細胞内にトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）等の脂質を蓄積することのできる藻類が注目されている。このような藻類の細胞内に蓄積した脂質は、ジェット燃料やバイオディーゼル燃料（ＢＤＦ：登録商標）の原料に用いることができるため、燃料生産に関する研究が行われている。しかしながら、これらの藻類は、細胞内にＴＡＧ等の脂質を蓄積するが、蓄積した脂質を取り出すには、培養した藻類菌体を回収・乾燥し、有機溶媒等で抽出する必要がある（細胞内生産法）。特に、藻類菌体の回収・乾燥及び有機溶媒による抽出工程は、燃料物質の生産に係る投与エネルギーの５０％以上を要するため、実用化の弊害となっている。
【0003】
そのため、遺伝子組換え藻類を用いた遊離脂肪酸（Ｆｒｅｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ：以下、ＦＦＡともいう）の細胞外生産系が注目されている。
従来の細胞外生産系である遺伝子組換え藻類の脂肪酸代謝経路の模式図を図５に示す。
藻類は、光合成によって同化したＣＯ２からアシルＡＣＰを合成して膜脂質を生合成する。膜脂質からリパーゼの働きによりＦＦＡが切り出されるが、ＦＦＡはアシルＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）によりアシルＡＣＰへと変換されて膜脂質の生合成に再利用されるため、通常は細胞外にＦＦＡは放出されない。しかし、アシルＡＣＰ合成酵素遺伝子（ａａｓ）を破壊すると、細胞内にＦＦＡが蓄積し過剰量のＦＦＡは細胞外へと放出される。さらに、外来のチオエステラーゼ遺伝子（ｔｅｓ）を導入することにより、直接、アシルＡＣＰからＦＦＡを切り出すことが可能となり、ＦＦＡ生産量が大きく増大する。
従来の細胞外生産系である遺伝子組換え藻類の脂肪酸代謝経路の模式図を図５に示す。
藻類は、光合成によって同化したＣＯ２からアシルＡＣＰを合成して膜脂質を生合成する。膜脂質からリパーゼの働きによりＦＦＡが切り出されるが、ＦＦＡはアシルＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）によりアシルＡＣＰへと変換されて膜脂質の生合成に再利用されるため、通常は細胞外にＦＦＡは放出されない。しかし、アシルＡＣＰ合成酵素遺伝子（ａａｓ）を破壊すると、細胞内にＦＦＡが蓄積し過剰量のＦＦＡは細胞外へと放出される。さらに、外来のチオエステラーゼ遺伝子（ｔｅｓ）を導入することにより、直接、アシルＡＣＰからＦＦＡを切り出すことが可能となり、ＦＦＡ生産量が大きく増大する。
【0004】
本発明者らは、非特許文献１において、シアノバクテリアの一種である、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２株（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ
ＰＣＣ ７９４２、以下、７９４２株ともいう）のＳＰｃ株由来で、遺伝子操作によって内在性のアシルＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）の欠損したｄＡＳ１株、非特許文献２において、ｄＡＳ１株に大腸菌由来のアシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子（｀t
ｅｓＡ）を導入したＦＦＡ生産能に優れたｄＡＳ１Ｔ株を提案している。
非特許文献３において、７９４２株の硝酸イオン輸送体欠損株であるＮＡ３を親株として、アシルＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）の欠損と大腸菌由来のチオエステラーゼ（｀tｅｓ
Ａ）を導入したｄＡＳ２Ｔ株に、ＦＦＡを細胞外に排出するためのｒｎｄＡ１Ｂ１を過剰発現するためのプラスミド（ｐＲＮＤ１）を導入した細胞外へのＦＦＡ放出能に優れたｄＡＳ２Ｔ／ｐＲＮＤ１株を提案している。
ＰＣＣ ７９４２、以下、７９４２株ともいう）のＳＰｃ株由来で、遺伝子操作によって内在性のアシルＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）の欠損したｄＡＳ１株、非特許文献２において、ｄＡＳ１株に大腸菌由来のアシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子（｀t
ｅｓＡ）を導入したＦＦＡ生産能に優れたｄＡＳ１Ｔ株を提案している。
非特許文献３において、７９４２株の硝酸イオン輸送体欠損株であるＮＡ３を親株として、アシルＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）の欠損と大腸菌由来のチオエステラーゼ（｀tｅｓ
Ａ）を導入したｄＡＳ２Ｔ株に、ＦＦＡを細胞外に排出するためのｒｎｄＡ１Ｂ１を過剰発現するためのプラスミド（ｐＲＮＤ１）を導入した細胞外へのＦＦＡ放出能に優れたｄＡＳ２Ｔ／ｐＲＮＤ１株を提案している。
【0005】
ＦＦＡを細胞外に放出する細胞外放出系により、細胞内生産法よりもエネルギー効率に優れたバイオ燃料製造が可能である。しかしながら、上記したように、細胞外放出系の遊離脂肪酸生産藻類は、別種由来の遺伝子（以下、外来遺伝子ともいう）が導入されている。
このような外来遺伝子を組み込んだ自然界には存在しない生物は、環境中に漏洩すると、生態系に悪影響を及ぼしかねない。そのため、外来遺伝子を組み込んだ遺伝子組換え藻類による遊離脂肪酸の工業生産実用化のためには、遺伝子組換え藻類の漏洩を防ぐための設備や管理などが必要である。そのため、外来遺伝子を用いることなく、親株である藻類が生来備える内在性遺伝子を高発現させた、非遺伝子組換え型の遊離脂肪酸生産藻類を実現することが求められている。
このような外来遺伝子を組み込んだ自然界には存在しない生物は、環境中に漏洩すると、生態系に悪影響を及ぼしかねない。そのため、外来遺伝子を組み込んだ遺伝子組換え藻類による遊離脂肪酸の工業生産実用化のためには、遺伝子組換え藻類の漏洩を防ぐための設備や管理などが必要である。そのため、外来遺伝子を用いることなく、親株である藻類が生来備える内在性遺伝子を高発現させた、非遺伝子組換え型の遊離脂肪酸生産藻類を実現することが求められている。
【0006】
ここで、ＦＦＡを高生産させるには光合成を盛んに行わせればよい。しかし、遊離脂肪酸生産藻類を含む藻類は強い光に弱く、強光条件下では、増殖、光合成が停止してしまう場合もある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Takatani N, Use K, Kato A, Ikeda K, Kojima K, Aichi M, et al.(2015) Essential role of acyl-ACP synthetase in acclimation of the cyanobacterium Synechococcus elongatus strain PCC 7942 to high-light conditions. Plant Cell Physiol. 56:1608-15.
【非特許文献2】Kato A, Use K, Takatani N, Ikeda K, Matsuura M, Kojima K, Aichi M, et al. (2016) Modulation of the balance of fatty acid production and secretion is crucial for enhancement of growth and productivity of the engineered mutant of the cyanobacterium Synechococcus elongatus. Biotechonol for Biofu. Vol. 9, 91
【非特許文献3】Kato A, Takatani N, Use K, Uesaka K, Ikeda K, Chang Y, et al. (2015)Identification of a cyanobacterial RND-type efflux system involved in export of free fatty acids. Plant Cell Physiol. 56:2467-77.
【非特許文献4】Kato A, Takatani N, Ikeda K, Maeda SI, Omata T (2017) Removal of the product from the culture medium strongly enhances free fatty acid production by genetically engineered Synechococcus elongatus. Biotechnol Biofuels 10:141.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、藻類が生来備える内在性遺伝子を高発現させた非遺伝子組換え型の遊離脂肪酸生産藻類と、この非遺伝子組換え型の遊離脂肪酸生産藻類の製造方法と、非遺伝子組換え型の遊離脂肪酸生産藻類を親株として光合成機能を強化した遊離脂肪酸生産藻類と、遊離脂肪酸生産藻類を用いた遊離脂肪酸製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明の課題を解決するための手段は以下の通りである。
１．藻類が生来備えるリパーゼをコードするＤＮＡ、生来備える遊離脂肪酸を細胞外に排出する輸送体をコードするＤＮＡからなる群から選ばれる１種以上を導入し、
別種由来の遺伝子を有さない非遺伝子組換え型であることを特徴とする遊離脂肪酸生産藻類。
２．シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２株（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ７９４２）を親株とすることを特徴とする１．に記載の遊離脂肪酸生産藻類。
３．ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－２２４６３）であることを特徴とする１．に記載の遊離脂肪酸生産藻類。
４．藻類に、生来備えるリパーゼをコードするＤＮＡ、生来備える遊離脂肪酸を細胞外に排出する輸送体をコードするＤＮＡからなる群から選ばれる１種以上を導入することを特徴とする非遺伝子組換え型の遊離脂肪酸生産藻類の製造方法。
５．藻類が生来備えるリパーゼをコードするＤＮＡ、生来備える遊離脂肪酸を細胞外に排出する輸送体をコードするＤＮＡからなる群から選ばれる１種以上を導入し、
さらに、ｋａｔＧ遺伝子およびｓｏｄＢ遺伝子を導入し、
遺伝子組換え型であることを特徴とする遊離脂肪酸生産藻類。
６．ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ＿ＫＳ株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－２２４８９）であることを特徴とする５．に記載の遊離脂肪酸生産藻類。
７．１．～３．、５．～６．のいずれかに記載の遊離脂肪酸生産藻類を用いることを特徴とする脂肪酸の製造方法。
１．藻類が生来備えるリパーゼをコードするＤＮＡ、生来備える遊離脂肪酸を細胞外に排出する輸送体をコードするＤＮＡからなる群から選ばれる１種以上を導入し、
別種由来の遺伝子を有さない非遺伝子組換え型であることを特徴とする遊離脂肪酸生産藻類。
２．シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２株（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ７９４２）を親株とすることを特徴とする１．に記載の遊離脂肪酸生産藻類。
３．ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－２２４６３）であることを特徴とする１．に記載の遊離脂肪酸生産藻類。
４．藻類に、生来備えるリパーゼをコードするＤＮＡ、生来備える遊離脂肪酸を細胞外に排出する輸送体をコードするＤＮＡからなる群から選ばれる１種以上を導入することを特徴とする非遺伝子組換え型の遊離脂肪酸生産藻類の製造方法。
５．藻類が生来備えるリパーゼをコードするＤＮＡ、生来備える遊離脂肪酸を細胞外に排出する輸送体をコードするＤＮＡからなる群から選ばれる１種以上を導入し、
さらに、ｋａｔＧ遺伝子およびｓｏｄＢ遺伝子を導入し、
遺伝子組換え型であることを特徴とする遊離脂肪酸生産藻類。
６．ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ＿ＫＳ株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－２２４８９）であることを特徴とする５．に記載の遊離脂肪酸生産藻類。
７．１．～３．、５．～６．のいずれかに記載の遊離脂肪酸生産藻類を用いることを特徴とする脂肪酸の製造方法。
【発明の効果】
【0010】
本発明の非遺伝子組換え型である遊離脂肪酸生産藻類は、別種由来の遺伝子（外来遺伝子）を有さない非遺伝子組換え型であるため、仮に環境中に漏洩したとしても、生態系へ悪影響を及ぼす可能性が低い。本発明の非遺伝子組換え型である遊離脂肪酸生産藻類は、藻類が生来備える遺伝子を高発現させたものであり、様々な藻類から製造することができる。脂肪酸製造を行う現場に生息する在来の藻類を親株として非遺伝子組換え型である遊離脂肪酸生産藻類を製造することにより、非遺伝子組換え型である遊離脂肪酸生産藻類が環境中に漏洩した際に生態系へ及ぼす影響を極めて小さくすることができる。
【0011】
本発明の遺伝子組換え型である遊離脂肪酸生産藻類は、光合成機能が強化されており、強光条件下でも光合成を行うことができ、遊離脂肪酸をより効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】本発明の非遺伝子組換え型である遊離脂肪酸生産藻類の代謝経路の模式図。
【図2】実験１における菌量（Ａ）と遊離脂肪酸濃度（Ｂ）の経時変化を示すグラフ。
【図3】実験２における菌量（Ａ）と遊離脂肪酸濃度（Ｂ）の経時変化を示すグラフ。
【図4】実験２における菌量（Ａ）と遊離脂肪酸濃度（Ｂ）の経時変化を示すグラフ。
【図5】従来の細胞外生産系である遺伝子組換え藻類の脂肪酸代謝経路の模式図。
【図6】実験３におけるｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ＿ＫＳ株の異なる光強度での菌量（Ａ）と遊離脂肪酸濃度（Ｂ）の経時変化を示すグラフ。
【図7】実験４における遺伝子組換え型であるｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ＿ＫＳ株と非遺伝子組換え型であるｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ株とを、光強度４００μＥ／ｍ２・ｓで培養したときの菌量（Ａ）と遊離脂肪酸濃度（Ｂ）の経時変化を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【0013】
・非遺伝子組換え型
本発明の非遺伝子組換え型である遊離脂肪酸生産藻類は、別種由来の遺伝子を有さない非遺伝子組換え型であり、親株として用いた藻類が生来備えるリパーゼをコードするＤＮＡ、生来備える遊離脂肪酸を細胞外に排出する輸送体をコードするＤＮＡからなる群から選ばれる１種以上を導入したものである。
本発明の非遺伝子組換え型である遊離脂肪酸生産藻類は、別種由来の遺伝子を有さない非遺伝子組換え型であり、親株として用いた藻類が生来備えるリパーゼをコードするＤＮＡ、生来備える遊離脂肪酸を細胞外に排出する輸送体をコードするＤＮＡからなる群から選ばれる１種以上を導入したものである。
【0014】
非遺伝子組換え型で、遊離脂肪酸生産藻類を構築するためには、（１）内在性のアシルＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）の欠損、（２）外来のチオエステラーゼと同等以上のＦＦＡ生産が可能なリパーゼの高発現が必要である。また、ＦＦＡの細胞内での生産速度が細胞外への放出速度を上回ってしまうと、細胞内に過剰量のＦＦＡが蓄積して生育阻害を引き起こすおそれがあるため、（３）ＦＦＡを細胞外へと排出する輸送体の高発現が必要である。
【0015】
本発明の非遺伝子組換え型である遊離脂肪酸生産藻類の代謝経路の模式図を図１に示す。
本発明の非遺伝子組換え型である遊離脂肪酸生産藻類は、親株として用いた藻類が生来備えるリパーゼをコードするＤＮＡ（以下、リパーゼＤＮＡともいう）、生来備える遊離脂肪酸を細胞外に排出する輸送体をコードするＤＮＡ（以下、輸送体ＤＮＡともいう）からなる群から選ばれる１種以上を導入したものである。これにより上記した（２）リパーゼの高発現と（３）輸送体の高発現のいずれか、または両方が可能となる。
本発明の非遺伝子組換え型である遊離脂肪酸生産藻類は、親株として用いた藻類が生来備えるリパーゼをコードするＤＮＡ（以下、リパーゼＤＮＡともいう）、生来備える遊離脂肪酸を細胞外に排出する輸送体をコードするＤＮＡ（以下、輸送体ＤＮＡともいう）からなる群から選ばれる１種以上を導入したものである。これにより上記した（２）リパーゼの高発現と（３）輸送体の高発現のいずれか、または両方が可能となる。
【0016】
本発明において、親株として使用する藻類は、外来遺伝子を有さないものであれば特に制限されず、シネココッカス属、シネコシスティス属等を用いることができる。具体的には、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２株が挙げられる。なお、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２株は、パスツール研究所（フランス）等から入手可能である。また、遊離脂肪酸製造を行う現場に生息している野生の藻類を採取して親株として使用することもできる。
【0017】
通常、藻類は、複数種のリパーゼ、複数種の輸送体を有しており、リパーゼをコードするＤＮＡとして複数種のＤＮＡ、遊離脂肪酸を細胞外に排出する輸送体をコードするＤＮＡとして複数種のＤＮＡを有する。
本発明において、親株である藻類に導入するＤＮＡとしては、親株が生来備えるリパーゼＤＮＡ、親株が生来備える輸送体ＤＮＡからなる群から選ばれる１種以上であり、例えば、親株が生来備えるリパーゼＤＮＡの１種または２種以上を導入することもでき、親株が生来備える輸送体ＤＮＡの１種または２種以上を導入することもでき、親株が生来備えるリパーゼＤＮＡの１種以上と親株が生来備える輸送体ＤＮＡの１種以上を導入することもできる。親株が有するリパーゼＤＮＡと輸送体ＤＮＡの中から、遊離脂肪酸生産性を高めることのできる１種または２種以上を選択することができる。
遺伝子の導入方法は特に制限されず、自然形質転換、相同組換え等により行うことができる。この際、組み込むＤＮＡの上流に、光化学系ＩＩの反応中心Ｄ１タンパク質をコードするｐｓｂＡＩＩのプロモーターに対して、ネガティブエレメント配列を取り除き恒常的に発現するようにしたｐｓｂＡＩＩプロモーターを接続することにより、導入するリパーゼＤＮＡ、輸送体ＤＮＡを強く発現することができる。
本発明において、親株である藻類に導入するＤＮＡとしては、親株が生来備えるリパーゼＤＮＡ、親株が生来備える輸送体ＤＮＡからなる群から選ばれる１種以上であり、例えば、親株が生来備えるリパーゼＤＮＡの１種または２種以上を導入することもでき、親株が生来備える輸送体ＤＮＡの１種または２種以上を導入することもでき、親株が生来備えるリパーゼＤＮＡの１種以上と親株が生来備える輸送体ＤＮＡの１種以上を導入することもできる。親株が有するリパーゼＤＮＡと輸送体ＤＮＡの中から、遊離脂肪酸生産性を高めることのできる１種または２種以上を選択することができる。
遺伝子の導入方法は特に制限されず、自然形質転換、相同組換え等により行うことができる。この際、組み込むＤＮＡの上流に、光化学系ＩＩの反応中心Ｄ１タンパク質をコードするｐｓｂＡＩＩのプロモーターに対して、ネガティブエレメント配列を取り除き恒常的に発現するようにしたｐｓｂＡＩＩプロモーターを接続することにより、導入するリパーゼＤＮＡ、輸送体ＤＮＡを強く発現することができる。
【0018】
本発明の非遺伝子組換え型である遊離脂肪酸生産藻類として、ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ株を用いることができる。ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ株は受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－２２４６３として、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８（郵便番号２９２－０８１８））に、２０２２年１２月１３日付で国際寄託されている。
【0019】
ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ株は、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２株を親株とする非遺伝子組換え型の遊離脂肪酸生産藻類である。シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２株は、２２個のリパーゼＤＮＡを有すると推定されている。ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ株は、親株に対して、Ｇａｌｐ２リパーゼをコードするＤＮＡであるｇａｌｐ２（配列番号１）と、Ｇａｌｐ１リパーゼをコードするＤＮＡであるｇａｌｐ１（配列番号２）と、遊離脂肪酸を細胞外に排出する輸送体をコードするＤＮＡであるｒｎｄＡ（配列番号３）とｒｎｄＢ（配列番号４）とをｒｎｄＡＢ（配列番号５）として導入したものである。
【0020】
本発明の非遺伝子組換え型である遊離脂肪酸生産藻類は、（１）内在性のアシルＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）の欠損のみを施した親株と比較した、細胞乾燥重量（ＤＣＷ：Ｄｒｙ Ｃｅｌｌ Ｗｅｉｇｈｔ）あたりの遊離脂肪酸生産速度が、１．２倍以上であることが好ましく、１．５倍以上であることがより好ましく、２倍以上であることがさらに好ましく、３倍以上であることがよりさらに好ましく、４倍以上であることがよりさらに好ましい。
【0021】
・遺伝子組換え型
本発明の遺伝子組換え型である遊離脂肪酸生産藻類は、上記した非遺伝子組換え型である遊離脂肪酸生産藻類に、さらに、７９４２株由来のｋａｔＧ遺伝子およびｓｏｄＢ遺伝子を大腸菌由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子と共に導入した遺伝子組換え型である。
ｋａｔＧ遺伝子（配列番号６）は、カタラーゼをコードするＤＮＡである。ＳｏｄＢ遺伝子（配列番号７）は、スーパーオキシドディムスターゼをコードするＤＮＡである。ｋａｔＧ遺伝子とｓｏｄＢ遺伝子は、光合成により生じる活性酸素を除去する酵素であるカタラーゼとスーパーオキシドディムスターゼをコードしており、ｋａｔＧ遺伝子とｓｏｄＢ遺伝子とを導入することにより、光合成機能を強化することができる。
本発明の遺伝子組換え型である遊離脂肪酸生産藻類は、上記した非遺伝子組換え型である遊離脂肪酸生産藻類に、さらに、７９４２株由来のｋａｔＧ遺伝子およびｓｏｄＢ遺伝子を大腸菌由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子と共に導入した遺伝子組換え型である。
ｋａｔＧ遺伝子（配列番号６）は、カタラーゼをコードするＤＮＡである。ＳｏｄＢ遺伝子（配列番号７）は、スーパーオキシドディムスターゼをコードするＤＮＡである。ｋａｔＧ遺伝子とｓｏｄＢ遺伝子は、光合成により生じる活性酸素を除去する酵素であるカタラーゼとスーパーオキシドディムスターゼをコードしており、ｋａｔＧ遺伝子とｓｏｄＢ遺伝子とを導入することにより、光合成機能を強化することができる。
【0022】
本発明の遺伝子組換え型である遊離脂肪酸生産藻類として、ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ＿ＫＳ株を用いることができる。ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ＿ＫＳ株は、ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ株にｋａｔＧ遺伝子とｓｏｄＢ遺伝子を導入した遺伝子組換え型の遊離脂肪酸生産藻類である。ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ＿ＫＳ株は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－２２４８９として、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８（郵便番号２９２－０８１８））に、２０２３年１２月２２日付で国際寄託されている。
【0023】
本発明の遊離脂肪酸生産藻類を培養することにより、脂肪酸を製造することができる。
培養する際の温度は、例えば、１５℃以上４０℃以下であり、２０℃以上が好ましく、２２℃以上がより好ましく、２４℃以上がさらに好ましく、また、３８℃以下が好ましく、３６℃以下がより好ましく、３４℃以下がさらに好ましい。
培養する際のｐＨは、例えば、ｐＨ７．５以上１２．０以下であり、ｐＨ７．８以上が好ましく、ｐＨ８．０以上がより好ましく、また、ｐＨ１１．０以下が好ましく、ｐＨ１０．５以下がより好ましく、ｐＨ１０．０以下がさらに好ましい。
培養する際の温度は、例えば、１５℃以上４０℃以下であり、２０℃以上が好ましく、２２℃以上がより好ましく、２４℃以上がさらに好ましく、また、３８℃以下が好ましく、３６℃以下がより好ましく、３４℃以下がさらに好ましい。
培養する際のｐＨは、例えば、ｐＨ７．５以上１２．０以下であり、ｐＨ７．８以上が好ましく、ｐＨ８．０以上がより好ましく、また、ｐＨ１１．０以下が好ましく、ｐＨ１０．５以下がより好ましく、ｐＨ１０．０以下がさらに好ましい。
【0024】
本発明の遊離脂肪酸生産藻類は、光合成により遊離脂肪酸を生産する。そのため、培養時には光合成のための光を照射することが必要である。
遊離脂肪酸生産藻類が非遺伝子組換え型である場合は、光の強度は、３０μＥ／ｍ２・ｓ以上１５００μＥ／ｍ２・ｓ以下が好ましく、５０μＥ／ｍ２・ｓ以上がより好ましく、１００μＥ／ｍ２・ｓ以上がさらに好ましく、１５０μＥ／ｍ２・ｓ以上がよりさらに好ましく、また、１２００μＥ／ｍ２・ｓ以下がより好ましく、１０００μＥ／ｍ２・ｓ以下がさらに好ましく、８００μＥ／ｍ２・ｓ以下がよりさらに好ましく、６００μＥ／ｍ２・ｓ以下がよりさらに好ましく、４００μＥ／ｍ２・ｓ以下がよりさらに好ましい。
遊離脂肪酸生産藻類が非遺伝子組換え型である場合は、光の強度は、３０μＥ／ｍ２・ｓ以上１５００μＥ／ｍ２・ｓ以下が好ましく、５０μＥ／ｍ２・ｓ以上がより好ましく、１００μＥ／ｍ２・ｓ以上がさらに好ましく、１５０μＥ／ｍ２・ｓ以上がよりさらに好ましく、また、１２００μＥ／ｍ２・ｓ以下がより好ましく、１０００μＥ／ｍ２・ｓ以下がさらに好ましく、８００μＥ／ｍ２・ｓ以下がよりさらに好ましく、６００μＥ／ｍ２・ｓ以下がよりさらに好ましく、４００μＥ／ｍ２・ｓ以下がよりさらに好ましい。
【0025】
遊離脂肪酸生産藻類が遺伝子組換え型である場合は、光の強度は、１００μＥ／ｍ２・ｓ以上１５００μＥ／ｍ２・ｓ以下が好ましく、１５０μＥ／ｍ２・ｓ以上がより好ましく、２００μＥ／ｍ２・ｓ以上がさらに好ましく、２５０μＥ／ｍ２・ｓ以上がよりさらに好ましく、３００μＥ／ｍ２・ｓ以上がよりさらに好ましく、また、１２００μＥ／ｍ２・ｓ以下がより好ましく、１０００μＥ／ｍ２・ｓ以下がさらに好ましく、８００μＥ／ｍ２・ｓ以下がよりさらに好ましく、６００μＥ／ｍ２・ｓ以下がよりさらに好ましい。
【0026】
本発明の遊離脂肪酸生産藻類は、光合成により水と二酸化炭素から脂肪酸を製造する。そのため、脂肪酸の生産性向上の点からは、二酸化炭素濃度が高いことが好ましく、二酸化炭素濃度０．０４％（ｖ／ｖ）以上のガスを吹き込むことが好ましい。吹き込むガス中の二酸化炭素濃度は０．１％以上であることがより好ましく、０．５％以上であることがさらに好ましく、１．０％以上であることがよりさらに好ましく、１．５％以上であることがよりさらに好ましい。一方、二酸化炭素濃度が高くなりすぎると、藻類の生育が阻害される場合がある。そのため、吹き込むガス中の二酸化炭素濃度は、４．０％以下であることが好ましく、３．５％以下であることがより好ましく、３．０％以下であることがさらに好ましい。
【実施例0027】
非特許文献１では、シアノバクテリアの一種である、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２株（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ７９４２、以下、７９４２株ともいう）のＳＰｃ株由来で、遺伝子操作によって内在性のアシルＡＣＰ合成酵素遺伝子（ａａｓ）のコード領域に、カナマイシン耐性遺伝子（ｎｐｔＩ）とスクロース存在下で細胞死を誘導するレバンスクラーゼをコードする遺伝子（ｓａｃＢ）を導入したｄＡＳ１＿ｓａｃＢ株が作製された。
また、非特許文献１では、ａａｓ遺伝子の１９５０塩基のコード領域のうち、７０５－１，３６６にあたる塩基が欠失したＤＮＡプラスミドが作製され、ｄＡＳ１＿ｓａｃＢ株に作製したＤＮＡプラスミドを自然形質転換と相同組換えによって導入し、スクロース添加培地で選抜することにより、ｎｐｔＩとｓａｃＢが取り除かれ、ａａｓ遺伝子の一部が欠失して機能が喪失したｄＡＳ１株が作製された。
また、非特許文献１では、ａａｓ遺伝子の１９５０塩基のコード領域のうち、７０５－１，３６６にあたる塩基が欠失したＤＮＡプラスミドが作製され、ｄＡＳ１＿ｓａｃＢ株に作製したＤＮＡプラスミドを自然形質転換と相同組換えによって導入し、スクロース添加培地で選抜することにより、ｎｐｔＩとｓａｃＢが取り除かれ、ａａｓ遺伝子の一部が欠失して機能が喪失したｄＡＳ１株が作製された。
【0028】
ｐｓｂＡＩＩプロモーターに接続したｇａｌｐ１及びｒｎｄＡＢを、上記に示したａａｓ遺伝子の欠失領域内に導入したＤＮＡプラスミドを作製した。作製したＤＮＡプラスミドをｄＡＳ１＿ｓａｃＢ株にそれぞれ導入し、スクロース添加培地で選抜してｄＡＳ１＿ｇａｌｐ１及びｄＡＳ１＿ｒｎｄＡＢ株を作製した。
【0029】
ａａｓ遺伝子の欠失領域内に、ｐｓｂＡＩＩプロモーターに接続したｇａｌｐ１、ｐｓｂＡＩＩプロモーターに接続したｒｎｄＡＢをタンデムに接続したＤＮＡプラスミドを作製した。作製したＤＮＡプラスミドをｄＡＳ１＿ｓａｃＢ株に導入し、スクロース添加培地で選抜してｄＡＳ１＿ｇａｌｐ１＿ｒｎｄＡＢ株を作製した。ｄＡＳ１＿ｇａｌｐ２＿ｒｎｄＡＢ株も同様に作製した。
【0030】
ａａｓ遺伝子の欠失領域内にｇａｌｐ２、ｇａｌｐ１、ｒｎｄＡＢをそれぞれｐｓｂＡＩＩプロモーターに接続し、順番にタンデムに接続したＤＮＡプラスミドを作製し、ｄＡＳ１＿ｓａｃＢ株に導入し、スクロース添加培地で選抜してｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ株（ｄＡＳ１＿ｇａｌｐ２＿ｇａｌｐ１＿ｒｎｄＡＢ株）を作製した。
【0031】
培養には、ＢＧ－１１培地を一部改変した基本培地（Ｓｕｚｕｋｉ Ｉ．，Ｋｉｋｕｃｈｉ Ｈ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｓ．，Ｆｕｊｉｔａ Ｙ．，Ｓｕｇｉｙａｍａ Ｔ．，Ｏｍａｔａ Ｔ．（１９９５）、Ａ ｎｏｖｅｌ ｎｉｔｒｉｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｐｌｅｃｔｏｎｅｍａ ｂｏｒｙａｎｕｍ． Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：６１３７－６１４３．）を用いた。
基本培地のｐＨは、グッドバッファーであるＴＥＳを使用し、水酸化カリウムの添加によりｐＨ８．２に調整した。
藻類を植菌する際には、硫酸アンモニウムをアンモニウムイオンの終濃度が７．５ｍＭとなるように加えて窒素源とした。
基本培地のｐＨは、グッドバッファーであるＴＥＳを使用し、水酸化カリウムの添加によりｐＨ８．２に調整した。
藻類を植菌する際には、硫酸アンモニウムをアンモニウムイオンの終濃度が７．５ｍＭとなるように加えて窒素源とした。
【0032】
「実験１：非遺伝子組換え型」
・実施例１
９０ｍＬ容量のガラス製培養管に基本培地５０ｍＬを入れてオートクレーブにより滅菌処理（１２１℃、１５分）を施した後、ｄＡＳ１＿ｇａｌｐ１株を植菌し、７０μＥ／ｍ２・ｓの連続光照射下でＯＤ７３０が０．５～１．０になるまで培養した（前培養）。
続いて、前培養液を新しい基本培地へＯＤ７３０が０．０５となるように植菌し、培地中の遊離脂肪酸を回収するためにミリスチン酸イソプロピルを重層した。
ガスボンベによる２％（ｖ/ｖ）ＣＯ２供給と電球色のＬＥＤライトによる７００μＥ／ｍ２・ｓの連続光照射下で、３２℃で１６日間培養した。
・比較例１
ｄＡＳ１株を用いた以外は、実施例１と同様にした。
・実施例１
９０ｍＬ容量のガラス製培養管に基本培地５０ｍＬを入れてオートクレーブにより滅菌処理（１２１℃、１５分）を施した後、ｄＡＳ１＿ｇａｌｐ１株を植菌し、７０μＥ／ｍ２・ｓの連続光照射下でＯＤ７３０が０．５～１．０になるまで培養した（前培養）。
続いて、前培養液を新しい基本培地へＯＤ７３０が０．０５となるように植菌し、培地中の遊離脂肪酸を回収するためにミリスチン酸イソプロピルを重層した。
ガスボンベによる２％（ｖ/ｖ）ＣＯ２供給と電球色のＬＥＤライトによる７００μＥ／ｍ２・ｓの連続光照射下で、３２℃で１６日間培養した。
・比較例１
ｄＡＳ１株を用いた以外は、実施例１と同様にした。
【0033】
「実験２：非遺伝子組換え型」
・実施例２
９０ｍＬ容量のガラス製培養管に基本培地５０ｍＬを入れてオートクレーブにより滅菌処理（１２１℃、１５分）を施した後、ｄＡＳ１＿ｒｎｄＡＢ株を植菌し、７０μＥ／ｍ２・ｓの連続光照射下でＯＤ７３０が０．５～１．０になるまで培養した（前培養）。
続いて、前培養液を本培養の培地へＯＤ７３０が０．０５となるように植菌し、培地中の遊離脂肪酸を回収するためにミリスチン酸イソプロピルを重層した。本培養の培地は硫酸アンモニウムの終濃度が１５ｍＭとなるようにした。ｄＡＳ１Ｔ株のみ窒素源を硫酸アンモニウムではなく、硝酸カリウムにして終濃度が１５ｍＭとなるようにした。
ガスボンベによる２％ＣＯ２供給と電球色のＬＥＤライトによる２００μＥ／ｍ２・ｓの連続光照射下で、３２℃で１０日間培養した。
・実施例２
９０ｍＬ容量のガラス製培養管に基本培地５０ｍＬを入れてオートクレーブにより滅菌処理（１２１℃、１５分）を施した後、ｄＡＳ１＿ｒｎｄＡＢ株を植菌し、７０μＥ／ｍ２・ｓの連続光照射下でＯＤ７３０が０．５～１．０になるまで培養した（前培養）。
続いて、前培養液を本培養の培地へＯＤ７３０が０．０５となるように植菌し、培地中の遊離脂肪酸を回収するためにミリスチン酸イソプロピルを重層した。本培養の培地は硫酸アンモニウムの終濃度が１５ｍＭとなるようにした。ｄＡＳ１Ｔ株のみ窒素源を硫酸アンモニウムではなく、硝酸カリウムにして終濃度が１５ｍＭとなるようにした。
ガスボンベによる２％ＣＯ２供給と電球色のＬＥＤライトによる２００μＥ／ｍ２・ｓの連続光照射下で、３２℃で１０日間培養した。
【0034】
・実施例３
ｄＡＳ１＿ｇａｌｐ１＿ｒｎｄＡＢ株を用いた以外は実施例２と同様にした。
・実施例４
ｄＡＳ１＿ｇａｌｐ２＿ｒｎｄＡＢ株を用いた以外は実施例２と同様にした。
・実施例５
ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ株を用いた以外は実施例２と同様にした。
ｄＡＳ１＿ｇａｌｐ１＿ｒｎｄＡＢ株を用いた以外は実施例２と同様にした。
・実施例４
ｄＡＳ１＿ｇａｌｐ２＿ｒｎｄＡＢ株を用いた以外は実施例２と同様にした。
・実施例５
ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ株を用いた以外は実施例２と同様にした。
【0035】
・比較例２
ｄＡＳ１株を用いた以外は実施例２と同様にした。
・参考例
非特許文献１に記載のｄＡＳ１Ｔ株を用いた以外は実施例２と同様にした。
ｄＡＳ１株を用いた以外は実施例２と同様にした。
・参考例
非特許文献１に記載のｄＡＳ１Ｔ株を用いた以外は実施例２と同様にした。
【0036】
ＦＦＡ濃度は、Ｆｒｅｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）で測定した。
細胞乾燥重量（ｇ／Ｌ）は非特許文献４より、０．２１８×ＯＤ７３０＋０．０１４の式から算出した。
ＯＤ７３０（菌体濁度）とＦＦＡ濃度を定期的に測定した。
１６日後（実験１）または１０日後（実験２）のＦＦＡ濃度と細胞乾燥重量（ＤＣＷ）を求め、ミリスチン酸イソプロピル中のＦＦＡ濃度から培地当たりのＦＦＡ濃度を算出した。さらに培地当たりのＦＦＡ濃度を培養日数（１６日、１０日）で割り、ＦＦＡ生産速度を求め、ＦＦＡ生産速度を細胞乾燥重量で割り、細胞乾燥重量当たりのＦＦＡ生産速度を求めた。結果を表１に示す。
細胞乾燥重量（ｇ／Ｌ）は非特許文献４より、０．２１８×ＯＤ７３０＋０．０１４の式から算出した。
ＯＤ７３０（菌体濁度）とＦＦＡ濃度を定期的に測定した。
１６日後（実験１）または１０日後（実験２）のＦＦＡ濃度と細胞乾燥重量（ＤＣＷ）を求め、ミリスチン酸イソプロピル中のＦＦＡ濃度から培地当たりのＦＦＡ濃度を算出した。さらに培地当たりのＦＦＡ濃度を培養日数（１６日、１０日）で割り、ＦＦＡ生産速度を求め、ＦＦＡ生産速度を細胞乾燥重量で割り、細胞乾燥重量当たりのＦＦＡ生産速度を求めた。結果を表１に示す。
【0037】
【表1】
【0038】
・結果
「実験１」より、Ａａｓの欠損のみを施した比較例１と比較して、リパーゼＤＮＡであるｇａｌｐ１を高発現させた実施例１の遊離脂肪酸生産藻類は、遊離脂肪酸が高蓄積しており（図２）、生産性が向上していた。
「実験２」より輸送体ＤＮＡであるｒｎｄＡＢを発現させた実施例２～５の遊離脂肪酸生産藻類は、Ａａｓの欠損のみを施した比較例２より遊離脂肪酸が高蓄積しており（図３）、生産性が向上していた。輸送体ＤＮＡとリパーゼＤＮＡを共発現した実施例３～５の遊離脂肪酸生産藻類は、Ａａｓの欠損のみを施した比較例２と比較した細胞乾燥重量当たりのＦＦＡ生産速度が４倍以上にもなっており、特に、実施例５の遊離脂肪酸生産藻類は、培地当たりの蓄積脂肪酸量が高く遊離脂肪酸の生産性に優れていた。
さらに実施例５の遊離脂肪酸生産藻類は、非特許文献２で示される外来のチオエステラーゼを導入した遺伝子組換え株である参考例よりも遊離脂肪酸が高蓄積しており（図４）、細胞乾燥重量あたりのＦＦＡ生産速度が高く、非遺伝子組換え型であっても遺伝子組換え藻類と同等以上の遊離脂肪酸の生産性を達成できることが確かめられた。
「実験１」より、Ａａｓの欠損のみを施した比較例１と比較して、リパーゼＤＮＡであるｇａｌｐ１を高発現させた実施例１の遊離脂肪酸生産藻類は、遊離脂肪酸が高蓄積しており（図２）、生産性が向上していた。
「実験２」より輸送体ＤＮＡであるｒｎｄＡＢを発現させた実施例２～５の遊離脂肪酸生産藻類は、Ａａｓの欠損のみを施した比較例２より遊離脂肪酸が高蓄積しており（図３）、生産性が向上していた。輸送体ＤＮＡとリパーゼＤＮＡを共発現した実施例３～５の遊離脂肪酸生産藻類は、Ａａｓの欠損のみを施した比較例２と比較した細胞乾燥重量当たりのＦＦＡ生産速度が４倍以上にもなっており、特に、実施例５の遊離脂肪酸生産藻類は、培地当たりの蓄積脂肪酸量が高く遊離脂肪酸の生産性に優れていた。
さらに実施例５の遊離脂肪酸生産藻類は、非特許文献２で示される外来のチオエステラーゼを導入した遺伝子組換え株である参考例よりも遊離脂肪酸が高蓄積しており（図４）、細胞乾燥重量あたりのＦＦＡ生産速度が高く、非遺伝子組換え型であっても遺伝子組換え藻類と同等以上の遊離脂肪酸の生産性を達成できることが確かめられた。
【0039】
「実験３：遺伝子組換え型」
７９４２株のニュートラルサイトである００８４遺伝子の領域内に、ｐｓｂＡＩＩプロモーターに接続したｋａｔＧ遺伝子およびｓｏｄＢ遺伝子とクロラムフェニコール耐性遺伝子を導入したＤＮＡプラスミドを作製した。作製したプラスミドをｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ株に導入してクロラムフェニコール添加培地で選抜し、ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ＿ＫＳ株を作製した。
７９４２株のニュートラルサイトである００８４遺伝子の領域内に、ｐｓｂＡＩＩプロモーターに接続したｋａｔＧ遺伝子およびｓｏｄＢ遺伝子とクロラムフェニコール耐性遺伝子を導入したＤＮＡプラスミドを作製した。作製したプラスミドをｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ株に導入してクロラムフェニコール添加培地で選抜し、ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ＿ＫＳ株を作製した。
【0040】
・実施例６
９０ｍＬ容量のガラス製培養管に基本培地５０ｍＬを入れてオートクレーブにより滅菌処理（１２１℃、１５分）を施した後、ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ＿ＫＳ株を植菌し、７０μＥ／ｍ２・ｓの連続光照射下でＯＤ７３０が０．５～１．０になるまで培養した（前培養）。
続いて、前培養液を本培養の培地へＯＤ７３０が０．０５となるように植菌し、培地中の遊離脂肪酸を回収するためにミリスチン酸イソプロピルを重層した。本培養の培地は硫酸アンモニウムの終濃度が１５ｍＭとなるようにした。
ガスボンベによる２％ＣＯ２供給と様々な光強度の電球色のＬＥＤライト照射下で、２５℃で１２日間培養した。ＯＤ７３０（菌体濁度）とＦＦＡ濃度を定期的に測定した。結果を図６、表２に示す。
９０ｍＬ容量のガラス製培養管に基本培地５０ｍＬを入れてオートクレーブにより滅菌処理（１２１℃、１５分）を施した後、ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ＿ＫＳ株を植菌し、７０μＥ／ｍ２・ｓの連続光照射下でＯＤ７３０が０．５～１．０になるまで培養した（前培養）。
続いて、前培養液を本培養の培地へＯＤ７３０が０．０５となるように植菌し、培地中の遊離脂肪酸を回収するためにミリスチン酸イソプロピルを重層した。本培養の培地は硫酸アンモニウムの終濃度が１５ｍＭとなるようにした。
ガスボンベによる２％ＣＯ２供給と様々な光強度の電球色のＬＥＤライト照射下で、２５℃で１２日間培養した。ＯＤ７３０（菌体濁度）とＦＦＡ濃度を定期的に測定した。結果を図６、表２に示す。
【0041】
【表2】
【0042】
・結果
ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ＿ＫＳ株を様々な光強度で培養したところ、光強度２００μＥ／ｍ２・ｓで増殖速度が最も高まった。一方、ＦＦＡ生産は、光強度４００μＥ／ｍ２・ｓで４０９ｍｇ－ＦＦＡ／Ｌと最も高い生産量を示し、ＦＦＡ生産速度は培養１２日目に７０ｍｇ－ＦＦＡ／ｇ－ＤＣＷ／日に達した。さらに強い光強度の下では、生育が阻害され、バイオマス当たりのＦＦＡ生産速度は向上したが、ＦＦＡ生産量は減少した。したがって、ＦＦＡ生産量とＦＦＡ生産速度の双方の指標から、この株は光強度４００μＥ／ｍ２・ｓで最も優れたＦＦＡ生産性を示すことが考えられる。
ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ＿ＫＳ株を様々な光強度で培養したところ、光強度２００μＥ／ｍ２・ｓで増殖速度が最も高まった。一方、ＦＦＡ生産は、光強度４００μＥ／ｍ２・ｓで４０９ｍｇ－ＦＦＡ／Ｌと最も高い生産量を示し、ＦＦＡ生産速度は培養１２日目に７０ｍｇ－ＦＦＡ／ｇ－ＤＣＷ／日に達した。さらに強い光強度の下では、生育が阻害され、バイオマス当たりのＦＦＡ生産速度は向上したが、ＦＦＡ生産量は減少した。したがって、ＦＦＡ生産量とＦＦＡ生産速度の双方の指標から、この株は光強度４００μＥ／ｍ２・ｓで最も優れたＦＦＡ生産性を示すことが考えられる。
【0043】
「実験４：遺伝子組換え型と非遺伝子組換え型の比較」
・実施例７
ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ＿ＫＳ株の光耐性を評価するために、ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ＿ＫＳ株を用いて培養試験を行った。本培養の光強度を４００μＥ／ｍ２・ｓに固定した以外は実験３と同様に行った。
・参考例２
ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ株を用いた以外は実施例７と同様にした。
・実施例７
ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ＿ＫＳ株の光耐性を評価するために、ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ＿ＫＳ株を用いて培養試験を行った。本培養の光強度を４００μＥ／ｍ２・ｓに固定した以外は実験３と同様に行った。
・参考例２
ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ株を用いた以外は実施例７と同様にした。
【0044】
【0045】
・結果
１２日目のＦＦＡ生産量は、ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ株は２８８ｍｇ／Ｌに対し、ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ＿ＫＳ株は４０９ｍｇ／Ｌを示した。さらにｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ＿ＫＳ株のＤＣＷ当たりのＦＦＡ生産速度はｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ株の１．８倍であった。
ｋａｔＧ遺伝子およびｓｏｄＢ遺伝子を導入することにより、強光耐性が付与され、ＦＦＡ生産を促進できることが示唆された。
１２日目のＦＦＡ生産量は、ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ株は２８８ｍｇ／Ｌに対し、ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ＿ＫＳ株は４０９ｍｇ／Ｌを示した。さらにｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ＿ＫＳ株のＤＣＷ当たりのＦＦＡ生産速度はｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ株の１．８倍であった。
ｋａｔＧ遺伝子およびｓｏｄＢ遺伝子を導入することにより、強光耐性が付与され、ＦＦＡ生産を促進できることが示唆された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】