特開 2024-131743 間質性肺疾患の治療のための医薬組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024131743

(43)【公開日】2024-09-30

(54)【発明の名称】間質性肺疾患の治療のための医薬組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/16 20060101AFI20240920BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20240920BHJP

   C07K 14/47 20060101ALN20240920BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20240920BHJP

【ＦＩ】

A61K38/16

A61P11/00

C07K14/47 ZNA

C07K19/00

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023042184

(22)【出願日】2023-03-16

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 令和４年８月２６日にＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第２３巻、第１７号にて発表 令和５年２月２２日に第６５回九州リウマチ学会、九州リウマチ学会抄録集にて発表 令和５年３月１１日に第６５回九州リウマチ学会、九州リウマチ学会にて発表

(71)【出願人】

【識別番号】502437894

【氏名又は名称】学校法人大阪医科薬科大学

(74)【代理人】

【識別番号】100121728

【弁理士】

【氏名又は名称】井関 勝守

(74)【代理人】

【識別番号】100165803

【弁理士】

【氏名又は名称】金子 修平

(72)【発明者】

【氏名】武内 徹

(72)【発明者】

【氏名】池本 正生

(72)【発明者】

【氏名】小谷 卓矢

【テーマコード（参考）】

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA20

4C084BA23

4C084DC50

4C084NA14

4C084ZA59

4H045AA30

4H045BA41

4H045CA40

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

【課題】治療効果に優れて且つ副作用が少ない、有効な間質性肺疾患の治療のための医薬組成物を提供する。
【解決手段】本発明に係る医薬組成物は、間質性肺疾患を治療するための医薬組成物であり、ｈＭＩＫＯ－１を含むことを特徴とする。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｈＭＩＫＯ－１を含む、間質性肺疾患を治療するための医薬組成物。

【請求項2】

前記間質性肺疾患は、進行性線維化を伴う間質性肺疾患を含む、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記間質性肺疾患は、特発性肺線維症を含む、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記間質性肺疾患は、膠原病性間質性肺疾患を含む、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記膠原病性間質性肺疾患は、全身性強皮症に伴う間質性肺疾患を含む、請求項１に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、間質性肺疾患の治療のための医薬組成物、すなわちヒトＭＩＫＯ－１（以下、ｈＭＩＫＯ－１と呼ぶ）及びその誘導体に関する事象である。

【背景技術】

【0002】

間質性肺疾患は、肺胞隔壁や小葉間間質、気管支血管束等の広義の間質に炎症や線維化病変が生じる疾患であり、進行すると呼吸不全を引き起こし生命に関わる重篤な疾患である。従来から、進行性間質性肺疾患において、炎症に対してはステロイドや免疫抑制剤が用いられ、線維化病変に対しては抗線維化薬が用いられてきた（非特許文献１及び２）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【非特許文献1】Ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．９９（２０２０），ｐ．８１９－ｐ．８２９

【非特許文献2】Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ，Ｖｏｌ．５５（２０２１），ｐ．７２３－ｐ．７３１

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

しかしながら、間質性肺疾患に対しての従来の治療では効果が無い患者も見られ、また当該治療による副作用の発生等の有害事象も問題となっており、新たな治療法の開発が強く求められている。

【0005】

本発明は前記問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、間質性肺疾患の治療のためにより優れた治療効果が期待できる新しい医薬組成物を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

前記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究の結果、間質性肺疾患に対して、ｈＭＩＫＯ－１が優れた治療効果を発揮することを見出して本発明を完成した。

【0007】

具体的に、本発明に係る医薬組成物は、間質性肺疾患を治療するための医薬組成物であり、ｈＭＩＫＯ－１及びその誘導体を含むことを特徴とする。

【0008】

本発明に係る医薬組成物において、前記間質性肺疾患は、進行性線維化を伴う間質性肺疾患を含む。

【0009】

本発明に係る医薬組成物において、前記間質性肺疾患は、特発性肺線維症を含む。

【0010】

本発明に係る医薬組成物において、前記間質性肺疾患は、膠原病性間質性肺疾患を含む。

【0011】

本発明に係る医薬組成物において、前記膠原病性間質性肺疾患は、全身性強皮症に伴う間質性肺疾患も含む。

【発明の効果】

【0012】

本発明に係る医薬組成物、すなわちｈＭＩＫＯ－１より優れた治療効果を発揮する新しい誘導体の開発に繋がる可能性がある。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】図１は、ｈＳ１００Ａ８、ｈＳ１００Ａ９及びｈＭＩＫＯ－１の構造を説明するための概略図である。

【図2】図２は、実施例において、無処理マウス（正常群）、ブレオマイシン誘発性間質性肺疾患を有するマウス（ＢＬＭ群）及びブレオマイシン誘発性間質性疾患を有し且つｈＭＩＫＯ－１を投与したマウス（ＢＬＭ＋ｈＭＩＫＯ－１群）から肺組織を摘出し、それぞれの肺組織パラフィン包埋切片を用いてマッソントリクローム染色を行った結果を示す写真である。

【図3】図３は、実施例において、正常群、ＢＬＭ群及びＢＬＭ＋ｈＭＩＫＯ－１群のマッソントリクローム染色を施行した肺病理切片を用いて、重複しない５病変部位について修正Ａｓｈｃｒｏｆｔスケールを用いて肺の線維化を評価しスコア化した結果を示すグラフである。

【図4】図４は、実施例において、正常群、ＢＬＭ群及びＢＬＭ＋ｈＭＩＫＯ－１群マウスの肺組織におけるヒドロキシプロリン量（コラーゲン量を反映する）を測定した結果を示すグラフである。

【図5】図５（ａ）～（ｇ）は、実施例において、正常群、ＢＬＭ群及びＢＬＭ＋ｈＭＩＫＯ－１群マウスのそれぞれの肺から総ＲＮＡを抽出し、定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）法を用いて炎症及び線維化に関連する遺伝子の発現量について評価した結果を示すグラフである。（ａ）は腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、（ｂ）はインターロイキン（ＩＬ）－６、（ｃ）はＩＬ－１β、（ｄ）はＦ４／８０、（ｅ）は組織メタロプロテアーゼ阻害剤（ＴＩＭＰ）－１、（ｆ）はマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）－９のそれぞれの遺伝子発現量を測定した結果を示し、（ｇ）はＭＭＰ－９／ＴＩＭＰ－１比を示す。

【図6】図６は、実施例において、マウス腹腔から得られたマクロファージに対してｈＭＩＫＯ－１処理群と対照群における細胞表面抗原のＣＤ６４及びＣＤ１６３の発現を評価した結果を示すグラフである。上段は左から解析した細胞分画、ＣＤ６４発現量及びＣＤ１６３発現量の測定結果を示し、下段は左からＣＤ６４の発現比率、ＣＤ１６３の発現比率及びＣＤ１６３／ＣＤ６４比について、対照群とｈＭＩＫＯ－１群を比較検討した結果を示すグラフである。

【図7】図７（ａ）～（ｃ）は、実施例において、対照群とｈＭＩＫＯ－１処理群においてマウスマクロファージの培養上清中ＩＬ－１０及びＩＬ－１２濃度を測定した結果を示すグラフである。（ａ）はＩＬ－１２の測定結果、（ｂ）はＩＬ－１０の測定結果、（ｃ）はＩＬ－１０／ＩＬ－１２比をそれぞれ示す。

【図8】図８（ａ）～（ｆ）は、実施例において、対照群とｈＭＩＫＯ－１処理群のマウスマクロファージから総ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲ法を用いて各標的遺伝子を定量測定した結果を示すグラフである。（ａ）はＣＤ６４、（ｂ）はＣＤ１６３、（ｃ）はＩＬ－１２、（ｄ）はＩＬ－１０の測定結果をそれぞれ示し、（ｅ）はＣＤ１６３／ＣＤ６４比、（ｆ）はＩＬ－１０／ＩＬ－１２比をそれぞれ示す。

【発明を実施するための形態】

【0014】

以下、本発明を実施するための形態を説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。

【0015】

本発明の一実施形態は、間質性肺疾患を治療するための主たる医薬組成物、すなわちｈＭＩＫＯ－１及びその誘導体である。

【0016】

ｈＭＩＫＯ－１とは、骨髄系免疫細胞及び血管内皮細胞から産生されるカルシウム結合タンパク質であるヒトＳ１００タンパク質の一次構造をモチーフとして開発された遺伝子
組換えペプチドであり、特開２０２０－８３７５９号公報に記載されたものである。具体的に、ｈＭＩＫＯ－１は、ヒトＳ１００タンパク質のうちＳ１００Ａ８タンパク質（以下、ｈＳ１００Ａ８と呼ぶ）とＳ１００Ａ９タンパク質（以下、ｈＳ１００Ａ９と呼ぶ）のＣ末端領域とが連結されたハイブリッドペプチドである。ｈＳ１００Ａ８及びｈＳ１００Ａ９のアミノ酸配列および塩基配列は、既存のデータベースに登録されており、これらの情報を参照できる。ｈＳ１００Ａ８の情報は、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＢＣ００５９２８（塩基配列）、ＡＡＨ０５９２８（アミノ酸配列）に登録されており、ｈＳ１００Ａ９の情報は、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＢＣ０４７６８１（塩基配列）、ＡＡＨ４７６８１（アミノ酸配列）に登録されている。なお、ｈＳ１００Ａ８及びｈＳ１００Ａ９、並びにｈＭＩＫＯ－１を構成するｈＳ１００Ａ９のＣ末端領域のアミノ酸配列は以下の通りである。
ｈＳ１００Ａ８：ＭＬＴＥＬＥＫＡＬＮ ＳＩＩＤＶＹＨＫＹＳ ＬＩＫＧＮＦＨＡＶＹ
ＲＤＤＬＫＫＬＬＥＴ ＥＣＰＱＹＩＲＫＫＧ ＡＤＶＷＦＫＥＬＤＩ ＮＴＤＧＡＶＮＦＱＥ ＦＬＩＬＶＩＫＭＧＶ ＡＡＨＫＫＳＨＥＥＳ ＨＫＥ（配列番号１）
ｈＳ１００Ａ９：ＭＴＣＫＭＳＱＬＥＲ ＮＩＥＴＩＩＮＴＦＨ ＱＹＳＶＫＬＧＨＰＤ
ＴＬＮＱＧＥＦＫＥＬ ＶＲＫＤＬＱＮＦＬＫ ＫＥＮＫＮＥＫＶＩＥ ＨＩＭＥＤＬＤＴＮＡ ＤＫＱＬＳＦＥＥＦＩ ＭＬＭＡＲＬＴＷＡＳ ＨＥＫＭＨＥＧＤＥＧ ＰＧＨＨＨＫＰＧＬＧ ＥＧＴＰ（配列番号２）
ｈＳ１００Ａ９のＣ末端領域：ＭＨＥＧＤＥＧ ＰＧＨＨＨＫＰＧＬＧ ＥＧＴＰ（配列番号３）

【0017】

ｈＭＩＫＯ－１は、上記ｈＳ１００Ａ８（配列番号１）のＣ末端側に２１アミノ酸からなるｈＳ１００Ａ９（配列番号３）のＣ末端領域が連結されてなる１１４アミノ酸（配列番号４）で構成されている。
ｈＭＩＫＯ－１：ＭＬＴＥＬＥＫＡＬＮ ＳＩＩＤＶＹＨＫＹＳ ＬＩＫＧＮＦＨＡＶＹ
ＲＤＤＬＫＫＬＬＥＴ ＥＣＰＱＹＩＲＫＫＧ ＡＤＶＷＦＫＥＬＤＩ ＮＴＤＧＡＶＮＦＱＥ ＦＬＩＬＶＩＫＭＧＶ ＡＡＨＫＫＳＨＥＥＳ ＨＫＥ ＭＨＥＧＤＥＧ ＰＧＨＨＨＫＰＧＬＧ ＥＧＴＰ（配列番号４）

【0018】

ｈＭＩＫＯ－１は、上記配列番号４のアミノ酸配列からなるものであるが、タンパク質の機能を実質的に改変しないようなアミノ酸の保存的置換を含むものであってもよい。このようなアミノ酸の保存的置換は、本技術分野において周知であり、例えば疎水性および親水性の指標（ハイドロパシー）、極性、電荷等の化学的性質、または、二次構造等の生化学的性質等が類似しているアミノ酸による置換である。具体的に、非極性アミノ酸（疎水性アミノ酸）は、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられ、極性アミノ酸（中性アミノ酸）は、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられ、陽電荷を有するアミノ酸（塩基性アミノ）酸は、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられ、負電荷を有するアミノ酸（酸性アミノ酸）は、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。

【0019】

本実施形態に係る医薬組成物において、ｈＭＩＫＯ－１は、その安定性等の特性向上のために、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の分子によって修飾されていても構わない。その他に、特定薬物等を目的（標的）組織にデリバリーできるようにするための担体として、ｈＭＩＫＯ－１が各種処理されても構わない。このようなペプチドに対する各種の修飾方法は、本技術分野において周知である。

【0020】

本実施形態に係る医薬組成物は、上記ｈＭＩＫＯ－１が主成分であるが、医薬的に種々の許容可能な添加剤を含んでいても構わない。例えば、添加剤としては基剤原料、賦形剤、着色剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定化剤、保存剤、香料等の矯味矯臭剤等があげら
れる。本発明において、前記添加剤の配合量は、前記ｈＭＩＫＯ－１の機能を妨げるものでなければ、特に制限されない。

【0021】

本実施形態において、医薬組成物の投与方法は特に限定されず、経口投与でも、非経口投与でもよい。例えば、前記非経口投与は、静脈注射（静脈内投与）、筋肉注射（筋肉内投与）、経皮投与、皮下投与、皮内投与、経腸投与、直腸投与、経膣投与、経鼻投与、経肺投与、腹腔内投与、局所投与等を用いることができる。

【0022】

本実施形態において、医薬組成物の剤形は特に限定されない。例えば、液体状や固体状が挙げられる。具体例として、１）カプセル剤、経口液剤、顆粒剤、散剤、錠剤、丸剤、経口ゼリー剤等の経口投与用製剤、２）注射剤、凍結乾燥注射剤、粉末注射剤、充填済シリンジ剤、カートリッジ剤等の注射投与用製剤、３）腹膜透析用剤、血液透析用剤等の透析用製剤、４）吸入剤、５）坐剤、注腸剤等の直腸適用製剤等を用いることができる。

【0023】

本実施形態に係る医薬組成物において、後に実施例にて示す通りｈＭＩＫＯ－１が肺線維化を効果的に抑制し、炎症や線維化に関連する遺伝子の発現を抑制することができる。その結果、間質性肺疾患の治療に有効性を示し得る。ここで特に限定されないが、間質性肺疾患として，例えば進行性線維化を伴う間質性肺疾患、特発性肺線維症、膠原病性間質性肺疾患、又は全身性強皮症に伴う間質性肺疾患等、種々の間質性肺疾患を対象とすることができる。

【0024】

また、ｈＭＩＫＯ－１は、後に実施例にて示す通りマクロファージのＭ２優位への分極を抑制することができる。間質性肺疾患の初期炎症過程において、肺マクロファージはＭＭＰやＴＮＦ－α、ＩＬ－６及びＩＬ－１β等の炎症性サイトカインを産生し、肺損傷に関与することが知られている。また、間質性肺疾患の肺線維化の過程には主にＭ２マクロファージが関与していることが知られており、炎症の慢性期において、Ｍ２マクロファージが肺胞に浸潤し、線維化促進因子の産生を介して線維芽細胞の分化と増殖を誘導することが知られている。特に、特発性肺線維症患者では、Ｍ２マクロファージが肺胞に過剰に浸潤し、肺損傷の修復過程で線維化を引き起こすこと、また膠原病性間質性肺疾患では、肺胞にＣＤ１６３＋マクロファージが浸潤しており、ＩＬＤの重症度と関連していることも知られている。これに対して、ｈＭＩＫＯ－１は、上述の通りマクロファージのＭ２優位への分極を抑制することができ、これにより間質性肺疾患を改善できることが考えられる。

【実施例0025】

以下に、本発明に係る医薬組成物について詳細に説明するための実施例を示す。

【0026】

（ｈＭＩＫＯ－１の調製）
ｈＳ１００Ａ８ペプチド（配列番号１の前記ｈＳ１００Ａ８）及びｈＳ１００Ａ９ペプチドのＣ末端領域（配列番号３の前記ｈＳ１００Ａ９のＣ末端領域）から設計したｈＭＩＫＯ－１（配列番号４の前記ｈＭＩＫＯ－１）を、遺伝子工学的手法により調製した（図１を参照）。前記ｈＭＩＫＯ－１の全長は、アミノ酸の数においてｈＳ１００Ａ９ペプチド（配列番号２）と同じであり、その分子量もｈＳ１００Ａ９とほぼ同等である。得られたｈＭＩＫＯ－１を以下の実験に供した。

【0027】

（ｈＭＩＫＯ－１の間質性肺疾患モデルマウスに対する効果）
１３週齢の雌のＣ５７／ＢＬ６Ｊマウス（清水実験材料株式会社）を用い、麻酔は１．５～２．０％のイソフルラン吸入を用いた。実験群は、無処理マウス（正常群）、ブレオマイシン誘発性間質性肺疾患を有するマウス（ＢＬＭ群）及びブレオマイシン誘発性間質性疾患を有し且つｈＭＩＫＯ－１を投与したマウス（ＢＬＭ＋ｈＭＩＫＯ－１群）の３群
を設定し、１群当たり１０匹のマウスを使用した。ブレオマイシン溶液は、滅菌ブレオマイシン硫酸塩粉末（日本化薬）を滅菌生理食塩水に混合して調製した。ＢＬＭ群及びＢＬＭ＋ｈＭＩＫＯ－１群のマウスに１００μＬの滅菌生理食塩水に含まれる３ｍｇのブレオマイシンを、浸透圧ミニポンプ（ＡＬＺＥＴ社）を用いて０日目から７日目に持続皮下投与した。また、ＢＬＭ＋ｈＭＩＫＯ－１群のマウスに０．２ｍＬのｈＭＩＫＯ－１（０．１ｍｇのｈＭＩＫＯ－１、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、０．９％のＮａＣｌ）を０日目から１４日目まで腹腔内投与した。他の対照群のマウスには、同量（０．２ｍＬ）の５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）／０．９％ＮａＣｌ（以下緩衝液Ａと呼ぶ）を投与した。マウスを２１日目に頸椎脱臼により安楽死させ、肺を解析用に採取した。

【0028】

採取した肺のうち、右中葉を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで６時間固定した後、２０％スクロース／ＰＢＳに一晩置換した。その後、パラフィン包埋した右中葉の５μｍ切片を用いてマッソントリクローム染色を行った。各切片について、肺の実質組織における最も重症である５つの非重複視野（顕微鏡倍率２００倍）を取得した。各群の代表的な視野を図２に示す。また、各群で得られた視野において肺の線維化について数値スケールを用いて定量化した。具体的に、各視野における線維化の重症度は、周知の修正Ａｓｈｃｒｏｆｔスケール（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ．４４（２００８），ｐ．５０７－ｐ．５１７を参照）を用いて評価し、スコア化した。当該スケールでは０から８までの数値で評価し、数値が大きいほど重症と評価される。各群の重症度は、観察された顕微鏡野のスコアの平均値として表し、当該評価は、３人の独立した観察者によって行われた。その結果を図３に示す。

【0029】

図３に示すように、正常群ではほぼ０から１の低いスコアを示し、ＢＬＭ群では５以上の高いスコアを示した。しかしながら、ＢＬＭ＋ｈＭＩＫＯ－１群では、ＢＬＭ群と比較してスコアが低減して２程度となった。この結果から、ｈＭＩＫＯ－１によってブレオマイシン誘発性の肺線維化が改善されることが明らかとなり、ｈＭＩＫＯ－１が間質性肺疾患を改善できることが示唆された。

【0030】

次に、各群における肺組織中のヒドロキシプロリン量（線維性コラーゲン量を反映）を測定した。具体的に、上記各群のマウスの左肺を採取し、－７０℃で保存した後、各サンプルに対してペプシン（０．３ｍｇ／１０ｍｇ組織）を含む０．５ｍｏｌ／Ｌの酢酸を用いて４℃で１８時間処理した。その後、ＳｉｒｃｏｌＳｏｌｕｂｌｅ Ｃｏｌｌａｇｅｎ
Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ社）を用いて肺におけるヒドロキシプロリン量を測定した。その結果を図４に示す。

【0031】

図４に示すように、正常群では約３００μｇ程度のヒドロキシプロリン量を示すのに対し、ＢＬＭ群では約８００μｇ程度の高いヒドロキシプロリン量を示した。一方、ＢＬＭ＋ｈＭＩＫＯ－１群では、約４００μｇ程度を示し、ＢＬＭ群と比較してヒドロキシプロリン量が顕著に低下した。この結果からも、図３の結果と同様にｈＭＩＫＯ－１によってブレオマイシン誘発性の肺線維化が改善されることが明らかとなり、ｈＭＩＫＯ－１が間質性肺疾患を改善できることが示唆された。

【0032】

次に、ｈＭＩＫＯ－１における抗炎症及び抗線維化効果をさらに評価するために、上記各群のマウスの肺から常法によって総ＲＮＡを抽出し、炎症及び線維化に関連する分子の遺伝子発現について、定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）法を用いて定量評価した。具体的な項目は、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、Ｆ４／８０、ＭＭＰ－９、メタロプロテイナーゼ－１組織阻害剤（ＴＩＭＰ－１）、及びＧＡＰＤＨ（ハウスキーピング遺伝子）である。測定結果を図５に示す。なお、各測定のために用いたプライマーは以下の通りである。
ＴＮＦ－α（フォワード）：ＡＣＣＴＴＧＴＴＧＣＣＴＣＣＴＣＴＴ（配列番号５）
ＴＮＦ－α（リバース）：ＧＴＴＣＡＧＴＧＡＴＧＴＡＧＣＧＡＣＡＧ（配列番号６）
ＩＬ－６（フォワード）：ＡＡＡＴＧＡＧＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＴＧ（配列番号７）
ＩＬ－６（リバース）：ＴＴＴＧＴＡＴＣＴＣＴＧＧＡＡＧＴＴＴ（配列番号８）
ＩＬ－１β（フォワード）：ＧＡＴＡＣＣＡＣＴＣＣＣＡＡＣＡＧＡ（配列番号９）
ＩＬ－１β（リバース）：ＧＣＣＡＴＴＧＣＡＣＡＡＣＴＣＴＴＴ（配列番号１０）
Ｆ４／８０（フォワード）：ＴＧＴＣＴＧＡＡＧＡＴＴＣＴＣＡＡＡＡＣＡＴＧＧＡ（配列番号１１）
Ｆ４／８０（リバース）：ＴＧＧＡＧＣＴＴＣＡＴＡＧＴＴＧＴＡＡＧＧＣＡ（配列番号１２）
ＭＭＰ－９（フォワード）：ＣＧＡＴＴＣＣＡＡＡＣＣＴＴＣＡＡＡ（配列番号１３）
ＭＭＰ－９（リバース）：ＧＣＡＡＧＴＣＴＴＣＡＧＡＧＴＡＧＴ（配列番号１４）
ＴＩＭＰ－１（フォワード）：ＡＡＧＡＴＧＡＣＴＡＡＧＡＴＧＣＴＡＡ（配列番号１５）
ＴＩＭＰ－１（リバース）：ＧＡＴＧＡＧＡＡＡＣＴＣＴＴＣＡＣＴ（配列番号１６）
ＧＡＰＤＨ（フォワード）：ＡＣＡＡＴＧＡＡＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＧ（配列番号１７）ＧＡＰＤＨ（リバース）：ＧＧＴＣＣＡＧＧＧＴＴＴＣＴＴＡＣＴ（配列番号１８）

【0033】

図５に示すように、炎症又は線維化に関わるＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、Ｆ４／８０及びＴＩＭＰ－１の相対的遺伝子発現レベルは（図５（ａ）～（ｅ））、ＢＬＭ群では正常群と比較して有意に増加しており、ＢＬＭ＋ｈＭＩＫＯ－１群ではＢＬＭ群と比較して有意に減少していた。一方、ＭＭＰ－９の相対的遺伝子発現レベルは（図５（ｆ））、ＢＬＭ群では正常群と比較して有意に減少していたが、ＢＬＭ＋ｈＭＩＫＯ－１群ではＢＬＭ群と比較して有意差は無かった。また、ＭＭＰ－９／ＴＩＭＰ－１比（図５（ｇ））は、ＢＬＭ単独群では正常群に比べ有意に低く、ＢＬＭ＋ｈＭＩＫＯ－１群ではＢＬＭ群と比較して有意な差は無かったが増加する傾向にあった。

【0034】

以上の結果から、ブレオマイシンによって炎症及び線維化に関する分子の遺伝子発現が増大したが、ｈＭＩＫＯ－１の投与によりそれらの発現を抑制できることが示唆された。従って、これらの結果からもｈＭＩＫＯ－１によって肺の炎症及び線維化を改善できると考えられ、ｈＭＩＫＯ－１が間質性肺疾患を改善できることが示唆された。

【0035】

（ｈＭＩＫＯ－１のチオグリコレート誘導マウス腹腔マクロファージに対する効果）
１３週齢の雌のＣ５７／ＢＬ６Ｊマウス（清水実験材料株式会社）に対して、緩衝液Ａ中に含まれた４％チオグリコレート（Ｓｉｇｍａ）１ｍＬを腹腔内注射することによって、マウスマクロファージを誘導した。その４日後にマウスを安楽死させて、マウスの腹腔内を５ｍＬの氷冷緩衝液Ａによって洗浄し、常法によって細胞を採取し、１０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離後、１０％のウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ－１６４０培地に再懸濁した。６ウェルプレートに採取した細胞を播種し、各サンプル（３×１０^５個／ウェル）に対して、ｈＭＩＫＯ－１（約２５μｇ／ｍＬ）を添加して（ｈＭＩＫＯ－１投与群）又は無添加（対照群）で、３７℃で２４時間培養した。その後に非接着細胞を除去し、培養上清を後のサイトカイン測定のために－３０℃で保存した。接着細胞は、緩衝液Ａで２回洗浄した後、スクレイパーを用いて１ｍＬの緩衝液Ａ中に回収した。得られた細胞懸濁液を１１２×ｇ、４℃で１０分間遠心し上清を除去した。

【0036】

ｈＭＩＫＯ－１によるマクロファージの細胞表面抗原レベルの変化を評価するために、上記のようにして得られた細胞をＰＢＳで洗浄した後、１０μＬのＰＥ－シアニン７標識マウス抗マウスＣＤ６４モノクローナル抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）又はＡＰＣ標識ラット抗マウスＣＤ１６３モノクローナル抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）と共に４℃、暗所で３０分インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、Ｎａｖｉｏｓサイトメーター（Ｂｅｃ
ｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて解析した。その結果を図６に示す。

【0037】

図６に示すように、ｈＭＩＫＯ－１処理群では、対照群と比較してマクロファージの細胞表面抗原のうちＭ１マクロファージのマーカーであるＣＤ６４の発現が有意に増加した。一方、Ｍ２マクロファージのマーカーであるＣＤ１６３の発現が有意に減少した。また、ｈＭＩＫＯ－１処理群では、対照群と比較してＣＤ１６３／ＣＤ６４比は有意に減少した。この結果から、ｈＭＩＫＯ－１は、マクロファージのＭ２への分極を抑制することが示唆された。

【0038】

次に、上記の通り－３０℃で保存した培養上清について、マウスＩＬ－１０ ＥＬＩＳ
Ａキット（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ）及びＬＢＩＳマウスＩＬ－１２ ＥＬ
ＩＳＡキット（富士フィルム和光純薬）を用いて、主にＭ２マクロファージから分泌されるＩＬ－１０及び主にＭ１マクロファージから分泌されるＩＬ－１２を測定し、それらの分泌レベルを評価した。その結果を図７に示す。

【0039】

また、上記の実験で得られたマクロファージから総ＲＮＡを抽出し、ＣＤ６４、ＣＤ１６３、ＩＬ－１２、ＩＬ－１０及びＧＡＰＤＨ（ハウスキーピング遺伝子）の遺伝子発現を定量評価した。具体的に、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて総ＲＮＡを抽出した後、Ｅｘｓｃｒｉｐｔ ＲＴ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてｃＤＮＡを合成し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７０００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、遺伝子増幅を行った。各標的遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現量は、比較ＣＴ法を用いて算出し、その結果を図８に示す。なお、各標的遺伝子増幅のために用いたプライマーは以下の通りである。
ＣＤ６４（フォワード））：ＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＴＡＴＧＴＧＧＧＣＡＧＴ（配列番号１９）
ＣＤ６４（リバース）：ＧＣＴＡＣＣＴＣＧＣＡＣＣＡＧＴＡＴＧＡＴ（配列番号２０）ＣＤ１６３（フォワード）：ＴＣＡＣＴＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＡＣＧＴＡＡＡＣ（配列番号２１）
ＣＤ１６３（リバース）：ＧＡＴＧＴＴＡＴＴＴＧＣＣＡＴＡＣＡＧＧＡＧＡＡＴＴＧ（配列番号２２）
ＩＬ－１２（フォワード）：ＡＡＧＡＴＧＡＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧ（配列番号２３）
ＩＬ－１２（リバース）：ＣＡＴＴＧＧＡＣＴＴＣＧＧＴＡＧＡＴ（配列番号２４）
ＩＬ－１０（フォワード）：ＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＡＡＧＡＧＴＧＡ（配列番号２５）
ＩＬ－１０（リバース）：ＴＴＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＴＡＧＡＣＡＣＣＴ（配列番号２６）
ＧＡＰＤＨ（フォワード）：ＡＣＡＡＴＧＡＡＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＧ（配列番号１７）ＧＡＰＤＨ（リバース）：ＧＧＴＣＣＡＧＧＧＴＴＴＣＴＴＡＣＴ（配列番号１８）

【0040】

図７に示すように、マウスマクロファージの培養上清中のＩＬ－１０及びＩＬ－１２濃度は、ｈＭＩＫＯ－１処理群では対照群と比較していずれも有意に高かったが、ＩＬ－１０／ＩＬ－１２比は、ｈＭＩＫＯ－１処理群において対照群と比較して有意に低かった。また、図８に示すように、ｈＭＩＫＯ－１処理群におけるマウスマクロファージにおける上記遺伝子発現は、対照群と比較してＣＤ６４（ａ）、ＩＬ－１２（ｃ）及びＩＬ－１０（ａ）レベルが有意に増大したが、ＣＤ１６３については差が無かった。また、ｈＭＩＫＯ－１処理群において、ＣＤ１６３／ＣＤ６４比は対照群と比較して有意に低かった。これらの結果からも、ｈＭＩＫＯ－１は、マクロファージのＭ２優位への分極を抑制することが示唆された。

【0041】

これらの結果から、ｈＭＩＫＯ－１はブレオマイシン誘発性の肺の線維化及び炎症を有
意に改善することができ、特に炎症性サイトカインや線維化に関わる分子の発現を抑制すること、またマクロファージのＭ２優位への分極を抑制することで、上記のような肺の線維化及び炎症を改善することに寄与していると考えられる。

【0042】

以上から、本発明に係るｈＭＩＫＯ－１を含む医薬組成物は、間質性肺疾患の治療に有用であるといえる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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