特開 2024-128351 肝細胞からなるスフェロイドの品質評価方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024128351

(43)【公開日】2024-09-24

(54)【発明の名称】肝細胞からなるスフェロイドの品質評価方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/06 20060101AFI20240913BHJP

   G01N 21/17 20060101ALI20240913BHJP

   G01N 33/48 20060101ALI20240913BHJP

   G01N 33/483 20060101ALI20240913BHJP

   C12Q 1/26 20060101ALI20240913BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/06

G01N21/17 630

G01N33/48 M

G01N33/48 Z

G01N33/483 C

C12Q1/26

【審査請求】未請求

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023037283

(22)【出願日】2023-03-10

(71)【出願人】

【識別番号】000207551

【氏名又は名称】株式会社ＳＣＲＥＥＮホールディングス

(71)【出願人】

【識別番号】511155187

【氏名又は名称】株式会社サイフューズ

(74)【代理人】

【識別番号】100135013

【弁理士】

【氏名又は名称】西田 隆美

(72)【発明者】

【氏名】長谷部 涼

(72)【発明者】

【氏名】前川 敏彦

(72)【発明者】

【氏名】井上 愛優

【テーマコード（参考）】

2G045

2G059

4B063

【Ｆターム（参考）】

2G045AA24

2G045CB01

2G045FA14

2G045FA19

2G045JA03

2G059AA05

2G059BB04

2G059BB09

2G059BB14

2G059DD13

2G059EE02

2G059EE09

2G059FF02

2G059GG02

2G059HH01

2G059JJ17

2G059JJ22

2G059MM01

2G059MM05

2G059MM09

2G059MM10

4B063QA01

4B063QQ08

4B063QX01

(57)【要約】      （修正有）

【課題】細胞に染色等の加工を行うことなく、非侵襲で、バイオ３Ｄプリンタに使用されるスフェロイドの局在領域を観察しスフェロイドの状態を評価できる方法を提供する。
【解決手段】まず、複数種の肝臓由来細胞を三次元培養したスフェロイドを光干渉断層撮影により撮影し（画像取得工程）、撮影画像から局在領域を抽出し（領域抽出工程）、局在領域を解析し（解析工程）、スフェロイドの状態を評価する（評価工程）。解析工程は、撮影画像におけるスフェロイド全体の面積を算出する第１算出工程（Ｓ４１）と、局在領域の面積を算出する第２算出工程（Ｓ４２）と、２つの面積に基づいて局在領域の割合を算出する第３算出工程（Ｓ４３）と、当該割合に基づいて評価パラメータを算出する第４算出工程（Ｓ４４）とを有する。このような評価パラメータを用いれば、非侵襲で、スフェロイドの評価を行うことができる。
【選択図】図１０

【特許請求の範囲】

【請求項1】

バイオ３Ｄプリンタに使用されるスフェロイドの評価方法であって、
前記スフェロイドは、肝細胞を含む複数種の肝臓由来細胞を含むスフェロイドであり、
光干渉断層撮影により前記スフェロイドを撮影して、撮影画像を取得する画像取得工程と、
前記撮影画像から、一種類の細胞が局在する局在領域を抽出する領域抽出工程と、
前記局在領域を解析する解析工程と、
前記スフェロイドの状態を評価する評価工程と、
を有し、
前記解析工程は、
前記撮影画像における、前記スフェロイド全体の面積を算出する第１算出工程と、
前記撮影画像における、前記局在領域の面積を算出する第２算出工程と、
前記スフェロイド全体の面積と、前記局在領域の面積とに基づいて、前記局在領域の割合を算出する第３算出工程と、
前記局在領域の割合に基づいて、評価パラメータを算出する第４算出工程と、
を有する、評価方法。

【請求項2】

請求項１に記載の評価方法であって、
前記評価工程は、
前記評価パラメータに基づいて前記スフェロイドの良否判定を行う判定工程
を含む、評価方法。

【請求項3】

請求項１に記載の評価方法であって、
前記評価パラメータは、前記スフェロイドにおける、所定のタンパク質の分泌量の推定値である、評価方法。

【請求項4】

請求項３に記載の評価方法であって、
前記評価パラメータは、前記スフェロイドにおける、ＣＹＰ３Ａ４の酵素活性の推定値である、評価方法。

【請求項5】

請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の評価方法であって、
前記領域抽出工程は、
前記撮影画像から、前記スフェロイドに相当する全体領域を抽出する第１抽出工程と、
前記全体領域のうち、輝度値が所定の閾値よりも高い高輝度領域を抽出する第２抽出工程と、
前記全体領域から、前記高輝度領域および前記高輝度領域よりも内側の領域を除いた残りの領域を、前記局在領域として抽出する第３抽出工程と、
を有する、評価方法。

【請求項6】

バイオ３Ｄプリンタに使用されるスフェロイドの評価方法であって、
前記スフェロイドは、肝細胞を含む複数種の肝臓由来細胞を含むスフェロイドであり、
光干渉断層撮影により前記スフェロイドを撮影した撮影画像を入力情報とし、一種類の細胞が局在する局在領域を出力情報とする学習モデルを、深層学習により作成する学習工程と、
光干渉断層撮影により前記スフェロイドを撮影して、撮影画像を取得する画像取得工程と、
前記撮影画像を、前記学習モデルに入力して、前記学習モデルから出力される前記局在領域を得る領域抽出工程と、
前記局在領域を解析する解析工程と、
前記スフェロイドの状態を評価する評価工程と、
を有し、
前記解析工程は、
前記撮影画像における、前記スフェロイド全体の面積を算出する第１算出工程と、
前記撮影画像における、前記局在領域の面積を算出する第２算出工程と、
前記スフェロイド全体の面積と、前記局在領域の面積とに基づいて、前記局在領域の割合を算出する第３算出工程と、
前記局在領域の割合に基づいて、評価パラメータを算出する第４算出工程と、
を有する、評価方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、スフェロイドの評価方法に関する。

【背景技術】

【0002】

従来、複数の細胞により構成される生体試料を光干渉断層撮影（Optical Coherence Tomography；ＯＣＴ）により撮影し、得られた断層画像に基づいて、生体試料を観察する観察装置が知られている。従来の観察装置については、例えば特許文献１に記載されている。この種の観察装置を使用すれば、生体試料の立体構造を非侵襲で観察することができる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２０１５－１８１３４８号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

スフェロイド等の生体試料は、他の部分と細胞の状態が異なる特異部を有する場合がある。例えば、複数種類の細胞を組み合わせてスフェロイドなどの生体試料を作成する場合、一部の種類の細胞が生体試料の外側または内側に局在する場合がある。また、幹細胞とそれ以外の種類の細胞を含むスフェロイドなどの生体試料においては、分化した細胞が生体試料の一部分に局在する場合もある。生体試料の品質管理を行う上で、これらの特異部を観察することは、極めて重要である。

【0005】

従来、スフェロイドの局在領域のような特異部を観察する方法としては、蛍光試薬を用いて観察対象の切片を染色する方法が知られている。しかしながら、この方法によれば観察対象がダメージを受ける。このため、生体試料の特異部を、ダメージを与えず自然な状態のまま観察する技術が求められている。

【0006】

本発明は、このような事情に鑑みなされたものであり、非侵襲でもスフェロイドの状態を評価できる評価方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

上記課題を解決するため、本願の第１発明は、スフェロイドの評価方法であって、前記スフェロイドは、肝細胞を含む複数種の肝臓由来細胞を含むスフェロイドであり、光干渉断層撮影により前記スフェロイドを撮影して、撮影画像を取得する画像取得工程と、前記撮影画像から、一種類の細胞が局在する局在領域を抽出する領域抽出工程と、前記局在領域を解析する解析工程と、前記スフェロイドの状態を評価する評価工程と、を有し、前記解析工程は、前記撮影画像における、前記スフェロイド全体の面積を算出する第１算出工程と、前記撮影画像における、前記局在領域の面積を算出する第２算出工程と、前記スフェロイド全体の面積と、前記局在領域の面積とに基づいて、前記局在領域の割合を算出する第３算出工程と、前記局在領域の割合に基づいて、評価パラメータを算出する第４算出工程と、を有する。

【0008】

本願の第２発明は、第１発明の評価方法であって、前記評価工程は、前記評価パラメータに基づいて前記スフェロイドの良否判定を行う判定工程を含む。

【0009】

本願の第３発明は、第１発明の評価方法であって、前記評価パラメータは、前記スフェロイドにおける、所定のタンパク質の分泌量の推定値である。

【0010】

本願の第４発明は、第３発明の評価方法であって、前記評価パラメータは、前記スフェロイドにおける、ＣＹＰ３Ａ４の酵素活性の推定値である、評価方法。

【0011】

本願の第５発明は、第１発明ないし第４発明のいずれか一発明の評価方法であって、前記領域抽出工程は、前記撮影画像から、前記スフェロイドに相当する全体領域を抽出する第１抽出工程と、前記全体領域のうち、輝度値が所定の閾値よりも高い高輝度領域を抽出する第２抽出工程と、前記全体領域から、前記高輝度領域および前記高輝度領域よりも内側の領域を除いた残りの領域を、前記局在領域として抽出する第３抽出工程と、を有する。

【0012】

本願の第６発明は、スフェロイドの評価方法であって、前記スフェロイドは、肝細胞を含む複数種の肝臓由来細胞含むスフェロイドであり、光干渉断層撮影により前記スフェロイドを撮影した撮影画像を入力情報とし、一種類の細胞が局在する局在領域を出力情報とする学習モデルを、深層学習により作成する学習工程と、光干渉断層撮影により前記スフェロイドを撮影して、撮影画像を取得する画像取得工程と、前記撮影画像を、前記学習モデルに入力して、前記学習モデルから出力される前記局在領域を得る領域抽出工程と、前記局在領域を解析する解析工程と、前記スフェロイドの状態を評価する評価工程と、を有し、前記解析工程は、前記撮影画像における、前記スフェロイド全体の面積を算出する第１算出工程と、前記撮影画像における、前記局在領域の面積を算出する第２算出工程と、前記スフェロイド全体の面積と、前記局在領域の面積とに基づいて、前記局在領域の割合を算出する第３算出工程と、前記局在領域の割合に基づいて、評価パラメータを算出する第４算出工程と、を有する。

【発明の効果】

【0013】

本願の第１発明～第６発明によれば、複数種の細胞を含むスフェロイドの撮影画像から、特定の種類の細胞が局在する局在領域を抽出し、局在領域の割合に基づいた評価パラメータを算出できる。これにより、非侵襲でもスフェロイドの評価を行うことができる。

【0014】

特に、本願の第３発明および第４発明によれば、組織の一部として必要な挙動をしているか否かが直接現れるパラメータを評価パラメータとすることにより、よりユーザに理解しやすい評価パラメータが得られる。

【0015】

特に、本願の第５発明によれば、生体試料の外表面に広がる特異部に相当する局在領域を、精度よく抽出できる。

【0016】

特に、本願の第６発明によれば、学習モデルを用いて、スフェロイドの撮影画像から、精度良く局在領域を抽出できる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】観察装置の構成を示した図である。

【図2】観察装置の制御ブロック図である。

【図3】画像処理／評価装置の機能を、概念的に示したブロック図である。

【図4】スフェロイドの例を模式的に示した図である。

【図5】作成工程から組織形成工程の流れを示したフローチャートである。

【図6】局在領域の領域抽出工程の流れの一例を示すフローチャートである。

【図7】断層画像を模式的に示した図である。

【図8】全体領域を抽出した結果を、模式的に示した図である。

【図9】局在領域を抽出した結果を、模式的に示した図である。

【図10】スフェロイドの解析・評価工程の流れの一例を示すフローチャートである。

【図11】実験１の実験結果を示したグラフである。

【図12】実験２の実験結果を示したグラフである。

【図13】学習モデルを利用する場合の、作成工程から組織形成工程の流れを示すフローチャートである。

【発明を実施するための形態】

【0018】

以下、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明する。

【0019】

＜１．観察装置の構成＞
図１は、本発明の一実施形態に係る観察装置１の構成を示した図である。この観察装置１は、試料容器９０内に保持された生体試料９を撮影し、得られた画像に基づいて、生体試料９の状態を評価する装置である。

【0020】

この観察装置１で観察および評価する生体試料９は、スフェロイドと呼ばれる細胞集塊である。

【0021】

スフェロイドは、公知の各種用途に用いることができる。例えば、バイオ３Ｄプリンタに複数配置して、より大きなサイズの立体構造体を形成することができる。バイオ３Ｄプリンタにスフェロイドを配置するにあたっては三次元的に配置することが好ましい。例えば、肝臓を構成する2種類以上の細胞を均一に含むスフェロイドから立体構造体を形成する場合、得られた立体構造体を再生医療の分野や被検物質の肝毒性の評価に用いる等の用途に使用することができる。好適には、観察装置１では、バイオ３Ｄプリンタ用部品として適したスフェロイドを選別するために、複数種類の細胞を含むスフェロイドの状態の良否を評価する。

【0022】

図１に示すように、観察装置１は、ステージ１０、撮像部２０、およびコンピュータ３０を備えている。

【0023】

ステージ１０は、試料容器９０を支持する支持台である。試料容器９０には、例えば、ウェルプレートが使用される。ウェルプレートは、複数のウェル（凹部）９１を有する。各ウェル９１は、Ｕ字状またはＶ字状の底部を有する。生体試料９は、各ウェル９１の底部付近に、培養液とともに保持される。試料容器９０の材料には、光を透過する透明な樹脂またはガラスが使用される。

【0024】

ステージ１０は、上下方向に貫通する開口部１１を有する。試料容器９０は、ステージ１０の当該開口部１１に嵌め込まれた状態で、水平に支持される。したがって、試料容器９０の下面は、ステージ１０に覆われることなく、撮像部２０へ向けて露出する。

【0025】

撮像部２０は、試料容器９０内の生体試料９を撮影するユニットである。撮像部２０は、ステージ１０に支持された試料容器９０の下方に配置されている。本実施形態の撮像部２０は、生体試料９の断層画像および三次元画像を撮影することが可能な、光干渉断層撮影（Optical Coherence Tomography；ＯＣＴ）装置である。

【0026】

図１に示すように、撮像部２０は、光源２１、物体光学系２２、参照光学系２３、検出部２４、および光ファイバカプラ２５を有する。光ファイバカプラ２５は、第１光ファイバ２５１～第４光ファイバ２５４が、接続部２５５において連結されたものである。光源２１、物体光学系２２、参照光学系２３、および検出部２４は、光ファイバカプラ２５により構成される光路を介して、互いに接続されている。

【0027】

光源２１は、ＬＥＤ等の発光素子を有する。光源２１は、広帯域の波長成分を含む低コヒーレンス光を出射する。生体試料９を侵襲することなく、生体試料９の内部まで光を到達させるために、光源２１から出射される光は、近赤外線であることが望ましい。光源２１は、第１光ファイバ２５１に接続されている。光源２１から出射される光は、第１光ファイバ２５１へ入射し、接続部２５５において、第２光ファイバ２５２へ入射する光と、第３光ファイバ２５３へ入射する光とに、分岐される。

【0028】

第２光ファイバ２５２は、物体光学系２２に接続されている。接続部２５５から第２光ファイバ２５２へ進む光は、物体光学系２２へ入射する。物体光学系２２は、コリメータレンズ２２１および対物レンズ２２２を含む複数の光学部品を有する。第２光ファイバ２５２から出射された光は、コリメータレンズ２２１および対物レンズ２２２を通って、試料容器９０内の生体試料９へ照射される。このとき、対物レンズ２２２により、光が生体試料９へ向けて収束する。そして、生体試料９において反射した光（以下「観察光」と称する）は、対物レンズ２２２およびコリメータレンズ２２１を通って、再び第２光ファイバ２５２へ入射する。

【0029】

図１に示すように、物体光学系２２は、走査機構２２３に接続されている。走査機構２２３は、コンピュータ３０からの指令に従って、物体光学系２２を、鉛直方向および水平方向に微小移動させる。これにより、生体試料９に対する光の入射位置を、鉛直方向および水平方向に微小移動させることができる。

【0030】

また、撮像部２０は、図示を省略した移動機構により、水平方向に移動可能となっている。これにより、撮像部２０の視野を、複数のウェル９１の間で切り替えることができる。

【0031】

第３光ファイバ２５３は、参照光学系２３に接続されている。接続部２５５から第３光ファイバ２５３へ進む光は、参照光学系２３へ入射する。参照光学系２３は、コリメータレンズ２３１およびミラー２３２を有する。第３光ファイバ２５３から出射された光は、コリメータレンズ２３１を通って、ミラー２３２へ入射する。そして、ミラー２３２により反射された光（以下「参照光」と称する）は、コリメータレンズ２３１を通って、再び第３光ファイバ２５３へ入射する。

【0032】

図１に示すように、ミラー２３２は、進退機構２３３に接続されている。進退機構２３３は、コンピュータ３０からの指令に従って、ミラー２３２を、光軸方向に微小移動させる。これにより、参照光の光路長を変化させることができる。

【0033】

第４光ファイバ２５４は、検出部２４に接続されている。物体光学系２２から第２光ファイバ２５２へ入射した観察光と、参照光学系２３から第３光ファイバ２５３へ入射した参照光とは、接続部２５５において合流して、第４光ファイバ２５４へ入射する。そして、第４光ファイバ２５４から出射された光は、検出部２４へ入射する。このとき、観察光と参照光との間で、位相差に起因する干渉が生じる。この干渉光の分光スペクトルは、観察光の反射位置の高さによって異なる。

【0034】

検出部２４は、分光器２４１および光検出器２４２を有する。第４光ファイバ２５４から出射された干渉光は、分光器２４１において波長成分ごとに分光されて、光検出器２４２へ入射する。光検出器２４２は、分光された干渉光を検出し、その検出信号を、コンピュータ３０へ出力する。

【0035】

コンピュータ３０の後述する画像取得部４１は、光検出器２４２から得られる検出信号をフーリエ変換することで、観察光の鉛直方向の光強度分布を求める。また、走査機構２２３により、物体光学系２２を水平方向に移動させつつ、上記の光強度分布の算出を繰り返すことにより、三次元空間の各座標における観察光の光強度分布を求めることができる。その結果、コンピュータ３０は、生体試料９の断層画像および三次元画像を得ることができる。

【0036】

断層画像は、二次元座標上に配列された複数の画素（ピクセル）により構成され、画素毎に輝度値が規定されたデータである。三次元画像は、三次元座標上に配列された複数の画素（ボクセル）により構成され、画素毎に輝度値が規定されたデータである。すなわち、断層画像および三次元画像は、いずれも、所定の座標上に輝度値が分布した撮影画像である。

【0037】

コンピュータ３０は、撮像部２０を動作制御する制御部としての機能を有する。また、コンピュータ３０は、撮像部２０から入力される検出信号に基づいて断層画像および三次元画像を作成し、得られた断層画像および三次元画像に基づいて、生体試料９の状態を評価するデータ処理部としての機能を有する。

【0038】

図２は、観察装置１の制御ブロック図である。図２中に概念的に示したように、コンピュータ３０は、ＣＰＵ等のプロセッサ３１、ＲＡＭ等のメモリ３２、およびハードディスクドライブ等の記憶部３３を有する。記憶部３３内には、観察装置１内の各部を動作制御するための制御プログラムＰ１と、断層画像および三次元画像を作成して、生体試料９の状態を評価するためのデータ処理プログラムＰ２とが、記憶されている。

【0039】

また、図３に示すように、コンピュータ３０は、上述した光源２１、走査機構２２３、進退機構２３３、光検出器２４２、および後述する表示部７０と、それぞれ通信可能に接続されている。コンピュータ３０は、制御プログラムＰ１に従って、上記の各部を動作制御する。これにより、試料容器９０に保持された生体試料９の撮影処理が進行する。

【0040】

図３は、生体試料９の観察・評価を行うための画像処理／評価装置としてのコンピュータ３０の機能を、概念的に示したブロック図である。図３に示すように、コンピュータ３０は、画像取得部４１、領域抽出部４２、および評価部４３を有する。画像取得部４１、領域抽出部４２、および評価部４３の各機能は、コンピュータ３０のプロセッサ３１が、上述したデータ処理プログラムＰ２に従って動作することにより、実現される。画像取得部４１、領域抽出部４２、および評価部４３が実行する処理の詳細については、後述する。

【0041】

＜２．作製工程、画像取得工程、領域抽出工程、解析・評価工程、および組織形成工程について＞
続いて、上記の観察装置１におけるスフェロイド９（生体試料９）の作製工程、画像取得工程、領域抽出工程、解析・評価工程、および組織形成工程について、説明する。

【0042】

スフェロイド９には、主要組織、神経組織を始めとした様々な種類の細胞により構成されるスフェロイドを用いることができる。スフェロイド９は、バイオ３Ｄプリンタにおいて材料となるものであることが好ましい。

【0043】

いずれの組織に由来する細胞によって構成されるスフェロイドであっても、複数種類の細胞を含むスフェロイドにおいては、細胞が均一に分布せず、特定種類の細胞が一部に局在することで、スフェロイドの遺伝子発現やタンパク質分泌に影響を及ぼすことがある。このため、スフェロイド９において複数種類の細胞が均一に分布しているか否かを評価すること、好適には、バイオ３Ｄプリンタによる再生医療用もしくはin vitro評価用等の構造体の形成に利用できるほどに複数種類の細胞が均一に分布しているか否かを評価することが求められる。

【0044】

スフェロイド９は、２種類以上の細胞を、用途、細胞の種類や割合などの条件に応じて公知の方法により共培養して得ることができる。

【0045】

スフェロイド９は、いわゆる肝スフェロイドであることが好ましい。肝スフェロイドは、肝臓を構成する複数種類の細胞のうち、肝実質細胞（肝細胞）を含む２種類以上の細胞を含む細胞集塊である。肝スフェロイドが肝実質細胞（肝細胞）の他に含む細胞は、肝臓由来の細胞であればよく、例えば、肝類洞内皮細胞、クッパー細胞、肝星細胞、ピット細胞、胆管上皮細胞、中皮細胞などが含まれていてもよい。

【0046】

図４は、以下の説明において観察対象とするスフェロイド９の例を、模式的に示した図である。図４（ａ），（ｂ）のスフェロイド９は、いずれも、局在領域９ａを有する。局在領域９ａは、スフェロイド９を構成する複数種類の細胞のうち、特定の細胞が局在した部分である。

【0047】

局在領域９ａは、例えば、図４（ａ）のように、スフェロイド９の表面（外側）に局在する場合や、図４（ｂ）のように、スフェロイド９の内側に局在することが考えられる。

【0048】

図５は、作成工程から組織形成工程の流れを示したフローチャートである。観察装置１によるスフェロイド９の解析・評価工程と、バイオ３Ｄプリンタによる組織形成工程とを行うときには、まず、多数のスフェロイド９を作成する（ステップＳ１，スフェロイド作成工程）。そして、作成したスフェロイド９が、試料容器９０へと収容される。なお、スフェロイド９は、試料容器９０内で作成されてもよいし、別の培養容器で作成されたスフェロイド９を試料容器９０内へと収容してもよい。このとき、試料容器９０内には、培養液とともに複数のスフェロイド９が保持されている。

【0049】

次に、観察装置１のステージ１０に試料容器９０をセットし、撮像部２０により、スフェロイド９の撮影を行う（ステップＳ２，画像取得工程）。本実施形態では、撮像部２０が、光干渉断層撮影を行う。具体的には、光源２１から光を出射し、走査機構２２３により物体光学系２２を微少移動させながら、観察光および参照光の干渉光を、波長成分ごとに、光検出器２４２で検出する。コンピュータ３０の画像取得部４１は、光検出器２４２から出力される検出信号に基づいて、スフェロイド９の各座標位置における光強度分布を算出する。これにより、スフェロイド９の断層画像Ｄ１および三次元画像Ｄ２が得られる。

【0050】

観察装置１は、１つのスフェロイド９について、複数の断層画像Ｄ１と、１つの三次元画像Ｄ２とを取得する。また、観察装置１は、撮影対象となるウェル９１を変更しながら、ステップＳ２の処理を繰り返すことにより、複数のスフェロイド９の断層画像Ｄ１および三次元画像Ｄ２を取得する。得られた断層画像Ｄ１および三次元画像Ｄ２は、コンピュータ３０の記憶部３３に記憶される。また、コンピュータ３０は、得られた断層画像Ｄ１および三次元画像Ｄ２を、表示部７０に表示する。

【0051】

図６は、断層画像Ｄ１を模式的に示した図である。図６の例では、略球形のスフェロイド９の外周部に、局在領域９ａに相当する領域（以下「局在領域Ａ」と称する）が存在している。コンピュータ３０の領域抽出部４２は、断層画像Ｄ１から、この局在領域Ａを抽出する（ステップＳ３，領域抽出工程）。

【0052】

図７は、ステップＳ３のスフェロイド９の局在領域９ａ（上記の「局在領域Ａ」）を抽出する領域抽出工程の流れの一例を示すフローチャートである。図７の例では、まず、領域抽出部４２は、断層画像Ｄ１から、スフェロイド９の全体に相当する全体領域Ａ１を抽出する（ステップＳ３１，第１抽出工程）。具体的には、断層画像Ｄ１のうち、輝度値が予め設定された第１閾値よりも高い領域を、全体領域Ａ１として抽出する。図８は、全体領域Ａ１を抽出した結果を、模式的に示した図である。

【0053】

次に、領域抽出部４２は、全体領域Ａ１から、輝度値が、所定の第２閾値よりも高い領域を、高輝度領域Ａ２として抽出する（ステップＳ３２，第２抽出工程）。なお、第２閾値は、第１閾値よりも高い値である。図８では、環状の高輝度領域Ａ２が、破線で示されている。略球形の細胞塊の外周部は、輝度が高くなる傾向が強い。このため、ステップＳ３２では、高輝度領域Ａ２を抽出することで、略球形の細胞塊の外周部を特定する。

【0054】

その後、領域抽出部４２は、全体領域Ａ１から、高輝度領域Ａ２および高輝度領域Ａ２よりも内側の領域を除いた残りの領域を、局在領域Ａとして抽出する（ステップＳ３３，第３抽出工程）。図９は、局在領域Ａを抽出した結果を、模式的に示した図である。これにより、球形の細胞塊の外表面に広がる局在領域９ａに相当する局在領域Ａを、適切に抽出することができる。

【0055】

このように、ステップＳ３では、断層画像Ｄ１のうち、輝度値が所定の条件を満たす領域を、局在領域Ａとして抽出する。局在領域Ａの抽出手順は、必ずしも、上記のステップＳ３１～Ｓ３３の通りでなくてもよい。領域抽出部４２は、局在領域Ａの位置や輝度値に応じて、適切な手順で、局在領域Ａを抽出すればよい。

【0056】

その後、コンピュータ３０の評価部４３は、ステップＳ３で抽出された局在領域Ａを解析し、スフェロイド９の状態を評価する（ステップＳ４，解析・評価工程）。このステップＳ４では、評価部４３は、断層画像Ｄ１および三次元画像Ｄ２における局在領域９ａを解析し、スフェロイド９の状態を評価する。

【0057】

図１０は、ステップＳ４のスフェロイド９の状態を評価する解析・評価工程の流れの一例を示すフローチャートである。図１０の例の解析・評価工程では、撮影画像である断層画像Ｄ１における局在領域Ａの面積に基づいて、スフェロイド９の状態を評価する。また、図１０の例の解析・評価工程は、ステップＳ４１～Ｓ４４を含む解析工程と、ステップＳ４５を含む評価工程とからなる。

【0058】

図１０の例では、まず、評価部４３は、断層画像Ｄ１における、スフェロイド９全体の面積を算出する（ステップＳ４１，第１算出工程）。具体的には、評価部４３は、断層画像Ｄ１における全体領域Ａ１の面積を算出する。全体領域Ａ１の面積は、例えば、全体領域Ａ１に含まれる画素数に基づいて算出すればよい。

【0059】

次に、評価部４３は、断層画像Ｄ１における、局在領域Ａの面積を算出する（ステップＳ４２，第２算出工程）。具体的には、評価部４３は、断層画像Ｄ１における局在領域Ａの面積を算出する。局在領域Ａの面積は、例えば、局在領域Ａに含まれる画素数に基づいて算出すればよい。

【0060】

続いて、評価部４３は、ステップＳ４１の第１算出工程で算出したスフェロイド９全体の面積と、ステップＳ４２の第２算出工程で算出した局在領域Ａの面積とに基づいて、局在領域９ａの割合を算出する（ステップＳ４３，第３算出工程）。ステップＳ４３で算出される割合は、例えば、代表的な１つの断層画像Ｄ１における面積割合（局在領域Ａの面積を全体領域Ａ１の面積で除したもの）であってもよい。

【0061】

また、例えば、１つのスフェロイド９について複数の断層画像Ｄ１を取得している場合、ステップＳ４３の第３算出工程において算出される局在領域９ａの割合は、体積の割合であってもよい。その場合、まず、複数の断層画像Ｄ１の全体領域Ａ１および局在領域Ａの面積に基づいて、スフェロイド９全体および局在領域９ａの体積を算出する。その後、局在領域９ａの体積をスフェロイド９全体の体積で除して局在領域９ａの割合を算出する。

【0062】

その後、評価部４３は、評価パラメータＶを算出する（ステップＳ４４，第４算出工程）。評価パラメータＶは、ステップＳ４３の第３算出工程において算出される局在領域９ａの割合に基づいて算出される。評価パラメータＶは、例えば、後述の実験２に示されるように、局在領域９ａの割合に基づいて算出される、スフェロイド９における、所定の遺伝子発現の度合いの推定値や、所定のタンパク質の分泌量の推定値である。スフェロイド９が肝スフェロイドである場合、評価パラメータＶには、例えば、スフェロイド９からのタンパク質ＣＹＰ３Ａ４の分泌量が用いられる。

【0063】

評価パラメータＶとして、ステップＳ４３の第３算出工程において算出される局在領域９ａの割合そのものが用いられてもよい。しかしながら、評価パラメータＶとして、所定の遺伝子発現の度合いの推定値や、所定のタンパク質の分泌量の推定値のように、組織の一部として必要な挙動をしているか否かが直接現れるパラメータを評価パラメータＶとすることにより、よりユーザに理解しやすい評価パラメータＶが得られる。

【0064】

評価部４３は、算出された評価パラメータＶに基づいて、スフェロイド９の良否判定を行う（ステップＳ４５，判定工程）。例えば、評価パラメータＶが所定の閾値以上、または、所定の閾値以下である場合に、当該スフェロイド９がバイオ３Ｄプリンタの材料として適していると判断し、そうでない場合に、当該スフェロイド９がバイオ３Ｄプリンタの材料として不適切であると判断する。

【0065】

例えば、評価パラメータＶが局在領域の割合そのものであり、再生医療用もしくは肝毒性評価用に適した健康なスフェロイドの選別を目的とする場合は、評価パラメータＶが所定の閾値以下であるスフェロイドを「良」とし、所定の閾値より大きいスフェロイドを「否」とすることが好ましい。

【0066】

評価パラメータＶとして、局在領域９ａの割合に基づいて算出される、スフェロイドにおける、所定の遺伝子発現の度合いの推定値や、所定のタンパク質の分泌量の推定値を用いる場合には、遺伝子やタンパク質の種類、スフェロイドの組成、スフェロイドの用途などに応じて、評価パラメータＶが所定の下限閾値以上、かつ、所定の上限閾値以下であるスフェロイドを「良」とすることが好ましい。

【0067】

評価部４３により算出された局在領域９ａの大きさ（面積または体積）、局在領域９ａの割合、および評価パラメータＶは、記憶部３３に記憶される。また、評価部４３は、評価パラメータＶを、表示部７０に表示する。

【0068】

以上のように、この観察装置１では、スフェロイド９を光干渉断層撮影により撮影し、得られた断層画像Ｄ１から、スフェロイド９の局在領域９ａに相当する局在領域Ａを抽出できる。これにより、非侵襲でも、スフェロイド９の局在領域９ａを観察できる。また、局在領域９ａの割合に基づいた評価パラメータＶを算出することにより、スフェロイド９のバイオ３Ｄプリンタの材料としての適否を容易に評価できる。

【0069】

このようなステップＳ２の画像取得工程、ステップＳ３の領域抽出工程、およびステップＳ４の解析・評価工程を、作成した多数のスフェロイド９に対して行う。そして、ステップＳ４の解析・評価工程においてバイオ３Ｄプリンタの材料として適していると判断されたスフェロイド９を用いて、例えばバイオ３Ｄプリンタによって組織形成を行う（ステップＳ５，組織形成工程）。このようにすれば、例えば肝毒性評価用途に適した品質の良い組織を得ることができる。

【0070】

＜３．実験＞
＜３－１．実験１＞
上記の実施形態の評価方法において、光干渉断層撮影によって得られた断層画像（以下では「ＯＣＴ画像」と称する）における局在領域の検出精度を確かめるため、以下の２種類の方法で肝スフェロイドの局在領域の面積割合を算出した。

【0071】

（方法１：ＯＣＴ画像から局在領域の面積割合を算出）
複数の肝スフェロイドについて、上記の実施形態に記載の方法で、光干渉断層撮影を行い、得られたＯＣＴ画像（断層画像）のうち、任意の画像１つから、局在領域を抽出し、局在領域を全体領域で除した値を面積割合として算出した。

【0072】

（方法２：染色組織切片画像から局在領域の面積割合を算出）
方法１で光干渉断層撮影を行った複数の肝スフェロイドについて、蛍光試薬を用いて染色した後、任意の断面で切断し、当該切断面において、従来の手法で局在領域を抽出し、局在領域を全体領域で除した値を面積割合として算出した。

【0073】

図１１は、実験１の実験結果であり、肝スフェロイドについて、光干渉断層撮影によって得られた画像（ＯＣＴ画像）から算出された局在領域の面積割合と、染色した組織切片画像から算出された局在領域の面積割合との関係を示すグラフである。

【0074】

図１１に示すように、光干渉断層撮影によって得られたＯＣＴ画像から算出された局在領域の面積割合と、従来の方法である染色した組織切片画像から算出された面積割合とのピアソンの積率相関係数は０．８３９となった。すなわち、光干渉断層撮影によって得られたＯＣＴ画像から算出された局在領域の面積割合は、従来の方法である染色した組織切片画像から算出された面積割合と十分に相関関係を有している。これより、光干渉断層撮影によって得られたＯＣＴ画像から局在領域の面積割合を算出する方法は、従来の方法と比較して同等の精度で面積割合を算出できていると考えられる。

【0075】

＜３－２．実験２＞
上記の実施形態の評価方法において、評価パラメータＶとして所定の遺伝子発現の度合いの推定値や、所定のタンパク質の分泌量の推定値を用いる場合に、これらの評価パラメータＶの推定値の信頼性を確かめるため、以下の方法で実験を行った。

【0076】

まず、複数の肝スフェロイドについて、上記の実施形態に記載の方法で、光干渉断層撮影を行い、得られたＯＣＴ画像（断層画像）のうち、任意の画像１つから、局在領域を抽出し、局在領域を全体領域で除した値を面積割合として算出した。

【0077】

一方、光干渉断層撮影を行った当該複数の肝スフェロイドについて、それぞれの肝スフェロイドからのタンパク質ＣＹＰ３Ａ４の酵素活性を計測した。なお、各肝スフェロイドについて、光干渉断層撮影とタンパク質ＣＹＰ３Ａ４の酵素活性の計測とは、どちらを先に行ってもよい。

【0078】

図１２は、実験２の実験結果であり、肝スフェロイドについて、ＯＣＴ画像から算出された局在領域の面積割合と、ＣＹＰ３Ａ４の酵素活性との関係を示すグラフである。図１２に示すように、肝スフェロイドにおけるＯＣＴ画像から算出された局在領域の面積割合と、ＣＹＰ３Ａ４の酵素活性とのピアソンの積率相関係数は－０．８８５となった。肝スフェロイドにおけるＯＣＴ画像から算出された局在領域の面積割合と、ＣＹＰ３Ａ４の酵素活性との間には、高い（負の）相関関係が認められる。このため、肝スフェロイドについて、ＯＣＴ画像から算出された局在領域の面積割合に基づいて、ＣＹＰ３Ａ４の酵素活性を推定した場合に、その推定値には十分な信頼性があるものといえる。

【0079】

＜４．変形例＞
以上、本発明の一実施形態について説明したが、本発明は、上記の実施形態に限定されるものではない。

【0080】

＜４－１．第１変形例＞
上記の実施形態では、ステップＳ３において、領域抽出部４２が、断層画像Ｄ１のうち、輝度値が所定の条件を満たす領域を、局在領域Ａとして抽出していた。しかしながら、ステップＳ３において、領域抽出部４２は、学習モデルを利用して局在領域Ａを抽出してもよい。図１３は、学習モデルを利用する場合の、評価処理の流れを示すフローチャートである。

【0081】

図１３の例では、まず、コンピュータ３０が、深層学習により学習モデルを作成する（ステップＳ０，学習工程）。学習モデルは、スフェロイド９の断層画像Ｄ１を入力情報とし、断層画像Ｄ１中の局在領域９ａに相当する局在領域Ａを出力情報とする入出力器である。コンピュータ３０は、予め用意した多数の断層画像Ｄ１と、それらの断層画像Ｄ１に含まれる局在領域Ａとを、教師データとして、教師あり機械学習アルゴリズムにより、学習モデルを作成する。学習モデルは、記憶部３３に記憶される。機械学習アルゴリズムには、例えば、セマンティックセグメンテーションを使用することができるが、これには限られない。

【0082】

一方、多数のスフェロイド９の作成を行う（ステップＳ１，スフェロイド作成工程）。ステップ１のスフェロイド作成工程は、図１３に記載のように、ステップＳ０の学習工程の後に行われてもよいし、学習工程の前や、学習工程と並行して行われてもよい。

【0083】

ステップＳ０の学習工程およびステップＳ１のスフェロイド作成工程の終了後、観察装置１により、スフェロイド９の撮影が行われる（ステップＳ２，画像取得工程）。続いて、コンピュータ３０の領域抽出部４２は、撮影により得られた断層画像Ｄ１から、局在領域９ａに相当する局在領域Ａを抽出する（ステップＳ３，領域抽出工程）。具体的には、領域抽出部４２は、ステップＳ０で作成された学習モデルに、ステップＳ２で取得した断層画像Ｄ１を入力する。そうすると、学習モデルから局在領域Ａが出力される。これにより、上述したステップＳ３１～Ｓ３３のような処理を行うことなく、局在領域Ａを得ることができる。

【0084】

＜４－２．第２変形例＞
上記の実施形態では、断層画像Ｄ１から局在領域Ａを抽出する場合について説明した。しかしながら、三次元画像Ｄ２から局在領域Ａを抽出してもよい。三次元画像Ｄ２を対象とする場合、上述したステップＳ３において、三次元画像Ｄ２を構成する三次元座標のうち、局在領域９ａに相当する三次元領域を、局在領域Ａとして抽出する。そして、抽出した三次元領域の局在領域９ａの体積とスフェロイド９全体の体積とから局在領域９ａの割合を算出し、当該割合に基づいて評価パラメータＶを算出する。抽出の方法は、上記の実施形態のような輝度値に基づく領域抽出であってもよく、上記の第１変形例のような学習モデルを使用した領域抽出であってもよい。

【0085】

＜４－３．他の変形例＞
上記の実施形態では、試料容器９０が、複数のウェル（凹部）９１を有するウェルプレートであった。そして、各ウェル９１に、１つの生体試料９が保持されていた。しかしながら、１つのウェルの中に、複数の生体試料が保持されていてもよい。その場合、１つの画像の中に、複数の生体試料に相当する領域が含まれていてもよい。また、生体試料を保持する試料容器は、１つの凹部のみを有するディッシュであってもよい。

【0086】

また、上記の実施形態や変形例に登場した各要素を、矛盾が生じない範囲で、適宜に組み合わせてもよい。

【符号の説明】

【0087】

１ 観察装置
９ 生体試料／スフェロイド
９ａ 局在領域
４１ 画像取得部
４２ 領域抽出部
４３ 評価部
９０ 試料容器
９１ ウェル
Ａ 局在領域
Ａ１ 全体領域
Ａ２ 高輝度領域
Ｄ１ 断層画像
Ｄ２ 三次元画像
Ｖ 評価パラメータ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】