特開 2024-128170 遊離脂肪酸の製造方法および遊離脂肪酸生産藻類

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024128170

(43)【公開日】2024-09-24

(54)【発明の名称】遊離脂肪酸の製造方法および遊離脂肪酸生産藻類

(51)【国際特許分類】

   C12P 7/6409 20220101AFI20240913BHJP

   C12N 1/13 20060101ALI20240913BHJP

   C12N 15/53 20060101ALI20240913BHJP

【ＦＩ】

C12P7/6409

C12N1/13 ZNA

C12N15/53

【審査請求】未請求

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023037015

(22)【出願日】2023-03-10

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和２年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、未来社会創造事業「ＦＦＡ生産株における培養条件の最適化とＦＦＡ回収・分離手法の確立」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(71)【出願人】

【識別番号】000206211

【氏名又は名称】大成建設株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】504190548

【氏名又は名称】国立大学法人埼玉大学

(71)【出願人】

【識別番号】504139662

【氏名又は名称】国立大学法人東海国立大学機構

(74)【代理人】

【識別番号】100162396

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 泰之

(74)【代理人】

【識別番号】100122954

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷部 善太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100194803

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 理弘

(72)【発明者】

【氏名】山本 哲史

(72)【発明者】

【氏名】西山 佳孝

(72)【発明者】

【氏名】小俣 達男

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AD85

4B064CA08

4B064CA19

4B064CA21

4B064CC24

4B064DA16

4B065AA01Y

4B065AA83X

4B065AB01

4B065AC06

4B065AC14

4B065BA01

(57)【要約】      （修正有）

【課題】遊離脂肪酸の製造を効率的に行うことのできる脂肪酸の製造方法と遺伝子組換藻類を提供すること。
【解決手段】遊離脂肪酸生産藻類に、下記（Ａ）、（Ｂ）の両方を導入した遺伝子組換藻類を、ｐＨ９．０以上１２．０以下の条件下で培養して脂肪酸を生産させる脂肪酸の製造方法、及び、下記（Ａ）、（Ｂ）の両方を導入した遺伝子組換藻類。
（Ａ）特定の塩基配列を含みＳｏｄＢをコードするＤＮＡ、または、この塩基配列との同一性が８０％以上であり、かつ、スーパーオキシドディムターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｂ）別の特定の塩基配列を含みＶｋｔＡをコードするＤＮＡ、または、この塩基配列との同一性が８０％以上であり、かつ、カタラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【選択図】図４

【特許請求の範囲】

【請求項1】

遊離脂肪酸生産藻類に、下記（Ａ）、（Ｂ）の両方を導入した遺伝子組換藻類を、
ｐＨ９．０以上１２．０以下の条件下で培養して脂肪酸を生産させることを特徴とする脂肪酸の製造方法。
（Ａ）配列番号１で表される塩基配列を含みＳｏｄＢをコードするＤＮＡ、または、該ＳｏｄＢをコードするＤＮＡとの塩基配列の同一性が８０％以上であり、かつ、スーパーオキシドディムターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号２で表される塩基配列を含みＶｋｔＡをコードするＤＮＡ、または、該ＶｋｔＡをコードするＤＮＡとの塩基配列の同一性が８０％以上であり、かつ、カタラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

【請求項2】

前記遺伝子組換藻類が、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２株（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ７９４２）を親株とすることを特徴とする請求項１に記載の脂肪酸の製造方法。

【請求項3】

前記遺伝子組換藻類が、ｄＡＳ１Ｔ＿ＳＶ株（受託番号ＮＩＴＥ ＦＥＲＭ ＢＰ－２２４６４）またはｄＡＳ２Ｔ＿ｐＲＮＤ１＿ＳＶ株（受託番号ＮＩＴＥ ＦＥＲＭ ＢＰ－２２４６５）であることを特徴とする請求項１または２に記載の脂肪酸の製造方法。

【請求項4】

遊離脂肪酸生産藻類に、下記（Ａ）、（Ｂ）の両方を導入した遺伝子組換藻類。
（Ａ）配列番号１で表される塩基配列を含みＳｏｄＢをコードするＤＮＡ、または、該ＳｏｄＢをコードするＤＮＡとの塩基配列の同一性が８０％以上であり、かつ、スーパーオキシドディムターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号２で表される塩基配列を含みＶｋｔＡをコードするＤＮＡ、または、該ＶｋｔＡをコードするＤＮＡとの塩基配列の同一性が８０％以上であり、かつ、カタラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

【請求項5】

前記遊離脂肪酸生産藻類が、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２株（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ７９４２）に遺伝子組換えを行った藻類であることを特徴とする請求項４に記載の遺伝子組換藻類。

【請求項6】

ｄＡＳ１Ｔ＿ＳＶ株（受託番号ＮＩＴＥ ＦＥＲＭ ＢＰ－２２４６４）またはｄＡＳ２Ｔ＿ｐＲＮＤ１＿ＳＶ株（受託番号ＮＩＴＥ ＦＥＲＭ ＢＰ－２２４６５）である遺伝子組換藻類。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、遊離脂肪酸生産藻類を用いた遊離脂肪酸の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

化石燃料依存からの脱却を目指して、エネルギー物質の持続可能な生産技術の開発が世界中で進められている。その中で、遺伝子組み換え微生物を用いた遊離脂肪酸（Ｆｒｅｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ：以下、ＦＦＡともいう）の細胞外生産系が注目されている。細胞外生産系では、生産されたＦＦＡが菌体外に放出され、細胞を破壊することなくＦＦＡを取り出すことができるため、生産量を飛躍的に増加できると期待されている。そのため、これまでに大腸菌、酵母、シアノバクテリアといった様々な微生物を材料にして、ＦＦＡを細胞外へと放出する遺伝子組み換え株が作製されている（非特許文献１～３）。

【0003】

藻類による遊離脂肪酸の製造が、光合成により水と二酸化炭素から脂肪酸を製造することができるため食料生産と競合せず、また、単位面積あたりの脂肪酸の生産量が多いため注目されている。
例えば、非特許文献４には、シアノバクテリアの一種である、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２株（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ７９４２、以下、７９４２株ともいう）のＳＰｃ株由来で、遺伝子操作によって内在性のアシルＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）の欠損と大腸菌由来のアシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子（｀ｔｅｓＡ）を導入したＦＦＡ生産能に優れたｄＡＳ１Ｔ株が提案されている。
非特許文献５には、７９４２株の硝酸イオン輸送体欠損株であるＮＡ３を親株として、アシルＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）の欠損と大腸菌由来のチオエステラーゼ（｀ｔｅｓＡ）を導入したｄＡＳ２Ｔ株に、ＦＦＡを細胞外に排出するためのｒｎｄＡ１Ｂ１を過剰発現するためのプラスミド（ｐＲＮＤ１）を導入した細胞外へのＦＦＡ放出能に優れたｄＡＳ２Ｔ／ｐＲＮＤ１株が提案されている。
特許文献１には、ペルオキシダーゼの発現を促進した脂肪酸又は脂肪酸を構成成分とする脂質の生産性に優れた遊離脂肪酸生産藻類が提案されている。
ここで、遊離脂肪酸生産藻類が、光合成を盛んに行い、脂肪酸を効率的に生産することのできる温度、ｐＨ、光強度等の条件は、当然に他の藻類等の生育にも好ましい条件である。そのため、遊離脂肪酸生産藻類による脂肪酸製造時には、コンタミネーション（他の微生物による汚染）が起こりやすい。そして、コンタミネーションが起こると、他の微生物が栄養源を消費して、遊離脂肪酸生産藻類が利用できる栄養源の割合が少なくなるため、遊離脂肪酸の生産性が低下してしまう。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２０２０－０８０６９８号公報

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Rebecca M. Lennen., Drew J. Braden., Ryan M. West., James A.Dumesic., Brian F. Pfleger. (2010) A Process for Microbial Hydrocarbon Synthesis: Overproduction of Fatty Acids in Escherichia coli and Catalytic Conversion toAlkanes. Biotechnol Bioeng. June 1; 106(2)

【非特許文献2】Yongjin J. Zhou1., Nicolaas A. Buijs1., Zhiwei Zhu., Jiufu Qin., Verena Siewers., Jens Nielsen. (2016) Production of fatty acid-derived oleochemicals and biofuels by synthetic yeast cell factories. Nat. Commun. 7:11709

【非特許文献3】Liu, X., Sheng, J. and Curtiss, R. (2011) Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108: 6899-6904.

【非特許文献4】Kato, A., Use, K., Takatani, N., Ikeda, K., Matsuura, M., Kojima, K., Aichi, M., Maeda, S., Omata, T. (2016) Modulation of the balance of fatty acid production and secretion is crucial for enhancement of growth and productivity of the engineered mutant of the cyanobacterium Synechococcus elongatus. Biotechonol for Biofu. Vol. 9, 91

【非特許文献5】Kato A, Takatani N, Use K, Uesaka K, Ikeda K, Chang Y, et al. (2015)Identification of a cyanobacterial RND-type efflux system involved in export of free fatty acids. Plant Cell Physiol. 56:2467-77.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、遊離脂肪酸の製造を効率的に行うことのできる脂肪酸の製造方法と遺伝子組換え藻類を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の課題を解決するための手段は以下の通りである。
１．遊離脂肪酸生産藻類に、下記（Ａ）、（Ｂ）の両方を導入した遺伝子組換藻類を、
ｐＨ９．０以上１２．０以下の条件下で培養して脂肪酸を生産させることを特徴とする脂肪酸の製造方法。
（Ａ）配列番号１で表される塩基配列を含みＳｏｄＢをコードするＤＮＡ、または、該ＳｏｄＢをコードするＤＮＡとの塩基配列の同一性が８０％以上であり、かつ、スーパーオキシドディムターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号２で表される塩基配列を含みＶｋｔＡをコードするＤＮＡ、または、該ＶｋｔＡをコードするＤＮＡとの塩基配列の同一性が８０％以上であり、かつ、カタラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
２．前記遺伝子組換藻類が、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２株（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ７９４２）を親株とすることを特徴とする１．に記載の脂肪酸の製造方法。
３．前記遺伝子組換藻類が、ｄＡＳ１Ｔ＿ＳＶ株（受託番号ＮＩＴＥ ＦＥＲＭ ＢＰ－２２４６４）またはｄＡＳ２Ｔ＿ｐＲＮＤ１＿ＳＶ株（受託番号ＮＩＴＥ ＦＥＲＭ ＢＰ－２２４６５）であることを特徴とする１．または２．に記載の脂肪酸の製造方法。
４．遊離脂肪酸生産藻類に、下記（Ａ）、（Ｂ）の両方を導入した遺伝子組換藻類。
（Ａ）配列番号１で表される塩基配列を含みＳｏｄＢをコードするＤＮＡ、または、該ＳｏｄＢをコードするＤＮＡとの塩基配列の同一性が８０％以上であり、かつ、スーパーオキシドディムターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号２で表される塩基配列を含みＶｋｔＡをコードするＤＮＡ、または、該ＶｋｔＡをコードするＤＮＡとの塩基配列の同一性が８０％以上であり、かつ、カタラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
５．前記遊離脂肪酸生産藻類が、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２株（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ７９４２）に遺伝子組換えを行った藻類であることを特徴とする４．に記載の遺伝子組換藻類。
６．ｄＡＳ１Ｔ＿ＳＶ株（受託番号ＮＩＴＥ ＦＥＲＭ ＢＰ－２２４６４）またはｄＡＳ２Ｔ＿ｐＲＮＤ１＿ＳＶ株（受託番号ＮＩＴＥ ＦＥＲＭ ＢＰ－２２４６５）である遺伝子組換藻類。

【発明の効果】

【0008】

本発明において使用する遺伝子組換藻類は、遺伝子組換え前と比較して、アルカリ条件下での脂肪酸生産性に優れている。一般的な藻類の至適ｐＨはｐＨ８．０程度であるため、ｐＨ９～１２の範囲内を保つことにより、他の微生物、特に他の藻類によるコンタミネーションの発生を防止することができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】実験１における、ｄＡＳ１Ｔ＿ＳＶ株とｄＡＳ１Ｔ株を、１８０ｕＥ／ｍ^２・ｓの連続光照射下で培養したときの、菌体量（ＯＤ_７３０）と遊離脂肪酸濃度の経時変化を示すグラフ。

【図2】実験２における、ｄＡＳ１Ｔ＿ＳＶ株とｄＡＳ１Ｔ株を、ｐＨ１０で培養したときの、菌体量（ＯＤ_７３０）と遊離脂肪酸濃度の経時変化を示すグラフ。

【図3】実験２における、ｄＡＳ１Ｔ＿ＳＶ株とｄＡＳ１Ｔ株を、ｐＨ１１で培養したときの、菌体量（ＯＤ_７３０）と遊離脂肪酸濃度の経時変化を示すグラフ。

【図4】実験３における、ｄＡＳ２Ｔ＿ｐＲＮＤ１＿ＳＶ株とｄＡＳ２Ｔ＿ｐＲＮＤ１株を、ｐＨ１０で培養したときの、菌体量（ＯＤ_７３０）と遊離脂肪酸濃度の経時変化を示すグラフ。

【図5】実験３における、ｄＡＳ２Ｔ＿ｐＲＮＤ１＿ＳＶ株とｄＡＳ２Ｔ＿ｐＲＮＤ１株を、ｐＨ１１で培養したときの、菌体量（ＯＤ_７３０）と遊離脂肪酸濃度の経時変化を示すグラフ。

【発明を実施するための形態】

【0010】

ＳｏｄＢは、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ． ＰＣＣ ６８０３株由来のスーパーオキシドディスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）であり、遺伝子ｓｏｄＢ（配列番号１）にコードされている。ｓｏｄＢの配列情報は、データベースＣｙａｎｏｂａｓｅのｓｌｒ１５１６（https://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?syn:slr1516）に登録されている。
ＶｋｔＡは、過酸化水素耐性菌であるビブリオ・ルモイエンシス（Ｖｉｂｒｉｏ ｒｕｍｏｉｅｎｓｉｓ）由来のカタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ）であり、遺伝子ｖｋｔＡ（配列番号２）にコードされている。ｖｋｔＡの配列情報は、ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ番号ＡＢ０３０８２１（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/9967435）に登録されている。

【0011】

活性酸素種であるＯ_２ ^－は、スーパーオキシドディスムターゼにより過酸化水素へと変換され、さらにカタラーゼにより水へと分解される。このように、ｓｏｄＢとｖｋｔＡとは、活性酸素種除去に関するタンパク質をコードするＤＮＡである。
本発明者らは、ｓｏｄＢとｖｋｔＡとを導入した藻類が、遺伝子組換え前と比較して耐アルカリ性が向上することを発見し、本発明を完成させた。

【0012】

本発明は、遊離脂肪酸生産藻類に下記（Ａ）、（Ｂ）の両方を導入した遺伝子組換藻類を、ｐＨ９．０以上１２．０以下の条件下で培養して脂肪酸を生産させる脂肪酸の製造方法と、遊離脂肪酸生産藻類に下記（Ａ）、（Ｂ）の両方を導入した遺伝子組換藻類に関する。
（Ａ）配列番号１で表される塩基配列を含みＳｏｄＢをコードするＤＮＡ、または、該ＳｏｄＢをコードするＤＮＡとの塩基配列の同一性が８０％以上であり、かつ、スーパーオキシドディムターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号２で表される塩基配列を含みＶｋｔＡをコードするＤＮＡ、または、該ＶｋｔＡをコードするＤＮＡとの塩基配列の同一性が８０％以上であり、かつ、カタラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
以下、（Ａ）、（Ｂ）の両方を導入した遺伝子組換藻類を本発明の藻類という。

【0013】

本発明の藻類は、高アルカリであるｐＨ９．０～１２．０において、遺伝子組換え前と比較して、高い脂肪酸生産性を示す。なお、この活性酸素種を除去するタンパク質をコードするＤＮＡの導入によりアルカリ条件下で高い脂肪酸生産性を示すメカニズムは不明である。アルカリ条件下では、他の微生物、特に、他の藻類の活動性は低下するため、ｐＨ９．０以上１２．０以下で本発明の藻類を培養することにより、他の微生物の増殖を抑制することができるため、本発明の藻類を効率的に培養することができ、それにより脂肪酸を効率的に製造することができる。

【0014】

本発明で遊離脂肪酸生産藻類に組み込むＤＮＡのうち、ＳｏｄＢをコードするＤＮＡとの塩基配列の同一性が８０％以上であるＤＮＡは、酵素活性の点から、同一性は高いことが好ましく、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がさらに好ましく、９６％以上がよりさらに好ましい。
ＳｏｄＢをコードするＤＮＡとの塩基配列の同一性が８０％以上であるＤＮＡが、スーパーオキシドディムターゼ活性を有するタンパク質をコードするかは、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）活性染色法等により確認することができる。

【0015】

本発明で遊離脂肪酸生産藻類に組み込むＤＮＡのうち、ＶｋｔＡをコードするＤＮＡと塩基配列の同一性が８０％以上であるＤＮＡは、酵素活性の点から、同一性は高いことが好ましく、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がさらに好ましく、９６％以上がよりさらに好ましい。
ＶｋｔＡをコードするＤＮＡとの塩基配列の同一性が８０％以上であるＤＮＡが、カタラーゼ活性を有するタンパク質をコードするかは、過酸化水素の消去を２４０ｎｍの吸光度変化を測定すること等により確認することができる。

【0016】

本発明で使用する、（Ａ）、（Ｂ）で表されるＤＮＡを組み込む遊離脂肪酸生産藻類としては特に制限されず、公知の遊離脂肪酸藻類、または公知の藻類に遊離脂肪酸を生産するための遺伝子組換えを行った藻類を用いることができる。これらの藻類としては、シネココッカス属、シネコシスティス属等が挙げられる。具体的には、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２株や、非特許文献４、５に記載の７９４２株を親株とするｄＡＳ１Ｔ株、ｄＡＳ２Ｔ＿ｐＲＮＤ１株等が挙げられる。なお、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２株は、パスツール研究所（フランス）等から入手可能である。
遊離脂肪酸藻類への、（Ａ）、（Ｂ）で表される遺伝子の導入は、自然形質転換、相同組換え等により行うことができる。

【0017】

本発明で使用する、（Ａ）、（Ｂ）の両方を導入した遺伝子組換藻類としては、例えば、ｄＡＳ１Ｔ株に配列番号１で表される塩基配列を含みＳｏｄＢをコードするＤＮＡと配列番号２で表される塩基配列を含みＶｋｔＡをコードするＤＮＡとを導入したｄＡＳ１Ｔ＿ＳＶ株、ｄＡＳ２Ｔ＿ｐＲＮＤ１株に配列番号１で表される塩基配列を含みＳｏｄＢをコードするＤＮＡと配列番号２で表される塩基配列を含みＶｋｔＡをコードするＤＮＡとを導入したｄＡＳ２Ｔ＿ｐＲＮＤ１＿ＳＶ株が挙げられる。

【0018】

ｄＡＳ１Ｔ＿ＳＶ株、ｄＡＳ２Ｔ＿ｐＲＮＤ１株は、いずれもシネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２株の遺伝子組換株であり、グラム陰性の桿菌であり、酸素発生型光合成により完全独立栄養で増殖可能であり、培地では緑色を呈す。
ｄＡＳ１Ｔ ＳＶ株は、遺伝子組換株であり、大腸菌Ｋ－１２株のアシルＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子｀ｔｅｓＡがゲノムのアシルＡＣＰ合成酵素遺伝子の中に導入されており、アシル－ＡＣＰシンテターゼ遺伝子の機能は欠損している。また、シアノバクテリアＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ． ＰＣＣ ６８０３のスーパーオキシドディスムターゼ遺伝子ｓｏｄＢ、およびビブリオ菌Ｖｉｂｒｉｏ ｒｕｍｏｉｅｎｓｉｓのカタラーゼ遺伝子ｖｋｔＡ、スペクチノマイシン耐性遺伝子がゲノムのＯＲＦ２４９７とＯＲＦ２４９８の間に導入されている。

【0019】

ｄＡＳ２Ｔ ｐＲＮＤ１株は、ｄＡＳ１Ｔ ＳＶ株と同様にＥｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２株由来のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼを、宿主であるＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ７９４２のアシルＡＣＰシンテターゼ遺伝子の内部にマーカーレスで導入している。さらに、カナマイシン耐性遺伝子と宿主由来の脂肪酸排出輸送体遺伝子を有するプラスミドｐＲＮＤ１が導入されている。また、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ． ＰＣＣ ６８０３のスーパーオキシドディスムターゼ遺伝子ｓｏｄＢ、およびビブリオ菌Ｖｉｂｒｉｏ ｒｕｍｏｉｅｎｓｉｓのカタラーゼ遺伝子ｖｋｔＡ、スペクチノマイシン耐性遺伝子がＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ７９４２ ＯＲＦ２４９７とＯＲＦ２４９８の間に導入されている。

【0020】

ｄＡＳ１Ｔ＿ＳＶ株は受託番号ＮＩＴＥ ＦＥＲＭ ＢＰ－２２４６４として、ｄＡＳ２Ｔ＿ｐＲＮＤ１＿ＳＶ株は受託番号ＮＩＴＥ ＦＥＲＭ ＢＰ－２２４６５として、それぞれ独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８（郵便番号２９２－０８１８））に、２０２２年１２月２７日付で国際寄託されている。
ｄＡＳ１Ｔ＿ＳＶ株は、遺伝子組換え前のｄＡＳ１Ｔ株と比較して、アルカリ条件下での増殖性はほとんど変わらないが、脂肪酸生産性が向上している。
ｄＡＳ２Ｔ＿ｐＲＮＤ１＿ＳＶ株は、遺伝子組換え前のｄＡＳ２Ｔ＿ｐＲＮＤ１株と比較して、アルカリ条件下での増殖性、脂肪酸生産性の両方が向上している。

【0021】

本発明の微生物を培養して、脂肪酸を生産させる際の培養条件は、ｐＨ９．０以上１２．０以下とする以外は特に制限されず、培養する微生物に応じて適切な条件を設定することができる。高アルカリとなるほど、他の微生物の活動性が低下するため、コンタミネーション防止の点からは、ｐＨ９．５以上が好ましく、ｐＨ１０．０以上がより好ましく、ｐＨ１０．５以上がさらに好ましく、ｐＨ１１．０以上がよりさらに好ましい。一方、高アルカリになるにつれて、本発明の藻類の活性も多少は低下する。そのため、本発明の藻類による脂肪酸製造の効率性の点からは、ｐＨ１１．５以下が好ましく、ｐＨ１１．０以下がより好ましく、ｐＨ１０．５以下がさらに好ましく、ｐＨ１０．０以下がよりさらに好ましい。

【0022】

本発明の藻類は、光合成により水と二酸化炭素から脂肪酸を製造する。そのため、脂肪酸の生産性向上の点からは、二酸化炭素濃度が高いことが好ましく、０．０４％以上であることが好ましく、０．１％以上であることがより好ましく、０．５％以上であることがさらに好ましく、１．０％以上であることがよりさらに好ましく、１．５％以上であることがよりさらに好ましい。一方、二酸化炭素濃度が高くなりすぎると、ｐＨを９．０以上１２．０以下に保つことが難しくなるとともに、藻類の生育が阻害される場合がある。そのため、二酸化炭素濃度は、４．０％以下であることが好ましく、３．５％以下であることがより好ましく、３．０％以下であることがさらに好ましい。なお、二酸化炭素は、ｐＨ９．０では、炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ^－）と炭酸イオン（ＣＯ_３ ^2－）がほぼ同濃度で存在し、アルカリ性となるにつれ炭酸イオン濃度が高くなる。

【0023】

培養する際の温度は、１５℃以上４０℃以下が好ましく、２０℃以上がより好ましく、２２℃以上がさらに好ましく、２４℃以上がよりさらに好ましく、また、３８℃以下がより好ましく、３６℃以下がさらに好ましく、３４℃以下がよりさらに好ましい。
本発明の藻類は、光合成により遊離脂肪酸を生産する。そのため、培養時には光合成のための光を照射することが必要である。光の強度は、３０μＥ／ｍ^２・ｓ以上１５００μＥ／ｍ^２・ｓ以下が好ましく、５０μＥ／ｍ^２・ｓ以上がより好ましく、１００μＥ／ｍ^２・ｓ以上がさらに好ましく、１５０μＥ／ｍ^２・ｓ以上がよりさらに好ましく、また、１２００μＥ／ｍ^２・ｓ以下がより好ましく、１０００μＥ／ｍ^２・ｓ以下がさらに好ましい。

【実施例0024】

ｄＡＳ１Ｔ（非特許文献４）及びｄＡＳ２Ｔ＿ｐＲＮＤ１（非特許文献５）に、ｖｋｔＡ＿ｓｏｄＢ／ｐＡＭ１０４４（Ｓａｅ－Ｔａｎｇ，Ｐ．，Ｈｉｈａｒａ，Ｙ．，Ｙｕｍｏｔｏ，Ｉ．，Ｏｒｉｋａｓａ，Ｙ．，Ｏｋｕｙａｍａ，Ｈ． ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ｙ．（２０１６）、Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ａｎｄ ｃａｔａｌａｓｅ ａｃｔ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｔｏ ｐｒｏｔｅｃｔ ｔｈｅ ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ＰＳＩＩ ｄｕｒｉｎｇ ｐｈｏｔｏｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ７９４２．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．５７：１８９９－１９０７．）を用いて形質転換を行い、スペクチノマイシンにより形質転換体を選抜し、ｄＡＳ１Ｔ＿ＳＶ株及びｄＡＳ２Ｔ＿ｐＲＮＤ１＿ＳＶ株を得た。
培養には、ＢＧ－１１培地を一部改変した基本培地（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｉ．，Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｈ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｓ．，Ｆｕｊｉｔａ，Ｙ．，Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｔ． ａｎｄ Ｏｍａｔａ， Ｔ．（１９９５）、Ａ ｎｏｖｅｌ ｎｉｔｒｉｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｐｌｅｃｔｏｎｅｍａ ｂｏｒｙａｎｕｍ． Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：６１３７－６１４３．）を用いた。
基本培地のｐＨは、グッドバッファーであるＴＥＳを使用し、水酸化カリウムの添加によりｐＨ８．２に調整した。
藻類を植菌する際には、硫酸アンモニウムをアンモニウムイオンの終濃度が７．５ｍＭとなるように加えて窒素源とした。

【0025】

「実験１」
９０ｍＬ容量のガラス製培養管に基本培地５０ｍＬを入れてオートクレーブにより滅菌処理（１２１℃、１５分）を施した後、ｄＡＳ１Ｔ＿ＳＶ株、またはｄＡＳ１Ｔ株を植菌し、５０ｕＥ／ｍ^２・ｓの連続光照射下でＯＤ_７３０が０．５～１．０になるまで培養した（前培養）。
続いて、前培養液を本培養の培地（ｐＨ８．２）へＯＤ_７３０が０．０１となるように植菌した。本培養の培地は、硫酸アンモニウムの代わりに硝酸カリウムを硝酸イオンの終濃度が３０ｍＭとなるように加えて窒素源としたものを用いた。
ガスボンベによる２％ＣＯ_２供給と電球色のＬＥＤライトによる１８０ｕＥ／ｍ^２・ｓの連続光照射下で培養しながら藻類の菌体量（ＯＤ_７３０）とＦＦＡ放出量を測定した（本培養）。

【0026】

ＦＦＡ濃度は、Ｆｒｅｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）で測定した。菌体量（ＯＤ_７３０）と遊離脂肪酸濃度の経時変化を図１に示す。
・結果
ｄＡＳ１Ｔ＿ＳＶ株は、ｄＡＳ１Ｔ株と比較して、ｐＨ８．２、５０～１８０ｕＥ／ｍ^２・ｓの連続光照射下における増殖性、脂肪酸生産性にほとんど向上は認められなかった。

【0027】

「実験２」
本培養の培地のｐＨ調整をＴＥＳの代わりにグッドバッファーであるＣＨＥＳとＣＨＡＰＳを用い、それぞれｐＨ１０．０または１１．０となるように水酸化カリウムで調製した。それ以外は、実験１と同様にして、ｄＡＳ１Ｔ＿ＳＶ株、またはｄＡＳ１Ｔ株を培養した。図２、３に、それぞれｐＨ１０と１１における菌体量（ＯＤ_７３０）と遊離脂肪酸濃度と経時変化を示す。
・結果
ｄＡＳ１Ｔ＿ＳＶ株は、ｄＡＳ１Ｔ株と比較して、ｐＨ１０では増殖性はほとんど変わらず、ｐＨ１１では増殖性は少し劣っていた。しかし、ｄＡＳ１Ｔ＿ＳＶ株は、ｄＡＳ１Ｔ株と比較して、ｐＨ１０、１１ともに、培地中の遊離脂肪酸濃度が高濃度であり、高アルカリ条件下で脂肪酸の生産性に優れていた。

【0028】

「実験３」
ｄＡＳ２Ｔ＿ｐＲＮＤ１＿ＳＶ株、ｄＡＳ２Ｔ＿ｐＲＮＤ１株を用いた以外は、実験２と同様にして培養を行った。図４、５に、それぞれｐＨ１０と１１における菌体量（ＯＤ_７３０）と遊離脂肪酸濃度の経時変化を示す。
・結果
ｄＡＳ２Ｔ＿ｐＲＮＤ１＿ＳＶ株は、ｄＡＳ２Ｔ＿ｐＲＮＤ１株と比較して、ｐＨ１０、１１での増殖性に優れていた。また、ｄＡＳ２Ｔ＿ｐＲＮＤ１＿ＳＶ株は、ｄＡＳ２Ｔ＿ｐＲＮＤ１株と比較して、ｐＨ１０、１１ともに、培地中の遊離脂肪酸濃度が高濃度であり、高アルカリ条件下で脂肪酸の生産性に優れていた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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