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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024132607
(43)【公開日】2024-10-01
(54)【発明の名称】植物病害防除剤
(51)【国際特許分類】
C07K 7/06 20060101AFI20240920BHJP
A01P 1/00 20060101ALI20240920BHJP
A01P 3/00 20060101ALI20240920BHJP
A01N 25/02 20060101ALI20240920BHJP
A01N 37/46 20060101ALI20240920BHJP
【ＦＩ】
C07K7/06 ZNA
A01P1/00
A01P3/00
A01N25/02
A01N37/46
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023043447
(22)【出願日】2023-03-17
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 令和４年度日本植物病理学会大会 プログラム・講演要旨予稿集、発行者 日本植物病理学会、発行日 令和４年３月１８日 令和４年度日本植物病理学会大会、発表日 令和４年３月２７日
(71)【出願人】
【識別番号】504139662
【氏名又は名称】国立大学法人東海国立大学機構
(74)【代理人】
【識別番号】110000648
【氏名又は名称】弁理士法人あいち国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】竹本 大吾
(72)【発明者】
【氏名】今野 沙弥香
【テーマコード（参考）】
4H011
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H011AA01
4H011BB19
4H011DA13
4H011DA14
4H011DH11
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA15
4H045BA32
4H045CA30
4H045FA34
4H045GA25
(57)【要約】 （修正有）
【課題】環境汚染を防止しつつ、植物の病害を抑制または防止することができる植物病害防除剤を提供する。
【解決手段】少なくとも８個のアミノ酸から構成されるペプチドを含有する植物病害防除剤である。ただし、Ｎ末端から１番目及び６番目のＢは塩基性アミノ酸を示す。また、３番目及び４番目のＢはシステイン以外の中性アミノ酸を示す。
【選択図】なし
【解決手段】少なくとも８個のアミノ酸から構成されるペプチドを含有する植物病害防除剤である。ただし、Ｎ末端から１番目及び６番目のＢは塩基性アミノ酸を示す。また、３番目及び４番目のＢはシステイン以外の中性アミノ酸を示す。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１に示す少なくとも８個のアミノ酸（ただし、Ｎ末端から１番目及び６番目のＢは塩基性アミノ酸を示し、３番目及び４番目のＢはシステイン以外の中性アミノ酸を示す。）から構成されるペプチドを含有する、植物病害防除剤。
【請求項2】
上記ペプチドが、配列番号２に示す少なくとも８個のアミノ酸から構成されている、請求項１に記載の植物病害防除剤。
【請求項3】
上記ペプチドがジスルフィド結合を有する、請求項１又は２に記載の植物病害防除剤。
【請求項4】
上記ペプチドの濃度が５μＭ以上の液体からなる、請求項１又は２に記載の植物病害防除剤。
【請求項5】
胞子によって増殖する植物病原性微生物が引き起こす病害に対して使用される、請求項１又は２に記載の植物病害防除剤。
【請求項6】
上記植物病原性微生物が植物病原性卵菌又は植物病原性真菌である、請求項５に記載の植物病害防除剤。
【請求項7】
農作物に用いられる、請求項１又は２に記載の植物病害防除剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ペプチドを含有する植物病害防除剤に関する。
【背景技術】
【0002】
植物は、病原性微生物に感染すると病害を引き起こすことがある。特に農作物の病害は、生産者にとっての大きな問題となっている。
【0003】
植物は病原性微生物による病害に対して多様性を有し、植物の罹病性や抵抗性は植物や病原性微生物の種類によって異なることが知られている。例えばベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）は、ナス科タバコ属に属する植物であり、ナス科のモデル植物として知られているが、同じナス科であるトマトやジャガイモが罹病するジャガイモ疫病菌（Phytophthora infestans）に対して抵抗性を有する。
【0004】
ＳＡＲ８．２遺伝子ファミリーは、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）感染やエリシター処理によって活性化される全身獲得抵抗性の誘導に伴って発現する遺伝子群としてベンサミアナタバコから単離された。これまでに、ベンサミアナタバコのＮｂＳＡＲ８．２ｍ遺伝子の発現と植物の病害に対する抵抗性との関係が示唆されているもののその機能は十分明らかになっておらず、機能解析が進められている（特許文献１及び２、非特許文献１～３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】米国特許５７６７３６９号明細書
【特許文献2】米国特許９９５７５２２号明細書
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】モレキュラー プラント－マイクローブ インタラクションズ（MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS）、米国、１９９２年、第５巻、第６号、ｐ．５１３－５１５
【非特許文献2】プラント モレキュラー バイオロジー（Plant Molecular Biology）、韓国、２００６年、第６１巻、ｐ．９５－１０９
【非特許文献3】ファンクショナル プラント バイオロジー（Functional Plant Biology）、カナダ、２００５年、第３２巻、ｐ．２５９－２６６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
病原性微生物による植物病害の抑制、防止には、殺菌作用を有する化学農薬が有効であるものの、農薬は、圃場だけでなく周囲の土壌、河川、大気などの自然環境を汚染させる可能性があるため、その使用には懸念がある。したがって、化学農薬以外の病害防除剤の開発が望まれている。
【0008】
本発明は、かかる課題に鑑みてなされたものであり、環境汚染を防止しつつ、植物の病害を抑制または防止することができる植物病害防除剤を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明の一態様は、下記の［１］～［７］にかかる植物病害防除剤にある。
［１］配列番号１に示す少なくとも８個のアミノ酸（ただし、Ｎ末端から１番目及び６番目のＢは塩基性アミノ酸を示し、３番目及び４番目のＢはシステイン以外の中性アミノ酸を示す。）から構成されるペプチドを含有する、植物病害防除剤。
［１］配列番号１に示す少なくとも８個のアミノ酸（ただし、Ｎ末端から１番目及び６番目のＢは塩基性アミノ酸を示し、３番目及び４番目のＢはシステイン以外の中性アミノ酸を示す。）から構成されるペプチドを含有する、植物病害防除剤。
【0010】
［２］上記ペプチドが、配列番号２に示す少なくとも８個のアミノ酸から構成されている、［１］に記載の植物病害防除剤。
［３］上記ペプチドがジスルフィド結合を有する、［１］又は［２］に記載の植物病害防除剤。
［４］上記ペプチドの濃度が５μＭ以上の液体からなる、［１］～［３］のいずれかに記載の植物病害防除剤。
［３］上記ペプチドがジスルフィド結合を有する、［１］又は［２］に記載の植物病害防除剤。
［４］上記ペプチドの濃度が５μＭ以上の液体からなる、［１］～［３］のいずれかに記載の植物病害防除剤。
【0011】
［５］胞子によって増殖する植物病原性微生物が引き起こす病害に対して使用される、［１］～［４］のいずれかに記載の植物病害防除剤。
［６］上記植物病原性微生物が植物病原性卵菌又は植物病原性真菌である、［５］に記載の植物病害防除剤。
［７］農作物に用いられる、［１］～［６］のいずれかに記載の植物病害防除剤。
［６］上記植物病原性微生物が植物病原性卵菌又は植物病原性真菌である、［５］に記載の植物病害防除剤。
［７］農作物に用いられる、［１］～［６］のいずれかに記載の植物病害防除剤。
【発明の効果】
【0012】
配列番号１に示す少なくとも８個のアミノ酸から構成されるペプチドは、植物の病害に対する抵抗性の誘導活性を有する。そのため、上記ペプチドを含有する植物病害防除剤は、植物の病害を抑制または防止することができる。さらに、ペプチドは、自然環境下で容易に分解される。そのため、たとえ土壌、水質、大気に流出しても汚染の懸念がなく、環境汚染を防止することができる。
【0013】
以上のごとく、上記態様によれば、環境汚染を防止しつつ、植物の病害を抑制または防止することができる植物病害防除剤を提供することができる。
なお、特許請求の範囲及び課題を解決する手段に記載した括弧内の符号は、後述する実施形態に記載の具体的手段との対応関係を示すものであり、本発明の技術的範囲を限定するものではない。
なお、特許請求の範囲及び課題を解決する手段に記載した括弧内の符号は、後述する実施形態に記載の具体的手段との対応関係を示すものであり、本発明の技術的範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図6】図６（ａ）は、実施例２における各ペプチドによるジャガイモ疫病菌の発芽抑制効果を示すグラフ、図６（ｂ）は、実施例２における変異型のＳＡＲ８．２ｍペプチドによるジャガイモ疫病菌の発芽抑制効果を示す写真であり、図６（ｃ）は、実施例２における未酸化型のＳＡＲ８．２ｍペプチドによるジャガイモ疫病菌の発芽抑制効果を示す写真であり、図６（ｄ）は、実施例２における酸化型のＳＡＲ８．２ｍペプチドによるジャガイモ疫病菌の発芽抑制効果を示す写真である。
【図7】図７（ａ）は、実施例２における各ペプチドによるブロッコリー黒すす病菌の発芽抑制効果を示すグラフ、図７（ｂ）は、実施例２における変異型のＳＡＲ８．２ｍペプチドによるブロッコリー黒すす病菌の発芽抑制効果を示す写真であり、図７（ｃ）は、実施例２における未酸化型のＳＡＲ８．２ｍペプチドによるブロッコリー黒すす病菌の発芽抑制効果を示す写真であり、図７（ｄ）は、実施例２における酸化型のＳＡＲ８．２ｍペプチドによるブロッコリー黒すす病菌の発芽抑制効果を示す写真である。
【図8】図８（ａ）は、実施例２における各ペプチドによるメロンつる割病菌の発芽抑制効果を示すグラフ、図８（ｂ）は、変異型のＳＡＲ８．２ｍペプチドによるメロンつる割病菌の発芽抑制効果を示す写真であり、図８（ｃ）は、未酸化型のＳＡＲ８．２ｍペプチドによるメロンつる割病菌の発芽抑制効果を示す写真であり、図８（ｄ）は、酸化型のＳＡＲ８．２ｍペプチドによるメロンつる割病菌の発芽抑制効果を示す写真である。
【図9】図９（ａ）は、実施例３における各ペプチドによる灰色かび病菌の発芽抑制効果を示すグラフ、図９（ｂ）は、実施例３における変異型のＳＡＲ８．２ｍペプチドによる灰色かび病菌の発芽抑制効果を示す写真であり、図９（ｃ）は、実施例３における未酸化型のＳＡＲ８．２ｍペプチドによる灰色かび病菌の発芽抑制効果を示す写真であり、図９（ｄ）は、実施例３における酸化型のＳＡＲ８．２ｍペプチドによる灰色かび病菌の発芽抑制効果を示す写真である。
【図12】図１２（ａ）は、［配列番号５］のNbSAR8.2aのアミノ酸配列であり、図１２（ｂ）は、［配列番号６］のNbSAR8.2bのアミノ酸配列であり、図１２（ｃ）は、［配列番号７］のNbSAR8.2dのアミノ酸配列であり、図１２（ｄ）は、［配列番号８］のNbSAR8.2mのアミノ酸配列であり、図１２（ｅ）は、［配列番号９］のNtSAR8.2aのアミノ酸配列である。
【図13】図１３（ａ）は、［配列番号１０］のNtSAR8.2bのアミノ酸配列であり、図１３（ｂ）は、［配列番号１１］のNtSAR8.2cのアミノ酸配列であり、図１３（ｃ）は、［配列番号１２］のNtSAR8.2dのアミノ酸配列であり、図１３（ｄ）は、［配列番号１３］のNtSAR8.2eのアミノ酸配列であり、図１３（ｅ）は、［配列番号１４］のNtSAR8.2hのアミノ酸配列である。
【図14】図１４（ａ）は、［配列番号１５］のNtSAR8.2iのアミノ酸配列であり、図１４（ｂ）は、［配列番号１６］のNtSAR8.2jのアミノ酸配列であり、図１４（ｃ）は、［配列番号１７］のNtSAR8.2kのアミノ酸配列であり、図１４（ｄ）は、［配列番号１８］のNtSAR8.2mのアミノ酸配列であり、図１４（ｅ）は、［配列番号１９］のNitab4.5_0000037g0340.1.のアミノ酸配列である。
【図15】図１５（ａ）は、［配列番号２０］のNitab4.5_0000037g0360.1のアミノ酸配列であり、図１５（ｂ）は、［配列番号２１］のNitab4.5_0000309g0200.1のアミノ酸配列であり、図１５（ｃ）は、［配列番号２２］のLOC104086212のアミノ酸配列であり、図１５（ｄ）は、［配列番号２３］のLOC104104830のアミノ酸配列であり、図１５（ｅ）は、［配列番号２４］のLOC104119564のアミノ酸配列である。
【図16】図１６（ａ）は、［配列番号２５］のmRNA_63025_cdsのアミノ酸配列であり、図１６（ｂ）は、［配列番号２６］のmRNA_79697_cdsのアミノ酸配列であり、図１６（ｃ）は、［配列番号２７］のLOC104234595のアミノ酸配列であり、図１６（ｄ）は、［配列番号２８］のCaSAR8.2Aのアミノ酸配列であり、図１６（ｅ）は、［配列番号２９］のCaSAR8.2Bのアミノ酸配列である。
【図17】図１７（ａ）は、［配列番号３０］のCaSAR8.2Cのアミノ酸配列であり、図１７（ｂ）は、［配列番号３１］のCaSAR8.2Dのアミノ酸配列であり、図１７（ｃ）は、［配列番号３２］のCQW23_08460のアミノ酸配列であり、図１７（ｄ）は、［配列番号３３］のCQW23_08471のアミノ酸配列であり、図１７（ｅ）は、［配列番号３４］のCQW23_08712のアミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
植物病害防除剤は、配列番号１に示す少なくとも８個のアミノ酸から構成されるペプチドを含有する（図１（ｃ）参照）。配列番号１におけるＮ末端から１番目及び６番目のＢは塩基性アミノ酸を示し、３番目及び４番目のＢはシステイン以外の中性アミノ酸を示す。なお、本明細書では、配列番号１に示す少なくとも８個のアミノ酸から構成されるペプチドのことを適宜「ＳＡＲ８．２ｍペプチド」と称する。
【0016】
ＳＡＲ８．２ｍペプチドは、ベンサミアナタバコのＳＡＲ８．２ファミリーのひとつであるＮｂＳＡＲ８．２ｍの成熟型ペプチドと５０％以上の相同性を有し、４個のシステインを有するペプチドである。
ＮｂＳＡＲ８．２ｍ遺伝子は、図１（ａ）に示す配列番号３のアミノ酸配列を有する約７ｋＤａのタンパク質をコードしている。このタンパク質は、システインリッチであり、配列番号３における１～２６番目のアミノ酸からなる配列に分泌シグナルを有する（図１（ａ）参照）。分泌シグナルを有するＮｂＳＡＲ８．２ｍタンパク質は、ベンサミアナタバコの細胞外に分泌された後、８個のアミノ酸配列から構成される上述の成熟型のＮｂＳＡＲ８．２ｍペプチドとなる。成熟型のＮｂＳＡＲ８．２ｍペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に示す（図１（ｂ）参照）。
ＮｂＳＡＲ８．２ｍ遺伝子は、図１（ａ）に示す配列番号３のアミノ酸配列を有する約７ｋＤａのタンパク質をコードしている。このタンパク質は、システインリッチであり、配列番号３における１～２６番目のアミノ酸からなる配列に分泌シグナルを有する（図１（ａ）参照）。分泌シグナルを有するＮｂＳＡＲ８．２ｍタンパク質は、ベンサミアナタバコの細胞外に分泌された後、８個のアミノ酸配列から構成される上述の成熟型のＮｂＳＡＲ８．２ｍペプチドとなる。成熟型のＮｂＳＡＲ８．２ｍペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に示す（図１（ｂ）参照）。
【0017】
ＳＡＲ８．２ｍペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列と５０％以上の相同性（つまり、同一性）を有する少なくとも８個のアミノ酸から構成されると共に、上記配列番号２に示すアミノ酸配列と同じ位置に４つのシステインを有するペプチドであるといえる。配列番号２に示すアミノ酸配列において、アルギニン及び／又はリシンは、それぞれ他の塩基性アミノ酸に置き換えられていれもよく、ロイシン及び／又はアラニンは、それぞれ、システイン以外の他の中性アミノ酸に置き換えられてもよい。
【0018】
植物病害防除剤は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する少なくとも８個のアミノ酸をからなるＳＡＲ８．２ｍペプチドを含有するが、本願の所望の効果を示す限り、Ｎ末端及び／又はＣ末端にさらにアミノ酸残基が追加されていてもよい。病害抑制又は防止効果の低下を抑制する観点から、Ｎ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸残基は、システイン以外のアミノ酸であることが好ましい。また、同様の観点から、ＳＡＲ８．２ｍペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に追加されるアミノ酸残基の数は、それぞれ１～３個であることが好ましい。
【0019】
ＳＡＲ８．２ｍペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列と７５％以上の相同性を有することが好ましく、８５％以上の相同性を有することがより好ましく、９５％以上の相同性を有することがさらに好ましい。この場合には、ＳＡＲ８．２ｍペプチドは、ＮｂＳＡＲ８．２ｍ成熟型ペプチドとの同一性が高くなり、植物の病害抑制効果または防止効果が向上する。
【0020】
配列番号２に示す少なくとも８個のアミノ酸配列との類似性の観点から、配列番号１におけるＮ末端から１番目のＢは、塩基性アミノ酸の中でもアルギニン又はリシンであることが好ましく、アルギニンであることがより好ましい。Ｎ末端から６番目Ｂも同様であり、塩基性アミノ酸の中でもアルギニン又はリシンであることが好ましく、アルギニンであることがより好ましい。
また、配列番号２に示す少なくとも８個のアミノ酸配列との類似性の観点から、配列番号１におけるＮ末端から３番目のＢは、中性アミノ酸の中でも、脂肪族アミノ酸であることが好ましく、ロイシン、イソロイシン、又はアラニンであることがより好ましく、ロイシン又はイソロイシンであることがより好ましく、ロイシンであることがさらに好ましい。Ｎ末端から４番目のＢは、中性アミノ酸の中でも、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、又はイソロイシンであることが好ましく、アラニン、フェニルアラニン、又はグリシンであることがより好ましく、アラニンであることがさらに好ましい。
また、配列番号２に示す少なくとも８個のアミノ酸配列との類似性の観点から、配列番号１におけるＮ末端から３番目のＢは、中性アミノ酸の中でも、脂肪族アミノ酸であることが好ましく、ロイシン、イソロイシン、又はアラニンであることがより好ましく、ロイシン又はイソロイシンであることがより好ましく、ロイシンであることがさらに好ましい。Ｎ末端から４番目のＢは、中性アミノ酸の中でも、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、又はイソロイシンであることが好ましく、アラニン、フェニルアラニン、又はグリシンであることがより好ましく、アラニンであることがさらに好ましい。
【0021】
ＳＡＲ８．２ｍペプチドは、配列番号２に示す少なくとも８個のアミノ酸から構成されていることが好ましい。この場合には、ペプチドは、ベンサアミノタバコが有する病害抵抗性と同程度の病害抵抗性を示し、病害抑制効果または防止効果が向上する。
【0022】
ＳＡＲ８．２ｍペプチドは、例えばペプチド合成により製造される。また、ベンサミアナタバコの培養液から、分泌ペプチドを抽出し、周知のクロマトグラフィ法を用いて抽出物からＮｂＳＡＲ８．２ｍペプチドを含む画分を精製することによっても得られる。
また、ＳＡＲ８．２ｍペプチドをコードするＳＡＲ８．２ｍ遺伝子を組み込んだベクターを構築し、ベクターを例えばシロイヌナズナ等の植物に導入した植物形質転換体得た後、形質転換体から分泌ペプチドを抽出し、クロマトグラフィにより精製することによってもＳＡＲ８．２ｍペプチドを得ることができる。形質転換体の製造は、例えば、プラント バイオテクノロジー（Plant Biotechnology）、日本、２０１０年、第２７巻、ｐ．３４９－３５１の記載に基づいて行うことができる。
また、ＳＡＲ８．２ｍペプチドをコードするＳＡＲ８．２ｍ遺伝子を組み込んだベクターを構築し、ベクターを例えばシロイヌナズナ等の植物に導入した植物形質転換体得た後、形質転換体から分泌ペプチドを抽出し、クロマトグラフィにより精製することによってもＳＡＲ８．２ｍペプチドを得ることができる。形質転換体の製造は、例えば、プラント バイオテクノロジー（Plant Biotechnology）、日本、２０１０年、第２７巻、ｐ．３４９－３５１の記載に基づいて行うことができる。
【0023】
ＳＡＲ８．２ｍペプチドは、ジスルフィド結合を有することが好ましい。ＳＡＲ８．２ｍペプチドは、ペプチド内に少なくとも１組のジスルフィド結合を有することが好ましく、２組のジスルフィド結合を有することがより好ましい。この場合には、植物の病害抑制または防止効果が向上する。ジスルフィド結合は、ＳＡＲ８．２ｍペプチドの酸化により形成される。ＳＡＲ８．２ｍペプチドは、４つのシステインを有しており、酸化により、少なくとも４つのシステインにより２組のジスルフィド結合が形成される。
【0024】
植物病害防除剤は、固体（具体的には、粉体）であっても液体であってもよく、粉体のＳＡＲ８．２ｍペプチドを封入した水溶性のカプセルであってもよい。植物病害防除剤は、例えば、農薬（つまり、ペプチド農薬）として圃場に散布されたり、たい肥や肥料として圃場に供給される。
【0025】
植物病害防除剤は、液体であることが好ましい。この場合には、散布などによる植物への供給が容易になる。また、病害抑制効果または防止効果が向上する観点から、液体中のＳＡＲ８．２ｍペプチドの濃度は１μＭ以上であることが好ましく、５μＭ以上であることがより好ましく、１０μＭ以上であることがさらに好ましい。生産性やコストの観点、濃度上昇に見合った向上効果得られなくなる観点、環境中への残留を避けるという観点から、液体状の植物病害防除剤の濃度は１００μＭ以下であることが好ましく、５０μＭ以下であることがより好ましく、３０μＭ以下がさらに好ましい。
【0026】
後述の実施例において示されるように、ＳＡＲ８．２ｍペプチドは微生物の胞子の発芽を抑制、防止する効果を有する。植物病害防除剤による病害抑制効果または防止効果が向上する観点から、植物病害防除剤は、胞子によって増殖する病原性微生物が引き起こす病害に対して使用されることが好ましい。より好ましくは、植物病原性糸状菌等の真菌、又は植物病原性卵菌が引き起こす病害に使用される。
【0027】
植物病原性卵菌としては、具体的には、ジャガイモ疫病菌（Phytophthora infestans）、タイズ茎疫病菌（Phytophthora sojae）、疫病菌（多犯性）（Phytophthora nicotianae）、疫病菌（多犯性）（Phytophthora capsici）、苗立枯病菌（多犯性）（Pythium aphanidermatum）苗立枯病菌（多犯性）（Pythium ultimum）等がある。
【0028】
植物病原性糸状菌としては、具体的には、ブロッコリー黒すす病菌（Alternaria brassicicola）、メロンつる割病菌（Fusarium oxysporum f. sp. melonis）、灰色かび病菌（多犯性）（Botrytis cinerea）、ウリ類炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）、トマト萎凋病菌（Fusarium oxysporum f. sp.lycopersici）、イネいもち病菌（Pyricularia oryzae）、菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）半身萎凋病（多犯性）（Verticillium dahliae）等がある。
【0029】
糸状菌以外の植物病原性真菌としては、具体的には、トウモロコシ黒穂病（Ustilago maydis）、オオムギ堅黒穂病（Ustilago hordei）、イネ墨黒穂病（Tilletia horrida）、アワ黒穂病（Macalpinomyces tanakae）モロコシ裸黒穂病（Sporisorium cruentum）等がある。
【0030】
植物病害防除剤は、農作物に用いられることが好ましい。この場合には、植物病害防除剤の有用性がより顕著になる。これは、上述のように、植物病害防除剤が灰色かび病菌等の植物病原性真菌やジャガイモ疫病菌等の植物病原性卵菌に対してその胞子発芽の抑制効果や防止効果を示し、これらの植物病原性微生物は、農作物に対して深刻な病害を引き起こすためである。また、灰色かび病菌等の植物病原性真菌は、農作物だけでなくほぼすべての植物に対する感染性を有する。したがって、植物病害防除剤は、農作物だけでなく、植物全般の病害防除に有効である可能性が高い。
【実施例0031】
［実施例１］
本例は、質量分析により、ＳＡＲ８．２ｍペプチドの構造解析を行うである。具体的には、まず、植物から抽出したＳＡＲ８．２ｍペプチドについて解析を行った。
本例は、質量分析により、ＳＡＲ８．２ｍペプチドの構造解析を行うである。具体的には、まず、植物から抽出したＳＡＲ８．２ｍペプチドについて解析を行った。
【0032】
・植物の水中培養及びペプチド画分の抽出
ＳＡＲ８．２ｍ遺伝子を導入したシロイヌナズナＣｏｌ－０株の芽生え約５０個体をスクロース濃度１．０質量％のガンボーグＢ５液体培地１００ｍｌに入れ、照度１５０００ｌｕｘの明条件、温度２２℃の植物インキュベータ内で３週間静置することにより水中培養を行った。なお、ＳＡＲ８．２ｍ遺伝子を導入したシロイヌナズナの形質転換体の製造は、プラント バイオテクノロジー（Plant Biotechnology）、日本、２０１０年、第２７巻、ｐ．３４９－３５１の記載に基づいて行った。また、ガンボーグＢ５液体培地は水溶液であり、その組成は、スクロース：１質量％、硝酸カリウム：０.２５質量％、硫酸マグネシウム七水和物：０.０２５質量％、りん酸二水素ナトリウム一水和物：０.０１５質量％、塩化カルシウム二水和物：０.０１５質量％、硫酸アンモニウム：０.０１３４質量％、エチレンジアミン四酢酸 二ナトリウム：０.００３７３質量％、硫酸鉄(II)七水和物：０.００２７８質量％、硫酸マンガン一水和物：０.００１０質量％、ホウ酸：０.０００３質量％、硫酸亜鉛七水和物：０.０００２質量％、よう化カリウム：０.００００７５質量％、モリブデン(VI)酸二ナトリウム二水和物：０.００００２５質量％、硫酸銅(II)五水和物：０.０００００２５質量％、塩化コバルト(II)六水和物：０.０００００２５質量％である。水中培養後の培養液を回収し、ロータリーエバポレーターにより、培養液約１００ｍｌを５倍に濃縮した。濃縮後の培養液に最終濃度１質量％となるようにＮ－エチルモルホリンを加え、さらに水飽和ｏ－クロロフェノール１０ｍｌを加えて、１分間室温で振とうした。次いで、ｏ－クロロフェノールを加えた培養液を５０００×ｇの条件で１０分間遠心し、遠心後に１０ｍｌのフェノール層を回収した。回収物に最終濃度０．０２質量％となるように１質量％フィコールを加えた後に４０ｍｌのアセトンを加え、－２０℃で一晩静置することにより、沈殿を形成させた。このようにしてペプチド画分を含むサンプルを得た。このサンプルを５０００×ｇの条件で１０分間遠心した。次いで、アセトンを取り除いた後、沈殿に再び２０ｍｌのアセトンを加えて、同条件（つまり、５０００×ｇ、１０分間）で遠心を行うことにより沈殿を洗浄した。この沈殿を風乾させ、超純水により懸濁させた。このようにして得られた懸濁液には、各植物から分泌されるペプチド画分が含まれている。この懸濁液をジチオトレイトール処理により還元した後に、ヨードアセトアミド処理によりアルキル化し、この懸濁液を下記のナノＬＣ－ＭＳ分析（つまり、ナノ液体クロマトグラフィ質量分析）に供試した。
ＳＡＲ８．２ｍ遺伝子を導入したシロイヌナズナＣｏｌ－０株の芽生え約５０個体をスクロース濃度１．０質量％のガンボーグＢ５液体培地１００ｍｌに入れ、照度１５０００ｌｕｘの明条件、温度２２℃の植物インキュベータ内で３週間静置することにより水中培養を行った。なお、ＳＡＲ８．２ｍ遺伝子を導入したシロイヌナズナの形質転換体の製造は、プラント バイオテクノロジー（Plant Biotechnology）、日本、２０１０年、第２７巻、ｐ．３４９－３５１の記載に基づいて行った。また、ガンボーグＢ５液体培地は水溶液であり、その組成は、スクロース：１質量％、硝酸カリウム：０.２５質量％、硫酸マグネシウム七水和物：０.０２５質量％、りん酸二水素ナトリウム一水和物：０.０１５質量％、塩化カルシウム二水和物：０.０１５質量％、硫酸アンモニウム：０.０１３４質量％、エチレンジアミン四酢酸 二ナトリウム：０.００３７３質量％、硫酸鉄(II)七水和物：０.００２７８質量％、硫酸マンガン一水和物：０.００１０質量％、ホウ酸：０.０００３質量％、硫酸亜鉛七水和物：０.０００２質量％、よう化カリウム：０.００００７５質量％、モリブデン(VI)酸二ナトリウム二水和物：０.００００２５質量％、硫酸銅(II)五水和物：０.０００００２５質量％、塩化コバルト(II)六水和物：０.０００００２５質量％である。水中培養後の培養液を回収し、ロータリーエバポレーターにより、培養液約１００ｍｌを５倍に濃縮した。濃縮後の培養液に最終濃度１質量％となるようにＮ－エチルモルホリンを加え、さらに水飽和ｏ－クロロフェノール１０ｍｌを加えて、１分間室温で振とうした。次いで、ｏ－クロロフェノールを加えた培養液を５０００×ｇの条件で１０分間遠心し、遠心後に１０ｍｌのフェノール層を回収した。回収物に最終濃度０．０２質量％となるように１質量％フィコールを加えた後に４０ｍｌのアセトンを加え、－２０℃で一晩静置することにより、沈殿を形成させた。このようにしてペプチド画分を含むサンプルを得た。このサンプルを５０００×ｇの条件で１０分間遠心した。次いで、アセトンを取り除いた後、沈殿に再び２０ｍｌのアセトンを加えて、同条件（つまり、５０００×ｇ、１０分間）で遠心を行うことにより沈殿を洗浄した。この沈殿を風乾させ、超純水により懸濁させた。このようにして得られた懸濁液には、各植物から分泌されるペプチド画分が含まれている。この懸濁液をジチオトレイトール処理により還元した後に、ヨードアセトアミド処理によりアルキル化し、この懸濁液を下記のナノＬＣ－ＭＳ分析（つまり、ナノ液体クロマトグラフィ質量分析）に供試した。
【0033】
・ナノＬＣ－ＭＳ分析
ナノＬＣ－ＭＳ分析は、ＫＹＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製「ＤｉＮａ－Ｍ ｓｐｌｉｔｌｅｓｓ ｎａｎｏ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製の「ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ」を用いて行った。
具体的には、まず、ペプチド画分サンプル（上述の懸濁液）５ μｌをプレカラム（具体的には、ＫＹＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製の「Ｃ１８トラップカラム（内径：０．５ｍｍ、長さ：１ｍｍのカートリッジカラム）」にロードし、０．１質量％ギ酸水溶液１０ｍｌで洗浄した。次いで、プレカラムから溶出したペプチド画分サンプルを、ジーエル社製の「ＭｏｎｏＣａｐ Ｃ１８ Ｆａｓｔ－ｆｌｏｗ ｎａｎｏ－ｃｏｌｕｍｎ（内径１００ｎｍ、長さ１５０ｍｍ）」により分離させた。溶出時間は３０分間であり、溶出溶媒としては０．１質量％ギ酸水溶液を含む２～５０質量％グラジエントのアセトニトリルを用い、流速条件は５００ｎｌ／ｍｉｎである。
タンデムマススペクトル測定は、ＨＣＤフラグメンテーション手法を用いたｄａｔａ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓにより、ｍ／ｚ４００～２０００までの質量範囲（より具体的には、質量電荷比の範囲）をスキャンすることにより行った。データ解析は、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製「Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ １．３ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＭＥＱＵＥＳＴ ｓｅａｒｃｈ ｅｎｇｉｎｅ」を用いて行った。図２に、全イオンクロマトグラムの結果を示し、図３に、ＮｂＳＡＲ８．２ペプチドのＭＳ／ＭＳ解析の結果を示す。
ナノＬＣ－ＭＳ分析は、ＫＹＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製「ＤｉＮａ－Ｍ ｓｐｌｉｔｌｅｓｓ ｎａｎｏ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製の「ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ」を用いて行った。
具体的には、まず、ペプチド画分サンプル（上述の懸濁液）５ μｌをプレカラム（具体的には、ＫＹＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製の「Ｃ１８トラップカラム（内径：０．５ｍｍ、長さ：１ｍｍのカートリッジカラム）」にロードし、０．１質量％ギ酸水溶液１０ｍｌで洗浄した。次いで、プレカラムから溶出したペプチド画分サンプルを、ジーエル社製の「ＭｏｎｏＣａｐ Ｃ１８ Ｆａｓｔ－ｆｌｏｗ ｎａｎｏ－ｃｏｌｕｍｎ（内径１００ｎｍ、長さ１５０ｍｍ）」により分離させた。溶出時間は３０分間であり、溶出溶媒としては０．１質量％ギ酸水溶液を含む２～５０質量％グラジエントのアセトニトリルを用い、流速条件は５００ｎｌ／ｍｉｎである。
タンデムマススペクトル測定は、ＨＣＤフラグメンテーション手法を用いたｄａｔａ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓにより、ｍ／ｚ４００～２０００までの質量範囲（より具体的には、質量電荷比の範囲）をスキャンすることにより行った。データ解析は、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製「Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ １．３ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＭＥＱＵＥＳＴ ｓｅａｒｃｈ ｅｎｇｉｎｅ」を用いて行った。図２に、全イオンクロマトグラムの結果を示し、図３に、ＮｂＳＡＲ８．２ペプチドのＭＳ／ＭＳ解析の結果を示す。
【0034】
図２に示すように、ｍ／ｚ＝５７８．２４の位置に現れるピークが成熟型のＮｂＳＡＲ８．２ペプチドのアルキル化したものである。還元処理を施さない場合にはＮｂＳＡＲ８．２ペプチドが検出されないため、ジスルフィド結合が形成されていることがわかる。
また、図３から理解されるように、フラグメントイオンの特徴からＮｂＳＡＲ８．２の８アミノ酸のペプチドが特定された。、ＮｂＳＡＲ８．２ペプチド内ではジスルフィド結合が形成されていることがわかる。
また、図３から理解されるように、フラグメントイオンの特徴からＮｂＳＡＲ８．２の８アミノ酸のペプチドが特定された。、ＮｂＳＡＲ８．２ペプチド内ではジスルフィド結合が形成されていることがわかる。
【0035】
次に、ペプチド合成により製造されたＳＡＲ８．２ペプチドについて解析を行った。
まず、配列番号２に示す８アミノ酸からなるＳＡＲ８．２ペプチドの合成を行った。ペプチド合成は、ユーロフィンジェノミクス社に委託した。
まず、配列番号２に示す８アミノ酸からなるＳＡＲ８．２ペプチドの合成を行った。ペプチド合成は、ユーロフィンジェノミクス社に委託した。
【0036】
次に、ペプチド合成により得られたＳＡＲ８．２ｍペプチド（つまり、未酸化型のＳＡＲ８．２ｍペプチド）を用いて酸化型のＳＡＲ８．２ｍペプチドを作製した。具体的には、まず、ｐＨ８．０の５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液に４ｍＭのＳＡＲ８．２ｍペプチドおよび４ｍＭのシスチンを添加することによりペプチド溶液を作製し、このペプチド溶液を２日間攪拌することにより、ペプチドを酸化させた。その後、逆相クロマトグラフィにより、酸化型のＳＡＲ８．２ｍペプチド溶液の精製を行った。このようにして、酸化型のＳＡＲ８．２ｍペプチドを得た。
【0037】
次に、未酸化型及び酸化型のＳＡＲ８．２ｍペプチドサンプルを、それぞれＭＡＬＤＩ－ＴｏＦＭＳ分析（つまり、マトリクス支援レーザ脱離イオン化飛行時間質量分析）に供試した。具体的には、まず、マトリクス（つまり、イオン化支援剤）として、α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸を準備し、α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸とサンプルとを混合し、その混合物をプレート上で結晶化させた。結晶化物のＭＡＬＤＩ－ＴｏＦＭＳ分析を、エービーサイエックス社製の「ＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＴＯＦ／ＴＯＦ ５８００」を使用してリフレクターモードにて行った。未酸化型のＮｂＳＡＲ８．２ｍペプチドのマススペクトルを図４に示し、酸化型のＮｂＳＡＲ８．２ｍペプチドのマススペクトルを図５に示す。
【0038】
図４より理解されるように、未酸化型のＳＡＲ８．２ｍペプチドのマススペクトルでは、アミノ酸配列から推定される質量が検出されるため、未酸化型のＳＡＲ８．２ペプチドは、ジスルフィド結合を有しておらず、直鎖状であることがわかる。
一方、図５より理解されるように、酸化型のＳＡＲ８．２ｍペプチドのマススペクトルでは、未酸化型のＳＡＲ８．２ペプチドの質量と比較して分子量が約３.７少ないため、酸化型のＳＡＲ８．２ペプチドは、２組のジスルフィド結合を有し、ペプチド内に環状構造を有していることがわかる。
一方、図５より理解されるように、酸化型のＳＡＲ８．２ｍペプチドのマススペクトルでは、未酸化型のＳＡＲ８．２ペプチドの質量と比較して分子量が約３.７少ないため、酸化型のＳＡＲ８．２ペプチドは、２組のジスルフィド結合を有し、ペプチド内に環状構造を有していることがわかる。
【0039】
［実施例２］
本例は、ＳＡＲ８．２ｍペプチドの抗菌活性を評価する例である。
本例は、ＳＡＲ８．２ｍペプチドの抗菌活性を評価する例である。
【0040】
・供試菌の調製
＜卵菌＞
卵菌として、ジャガイモ疫病菌（Phytophthora infestans）の菌株０８ＹＤ１（レース：１．３．４．１０）を準備した。菌株０８ＹＤ１のレース：１．３．４．１０は、北海道立北見農業試験場から分与されたものを使用した。温度２０℃の暗条件で、ライ麦培地［雪印種苗社製の「春一番」、２ｇ／ｌ酵母エキス、２０ｇ／ｌショ糖、１．５質量％寒天］上で菌株を培養した。培養開始から１週間後に、遊走子のうを超純水中に掻き取り、懸濁液を得た。懸濁液１ｍｌを遠心分離し、上清を取り除いた後、超純水を加えた。なお、遠心分離は、室温（具体的には、２５℃）、回転数３０００ｒｐｍで５分間行った。このようにして、ジャガイモ疫病菌の供試菌サンプルを得た。
＜卵菌＞
卵菌として、ジャガイモ疫病菌（Phytophthora infestans）の菌株０８ＹＤ１（レース：１．３．４．１０）を準備した。菌株０８ＹＤ１のレース：１．３．４．１０は、北海道立北見農業試験場から分与されたものを使用した。温度２０℃の暗条件で、ライ麦培地［雪印種苗社製の「春一番」、２ｇ／ｌ酵母エキス、２０ｇ／ｌショ糖、１．５質量％寒天］上で菌株を培養した。培養開始から１週間後に、遊走子のうを超純水中に掻き取り、懸濁液を得た。懸濁液１ｍｌを遠心分離し、上清を取り除いた後、超純水を加えた。なお、遠心分離は、室温（具体的には、２５℃）、回転数３０００ｒｐｍで５分間行った。このようにして、ジャガイモ疫病菌の供試菌サンプルを得た。
【0041】
＜真菌＞
真菌としては、糸状菌を評価に用いた。具体的には、ブロッコリー黒すす病菌、メロンつる割病菌、灰色かび病菌を使用した。
真菌としては、糸状菌を評価に用いた。具体的には、ブロッコリー黒すす病菌、メロンつる割病菌、灰色かび病菌を使用した。
【0042】
「ブロッコリー黒すす病菌」
ブロッコリー黒すす病菌（Alternaria blassicicola）としては、農業生物資源ジーンバンクの保存菌株（具体的には、ＭＡＦＦ番号：２４２９９３株）を使用した。この菌株をポテトデキストロース寒天培地（つまり、ＰＤＡ培地）上で培養することにより、供試菌サンプルを得た。
ブロッコリー黒すす病菌（Alternaria blassicicola）としては、農業生物資源ジーンバンクの保存菌株（具体的には、ＭＡＦＦ番号：２４２９９３株）を使用した。この菌株をポテトデキストロース寒天培地（つまり、ＰＤＡ培地）上で培養することにより、供試菌サンプルを得た。
【0043】
「メロンつる割病菌」
メロンつる割病菌（Fusarium oxysporum f. sp. Melonis）としては、中部大学の拓殖尚志研究室（柘植尚志教授）より分譲されたＫＴＦ４株を使用し、菌株をＰＤＡ培地上で植え継いだ。このような菌株を用いて、以下の方法によりメロンつる割病菌のバド・セルを形成させた。具体的には、まず、５０ｍｌのＰＤＢ培地（つまり、ポテトデキストロース培地）を含む容積１００ｍｌ三角フラスコに菌株を接種し、室温で３日間、１２０ｒｐｍ回転速度で振とう培養を行った。次いで、培養液をコーニング社製のＦａｌｃｏｎ（登録商標）セルストレーナー（メッシュ７０μｍ）でろ過し、ストレーナーを通り抜けたバド・セルを回収し、供試菌サンプルとして用いた。
メロンつる割病菌（Fusarium oxysporum f. sp. Melonis）としては、中部大学の拓殖尚志研究室（柘植尚志教授）より分譲されたＫＴＦ４株を使用し、菌株をＰＤＡ培地上で植え継いだ。このような菌株を用いて、以下の方法によりメロンつる割病菌のバド・セルを形成させた。具体的には、まず、５０ｍｌのＰＤＢ培地（つまり、ポテトデキストロース培地）を含む容積１００ｍｌ三角フラスコに菌株を接種し、室温で３日間、１２０ｒｐｍ回転速度で振とう培養を行った。次いで、培養液をコーニング社製のＦａｌｃｏｎ（登録商標）セルストレーナー（メッシュ７０μｍ）でろ過し、ストレーナーを通り抜けたバド・セルを回収し、供試菌サンプルとして用いた。
【0044】
「灰色かび病菌」
灰色かび病菌（Botrytis cinerea）のＡＩ１８株は、日本の三重県にて採取したものを使用し、ＰＤＡ培地上で菌株の胞子形成を誘導させた。次いで、胞子を形成した菌塊に超純水を加え、コンラージ棒を用いて菌糸表面から胞子を遊離させた。このようにして、供試菌サンプルを得た。
灰色かび病菌（Botrytis cinerea）のＡＩ１８株は、日本の三重県にて採取したものを使用し、ＰＤＡ培地上で菌株の胞子形成を誘導させた。次いで、胞子を形成した菌塊に超純水を加え、コンラージ棒を用いて菌糸表面から胞子を遊離させた。このようにして、供試菌サンプルを得た。
【0045】
・評価用ペプチドサンプル
実施例１における未酸化型及び酸化型のＳＡＲ８．２ｍペプチドを評価に用いた。さらに、比較用として、配列番号４に示す８個のアミノ酸からなる変異型のＳＡＲ８．２ｍペプチドを準備した。変異型のＳＡＲ８．２ｍペプチドは、ペプチド合成により作製したものであり、合成はユーロフィンジェノミクス社に委託した。変異型のＳＡＲ８．２ｍペプチドは、配列番号２に示すＳＡＲ８．２ｍペプチドのシステインをアラニンに置換したものである。変異型のＳＡＲ８．２ｍペプチドのことを適宜「コントロール」と表記する。
・抗菌活性の評価試験
３種類の評価用ペプチドを用いて、卵菌、真菌に対する抗菌活性の評価を行った。
９６ウェルのマイクロプレートのウェル内に各供試菌サンプルを加えた。さらに、超純水で希釈して濃度１０μＭに調整された各評価用ペプチドをウェル内に加え、インキュベータ（２０℃、暗条件）内に静置した。１～３日後にインキュベータから取り出し、発芽率を算出した。
実施例１における未酸化型及び酸化型のＳＡＲ８．２ｍペプチドを評価に用いた。さらに、比較用として、配列番号４に示す８個のアミノ酸からなる変異型のＳＡＲ８．２ｍペプチドを準備した。変異型のＳＡＲ８．２ｍペプチドは、ペプチド合成により作製したものであり、合成はユーロフィンジェノミクス社に委託した。変異型のＳＡＲ８．２ｍペプチドは、配列番号２に示すＳＡＲ８．２ｍペプチドのシステインをアラニンに置換したものである。変異型のＳＡＲ８．２ｍペプチドのことを適宜「コントロール」と表記する。
・抗菌活性の評価試験
３種類の評価用ペプチドを用いて、卵菌、真菌に対する抗菌活性の評価を行った。
９６ウェルのマイクロプレートのウェル内に各供試菌サンプルを加えた。さらに、超純水で希釈して濃度１０μＭに調整された各評価用ペプチドをウェル内に加え、インキュベータ（２０℃、暗条件）内に静置した。１～３日後にインキュベータから取り出し、発芽率を算出した。
【0046】
発芽率の算出は、顕微鏡観察により行った。具体的には、顕微鏡観察により、９６ウェル内の胞子の数Ｎ１を計測すると共に、発芽した胞子の数Ｎ２を計測した。次いで、下記算出式（Ｉ）に基づいて発芽率Ｇを算出した。
Ｇ［％］＝１００×Ｎ２／Ｎ１ ・・・（Ｉ）
Ｇ［％］＝１００×Ｎ２／Ｎ１ ・・・（Ｉ）
【0047】
図６に、ジャガイモ疫病菌（P. infestans）の発芽率、顕微鏡観察結果を示した。
図７に、ブロッコリー黒すす病菌（A. blassicicola）の発芽率、顕微鏡観察結果を示した。
図８に、メロンつる割病菌（F. oxysporum）の発芽率、顕微鏡観察結果を示した。
図９に、灰色かび病菌（B. cinerea）の発芽率、顕微鏡観察結果を示した。
図６～図９における（ａ）は、発芽率の結果を示す。図６～図９における（ｂ）は、変異型ＳＡＲ８．２ｍペプチドが投与された供試菌サンプルの顕微鏡観察結果を示す。図６～図９における（ｃ）は、未酸化型のＳＡＲ８．２ｍペプチドが投与された供試菌サンプルの顕微鏡観察結果を示す。図６～図９における（ｄ）は、酸化型のＳＡＲ８．２ｍペプチドが投与された供試菌サンプルの顕微鏡観察結果を示す。図６～図９では、「Control」は、変異型のＳＡＲ８．２ｍを意味し、「ＳＡＲ８．２ｍ」は、未酸化型のＳＡＲ８．２ｍを意味し、「Ｏｘｉｄｉｚｅｄ ＳＡＲ８．２ｍ」は、酸化型のＳＡＲ８．２ｍを意味する。
図７に、ブロッコリー黒すす病菌（A. blassicicola）の発芽率、顕微鏡観察結果を示した。
図８に、メロンつる割病菌（F. oxysporum）の発芽率、顕微鏡観察結果を示した。
図９に、灰色かび病菌（B. cinerea）の発芽率、顕微鏡観察結果を示した。
図６～図９における（ａ）は、発芽率の結果を示す。図６～図９における（ｂ）は、変異型ＳＡＲ８．２ｍペプチドが投与された供試菌サンプルの顕微鏡観察結果を示す。図６～図９における（ｃ）は、未酸化型のＳＡＲ８．２ｍペプチドが投与された供試菌サンプルの顕微鏡観察結果を示す。図６～図９における（ｄ）は、酸化型のＳＡＲ８．２ｍペプチドが投与された供試菌サンプルの顕微鏡観察結果を示す。図６～図９では、「Control」は、変異型のＳＡＲ８．２ｍを意味し、「ＳＡＲ８．２ｍ」は、未酸化型のＳＡＲ８．２ｍを意味し、「Ｏｘｉｄｉｚｅｄ ＳＡＲ８．２ｍ」は、酸化型のＳＡＲ８．２ｍを意味する。
【0048】
図６（ａ）～（ｄ）より理解されるように、ジャガイモ疫病菌では、未酸化型ＳＡＲ８．２ペプチド及び酸化型ＳＡＲ８．２ｍペプチドが、コントロールと比較して高い発芽抑制効果を示した。また、酸化型ＳＡＲ８．２ｍペプチドでは、未酸化型ＳＡＲ８．２ｍよりも発芽が大幅に抑制されており、発芽抑制効果が顕著に増大した。つまり、ＳＡＲ８．２ｍペプチドは、ジャガイモ疫病菌などの卵菌の発芽を抑制または防止でき、ＳＡＲ８．２ｍペプチドがジスルフィド結合を有する場合には、発芽抑制効果又は防止効果が増大することが理解される。
【0049】
図７（ａ）～（ｄ）、図８（ａ）～（ｄ）、図９（ａ）～（ｄ）においても、ジャガイモ疫病菌と同様の傾向が示されている。つまり、ＳＡＲ８．２ｍペプチドは、ブロッコリー黒すす病菌、メロンつる割病菌、灰色かび病菌等の真菌の発芽を抑制又は防止でき、ＳＡＲ８．２ｍペプチドがジスルフィド結合を有する場合には、発芽抑制効果又は防止効果が増大することが理解される。
【0050】
このように、本例によれば、ＳＡＲ８．２ｍペプチドは、植物病原性微生物の成長を抑制又は防止する効果があり、ＳＡＲ８．２ｍペプチドを含有する植物病害防除剤によれば、植物の病害を抑制または防止できるといえる。また、ＳＡＲ８．２ｍペプチドによる病害抑制又は防止効果はジスルフィド結合の形成により大幅に増大することから、ペプチド内の４つのシステインの存在が効果発現に重要であることが推察される。ＳＡＲ８．２ｍペプチドは、自然環境下で容易に分解されるため、ＳＡＲ８．２ｍペプチドをたとえば有効成分として含有する植物病害防除剤は、たとえ土壌、水質、大気に流出しても汚染の懸念がなく、環境汚染を防止することができる。
【0051】
［実施例３］
本例は、ＳＡＲ８．２ｍペプチドの抗菌活性の濃度依存性を評価する例である。
供試菌サンプルとしてジャガイモ疫病菌を用い、評価用ペプチドサンプルとして変異型ＳＡＲ８．２ｍペプチド及び酸化型ＳＡＲ８．２ｍペプチドを用い、実施例２と同様の抗菌活性の評価を行った。抗菌活性の評価には、濃度５μＭ、濃度１０μＭ、濃度１００μＭ、各評価用ペプチドサンプルを使用し、評価は、顕微鏡観察により行った。その結果を図１０に示す。
本例は、ＳＡＲ８．２ｍペプチドの抗菌活性の濃度依存性を評価する例である。
供試菌サンプルとしてジャガイモ疫病菌を用い、評価用ペプチドサンプルとして変異型ＳＡＲ８．２ｍペプチド及び酸化型ＳＡＲ８．２ｍペプチドを用い、実施例２と同様の抗菌活性の評価を行った。抗菌活性の評価には、濃度５μＭ、濃度１０μＭ、濃度１００μＭ、各評価用ペプチドサンプルを使用し、評価は、顕微鏡観察により行った。その結果を図１０に示す。
【0052】
図１０より理解されるように、５μＭ、１０μＭ、１００μＭのいずれの濃度のＳＡＲ８．２ｍペプチド溶液により、菌株の発芽が抑制または防止されていた。発芽抑制効果は、濃度依存的に増大する傾向にあるが、濃度１０μｍを超えると増大幅が緩やかになる。
【0053】
［実施例４］
本例は、ＳＡＲ８．２ｍペプチドの相同性を検討する例である。
図１１にナス科植物におけるＳＡＲ８．２ｍペプチドの相同性を示した。図１１における各アミノ酸配列は、配列番号５～４５に示される（図１２～図１９参照）。図１１では、各配列における相同性を有するアミノ酸の位置が黒背景の白抜きで表されており、図１１における「シグナルぺプチド」で表される領域は、分泌シグナルを表す。また、図１１における各アミノ酸配列は、上から順に配列番号５～４５のアミノ酸配列を有し、図１２（ａ）～図１９（ｆ）に表される。図１１中「Ｎｂ」はNicotiana benthamiana、「Ｎｔ」はNicotiana tabacum、「Ｎｔｏ」はNicotiana tomentosiformis、「Ｎｓ」はNicotiana sylvestris、「Ｃａ」はCapsicum annuum「Ｃｂ」はCapsicum Baccatum、「Ｓｔ」はSolanum tuberosum、「Ｓｌ」はSolanum lycopersicum、「Ｓｃ」はSolanum chilenseを表す。
本例は、ＳＡＲ８．２ｍペプチドの相同性を検討する例である。
図１１にナス科植物におけるＳＡＲ８．２ｍペプチドの相同性を示した。図１１における各アミノ酸配列は、配列番号５～４５に示される（図１２～図１９参照）。図１１では、各配列における相同性を有するアミノ酸の位置が黒背景の白抜きで表されており、図１１における「シグナルぺプチド」で表される領域は、分泌シグナルを表す。また、図１１における各アミノ酸配列は、上から順に配列番号５～４５のアミノ酸配列を有し、図１２（ａ）～図１９（ｆ）に表される。図１１中「Ｎｂ」はNicotiana benthamiana、「Ｎｔ」はNicotiana tabacum、「Ｎｔｏ」はNicotiana tomentosiformis、「Ｎｓ」はNicotiana sylvestris、「Ｃａ」はCapsicum annuum「Ｃｂ」はCapsicum Baccatum、「Ｓｔ」はSolanum tuberosum、「Ｓｌ」はSolanum lycopersicum、「Ｓｃ」はSolanum chilenseを表す。
【0054】
図１１及び図１２～図１９の配列番号５～４５より理解されるように、ナス科に属するNicotiana属、Capsicum属およびSolanum属植物は配列が多様なＳＡＲ８．２ペプチドをもっており、長さや配列の大きく異なる同様の効果を示すペプチドが今後見出される可能性や、ＳＡＲ８．２ｍペプチドのアミノ酸置換によって抗菌活性が向上したペプチドがデザインできる可能性がある。
また、図１１及び図１２～図１９の配列番号５～４５より理解されるように、ナス科に属する植物の中には、配列番号２に示されるペプチドと相同性の低いＳＡＲ８．２ペプチドを有するものがあり、発芽した胞子を介して植物に侵入する植物病原性糸状菌や卵菌等の植物病原性微生物に対する抵抗性が低いものがある。そして、ベンサミアナのNbSAR8.2mと極めて高い相同性を示す分泌タンパク質は、植物病原性糸状菌や卵菌等の植物病原性微生物に対する抵抗性が高いタバコ属（具体的には、N. tabacum）で見出される。したがって、配列番号１や配列番号２で示されるペプチドを含む植物病害防除剤は、様々な植物に対して有効に機能する可能性がきわめて高いことが示唆される。
また、図１１及び図１２～図１９の配列番号５～４５より理解されるように、ナス科に属する植物の中には、配列番号２に示されるペプチドと相同性の低いＳＡＲ８．２ペプチドを有するものがあり、発芽した胞子を介して植物に侵入する植物病原性糸状菌や卵菌等の植物病原性微生物に対する抵抗性が低いものがある。そして、ベンサミアナのNbSAR8.2mと極めて高い相同性を示す分泌タンパク質は、植物病原性糸状菌や卵菌等の植物病原性微生物に対する抵抗性が高いタバコ属（具体的には、N. tabacum）で見出される。したがって、配列番号１や配列番号２で示されるペプチドを含む植物病害防除剤は、様々な植物に対して有効に機能する可能性がきわめて高いことが示唆される。
【0055】
本発明は上記各実施例に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において種々の実施形態に適用することが可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【配列表】