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特開2024-12927ブタ細胞試料のヒトへのウイルス感染性を検査する方法、及び異種移植材製品の作成方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024012927
(43)【公開日】2024-01-31
(54)【発明の名称】ブタ細胞試料のヒトへのウイルス感染性を検査する方法、及び異種移植材製品の作成方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/70 20060101AFI20240124BHJP
C12Q 1/6888 20180101ALI20240124BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240124BHJP
A61L 27/38 20060101ALI20240124BHJP
A61K 35/14 20150101ALI20240124BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240124BHJP
C12N 5/09 20100101ALN20240124BHJP
C12N 5/071 20100101ALN20240124BHJP
C12N 7/00 20060101ALN20240124BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/70
C12Q1/6888 Z ZNA
C12Q1/02
A61L27/38 100
A61L27/38 120
A61K35/14 Z
A61P43/00 105
C12N5/09
C12N5/071
C12N7/00
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022114759
(22)【出願日】2022-07-19
(71)【出願人】
【識別番号】505327631
【氏名又は名称】株式会社栄養・病理学研究所
(71)【出願人】
【識別番号】503420833
【氏名又は名称】学校法人常翔学園
(74)【代理人】
【識別番号】100131705
【弁理士】
【氏名又は名称】新山 雄一
(74)【代理人】
【識別番号】100114292
【弁理士】
【氏名又は名称】来間 清志
(72)【発明者】
【氏名】井上 亮
(72)【発明者】
【氏名】塚原 隆充
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4C081
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QQ08
4B063QQ10
4B063QR08
4B063QR42
4B063QR62
4B063QR66
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
4B065AA90X
4B065AA93X
4B065AA97X
4B065AC20
4B065CA44
4C081AB11
4C081AB12
4C081BA14
4C081CD34
4C081EA02
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB34
4C087DA06
4C087NA01
4C087NA06
4C087ZB21
(57)【要約】
【課題】ヒトへのブタウイルス感染性の検査が改善されたブタ細胞試料のヒトへのウイルス感染性を検査する方法、及び異種移植材製品の作成方法を提供すること。
【解決手段】ブタ細胞試料のヒトへのウイルス感染性を検査する方法であって、
ブタ細胞試料と、ヒト細胞とを、互いに接触可能な環境で共培養すること、
前記ヒト細胞がマーカー及び／又は標識を有し、
前記マーカー及び／又は標識に基づき前記ヒト細胞を前記ブタ細胞試料から分離すること、及び
前記分離後のヒト細胞において、前記ブタ細胞試料が有し得る少なくとも１種のウイルスを検出することを含む、前記ウイルスのヒトへの感染性を検査する方法。
【選択図】図２
【解決手段】ブタ細胞試料のヒトへのウイルス感染性を検査する方法であって、
ブタ細胞試料と、ヒト細胞とを、互いに接触可能な環境で共培養すること、
前記ヒト細胞がマーカー及び／又は標識を有し、
前記マーカー及び／又は標識に基づき前記ヒト細胞を前記ブタ細胞試料から分離すること、及び
前記分離後のヒト細胞において、前記ブタ細胞試料が有し得る少なくとも１種のウイルスを検出することを含む、前記ウイルスのヒトへの感染性を検査する方法。
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ブタ細胞試料のヒトへのウイルス感染性を検査する方法であって、
前記ブタ細胞試料と、ヒト細胞とを、互いに接触可能な環境で共培養すること、
前記ヒト細胞がマーカー及び／又は標識を有し、
前記マーカー及び／又は標識に基づき前記ヒト細胞を前記ブタ細胞試料から分離すること、及び
前記分離後のヒト細胞において、前記ブタ細胞試料が有し得る少なくとも１種のウイルスを検出することを含む、前記ウイルスのヒトへの感染性を検査する方法。
前記ブタ細胞試料と、ヒト細胞とを、互いに接触可能な環境で共培養すること、
前記ヒト細胞がマーカー及び／又は標識を有し、
前記マーカー及び／又は標識に基づき前記ヒト細胞を前記ブタ細胞試料から分離すること、及び
前記分離後のヒト細胞において、前記ブタ細胞試料が有し得る少なくとも１種のウイルスを検出することを含む、前記ウイルスのヒトへの感染性を検査する方法。
【請求項2】
前記ブタ細胞試料は、Ｘ線照射されていないブタ細胞試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ウイルスは、人獣共通感染症又はブタ感染症の原因となるウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記ウイルスは、ＰＥＲＶを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記ブタ細胞試料が、ブタ個体又はブタ個体から摘出した臓器、から採取した細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記ヒト細胞が、ヒトがん細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記マーカーが細胞表面マーカーである、及び／又は、前記標識が蛍光標識である、及び／又は、前記分離がセルソーターにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
ブタミトコンドリアＤＮＡもしくはＲＮＡを排出するための継代培養を行わない、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
ブタ個体又はブタ個体から摘出した臓器から採取した細胞について、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法で感染性を検査すること、
感染性が所定基準を満たさないことに基づき、前記ブタ個体から摘出した臓器を材料として排除し、かつ／又は、感染性が所定基準を満たすことに基づき、前記ブタ個体から摘出した臓器を材料として選抜すること、及び
前記排除されなかったかつ／又は前記選抜された臓器を異種移植材へと製品化すること、
を含む、異種移植材製品の作成方法。
感染性が所定基準を満たさないことに基づき、前記ブタ個体から摘出した臓器を材料として排除し、かつ／又は、感染性が所定基準を満たすことに基づき、前記ブタ個体から摘出した臓器を材料として選抜すること、及び
前記排除されなかったかつ／又は前記選抜された臓器を異種移植材へと製品化すること、
を含む、異種移植材製品の作成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、異種移植材製品の提供に好適な、ブタ細胞試料のヒトへのウイルス感染性を検査する方法、及び異種移植材製品の作成方法に関する。
【背景技術】
【0002】
異種移植ドナーとして最も研究が進んでいる動物種はブタであるが、ブタは感染症に罹患しやすい。ブタ病原体ウイルスとしては、腫瘍、免疫不全等のリスクがあるブタ内在性レトロウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ；ＰＥＲＶ）、ブタサーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）に関わるブタサーコウイルス、ブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス等が挙げられる。
異種移植に関し、移植片（移植された臓器、組織、細胞等）に病原体ウイルスが感染していた場合、レシピエントにその病原体ウイルスが感染するリスクが高まる。したがって、移植前にドナー及び移植片の病原体ウイルス検査を行い、病原体ウイルス感染のリスクが限りなく低いことを確認することが求められる。
異種移植に関し、移植片（移植された臓器、組織、細胞等）に病原体ウイルスが感染していた場合、レシピエントにその病原体ウイルスが感染するリスクが高まる。したがって、移植前にドナー及び移植片の病原体ウイルス検査を行い、病原体ウイルス感染のリスクが限りなく低いことを確認することが求められる。
【0003】
異種移植ドナーとして最も研究が進んでいるブタに関し、異種移植のドナーとなるのは、ブタ－ヒト間の異種移植の場合、ヒト及びブタに感染する可能性がある病原体ウイルスが存在しない医療グレードのＤＰＦ（Ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｆｒｅｅ）ブタをドナーとして選択することが世界的な共通認識となっている（例えば、非特許文献１）。
検査の対象となる病原体ウイルスは国や地域により異なるが、ＤＰＦブタは定期的に多数の病原体ウイルスに対する検査を受けるため、高い清浄度の移植片を得ることができる（例えば、非特許文献２）。
検査の対象となる病原体ウイルスは国や地域により異なるが、ＤＰＦブタは定期的に多数の病原体ウイルスに対する検査を受けるため、高い清浄度の移植片を得ることができる（例えば、非特許文献２）。
【0004】
病原体ウイルスの典型例として、例えば、ブタ内在性レトロウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ；ＰＥＲＶ）は異種移植において、ヒトへの感染が最も懸念される病原体ウイルスの１つである。
ＰＥＲＶはｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト細胞に感染することが報告されている。その後、様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ試験系によりＰＥＲＶの感染性が調査されたが、その多くでヒト細胞へ感染することが確認されている（非特許文献３）。
ＰＥＲＶ感染のリスクを最小限にするために、生体内の状態を模倣したｉｎ ｖｉｔｒｏ試験によりドナーとなるブタ及び移植片のＰＥＲＶ感染性を評価する必要があり、このことは厚生労働省の指針「ドナーブタからヒトへの感染の危険性が排除されるべき病原体リスト（俣野，２０１６年度版）」にも明記されている。つまり、ブタをドナーとした異種移植の実現に向けて、ＰＥＲＶの感染性を正確に評価することは極めて重要である。
ＰＥＲＶはｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト細胞に感染することが報告されている。その後、様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ試験系によりＰＥＲＶの感染性が調査されたが、その多くでヒト細胞へ感染することが確認されている（非特許文献３）。
ＰＥＲＶ感染のリスクを最小限にするために、生体内の状態を模倣したｉｎ ｖｉｔｒｏ試験によりドナーとなるブタ及び移植片のＰＥＲＶ感染性を評価する必要があり、このことは厚生労働省の指針「ドナーブタからヒトへの感染の危険性が排除されるべき病原体リスト（俣野，２０１６年度版）」にも明記されている。つまり、ブタをドナーとした異種移植の実現に向けて、ＰＥＲＶの感染性を正確に評価することは極めて重要である。
【0005】
従来、ＰＥＲＶの感染性を検査するために、主に、下記（１）及び（２）の２種類の共培養系検査が実施されている。
（１）Ｘ線を照射したＰＥＲＶ産生ブタ細胞を標的ヒト細胞と共培養する検査（例えば、非特許文献３）。上記Ｘ線照射は一定期間の共培養の後、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞を死滅させ、標的ヒト細胞のみを選択、単離するために実施される。
（２）多孔質膜でＰＥＲＶ産生ブタ細胞と標的ヒト細胞を隔てて共培養する検査（非特許文献４）。上記多孔質膜には直径約０．４μｍのポアがあり、２種類の細胞を接触させずにＰＥＲＶなどのウイルス粒子だけを通過させることができる。
（１）Ｘ線を照射したＰＥＲＶ産生ブタ細胞を標的ヒト細胞と共培養する検査（例えば、非特許文献３）。上記Ｘ線照射は一定期間の共培養の後、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞を死滅させ、標的ヒト細胞のみを選択、単離するために実施される。
（２）多孔質膜でＰＥＲＶ産生ブタ細胞と標的ヒト細胞を隔てて共培養する検査（非特許文献４）。上記多孔質膜には直径約０．４μｍのポアがあり、２種類の細胞を接触させずにＰＥＲＶなどのウイルス粒子だけを通過させることができる。
【0006】
しかしながら、上記従来法による（１）及び（２）のｉｎ ｖｉｔｒｏ検査はいずれも、異種移植で起こり得る生体内の状態を模倣できているとは言い難く、以下のように、いくつかの問題点があった。
上記（１）の検査に関し、細胞へのＸ線照射は、照射線量や細胞の種類、状態により細胞の生存率が異なるため、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞を完全に除去することができず、ＰＥＲＶ擬陽性という結果を招く可能性があった。また、Ｘ線照射は当該ブタ細胞の遺伝子発現変化（例えば、ウイルス発現変化）のリスクがあり、ＰＥＲＶの感染性自体に与える影響は確認されたことがなく、Ｘ線照射無しに移植される移植細胞の生体内における状態をどの程度模倣出来ているかについて大きな疑問が生じていた。
上記（２）の検査に関し、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞と標的ヒト細胞とが接触していないという点が問題となっていた。ブタの腎臓や心臓、肺を移植する異種移植では、移植片をレシピエントの臓器に生着させることが前提であり（非特許文献５）、移植細胞とレシピエント細胞との接触は免れない。細胞同士の接触の有無がＰＥＲＶの感染性に必須であるかは未だ不明であるため、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞と標的ヒト細胞を接触させる共培養系でのＰＥＲＶ感染性の評価は必須であると考えられる。
上記（１）の検査に関し、細胞へのＸ線照射は、照射線量や細胞の種類、状態により細胞の生存率が異なるため、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞を完全に除去することができず、ＰＥＲＶ擬陽性という結果を招く可能性があった。また、Ｘ線照射は当該ブタ細胞の遺伝子発現変化（例えば、ウイルス発現変化）のリスクがあり、ＰＥＲＶの感染性自体に与える影響は確認されたことがなく、Ｘ線照射無しに移植される移植細胞の生体内における状態をどの程度模倣出来ているかについて大きな疑問が生じていた。
上記（２）の検査に関し、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞と標的ヒト細胞とが接触していないという点が問題となっていた。ブタの腎臓や心臓、肺を移植する異種移植では、移植片をレシピエントの臓器に生着させることが前提であり（非特許文献５）、移植細胞とレシピエント細胞との接触は免れない。細胞同士の接触の有無がＰＥＲＶの感染性に必須であるかは未だ不明であるため、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞と標的ヒト細胞を接触させる共培養系でのＰＥＲＶ感染性の評価は必須であると考えられる。
【0007】
さらに、公定又はそれに準ずるＰＥＲＶの感染性評価手法が策定されていないため、検査毎にＰＥＲＶ産生ブタ細胞と標的ヒト細胞との接触の有無や、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞と標的ヒト細胞の種類や割合、共培養期間、標的ヒト細胞の評価の際のＰＥＲＶ産生ブタ細胞混入検証の有無などが異なるという問題もあった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｓｐｉｚｚｏ，Ｔ．，Ｄｅｎｎｅｒ，Ｊ．，Ｇａｚｄａ，Ｌ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｍ．，Ｎａｔｈｕ，Ｄ．，Ｓｃｏｂｉｅ，Ｌ．，＆Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｙ．（２０１６）．Ｆｉｒｓｔ ｕｐｄａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｕｎｄｅｒｔａｋｉｎｇ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｉｓｌｅｔ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｉｎ ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ－Ｃｈａｐｔｅｒ ２ａ： ｓｏｕｒｃｅ ｐｉｇｓ－ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ ｘｅｎｏｚｏｏｎｏｓｅｓ．Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２３（１），２５－３１．
【非特許文献2】Ｆｉｓｈｍａｎ ＪＡ．（２０１８）．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｉｓｋｓ ｉｎ ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，（１８），１８５７－１８６４．
【非特許文献3】Ｐａｔｉｅｎｃｅ，Ｃ．，Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｙ．，＆ Ｗｅｉｓｓ，Ｒ．Ａ．（１９９７）．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｏｆ ｐｉｇｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３（３），２８２－２８６．
【非特許文献4】Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ Ｃｏｓｔａ，Ｍ．，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｎ．，Ｇｕｌｉｃｈ，Ｂ．，＆ Ｔｏｎｊｅｓ，Ｒ．Ｒ．（２０１４）．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｎ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２１（２），１６２－１７３．
【非特許文献5】佐原寿史，関島光裕，＆山田和彦．（２０１５）．異種移植の未来動向．移植，５０（１），０１６－０２３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
また、上記ブタ細胞試料でウイルス陽性と判定されたからといって、そのウイルスはヒトへの感染性があるとは必ずしも限らない。
一方、あるブタ細胞試料でウイルス陰性と判定されたからといって、ウイルス種によればプロウイルス化があり得ることから、上記ウイルスのヒトへの感染性は否定し得ない。
本発明は、このような従来技術の実情に鑑みてなされたものであり、正確性が改善された、ブタ細胞試料のヒトへのウイルス感染性を検査する方法、及び異種移植材製品の作成方法を提供することを目的とする。
一方、あるブタ細胞試料でウイルス陰性と判定されたからといって、ウイルス種によればプロウイルス化があり得ることから、上記ウイルスのヒトへの感染性は否定し得ない。
本発明は、このような従来技術の実情に鑑みてなされたものであり、正確性が改善された、ブタ細胞試料のヒトへのウイルス感染性を検査する方法、及び異種移植材製品の作成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、上記従来技術の問題点に鑑み、ブタ細胞のヒトへの移植後に近い状態、すなわちブタ細胞と標的ヒト細胞とを接触可能な状態で共培養することにより、ヒトへのウイルス感染性を高精度に検査し得ることを見出した。本発明は、上記知見に基づき完成されるに至ったものである。
すなわち本発明は以下の通りである。
すなわち本発明は以下の通りである。
【0011】
＜１＞ブタ細胞試料のヒトへのウイルス感染性を検査する方法であって、
上記ブタ細胞試料と、ヒト細胞とを、互いに接触可能な環境で共培養すること、
前記ヒト細胞がマーカー及び／又は標識を有し、
前記マーカー及び／又は標識に基づき前記ヒト細胞を前記ブタ細胞試料から分離すること、及び
前記分離後のヒト細胞において、前記ブタ細胞試料が有し得る少なくとも１種のウイルスを検出することを含む、前記ウイルスのヒトへの感染性を検査する方法。
＜２＞上記ブタ細胞試料は、Ｘ線照射されていないブタ細胞試料である、＜１＞に記載の方法。
＜３＞前記ウイルスは、人獣共通感染症又はブタ感染症の原因となるウイルスである、＜１＞に記載の方法。
＜４＞前記ウイルスは、ＰＥＲＶを少なくとも含む、＜１＞に記載の方法。
＜５＞前記ブタ細胞試料が、ブタ個体又はブタ個体から摘出した臓器、から採取した細胞である、＜１＞に記載の方法。
＜６＞前記ヒト細胞が、ヒトがん細胞である、＜１＞に記載の方法。
＜７＞前記マーカーが細胞表面マーカーである、及び／又は、前記標識が蛍光標識である、及び／又は、前記分離がセルソーターにより行われる、＜１＞に記載の方法。
＜８＞ブタミトコンドリアＤＮＡもしくはＲＮＡを排出するための継代培養を行わない、＜１＞に記載の方法。
＜９＞ブタ個体又はブタ個体から摘出した臓器から採取した細胞について、＜１＞～＜８＞のいずれか１項に記載の方法で感染性を検査すること、
感染性が所定基準を満たさないことに基づき、前記ブタ個体から摘出した臓器を材料として排除し、かつ／又は、感染性が所定基準を満たすことに基づき、前記ブタ個体から摘出した臓器を材料として選抜すること、及び
前記排除されなかったかつ／又は前記選抜された臓器を異種移植材へと製品化すること、
を含む、異種移植材製品の作成方法。
上記ブタ細胞試料と、ヒト細胞とを、互いに接触可能な環境で共培養すること、
前記ヒト細胞がマーカー及び／又は標識を有し、
前記マーカー及び／又は標識に基づき前記ヒト細胞を前記ブタ細胞試料から分離すること、及び
前記分離後のヒト細胞において、前記ブタ細胞試料が有し得る少なくとも１種のウイルスを検出することを含む、前記ウイルスのヒトへの感染性を検査する方法。
＜２＞上記ブタ細胞試料は、Ｘ線照射されていないブタ細胞試料である、＜１＞に記載の方法。
＜３＞前記ウイルスは、人獣共通感染症又はブタ感染症の原因となるウイルスである、＜１＞に記載の方法。
＜４＞前記ウイルスは、ＰＥＲＶを少なくとも含む、＜１＞に記載の方法。
＜５＞前記ブタ細胞試料が、ブタ個体又はブタ個体から摘出した臓器、から採取した細胞である、＜１＞に記載の方法。
＜６＞前記ヒト細胞が、ヒトがん細胞である、＜１＞に記載の方法。
＜７＞前記マーカーが細胞表面マーカーである、及び／又は、前記標識が蛍光標識である、及び／又は、前記分離がセルソーターにより行われる、＜１＞に記載の方法。
＜８＞ブタミトコンドリアＤＮＡもしくはＲＮＡを排出するための継代培養を行わない、＜１＞に記載の方法。
＜９＞ブタ個体又はブタ個体から摘出した臓器から採取した細胞について、＜１＞～＜８＞のいずれか１項に記載の方法で感染性を検査すること、
感染性が所定基準を満たさないことに基づき、前記ブタ個体から摘出した臓器を材料として排除し、かつ／又は、感染性が所定基準を満たすことに基づき、前記ブタ個体から摘出した臓器を材料として選抜すること、及び
前記排除されなかったかつ／又は前記選抜された臓器を異種移植材へと製品化すること、
を含む、異種移植材製品の作成方法。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、正確性が改善されたブタ細胞試料のヒトへのウイルス感染性を検査する方法、及び異種移植材製品の作成方法を提供し得る。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】標的ヒト細胞のゲーティングの一例を示す図である。
【図2】単離した標的ヒト細胞のフローサイトメトリー解析の一例を示す図である。
【図3】ＰＥＲＶ産生ブタ細胞の混入確認を目的とした蛍光顕微鏡観察結果を示す図である。
【図4】実施例の接触下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のブタミトコンドリア ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果（接触期間検討）を示す図である。
【図5】実施例の接触下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のブタミトコンドリアｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果（接触比率検討）を示す図である。
【図6】実施例の接触下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＵＶＥＣ細胞（Ｌｏｗ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のブタミトコンドリアｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果を示す図である。
【図7】実施例の接触下でＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のブタミトコンドリアｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果を示す図である。
【図8】ＰＥＲＶ産生ブタ細胞のｐｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果を示す図である。
【図9】実施例の接触下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のｐｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果（接触期間検討）を示す図である。
【図10】実施例の接触下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のｐｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果（接触比率検討）を示す図である。
【図11】実施例の接触下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＵＶＥＣ細胞（Ｌｏｗ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のｐｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果を示す図である。
【図12】実施例の接触下でＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のｐｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果を示す図である。
【図13】比較例の多孔質膜隔離下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のｐｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果を示す図である。
【図14】比較例の多孔質膜隔離下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＵＶＥＣ細胞（Ｌｏｗ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のｐｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果を示す図である。
【図15】比較例の多孔質膜隔離下でＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のｐｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果を示す図である。
【図16】実施例の接触下でＰＥＲＶ陽性ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞とＨＥＫ２９３細胞を共培養した標的ヒト細胞のｐｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果を示す図である。
【図17】比較例で使用した縦型共培養プレート及び水平型共培養容器の模式図（水平型共培養容器ＵｎｉＷｅｌｌｓ（登録商標）（和光純薬社製）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下、本発明の実施態様について詳細に説明するが、本発明は、以下の実施態様に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。
【0015】
≪異種移植用材料の病原体感染を検査する方法≫
本発明の第１の態様は、ブタ細胞試料のヒトへのウイルス感染性を検査する方法であって、
ブタ細胞試料と、ヒト細胞とを、互いに接触可能な環境で共培養すること、
前記ヒト細胞がマーカー及び／又は標識を有し、
前記マーカー及び／又は標識に基づき前記ヒト細胞を前記ブタ細胞試料から分離すること、及び
前記分離後のヒト細胞において、前記ブタ細胞試料が有し得る少なくとも１種のウイルスを検出することを含む、前記ウイルスのヒトへの感染性を（好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで）検査する方法である。
本発明の第１の態様は、ブタ細胞試料のヒトへのウイルス感染性を検査する方法であって、
ブタ細胞試料と、ヒト細胞とを、互いに接触可能な環境で共培養すること、
前記ヒト細胞がマーカー及び／又は標識を有し、
前記マーカー及び／又は標識に基づき前記ヒト細胞を前記ブタ細胞試料から分離すること、及び
前記分離後のヒト細胞において、前記ブタ細胞試料が有し得る少なくとも１種のウイルスを検出することを含む、前記ウイルスのヒトへの感染性を（好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで）検査する方法である。
【0016】
本発明において、ウイルスの感染性とは、上記ウイルスがヒト（好ましくはヒト細胞）に吸着又は侵入する性質ないしはその程度（例えば、侵入したウイルスのコピー数等）を意味する。
本発明において、ウイルスに対する感受性とは、上記ウイルスによる感染され易さ若しくはその程度（例えば、ウイルス取り込み量の多さ、取り込んだウイルスのコピー数の多さ等）を意味する。
本発明において、ウイルスに対する感受性とは、上記ウイルスによる感染され易さ若しくはその程度（例えば、ウイルス取り込み量の多さ、取り込んだウイルスのコピー数の多さ等）を意味する。
【0017】
本発明において、互いに接触可能な環境で共培養するとは、上記ブタ細胞と、上記ヒト細胞との接触が、細胞不透過性の膜（例えば、多孔質膜）等で遮られない環境中（例えば、任意の容器（フラスコ、プレート、ディッシュ、シャーレ等）内）で共培養することを意味する（非特許文献４）。
本発明は、互いに接触可能な環境で共培養することにより、従来の検査方法よりもより生体内に近い状態となり、ヒトへのブタウイルス感染性検査の正確性を改善することができる。
異種移植は移植片をヒトレシピエントの臓器に直接接触させて生着させることが前提であり、本発明は異種移植用のブタ由来移植片の検査に好適である。
本発明は、互いに接触可能な環境で共培養することにより、従来の検査方法よりもより生体内に近い状態となり、ヒトへのブタウイルス感染性検査の正確性を改善することができる。
異種移植は移植片をヒトレシピエントの臓器に直接接触させて生着させることが前提であり、本発明は異種移植用のブタ由来移植片の検査に好適である。
【0018】
第１の態様に係る検査方法は、上記共培養を動物体内ないしは動物臓器内で行うｉｎ ｖｉｖｏ検査方法であってもよい。上記動物としてはブタ、マウス（例えば、上記ブタ細胞試料及び上記ヒト細胞を導入したマウス）等が挙げられる。
第１の態様に係る検査方法は、操作性、作業性等の観点から、ｉｎ ｖｉｔｒｏ検査方法であることが好ましい。
第１の態様に係る検査方法は、操作性、作業性等の観点から、ｉｎ ｖｉｔｒｏ検査方法であることが好ましい。
【0019】
共培養開始時における上記ブタ細胞と、上記ヒト細胞との比率（例えば、細胞数の比率）としては、例えば、上記ブタ細胞：上記ヒト細胞＝１０～１：１～１０が挙げられ、上記ヒト細胞に対する上記ブタ細胞の比率が小さすぎると、検査感度が不十分となり得、偽陰性のリスクがある観点、及び、上記ヒト細胞に対する上記ブタ細胞の比率が大きすぎると、共培養におけるヒト細胞の生存性にリスクがあり、また、偽陽性のリスクがある観点から、９～１：１～９が好ましく、９～３：１～７が好ましく、９～５：１～５がより好ましく、７～５：３～５であってもよい。
上記ヒト細胞が、後述するＨＵＶＥＣ細胞等のウイルスに対する感受性が比較的に低い細胞の場合については、上記ブタ細胞に対する比率を増やして検査感度を向上させてもさせなくてもよい。その比率としては、例えば、上記ブタ細胞：上記ヒト細胞＝９～３：１～７（好ましくは９～５：１～５、より好ましくは８～５：２～５）が挙げられる。
上記ヒト細胞が、後述するＨＵＶＥＣ細胞等のウイルスに対する感受性が比較的に低い細胞の場合については、上記ブタ細胞に対する比率を増やして検査感度を向上させてもさせなくてもよい。その比率としては、例えば、上記ブタ細胞：上記ヒト細胞＝９～３：１～７（好ましくは９～５：１～５、より好ましくは８～５：２～５）が挙げられる。
【0020】
共培養の培地としては、上記ブタ細胞と、上記ヒト細胞との両方が生存し得る限り特に制限はなく、例えば、血清添加ＤＭＥＭ培地［１０％（ｖ／ｖ）非動化処理済みウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ，Ｓｉｇｍａ社）、５０Ｕ／ｍｌペニシリン（ナカライテスク社）、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ナカライテスク社）加ＤＭＥＭ（４．５ｇ／ｌ Ｇｌｕｃｏｓｅ）培地（ナカライテスク社）］、血清添加ＲＰＭＩ培地［１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ社）、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン加ＲＰＭＩ１６４０培地（ナカライテスク社）］、ＥＢＭ（登録商標）－２基本培地（Ｌｏｎｚａ社）等が挙げられる。
共培養の温度としては、上記ブタ細胞と、上記ヒト細胞との両方が生存し得る限り特に制限はなく、例えば、２５℃～３９℃が挙げられ、３０℃～３８℃が好ましく、３３℃～３７℃がより好ましい。
ＣＯ２雰囲気としても、上記ブタ細胞と、上記ヒト細胞との両方が生存し得る限り特に制限はなく、例えば、３～１０％のＣＯ２雰囲気下が挙げられ、４～９％のＣＯ２雰囲気下が好ましく、５～８％のＣＯ２雰囲気下がより好ましい。
共培養時間としては、例えば、３時間以上が挙げられ、共培養時間が短すぎると接触不十分であり偽陰性のリスクがある観点から、６時間以上が好ましく、１２時間以上がより好ましく、１６時間以上が更に好ましく、２０時間以上が特に好ましい。１日以上、２日以上又は３日以上であってもよい。
上記ヒト細胞が、後述するＨＵＶＥＣ細胞等のウイルスに対する感受性が比較的に低い細胞の場合については、上記共培養時間を増やして検査感度を向上させてもさせなくてもよい。その共培養時間としては、例えば、１２時間以上（好ましくは２０時間以上、より好ましくは１日以上）が挙げられ、２日以上又は３日以上であってもよい。
共培養の温度としては、上記ブタ細胞と、上記ヒト細胞との両方が生存し得る限り特に制限はなく、例えば、２５℃～３９℃が挙げられ、３０℃～３８℃が好ましく、３３℃～３７℃がより好ましい。
ＣＯ２雰囲気としても、上記ブタ細胞と、上記ヒト細胞との両方が生存し得る限り特に制限はなく、例えば、３～１０％のＣＯ２雰囲気下が挙げられ、４～９％のＣＯ２雰囲気下が好ましく、５～８％のＣＯ２雰囲気下がより好ましい。
共培養時間としては、例えば、３時間以上が挙げられ、共培養時間が短すぎると接触不十分であり偽陰性のリスクがある観点から、６時間以上が好ましく、１２時間以上がより好ましく、１６時間以上が更に好ましく、２０時間以上が特に好ましい。１日以上、２日以上又は３日以上であってもよい。
上記ヒト細胞が、後述するＨＵＶＥＣ細胞等のウイルスに対する感受性が比較的に低い細胞の場合については、上記共培養時間を増やして検査感度を向上させてもさせなくてもよい。その共培養時間としては、例えば、１２時間以上（好ましくは２０時間以上、より好ましくは１日以上）が挙げられ、２日以上又は３日以上であってもよい。
【0021】
比較例として後述するように、多孔質膜隔離下における従来の共培養検査系では、３週間又は２週間共培養しても、検査感度が低く、偽陰性が生じるリスクがある。
一方、本発明の検査方法によれば、そのような偽陰性のリスクがなく、共培養時間の上限としては、例えば、３週間以下、２週間以下、１週間以下、４日以下、３日以下、２日以下、又は２４時間以下とすることができる。共培養時間が長すぎると、検査効率が悪く、また、偽陽性のリスクが生じ得る観点から、２４時間以下が好ましい。
一方、本発明の検査方法によれば、そのような偽陰性のリスクがなく、共培養時間の上限としては、例えば、３週間以下、２週間以下、１週間以下、４日以下、３日以下、２日以下、又は２４時間以下とすることができる。共培養時間が長すぎると、検査効率が悪く、また、偽陽性のリスクが生じ得る観点から、２４時間以下が好ましい。
【0022】
本発明において、上記ブタ細胞の遺伝子発現変化（例えば、ウイルス発現変化）のリスク回避、及び、Ｘ線照射無しに移植される移植細胞の生体内における状態の模倣の観点から、上記ブタ細胞は、Ｘ線照射されていないことが好ましい。
上記ブタ細胞試料としては、ブタ細胞を含む試料である限り特に制限はなく、上記ブタ細胞としては、生きているブタ細胞が好ましく、ブタ個体又はブタ個体から摘出した臓器から任意の方法で採取した細胞が好ましい。
ブタ個体から摘出した上記臓器としては、完全な臓器であっても、臓器の一部分であってもよい。
ブタ個体から摘出した上記臓器としては、より具体的には、リンパ節、肺、肝臓、腎臓、膵臓、心臓等、血液、尿、汗等が挙げられる。
上記ブタ個体としては特に制限はなく、野生型（例えば、肉ブタ系統、固有種系統、ミニブタ等）であっても、遺伝子組み換えブタであっても、ＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｆｒｅｅ）ブタであっても、閉鎖系のよく管理された環境において、医療用として飼育された感染症、特に人獣共通感染症又はブタ感染症のリスクを排除した動物（例えば、ＳＰＦブタ又はＤＰＦブタ）であってもよい。
上記ブタ細胞試料としては、ブタ細胞を含む試料である限り特に制限はなく、上記ブタ細胞としては、生きているブタ細胞が好ましく、ブタ個体又はブタ個体から摘出した臓器から任意の方法で採取した細胞が好ましい。
ブタ個体から摘出した上記臓器としては、完全な臓器であっても、臓器の一部分であってもよい。
ブタ個体から摘出した上記臓器としては、より具体的には、リンパ節、肺、肝臓、腎臓、膵臓、心臓等、血液、尿、汗等が挙げられる。
上記ブタ個体としては特に制限はなく、野生型（例えば、肉ブタ系統、固有種系統、ミニブタ等）であっても、遺伝子組み換えブタであっても、ＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｆｒｅｅ）ブタであっても、閉鎖系のよく管理された環境において、医療用として飼育された感染症、特に人獣共通感染症又はブタ感染症のリスクを排除した動物（例えば、ＳＰＦブタ又はＤＰＦブタ）であってもよい。
【0023】
上記ブタ細胞として、ブタの細胞である限り特に制限はなく、例えば、ブタ腎臓上皮細胞（ＰＫ１５細胞）、ブタ末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）、ブタ膵島細胞、ブタ大動脈内皮細胞、ブタ肝細胞、ブタリンパ節細胞等が挙げられるが、本発明はこれらに限定される発明ではない。
【0024】
ヒト細胞としては、マーカー（好ましくは細胞表面マーカー）及び／又は標識を有するヒト細胞である限り特に制限はなく、一定期間ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養できるヒト細胞が好ましく、例えば、ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３細胞）、ヒト線維芽細胞（例えば、ヒト初代線維芽細胞）、ヒトＰＢＭＣ、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ細胞）等が挙げられる。
ウイルスに対する感受性が高く（例えば、ウイルスが入り込み易く）、上記ブタ細胞と、上記ヒト細胞との比率（例えば、細胞数の比率）の自由度が高く、また、共培養時間を短縮し得る観点から、ヒトがん細胞が好ましく、ＨＥＫ２９３細胞がより好ましい。
ＨＥＫ２９３細胞としてより詳細には、通常のＨＥＫ２９３細胞の他、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｓ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞等が挙げられる。
ＨＵＶＥＣ細胞は、ウイルス感染（例えば、ＰＥＲＶ感染）を阻害するＡＰＯＢＥＣ３Ｇタンパクを発現することが知られ、ウイルスに対する感受性が比較的に低いといえる（Ｍｅｉｊｅ，Ｙ．，Ｔｏｎｊｅｓ，Ｒ．Ｒ．，＆Ｆｉｓｈｍａｎ，Ｊ．Ａ．（２０１０）．Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｒｉｓｋ ｉｎ ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１０（７），１５１１－１５１６．）。
ウイルスに対する感受性が高く（例えば、ウイルスが入り込み易く）、上記ブタ細胞と、上記ヒト細胞との比率（例えば、細胞数の比率）の自由度が高く、また、共培養時間を短縮し得る観点から、ヒトがん細胞が好ましく、ＨＥＫ２９３細胞がより好ましい。
ＨＥＫ２９３細胞としてより詳細には、通常のＨＥＫ２９３細胞の他、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｓ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞等が挙げられる。
ＨＵＶＥＣ細胞は、ウイルス感染（例えば、ＰＥＲＶ感染）を阻害するＡＰＯＢＥＣ３Ｇタンパクを発現することが知られ、ウイルスに対する感受性が比較的に低いといえる（Ｍｅｉｊｅ，Ｙ．，Ｔｏｎｊｅｓ，Ｒ．Ｒ．，＆Ｆｉｓｈｍａｎ，Ｊ．Ａ．（２０１０）．Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｒｉｓｋ ｉｎ ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１０（７），１５１１－１５１６．）。
【0025】
上記マーカーは、細胞帰属、分化段階等の同定、細胞性状の把握等の指標ないし目印になり得るものを意味し、マーカー分子が好ましい。
上記マーカーとしては、細胞表面に露出している細胞表面マーカーのみならず、免疫組織化学的ないし免疫細胞化学的な方法による後述の分離の観点から、細胞表面に露出していない細胞膜構成成分及び細胞膜下の細胞質、核等に存在するいかなるマーカーであってもよいが、細胞表面マーカーが好ましい。
細胞表面マーカーとしては、例えば、ヒト細胞表面抗原ないしエピトープが挙げられ、任意のヒト細胞表面ＣＤ抗原が好ましく、ヒトＣＤ３１抗原、ヒトＣＤ３４抗原、ヒトＣＤ４５抗原、ヒトＣＤ５４抗原等がより好ましい。
上記マーカーとしては、細胞表面に露出している細胞表面マーカーのみならず、免疫組織化学的ないし免疫細胞化学的な方法による後述の分離の観点から、細胞表面に露出していない細胞膜構成成分及び細胞膜下の細胞質、核等に存在するいかなるマーカーであってもよいが、細胞表面マーカーが好ましい。
細胞表面マーカーとしては、例えば、ヒト細胞表面抗原ないしエピトープが挙げられ、任意のヒト細胞表面ＣＤ抗原が好ましく、ヒトＣＤ３１抗原、ヒトＣＤ３４抗原、ヒトＣＤ４５抗原、ヒトＣＤ５４抗原等がより好ましい。
【0026】
上記標識としては特に制限はないが、蛍光標識（蛍光タンパク質発現による標識を含む。）、磁気標識、酵素標識、放射線標識、吸光度標識等が挙げられ、定量性及び後述の分離性の観点から、蛍光標識、磁気標識、酵素標識が好ましく、蛍光標識がより好ましい。
上記標識の態様としては、抗原抗体反応（例えば、１次抗体、２次抗体等を使用）等のアフィニティーによる標識等が挙げられる。
上記磁気標識としては、例えば、磁気ビーズ等が挙げられる。
上記標識の態様としては、抗原抗体反応（例えば、１次抗体、２次抗体等を使用）等のアフィニティーによる標識等が挙げられる。
上記磁気標識としては、例えば、磁気ビーズ等が挙げられる。
【0027】
上記マーカー及び／又は標識に基づき上記ヒト細胞を上記ブタ細胞試料から分離（好ましくは単離）する方法としては、アフィニティーを利用する方法（抗体及び磁気ビーズを用いる免疫磁気分離法、抗体と比重遠心を用いる免疫比重遠心法、放射線標識を利用するラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法、酵素標識を利用する、酵素免疫測定法（ＥＩＡ，ＥＬＩＳＡ）、蛍光酵素免疫測定法（ＦＬＥＩＡ）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、電気化学発光測免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）など、セルソーター、フローサイトメトリー等）、生物物理学的な方法（誘電泳動、フィールドフロー分画、光散乱検出等を利用して分離する方法等）、物理化学的な方法（遠心分離法、分離膜法）又はそれらの組み合わせ等の任意の方法であってよく特に制限はない。
上記マーカー及び／又は標識に基づき上記ヒト細胞を上記ブタ細胞試料から分離する方法として、セルソーター、フローサイトメトリー、顕微鏡観察（好ましくは蛍光顕微鏡観察）又はそれらの組み合わせが挙げられ、より確実に上記ヒト細胞を分離（好ましくは単離）することができる観点から、セルソーター、フローサイトメトリー又はそれらの組み合わせがより好ましく、
より確実に上記ヒト細胞を高純度（例えば、７０％以上が挙げられ、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上）で単離することができる観点から、セルソーター及びフローサイトメトリーの組み合わせが更に好ましい。
上記マーカー及び／又は標識に基づき上記ヒト細胞を上記ブタ細胞試料から分離する方法として、セルソーター、フローサイトメトリー、顕微鏡観察（好ましくは蛍光顕微鏡観察）又はそれらの組み合わせが挙げられ、より確実に上記ヒト細胞を分離（好ましくは単離）することができる観点から、セルソーター、フローサイトメトリー又はそれらの組み合わせがより好ましく、
より確実に上記ヒト細胞を高純度（例えば、７０％以上が挙げられ、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上）で単離することができる観点から、セルソーター及びフローサイトメトリーの組み合わせが更に好ましい。
【0028】
ヒト細胞は、外来（培地中）のミトコンドリアを細胞内部に取り込むこと、継代培養後（特にブタミトコンドリアについては数週間の継代培養後）には取り込んだ外来ミトコンドリアが排出され、減少することが知られている（Ｋｅｓｎｅｒ，Ｅ．Ｅ．，Ｓａａｄａ－Ｒｅｉｃｈ，Ａ．，＆Ｌｏｒｂｅｒｂｏｕｍ－Ｇａｌｓｋｉ，Ｈ．（２０１６）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ，６（１），１－１５、及び
Ｇａｒｋａｖｅｎｋｏ，Ｏ．，Ｗｙｎｙａｒｄ，Ｓ．，Ｎａｔｈｕ，Ｄ．，Ｓｉｍｏｎｄ，Ｄ．，Ｍｕｚｉｎａ，Ｍ．，Ｍｕｚｉｎａ，Ｚ．，．．．＆Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｂ．Ｒ．（２００８）．Ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ（ＰＥＲＶ） ａｎｄ ｉｔｓ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ：ａ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ ｈｅｒｄ．Ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１７（１２），１３８１－１３８８．）。
本発明において、ブタミトコンドリアＤＮＡもしくはＲＮＡを排出するための継代培養を行ってもよい。
しかし、本発明によれば、確実に上記ヒト細胞を分離することができることから、ブタミトコンドリアＤＮＡもしくはＲＮＡを排出するための継代培養を省略することができる。これにより、ウイルス感染性の検査に要する時間が大幅に短縮される。
Ｇａｒｋａｖｅｎｋｏ，Ｏ．，Ｗｙｎｙａｒｄ，Ｓ．，Ｎａｔｈｕ，Ｄ．，Ｓｉｍｏｎｄ，Ｄ．，Ｍｕｚｉｎａ，Ｍ．，Ｍｕｚｉｎａ，Ｚ．，．．．＆Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｂ．Ｒ．（２００８）．Ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ（ＰＥＲＶ） ａｎｄ ｉｔｓ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ：ａ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ ｈｅｒｄ．Ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１７（１２），１３８１－１３８８．）。
本発明において、ブタミトコンドリアＤＮＡもしくはＲＮＡを排出するための継代培養を行ってもよい。
しかし、本発明によれば、確実に上記ヒト細胞を分離することができることから、ブタミトコンドリアＤＮＡもしくはＲＮＡを排出するための継代培養を省略することができる。これにより、ウイルス感染性の検査に要する時間が大幅に短縮される。
【0029】
上記マーカーに基づく分離の場合は、上記マーカーを認識する１次抗体及び上記１次抗体を認識する標識２次抗体の組み合わせ、上記マーカーを認識する標識抗体等を利用した分離法が挙げられる。
上記分離において、フローサイトメトリー（ないしその解析）を組み合わせることにより、より確実な上記ヒト細胞の高純度単離を達成することができる。
上記分離は、上記標識の強度（例えば、蛍光強度、磁気強度、酵素標識強度、放射線強度、吸光度等）に基づいていてもいなくてもよい。
上記分離において、フローサイトメトリー（ないしその解析）を組み合わせることにより、より確実な上記ヒト細胞の高純度単離を達成することができる。
上記分離は、上記標識の強度（例えば、蛍光強度、磁気強度、酵素標識強度、放射線強度、吸光度等）に基づいていてもいなくてもよい。
【0030】
検出対象の少なくとも１種のウイルスとしては、２種以上のウイルスであってもよく、３種以上のウイルスであってもよく、４種以上のウイルスであってもよい。
検出対象のウイルスの種類の上限値としては、特に制限はないが、例えば、２０種以下、１５種以下、１０種以下が挙げられる。
検出対象の病原体ウイルスとしては、人獣共通感染症、動物感染症（例えば、ブタ感染症）又はヒト感染症の原因となるウイルスが挙げられ、人獣共通感染症又はブタ感染症の原因となるウイルスが好ましい。
検出対象のウイルスの種類の上限値としては、特に制限はないが、例えば、２０種以下、１５種以下、１０種以下が挙げられる。
検出対象の病原体ウイルスとしては、人獣共通感染症、動物感染症（例えば、ブタ感染症）又はヒト感染症の原因となるウイルスが挙げられ、人獣共通感染症又はブタ感染症の原因となるウイルスが好ましい。
【0031】
検出対象のウイルスとして、具体的には、ＰＥＲＶ、ブタサーコウイルス（例えば、ブタサーコウイルス１型、ブタサーコウイルス２型等）、ブタリンパ球向性ヘルペスウイルス（例えば、ブタリンパ球向性ヘルペスウイルス１型、ブタリンパ球向性ヘルペスウイルス２型等）、ブタサイトメガロウイルス、脳心筋炎ウイルス、ブタパルボウイルス、ブタロタウイルス（例えば、ブタロタウイルスＡ、ブタロタウイルスＢアメリカ型、ブタロタウイルスＢベトナム型、ブタロタウイルスＣ等）、哺乳類レオウイルス、ブタエンテロウイルス、ブタ赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス、ブタインフルエンザウイルス（例えば、ブタインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１型、ブタインフルエンザウイルスＨ３Ｎ２型等）、ブタ呼吸器コロナウイルス、ブタ熱ウイルス、ブタポックスウイルス、アフリカブタ熱ウイルス、オーエスキー病ウイルス、ゲタウイルス、日本脳炎ウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス、ブタ水疱病ウイルス、ブタ水疱疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（例えば、水疱性口内炎ウイルスｎｅｗ ｊｅｒｓｅｙ、水疱性口内炎ウイルスｉｎｄｉａｎａ等）、口蹄疫ウイルス、狂犬病ウイルス（例えば、狂犬病ウイルス１、狂犬病ウイルス２、狂犬病ウイルス３、狂犬病ウイルス４、狂犬病ウイルス５、狂犬病ウイルス６、狂犬病ウイルス７等）、ブタアデノウイルス、ブタアストロウイルス（例えば、ブタアストロウイルス１、ブタアストロウイルス２、ブタアストロウイルス３、ブタアストロウイルス４、ブタアストロウイルス５等）、メナングルウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス（例えば、東部ウマ脳炎ウイルス１、東部ウマ脳炎ウイルス２、東部ウマ脳炎ウイルス３、東部ウマ脳炎ウイルス４等）、西部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ボルナウイルス、アポイウイルス、ポリオーマウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス（例えば、ウシウイルス性下痢ウイルス１型、ウシウイルス性下痢ウイルス２型、ウシウイルス性下痢ウイルス３型等）、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス、ブタトルクテノウイルス（例えば、ブタトルクテノウイルス１型、ブタトルクテノウイルス２型等）、サポウイルス（例えば、サポウイルス３型、サポウイルス６型、サポウイルス７ａ型、サポウイルス７ｂ型、サポウイルス７ｃ型、サポウイルス８型、サポウイルス９型、サポウイルス１０型等）、ノロウイルス（例えば、ノロウイルスＡ型、ノロウイルスＢ型等）、ブタルブラウイルス、カリシウイルス、スピューマウイルス、ブタγヘルペスウイルスが挙げられる。
【0032】
異種移植に関し、移植前にドナー及び移植片の病原体ウイルス検査を行い、病原体ウイルス感染のリスクが限りなく低いことを確認することが求められているが、上記病原体ウイルス検出はＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応；ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ（商標）を含む）による方法が一般的である。
しかし、上記ＰＣＲで陰性と判断された場合であっても、培養中ないし移植後に、病原体ウイルスが発現増加するリスクがある。
上記リスクないし偽陰性を回避する観点から、上記列挙した各種ウイルス（特に、ＰＥＲＶ以外の上記列挙した各種ウイルス）を本発明の検出対象のウイルスとし得る。
しかし、上記ＰＣＲで陰性と判断された場合であっても、培養中ないし移植後に、病原体ウイルスが発現増加するリスクがある。
上記リスクないし偽陰性を回避する観点から、上記列挙した各種ウイルス（特に、ＰＥＲＶ以外の上記列挙した各種ウイルス）を本発明の検出対象のウイルスとし得る。
【0033】
検出対象のウイルスとして、ＰＥＲＶ、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、ブタサーコウイルス２型、ブタインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１型、ブタリンパ球向性ヘルペスウイルス、ブタサイトメガロウイルス及びＥ型肝炎ウイルスを少なくとも含むことが好ましく、ＰＥＲＶを少なくとも含むことがより好ましい。
【0034】
ＰＥＲＶはブタゲノムに組み込まれているガンマレトロウイルスの一種であり、全てのブタに存在する。
プロウイルス化は生殖系列でも起こるため、ＰＥＲＶは子孫に受け継がれる。また、正常なブタ細胞から感染性を有するＰＥＲＶが放出されることも確認されている（Ｍａｔｔｉｕｚｚｏ，Ｇ．，Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｙ．，＆Ｓｃｏｂｉｅ，Ｌ．（２０１２）．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｚｏｏｎｏｔｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｉｎ ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｉｎ Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（ｐｐ．２６３－２７９）．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ．）。
ＰＥＲＶのゲノムはｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖの３つの遺伝子から構成され、そのコピー数はブタの品種間や臓器間、さらには個体間で異なる。
ＰＥＲＶはｅｎｖ遺伝子の配列の違いによりＡ型、Ｂ型、Ｃ型の３つのタイプに分類される。Ａ型、Ｂ型は全てのブタで陽性であり、ヒトを含む様々な動物に感染することが報告されている（Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｙ．，Ｐａｔｉｅｎｃｅ，Ｃ．，Ｍａｇｒｅ，Ｓ．，Ｗｅｉｓｓ，Ｒ．Ａ．，Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｐ．Ｔ．，Ｌｅ Ｔｉｓｓｉｅｒ，Ｐ．，＆Ｓｔｏｙｅ，Ｊ．Ｐ．（１９９８）．Ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｃｌａｓｓｅｓ ｏｆ ｐｉｇ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７２（１２），９９８６－９９９１．）。
したがって、上記ブタ細胞試料における上記Ａ型又はＢ型のＰＥＲＶのヒトへの感染性を検査する観点から、本発明の検査方法において、検出対象のウイルスとして、ＰＥＲＶの中でも、ＰＥＲＶのＡ型又はＢ型を含むことが好ましい。
一方、Ｃ型はいくつかのブタのみで陽性であり、ブタ以外の動物には感染しないが、Ａ型と組み換えを起こし、感染性が５００倍高い組み換え体となることが報告されている（Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｉ．，Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｙ．，Ｂａｒｔｏｓｃｈ，Ｂ．，＆Ｓｔｏｙｅ，Ｊ．Ｐ．（２００４）．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ｔｉｔｅｒ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７８（２４）， １３８７１－１３８７９．）。
このため、ＰＥＲＶ－Ｃ型のＰＣＲ検査（従来の検査）結果が陰性のブタ細胞試料を選抜し、異種移植材へと製品化してもよい。一方、ブタ細胞試料に関するＰＥＲＶ－Ｃ型のＰＣＲ検査を省略し、本発明の検査方法において、上記ヒト細胞における検出対象のウイルスとして、ＰＥＲＶ－Ｃ型を含んでいてもよい。
プロウイルス化は生殖系列でも起こるため、ＰＥＲＶは子孫に受け継がれる。また、正常なブタ細胞から感染性を有するＰＥＲＶが放出されることも確認されている（Ｍａｔｔｉｕｚｚｏ，Ｇ．，Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｙ．，＆Ｓｃｏｂｉｅ，Ｌ．（２０１２）．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｚｏｏｎｏｔｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｉｎ ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｉｎ Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（ｐｐ．２６３－２７９）．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ．）。
ＰＥＲＶのゲノムはｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖの３つの遺伝子から構成され、そのコピー数はブタの品種間や臓器間、さらには個体間で異なる。
ＰＥＲＶはｅｎｖ遺伝子の配列の違いによりＡ型、Ｂ型、Ｃ型の３つのタイプに分類される。Ａ型、Ｂ型は全てのブタで陽性であり、ヒトを含む様々な動物に感染することが報告されている（Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｙ．，Ｐａｔｉｅｎｃｅ，Ｃ．，Ｍａｇｒｅ，Ｓ．，Ｗｅｉｓｓ，Ｒ．Ａ．，Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｐ．Ｔ．，Ｌｅ Ｔｉｓｓｉｅｒ，Ｐ．，＆Ｓｔｏｙｅ，Ｊ．Ｐ．（１９９８）．Ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｃｌａｓｓｅｓ ｏｆ ｐｉｇ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７２（１２），９９８６－９９９１．）。
したがって、上記ブタ細胞試料における上記Ａ型又はＢ型のＰＥＲＶのヒトへの感染性を検査する観点から、本発明の検査方法において、検出対象のウイルスとして、ＰＥＲＶの中でも、ＰＥＲＶのＡ型又はＢ型を含むことが好ましい。
一方、Ｃ型はいくつかのブタのみで陽性であり、ブタ以外の動物には感染しないが、Ａ型と組み換えを起こし、感染性が５００倍高い組み換え体となることが報告されている（Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｉ．，Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｙ．，Ｂａｒｔｏｓｃｈ，Ｂ．，＆Ｓｔｏｙｅ，Ｊ．Ｐ．（２００４）．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ｔｉｔｅｒ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７８（２４）， １３８７１－１３８７９．）。
このため、ＰＥＲＶ－Ｃ型のＰＣＲ検査（従来の検査）結果が陰性のブタ細胞試料を選抜し、異種移植材へと製品化してもよい。一方、ブタ細胞試料に関するＰＥＲＶ－Ｃ型のＰＣＲ検査を省略し、本発明の検査方法において、上記ヒト細胞における検出対象のウイルスとして、ＰＥＲＶ－Ｃ型を含んでいてもよい。
【0035】
上記分離後のヒト細胞において、少なくとも１種の上記ウイルスを検出する手法としては、上記ヒト細胞における上記ウイルスの感染性（例えば、上記ヒト細胞における上記ウイルスの存在）を知得し得る限り特に制限はなく、例えば、ＰＣＲ法による検出ないし定量が挙げられる。
より詳細には、少なくとも１種のウイルスの上記検出は、少なくとも１種類のウイルス各々の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）に選択的に（好ましくは特異的に）結合するプライマーセット（以下、「プライマー対」ともいう。；Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（Ｆプライマー）及びＲｅｖｅｒｓｅプライマー（Ｒプライマー）の対）を用いてＰＣＲ法により検出ないし定量してもよい。
ＰＣＲ法による上記検出ないし定量の前に、当業界における技術常識に基づいて、細胞の溶解、ＲＮＡ抽出等を行ってもよい。
より詳細には、少なくとも１種のウイルスの上記検出は、少なくとも１種類のウイルス各々の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）に選択的に（好ましくは特異的に）結合するプライマーセット（以下、「プライマー対」ともいう。；Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（Ｆプライマー）及びＲｅｖｅｒｓｅプライマー（Ｒプライマー）の対）を用いてＰＣＲ法により検出ないし定量してもよい。
ＰＣＲ法による上記検出ないし定量の前に、当業界における技術常識に基づいて、細胞の溶解、ＲＮＡ抽出等を行ってもよい。
【0036】
本発明において、ＰＣＲ法は、標準的なＰＣＲ法（ｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲ）であってもなくてもよく、ＲＮＡウイルス（インフルエンザウイルス等）を検出する観点から、ＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵素によって、一旦、相補的なｃＤＮＡ合成してからＰＣＲを行う、いわゆるＲＴ－ＰＣＲ法であってもなくてもよい。
また、ＰＣＲ法は、定量性を高める観点から、リアルタイムＰＣＲ法（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）（商標）であってもなくてもよい。
更に、ＰＣＲ法は、特異性及び収率を向上させる等の観点からネステッドＰＣＲ法（ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）等の変法であってもなくてもよい。
また、ＰＣＲ法は、定量性を高める観点から、リアルタイムＰＣＲ法（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）（商標）であってもなくてもよい。
更に、ＰＣＲ法は、特異性及び収率を向上させる等の観点からネステッドＰＣＲ法（ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）等の変法であってもなくてもよい。
【0037】
上記少なくとも１種類のウイルス各々の核酸に選択的に結合するプライマーは特に制限されず、例えば、上記選択的に結合する配列に加えて任意の他の配列を含むものであり得る。上記プライマーの塩基長としても、上記少なくとも１種類のウイルス各々の核酸に選択的に結合し得るというプライマーとしての機能を発揮する程度の長さであれば特に制限されず、例えば、１０～５０塩基の長さが挙げられ、１２～４０塩基の長さが好ましく、１５～３０塩基の長さがより好ましい。
上記プライマーのＴｍ値としては、ゲノム遺伝子（例えば、ブタゲノム遺伝子）等との非特異的アニーリングを回避する観点から、５０℃以上であることが好ましく、５５℃以上であることがより好ましい。
また、プライマーのＴｍ値の上限値としては特に制限はないが、例えば、８０℃以下であり、好ましくは７５℃以下である。
また、少なくとも１種のウイルスの上記検出に使用する全プライマーの融解温度差が２５℃以下（より好ましくは２０℃以下、更に好ましくは１５℃以下、特に好ましくは１２℃以下）であることが好ましい。
全プライマーの融解温度差は小さければ小さいほど好ましく、融解温度差の下限値としては特に制限はないが、例えば、１０℃以上、８℃以上、６℃以上、５℃以上、３℃以上、１℃以上等が挙げられ、理想的には０℃である。
上記プライマーのＴｍ値としては、ゲノム遺伝子（例えば、ブタゲノム遺伝子）等との非特異的アニーリングを回避する観点から、５０℃以上であることが好ましく、５５℃以上であることがより好ましい。
また、プライマーのＴｍ値の上限値としては特に制限はないが、例えば、８０℃以下であり、好ましくは７５℃以下である。
また、少なくとも１種のウイルスの上記検出に使用する全プライマーの融解温度差が２５℃以下（より好ましくは２０℃以下、更に好ましくは１５℃以下、特に好ましくは１２℃以下）であることが好ましい。
全プライマーの融解温度差は小さければ小さいほど好ましく、融解温度差の下限値としては特に制限はないが、例えば、１０℃以上、８℃以上、６℃以上、５℃以上、３℃以上、１℃以上等が挙げられ、理想的には０℃である。
【0038】
少なくとも１種のウイルスの上記検出が、２種以上のウイルス（３種以上のウイルスであってもよく、４種以上のウイルスであってもよい。）を、各々のウイルスの核酸に選択的に結合するプライマー対を用いてＰＣＲ法による検出であってもよい。
ウイルスの種類の上限値としては特に制限はないが、例えば、２０種以下、１５種以下、１０種以下が挙げられる。
ウイルスの種類の上限値としては特に制限はないが、例えば、２０種以下、１５種以下、１０種以下が挙げられる。
【0039】
ウイルスの核酸に選択的に結合するプライマーとしては、実施例の項で後述する配列番号１～１６のいずれかで表されるプライマーが挙げられるが、本発明におけるプライマーとしてはこれらに限定されない。
【0040】
少なくとも１種のウイルスの上記検出において、ウイルスの核酸が統計的に有意に検出されれば特に制限はない。例えば、対照と対比して、上記核酸が１．１倍以上検出されることが挙げられ、１．２倍以上検出されることが好ましく、１．５倍以上検出されることがより好ましい。
上記核酸の検出の上限値としては特に制限はないが、例えば、１０倍以下が挙げられる。
上記対照としては、上記ブタ細胞試料との共培養を行っていない点、又は、ヒト細胞だけで培養している点でのみ相違するヒト細胞から得られた測定値であっても、予め健常ヒト細胞の検体群から収集して得られた統計的な値ないし範囲であってもよい。
上記核酸の検出の上限値としては特に制限はないが、例えば、１０倍以下が挙げられる。
上記対照としては、上記ブタ細胞試料との共培養を行っていない点、又は、ヒト細胞だけで培養している点でのみ相違するヒト細胞から得られた測定値であっても、予め健常ヒト細胞の検体群から収集して得られた統計的な値ないし範囲であってもよい。
【0041】
上記検出は、上記標識の強度（例えば、蛍光強度、磁気強度、放射線強度、吸光度、酵素標識強度等）に基づいていてもいなくてもよい。
【0042】
少なくとも１種のウイルスの上記検出において、ＰＣＲのサーマルサイクル条件（例えば、温度、時間、サイクル数等）としては特に制限されず、当業界における技術常識を勘案して、二本鎖核酸を一本鎖化する変性反応、アニーリング反応及びＤＮＡポリメラーゼなどの核酸合成酵素による核酸伸長反応が生じる温度及び時間を適宜設定し、これらの反応を数十サイクル繰り返すことにより実施することができる。
変性反応条件としては特に制限されず、例えば、標的核酸を９０℃～１００℃で数十秒～数分間に加熱する反応が挙げられる。
プライマーと標的核酸とがハイブリダイズするような条件下でプライマー及び標的核酸をおく反応であるアニーリング反応としても特に制限されないが、例えば、変性反応の後、例えば、急速に冷却して５０℃～７０℃（好ましくは、５２℃～６５℃）に数十秒間～数分間おく反応であることができる。
変性反応条件としては特に制限されず、例えば、標的核酸を９０℃～１００℃で数十秒～数分間に加熱する反応が挙げられる。
プライマーと標的核酸とがハイブリダイズするような条件下でプライマー及び標的核酸をおく反応であるアニーリング反応としても特に制限されないが、例えば、変性反応の後、例えば、急速に冷却して５０℃～７０℃（好ましくは、５２℃～６５℃）に数十秒間～数分間おく反応であることができる。
【0043】
核酸伸長反応としても特に制限されず、例えば、ＤＮＡポリメラーゼなどの核酸合成酵素を用い、該核酸合成酵素の酵素活性に適した温度で実施する反応をいうことができる。
【0044】
検出対象の上記ウイルスが複数種である場合、複数種の上記ウイルスの検出はできるだけ少ない回数で検出を行う観点から同時に行うことが好ましい。
できるだけ少ない回数で検出を行う観点から、複数種の上記ウイルスの検出を、同一のサーマルサイクル条件のＰＣＲ法により行うことが好ましい。また、上記ウイルスの検出に使用する使用する全プライマーの融解温度差が２５℃以下（より好ましくは２０℃以下、更に好ましくは１５℃以下、特に好ましくは１２℃以下）であることが好ましい。
全プライマーの融解温度差は小さければ小さいほど好ましく、融解温度差の下限値としては特に制限はないが、例えば、１０℃以上、８℃以上、６℃以上、５℃以上、３℃以上、１℃以上等が挙げられ、理想的には０℃である。
第１の態様に係る検査方法を実施する時期、及び頻度等としては特に制限はないが、移植前が好ましい。
できるだけ少ない回数で検出を行う観点から、複数種の上記ウイルスの検出を、同一のサーマルサイクル条件のＰＣＲ法により行うことが好ましい。また、上記ウイルスの検出に使用する使用する全プライマーの融解温度差が２５℃以下（より好ましくは２０℃以下、更に好ましくは１５℃以下、特に好ましくは１２℃以下）であることが好ましい。
全プライマーの融解温度差は小さければ小さいほど好ましく、融解温度差の下限値としては特に制限はないが、例えば、１０℃以上、８℃以上、６℃以上、５℃以上、３℃以上、１℃以上等が挙げられ、理想的には０℃である。
第１の態様に係る検査方法を実施する時期、及び頻度等としては特に制限はないが、移植前が好ましい。
【0045】
≪異種移植材製品の作成方法≫
本発明の第２の態様は、ブタ個体又はブタ個体から摘出した臓器から採取した細胞について、第１の態様に係る検査方法で感染性を検査すること、
感染性が所定基準を満たさないことに基づき、前記ブタ個体から摘出した臓器を材料から排除し、かつ／又は、感染性が所定基準を満たすことに基づき、前記ブタ個体から摘出した臓器を材料として選抜すること、及び
前記排除されなかったかつ／又は前記選抜された臓器を異種移植材へと製品化すること、を含む、異種移植材製品の作成方法である。
上記排除及び／又は選抜により、所定基準を満たさない臓器は、異種移植材製品へと製品化できないと評価し、上記排除及び／又は選抜により、上記所定基準を満たす臓器を、異種移植材製品へと製品化し得ると評価し得る。
本発明の第２の態様は、ブタ個体又はブタ個体から摘出した臓器から採取した細胞について、第１の態様に係る検査方法で感染性を検査すること、
感染性が所定基準を満たさないことに基づき、前記ブタ個体から摘出した臓器を材料から排除し、かつ／又は、感染性が所定基準を満たすことに基づき、前記ブタ個体から摘出した臓器を材料として選抜すること、及び
前記排除されなかったかつ／又は前記選抜された臓器を異種移植材へと製品化すること、を含む、異種移植材製品の作成方法である。
上記排除及び／又は選抜により、所定基準を満たさない臓器は、異種移植材製品へと製品化できないと評価し、上記排除及び／又は選抜により、上記所定基準を満たす臓器を、異種移植材製品へと製品化し得ると評価し得る。
【0046】
第２の態様において、感染性検査に供する上記ブタ細胞試料としては、上記臓器の上記摘出元のブタ個体の別の箇所（例えば、臓器、組織）から採取した細胞であってもよいが、異種移植材として排除及び／又は選抜の対象となる上記臓器から採取したブタ細胞試料であることが好ましい。
【0047】
上記所定基準としては、例えば、上記ブタ細胞試料を第１の態様に係る検査方法に供することによりウイルス感染性陰性と判定されるか否かを基準とすることが挙げられる。例えば、上記感染性陰性か否かの判定は、上記ヒト細胞における上記ウイルスのコピー数に基づき判定することが挙げられ、例えば、上記ヒト細胞における上記ウイルスのコピー数が所定値未満（例えば、細胞当り１．５コピー未満が挙げられ、好ましくは１．０コピー未満、より好ましくは０．７コピー未満、更に好ましくは０．５コピー未満、特に好ましくは０．３コピー未満、とりわけ好ましくは０．１コピー未満、最も好ましくは０．０７コピー未満）である場合をウイルス感染性陰性と判定することができる。
上記所定基準としては、ウイルス感染前の健常ブタ（野生型であっても、閉鎖系のよく管理された環境において、医療用として飼育された感染症、特に人獣共通感染症又はブタ感染症のリスクを排除したブタ（例えば、ＳＰＦブタ又はＤＰＦブタ）であってもよい。）から採取したブタ細胞試料を第１の態様に係る検査方法に供して得られた検査結果ないし測定値であっても、予め健常ブタ（野生型であっても、閉鎖系のよく管理された環境において、医療用として飼育された感染症、特に人獣共通感染症又はブタ感染症のリスクを排除したブタ（例えば、ＳＰＦブタ又はＤＰＦブタ）であってもよい。）の検体群から採取したブタ細胞試料を第１の態様に係る検査方法に供して得られた統計的な値ないし範囲であってもよい。
異種移植材製品としては、臓器（肝臓、腎臓、膵臓、心臓等）製品、血液製品、尿製品、汗製品等が挙げられ、臓器製品又は血液製品が好ましい。
第２の態様により得られた異種移植材製品は、病原体ウイルス感染のリスクが低減されており、異種移植に好適に使用し得る。
上記所定基準としては、ウイルス感染前の健常ブタ（野生型であっても、閉鎖系のよく管理された環境において、医療用として飼育された感染症、特に人獣共通感染症又はブタ感染症のリスクを排除したブタ（例えば、ＳＰＦブタ又はＤＰＦブタ）であってもよい。）から採取したブタ細胞試料を第１の態様に係る検査方法に供して得られた検査結果ないし測定値であっても、予め健常ブタ（野生型であっても、閉鎖系のよく管理された環境において、医療用として飼育された感染症、特に人獣共通感染症又はブタ感染症のリスクを排除したブタ（例えば、ＳＰＦブタ又はＤＰＦブタ）であってもよい。）の検体群から採取したブタ細胞試料を第１の態様に係る検査方法に供して得られた統計的な値ないし範囲であってもよい。
異種移植材製品としては、臓器（肝臓、腎臓、膵臓、心臓等）製品、血液製品、尿製品、汗製品等が挙げられ、臓器製品又は血液製品が好ましい。
第２の態様により得られた異種移植材製品は、病原体ウイルス感染のリスクが低減されており、異種移植に好適に使用し得る。
【実施例0048】
以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
【0049】
＜＜材料及び方法＞＞
＜１．１．供試細胞＞
以下の実施例及び比較例において、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞としてＰＫ１５細胞及びミニブタ又は肉豚系統ブタのＰＢＭＣを、標的ヒト細胞としてＨＥＫ２９３細胞（ＧＦＰを発現しない）、ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞、ＨＵＶＥＣ細胞を使用した。
ＰＫ１５細胞は大阪大学大学院 医学系研究科 小児成育外科・臓器移植学研究室の宮川周士先生から分与頂いた。
ＨＥＫ２９３細胞、ＧＦＰを安定発現するＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞、及びＨＵＶＥＣ細胞はそれぞれＪＣＲＢ細胞バンク、コスモ・バイオ、Ｌｏｎｚａから購入した。ミニブタのＰＢＭＣ（ｍｉｎｉ ＰＢＭＣ）は国立国際医療研究センターの霜田雅之先生から譲与頂いた。肉豚系統ブタのＰＢＭＣ（ｈｙｐｏ ＰＢＭＣ）は株式会社ポル・メド・テックから譲与いただいた肉豚系統ブタ（ｈｙｐｏ系統）の全血から単離した。各細胞の継代培養、ＰＢＭＣの刺激の手順を以下に記述した。
＜１．１．供試細胞＞
以下の実施例及び比較例において、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞としてＰＫ１５細胞及びミニブタ又は肉豚系統ブタのＰＢＭＣを、標的ヒト細胞としてＨＥＫ２９３細胞（ＧＦＰを発現しない）、ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞、ＨＵＶＥＣ細胞を使用した。
ＰＫ１５細胞は大阪大学大学院 医学系研究科 小児成育外科・臓器移植学研究室の宮川周士先生から分与頂いた。
ＨＥＫ２９３細胞、ＧＦＰを安定発現するＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞、及びＨＵＶＥＣ細胞はそれぞれＪＣＲＢ細胞バンク、コスモ・バイオ、Ｌｏｎｚａから購入した。ミニブタのＰＢＭＣ（ｍｉｎｉ ＰＢＭＣ）は国立国際医療研究センターの霜田雅之先生から譲与頂いた。肉豚系統ブタのＰＢＭＣ（ｈｙｐｏ ＰＢＭＣ）は株式会社ポル・メド・テックから譲与いただいた肉豚系統ブタ（ｈｙｐｏ系統）の全血から単離した。各細胞の継代培養、ＰＢＭＣの刺激の手順を以下に記述した。
【0050】
（１．１．１．継代培養）
凍結保存されたＰＫ１５細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞を３７℃の温水で振盪しながら融解し、１０ｍｌの血清添加ＤＭＥＭ培地［１０％（ｖ／ｖ）非動化処理済みウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｓｉｇｍａ社）、５０Ｕ／ｍｌペニシリン（ナカライテスク社）、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ナカライテスク社）加ＤＭＥＭ（４．５ｇ／ｌ Ｇｌｕｃｏｓｅ）培地（ナカライテスク社）］に添加した。この細胞懸濁液を室温で８００×ｇ、３分間遠心分離し、上清を除去した。細胞を１ｍｌの血清添加ＤＭＥＭ培地で懸濁し、懸濁液中の細胞数をＴＣ２０（登録商標）Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）を用いて計数した。生細胞数濃度をもとにＰＫ１５細胞を５．０×１０５ｃｅｌｌｓ、ＨＥＫ２９３細胞を１．０×１０６ｃｅｌｌｓ、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞を８．６×１０５ｃｅｌｌｓ、それぞれ血清添加ＤＭＥＭ培地１０ｍｌに懸濁し、７５ｃｍ２培養用フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ社）に播種した。その後、３７℃、６％ＣＯ２の条件下で培養した。翌日、培養上清を吸引除去し、１０ｍｌの血清添加ＤＭＥＭ培地を新たに添加して培地交換を行った。
８０％コンフルエントになった時点で、フラスコ内の培地を吸引除去し、１０ｍｌのＰＢＳ（－）（和光純薬社）で洗浄した後、５ｍｌの２．５ｇ／ｌトリプシン－１ｍＭ ＥＤＴＡ（ナカライテスク社）を培養フラスコに加え、３７℃、６％ＣＯ２の条件下で２～３分間、細胞剥離処理を行った。細胞剥離後、等量の血清添加ＤＭＥＭ培地を加えて反応を止め、細胞懸濁液を室温で８００×ｇ、３分間遠心分離した。上清を除去し、血清添加ＤＭＥＭ培地を３～５ｍｌ加えて細胞を懸濁した。上記と同様に、細胞懸濁液中の細胞数を計数し、必要細胞数を培養フラスコへと継代した。継代は３日もしくは４日ごとに行い、継代時に剥離した細胞を以下の共培養試験に用いた。
ＨＵＶＥＣ細胞は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（登録商標）血管内皮細胞システム 操作手順マニュアルに従い培養を行った。培地はＥＧＭ（登録商標）－２添加因子キット（Ｌｏｎｚａ社）を添加したＥＢＭ（登録商標）－２基本培地（Ｌｏｎｚａ社）（以下、ＥＢＭ－２培地）を使用した。推奨播種密度を参考に、必要細胞数を１５ｍｌのＥＢＭ－２培地に懸濁し、７５ｃｍ２培養用フラスコに播種した。その後、３７℃６％ＣＯ２の条件下で培養した。７０～８０％コンフルエントになったＨＵＶＥＣ細胞は、上記と同様のマニュアルに従い、ＨＥＰＥＳ溶液（Ｌｏｎｚａ社）、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｌｏｎｚａ社）、トリプシン中和液（Ｌｏｎｚａ社）を用いて剥離、継代した。継代は２もしくは３日ごとに行い、継代時に剥離した細胞を以下の共培養試験に用いた。
凍結保存されたＰＫ１５細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞を３７℃の温水で振盪しながら融解し、１０ｍｌの血清添加ＤＭＥＭ培地［１０％（ｖ／ｖ）非動化処理済みウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｓｉｇｍａ社）、５０Ｕ／ｍｌペニシリン（ナカライテスク社）、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ナカライテスク社）加ＤＭＥＭ（４．５ｇ／ｌ Ｇｌｕｃｏｓｅ）培地（ナカライテスク社）］に添加した。この細胞懸濁液を室温で８００×ｇ、３分間遠心分離し、上清を除去した。細胞を１ｍｌの血清添加ＤＭＥＭ培地で懸濁し、懸濁液中の細胞数をＴＣ２０（登録商標）Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）を用いて計数した。生細胞数濃度をもとにＰＫ１５細胞を５．０×１０５ｃｅｌｌｓ、ＨＥＫ２９３細胞を１．０×１０６ｃｅｌｌｓ、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞を８．６×１０５ｃｅｌｌｓ、それぞれ血清添加ＤＭＥＭ培地１０ｍｌに懸濁し、７５ｃｍ２培養用フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ社）に播種した。その後、３７℃、６％ＣＯ２の条件下で培養した。翌日、培養上清を吸引除去し、１０ｍｌの血清添加ＤＭＥＭ培地を新たに添加して培地交換を行った。
８０％コンフルエントになった時点で、フラスコ内の培地を吸引除去し、１０ｍｌのＰＢＳ（－）（和光純薬社）で洗浄した後、５ｍｌの２．５ｇ／ｌトリプシン－１ｍＭ ＥＤＴＡ（ナカライテスク社）を培養フラスコに加え、３７℃、６％ＣＯ２の条件下で２～３分間、細胞剥離処理を行った。細胞剥離後、等量の血清添加ＤＭＥＭ培地を加えて反応を止め、細胞懸濁液を室温で８００×ｇ、３分間遠心分離した。上清を除去し、血清添加ＤＭＥＭ培地を３～５ｍｌ加えて細胞を懸濁した。上記と同様に、細胞懸濁液中の細胞数を計数し、必要細胞数を培養フラスコへと継代した。継代は３日もしくは４日ごとに行い、継代時に剥離した細胞を以下の共培養試験に用いた。
ＨＵＶＥＣ細胞は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（登録商標）血管内皮細胞システム 操作手順マニュアルに従い培養を行った。培地はＥＧＭ（登録商標）－２添加因子キット（Ｌｏｎｚａ社）を添加したＥＢＭ（登録商標）－２基本培地（Ｌｏｎｚａ社）（以下、ＥＢＭ－２培地）を使用した。推奨播種密度を参考に、必要細胞数を１５ｍｌのＥＢＭ－２培地に懸濁し、７５ｃｍ２培養用フラスコに播種した。その後、３７℃６％ＣＯ２の条件下で培養した。７０～８０％コンフルエントになったＨＵＶＥＣ細胞は、上記と同様のマニュアルに従い、ＨＥＰＥＳ溶液（Ｌｏｎｚａ社）、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｌｏｎｚａ社）、トリプシン中和液（Ｌｏｎｚａ社）を用いて剥離、継代した。継代は２もしくは３日ごとに行い、継代時に剥離した細胞を以下の共培養試験に用いた。
【0051】
（１．１．２．ＰＢＭＣの刺激）
ＰＢＭＣは共培養前にフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ；レクチン キントキマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社））で３日間刺激したもの（刺激ＰＢＭＣ）と、ＰＨＡ無しで３日間培養したもの（非刺激ＰＢＭＣ）を使用した。ＰＨＡによる刺激は次の通り行った。ｍｉｎｉＰＢＭＣ及びｈｙｐｏＰＢＭＣの生細胞をＰＨＡ濃度が２．５μｇ／ｍｌの血清添加ＲＰＭＩ培地で５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるよう調製した。調製後、３７℃６％ＣＯ２の条件下で３日間培養した（以下、ｍｉｎｉ ｓ－ＰＢＭＣ、ｈｙｐｏ ｓ－ＰＢＭＣ）。非刺激ＰＢＭＣ はＰＨＡを含まない血清添加ＲＰＭＩ培地を用いてｍｉｎｉ及びｈｙｐｏ ＰＢＭＣを３日間培養した（以下、ｍｉｎｉ ｎ－ＰＢＭＣ、ｈｙｐｏ ｎ－ＰＢＭＣ）。その後、全てのＰＢＭＣを洗浄するために、室温で８００×ｇ、３分間遠心分離後、上清除去し、５ｍｌの血清添加ＲＰＭＩ培地で懸濁した。この洗浄を２回繰り返した後、細胞数を計数し共培養試験に用いた。また、４種類のＰＢＭＣはＰＥＲＶコピー数計測のため、１．０×１０５ｃｅｌｌずつ２５０μｌの血清添加ＲＰＭＩ培地に懸濁し、７５０μｌのＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）と混合した後（細胞懸濁液：ＴＲＩｚｏｌ＝１：３）、ＲＮＡ抽出に供するまで－８０℃で保存した。なお、以降の実験では、細胞懸濁液とＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔは全てこの比率で混合した。
ＰＢＭＣは共培養前にフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ；レクチン キントキマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社））で３日間刺激したもの（刺激ＰＢＭＣ）と、ＰＨＡ無しで３日間培養したもの（非刺激ＰＢＭＣ）を使用した。ＰＨＡによる刺激は次の通り行った。ｍｉｎｉＰＢＭＣ及びｈｙｐｏＰＢＭＣの生細胞をＰＨＡ濃度が２．５μｇ／ｍｌの血清添加ＲＰＭＩ培地で５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるよう調製した。調製後、３７℃６％ＣＯ２の条件下で３日間培養した（以下、ｍｉｎｉ ｓ－ＰＢＭＣ、ｈｙｐｏ ｓ－ＰＢＭＣ）。非刺激ＰＢＭＣ はＰＨＡを含まない血清添加ＲＰＭＩ培地を用いてｍｉｎｉ及びｈｙｐｏ ＰＢＭＣを３日間培養した（以下、ｍｉｎｉ ｎ－ＰＢＭＣ、ｈｙｐｏ ｎ－ＰＢＭＣ）。その後、全てのＰＢＭＣを洗浄するために、室温で８００×ｇ、３分間遠心分離後、上清除去し、５ｍｌの血清添加ＲＰＭＩ培地で懸濁した。この洗浄を２回繰り返した後、細胞数を計数し共培養試験に用いた。また、４種類のＰＢＭＣはＰＥＲＶコピー数計測のため、１．０×１０５ｃｅｌｌずつ２５０μｌの血清添加ＲＰＭＩ培地に懸濁し、７５０μｌのＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）と混合した後（細胞懸濁液：ＴＲＩｚｏｌ＝１：３）、ＲＮＡ抽出に供するまで－８０℃で保存した。なお、以降の実験では、細胞懸濁液とＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔは全てこの比率で混合した。
【0052】
＜１．２．新規ｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養系の確立（共培養細胞からの標的ヒト細胞の単離）＞
（１．２．１．セルソーターによる標的ヒト細胞の単離）
以下の方法で共培養後に高純度で標的ヒト細胞を単離できることを確認した。細胞の単離にはセルソーター（ＳＨ８００，ＳＯＮＹ社）を用いた。ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞はＧＦＰの蛍光を、ＨＵＶＥＣ細胞は血管内皮細胞のマーカー分子であるＣＤ３１を蛍光抗体で標識し、その蛍光をＰＥＲＶ産生ブタ細胞と区別するために利用した。ＨＵＶＥＣ細胞とＰＫ１５細胞を含む細胞混合液は室温で２００×ｇ、５分間遠心分離し、上清を除去した後、０．５％（ｗ／ｖ）Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ，和光純薬社）を含むＰＢＳ（－）（以下、０．５％ＢＳＡ－ＰＢＳ）１ｍｌで懸濁した。再び室温で２００×ｇ、５分間遠心分離し、上清を除去した後、１．０×１０６ｃｅｌｌに対し１２０μｌの希釈抗体液を添加し、混合した。希釈抗体液は０．５％ＢＳＡ－ＰＢＳ溶液１００μｌあたりに、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ３１抗体（ｃｌｏｎｅ ＷＭ５９；ベクトン ディッキンソン社）を２０μｌ添加することで作製した。暗所で４℃３０分間反応させた後、室温で２００×ｇ、５分間遠心分離し、上清を除去した。１ｍｌの０．５％ＢＳＡ－ＰＢＳ溶液で懸濁し、再び室温で２００×ｇ、５分間遠心分離し、上清を除去した。その後、３ｍｌのＥＢＭ－２培地で懸濁した。
図１Ａは、ＧＦＰの蛍光強度によりＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞を、図１Ｂは、ＦＩＴＣの蛍光強度によりＨＵＶＥＣ細胞をそれぞれゲーティングした一例を示す図である。
ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞とＰＫ１５細胞もしくはＰＢＭＣ、及びＨＵＶＥＣ細胞とＰＫ１５細胞の細胞混合液はナイロンメッシュ（ポアサイズ３２μｍ；東京スクリーン社）で濾過した後、セルソーターに供した。解析ソフトＣｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ ＳＨ８００ Ｓｅｒｉｅｓ（ＳＯＮＹ社）を用いて、前方散乱光の幅（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅ－Ｗｉｄｔｈ （ＦＳＣ－Ｗ））及び前方散乱光の高さ（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ－Ｈｅｉｇｈｔ（ＦＳＣ－Ｈ））からダブレット（凝集細胞）を除去するようにゲーティング及び展開し、図１に示すように、ＧＦＰの蛍光強度からＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞を、ＦＩＴＣの蛍光強度からＨＵＶＥＣ細胞をゲーティングし、それぞれの細胞を単離した。
（１．２．１．セルソーターによる標的ヒト細胞の単離）
以下の方法で共培養後に高純度で標的ヒト細胞を単離できることを確認した。細胞の単離にはセルソーター（ＳＨ８００，ＳＯＮＹ社）を用いた。ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞はＧＦＰの蛍光を、ＨＵＶＥＣ細胞は血管内皮細胞のマーカー分子であるＣＤ３１を蛍光抗体で標識し、その蛍光をＰＥＲＶ産生ブタ細胞と区別するために利用した。ＨＵＶＥＣ細胞とＰＫ１５細胞を含む細胞混合液は室温で２００×ｇ、５分間遠心分離し、上清を除去した後、０．５％（ｗ／ｖ）Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ，和光純薬社）を含むＰＢＳ（－）（以下、０．５％ＢＳＡ－ＰＢＳ）１ｍｌで懸濁した。再び室温で２００×ｇ、５分間遠心分離し、上清を除去した後、１．０×１０６ｃｅｌｌに対し１２０μｌの希釈抗体液を添加し、混合した。希釈抗体液は０．５％ＢＳＡ－ＰＢＳ溶液１００μｌあたりに、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ３１抗体（ｃｌｏｎｅ ＷＭ５９；ベクトン ディッキンソン社）を２０μｌ添加することで作製した。暗所で４℃３０分間反応させた後、室温で２００×ｇ、５分間遠心分離し、上清を除去した。１ｍｌの０．５％ＢＳＡ－ＰＢＳ溶液で懸濁し、再び室温で２００×ｇ、５分間遠心分離し、上清を除去した。その後、３ｍｌのＥＢＭ－２培地で懸濁した。
図１Ａは、ＧＦＰの蛍光強度によりＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞を、図１Ｂは、ＦＩＴＣの蛍光強度によりＨＵＶＥＣ細胞をそれぞれゲーティングした一例を示す図である。
ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞とＰＫ１５細胞もしくはＰＢＭＣ、及びＨＵＶＥＣ細胞とＰＫ１５細胞の細胞混合液はナイロンメッシュ（ポアサイズ３２μｍ；東京スクリーン社）で濾過した後、セルソーターに供した。解析ソフトＣｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ ＳＨ８００ Ｓｅｒｉｅｓ（ＳＯＮＹ社）を用いて、前方散乱光の幅（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅ－Ｗｉｄｔｈ （ＦＳＣ－Ｗ））及び前方散乱光の高さ（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ－Ｈｅｉｇｈｔ（ＦＳＣ－Ｈ））からダブレット（凝集細胞）を除去するようにゲーティング及び展開し、図１に示すように、ＧＦＰの蛍光強度からＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞を、ＦＩＴＣの蛍光強度からＨＵＶＥＣ細胞をゲーティングし、それぞれの細胞を単離した。
【0053】
（１．２．２．ＰＥＲＶ産生ブタ細胞混入の確認）
単離した標的ヒト細胞をセルソーターもしくはＡｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃ６ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ベクトン ディッキンソン社）に供し、フローサイトメトリー解析を行った。Ａｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃ６ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いた際は測定ソフトＣ Ｓａｍｐｌｅｒ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ベクトン ディッキンソン社）を使用した。ＧＦＰもしくはＦＩＴＣの蛍光強度から、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞の混入の有無を確認した。また、単離したＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞はその一部を播種し、８０％コンフルエントになった時点で、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭ ＩＬ ＬＥＤ，Ｌｅｉｃａ社）下で画像解析ソフトＬｅｉｃａ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｕｉｔｅ Ｖ４（Ｌｅｉｃａ社）を用いて観察、撮影し、非蛍光細胞であるＰＥＲＶ産生ブタ細胞の混入の有無を確認した。
単離した標的ヒト細胞をセルソーターもしくはＡｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃ６ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ベクトン ディッキンソン社）に供し、フローサイトメトリー解析を行った。Ａｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃ６ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いた際は測定ソフトＣ Ｓａｍｐｌｅｒ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ベクトン ディッキンソン社）を使用した。ＧＦＰもしくはＦＩＴＣの蛍光強度から、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞の混入の有無を確認した。また、単離したＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞はその一部を播種し、８０％コンフルエントになった時点で、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭ ＩＬ ＬＥＤ，Ｌｅｉｃａ社）下で画像解析ソフトＬｅｉｃａ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｕｉｔｅ Ｖ４（Ｌｅｉｃａ社）を用いて観察、撮影し、非蛍光細胞であるＰＥＲＶ産生ブタ細胞の混入の有無を確認した。
【0054】
＜１．３．新規ｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養系（実施例）及び従来の共培養系（比較例）によるＰＥＲＶ感染性の評価＞
従来の共培養系（比較例）におけるＰＥＲＶの感染性と比較することにより、新規ｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養系（実施例）の有用性を以下検証した。
（１．３．１．実施例：接触下における共培養）
実施例として、Ｘ線照射などの処理を行わないＰＥＲＶ産生ブタ細胞を、標的ヒト細胞に接触させる共培養を行った。ここでは高コピーのＰＥＲＶを産生するＨｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞としてＰＫ１５細胞とＰＥＲＶに感受性の高いＨｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞としてＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞を使用した。
評価は細胞の接触期間及び接触比率の２種類を対象とし、前者は１～４日間、１～３週間の接触期間を設け、後者はＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）の比率を９：１から１：９の範囲で複数設定し共培養を行った。
１、２、３週間の共培養では、週に２回継代を行ったが、ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞の分裂速度がＰＫ１５細胞よりも速かったため、１週間に一度、別で培養したＰＫ１５細胞を新たに加え、細胞の比率を調整した。各共培養の条件及び播種時の各細胞数を下記表１に示す。
次に、ＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＰＥＲＶ感受性が低いと考えられるＬｏｗ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞としてＨＵＶＥＣ細胞を使用し、標的ヒト細胞のＰＥＲＶ感受性の違いがＰＥＲＶ感染性に与える影響を検討した。
ＰＫ１５細胞及びＨＵＶＥＣ細胞を１５ｍｌのＥＢＭ－２培地に懸濁、混合した後、７５ｃｍ２培養用フラスコに播種し、培養した。播種時の各細胞数は下記表１に示した。
最後に、Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞であるＰＢＭＣとＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）を共培養し、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞の違いがＰＥＲＶ感染性に与える影響を検討した。ｍｉｎｉＰＢＭＣもしくはｈｙｐｏＰＢＭＣ及びＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞を５ｍｌの血清添加ＤＭＥＭ培地に懸濁、混合した後、２５ｃｍ２培養用フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ社）に播種し、培養した。共培養の条件及び播種時の各細胞数を下記表１に示す。
共培養後、上記１．１．１項の継代培養と同様に細胞を剥離し、細胞を回収した。ＰＫ１５細胞またはＰＢＭＣと共培養したＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）は回収後、Ｐｅｒｃｏｌｌ溶液を用いて培養上清中に存在するＰＥＲＶ粒子の除去及び細胞の洗浄を行った。ここでは、ＳＩＰ溶液１０ｍｌに６．４ｍｌの０．１５Ｍ ＮａＣｌを添加した比重１．０７７ｇ／ｍｌのＰｅｒｃｏｌｌ溶液を用いて、上記１．１．２項のＰＢＭＣ単離と同様の操作を行った。
なお、ＨＵＶＥＣ細胞を含む共培養細胞は、ＨＵＶＥＣ細胞がＰｅｒｃｏｌｌによる遠心分離でダメージを受けてしまうため、上記の操作は行わなかった。標的ヒト細胞の単離は上記１．２．１項と同様にセルソーターを用いて行い、得られた標的ヒト細胞はＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔと混合した後、－８０℃で保存した。
従来の共培養系（比較例）におけるＰＥＲＶの感染性と比較することにより、新規ｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養系（実施例）の有用性を以下検証した。
（１．３．１．実施例：接触下における共培養）
実施例として、Ｘ線照射などの処理を行わないＰＥＲＶ産生ブタ細胞を、標的ヒト細胞に接触させる共培養を行った。ここでは高コピーのＰＥＲＶを産生するＨｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞としてＰＫ１５細胞とＰＥＲＶに感受性の高いＨｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞としてＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞を使用した。
評価は細胞の接触期間及び接触比率の２種類を対象とし、前者は１～４日間、１～３週間の接触期間を設け、後者はＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）の比率を９：１から１：９の範囲で複数設定し共培養を行った。
１、２、３週間の共培養では、週に２回継代を行ったが、ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞の分裂速度がＰＫ１５細胞よりも速かったため、１週間に一度、別で培養したＰＫ１５細胞を新たに加え、細胞の比率を調整した。各共培養の条件及び播種時の各細胞数を下記表１に示す。
次に、ＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＰＥＲＶ感受性が低いと考えられるＬｏｗ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞としてＨＵＶＥＣ細胞を使用し、標的ヒト細胞のＰＥＲＶ感受性の違いがＰＥＲＶ感染性に与える影響を検討した。
ＰＫ１５細胞及びＨＵＶＥＣ細胞を１５ｍｌのＥＢＭ－２培地に懸濁、混合した後、７５ｃｍ２培養用フラスコに播種し、培養した。播種時の各細胞数は下記表１に示した。
最後に、Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞であるＰＢＭＣとＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）を共培養し、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞の違いがＰＥＲＶ感染性に与える影響を検討した。ｍｉｎｉＰＢＭＣもしくはｈｙｐｏＰＢＭＣ及びＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞を５ｍｌの血清添加ＤＭＥＭ培地に懸濁、混合した後、２５ｃｍ２培養用フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ社）に播種し、培養した。共培養の条件及び播種時の各細胞数を下記表１に示す。
【表1】
なお、ＨＵＶＥＣ細胞を含む共培養細胞は、ＨＵＶＥＣ細胞がＰｅｒｃｏｌｌによる遠心分離でダメージを受けてしまうため、上記の操作は行わなかった。標的ヒト細胞の単離は上記１．２．１項と同様にセルソーターを用いて行い、得られた標的ヒト細胞はＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔと混合した後、－８０℃で保存した。
【0055】
（１．３．２．比較例：多孔質膜隔離下における共培養）
細胞同士の接触の有無がＰＥＲＶ感染性に与える影響を検討するため、比較例としてＰＥＲＶ産生ブタ細胞と標的ヒト細胞とを多孔質膜で隔離した条件下でも共培養を行った。実施した細胞の組み合わせや条件は原則として上記接触下における共培養と同様とした。
図１７は、比較例で使用した縦型共培養プレート及び水平型共培養容器の模式図（水平型共培養容器ＵｎｉＷｅｌｌｓ（登録商標）（和光純薬社製）を示す図である。
ＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）の共培養では、図１７Ａの形状の縦型共培養プレート２４ｍｍ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）ｗｉｔｈ０．４μｍＰｏｒｅ Ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｉｎｓｅｒｔ（６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ；ＣＯＲＮＩＮＧ社）を使用した。
縦型共培養プレートは細胞の培養面積がインサート上部と下部で異なるため、インサート上部にＰＥＲＶ産生ブタ細胞を、下部に標的ヒト細胞を播種する共培養、及びその逆の上下を入れ替えたパターンでそれぞれの細胞を播種する共培養を実施した。
インサート上部の培地は１．５ｍｌ、下部は３．０ｍｌとした。１、２、３週間の共培養では、ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞のみを週に２回継代した。播種時の各細胞数は下記表２に示した。
ＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＵＶＥＣ細胞（Ｌｏｗ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）、ＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）の共培養では、ＵｎｉＷｅｌｌｓ（登録商標）Ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ Ｃｏ－Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｌａｔｅ（和光純薬社）とＵｎｉＷｅｌｌｓ（登録商標）Ｆｉｌｔｅｒ０．６μｍ（ポアサイズ０．６μｍ；和光純薬社）を組み合わせた図１７Ｂの形状の水平型共培養容器を使用した。水平型共培養容は細胞の培養面積が左右同じであるため、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞と標的ヒト細胞の入れ替えは行わなかった。なお、水平型共培養では左側にＰＥＲＶ産生ブタ細胞を、右側に標的ヒト細胞を播種し、培地量は１．５ｍｌとした。共培養の条件及び播種時の各細胞数を下記表２に示す。
共培養後、標的ヒト細胞を剥離し、回収した。多孔質膜隔離下における共培養では、回収できる細胞数が少ないため、Ｐｅｒｃｏｌｌ溶液を用いたＰＥＲＶ粒子の除去及び細胞洗浄は実施しなかった。回収した全ての標的ヒト細胞は、上述と同様にＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔと混合し、－８０℃で保存した。
細胞同士の接触の有無がＰＥＲＶ感染性に与える影響を検討するため、比較例としてＰＥＲＶ産生ブタ細胞と標的ヒト細胞とを多孔質膜で隔離した条件下でも共培養を行った。実施した細胞の組み合わせや条件は原則として上記接触下における共培養と同様とした。
図１７は、比較例で使用した縦型共培養プレート及び水平型共培養容器の模式図（水平型共培養容器ＵｎｉＷｅｌｌｓ（登録商標）（和光純薬社製）を示す図である。
ＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）の共培養では、図１７Ａの形状の縦型共培養プレート２４ｍｍ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）ｗｉｔｈ０．４μｍＰｏｒｅ Ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｉｎｓｅｒｔ（６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ；ＣＯＲＮＩＮＧ社）を使用した。
縦型共培養プレートは細胞の培養面積がインサート上部と下部で異なるため、インサート上部にＰＥＲＶ産生ブタ細胞を、下部に標的ヒト細胞を播種する共培養、及びその逆の上下を入れ替えたパターンでそれぞれの細胞を播種する共培養を実施した。
インサート上部の培地は１．５ｍｌ、下部は３．０ｍｌとした。１、２、３週間の共培養では、ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞のみを週に２回継代した。播種時の各細胞数は下記表２に示した。
ＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＵＶＥＣ細胞（Ｌｏｗ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）、ＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）の共培養では、ＵｎｉＷｅｌｌｓ（登録商標）Ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ Ｃｏ－Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｌａｔｅ（和光純薬社）とＵｎｉＷｅｌｌｓ（登録商標）Ｆｉｌｔｅｒ０．６μｍ（ポアサイズ０．６μｍ；和光純薬社）を組み合わせた図１７Ｂの形状の水平型共培養容器を使用した。水平型共培養容は細胞の培養面積が左右同じであるため、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞と標的ヒト細胞の入れ替えは行わなかった。なお、水平型共培養では左側にＰＥＲＶ産生ブタ細胞を、右側に標的ヒト細胞を播種し、培地量は１．５ｍｌとした。共培養の条件及び播種時の各細胞数を下記表２に示す。
共培養後、標的ヒト細胞を剥離し、回収した。多孔質膜隔離下における共培養では、回収できる細胞数が少ないため、Ｐｅｒｃｏｌｌ溶液を用いたＰＥＲＶ粒子の除去及び細胞洗浄は実施しなかった。回収した全ての標的ヒト細胞は、上述と同様にＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔと混合し、－８０℃で保存した。
【表2】
【0056】
＜１．４．感染ヒト細胞から未感染ヒト細胞へのＰＥＲＶ感染性の評価＞
ＰＥＲＶが感染したヒト細胞から未感染のヒト細胞にＰＥＲＶ感染が起こるかどうかを確認するために、ＰＥＲＶ感染が確認されたＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞とＨＥＫ２９３細胞の接触下における共培養を行った。
まず、上記１．３項と同様にＰＫ細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを接触下で４日間共培養した。その後、ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞をセルソーターにより単離し、一部をＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔと混合し－８０℃で保存、一部を７５ｃｍ２培養用フラスコに播種し、培養した。単離したＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞を５回継代し、ブタミトコンドリアに対するＰＣＲ検査が陰性、ＰＥＲＶ遺伝子に対するＰＣＲ検査が陽性であることを確認し、これをＰＥＲＶ陽性ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞とした。
このＰＥＲＶ陽性ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞とＨＥＫ２９３細胞を１０ｍｌの血清添加ＤＭＥＭ培地に懸濁、混合した後、７５ｃｍ２培養用フラスコに播種し、接触下で共培養した。４日間の培養後、セルソーターにより標的ヒト細胞であるＨＥＫ２９３細胞（ＧＦＰ陰性細胞）を単離した。単離したＨＥＫ２９３細胞を上述と同様にＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔと混合し、－８０℃で保存した。各培養における播種時の条件及び各細胞数は上記表１に示した。
ＰＥＲＶが感染したヒト細胞から未感染のヒト細胞にＰＥＲＶ感染が起こるかどうかを確認するために、ＰＥＲＶ感染が確認されたＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞とＨＥＫ２９３細胞の接触下における共培養を行った。
まず、上記１．３項と同様にＰＫ細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを接触下で４日間共培養した。その後、ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞をセルソーターにより単離し、一部をＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔと混合し－８０℃で保存、一部を７５ｃｍ２培養用フラスコに播種し、培養した。単離したＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞を５回継代し、ブタミトコンドリアに対するＰＣＲ検査が陰性、ＰＥＲＶ遺伝子に対するＰＣＲ検査が陽性であることを確認し、これをＰＥＲＶ陽性ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞とした。
このＰＥＲＶ陽性ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞とＨＥＫ２９３細胞を１０ｍｌの血清添加ＤＭＥＭ培地に懸濁、混合した後、７５ｃｍ２培養用フラスコに播種し、接触下で共培養した。４日間の培養後、セルソーターにより標的ヒト細胞であるＨＥＫ２９３細胞（ＧＦＰ陰性細胞）を単離した。単離したＨＥＫ２９３細胞を上述と同様にＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔと混合し、－８０℃で保存した。各培養における播種時の条件及び各細胞数は上記表１に示した。
【0057】
＜１．５．ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成＞
－８０℃で保存した共培養後の細胞、及び全ての供試細胞（共培養前）からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成した。共培養前の供試細胞はそれぞれ１．０×１０５ｃｅｌｌをＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔと混合し、室温で５分間インキュベートした。ＲＮＡ抽出用にＴｒｉｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔと混合後に保存した細胞は、凍結状態のものは解凍後、ボルテックスにより再度混合し、同様にインキュベートした。インキュベート後、細胞懸濁液を２３Ｇの注射針（ＴＥＲＵＭＯ社）に１０回通し、細胞を溶解した。クロロホルムを２００μｌ加え１５秒間ボルテックスにより混合し、室温で３分静置した。４℃で１２，０００×ｇ、１５分間遠心分離し、遠心後の透明な上層（水層）を、５００μｌ回収した。
ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、回収した水層から全ＲＮＡ精製を行った。回収した水層と等量の７０％（ｖ／ｖ）エタノールを加えピペッティングした後、キット付属のカラムに混合液を２回に分けてアプライし、室温で８，０００×ｇ、３０秒間遠心分離し、ろ液を廃棄した。カラムにＢｕｆｆｅｒＲＷ１を３５０μｌ添加し、再び室温で８，０００×ｇ、３０秒間遠心分離し、ろ液を廃棄した。ＤＮａｓｅ処理にはＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いた。キット付属のＤＮａｓｅＩ及びＢｕｆｆｅｒＲＤＤを１：７になるよう懸濁した溶液を７５μｌ添加し、室温で７分静置した。ＤＮａｓｅ処理後、ＲＷ１を３５０μｌ添加し、室温で８，０００×ｇ、３０秒間遠心分離し、ろ液を廃棄した。次にＢｕｆｆｅｒ ＲＰＥ５００μｌを添加し、室温で８，０００×ｇ、３０秒間遠心分離し、ろ液を廃棄した。８０％（ｖ／ｖ）エタノールを５００μｌ添加し、室温、８，０００×ｇで２分間遠心分離し、ろ液を廃棄した。エタノールの除去を目的として、カラムに何も添加せず室温で、８，０００×ｇ、５分間遠心分離した。最後にカラムを新しいチューブにセットし、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ１４μｌを添加し、室温で８，０００×ｇ、１分間遠心分離した。
抽出したＲＮＡからＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてｃＤＮＡ合成した。ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）又はｏｌｉｇｏ ｄＴ２０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）１．５μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ４μｌ、ＲＮＡ（２５～２００ｎｇ；ＲＮＡ量は各共培養試験の標的ヒト細胞ごとに統一）１μｌ、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ５．５μｌを混合した１２μｌの反応液を作製した。６５℃で５分間静置し、すぐ氷上に移動させた。その後の操作は、キット付属のプロトコルに従い行った。
－８０℃で保存した共培養後の細胞、及び全ての供試細胞（共培養前）からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成した。共培養前の供試細胞はそれぞれ１．０×１０５ｃｅｌｌをＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔと混合し、室温で５分間インキュベートした。ＲＮＡ抽出用にＴｒｉｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔと混合後に保存した細胞は、凍結状態のものは解凍後、ボルテックスにより再度混合し、同様にインキュベートした。インキュベート後、細胞懸濁液を２３Ｇの注射針（ＴＥＲＵＭＯ社）に１０回通し、細胞を溶解した。クロロホルムを２００μｌ加え１５秒間ボルテックスにより混合し、室温で３分静置した。４℃で１２，０００×ｇ、１５分間遠心分離し、遠心後の透明な上層（水層）を、５００μｌ回収した。
ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、回収した水層から全ＲＮＡ精製を行った。回収した水層と等量の７０％（ｖ／ｖ）エタノールを加えピペッティングした後、キット付属のカラムに混合液を２回に分けてアプライし、室温で８，０００×ｇ、３０秒間遠心分離し、ろ液を廃棄した。カラムにＢｕｆｆｅｒＲＷ１を３５０μｌ添加し、再び室温で８，０００×ｇ、３０秒間遠心分離し、ろ液を廃棄した。ＤＮａｓｅ処理にはＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いた。キット付属のＤＮａｓｅＩ及びＢｕｆｆｅｒＲＤＤを１：７になるよう懸濁した溶液を７５μｌ添加し、室温で７分静置した。ＤＮａｓｅ処理後、ＲＷ１を３５０μｌ添加し、室温で８，０００×ｇ、３０秒間遠心分離し、ろ液を廃棄した。次にＢｕｆｆｅｒ ＲＰＥ５００μｌを添加し、室温で８，０００×ｇ、３０秒間遠心分離し、ろ液を廃棄した。８０％（ｖ／ｖ）エタノールを５００μｌ添加し、室温、８，０００×ｇで２分間遠心分離し、ろ液を廃棄した。エタノールの除去を目的として、カラムに何も添加せず室温で、８，０００×ｇ、５分間遠心分離した。最後にカラムを新しいチューブにセットし、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ１４μｌを添加し、室温で８，０００×ｇ、１分間遠心分離した。
抽出したＲＮＡからＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてｃＤＮＡ合成した。ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）又はｏｌｉｇｏ ｄＴ２０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）１．５μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ４μｌ、ＲＮＡ（２５～２００ｎｇ；ＲＮＡ量は各共培養試験の標的ヒト細胞ごとに統一）１μｌ、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ５．５μｌを混合した１２μｌの反応液を作製した。６５℃で５分間静置し、すぐ氷上に移動させた。その後の操作は、キット付属のプロトコルに従い行った。
【0058】
＜１．６．ブタミトコンドリア及びＰＥＲＶのｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲ検出＞
合成したｃＤＮＡをサンプルとして、ＬｉｆｅＥＣＯ（日本ジェネティクス社）により、ブタミトコンドリア遺伝子に対するｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲ（以下、ブタミトコンドリアｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲ）及びＰＥＲＶのｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖＡ、ｅｎｖＢ遺伝子に対するｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲを行った（以下、４種のＰＥＲＶ遺伝子のｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲをＰＥＲＶ ｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲ、各遺伝子のｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲをｇａｇ ｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲ、ｐｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲ、ｅｎｖＡ ｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲ、ｅｎｖＢ ｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲと記載する）。なお、ＰＥＲＶ ｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲは、実施例の接触下における共培養試験では、標的ヒト細胞を単離後、ブタミトコンドリアｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲが陰性になるまでの期間は実施しなかった。
ポジティブコントロール（ＰＣ）にはサンプルと同量のＰＫ１５細胞由来ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを、ネガティブコントロール（ＮＣ）には２００ｎｇの共培養とは別に単体で培養したＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＵＶＥＣ細胞のＲＮＡから合成したｃＤＮＡ及びＮｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ（ＮＦＷ）を用いた。ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（日本ジェネティクス社）１０μｌ、１０μＭプライマーセット各０．６μｌ、ＮＦＷ７．３μｌ、サンプル１．５μｌの計２０μｌの反応液を作製した。用いたプライマーの配列は下記表３に示した。
ブタミトコンドリアｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲは９２℃３分間の初期変性の後、９２℃２０秒間、５８℃２０秒間、７２℃３０秒間の温度サイクルを３５サイクル行った。ＰＥＲＶ ｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲは９４℃１０分間の初期変性の後、９４℃３０秒間、６５℃４５秒間、７２℃４０秒間の温度サイクルを３０サイクル、最後に７２℃１０分間の伸長反応を行った。
増幅後は、トリス－ホウ酸－ＥＤＴＡ緩衝原液（ナカライテスク社）を用い、１．５％アガロースゲルで電気泳動を行い、目的サイズと一致することを確認した。
合成したｃＤＮＡをサンプルとして、ＬｉｆｅＥＣＯ（日本ジェネティクス社）により、ブタミトコンドリア遺伝子に対するｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲ（以下、ブタミトコンドリアｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲ）及びＰＥＲＶのｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖＡ、ｅｎｖＢ遺伝子に対するｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲを行った（以下、４種のＰＥＲＶ遺伝子のｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲをＰＥＲＶ ｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲ、各遺伝子のｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲをｇａｇ ｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲ、ｐｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲ、ｅｎｖＡ ｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲ、ｅｎｖＢ ｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲと記載する）。なお、ＰＥＲＶ ｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲは、実施例の接触下における共培養試験では、標的ヒト細胞を単離後、ブタミトコンドリアｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲが陰性になるまでの期間は実施しなかった。
ポジティブコントロール（ＰＣ）にはサンプルと同量のＰＫ１５細胞由来ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを、ネガティブコントロール（ＮＣ）には２００ｎｇの共培養とは別に単体で培養したＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＵＶＥＣ細胞のＲＮＡから合成したｃＤＮＡ及びＮｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ（ＮＦＷ）を用いた。ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（日本ジェネティクス社）１０μｌ、１０μＭプライマーセット各０．６μｌ、ＮＦＷ７．３μｌ、サンプル１．５μｌの計２０μｌの反応液を作製した。用いたプライマーの配列は下記表３に示した。
ブタミトコンドリアｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲは９２℃３分間の初期変性の後、９２℃２０秒間、５８℃２０秒間、７２℃３０秒間の温度サイクルを３５サイクル行った。ＰＥＲＶ ｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲは９４℃１０分間の初期変性の後、９４℃３０秒間、６５℃４５秒間、７２℃４０秒間の温度サイクルを３０サイクル、最後に７２℃１０分間の伸長反応を行った。
増幅後は、トリス－ホウ酸－ＥＤＴＡ緩衝原液（ナカライテスク社）を用い、１．５％アガロースゲルで電気泳動を行い、目的サイズと一致することを確認した。
【0059】
＜１．７．ＰＥＲＶのｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ（商標）検出＞
Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、ＰＥＲＶのｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖＡ、ｅｎｖＢ遺伝子に対するｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ（商標）を実施した（以下、４種のＰＥＲＶ遺伝子のｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ（商標）をＰＥＲＶ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ（商標）、各遺伝子のｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ（商標）をｇａｇ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ、ｐｏｌ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ、ｅｎｖＡ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ、ｅｎｖＢ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲと記載する）。ＰＥＲＶ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲは上記１．６項でＰＥＲＶ検出に供したものと同じサンプル、ＰＣ、ＮＣで実施した。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅ Ｐｌｕｓ）（ＴＡＫＡＲＡ社）５μｌ、１０μＭプライマーセット各０．２μｌ、ＮＦＷ３．６μｌ、サンプル１μｌの計１０μｌの反応液を作製した。用いたプライマーの配列は下記表３に示した。また、反応は２連で行った。９５℃３０秒間の初期変性の後、９５℃５秒間、６０℃３０秒間の温度サイクルを４０サイクル、９５℃５秒間、６５℃６０秒間の融解曲線分析を行った。
Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、ＰＥＲＶのｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖＡ、ｅｎｖＢ遺伝子に対するｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ（商標）を実施した（以下、４種のＰＥＲＶ遺伝子のｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ（商標）をＰＥＲＶ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ（商標）、各遺伝子のｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ（商標）をｇａｇ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ、ｐｏｌ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ、ｅｎｖＡ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ、ｅｎｖＢ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲと記載する）。ＰＥＲＶ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲは上記１．６項でＰＥＲＶ検出に供したものと同じサンプル、ＰＣ、ＮＣで実施した。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅ Ｐｌｕｓ）（ＴＡＫＡＲＡ社）５μｌ、１０μＭプライマーセット各０．２μｌ、ＮＦＷ３．６μｌ、サンプル１μｌの計１０μｌの反応液を作製した。用いたプライマーの配列は下記表３に示した。また、反応は２連で行った。９５℃３０秒間の初期変性の後、９５℃５秒間、６０℃３０秒間の温度サイクルを４０サイクル、９５℃５秒間、６５℃６０秒間の融解曲線分析を行った。
【表3】
【0060】
＜１．８．ＰＥＲＶ遺伝子発現量（ＰＥＲＶのコピー数）測定＞
ＰＥＲＶ遺伝子の発現量を測定するため、合成したｃＤＮＡをサンプルとして１細胞当たりのＰＥＲＶコピー数を測定した。ｐｏｌ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲで標的とした遺伝子配列を含むプラスミドを作成し、ｐｏｌ遺伝子１コピー＝ＰＥＲＶ１コピーと定義した。
ＰＥＲＶ ｐｏｌプラスミドは以下の手順で作製した。ＰＫ１５細胞から抽出、合成したｃＤＮＡを鋳型核酸として、上記１．７項と同様にｐｏｌ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲを実施した。得られたｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて精製した。ＰＣＲ産物に等量のＭｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを混合し、Ｅｃｏｎｏ Ｓｐｉｎ（登録商標）ｆｏｒ ＤＮＡ（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｌａｂｓ社）に全量添加した。室温で１分間静置した後、室温で１６，０００×ｇ、１分間遠心分離した。ろ液を除去し、Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ４００μｌを添加し、室温で１６，０００×ｇ、１分間遠心分離した。再度、ろ液を除去し、Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ４００μｌを添加し、室温で１６，０００×ｇ、５分間遠心分離した。カラムを別のチューブにセットし、ＮＦＷ３０μｌを添加して、室温で１分間静置した。室温で１６，０００×ｇ、１分間遠心分離した。その後、ＴＯＰＯ ＴＡ（登録商標）Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてキット付属のクローニングベクターに組み込んだ。ベクター２μｌを、熱ショック法でＣｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｑｕｉｃｋ ＤＨ５α（Ｇｒｅｅｎ Ｃａｐ）（ＴＯＹＯＢＯ社）に形質転換し、ＬＢ寒天培地に播種した。生育したコロニーのコロニーＰＣＲを行い、インサートが挿入されたベクターを選抜した。コロニーＰＣＲにはＧｏＴａｑ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ１２．５μｌ、ＴＯＰＯ ＴＡ（登録商標）Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）ｋｉｔ付属のＭ１３ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ及びＭ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）各０．５μｌ、ＮＦＷ１１．５μｌの計２５μｌの反応液を作製した。１０μｌ用ピペットチップでコロニーに軽く触れ、その先を反応液に添加した。９４℃で２分間の初期変性後、９８℃で１０秒間の熱変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長反応を３０サイクル行った。上記１．６項と同様の方法で電気泳動を行った。目的サイズのバンドが確認できたコロニーを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ液体培地６ｍｌに播種し、３７℃で１晩培養した。
Ｍｉｎｉ Ｐｌｕｓ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＶＩＯＧＥＮＥ社）を用いて、キット付属のプロトコルに従いプラスミド抽出を行った。プラスミドの濃度をＮａｎｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（登録商標）Ｎ５０（ＩＭＰＬＥＮ社）で濃度測定を行い、コピー数を算出した。
作製したＰＥＲＶ ｐｏｌプラスミドを１０倍ずつ段階希釈し、３．４３×１０６ｃｏｐｉｅｓ／μｌ～０．３４３ｃｏｐｉｅｓ／μｌ（８段階）の濃度のプラスミドをＰＥＲＶ遺伝子発現量測定のスタンダードとした。このスタンダード及び上記１．６項でＰＥＲＶ検出に供したサンプルのうちｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒで合成したｃＤＮＡをサンプルとし、上記１．７項と同様にｐｏｌ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲを実施した。コピー数算出のためのｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲは、スタンダードは３連で、サンプルは２連で行った。スタンダードのコピー数及びＣｐ値を用いて検量線を作成した。この検量線にまとめた各サンプルの細胞数及びｃＤＮＡ合成に用いたＲＮＡ量から、１つの細胞が発現するＰＥＲＶコピー数を算出した。
また、３．４３×１０３ｃｏｐｉｅｓ／μｌ～０．３４３ｃｏｐｉｅｓ／μｌ（５段階）のスタンダードを用いて、ＰＥＲＶコピー数測定（ｐｏｌ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ）の検出限界を算出した。各濃度８連で上記１．７項と同様にｐｏｌ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ（商標）を実施し、統計解析ソフトＲを用いてプロビット回帰解析を行った。
ＰＥＲＶ遺伝子の発現量を測定するため、合成したｃＤＮＡをサンプルとして１細胞当たりのＰＥＲＶコピー数を測定した。ｐｏｌ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲで標的とした遺伝子配列を含むプラスミドを作成し、ｐｏｌ遺伝子１コピー＝ＰＥＲＶ１コピーと定義した。
ＰＥＲＶ ｐｏｌプラスミドは以下の手順で作製した。ＰＫ１５細胞から抽出、合成したｃＤＮＡを鋳型核酸として、上記１．７項と同様にｐｏｌ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲを実施した。得られたｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて精製した。ＰＣＲ産物に等量のＭｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを混合し、Ｅｃｏｎｏ Ｓｐｉｎ（登録商標）ｆｏｒ ＤＮＡ（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｌａｂｓ社）に全量添加した。室温で１分間静置した後、室温で１６，０００×ｇ、１分間遠心分離した。ろ液を除去し、Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ４００μｌを添加し、室温で１６，０００×ｇ、１分間遠心分離した。再度、ろ液を除去し、Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ４００μｌを添加し、室温で１６，０００×ｇ、５分間遠心分離した。カラムを別のチューブにセットし、ＮＦＷ３０μｌを添加して、室温で１分間静置した。室温で１６，０００×ｇ、１分間遠心分離した。その後、ＴＯＰＯ ＴＡ（登録商標）Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてキット付属のクローニングベクターに組み込んだ。ベクター２μｌを、熱ショック法でＣｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｑｕｉｃｋ ＤＨ５α（Ｇｒｅｅｎ Ｃａｐ）（ＴＯＹＯＢＯ社）に形質転換し、ＬＢ寒天培地に播種した。生育したコロニーのコロニーＰＣＲを行い、インサートが挿入されたベクターを選抜した。コロニーＰＣＲにはＧｏＴａｑ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ１２．５μｌ、ＴＯＰＯ ＴＡ（登録商標）Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）ｋｉｔ付属のＭ１３ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ及びＭ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）各０．５μｌ、ＮＦＷ１１．５μｌの計２５μｌの反応液を作製した。１０μｌ用ピペットチップでコロニーに軽く触れ、その先を反応液に添加した。９４℃で２分間の初期変性後、９８℃で１０秒間の熱変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長反応を３０サイクル行った。上記１．６項と同様の方法で電気泳動を行った。目的サイズのバンドが確認できたコロニーを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ液体培地６ｍｌに播種し、３７℃で１晩培養した。
Ｍｉｎｉ Ｐｌｕｓ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＶＩＯＧＥＮＥ社）を用いて、キット付属のプロトコルに従いプラスミド抽出を行った。プラスミドの濃度をＮａｎｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（登録商標）Ｎ５０（ＩＭＰＬＥＮ社）で濃度測定を行い、コピー数を算出した。
作製したＰＥＲＶ ｐｏｌプラスミドを１０倍ずつ段階希釈し、３．４３×１０６ｃｏｐｉｅｓ／μｌ～０．３４３ｃｏｐｉｅｓ／μｌ（８段階）の濃度のプラスミドをＰＥＲＶ遺伝子発現量測定のスタンダードとした。このスタンダード及び上記１．６項でＰＥＲＶ検出に供したサンプルのうちｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒで合成したｃＤＮＡをサンプルとし、上記１．７項と同様にｐｏｌ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲを実施した。コピー数算出のためのｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲは、スタンダードは３連で、サンプルは２連で行った。スタンダードのコピー数及びＣｐ値を用いて検量線を作成した。この検量線にまとめた各サンプルの細胞数及びｃＤＮＡ合成に用いたＲＮＡ量から、１つの細胞が発現するＰＥＲＶコピー数を算出した。
また、３．４３×１０３ｃｏｐｉｅｓ／μｌ～０．３４３ｃｏｐｉｅｓ／μｌ（５段階）のスタンダードを用いて、ＰＥＲＶコピー数測定（ｐｏｌ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ）の検出限界を算出した。各濃度８連で上記１．７項と同様にｐｏｌ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ（商標）を実施し、統計解析ソフトＲを用いてプロビット回帰解析を行った。
【0061】
＜＜結果＞＞
＜２．１．セルソーターによる標的ヒト細胞の単離＞
ＰＥＲＶ産生ブタ細胞と標的ヒト細胞の混合液からセルソーターを用いて標的ヒト細胞を単離し、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞の混入をフローサイトメトリー解析及び蛍光顕微鏡観察により確認した。
図２Ａは、単離した標的ヒト細胞ＨＥＫ２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞のフローサイトメトリー解析の一例を示す図であり、図２Ｂは、単離した標的ヒト細胞ＨＵＶＥＣ細胞のフローサイトメトリー解析の一例を示す図である。
単離後のプロットのうち、いずれの標的ヒト細胞でも、プロット中の標的ヒト細胞の割合は９９．４％以上で、その他はデブリと考えられるプロットであり、非蛍光細胞であるＰＥＲＶ産生ブタ細胞の割合は０％であった。
＜２．１．セルソーターによる標的ヒト細胞の単離＞
ＰＥＲＶ産生ブタ細胞と標的ヒト細胞の混合液からセルソーターを用いて標的ヒト細胞を単離し、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞の混入をフローサイトメトリー解析及び蛍光顕微鏡観察により確認した。
図２Ａは、単離した標的ヒト細胞ＨＥＫ２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞のフローサイトメトリー解析の一例を示す図であり、図２Ｂは、単離した標的ヒト細胞ＨＵＶＥＣ細胞のフローサイトメトリー解析の一例を示す図である。
単離後のプロットのうち、いずれの標的ヒト細胞でも、プロット中の標的ヒト細胞の割合は９９．４％以上で、その他はデブリと考えられるプロットであり、非蛍光細胞であるＰＥＲＶ産生ブタ細胞の割合は０％であった。
【0062】
セルソーターによる単離後に標的ヒト細胞を播種・培養したＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞の蛍光顕微鏡写真を図３に示す。
図３Ａは、単離前のＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞を含む共培養細胞の写真を示す図であり（蛍光細胞がＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞、非蛍光細胞がＰＫ１５細胞）、
図３Ｂは単離後に培養したＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞を明視野で撮影した写真であり、図３Ｃは暗視野（蛍光）で撮影した写真である。
図３から明らかなように、単離前の共培養細胞ではＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞と非蛍光細胞であるＰＫ１５細胞の混在が確認されたが、単離後に培養したＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞には非蛍光細胞であるＰＥＲＶ産生ブタ細胞の存在は確認されなかった。
図３Ａは、単離前のＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞を含む共培養細胞の写真を示す図であり（蛍光細胞がＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞、非蛍光細胞がＰＫ１５細胞）、
図３Ｂは単離後に培養したＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞を明視野で撮影した写真であり、図３Ｃは暗視野（蛍光）で撮影した写真である。
図３から明らかなように、単離前の共培養細胞ではＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞と非蛍光細胞であるＰＫ１５細胞の混在が確認されたが、単離後に培養したＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞には非蛍光細胞であるＰＥＲＶ産生ブタ細胞の存在は確認されなかった。
【0063】
以上のように、接触下での共培養後にセルソーターを用いて標的ヒト細胞を単離し、フローサイトメトリー解析及び蛍光顕微鏡観察によりＰＥＲＶ産生ブタ細胞の混入を確認したところ、フローサイトメトリー解析では、供した細胞の９９．４％以上が標的ヒト細胞でＰＥＲＶ産生ブタ細胞の混入は確認されず、蛍光顕微鏡観察でも同様であった。
したがって、セルソーターを使用することで標的ヒト細胞を高純度に単離することができるため、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞にＰＥＲＶの発現に影響を与え得るＸ線照射などの処理をすることなく、実際の移植時と同様に細胞同士を接触させた状態で共培養できることが示された。このことからセルソーターにより標的ヒト細胞の単離を行う新規のｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養系を確立することができたと言える。
したがって、セルソーターを使用することで標的ヒト細胞を高純度に単離することができるため、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞にＰＥＲＶの発現に影響を与え得るＸ線照射などの処理をすることなく、実際の移植時と同様に細胞同士を接触させた状態で共培養できることが示された。このことからセルソーターにより標的ヒト細胞の単離を行う新規のｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養系を確立することができたと言える。
【0064】
＜２．２．ブタミトコンドリア検出＞
ブタミトコンドリアｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲの結果を図４～７に示す。
図４は、実施例の接触下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のブタミトコンドリア ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果（接触期間検討）を示す図であり、図４Ａは単離直後、図４Ｂは単離後継代４回目の標的ヒト細胞の結果である。
図５は、実施例の接触下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のブタミトコンドリアｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果（接触比率検討）を示す図であり、図５Ａは単離直後、図５Ｂは単離後継代４回目の標的ヒト細胞の結果である。
図４、５中、Ｒはｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒにより合成したｃＤＮＡ、Ｏはｏｌｉｇｏ ｄＴ ｐｒｉｍｅｒにより合成したｃＤＮＡを使ったＰＣＲ結果を示す。陽性対照（ＰＣ）はＰＫ１５細胞、陰性対照（ＮＣ）はＨＥＫ２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞から抽出したＲＮＡを用いたＰＣＲ結果を示す。
ブタミトコンドリアｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲの結果を図４～７に示す。
図４は、実施例の接触下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のブタミトコンドリア ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果（接触期間検討）を示す図であり、図４Ａは単離直後、図４Ｂは単離後継代４回目の標的ヒト細胞の結果である。
図５は、実施例の接触下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のブタミトコンドリアｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果（接触比率検討）を示す図であり、図５Ａは単離直後、図５Ｂは単離後継代４回目の標的ヒト細胞の結果である。
図４、５中、Ｒはｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒにより合成したｃＤＮＡ、Ｏはｏｌｉｇｏ ｄＴ ｐｒｉｍｅｒにより合成したｃＤＮＡを使ったＰＣＲ結果を示す。陽性対照（ＰＣ）はＰＫ１５細胞、陰性対照（ＮＣ）はＨＥＫ２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞から抽出したＲＮＡを用いたＰＣＲ結果を示す。
【0065】
図６は、実施例の接触下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＵＶＥＣ細胞（Ｌｏｗ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のブタミトコンドリアｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果を示す図であり、図６Ａは単離直後、図６Ｂは単離後継代４回目の標的ヒト細胞の結果である。
図６中、Ｒはｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒにより合成したｃＤＮＡ、Ｏはｏｌｉｇｏ ｄＴ ｐｒｉｍｅｒにより合成したｃＤＮＡを使ったＰＣＲ結果を指す。陽性対照 （ＰＣ） はＰＫ１５細胞、陰性対照 （ＮＣ） はＨＵＶＥＣ細胞から抽出したＲＮＡを用いたＰＣＲ結果を示す。
図７は、実施例の接触下でＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のブタミトコンドリアｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果を示す図である。
図７中、Ｒはｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒにより合成したｃＤＮＡ、Ｏはｏｌｉｇｏ ｄＴ ｐｒｉｍｅｒにより合成したｃＤＮＡを使ったＰＣＲ結果を指す。陽性対照（ＰＣ）はＰＫ１５細胞、陰性対照（ＮＣ）はＨＥＫ２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞から抽出したＲＮＡを用いたＰＣＲ結果である。
図６中、Ｒはｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒにより合成したｃＤＮＡ、Ｏはｏｌｉｇｏ ｄＴ ｐｒｉｍｅｒにより合成したｃＤＮＡを使ったＰＣＲ結果を指す。陽性対照 （ＰＣ） はＰＫ１５細胞、陰性対照 （ＮＣ） はＨＵＶＥＣ細胞から抽出したＲＮＡを用いたＰＣＲ結果を示す。
図７は、実施例の接触下でＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のブタミトコンドリアｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果を示す図である。
図７中、Ｒはｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒにより合成したｃＤＮＡ、Ｏはｏｌｉｇｏ ｄＴ ｐｒｉｍｅｒにより合成したｃＤＮＡを使ったＰＣＲ結果を指す。陽性対照（ＰＣ）はＰＫ１５細胞、陰性対照（ＮＣ）はＨＥＫ２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞から抽出したＲＮＡを用いたＰＣＲ結果である。
【0066】
ブタミトコンドリア遺伝子は接触下での共培養では、標的ヒト細胞のＰＥＲＶの感受性を問わず、ＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）と共培養後に単離した直後の標的ヒト細胞から検出されたが（図４Ａ、図５Ａ、図６Ａ）、単離後３～８回継代培養した標的ヒト細胞からは検出されなかった（図４Ｂ、図５Ｂ、図６Ｂ）。ＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）と共培養した標的ヒト細胞からはブタミトコンドリア遺伝子は検出されなかった（図７）。
【0067】
以上のように、フローサイトメトリー解析及び顕微鏡観察下でＰＥＲＶ産生ブタ細胞の混入が確認できなかったにも関わらず、単離直後の標的ヒト細胞においてブタミトコンドリア遺伝子が検出された。本実施例でも標的ヒト細胞を単離後３～８回継代培養するとブタミトコンドリア遺伝子が検出されなくなったことから、接触下での共培養では、ＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）が死滅した際に放出したミトコンドリアが標的ヒト細胞であるＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞及びＨＵＶＥＣ細胞に取り込まれたと考えられる。
なお、従来のＰＥＲＶ産生ブタ細胞へＸ線を照射する共培養系検査においても、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞が死滅したと考えられる共培養後にブタミトコンドリア遺伝子が検出され、数週間の継代培養後にはブタミトコンドリア遺伝子が検出されなくなったという、本実施例と同様の現象が報告されている。
なお、従来のＰＥＲＶ産生ブタ細胞へＸ線を照射する共培養系検査においても、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞が死滅したと考えられる共培養後にブタミトコンドリア遺伝子が検出され、数週間の継代培養後にはブタミトコンドリア遺伝子が検出されなくなったという、本実施例と同様の現象が報告されている。
【0068】
＜２．３．ＰＥＲＶ遺伝子の検出＞
（２．３．１．共培養前のＰＥＲＶ産生ブタ細胞及び標的ヒト細胞）
ＰＥＲＶ産生ブタ細胞のｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ（商標）の結果、及び、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞のＰＥＲＶ遺伝子発現量（ＰＥＲＶのコピー数）測定結果を下記表４に示す。
＋＋は２連とも陽性、＋は１連のみ陽性、－は２連とも陰性をそれぞれ示す。
ＮＴ（Ｎｏｔ Ｔｅｓｔｅｄ）は実験を実施しなかったもの、ＮＤ（Ｎｏｔ Ｄｅｔｅｃｔｅｄ）は検出ができなかったものをそれぞれ示す。
（２．３．１．共培養前のＰＥＲＶ産生ブタ細胞及び標的ヒト細胞）
ＰＥＲＶ産生ブタ細胞のｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ（商標）の結果、及び、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞のＰＥＲＶ遺伝子発現量（ＰＥＲＶのコピー数）測定結果を下記表４に示す。
【表4】
ＮＴ（Ｎｏｔ Ｔｅｓｔｅｄ）は実験を実施しなかったもの、ＮＤ（Ｎｏｔ Ｄｅｔｅｃｔｅｄ）は検出ができなかったものをそれぞれ示す。
【0069】
上記表４に示した測定結果から明らかなように、ＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）のＰＥＲＶコピー数はＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）の１０５倍以上のコピー数であり、ＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）のＰＥＲＶ遺伝子発現量は２２６１．７８ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣのＰＥＲＶ遺伝子発現量は高くても０．０３ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌであった。
【0070】
本実施例でＬｏｗ ｃｏｐｙ細胞として用いた２種（ｍｉｎｉ及びｈｙｐｏ）の刺激あり及び無しのＰＢＭＣにおけるＰＥＲＶ遺伝子の発現量は０．０２～０．０３ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌであり、ＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）の発現量の１／１００，０００以下と、顕著に低かった。
このＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）と共培養し単離した標的ヒト細胞からはＰＥＲＶ遺伝子が検出されず、ＰＥＲＶコピー数測定の検出限界値から、これらの標的ヒト細胞のＰＥＲＶ遺伝子発現量は０．０２ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌ以下であると推定された。
このＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）と共培養し単離した標的ヒト細胞からはＰＥＲＶ遺伝子が検出されず、ＰＥＲＶコピー数測定の検出限界値から、これらの標的ヒト細胞のＰＥＲＶ遺伝子発現量は０．０２ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌ以下であると推定された。
【0071】
また、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞のｐｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果を図８に示す。
図８及び表４から明らかなように、ＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）からはｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲ、ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ（商標）を問わず、４種全てのＰＥＲＶ遺伝子が検出された。
ＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）はｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲにおいて、ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒを用いて合成したｍｉｎｉ ｓ－ＰＢＭＣのｃＤＮＡからｇａｇ遺伝子が、全てのＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）からｐｏｌ遺伝子が検出され（図８）、ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ（商標）においては全てのＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）からｐｏｌ、ｇａｇ、ｅｎｖＢ遺伝子が検出された。
ｈｙｐｏ ｎ－ＰＢＭＣ及びｈｙｐｏ ｓ－ＰＢＭＣは、ｅｎｖＡ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲで目的サイズ付近にバンドが確認されたが（図示せず）、
ｅｎｖＡ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲではｅｎｖＡ遺伝子は検出されなかった。以下の共培養試験のｅｎｖＡ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲにおいても目的サイズ付近にバンドが確認されたが、ＮＣでも同様のバンドが確認されたため、以下ｅｎｖ Ａ遺伝子の検出はｅｎｖＡ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲの結果を反映することとした。
標的ヒト細胞からはｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲ、ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ（商標）を問わず、４種全てのＰＥＲＶ遺伝子が検出されなかった（図表なし、ただし、図９～１６のＮＣとしてｐｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果を示す）。
図８及び表４から明らかなように、ＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）からはｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲ、ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ（商標）を問わず、４種全てのＰＥＲＶ遺伝子が検出された。
ＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）はｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲにおいて、ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒを用いて合成したｍｉｎｉ ｓ－ＰＢＭＣのｃＤＮＡからｇａｇ遺伝子が、全てのＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）からｐｏｌ遺伝子が検出され（図８）、ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ（商標）においては全てのＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）からｐｏｌ、ｇａｇ、ｅｎｖＢ遺伝子が検出された。
ｈｙｐｏ ｎ－ＰＢＭＣ及びｈｙｐｏ ｓ－ＰＢＭＣは、ｅｎｖＡ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲで目的サイズ付近にバンドが確認されたが（図示せず）、
ｅｎｖＡ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲではｅｎｖＡ遺伝子は検出されなかった。以下の共培養試験のｅｎｖＡ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲにおいても目的サイズ付近にバンドが確認されたが、ＮＣでも同様のバンドが確認されたため、以下ｅｎｖ Ａ遺伝子の検出はｅｎｖＡ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲの結果を反映することとした。
標的ヒト細胞からはｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲ、ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ（商標）を問わず、４種全てのＰＥＲＶ遺伝子が検出されなかった（図表なし、ただし、図９～１６のＮＣとしてｐｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果を示す）。
【0072】
以上に示した結果から、ブタの品種及び細胞の種類の違いよりはむしろＰＥＲＶ遺伝子の発現量、逆転写酵素活性等、すなわち放出される感染性を有したＰＥＲＶのウイルス数こそがヒト細胞へのＰＥＲＶ感染の成立に重要と考えられ、これが少ないブタ細胞の場合、ヒト細胞にＰＥＲＶを感染させるリスクは低くなる、または無くなると考えられる。なお、仮に検出限界の０．０２ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌ以下のＰＥＲＶが標的ヒト細胞に感染していたとしても、後述のように、感染したヒト細胞から無感染のヒト細胞に感染する際にＰＥＲＶコピー数は減弱するので（ＨＥＫ２９３からＨＥＫ２９３の場合は１／２，０００程度）、そこから新たに感染が波及する可能性は低いと考えられる。
【0073】
（２．３．２．実施例：接触下における共培養）
フローサイトメトリー解析及び顕微鏡観察において、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞の混入は確認されず、セルソーターにより高純度で標識ヒト細胞を単離できることが明らかになった。そのため、実施例として、Ｘ線照射などの処理を行わないＰＥＲＶ産生ブタ細胞を、標的ヒト細胞に接触させる共培養を行った。
実施例の接触下で共培養した標的ヒト細胞のＰＥＲＶ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲの結果、及び、上記標的ヒト細胞のＰＥＲＶ遺伝子発現量（ＰＥＲＶのコピー数）測定結果を下記表５に示す。
フローサイトメトリー解析及び顕微鏡観察において、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞の混入は確認されず、セルソーターにより高純度で標識ヒト細胞を単離できることが明らかになった。そのため、実施例として、Ｘ線照射などの処理を行わないＰＥＲＶ産生ブタ細胞を、標的ヒト細胞に接触させる共培養を行った。
実施例の接触下で共培養した標的ヒト細胞のＰＥＲＶ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲの結果、及び、上記標的ヒト細胞のＰＥＲＶ遺伝子発現量（ＰＥＲＶのコピー数）測定結果を下記表５に示す。
【表5】
【0074】
上記表５から明らかなように、１日～３週間の接触期間でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）を共培養した標的ヒト細胞のＰＥＲＶコピー数は１日が１３１．７４、２日が３８．２７、３日が３５．９３、４日が１７６．０９、１週間が１２８．６６、２週間が３５４．３２、３週間が３３４．６３ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌであった。接触下で２、３週間共培養した標的ヒト細胞のＰＥＲＶ遺伝子発現量は、１日～１週間共培養した標的ヒト細胞の約２～１０倍であった。
ＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）との比率を９：１から１：９の範囲で共培養した標的ヒト細胞のＰＥＲＶコピー数はそれぞれ、９：１が５．０７、７：３が９．０４、５：５が４．０１、３：７が１．０２、１：９が０．３０ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌであった。接触下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを７：３で共培養した標的ヒト細胞のＰＥＲＶ遺伝子発現量は、１：９で共培養した標的ヒト細胞の約３０倍であった。
ＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＵＶＥＣ細胞（Ｌｏｗ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のＰＥＲＶコピー数はＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）と同様にＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）の比率が高い方が高値であり、１：１で１．３９ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌ、２：１で１６．９３ ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌであった。
接触下でＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞からはＰＥＲＶ遺伝子は検出されなかったため、ＰＥＲＶコピー数測定の検出限界である２１．９８ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎとＲＮＡ抽出に供試した細胞数から算出した値である０．０２ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌ以下とした。
ＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）との比率を９：１から１：９の範囲で共培養した標的ヒト細胞のＰＥＲＶコピー数はそれぞれ、９：１が５．０７、７：３が９．０４、５：５が４．０１、３：７が１．０２、１：９が０．３０ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌであった。接触下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを７：３で共培養した標的ヒト細胞のＰＥＲＶ遺伝子発現量は、１：９で共培養した標的ヒト細胞の約３０倍であった。
ＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＵＶＥＣ細胞（Ｌｏｗ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のＰＥＲＶコピー数はＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）と同様にＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）の比率が高い方が高値であり、１：１で１．３９ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌ、２：１で１６．９３ ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌであった。
接触下でＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞からはＰＥＲＶ遺伝子は検出されなかったため、ＰＥＲＶコピー数測定の検出限界である２１．９８ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎとＲＮＡ抽出に供試した細胞数から算出した値である０．０２ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌ以下とした。
【0075】
細胞同士の接触期間とＰＥＲＶ感染性への影響をみると、２週または３週間共培養した標的ヒト細胞のＰＥＲＶ遺伝子発現量は１日～１週間共培養した標的ヒト細胞の発現量よりも２～１０倍高かったが、その一方、２日または３日間共培養した標的ヒト細胞の発現量は１日共培養した標的ヒト細胞の発現量の約１／３以下であった。
一方、１日の共培養でも標的ヒト細胞への感染が確認されたことから、ＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）からＨＥＫ２９３細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）へのＰＥＲＶ感染は２４時間以内に起こり得るという重要な事実が明らかになった。
一方、１日の共培養でも標的ヒト細胞への感染が確認されたことから、ＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）からＨＥＫ２９３細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）へのＰＥＲＶ感染は２４時間以内に起こり得るという重要な事実が明らかになった。
【0076】
上記表５から明らかなように、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞と標的ヒト細胞の接触比率とＰＥＲＶの感染性の相関については、比較的明確といえる。
ＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）の比率が高い方が、感染した標的ヒト細胞が発現するＰＥＲＶのコピー数が高く、９：１では５．０７ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌ、７：３では９．０４ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌｓであるのに対し、１：９では０．３０ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌと約１／１０以下であった。
したがって、ヒト細胞が接触するＰＥＲＶ産生ブタ細胞の割合が高ければ高いほど、標的ヒト細胞が感染するリスクや感染するＰＥＲＶコピー数が高くなると考えられる。
ＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）の比率が高い方が、感染した標的ヒト細胞が発現するＰＥＲＶのコピー数が高く、９：１では５．０７ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌ、７：３では９．０４ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌｓであるのに対し、１：９では０．３０ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌと約１／１０以下であった。
したがって、ヒト細胞が接触するＰＥＲＶ産生ブタ細胞の割合が高ければ高いほど、標的ヒト細胞が感染するリスクや感染するＰＥＲＶコピー数が高くなると考えられる。
【0077】
また、実施例の接触下で共培養した標的ヒト細胞のｐｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果を図９～１２に示す。
図９は、実施例の接触下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のｐｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果（接触期間検討）を示す図である。
図１０は、実施例の接触下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のｐｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果（接触比率検討）を示す図である。
図９、１０、表５に示した結果から明らかなように、実施例の接触下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した全ての標的ヒト細胞からは、接触期間及び接触比率を問わず、ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲ及びｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ（商標）どちらでもｐｏｌ、ｇａｇ、ｅｎｖＢ遺伝子が検出された（ただし、ｇａｇ、ｅｎｖＢ遺伝子については図示せず）。
図９は、実施例の接触下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のｐｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果（接触期間検討）を示す図である。
図１０は、実施例の接触下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のｐｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果（接触比率検討）を示す図である。
図９、１０、表５に示した結果から明らかなように、実施例の接触下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した全ての標的ヒト細胞からは、接触期間及び接触比率を問わず、ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲ及びｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ（商標）どちらでもｐｏｌ、ｇａｇ、ｅｎｖＢ遺伝子が検出された（ただし、ｇａｇ、ｅｎｖＢ遺伝子については図示せず）。
【0078】
図１１は、実施例の接触下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＵＶＥＣ細胞（Ｌｏｗ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のｐｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果を示す図である。
図１２は、実施例の接触下でＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のｐｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果を示す図である。
図１１、表５に示した結果から明らかなように、実施例の接触下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＵＶＥＣ細胞（Ｌｏｗ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した全ての標的ヒト細胞からも、同様にｐｏｌ、ｇａｇ、ｅｎｖＢ遺伝子が検出された（ただし、ｇａｇ、ｅｎｖＢ遺伝子については図示せず）。
一方、接触下でＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した全ての標的ヒト細胞からは、ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲ、ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ（商標）を問わず、４種全てのＰＥＲＶ遺伝子が検出されなかった（図１２、表５）。
図１２は、実施例の接触下でＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のｐｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果を示す図である。
図１１、表５に示した結果から明らかなように、実施例の接触下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＵＶＥＣ細胞（Ｌｏｗ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した全ての標的ヒト細胞からも、同様にｐｏｌ、ｇａｇ、ｅｎｖＢ遺伝子が検出された（ただし、ｇａｇ、ｅｎｖＢ遺伝子については図示せず）。
一方、接触下でＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した全ての標的ヒト細胞からは、ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲ、ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ（商標）を問わず、４種全てのＰＥＲＶ遺伝子が検出されなかった（図１２、表５）。
【0079】
以上をまとめると、実施例の共培養系にて接触下でのＰＥＲＶの感染性検査において、ＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）と共培養したＨＥＫ２９３細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）からは、接触期間及び接触比率を問わず、検討した全ての条件でｐｏｌ、ｇａｇ、ｅｎｖＢ遺伝子が検出された。
このことから、ブタ細胞試料をヒト細胞とを接触させる本発明の検査方法によれば、ウイルス感染性を精度よく検査することができるといえる。
このことから、ブタ細胞試料をヒト細胞とを接触させる本発明の検査方法によれば、ウイルス感染性を精度よく検査することができるといえる。
【0080】
また、ＰＥＲＶ感染を阻害するＡＰＯＢＥＣ３Ｇタンパクを発現するＨＵＶＥＣ細胞（Ｌｏｗ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）を用いて、ＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）との共培養を行い、標的ヒト細胞のＰＥＲＶ感受性とＰＥＲＶ感染性との相関を確認した。
表５から明らかなように、単離したＨＵＶＥＣ細胞からｐｏｌ、ｇａｇ、ｅｎｖＢ遺伝子が検出され、ＰＥＲＶへの感染が示された。
Ｘ線を照射したＰＫ１５細胞とＨＵＶＥＣ細胞及びヒトＰＢＭＣを接触下で共培養した際、ＰＥＲＶが感染したことが報告されており、これは本実施例の上記結果と合致する。
このことから、少なくともＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）からのＰＥＲＶ感染は標的ヒト細胞のＰＥＲＶ感受性を問わず起こり得ることが確認された。
また、上記表５から明らかなように、ＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＵＶＥＣ細胞（Ｌｏｗ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）を１：１、２：１で共培養した際の標的ヒト細胞のＰＥＲＶ遺伝子の発現量はそれぞれ１．３９、１６．９３ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌとして検出された。
一方、ＨＵＶＥＣ細胞（Ｌｏｗ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）よりも、がん細胞であるＨＥＫ２９３細胞の方が、共培養開始時における上記ブタ細胞と、上記ヒト細胞との比率（例えば、細胞数の比率）の自由度が高く、上記比率の広い範囲で制御し易いといえる。
また、がん細胞であるＨＥＫ２９３細胞の方が、共培養時間を短縮し得るといえる。
表５から明らかなように、単離したＨＵＶＥＣ細胞からｐｏｌ、ｇａｇ、ｅｎｖＢ遺伝子が検出され、ＰＥＲＶへの感染が示された。
Ｘ線を照射したＰＫ１５細胞とＨＵＶＥＣ細胞及びヒトＰＢＭＣを接触下で共培養した際、ＰＥＲＶが感染したことが報告されており、これは本実施例の上記結果と合致する。
このことから、少なくともＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）からのＰＥＲＶ感染は標的ヒト細胞のＰＥＲＶ感受性を問わず起こり得ることが確認された。
また、上記表５から明らかなように、ＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＵＶＥＣ細胞（Ｌｏｗ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）を１：１、２：１で共培養した際の標的ヒト細胞のＰＥＲＶ遺伝子の発現量はそれぞれ１．３９、１６．９３ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌとして検出された。
一方、ＨＵＶＥＣ細胞（Ｌｏｗ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）よりも、がん細胞であるＨＥＫ２９３細胞の方が、共培養開始時における上記ブタ細胞と、上記ヒト細胞との比率（例えば、細胞数の比率）の自由度が高く、上記比率の広い範囲で制御し易いといえる。
また、がん細胞であるＨＥＫ２９３細胞の方が、共培養時間を短縮し得るといえる。
【0081】
また、ＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ２９３細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）の共培養を行った結果、ＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）から標的ヒト細胞へのＰＥＲＶ感染は確認されなかった。これにより、ＰＥＲＶ感染性に、より重要なのはＰＥＲＶ産生ブタ細胞側の発現量であることが確認された。
【0082】
（２．３．３．比較例：多孔質膜隔離下における共培養）
比較例の多孔質膜隔離下で共培養した標的ヒト細胞のＰＥＲＶ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲの結果、及び、多孔質膜隔離下で共培養した標的ヒト細胞のＰＥＲＶ遺伝子発現量（ＰＥＲＶのコピー数）の測定結果を下記表６に示す。
比較例の多孔質膜隔離下で共培養した標的ヒト細胞のＰＥＲＶ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲの結果、及び、多孔質膜隔離下で共培養した標的ヒト細胞のＰＥＲＶ遺伝子発現量（ＰＥＲＶのコピー数）の測定結果を下記表６に示す。
【表6】
【0083】
上記表６から明らかなように、比較例の多孔質膜隔離下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）を１～４日間共培養した標的ヒト細胞のＰＥＲＶコピー数は０．０２～０．１０ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌであり、１～３週間共培養した標的ヒト細胞のコピー数は０．０３～０．６３ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌであった。
比較例の多孔質膜隔離下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のＰＥＲＶ遺伝子発現量は、これらの細胞を接触下で共培養した標的ヒト細胞の約１／２００～１／１０００の発現量であり、接触下で共培養する実施例の検査系よりも検査感度に劣るといえる。
ＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＵＶＥＣ細胞（Ｌｏｗ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）を共培養した標的ヒト細胞のＰＥＲＶコピー数は０．２１ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌであった。
比較例の多孔質膜隔離下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＵＶＥＣ細胞（Ｌｏｗ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のＰＥＲＶ遺伝子発現量は、これらの細胞を接触下で共培養した標的ヒト細胞の約１／７の発現量であり、接触下で共培養する実施例の検査系よりも検査感度に劣るといえる。
比較例の多孔質膜隔離下でＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞からはＰＥＲＶ遺伝子は検出されなかったが、ＰＥＲＶコピー数測定の検出限界とＲＮＡ抽出に供試した細胞数から算出した値である０．０３ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌ以下とした。
比較例の多孔質膜隔離下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のＰＥＲＶ遺伝子発現量は、これらの細胞を接触下で共培養した標的ヒト細胞の約１／２００～１／１０００の発現量であり、接触下で共培養する実施例の検査系よりも検査感度に劣るといえる。
ＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＵＶＥＣ細胞（Ｌｏｗ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）を共培養した標的ヒト細胞のＰＥＲＶコピー数は０．２１ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌであった。
比較例の多孔質膜隔離下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＵＶＥＣ細胞（Ｌｏｗ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のＰＥＲＶ遺伝子発現量は、これらの細胞を接触下で共培養した標的ヒト細胞の約１／７の発現量であり、接触下で共培養する実施例の検査系よりも検査感度に劣るといえる。
比較例の多孔質膜隔離下でＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞からはＰＥＲＶ遺伝子は検出されなかったが、ＰＥＲＶコピー数測定の検出限界とＲＮＡ抽出に供試した細胞数から算出した値である０．０３ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌ以下とした。
【0084】
また、比較例の多孔質膜隔離下で共培養した標的ヒト細胞のｐｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果を図１３～１５に示す。
図１３は、比較例の多孔質膜隔離下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のｐｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果を示す図である。
図１３から明らかなように、多孔質膜隔離下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養したいくつかの標的ヒト細胞から、ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲによりｐｏｌ遺伝子が検出された。
検出された標的ヒト細胞は、インサート上部にＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）を、下部にＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）を播種した１週間の共培養の２連で実施したうちの１つの標的ヒト細胞、インサート上部にＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）を、下部にＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）を播種した１週間の共培養の２連で実施した両方の標的ヒト細胞及び３週間の共培養の２連で実施したうちの１つの標的ヒト細胞である（図１３）。ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲでは、上記以外の標的ヒト細胞からはＰＥＲＶの遺伝子は検出されなかったことから（図１３）、偽陰性が生じ得るといえる。
図１３は、比較例の多孔質膜隔離下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のｐｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果を示す図である。
図１３から明らかなように、多孔質膜隔離下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養したいくつかの標的ヒト細胞から、ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲによりｐｏｌ遺伝子が検出された。
検出された標的ヒト細胞は、インサート上部にＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）を、下部にＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）を播種した１週間の共培養の２連で実施したうちの１つの標的ヒト細胞、インサート上部にＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）を、下部にＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）を播種した１週間の共培養の２連で実施した両方の標的ヒト細胞及び３週間の共培養の２連で実施したうちの１つの標的ヒト細胞である（図１３）。ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲでは、上記以外の標的ヒト細胞からはＰＥＲＶの遺伝子は検出されなかったことから（図１３）、偽陰性が生じ得るといえる。
【0085】
一方、ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲでは、インサート上部にＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）を、下部にＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）を播種した２日間、３週間の共培養、及びインサート上部にＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）を、下部にＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）を播種した２、３週間の共培養の２連で実施したうちの１つの標的ヒト細胞のｏｌｉｇｏ ｄＴ ｐｒｉｍｅｒを用いて合成したｃＤＮＡからのみ、４種全てのＰＥＲＶの遺伝子が検出されず、偽陰性が生じ得るといえる。
これらを除く全ての標的ヒト細胞からはＰＥＲＶのいずれかの遺伝子が検出された（表６）。
これらを除く全ての標的ヒト細胞からはＰＥＲＶのいずれかの遺伝子が検出された（表６）。
【0086】
図１４は、比較例の多孔質膜隔離下でＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＵＶＥＣ細胞（Ｌｏｗ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のｐｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果を示す図である。
図１４から明らかなように、比較例の多孔質膜隔離下におけるＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＵＶＥＣ細胞（Ｌｏｗ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）との共培養では、ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲにより、２連で実施したうちの１つの標的ヒト細胞のｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒを用いて合成したｃＤＮＡから、ｐｏｌ遺伝子が検出された。
上記表６から明らかなように、ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲではｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲでｐｏｌ遺伝子が検出されたｃＤＮＡから４種全てのＰＥＲＶ遺伝子が検出され、同じ標的ヒト細胞のｏｌｉｇｏ ｄＴ ｐｒｉｍｅｒを用いて合成したｃＤＮＡからもｐｏｌ、ｇａｇ、ｅｎｖＢ遺伝子が検出された。
一方、ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲではその他のＰＥＲＶ遺伝子は検出されず（図１４）、偽陰性が生じ得るといえる。
図１４から明らかなように、比較例の多孔質膜隔離下におけるＰＫ１５細胞（Ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ細胞）とＨＵＶＥＣ細胞（Ｌｏｗ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）との共培養では、ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲにより、２連で実施したうちの１つの標的ヒト細胞のｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒを用いて合成したｃＤＮＡから、ｐｏｌ遺伝子が検出された。
上記表６から明らかなように、ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲではｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲでｐｏｌ遺伝子が検出されたｃＤＮＡから４種全てのＰＥＲＶ遺伝子が検出され、同じ標的ヒト細胞のｏｌｉｇｏ ｄＴ ｐｒｉｍｅｒを用いて合成したｃＤＮＡからもｐｏｌ、ｇａｇ、ｅｎｖＢ遺伝子が検出された。
一方、ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲではその他のＰＥＲＶ遺伝子は検出されず（図１４）、偽陰性が生じ得るといえる。
【0087】
図１５は、比較例の多孔質膜隔離下でＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）とを共培養した標的ヒト細胞のｐｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果を示す図である。
図１５及び表６から明らかなように、比較例の多孔質膜隔離下でＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）を共培養した全ての標的ヒト細胞からは、ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲ、ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを問わず、４種全てのＰＥＲＶ遺伝子が検出されなかった。
図１５及び表６から明らかなように、比較例の多孔質膜隔離下でＰＢＭＣ（Ｌｏｗ ｃｏｐｙ細胞）とＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞（Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ細胞）を共培養した全ての標的ヒト細胞からは、ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲ、ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを問わず、４種全てのＰＥＲＶ遺伝子が検出されなかった。
【0088】
比較例の多孔質膜を使用してＰＥＲＶ産生ブタ細胞と標的ヒト細胞を隔離した共培養検査系では、標的ヒト細胞にＰＥＲＶ感染が成立した場合でも、同じ条件の実施例の接触下の共培養時よりも発現量が１／１０以下であったことから、上述のように、偽陰性が生じるリスクがあり、比較例の多孔質膜を使用した検査系はウイルス検査の正確性に劣るといえる。
上記した通り、移植臓器はヒト細胞と接触し得る。そのため、細胞同士が接触しない多孔質膜を使った従来の比較例の共培養系では、移植時のＰＥＲＶの感染性を正確に評価できない可能性が高い。
上記した通り、移植臓器はヒト細胞と接触し得る。そのため、細胞同士が接触しない多孔質膜を使った従来の比較例の共培養系では、移植時のＰＥＲＶの感染性を正確に評価できない可能性が高い。
【0089】
（２．３．４．ＰＥＲＶ陽性ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞とＨＥＫ２９３細胞の共培養）
ＰＥＲＶ陽性ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞と共培養したＨＥＫ２９３細胞のＰＥＲＶ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ（商標）の結果、及び、ＰＥＲＶ遺伝子発現量（ＰＥＲＶのコピー数）測定結果を下記表７に示す。
ＰＥＲＶ陽性ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞と共培養したＨＥＫ２９３細胞のＰＥＲＶ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ（商標）の結果、及び、ＰＥＲＶ遺伝子発現量（ＰＥＲＶのコピー数）測定結果を下記表７に示す。
【表7】
【0090】
上記表７から明らかなように、ＰＥＲＶ陽性ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞とＨＥＫ２９３細胞を１：１で共培養した標的ヒト細胞のＰＥＲＶコピー数は０．０４ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌであり、ＰＥＲＶ陽性ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞とＨＥＫ２９３細胞を２：１で共培養した標的ヒト細胞のコピー数は０．０３ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌであった。
ＰＥＲＶ陽性ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞のコピー数は６３．６７ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌであったため、この細胞と共培養した標的ヒト細胞のＰＥＲＶ遺伝子発現量は、ＰＥＲＶ陽性ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞の約１／２０００の発現量であった。
ＰＥＲＶ陽性ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞のコピー数は６３．６７ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌであったため、この細胞と共培養した標的ヒト細胞のＰＥＲＶ遺伝子発現量は、ＰＥＲＶ陽性ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞の約１／２０００の発現量であった。
【0091】
また、ＰＥＲＶ陽性ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞とＨＥＫ２９３細胞を共培養した標的ヒト細胞のＰＥＲＶ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲの結果を図１６に示す。
図１６中、Ｒはｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒにより合成したｃＤＮＡ、Ｏはｏｌｉｇｏ ｄＴ ｐｒｉｍｅｒにより合成したｃＤＮＡを使ったＰＣＲ結果を指す。陽性対照（ＰＣ）はＰＫ１５細胞、陰性対照（ＮＣ）はＨＥＫ２９３細胞から抽出したＲＮＡを用いたＰＣＲ結果である。
この標的ヒト細胞からは、ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲ、ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ（商標）を問わず、ｐｏｌ、ｇａｇ、ｅｎｖＢ遺伝子が検出された（図１６）。
図１６中、Ｒはｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒにより合成したｃＤＮＡ、Ｏはｏｌｉｇｏ ｄＴ ｐｒｉｍｅｒにより合成したｃＤＮＡを使ったＰＣＲ結果を指す。陽性対照（ＰＣ）はＰＫ１５細胞、陰性対照（ＮＣ）はＨＥＫ２９３細胞から抽出したＲＮＡを用いたＰＣＲ結果である。
この標的ヒト細胞からは、ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲ、ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ（商標）を問わず、ｐｏｌ、ｇａｇ、ｅｎｖＢ遺伝子が検出された（図１６）。
【0092】
以上のように、ＰＥＲＶが感染したヒト細胞から未感染のヒト細胞へのＰＥＲＶ感染について、ＰＥＲＶ陽性ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞とＨＥＫ２９３細胞の接触下でＰＥＲＶの感染が起こり得ることが確認された。
しかしながら、ＰＫ１５細胞からＰＥＲＶが感染したＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞のＰＥＲＶ発現量が６３．６７ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌであったのに対し、ＰＥＲＶ陽性ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞からＨＥＫ２９３細胞に感染したＰＥＲＶ発現量は０．０３ ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌｓと約１／２，０００に減弱した。
なお、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞にＸ線を照射する共培養系においても本実施例と同様に、ＰＥＲＶ陽性ＨＥＫ２９３細胞からＨＥＫ２９３細胞へＰＥＲＶが感染し、感染を経るごとにＰＥＲＶの逆転写酵素活性や遺伝子発現量、すなわちＰＥＲＶの感染性が低下していくことが報告されている（Ｇａｒｋａｖｅｎｋｏ，Ｏ．，Ｗｙｎｙａｒｄ，Ｓ．，Ｎａｔｈｕ，Ｄ．，Ｓｉｍｏｎｄ，Ｄ．，Ｍｕｚｉｎａ，Ｍ．，Ｍｕｚｉｎａ，Ｚ．，．．．＆Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｂ．Ｒ．（２００８）．Ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ（ＰＥＲＶ） ａｎｄ ｉｔｓ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ：ａ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ ｈｅｒｄ．Ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１７（１２），１３８１－１３８８．；及びＰａｔｉｅｎｃｅ，Ｃ．，Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｙ．，＆ Ｗｅｉｓｓ，Ｒ．Ａ．（１９９７）．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｏｆ ｐｉｇｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３（３），２８２－２８６．）。
しかしながら、ＰＫ１５細胞からＰＥＲＶが感染したＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞のＰＥＲＶ発現量が６３．６７ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌであったのに対し、ＰＥＲＶ陽性ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＧＦＰ）細胞からＨＥＫ２９３細胞に感染したＰＥＲＶ発現量は０．０３ ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌｓと約１／２，０００に減弱した。
なお、ＰＥＲＶ産生ブタ細胞にＸ線を照射する共培養系においても本実施例と同様に、ＰＥＲＶ陽性ＨＥＫ２９３細胞からＨＥＫ２９３細胞へＰＥＲＶが感染し、感染を経るごとにＰＥＲＶの逆転写酵素活性や遺伝子発現量、すなわちＰＥＲＶの感染性が低下していくことが報告されている（Ｇａｒｋａｖｅｎｋｏ，Ｏ．，Ｗｙｎｙａｒｄ，Ｓ．，Ｎａｔｈｕ，Ｄ．，Ｓｉｍｏｎｄ，Ｄ．，Ｍｕｚｉｎａ，Ｍ．，Ｍｕｚｉｎａ，Ｚ．，．．．＆Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｂ．Ｒ．（２００８）．Ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ（ＰＥＲＶ） ａｎｄ ｉｔｓ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ：ａ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ ｈｅｒｄ．Ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１７（１２），１３８１－１３８８．；及びＰａｔｉｅｎｃｅ，Ｃ．，Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｙ．，＆ Ｗｅｉｓｓ，Ｒ．Ａ．（１９９７）．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｏｆ ｐｉｇｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３（３），２８２－２８６．）。
【0093】
＜２．４．まとめ＞
以上の実施例と比較例との比較結果から、ウイルス感染性検査について以下のことが言える。
（１）本発明のウイルス検査方法によれば、ブタ細胞とヒト細胞とが接触することにより、ヒト細胞へのウイルス感染性を検査することができる。
（２）本発明のウイルス検査方法によれば、ＰＫ１５細胞のようなウイルス遺伝子の発現量が高いブタ細胞からヒト細胞へのウイルス感染性を共培養２４時間以内に検査することができる。
（３）本発明のウイルス検査方法では、ヒト細胞に接触するウイルス産生ブタ細胞の割合が多ければ多いほど、ヒト細胞へのウイルス感染性の感度が向上し得る。
（４）ブタ細胞から放出される感染性を有するウイルス数が多ければ多いほど、ヒト細胞へのウイルス感染性が向上し、本発明のウイルス検査方法の検査感度が向上し得る。
（５）ウイルス感染はヒト細胞からヒト細胞へと起こり得るが、感染を経るごとにウイルス感染性は減弱する。
以上の実施例と比較例との比較結果から、ウイルス感染性検査について以下のことが言える。
（１）本発明のウイルス検査方法によれば、ブタ細胞とヒト細胞とが接触することにより、ヒト細胞へのウイルス感染性を検査することができる。
（２）本発明のウイルス検査方法によれば、ＰＫ１５細胞のようなウイルス遺伝子の発現量が高いブタ細胞からヒト細胞へのウイルス感染性を共培養２４時間以内に検査することができる。
（３）本発明のウイルス検査方法では、ヒト細胞に接触するウイルス産生ブタ細胞の割合が多ければ多いほど、ヒト細胞へのウイルス感染性の感度が向上し得る。
（４）ブタ細胞から放出される感染性を有するウイルス数が多ければ多いほど、ヒト細胞へのウイルス感染性が向上し、本発明のウイルス検査方法の検査感度が向上し得る。
（５）ウイルス感染はヒト細胞からヒト細胞へと起こり得るが、感染を経るごとにウイルス感染性は減弱する。
【0094】
上記（１）から、多孔質膜によりブタ細胞とヒト細胞を隔離する従来の検査系は、ＰＥＲＶ感染性の評価に不適切であると言える。
したがって、評価対象であるブタ細胞にＸ線照射を含む処理を行わず、移植時の生体内と同様にブタ細胞とヒト細胞を接触させた状態で共培養することを可能とする新規ｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養系は、ウイルス感染性の評価において最良の方法の一つとして提案できる。
したがって、評価対象であるブタ細胞にＸ線照射を含む処理を行わず、移植時の生体内と同様にブタ細胞とヒト細胞を接触させた状態で共培養することを可能とする新規ｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養系は、ウイルス感染性の評価において最良の方法の一つとして提案できる。
【0095】
上記（４）から、異種移植のドナー候補であるブタ細胞に対するウイルス感染性の評価において、ブタ細胞に与える影響を明確に把握できないＸ線照射は実施しないことが好ましい。
例えば、実際に移植に使われる膵島細胞や腎臓の細胞に対する適切なＸ線照射量や時間は不明であり、Ｘ線照射がＰＥＲＶ発現に影響を与える可能性が高い。
例えば、実際に移植に使われる膵島細胞や腎臓の細胞に対する適切なＸ線照射量や時間は不明であり、Ｘ線照射がＰＥＲＶ発現に影響を与える可能性が高い。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】