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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024128959
(43)【公開日】2024-09-24
(54)【発明の名称】コロナウイルス感染症治療薬のスクリーニング方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20240913BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20240913BHJP
C12Q 1/6811 20180101ALI20240913BHJP
C12Q 1/6816 20180101ALI20240913BHJP
C12Q 1/6818 20180101ALI20240913BHJP
C12Q 1/70 20060101ALI20240913BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240913BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20240913BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20240913BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
C12N15/113 100Z
C12Q1/68
C12Q1/6811 Z
C12Q1/6816 Z
C12Q1/6818 Z
C12Q1/70
C12N15/11 Z
G01N33/15 Z
G01N33/50 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】17
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024034653
(22)【出願日】2024-03-07
(31)【優先権主張番号】P 2023037223
(32)【優先日】2023-03-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和４年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、未来社会創造事業大規模プロジェクト型エネルギー損失の革新的な低減化につながる高温超電導線材接合技術「高温超電導線材接合技術の超高磁場ＮＭＲと鉄道き電線への社会実装」、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】503359821
【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所
(71)【出願人】
【識別番号】523088718
【氏名又は名称】石井 佳誉
(74)【代理人】
【識別番号】110000109
【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス
(72)【発明者】
【氏名】大山 貴子
(72)【発明者】
【氏名】石井 佳誉
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G045AA40
2G045DA14
2G045DA20
2G045FA36
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ10
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR32
4B063QR35
4B063QS16
4B063QS39
4B063QS40
4B063QX01
4B063QX10
(57)【要約】
【課題】 コロナウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはプライマーゼが結合する二次構造を形成する塩基配列を含むＲＮＡ、およびこのＲＮＡを用いたコロナウイルス感染症の治療剤または予防剤のスクリーニング方法を提供すること。
【解決手段】 シュードノット構造を形成する塩基配列を含むＲＮＡ、およびこのＲＮＡを用いたコロナウイルス感染症の治療剤または予防剤のスクリーニング方法が提供される。
【選択図】図７
【解決手段】 シュードノット構造を形成する塩基配列を含むＲＮＡ、およびこのＲＮＡを用いたコロナウイルス感染症の治療剤または予防剤のスクリーニング方法が提供される。
【選択図】図７
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２２に記載の塩基配列、または
配列番号２２に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
配列番号２２に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
【請求項2】
配列番号２１に記載の塩基配列、または配列番号２１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ３つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
【請求項3】
配列番号２０に記載の塩基配列、または配列番号２０に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
【請求項4】
配列番号１９に記載の塩基配列、または配列番号１９に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ２つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
【請求項5】
シュードノット構造に加えて１つのステムループ構造を形成する、請求項１に記載のＲＮＡ。
【請求項6】
請求項１に記載のＲＮＡ、並びに
請求項２から４のいずれか一項に記載のＲＮＡから選択される１種、２種、または３種のＲＮＡを含む、セット。
請求項２から４のいずれか一項に記載のＲＮＡから選択される１種、２種、または３種のＲＮＡを含む、セット。
【請求項7】
請求項１に記載のＲＮＡとプライマーゼ／ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）との結合を検出するアッセイを使用して、プライマーゼ／ＲｄＲｐのＲＮＡへの結合を阻害する化合物を同定する工程を含む、
コロナウイルス感染症の治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
コロナウイルス感染症の治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
【請求項8】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析により、請求項１に記載のＲＮＡについて化合物の結合部位を解析する工程をさらに含む、請求項７に記載のスクリーニング方法。
【請求項9】
同定された化合物の存在下で、請求項２から４のいずれか一項に記載のＲＮＡとプライマーゼ／ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）との結合を分析する工程をさらに含む、請求項７に記載のスクリーニング方法。
【請求項10】
コロナウイルスがアルファコロナウイルス属またはベータコロナウイルス属のウイルスである、請求項７に記載のスクリーニング方法。
【請求項11】
コロナウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求項７に記載のスクリーニング方法。
【請求項12】
請求項１から４のいずれか一項に記載のＲＮＡをコードするＤＮＡ。
【請求項13】
請求項１から４のいずれか一項に記載のＲＮＡについてＮＭＲ解析により二次構造の形成を測定する方法。
【請求項14】
プライマーゼまたはＲｄＲｐのＲＮＡにおける結合部位を特定するための、請求項１３に記載の測定方法。
【請求項15】
請求項１から４のいずれか一項にＲＮＡをアッセイ溶液中で維持することを含む、シュードノット構造またはステムループ構造の形成方法であって、アッセイ溶液のカリウムイオン濃度がナトリウムイオン濃度よりも高い、方法。
【請求項16】
請求項１から４のいずれか一項に記載のＲＮＡの少なくとも一部分に結合して、前記ＲＮＡとプライマーゼ／ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）との結合を阻害する、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項17】
下記（ａ）～（ｏ）からなる群から選択される何れかの塩基配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）を含む、請求項１６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド：
（ａ）ＧＧＧＡＡＵＡＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＧＡＡＵ（配列番号２５）、
（ｂ）ＡＡＵＡＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＧＡＡＵ（配列番号２７）、
（ｃ）ＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＵＵＡＣＧＡＧＡＡＵＵ（配列番号２８）、
（ｄ）ＡＡＡＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＡＵＵＣＡＵＵＣＵ（配列番号２９）、
（ｅ）ＵＵＧＵＧＣＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡＣＧＡＧＡ（配列番号３０）、
（ｆ）ＵＧＵＧＡＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＣＵＡＣＡＵＣＵＡＣ（配列番号３１）、
（ｇ）ＵＵＧＵＧＣＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡ（配列番号３２）、
（ｈ）ＵＧＵＧＡＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＣＵＡＣＡ（配列番号３３）、
（ｉ）ＡＵＵＣＵＣＣＵＡＡＧＡＡＧＣＵＡＵＵ（配列番号３４）、
（ｊ）ＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡＣＧＡＧＡＡＵＵＣＡＵＵＣＵ（配列番号３５）、
（ｋ）ＡＡＡＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＡＵＵＣＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧ（配列番号３６）、
（ｌ）ＡＵＣＵＡＣＵＵＧＵＧＣＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡＣＧＡＧＡＡ（配列番号３７）、
（ｍ）ＵＧＵＧＡＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＣＵＡＣＡＵＣＵＡＵ（配列番号３８）、
（ｎ）（ａ）～（ｍ）の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなり、請求項１から４のいずれか一項に記載のＲＮＡとＲｄＲｐとの結合を阻害することができる、塩基配列、および
（ｏ）（ａ）～（ｍ）のいずれか一の塩基配列と９０％塩基配列同一性を有する配列を含み、請求項１から４のいずれか一項に記載のＲＮＡとＲｄＲｐとの結合を阻害することができる、塩基配列。
（ａ）ＧＧＧＡＡＵＡＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＧＡＡＵ（配列番号２５）、
（ｂ）ＡＡＵＡＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＧＡＡＵ（配列番号２７）、
（ｃ）ＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＵＵＡＣＧＡＧＡＡＵＵ（配列番号２８）、
（ｄ）ＡＡＡＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＡＵＵＣＡＵＵＣＵ（配列番号２９）、
（ｅ）ＵＵＧＵＧＣＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡＣＧＡＧＡ（配列番号３０）、
（ｆ）ＵＧＵＧＡＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＣＵＡＣＡＵＣＵＡＣ（配列番号３１）、
（ｇ）ＵＵＧＵＧＣＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡ（配列番号３２）、
（ｈ）ＵＧＵＧＡＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＣＵＡＣＡ（配列番号３３）、
（ｉ）ＡＵＵＣＵＣＣＵＡＡＧＡＡＧＣＵＡＵＵ（配列番号３４）、
（ｊ）ＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡＣＧＡＧＡＡＵＵＣＡＵＵＣＵ（配列番号３５）、
（ｋ）ＡＡＡＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＡＵＵＣＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧ（配列番号３６）、
（ｌ）ＡＵＣＵＡＣＵＵＧＵＧＣＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡＣＧＡＧＡＡ（配列番号３７）、
（ｍ）ＵＧＵＧＡＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＣＵＡＣＡＵＣＵＡＵ（配列番号３８）、
（ｎ）（ａ）～（ｍ）の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなり、請求項１から４のいずれか一項に記載のＲＮＡとＲｄＲｐとの結合を阻害することができる、塩基配列、および
（ｏ）（ａ）～（ｍ）のいずれか一の塩基配列と９０％塩基配列同一性を有する配列を含み、請求項１から４のいずれか一項に記載のＲＮＡとＲｄＲｐとの結合を阻害することができる、塩基配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、シュードノット構造を形成する塩基配列を含むＲＮＡに関する。本発明はさらに、このＲＮＡを用いたコロナウイルス感染症の治療剤または予防剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【0002】
日本で承認されている新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療薬のうち、レムデシビルとモルヌピラビルはＲＮＡ合成阻害剤である（非特許文献１）。レムデシビルはアデノシンヌクレオシドのプロドラッグである。生体内で加水分解などを経て生成される活性代謝物であるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の類似体が、ＲＮＡウイルスの複製に必要なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを阻害することで抗ウイルス作用を発揮する（非特許文献１）。モルヌピラビルもプロドラッグであり、Ｎ－ヒドロキシシチジン（ＮＨＣ）に代謝され細胞内に取り込まれた後、活性型であるリボヌクレオシド三リン酸化体（ＮＨＣ－ＴＰ）にリン酸化され、ＮＨＣ－ＴＰがウイルス由来ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによりウイルスＲＮＡに取り込まれた結果、ウイルスゲノムのエラー頻度が増加し、ウイルスの増殖が阻害される（非特許文献２）。すなわちこれら２剤はＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）阻害剤である。ＲｄＲｐは、ＲＮＡウイルスの複製過程を担う重要な酵素であり、ＣＯＶＩＤ－１９治療薬の開発の有用な標的の一つである。しかしながら、両剤ともＣＯＶＩＤ－１９に対する治療効果が十分であるとはいえないものである。
【0003】
コロナウイルスはプラス鎖一本鎖のＲＮＡをウイルスゲノムとして有し、その３′末端非翻訳領域（ＵＴＲ）から（－）鎖ゲノムＲＮＡとサブゲノムＲＮＡが転写される。非特許文献３は、コロナウイルス（－）鎖ＲＮＡ合成の開始に関する仮説的モデルを開示する。この仮説的モデルでは、プライマーゼがシュードノットのループ（ループ１）になる部分と３′末端が形成するステムに結合してプライマーゼが（－）鎖ＲＮＡの５′末端を合成することで、ゲノムの３′末端がループ１から離れてシュードノットが形成され、このシュードノットにＲｄＲｐが結合して（－）鎖が伸長することが提唱されている。しかしながら、コロナウイルスゲノムの３′末端においてシュードノット構造が形成されるかについては実験的に確認されてなかったため、コロナウイルス（－）鎖ＲＮＡの合成開始機構の詳細は分かっていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Ghosh, Arun K et al. “Recent Drug Development and Medicinal Chemistry Approaches for the Treatment of SARS-CoV-2 Infection and COVID-19.” ChemMedChem vol. 17,22 (2022): e202200440. doi:10.1002/cmdc.202200440．
【非特許文献2】Imran M, Kumar Arora M, Asdaq SMB, Khan SA, Alaqel SI, Alshammari MK, Alshehri MM, Alshrari AS, Mateq Ali A, Al-Shammeri AM, Alhazmi BD, Harshan AA, Alam MT, Abida. Discovery, Development, and Patent Trends on Molnupiravir: A Prospective Oral Treatment for COVID-19. Molecules. 2021 Sep 24;26(19):5795. doi: 10.3390/molecules26195795. PMID: 34641339; PMCID: PMC8510125.
【非特許文献3】Zust, R., Miller, T. B., Goebel, S. J., Thiel, V. & Masters, P. S. Genetic interactions between an essential 3' cis-acting RNA pseudoknot, replicase gene products, and the extreme 3' end of the mouse coronavirus genome. J Virol 82, 1214-1228 (2008). https://doi.org:10.1128/JVI.01690-07
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
上記のとおり、ＲｄＲｐは、ＲＮＡウイルスの複製過程を担う重要な酵素であるため、これを標的とするＣＯＶＩＤ－１９治療薬の開発が求められている。コロナウイルスのＲｄＲｐ阻害剤の開発には、（－）鎖ｇＲＮＡの転写開始点であり特異な構造を形成するウイルスゲノムの３′末端の二次構造の詳細を実験的に明らかにし、それをin vitroで再構築する必要がある。
【0006】
よって、本発明の課題は、コロナウイルスのＲｄＲｐまたはプライマーゼが結合する二次構造を形成する塩基配列を含むＲＮＡを提供すること、およびこのＲＮＡを用いたコロナウイルス感染症の治療剤または予防剤のスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の３′ＵＴＲの塩基配列を基にＲＮＡコンストラクトを設計作成し、３′ＵＴＲの３′ＰＫと呼ばれている部分がステムループ構造とシュードノット構造を相互に排他的にとることをＮＭＲにより初めて原子レベルで証明した。Ｐ１ｐｋとＰ２領域によるシュードノット形成に伴い、ステムループ構造から抜け出し、３′末端の配列を含むＰ５ステムが開口することを明らかにした。ゲルシフトアッセイにより、ｎｓｐ７とｎｓｐ８の１対１混合物は、ステムループとシュードノットの両方のコンフォメーションと約２μＭの見かけの親和性で相互作用することが明らかになった。ＮＭＲ解析の結果、ｎｓｐ７とｎｓｐ８の相互作用はステムループ構造においてはＰ５ステムを不安定化させ、シュードノット型は変化させないことがわかった。これらの結果は、シュードノットとｎｓｐ７－ｎｓｐ８複合体の相互作用により、ウイルスｇＲＮＡの３′末端がＲＮＡ合成に適した一本鎖ＲＮＡに変換されることを示唆しており、シュードノットが抗ウイルス薬開発の有用な標的であることを示している。本発明はこの知見に基づくものである。
【0008】
本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］ 配列番号２２に記載の塩基配列、または配列番号２２に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
［２］ 配列番号２１に記載の塩基配列、または配列番号２１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ３つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
［３］ 配列番号２０に記載の塩基配列、または配列番号２０に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
［４］ 配列番号１９に記載の塩基配列、または配列番号１９に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ２つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
［５］ シュードノット構造に加えて、１つのステムループ構造を形成する、［１］に記載のＲＮＡ。
［６］ ［１］に記載のＲＮＡ、並びに［２］から［４］のいずれか一に記載のＲＮＡから選択される１種、２種、または３種のＲＮＡを含む、セット。
［７］ ［１］に記載のＲＮＡとプライマーゼ／ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）との結合を検出するアッセイを使用して、プライマーゼ／ＲｄＲｐのＲＮＡへの結合を阻害する化合物を同定する工程を含む、コロナウイルス感染症の治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
［８］ 核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析により、［１］に記載のＲＮＡについて化合物の結合部位を解析する工程をさらに含む、［７］に記載のスクリーニング方法。
［９］ 同定された化合物の存在下で、［２］から［４］のいずれか一に記載のＲＮＡとプライマーゼ／ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）との結合を分析する工程をさらに含む、［７］に記載のスクリーニング方法。
［１０］ コロナウイルスがアルファコロナウイルス属またはベータコロナウイルス属のウイルスである、［７］に記載のスクリーニング方法。
［１１］ コロナウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、［７］に記載のスクリーニング方法。
［１２］ ［１］から［４］のいずれか一に記載のＲＮＡをコードするＤＮＡ。
［１３］ ［１］から［４］のいずれか一に記載のＲＮＡについてＮＭＲ解析により二次構造の形成を測定する方法。
［１４］ プライマーゼまたはＲｄＲｐのＲＮＡにおける結合部位を特定するための、［１３］に記載の測定方法。
［１５］ ［１］から［４］のいずれか一にＲＮＡをアッセイ溶液中で維持することを含む、シュードノット構造またはステムループ構造の形成方法であって、アッセイ溶液のカリウムイオン濃度がナトリウムイオン濃度よりも高い、方法。
［１６］ ［１］から［４］のいずれか一に記載のＲＮＡの少なくとも一部分に結合して、前記ＲＮＡとプライマーゼ／ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）との結合を阻害する、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
［１７］ 下記（ａ）～（ｏ）からなる群から選択される何れかの塩基配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）を含む、［１６］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド：
（ａ）ＧＧＧＡＡＵＡＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＧＡＡＵ（配列番号２５）、
（ｂ）ＡＡＵＡＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＧＡＡＵ（配列番号２７）、
（ｃ）ＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＵＵＡＣＧＡＧＡＡＵＵ（配列番号２８）、
（ｄ）ＡＡＡＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＡＵＵＣＡＵＵＣＵ（配列番号２９）、
（ｅ）ＵＵＧＵＧＣＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡＣＧＡＧＡ（配列番号３０）、
（ｆ）ＵＧＵＧＡＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＣＵＡＣＡＵＣＵＡＣ（配列番号３１）、
（ｇ）ＵＵＧＵＧＣＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡ（配列番号３２）、
（ｈ）ＵＧＵＧＡＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＣＵＡＣＡ（配列番号３３）、
（ｉ）ＡＵＵＣＵＣＣＵＡＡＧＡＡＧＣＵＡＵＵ（配列番号３４）、
（ｊ）ＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡＣＧＡＧＡＡＵＵＣＡＵＵＣＵ（配列番号３５）、
（ｋ）ＡＡＡＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＡＵＵＣＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧ（配列番号３６）、
（ｌ）ＡＵＣＵＡＣＵＵＧＵＧＣＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡＣＧＡＧＡＡ（配列番号３７）、
（ｍ）ＵＧＵＧＡＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＣＵＡＣＡＵＣＵＡＵ（配列番号３８）、
（ｎ）（ａ）～（ｍ）の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加塩基配列された塩基配列から成り、［１］から［４］のいずれか一に記載のＲＮＡとＲｄＲｐとの結合を阻害することができる、塩基配列、および
（ｏ）（ａ）～（ｍ）のいずれか一の塩基配列と９０％塩基配列同一性を有する配列を含み、［１］から［４］のいずれか一に記載のＲＮＡとＲｄＲｐとの結合を阻害することができる、塩基配列。
［１］ 配列番号２２に記載の塩基配列、または配列番号２２に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
［２］ 配列番号２１に記載の塩基配列、または配列番号２１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ３つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
［３］ 配列番号２０に記載の塩基配列、または配列番号２０に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
［４］ 配列番号１９に記載の塩基配列、または配列番号１９に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ２つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
［５］ シュードノット構造に加えて、１つのステムループ構造を形成する、［１］に記載のＲＮＡ。
［６］ ［１］に記載のＲＮＡ、並びに［２］から［４］のいずれか一に記載のＲＮＡから選択される１種、２種、または３種のＲＮＡを含む、セット。
［７］ ［１］に記載のＲＮＡとプライマーゼ／ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）との結合を検出するアッセイを使用して、プライマーゼ／ＲｄＲｐのＲＮＡへの結合を阻害する化合物を同定する工程を含む、コロナウイルス感染症の治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
［８］ 核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析により、［１］に記載のＲＮＡについて化合物の結合部位を解析する工程をさらに含む、［７］に記載のスクリーニング方法。
［９］ 同定された化合物の存在下で、［２］から［４］のいずれか一に記載のＲＮＡとプライマーゼ／ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）との結合を分析する工程をさらに含む、［７］に記載のスクリーニング方法。
［１０］ コロナウイルスがアルファコロナウイルス属またはベータコロナウイルス属のウイルスである、［７］に記載のスクリーニング方法。
［１１］ コロナウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、［７］に記載のスクリーニング方法。
［１２］ ［１］から［４］のいずれか一に記載のＲＮＡをコードするＤＮＡ。
［１３］ ［１］から［４］のいずれか一に記載のＲＮＡについてＮＭＲ解析により二次構造の形成を測定する方法。
［１４］ プライマーゼまたはＲｄＲｐのＲＮＡにおける結合部位を特定するための、［１３］に記載の測定方法。
［１５］ ［１］から［４］のいずれか一にＲＮＡをアッセイ溶液中で維持することを含む、シュードノット構造またはステムループ構造の形成方法であって、アッセイ溶液のカリウムイオン濃度がナトリウムイオン濃度よりも高い、方法。
［１６］ ［１］から［４］のいずれか一に記載のＲＮＡの少なくとも一部分に結合して、前記ＲＮＡとプライマーゼ／ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）との結合を阻害する、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
［１７］ 下記（ａ）～（ｏ）からなる群から選択される何れかの塩基配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）を含む、［１６］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド：
（ａ）ＧＧＧＡＡＵＡＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＧＡＡＵ（配列番号２５）、
（ｂ）ＡＡＵＡＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＧＡＡＵ（配列番号２７）、
（ｃ）ＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＵＵＡＣＧＡＧＡＡＵＵ（配列番号２８）、
（ｄ）ＡＡＡＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＡＵＵＣＡＵＵＣＵ（配列番号２９）、
（ｅ）ＵＵＧＵＧＣＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡＣＧＡＧＡ（配列番号３０）、
（ｆ）ＵＧＵＧＡＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＣＵＡＣＡＵＣＵＡＣ（配列番号３１）、
（ｇ）ＵＵＧＵＧＣＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡ（配列番号３２）、
（ｈ）ＵＧＵＧＡＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＣＵＡＣＡ（配列番号３３）、
（ｉ）ＡＵＵＣＵＣＣＵＡＡＧＡＡＧＣＵＡＵＵ（配列番号３４）、
（ｊ）ＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡＣＧＡＧＡＡＵＵＣＡＵＵＣＵ（配列番号３５）、
（ｋ）ＡＡＡＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＡＵＵＣＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧ（配列番号３６）、
（ｌ）ＡＵＣＵＡＣＵＵＧＵＧＣＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡＣＧＡＧＡＡ（配列番号３７）、
（ｍ）ＵＧＵＧＡＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＣＵＡＣＡＵＣＵＡＵ（配列番号３８）、
（ｎ）（ａ）～（ｍ）の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加塩基配列された塩基配列から成り、［１］から［４］のいずれか一に記載のＲＮＡとＲｄＲｐとの結合を阻害することができる、塩基配列、および
（ｏ）（ａ）～（ｍ）のいずれか一の塩基配列と９０％塩基配列同一性を有する配列を含み、［１］から［４］のいずれか一に記載のＲＮＡとＲｄＲｐとの結合を阻害することができる、塩基配列。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】（Ａ） ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡと二次構造の模式図。（Ｂ）３′ＰＫ領域の二次構造の模式図。ＢＳＬ：バルジドステムループ、ＨＶＲ：超可変領域、ＯＮＭ：オクタヌクレオチドモチーフ、Ｓ２Ｍ：ステムループＩＩ様モチーフ、３′ＰＫ：ＢＳＬの一部とＢＳＬとＨＶＲ構造の間のステムを含む領域。
【図2】Ｚｕｓｔら（非特許文献３）の提案に基づき、若干の修正を加えたコロナウイルスの仮想的なゲノムＲＮＡ複製開始モデル。（Ａ）３′ＰＫにステムループ構造が形成される。（Ｂ）ｎｓｐ７、ｎｓｐ８、ｎｓｐ９からなるプライマーゼがＰ５ステムに結合する。（Ｃ）プライマーゼは（－）鎖ｇＲＮＡのプライマーを転写する。（Ｄ）プライマーがｇＲＮＡの３′末端にプライミングされ、Ｐ５ステムが対になっていないため、シュードノット構造が形成される。（Ｅ）Ｎｓｐ１２がシュードノット構造とｎｓｐ７－ｎｓｐ８－ｎｓｐ９複合体に結合し、（－）鎖ｇＲＮＡを伸長させる。
【図3】（Ａ）ＳＬ、（Ｂ）ＰＫ、（Ｃ）ＳＬＰ４、（Ｄ）ＰＫＰ４の３′ＰＫ断片の２Ｄ ＮＯＥＳＹスペクトルのイミノプロトン領域と、ＮＭＲに基づく対応する二次構造との比較。図では簡略化のため、塩基番号の最初の２桁（２９ＸＸＸ）は省略した。塗りつぶした丸で示したＮＯＥはＧ６３９－ＵおそらくＵ６３７またはＵ６５０である。アスタリスクで示したクロスピークはＵ６６５とＵ８４６イミノプロトン間の塩基対内ＮＯＥである。Ｕ８４５－★はＵ８４５とＵ６６５またはＵ８４６間のＮＯＥ、Ｕ８４７－★はＵ８４７とＵ６６５またはＵ８４６間のＮＯＥ。
【図4】ｎｓｐ７およびｎｓｐ８との結合について試験した４つのＲＮＡ断片（ＳＬ、ＰＫ、ＳＬＰ４、ＰＫＰ４）のゲル画像。一番下の矢印（ウエルから最も離れたもの）で示したバンドは構造を形成したＲＮＡ、下から二番目の矢印で示したバンドは構造を形成していない（直鎖状）ＲＮＡに対応し、上から二番目と一番目の矢印で示したバンドはそれぞれタンパク質と結合したＲＮＡ、タンパク質と結合したＲＮＡの別のコンフォーマーに対応する。ＲＮＡ断片は、ｎｓｐ８またはｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物の添加により、バンドがシフトすることがわかった。
【図5】ＲＮＡとｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物の複合体形成による構造変化。（Ａ）ＰＫＰ４，ｎｓｐ７，ｎｓｐ８の１：２：２混合物，（Ｂ）ＳＬＰ４，ｎｓｐ７，ｎｓｐ８の１：１：１混合物，（Ｃ）ｎｓｐ７とｎｓｐ８の１：１混合物，（Ｄ）ＰＫＰ４，および（Ｅ）ＳＬＰ４の１Ｄ １Ｈ ＮＭＲスペクトルのイミノプロトン領域。星印で示したタンパク質によるシグナルは、ＰＫＰ４－ｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物でのみ観察された。
【図6-1】ｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物の結合によるＳＬＰ４とＰＫＰ４の構造変化。１Ｈ－１Ｈ ２Ｄ ＮＯＥＳＹ スペクトルのイミノプロトン領域（Ａ）ＳＬＰ４，（Ｂ）ＰＫＰ４，（Ｃ）ＳＬＰ４，ｎｓｐ７，ｎｓｐ８の１：１：１混合物および（Ｄ）ＰＫＰ４，ｎｓｐ７，ｎｓｐ８の１：２：２混合物。
【図6-2】ｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物の結合によるＳＬＰ４とＰＫＰ４の構造変化。（Ｅ）ｎｓｐ７－ｎｓｐ８とＳＬＰ４の結合の模式図。ＳＬＰ４に存在するＰ５ステム領域の解離は、塩基対内ＮＯＥシグナルの欠如によって確認された。（Ｆ）ｎｓｐ７－ｎｓｐ８と結合したＰＫＰ４の二次構造の模式図。ｎｓｐ７－ｎｓｐ８との結合による化学シフトの変化Δδを示す。
【図7】コロナウイルスの改変（－）鎖ゲノムＲＮＡ複製開始仮説モデル。本発明者らにより提案されるモデルである。（Ａ）３′ＰＫにステムループ構造が形成される。（Ｂ）ｎｓｐ７－ｎｓｐ８複合体（図中ではＰｒｉｍａｓｅと記載）がステムループ構造に結合するか、（Ｃ）シュードノット構造に直接結合し、Ｐ５が一本鎖に変換される。（Ｄ）プライマーゼによりＲＮＡプライマーが合成される。（Ｅ）Ｎｓｐ１２がシュードノット構造およびプライマーゼに結合し、（－）鎖ｇＲＮＡを伸長させる。
【図8】Ｐ１の２Ｄ ＮＯＥＳＹスペクトルのイミノプロトン領域と、ＮＭＲに基づく対応する二次構造との比較。図では簡略化のため、塩基番号の最初の２桁（２９ＸＸＸ）は省略した。
【図9】Ｐ２の２Ｄ ＮＯＥＳＹスペクトルのイミノプロトン領域と、ＮＭＲに基づく対応する二次構造との比較。図では簡略化のため、塩基番号の最初の２桁（２９ＸＸＸ）は省略した。
【図10】（Ａ）ＳＬ，（Ｂ）ＳＬＬ，（Ｃ）ＳＬＰ４のイミノプロトン領域。（Ｄ）ＳＬ（Ｅ）ＳＬＬ，（Ｆ）ＳＬＰ４のＮＭＲによる二次構造の模式図。ＳＬＬとＳＬＰ４のＵ２９６５５とＵ２９６５６（Ｐ２ステムに含まれる）に起因するシグナルは、ＳＬに対して著しく低い強度を示した。
【図11】（Ａ）ＰＫ、ＳＬ、ＳＬＰ４、ＰＫＰ４のゲルシフトアッセイ。下から（移動度の早い）順に矢印で、タンパク質と結合していないが構造を形成しているRNA、タンパク質と結合していない直鎖状ＲＮＡ、ＲＮＡ－ｎｓｐ７－ｎｓｐ８複合体を示した。（Ｂ）各ＲＮＡ断片のＨｉｌｌ－Ｌａｎｇｍｕｉｒプロット。ＰＫのＫｄは５．１μＭ、ＳＬは５．５μＭ、ＰＫＰ４は２．５μＭ、ＳＬＰ４は２．３μＭであった。パラメータθ＝１－（［タンパク質と結合していないＲＮＡ］／［ＲＮＡ総量］），［タンパク質と結合していないＲＮＡ］／［ＲＮＡ総量］はタンパク質とＲＮＡを混合したサンプルの各タンパク質と結合していないが構造を形成しているＲＮＡ のバンドとＲＮＡのみの構造を形成しているＲＮＡのバンドの体積比から求めた。Ｐ４とＬ４／５を持つ断片は、他の断片よりも親和性が高いことがわかった。また、全ての断片がｎ＞１を示し、ｎｓｐ７－ｎｓｐ８が正の協同性を示すことが示された。
【図12】（Ａ）ｎｓｐ７－ｎｓｐ８、（Ｂ）ＰＫＰ４－ｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物、（Ｃ）ＳＬＰ４－ｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物の１Ｈ－１Ｈ ２Ｄ ＮＯＥＳＹスペクトルのタンパク質アミドプロトン領域。ＰＫＰ４やＳＬＰ４の添加により、ＲＮＡ－タンパク質複合体による新たなＮＯＥシグナルが多数観測された。ＲＮＡ－タンパク質複合体のＮＯＥパターンは、結合するＲＮＡの構造によって部分的に異なることがわかった。
【図13】実施例４のアンチセンスＲＮＡを用いた実験の電気泳動のゲル写真である。
【図14】実施例５のアンチセンスＲＮＡを用いた実験の電気泳動のゲル写真である。
【図15】アンチセンスＲＮＡ＃２（配列番号２８）、＃３（配列番号２９）、＃４（配列番号３０）および＃５（配列番号３１）のＳＬＰ４およびＰＫＰ４への結合位置を示す概要図である。
【図16】アンチセンスＲＮＡ＃８（配列番号３４）、＃９（配列番号３５）、＃１０（配列番号３６）および＃１１（配列番号３７）のＳＬＰ４およびＰＫＰ４への結合位置を示す概要図である。
【図17】実施例６のアンチセンスＲＮＡを用いた実験の電気泳動のゲル写真である。
【図18】実施例６における、結合していないＲＮＡのバンドボリューム比を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0010】
以下に記載する本発明の説明は、代表的な実施形態や具体例に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に限定されるものではない。なお、本明細書において「～」を用いて表される数値範囲は「～」の前後に記載される数値を下限値および上限値として含む範囲を意味する。
【0011】
本明細書で使用する略語の説明
ＤＮＡ:デオキシリボ核酸
ＤＴＴ：ジチオトレイトール
ＲｄＲｐ:ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ
３′ＰＫ:３′ＵＴＲのシュードノット領域
ｇＲＮＡ:ゲノムＲＮＡ
ＮＭＲ:核磁気共鳴
ＮＯＥ:核オーバーハウザー効果
ｎｓｐ:非構造タンパク質
ｎｔ:ヌクレオチド
ＰＫ:シュードノット
ＲＮＡ：リボ核酸
ｓｇＲＮＡ:サブゲノムＲＮＡ
ＵＴＲ:非翻訳領域
ＤＮＡ:デオキシリボ核酸
ＤＴＴ：ジチオトレイトール
ＲｄＲｐ:ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ
３′ＰＫ:３′ＵＴＲのシュードノット領域
ｇＲＮＡ:ゲノムＲＮＡ
ＮＭＲ:核磁気共鳴
ＮＯＥ:核オーバーハウザー効果
ｎｓｐ:非構造タンパク質
ｎｔ:ヌクレオチド
ＰＫ:シュードノット
ＲＮＡ：リボ核酸
ｓｇＲＮＡ:サブゲノムＲＮＡ
ＵＴＲ:非翻訳領域
【0012】
本明細書において、核酸は、５′末端から３′末端に示される。
本明細書において、ＲＮＡにおける塩基位置は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１の全ゲノム（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｃｏｄｅ ＮＣ＿０４５５１２．２、配列番号２６）を基準として、（＋）鎖の５′末端から数えた位置を指す。
本明細書において、ＲＮＡにおける塩基位置は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１の全ゲノム（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｃｏｄｅ ＮＣ＿０４５５１２．２、配列番号２６）を基準として、（＋）鎖の５′末端から数えた位置を指す。
【0013】
本明細書において、「ＲＮＡを示す４種類の文字のうち一つ（Ａ，Ｇ，ＣまたはＵ）＋数字」の記載は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列（配列番号２６）の５′末端からの位置の塩基を示す。例えば「Ｕ２９６０９」は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の５′末端から２９６０９番目の位置のＵ（ウラシル）を指す。図中では、塩基位置を表す数字の最初の２桁（２９ＸＸＸ）を省略した。
【0014】
本明細書において、「上流」とは、所与の位置よりも（＋）鎖の５′末端（または（－）鎖の３′末端）に近い位置を指す。「下流」とは、所与の位置よりも（＋）鎖の３′末端（または（－）鎖の５′末端）に近い位置を指す。
【0015】
本明細書において、３′ＰＫ領域は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１のゲノムＲＮＡの塩基位置２９６１０から２９６５６の範囲である。
シュードノット（ｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔ）構造は、少なくとも２つのステムループ構造を含む核酸の二次構造で、一方のステムの片側を形成する部分塩基配列が他方のステムを形成する部分塩基配列の間に位置している。
本明細書において、Ｐ１、Ｐ１ｐｋ、Ｐ２、Ｐ４およびＰ５は、ステムループ構造のステム部分を指す。Ｐ１ステムがシュードノットに含まれる場合はＰ１ｐｋと記載する。
シュードノット（ｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔ）構造は、少なくとも２つのステムループ構造を含む核酸の二次構造で、一方のステムの片側を形成する部分塩基配列が他方のステムを形成する部分塩基配列の間に位置している。
本明細書において、Ｐ１、Ｐ１ｐｋ、Ｐ２、Ｐ４およびＰ５は、ステムループ構造のステム部分を指す。Ｐ１ステムがシュードノットに含まれる場合はＰ１ｐｋと記載する。
【0016】
本明細書において、配列同一性は、比較する２本の塩基配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならばギャップを導入した後、２本の塩基配列間で同一である塩基のパーセントとして定義される。塩基配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより決定することができる。ＤＮＡとＲＮＡと配列解析では、ＲＮＡのＵをＴに変換してアライメントをすることができる。
【0017】
本明細書中の「１もしくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【0018】
新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）を引き起こすＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのゲノムは約３０ｋｎｔの長さであり、ゲノムの５′末端と３′末端にはそれぞれ約２５０ｎｔと約３４０ｎｔの非翻訳領域（ＵＴＲ）が存在する（図１）（文献１、文献リストは本明細書の末尾に示す。以下同じ）。ウイルスゲノムおよびサブゲノムＲＮＡの転写機構については、いくつかの仮説が提唱されている（文献２および３）。いずれにしろ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの（＋）鎖ゲノムＲＮＡの３′末端から（－）鎖ゲノムＲＮＡとサブゲノムＲＮＡが転写される。３′ＵＴＲは非コードＲＮＡであり、ウイルスゲノムＲＮＡの翻訳や転写に不可欠な役割を果たすことが知られている（文献４および５）。３′ＵＴＲには、バルジドステムループ（ＢＳＬ、図１Ｂ）と呼ばれる１つのステムループと、超可変領域（ＨＶＲ、図１Ｂ）、オクタヌクレオチドモチーフ（ＯＮＭ、図１Ｂ）、ステムループＩＩ様モチーフ（Ｓ２Ｍ、図１Ｂ）などの大きく分岐したステムループを含む領域がある。ＢＳＬの一部とＢＳＬとＨＶＲ構造の間のステムを含む領域（３′ＰＫ、図１Ｂ）は、シュードノット構造を形成していると提案されている（文献６）。この領域は、ウイルスゲノムの複製を制御する重要な役割を果たすと広く信じられている（文献５、６、７）。ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶ）の間で高度に保存されている（文献９および１０）。
【0019】
ゲノム５′末端のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）１ａｂにコードされる非構造タンパク質（ｎｓｐ）７～１６は、ウイルスゲノムの複製に主要な役割を果たす。ゲノムＲＮＡは、ｎｓｐ１２とも呼ばれるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）と補因子タンパク質ｎｓｐ７およびｎｓｐ８からなる複製転写複合体（ｎｓｐ７－ｎｓｐ８－ｎｓｐ１２）により転写され、ゲノムＲＮＡは複製される（文献１１－１４）。ｎｓｐ８もＲＮＡポリメラーゼ活性を持つことが示唆されている（文献１５）。ｎｓｐ７－ｎｓｐ８複合体がプライマーゼとして働くことが示唆されている（文献１６）。また、ＲｄＲｐはｎｓｐ９やｎｓｐ１３などの他のアクセサリータンパク質と結合する（文献１７および１８）。Ｎｓｐ９は二量体を形成してｎｓｐ８と結合し、一本鎖ＲＮＡと非特異的に結合している（文献１９－２３）。最近、ｎｓｐ９はｎｓｐ１２と複合体となってＲＮＡのキャッピングを仲介することが明らかにされた（文献１７）。Ｎｓｐ１３は２量体を形成し、ヘリカーゼとして働き、ｎｓｐ８およびｎｓｐ１２と結合する（文献１８）。
【0020】
Ｚｕｓｔらが提唱した（－）鎖ｇＲＮＡの転写開始のモデルとして広く採用されているものは、以下のように記述されている（文献５）（図２）。まず、ｎｓｐ７、ｎｓｐ８とｎｓｐ９からなるプライマーゼ複合体が３′ＰＫのステムループ構造に結合し、低分子ＲＮＡプライマーを転写する。次に、３′ＰＫはこの構造をシュードノット型に変換する。そして、シュードノット構造が形成されると、ｎｓｐ１２がプライマーゼ－３′ＰＫ複合体中のシュードノット構造のＲＮＡに結合し、ウイルスｇＲＮＡの転写を開始することが提案されている。３′ＰＫ領域のシュードノット塩基対の変異は、ウイルスの複製に致死的であった（文献４および２４）。ＳＨＡＰＥ－ＭａＰｓｅｑおよびＤＭＳ－ＭａＰｓｅｑによるｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｒｉｏｎ（細胞外においてウイルスが粒子構造をとった状態)の全ゲノムまたは部分ゲノムＲＮＡ解析により、３′ＵＴＲの二次構造が明らかになった（文献８，２５－２９）。これらの報告は、３′ＰＫ領域の二次構造がステムループであることを示唆しているが、シュードノット構造の形成を支持する証拠はほとんどない（文献８，２５－２９）。サーマルアンフォールディングプロファイリング実験とＳＰＬＡＳＹアッセイにより、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２では３′ＰＫにおけるシュードノット構造の形成がわずかに安定であることが間接的に示唆された（文献３０および３１）。さらに、最近のＮＭＲによる二次構造の研究では、３′ＰＫ領域にはシュードノットではなくステムループが存在することが報告されている（文献３２）。このように、従来、シュードノット構造の実験的な検出は困難であった。
【0021】
一方、本明細書において、本発明者らは実験からウイルスｇＲＮＡの転写開始に関与するタンパク質が３′ＰＫ領域に結合する時にシュードノット構造を形成することを示した。従来シュードノット構造の検出が困難であったのは、シュードノット構造の形成が転写開始時のみということが理由の一つであったと考えられる。本発明者らは、３′ＰＫがシュードノットとステムループの両方の二次構造を形成できることを、一方の構造を安定化するように設計したＲＮＡコンストラクトのＮＭＲ分光測定によって初めて実験的に証明した。２つの二次構造の比較から、３′末端の配列を含むＰ５ステムはステムループ構造でのみ形成され、シュードノット構造では形成されないことが示された。一方、Ｐ２ステムはどちらの構造にも存在し、２つの構造の間にはわずかな違いしか見られなかった。このように、ステムループ構造からシュードノット構造への構造転換により、プライマーゼは３′末端（＋）鎖一本鎖配列を転写することができることが示された。さらに、ステムループ型とシュードノット型とｎｓｐ７－ｎｓｐ８プライマーゼとの原子レベルでの相互作用と、その結果生じるプライマーゼと結合していない状態からプライマーゼ結合状態への構造変化についても検討した。ｎｓｐ７とｎｓｐ８の１：１混合タンパク質は、ステムループとシュードノット構造の両方と相互作用した。ステムループ構造のイミノプロトン信号解析の結果、Ｐ５ステムはｎｓｐ７とｎｓｐ８の結合により不安定化することがわかった。一方、シュードノットＲＮＡはｎｓｐ７とｎｓｐ８の結合後もその二次構造をほぼ維持していた。このことから、ステムループ構造の３′ＰＫにｎｓｐ７－ｎｓｐ８複合体が結合することで、ｇＲＮＡの３′末端が一本鎖ＲＮＡに変化していることが示唆された。また、ｎｓｐ７とｎｓｐ８の主鎖アミドプロトンのＮＭＲ信号は、タンパク質－ＳＬＰ４混合物中の信号と同じ化学シフトを示したが、いくつかの信号はＲＮＡ構造がステムループかシュードノットかによって顕著に異なる化学シフトを示した。これらの結果は、ｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合タンパク質のＲＮＡへの結合様式が、ＲＮＡの構造に一部依存していることを示唆するものであった。
【0022】
これらの結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのゲノム複製の初期過程における仮説的モデルに強い実験的根拠を与えるものである。プライマーゼ複合体の主要構成要素であるｎｓｐ７とｎｓｐ８が結合することで、ウイルスｇＲＮＡの３′末端に配置されたステムループ構造のＰ５ステムが一本鎖に誘導された。また、ｎｓｐ７－ｎｓｐ８がＲＮＡプライマーの合成開始前でも、シュードノット構造が形成される可能性が示され、ＲＮＡ複製の初期過程における既存の機構モデルの経路が変化する可能性が示された。
【0023】
１）ＰＫＰ４
本発明は、「ＰＫＰ４」と名付けた、以下のＲＮＡに関する。
配列番号２２に記載の塩基配列、または配列番号２２に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
CUUGUGCAGAAUGAAUUCUCGUAACUACAUAGCACAAGUAGAUGUAGUUAACUUUAAUCUCACAGCAAUGUGAUUUUAAUAGCUUCUUAGGAGAAU （配列番号２２）
配列番号２２に示す塩基配列を有する設計された「ＰＫＰ４」は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６０８から２９６７１に対応するＲＮＡ断片、および位置２９８４０から２９８６７に対応するＲＮＡ断片をＧＣＡＡリンカーで連結したＲＮＡコンストラクトである。「ＰＫＰ４」は、３′ＵＴＲに由来する複数の部分を連結したＲＮＡコンストラクトであり、天然に存在しない。ＧＣＡＡリンカーは安定的にループを形成する。
本発明は、「ＰＫＰ４」と名付けた、以下のＲＮＡに関する。
配列番号２２に記載の塩基配列、または配列番号２２に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
CUUGUGCAGAAUGAAUUCUCGUAACUACAUAGCACAAGUAGAUGUAGUUAACUUUAAUCUCACAGCAAUGUGAUUUUAAUAGCUUCUUAGGAGAAU （配列番号２２）
配列番号２２に示す塩基配列を有する設計された「ＰＫＰ４」は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６０８から２９６７１に対応するＲＮＡ断片、および位置２９８４０から２９８６７に対応するＲＮＡ断片をＧＣＡＡリンカーで連結したＲＮＡコンストラクトである。「ＰＫＰ４」は、３′ＵＴＲに由来する複数の部分を連結したＲＮＡコンストラクトであり、天然に存在しない。ＧＣＡＡリンカーは安定的にループを形成する。
【0024】
配列番号２２に記載の塩基配列の５′末端から１番目から６１番目の塩基の部分が、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６０８から２９６７０に対応し、配列番号２２に記載の塩基配列の５′末端から６９番目から９６番目の塩基の部分が、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９８４０から２９８６７に対応する。
【0025】
「ＰＫＰ４」は、Ｐ１ｐｋステム構造（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６１０から２９６１４部分および位置２９６４３から２９６３９部分が形成する塩基対を少なくとも含む）、
Ｐ２ステム構造（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６３０から２９６３５部分および位置２９６５１から２９６５６部分が形成する塩基対を少なくとも含む）、および
Ｐ４ステム構造（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６６３から２９６７０部分および位置２９８４１から２９８４８部分が形成する塩基対を少なくとも含む）を形成することができる。
Ｐ２ステム構造（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６３０から２９６３５部分および位置２９６５１から２９６５６部分が形成する塩基対を少なくとも含む）、および
Ｐ４ステム構造（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６６３から２９６７０部分および位置２９８４１から２９８４８部分が形成する塩基対を少なくとも含む）を形成することができる。
【0026】
ＰＫＰ４は、シュードノット構造を形成することができる。シュードノット構造は、Ｐ１ｐｋステム構造とＰ２ステム構造を含む。ＰＫＰ４は、シュードノット構造に含まれるステム構造のほかに、１つのステムループ構造（Ｐ４）を形成することができる。ＰＫＰ４はＰ５ステム構造（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６２３から２９６２６部分および２９８６３から２９８６６部分が形成する塩基対を少なくとも含む）を形成しない。ＰＫＰ４は、ｎｓｐ８、またはｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物と複合体を形成することができる。一態様では、ＰＫＰ４は、ｎｓｐ８、またはｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物と複合体を形成することができ、それによりシュードノット構造が形成され得る。別の態様では、ＰＫＰ４は、シュードノット構造が形成することができ、そのシュードノット構造にｎｓｐ８、またはｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物が結合することができる。一方で、ＰＫＰ４は、ｎｓｐ８、またはｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物が十分に存在する場合に、Ｐ５ステム構造（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６２３から２９６２６部分および２９８６３から２９８６６部分が形成する塩基対を少なくとも含む）を形成しない。
【0027】
本発明の一実施態様において、プライマーゼおよび／またはＲｄＲＰが、ＰＫＰ４において、シュードノット構造の少なくとも一部に結合する。本発明の一実施態様において、プライマーゼおよび／またはＲｄＲＰが、ＰＫＰ４において、位置Ａ２９８５０からＣ２９８５４に対応する領域（配列番号２２に記載の塩基配列の５′末端から７９番目から８３番目の塩基の部分）の少なくとも一部に結合する。本発明の一実施態様において、プライマーゼおよび／またはＲｄＲＰが、ＰＫＰ４において、Ｐ４ステムの少なくとも一部に結合する。本発明の一実施態様において、プライマーゼおよび／またはＲｄＲＰが、ＰＫＰ４において、シュードノット構造の少なくとも一部、位置Ａ２９８５０からＣ２９８５４に対応する領域（配列番号２２に記載の塩基配列の５′末端から７９番目から８３番目の塩基の部分）の少なくとも一部および／またはＰ４ステムの少なくとも一部に結合する。本発明の一実施態様において、プライマーゼおよび／またはＲｄＲＰが、ＰＫＰ４において、シュードノット構造の少なくとも一部、位置Ａ２９８５０からＣ２９８５４に対応する領域（配列番号２２に記載の塩基配列の５′末端から７９番目から８３番目の塩基の部分）の少なくとも一部および／またはＰ４ステムの少なくとも一部に結合し、かつＰ５ステム構造が形成されない。
【0028】
ＰＫＰ４のシュードノット構造を含む二次構造、およびＰＫＰ４とタンパク質（ｎｓｐ８、またはｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物）の相互作用は、ＮＭＲ法、ゲルシフトアッセイ、ＡＬＰＨＡ ｓｃｒｅｅｎ、質量分析法、Ｂｉａｃｏｒｅ、等温滴定型カロリメトリー、等により測定することができる。ＲＮＡの二次構造分析やＲＮＡとタンパク質の相互作用分析に用いるアッセイ溶液は、塩、緩衝液、ＲＮＡａｓｅ阻害剤を含み得るがこれらに限定されない。ＲＮＡの二次構造測定や、ＲＮＡとタンパク質の相互作用の測定は、ｎｓｐ８またはｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物の存在下で実施することができる。ＲＮＡとｎｓｐ８は、１：１または１：２以上のモル比で混合することができる。ＲＮＡとｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物は、１：１または１：２以上のモル比で混合することができ、ここでｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物はｎｓｐ７とｎｓｐ８の等モル混合物であることができる。
【0029】
本発明の特定の実施態様では、ＲＮＡの二次構造分析やＲＮＡとタンパク質の相互作用分析は、ｎｓｐ８、またはｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物に加えて、ｎｓｐ１２（ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ））の存在下で実施することができ、さらにｎｓｐ９やｎｓｐ１３を加えることができる。
【0030】
アッセイ溶液のイオン強度は細胞内（細胞質）のイオン環境に基づいて設定することができる。細胞内液のカリウムイオン濃度は約１４０ｍＭ、ナトリウムイオン濃度は約１０ｍＭであり、カリウムイオン濃度がナトリウムイオン濃度よりも高い。本発明のアッセイ溶液中のカリウムイオンの塩濃度を９０～１９０ｍＭの範囲、１００～１８０ｍＭの範囲、１１０～１７０ｍＭの範囲、または１２０～６０ｍＭの範囲とし、ナトリウムイオンの塩濃度を１～５０ｍＭの範囲、３～３０の範囲、または５～２０ｍＭのとすることができる。アッセイ溶液は、マグネシウムイオンを更に含むことができる。マグネシウムイオンの塩濃度は、０．１ｍＭ～５ｍＭの範囲、０．１ｍＭ～３ｍＭの範囲、または０．１ｍＭ～１ｍＭの範囲であることができる。アッセイ溶液のｐＨは５．５～９の範囲で設定することができる。
【0031】
本発明は、配列番号２２に記載の塩基配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含むＲＮＡに関する。さらに本発明は、配列番号２２に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含むＲＮＡに関する。配列番号２２に記載の塩基配列において許容される変異（置換、挿入、欠失および／または付加）は、配列番号２２の塩基配列を含むＲＮＡ「ＰＫＰ４」が形成する２次構造（シュードノットを含む構造）を壊さないものである。本発明の一実施形態では、シュードノット構造が形成されることは、ｎｓｐ８またはｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物の存在下、上記アッセイ溶液中でＮＭＲ法により測定することができる。
【0032】
「ＰＫＰ４」は、配列番号２２に記載の塩基配列の５′末端または３′末端に、ＲＮＡコンストラクト解析用、合成用等のヌクレオチドを付加することができる。付加されるヌクレオチドは、１０ｎｔ以下、９ｎｔ以下、８ｎｔ以下、７ｎｔ以下、６ｎｔ以下、５ｎｔ以下、４ｎｔ以下、３ｎｔ以下、２ｎｔ以下、または１ｎｔである。本発明の一実施態様において、「ＰＫＰ４」は、配列番号２２に記載の塩基配列の５′末端に、ＲＮＡコンストラクトの製造の際に追加される１～３個のＧを含むことができる。
【0033】
本発明の一実施態様では、「ＰＫＰ４」の５′末端は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６０８より上流の配列に対応するヌクレオチドを含むことができる。例えば、「ＰＫＰ４」は、配列番号２２に記載の塩基配列の５′末端に、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６０７から上流の位置２９５８７に連続して対応する長さ１～１０ｎｔのヌクレオチドをさらに含むことができる。
【0034】
本発明の上記ＲＮＡは、限定されないが、特にループ構造を形成する部分、およびステム構造を形成しない部分の塩基配列に変異、すなわち置換、挿入、欠失および／または付加を有することができる。ただし、変異はシュードノット構造の形成を阻害するものではない。例えば、上記ＲＮＡは、配列番号２２に記載の塩基配列の５′末端からの位置１、位置２、位置８から位置２２、位置２９から位置３１、位置３７から位置４３、位置５０から位置５５、位置６４から位置６９、位置７８から位置９６の塩基に変異を有することができる。さらに、本発明の一態様では、ステム構造を形成する部分に変異があってよい。ステム構造を形成する部分に存在する変異は、塩基対を形成する相手塩基とともに対で生じることができ、変異の結果、Ｃ－Ｇ、Ａ－Ｕ、またはＵ－Ｇ塩基対のいずれかを生じ得る。例えば、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株のＣ２９６３５－Ｇ２９６５１の塩基対は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の一部の変異株およびベータコロナウイルス属の他種では、Ｕ２９６３５－Ａ２９６５１、Ａ２９６３５－Ｕ２９６５１、またはＵ２９６３５－Ｇ２９６５１の塩基対に変化することが報告されている（文献４４）。同様に、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株のＵ２９６３７－Ａ２９６４９は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の一部の変異株あるいは他のベータコロナウイルス属の他種では、Ｃ２９６３７－Ｕ２９６４９、Ｃ２９６３７－Ｇ２９６４９の塩基対に変化することが報告されている。さらに、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株のＡ２９６３１―Ｕ２９６５５は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の一部の変異株およびベータコロナウイルス属の他種では、Ａ２９６３１―Ｕ２９６５５の塩基対に変化することが報告されている。よって、「ＰＫＰ４」ＲＮＡもこれらに相当する変異を有することができると考えられる。例えば、「ＰＫＰ４」ＲＮＡは、配列番号２２に記載の塩基配列の５′末端から数えた位置３から７、２２から３０、３２から３６、４２から５０、５６から６３、７０から７７に変異を有することができ、特に変異は以下の塩基対を形成する相手塩基とともに対で生じ得る：位置３と３６、位置４と３５、位置５と３４、位置６と３３、位置７と３２；位置２２と５０、位置２３と４９、位置２４と４８、位置２５と４７、位置２６と４６、位置２７と４５、位置２８と４４、位置２９と４３、位置３０と４２；位置５６と７７、位置５７と７６、位置５８と７５、位置５９と７４、位置６０と７３、位置６１と７２、位置６２と７１、位置６３と７０。
【0035】
本発明の一実施態様では、配列番号２２に記載の塩基配列、または配列番号２２に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡは、プライマーゼおよび／またはＲｄＲｐの前記ＲＮＡへの結合を阻害する化合物を同定する方法、および／またはコロナウイルス感染症の治療剤または予防剤をスクリーニングする方法に用いることができる。
【0036】
２）ＳＬＰ４
本発明は、「ＳＬＰ４」と名付けた、以下のＲＮＡに関する。
配列番号２１に記載の塩基配列、または配列番号２１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ３つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
AUUCUCGUAACUACAUAGCACAAGUAGAUGUAGUUAACUUUAAUCUCACAGCAAUGUGAUUUUAAUAGCUUCUUAGGAGAAU （配列番号２１）
本発明は、「ＳＬＰ４」と名付けた、以下のＲＮＡに関する。
配列番号２１に記載の塩基配列、または配列番号２１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ３つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
AUUCUCGUAACUACAUAGCACAAGUAGAUGUAGUUAACUUUAAUCUCACAGCAAUGUGAUUUUAAUAGCUUCUUAGGAGAAU （配列番号２１）
【0037】
配列番号２１に示す塩基配列を有する設計されたＲＮＡの「ＳＬＰ４」は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６２２から２９６７１に対応するＲＮＡ断片、および位置２９８４０から２９８６７に対応するＲＮＡ断片を含む、ＲＮＡコンストラクトである。「ＳＬＰ４」は、３′ＵＴＲに由来する複数の部分を連結したＲＮＡコンストラクトであり、天然に存在しない。
【0038】
配列番号２１に記載の塩基配列の５′末端から数えて１番目から５０番目の塩基の部分が、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６２２から２９６７１に対応し、配列番号２１に記載の塩基配列の５′末端から５５番目から８２番目の塩基の部分が、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９８４０から２９８６７に対応する。
【0039】
「ＳＬＰ４」は、Ｐ２ステム構造（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６３０から２９６３５部分および２９６５１から２９６５６部分が形成する塩基対）、
Ｐ４ステム構造（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６６３から２９６７０部分および２９８４１から２９８４８部分が形成する塩基対を少なくとも含む）、および
Ｐ５ステム構造（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６２３から２９６２６部分および２９８６３から２９８６６部分が形成する塩基対を少なくとも含む）を形成することができる。
Ｐ４ステム構造（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６６３から２９６７０部分および２９８４１から２９８４８部分が形成する塩基対を少なくとも含む）、および
Ｐ５ステム構造（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６２３から２９６２６部分および２９８６３から２９８６６部分が形成する塩基対を少なくとも含む）を形成することができる。
【0040】
ＳＬＰ４は、ｎｓｐ８、またはｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物と複合体を形成することができる。ＳＬＰ４の二次構造や、ＳＬＰ４とｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物との相互作用は、ＮＭＲ法、ゲルシフトアッセイ等により測定することができる。ＲＮＡとタンパク質の相互作用分析に用いるアッセイ溶液は、塩、緩衝液、ＲＮＡａｓｅ阻害剤を含み得るがこれらに限定されない。
【0041】
本発明は、配列番号２１に記載の塩基配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の塩基配列同一性を有し且つ３つのステム構造を形成する塩基配列を含むＲＮＡに関する。さらに本発明は、配列番号２１に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有し且つ３つのステム構造を形成す塩基配列を含むＲＮＡに関する。配列番号２１に記載の塩基配列において許容される変異（置換、挿入、欠失および／または付加）は、配列番号２１の塩基配列を含むＲＮＡ「ＳＬＰ４」が形成する２次構造（Ｐ２、Ｐ４およびＰ５を含む構造）を壊さないものである。本発明の一実施形態では、Ｐ２、Ｐ４およびＰ５を含む構造が形成されることは、ｎｓｐ８またはｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物の存在下、上記アッセイ溶液中でＮＭＲ法により測定することができる。
【0042】
「ＳＬＰ４」は、配列番号２１に記載の塩基配列の５′末端または３′末端に、ＲＮＡコンストラクト解析用、合成用等のヌクレオチドを付加することができる。付加されるヌクレオチドは、１０ｎｔ以下、９ｎｔ以下、８ｎｔ以下、７ｎｔ以下、６ｎｔ以下、５ｎｔ以下、４ｎｔ以下、３ｎｔ以下、２ｎｔ以下、または１ｎｔである。本発明の一実施態様において、「ＳＬＰ４」は、配列番号２１に記載の塩基配列の５′末端に、ＲＮＡコンストラクトの製造の際に追加される１～３個のＧを含むことができる。
【0043】
本発明の上記ＲＮＡは、限定されないが、特にループ構造を形成する部分、およびステム構造を形成しない部分の塩基配列に変異、すなわち置換、挿入、欠失および／または付加を有することができる。ただし、変異はＰ２、Ｐ４およびＰ５を含む構造の形成を阻害するものではない。例えば、上記ＲＮＡは、配列番号２１に記載の塩基配列の５′末端から位置１、位置１６から２８、位置３７から４１、位置５０から５５、位置６４から７７、位置８２の塩基に変異を有することができる。さらに、本発明の一態様では、ステム構造を形成する部分に変異があってよい。ステム構造を形成する部分に存在する変異は、塩基対を形成する相手塩基とともに対で生じ得ることができ、変異の結果Ｃ－Ｇ、Ａ－Ｕ、またはＵ－Ｇ塩基対のいずれかを生じ得る。例えば、上記ＲＮＡは、配列番号２１に記載の塩基配列の５′末端から数えた位置２から５、位置１１から１４、位置３０から３３、位置４２から４９、位置５６から６３、位置７８から８１に変異を有することができ、特に変異は以下の塩基対を形成する相手塩基とともに対で生じ得る：位置３と８０、位置４と７９、位置５と７８；位置１１と３３、位置１２と３２、位置１３と３１、位置１４と３０；位置４２と６３、位置４３と６２、位置４４と６１、位置４５と６０、位置４６と５９、位置４７と５８、位置４８と５７、位置４９と５６。
【0044】
本発明の一実施態様では、配列番号２１に記載の塩基配列、または配列番号２１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ３つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡは、プライマーゼおよび／またはＲｄＲｐの前記ＲＮＡへの結合を阻害する化合物を同定する方法、および／またはコロナウイルス感染症の治療剤または予防剤をスクリーニングする方法に用いることができる。
【0045】
３）ＰＫ
本発明は、「ＰＫ」と名付けた、以下のＲＮＡに関する。
配列番号２０に記載の塩基配列、または配列番号２０に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
UCUUGUGCAGAAUGAAUUCUCGUAACUACAUAGCACAAGUAGAUGUAGUUA （配列番号２０）
配列番号２０に示す塩基配列を有する設計されたＲＮＡの「ＰＫ」は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６０７から２９６５７に対応するＲＮＡ断片を含む。
本発明は、「ＰＫ」と名付けた、以下のＲＮＡに関する。
配列番号２０に記載の塩基配列、または配列番号２０に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
UCUUGUGCAGAAUGAAUUCUCGUAACUACAUAGCACAAGUAGAUGUAGUUA （配列番号２０）
配列番号２０に示す塩基配列を有する設計されたＲＮＡの「ＰＫ」は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６０７から２９６５７に対応するＲＮＡ断片を含む。
【0046】
配列番号２０に記載の塩基配列の５′末端から１番目から５１番目の塩基の部分が、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６０７から２９６５７に対応する。本発明の一実施態様において、「ＰＫ」は、配列番号２０に記載の塩基配列の５′末端に、ＲＮＡ合成の際に追加される１～３個のＧ（例えば、ＧＧＧ）を含むことができる。
【0047】
「ＰＫ」は、Ｐ１ｐｋステム構造（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６１０から２９６１４部分および２９６４３から２９６３９部分が形成する塩基対を少なくとも含む）、
Ｐ２ステム構造（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６３０から２９６３５部分および２９６５１から２９６５６部分が形成する塩基対を少なくとも含む）を形成することができる。
Ｐ２ステム構造（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６３０から２９６３５部分および２９６５１から２９６５６部分が形成する塩基対を少なくとも含む）を形成することができる。
【0048】
ＰＫは、シュードノット構造を形成することができる。シュードノット構造は、Ｐ１ｐｋステム構造とＰ２ステム構造を含む。ＰＫは、ｎｓｐ８、またはｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物と複合体を形成することができる。一態様では、ＰＫは、ｎｓｐ８、またはｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物と複合体を形成することができ、それによりシュードノット構造が形成され得る。別の態様では、ＰＫＰ４は、シュードノット構造が形成することができ、そのシュードノット構造にｎｓｐ８、またはｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物が結合することができる。
【0049】
本発明は、配列番号２０に記載の塩基配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含むＲＮＡに関する。さらに本発明は、配列番号２０に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含むＲＮＡに関する。配列番号２０に記載の塩基配列において許容される変異（置換、挿入、欠失および／または付加）は、配列番号２０の塩基配列を含むＲＮＡ「ＰＫ」が形成する２次構造（シュードノットを含む構造）を壊さないものである。本発明の一実施形態では、シュードノット構造が形成されることは、ｎｓｐ８またはｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物の存在下、上記アッセイ溶液中でＮＭＲ法により測定することができる。
【0050】
「ＰＫ」は、配列番号２０に記載の塩基配列の５′末端または３′末端に、ＲＮＡコンストラクト解析用、合成用等のヌクレオチドを付加することができる。付加されるヌクレオチドは、１０ｎｔ以下、９ｎｔ以下、８ｎｔ以下、７ｎｔ以下、６ｎｔ以下、５ｎｔ以下、４ｎｔ以下、３ｎｔ以下、２ｎｔ以下、または１ｎｔである。本発明の一実施態様において、「ＰＫ」は、配列番号２０に記載の塩基配列の５′末端に、ＲＮＡコンストラクトの製造の際に追加される１～３個のＧ（例えば、ＧＧＧ）を含むことができる。
【0051】
本発明の一実施態様では、「ＰＫ」の５′末端は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６０７より上流の配列に対応するヌクレオチドを含むことができる。例えば、「ＰＫ」は、配列番号２０に記載の塩基配列の５′末端に、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６０６から上流の位置２９５８６に連続して対応する長さ１～１０ｎｔのヌクレオチドをさらに含むことができる。
【0052】
本発明の一実施態様では、「ＰＫ」の３′末端は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６５７より下流の配列に対応するヌクレオチドを含むことができる。例えば、「ＰＫ」は、配列番号２０に記載の塩基配列の３′末端に、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６５８から上流の位置２９６６７に連続して対応する長さ１～１０ｎｔのヌクレオチドをさらに含むことができる。
【0053】
本発明の上記ＲＮＡは、限定されないが、特にループ構造を形成する部分、およびステム構造を形成しない部分の塩基配列に変異、すなわち置換、挿入、欠失および／または付加を有することができる。ただし、変異はシュードノット構造の形成を阻害するものではない。例えば、上記ＲＮＡは、配列番号２０に記載の塩基配列の５′末端からの位置１から３、位置９から位置２２、位置３２、位置３８から位置４４、の塩基に変異を有することができる。さらに、本発明の一態様では、ステム構造を形成する部分に変異があってよい。ステム構造を形成する部分に存在する変異は、塩基対を形成する相手塩基とともに対で生じ得ることができ、変異の結果Ｃ－Ｇ、Ａ－Ｕ、またはＵ－Ｇ塩基対のいずれかを生じ得る。例えば、上記ＲＮＡは、配列番号２０に記載の塩基配列の５′末端から数えた位置４から８、２４から３１、３３から３７、４３から５１に変異を有することができ、特に変異は以下の塩基対を形成する相手塩基とともに対で生じ得る：位置４と３７、位置５と３６、位置６と３５、位置７と３４、位置８と３３；位置２３と５１、位置２４と５０、位置２５と４９、位置２６と４８、位置２７と４７、位置２８と４６、位置２９と４５、位置３０と４４、位置３１と４３。
【0054】
本発明の一実施態様では、配列番号２０に記載の塩基配列、または配列番号２０に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡは、プライマーゼおよび／またはＲｄＲｐの前記ＲＮＡへの結合を阻害する化合物を同定する方法、および／またはコロナウイルス感染症の治療剤または予防剤をスクリーニングする方法に用いることができる。
【0055】
４）ＳＬ
本発明は、「ＳＬ」と名付けた、以下のＲＮＡに関する。
配列番号１９に記載の塩基配列、または配列番号１９に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ２つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
AUUCUCGUAACUACAUAGCACAAGUAGAUGUAGUUACUUAGGAGAAU （配列番号１９）
配列番号１９に示す塩基配列を有する設計された「ＳＬ」は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６２２から２９６５７に対応するＲＮＡ断片、および位置２９８５７から２９８６７に対応するＲＮＡ断片を含むＲＮＡコンストラクトである。「ＳＬ」は、３′ＵＴＲに由来する複数の部分を連結したＲＮＡコンストラクトであり、天然に存在しない。
本発明は、「ＳＬ」と名付けた、以下のＲＮＡに関する。
配列番号１９に記載の塩基配列、または配列番号１９に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ２つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
AUUCUCGUAACUACAUAGCACAAGUAGAUGUAGUUACUUAGGAGAAU （配列番号１９）
配列番号１９に示す塩基配列を有する設計された「ＳＬ」は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６２２から２９６５７に対応するＲＮＡ断片、および位置２９８５７から２９８６７に対応するＲＮＡ断片を含むＲＮＡコンストラクトである。「ＳＬ」は、３′ＵＴＲに由来する複数の部分を連結したＲＮＡコンストラクトであり、天然に存在しない。
【0056】
配列番号１９に記載の塩基配列の５′末端から数えて１番目から３６番目の塩基の部分が、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６２２から２９６５７に対応し、配列番号１９に記載の塩基配列の５′末端から３７番目から４７番目の塩基の部分が、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９８５７から２９８６７に対応する。
【0057】
「ＳＬ」は、Ｐ２ステム構造（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６３０から２９６３５部分および２９６５１から２９６５６部分が形成する塩基対を少なくとも含む）、および
Ｐ５ステム構造（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６２３から２９６２６部分および２９８６３から２９８６６部分が形成する塩基対を少なくとも含む）を形成することができる。
Ｐ５ステム構造（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９６２３から２９６２６部分および２９８６３から２９８６６部分が形成する塩基対を少なくとも含む）を形成することができる。
【0058】
ＳＬは、ｎｓｐ８、またはｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物と複合体を形成することができる。ＳＬの二次構造や、ＳＬとｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物との相互作用は、ＮＭＲ法、ゲルシフトアッセイ等により測定することができる。ＲＮＡとタンパク質の相互作用分析に用いるアッセイ溶液は、塩、緩衝液、ＲＮＡａｓｅ阻害剤を含み得るがこれらに限定されない。
【0059】
本発明は、配列番号１９に記載の塩基配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の塩基配列同一性を有し且つ２つのステム構造を形成する塩基配列を含むＲＮＡに関する。さらに本発明は、配列番号１９に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有し且つ２つのステム構造を形成す塩基配列を含むＲＮＡに関する。配列番号１９に記載の塩基配列において許容される変異（置換、挿入、欠失および／または付加）は、配列番号１９の塩基配列を含むＲＮＡ「ＳＬ」が形成する２次構造を壊さないものである。
【0060】
「ＳＬ」は、配列番号１９に記載の塩基配列の５′末端または３′末端に、ＲＮＡコンストラクト解析用、合成用等のヌクレオチドを付加することができる。付加されるヌクレオチドは、１０ｎｔ以下、９ｎｔ以下、８ｎｔ以下、７ｎｔ以下、６ｎｔ以下、５ｎｔ以下、４ｎｔ以下、３ｎｔ以下、２ｎｔ以下、または１ｎｔである。本発明の一実施態様において、「ＳＬ」は、配列番号１９に記載の塩基配列の５′末端に、ＲＮＡコンストラクトの製造の際に追加される1～３のＧを含むことができる。
【0061】
本発明の上記ＲＮＡは、限定されないが、特にループ構造を形成する部分、およびステム構造を形成しない部分の塩基配列に変異、すなわち置換、挿入、欠失および／または付加を有することができる。例えば、上記ＲＮＡは、配列番号１９に記載の塩基配列の５′末端から位置１、位置６から８、位置１５から２９、位置３６から４２、位置４７の塩基に変異を有することができる。さらに、本発明の一態様では、ステム構造を形成する部分に変異があってよい。ステム構造を形成する部分に存在する変異は、塩基対を形成する相手塩基とともに対で生じ得ることができ、変異の結果Ｃ－Ｇ、Ａ－Ｕ、またはＵ－Ｇ塩基対のいずれかを生じ得る。例えば、上記ＲＮＡは、配列番号１９に記載の塩基配列の５′末端から数えた位置２から５、位置８から１５、位置２９から３６、位置４３から４６に変異を有することができ、特に変異は以下の塩基対を形成する相手塩基とともに対で生じ得る：位置２と４６、位置３と４５、位置４と４４、位置５と４３；位置８と３６、位置９と３５、位置１０と３４、位置１１と３３、位置１２と３２、位置１３と３１、位置１４と３０、位置１５と２９。
【0062】
本発明の一実施態様では、配列番号１９に記載の塩基配列、または配列番号１９に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ２つのステム構造を形成する塩基配列を含むＲＮＡは、プライマーゼおよび／またはＲｄＲｐの前記ＲＮＡへの結合を阻害する化合物を同定する方法、および／またはコロナウイルス感染症の治療剤または予防剤をスクリーニングする方法に用いることができる。
【0063】
本発明は、上記ＰＫＰ４、ＳＬＰ４、ＰＫ、およびＳＬの４つのＲＮＡから選択される１種、２種、３種、または４種のＲＮＡを含む、セットに関する。
本発明の一実施態様では、前記セットは、ＰＫＰ４、ならびにＳＬＰ４、ＰＫ、およびＳＬの４つのＲＮＡから選択される１種、２種、または３種のＲＮＡを含むことができる。
本発明の一実施態様では、前記セットは、ＰＫＰ４、ならびにＳＬＰ４、ＰＫ、およびＳＬの４つのＲＮＡから選択される１種、２種、または３種のＲＮＡを含むことができる。
【0064】
本発明の一実施態様では、前記セットは、ＰＫＰ４およびＳＬＰ４を含むことができる。本発明の一実施態様では、前記セットは、ＰＫＰ４およびＰＫを含むことができる。本発明の一実施態様では、前記セットは、ＳＬＰ４およびＳＬを含むことができる。本発明のセットは、プライマーゼおよび／またはＲｄＲｐの前記ＲＮＡへの結合を阻害する化合物を同定する方法、および／またはコロナウイルス感染症の治療剤または予防剤をスクリーニングする方法に用いることができる。
【0065】
スクリーニング方法
本発明は、コロナウイルス感染症の治療剤または予防剤のスクリーニング方法に関し、本方法はＲＮＡコンストラクトであるＰＫＰ４と、プライマーゼおよび／またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）との結合を検出するアッセイを使用して、プライマーゼおよび／またはＲｄＲｐのＰＫＰ４への結合を阻害する化合物を同定する工程を含む。ＲＮＡとタンパク質との結合を検出するアッセイは、ＮＭＲ法やゲルシフトアッセイであってもよい。
本発明は、コロナウイルス感染症の治療剤または予防剤のスクリーニング方法に関し、本方法はＲＮＡコンストラクトであるＰＫＰ４と、プライマーゼおよび／またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）との結合を検出するアッセイを使用して、プライマーゼおよび／またはＲｄＲｐのＰＫＰ４への結合を阻害する化合物を同定する工程を含む。ＲＮＡとタンパク質との結合を検出するアッセイは、ＮＭＲ法やゲルシフトアッセイであってもよい。
【0066】
本発明の一実施態様では、さらに、本方法は、同定された化合物の存在下で、ＲＮＡコンストラクトであるＳＬＰ４、ＰＫ、およびＳＬから選択される何れかと、プライマーゼおよび／またはＲｄＲｐとの結合を分析する工程を含むことができる。本発明の一実施態様では、本方法は、同定された化合物の存在下で、ＳＬＰ４と、プライマーゼおよび／またはＲｄＲｐとの結合を分析する工程を含むことができる。
【0067】
ＰＫＰ４を用いたアッセイの結果と、ＳＬＰ４を用いたアッセイの結果を比較することにより、化合物が、プライマーゼおよび／またはＲｄＲｐのシュードノット構造への結合を阻害するものであるか否かを判別することができる。ＰＫＰ４を用いたアッセイの結果と、ＰＫを用いたアッセイの結果を比較することにより、化合物とＰ４ステム構造との間の相互作用を評価することができる。さらに、ＳＬを用いたアッセイの結果を評価することにより、化合物とＰ２、Ｐ４、またはＰ５ステム構造との間の相互作用を評価することができる。
【0068】
本発明の一実施態様では、化合物（候補物質あるいは被験物質）は、任意の化合物、例えばタンパク質（例えば、抗体、およびその抗原結合性断片）、ペプチド、核酸、糖質、脂質、タンパク質以外の高分子化合物または低分子化合物、およびこれらの誘導体などであるが、これらに限定されない。
【0069】
本発明の一実施態様では、コロナウイルスがアルファコロナウイルス属またはベータコロナウイルス属のウイルスであってもよい。今までに分離同定されたヒトの病原コロナウイルスはアルファコロナウイルス属またはベータコロナウイルス属に属する。アルファコロナウイルス属には、ヒトで風邪の原因となるヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ヒトコロナウイルスＮＬ６３が同定されている。ベータコロナウイルス属には、ヒトコロナウイルスＯＣ４３、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）の原因となるＭＥＲＳコロナウイルス、２００３年に同定され重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の原因となるＳＡＲＳコロナウイルス、ＣＯＶＩＤ－１９の原因となるＳＡＲＳコロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が同定されている。
【0070】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株の配列比較では、３′ＵＴＲでは配列の変異が非常に少なく、特に３′ＰＫは非常に高い配列保存性を示す（文献４４）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の属するベータコロナウイルス属の種は３′ＰＫを持ち、それらの種間で高い配列保存性を示す（文献４４）。よって、３′ＰＫ部位の機能はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に必須であるため、機能阻害により変異体ウイルスも抑制可能であると考えられる。アルファコロナウイルス属の種にも３′ＰＫの相同配列が存在するため、ベータコロナ属と同様のゲノムＲＮＡ転写開始機構が推定され、アルファコロナウイルス属の増殖も抑制可能であると考えられる。
【0071】
ＤＮＡ
本発明は、以下のいずれかのＲＮＡをコードするＤＮＡまたはその相補鎖ＤＮＡに関する。
１）配列番号２２に記載の塩基配列、または配列番号２２に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
２）配列番号２１に記載の塩基配列、または配列番号２１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ３つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
３）配列番号２０に記載の塩基配列、または配列番号２０に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
４）配列番号１９に記載の塩基配列、または配列番号１９に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ２つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
本発明は、以下のいずれかのＲＮＡをコードするＤＮＡまたはその相補鎖ＤＮＡに関する。
１）配列番号２２に記載の塩基配列、または配列番号２２に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
２）配列番号２１に記載の塩基配列、または配列番号２１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ３つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
３）配列番号２０に記載の塩基配列、または配列番号２０に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
４）配列番号１９に記載の塩基配列、または配列番号１９に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ２つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
【0072】
測定方法
本発明は、ＮＭＲ解析によりＲＮＡコンストラクトの二次構造の形成を測定する方法に関する。ここで、ＲＮＡコンストラクトは、コロナウイルスの３′ＵＴＲ構造を再構築できるものであり、特にシュードノット構造を再構築できるものである。一実施態様では、本発明は、以下のいずれかのＲＮＡについてＮＭＲ解析により二次構造の形成を測定する方法に関する。
１）配列番号２２に記載の塩基配列、または配列番号２２に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
２）配列番号２１に記載の塩基配列、または配列番号２１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ３つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
３）配列番号２０に記載の塩基配列、または配列番号２０に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
４）配列番号１９に記載の塩基配列、または配列番号１９に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ２つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
本発明は、ＮＭＲ解析によりＲＮＡコンストラクトの二次構造の形成を測定する方法に関する。ここで、ＲＮＡコンストラクトは、コロナウイルスの３′ＵＴＲ構造を再構築できるものであり、特にシュードノット構造を再構築できるものである。一実施態様では、本発明は、以下のいずれかのＲＮＡについてＮＭＲ解析により二次構造の形成を測定する方法に関する。
１）配列番号２２に記載の塩基配列、または配列番号２２に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
２）配列番号２１に記載の塩基配列、または配列番号２１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ３つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
３）配列番号２０に記載の塩基配列、または配列番号２０に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
４）配列番号１９に記載の塩基配列、または配列番号１９に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ２つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
【0073】
本発明の一実施態様では、上記のＮＭＲ解析によりＲＮＡの二次構造の形成を測定する方法は、プライマーゼまたはＲｄＲｐの、ＲＮＡにおける結合部位を特定するために実施することができる。例えば、１次元１Ｈ ＮＭＲ測定、１次元３１Ｐ ＮＭＲ測定、２次元１Ｈ－１５Ｎ ＨＳＱＣ， １Ｈ－１５Ｎ ＨＭＱＣ， １Ｈ－１３Ｃ ＨＳＱＣ、１Ｈ－１Ｈ ＮＯＥＳＹ測定等により、ＲＮＡとプライマーゼおよび／またはＲｄＲｐとを混合した時の、プライマーゼまたはＲｄＲｐ由来のＮＭＲ信号をモニターすることができる。プライマーゼおよび／またはＲｄＲｐのＮＭＲ信号の帰属情報に基づいて、混合により信号が変化すること（化学シフト）を一次元や多次元スペクトルでモニターすることができ、プライマーゼおよび／またはＲｄＲｐがＲＮＡのどの部分に結合しているのかを詳細に解析することができる。ＲＮＡと結合したｎｓｐ７－ｎｓｐ８（プライマーゼ）由来のシグナルの一部が９～１０ｐｐｍに観測されることが分かっている。タンパク質（プライマーゼおよび／またはＲｄＲｐ）のほか、ＲＮＡを安定同位体で標識してＮＭＲ解析することもできる。ＲＮＡだけ標識、タンパク質だけ標識、どちらも標識のそれぞれについて測定することができる。安定同位体としては、例えば１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈが挙げられるがこれらに限定されない。
【0074】
本発明の一実施態様では、上記のＮＭＲ解析によりＲＮＡの二次構造の形成を測定する方法は、コロナウイルス感染症の治療剤または予防剤をスクリーニングする方法において、プライマーゼまたはＲｄＲｐとＲＮＡとの相互作用における、化合物（候補物質あるいは被験物質）の影響を評価するために実施することができる。例えば、１次元１Ｈ ＮＭＲ測定、１次元３１Ｐ ＮＭＲ測定、２次元１Ｈ－１５Ｎ ＨＳＱＣ，１Ｈ－１５Ｎ ＨＭＱＣ，１Ｈ－１３Ｃ ＨＳＱＣ，１Ｈ－１Ｈ ＮＯＥＳＹ測定等により、ＲＮＡとプライマーゼおよび／またはＲｄＲｐに、化合物を混合した時の、プライマーゼまたはＲｄＲｐ由来のＮＭＲ信号をモニターすることができる。化学シフトをモニターして、化合物が、ＲＮＡとプライマーゼおよび／またはＲｄＲｐとの相互作用に与える影響を詳細に解析することができる。また、フッ素を含む低分子化合物の結合アッセイには１９Ｆ ＮＭＲ解析も有効である。
【0075】
本発明は、以下のいずれかのＲＮＡをアッセイ溶液中で維持することを含む、シュードノット構造またはステムループ構造の形成方法に関する。本発明の一態様ではでアッセイ溶液のカリウムイオン濃度がナトリウムイオン濃度よりも高い。
１）配列番号２２に記載の塩基配列、または配列番号２２に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
２）配列番号２１に記載の塩基配列、または配列番号２１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ３つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
３）配列番号２０に記載の塩基配列、または配列番号２０に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
４）配列番号１９に記載の塩基配列、または配列番号１９に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ２つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
１）配列番号２２に記載の塩基配列、または配列番号２２に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
２）配列番号２１に記載の塩基配列、または配列番号２１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ３つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
３）配列番号２０に記載の塩基配列、または配列番号２０に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
４）配列番号１９に記載の塩基配列、または配列番号１９に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ２つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
【0076】
本発明の一実施態様において、アッセイ溶液のイオン強度は細胞内（細胞質）のイオン環境に基づいて設定することができる。細胞内液のカリウムイオン濃度は約１４０ｍＭ、ナトリウムイオン濃度は約１０ｍＭであり、カリウムイオン濃度がナトリウムイオン濃度よりも高い。本発明のアッセイ溶液中のカリウムイオンの塩濃度を９０～１９０ｍＭの範囲、１００～１８０ｍＭの範囲、１１０～１７０ｍＭの範囲、または１２０～１６０ｍＭの範囲とし、ナトリウムイオンの塩濃度を１～５０ｍＭの範囲、３～３０の範囲、または５～２０ｍＭのとすることができる。アッセイ溶液は、マグネシウムイオンを更に含むことができる。マグネシウムイオンの塩濃度は、０．１ｍＭ～５ｍＭの範囲、０．２ｍＭ～４ｍＭの範囲、または０．３ｍＭ～３ｍＭの範囲であることができる。アッセイ溶液のｐＨは６～９の範囲で設定することができる。アッセイ溶液でのインキュベーションは、例えば室温で１０分間静置することにより実施できるが、これに限定されず、当業者は最適な条件を検討し採用することができる。
【0077】
本発明の一実施態様において、ＲＮＡにおけるシュードノット構造またはステムループ構造の形成方法は、ｎｓｐ８またはｎｓｐ７－ｎｓｐ８の存在下で実施することができる。アッセイ溶液は、ＲＮＡとｎｓｐ８を、１：１または１：２以上のモル比で含有することができる。アッセイ溶液は、ＲＮＡとｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物を、１：１または１：２以上のモル比で含有することができ、ここでｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物はｎｓｐ７とｎｓｐ８の等モル混合物であることができる。
【0078】
本発明は、以下のいずれかのＲＮＡの少なくとも一部分に結合して、前記ＲＮＡとプライマーゼ／ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）との結合を阻害する、アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスＲＮＡに関する。
１）配列番号２２に記載の塩基配列、または配列番号２２に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
２）配列番号２１に記載の塩基配列、または配列番号２１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ３つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
３）配列番号２０に記載の塩基配列、または配列番号２０に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
４）配列番号１９に記載の塩基配列、または配列番号１９に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ２つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
１）配列番号２２に記載の塩基配列、または配列番号２２に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
２）配列番号２１に記載の塩基配列、または配列番号２１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ３つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
３）配列番号２０に記載の塩基配列、または配列番号２０に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
４）配列番号１９に記載の塩基配列、または配列番号１９に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ２つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
【0079】
本発明の一実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＧＧＧＡＡＵＡＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＧＡＡＵ（配列番号２５）の配列を含む。この配列は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の全長ゲノム配列の位置２９８４４～２９８６７の配列である。
【0080】
本発明の一実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の（ａ）～（ｏ）からなる群から選択される何れかの塩基配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）を含む：
（ａ）ＧＧＧＡＡＵＡＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＧＡＡＵ（配列番号２５）、
（ｂ）ＡＡＵＡＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＧＡＡＵ（配列番号２７）、
（ｃ）ＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＵＵＡＣＧＡＧＡＡＵＵ（配列番号２８）、
（ｄ）ＡＡＡＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＡＵＵＣＡＵＵＣＵ（配列番号２９）、
（ｅ）ＵＵＧＵＧＣＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡＣＧＡＧＡ（配列番号３０）、
（ｆ）ＵＧＵＧＡＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＣＵＡＣＡＵＣＵＡＣ（配列番号３１）、
（ｇ）ＵＵＧＵＧＣＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡ（配列番号３２）、
（ｈ）ＵＧＵＧＡＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＣＵＡＣＡ（配列番号３３）、
（ｉ）ＡＵＵＣＵＣＣＵＡＡＧＡＡＧＣＵＡＵＵ（配列番号３４）、
（ｊ）ＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡＣＧＡＧＡＡＵＵＣＡＵＵＣＵ（配列番号３５）、
（ｋ）ＡＡＡＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＡＵＵＣＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧ（配列番号３６）、
（ｌ）ＡＵＣＵＡＣＵＵＧＵＧＣＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡＣＧＡＧＡＡ（配列番号３７）、
（ｍ）ＵＧＵＧＡＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＣＵＡＣＡＵＣＵＡＵ（配列番号３８）、
（ｎ）（ａ）～（ｍ）の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなり、下記１）～４）のいずれかのＲＮＡとＲｄＲｐとの結合を阻害することができる、塩基配列、または
（ｏ）（ａ）～（ｍ）のいずれか一の塩基配列と９０％塩基配列同一性を有する配列を含み、下記１）～４）のいずれかのＲＮＡとＲｄＲｐとの結合を阻害することができる、塩基配列。
１）配列番号２２に記載の塩基配列、または配列番号２２に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
２）配列番号２１に記載の塩基配列、または配列番号２１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ３つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
３）配列番号２０に記載の塩基配列、または配列番号２０に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
４）配列番号１９に記載の塩基配列、または配列番号１９に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ２つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
（ａ）ＧＧＧＡＡＵＡＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＧＡＡＵ（配列番号２５）、
（ｂ）ＡＡＵＡＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＧＡＡＵ（配列番号２７）、
（ｃ）ＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＵＵＡＣＧＡＧＡＡＵＵ（配列番号２８）、
（ｄ）ＡＡＡＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＡＵＵＣＡＵＵＣＵ（配列番号２９）、
（ｅ）ＵＵＧＵＧＣＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡＣＧＡＧＡ（配列番号３０）、
（ｆ）ＵＧＵＧＡＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＣＵＡＣＡＵＣＵＡＣ（配列番号３１）、
（ｇ）ＵＵＧＵＧＣＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡ（配列番号３２）、
（ｈ）ＵＧＵＧＡＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＣＵＡＣＡ（配列番号３３）、
（ｉ）ＡＵＵＣＵＣＣＵＡＡＧＡＡＧＣＵＡＵＵ（配列番号３４）、
（ｊ）ＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡＣＧＡＧＡＡＵＵＣＡＵＵＣＵ（配列番号３５）、
（ｋ）ＡＡＡＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＡＵＵＣＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧ（配列番号３６）、
（ｌ）ＡＵＣＵＡＣＵＵＧＵＧＣＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡＣＧＡＧＡＡ（配列番号３７）、
（ｍ）ＵＧＵＧＡＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＣＵＡＣＡＵＣＵＡＵ（配列番号３８）、
（ｎ）（ａ）～（ｍ）の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなり、下記１）～４）のいずれかのＲＮＡとＲｄＲｐとの結合を阻害することができる、塩基配列、または
（ｏ）（ａ）～（ｍ）のいずれか一の塩基配列と９０％塩基配列同一性を有する配列を含み、下記１）～４）のいずれかのＲＮＡとＲｄＲｐとの結合を阻害することができる、塩基配列。
１）配列番号２２に記載の塩基配列、または配列番号２２に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
２）配列番号２１に記載の塩基配列、または配列番号２１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ３つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
３）配列番号２０に記載の塩基配列、または配列番号２０に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
４）配列番号１９に記載の塩基配列、または配列番号１９に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ２つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
【0081】
本明細書で言う「１から数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、欠失、置換、挿入については、例えば、１から３個、１または２個、または１個を意味し、両端部への付加については、特には限定されないが、１から２０個、１から１０個、１から７個、１から５個、1から３個程度を意味する。一実施態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、塩基配列の５′末端に、ＲＮＡ合成の際に追加される１～３個のＧ（例えば、ＧＧＧ）を含むことができる。上記の（ｏ）の塩基配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記１）～４）のいずれかのＲＮＡとＲｄＲｐとの結合を阻害することができる効果を有する限りにおいて、（ａ）～（ｍ）のいずれか一の塩基配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％塩基配列同一性を有する塩基配列を含むことができる。
【0082】
本発明は、被検ヌクレオチドの存在下で、下記ＲＮＡ１）～４）のいずれかのＲＮＡとプライマーゼ／ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）との結合を検出する工程を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドの製造方法に関する。
１）配列番号２２に記載の塩基配列、または配列番号２２に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
２）配列番号２１に記載の塩基配列、または配列番号２１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ３つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
３）配列番号２０に記載の塩基配列、または配列番号２０に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
４）配列番号１９に記載の塩基配列、または配列番号１９に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ２つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
１）配列番号２２に記載の塩基配列、または配列番号２２に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
２）配列番号２１に記載の塩基配列、または配列番号２１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ３つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
３）配列番号２０に記載の塩基配列、または配列番号２０に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つシュードノット構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
４）配列番号１９に記載の塩基配列、または配列番号１９に記載の塩基配列と少なくとも９０％の塩基配列同一性を有し且つ２つのステム構造を形成する塩基配列を含む、ＲＮＡ。
【0083】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、および低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬組成物の形態で提供され得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、in vivoでのその安定性および／または治療効率を増加させる、修飾されたヌクレオチド、例えば化学修飾されたヌクレオチドを含み得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖または二本鎖ＲＮＡであり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むナノ粒子の形態で提供され得る。ナノ粒子を使用することにより、アンチセンスオリゴヌクレオチドの半減期を増加させることが可能となる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡ転写を阻害することができ、ＣＯＶＩＤ－１９の治療のために有用である。
【実施例0084】
以下の例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、本明細書において、特に記載しない限り、「％」、「部」等は質量基準であり、数値範囲はその端点を含むものとして記載される。
【0085】
方法と材料
１）ＲＮＡ断片の作成
本実施例では、ＲＮＡコンストラクトＰ１、Ｐ４、ＳＬ、ＳＬＬ，ＳＬＰ４およびＰＫＰ４を作成した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１の全ゲノム（NCBI accession code NC_045512.2）を参照配列として用いた。すべてのＲＮＡ断片は、AmpliScribe T7-Flash Transcription Kit (LGC Biosearch Technologies, Teddington, UK) とHiScribe T7 High Yield RNA Synthesis kit (New England Biolabs Inc., Massachusetts, USA) を用いて作成され、文献４０に記載のように精製した。
１）ＲＮＡ断片の作成
本実施例では、ＲＮＡコンストラクトＰ１、Ｐ４、ＳＬ、ＳＬＬ，ＳＬＰ４およびＰＫＰ４を作成した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１の全ゲノム（NCBI accession code NC_045512.2）を参照配列として用いた。すべてのＲＮＡ断片は、AmpliScribe T7-Flash Transcription Kit (LGC Biosearch Technologies, Teddington, UK) とHiScribe T7 High Yield RNA Synthesis kit (New England Biolabs Inc., Massachusetts, USA) を用いて作成され、文献４０に記載のように精製した。
【0086】
ＲＮＡのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたＲＮＡ合成にはフォワードとリバースのＤＮＡ鋳型が必要であり、フォワードとリバースは相補配列である。ｉｎ－ｖｉｔｒｏ転写用のＤＮＡ鋳型はＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社から購入した。ＲＮＡコンストラクトＰ１、Ｐ４、ＳＬ、ＳＬＬ，ＳＬＰ４、ＰＫＰ４のＤＮＡ鋳型は各々２つの配列をＧＣＡＡリンカーで連結した。フォワード鋳型の５′側にはＴ７プロモーター配列（フォワード：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ（配列番号１）を、リバース鋳型には３′側にＴ７プロモーター配列（リバース：ＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ（配列番号２）を付与した。
Ｐ１のＤＮＡ鋳型は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の塩基位置２９６０７～２９６１７の配列、ＧＣＡＡリンカーおよび位置２９６３６～２９６４５の配列に基づく。
Ｐ２のＤＮＡ鋳型は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の塩基位置２９６２８～２９６５７の配列に基づく。
Ｐ４のＤＮＡ鋳型は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の塩基位置２９６６１～２９６７１の配列、ＧＣＡＡリンカーおよび位置２９８４０～２９８４８の配列に基づく。
ＰＫのＤＮＡ鋳型は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の塩基位置２９６０７～２９６４５の配列に基づく。
ＳＬのＤＮＡ鋳型は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の塩基位置２９６２２～２９６５７の配列、ＧＣＡＡリンカーおよび位置２９８５７～２９８６７の配列に基づく。
ＳＬＬのＤＮＡ鋳型は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の塩基位置２９６２２～２９６５７の配列、ＧＣＡＡリンカーおよび位置２９８５０～２９８６７の配列に基づく。
ＳＬＰ４のＤＮＡ鋳型は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の塩基位置２９６２２～２９６７１の配列、ＧＣＡＡリンカーおよび位置２９８４０～２９８６７の配列に基づく。
ＰＫＰ４のＤＮＡ鋳型は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の塩基位置２９６０７～２９６７１の配列、ＧＣＡＡリンカーおよび位置２９８４０～２９８６７の配列に基づく。
すべてのコンストラクトについて、フォワード鋳型はＴ７プロモーター配列を用いてもよい。
Ｐ１のＤＮＡ鋳型は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の塩基位置２９６０７～２９６１７の配列、ＧＣＡＡリンカーおよび位置２９６３６～２９６４５の配列に基づく。
Ｐ２のＤＮＡ鋳型は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の塩基位置２９６２８～２９６５７の配列に基づく。
Ｐ４のＤＮＡ鋳型は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の塩基位置２９６６１～２９６７１の配列、ＧＣＡＡリンカーおよび位置２９８４０～２９８４８の配列に基づく。
ＰＫのＤＮＡ鋳型は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の塩基位置２９６０７～２９６４５の配列に基づく。
ＳＬのＤＮＡ鋳型は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の塩基位置２９６２２～２９６５７の配列、ＧＣＡＡリンカーおよび位置２９８５７～２９８６７の配列に基づく。
ＳＬＬのＤＮＡ鋳型は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の塩基位置２９６２２～２９６５７の配列、ＧＣＡＡリンカーおよび位置２９８５０～２９８６７の配列に基づく。
ＳＬＰ４のＤＮＡ鋳型は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の塩基位置２９６２２～２９６７１の配列、ＧＣＡＡリンカーおよび位置２９８４０～２９８６７の配列に基づく。
ＰＫＰ４のＤＮＡ鋳型は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株の塩基位置２９６０７～２９６７１の配列、ＧＣＡＡリンカーおよび位置２９８４０～２９８６７の配列に基づく。
すべてのコンストラクトについて、フォワード鋳型はＴ７プロモーター配列を用いてもよい。
【0087】
【表1】
【0088】
２）ｎｓｐ７およびｎｓｐ８の作成
ｎｓｐ７，ｎｓｐ８の遺伝子は以下の配列を使用した。
nsp7 [Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2]
NCBI Reference Sequence: YP_009742614.1
nsp8 [Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2]
NCBI Reference Sequence: YP_009742615.1
Ｎｓｐ７，ｎｓｐ８の遺伝子はｐＣＲ２．１－ＴＯＰＯベクターにクローニングした。各遺伝子はＮ末端にニッケル結合タグとＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼ切断サイトを持つ。大腸菌ＫＲＸ細胞を上述のプラスミドで形質転換し、０．１％ラムノースを含む培養液で細胞を培養した。培養後に回収した細胞は緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．９もしくは８．０）、５００ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭイミダゾール、１ｍＭ ＰＭＳＦ、ｃＯｍｐｌｅｔｅ プロテアーゼ抑制剤）に懸濁し、超音波破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、得られた上清をニッケルセファロース６ファストフロー樹脂と懸濁後、４℃にて１－１．５時間静置した。その後、樹脂をカラムに移し、樹脂の洗浄後にタンパク質を溶出した。Ｎ末端に付加したタグを除去するため、ＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼを添加し、ＰＭＳＦとｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤を含まない緩衝液Ａに対して透析した。透析した目的タンパク質を含む溶液をニッケルセファロース６ファストフローおよびＨｉＴｒａｐＱカラムにて精製した。その後、目的タンパク質を含む溶液を緩衝液Ｂ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ８．０）、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭジチオトレイトール）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００カラムにて分画した。
ｎｓｐ７，ｎｓｐ８の遺伝子は以下の配列を使用した。
nsp7 [Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2]
NCBI Reference Sequence: YP_009742614.1
nsp8 [Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2]
NCBI Reference Sequence: YP_009742615.1
Ｎｓｐ７，ｎｓｐ８の遺伝子はｐＣＲ２．１－ＴＯＰＯベクターにクローニングした。各遺伝子はＮ末端にニッケル結合タグとＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼ切断サイトを持つ。大腸菌ＫＲＸ細胞を上述のプラスミドで形質転換し、０．１％ラムノースを含む培養液で細胞を培養した。培養後に回収した細胞は緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．９もしくは８．０）、５００ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭイミダゾール、１ｍＭ ＰＭＳＦ、ｃＯｍｐｌｅｔｅ プロテアーゼ抑制剤）に懸濁し、超音波破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、得られた上清をニッケルセファロース６ファストフロー樹脂と懸濁後、４℃にて１－１．５時間静置した。その後、樹脂をカラムに移し、樹脂の洗浄後にタンパク質を溶出した。Ｎ末端に付加したタグを除去するため、ＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼを添加し、ＰＭＳＦとｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤を含まない緩衝液Ａに対して透析した。透析した目的タンパク質を含む溶液をニッケルセファロース６ファストフローおよびＨｉＴｒａｐＱカラムにて精製した。その後、目的タンパク質を含む溶液を緩衝液Ｂ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ８．０）、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭジチオトレイトール）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００カラムにて分画した。
【0089】
３）電気泳動移動度測定法
ＲＮＡ断片およびタンパク質の保存および反応バッファー成分は、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－Ｎａ（ｐＨ７．４、ＮａＯＨにてｐＨ調整を行った）、１４０ｍＭ ＫＣｌ、および０．８ｍＭ ＭｇＣｌ２であった。０または４．９５μＭのｎｓｐ７と０または４．９５μＭのｎｓｐ８の反応バッファー溶液を０．３３μＭのＲＮＡと混合した。この混合溶液を２０℃で１０分間インキュベートした後、３５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４３ｍＭ イミダゾール、１０ｍＭ ＫＣｌバッファーを含む６％ポリアクリルアミド（１９：１＝ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ：ｂｉｓ）ゲルにロードし、１００Ｖで４℃、６０分間反応させた。電気泳動に用いるバッファー成分は、ｐＨ７．４となるように選択した（文献４１）。
バンドはＧｅｌＳｔａｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で染色し、４７０ｎｍの青色ＬＥＤライトで可視化した。
見かけの解離定数Ｋｄは、以下のＨｉｌｌ－Ｌａｎｇｍｕｉｒの式から求めた。
式中、θは｛１－（タンパク質と非結合ＲＮＡ／ＲＮＡ総量）｝、［Ｌ］は［ｎｓｐ８］から求めた。タンパク質と非結合ＲＮＡ／ＲＮＡ総量は、各ＲＮＡ－タンパク質混合物のタンパク質と非結合ＲＮＡバンドに対するＲＮＡのみのレーンの構造形成したＲＮＡバンドの比率から求めた。
ＲＮＡ断片およびタンパク質の保存および反応バッファー成分は、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－Ｎａ（ｐＨ７．４、ＮａＯＨにてｐＨ調整を行った）、１４０ｍＭ ＫＣｌ、および０．８ｍＭ ＭｇＣｌ２であった。０または４．９５μＭのｎｓｐ７と０または４．９５μＭのｎｓｐ８の反応バッファー溶液を０．３３μＭのＲＮＡと混合した。この混合溶液を２０℃で１０分間インキュベートした後、３５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４３ｍＭ イミダゾール、１０ｍＭ ＫＣｌバッファーを含む６％ポリアクリルアミド（１９：１＝ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ：ｂｉｓ）ゲルにロードし、１００Ｖで４℃、６０分間反応させた。電気泳動に用いるバッファー成分は、ｐＨ７．４となるように選択した（文献４１）。
バンドはＧｅｌＳｔａｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で染色し、４７０ｎｍの青色ＬＥＤライトで可視化した。
見かけの解離定数Ｋｄは、以下のＨｉｌｌ－Ｌａｎｇｍｕｉｒの式から求めた。
【0090】
４）ＮＭＲ測定
すべてのＲＮＡサンプルは、８％または１００％Ｄ２Ｏを含む２０ｍＭ ＭＥＳ（ＮａＯＨで調整したｐＨ６．０），１４０ｍＭ ＫＣｌ，０．８ｍＭ ＭｇＣｌ２に溶解し、溶液はその後５６～３３４μＭに調整した。ＲＮＡとタンパク質の混合試料は、８％Ｄ２Ｏを含む２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０，ＮａＯＨで調整）、１４０ｍＭ ＫＣｌ、０．８ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴおよび４０ｕｎｉｔｓ ＲｉｂｏＧｕａｒｄ ＲＮＡｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＬＧＣ Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）に溶解し、溶液はその後、５０μＭ ＳＬＰ４，５０μＭ ｎｓｐ７および５０μＭ ｎｓｐ８に調節してＳＬＰ４－ｎｓｐ７－ｎｓｐ８とし、５０μＭ ＳＬＰ４，１００μＭ ｎｓｐ７および１００μＭ ｎｓｐ８に調節してＰＫＰ４－ｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物とした。ＮＭＲ試料にはすべて直径４ｍｍのＳｈｉｇｅｍｉ管（Ｓｈｉｇｅｍｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用した。ＮＭＲバッファーの一価および二価のカチオン濃度は、細胞質のイオン強度に基づき選択した（文献４２）。
すべてのＲＮＡサンプルは、８％または１００％Ｄ２Ｏを含む２０ｍＭ ＭＥＳ（ＮａＯＨで調整したｐＨ６．０），１４０ｍＭ ＫＣｌ，０．８ｍＭ ＭｇＣｌ２に溶解し、溶液はその後５６～３３４μＭに調整した。ＲＮＡとタンパク質の混合試料は、８％Ｄ２Ｏを含む２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０，ＮａＯＨで調整）、１４０ｍＭ ＫＣｌ、０．８ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴおよび４０ｕｎｉｔｓ ＲｉｂｏＧｕａｒｄ ＲＮＡｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＬＧＣ Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）に溶解し、溶液はその後、５０μＭ ＳＬＰ４，５０μＭ ｎｓｐ７および５０μＭ ｎｓｐ８に調節してＳＬＰ４－ｎｓｐ７－ｎｓｐ８とし、５０μＭ ＳＬＰ４，１００μＭ ｎｓｐ７および１００μＭ ｎｓｐ８に調節してＰＫＰ４－ｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物とした。ＮＭＲ試料にはすべて直径４ｍｍのＳｈｉｇｅｍｉ管（Ｓｈｉｇｅｍｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用した。ＮＭＲバッファーの一価および二価のカチオン濃度は、細胞質のイオン強度に基づき選択した（文献４２）。
【0091】
ＮＭＲスペクトルは，Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ７００，８００，９００ＭＨｚ スペクトロメーターにクライオプローブ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＵＳＡ）を装着して記録した．１Ｄ １Ｈ ＮＭＲスペクトルは、８ｋのデータポイント、および２８８Ｋで２５ｐｐｍのスペクトル幅で収集された。１Ｈ－１Ｈ ２Ｄ ＮＯＥＳＹ スペクトルのスペクトル幅（全データポイント数）は、direct dimensionでは２５ｐｐｍ（２０４８）、in-direct dimensionでは２５ｐｐｍ（５１２または６００）、混合時間は１２０または２４０ｍｓ、繰り返し時間１．５ｓ、測定温度２８８Ｋまたは２９８Ｋを用いた。Ｗａｔｅｒｇａｔｅ ３－９－１９パルスシーケンスで水を抑制した。スペクトルの解析には，ＮＭＲＦＡＭ－ＳＰＡＲＫＹ（文献４３）（ｈｔｔｐｓ：／／ｎｍｒｆａｍ．ｗｉｓｃ．ｅｄｕ／ｎｍｒｆａｍ－ｓｐａｒｋｙ－ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／）とＴｏｐＳｐｉｎ ３．６．２ ＮＭＲ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｓｏｆｔｗａｒｅ （Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ， Ｉｎｃ．）を用いて解析した。
【0092】
実施例１：３′ＰＫ領域で形成される２つの二次構造の解析
まず、３′ＰＫの構造領域ともっともらしい構造を定義するために、３′ＰＫから切り離した一連のＲＮＡ断片を準備した（表２）。
なお、実験には、各配列の５′末端にＧＧＧが付加されたＲＮＡを用いた。
まず、３′ＰＫの構造領域ともっともらしい構造を定義するために、３′ＰＫから切り離した一連のＲＮＡ断片を準備した（表２）。
【表2】
【0093】
Ｒａｎｇａｎらによって決定された二次構造モデルを参考にした（文献９）。図３に、ＳＬ、ＰＫ、ＳＬＰ４、およびＰＫＰ４（順に、図３のＡ、Ｂ、ＣおよびＤ）と呼ばれる４つの設計ＲＮＡ断片の２Ｄ１Ｈ－１Ｈ ＮＯＥＳＹ スペクトルとＮＭＲデータから解明された２次構造を示す。ＳＬＰ４とＰＫＰ４は、それぞれＳＬとＰＫに、Ｐ４ステムとＰ４とＰ５の間のループ（Ｌ４／５）領域の配列を追加した断片に相当する。イミノプロトン共鳴は、ＲＮＡが塩基対を形成しているときのみ検出される。これは、一般にＮＭＲ検出には速すぎる溶媒水プロトンとの交換速度が、イミノプロトンが水素結合に関与すると十分に低くなるためである。
【0094】
ＰＫとＰＫＰ４はＰ１ｐｋとＰ２イミノプロトンの両方のシグナルを示した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｇＲＮＡ全体の二次構造については、いくつかの研究グループによって報告されている（文献２５－２９，３１，３２）。これらの解析から、３′ＰＫ領域はステムループ構造を形成していることが示唆された（文献２５－２９，３２）。ＮＭＲによる解析の結果、図３（ＢおよびＤ）において、ＰＫとＰＫＰ４は３′ＰＫ領域がシュードノット構造をとることが確認された。図３（ＢおよびＤ）では、ＰＫとＰＫＰ４の４塩基対のシグナルは、Ｐ１ステム構造のみを含むＲＮＡ配列からのＮＭＲスペクトルに基づき、Ｐ１ｐｋステムに起因することがわかった（図８）。Ｕ２９６０９、Ｕ２９６１０、Ｇ２９６４５はＰ１単独でのステム構造（Ｐ１ステム）のみに観測され、ＰＫとＰＫＰ４には観測されない。Ｐ１ステムで観測された化学シフトは、シュードノット構造に収容されたＰ１ｐｋ（ＰＫおよびＰＫＰ４）のものとわずかな差はあるがおおよそ一致した（表３および図８を参照）。ＰＫとＰＫＰ４のＰ２ステムのシグナルは、ＳＬとＳＬＰ４のシグナルとの比較から同定された。図３（ＢおよびＤ）のシュードノット構造（ＰＫとＰＫＰ４）のＰ２ステムのシグナルは、ＳＬのもの（図３Ａ）とほぼ同じであった。ＰＫＰ４断片は、塩基対Ｕ２９８５５－Ａ２９８６６、Ｕ２９８５６－Ａ２９８６５、Ｃ２９８５７－Ｇ２９８６４と推定される小さなシグナルを示した（図３Ｂ）。全体として、ＰＫとＰＫＰ４の塩基対形成パターンは、すべてシュードノット構造の形成と一致した。
【0095】
興味深いことに、ＳＬＰ４では、Ｕ２９６５５、Ｕ２９６５６、Ｕ２９６２９のイミノプロトン信号がＰ２には観測されなかった（図３Ｃ）。これらの３つのＵ－Ａペアは、ＳＬＰ４と同じ領域を含む３＿ＳＬ３ｂａｓｅでも観測されなかった（文献３２）。一方、Ｐ２ステムのみ（図９）、ＳＬ（図３Ａ）では、これらのシグナルが観測された。ＳＬはＰ２とＰ５の間に短いバルジ領域（Ｃ２９８５７－Ｇ２９８６１）を持ち（図３Ａ）、これはＳＬＰ４のＰ４－Ｐ５間の全長バルジループ領域の半分（Ｌ４／５；Ａ２９８５０－Ｇ２９８６１）（図３Ｃ）に相当する。Ｐ２ステムのみではバルジループ領域を持たなかった。また、Ｐ２とＰ５のステムを持ち、Ｌ４／５が全長のＳＬＬも、ＳＬＰ４と同様に非常に弱いＵ２９６５５とＵ２９６５６シグナルを示した（図１０）。これらのデータから、ＳＬＰ４とＳＬＬのＰ２領域の末端部位は、Ｌ４／５の上流（Ａ２９８５０－Ｕ２９８５６）を欠いた他の断片（ＳＬとＰ２シングルステム）とは明らかに異なる構造をとっており、おそらくＬ４／５のこの領域と相互作用していることが推測された。実際、Ａ２９８５０からＣ２９８５４の領域は、ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶ間で高度に保存されている（文献９）。これらの結果から、Ｌ４／５の上流領域はステムループ構造を変化させ、プライマーゼやＲｄＲｐによる認識に必須である可能性が示唆された。
Ｐ５ステムはステムループ構造（ＳＬとＳＬＰ４；図３（ＡおよびＣ））でのみ形成されていた。ＰＫＰ４もこの領域を含んでいたが、ＰＫＰ４ではＰ５ステムは形成されなかった。Ｐ１ｐｋとＰ５ステムの両方の形成が全長のｇＲＮＡ解析で示唆された（文献３１）。全ゲノム解析におけるこれらのデータは、シュードノットとステムループの２つのコンフォーマーが混在していることが想定されていたが、３′ＰＫ領域でシュードノット構造が形成できることは、これまで確認されていなかった。
Ｐ５ステムはステムループ構造（ＳＬとＳＬＰ４；図３（ＡおよびＣ））でのみ形成されていた。ＰＫＰ４もこの領域を含んでいたが、ＰＫＰ４ではＰ５ステムは形成されなかった。Ｐ１ｐｋとＰ５ステムの両方の形成が全長のｇＲＮＡ解析で示唆された（文献３１）。全ゲノム解析におけるこれらのデータは、シュードノットとステムループの２つのコンフォーマーが混在していることが想定されていたが、３′ＰＫ領域でシュードノット構造が形成できることは、これまで確認されていなかった。
【0096】
【表3】
【0097】
実施例２：ＲＮＡ断片とｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物の結合アッセイ
次に、ステムループ構造あるいはシュードノット構造を形成する４つのｇＲＮＡ断片（ＰＫ、ＳＬ、ＰＫＰ４、ＳＬＰ４）とｎｓｐ７－ｎｓｐ８との相互作用をゲルシフトアッセイにより検討した。ｎｓｐ７と混合したＲＮＡ断片は、ＲＮＡ－ｎｓｐ７複合体に起因するバンドを示さなかった。また、ｎｓｐ８と混合したＲＮＡ断片やｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物では、ＲＮＡ－タンパク質複合体による新しいシフトしたバンドを示した（図４）。これらの結果は、ｎｓｐ７が二重鎖や一本鎖ＲＮＡに直接結合しないというこれまでの報告と一致していた（文献３３および３４）。また、ＰＫＰ４（２．５μＭ）およびＳＬＰ４（２．３μＭ）に対して、ｎｓｐ７－ｎｓｐ８が比較的に高い見かけ上の親和性を示すこともわかった。この結果は、３′ＰＫのステムループＲＮＡ構造がｎｓｐ７－ｎｓｐ８複合体をリクルートし、ｎｓｐ７－ｎｓｐ８と結合している間にシュードノット構造にコンフォメーションが変化するという現在の仮説と矛盾しない。また、ｎｓｐ７－ｎｓｐ８がステムループ型と平衡状態にある３′ＰＫのシュードノット型に直接結合できる可能性が新たに示された。ｎｓｐ７－ｎｓｐ８に対する見かけの親和性は、ＰＫ（５．１μＭ）とＳＬ（５．５μＭ；図１１Ｂ）で顕著に低下していた。この結果は、Ｐ４ステムまたはＰ４とＰ５の間のループがタンパク質結合に関与していることを示唆するものであった。ｎｓｐ８またはｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物を添加すると、すべてのＲＮＡ断片にタンパク質結合による２本の遅い移動度バンド（図１１Ａの矢印）が見られた。すべてのＲＮＡ断片について、Ｈｉｌｌ－Ｌａｎｇｍｕｉｒ式から求めたＨｉｌｌ係数は１以上であった（図１１Ｂ）。特に、ＰＫＰ４とＳＬＰ４については、Ｈｉｌｌ係数が約２．７であり、複数のｎｓｐ７－ｎｓｐ８複合体がこれらのＲＮＡ断片と相互作用している可能性があることがわかった。ｎｓｐ７とｎｓｐ８の混合物が複数の多量体コンフォーマーを示すことは既に報告されている（文献３５，３６）。したがって、これらのバンドは、ＲＮＡ断片と結合したタンパク質の多量体構造の違いを反映していると考えることができる。
次に、ステムループ構造あるいはシュードノット構造を形成する４つのｇＲＮＡ断片（ＰＫ、ＳＬ、ＰＫＰ４、ＳＬＰ４）とｎｓｐ７－ｎｓｐ８との相互作用をゲルシフトアッセイにより検討した。ｎｓｐ７と混合したＲＮＡ断片は、ＲＮＡ－ｎｓｐ７複合体に起因するバンドを示さなかった。また、ｎｓｐ８と混合したＲＮＡ断片やｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物では、ＲＮＡ－タンパク質複合体による新しいシフトしたバンドを示した（図４）。これらの結果は、ｎｓｐ７が二重鎖や一本鎖ＲＮＡに直接結合しないというこれまでの報告と一致していた（文献３３および３４）。また、ＰＫＰ４（２．５μＭ）およびＳＬＰ４（２．３μＭ）に対して、ｎｓｐ７－ｎｓｐ８が比較的に高い見かけ上の親和性を示すこともわかった。この結果は、３′ＰＫのステムループＲＮＡ構造がｎｓｐ７－ｎｓｐ８複合体をリクルートし、ｎｓｐ７－ｎｓｐ８と結合している間にシュードノット構造にコンフォメーションが変化するという現在の仮説と矛盾しない。また、ｎｓｐ７－ｎｓｐ８がステムループ型と平衡状態にある３′ＰＫのシュードノット型に直接結合できる可能性が新たに示された。ｎｓｐ７－ｎｓｐ８に対する見かけの親和性は、ＰＫ（５．１μＭ）とＳＬ（５．５μＭ；図１１Ｂ）で顕著に低下していた。この結果は、Ｐ４ステムまたはＰ４とＰ５の間のループがタンパク質結合に関与していることを示唆するものであった。ｎｓｐ８またはｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物を添加すると、すべてのＲＮＡ断片にタンパク質結合による２本の遅い移動度バンド（図１１Ａの矢印）が見られた。すべてのＲＮＡ断片について、Ｈｉｌｌ－Ｌａｎｇｍｕｉｒ式から求めたＨｉｌｌ係数は１以上であった（図１１Ｂ）。特に、ＰＫＰ４とＳＬＰ４については、Ｈｉｌｌ係数が約２．７であり、複数のｎｓｐ７－ｎｓｐ８複合体がこれらのＲＮＡ断片と相互作用している可能性があることがわかった。ｎｓｐ７とｎｓｐ８の混合物が複数の多量体コンフォーマーを示すことは既に報告されている（文献３５，３６）。したがって、これらのバンドは、ＲＮＡ断片と結合したタンパク質の多量体構造の違いを反映していると考えることができる。
【0098】
実施例３：ｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物との結合によるＲＮＡの構造変化
ゲルシフトアッセイにより、ＰＫＰ４とＳＬＰ４はＰＫやＳＬよりもｎｓｐ７－ｎｓｐ８に親和性が高いことがわかったため、ＲＮＡ－タンパク質相互作用のより詳細な情報を得るために、さらにＮＭＲ分析に使用することにした。ＲＮＡを含まないｎｓｐ７とｎｓｐ８の混合物のＮＭＲ信号は顕著なブロード化を示し、ＮＭＲの時間スケールよりも非一様な、あるいは速い複合化速度が示唆された（図５Ｃ）。実際、ｎｓｐ７とｎｓｐ８の混合物が多様な多量体形成パターンを示すことは既に報告されており、その主成分はｎｓｐ７：ｎｓｐ８＝２：２の複合体であった（文献３５，３６）。ＰＫＰ４をｎｓｐ７とｎｓｐ８の混合物に１：２：２（ＰＫＰ４：ｎｓｐ７：ｎｓｐ８）の割合で添加すると、ＲＮＡを含まないｎｓｐ７とｎｓｐ８の混合物のシグナル（図５Ｃ）と比較して、タンパク質によるシグナルは劇的な違いを示した（図５Ａ）。特に、ＲＮＡを添加することで、９～１０ｐｐｍに新たなシャープなシグナルがいくつか観測された（図５Ａ）。これらの新しいシグナルはタンパク質のアミドプロトンのシグナルと考えられ、ＲＮＡの結合によってｎｓｐ７－ｎｓｐ８複合体の大きな構造変化が引き起こされたことが示唆された。ｎｓｐ７とｎｓｐ８タンパク質にＳＬＰ４を１：１：１の割合で添加すると、ＲＮＡを含まないｎｓｐ７とｎｓｐ８タンパク質のスペクトル（図５Ｃ）と比較して、同様の劇的な変化と鋭いシグナルが観測された（図５Ｂ）。なお、ｎｓｐ７とｎｓｐ８の組成を減らしたのは、１：２：２混合試料ではＳＬＰ４のイミノプロトンＮＭＲ信号が大幅にブロード化し、ＮＯＥ信号が観測しにくくなったためである。図５ＡおよびＢでシャープなＮＭＲシグナルが現れたことから、ＲＮＡ断片に結合したｎｓｐ７－ｎｓｐ８の特定の多量体が安定化したことが示唆された。また、ｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物で観測されたＮＯＥは、ＳＬＰ４－ｎｓｐ７－ｎｓｐ８およびＰＫＰ４－ｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物では観測されなかった（図１２参照）。このことから、ｎｓｐ７－ｎｓｐ８タンパク質の大部分は、混合試料中のＰＫＰ４とＳＬＰ４の両方のＲＮＡ断片と複合体化しているはずであることが示唆された。図５Ａには、ＰＫＰ４－ｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合試料でのみ観測されたタンパク質に起因するシグナル（アスタリスクで示す）がいくつか示されている。このように、ＰＫＰ４とＳＬＰ４では、ＲＮＡ断片との相互作用の様式が異なる可能性がある。
ゲルシフトアッセイにより、ＰＫＰ４とＳＬＰ４はＰＫやＳＬよりもｎｓｐ７－ｎｓｐ８に親和性が高いことがわかったため、ＲＮＡ－タンパク質相互作用のより詳細な情報を得るために、さらにＮＭＲ分析に使用することにした。ＲＮＡを含まないｎｓｐ７とｎｓｐ８の混合物のＮＭＲ信号は顕著なブロード化を示し、ＮＭＲの時間スケールよりも非一様な、あるいは速い複合化速度が示唆された（図５Ｃ）。実際、ｎｓｐ７とｎｓｐ８の混合物が多様な多量体形成パターンを示すことは既に報告されており、その主成分はｎｓｐ７：ｎｓｐ８＝２：２の複合体であった（文献３５，３６）。ＰＫＰ４をｎｓｐ７とｎｓｐ８の混合物に１：２：２（ＰＫＰ４：ｎｓｐ７：ｎｓｐ８）の割合で添加すると、ＲＮＡを含まないｎｓｐ７とｎｓｐ８の混合物のシグナル（図５Ｃ）と比較して、タンパク質によるシグナルは劇的な違いを示した（図５Ａ）。特に、ＲＮＡを添加することで、９～１０ｐｐｍに新たなシャープなシグナルがいくつか観測された（図５Ａ）。これらの新しいシグナルはタンパク質のアミドプロトンのシグナルと考えられ、ＲＮＡの結合によってｎｓｐ７－ｎｓｐ８複合体の大きな構造変化が引き起こされたことが示唆された。ｎｓｐ７とｎｓｐ８タンパク質にＳＬＰ４を１：１：１の割合で添加すると、ＲＮＡを含まないｎｓｐ７とｎｓｐ８タンパク質のスペクトル（図５Ｃ）と比較して、同様の劇的な変化と鋭いシグナルが観測された（図５Ｂ）。なお、ｎｓｐ７とｎｓｐ８の組成を減らしたのは、１：２：２混合試料ではＳＬＰ４のイミノプロトンＮＭＲ信号が大幅にブロード化し、ＮＯＥ信号が観測しにくくなったためである。図５ＡおよびＢでシャープなＮＭＲシグナルが現れたことから、ＲＮＡ断片に結合したｎｓｐ７－ｎｓｐ８の特定の多量体が安定化したことが示唆された。また、ｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物で観測されたＮＯＥは、ＳＬＰ４－ｎｓｐ７－ｎｓｐ８およびＰＫＰ４－ｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物では観測されなかった（図１２参照）。このことから、ｎｓｐ７－ｎｓｐ８タンパク質の大部分は、混合試料中のＰＫＰ４とＳＬＰ４の両方のＲＮＡ断片と複合体化しているはずであることが示唆された。図５Ａには、ＰＫＰ４－ｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合試料でのみ観測されたタンパク質に起因するシグナル（アスタリスクで示す）がいくつか示されている。このように、ＰＫＰ４とＳＬＰ４では、ＲＮＡ断片との相互作用の様式が異なる可能性がある。
【0099】
ＲＮＡのＮＭＲ信号については、ＲＮＡ－タンパク質混合物試料は結合時に１０．５－１４．５ｐｐｍで線幅が広がった（図５ＡおよびＢ）。これは、ＰＫＰ４とＳＬＰ４の両方において、ＲＮＡ－タンパク質複合体のモル質量がＲＮＡ断片単独の場合よりも大きいことを考えると、驚くにはあたらない。ｎｓｐ７－ｎｓｐ８と混合したＰＫＰ４とＳＬＰ４のイミノプロトン信号の一部（図５ＡおよびＢ）は、タンパク質結合によってＲＮＡ断片単独の信号（図５ＤおよびＥ）から化学シフトが変化していることが確認された。図６－１は、（Ａ）ＳＬＰ４，（Ｂ）ＰＫＰ４，（Ｃ）ＳＬＰ４－ｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物（１：１：１），（Ｄ）ＰＫＰ４－ｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物（１：２：２）の二次元１Ｈ／１ Ｈ ＮＯＥＳＹスペクトルである。ＳＬＰ４とＰＫＰ４は共にｎｓｐ７－ｎｓｐ８を添加してもイミノ・イミノ ＮＯＥをほとんど示さなかった。そこで、水素結合塩基対でのみ観測される１１．５－１４．５ｐｐｍのイミノプロトン共鳴（Ｕ Ｈ３，Ｇ Ｈ１，Ｕ Ｈ３）と５．５－８．５ｐｐｍのＡ Ｈ２またはＣアミノ基プロトン共鳴間の塩基対内ＮＯＥを用いてさらに解析した。ｎｓｐ７－ｎｓｐ８と結合したＰＫＰ４のスペクトルパターン（図６－１、Ｄ）は、タンパク質を添加していないＰＫＰ４のスペクトルパターン（図６―１、Ｂ）とほとんど変わりがない。ｎｓｐ７－ｎｓｐ８結合後、ＰＫＰ４はＰ１ｐｋ、Ｐ２ステム、Ｐ４について、残基間ＮＯＥによるクロスピーク（図６－１のＤ）の大部分を保持していた。また、観測された化学シフトの変化は、Ｐ１ｐｋとＰ２で０．０６ｐｐｍ以内であった（図６Ｆ）。この結果から、ＰＫＰ４はシュードノット構造を維持したまま、ｎｓｐ７－ｎｓｐ８と結合することが示唆された（図６－１のＢ、Ｄ；図６－２のＦ）。
【0100】
一方、遊離のＳＬＰ４（図６－１のＡ）とｎｓｐ７－ｎｓｐ８と結合したＳＬＰ４（図６－１のＣ）では、スペクトルパターンが大きく異なっていることがわかる。両スペクトルとも、Ｐ２ステムとＰ４の残基間ＮＯＥによるクロスピークが観測された。ｎｓｐ７－ｎｓｐ８と結合したＳＬＰ４では、線幅が広がるためＰ２ステムの隣接塩基間の弱いＮＯＥシグナルが欠落しているが、ペア内の強いＮＯＥシグナルはすべて保持されていた。興味深いことに、ｎｓｐ７－ｎｓｐ８と複合体化したＳＬＰ４ではＰ５による塩基対内ＮＯＥは観測されなかったが（図６－１のＣ）、ＳＬＰ４のみではＰ５によるＮＯＥが明確に見られた（図６－１のＡ）。したがって、この結果はｎｓｐ７－ｎｓｐ８結合によるＰ５ステムの不安定化を示唆するものであった。
【0101】
いずれのＲＮＡもｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物を添加することでＰ４ステムの化学シフトが小さいながらも顕著に変化し、Ｐ４ステムがタンパク質相互作用に関与していると考えられる（図６－２のＦおよび表３）。このことは、ＰKＰ４やＳＬＰ４がＰ４を欠くＰＫやＳＬよりも高い見かけ上の結合親和性を持つことと矛盾しない。ＮＭＲの結果は、Ｐ４とｎｓｐ７－ｎｓｐ８複合体の相互作用がＰKＰ４とＳＬＰ４への親和性を高めていることを支持するものであった。
【0102】
検討
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むＳＡＲＳｒ－ＣｏＶのｇＲＮＡ転写開始機構は、近年盛んに研究されているが、これまで不明な点が多くあった。ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶを含むベータコロナウイルスでは、センス鎖ｇＲＮＡやｓｇＲＮＡを転写するためには、アンチセンス鎖のｇＲＮＡをセンス鎖から転写することが第一段階であり、必須である。転写開始仮説モデルによるとｎｓｐ７とｎｓｐ８の複合体により、ｇＲＮＡの３′末端でのプライマー伸長が達成される（文献５、非特許文献３）。ｎｓｐ７－ｎｓｐ８複合体は、ステムループ構造を形成する３′ＰＫに結合し、プライマーＲＮＡが伸長すると、３′ＰＫはシュードノットに構造を変化させると提唱されている。しかし、３′ＰＫのシュードノット構造の存在は、実験的には明らかにされていなかった。今回、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の３′ＰＫがステムループ構造だけでなく、シュードノット構造も形成することを明らかにした。Ｐ１ｐｋ、Ｐ２、Ｐ５の３つのステムを持つシュードノット構造は、計算機による立体構造予測プログラムを用いた研究により、以前から提案されていた（文献３７）。本発明者らのＮＭＲ解析（図３Ｄ）では、Ｐ５ステムはシュードノット構造では形成されていないことが明らかになった。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むＳＡＲＳｒ－ＣｏＶのｇＲＮＡ転写開始機構は、近年盛んに研究されているが、これまで不明な点が多くあった。ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶを含むベータコロナウイルスでは、センス鎖ｇＲＮＡやｓｇＲＮＡを転写するためには、アンチセンス鎖のｇＲＮＡをセンス鎖から転写することが第一段階であり、必須である。転写開始仮説モデルによるとｎｓｐ７とｎｓｐ８の複合体により、ｇＲＮＡの３′末端でのプライマー伸長が達成される（文献５、非特許文献３）。ｎｓｐ７－ｎｓｐ８複合体は、ステムループ構造を形成する３′ＰＫに結合し、プライマーＲＮＡが伸長すると、３′ＰＫはシュードノットに構造を変化させると提唱されている。しかし、３′ＰＫのシュードノット構造の存在は、実験的には明らかにされていなかった。今回、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の３′ＰＫがステムループ構造だけでなく、シュードノット構造も形成することを明らかにした。Ｐ１ｐｋ、Ｐ２、Ｐ５の３つのステムを持つシュードノット構造は、計算機による立体構造予測プログラムを用いた研究により、以前から提案されていた（文献３７）。本発明者らのＮＭＲ解析（図３Ｄ）では、Ｐ５ステムはシュードノット構造では形成されていないことが明らかになった。
【0103】
これまでの全ゲノムに対するケミカルプロービング解析では、３′ＰＫにおいてＡ２９６３６－Ｕ２９６５０，Ｕ２９６３７－Ａ２９６４９、Ｇ２９６３９－Ｕ２９６４６、Ｃ２９６４０－Ｇ２９６４５の塩基対形成が報告されている（文献２５－２９）。一方、ＮＭＲ実験では、ＳＬとＳＬＰ４ではこれらの塩基対は観察されなかった（図３）。Ａ２９６３６－Ｕ２９６５０を除くこれらの塩基対は、以前に報告された３＿ＳＬ３ｂａｓｅでも観察されなかった（文献３２）。これらの塩基はＰ１ｐｋのステムを形成しているか、あるいはシュードノット構造が形成される際にＰ１ｐｋとＰ２の接合部に配置されていることがわかった。実験的に決定された３′ＰＫのステムループとシュードノット二次構造から、化学証明解析でＰ２ステムのループに配置された未反応塩基は、シュードノット構造を形成する少量のＲＮＡに起因すると推測することができる。
【0104】
ＲＮＡ－ｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物のゲルシフトアッセイとＮＭＲ解析により、ｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物は、突出末端を持つシングルステムループのみならず、分岐したステムループ（ＳＬＰ４）やシュードノット（ＰＫＰ４）とも相互作用することが示された。ＰＫＰ４とＳＬＰ４は、ｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物を添加することでＰ４ステムに対する１Ｈ ＮＭＲシグナルに軽度の化学シフト変化を示し（表４）、ＳＬやＰＫよりもわずかに高い親和性を持つことがわかった。これらの結果は、Ｐ４がｎｓｐ７－ｎｓｐ８結合に関与している可能性を示唆するものであった。また、２次元ＮＭＲのデータから、ＳＬＰ４のＰ５ステムはｎｓｐ７－ｎｓｐ８結合によって不安定化することが明らかになった。また、ＰＫＰ４のＰ５領域は、ｎｓｐ７－ｎｓｐ８が結合した状態でも、結合していない状態でも、塩基対を形成していないことがわかった。この結果は、ｇＲＮＡが３′ＰＫ領域でｎｓｐ７－ｎｓｐ８と結合すると、３′末端が一本鎖になることを初めて実験的に証明した（図７）。
【0105】
興味深いことに、ｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物のＮＭＲシグナルは、ＰＫＰ４やＳＬＰＫの添加により化学シフトが大きく変化した（図５ＡおよびＢ）。これらのシャープなスペクトルを持つシグナルは、遊離のｎｓｐ７、ｎｓｐ８（ＢＭＲＢ ＩＤ ５１３２５）またはＲＮＡ断片を含まないｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物のシグナルとは異なっていた（文献３８）。また、ＰＫＰ４やＳＬＰ４を添加すると、ｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物中のタンパク質の多量体化や高速交換に起因するブロードなシグナルが減少することがわかった。この結果は、ＲＮＡ断片との結合により、様々な多量体化状態を持つｎｓｐ７－ｎｓｐ８複合体が、特定のｎｓｐ７－ｎｓｐ８多量体化状態を持つ固有の複合体に構造変化する可能性を示唆するものであった。ｎｓｐ７－ｎｓｐ８に起因する９－１０ｐｐｍの１Ｈ ＮＭＲシグナルは、ＳＬＰ４－タンパク質とＰＫＰ４－タンパク質複合体の間で異なる化学シフトを示した（図５Ａ、Ｂアスタリスクで示すシグナル）。この結果は、ｎｓｐ７－ｎｓｐ８とＳＬＰ４およびＰＫＰ４の複合体は、ＲＮＡの構造によって何らかの構造の違いがあることを示唆するものであった。ＳＬＰ４－ｎｓｐ７－ｎｓｐ８混合物のｎｓｐ７－ｎｓｐ８は、１：１：１混合物では鋭いシグナルを示したが、１：２：２混合物では線幅の広がりを示した理由は不明である。これは、図２で示唆されたように、ｎｓｐ７－ｎｓｐ８を多く搭載することでＳＬＰ４－ｎｓｐ７－ｎｓｐ８複合体が不安定化したことを示唆している可能性がある。ＳＬＰ４やＰＫＰ４との複合体形成に伴うｎｓｐ７－ｎｓｐ８の構造変化については、さらなる研究が必要である。
【0106】
以上のことから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をはじめとするＳＡＲＳｒ－ＣｏＶの仮想的なゲノムＲＮＡ複製開始モデル（図２）のキーコンセプトであるシュードノット構造に関する初めての実験的証拠を得ることができた。この構造は、ゲノムＲＮＡ複製にとってかなり稀であり、重要であることから、今回の結果は、ＰＫＰ４とその関連ＲＮＡ断片が、ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶを含む抗コロナウイルス薬の開発における治療標的となる可能性を示している。３′ＰＫ領域はベータコロナウイルス間で高度に保存されている（文献３９）。また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体の変異解析では、３′ＰＫ領域の変異はほとんど見られず、ステムループ構造を維持していることが示された。これらの結果は、構造特異的な結合がウイルスの増殖を制御している可能性を示唆している。また、ｎｓｐ７－ｎｓｐ８との相互作用により、３′ＰＫのシュードノット構造とステムループ構造のＲＮＡ構造の詳細が初めて明らかになった。また、３′ＰＫのＰ５ステムは、プライマーゼ複合体がステムループ化した３′ＰＫに結合すると、一本鎖に構造変化する可能性が高いことも明らかになった（図７）。
【0107】
実施例４：アンチセンスＲＮＡを用いた実験
反応条件：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨでｐＨ７．４に合わせた），１４０ｍＭ ＫＣｌ，０．８ｍＭ ＭｇＣｌ２
ＰＫＰ４，ＳＬＰ４ 各ＲＮＡ濃度０．４μＭ，ｎｓｐ７ ６μＭ，ｎｓｐ８ ６μＭ
アンチセンスＲＮＡ ０．２（＋）または１（＋＋）μＭ（配列：ＧＧＧＡＡＵＡＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＧＡＡＵ（配列番号２５）
上記の溶液５μＬを室温で３０分静置後に電気泳動（４℃、１００Ｖ，５２分）した。
ゲル：６％ ポリアクリルアミド（アクリルアミド：ビス＝１９：１）、３５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，４３ｍＭ イミダゾール、１０ｍＭ ＫＣｌ
泳動バッファー：３５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，４３ ｍＭ イミダゾール、１０ｍＭ ＫＣｌ
反応条件：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨでｐＨ７．４に合わせた），１４０ｍＭ ＫＣｌ，０．８ｍＭ ＭｇＣｌ２
ＰＫＰ４，ＳＬＰ４ 各ＲＮＡ濃度０．４μＭ，ｎｓｐ７ ６μＭ，ｎｓｐ８ ６μＭ
アンチセンスＲＮＡ ０．２（＋）または１（＋＋）μＭ（配列：ＧＧＧＡＡＵＡＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＧＡＡＵ（配列番号２５）
上記の溶液５μＬを室温で３０分静置後に電気泳動（４℃、１００Ｖ，５２分）した。
ゲル：６％ ポリアクリルアミド（アクリルアミド：ビス＝１９：１）、３５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，４３ｍＭ イミダゾール、１０ｍＭ ＫＣｌ
泳動バッファー：３５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，４３ ｍＭ イミダゾール、１０ｍＭ ＫＣｌ
【0108】
ＰＫＰ４あるいはＳＬＰ４に１５当量のｎｓｐ７とｎｓｐ８を添加しさらにＲＮＡに対して０．５当量あるいは２．５当量のアンチセンスＲＮＡを添加した試料の電気泳動を行った結果、ＰＫＰ４に対して２．５当量アンチセンスＲＮＡを添加した場合では、アンチセンスを添加していないか、０．５当量添加した場合と比べて、タンパク質と結合していないＲＮＡのバンドが濃くなった。一方、ＳＬＰ４ではアンチセンスＲＮＡを添加してもＳＬＰ４のみのバンドに変化はなかった。これらのことから、アンチセンスＲＮＡはＰＫＰ４とｎｓｐ７－ｎｓｐ８の複合体からＰＫＰ４を解離させることが示唆された。アンチセンスＲＮＡはＰＫＰ４とｎｓｐ７－ｎｓｐ８の結合を選択的に阻害することから、このアンチセンスＲＮＡはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡ転写を阻害する抗ＣＯＶＩＤ－１９薬の候補になると考えられる。
【0109】
実施例５：アンチセンスＲＮＡを用いた実験２
本実施例および実施例６では、ベータコロナ属内の配列相同性を考慮してアンチセンスＲＮＡを作成し、ＰＫＰ４およびＳＬＰ４それぞれとｎｓｐ７：ｎｓｐ８複合体の結合を阻害するアンチセンスＲＮＡの探索を行った。
反応条件：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨでｐＨ７．４に合わせた），１４０ｍＭ ＫＣｌ，０．８ｍＭ ＭｇＣｌ２
ＰＫＰ４，ＳＬＰ４ 各ＲＮＡ濃度０．２μＭ，ｎｓｐ７ ３μＭ，ｎｓｐ８ ３μＭ
アンチセンスＲＮＡ 各０．１（＋）または１（＋＋）μＭ
アンチセンスＲＮＡ
＃１ 配列：ＡＡＵＡＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＧＡＡＵ（配列番号２７）
＃２ 配列：ＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＵＵＡＣＧＡＧＡＡＵＵ（配列番号２８）
＃３ 配列：ＡＡＡＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＡＵＵＣＡＵＵＣＵ（配列番号２９）
＃４ 配列：ＵＵＧＵＧＣＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡＣＧＡＧＡ（配列番号３０）
＃５ 配列：ＵＧＵＧＡＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＣＵＡＣＡＵＣＵＡＣ（配列番号３１）
上記の溶液１０μＬを室温で３０分静置後に電気泳動（４℃、１００Ｖ定電圧，１時間）した。
ゲル：６％ ポリアクリルアミド（アクリルアミド：ビス＝１９：１）、３５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，４３ｍＭ イミダゾール、１０ｍＭ ＫＣｌ
泳動バッファー：３５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，４３ ｍＭ イミダゾール、１０ｍＭ ＫＣｌ
本実施例および実施例６では、ベータコロナ属内の配列相同性を考慮してアンチセンスＲＮＡを作成し、ＰＫＰ４およびＳＬＰ４それぞれとｎｓｐ７：ｎｓｐ８複合体の結合を阻害するアンチセンスＲＮＡの探索を行った。
反応条件：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨでｐＨ７．４に合わせた），１４０ｍＭ ＫＣｌ，０．８ｍＭ ＭｇＣｌ２
ＰＫＰ４，ＳＬＰ４ 各ＲＮＡ濃度０．２μＭ，ｎｓｐ７ ３μＭ，ｎｓｐ８ ３μＭ
アンチセンスＲＮＡ 各０．１（＋）または１（＋＋）μＭ
アンチセンスＲＮＡ
＃１ 配列：ＡＡＵＡＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＧＡＡＵ（配列番号２７）
＃２ 配列：ＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＵＵＡＣＧＡＧＡＡＵＵ（配列番号２８）
＃３ 配列：ＡＡＡＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＡＵＵＣＡＵＵＣＵ（配列番号２９）
＃４ 配列：ＵＵＧＵＧＣＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡＣＧＡＧＡ（配列番号３０）
＃５ 配列：ＵＧＵＧＡＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＣＵＡＣＡＵＣＵＡＣ（配列番号３１）
上記の溶液１０μＬを室温で３０分静置後に電気泳動（４℃、１００Ｖ定電圧，１時間）した。
ゲル：６％ ポリアクリルアミド（アクリルアミド：ビス＝１９：１）、３５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，４３ｍＭ イミダゾール、１０ｍＭ ＫＣｌ
泳動バッファー：３５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，４３ ｍＭ イミダゾール、１０ｍＭ ＫＣｌ
【0110】
ＳＬＰ４に１５当量のｎｓｐ７とｎｓｐ８を添加しさらにＲＮＡに対して０．５当量あるいは５当量のアンチセンスＲＮＡ＃１～＃５の何れかを添加した試料の電気泳動を行った結果、ＳＬＰ４に対してアンチセンスＲＮＡ＃３および＃４をそれぞれ添加した場合では、アンチセンスを添加していない場合と比べて、タンパク質と結合していないＲＮＡのバンドが濃くなった。一方、ＰＫＰ４ではアンチセンスＲＮＡ＃３および＃４をそれぞれ添加してもＰＫＰ４のみのバンドに変化はなかった（図１４）。これらのことから、アンチセンスＲＮＡ＃３および＃４はＳＬＰ４とｎｓｐ７－ｎｓｐ８の複合体からＳＬＰ４を解離させることが示唆された。アンチセンスＲＮＡ＃３および＃４はＳＬＰ４とｎｓｐ７－ｎｓｐ８の結合を選択的に阻害することから、これらのアンチセンスＲＮＡはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡ転写を阻害する抗ＣＯＶＩＤ－１９薬の候補になると考えられる。
【0111】
実施例６：アンチセンスＲＮＡを用いた実験３
反応条件：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨでｐＨ７．４に合わせた），１４０ｍＭ ＫＣｌ，０．８ｍＭ ＭｇＣｌ２
ＰＫＰ４，ＳＬＰ４ 各ＲＮＡ濃度０．２μＭ，ｎｓｐ７ ３μＭ，ｎｓｐ８ ３μＭ
アンチセンスＲＮＡ 各０．２（＋）または１（＋＋）μＭ
アンチセンスＲＮＡ
＃６ 配列：ＵＵＧＵＧＣＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡ（配列番号３２）
＃７ 配列：ＵＧＵＧＡＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＣＵＡＣＡ（配列番号３３）
＃８ 配列：ＡＵＵＣＵＣＣＵＡＡＧＡＡＧＣＵＡＵＵ（配列番号３４）
＃９ 配列：ＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡＣＧＡＧＡＡＵＵＣＡＵＵＣＵ（配列番号３５）
＃１０ 配列：ＡＡＡＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＡＵＵＣＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧ（配列番号３６）
＃１１ 配列：ＡＵＣＵＡＣＵＵＧＵＧＣＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡＣＧＡＧＡＡ（配列番号３７）
＃１２ 配列：ＵＧＵＧＡＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＣＵＡＣＡＵＣＵＡＵ（配列番号３８）
上記の溶液１０μＬを３０℃で３０分静置後に電気泳動（４℃、１００Ｖ定電圧，１時間）した。
ゲル：６％ ポリアクリルアミド（アクリルアミド：ビス＝１９：１）、３５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，４３ｍＭ イミダゾール、１０ｍＭ ＫＣｌ
泳動バッファー：３５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，４３ ｍＭ イミダゾール、１０ｍＭ ＫＣｌ
反応条件：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨでｐＨ７．４に合わせた），１４０ｍＭ ＫＣｌ，０．８ｍＭ ＭｇＣｌ２
ＰＫＰ４，ＳＬＰ４ 各ＲＮＡ濃度０．２μＭ，ｎｓｐ７ ３μＭ，ｎｓｐ８ ３μＭ
アンチセンスＲＮＡ 各０．２（＋）または１（＋＋）μＭ
アンチセンスＲＮＡ
＃６ 配列：ＵＵＧＵＧＣＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡ（配列番号３２）
＃７ 配列：ＵＧＵＧＡＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＣＵＡＣＡ（配列番号３３）
＃８ 配列：ＡＵＵＣＵＣＣＵＡＡＧＡＡＧＣＵＡＵＵ（配列番号３４）
＃９ 配列：ＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡＣＧＡＧＡＡＵＵＣＡＵＵＣＵ（配列番号３５）
＃１０ 配列：ＡＡＡＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＡＵＵＣＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧ（配列番号３６）
＃１１ 配列：ＡＵＣＵＡＣＵＵＧＵＧＣＵＡＵＧＵＡＧＵＵＡＣＧＡＧＡＡ（配列番号３７）
＃１２ 配列：ＵＧＵＧＡＧＡＵＵＡＡＡＧＵＵＡＡＣＵＡＣＡＵＣＵＡＵ（配列番号３８）
上記の溶液１０μＬを３０℃で３０分静置後に電気泳動（４℃、１００Ｖ定電圧，１時間）した。
ゲル：６％ ポリアクリルアミド（アクリルアミド：ビス＝１９：１）、３５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，４３ｍＭ イミダゾール、１０ｍＭ ＫＣｌ
泳動バッファー：３５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，４３ ｍＭ イミダゾール、１０ｍＭ ＫＣｌ
【0112】
ＳＬＰ４に１５当量のｎｓｐ７とｎｓｐ８を添加しさらにＲＮＡに対して１当量あるいは５当量のアンチセンスＲＮＡ＃６～＃１２の何れかを添加した試料の電気泳動を行った結果、ＳＬＰ４に対してアンチセンスＲＮＡ＃９および＃１０をそれぞれ添加した場合では、アンチセンスを添加していない場合と比べて、タンパク質と結合していないＲＮＡのバンドが濃くなった。さらに、ＰＫＰ４に対してアンチセンスＲＮＡ＃１０を添加した場合では、アンチセンスを添加していない場合と比べて、タンパク質と結合していないＲＮＡのバンドが濃くなった（図１７）。これらのことから、アンチセンスＲＮＡ＃９および＃１０はＳＬＰ４とｎｓｐ７－ｎｓｐ８の複合体からＳＬＰ４を解離させることが示唆された。さらに、アンチセンスＲＮＡ＃１０は、ＰＫＰ４とｎｓｐ７－ｎｓｐ８の複合体からＰＫＰ４を解離させることが示唆された。よって、アンチセンスＲＮＡ＃９および＃１０はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡ転写を阻害する抗ＣＯＶＩＤ－１９薬の候補になると考えられる。
【0113】
文献リスト
1 Wu, F. et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature 579, 265-269 (2020). https://doi.org:10.1038/s41586-020-2008-3
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】