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▶ ホーナン・ジェニュイン・バイオテック・カンパニー・リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024128909
(43)【公開日】2024-09-24
(54)【発明の名称】アズブジンを含む免疫調節剤組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7068 20060101AFI20240913BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240913BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240913BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240913BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240913BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240913BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7068
A61K39/395 N
A61P37/04
A61P35/00
A61P35/02
A61P43/00 121
【審査請求】未請求
【請求項の数】15
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023092449
(22)【出願日】2023-06-05
(31)【優先権主張番号】202310232465.9
(32)【優先日】2023-03-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(71)【出願人】
【識別番号】523187789
【氏名又は名称】ホーナン・ジェニュイン・バイオテック・カンパニー・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100122644
【弁理士】
【氏名又は名称】寺地 拓己
(74)【代理人】
【識別番号】100220098
【弁理士】
【氏名又は名称】宮脇 薫
(72)【発明者】
【氏名】パン・リー
(72)【発明者】
【氏名】リミン・ジア
(72)【発明者】
【氏名】ジヨン・シン
(72)【発明者】
【氏名】ザオヤン・ワン
【テーマコード（参考）】
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG01
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA17
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZB02
4C086ZB07
4C086ZB09
4C086ZC75
(57)【要約】 （修正有）
【課題】アズブジンを含む免疫調節剤組成物を提供する。
【解決手段】免疫調節剤としてアズブジンを含む、医薬組成物を提供する。前記医薬組成物が、ＰＤ-１抗体、ＰＤ-Ｌ１抗体、又はそれらの組み合わせである第２の免疫調節活性物をさらに含むことが好ましい。
【選択図】なし
【解決手段】免疫調節剤としてアズブジンを含む、医薬組成物を提供する。前記医薬組成物が、ＰＤ-１抗体、ＰＤ-Ｌ１抗体、又はそれらの組み合わせである第２の免疫調節活性物をさらに含むことが好ましい。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
免疫調節剤としてアズブジンを含む、医薬組成物。
【請求項2】
ＰＤ-１抗体、ＰＤ-Ｌ１抗体、又はそれらの組み合わせである第２の免疫調節活性物をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
アズブジンを有効活性物として含む、免疫機能を調節するために用いられる医薬組成物。
【請求項4】
第２の免疫調節活性物をさらに含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記第２の免疫活性物質が、ＰＤ-１抗体、ＰＤ-Ｌ１抗体、又はそれらの組み合わせである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記ＰＤ-１抗体が、ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、シンチリマブ（ｓｉｎｔｉｌｉｍａｂ）、トリパリマブ（ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂ）、ＲＭＰ１－１４、カムレリズマブ（ｃａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、チスレリズマブ（ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂ）、セミプリマブ（ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ）、及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるか、或いは、
前記ＰＤ-Ｌ１抗体が、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、デュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるか、或いは、
前記ＰＤ-１抗体が、ＲＭＰ１－１４抗体と一致する相補性決定領域を有するヒト化抗体から選択される、請求項５に記載の医薬組成物。
前記ＰＤ-Ｌ１抗体が、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、デュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるか、或いは、
前記ＰＤ-１抗体が、ＲＭＰ１－１４抗体と一致する相補性決定領域を有するヒト化抗体から選択される、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項7】
インビボでの免疫応答を調節又は増強するために用いられるアズブジン。
【請求項8】
免疫応答を増強するためのアズブジンを含む医薬組成物。
【請求項9】
第２の免疫調節活性物質をさらに含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記第２の免疫調節活性物質が、ＰＤ-１抗体、ＰＤ-Ｌ１抗体、又はそれらの組み合わせである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
前記ＰＤ-１抗体が、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、シンチリマブ、トリパリマブ、ＲＭＰ１－１４、カムレリズマブ、チスレリズマブ、セミプリマブ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるか、或いは
前記ＰＤ-Ｌ１抗体が、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
前記ＰＤ-Ｌ１抗体が、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項12】
免疫細胞の浸潤及び増殖の改善のために用いられるアズブジン。
【請求項13】
前記免疫細胞が、Ｂ細胞、Ｔ細胞及びＮＫ細胞からなる群より選択される、請求項１２に記載のアズブジン。
【請求項14】
腫瘍組織又は血清サンプルからのサイトカインの放出を調節するために用いられるアズブジン。
【請求項15】
前記サイトカインが、ＩＦＮγ、ＩＦＮβ、ＴＮＦａ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ１０、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ８、及びＭＣＰ－１からなる群より選択される、請求項１４に記載のアズブジン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオ医薬品の分野に属し、具体的にはアズブジンを含む免疫調節剤組成物の分野に関する。
【背景技術】
【0002】
デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）は、幅広い基質の特異性を備えた酵素であり、ピリミジン及びプリンデオキシヌクレオシドをリン酸化することができ、デオキシヌクレオシド生合成のサルベージ経路における肝要な酵素であり、正常なＤＮＡ代謝を維持して様々な抗ウイルス及び抗がんのヌクレオシド類似体薬物（これらの薬物は、リン酸化された後にのみ活性化され、それによって腫瘍の増殖を阻害する。）をリン酸化することができる。過去数十年間、広く研究されているアポトーシスについての放射線治療戦略は、腫瘍治療に重要な手段の１つになっている。
【0003】
アズブジンは、広域スペクトルＲＮＡウイルス阻害剤であり、人工的に合成されたウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）のヌクレオシド類似体として、細胞内で抗ウイルス活性を有する５’－三リン酸塩代謝物（アズブジン三リン酸塩）に代謝され、新型コロナウイルスポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）に特異的に作用することができ、ウイルスのＲｄＲｐを標的として宿主細胞においてＲｄＲｐの活性を阻害することにより、ＲＮＡ鎖の合成と複製をブロックすることができる。２０２１年７月に、アズブジン錠は、ウイルス量の高い成人のＨＩＶ－１感染患者を治療するために用いられるのが中国での販売に承認された。また、２０２２年７月に、アズブジンは、新型コロナウイルス感染症の治療薬として承認された。
【0004】
特許文献ＣＮ２０１０１０５０６５９５．Ｘには、結腸がん、肝臓癌、胃癌、食道癌、肺癌、乳がん、子宮頸癌、白血病、リンパ腫などの腫瘍を治療するためにアズブジンを使用することが開示されている。アズブジンは様々なヒトのがん細胞や動物の移植腫瘍に対して明らかな抑制効果を有することが見られた。
【発明の概要】
【0005】
本発明では、従来技術に基づいて、アズブジンに対してさらに研究したところ、アズブジンは広範囲の抗ウイルス薬や抗腫瘍薬に使用されることに加えて、免疫調節剤として良好な免疫調節効果を示す可能性もあり、そしてＰＤ-１と併用されると腫瘍の進行を有意に阻害できることが分かった。
【0006】
本発明は、免疫調節剤としてアズブジンを含む医薬組成物を提供する。体的には、本発明は以下の技術的態様を提供する。
【0007】
一態様では、本発明は、免疫調節剤としてアズブジンを含む医薬組成物を提供する。
【0008】
本発明の好ましい実施形態では、第２の免疫調節活性物をさらに含む。
【0009】
本発明の好ましい実施形態では、前記第２の免疫調節活性物は、ＰＤ１抗体、ＰＤ-Ｌ１抗体、又はそれらの組み合わせである。
【0010】
別の態様では、本発明は、免疫機能の調節における有効活性物としてのアズブジンの使用を提供する。
【0011】
さらに別の態様では、本発明は、免疫機能を調節するための薬物の調製におけるアズブジンの使用を提供する。
【0012】
さらに別の態様では、本発明は、免疫機能を調節するために有効活性物として用いられるアズブジンを提供する。
【0013】
さらに別の態様では、本発明は、免疫機能の調節における、アズブジンを有効活性物として含む医薬組成物の使用を提供する。
【0014】
さらに別の態様では、本発明は、免疫機能を調節するための薬物の調製における、アズブジンを含む医薬組成物の使用を提供する。
【0015】
さらに別の態様では、本発明は、免疫機能を調節するためのアズブジンを有効活性物として含む医薬組成物を提供する。
【0016】
本発明の好ましい実施形態では、前記医薬組成物は第２の免疫調節活性物をさらに含む。
【0017】
本発明の好ましい実施形態では、前記第２の免疫活性物質は、ＰＤ-１抗体、ＰＤ-Ｌ１抗体、又はそれらの組み合わせである。
【0018】
本発明の好ましい実施形態では、前記ＰＤ-１抗体は、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、シンチリマブ、トリパリマブ、ＲＭＰ１－１４、カムレリズマブ、チスレリズマブ、セミプリマブ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【0019】
本発明の好ましい実施形態では、前記ＰＤ-Ｌ１抗体は、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【0020】
本発明の好ましい実施形態では、前記ＰＤ-１抗体は、ＲＭＰ１－１４抗体と一致する相補性決定領域を有するヒト化抗体からなる群より選択される。
【0021】
別の態様では、本発明は、必要とする個体にを投与することを含むか、特には、必要とする個体に有効量のアズブジンを投与することを含むインビボでの免疫応答を調節又は増強するための方法を提供する。
【0022】
また別の態様では、本発明は、インビボでの免疫応答を調節又は増強するために用いられるアズブジンを提供する。
【0023】
さらに別の態様では、本発明はまた、患者からサンプルを採取すること、サンプルから免疫細胞を単離すること、アズブジンを用いて免疫細胞を培養すること、免疫細胞を増幅させて前記細胞を患者に再導入すること、及び免疫応答を増強することを含む、免疫応答を増強するための方法を提供する。
【0024】
また別の態様では、本発明は、免疫応答を増強するために用いられるアズブジンを提供する。
【0025】
また別の態様では、本発明は、免疫応答を増強するために用いられるアズブジンを含む医薬組成物を提供する。
【0026】
さらにまた別の態様では、本発明は、対象からサンプルを採取すること、サンプルから免疫細胞を単離すること、アズブジンを含む医薬組成物を用いて免疫細胞を培養すること、免疫細胞を増幅させて前記細胞を該対象に再導入すること、及び免疫応答を増強することを含む、免疫応答の増強方法を提供する。
【0027】
本発明の好ましい実施形態では、前記免疫細胞は、抗原提示細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びナチュラルキラー細胞からなる群より選択される。
【0028】
本発明の好ましい実施形態では、前記医薬組成物は第２の免疫調節活性物質をさらに含む。
【0029】
本発明の好ましい実施形態では、前記第２の免疫調節活性物質は、ＰＤ１抗体、ＰＤＬ１抗体、又はそれらの組み合わせである。
【0030】
本発明の好ましい実施形態では、前記ＰＤ-１抗体は、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、シンチリマブ、トリパリマブ、ＲＭＰ１－１４、カムレリズマブ、チスレリズマブ、セミプリマブ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【0031】
本発明の好ましい実施形態では、前記ＰＤ-Ｌ１抗体は、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【0032】
別の態様では、本発明は、免疫細胞の浸潤及び増殖の改善におけるアズブジンの使用を提供する。
【0033】
別の態様では、本発明は、免疫細胞の浸潤及び増殖の改善のために用いられるアズブジンを提供する。
【0034】
本発明の好ましい実施形態では、前記免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞及びＮＫ細胞からなる群より選択される。
【0035】
さらに別の態様では、本発明は、腫瘍組織又は血清サンプルからのサイトカインの放出を調節するためのアズブジンの使用を提供する。
【0036】
別の態様では、本発明は、腫瘍組織又は血清サンプルからのサイトカインの放出を調節するためのアズブジンを提供する。
【0037】
本発明の好ましい実施形態では、前記サイトカインは、ＩＦＮγ、ＩＦＮβ、ＴＮＦａ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ１０、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ８、及びＭＣＰ－１からなる群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【0038】
【発明を実施するための形態】
【0039】
実施例１ 正常免疫マウス及び重度免疫不全マウスに対するアズブジンの抗腫瘍効果の比較
実験材料
実験動物及び飼育環境
実験材料
実験動物及び飼育環境
【0040】
実験動物
種：マウス
系統：ＢＡＬＢ／ｃマウス
週齢及び体重：６～８週齢、１８．７～２２．５ｇ
性別：雌
サプライヤー：Shanghai Lingchang Biotechnology Co., Ltd.
種：マウス
系統：ＢＡＬＢ／ｃマウス
週齢及び体重：６～８週齢、１８．７～２２．５ｇ
性別：雌
サプライヤー：Shanghai Lingchang Biotechnology Co., Ltd.
【0041】
供試品及び対照品の情報
名称：アズブジン、物性説明：粉末、純度：１００％、分子量：２８６．０８、塩分含有分子量：２８６．２２、包装：３０．５ｍｇ／本、保存条件：４°Ｃ
名称：抗マウスＰＤ－１（ＣＤ２７９）、サプライヤー：Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ社、物性説明：液体、包装：１０．２９ｍｇ／ｍｌ
保存条件：４°Ｃ
名称：アズブジン、物性説明：粉末、純度：１００％、分子量：２８６．０８、塩分含有分子量：２８６．２２、包装：３０．５ｍｇ／本、保存条件：４°Ｃ
名称：抗マウスＰＤ－１（ＣＤ２７９）、サプライヤー：Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ社、物性説明：液体、包装：１０．２９ｍｇ／ｍｌ
保存条件：４°Ｃ
【0042】
細胞培養
ＣＴ２６細胞は、１０％ウシ胎児血清を加えたＲＰＭＩ １６４０培地に、３７°Ｃ、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。通常の継代を週に１回行った。細胞の飽和度が８０％～９０％になって必要な数に達したら、細胞を収集し、カウントして接種した。
ＣＴ２６細胞は、１０％ウシ胎児血清を加えたＲＰＭＩ １６４０培地に、３７°Ｃ、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。通常の継代を週に１回行った。細胞の飽和度が８０％～９０％になって必要な数に達したら、細胞を収集し、カウントして接種した。
【0043】
腫瘍細胞接種
ＣＴ２６細胞０．１ｍＬ（０．３×１０６）を各マウスの右下肢に皮下接種し、腫瘍の平均体積が約５１ｍｍ３に達した時にグループ分けに投薬を開始した。
ＣＴ２６細胞０．１ｍＬ（０．３×１０６）を各マウスの右下肢に皮下接種し、腫瘍の平均体積が約５１ｍｍ３に達した時にグループ分けに投薬を開始した。
【0044】
試験過程：免疫が正常なＢＡＬＢ／ｃマウスを選択した。それらのマウスは、兄妹・姉弟同士の近親交配により得られた近交系マウスであり、それらの間の個体差が小さく、遺伝子がより純粋であり、全体の品質がより良い。Ｂ－ＮＤＧマウスは、バイオサイトジェンが独自に開発した重度免疫不全マウスである。ＮＯＤ－ｓｃｉｄマウスからＩＬ２ｒｇ遺伝子がノックアウトされて成熟のＴ、Ｂ、ＮＫ細胞が欠損したマウスである。
【0045】
第１群はブランク群、第２群は０．２５ｍｐｋで投与された正常免疫マウス、第３群は１ｍｐｋで投与された正常免疫マウス、第４群は０．２５ｍｐｋで投与された重度免疫不全マウス、第５群は１ｍｐｋで投与された重度免疫不全であった。投与方式を経口投与（ｏ．ｐ．）とし、投与周期をＱＤ×２Ｗとした。
【0046】
実験指標は、腫瘍の増殖が阻害、遅延又は治癒されたかどうかを調査することであった。腫瘍の直径を週に３回ノギスにで測定した。腫瘍体積は、Ｖ＝０．５ａ×ｂ２（但し、ａとｂはそれぞれ腫瘍の長径と短径を表す）という計算式で算出した。
【0047】
化合物の抗腫瘍効果は、ＴＧＩ（％）又は相対的腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）によって評価した。ＴＧＩ（％）は、腫瘍増殖阻害率を反映し、ＴＧＩ（％）＝［１－（ある治療群の投与終了時の平均腫瘍体積－当該治療群の投与開始時の平均腫瘍体積）／（溶剤対照群の治療終了時の平均腫瘍体積－溶剤対照群の治療開始時の平均腫瘍体積）］×１００％という計算式で算出した。
【0048】
相対的腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）は、Ｔ／Ｃ％＝ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ×１００％（ただし、ＴＲＴＶは治療群のＲＴＶ平均値、ＣＲＴＶは陰性対照群のＲＴＶ平均値である）という計算式で算出した。相対的腫瘍体積（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ，ＲＴＶ）は、腫瘍測定の結果から、ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０（ただし、Ｖ０はグループ投与時（即ちｄ０）に測定された腫瘍体積、Ｖｔはある測定時の腫瘍体積であり、ＴＲＴＶとＣＲＴＶは同じ日に取得したデータである）という計算式で算出した。
【0049】
【表1】
【0050】
試験結果の比較
上記の試験結果から分かるように、アズブジンは、０．２５ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇの２つの投与量で投与された場合、ＣＴ－２６腫瘍担持Ｂ－ＮＤＧ免疫不全マウスに対して明らかな腫瘍阻害効果を示さず、ＴＧＩがそれぞれ１３％と５３％であった。また、それらの結果はＣＴ－２６腫瘍担持ＢＡＬＢ／ｃ免疫正常マウスモデルに対して同じの投与量で投与されたアズブジンの抗腫瘍効果（ＴＧＩがそれぞれ６３％と９４％であった）よりもそれぞれ低かったことから、アズブジンは免疫調節剤として使用できることが証明された。
上記の試験結果から分かるように、アズブジンは、０．２５ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇの２つの投与量で投与された場合、ＣＴ－２６腫瘍担持Ｂ－ＮＤＧ免疫不全マウスに対して明らかな腫瘍阻害効果を示さず、ＴＧＩがそれぞれ１３％と５３％であった。また、それらの結果はＣＴ－２６腫瘍担持ＢＡＬＢ／ｃ免疫正常マウスモデルに対して同じの投与量で投与されたアズブジンの抗腫瘍効果（ＴＧＩがそれぞれ６３％と９４％であった）よりもそれぞれ低かったことから、アズブジンは免疫調節剤として使用できることが証明された。
【0051】
実施例２ アズブジンが腫瘍中の免疫細胞浸潤に与える影響の研究
単一細胞懸濁液の調製
脂肪を除去するために腫瘍組織をＰＢＳで１回洗浄し、腫瘍組織を迅速に小塊に切断した。切り刻んだ腫瘍組織を５ｍＬの消化酵素混合液を含むチューブＣに移した。チューブＣを組織プロセッサーに置き、組織破片が消化酵素に浸るように確認し、プログラムｍ＿ｉｍｐｔｕｍｏｒ＿０１＿０１を実行した。サンプルを３７°Ｃの水浴シェーカーに入れ、３０分間消化した。消化終了後、プログラムｍ＿ｉｍｐｔｕｍｏｒ＿０１＿０１を再度実行し、２％ウシ胎児血清を含む適切な量のＰＢＳを加えて消化を停止させた。残留組織を７０μｍ細胞メッシュでろ過して除去し、ＰＢＳで洗浄した。細胞沈殿の量に応じて適切な体積のＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、細胞を均一に軽くピペッティングし、血球計で細胞を計数した。適切な量の細胞を採取して抗体染色を行った。
単一細胞懸濁液の調製
脂肪を除去するために腫瘍組織をＰＢＳで１回洗浄し、腫瘍組織を迅速に小塊に切断した。切り刻んだ腫瘍組織を５ｍＬの消化酵素混合液を含むチューブＣに移した。チューブＣを組織プロセッサーに置き、組織破片が消化酵素に浸るように確認し、プログラムｍ＿ｉｍｐｔｕｍｏｒ＿０１＿０１を実行した。サンプルを３７°Ｃの水浴シェーカーに入れ、３０分間消化した。消化終了後、プログラムｍ＿ｉｍｐｔｕｍｏｒ＿０１＿０１を再度実行し、２％ウシ胎児血清を含む適切な量のＰＢＳを加えて消化を停止させた。残留組織を７０μｍ細胞メッシュでろ過して除去し、ＰＢＳで洗浄した。細胞沈殿の量に応じて適切な体積のＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、細胞を均一に軽くピペッティングし、血球計で細胞を計数した。適切な量の細胞を採取して抗体染色を行った。
【0052】
細胞外染色
細胞濃度が１×１０６個／１００μＬになるように、ＰＢＳで細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を９６ウェル－Ｖ底プレートにウェルあたり１００μＬで加え、４℃、４５０ｇ条件下で５分間遠心し、上清を除去した。準備したＺｏｍｂｉｅ ＮＩＲ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ溶液１００μＬで細胞を再懸濁し、４°Ｃで暗所で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。次に、ウェルあたりＦｃ受容体阻害剤を含む染色緩衝液５０μＬ（１μＬのＦｃ受容体阻害剤＋４９μＬの染色緩衝液）で細胞を再懸濁し、４℃で暗所で５分間インキュベートした。次に、各ウェルにＰａｃｉｆｉｃ Ｏｒａｎｇｅ ＣＤ８、ＢＶ６０５ ＭＨＣＩＩ、ＢＶ６５０ ＣＤ２５、ＢＶ７５０ ＣＤ４５、ＢＶ７８５ Ｌｙ６Ｃ、ＡＦ４８８ ＣＤ１１ｃ、ＡＦ５３２ ＣＤ１１ｂ、ＰＥ－ＤＺＬ５９４ ＣＤ４９ｂ、ＡＰＣ Ｌｙ６Ｇ、ＡＰＣ－Ｃｙ５．５ ＣＤ４、ＡＰＣ－Ｃｙ７ ＣＤ３、ＢＶ４２１ ＣＤ６９（又はそのアイソタイプ対照抗体）を含むブリリアント染色緩衝液５０μＬを加えて細胞を再懸濁し、４°Ｃで暗所で３０分間インキュベートした。染色終了後、２００μＬの染色緩衝液で２回洗浄した。
細胞濃度が１×１０６個／１００μＬになるように、ＰＢＳで細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を９６ウェル－Ｖ底プレートにウェルあたり１００μＬで加え、４℃、４５０ｇ条件下で５分間遠心し、上清を除去した。準備したＺｏｍｂｉｅ ＮＩＲ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ溶液１００μＬで細胞を再懸濁し、４°Ｃで暗所で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。次に、ウェルあたりＦｃ受容体阻害剤を含む染色緩衝液５０μＬ（１μＬのＦｃ受容体阻害剤＋４９μＬの染色緩衝液）で細胞を再懸濁し、４℃で暗所で５分間インキュベートした。次に、各ウェルにＰａｃｉｆｉｃ Ｏｒａｎｇｅ ＣＤ８、ＢＶ６０５ ＭＨＣＩＩ、ＢＶ６５０ ＣＤ２５、ＢＶ７５０ ＣＤ４５、ＢＶ７８５ Ｌｙ６Ｃ、ＡＦ４８８ ＣＤ１１ｃ、ＡＦ５３２ ＣＤ１１ｂ、ＰＥ－ＤＺＬ５９４ ＣＤ４９ｂ、ＡＰＣ Ｌｙ６Ｇ、ＡＰＣ－Ｃｙ５．５ ＣＤ４、ＡＰＣ－Ｃｙ７ ＣＤ３、ＢＶ４２１ ＣＤ６９（又はそのアイソタイプ対照抗体）を含むブリリアント染色緩衝液５０μＬを加えて細胞を再懸濁し、４°Ｃで暗所で３０分間インキュベートした。染色終了後、２００μＬの染色緩衝液で２回洗浄した。
【0053】
細胞内染色
各ウェルに１００μＬの固定／透過処理液（Ｆｉｘａｔｉｏｎ／ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を加えて細胞を再懸濁し、４℃で暗所で３０分間インキュベートした。透過処理終了後、２００μＬの透過処理緩衝液で２回洗浄した。Ｆｃ受容体阻害剤を含む透過緩衝液１００μＬを加えて細胞を再懸濁し、４℃で暗所で５分間インキュベートし、次に、ＰＥ－Ｃｙ７ ＦｏｘＰ３、ＰＥ Ｋｉ６７（又はそのアイソタイプ対照抗体）細胞内抗体を直接加え、４℃で暗所で３０分間インキュベートした。染色終了後、２００μＬの透過処理緩衝液で２回洗浄した後、２００μＬの染色緩衝液で細胞を再懸濁し、２４時間以内にフローサイトメトリー検出を完了した。
各ウェルに１００μＬの固定／透過処理液（Ｆｉｘａｔｉｏｎ／ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を加えて細胞を再懸濁し、４℃で暗所で３０分間インキュベートした。透過処理終了後、２００μＬの透過処理緩衝液で２回洗浄した。Ｆｃ受容体阻害剤を含む透過緩衝液１００μＬを加えて細胞を再懸濁し、４℃で暗所で５分間インキュベートし、次に、ＰＥ－Ｃｙ７ ＦｏｘＰ３、ＰＥ Ｋｉ６７（又はそのアイソタイプ対照抗体）細胞内抗体を直接加え、４℃で暗所で３０分間インキュベートした。染色終了後、２００μＬの透過処理緩衝液で２回洗浄した後、２００μＬの染色緩衝液で細胞を再懸濁し、２４時間以内にフローサイトメトリー検出を完了した。
【0054】
データ分析
ＦｌｏｗＪｏ、ＳＰＳＳ及びＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してフローデータを以下の数値を分析した。
１）腫瘍組織活細胞中のＣＤ４５と細胞の合計（ＣＤ４５＋細胞）の割合
２）ＣＤ４５と細胞との合計（ＣＤ４５＋細胞）中のＴ、ＣＤ４とＴの合計（ＣＤ４＋Ｔ）、ＣＤ８とＴの合計（ＣＤ８＋Ｔ）、Ｔｒｅｇ、Ｍｙｅｌｏｉｄ、ＤＣ、ＮＫ、ＰＭＮ－ＭＤＳＣ、Ｍ－ＭＤＳＣの割合
３）ＣＤ８とＴの合計（ＣＤ８＋Ｔ）とＴｒｅｇの比及びＣＤ４とＴｅｆｆの合計（ＣＤ４＋Ｔｅｆｆ）とＴｒｅｇの比
４）Ｔ、ＣＤ４とＴの合計（ＣＤ４＋Ｔ）、ＣＤ８とＴの合計（ＣＤ８＋Ｔ）の細胞におけるＣＤ６９陽性率及び蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）
５）Ｔ、ＣＤ４とＴの合計（ＣＤ４＋Ｔ）、ＣＤ８とＴの合計（ＣＤ８＋Ｔ）の細胞におけるＫｉ６７陽性率及び蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）
６）腫瘍組織１００ｍｇあたりのＴ、ＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ、Ｔｒｅｇ、Ｍｙｅｌｏｉｄ、ＤＣ、ＮＫ、ＰＭＮ－ＭＤＳＣ、Ｍ－ＭＤＳＣ、白血球の細胞数
ＦｌｏｗＪｏ、ＳＰＳＳ及びＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してフローデータを以下の数値を分析した。
１）腫瘍組織活細胞中のＣＤ４５と細胞の合計（ＣＤ４５＋細胞）の割合
２）ＣＤ４５と細胞との合計（ＣＤ４５＋細胞）中のＴ、ＣＤ４とＴの合計（ＣＤ４＋Ｔ）、ＣＤ８とＴの合計（ＣＤ８＋Ｔ）、Ｔｒｅｇ、Ｍｙｅｌｏｉｄ、ＤＣ、ＮＫ、ＰＭＮ－ＭＤＳＣ、Ｍ－ＭＤＳＣの割合
３）ＣＤ８とＴの合計（ＣＤ８＋Ｔ）とＴｒｅｇの比及びＣＤ４とＴｅｆｆの合計（ＣＤ４＋Ｔｅｆｆ）とＴｒｅｇの比
４）Ｔ、ＣＤ４とＴの合計（ＣＤ４＋Ｔ）、ＣＤ８とＴの合計（ＣＤ８＋Ｔ）の細胞におけるＣＤ６９陽性率及び蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）
５）Ｔ、ＣＤ４とＴの合計（ＣＤ４＋Ｔ）、ＣＤ８とＴの合計（ＣＤ８＋Ｔ）の細胞におけるＫｉ６７陽性率及び蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）
６）腫瘍組織１００ｍｇあたりのＴ、ＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ、Ｔｒｅｇ、Ｍｙｅｌｏｉｄ、ＤＣ、ＮＫ、ＰＭＮ－ＭＤＳＣ、Ｍ－ＭＤＳＣ、白血球の細胞数
【0055】
【表2】
【0056】
この実験では、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＴ２６腫瘍モデルを構築し、異なる用量（０．２５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ）のアズブジンで処理したマウスから、腫瘍サンプルを収集した後、フローサイトメトリーを使用して各免疫細胞サブセットの割合、及びＴ、ＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔの活性化と増殖を検出した。
【0057】
投薬後の腫瘍における免疫細胞浸潤の増加は、主にＣＤ８＋Ｔ及びＮＫ細胞浸潤の増加に起因し、一定の用量依存性があった。高用量群では、ＣＤ８Ｔ／Ｔｒｅｇ及びＣＤ４Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇの割合が有意に向上し、また、高用量群における骨髄細胞の割合が有意に低減し、それは、Ｍ－ＭＤＳＣ及びＰＭＮ－ＭＤＳＣ細胞の割合が有意に低減したことに起因したと主に考えられ、また、低用量群でも同じ傾向を示し、一定の用量依存性を示した。他の細胞サブセットでは、投薬後に、対照群と比較して有意な変化は見られなく、Ｔ、ＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＫｉ６７及びＣＤ６９の発現レベルにも有意差は見られなかった（実験結果を図１～図７に示す。図２～図７には、ブラックはブランク群、ライトブラックは０．２５ｍｇ／ｋｇで投与した投与群、グレーは１ｍｇ／ｋｇで投与した投与群を表す。）。
【0058】
この実験から、アズブジンは、腫瘍におけるＭ－ＭＤＳＣ及びＰＭＮ－ＭＤＳＣの浸潤及び増殖を抑制し、ＣＤ８＋Ｔ／ＮＫ細胞の浸潤及び増殖を促進することにより腫瘍抑制効果を発揮することができ、また、アズブジンが免疫調節剤として使用できることが証明された。
【0059】
実施例３ 血清及び腫瘍組織におけるサイトカインの放出レベルに対するアズブジンの影響
細胞培養：
ＣＴ２６細胞は、１０％ウシ胎児血清を加えたＲＰＭＩ １６４０培地に、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。通常の継代を週に１回行った。細胞の飽和度が８０％～９０％になって必要な数に達したら、細胞を収集し、カウントして接種した。
細胞培養：
ＣＴ２６細胞は、１０％ウシ胎児血清を加えたＲＰＭＩ １６４０培地に、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。通常の継代を週に１回行った。細胞の飽和度が８０％～９０％になって必要な数に達したら、細胞を収集し、カウントして接種した。
【0060】
動物：
ＢＡＬＢ／ｃメスマウスは、雌、８週齢、体重１８．５～２２．９グラムであり、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．より提供された。
ＢＡＬＢ／ｃメスマウスは、雌、８週齢、体重１８．５～２２．９グラムであり、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．より提供された。
【0061】
腫瘍接種：
ＣＴ２６細胞０．１ｍｌ（０．３×１０＾６）を各マウスに皮下接種し、腫瘍の平均体積が１０１ｍｍ３に達した時にグループ分けに投薬を開始した。
ＣＴ２６細胞０．１ｍｌ（０．３×１０＾６）を各マウスに皮下接種し、腫瘍の平均体積が１０１ｍｍ３に達した時にグループ分けに投薬を開始した。
【0062】
投薬レジメン：
この実験のインビボ投薬レジメンを以下の表に示す。
この実験のインビボ投薬レジメンを以下の表に示す。
【0063】
【表3】
【0064】
タンパク質の抽出と定量
１）－８０℃の冷蔵庫から急速凍結した組織サンプルを取り出した。
２）ドライアイス上で切り取った腫瘍組織の一部（約５０～１００ｍｇ）を、スチールビーズを加えた２ｍＬの遠心管に入れ、さらに、３５０μＬの細胞分解液ＲＩＰＡ（１％のプロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤が新たに加えておいた。）を加えた。
３）ティッシュ グラインダーにより最高周波数で組織を５分間破砕した。
４）組織分解液を氷の上に置いて３０分間分解した。
５）１２，０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心し、上清を取り、新しい１．５ｍＬの遠心管に入れた。
１）－８０℃の冷蔵庫から急速凍結した組織サンプルを取り出した。
２）ドライアイス上で切り取った腫瘍組織の一部（約５０～１００ｍｇ）を、スチールビーズを加えた２ｍＬの遠心管に入れ、さらに、３５０μＬの細胞分解液ＲＩＰＡ（１％のプロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤が新たに加えておいた。）を加えた。
３）ティッシュ グラインダーにより最高周波数で組織を５分間破砕した。
４）組織分解液を氷の上に置いて３０分間分解した。
５）１２，０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心し、上清を取り、新しい１．５ｍＬの遠心管に入れた。
【0065】
腫瘍組織タンパク質定量の方法
１）タンパク質抽出物を５０倍希釈した（タンパク質抽出物２μＬ＋ＲＩＰＡ細胞分解緩衝液９８μＬ）。
２）標準品及び希釈サンプルを９６ウェル透明プレートに１０μＬ／ウェルで加えた。
３）試薬Ａと試薬Ｂを５０：１の割合で混合して調製した作業溶液を各ウェルに２００μＬ添加した。
４）９６ウェル透明プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。
５）マイクロプレートリーダーにより５６２ｎｍでＯＤ値を検出し、ＯＤの結果に従って腫瘍タンパク質を定量化した。
６）腫瘍サンプルの総タンパク質濃度をすべて２ｍｇ／ｍＬにした。
７）ＢＣＡ定量化キットによりタンパク質を定量化した。
８）定量結果に従って、ＲＩＰＡ分解液を用いてサンプルタンパク質濃度をすべて２μｇ／μＬに希釈した。
９）ＭＳＤ実験を行ったか、又は希釈したサンプルを－８０℃の冷蔵庫に保管した。
１）タンパク質抽出物を５０倍希釈した（タンパク質抽出物２μＬ＋ＲＩＰＡ細胞分解緩衝液９８μＬ）。
２）標準品及び希釈サンプルを９６ウェル透明プレートに１０μＬ／ウェルで加えた。
３）試薬Ａと試薬Ｂを５０：１の割合で混合して調製した作業溶液を各ウェルに２００μＬ添加した。
４）９６ウェル透明プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。
５）マイクロプレートリーダーにより５６２ｎｍでＯＤ値を検出し、ＯＤの結果に従って腫瘍タンパク質を定量化した。
６）腫瘍サンプルの総タンパク質濃度をすべて２ｍｇ／ｍＬにした。
７）ＢＣＡ定量化キットによりタンパク質を定量化した。
８）定量結果に従って、ＲＩＰＡ分解液を用いてサンプルタンパク質濃度をすべて２μｇ／μＬに希釈した。
９）ＭＳＤ実験を行ったか、又は希釈したサンプルを－８０℃の冷蔵庫に保管した。
【0066】
ＭＳＤサイトカインの検出
ＭＳＤ試薬の調製
１）標準品の調製：標準品にＤｉｌｕｅｎｔ ４３希釈剤２５０μＬを加え、均一に混合し、室温で１５～３０ｍｉｎ静置し、Ｄｉｌｕｅｎｔ ４３で４倍段階希釈し、番号１～７の標準品を得た。なお、Ｄｉｌｕｅｎｔ ４３は番号８標準品とした。
２）サンプル希釈：Ｄｉｌｕｅｎｔ ４３でサンプルを希釈した。
３）抗体希釈：１００Ｘ抗体原液を１Ｘに希釈した。
４）緩衝液の調製：脱イオン水で５Ｘ緩衝液を１Ｘに希釈した。
ＭＳＤ試薬の調製
１）標準品の調製：標準品にＤｉｌｕｅｎｔ ４３希釈剤２５０μＬを加え、均一に混合し、室温で１５～３０ｍｉｎ静置し、Ｄｉｌｕｅｎｔ ４３で４倍段階希釈し、番号１～７の標準品を得た。なお、Ｄｉｌｕｅｎｔ ４３は番号８標準品とした。
２）サンプル希釈：Ｄｉｌｕｅｎｔ ４３でサンプルを希釈した。
３）抗体希釈：１００Ｘ抗体原液を１Ｘに希釈した。
４）緩衝液の調製：脱イオン水で５Ｘ緩衝液を１Ｘに希釈した。
【0067】
ＭＳＤ検出
１）指定されたリンカー３００ｕｌに各ビオチン抗体２００μＬを加えた。ボルテックスし、室温で３０分間インキュベートした。
２）停止液を２００μＬ加えた。ボルテックスし、室温で３０分間インキュベートした。
３）各Ｕ－ＰＬＥＸリンカー結合抗体溶液（１０Ｘ）６００μＬを１本のチューブに混合してボルテックスした。
４）結合抗体の数が１０未満である場合、停止液で溶液を６ｍｌに増加した。
５）各ウェルに５０μＬのマルチプレックスコーティング溶液を加え、粘着プレートシールでプレートをシールし、室温で１時間振とうした。
６）１５０μＬ／ウェル１Ｘ ＭＳＤ洗浄緩衝液で３回洗浄した。
７）標準品及び検出抗体溶液を調製した。
８）各ウェルに２５μＬのＤｉｌｕｅｎｔ ４３を加えた。
９）各ウェルに２５μＬの調製済み標準品、組織サンプル又は血清サンプルを加えた。粘着プレートシールでプレートをシールした。室温で１時間インキュベートした。
１０）１５０μＬ／ウェル１Ｘ ＭＳＤ洗浄緩衝液で３回洗浄した。
１１）各ウェルに検出抗体液５０μＬを加えた。粘着プレートシールでプレートをシールした。室温で１時間インキュベートした。
１２）１５０μＬ／ウェル１Ｘ ＭＳＤ洗浄緩衝液で３回洗浄した。
１３）各ウェルに１５０μＬのＬＭＳＤ ＧＬＯＤ読み取りバッファーを加えた。ＭＳＤ装置でプレート読み取りを行った。
１）指定されたリンカー３００ｕｌに各ビオチン抗体２００μＬを加えた。ボルテックスし、室温で３０分間インキュベートした。
２）停止液を２００μＬ加えた。ボルテックスし、室温で３０分間インキュベートした。
３）各Ｕ－ＰＬＥＸリンカー結合抗体溶液（１０Ｘ）６００μＬを１本のチューブに混合してボルテックスした。
４）結合抗体の数が１０未満である場合、停止液で溶液を６ｍｌに増加した。
５）各ウェルに５０μＬのマルチプレックスコーティング溶液を加え、粘着プレートシールでプレートをシールし、室温で１時間振とうした。
６）１５０μＬ／ウェル１Ｘ ＭＳＤ洗浄緩衝液で３回洗浄した。
７）標準品及び検出抗体溶液を調製した。
８）各ウェルに２５μＬのＤｉｌｕｅｎｔ ４３を加えた。
９）各ウェルに２５μＬの調製済み標準品、組織サンプル又は血清サンプルを加えた。粘着プレートシールでプレートをシールした。室温で１時間インキュベートした。
１０）１５０μＬ／ウェル１Ｘ ＭＳＤ洗浄緩衝液で３回洗浄した。
１１）各ウェルに検出抗体液５０μＬを加えた。粘着プレートシールでプレートをシールした。室温で１時間インキュベートした。
１２）１５０μＬ／ウェル１Ｘ ＭＳＤ洗浄緩衝液で３回洗浄した。
１３）各ウェルに１５０μＬのＬＭＳＤ ＧＬＯＤ読み取りバッファーを加えた。ＭＳＤ装置でプレート読み取りを行った。
【0068】
この実験では、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＴ２６腫瘍モデルを構築し、異なる用量（０．２５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ）のアズブジンでマウスを５日間処理し、最後の投与から２時間後に血清及び腫瘍サンプルを採取し、血清及び腫瘍組織中のサイトカイン（ＧＭ－ＣＳＦ、ＭＣＰ－１、ＩＦＮγ、ＩＦＮβ、ＴＮＦａ、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ８、ＩＬ１０）の放出レベルをＭＳＤ法で検出した（図８）。
【0069】
血清サンプルでは、ブランク群に比較すると、アズブジン０．２５ｍｇ／ｋｇ治療群はＭＣＰ－１の放出が有意に低減し、アズブジン０．２５ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇ治療群はＩＬ８の放出が有意に低減し、他の因子が有意な変化が見られなかった。腫瘍組織では、ブランク群に比較すると、アズブジン０．２５ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇ治療群はＩＦＮγ及びＴＮＦαの放出が増加し、ＩＦＮ－βの放出が低減し、一定の用量依存性を示した。上記の実験結果は、アズブジンがサイトカインの放出に対して一定の調節効果を有することを示した。
【0070】
実施例４ マウス結腸直腸癌ＣＴ－２６同種移植腫瘍モデルにおけるアズブジンとＰＤ-１抗体の併用の研究
さらに、マウス結腸直腸癌ＣＴ－２６細胞株ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの皮下異種移植動物モデルにおけるアズブジンとＰＤ-１抗体の併用の抗腫瘍効果。
さらに、マウス結腸直腸癌ＣＴ－２６細胞株ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの皮下異種移植動物モデルにおけるアズブジンとＰＤ-１抗体の併用の抗腫瘍効果。
【0071】
【表4】
【0072】
試験結果の分析を以下の表に示す。
【0073】
【表5】
【0074】
【表6】
【0075】
この実験では、ＣＴ２６同種移植腫瘍モデルにおける被験物質のインビボ薬効を評価した。異なる時点での各群の腫瘍体積を表５、表６及び図９に示す。投与開始１７日後、アズブジン（０．２５ｍｇ／ｋｇ）は、担癌マウスの腫瘍体積が２，００４ｍｍ３に達したブランク対照群に比較すると、明らかな抗腫瘍効果を有し、腫瘍体積が７６８ｍｍ３、Ｔ／Ｃが３９．１８％、ＴＧＩが６３．２６％、ｐ値＜０．０００１であった。アズブジン（０．５ｍｇ／ｋｇ）は、ブランク対照群に比較すると、明らかな抗腫瘍効果を有し、腫瘍体積が３４７ｍｍ３、Ｔ／Ｃが１７．６３％、ＴＧＩが８４．８５％、ｐ値＜０．０００１であった。被験物質併用群であるアズブジン＋抗ＰＤ－１（０．５＋１０ｍｇ／ｋｇ）は、ブランク対照群に比較すると、明らかな抗腫瘍効果を有し、腫瘍体積がそれぞれ１１９ｍｍ３、Ｔ／Ｃがそれぞれ５．６６％、ＴＧＩが９６．５％、ｐ値＜０．０００１であった。被験物質併用群における腫瘍重量の分析及び統計結果は、腫瘍体積のデータと基本的に合致した。
【0076】
実験動物の体重は、薬物毒性を間接的に測定するための参照指標とした。担癌マウスは、様々な用量の被験薬に対して良好な耐性を示し、すべての治療群では有意な体重減少が見られなかった。
【0077】
この実験では、被験物質であるアズブジン（０．２５ｍｇ／ｋｇ）、アズブジン（０．５ｍｇ／ｋｇ）、及びアズブジン＋抗ＰＤ－１（０．５＋１０ｍｇ／ｋｇ）は、試験用量でＣＴ２６同種移植腫瘍の増殖に対して有意な阻害効果を示した。この実験では、被験物質であるアズブジン（０．５ｍｇ／ｋｇ）と抗ＰＤ－１の併用により、このＣＴ２６モデルにおける単剤アズブジン及び単剤抗ＰＤ－１の抗腫瘍効果を向上させることができ、ＴＧＩはそれぞれ８４．８５％、７４．１６％から９６．５％に向上した。
【0078】
実施例５ Ｂ細胞リンパ腫Ａ２０担癌マウスモデルにおけるアズブジンとＰＤ-１抗体の併用の研究
アズブジンとＰＤ-１抗体の併用がＢ細胞リンパ腫Ａ２０担癌マウスモデルにおいて生じる影響をさらに研究したところ、ＰＤ－１及びアズブジンをそれぞれの単独投与した場合は、Ｂ細胞リンパ腫Ａ２０担癌マウスに対して一定の阻害活性を示したが、アズブジンとＰＤ－１抗体を併用した場合は、マウスの腫瘍進行が顕著に抑制された。
アズブジンとＰＤ-１抗体の併用がＢ細胞リンパ腫Ａ２０担癌マウスモデルにおいて生じる影響をさらに研究したところ、ＰＤ－１及びアズブジンをそれぞれの単独投与した場合は、Ｂ細胞リンパ腫Ａ２０担癌マウスに対して一定の阻害活性を示したが、アズブジンとＰＤ－１抗体を併用した場合は、マウスの腫瘍進行が顕著に抑制された。
【0079】
【表7】
【0080】
表７及び図１０に示すように、アズブジン１ｍｇ／ｋｇと２ｍｇ／ｋｇの２つの用量の場合、及びアズブジンと抗ＰＤ－１（１＋１０ｍｇ／ｋｇ）の併用の場合は、Ａ２０同種移植腫瘍の増殖に対して明らかな阻害効果を示し、ＴＧＩがそれぞれ７０％、８８％、８１％であった。アズブジン１ｍｇ／ｋｇと抗ＰＤ－１の併用により、このＡ２０ Ｂ細胞性リンパ腫における単剤抗ＰＤ－１の抗腫瘍効果を向上させることができ、ＴＧＩは３４．８％から８１％に向上した。
【0081】
以上、本発明の具体的な実施形態を説明したが、これらは単なる例であり、本発明の原理及び要旨から逸脱することなく、これらの実施形態に対して様々な変更や修正を加え得ることは、当業者なら理解すべきである。従って、本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義されるものである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10】
