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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024131845
(43)【公開日】2024-09-30
(54)【発明の名称】ＳＣＦＡまたは乳酸の産生方法
(51)【国際特許分類】
C12P 7/6409 20220101AFI20240920BHJP
C12P 7/56 20060101ALI20240920BHJP
【ＦＩ】
C12P7/6409
C12P7/56
【審査請求】未請求
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023042323
(22)【出願日】2023-03-16
(71)【出願人】
【識別番号】304021831
【氏名又は名称】国立大学法人千葉大学
(71)【出願人】
【識別番号】501176303
【氏名又は名称】日環科学株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100080182
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 三彦
(74)【代理人】
【識別番号】100142572
【弁理士】
【氏名又は名称】水内 龍介
(72)【発明者】
【氏名】児玉 浩明
(72)【発明者】
【氏名】宮本 浩邦
(72)【発明者】
【氏名】栗原 瑞穂
(72)【発明者】
【氏名】板谷 かえで
【テーマコード（参考）】
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B064AD33
4B064AD85
4B064CA02
4B064DA01
4B064DA10
(57)【要約】
【課題】乳酸代謝による乳酸またはＳＣＦＡの産生を促す方法を提供すること。
【解決手段】一段階目として、乳酸資化菌Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａｅｌｓｄｅｎｉｉ Ｙ２株を培養し、二段階目として、前記一段階目の培養で得られた培養上清を用いて乳酸菌を培養することを特徴としたこと。
【選択図】図１６
【解決手段】一段階目として、乳酸資化菌Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａｅｌｓｄｅｎｉｉ Ｙ２株を培養し、二段階目として、前記一段階目の培養で得られた培養上清を用いて乳酸菌を培養することを特徴としたこと。
【選択図】図１６
【特許請求の範囲】
【請求項1】
一段階目として、乳酸資化菌Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａｅｌｓｄｅｎｉｉ Ｙ２株を培養し、
二段階目として、前記一段階目の培養で得られた培養上清を用いて乳酸菌を培養することを特徴とする乳酸またはＳＣＦＡの産生方法。
二段階目として、前記一段階目の培養で得られた培養上清を用いて乳酸菌を培養することを特徴とする乳酸またはＳＣＦＡの産生方法。
【請求項2】
前記乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の菌種は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株またはＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ株であることを特徴とする請求項１に記載の乳酸またはＳＣＦＡの産生方法。
【請求項3】
一段階目として、乳酸資化菌Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａｅｌｓｄｅｎｉｉ Ｙ２株を培養し、
前記一段階目の培養で得られた培養上清を熱処理し、
二段階目として、前記熱処理後の培養上清を用いて乳酸菌を培養することを特徴とする乳酸またはＳＣＦＡの産生方法。
前記一段階目の培養で得られた培養上清を熱処理し、
二段階目として、前記熱処理後の培養上清を用いて乳酸菌を培養することを特徴とする乳酸またはＳＣＦＡの産生方法。
【請求項4】
前記乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の菌種は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株であることを特徴とする請求項３に記載の乳酸またはＳＣＦＡの産生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＳＣＦＡまたは乳酸の産生方法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
腸内細菌叢は、人間や動物の消化管に生息する複雑な微生物群であり、ヒトの腸内細菌叢は体の他の部分と比較して微生物の量、種類が最も多く、１５００種、５０を超える異なる門に分布している。これらの細菌は細菌同士あるいは宿主との相互作用を介して、複雑な生態系を構成し、宿主の恒常性維持に大きく関わっている。例えば、腸において粘膜表面にコロニーを形成し、様々な抗菌物質を生成することで病原体感染防御を行うこと、上皮細胞の増殖と分化を制御し、恒常性を維持することが示されている。さらに近年では腸だけではなく、宿主の健康維持に大きな役割を果たすことが明らかとなっており、炎症性疾患、肥満、糖尿病、アレルギー、自己免疫疾患、心疾患および鬱病と言った多くの疾患において腸内細菌叢とその代謝産物との関連が示唆されている。これらのことから腸内細菌叢のバランスを整えることは、宿主の健康に様々な効果をもたらすと考えられるようになっている。
【0003】
腸内細菌叢のバランスを変え、宿主の健康に有益な効果をもたらす生きた微生物、またはそれらを含む食品をプロバイオティクスといい、ＦＡＯ／ＷＨＯは「適切な量を投与されると宿主に健康上の利益をもたらす生きた微生物」と定義している。乳酸菌は代表的なプロバイオティクスであり、糖質を代謝して乳酸を産生する代謝特徴を持つ。乳酸菌のプロバイオティクス効果としては、腸内細菌叢のバランスと回復、病原体に対する保護、免疫調節、および腸バリアの完全性の維持などがあり、産生された乳酸によって消化管内のｐＨが低下し、病原体コロニー形成を抑制することができる。その一方で、健康な家畜や人の排泄糞中から乳酸が検出されることは少なく、むしろ血中乳酸濃度が上昇すると乳酸アシドーシスを引き起こす可能性がある。血中乳酸濃度の上昇および乳酸アシドーシスは重度の敗血症と関連し、重大な罹患率および死亡率と関連することが知られている。通常、消化管内で生成された乳酸は乳酸資化菌によって急速に代謝され、酢酸、プロピオン酸、酪酸などの短鎖脂肪酸 （Ｓｈｏｒｔ－ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ： ＳＣＦＡ） に変換されるが、乳酸産生菌と乳酸資化菌の間で非同期発酵が起こると、乳酸アシドーシスが誘発される可能性がある。
【0004】
一方、好熱菌発酵産物は未利用の海産資源を７０～８０℃の高温好気下で発酵させた飼料であり、すでに幅広い農業分野で利用され、有益な効果が確認されている。中でも好熱菌発酵産物を給与したブタにおいては、死産率の低下や仔豚の成長促進 、肉質の向上といった効果が認められている。この好熱菌発酵産物を給与したブタ排泄糞中では有意な乳酸含量の低下が見られることから乳酸代謝に関わる腸内細菌叢の変化が示唆された。そこで、ノンメタポークを飼育している農場においてブタの腸内細菌叢の変化を調べたところ、優占乳酸菌種がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕＳ．ａｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓからＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓへと変化すると同時に乳酸資化菌であるＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉが増えていることが確認された。
【0005】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌は様々な動物種に対するプロバイオティクスとして広く利用されている乳酸菌で、これまでに２００菌種以上が分類されてきた。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌は系統的に多様であり、グルコースの代謝方法、運動性など生理・生化学的特徴も菌種間で大きく異なることが報告されている。中でも、今回優先乳酸菌種となったＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓはブタの腸内細菌叢を代表する菌種であり、腸管上皮細胞に付着し病原体を抑制する効果があること、肥満を改善するといったプロバイオティクス効果を持つことが示されている。また、乳酸資化菌はヒト糞便中から単離されたものとして、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ ｃａｃｃａｅやＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｌｉｉが挙げられ、乳酸を酪酸に変換することが知られている。一方で、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉはブタ排泄糞中から主要な乳酸資化菌として単離されており、グルコースよりも乳酸を優先的に代謝することが知られている。
【0006】
先行研究では、ブタの盲腸ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいて乳酸菌によって生成された乳酸が、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉによってｎ－酪酸に変換されること、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ と乳酸産生菌と共培養するとルーメンアシドーシスモデルにおける有機酸蓄積が乳酸から酪酸に移行し、ルーメンのｐＨ が回復することが報告されている。この事から、好熱菌発酵産物給与による糞便中乳酸含量の低下はＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの関与が考えられる。また、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉは乳酸から酢酸・プロピオン酸・酪酸・吉草酸といったＳＣＦＡを産生することが知られている。ＳＣＦＡは宿主に良い生理作用を示すことが知られており、酢酸は体脂肪蓄積の抑制、肝脂肪症の抑制、プロピオン酸は動脈硬化の抑制、酪酸は高血糖の正常化、急性膵炎とそれに伴う腸管障害の改善、腸管マクロファージの制御、吉草酸は神経炎症の抑制といった効果を示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】特開２０２０―１９１７９３
【特許文献2】特表２０２２―５５３０１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
そこで、本発明は、乳酸菌と乳酸資化菌の相互作用によりＳＣＦＡまたは乳酸の産生方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【0009】
上記課題を解決するために、一段階目として、乳酸資化菌ＭｅｇａｓｐｈａｅｒａｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株を培養し、二段階目として、前記一段階目の培養で得られた培養上清を用いて乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属を培養することを特徴としたことにある。
【0010】
前記乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の菌種は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株またはＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉであることを特徴としたことにある。
【0011】
一段階目として、乳酸資化菌ＭｅｇａｓｐｈａｅｒａｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株を培養し、二段階目として、前記一段階目の培養で得られた培養上清を熱処理し、前記熱処理後の培養上清を用いて乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属を培養することを特徴としたことにある。
【0012】
前記乳酸菌の菌種は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株であることを特徴としたことにある。
【発明の効果】
【0013】
また、本発明によれば、乳酸資化菌Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の産生する分子が乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属と相互作用し、乳酸またはＳＣＦＡの産生を促進することができる。
【0014】
また、本発明によれば、乳酸菌の菌種をＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株とすることで、乳酸またはＳＣＦＡの産生の促進効果を高めることができる。
【0015】
また、本発明によれば、乳酸資化菌Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の産生する分子を熱処理後、乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属と相互作用することで、乳酸またはＳＣＦＡの産生を促進することができる。
【0016】
また、本発明によれば、乳酸菌の菌種をＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株とすることで、乳酸またはＳＣＦＡの産生の促進効果を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】ｐＨの低下を緩和した場合のＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株による乳酸産生量への影響（ｎ＝４） ＊ｐ＜０．０５を示す図である。
【図2】各種濃度のＤＬ－乳酸含有１／２ＧＡＭ液体培地中でのＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の乳酸産生量（ｎ＝４）を示す図である。
【図3】（ａ）Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地におけるＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株２４時間培養後の有機酸濃度（ｎ＝４）を示す図である。（ｂ）Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の培養上清を用いた二段階培養におけるＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの乳酸産生量、ＯＤ、生菌数（ｎ＝４） ＃ｐ＜０．１を示す図である。
【図4】（ａ）Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地上でのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ Ｙ２株のＯＤ、ｐＨ、有機酸濃度の経時的変化を示す図である。（ｂ）Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の各培養時間の培養上清を添加したＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株二段階培養後のＯＤ、ｐＨ、有機酸濃度（ｎ＝４） ＊＊ｐ＜０．００１を示す図である。
【図5】（ａ）Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地でのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ Ｙ２株１８時間培養後ＯＤ、有機酸濃度（ｂ）Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清に対する熱処理の有無がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株二段階培養後のＯＤ、ｐＨ、乳酸産生量に与える影響（ｎ＝４） ＃ｐ＜０．１、＊ｐ＜０．０５を示す図である。
【図6】（ａ）ＤＬ－乳酸液体培地上のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ Ｙ２株１８時間培養後のＯＤ、有機酸濃度（ｂ）Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓによる二段階目の培養試験後の乳酸濃度（ｎ＝４） ＊＊ｐ＜０．００１（ｃ）Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ Ｙ２株培養上清の添加により増加したＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの乳酸産生量に占めるＤ／Ｌ乳酸異性体の割合（二段階目として２×Ｂａｓｉｃ＋デンプン改変培地を用いた）（ｎ＝４）。（ｄ）Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ Ｙ２株培養上清の添加により増加したＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの乳酸産生量に占めるＤ／Ｌ乳酸異性体の割合（二段階目として２×Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ改変培地を用いた） を示す図である。
【図7】（ａ）Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地上のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ Ｙ２株１８時間培養後有機酸濃度（ｂ）Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清を用いた各種乳酸菌の二段階培養後の乳酸産生量 ＊ｐ＜０．０５を示す図である。
【図8】（ａ）ＤＬ－乳酸液体培地上のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ Ｙ２株１８時間培養後ＯＤ、有機酸濃度（ｂ）Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ Ｙ２株培養上清を用いたＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉによる二段階培養後の乳酸産生量（ｎ＝３） ＊ｐ＜０．０５を示す図である。
【図9】（ａ）Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ液体培地上でＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株を２４時間培養した際の有機酸濃度（ｎ＝３）（ｂ）Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ液体培地をＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の一段階目の培養に使用した際のＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株二段階培養後ＯＤ、ｐＨ、乳酸産生量（ｎ＝３）を示す図である。
【図10】（ａ）ＤＬ－乳酸・Ｌ－乳酸液体培地を用いたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ Ｙ２株１８時間培養後ＯＤ、有機酸濃度（ｂ）一段階目の培養に異なる組成の乳酸異性体を用いたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清を用いたＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓにおける二段階培養（ｎ＝４）を示す図である。
【図11】（ａ）ＤＬ－乳酸液体培地上のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ Ｙ２株１８時間培養後ＯＤ、有機酸濃度（ｂ）Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ Ｙ２株培養上清を用いたＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の二段階培養（培地にＧＡＭ液体培地を用いた）対象区（ｎ＝３）、DL―乳酸、L―乳酸（ｎ＝４）を示す図である。
【図12】（ａ）Ｂａｓｉｃ＋デンプン改変培地＋酢酸、Ｂａｓｉｃ＋デンプン改変培地＋プロピオン酸液体培地におけるＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株２４時間培養後のＯＤ、ｐＨ、乳酸濃度（ｎ＝３）（ｂ）Ｂａｓｉｃ＋デンプン改変培地＋酪酸、Ｂａｓｉｃ＋デンプン改変培地＋吉草酸液体培地におけるＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株２４時間培養後のＯＤ、ｐＨ、乳酸濃度（ｎ＝３）を示す図である。
【図13】（ａ）Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地におけるＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株２４時間培養後の有機酸濃度（ｂ）Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の凍結乾燥培養上清を用いた二段階培養における乳酸産生量（ｎ＝４）を示す図である。
【図14】（ａ）ＤＬ－乳酸液体培地上のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ Ｙ２株１８時間培養後ＯＤ、有機酸濃度（ｂ）Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ Ｙ２株培養上清から調製したアセトン沈殿物を用いたＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ二段階培養による乳酸産生量（ｎ＝３） を示す図である。
【図15】（ａ）Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地上のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ Ｙ２株１８時間培養後有機酸濃度（ｂ）Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清に対する限外濾過処理の有無と、二段階培養後のＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株乳酸産生量（ｎ＝４）＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１（対照区ではＢａｓｉｃ液体培地を、試験区ではＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地で培養したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清を二段階目に添加している。）を示す図である。
【図16】結果の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【0018】
以下、段落［００１９］～［０１０４］まで、実験方法、実験手法について述べる。
【0019】
１－１． 使用した菌株
本実験では、好熱菌発酵産物給与区のブタ糞便サンプルより単離された Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２ 株、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ ４－４ 株、好熱菌発酵産物非給与区のブタ糞便サンプルより単離された Ｓ．ａｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ １－１２ 株、好熱菌発酵産物非給与区の採卵鶏糞便サンプルから単離されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｅｌｉｆｒａｖｕｓＣ３－３８株、および好熱菌発酵産物給与区の採卵鶏糞便サンプルから単離されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ を用いて、実験を行った。
本実験では、好熱菌発酵産物給与区のブタ糞便サンプルより単離された Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２ 株、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ ４－４ 株、好熱菌発酵産物非給与区のブタ糞便サンプルより単離された Ｓ．ａｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ １－１２ 株、好熱菌発酵産物非給与区の採卵鶏糞便サンプルから単離されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｅｌｉｆｒａｖｕｓＣ３－３８株、および好熱菌発酵産物給与区の採卵鶏糞便サンプルから単離されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ を用いて、実験を行った。
【0020】
１－２． 培地組成
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ、Ｓ．ａｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｅ． ｃａｓｅｌｉｆｒａｖｕｓ、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉをそれぞれ培養するために以下の培地を作成した。
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ、Ｓ．ａｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｅ． ｃａｓｅｌｉｆｒａｖｕｓ、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉをそれぞれ培養するために以下の培地を作成した。
【0021】
（１）１／２ＧＡＭ培地
一般嫌気性菌培養用のＧＡＭブイヨン （日水製薬株式）を規定量の半分用いた。固体培地を作成する場合は、１．５％ （ｗ／ｖ） ａｇａｒを添加した。その後、１２１℃、１５分のオートクレーブ滅菌を行った。
一般嫌気性菌培養用のＧＡＭブイヨン （日水製薬株式）を規定量の半分用いた。固体培地を作成する場合は、１．５％ （ｗ／ｖ） ａｇａｒを添加した。その後、１２１℃、１５分のオートクレーブ滅菌を行った。
【0022】
（２）ＧＡＭ培地
一般嫌気性菌培養用のＧＡＭブイヨン （日水製薬株式）を規定量用いた。固体培地を作成する場合は、１．５ ％ （ｗ／ｖ） ａｇａｒを添加した。その後、１２１℃、１５分のオートクレーブ滅菌を行った。
一般嫌気性菌培養用のＧＡＭブイヨン （日水製薬株式）を規定量用いた。固体培地を作成する場合は、１．５ ％ （ｗ／ｖ） ａｇａｒを添加した。その後、１２１℃、１５分のオートクレーブ滅菌を行った。
【0023】
（３）Ｂａｓｉｃ培地
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの培養実験を行った論文を参考に、その組成を改変し作成した。この培地は実験の目的に応じて炭素源を変更できるように、基本組成には炭素源を含まない。
組成を以下に示す。
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの培養実験を行った論文を参考に、その組成を改変し作成した。この培地は実験の目的に応じて炭素源を変更できるように、基本組成には炭素源を含まない。
組成を以下に示す。
【0024】
【表1】
【0025】
（４）Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸培地
Ｂａｓｉｃ培地に３．２５ｍＬ／ＬのＤＬ－乳酸（和光純薬工業株式会社）を添加し、ＫＯＨを用いてｐＨ＝７．０に調整した後、１２１℃、１５ｍｉｎオートクレーブ滅菌を行った。
Ｂａｓｉｃ培地に３．２５ｍＬ／ＬのＤＬ－乳酸（和光純薬工業株式会社）を添加し、ＫＯＨを用いてｐＨ＝７．０に調整した後、１２１℃、１５ｍｉｎオートクレーブ滅菌を行った。
【0026】
（５）Ｂａｓｉｃ＋Ｌ－乳酸培地
Ｂａｓｉｃ培地に３．２５ｍＬ／ＬのＬ－乳酸（和光純薬工業株式会社）を添加し、ＫＯＨを用いてｐＨ＝７．０に調整した後、１２１℃、１５ｍｉｎオートクレーブ滅菌を行った。
Ｂａｓｉｃ培地に３．２５ｍＬ／ＬのＬ－乳酸（和光純薬工業株式会社）を添加し、ＫＯＨを用いてｐＨ＝７．０に調整した後、１２１℃、１５ｍｉｎオートクレーブ滅菌を行った。
【0027】
（６）Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ培地
Ｂａｓｉｃ培地にＧｌｕｃｏｓｅ ３．０ｇ／Ｌを添加し、ＫＯＨを用いてｐＨ＝７．０に調整した後、１２１℃、１５ｍｉｎオートクレーブ滅菌を行った。
Ｂａｓｉｃ培地にＧｌｕｃｏｓｅ ３．０ｇ／Ｌを添加し、ＫＯＨを用いてｐＨ＝７．０に調整した後、１２１℃、１５ｍｉｎオートクレーブ滅菌を行った。
【0028】
（７）Ｂａｓｉｃ＋デンプン改変培地
炭素源を含まないＢａｓｉｃ培地に唯一の炭素源としてデンプン、ビタミンを供給する肝臓エキス、各細菌の培養による培地ｐＨの低下を防ぐためにＣａＣＯ３を加えた培地を作成した。具体的にはＧＡＭブイヨン（日水製薬株式会社）を参考に、デンプンの量を設定した。組成を以下に示す。
炭素源を含まないＢａｓｉｃ培地に唯一の炭素源としてデンプン、ビタミンを供給する肝臓エキス、各細菌の培養による培地ｐＨの低下を防ぐためにＣａＣＯ３を加えた培地を作成した。具体的にはＧＡＭブイヨン（日水製薬株式会社）を参考に、デンプンの量を設定した。組成を以下に示す。
【0029】
【表2】
【0030】
（８）Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ改変培地
炭素源を含まないＢａｓｉｃ培地に唯一の炭素源としてＧｌｕｃｏｓｅ、ビタミンを供給する肝臓エキス、各細菌の培養による培地ｐＨの低下を防ぐためにＣａＣＯ３を加えた培地を作成した。具体的にはＧＡＭブイヨン（日水製薬株式会社）を参考に、Ｇｌｕｃｏｓｅの量を設定した。組成を以下に示す。
炭素源を含まないＢａｓｉｃ培地に唯一の炭素源としてＧｌｕｃｏｓｅ、ビタミンを供給する肝臓エキス、各細菌の培養による培地ｐＨの低下を防ぐためにＣａＣＯ３を加えた培地を作成した。具体的にはＧＡＭブイヨン（日水製薬株式会社）を参考に、Ｇｌｕｃｏｓｅの量を設定した。組成を以下に示す。
【0031】
【表3】
【0032】
（９）２×Ｂａｓｉｃ＋デンプン改変培地
二段階培養で乳酸菌を培養する際に、炭素源含有量を同等にするために、Ｂａｓｉｃ＋デンプン改変培地のうちデンプン、肝臓エキス、ＣａＣＯ３を２倍量添加した培地を作成した。
二段階培養で乳酸菌を培養する際に、炭素源含有量を同等にするために、Ｂａｓｉｃ＋デンプン改変培地のうちデンプン、肝臓エキス、ＣａＣＯ３を２倍量添加した培地を作成した。
【0033】
（１０）２×Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ改変培地
二段階培養で乳酸菌を培養する際に、炭素源含有量を同等にするために、Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ改変培地のうちＧｌｕｃｏｓｅ、肝臓エキス、ＣａＣＯ３を２倍量添加した培地を作成した。
二段階培養で乳酸菌を培養する際に、炭素源含有量を同等にするために、Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ改変培地のうちＧｌｕｃｏｓｅ、肝臓エキス、ＣａＣＯ３を２倍量添加した培地を作成した。
【0034】
１－３． 有機酸産生能試験
本実験における、各代表菌株の単独培養を以下の手順で行った。なお、嫌気条件での培養は、固体培養の際はシャーレと共にアネロパウチ・ケンキ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉｇａｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を専用のビニール袋に入れて嫌気状態とした。液体培養の際には２．５リットル角型ジャー（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉｇａｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて、培養容器と共にアネロパック・ケンキ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉｇａｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を入れて嫌気条件とした。なお、実験（１）、（３）、（９）、 （１２）においては三角フラスコを培養容器として使用し、実験（２）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（１０）、（１１）、（１３）、（１４）、（１５）では２４ Ｗｅｌｌプレート（ＦＡＬＣＯＮ ＲＥＦ３５３０４７）を使用した。
本実験における、各代表菌株の単独培養を以下の手順で行った。なお、嫌気条件での培養は、固体培養の際はシャーレと共にアネロパウチ・ケンキ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉｇａｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を専用のビニール袋に入れて嫌気状態とした。液体培養の際には２．５リットル角型ジャー（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉｇａｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて、培養容器と共にアネロパック・ケンキ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉｇａｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を入れて嫌気条件とした。なお、実験（１）、（３）、（９）、 （１２）においては三角フラスコを培養容器として使用し、実験（２）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（１０）、（１１）、（１３）、（１４）、（１５）では２４ Ｗｅｌｌプレート（ＦＡＬＣＯＮ ＲＥＦ３５３０４７）を使用した。
【0035】
以下に今後の実験において内容が重複する手法をまとめて記載する。
【0036】
～実験手法（１）：各嫌気性細菌のプレ培養液の調製～
各菌株を１／２ＧＡＭ固体培地上で３７℃、嫌気条件下で一晩培養した。次に、プレ培養として、ＧＡＭ液体培地を作成し、乾熱滅菌した５０ｍＬ三角フラスコに２０ｍＬずつ分注した。固体培地上から白金耳を用いて各菌株を植菌し、３７℃、８０ｒｐｍ嫌気条件下で２４時間振盪培養を行った。
各菌株を１／２ＧＡＭ固体培地上で３７℃、嫌気条件下で一晩培養した。次に、プレ培養として、ＧＡＭ液体培地を作成し、乾熱滅菌した５０ｍＬ三角フラスコに２０ｍＬずつ分注した。固体培地上から白金耳を用いて各菌株を植菌し、３７℃、８０ｒｐｍ嫌気条件下で２４時間振盪培養を行った。
【0037】
～実験手法（２）：三角フラスコにおける各代表菌株の本培養～
乾熱滅菌した５０ｍＬ三角フラスコに１２１℃、１５ｍｉｎでオートクレーブ滅菌を行った液体培地を２０ｍＬずつ分注し、実験手法（１）の手順で作成した各菌株のプレ培養液を培地の１／１００量となる２００μＬ接種した。
乾熱滅菌した５０ｍＬ三角フラスコに１２１℃、１５ｍｉｎでオートクレーブ滅菌を行った液体培地を２０ｍＬずつ分注し、実験手法（１）の手順で作成した各菌株のプレ培養液を培地の１／１００量となる２００μＬ接種した。
【0038】
～実験手法（３）：生菌数の測定～
菌体の増殖をコロニー形成単位（ＣＦＵ）によって測定した。ＯＤでは菌種、および死菌と生菌の判別が不可能であるため、測定を行った。
手順を以下に示す。
クリーンベンチ内で、回収した培養液を滅菌水で１０２～１０５倍に希釈した。この希釈液１００μＬを１／２ＧＡＭ固体培地に塗布した。その後３７℃、嫌気条件下で２４時間培養し、コロニー数を測定した。１ｍＬあたりのＣＦＵの算出には以下の式を用いた。
菌体の増殖をコロニー形成単位（ＣＦＵ）によって測定した。ＯＤでは菌種、および死菌と生菌の判別が不可能であるため、測定を行った。
手順を以下に示す。
クリーンベンチ内で、回収した培養液を滅菌水で１０２～１０５倍に希釈した。この希釈液１００μＬを１／２ＧＡＭ固体培地に塗布した。その後３７℃、嫌気条件下で２４時間培養し、コロニー数を測定した。１ｍＬあたりのＣＦＵの算出には以下の式を用いた。
【0039】
ＣＦＵ／ｍＬ ＝（コロニー数×希釈倍率）／ （プレーティングした溶液ｍＬ）
【0040】
～実験手法（４）：二段階培養試験における一段階目の培養上清回収～
一段階目の培養上清をＫＯＨでｐＨ ７．０に調整し、培養液を１０，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃で遠心し、菌体を沈殿させた。さらに遠心培養上清をクリーベンチ内で０．２２μシリンジフィルター（ＲＪＰ３２２２ＳＨ，ＡＳ ＯＮＥ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）を用いて濾過することで菌体を除去し、一段階目の培養上清とした。
一段階目の培養上清をＫＯＨでｐＨ ７．０に調整し、培養液を１０，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃で遠心し、菌体を沈殿させた。さらに遠心培養上清をクリーベンチ内で０．２２μシリンジフィルター（ＲＪＰ３２２２ＳＨ，ＡＳ ＯＮＥ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）を用いて濾過することで菌体を除去し、一段階目の培養上清とした。
【0041】
〈実験（１）：Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓに対するｐＨの乳酸生成阻害試験〉
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉとの相互作用によりＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ乳酸生成促進効果が生じるが、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉによる乳酸資化の結果、ｐＨ低下が抑制されたことによるものか確認するためにＧＡＭ培地に対して２ｇ／ＬのＣａＣＯ３を添加した液体培地と添加しない液体培地上でＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの単独培養を行った。
実験手法（１）の手順でＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株をプレ培養後、ＧＡＭ＋ＣａＣＯ３液体培地もしくはＧＡＭ液体培地を用いて実験手法（２）の手順でＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株プレ培養液をｎ＝４で接種し、３７℃、８０ｒｐｍ嫌気条件下で振盪培養、２４時間後に菌懸濁液ＯＤ測定を行った。その後、培養上清を回収してｐＨ、有機酸測定に用いた。
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉとの相互作用によりＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ乳酸生成促進効果が生じるが、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉによる乳酸資化の結果、ｐＨ低下が抑制されたことによるものか確認するためにＧＡＭ培地に対して２ｇ／ＬのＣａＣＯ３を添加した液体培地と添加しない液体培地上でＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの単独培養を行った。
実験手法（１）の手順でＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株をプレ培養後、ＧＡＭ＋ＣａＣＯ３液体培地もしくはＧＡＭ液体培地を用いて実験手法（２）の手順でＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株プレ培養液をｎ＝４で接種し、３７℃、８０ｒｐｍ嫌気条件下で振盪培養、２４時間後に菌懸濁液ＯＤ測定を行った。その後、培養上清を回収してｐＨ、有機酸測定に用いた。
【0042】
〈実験（２）：Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓに対するＤＬ－乳酸による乳酸生成阻害試験〉
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉとの相互作用によりＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ乳酸生成促進効果が生じるが、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの乳酸資化による培養液中の乳酸濃度低下によるものか確認するために、１／２ＧＡＭ液体培地にＤＬ－乳酸を各濃度で添加し、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの単独培養を行った。
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉとの相互作用によりＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ乳酸生成促進効果が生じるが、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの乳酸資化による培養液中の乳酸濃度低下によるものか確認するために、１／２ＧＡＭ液体培地にＤＬ－乳酸を各濃度で添加し、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの単独培養を行った。
【0043】
実験手法（１）の手順でＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株をプレ培養した。続いて、１／２ＧＡＭ＋ＤＬ－乳酸液体培地を作成した。ＤＬ－乳酸濃度は、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、１１０ｍＭとなる様に添加し、ＫＯＨを用いてｐＨ７．０に調整、滅菌済み２４ Ｗｅｌｌプレート（ＦＡＬＣＯＮ ＲＥＦ３５３０４７）に２ｍＬずつ分注した。ここで１／２ＧＡＭ液体培地を用いて実験手法（１）の手順でＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓプレ培養液を作成した。Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓプレ培養液をｎ＝４で培地の１／１００量となるように２０ μＬ接種し、３７℃、８０ｒｐｍ嫌気条件下で振盪培養し２４時間後に菌懸濁液ＯＤ測定を行った。その後、培養上清を回収して有機酸測定に用いた。
【0044】
〈実験（３）： Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ の培養上清を用いた二段階培養試験〉
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉが産生する分子がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの乳酸産生を促進するか確認するために、一段階目としてＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の２４時間培養を行い、その培養上清を用いて二段階目としてＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の２４時間培養を行った。その後、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ培養上清の有機酸濃度を測定した。
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉが産生する分子がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの乳酸産生を促進するか確認するために、一段階目としてＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の２４時間培養を行い、その培養上清を用いて二段階目としてＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の２４時間培養を行った。その後、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ培養上清の有機酸濃度を測定した。
【0045】
実験手法（１）の手順でＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株をプレ培養後、Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸培地を用いて、実験手法（２）の手順でＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株プレ培養液を接種、３７℃、８０ｒｐｍ嫌気条件下で振盪培養し、２４時間後に菌懸濁液のＯＤを測定、培養上清の有機酸測定を行った。
【0046】
続いて、得られたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清を実験手法（４）の手順で調製した。この調整済みＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清１０ｍＬと２×Ｂａｓｉｃ＋デンプン改変培地１０ｍＬを、乾熱滅菌した５０ｍＬ三角フラスコにトータル２０ｍＬずつ分注した。分注後、１／２ＧＡＭ液体培地を用いて実験手法（１）の手順でＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓプレ培養液を作成し、ｎ＝４で培地の１／１００量となるように２００μＬ接種した。３７℃、８０ｒｐｍ嫌気条件下で振盪培養し２４時間後に菌懸濁液のＯＤ測定を実験手法（３）の手順で生菌数の測定を行った。また、培養上清のｐＨ、有機酸測定を行った。
【0047】
また、対照区として一段階目に使用したＢａｓｉｃ液体培地と２×Ｂａｓｉｃ＋デンプン改変培地を等量混合した培養液を用意し、同様の方法でＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株プレ培養液を接種、各測定に用いた。
【0048】
〈実験（４）：Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清の経時変化〉
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清のＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの乳酸生成促進効果における、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの培養時間の影響を明らかにするために、一段階目としてＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清を各時間で回収し、その培養上清を用いて二段階目としてＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の２４時間培養を行った。その後、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株培養上清の有機酸濃度を測定した。
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清のＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの乳酸生成促進効果における、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの培養時間の影響を明らかにするために、一段階目としてＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清を各時間で回収し、その培養上清を用いて二段階目としてＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の２４時間培養を行った。その後、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株培養上清の有機酸濃度を測定した。
【0049】
実験手法（１）の手順でＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株をプレ培養後、Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ乳酸液体培地を用いて、実験手法（２）の手順で、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株プレ培養液を接種、その後３７℃、８０ｒｐｍ嫌気条件下で６時間、１２時間、１８時間、２４時間振盪培養した。各時間に菌懸濁液のＯＤを測定、培養上清の有機酸測定を行った。
【0050】
続いて、得られたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清を実験手法（４）の手順で調整した。この調整済みＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清７ｍＬと２×Ｂａｓｉｃ＋デンプン改変培地 ７ｍＬを、乾熱滅菌した５０ｍＬ三角フラスコにトータル１４ｍＬずつ入れ、混合した。この培養液を滅菌済み２４ Ｗｅｌｌプレート（ＦＡＬＣＯＮ ＲＥＦ３５３０４７）に２ｍＬずつ分注した。ここで１／２ＧＡＭ液体培地を用いて実験手法（１）の手順でＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓプレ培養液を作成し、ｎ＝４で培地の１／１００量となるように２０ μＬ接種した。３７℃、８０ｒｐｍ嫌気条件下で振盪培養し、２４時間後に菌懸濁液のＯＤを測定、培養上清の有機酸測定を行った。
【0051】
また、対照として一段目に使用したＢａｓｉｃ液体培地と２×Ｂａｓｉｃ＋デンプン改変培地を等量混合した培養液を用意し、同様の方法でＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株を接種、各測定に用いた。
【0052】
〈実験（５）：Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清の耐熱性試験〉
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの乳酸産生を促進することが確認された。そのため、この乳酸産生促進成分は耐熱性があるのか確認するために本実験を行った。
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの乳酸産生を促進することが確認された。そのため、この乳酸産生促進成分は耐熱性があるのか確認するために本実験を行った。
【0053】
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株を実験手法（１）の手順でプレ培養した。その後、Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸培地を用いて、実験手法（２）手順でＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株プレ培養液をｎ＝４で接種し、３７℃、８０ｒｐｍ、嫌気条件下で１８時間振盪培養後に菌懸濁液のＯＤを測定、培養上清の有機酸測定を行った。
【0054】
得られたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清を以下に示す３つの手法で処理し、二段階培養に使用した。
１．オートクレーブ処理を行わないＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清
得られたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清を実験手法（４）の手順で、菌体除去した。
２．菌体除去後にオートクレーブ処理を行うＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清
実験手法（４）の手順で菌体除去したのち、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清を１２１℃、１５ｍｉｎでオートクレーブ処理した。
３． 菌体除去前にオートクレーブ処理を行うＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清
菌体除去する前に１２１℃、１５ｍｉｎでオートクレーブ処理し、その後実験手法（４）の手順で菌体除去した。
１．オートクレーブ処理を行わないＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清
得られたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清を実験手法（４）の手順で、菌体除去した。
２．菌体除去後にオートクレーブ処理を行うＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清
実験手法（４）の手順で菌体除去したのち、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清を１２１℃、１５ｍｉｎでオートクレーブ処理した。
３． 菌体除去前にオートクレーブ処理を行うＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清
菌体除去する前に１２１℃、１５ｍｉｎでオートクレーブ処理し、その後実験手法（４）の手順で菌体除去した。
【0055】
このＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清７ｍＬと２×Ｂａｓｉｃ＋デンプン改変培地７ｍＬを、乾熱滅菌した５０ｍＬ三角フラスコにトータル１４ｍＬずつ入れて混合した。この培養液を滅菌済み２４ Ｗｅｌｌプレート（ＦＡＬＣＯＮ ＲＥＦ３５３０４７）に２ｍＬずつ分注した。ここで１／２ＧＡＭ液体培地を用いて実験手法（１）の手順でＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓプレ培養液を作成し、ｎ＝４で培地の１／１００量となるように２０μＬ接種した。３７℃、８０ｒｐｍ嫌気条件下で振盪培養し、２４時間後に菌懸濁液のＯＤを測定、培養上清の有機酸測定を行った。
【0056】
また、対照として一段目に使用したＢａｓｉｃ液体培地と２×Ｂａｓｉｃ＋デンプン改変培地を等量混合した培養液を用意し、同様の方法でＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株を接種、各測定に用いた。
【0057】
〈実験（６）：Ｆ－キットを用いた乳酸異性体濃度の定量〉
実験（５）の結果から、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清を菌体込みでオートクレーブ処理を行ったのちに精製した培養上清によりＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の乳酸産生促進効果が増強されることが明らかとなった。そのため、本実験では、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の培養上清によって乳酸産生が促進されたＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株培養上清と、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の培養上清を含まない対照となるＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ培養上清中の乳酸異性体濃度の違いを調べた。
実験（５）の結果から、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清を菌体込みでオートクレーブ処理を行ったのちに精製した培養上清によりＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の乳酸産生促進効果が増強されることが明らかとなった。そのため、本実験では、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の培養上清によって乳酸産生が促進されたＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株培養上清と、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の培養上清を含まない対照となるＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ培養上清中の乳酸異性体濃度の違いを調べた。
【0058】
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株を実験手法（１）の手順でプレ培養した。Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ乳酸液体培地を用いて実験手法（２）の手順でＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株プレ培養液を培地の１／１００量となるよう２００μＬ接種した。その後、３７℃、８０ｒｐｍ、嫌気条件下で１８時間振盪培養した。その培養液の一部を回収し、ＯＤと有機酸を測定した。
【0059】
続いて、得られたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清の菌体除去を行う前に、１２１℃、１５ｍｉｎでオートクレーブにかけ、その後実験手法（４）の手順で菌体除去した。この調整済みＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清７ｍＬと２×Ｂａｓｉｃ＋デンプン改変培地７ｍＬを、乾熱滅菌した５０ｍＬ三角フラスコにトータル１４ｍＬずつ入れて混合した。この培養液を滅菌済み２４ Ｗｅｌｌプレート（ＦＡＬＣＯＮ ＲＥＦ３５３０４７）に２ｍＬずつ分注した。ここに１／２ＧＡＭ液体培地を用いて実験手法（１）の手順でプレ培養を行ったＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株をｎ＝４で培地の１／１００量となる２０μＬ接種した。その後３７℃、８０ｒｐｍ嫌気条件下で振盪培養し、２４時間後に菌懸濁液のＯＤを測定、培養上清の有機酸測定を行った。
【0060】
また、対照として一段目に使用したＢａｓｉｃ液体培地をオートクレーブ処理した溶液と２×Ｂａｓｉｃ＋デンプン改変培地を等量混合した培養液を用意し、二段階培養に使用した。
その後Ｆ－キットを用いて、乳酸異性体濃度の定量を行った。
その後Ｆ－キットを用いて、乳酸異性体濃度の定量を行った。
【0061】
また実験（７）において、２×Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ改変培地を用いた二段階培養後のＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の培養上清においてもＦ－キットを用いて、乳酸異性体濃度の測定を行った。
【0062】
Ｆ－キットによる乳酸異性体濃度の定量方法を以下に示す。
培養上清を８０℃、１５ｍｉｎでインキュベートした。また、４℃に保管していたＦ－キット付属溶液１を２０～２５℃に戻した。
以下の通りに溶液をセルに分注し、優しくピペッティングして混和した。
培養上清を８０℃、１５ｍｉｎでインキュベートした。また、４℃に保管していたＦ－キット付属溶液１を２０～２５℃に戻した。
以下の通りに溶液をセルに分注し、優しくピペッティングして混和した。
【0063】
【表4】
【0064】
５分間室温で静置した後、吸光度（３４０ｎｍ）を測定した。この値をＡ１とした。
溶液４を１０μＬ添加し、優しくピペッティングして混和した。３０分間室温に静置した後、吸光度（３４０ｎｍ）を測定した。この値をＡ２とした。
溶液５を１０μＬ添加し、やさしくピペッティングして混和した３０分間室温で静置した後、吸光度（３４０ｎｍ）を測定した。この値をＡ３とした。
ΔＡＤ－乳酸とΔＡＬ－乳酸の比を、Ｄ－乳酸とＬ－乳酸の濃度比として算出した。
ΔＡＤ－乳酸＝（Ａ２－Ａ１）試料 － （Ａ２－Ａ１）ブランク
ΔＡＬ－乳酸＝（Ａ３－Ａ２）試料 － （Ａ３－Ａ２）ブランク
溶液４を１０μＬ添加し、優しくピペッティングして混和した。３０分間室温に静置した後、吸光度（３４０ｎｍ）を測定した。この値をＡ２とした。
溶液５を１０μＬ添加し、やさしくピペッティングして混和した３０分間室温で静置した後、吸光度（３４０ｎｍ）を測定した。この値をＡ３とした。
ΔＡＤ－乳酸とΔＡＬ－乳酸の比を、Ｄ－乳酸とＬ－乳酸の濃度比として算出した。
ΔＡＤ－乳酸＝（Ａ２－Ａ１）試料 － （Ａ２－Ａ１）ブランク
ΔＡＬ－乳酸＝（Ａ３－Ａ２）試料 － （Ａ３－Ａ２）ブランク
【0065】
〈実験（７）：Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの培養上清を用いた各乳酸菌の二段階培養試験〉
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉが産生する分子がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ以外の腸内乳酸産生菌による乳酸産生を促進するか確認するために、一段階目としてＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の１８ 時間培養を行い、その培養上清を用いて二段階目としてＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株、Ｓ．ａｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ１－１２株およびＥ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ Ｃ３－３８株の２４時間培養を行った。その後Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ、Ｓ．ａｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ 培養上清の有機酸濃度を測定した。なお、本実験では二段階目の培養において唯一の炭素源がＧｌｕｃｏｓｅである２×Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ改変培地を使用している。これは、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓはデンプンを分解菌で、デンプンを糖源として利用することが可能であるが、Ｓ．ａｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓおよびＥ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓは、デンプンの資化性が低いためＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清の乳酸産生促進効果を確認することが難しいためである。
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉが産生する分子がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ以外の腸内乳酸産生菌による乳酸産生を促進するか確認するために、一段階目としてＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の１８ 時間培養を行い、その培養上清を用いて二段階目としてＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株、Ｓ．ａｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ１－１２株およびＥ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ Ｃ３－３８株の２４時間培養を行った。その後Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ、Ｓ．ａｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ 培養上清の有機酸濃度を測定した。なお、本実験では二段階目の培養において唯一の炭素源がＧｌｕｃｏｓｅである２×Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ改変培地を使用している。これは、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓはデンプンを分解菌で、デンプンを糖源として利用することが可能であるが、Ｓ．ａｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓおよびＥ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓは、デンプンの資化性が低いためＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清の乳酸産生促進効果を確認することが難しいためである。
【0066】
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株を実験手法（１）の手順でプレ培養した。Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ乳酸液体培地を用いて実験手法（２）の手順でＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株プレ培養液を培地の１／１００量となるよう２００μＬ接種した。その後、３７℃、８０ｒｐｍ、嫌気条件下で１８時間振盪培養した。その培養液の一部を回収し、ＯＤと有機酸を測定した。
【0067】
続いて、得られたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清の菌体除去を行う前に、１２１℃、１５ｍｉｎでオートクレーブにかけ、その後実験手法（４）の手順で菌体除去した。この調整済みＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清７ｍＬと２×Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ改変培地７ｍＬを、乾熱滅菌した５０ｍＬ三角フラスコにトータル１４ｍＬずつ入れて混合した。この培養液を滅菌済み２４ Ｗｅｌｌプレート（ＦＡＬＣＯＮ ＲＥＦ３５３０４７）に２ｍＬずつ分注した。ここに１／２ＧＡＭ液体培地を用いて実験手法（１）の手順でプレ培養を行ったＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株、Ｓ．ａｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ１－１２株またはＥ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ Ｃ３－３８株ｎ＝３で培地の１／１００量となる２０μＬ接種した。その後３７℃、８０ｒｐｍ嫌気条件下で振盪培養し、２４時間後に菌懸濁液のＯＤを測定、培養上清の有機酸測定を行った。
【0068】
また、対照として一段目に使用したＢａｓｉｃ液体培地と２×Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ改変培地を等量混合した培養液を用意し、二段階培養に使用した。
【0069】
〈実験（８）：Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの培養上清を用いたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の二段階培養試験〉
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉが産生する分子がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ以外のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属による乳酸産生を促進するか確認するために、好熱菌発酵産物を給与した採卵鶏の排泄糞中において検出数が多かったＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉを用いてＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの培養上清を用いた二段階培養試験を行った。
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉが産生する分子がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ以外のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属による乳酸産生を促進するか確認するために、好熱菌発酵産物を給与した採卵鶏の排泄糞中において検出数が多かったＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉを用いてＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの培養上清を用いた二段階培養試験を行った。
【0070】
一段階目としてＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の１８ 時間培養を行い、その培養上清を用いて二段階目としてＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉの２４時間培養を行った。その後Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ培養上清の有機酸濃度を測定した。なお、本実験では二段階目の培養において唯一の炭素源がＧｌｕｃｏｓｅである２×Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ改変培地を使用している。これは、実験（７）において２×Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ改変培地を使用した際に、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓのより顕著な乳酸産生促進効果が確認されたためである。
【0071】
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株を実験手法（１）の手順でプレ培養した。Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ乳酸液体培地を用いて実験手法（２）の手順でＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株プレ培養液を培地の１／１００量となるよう２００μＬ接種した。その後、３７℃、８０ｒｐｍ、嫌気条件下で１８ 時間振盪培養した。その培養液の一部を回収し、ＯＤと有機酸を測定した。
【0072】
続いて、得られたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清の菌体除去を行う前に、１２１℃、１５ｍｉｎでオートクレーブにかけ、その後実験手法（４）の手順で菌体除去した。この調製済みＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清７ｍＬと２×Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ改変培地７ｍＬを、乾熱滅菌した５０ｍＬ三角フラスコにトータル１４ｍＬずつ入れて混合した。この培養液を滅菌済み２４ Ｗｅｌｌプレート（ＦＡＬＣＯＮ ＲＥＦ３５３０４７）に１ｍＬずつ分注した。ここに１／２ＧＡＭ液体培地を用いて実験手法（１）の手順でプレ培養を行ったＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉをｎ＝３で培地の１／１００量となる１０μＬ接種した。その後３７℃、８０ｒｐｍ嫌気条件下で振盪培養し、２４時間後に菌懸濁液のＯＤを測定、培養上清の有機酸測定を行った。なおＯＤは菌懸濁液をＰＣＲチューブに３０μＬ分注したのち、吸光度計Ｐｉｃｏｅｘｐｌｏｒｅｒを用いて測定しており、波長はＯＤ＝６１５である。
【0073】
また、対照として一段目に使用したＢａｓｉｃ液体培地と２×Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ改変培地を等量混合した培養液を用意し、二段階培養に使用した。
【0074】
〈実験（９）：Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ液体培地Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清による二段階培養試験〉
Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地で回収したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清によるＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの乳酸産生促進が確認されたことから、異なる炭素源においてもＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉが乳酸促進物質を放出することができるのか確認するためにＢａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ液体培地によるＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清を用いて二段階培養試験を行った。
Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地で回収したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清によるＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの乳酸産生促進が確認されたことから、異なる炭素源においてもＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉが乳酸促進物質を放出することができるのか確認するためにＢａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ液体培地によるＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清を用いて二段階培養試験を行った。
【0075】
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株を実験手法（１）の手順でプレ培養後、Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ液体培地を用いて実験手法（２）の手順で、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株のプレ培養液を培地の１／１００量となるように２００μＬ接種した。その後、３７℃、８０ｒｐｍ、嫌気条件下で２４時間振盪培養した。
【0076】
その培養液の一部を回収し、ＯＤと有機酸を測定した。続いて、得られたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清を実験手法（４）の手順で菌体除去したのち、この調整済みＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清１０ｍＬと２×Ｂａｓｉｃ＋デンプン改変培地１０ｍＬを、ｎ＝３で乾熱滅菌した５０ｍｌ三角フラスコにトータル２０ｍＬずつ分注した。ここに１／２ＧＡＭ液体培地を用いて実験手法（１）の手順でプレ培養したＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株をｎ＝３で培地の１／１００量となるように２００μＬ 接種した。その後３７℃、８０ｒｐｍ嫌気条件下で振盪培養し、２４時間後に菌懸濁液のＯＤを測定、培養上清の有機酸測定を行った。
【0077】
また、対照として一段目に使用したＢａｓｉｃ液体培地と２×Ｂａｓｉｃ＋デンプン改変培地を等量混合した培養液を用意し、二段階培養試験に用いた。
【0078】
〈実験（１０）：乳酸異性体の違いによるＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清のＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ乳酸産生促進効果〉
Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地から回収されたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清はＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ乳酸促進効果を確認できたことから、乳酸異性体の違いによるＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ乳酸促進効果を確認するためにＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地、Ｂａｓｉｃ＋Ｌ－乳酸液体培地から回収したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清を二段階培養試験に用い、乳酸産生量の違いを確認した。
Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地から回収されたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清はＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ乳酸促進効果を確認できたことから、乳酸異性体の違いによるＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ乳酸促進効果を確認するためにＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地、Ｂａｓｉｃ＋Ｌ－乳酸液体培地から回収したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清を二段階培養試験に用い、乳酸産生量の違いを確認した。
【0079】
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株を実験手法（１）の手順でプレ培養後、Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地もしくはＢａｓｉｃ＋Ｌ－乳酸液体培地を用いて実験手法（２）の手順でＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株のプレ培養液を培地の１／１００量となるように２００μＬ接種した。その後、３７℃、８０ｒｐｍ、嫌気条件下で２４時間振盪培養した。その培養液の一部を回収し、ＯＤと有機酸を測定した。続いて、得られたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清を実験手法（４）の手順で菌体除去した。この調整済みＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清７ｍＬと２×Ｂａｓｉｃ＋デンプン改変培地７ｍＬを、乾熱滅菌した５０ｍＬ三角フラスコにトータル１４ｍＬずつ入れて混合した。この培養液を滅菌済み２４ Ｗｅｌｌプレート（ＦＡＬＣＯＮ ＲＥＦ３５３０４７）に２ｍＬずつ分注した。ここに１／２ＧＡＭ液体培地を用いて実験手法（１）の手順でプレ培養したＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株を、ｎ＝４で培地の１／１００量となるように２０μＬ接種した。その後３７℃、８０ｒｐｍ嫌気条件下で振盪培養し、２４時間後に菌懸濁液のＯＤを測定、培養上清の有機酸測定を行った。
【0080】
また、対照として一段目に使用したＢａｓｉｃ液体培地と２×Ｂａｓｉｃ＋デンプン改変培地を等量混合した培養液を用意し、二段階培養を行った。
【0081】
〈実験（１１）：Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清を用いた二段階培養試験・ＧＡＭ液体培地〉
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清が二段階目培養として２×Ｂａｓｉｃ＋デンプン改変培地および２×Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ改変培地を用いた際、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの乳酸産生を促進する結果が得られた（図３（ｂ）：図７（ｂ））。そのため、本実験では一段階目としてＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地でＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清を回収した後、二段階目の培養としてＧＡＭ液体培地を用いることで、栄養源が豊富な培地上でもＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの乳酸産生促進効果が得られるのか検証した。
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清が二段階目培養として２×Ｂａｓｉｃ＋デンプン改変培地および２×Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ改変培地を用いた際、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの乳酸産生を促進する結果が得られた（図３（ｂ）：図７（ｂ））。そのため、本実験では一段階目としてＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地でＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清を回収した後、二段階目の培養としてＧＡＭ液体培地を用いることで、栄養源が豊富な培地上でもＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの乳酸産生促進効果が得られるのか検証した。
【0082】
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株を実験手法（１）の手順でプレ培養した。Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ乳酸液体培地を用いて実験手法（２）の手順でＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株プレ培養液を培地の１／１００量となるよう２００μＬ接種した。その後、３７℃、８０ｒｐｍ、嫌気条件下で１８時間振盪培養した。その培養液の一部を回収し、ＯＤと有機酸を測定した。
【0083】
続いて、得られたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清の菌体除去を行う前に、１２１℃、１５ｍｉｎでオートクレーブにかけ、その後実験手法（４）の手順で菌体除去した。この調整済みＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清７ｍＬとＧＡＭ液体培地７ｍＬを、乾熱滅菌した５０ｍＬ三角フラスコにトータル１４ｍＬずつ入れて混合した。この培養液を滅菌済み２４ Ｗｅｌｌプレート（ＦＡＬＣＯＮ ＲＥＦ３５３０４７）に２ｍＬずつ分注した。ここに１／２ＧＡＭ液体培地を用いて実験手法（１）の手順でプレ培養を行ったＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株をｎ＝３で培地の１／１００量となる２０μＬ接種した。その後３７℃、８０ｒｐｍ嫌気条件下で振盪培養し、２４時間後に菌懸濁液のＯＤを測定、培養上清の有機酸測定を行った。
【0084】
また、対照として一段目に使用したＢａｓｉｃ液体培地とＧＡＭ液体培地を等量混合した培養液を用意し、二段階培養に使用した。
【0085】
〈実験（１２）：Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ 培養上清中に含まれる短鎖脂肪酸がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ乳酸産生に与える影響〉
Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ乳酸生成促進効果が確認されたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清中には酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸といった短鎖脂肪酸ＳＣＦＡが含有されている。そのためこれらの短鎖脂肪酸がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ乳酸産生に与える影響を確かめるためにＢａｓｉｃ＋デンプン改変液体培地に各短鎖脂肪酸を含有させた液体培地を作成し、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ乳酸産生量を確認した。
Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ乳酸生成促進効果が確認されたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清中には酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸といった短鎖脂肪酸ＳＣＦＡが含有されている。そのためこれらの短鎖脂肪酸がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ乳酸産生に与える影響を確かめるためにＢａｓｉｃ＋デンプン改変液体培地に各短鎖脂肪酸を含有させた液体培地を作成し、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ乳酸産生量を確認した。
【0086】
Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓを実験手法（１）の手順でプレ培養後、乾熱滅菌した５０ｍＬ三角フラスコにＢａｓｉｃ＋デンプン改変培地＋酢酸（約９．８ｍＭ）、Ｂａｓｉｃ＋デンプン改変培地＋プロピオン酸（約７．９ｍＭ）、Ｂａｓｉｃ＋デンプン改変培地＋酪酸（約７．０ｍＭ）、Ｂａｓｉｃ＋デンプン改変培地＋吉草酸（約８．８ｍＭ）をｎ＝３で２０ｍＬずつ分注し、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓプレ培養液を培地の１／１００量となる２００μＬ接種した。その後３７℃、８０ｒｐｍ嫌気条件下で振盪培養し、２４時間後に菌懸濁液のＯＤを測定、培養上清の有機酸測定を行った。
【0087】
〈実験（１３）：Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ 培養上清の凍結乾燥試験〉
Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの乳酸生成促進効果が確認されたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清は凍結乾燥させた場合でも、乳酸促進効果を発揮するか確認するために、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清の凍結乾燥を行い、回収した粉末状のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清を高濃度で蒸留水に溶解した培養液を二段階培養に使用した。
Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの乳酸生成促進効果が確認されたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清は凍結乾燥させた場合でも、乳酸促進効果を発揮するか確認するために、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清の凍結乾燥を行い、回収した粉末状のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清を高濃度で蒸留水に溶解した培養液を二段階培養に使用した。
【0088】
実験手法（１）の手順でＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株をプレ培養後、Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ乳酸液体培地を用いて、実験手法（２）の手順で、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株プレ培養液を接種、その後３７℃、８０ｒｐｍ嫌気条件下で振盪培養し２４時間後に菌懸濁液のＯＤを測定、培養上清のｐＨと有機酸測定を行った。続いて、得られたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清を実験手法（４）の手順で調整した。この菌体除去を行った培養上清を１５ｍＬファルコンチューブに約５ｍＬずつ分注し、液体窒素で予備凍結を行った。予備凍結した培養上清を凍結乾燥機に２４時間かけた。凍結乾燥が完了したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清の重量を測定したところ、５ｍＬのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清の凍結乾燥物は約０．０７ｇであったため、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清の約３倍の濃度となる１０ｍＬの滅菌水に対して０．４ｇ溶解し、一段階目のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清とした。このＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清７ｍＬと２×Ｂａｓｉｃ＋デンプン改変培地７ｍＬを、乾熱滅菌した５０ｍＬ三角フラスコにトータル１４ｍＬずつ入れて混合した。この培養液を滅菌済み２４ Ｗｅｌｌプレート（ＦＡＬＣＯＮ ＲＥＦ３５３０４７）に２ｍＬずつ分注した。ここで１／２ＧＡＭ液体培地を用いて実験手法（１）の手順で調製したＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓプレ培養液を、ｎ＝４で培地の１／１００量となるよう２０μＬ接種した。３７℃、８０ｒｐｍ嫌気条件下で振盪培養し２４時間後に培養上清の有機酸測定を行った。
【0089】
また、対照として一段目に使用したＢａｓｉｃ液体培地を同様に凍結乾燥し、１０ｍＬの滅菌水に対して０．４ｇ溶解した後、２×Ｂａｓｉｃ＋デンプン改変培地を等量混合した。その後、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株プレ培養液を接種、有機酸濃度を測定した。
【0090】
〈実験（１４）：Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清のアセトン沈殿がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの乳酸産生に与える影響〉
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ の培養上清に含まれる乳酸産生促進物質がタンパク質であった場合、アセトン沈殿により培養上清から回収できる可能性がある。そこで、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清をアセトン沈殿によって回収し、二段階培養試験に用いることで、乳酸産生促進物質の回収が可能かどうか検証した。
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ の培養上清に含まれる乳酸産生促進物質がタンパク質であった場合、アセトン沈殿により培養上清から回収できる可能性がある。そこで、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清をアセトン沈殿によって回収し、二段階培養試験に用いることで、乳酸産生促進物質の回収が可能かどうか検証した。
【0091】
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株を実験手法（１）の手順でプレ培養した。Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ乳酸液体培地を用いて実験手法（２）の手順でＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株プレ培養液を培地の１／１００量となるよう２００μＬ接種した。その後、３７℃、８０ｒｐｍ、嫌気条件下で１８時間振盪培養した。その培養液の一部を回収し、ＯＤと有機酸を測定した。
【0092】
続いて、対照として利用するＢａｓｉｃ液体培地と得られたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清を菌体除去前に、１２１℃、１５ｍｉｎでオートクレーブにかけ、その後実験手法（４）の手順で菌体除去した。
【0093】
事前に－２０℃で一晩冷却したアセトン３０ｍＬに回収されたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清３ｍＬと対照として使用するＢａｓｉｃ液体培地３ｍＬを各アセトンに少しずつ添加し、－２０℃で一晩静置させて、沈殿物を作成した。
【0094】
得られたアセトン沈殿物を回収する為に、１０，０００ｒｐｍ、４℃、１５ｍｉｎで遠心分離し、大まかに上清を捨てた。その後再度１０，０００ｒｐｍ、４℃、１５ｍｉｎで遠心分離し上澄みをチップでできる限り捨て、滅菌水３ｍＬで沈殿物を溶解した。
【0095】
このアセトン沈殿物を溶解して得たＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清３ｍＬと２×Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ改変液体培地３ｍＬを、乾熱滅菌した５０ｍＬ三角フラスコにトータル６ｍＬずつ入れて混合した。この培養液を滅菌済み２４ Ｗｅｌｌプレート（ＦＡＬＣＯＮ ＲＥＦ３５３０４７）に１ｍＬずつ分注した。ここに１／２ＧＡＭ液体培地を用いて実験手法（１）の手順でプレ培養を行ったＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株をｎ＝３で培地の１／１００量となる１０μＬ接種した。その後３７℃、８０ｒｐｍ嫌気条件下で振盪培養し、２４時間後に菌懸濁液のＯＤを測定、培養上清の有機酸測定を行った。なおＯＤは菌懸濁液をＰＣＲチューブに３０μＬ分注したのち、吸光度計Ｐｉｃｏｅｘｐｌｏｒｅｒを用いて測定しており、波長はＯＤ＝６１５である。
【0096】
また、対照として一段目に使用し、アセトン沈殿によって同様に回収したＢａｓｉｃ液体培地と２×Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ改変液体培地を等量混合した培養液を用意し、二段階培養に使用した。
【0097】
〈実験（１５）：Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清の限外ろ過試験〉
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清中に含まれるＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの乳酸生成促進物質の分子量を推定するために、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清を限外ろ過した上清を二段階培養試験に用いた。Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株を実験手法（１）の手順でプレ培養後、Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ乳酸液体培地を用いて実験手法（２）の手順で、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株プレ培養液を接種した。その後、３７℃、８０ｒｐｍ、嫌気条件下で１８時間振盪培養した。その培養液の一部を回収し、ＯＤと有機酸を測定した。
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清中に含まれるＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの乳酸生成促進物質の分子量を推定するために、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清を限外ろ過した上清を二段階培養試験に用いた。Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株を実験手法（１）の手順でプレ培養後、Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ乳酸液体培地を用いて実験手法（２）の手順で、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株プレ培養液を接種した。その後、３７℃、８０ｒｐｍ、嫌気条件下で１８時間振盪培養した。その培養液の一部を回収し、ＯＤと有機酸を測定した。
【0098】
得られたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２培養上清を菌体除去する前に１２１℃、１５ｍｉｎでオートクレーブ滅菌し実験手法（４）の手順で菌体除去した。続いて、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清を３０００Ｄａの限外ろ過膜（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｌｔｄ．）に供し、１２，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃で遠心し、その濾液を分子量３０００ Ｄａ以下のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清とした。
【0099】
このＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清７ｍＬと２×Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ改変培地７ｍＬを、乾熱滅菌した５０ｍＬ三角フラスコにトータル１４ｍＬずつ入れて混合した。この培養液を滅菌済み２４ Ｗｅｌｌプレート（ＦＡＬＣＯＮ ＲＥＦ３５３０４７）に１ｍＬずつ分注した。ここで１／２ＧＡＭ液体培地を用いて実験手法（１）の手順でＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓプレ培養液を作成し、ｎ＝４で培地の１／１００量となるように１０μＬ接種した。その後３７℃、８０ｒｐｍ嫌気条件下で振盪培養し、２４時間後に菌懸濁液のＯＤを測定、培養上清の有機酸測定を行った。なおＯＤは菌懸濁液をＰＣＲチューブに３０μＬ分注したのち、吸光度計Ｐｉｃｏｅｘｐｌｏｒｅｒを用いて測定しており、波長はＯＤ＝６１５である。
【0100】
対象として、限外ろ過を行う前のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清と、Ｂａｓｉｃ液体培地、Ｂａｓｉｃ液体培地を限外ろ過処理した培養液を一段階目の培養液として用いた。
【0101】
１－４． 高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による有機酸濃度の測定
微生物を培養した培養液中には、菌体、培地由来のタンパク質、および菌体から放出されたタンパク質などの不純物が多数含まれるため、そのままではＨＰＬＣを用いた有機酸分析を行うには不適である。そこで、シリンジフィルターおよび限外ろ過膜を用いて培養上清の前処理を行い、その後有機酸濃度の測定を行った。手順を以下に示す。
微生物を培養した培養液中には、菌体、培地由来のタンパク質、および菌体から放出されたタンパク質などの不純物が多数含まれるため、そのままではＨＰＬＣを用いた有機酸分析を行うには不適である。そこで、シリンジフィルターおよび限外ろ過膜を用いて培養上清の前処理を行い、その後有機酸濃度の測定を行った。手順を以下に示す。
【0102】
培養上清を０．４５μｍのシリンジフィルター（ＳＹＮＮ０３０２ＭＮＸＸ１０４，ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＭＩＣＲＯＤＥＶＩＣＥＳ ＰＶＴ．ＬＴＤ）でろ過した。
ろ過済みサンプルを滅菌水で２０倍に希釈した。
希釈したサンプルを３０００ Ｄａの限外ろ過膜（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｌｔｄ．）に供し、１２，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃で遠心し、タンパク質を除いた。
徐タンパク質したサンプルを５０μＬ、ＨＰＬＣ専用のチューブに入れ、ＨＰＬＣ（ＣＢＭ－２０Ａ，Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で測定した。
ろ過済みサンプルを滅菌水で２０倍に希釈した。
希釈したサンプルを３０００ Ｄａの限外ろ過膜（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｌｔｄ．）に供し、１２，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃で遠心し、タンパク質を除いた。
徐タンパク質したサンプルを５０μＬ、ＨＰＬＣ専用のチューブに入れ、ＨＰＬＣ（ＣＢＭ－２０Ａ，Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で測定した。
【0103】
１－５． 吸光度計Ｐｉｃｏｅｘｐｌｏｒｅｒを用いた菌懸濁液の濁度測定
２４ Ｗｅｌｌプレート（ＦＡＬＣＯＮ ＲＥＦ３５３０４７）を用いた液体培養試験のうち、培養液を１ｍＬで培養を行った実験においては、液体量が不足しており、分光光度計による濁度測定が難しい。そこで、実験（８）、（１４）、（１５）においては光度計Ｐｉｃｏｅｘｐｌｏｒｅｒを用いてＯＤの測定を行った。手順としては、ＰＣＲチューブに菌懸濁液を３０ μＬ分注したのち測定を行った。測定波長は５７５～６６０ｎｍで、最大吸収波長は６１５ｎｍである。なお、一般的な分光光度計では波長の光を角セル内の試料に照射して濁度測定を行うが、Ｐｉｃｏｅｘｐｌｏｒｅｒでは白色光をＰＣＲチューブ内の試料に照射してカラーセンサＲｅｄによって濁度測定を行う。ＰＣＲチューブを使用しているため、分光光度計の角型セルより光路長が短く、濁度が分光光度計より小さくなる。そこで乳酸菌の濁度測定（Ｐｉｃｏｅｘｐｌｏｒｅｒを用いた乳酸菌の濁度測定）を参考に、補足係数によって、セルを用いた分光光度計で測定した濁度に近い値を算出した。計算式を以下に示す。
２４ Ｗｅｌｌプレート（ＦＡＬＣＯＮ ＲＥＦ３５３０４７）を用いた液体培養試験のうち、培養液を１ｍＬで培養を行った実験においては、液体量が不足しており、分光光度計による濁度測定が難しい。そこで、実験（８）、（１４）、（１５）においては光度計Ｐｉｃｏｅｘｐｌｏｒｅｒを用いてＯＤの測定を行った。手順としては、ＰＣＲチューブに菌懸濁液を３０ μＬ分注したのち測定を行った。測定波長は５７５～６６０ｎｍで、最大吸収波長は６１５ｎｍである。なお、一般的な分光光度計では波長の光を角セル内の試料に照射して濁度測定を行うが、Ｐｉｃｏｅｘｐｌｏｒｅｒでは白色光をＰＣＲチューブ内の試料に照射してカラーセンサＲｅｄによって濁度測定を行う。ＰＣＲチューブを使用しているため、分光光度計の角型セルより光路長が短く、濁度が分光光度計より小さくなる。そこで乳酸菌の濁度測定（Ｐｉｃｏｅｘｐｌｏｒｅｒを用いた乳酸菌の濁度測定）を参考に、補足係数によって、セルを用いた分光光度計で測定した濁度に近い値を算出した。計算式を以下に示す。
【0104】
ｙ ＝ ０．１５４３ ｘ （ｙ＝ Ｐｉｃｏｅｘｐｌｏｒｅｒ測定値：ｘ＝ ＯＤ６００）
【0105】
以下、段落［０１０６］～［０１８５］まで、上記実験の結果を述べる。
【0106】
〈実験（１）：Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓに対するｐＨの乳酸産生阻害試験〉
本実験ではＧＡＭ液体培地に対して２ｇ／ＬのＣａＣＯ３を添加した培地と添加しない培地上でＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの単独培養を行い、ｐＨとＯＤ、乳酸産生量の違いを調べた。ＯＤ、ｐＨ、乳酸産生量の結果を図１に示す。
本実験ではＧＡＭ液体培地に対して２ｇ／ＬのＣａＣＯ３を添加した培地と添加しない培地上でＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの単独培養を行い、ｐＨとＯＤ、乳酸産生量の違いを調べた。ＯＤ、ｐＨ、乳酸産生量の結果を図１に示す。
【0107】
まずＧＡＭ液体培地を用いたＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株２４時間培養後のｐＨの値は４．５２と低く、ＯＤは１．６５、乳酸産生量は約６７．９ｍＭであった。一方でＧＡＭ＋ＣａＣＯ３液体培地のＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株２４時間培養後のｐＨの値は５．０６とＣａＣＯ３を培地上に含むことで高い値となり、ＯＤは２．２９とｐＨが低いＧＡＭ液体培養の値よりも高くなった。しかし、乳酸産生量は約５７．９ｍＭであり、ｐＨ、ＯＤが共にＧＡＭ液体培養よりも高い値にも関わらず、乳酸量は低い値となった。
【0108】
このことから、ｐＨが低下することでＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の増殖は抑制される可能性があるが、ｐＨの低下によって必ずしも乳酸産生が減少することではないことが示唆された。
【0109】
〈実験（２）：Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓに対するＤＬ－乳酸による乳酸産生阻害試験〉
本実験ではＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株による乳酸産生において、乳酸によるフィードバック阻害のメカニズムがあるのか検討した。１／２ＧＡＭ液体培地に各濃度のＤＬ－乳酸を添加し、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株が産生する乳酸量を測定した。乳酸濃度の結果は図２に示されている。
本実験ではＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株による乳酸産生において、乳酸によるフィードバック阻害のメカニズムがあるのか検討した。１／２ＧＡＭ液体培地に各濃度のＤＬ－乳酸を添加し、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株が産生する乳酸量を測定した。乳酸濃度の結果は図２に示されている。
【0110】
はじめに、１／２ＧＡＭ＋ＤＬ－乳酸培地中に実際に含まれていた乳酸量を測定したところ、低濃度から８３．５ｍＭ （４４．７５μＬ）、１０２．２ｍＭ （５２．２５μＬ）、１１３．６ｍＭ （５９．５μＬ）、１４１．１ｍＭ （８２μＬ）含まれていた。（（）内の数字は培地１０ｍＬに対して添加したＤＬ－乳酸量を示す。）
【0111】
続いて、２４時間培養後のＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株乳酸産生量およびＯＤを測定した。ＯＤは（）内の数字に示す。ＤＬ－乳酸を含まない１／２ＧＡＭ液体培地において３６．５ｍＭ（１．１２）、８３．５ｍＭ ＤＬ－乳酸を含む培地において４０．１ｍＭ（０．８６）、１０２．２ｍＭ ＤＬ－乳酸を含む培地において４２．４ｍＭ（０．６７）、１１３．６ｍＭ ＤＬ－乳酸を含む培地において３５．７ｍＭ（１．０５）、１４１．１ｍＭ ＤＬ－乳酸を含む培地において４８．８ｍＭ（０．５２）乳酸を産生することが示された。
【0112】
このように培地中に乳酸が高濃度に含まれるとＯＤは減少する一方で、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの乳酸産生量が減少しないことが示されたことから、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株においては０～約１９０ｍＭ乳酸の濃度範囲では乳酸によるフィードバック阻害のような作用は認められないことが示された。
【0113】
〈実験（３）： Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの培養上清を用いた二段階培養試験〉
乳酸産生が増加する理由を明らかにするために、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉとＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓとの間の相互作用により本実験では一段階目としてＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の２４時間培養を行い、その培養上清を用いて二段階目としてＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の２４時間培養を行った。その後、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ培養上清の有機酸濃度を測定した。
はじめに一段階目としてＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地上でＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の２４時間培養を行った。実験（１）～（２）ではＧＡＭ液体培地を用いたが、ＧＡＭ液体培地には炭素源としてグルコースとデンプンが含まれており、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの前培養時にこれらの炭素源が消費尽くされなかった場合、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓによって乳酸産生に使われる可能性が高い。そこで、炭素源として乳酸のみを含むＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地を用いた。一段階目のＯＤと有機酸濃度を図３（ａ）に示す。ＯＤは１．０２であり、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株がＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地で十分に増殖したことが確認された。すると、Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地上に含まれていた乳酸濃度は約５６．３ｍＭであったが、２４時間培養後には含まれていた乳酸がＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株によってすべて消費されていることが確認された。さらに、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株は酢酸を約１４．２ｍＭ、プロピオン酸を約１３．０ｍＭ、イソ酪酸を約４．８ｍＭ、酪酸を約５．９ｍＭ、イソ吉草酸を約２．７ｍＭ、吉草酸を約８．３ｍＭ産生することが確認された。
乳酸産生が増加する理由を明らかにするために、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉとＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓとの間の相互作用により本実験では一段階目としてＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の２４時間培養を行い、その培養上清を用いて二段階目としてＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の２４時間培養を行った。その後、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ培養上清の有機酸濃度を測定した。
はじめに一段階目としてＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地上でＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の２４時間培養を行った。実験（１）～（２）ではＧＡＭ液体培地を用いたが、ＧＡＭ液体培地には炭素源としてグルコースとデンプンが含まれており、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの前培養時にこれらの炭素源が消費尽くされなかった場合、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓによって乳酸産生に使われる可能性が高い。そこで、炭素源として乳酸のみを含むＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地を用いた。一段階目のＯＤと有機酸濃度を図３（ａ）に示す。ＯＤは１．０２であり、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株がＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地で十分に増殖したことが確認された。すると、Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地上に含まれていた乳酸濃度は約５６．３ｍＭであったが、２４時間培養後には含まれていた乳酸がＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株によってすべて消費されていることが確認された。さらに、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株は酢酸を約１４．２ｍＭ、プロピオン酸を約１３．０ｍＭ、イソ酪酸を約４．８ｍＭ、酪酸を約５．９ｍＭ、イソ吉草酸を約２．７ｍＭ、吉草酸を約８．３ｍＭ産生することが確認された。
【0114】
続いて、二段階目に培養したＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株のＯＤ、生菌数、有機酸濃度を図３（ｂ）に示す。Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の培養上清を含まない培地においてＯＤは０．３２、生菌数は３．６８×１０４であり、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の培養上清を含む培地においてはＯＤが０．１２、生菌数が２．３２×１０４とＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の培養上清を含む培地上ではＯＤ、生菌数共に減少傾向にあることが確認された。この理由としては、一段階目の培養として用いたＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸培地中の成分がＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株によって消費され、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の生育に必要な培地成分が不足したことが考えられる。有機酸濃度は、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清を含まない培地上で最も多く産生された有機酸が乳酸であり、約４．９０ｍＭ、酢酸が約０．６９ｍＭであった。一方で、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清を含む培地上では乳酸が約７．３０ｍＭで、その他の有機酸はほとんど計測されなかった。
【0115】
このことはＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清はＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の増殖を促進することはないものの、乳酸産生を促進することが示された。
【0116】
〈実験（４）：Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清の経時変化〉
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の一段階目の培養において、どの培養時間で最もＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の乳酸産生促進効果があるのか確認するために、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株をＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地で６、１２、１８、２４時間培養後、これらの培養上清を用いてＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の二段階培養試験を行った。
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の一段階目の培養において、どの培養時間で最もＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の乳酸産生促進効果があるのか確認するために、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株をＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地で６、１２、１８、２４時間培養後、これらの培養上清を用いてＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の二段階培養試験を行った。
【0117】
はじめに、一段階目としてＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸培地で各時間培養したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株のＯＤ、ｐＨと有機酸濃度を図４（ａ）に示す。Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地中に含まれていた乳酸は５３．８ｍＭであった。
【0118】
培養時間６時間におけるＯＤは０．１１、ｐＨは６．１９であった。また有機酸濃度は乳酸が４６．６ｍＭと約７．２３ｍＭ消費されたことが示された。また、酢酸は１．４６ｍＭ、プロピオン酸は０．９９ｍＭ、イソ酪酸は３．１４ｍＭ産生された。
【0119】
培養時間１２時間におけるＯＤは１．０４、ｐＨは６．６２と１２時間培養でＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株が十分に増殖したことが示された。また、有機酸濃度においてＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地に含まれていた乳酸はすべて消費されており、酢酸が約９．１６ｍＭ、プロピオン酸が約８．９ｍＭ、イソ酪酸が約６．９５ｍＭ、酪酸が約４．６４ｍＭ、イソ吉草酸が約１．７６ｍＭ、吉草酸が約６．３８ｍＭ産生された。
【0120】
培養時間１８時間におけるＯＤは１．００で、ｐＨは６．７８であった。また有機酸濃度はＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地に含まれていた乳酸はすべて消費されており、酢酸が約９．０６ｍＭ、プロピオン酸が約８．５３ｍＭ、イソ酪酸が約６．５５ｍＭ、酪酸が約４．７３ｍＭ、イソ吉草酸が約２．０７ｍＭ、吉草酸が約６．８９ｍＭ産生された。
【0121】
培養時間２４時間におけるＯＤは０．９１で、ｐＨは６．７２であった。また有機酸濃度はＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地に含まれていた乳酸はすべて消費されており、酢酸が約９．２９ｍＭ、プロピオン酸が約８．７９ｍＭ、イソ酪酸が約７．４６ｍＭ、酪酸が約４．４ｍＭ、イソ吉草酸が約１．７７ｍＭ、吉草酸が約６．８ｍＭ産生された。
【0122】
続いて、二段階目に培養したＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株のＯＤ、有機酸濃度を図４（ｂ）に示す。Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の培養上清を含まない培地においてＯＤは０．４４、ｐＨは６．３６であった。また有機酸は乳酸が６．１４ｍＭ、酢酸が０．６ｍＭ産生することが確認された。
培養６時間のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株上清を用いた結果は、ＯＤが０．２６、ｐＨが６．４２であった。また有機酸は乳酸が５．２１ｍＭ、酢酸が約０．３３ｍＭであり、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清による乳酸産生促進効果は確認されなかった。
培養６時間のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株上清を用いた結果は、ＯＤが０．２６、ｐＨが６．４２であった。また有機酸は乳酸が５．２１ｍＭ、酢酸が約０．３３ｍＭであり、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清による乳酸産生促進効果は確認されなかった。
【0123】
続いて、培養１２時間のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清を用いた結果は、ＯＤは０．４７、ｐＨは６．５７であった。また有機酸は乳酸が約６．９８ｍＭ、酢酸が約０．７４ｍＭであった。
【0124】
続いて培養１８時間のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清を用いた結果は、ＯＤは０．３１、ｐＨは６．４７であった。また有機酸は乳酸が約９．９ｍＭ、酢酸が約０．１０ｍＭであった。
【0125】
続いて培養２４時間のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清を用いた結果は、ＯＤは０．２８、ｐＨは６．５７であった。また、有機酸は乳酸が約８．０７ｍＭ、酢酸が約０．３ｍＭであった。
【0126】
これらのことから、培養時間１８時間のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清を用いると、最もＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の乳酸産生促進効果が確認されることが示された。
【0127】
〈実験（５）：Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清の耐熱性試験〉
Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の乳酸産生を促進するＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清に含まれる成分は耐熱性を有するのか確認するために、Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地上から回収したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清を１２１℃、１５ｍｉｎオートクレーブにかけ、二段階培養試験に用いることで耐熱性を評価した。
Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の乳酸産生を促進するＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清に含まれる成分は耐熱性を有するのか確認するために、Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地上から回収したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清を１２１℃、１５ｍｉｎオートクレーブにかけ、二段階培養試験に用いることで耐熱性を評価した。
【0128】
一段階目としてＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸培地で１８時間培養したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株のＯＤと有機酸濃度を図５（ａ）に示す。ＯＤは０．９６であり、Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地に含まれていた乳酸５６．８ｍＭはすべて消費され酢酸が約 ９．６９ｍＭ、プロピオン酸が約７．６５ｍＭ、イソ酪酸が約４．１ｍＭ、酪酸が約４．７２ｍＭ、イソ吉相酸が約１．６９ｍＭ、吉草酸が約６．４４ｍＭ産生された。
【0129】
続いて、二段階目に培養したＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株のＯＤ、有機酸濃度を図５（ｂ）に示す。Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の培養上清を含まない培地においてＯＤは０．４９、ｐＨは６． ３３であった。また有機酸は乳酸が６．１８ｍＭ、酢酸が１．３９ｍＭ産生することが確認された。続いて、フィルター滅菌のみ行ったＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清を二段階培養に使用した際のＯＤは０．４２、ｐＨは６．５２であった。また有機酸は乳酸が約８．４３ｍＭ、酢酸が約０．１０ｍＭであった。
【0130】
続いて、フィルター滅菌でＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の菌体を除去後、オートクレーブにかけたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清を用いた二段階培養では、ＯＤは０．３９、ｐＨは６．３６であった。また有機酸は乳酸が約７．７ｍＭであった。
【0131】
続いて、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の菌体を含む培養液をオートクレーブ後、フィルター滅菌を行ったＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清を用いた二段階培養では、ＯＤは０．４７、ｐＨは６．３４であった。また有機酸は乳酸が約１０．８ｍＭであった。
【0132】
これらのことから、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の乳酸産生を促進するＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株由来の物質は耐熱性あることに加え、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株を菌体込みでオートクレーブに処理すると、乳酸産生促成効果が増加することが確認された。
【0133】
〈実験（６）：Ｆ－キットを用いた乳酸異性体濃度の定量〉
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＩＹ２株培養上清により促進されたＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の乳酸産生では産生される乳酸異性体の差があるのかどうか確認するために本実験を行った。Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の１８時間培養を行いその培養上清を用いてＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の２４時間培養を行った。その後、一段目の有機酸濃度をＨＰＬＣで測定し、二段目のＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株によって産生された乳酸異性体濃度をＦ－キットを用いて測定した。結果を以下に示す。
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＩＹ２株培養上清により促進されたＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の乳酸産生では産生される乳酸異性体の差があるのかどうか確認するために本実験を行った。Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の１８時間培養を行いその培養上清を用いてＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の２４時間培養を行った。その後、一段目の有機酸濃度をＨＰＬＣで測定し、二段目のＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株によって産生された乳酸異性体濃度をＦ－キットを用いて測定した。結果を以下に示す。
【0134】
Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸培地で１８時間培養したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株のＯＤと有機酸濃度を図６（ａ）に示す。ＯＤは０．９７であり、Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地に含まれていた乳酸５３．９ｍＭはすべて消費され酢酸が約９．０７ｍＭ、プロピオン酸が約８．７５ｍＭ、イソ酪酸が約３ ．９７ｍＭ、酪酸が約４．５３ｍＭ、イソ吉相酸が約１．７９ｍＭ、吉草酸が約６．４０ｍＭ産生された。
【0135】
続いて、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清中でＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株を２４時間培養した際の乳酸異性体濃度を図６（ｂ）に示す。対照となるＢａｓｉｃ液体培地をオートクレーブ処理した溶液を含むサンプルではＤ－乳酸が約２．１８ｍＭ、Ｌ－乳酸が約２．９１ｍＭ測定されたのに対して、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清を含むサンプルではＤ－乳酸が約３．３２ｍＭ、Ｌ－乳酸が約３．３５ｍＭ測定された。これは図６（ｃ）に示すように、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清により促進された乳酸産生のうちＤ－乳酸が約７２ ％、Ｌ－乳酸が約２８ ％を占めることを表す。
【0136】
また具体的な有機酸濃度は実験（７）の結果に記載するが、２×Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ改変培地を用いた二段階培養後のＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の培養上清の乳酸異性体濃度を測定したところ、図６（ｄ）に示すように、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清により促進された乳酸産生のうちＤ－乳酸が約８４ ％、Ｌ－乳酸が約１６ ％を占めることが明らかとなった。
【0137】
このことから、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株によるＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株乳酸産生促進効果は特にＤ－乳酸の産生に影響を及ぼすことが示された。
【0138】
〈実験（７）：Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの培養上清を用いた各乳酸菌の二段階培養試験〉
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の乳酸産生促進効果がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株以外の乳酸菌に対しても有効であるか確認するために実験を行った。Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地上でＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株を１８時間培養後、オートクレーブ、フィルター滅菌処理した培養上清をＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株、Ｓ．ａｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ１－１２株またはＥ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ Ｃ３－３８株の二段階培養に使用した。ＯＤ、ｐＨ、有機酸濃度の結果を以下示す。なお二段階目の培養は２×Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ改変液体培地を使用している。
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の乳酸産生促進効果がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株以外の乳酸菌に対しても有効であるか確認するために実験を行った。Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地上でＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株を１８時間培養後、オートクレーブ、フィルター滅菌処理した培養上清をＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株、Ｓ．ａｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ１－１２株またはＥ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ Ｃ３－３８株の二段階培養に使用した。ＯＤ、ｐＨ、有機酸濃度の結果を以下示す。なお二段階目の培養は２×Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ改変液体培地を使用している。
【0139】
一段階目としてＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸培地で１８時間培養したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株のＯＤとｐＨ、有機酸濃度を図７（ａ）に示す。Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養液のＯＤは０．９９であり、オートクレーブ後のｐＨは７．１２であった。Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地に含まれていた乳酸約５５．７ｍＭはほとんど消費され酢酸が約１２．０ｍＭ、プロピオン酸が約１０．２ｍＭ、イソ酪酸が約２．２１ｍＭ、酪酸が約６．９０ｍＭ、イソ吉相酸が約２．６８ｍＭ、吉草酸が約９．５６ｍＭ産生された。
【0140】
続いて、二段階目に培養したＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の有機酸濃度を図７（ｂ）に示す。Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の培養上清を含まない培地においてＯＤは０．３５ 、ｐＨは６．４６であり、有機酸は乳酸を８．７９ｍＭ産生することが確認された。続いて、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清を用いた二段階培養試験の結果、ＯＤは０．２７、ｐＨは６．１６であり、有機酸濃度は乳酸を約１８．８ｍＭ産生することが示された。
【0141】
続いて、二段階目に培養したＳ．ａｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ１－１２株の有機酸濃度を図７（ｂ）に示す。Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の培養上清を含まない培地においてＯＤは０．９１、ｐＨは６．１３であり、有機酸は乳酸を２７．３ｍＭ産生することが確認された。続いて、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清を用いた二段階培養試験の結果、ＯＤは０．８１、ｐＨは６．０３であり、有機酸濃度は乳酸を約２９．３ｍＭ産生することが示された。
【0142】
続いて、二段階目に培養したＥ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓＣ３－３８株の有機酸濃度を図７（ｂ）に示す。Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の培養上清を含まない培地においてＯＤは１．４９、ｐＨは５．６２であり、有機酸は乳酸を４５．５ｍＭ産生することが確認された。続いて、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清を用いた二段階培養試験の結果、ＯＤは１．３０、ｐＨは５．６９であり、有機酸濃度は乳酸を約４５．８ｍＭ産生することが示された。
【0143】
このことからＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清はＳ．ａｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ１－１２株およびＥ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ Ｃ３－３８株に対しては乳酸産生促進効果を示さないことが確認された。
【0144】
さらに、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清のＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株に対する乳酸産生促進効果は炭素源がデンプンのみの培地である２×Ｂａｓｉｃ＋デンプン改変培地（図５（ｂ））よりも炭素源がＧｌｕｃｏｓｅのみである２×Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ改変培地（図７（ｂ））の方がより乳酸産生増加量が顕著であることが確認された。
【0145】
〈実験（８）：Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの培養上清を用いたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の二段階培養試験〉
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉが産生する分子がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ以外のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌による乳酸産生を促進するか確認するために、好熱菌発酵産物を給与した採卵鶏の排泄糞中において検出数が多かったＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉを用いてＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの培養上清を用いた二段階培養試験を行った。
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉが産生する分子がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ以外のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌による乳酸産生を促進するか確認するために、好熱菌発酵産物を給与した採卵鶏の排泄糞中において検出数が多かったＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉを用いてＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの培養上清を用いた二段階培養試験を行った。
【0146】
Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地上でＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株を１８時間培養後、オートクレーブ、フィルター滅菌処理した培養上清をＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉの二段階培養に使用した。ＯＤ、有機酸濃度の結果を以下示す。なお二段階目の培養は２×Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ改変液体培地を使用している。
【0147】
一段階目としてＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸培地で１８時間培養したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株のＯＤとｐＨ、有機酸濃度を図８（ａ）に示す。Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養液のＯＤは１．０３であった。Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地に含まれていた乳酸約５５．１ｍＭはほとんど消費され酢酸が約６．４２ｍＭ、プロピオン酸が約６．９６ｍＭ、イソ酪酸が約０．２１ｍＭ、酪酸が約４．８１ｍＭ、イソ吉相酸が約１．７６ｍＭ、吉草酸が約７．４６ｍＭ産生された。
【0148】
続いて、二段階目に培養したＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉの有機酸濃度を図８（ｂ）に示す。Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の培養上清を含まない培地においてＯＤは０．１５であり、有機酸は乳酸を４．２６ｍＭ産生することが確認された。続いて、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清を用いた二段階培養試験の結果、ＯＤは０．０４であり、有機酸濃度は乳酸を約１２．９ｍＭ産生することが示された。
【0149】
このことからＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清はＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ以外のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に対しても乳酸産生促進効果を持つことが示唆された。
【0150】
〈実験（９）：Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ液体培地Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清による二段階培養試験〉
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉＹ２株の一段落目の培養において、炭素源としてＤＬ－乳酸を用いて培養すると、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓに対する乳酸産生促進物質を作ることが示されている。そこで、炭素源がＧｌｕｃｏｓｅのみのＢａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ 液体培地を用いて一段落目のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の培養上清を回収し、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の二段階培養試験を行うことで、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の乳酸産生促進物質は異なる炭素源においても産生されるのか確認した。ＯＤ、有機酸濃度の結果を以下に示す。
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉＹ２株の一段落目の培養において、炭素源としてＤＬ－乳酸を用いて培養すると、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓに対する乳酸産生促進物質を作ることが示されている。そこで、炭素源がＧｌｕｃｏｓｅのみのＢａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ 液体培地を用いて一段落目のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の培養上清を回収し、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の二段階培養試験を行うことで、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の乳酸産生促進物質は異なる炭素源においても産生されるのか確認した。ＯＤ、有機酸濃度の結果を以下に示す。
【0151】
一段階目としてＢａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ液体培地上で２４時間培養した際のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株のＯＤ、ｐＨ、有機酸濃度を図９（ａ）に示す。ＯＤは１．５８でｐＨは５．９２であった。また、有機酸濃度は酢酸が約３．０４ｍＭ、プロピオン酸が約０．１８ｍＭ、酪酸が約８．５９ｍＭ、イソ吉草酸が約２．１６ｍＭ産生された。
【0152】
続いて、二段階目に培養したＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４－株のＯＤ、ｐＨ、有機酸濃度の結果を図９（ｂ）に示す。Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の培養上清を含まない培地においてＯＤは０．３３ 、ｐＨは６．３９であり、有機酸は乳酸が９．０６ｍＭ、酢酸が０．５３ｍＭ産生することが確認された。続いて、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清を用いた二段階培養試験の結果、ＯＤは０．３６、ｐＨは６．４６であり、有機酸濃度は乳酸が約７．１５ｍＭ、酢酸が約０．４４ｍＭ産生することが示された。
【0153】
これらのことから、Ｂａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ液体培地上で培養したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清はＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の乳酸産生促進効果を示さなかった。
【0154】
〈実験（１０）：乳酸異性体の違いによるＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清のＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ乳酸産生促進効果〉
Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の乳酸産生促進物質をＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉが産生するためには、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの培養時の産生系としてグルコースではなく乳酸である必要があることが明らかとなった。そこで、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株による一段階目の培養において用いる乳酸異性体の違いがＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の乳酸産生を促進する物質の産生に変化を与えるのか確認するために、実験を行った。
Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の乳酸産生促進物質をＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉが産生するためには、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの培養時の産生系としてグルコースではなく乳酸である必要があることが明らかとなった。そこで、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株による一段階目の培養において用いる乳酸異性体の違いがＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の乳酸産生を促進する物質の産生に変化を与えるのか確認するために、実験を行った。
【0155】
一段階目としてＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地とＢａｓｉｃ＋Ｌ－乳酸液体培地上で１８時間培養した際のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株のＯＤ、有機酸濃度を図１０（ａ）に示す。はじめに、Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸培地で１８時間培養したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株のＯＤとｐＨ、有機酸濃度を示す。ＯＤは０．９３であり、ｐＨは６．７５であった。Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地に含まれていた乳酸５３．９ｍＭはすべて消費され酢酸が約９．０８ｍＭ、プロピオン酸が約８．７５ｍＭ、イソ酪酸が約３．９７ｍＭ、酪酸が約４．５３ｍＭ、イソ吉相酸が約１．７９ｍＭ、吉草酸が約６．４０ｍＭ産生された。
【0156】
続いて、Ｂａｓｉｃ＋Ｌ－乳酸培地で１８時間培養したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株のＯＤとｐＨ、有機酸濃度を示す。ＯＤは１．００であり、ｐＨは６．７９であった。Ｂａｓｉｃ＋Ｌ－乳酸液体培地に含まれていた乳酸５６．４ｍＭはすべて消費され酢酸が約９．０６ｍＭ、プロピオン酸が約８．３２ｍＭ、イソ酪酸が約４．２５ｍＭ、酪酸が約４．８５ｍＭ、イソ吉相酸が約１．８５ｍＭ、吉草酸が約６．０２ｍＭ産生された。
【0157】
続いて、二段階目に培養したＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株のＯＤ、ｐＨ、有機酸濃度の結果を図１０（ｂ）に示す。Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の培養上清を含まない培地においてＯＤは０．６８ 、ｐＨは６．２９であり、有機酸は乳酸が６．００ｍＭ、酢酸が０．７２ｍＭ産生することが確認された。Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地上で培養したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株を二段階培養で用いたサンプルではＯＤが０．４０、ｐＨが６．４４、有機酸濃度は乳酸が８．９４ｍＭ産生されることが確認された。
【0158】
Ｂａｓｉｃ＋Ｌ－乳酸液体培地上で培養したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株を二段階培養で用いたサンプルではＯＤが０．３３、ｐＨが６．４６、有機酸濃度は乳酸が９．９ｍＭ、酢酸が０．７１ｍＭ産生されることが確認された。
【0159】
この結果より、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の一段階目の培養で用いる乳酸異性体の違いがＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の乳酸産生促進効果に与える影響は少ないことが考えられる。
【0160】
〈実験（１１）：Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清を用いた二段階培養試験・ＧＡＭ液体培地〉
二段階目のＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの培養としてＢａｓｉｃ＋デンプン改変培地およびＢａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ改変培地を用いた際、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの乳酸産生を促進する結果が得られた（図７（ｂ））。そのため、本実験では一段階目としてＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地でＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清を回収した後、二段階目のＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの培養としてＧＡＭ液体培地を用いることで、栄養源が豊富な培地上でもＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの乳酸産生促進効果が得られるのか検証した。
二段階目のＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの培養としてＢａｓｉｃ＋デンプン改変培地およびＢａｓｉｃ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ改変培地を用いた際、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの乳酸産生を促進する結果が得られた（図７（ｂ））。そのため、本実験では一段階目としてＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地でＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清を回収した後、二段階目のＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの培養としてＧＡＭ液体培地を用いることで、栄養源が豊富な培地上でもＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの乳酸産生促進効果が得られるのか検証した。
【0161】
一段階目としてＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地で１８時間培養した際のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株のＯＤ、有機酸濃度を図１１（ａ）に示す。
【0162】
ＯＤは１．０２であり、Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地に含まれていた乳酸約４０．０ｍＭはほとんど消費され酢酸が約９．１８ｍＭ、プロピオン酸が約９．２０ｍＭ、イソ酪酸が約２．１３ｍＭ、酪酸が約４．８１ｍＭ、イソ吉相酸が約１．７７ｍＭ、吉草酸が約６．６８ｍＭ産生された。
続いて、二段階目に培養したＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の有機酸濃度の結果を図１１（ｂ）に示す。Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の培養上清を含まない培地においてＯＤは１．３６ 、ｐＨは４．８３であり、有機酸は乳酸が２４．４ｍＭ、酢酸が５．７６ｍＭ産生することが確認された。
続いて、二段階目に培養したＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の有機酸濃度の結果を図１１（ｂ）に示す。Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の培養上清を含まない培地においてＯＤは１．３６ 、ｐＨは４．８３であり、有機酸は乳酸が２４．４ｍＭ、酢酸が５．７６ｍＭ産生することが確認された。
【0163】
Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地上で培養したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株を二段階培養で用いたサンプルではＯＤが１．２９、ｐＨが５．００、有機酸濃度は乳酸が２４．３ｍＭ、酢酸が５．９４ｍＭ産生されることが確認された。
【0164】
このことから、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清によるＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの乳酸産生促進効果は栄養源が豊富であるＧＡＭ液体培地では確認されないことが示された。
【0165】
〈実験（１２）：Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清中に含まれる短鎖脂肪酸がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ乳酸産生に与える影響〉
乳酸産生促進効果が示されたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清中にはＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株が産生した短鎖脂肪酸が含まれている。そこで、これらの短鎖脂肪酸がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの乳酸産生を刺激している可能性について検証した。Ｂａｓｉｃ改変液体培地にＳＣＦＡを添加しＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓを２４時間培養後、ＯＤと有機酸を測定した。なお、Ｂａｓｉｃ改変液体培地に添加したＳＣＦＡの濃度は、Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地上でＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株を１８時間培養した際のＳＣＦＡ産生量を参考としている。結果を図１２（ａ）、図１２（ｂ）に示す。
乳酸産生促進効果が示されたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清中にはＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株が産生した短鎖脂肪酸が含まれている。そこで、これらの短鎖脂肪酸がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの乳酸産生を刺激している可能性について検証した。Ｂａｓｉｃ改変液体培地にＳＣＦＡを添加しＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓを２４時間培養後、ＯＤと有機酸を測定した。なお、Ｂａｓｉｃ改変液体培地に添加したＳＣＦＡの濃度は、Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地上でＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株を１８時間培養した際のＳＣＦＡ産生量を参考としている。結果を図１２（ａ）、図１２（ｂ）に示す。
【0166】
はじめに対照となるＢａｓｉｃ改変液体培地上でＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株を２４時間培養した際のＯＤ、有機酸濃度を示す。ＯＤは０．５４でｐＨは６．２７であった。有機酸濃度は乳酸が約７．９ｍＭ、酢酸が約０．４３ｍＭであった。Ｂａｓｉｃ改変培地＋酢酸（約９．８ｍＭ）ではＯＤが０．５４、ｐＨが６．２４であった。有機酸濃度は乳酸が約８．３３ｍＭ、酢酸が約０．７ｍＭであった。Ｂａｓｉｃ改変培地＋プロピオン酸（約７．９ｍＭ）ではＯＤが０．４２、ｐＨが６．３であった。有機酸濃度は乳酸が約６．６９ｍＭ、酢酸が約０．７１ｍＭであった。
【0167】
これらのことから、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清中に含まれていた酢酸、プロピオン酸はＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の乳酸産生促進効果に影響しないことが確認された。
【0168】
さらに、対照となるＢａｓｉｃ改変培地とＢａｓｉｃ改変培地＋酪酸（約７．０ｍＭ）、Ｂａｓｉｃ改変培地＋吉草酸（約８．８ｍＭ）で比較を行った。結果を図１２（ｂ）に示す。対照となるＢａｓｉｃ改変液体培地上でＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株を２４時間培養した際のＯＤ、有機酸濃度を示す。ＯＤは０．５３でｐＨは６．３４であった。有機酸濃度は乳酸が約７．７７ｍＭ、酢酸が約０．８４ｍＭであった。
【0169】
Ｂａｓｉｃ改変培地＋酪酸（約７．０ｍＭ）ではＯＤが０．４５、ｐＨが６．３４であり、有機酸濃度は乳酸が約８．５８ｍＭ、酢酸が約０．６５ｍＭであった。
【0170】
Ｂａｓｉｃ改変培地＋吉草酸（約８．８ｍＭ）ではＯＤが０．５４、ｐＨが６．３２であり、有機酸濃度は乳酸が約８．６８ｍＭ、酢酸が約０．６７ｍＭであった。
これのことから、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清中に含まれたＳＣＦＡはＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の乳酸産生促進効果に影響しないことが確認された。
これのことから、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清中に含まれたＳＣＦＡはＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の乳酸産生促進効果に影響しないことが確認された。
【0171】
〈実験（１３）：Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清の凍結乾燥試験〉
これまでの結果より、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清中にＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の乳酸産生を促進する成分が含まれている可能性が示唆された。そこで、乳酸産生促進成分を推定するために、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清を凍結乾燥し、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の二段階培養試験を行った。
これまでの結果より、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清中にＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の乳酸産生を促進する成分が含まれている可能性が示唆された。そこで、乳酸産生促進成分を推定するために、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清を凍結乾燥し、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の二段階培養試験を行った。
【0172】
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清の凍結乾燥を行い、回収した粉末状のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清を高濃度で蒸留水に溶解した培養液を二段階培養に使用、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株を２４時間培養後に有機酸濃度を測定した。
【0173】
はじめに、一段階目としてＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸培地で２４時間培養したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株のＯＤと有機酸濃度を図１３（ａ）に示す。ＯＤは１．１４であり、 Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株がＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地で十分に増殖したことが確認された。またＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地上に含まれていた乳酸濃度は約５５．７ｍＭであったが、２４時間培養後には含まれていた乳酸がすべて消費されていることが確認された。さらに、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株は酢酸を約１０．３ｍＭ、プロピオン酸を約９．６３ｍＭ、イソ酪酸を約３．２９ｍＭ、酪酸を約４．３２ｍＭ、イソ吉草酸を約２．２２ｍＭ、吉草酸を約７．０３ｍＭ産生することが確認された。この培養上清３０ｍＬを凍結乾燥して粉末化したのち、１０ｍＬの滅菌水に溶解し、二段階目の培養に用いた。
【0174】
続いて、二段階目に培養したＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の有機酸濃度図１３（ｂ）に示す。Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の培養上清を含まない培地上においては乳酸を約６．７３ｍＭ、酢酸を０．２６ｍＭ産生することが確認された。また、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清凍結乾燥物を含む培地上においては乳酸を約７．１６ｍＭ産生し、その他の有機酸はほとんど測定されなかった。
この結果より、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清中に含まれるＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ乳酸産生促進成分は凍結乾燥処理を行うことで、その活性を失う可能性が示唆された。
この結果より、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養上清中に含まれるＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ乳酸産生促進成分は凍結乾燥処理を行うことで、その活性を失う可能性が示唆された。
【0175】
〈実験（１４）：Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清のアセトン沈殿がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの乳酸産生に与える影響〉
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの培養上清に含まれる乳酸産生促進物質がタンパク質であった場合、アセトン沈殿により培養上清から回収できる可能性がある。そこで、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清をアセトン沈殿によって回収し、二段階培養試験に用いることで、乳酸産生促進物質の回収が可能かどうか検証した。
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの培養上清に含まれる乳酸産生促進物質がタンパク質であった場合、アセトン沈殿により培養上清から回収できる可能性がある。そこで、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清をアセトン沈殿によって回収し、二段階培養試験に用いることで、乳酸産生促進物質の回収が可能かどうか検証した。
【0176】
一段階目としてＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地で１８時間培養した際のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株のＯＤ、有機酸濃度を図１４（ａ）に示す。
【0177】
ＯＤは０．９９であり、Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地に含まれていた乳酸５５．７ｍＭはすべて消費され酢酸が約１１．９ｍＭ、プロピオン酸が約１０．２ｍＭ、イソ酪酸が約２．２１ｍＭ、酪酸が約６．９０ｍＭ、イソ吉相酸が約２．６８ｍＭ、吉草酸が約９．５６ｍＭ産生された。
続いて、二段階目に培養したＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の有機酸濃度の結果を図１４（ｂ）に示す。Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の培養上清を含まない培地においてＯＤは０．１５であり、有機酸は乳酸が１５．１ｍＭ産生することが確認された。
続いて、二段階目に培養したＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の有機酸濃度の結果を図１４（ｂ）に示す。Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の培養上清を含まない培地においてＯＤは０．１５であり、有機酸は乳酸が１５．１ｍＭ産生することが確認された。
【0178】
Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地上で培養したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株を二段階培養で用いたサンプルではＯＤが０．０４、有機酸濃度は乳酸が１６．９ｍＭ産生されることが確認された。
【0179】
このことから、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清をアセトン沈殿し、二段階培養に使用すると菌数は大幅に減少するが、乳酸産生量はわずかに増加することが示されたが、有意差は確認されなかった。
【0180】
〈実験（１５）：Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ 培養上清の限外ろ過試験〉
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の乳酸産生促進物質の分子量を推定するために、Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地で１８時間培養し、回収した上清を限外ろ過にかけて、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の二段階培養試験を行った。有機酸濃度の結果を以下に示す。
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の乳酸産生促進物質の分子量を推定するために、Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地で１８時間培養し、回収した上清を限外ろ過にかけて、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の二段階培養試験を行った。有機酸濃度の結果を以下に示す。
【0181】
一段階目としてＢａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸培地で１８時間培養したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株のＯＤと有機酸濃度を図１５（ａ）に示す。ＯＤは１．０３であり、Ｂａｓｉｃ＋ＤＬ－乳酸液体培地に含まれていた乳酸約５４．７ｍＭはすべて消費され酢酸が約 ７．２５ｍＭ、プロピオン酸が約７．８６ｍＭ、酪酸が約６．０６ｍＭ、イソ吉相酸が約２．０９ｍＭ、吉草酸が約７．６１ｍＭ産生された。
【0182】
続いて、二段階目に培養したＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ４－４株の有機酸濃度を図１５（ｂ）に示す。Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株の培養上清を含まない培地においてＯＤは０．０９、有機酸は乳酸が６．９４ｍＭ産生することが確認された。続いて、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養液をオートクレーブ後にフィルター滅菌し、二段階培養に使用した際はＯＤが０．０５、有機酸濃度は乳酸が約１７．６ｍＭ産生された。
【0183】
さらに、Ｂａｓｉｃ液体培地を限外ろ過により分子量３，０００ Ｄａ以下の分子を二段階培養に使用した際はＯＤが０．０６、有機酸濃度は乳酸が約 ７．１４ｍＭ産生された。Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉＹ２株培養液をオートクレーブ後、フィルター滅菌し、限外ろ過により分子量３，０００ Ｄａ以下の分子を二段階培養に使用した際はＯＤが０．０６、有機酸濃度は乳酸が約 ９．８７ｍＭ産生された。
【0184】
つまり、培養液を限外ろ過処理することで分子量３０００ Ｄａ以下の分子を二段階培養した結果、分子量３０００Ｄａ以下Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清は対照と比較して有意に乳酸産生量が増加した一方で、限外ろ過処理を行う前のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清を二段階培養に用いた結果と比較すると乳酸産生促進効果が減少することが示された。
【0185】
これらの結果がＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養上清に含まれる乳酸産生促進物質は単一のものではなく、複数存在している可能性を示している。
【図1】
【図2】
【図3a】
【図3b】
【図4a】
【図4b】
【図5a】
【図5b】
【図6a】
【図6b】
【図6c】
【図6d】
【図7a】
【図7b】
【図8a】
【図8b】
【図9a】
【図9b】
【図10a】
【図10b】
【図11a】
【図11b】
【図12a】
【図12b】
【図13a】
【図13b】
【図14a】
【図14b】
【図15a】
【図15b】
【図16】