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特開2024-129413Ｔ細胞受容体遺伝子再構成断片（ＴＲＥＣ）、Ｉｇκ鎖遺伝子再構成断片（ＫＲＥＣ）およびＳＭＮ１遺伝子の量を定量ＰＣＲにより同時に測定する方法およびそのための新規プライマー
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024129413
(43)【公開日】2024-09-27
(54)【発明の名称】Ｔ細胞受容体遺伝子再構成断片（ＴＲＥＣ）、Ｉｇκ鎖遺伝子再構成断片（ＫＲＥＣ）およびＳＭＮ１遺伝子の量を定量ＰＣＲにより同時に測定する方法およびそのための新規プライマー
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/686 20180101AFI20240919BHJP
C12Q 1/6881 20180101ALI20240919BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/686 Z ZNA
C12Q1/6881 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023038609
(22)【出願日】2023-03-13
(71)【出願人】
【識別番号】318010328
【氏名又は名称】ＫＭバイオロジクス株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】504159235
【氏名又は名称】国立大学法人 熊本大学
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100221545
【弁理士】
【氏名又は名称】白江 雄介
(72)【発明者】
【氏名】伊藤 和美
(72)【発明者】
【氏名】吉田 真一郎
(72)【発明者】
【氏名】山本 千尋
(72)【発明者】
【氏名】中村 公俊
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR56
4B063QR62
(57)【要約】
【課題】ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１の量を同時に測定するための方法、それを使用した検査方法、およびそのキットを提供する。
【解決手段】Ｔ細胞受容体遺伝子再構成断片（ＴＲＥＣ）、Ｉｇκ鎖遺伝子再構成断片（ＫＲＥＣ）およびＳＭＮ１遺伝子の量を定量ＰＣＲにより同時に測定する方法であって、以下：
（ｉ）対象から採取されたＤＮＡとＰＣＲ試薬を混合する工程であって、ここで前記ＰＣＲ試薬がプライマーのセット、およびプローブのセットを含む、工程；
（ｉｉ）定量ＰＣＲ反応を行い、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１遺伝子の量を定量する工程、
を含み、
ここで、前記プライマーのセットが、配列番号４、５、７、１０、３７、および３８で示される塩基配列を含む６つのプライマーを含み、かつ前記プローブのセットが、配列番号２２、２３、および２８で示される塩基配列を含む３つのプローブを含む、方法。
【選択図】なし
【解決手段】Ｔ細胞受容体遺伝子再構成断片（ＴＲＥＣ）、Ｉｇκ鎖遺伝子再構成断片（ＫＲＥＣ）およびＳＭＮ１遺伝子の量を定量ＰＣＲにより同時に測定する方法であって、以下：
（ｉ）対象から採取されたＤＮＡとＰＣＲ試薬を混合する工程であって、ここで前記ＰＣＲ試薬がプライマーのセット、およびプローブのセットを含む、工程；
（ｉｉ）定量ＰＣＲ反応を行い、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１遺伝子の量を定量する工程、
を含み、
ここで、前記プライマーのセットが、配列番号４、５、７、１０、３７、および３８で示される塩基配列を含む６つのプライマーを含み、かつ前記プローブのセットが、配列番号２２、２３、および２８で示される塩基配列を含む３つのプローブを含む、方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｔ細胞受容体遺伝子再構成断片（ＴＲＥＣ）、Ｉｇκ鎖遺伝子再構成断片（ＫＲＥＣ）およびＳＭＮ１遺伝子の量を定量ＰＣＲにより同時に測定する方法であって、以下：
（ｉ）対象から採取されたＤＮＡとＰＣＲ試薬を混合する工程であって、ここで前記ＰＣＲ試薬がプライマーのセット、およびプローブのセットを含む、工程；
（ｉｉ）定量ＰＣＲ反応を行い、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１遺伝子の量を定量する工程、
を含み、
ここで、前記プライマーのセットが、配列番号４、５、７、１０、３７、および３８で示される塩基配列を含む６つのプライマーを含み、かつ前記プローブのセットが、配列番号２２、２３、および２８で示される塩基配列を含む３つのプローブを含む、
方法。
（ｉ）対象から採取されたＤＮＡとＰＣＲ試薬を混合する工程であって、ここで前記ＰＣＲ試薬がプライマーのセット、およびプローブのセットを含む、工程；
（ｉｉ）定量ＰＣＲ反応を行い、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１遺伝子の量を定量する工程、
を含み、
ここで、前記プライマーのセットが、配列番号４、５、７、１０、３７、および３８で示される塩基配列を含む６つのプライマーを含み、かつ前記プローブのセットが、配列番号２２、２３、および２８で示される塩基配列を含む３つのプローブを含む、
方法。
【請求項2】
前記３つのプローブが蛍光物質およびクエンチャーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
対象から採取されたＤＮＡが、乾燥血液ろ紙に由来する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
プライマーのセットの６つのプライマーおよびプローブのセットの３つのプローブから選択される少なくとも１つの核酸が核酸修飾をさらに含む、請求項１－３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
請求項１－４のいずれか一項で規定される方法で測定されたＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１遺伝子の量に基づき、正常検体と比較した場合に、以下のリスクを評価する検査方法であって：
ＴＲＥＣが低い場合にＴ細胞減少症のリスクがあると評価し；
ＫＲＥＣが低い場合にＢ細胞減少症のリスクがあると評価し；
ＴＲＥＣが低い場合に重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）のリスクがあると評価し；または
ＳＭＮ１が低い場合に脊髄性筋委縮症（ＳＭＡ）のリスクがあると評価する、
検査方法。
ＴＲＥＣが低い場合にＴ細胞減少症のリスクがあると評価し；
ＫＲＥＣが低い場合にＢ細胞減少症のリスクがあると評価し；
ＴＲＥＣが低い場合に重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）のリスクがあると評価し；または
ＳＭＮ１が低い場合に脊髄性筋委縮症（ＳＭＡ）のリスクがあると評価する、
検査方法。
【請求項6】
カットオフ値が、ＳＭＡについて２００．０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ未満、ＴＲＥＣについて２０．０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ未満、ＫＲＥＣについて１０．０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ未満である、請求項５に記載の検査方法。
【請求項7】
配列番号４、５、７、１０、３７、および３８で示される塩基配列を含む６つのプライマーを含むプライマーのセット、および配列番号２２、２３、および２８で示される塩基配列を含む３つのプローブを含むプローブのセットを含む、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１の量を同時に測定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、一般にＴ細胞受容体遺伝子再構成断片（ＴＲＥＣ）、Ｉｇκ鎖遺伝子再構成断片（ＫＲＥＣ）およびＳＭＮ１遺伝子の量を定量ＰＣＲにより同時に測定する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
新生児スクリーニングは、新生児に対する先天性代謝異常等についての集団検診である。新生児スクリーニングの目的は、生まれつき特定の栄養素を利用できないとか、成長ホルモンなどが過不足の状態となり、その結果知的障害や身体の発育に障害を起こす遺伝性疾患等について、早期発見・早期治療により未然に心身障害を予防することである。具体的なスクリーニング方法では、まず産科医療機関で生後４～６日目の新生児のかかとから、ごく少量の血液をろ紙（ｄｒｉｅｄ ｂｌｏｏｄ ｓｐｏｔ；ＤＢＳ）に採り、スクリーニングセンターに郵送する。その後、スクリーニングセンターで乾燥血液ろ紙から抽出した試料から各種測定が行われる。
【0003】
日本では、１９７７年１０月より検査料の公費負担による国の事業として新生児マススクリーニングが開始されている。現在日本における新生児マススクリーニングの対象疾患は、糖代謝異常症であるガラクトース血症、内分泌疾患である先天性甲状腺機能低下症や先天性副腎過形成症、アミノ酸代謝異常疾患であるフェニールケトン尿症やメイプルシロップ尿症、有機酸代謝異常疾患であるメチルマロン酸血症やプロピオン酸血症、脂肪酸代謝異常疾患であるＶＬＣＡＤやＭＣＡＤなどの合計２０疾患となっている。一方で、新生児マススクリーニングの対象になっていない、５つの条件を満たす疾患について、オプションで選択できる有料検査として、拡大スクリーニング（オプショナルスクリーニングとも呼ばれる）検査がある。５つの条件は、（ａ）治療法がある、（ｂ）その病気であるかの可能性を調べる精度の高い検査方法がある、（ｃ）先天性代謝異常症の中でも比較的に患者数が多い、（ｄ）病気が発症する前にみつけると治療効果を高め症状を事前に予防したり、重い障害を防ぐことができる、（ｅ）特徴的な症状が少なく、通常の診療で見つけることが難しい、である。
拡大スクリーニングとしては、ライソゾーム病、重症複合免疫不全症（severe combined immunodeficiency：以下、「ＳＣＩＤ」という）および脊髄性筋委縮症（spinal muscular atrophy：以下、「ＳＭＡ」という）に関するものがある。
拡大スクリーニングとしては、ライソゾーム病、重症複合免疫不全症（severe combined immunodeficiency：以下、「ＳＣＩＤ」という）および脊髄性筋委縮症（spinal muscular atrophy：以下、「ＳＭＡ」という）に関するものがある。
【0004】
重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）は先天性免疫不全症の一つであり、液性および細胞性免疫の複合免疫不全症の最重症型と位置付けられる。通常生後数か月以内に日和見感染を含む様々な重症感染症を発症し、根本的治療である造血幹細胞移植を行わなければ生後１年以内に死亡する。発症頻度はおよそ５万出生あたり１人と推定されている。現在までにＳＣＩＤの病態の理解が進み、約２０の原因遺伝子が同定されている。ＳＣＩＤは造血幹細胞移植によって治癒しうるが、感染症を合併していると移植成績は不良となるため、いかに感染症罹患前に診断できるかが重要である（非特許文献１）。
【0005】
正常なＴ細胞が新たに造られる場合、通常Ｔ細胞では遺伝子の再構成が行われ、Ｔ細胞受容体遺伝子再構成断片（T-cell receptor excision circles：以下、「ＴＲＥＣｓ」という）と呼ばれる環状ＤＮＡが産生される。また、正常なＢ細胞でもこれが新たに造られる場合の産生マーカーとして、Ｉｇκ鎖遺伝子再構成断片（Kappa-deleting recombination excision circles：以下、「ＫＲＥＣｓ」という）、と呼ばれる環状ＤＮＡが産生される。このため、ＴＲＥＣｓおよびＫＲＥＣｓをＰＣＲ（polymerase chain reaction）法で測定すればごく少量の血液からも測定が可能である（非特許文献２）したがって、血液ろ紙検体に含まれるＴＲＥＣｓおよびＫＲＥＣｓの量をＴおよびＢ細胞の正常成熟の指標として評価することで、ＳＣＩＤをスクリーニングすることができる。すなわち、ＴＲＥＣｓの存在はＴ細胞、ＫＲＥＣｓの存在はＢ細胞の成熟を意味するため、ＴＲＥＣｓおよびＫＲＥＣｓの減少はＳＣＩＤをスクリーニングする指標となる。近年、欧米を中心にＴＲＥＣを検出する定量ＰＣＲ法を用いた新生児スクリーニングが行われるようになり、その有用性が示されてきている。一方、日本のＳＣＩＤ患者の予後改善のためにも、広く新生児マススクリーニングが行われることが望まれているものの、現在のところ、希望者のみの拡大スクリーニング検査となっている。
【0006】
脊髄性筋委縮症（ＳＭＡ）は、脊髄前角細胞の変性による運動ニューロン病であり筋緊張低下と進行性の筋力低下を示し、知的障害は呈さない。発症年齢と最高到達運動機能によりＩ型（生涯座位未獲得）、ＩＩ型（生涯立位未獲得）、ＩＩＩ型（歩行可能）、ＩＶ型（成人期発症）に分類される。小児期発症のＳＭＡでは９５％が５番染色体長腕５ｑ１３に存在するＳＭＮ１遺伝子変異による。臨床的なＳＭＡであっても、ＳＭＮ１遺伝子欠失を認めない症例、いわゆるｎｏｎ－５ｑ ＳＭＡが存在し、その頻度はＩＩＩ型、ＩＶ型で高くなる（非特許文献３）。我が国ではＩ型の重症例は、出生２万人に対して１人前後、乳児期～小児期に発症するＳＭＡの罹患率は１０万人に１～２人と言われている。近年、本国においてもＳＭＡに対する治療薬が承認され、早期診断、早期治療が重要視されてきている。新生児におけるＳＭＡのスクリーニング検査では、血液ろ紙検体に含まれるＳＭＮ１遺伝子を指標として評価することができる（非特許文献４：003-201804-kijyun.pdf (nanbyou.or.jp））。
【0007】
乾燥血液ろ紙ディスク（dried blood spot；ＤＢＳ）を用いた定量ＰＣＲによるＳＣＩＤの測定方法としては、特許文献１（特許６７６１０９３、積水）、特許文献２（ＷＯ２０２１－０４９６０１、積水）、特許文献３（特開２０２２－０５３９６１、ＫＭバイオロジクス出願特許）がある。また、定量ＰＣＲによるＳＭＡの測定方法としては、特許文献４（ＷＯ２０２１－０２０１６１、積水）がある。これらの測定は対象疾患１つを個別に定量ＰＣＲで測定する方法であり、積水メディカルでは受託検査として、ＳＣＩＤ（ＴＲＥＣ／ＫＲＥＣ）とＳＭＡを個別に測定している。
しかしながら、拡大スクリーニングでは、対象とする疾患を同時に測定できた方が、早期診断だけでなく、受診者の費用面からもメリットがある。このため、ＳＣＩＤとＳＭＡを同時測定する検査キットが販売されている。パーキンエルマー社のＮｅｏＭＤｘキット（非特許文献５：ＮｅｏＭＤｘキット－ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｊａｐａｎ）およびＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社のＴａｑＭａｎＴＭ ＳＣＩＤ／ＳＭＡ Ｐｌｕｓ Ａｓｓａｙ（非特許文献６：ＴａｑＭａｎＴＭ ＳＣＩＤ／ＳＭＡ Ｐｌｕｓ Ａｓｓａｙ （ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ））である。
しかしながら、拡大スクリーニングでは、対象とする疾患を同時に測定できた方が、早期診断だけでなく、受診者の費用面からもメリットがある。このため、ＳＣＩＤとＳＭＡを同時測定する検査キットが販売されている。パーキンエルマー社のＮｅｏＭＤｘキット（非特許文献５：ＮｅｏＭＤｘキット－ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｊａｐａｎ）およびＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社のＴａｑＭａｎＴＭ ＳＣＩＤ／ＳＭＡ Ｐｌｕｓ Ａｓｓａｙ（非特許文献６：ＴａｑＭａｎＴＭ ＳＣＩＤ／ＳＭＡ Ｐｌｕｓ Ａｓｓａｙ （ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ））である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】特許６７６１０９３
【特許文献2】ＷＯ２０２１－０４９６０１
【特許文献3】特開２０２２－０５３９６１
【特許文献4】ＷＯ２０２１－０２０１６１
【特許文献5】特表２００５－５１４００５
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】金兼弘和，今井耕輔，森尾友宏：重症複合免疫不全症～その発見から今後の展望～．日本臨床免疫学会会誌．４０，１４５－１５４（２０１７）
【非特許文献2】Ｃｈａｎ Ｋ．， Ｐｕｃｋ Ｊ．Ｍ．：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｓｅｖｅｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１５：３９１－３９８，２００５．
【非特許文献3】荒川玲子，日野香織、北村裕梨、斎藤加代子：神経筋疾患の遺伝学的検査．脳と発達．５０，１９２－１９６（２０１８）
【非特許文献4】難病情報センターウェブサイト：３ 脊髄性筋委縮症003-201804-kijyun.pdf(nanbyou.or.jp)
【非特許文献5】パーキンエルマー社：ＮｅｏＭＤｘキットＮｅｏＭＤｘキット－ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｊａｐａｎ
【非特許文献6】ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社：ＴａｑＭａｎ（ＴＭ） ＳＣＩＤ／ＳＭＡ Ｐｌｕｓ ＡｓｓａｙＴａｑＭａｎ（ＴＭ） ＳＣＩＤ／ＳＭＡ Ｐｌｕｓ Ａｓｓａｙ（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１遺伝子の量を同時に測定する方法が求められており、特異性・頑健性の点で特に優れた測定法を見出すことにある。
【課題を解決するための手段】
【0011】
ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１に対する新規プライマーおよびプローブを検討し、最適なものを見出した。
したがって、本開示は以下を含む：
［項１］
Ｔ細胞受容体遺伝子再構成断片（ＴＲＥＣ）、Ｉｇκ鎖遺伝子再構成断片（ＫＲＥＣ）およびＳＭＮ１遺伝子の量を定量ＰＣＲにより同時に測定する方法であって、以下：
（ｉ）対象から採取されたＤＮＡとＰＣＲ試薬を混合する工程であって、ここで前記ＰＣＲ試薬がプライマーのセット、およびプローブのセットを含む、工程；
（ｉｉ）定量ＰＣＲ反応を行い、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１遺伝子の量を定量する工程、
を含み、
ここで、前記プライマーのセットが、配列番号４、５、７、１０、３７、および３８で示される塩基配列を含む６つのプライマーを含み、かつ前記プローブのセットが、配列番号２２、２３、および２８で示される塩基配列を含む３つのプローブを含む、
方法、
［項２］
前記３つのプローブが蛍光物質およびクエンチャーを含む、項１に記載の方法、
［項３］
対象から採取されたＤＮＡが、乾燥血液ろ紙に由来する、項１または２に記載の方法、
［項４］
プライマーのセットの６つのプライマーおよびプローブのセットの３つのプローブから選択される少なくとも１つの核酸が核酸修飾をさらに含む、項１－３のいずれか一項に記載の方法、
［項５］
項１－４のいずれか一項で規定される方法で測定されたＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１遺伝子の量に基づき、正常検体と比較した場合に、以下のリスクを評価する検査方法であって：
ＴＲＥＣが低い場合にＴ細胞減少症のリスクがあると評価し；
ＫＲＥＣが低い場合にＢ細胞減少症のリスクがあると評価し；
ＴＲＥＣが低い場合に重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）のリスクがあると評価し；または
ＳＭＮ１が低い場合に脊髄性筋委縮症（ＳＭＡ）のリスクがあると評価する、
検査方法、
［項６］
カットオフ値が、ＳＭＡについて２００．０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ未満、ＴＲＥＣについて２０．０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ未満、ＫＲＥＣについて１０．０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ未満である、項５に記載の検査方法、
［項７］
配列番号４、５、７、１０、３７、および３８で示される塩基配列を含む６つのプライマーを含むプライマーのセット、および配列番号２２、２３、および２８で示される塩基配列を含む３つのプローブを含むプローブのセットを含む、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１の量を同時に測定するためのキット。
したがって、本開示は以下を含む：
［項１］
Ｔ細胞受容体遺伝子再構成断片（ＴＲＥＣ）、Ｉｇκ鎖遺伝子再構成断片（ＫＲＥＣ）およびＳＭＮ１遺伝子の量を定量ＰＣＲにより同時に測定する方法であって、以下：
（ｉ）対象から採取されたＤＮＡとＰＣＲ試薬を混合する工程であって、ここで前記ＰＣＲ試薬がプライマーのセット、およびプローブのセットを含む、工程；
（ｉｉ）定量ＰＣＲ反応を行い、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１遺伝子の量を定量する工程、
を含み、
ここで、前記プライマーのセットが、配列番号４、５、７、１０、３７、および３８で示される塩基配列を含む６つのプライマーを含み、かつ前記プローブのセットが、配列番号２２、２３、および２８で示される塩基配列を含む３つのプローブを含む、
方法、
［項２］
前記３つのプローブが蛍光物質およびクエンチャーを含む、項１に記載の方法、
［項３］
対象から採取されたＤＮＡが、乾燥血液ろ紙に由来する、項１または２に記載の方法、
［項４］
プライマーのセットの６つのプライマーおよびプローブのセットの３つのプローブから選択される少なくとも１つの核酸が核酸修飾をさらに含む、項１－３のいずれか一項に記載の方法、
［項５］
項１－４のいずれか一項で規定される方法で測定されたＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１遺伝子の量に基づき、正常検体と比較した場合に、以下のリスクを評価する検査方法であって：
ＴＲＥＣが低い場合にＴ細胞減少症のリスクがあると評価し；
ＫＲＥＣが低い場合にＢ細胞減少症のリスクがあると評価し；
ＴＲＥＣが低い場合に重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）のリスクがあると評価し；または
ＳＭＮ１が低い場合に脊髄性筋委縮症（ＳＭＡ）のリスクがあると評価する、
検査方法、
［項６］
カットオフ値が、ＳＭＡについて２００．０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ未満、ＴＲＥＣについて２０．０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ未満、ＫＲＥＣについて１０．０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ未満である、項５に記載の検査方法、
［項７］
配列番号４、５、７、１０、３７、および３８で示される塩基配列を含む６つのプライマーを含むプライマーのセット、および配列番号２２、２３、および２８で示される塩基配列を含む３つのプローブを含むプローブのセットを含む、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１の量を同時に測定するためのキット。
【発明の効果】
【0012】
本開示によれば、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１遺伝子の量を同時に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【発明を実施するための形態】
【0014】
第一の側面では、本開示は、Ｔ細胞受容体遺伝子再構成断片（ＴＲＥＣ）、Ｉｇκ鎖遺伝子再構成断片（ＫＲＥＣ）およびＳＭＮ１遺伝子の量を定量ＰＣＲにより同時に測定する方法に関する。
【0015】
本開示において、「同時」に測定するとは、２以上の対象について同じ反応系において測定することを指す。本開示において、「個別」に測定するとは、２以上の対象について別の反応系において測定することを指す。２以上の対象とは、ＰＣＲ反応においては、２つ以上の異なる標的配列を指す。例えば、１つのＰＣＲチューブ（すなわち、同じ反応系）において、試料とＰＣＲ試薬を反応させてＴＲＥＣとＳＭＮ１遺伝子の量を測定する場合、ＴＲＥＣとＳＭＮ１遺伝子は「同時」に測定される。例えば、「同時」に測定する場合、異なる２以上のプライマー対が同じ反応系において使用される。また、例えば、異なる２つのＰＣＲチューブ（すなわち、別の反応系）において、試料とＰＣＲ試薬をそれぞれ反応させてＴＲＥＣとＳＭＮ１遺伝子の量を測定する場合、ＴＲＥＣとＳＭＮ１遺伝子は「個別」に測定される。
【0016】
本開示において、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１遺伝子の量を同時に測定した結果、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１遺伝子のいずれか、または全てが検出されなくてもよい。例えば、検出されないまたは検出限界以下である場合、対応する核酸が試料に微量に存在することまたは存在しないことを示す。
【0017】
本開示に用いられる試料は核酸が含まれていれば特に限定されない。核酸は特に限定されないが、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、好ましくはＤＮＡである。一実施形態では、試料は、対象から採取された核酸を含む試料であり、好ましくは生体に由来する試料である。生体に由来する試料は、新生児に由来してもよいが、特に限定されない。生体に由来する試料には血液試料が含まれ、例えばかかとから採取される。例えば血液試料を含むろ紙を乾燥させた乾燥血液ろ紙が使用されてもよい。用いられる試料の量は、前記試料に含まれる核酸の量を検討して当業者が適宜設定できる。試料として乾燥血液ろ紙が用いられる場合、乾燥血液ろ紙から切り出されるパンチ片の大きさは、含まれる血液の量を検討して当業者が適宜設定できる。前記パンチ片の大きさは、例えば直径約０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、１．０ｍｍ、１．１ｍｍ、１．２ｍｍ、１．３ｍｍ、１．４ｍｍ、１．５ｍｍ、１．６ｍｍ、１．７ｍｍ、１．８ｍｍ、１．９ｍｍ、２．０ｍｍ、２．１ｍｍ、２．２ｍｍ、２．３ｍｍ、２．４ｍｍ、２．５ｍｍ、２．６ｍｍ、２．７ｍｍ、２．８ｍｍ、２．９ｍｍ、３．０ｍｍ、３．１ｍｍ、３．２ｍｍ、３．３ｍｍ、３．４ｍｍ、３．５ｍｍ、３．６ｍｍ、３．７ｍｍ、３．８ｍｍ、３．９ｍｍ、または４．０ｍｍである。例えば使用される前記パンチ片の枚数は、１、２、３、４、５、または６枚である。ろ紙の量（例えば枚数）を増やすことで得られる測定対象となるＤＮＡ量は増えるが、ＤＮＡ抽出効率の低下および反応系に持ち込まれる血液由来ＰＣＲ阻害物質量も増加するため、使用されるろ紙の量（例えば枚数）は少ないことが好ましい。
【0018】
本開示に用いられるＰＣＲ試薬は、本開示におけるＰＣＲ反応を行うため、または増幅産物の検出に必要な試薬を含む。前記ＰＣＲ試薬は、少なくともプライマーのセットおよびプローブのセットを含む。前記ＰＣＲ試薬はさらに、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（デオキシヌクレオシド三リン酸）を含んでもよい。また、典型的には前記ＰＣＲ試薬はバッファーを含む。前記ＰＣＲ試薬は当業者が公知のものを適宜選択して用いることができる。
【0019】
本開示において、プライマーまたはプローブについて配列番号に言及する場合は、当該プライマーまたはプローブがその配列番号で示される塩基配列を含むものとする。本開示のプライマーまたはプローブは、言及した配列に１、２、３の置換、欠失、挿入、および／または付加されていていもよい。
【0020】
本開示において、ＰＣＲ反応に用いるプライマーおよびプローブの塩基長は特に限定されず、例えば１３塩基長、１４塩基長、１５塩基長、１６塩基長、１７塩基長、１８塩基長、１９塩基長、２０塩基長、２１塩基長、２２塩基長、２３塩基長、２４塩基長、２５塩基長、２６塩基長、２７塩基長、２８塩基長、２９塩基長、３０塩基長、３１塩基長、３２塩基長、３３塩基長、３４塩基長、３５塩基長である。本開示において、ＰＣＲ反応に用いるプライマーおよびプローブは、公知の修飾を含んでもよく、例えばＬＮＡ（Locked nucleic acid）修飾、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、５－メチルシチジン（５－Ｍｅ－ｄＣ）を含む。ＬＮＡ修飾により、プライマーおよびプローブのそれぞれの標的との結合親和性が増加することが企図される。ＬＮＡ修飾された核酸は、当該核酸の表記の左側に「＋」を付して本明細書で示される。例えば、ＡＴＧＣからなる塩基配列で示される核酸の２番目のヌクレオチド「Ｔ」がＬＮＡ修飾されている場合、本明細書中では、Ａ＋ＴＧＣと示される。
【0021】
本開示において用いられるプライマーの塩基配列は、例えば配列番号４、５、７、１０、３７、および３８からなる群から選択される配列で示される塩基配列を含む。好ましくは、本開示において用いられるプライマーの塩基配列は、配列番号４、５、７、１０、３７、および３８からなる群から選択される配列で示される塩基配列からなる。本開示におけるプライマー対は、標的核酸を増幅させるためのプライマーの組み合わせをいい、例えば、３種のプライマー対が使用され、ＴＲＥＣについてのプライマー対は配列番号４、５の組み合わせ、ＫＲＥＣについてのプライマー対は配列番号７、１０の組み合わせ、およびＳＭＮ１についてのプライマー対は配列番号３７、３８の組み合わせに関する。
【0022】
本開示において用いられるプローブの塩基配列は、例えば配列番号２２、２３、および２８からなる群から選択される配列で示される塩基配列を含む。好ましくは、本開示において用いられるプローブの塩基配列は、配列番号２２、２３、および２８からなる群から選択される配列で示される塩基配列からなる。本開示におけるプローブのセットは、標的核酸を検出するためのプローブのセットをいい、例えば、３種のプローブが使用され、ＴＲＥＣについてのプローブは配列番号２２、ＫＲＥＣについてのプローブは配列番号２３およびＳＭＮ１についてのプローブは配列番号２８に関する。
【0023】
本開示において用いられるプローブは、蛍光物質およびクエンチャーを含んでもよい。当業者は適宜、蛍光物質およびクエンチャーを選択できる。蛍光物質には、Ｃｙ５、６ＦＡＭ、ＳＵＮ、Ｃｙ３、ＨＥＸ、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗが含まれ、好ましくはＣｙ５、６ＦＡＭ、ＳＵＮである。蛍光物質は好ましくはプローブの５’末端に標識される。クエンチャーには、３ＩＡｂＲＱＳｐ、３ＩＡＢｋＦＱが含まれる。クエンチャーは好ましくはプローブの３’末端に標識される。
【0024】
本開示において、特に明示されない限り、「ｑＰＣＲ」、「定量ＰＣＲ」、「リアルタイムＰＣＲ」は相互互換的に使用される。定量ＰＣＲ法は、一般的に、ＰＣＲにおける増幅産物の生成過程を一過的にまたは経時的にモニタリングする方法を意味する。本開示において、定量ＰＣＲにより検出する場合、例えばＰＣＲ反応の後に増幅された標的核酸（以下、単に増幅産物ともいう）が光学的手段により検出される。なお、増幅産物の検出は、例えば、ＰＣＲ反応終了後に行ってもよいし、ＰＣＲ反応工程と並行して行ってもよい。並行して行う場合、増幅産物の検出は、例えば、経時的に行うことができる。経時的な検出（モニタリング）は、例えば、連続的であっても非連続的（断続的）であってもよい。
【0025】
本開示の一実施形態では、マルチプレックスＰＣＲが行われる。ＰＣＲの条件は、増幅断片が得られる範囲において特に制限はされず、適宜設定することができる。ＰＣＲ反応における各ステップの温度変化は、例えば、サーマルサイクラー等を用いて自動的に制御できる。例えば、増幅サイクル数についても、用いる核酸増幅用酵素や増幅核酸長等に応じて、適宜設定することができる。例えば、増幅サイクル数としては、１０～１００サイクルが挙げられ、当該範囲の上限は９０、８０、７０、６０、５０若しくは４０であってもよく、当該範囲の下限は１５、２０、２５、３０、若しくは３５であってもよい。ＰＣＲ反応は、例えば、１ｃｙｃｌｅ／９５℃（１０分）、４５ｃｙｃｌｅ／９４℃（３０秒）、１ｃｙｃｌｅ／６０℃（１分）で行うことができる。ＰＣＲ反応により生成した増幅産物は、例えば、前記増幅産物から発生する蛍光強度を検出することにより検出できる。蛍光検出としては、特に制限されないが、従来公知のインターカレーター法、プローブ法、サイクリングプローブ法などがある。本開示において、好ましくは、プローブ法が使用され、より好ましくはＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法が使用される。蛍光強度の検出は、例えば、蛍光光度計で行うことができる。また、一般に、ＰＣＲ反応ユニット（例えば、サーマルサイクラー）と光学系ユニット（例えば、蛍光光度計）との両方を備える装置が使用される。
【0026】
本開示の標的核酸の定量方法は、試料中の標的核酸に対応する増幅産物を生成させ、前記増幅産物を光学的手段により検出して、前記増幅産物を定量する方法である。前記増幅産物が所定量となったＰＣＲサイクル数をカウントすることによって、前記試料中に含まれる標的核酸を定量する方法ことができる。また、標準品から算出されたＣｑ値の検量線から乾燥ろ紙血中の全血１μＬのコピー数を換算して定量することもできる。
【0027】
一実施形態では、試料は溶出法または抽出法で処理される。例えば、抽出法では、市販のキット、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ ＸＳ（ＴＡＫＡＲＡ Ｕ０９０１Ｂ：７４０９０．２５０）を用いることができ、溶出法では、市販のキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製 ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔ Ａｌｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔを用いることができる。
【0028】
本開示の第二の側面は、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１遺伝子の量に基づき、正常検体と比較した場合に、疾患のリスクを評価する検査方法に関する。本開示の方法により試料におけるＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１遺伝子の量を測定することにより、対象における疾患のリスクを評価してもよい。本開示の方法によれば、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１遺伝子の量を同時に測定することができるため、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの量を評価できるため、早期診断、費用、または工程などの観点から好ましい。前記疾患は、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１遺伝子の量に依存する疾患であれば特に限定されない。例えば、前記疾患は、Ｔ細胞減少症、Ｂ細胞減少症、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）および脊髄性筋委縮症（ＳＭＡ）が挙げられる。好ましくは、前記疾患は、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）または脊髄性筋委縮症（ＳＭＡ）である。
【0029】
本開示において、「リスクを評価する」とは、疾患を発症しているか、または疾患を発症する可能性があるかを、評価または判定することを指す。リスクを評価することにより、疾患の診断を補助してもよい。評価または判定には、カットオフ値または正常検体の値との比較に基づいて行われてもよい。本開示の方法により、同時マススクリーニングが可能となる。本開示の方法によりリスクが評価された対象は、再検査または精密医療機関でさらに検査が行われてもよい。
【0030】
一実施形態では、ＴＲＥＣが低い場合にＴ細胞減少症のリスクがあると評価し；ＫＲＥＣが低い場合にＢ細胞減少症のリスクがあると評価し；ＴＲＥＣが低い場合に重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）のリスクがあると評価し；またはＳＭＮ１が低い場合に脊髄性筋委縮症（ＳＭＡ）のリスクがあると評価する。量が低い場合には、標的とするＰＣＲ産物が検出されないことも含まれる。
【0031】
一実施形態では、ＳＭＡについて、カットオフ値は１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、４００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００ｃｏｐｉｅｓ／μＬ未満である。好ましくは、カットオフ値は２００．０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ未満である。
【0032】
一実施形態では、ＴＲＥＣについて、カットオフ値は５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ未満である。好ましくは、カットオフ値は２０．０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ未満である。
【0033】
一実施形態では、ＫＲＥＣについて、カットオフ値は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ未満である。好ましくは、カットオフ値は１０．０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ未満である。
【0034】
本開示の一実施形態では、例えば、検出の特異性が向上し、ＰＣＲ反応の頑健性が向上し、またはリテスト率が低減される。本開示の別の実施形態では、偽陽性率が低減する。
【0035】
本開示の第三の側面は、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１の量を同時に測定するためのキットに関する。本開示のキットは、配列番号４、５、７、１０、３７、および３８で示される塩基配列を含む６つのプライマーを含むプライマーのセット、および配列番号２２、２３、および２８で示される塩基配列を含む３つのプローブを含むプローブのセットを含む、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１の量を同時に測定するためのキットである。本開示のキットは、さらに、指示書を含んでもよい。前記キットは、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１の量を同時に測定できる範囲内において、その他のプライマーまたはプローブを含んでもよい。前記キットはまた、プローブ、その他のＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲに使用される試薬や容器を含むこともできる。
【0036】
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する。
【0037】
本明細書において「約」とは±１０％、好ましくは±５％の範囲を意味する。
【0038】
以下、本開示を実施例により具体的に説明するが、本開示はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例0039】
［実施例１］
試験方法等
（１）検体、試薬、機器等
本開示は定量ＰＣＲで対象遺伝子を検出する蛍光標識プローブ法、いわゆるタックマン（ＴａｑＭａｎ）・プローブ法を用いた。抽出法では、市販のキット、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ ＸＳ（ＴＡＫＡＲＡ Ｕ０９０１Ｂ：７４０９０．２５０）を用いた。溶出法では、市販のキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製 ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔ Ａｌｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔを用いた。
標準物質は株式会社日本遺伝子研究所にて作成した。配列を以下の表にまとめた。
試験方法等
（１）検体、試薬、機器等
本開示は定量ＰＣＲで対象遺伝子を検出する蛍光標識プローブ法、いわゆるタックマン（ＴａｑＭａｎ）・プローブ法を用いた。抽出法では、市販のキット、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ ＸＳ（ＴＡＫＡＲＡ Ｕ０９０１Ｂ：７４０９０．２５０）を用いた。溶出法では、市販のキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製 ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔ Ａｌｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔを用いた。
標準物質は株式会社日本遺伝子研究所にて作成した。配列を以下の表にまとめた。
【表1】
【0040】
その他、実施例において用いた検体、試薬等は以下の通りである。
［検体］
・検体：新生児乾燥血液ろ紙。
［ｑＰＣＲ用試薬・機器］
改良ダイレクト法：
・ｑＰＣＲキット：Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ Ｐｌｕｓ ＋ ＢＩＯＴＡＱ Ｓｈｉｍａｄｚｕ ２４１－０８８９０－９２
・ｑＰＣＲプレート：ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｆａｓｔ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６－Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ，０．１ｍＬ，ＡＢＩ，Ｃａｔ＃４３４６９０７
・ｑＰＣＲプレートシール：ＭｉｃｒｏＡｍｐ ９６－Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｖｅ ｆｉｌｍ，ＡＢＩ，Ｃａｔ＃４３６０９５４または＃４３１１９７１
・調製用プレートシール：ＢＩＯ ＢＩＫシーリングフィルムＢ－ＴＳ
・ｑＰＣＲ機器：Ｑｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ ５リアルタイムＰＣＲシステム，ＡＢＩ，ＱＳ５－９６Ｆ
・サーマルサイクラー（加温用）：サーマルサイクラーＡＳＴＥＣ
［検体］
・検体：新生児乾燥血液ろ紙。
［ｑＰＣＲ用試薬・機器］
改良ダイレクト法：
・ｑＰＣＲキット：Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ Ｐｌｕｓ ＋ ＢＩＯＴＡＱ Ｓｈｉｍａｄｚｕ ２４１－０８８９０－９２
・ｑＰＣＲプレート：ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｆａｓｔ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６－Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ，０．１ｍＬ，ＡＢＩ，Ｃａｔ＃４３４６９０７
・ｑＰＣＲプレートシール：ＭｉｃｒｏＡｍｐ ９６－Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｖｅ ｆｉｌｍ，ＡＢＩ，Ｃａｔ＃４３６０９５４または＃４３１１９７１
・調製用プレートシール：ＢＩＯ ＢＩＫシーリングフィルムＢ－ＴＳ
・ｑＰＣＲ機器：Ｑｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ ５リアルタイムＰＣＲシステム，ＡＢＩ，ＱＳ５－９６Ｆ
・サーマルサイクラー（加温用）：サーマルサイクラーＡＳＴＥＣ
【0041】
（２）測定操作
本実施例における測定操作は以下の通りである。
乾燥血液ろ紙よりＤＮＡを溶出あるいは抽出したＤＮＡ溶液をクリーンベンチ内に持ち込み、定量ＰＣＲ反応用９６マイクロプレートのウェルに５μＬずつ分注する。別途調製した４濃度の標準物質を５μＬずつ２ウェルに分注する。その後プライマー、プローブを添加したマスターミックスを調製し、各ウェルに１５μＬずつ分注する。その後８連フラットキャップをしっかり装着し、プレート遠心機で遠心後Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製 Ｑｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ５ リアルタイムＰＣＲシステムを用いて定量ＰＣＲを行う。機器の設定は、ＴＲＥＣｓ遺伝子に対しＣｙ５（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ）／Ｎｏｎｅ（Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）、ＫＲＥＣｓ遺伝子に対しＦＡＭ（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ）／Ｎｏｎｅ（Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）、ＳＭＮ１遺伝子に対しＶＩＣ（ＳＵＮ）（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ）／Ｎｏｎｅ（Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）を用いることができる。ＰＣＲ反応は、１ｃｙｃｌｅ／９５℃（１０分）、４５ｃｙｃｌｅ／９４℃（３０秒）、６２℃（１分）で行った。反応終了後、その量に応じた蛍光値を測定する。次に、既知量のＴＲＥＣｓ遺伝子配列、ＫＲＥＣｓ遺伝子配列およびＳＭＮ１遺伝子配列を含むＤＮＡスタンダードに対してＰＣＲ反応を行い、その量に応じた蛍光値から得られる検量線から、計算式を用いてＴＲＥＣｓ遺伝子、ＫＲＥＣｓ遺伝子およびＳＭＮ１遺伝子の量（ｃｏｐｉｅｓ／μＬ）を定量した。
［抽出法］
抽出法では、市販キットＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ ＸＳ（ＴＡＫＡＲＡ Ｕ０９０１Ｂ：７４０９０．２５０）を用いて抽出を行った。使用する乾燥血液ろ紙の枚数は３枚、２枚、１枚で検討した結果、乾燥血液ろ紙より直径３．２ｍｍ専用パンチャーを用いてディスク１枚を切り出し、これに対し当該キットプロトコールを参考にＤＮＡ抽出操作を行った。具体的には、ディスク１枚を１．５ｍＬマイクロチューブに入れ、Ｂｕｆｆｅｒ Ｔ１（１６０μＬ）添加し、ボルテックス５秒を２回行った。ブロックインキュベーターにて９４℃１０分インキュベート後、室温に戻し、プロテイナーゼＫ溶液（１６μＬ）を添加し、ボルテックス後軽くスピンダウンした。その後、５６℃で１時間インキュベートした。その際、抽出効率を上げるため約１０分毎にボルテックスを行った。その後、室温に戻してスピンダウンを行った後、当該溶液をマイクロピペットを用いて新しい１．５ｍＬマイクロチューブに移し、Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ３（１６０μＬ）を添加し、ボルテックス５秒を２回行い、７０℃で５分インキュベートし、その後、軽くボルテックス後、室温に戻し、スピンダウンした。その後、９６～１００％エタノールを１６０μＬ添加し、ボルテックス５秒を２回行い、軽くスピンダウンした。その後、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅの中のＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ ＸＳ Ｃｏｌｕｍｎに溶液を移し、１１，０００ｘｇにて１分遠心後、ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈを取り除き、再度新しいＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅを取り付けた。その後、Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ５（５０μＬ）をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ ＸＳ Ｃｏｌｕｍｎに添加し、１１，０００ｘｇにて１分遠心後、Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ５（５０μＬ）をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ ＸＳ Ｃｏｌｕｍｎに添加し、１１，０００ｘｇにて今度は２分遠心後、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅを取り除いた。最後にＤＮＡ抽出作業として、新しい１．５ｍＬマイクロチューブを取り付け、７０℃に加温したｍｉｌｌｉＱ滅菌水（２０μＬ）を添加し、１１，０００ｘｇにて１分遠心してＤＮＡ抽出液を得た。
［溶出法］
溶出法では、市販のキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製 ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔ Ａｌｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔを用いた。
［パンチアウトろ紙枚数検討結果］
ろ紙の枚数を増やすことで得られる測定対象となるＤＮＡ量は増えるが、ＤＮＡ抽出効率の低下および反応系に持ち込まれる血液由来ＰＣＲ阻害物質量も増加することが想定された。その結果、上記表の通りろ紙枚数が増加するに従い測定換算値は低くなる傾向が確認された。このため、検体毎のＤＮＡ抽出率およびＰＣＲ阻害物質の影響の差をなくすためにも、３．２ｍｍ１枚ろ紙での検査系構築を決定した。
本実施例における測定操作は以下の通りである。
乾燥血液ろ紙よりＤＮＡを溶出あるいは抽出したＤＮＡ溶液をクリーンベンチ内に持ち込み、定量ＰＣＲ反応用９６マイクロプレートのウェルに５μＬずつ分注する。別途調製した４濃度の標準物質を５μＬずつ２ウェルに分注する。その後プライマー、プローブを添加したマスターミックスを調製し、各ウェルに１５μＬずつ分注する。その後８連フラットキャップをしっかり装着し、プレート遠心機で遠心後Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製 Ｑｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ５ リアルタイムＰＣＲシステムを用いて定量ＰＣＲを行う。機器の設定は、ＴＲＥＣｓ遺伝子に対しＣｙ５（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ）／Ｎｏｎｅ（Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）、ＫＲＥＣｓ遺伝子に対しＦＡＭ（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ）／Ｎｏｎｅ（Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）、ＳＭＮ１遺伝子に対しＶＩＣ（ＳＵＮ）（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ）／Ｎｏｎｅ（Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）を用いることができる。ＰＣＲ反応は、１ｃｙｃｌｅ／９５℃（１０分）、４５ｃｙｃｌｅ／９４℃（３０秒）、６２℃（１分）で行った。反応終了後、その量に応じた蛍光値を測定する。次に、既知量のＴＲＥＣｓ遺伝子配列、ＫＲＥＣｓ遺伝子配列およびＳＭＮ１遺伝子配列を含むＤＮＡスタンダードに対してＰＣＲ反応を行い、その量に応じた蛍光値から得られる検量線から、計算式を用いてＴＲＥＣｓ遺伝子、ＫＲＥＣｓ遺伝子およびＳＭＮ１遺伝子の量（ｃｏｐｉｅｓ／μＬ）を定量した。
［抽出法］
抽出法では、市販キットＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ ＸＳ（ＴＡＫＡＲＡ Ｕ０９０１Ｂ：７４０９０．２５０）を用いて抽出を行った。使用する乾燥血液ろ紙の枚数は３枚、２枚、１枚で検討した結果、乾燥血液ろ紙より直径３．２ｍｍ専用パンチャーを用いてディスク１枚を切り出し、これに対し当該キットプロトコールを参考にＤＮＡ抽出操作を行った。具体的には、ディスク１枚を１．５ｍＬマイクロチューブに入れ、Ｂｕｆｆｅｒ Ｔ１（１６０μＬ）添加し、ボルテックス５秒を２回行った。ブロックインキュベーターにて９４℃１０分インキュベート後、室温に戻し、プロテイナーゼＫ溶液（１６μＬ）を添加し、ボルテックス後軽くスピンダウンした。その後、５６℃で１時間インキュベートした。その際、抽出効率を上げるため約１０分毎にボルテックスを行った。その後、室温に戻してスピンダウンを行った後、当該溶液をマイクロピペットを用いて新しい１．５ｍＬマイクロチューブに移し、Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ３（１６０μＬ）を添加し、ボルテックス５秒を２回行い、７０℃で５分インキュベートし、その後、軽くボルテックス後、室温に戻し、スピンダウンした。その後、９６～１００％エタノールを１６０μＬ添加し、ボルテックス５秒を２回行い、軽くスピンダウンした。その後、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅの中のＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ ＸＳ Ｃｏｌｕｍｎに溶液を移し、１１，０００ｘｇにて１分遠心後、ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈを取り除き、再度新しいＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅを取り付けた。その後、Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ５（５０μＬ）をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ ＸＳ Ｃｏｌｕｍｎに添加し、１１，０００ｘｇにて１分遠心後、Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ５（５０μＬ）をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ ＸＳ Ｃｏｌｕｍｎに添加し、１１，０００ｘｇにて今度は２分遠心後、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅを取り除いた。最後にＤＮＡ抽出作業として、新しい１．５ｍＬマイクロチューブを取り付け、７０℃に加温したｍｉｌｌｉＱ滅菌水（２０μＬ）を添加し、１１，０００ｘｇにて１分遠心してＤＮＡ抽出液を得た。
［溶出法］
溶出法では、市販のキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製 ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔ Ａｌｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔを用いた。
［パンチアウトろ紙枚数検討結果］
【表2】
【0042】
（３）解析操作
Ｑｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ ５ リアルタイムＰＣＲシステム，ＡＢＩ，ＱＳ５－９６Ｆに附属のＤｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析を行った。
Ｑｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ ５ リアルタイムＰＣＲシステム，ＡＢＩ，ＱＳ５－９６Ｆに附属のＤｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析を行った。
【0043】
［実施例２］
プライマーの設計
（１）ＴＲＥＣ増幅用プライマー
ＴＲＥＣ増幅用のＦｏｒｗａｒｄ（Ｆ）、Ｒｅｖｅｒｓｅ（Ｒ）プライマーは、特願２０２０－１６０８７３（ＫＭＢ出願特許）と同様の配列とした。表３にＴＲＥＣ増幅用プライマーの配列を記載する。
（２）ＫＲＥＣ増幅用プライマー
ＫＲＥＣの配列は表４のＦｏｒｗａｒｄ（Ｆ）、Ｒｅｖｅｒｓｅ（Ｒ）それぞれ３種類ずつ設計し、それぞれの組み合わせ９通り（（－）Ｆ３×Ｒ４、（ａ）Ｆ３×Ｒ６、（ｂ）Ｆ３×Ｒ８、（ｃ）Ｆ５×Ｒ４、（ｄ）Ｆ５×Ｒ６、（ｅ）Ｆ５×Ｒ８、（ｆ）Ｆ７×Ｒ４、（ｇ）Ｆ７×Ｒ６、（ｈ）Ｆ７×Ｒ８）でＰＣＲを行い電気泳動で確認した（図１）。
この結果非特異バンドがより少なく、当該バンドのシグナルが濃い、（ａ）Ｆ３×Ｒ６、（ｄ）Ｆ５×Ｒ６、（ｇ）Ｆ７×Ｒ６を選択し、以降の検討として他のＴａｒｇｅｔと同時反応の評価を行った結果、（ｄ）の組み合わせを活用することとなった。
（３）ＳＭＮ１増幅用プライマー
ＳＭＮ１の配列は表５のＦｏｒｗａｒｄ（Ｆ）３種類、Ｒｅｖｅｒｓｅ（Ｒ）６種類設計し、それぞれの組み合わせ１８通り（（ａ）Ｆ１×Ｒ４、（ｂ）Ｆ１×Ｒ５、（ｃ）Ｆ１×Ｒ６、（ｄ）Ｆ２×Ｒ４、（ｅ）Ｆ２×Ｒ５、（ｆ）Ｆ２×Ｒ６、（ｇ）Ｆ３×Ｒ４、（ｈ）Ｆ３×Ｒ５、（ｉ）Ｒ３×Ｒ６、（ｊ）Ｆ１×Ｒ１３、（ｋ）Ｆ１×Ｒ１４、（ｌ）Ｆ１×Ｒ１５、（ｍ）Ｆ２×Ｒ１３、（ｎ）Ｆ２×Ｒ１４、（ｏ）Ｆ２×Ｒ１５、（ｐ）Ｆ３×Ｒ１３、（ｑ）Ｆ３×Ｒ１４、（ｒ）Ｆ３×Ｒ１５）でＰＣＲを行い電気泳動で確認した。
この結果非特異バンドは無く、（ａ）～（ｉ）の組み合わせよりも（ｊ）～（ｒ）の組み合わせの方がシグナル強度の高かったため、（ｊ）～（ｒ）の中から複数ピックアップし他Ｔａｒｇｅｔとの同時反応等の実験を行い、最終的に（ｒ）Ｆ３×Ｒ１５に決定した（図２および３）。
プライマーの設計
（１）ＴＲＥＣ増幅用プライマー
ＴＲＥＣ増幅用のＦｏｒｗａｒｄ（Ｆ）、Ｒｅｖｅｒｓｅ（Ｒ）プライマーは、特願２０２０－１６０８７３（ＫＭＢ出願特許）と同様の配列とした。表３にＴＲＥＣ増幅用プライマーの配列を記載する。
【表3】
ＫＲＥＣの配列は表４のＦｏｒｗａｒｄ（Ｆ）、Ｒｅｖｅｒｓｅ（Ｒ）それぞれ３種類ずつ設計し、それぞれの組み合わせ９通り（（－）Ｆ３×Ｒ４、（ａ）Ｆ３×Ｒ６、（ｂ）Ｆ３×Ｒ８、（ｃ）Ｆ５×Ｒ４、（ｄ）Ｆ５×Ｒ６、（ｅ）Ｆ５×Ｒ８、（ｆ）Ｆ７×Ｒ４、（ｇ）Ｆ７×Ｒ６、（ｈ）Ｆ７×Ｒ８）でＰＣＲを行い電気泳動で確認した（図１）。
この結果非特異バンドがより少なく、当該バンドのシグナルが濃い、（ａ）Ｆ３×Ｒ６、（ｄ）Ｆ５×Ｒ６、（ｇ）Ｆ７×Ｒ６を選択し、以降の検討として他のＴａｒｇｅｔと同時反応の評価を行った結果、（ｄ）の組み合わせを活用することとなった。
【表4】
ＳＭＮ１の配列は表５のＦｏｒｗａｒｄ（Ｆ）３種類、Ｒｅｖｅｒｓｅ（Ｒ）６種類設計し、それぞれの組み合わせ１８通り（（ａ）Ｆ１×Ｒ４、（ｂ）Ｆ１×Ｒ５、（ｃ）Ｆ１×Ｒ６、（ｄ）Ｆ２×Ｒ４、（ｅ）Ｆ２×Ｒ５、（ｆ）Ｆ２×Ｒ６、（ｇ）Ｆ３×Ｒ４、（ｈ）Ｆ３×Ｒ５、（ｉ）Ｒ３×Ｒ６、（ｊ）Ｆ１×Ｒ１３、（ｋ）Ｆ１×Ｒ１４、（ｌ）Ｆ１×Ｒ１５、（ｍ）Ｆ２×Ｒ１３、（ｎ）Ｆ２×Ｒ１４、（ｏ）Ｆ２×Ｒ１５、（ｐ）Ｆ３×Ｒ１３、（ｑ）Ｆ３×Ｒ１４、（ｒ）Ｆ３×Ｒ１５）でＰＣＲを行い電気泳動で確認した。
この結果非特異バンドは無く、（ａ）～（ｉ）の組み合わせよりも（ｊ）～（ｒ）の組み合わせの方がシグナル強度の高かったため、（ｊ）～（ｒ）の中から複数ピックアップし他Ｔａｒｇｅｔとの同時反応等の実験を行い、最終的に（ｒ）Ｆ３×Ｒ１５に決定した（図２および３）。
【表5】
【0044】
［実施例３］
プローブの設計
実施例２で決定したＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１のプライマーを用いて、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１の各検出プローブの選定および作成を行った。プローブ設計はＷｅｂツールを用いて、立体構造・Ｔｍ値を参考に作成し、まずはＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１の各単一測定により確認した。
（１）ＴＲＥＣ検出プローブ
ＴＲＥＣ検出用のプローブは、特開２０２２－０５３９６１（ＫＭバイオロジクス出願特許）と同様の配列のＴＲＥＣ－ＰＢ１およびこれにＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ：１９９８年にＷｅｎｇｅｌらが初めて報告；特許文献５：特表２００５－５１４００５）を入れたＴＲＥＣ－ＰＢ２の２つを作成した。表６に記載のＴＲＥＣ検出プローブの配列に蛍光物質およびクエンチャーで修飾した核酸を使用した。確認の結果、ＴＲＥＣ－ＰＢ１では他Ｔａｒｇｅｔと同時反応を行った際相性が悪く、増幅が弱く不採用とした（図４および５）。結果ＴＲＥＣ－ＰＢ２の方がＴＲＥＣ－ＰＢ１よりも反応性が優れていた。
（２）ＫＲＥＣ検出プローブ
ＫＲＥＣ検出用のプローブは、５つ（ＫＲＥＣ－ＰＢ１～５）を作成した。表７に記載のＫＲＥＣ検出プローブの配列に蛍光物質およびクエンチャーで修飾した核酸を使用した。
ＫＲＥＣ－ＰＢ３～５は配列を設計したものの、インシリコの検討した結果、ヘアピン構造上にＬＮＡがくる配列となり、ＰＣＲ抑制の可能性が高かったため不採用とした。ＫＲＥＣ－ＰＢ１とＫＲＥＣ－ＰＢ２を比較したところ、ＫＲＥＣ－ＰＢ２は他Ｔａｒｇｅｔと同時反応をさせた場合相性が悪く、はっきりとした増幅が確認できなかった為、ＫＲＥＣ－ＰＢ１を採用した（図６および７）。
（３）ＳＭＮ１検出プローブ
ＳＭＮ１検出用のプローブは、９つ（ＳＭＮ１－ＰＢ１～９）を作成した。表８にＳＭＮ１検出プローブの配列を記載する。ＳＭＮ１－ＰＢ４～６は設計はしたもののインシリコの検討の結果、ヘアピン構造上にＬＮＡが多くのることになるため、予期せぬ立体構造異常をきたすことを懸念し不採用とした。ＳＭＮ１－ＰＢ７はＳＭＮ１のシングルアッセイのみ検討を行い、波形異常が多く安定した増幅を得られなかったため不採用とした。ＳＭＮ１－ＰＢ１、２、３、８、９を他Ｔａｒｇｅｔと同時反応を行い検討した結果、ＳＭＮ１－ＰＢ１が一番バランスよく安定的に増幅を確認することができ、反応性が最も優れていた（図８－１３）。
プローブの設計
実施例２で決定したＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１のプライマーを用いて、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１の各検出プローブの選定および作成を行った。プローブ設計はＷｅｂツールを用いて、立体構造・Ｔｍ値を参考に作成し、まずはＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１の各単一測定により確認した。
（１）ＴＲＥＣ検出プローブ
ＴＲＥＣ検出用のプローブは、特開２０２２－０５３９６１（ＫＭバイオロジクス出願特許）と同様の配列のＴＲＥＣ－ＰＢ１およびこれにＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ：１９９８年にＷｅｎｇｅｌらが初めて報告；特許文献５：特表２００５－５１４００５）を入れたＴＲＥＣ－ＰＢ２の２つを作成した。表６に記載のＴＲＥＣ検出プローブの配列に蛍光物質およびクエンチャーで修飾した核酸を使用した。確認の結果、ＴＲＥＣ－ＰＢ１では他Ｔａｒｇｅｔと同時反応を行った際相性が悪く、増幅が弱く不採用とした（図４および５）。結果ＴＲＥＣ－ＰＢ２の方がＴＲＥＣ－ＰＢ１よりも反応性が優れていた。
【表6】
ＫＲＥＣ検出用のプローブは、５つ（ＫＲＥＣ－ＰＢ１～５）を作成した。表７に記載のＫＲＥＣ検出プローブの配列に蛍光物質およびクエンチャーで修飾した核酸を使用した。
ＫＲＥＣ－ＰＢ３～５は配列を設計したものの、インシリコの検討した結果、ヘアピン構造上にＬＮＡがくる配列となり、ＰＣＲ抑制の可能性が高かったため不採用とした。ＫＲＥＣ－ＰＢ１とＫＲＥＣ－ＰＢ２を比較したところ、ＫＲＥＣ－ＰＢ２は他Ｔａｒｇｅｔと同時反応をさせた場合相性が悪く、はっきりとした増幅が確認できなかった為、ＫＲＥＣ－ＰＢ１を採用した（図６および７）。
【表7】
ＳＭＮ１検出用のプローブは、９つ（ＳＭＮ１－ＰＢ１～９）を作成した。表８にＳＭＮ１検出プローブの配列を記載する。ＳＭＮ１－ＰＢ４～６は設計はしたもののインシリコの検討の結果、ヘアピン構造上にＬＮＡが多くのることになるため、予期せぬ立体構造異常をきたすことを懸念し不採用とした。ＳＭＮ１－ＰＢ７はＳＭＮ１のシングルアッセイのみ検討を行い、波形異常が多く安定した増幅を得られなかったため不採用とした。ＳＭＮ１－ＰＢ１、２、３、８、９を他Ｔａｒｇｅｔと同時反応を行い検討した結果、ＳＭＮ１－ＰＢ１が一番バランスよく安定的に増幅を確認することができ、反応性が最も優れていた（図８－１３）。
【表8】
【0045】
［実施例４］
ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１の同時測定（１）
実施例２および３で決定したＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１のプライマーおよび検出プローブを用いて、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１の同時測定を行った。表９にＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１のプライマーおよび検出プローブの配列を記載する。プローブとして、ＴＲＥＣ－ＰＢ２は、５’末端をＣｙ５、３’末端を３ＩＡｂＲＱＳｐで修飾しており、ＫＲＥＣ－ＰＢ１は、５’末端を６ＦＡＭ、３’末端を３ＩＡＢｋＦＱで修飾しており、ＳＭＮ１－ＰＢ１は、５’末端をＳＵＮ、３’末端を３ＩＡＢｋＦＱで修飾している。確認の結果、ＳＭＮ１の増幅がうまくいかないことが確認された（図１４）。
ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１の同時測定（１）
実施例２および３で決定したＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１のプライマーおよび検出プローブを用いて、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１の同時測定を行った。表９にＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１のプライマーおよび検出プローブの配列を記載する。プローブとして、ＴＲＥＣ－ＰＢ２は、５’末端をＣｙ５、３’末端を３ＩＡｂＲＱＳｐで修飾しており、ＫＲＥＣ－ＰＢ１は、５’末端を６ＦＡＭ、３’末端を３ＩＡＢｋＦＱで修飾しており、ＳＭＮ１－ＰＢ１は、５’末端をＳＵＮ、３’末端を３ＩＡＢｋＦＱで修飾している。確認の結果、ＳＭＮ１の増幅がうまくいかないことが確認された（図１４）。
【表9】
【0046】
［実施例５］
ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１の同時測定（２）
実施例４でＳＭＮ１の増幅がうまくいかなかったことから、ＳＭＮ１のプライマーにＬＮＡを追加し、より特異性を高めることにした。この際、ＬＮＡ導入箇所はＳＭＮ１とＳＭＮ２とで配列に違いのある部分に導入した。表１０にＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１のプライマーおよび検出プローブの配列を記載する。プローブとして、ＴＲＥＣ－ＰＢ２は、５’末端をＣｙ５、３’末端を３ＩＡｂＲＱＳｐで修飾しており、ＫＲＥＣ－ＰＢ１は、５’末端を６ＦＡＭ、３’末端を３ＩＡＢｋＦＱで修飾しており、ＳＭＮ１－ＰＢ１は、５’末端をＳＵＮ、３’末端を３ＩＡＢｋＦＱで修飾している。確認の結果、ＳＭＮ１の増幅がうまくいくことが確認された（図１５）。
ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１の同時測定（２）
実施例４でＳＭＮ１の増幅がうまくいかなかったことから、ＳＭＮ１のプライマーにＬＮＡを追加し、より特異性を高めることにした。この際、ＬＮＡ導入箇所はＳＭＮ１とＳＭＮ２とで配列に違いのある部分に導入した。表１０にＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１のプライマーおよび検出プローブの配列を記載する。プローブとして、ＴＲＥＣ－ＰＢ２は、５’末端をＣｙ５、３’末端を３ＩＡｂＲＱＳｐで修飾しており、ＫＲＥＣ－ＰＢ１は、５’末端を６ＦＡＭ、３’末端を３ＩＡＢｋＦＱで修飾しており、ＳＭＮ１－ＰＢ１は、５’末端をＳＵＮ、３’末端を３ＩＡＢｋＦＱで修飾している。確認の結果、ＳＭＮ１の増幅がうまくいくことが確認された（図１５）。
【表10】
【0047】
［実施例６］
実施例５で確立した方法を用いて、新生児乾燥血液ろ紙から１．５ｍｍφの乾燥血液ろ紙を採取し、各患者検体を測定したところ、明確に識別できることを確認した（図１６）。
実施例５で確立した方法を用いて、新生児乾燥血液ろ紙から１．５ｍｍφの乾燥血液ろ紙を採取し、各患者検体を測定したところ、明確に識別できることを確認した（図１６）。
【0048】
［実施例７］
実施例５で確立した方法を用いて、正常判定検体（ｎ＝５００）の新生児乾燥血液ろ紙から１．５ｍｍφの乾燥血液ろ紙を採取し、ＳＭＡを確認したところ、カットオフ値は＜２００．０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ、平均は１８７３３．３ｃｏｐｉｅｓ／μＬであった（図１７）。同様にＴＲＥＣを確認したところ、カットオフは２０．０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ、平均は３０８．１ｃｏｐｉｅｓ／μＬであった（図１８）。ＫＲＥＣのカットオフは１０．０ｃｏｐｉｅｓ／μＬで平均は１６１．６ｃｏｐｉｅｓ／μＬであった（図１９）。
実施例５で確立した方法を用いて、正常判定検体（ｎ＝５００）の新生児乾燥血液ろ紙から１．５ｍｍφの乾燥血液ろ紙を採取し、ＳＭＡを確認したところ、カットオフ値は＜２００．０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ、平均は１８７３３．３ｃｏｐｉｅｓ／μＬであった（図１７）。同様にＴＲＥＣを確認したところ、カットオフは２０．０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ、平均は３０８．１ｃｏｐｉｅｓ／μＬであった（図１８）。ＫＲＥＣのカットオフは１０．０ｃｏｐｉｅｓ／μＬで平均は１６１．６ｃｏｐｉｅｓ／μＬであった（図１９）。
【0049】
［実施例８］
先行品との比較
実施例５で確立した方法を用いて、先行品であるパーキンエルマー社のＮｅｏＭＤｘキット（ＮｅｏＭＤｘキット－ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｊａｐａｎ）およびＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社のＴａｑＭａｎＴＭ ＳＣＩＤ／ＳＭＡ Ｐｌｕｓ Ａｓｓａｙ（ＴａｑＭａｎＴＭ ＳＣＩＤ／ＳＭＡ Ｐｌｕｓ Ａｓｓａｙ－Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ）との比較を行った（図２０）。本法と先行品との比較によると、本開示の技術は３つの対象遺伝子すべてで蛍光強度が高く、バラつきの少ない測定系であることが確認できた。一方、パーキンエルマーはＳＭＮ１の蛍光強度が低く、Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒはＴＲＥＣのベースラインが高く、バラついており、本開示の方法が優れていることが分かった。
先行品との比較
実施例５で確立した方法を用いて、先行品であるパーキンエルマー社のＮｅｏＭＤｘキット（ＮｅｏＭＤｘキット－ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｊａｐａｎ）およびＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社のＴａｑＭａｎＴＭ ＳＣＩＤ／ＳＭＡ Ｐｌｕｓ Ａｓｓａｙ（ＴａｑＭａｎＴＭ ＳＣＩＤ／ＳＭＡ Ｐｌｕｓ Ａｓｓａｙ－Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ）との比較を行った（図２０）。本法と先行品との比較によると、本開示の技術は３つの対象遺伝子すべてで蛍光強度が高く、バラつきの少ない測定系であることが確認できた。一方、パーキンエルマーはＳＭＮ１の蛍光強度が低く、Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒはＴＲＥＣのベースラインが高く、バラついており、本開示の方法が優れていることが分かった。
【0050】
［アルゴリズム］
同時スクリーニングにおけるＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＡの各検査対象に係る判定のアルゴリズムは、図２１－２３のものが挙げられる。
同時スクリーニングにおけるＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＡの各検査対象に係る判定のアルゴリズムは、図２１－２３のものが挙げられる。
【産業上の利用可能性】
【0051】
本開示によれば、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１の量を同時に測定することができ、効率よく、対象におけるＤＮＡを検出することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16-1】
【図16-2】
【図16-3】
【図16-4】
【図16-5】
【図16-6】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【配列表】