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特開2024-132760細菌の検出用ファージ、検出用試薬及びそれを用いた検出方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024132760
(43)【公開日】2024-10-01
(54)【発明の名称】細菌の検出用ファージ、検出用試薬及びそれを用いた検出方法
(51)【国際特許分類】
C12N 7/01 20060101AFI20240920BHJP
C12Q 1/70 20060101ALI20240920BHJP
C12Q 1/66 20060101ALI20240920BHJP
C12N 15/34 20060101ALI20240920BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20240920BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240920BHJP
【ＦＩ】
C12N7/01 ZNA
C12Q1/70
C12Q1/66
C12N15/34
C12Q1/04
C12N15/62 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】書面
(21)【出願番号】P 2023061020
(22)【出願日】2023-03-15
(71)【出願人】
【識別番号】591222245
【氏名又は名称】国立感染症研究所長
(72)【発明者】
【氏名】氣駕 恒太朗
(72)【発明者】
【氏名】田村 あずみ
(72)【発明者】
【氏名】アア ハエルマン アザム
(72)【発明者】
【氏名】渡士 幸一
(72)【発明者】
【氏名】高橋 宜聖
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA18
4B063QQ06
4B063QQ10
4B063QQ13
4B063QR79
4B063QR80
4B063QS36
4B063QS38
4B063QX01
4B065AA98X
4B065AA98Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA01
4B065CA24
4B065CA46
(57)【要約】
【課題】宿主特異性が高く、感度が良好で、簡便で迅速に検出でき、また安全で安価な、細菌検出用試薬、該試薬に用いる細菌検出用の組換えファージを提供すること。
【解決手段】ファージゲノム上の目的ファージタンパク質をコードする遺伝子配列の上流または下流にＤＮＡからなるタグ配列を付加したファージゲノムを含む組換えファージによる。
【選択図】図１
【解決手段】ファージゲノム上の目的ファージタンパク質をコードする遺伝子配列の上流または下流にＤＮＡからなるタグ配列を付加したファージゲノムを含む組換えファージによる。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ファージゲノム上の目的ファージタンパク質をコードする遺伝子配列の上流または下流にＤＮＡからなるタグ配列を付加したファージゲノムを含む組換えファージ。
【請求項2】
前記目的ファージタンパク質をコードする遺伝子配列が、ビリオン構成タンパク質、核酸複製遺伝子、溶菌遺伝子、パッケージング遺伝子、および代謝調節遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種であり、ＤＮＡからなるタグ配列が、ＨｉＢｉＴ ＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＬＣ４３７０２３）、またはレポーター遺伝子である請求項１に記載のファージ。
【請求項3】
前記請求項１に記載のファージと、ＤＮＡからなるタグ配列から発現するペプチドと結合できるルシフェラーゼの断片と、ルシフェリンとを混合し、発光法により目的タンパク質の存在の有無を観察する病原細菌の検出方法。
【請求項4】
前記病原細菌が、カンピロバクター・ジェジュニ、コレラ菌、大腸菌、レジオネラ・ニューモフィラ、ペスト菌、サルモネラ菌、または赤痢菌である請求項１～３のいずれか１項に記載の病原細菌の検出方法。
【請求項5】
大腸菌が、大腸菌Ｏ１５７である請求項４に記載の病原細菌の検出方法。
【請求項6】
以下の工程（１）～（４）を含む、組換えファージの調製方法。
（１）下記ａ）及びｂ）を用意する工程
ａ）ファージゲノム
ｂ）ＤＮＡからなるタグ配列
（２）前記ファージゲノム上の目的ファージタンパク質をコードする遺伝子配列の上流または下流に、前記ＤＮＡからなるタグ配列を付加して、組換えファージゲノムを得る工程（３）前記組換えファージゲノムを導入した組換えファージを得る工程
（４）前記組換えファージを回収する工程
（１）下記ａ）及びｂ）を用意する工程
ａ）ファージゲノム
ｂ）ＤＮＡからなるタグ配列
（２）前記ファージゲノム上の目的ファージタンパク質をコードする遺伝子配列の上流または下流に、前記ＤＮＡからなるタグ配列を付加して、組換えファージゲノムを得る工程（３）前記組換えファージゲノムを導入した組換えファージを得る工程
（４）前記組換えファージを回収する工程
【請求項7】
前記目的ファージタンパク質をコードする遺伝子配列が、ビリオン構成タンパク質、核酸複製遺伝子、溶菌遺伝子、パッケージング遺伝子、および代謝調節遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種であり、ＤＮＡからなるタグ配列が、ＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＬＣ４３７０２３）、またはレポーター遺伝子である請求項６に記載の組換えファージの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ファージを用いた細菌の迅速な検出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
病原細菌は、ヒトまたは動物の体内に侵入し、増殖することによって様々な感染症を引き起こす。感染症治療において、早期診断、簡便なモニタリングシステムの開発は必要不可欠である。このようなシステムの開発は、直接的な医療費や入院患者制限による病院機能の低下、法的訴訟費用まで含めた膨大な医療施設における経済的、社会的損失を防ぐことができる。しかし、パルスフィールド電気泳動（ＰＦＧＥ）法や、超並列ＤＮＡシークエンス解析（次世代シークエンス解析）、ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ ＯＲＦ Ｔｙｐｉｎｇ（ＰＯＴ）法に代表される高精度の細菌検査法は、高度な知識と熟練した手技の習得が必要になることに加え、これらを導入するには高額な機器が必要であり、金銭的にも人的にも余裕のある大学病院や大規模病院に限って行われている。そのため、安価で簡便な細菌検査法の開発が求められている。
【0003】
また、病原細菌の検出は、食品、水、乳製品、家畜領域においても重要である。飲食店や食料品を扱う業者は衛生管理を義務付けられているが、微生物による食中毒事故は毎年多数発生している。病原細菌の迅速な検出、簡便なモニタリングシステムを開発することで、食中毒の発生を未然に防ぐことができる。
【0004】
例えば、腸管出血性の病原細菌である大腸菌Ｏ１５７は集団的食中毒の原因となり、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）といった重篤な続発症を引き起こすことが知られている。大腸菌Ｏ１５７の汚染を迅速に検出できる手法があれば、社会問題までに発展する食中毒の発生の予防につながり、発生してしまった場合にも迅速な対応が可能となる。
【0005】
そのため、細菌に寄生するウイルスであり、極めて高い宿主特異性があるファージを利用することが検討されている。ファージは、カプシド（殻）に核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を封入しており、感染時には核酸を細菌内に注入し増殖する。ファージは、殺菌を主に行う溶菌性ファージ（ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｐｈａｇｅ）と、ファージの遺伝子が細菌の遺伝子の中に組み込まれる溶原性ファージ（ｔｅｍｐｅｒａｔｅ ｐｈａｇｅ）とに分類できる。検出方法としては、具体的には、レポーター遺伝子を搭載したファージによる細菌の検出方法が挙げられる。大腸菌Ｏ１５７に特異的に感染する溶菌性ファージによる検出例もあるが（非特許文献１）、実験室株での定性的な検討しか行われていない。大腸菌Ｏ１５７ファージの検出系が十分に検討されてこなかった理由として、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの遺伝子合成が困難であったことが挙げられる。通常、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成できるファージのＤＮＡ長は４０～５０ｋｂ程度であり、６０ｋｂを超える大腸菌Ｏ１５７に特異的に感染する組換え溶菌性ファージ（Ｏ１５７ ｃｏｌｉｐｈａｇｅ ｖＢ＿Ｅｃｏ４Ｍ－７、Ｇｅｎｂａｎｋ：ＭＮ１７６２１７）等の合成は困難であった。
【0006】
大腸菌Ｏ１５７に特異的に感染する溶原性ファージは、４０ｋｂほどのものも知られている。溶原性ファージはゲノムに入り込んでいるファージであるため、通常の細菌の遺伝子組み換え法が適用できる（非特許文献２）。また、従来のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成法も使用できる。しかしながら、この方法で得られた溶原性ファージは、ファージの遺伝子が細菌の遺伝子の中に組み込まれ、そしてファージ由来の遺伝子が細菌の子孫にも受け継がれるため、予期せぬ細菌の進化を引き起こす可能性が高く安全性に問題がある。また、同系統の溶原性ファージが溶原化した細菌には感染できない重感染阻害の問題がある。このように組換え溶原性ファージは、大腸菌Ｏ１５７の特異的検出に使用できない可能性が高い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｈｏａｎｇ ＨＡ， Ｄｉｅｎ ｌｅ Ｔ．Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７ ｉｎ ａｐｐｌｅ ｊｕｉｃｅ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ－ｂａｓｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ． Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｃｉ． ２０１５；２０（２）：９９－１０３．ｄｏｉ： １０．４２６５／ｂｉｏ．２０．９９．
【非特許文献2】Ｐｅｒｒｙ ＬＬ， ＳａｎＭｉｇｕｅｌ Ｐ， Ｍｉｎｏｃｈａ Ｕ， Ｔｅｒｅｋｈｏｖ ＡＩ， Ｓｈｒｏｙｅｒ ＭＬ， Ｆａｒｒｉｓ ＬＡ， Ｂｒｉｇｈｔ Ｎ， Ｒｅｕｈｓ ＢＬ， Ａｐｐｌｅｇａｔｅ ＢＭ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ＰｈｉＶ１０ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｈａｇｅ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｍｏｄｉｆｉｅｓ ｔｈｅ Ｏ１５７ ａｎｔｉｇｅｎ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ． ２００９ Ｍａｒ；２９２（２）：１８２－６． ｄｏｉ： １０．１１１１／ｊ．１５７４－６９６８．２００９．０１５１１．ｘ．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
以上の通り、現在までファージを用いた大腸菌Ｏ１５７等の病原細菌の高感度検出法は確立されていなかった。そこで、本発明の課題は、宿主特異性が高く、感度が良好で、簡便で迅速に検出でき、また安全で安価な、細菌検出用試薬、該試薬に用いる細菌検出用の組換え溶菌性ファージを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、従来のｉｎ ｖｉｔｒｏファージ合成法において、検出タグ位置を最適化することで、６０ｋｂを超えるＤＮＡ長のファージであっても目的とする細菌を検出するためのＤＮＡからなるタグ配列を遺伝子組換えで導入したファージを合成できることを見出し、本発明を完成させた。ファージに遺伝子を搭載するとファージの感染力が変化することも多いが、利用したタグは非常に小さいため、ファージの表現型は変化しなかった。さらに、タグ配列の挿入位置が検出感度に大きく影響することを見出した。
【0011】
本発明は以下の構成を有する。
［１］ファージゲノム上の目的ファージタンパク質をコードする遺伝子配列の上流または下流にＤＮＡからなるタグ配列を付加したファージゲノムを含む組換えファージ。
［２］前記目的ファージタンパク質をコードする遺伝子配列が、ビリオン構成タンパク質、核酸複製遺伝子、溶菌遺伝子、パッケージング遺伝子、および代謝調節遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種であり、ＤＮＡからなるタグ配列が、ＨｉＢｉＴ ＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＬＣ４３７０２３）、またはレポーター遺伝子である前記［１］項に記載のファージ。
［３］前記［１］項に記載のファージと、ＤＮＡからなるタグ配列から発現するペプチドと結合できるルシフェラーゼの断片と、ルシフェリンとを混合し、発光法により目的タンパク質の存在の有無を観察する病原細菌の検出方法。
［４］前記病原細菌が、カンピロバクター・ジェジュニ、コレラ菌、大腸菌、レジオネラ・ニューモフィラ、ペスト菌、サルモネラ菌、または赤痢菌である前記［１］～［３］のいずれか１項に記載の病原細菌の検出方法。
［５］大腸菌が、大腸菌Ｏ１５７である前記［４］項に記載の病原細菌の検出方法。
［６］以下の工程（１）～（４）を含む、組換えファージの調製方法。
（１）下記ａ）及びｂ）を用意する工程
ａ）ファージゲノム
ｂ）ＤＮＡからなるタグ配列
（２）前記ファージゲノム上の目的ファージタンパク質をコードする遺伝子配列の上流または下流に、前記ＤＮＡからなるタグ配列を付加して、組換えファージゲノムを得る工程（３）前記組換えファージゲノムを導入した組換えファージを得る工程
（４）前記組換えファージを回収する工程
［７］前記目的ファージタンパク質をコードする遺伝子配列が、ビリオン構成タンパク質、核酸複製遺伝子、溶菌遺伝子、パッケージング遺伝子、および代謝調節遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種であり、ＤＮＡからなるタグ配列が、ＨｉＢｉＴ ＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＬＣ４３７０２３）、またはレポーター遺伝子である前記［６］項に記載の組換えファージの調製方法。
［１］ファージゲノム上の目的ファージタンパク質をコードする遺伝子配列の上流または下流にＤＮＡからなるタグ配列を付加したファージゲノムを含む組換えファージ。
［２］前記目的ファージタンパク質をコードする遺伝子配列が、ビリオン構成タンパク質、核酸複製遺伝子、溶菌遺伝子、パッケージング遺伝子、および代謝調節遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種であり、ＤＮＡからなるタグ配列が、ＨｉＢｉＴ ＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＬＣ４３７０２３）、またはレポーター遺伝子である前記［１］項に記載のファージ。
［３］前記［１］項に記載のファージと、ＤＮＡからなるタグ配列から発現するペプチドと結合できるルシフェラーゼの断片と、ルシフェリンとを混合し、発光法により目的タンパク質の存在の有無を観察する病原細菌の検出方法。
［４］前記病原細菌が、カンピロバクター・ジェジュニ、コレラ菌、大腸菌、レジオネラ・ニューモフィラ、ペスト菌、サルモネラ菌、または赤痢菌である前記［１］～［３］のいずれか１項に記載の病原細菌の検出方法。
［５］大腸菌が、大腸菌Ｏ１５７である前記［４］項に記載の病原細菌の検出方法。
［６］以下の工程（１）～（４）を含む、組換えファージの調製方法。
（１）下記ａ）及びｂ）を用意する工程
ａ）ファージゲノム
ｂ）ＤＮＡからなるタグ配列
（２）前記ファージゲノム上の目的ファージタンパク質をコードする遺伝子配列の上流または下流に、前記ＤＮＡからなるタグ配列を付加して、組換えファージゲノムを得る工程（３）前記組換えファージゲノムを導入した組換えファージを得る工程
（４）前記組換えファージを回収する工程
［７］前記目的ファージタンパク質をコードする遺伝子配列が、ビリオン構成タンパク質、核酸複製遺伝子、溶菌遺伝子、パッケージング遺伝子、および代謝調節遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種であり、ＤＮＡからなるタグ配列が、ＨｉＢｉＴ ＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＬＣ４３７０２３）、またはレポーター遺伝子である前記［６］項に記載の組換えファージの調製方法。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【発明の効果】
【0013】
本発明の組換えファージは、特定の細菌を特異的に検出できるファージをベースに作製されているため宿主特異性が高い。そのため、本発明の組換えファージを用いた本発明の検出方法は、特定の細菌を特異的に検出できる。さらに、本発明の検出方法は、汎用な装置で測定できることから、安価で簡便に、さらには迅速に細菌が検出できる。また、本発明の検出方法において、溶菌性ファージに利用した場合、溶原性ファージとは異なり、重感染阻害を受けず、また、予期せぬ進化を細菌に引き起こさず、安全に利用できる。ファージの尾部にタグ配列を挿入したファージが高感度にＯ１５７を検出することができる。本発明の検出方法は、実施例で示したＯ１５７以外の他の細菌にも応用可能である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本明細書において、以下の通り表記を略記することがある。
大腸菌Ｏ１５７を単にＯ１５７と表記する。バクテリオファージを単にファージと表記する。Ｏ１５７に特異的に感染するファージをＯ１５７ファージと表記する。また、他の細菌についても、同様に表記することができる。
大腸菌Ｏ１５７を単にＯ１５７と表記する。バクテリオファージを単にファージと表記する。Ｏ１５７に特異的に感染するファージをＯ１５７ファージと表記する。また、他の細菌についても、同様に表記することができる。
【0015】
＜組換えファージ＞
本発明の組換えファージは、ファージゲノム上の目的ファージタンパク質をコードする遺伝子配列の上流または下流にＤＮＡからなるタグ配列を付加したファージゲノムを含む。具体的には、Ｏ１５７の場合、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）３７、ｇｐ３７の直下にタグを付加することができる。また、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）６４、ｇｐ６４の直下にタグを付加することができる。
本発明の組換えファージは、ファージゲノム上の目的ファージタンパク質をコードする遺伝子配列の上流または下流にＤＮＡからなるタグ配列を付加したファージゲノムを含む。具体的には、Ｏ１５７の場合、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）３７、ｇｐ３７の直下にタグを付加することができる。また、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）６４、ｇｐ６４の直下にタグを付加することができる。
【0016】
＜溶菌性ファージ＞
本発明では溶菌性ファージを用いることが望ましい。溶菌性ファージは、溶原性ファージと異なり、溶原サイクルを介さずに自己を増殖させるため、宿主細菌のゲノムＤＮＡを組み込み、宿主細胞に予期せぬ進化を引き起こさないことから、安全性の観点から好ましい。溶菌性ファージとしては、例えば、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｔ４様ウイルス属、ＳＰＯ１様ウイルス属）、サイフォウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｔ１様ウイルス属、Ｔ５様ウイルス属、ＰｓｉＭ１様ウイルス属）、ポドウイルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｔ７様ウイルス属、ｐｈｉ２９様ウイルス属、Ｎ４様ウイルス属）、テクティウイルス科（Ｔｅｃｔｉｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｔｅｃｔｉｖｉｒｕｓ属）、コルチコウイルス科（Ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｕｓ属）、リポスリクスウイルス科（Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｂｅｔａｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｕｓ属、Ｄｅｌｔａｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｕｓ属）、ルディウイルス科（Ｒｕｄｉｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｒｕｄｉｖｉｒｕｓ属）、ミクロウイルス科（Ｍｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｍｉｃｒｏｖｉｒｕｓ属、Ｓｐｉｒｏｍｉｃｒｏｖｉｒｕｓ属、Ｂｄｅｌｌｏｍｉｃｒｏｖｉｒｕｓ属、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｍｉｃｒｏｖｉｒｕｓ属）、シストウイルス科（Ｃｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｃｙｓｔｏｖｉｒｕｓ属）、レビウイルス科（Ｌｅｖｉｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｌｅｖｉｖｉｒｕｓ属、Ａｌｌｏｌｅｖｉｖｉｒｕｓ属）が挙げられる。
本発明では溶菌性ファージを用いることが望ましい。溶菌性ファージは、溶原性ファージと異なり、溶原サイクルを介さずに自己を増殖させるため、宿主細菌のゲノムＤＮＡを組み込み、宿主細胞に予期せぬ進化を引き起こさないことから、安全性の観点から好ましい。溶菌性ファージとしては、例えば、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｔ４様ウイルス属、ＳＰＯ１様ウイルス属）、サイフォウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｔ１様ウイルス属、Ｔ５様ウイルス属、ＰｓｉＭ１様ウイルス属）、ポドウイルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｔ７様ウイルス属、ｐｈｉ２９様ウイルス属、Ｎ４様ウイルス属）、テクティウイルス科（Ｔｅｃｔｉｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｔｅｃｔｉｖｉｒｕｓ属）、コルチコウイルス科（Ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｕｓ属）、リポスリクスウイルス科（Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｂｅｔａｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｕｓ属、Ｄｅｌｔａｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｕｓ属）、ルディウイルス科（Ｒｕｄｉｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｒｕｄｉｖｉｒｕｓ属）、ミクロウイルス科（Ｍｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｍｉｃｒｏｖｉｒｕｓ属、Ｓｐｉｒｏｍｉｃｒｏｖｉｒｕｓ属、Ｂｄｅｌｌｏｍｉｃｒｏｖｉｒｕｓ属、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｍｉｃｒｏｖｉｒｕｓ属）、シストウイルス科（Ｃｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｃｙｓｔｏｖｉｒｕｓ属）、レビウイルス科（Ｌｅｖｉｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｌｅｖｉｖｉｒｕｓ属、Ａｌｌｏｌｅｖｉｖｉｒｕｓ属）が挙げられる。
【0017】
＜溶原性ファージ＞
溶原性ファージとしては、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｐ１様ウイルス属、Ｐ２様ウイルス属、Ｍｕ様ウイルス属、ｐｈｉＨ様ウイルス属）、サイフォウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（λ様ウイルス属、ｃ２様ウイルス属、Ｌ５様ウイルス属、ｐｈｉＣ３１様ウイルス属、Ｎ１５様ウイルス属）、ポドウイルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｐ２２様ウイルス属）、リポスリクスウイルス科（Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ａｌｐｈａｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｕｓ属）、プラズマウイルス科（Ｐｌａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｐｌａｓｍａｖｉｒｕｓ属）、フセロウイルス科（Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｕｓ属）、イノウイルス科（Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｉｎｏｖｉｒｕｓ属、Ｐｌｅｃｔｒｏｖｉｒｕｓ属、Ｍ１３様ウイルス属、ｆｄ様ウイルス属）が挙げられる。
溶原性ファージとしては、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｐ１様ウイルス属、Ｐ２様ウイルス属、Ｍｕ様ウイルス属、ｐｈｉＨ様ウイルス属）、サイフォウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（λ様ウイルス属、ｃ２様ウイルス属、Ｌ５様ウイルス属、ｐｈｉＣ３１様ウイルス属、Ｎ１５様ウイルス属）、ポドウイルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｐ２２様ウイルス属）、リポスリクスウイルス科（Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ａｌｐｈａｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｕｓ属）、プラズマウイルス科（Ｐｌａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｐｌａｓｍａｖｉｒｕｓ属）、フセロウイルス科（Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｕｓ属）、イノウイルス科（Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ）ファージ（Ｉｎｏｖｉｒｕｓ属、Ｐｌｅｃｔｒｏｖｉｒｕｓ属、Ｍ１３様ウイルス属、ｆｄ様ウイルス属）が挙げられる。
【0018】
＜バクテリオファージゲノム＞
バクテリオファージゲノムの由来としては特に限定されないが、安全性の観点から溶菌性ファージが好ましい。溶菌性ファージは感染後に宿主細菌内で増殖し、最終的に溶菌させて宿主細菌を死滅させる（溶菌サイクル）。溶原性ファージは溶菌サイクル又は溶原サイクルによって増殖する。
バクテリオファージゲノムの由来としては特に限定されないが、安全性の観点から溶菌性ファージが好ましい。溶菌性ファージは感染後に宿主細菌内で増殖し、最終的に溶菌させて宿主細菌を死滅させる（溶菌サイクル）。溶原性ファージは溶菌サイクル又は溶原サイクルによって増殖する。
【0019】
＜目的ファージタンパク質及びこれらをコードする遺伝子配列＞
本発明に用いる目的ファージタンパク質としては、ｇｐ２７（テールファイバータンパク質）、ｇｐ１９（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｇｐ６４（溶菌酵素）、ｇｐ７５（ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ αサブユニット）、ｇｐ９１（ＤＮＡプライマーゼ）等が例示できる。これら以外では、ｇｐ２０、ｇｐ３２、ｇｐ３５、ｇｐ３６、ｇｐ３７、ｇｐ５５、ｇｐ８５、ｇｐ８６が利用できる。なかでも、検出感度が最も高くなる点から、ｇｐ２７（テールファイバータンパク質）がより好ましい。
また、本発明において、前記目的ファージタンパク質をコードする遺伝子配列を用いればよい。
本発明に用いる目的ファージタンパク質としては、ｇｐ２７（テールファイバータンパク質）、ｇｐ１９（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｇｐ６４（溶菌酵素）、ｇｐ７５（ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ αサブユニット）、ｇｐ９１（ＤＮＡプライマーゼ）等が例示できる。これら以外では、ｇｐ２０、ｇｐ３２、ｇｐ３５、ｇｐ３６、ｇｐ３７、ｇｐ５５、ｇｐ８５、ｇｐ８６が利用できる。なかでも、検出感度が最も高くなる点から、ｇｐ２７（テールファイバータンパク質）がより好ましい。
また、本発明において、前記目的ファージタンパク質をコードする遺伝子配列を用いればよい。
【0020】
＜ＤＮＡからなるタグ配列＞
本発明に用いるＤＮＡからなるタグ配列としては、市販のＨｉＢｉＴが利用できる。該塩基配列から１１アミノ酸のペプチドが発現する。
本発明に用いるＤＮＡからなるタグ配列としては、市販のＨｉＢｉＴが利用できる。該塩基配列から１１アミノ酸のペプチドが発現する。
【0021】
＜病原細菌の検出方法＞
本発明の病原細菌の検出方法は、ファージと、ＤＮＡからなるタグ配列から発現するペプチドと結合できる発光タンパク質（酵素）であるルシフェラーゼの断片と、その基質であるルシフェリンとを混合し、発光法により目的タンパク質の存在の有無を評価する。具体的には、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、前記発光法による発光量を測定し、サンプルの発光量からバックグラウンドの液体培地の発光量（３点の平均値）を引いた値から評価する。ここで、検出用タグとして、ＨｉＢｉＴタグ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いた場合には、該タグの検出には、検出用キットのＬｇＢｉＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いる。その他に、タンパク質検出用のタグとしては、アフィニティータグ（Ｈｉｓ、ｃ－Ｍｙｃ、ＦＬＡＧ）やＧＦＰ等の蛍光タンパク質、ＬａｃＺやＣＡＴ等のレポーター遺伝子も利用することができる。
本発明の病原細菌の検出方法は、ファージと、ＤＮＡからなるタグ配列から発現するペプチドと結合できる発光タンパク質（酵素）であるルシフェラーゼの断片と、その基質であるルシフェリンとを混合し、発光法により目的タンパク質の存在の有無を評価する。具体的には、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、前記発光法による発光量を測定し、サンプルの発光量からバックグラウンドの液体培地の発光量（３点の平均値）を引いた値から評価する。ここで、検出用タグとして、ＨｉＢｉＴタグ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いた場合には、該タグの検出には、検出用キットのＬｇＢｉＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いる。その他に、タンパク質検出用のタグとしては、アフィニティータグ（Ｈｉｓ、ｃ－Ｍｙｃ、ＦＬＡＧ）やＧＦＰ等の蛍光タンパク質、ＬａｃＺやＣＡＴ等のレポーター遺伝子も利用することができる。
【0022】
＜病原細菌＞
本発明に組換えファージが標的とする病原細菌は、病原性の恐れがあれば特に限定されず、形状（一般に球形、棒状、らせん状に大別される）、グラム染色性（グラム陽性又はグラム陰性）、酸素要求性（好気性、嫌気性、通性嫌気性）、存在様式等は問わない。病原細菌としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シゲラ属細菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓ．ｆｒｅｘｎｅｒｉ、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ等）、サルモネラ属細菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（例えば、Ｓ．ｔｙｐｈ、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ－Ａ、Ｓ．ｓｃｈｏｔｔｍｕｅｌｌｅｒｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ等）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌（例えば、Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ等）、クレブシエラ属細菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）（例えば、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ等）、プロテウス属細菌（Ｐｒｏｔｅｕｓ）（例えば、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ等）、エルシニア属細菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）（例えば、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ、Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ等）、ビブリオ属細菌（Ｖｉｂｒｉｏ）（例えば、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ等）、ヘモフィルス属細菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えば、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈ．ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ等）、シュードモナス属細菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ等）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）細菌（例えば、Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ａ．ｌｗｏｆｆｉｉ等）、レジオネラ属細菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）（例えば、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ等）、ボルデテラ属細菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）（例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ等）、ブルセラ属細菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）（例えば、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂ．ｓｕｉｓ等）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス属細菌（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）（例えば、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂ．ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ等）、ナイセリア属細菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）（例えば、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ等）、ブドウ球菌属細菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ等）、レンサ球菌属細菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｖｉｒｉｄａｎｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ等）、腸球菌属細菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅ．ａｖｉｕｍ等）、バシラス属細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ等）、クロストリジウム属細菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）（例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ等）、コリネバクテリウム属細菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（例えば、Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ等）、マイコバクテリウム属細菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ等）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ボレリア属細菌（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）（例えば、Ｂ．ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｆｅｒｉ等）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｉｄｕｍ）、カンピロバクター属細菌（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）（例えば、Ｃ．ｃｏｌｉ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｆｅｔｕｓ等）、ヘリコバクター属細菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）（例えば、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ、Ｈ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉ等）、リケッチア属細菌（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）（例えば、Ｒ．ｐｒｏｗａｚｅｋｉｌ、Ｒ．ｍｏｏｓｅｒｉ、Ｒ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ等）、クラミジア属細菌（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）（例えば、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉ等）、リステリア属細菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）（例えば、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ等）が挙げられる。
本発明に組換えファージが標的とする病原細菌は、病原性の恐れがあれば特に限定されず、形状（一般に球形、棒状、らせん状に大別される）、グラム染色性（グラム陽性又はグラム陰性）、酸素要求性（好気性、嫌気性、通性嫌気性）、存在様式等は問わない。病原細菌としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シゲラ属細菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓ．ｆｒｅｘｎｅｒｉ、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ等）、サルモネラ属細菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（例えば、Ｓ．ｔｙｐｈ、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ－Ａ、Ｓ．ｓｃｈｏｔｔｍｕｅｌｌｅｒｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ等）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌（例えば、Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ等）、クレブシエラ属細菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）（例えば、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ等）、プロテウス属細菌（Ｐｒｏｔｅｕｓ）（例えば、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ等）、エルシニア属細菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）（例えば、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ、Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ等）、ビブリオ属細菌（Ｖｉｂｒｉｏ）（例えば、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ等）、ヘモフィルス属細菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えば、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈ．ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ等）、シュードモナス属細菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ等）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）細菌（例えば、Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ａ．ｌｗｏｆｆｉｉ等）、レジオネラ属細菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）（例えば、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ等）、ボルデテラ属細菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）（例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ等）、ブルセラ属細菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）（例えば、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂ．ｓｕｉｓ等）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス属細菌（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）（例えば、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂ．ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ等）、ナイセリア属細菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）（例えば、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ等）、ブドウ球菌属細菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ等）、レンサ球菌属細菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｖｉｒｉｄａｎｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ等）、腸球菌属細菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅ．ａｖｉｕｍ等）、バシラス属細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ等）、クロストリジウム属細菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）（例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ等）、コリネバクテリウム属細菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（例えば、Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ等）、マイコバクテリウム属細菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ等）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ボレリア属細菌（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）（例えば、Ｂ．ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｆｅｒｉ等）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｉｄｕｍ）、カンピロバクター属細菌（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）（例えば、Ｃ．ｃｏｌｉ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｆｅｔｕｓ等）、ヘリコバクター属細菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）（例えば、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ、Ｈ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉ等）、リケッチア属細菌（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）（例えば、Ｒ．ｐｒｏｗａｚｅｋｉｌ、Ｒ．ｍｏｏｓｅｒｉ、Ｒ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ等）、クラミジア属細菌（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）（例えば、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉ等）、リステリア属細菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）（例えば、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ等）が挙げられる。
【0023】
本発明おいて検出対象とする病原細菌としては、カンピロバクター・ジェジュニ、コレラ菌、大腸菌（Ｏ１５７等）、レジオネラ・ニューモフィラ、ペスト菌、サルモネラ菌、または赤痢菌が特に好ましい。
【0024】
＜組換えファージの調整方法＞
本発明の組換えファージは、以下の工程（１）～（４）を含む、調製方法で得ることができる。
（１）下記ａ）及びｂ）を用意する工程
ａ）ファージゲノム
ｂ）ＤＮＡからなるタグ配列
（２）前記ファージゲノム上の目的ファージタンパク質をコードする遺伝子配列の上流または下流に、前記ＤＮＡからなるタグ配列を付加して、組換えファージゲノムを得る工程（３）前記組換えファージゲノムを導入した組換えファージを得る工程
（４）前記組換えファージを回収する工程
本発明の組換えファージは、以下の工程（１）～（４）を含む、調製方法で得ることができる。
（１）下記ａ）及びｂ）を用意する工程
ａ）ファージゲノム
ｂ）ＤＮＡからなるタグ配列
（２）前記ファージゲノム上の目的ファージタンパク質をコードする遺伝子配列の上流または下流に、前記ＤＮＡからなるタグ配列を付加して、組換えファージゲノムを得る工程（３）前記組換えファージゲノムを導入した組換えファージを得る工程
（４）前記組換えファージを回収する工程
【0025】
前記目的ファージタンパク質をコードする遺伝子配列が、ビリオン構成タンパク質、核酸複製遺伝子、溶菌遺伝子、パッケージング遺伝子、および代謝調節遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種である。
また、ＤＮＡからなるタグ配列が、ＨｉＢｉＴ ＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＬＣ４３７０２３）、またはレポーター遺伝子である。
また、ＤＮＡからなるタグ配列が、ＨｉＢｉＴ ＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＬＣ４３７０２３）、またはレポーター遺伝子である。
【0026】
＜エレクトロポレーション法＞
エレクトロポレーション法は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＰ、タンパク質、およびその他の分子を多種多様な細胞、特に初代細胞や幹細胞などのトランスフェクションが困難な細胞にこれらを導入するために用いられている最も効率のよい非ウイルスベクター系による遺伝子導入法である。
この方法では、細胞膜のリン脂質二重層に正確にパルス化された電流で、一時的に細孔を作り出すことにより、細胞外の遺伝物質を標的とする細胞内に導入させ、細胞のＤＮＡに取り込ませることができる。
エレクトロポレーション法は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＰ、タンパク質、およびその他の分子を多種多様な細胞、特に初代細胞や幹細胞などのトランスフェクションが困難な細胞にこれらを導入するために用いられている最も効率のよい非ウイルスベクター系による遺伝子導入法である。
この方法では、細胞膜のリン脂質二重層に正確にパルス化された電流で、一時的に細孔を作り出すことにより、細胞外の遺伝物質を標的とする細胞内に導入させ、細胞のＤＮＡに取り込ませることができる。
【実施例0027】
以下、本発明を実施例、比較例を用いて具体的に説明を行うが、本発明はこれらに限定されない。
【0028】
実施例１
１．溶菌活性の確認（スポットアッセイ）
ＬＢ寒天培地３０ｍＬにＬＴＡ（ＬＢ Ｔｏｐ Ａｇａｒ、０．５％アガロース・１ｍＭＣａＣｌ２含有）１０ｍＬと細菌の一晩培養液３００μＬを加え、一定濃度に揃えたＯ１５７ファージの１０倍希釈系列を２μＬずつスポットした。３７℃で一晩培養した後にプラーク数をそれぞれ数え、自然宿主菌（大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株 ＡＴＣＣ ４３８８８）に対するプラーク数と比較してＥＯＰ（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ Ｐｌａｔｉｎｇ、プラーク形成効率）を計算した。
１．溶菌活性の確認（スポットアッセイ）
ＬＢ寒天培地３０ｍＬにＬＴＡ（ＬＢ Ｔｏｐ Ａｇａｒ、０．５％アガロース・１ｍＭＣａＣｌ２含有）１０ｍＬと細菌の一晩培養液３００μＬを加え、一定濃度に揃えたＯ１５７ファージの１０倍希釈系列を２μＬずつスポットした。３７℃で一晩培養した後にプラーク数をそれぞれ数え、自然宿主菌（大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株 ＡＴＣＣ ４３８８８）に対するプラーク数と比較してＥＯＰ（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ Ｐｌａｔｉｎｇ、プラーク形成効率）を計算した。
【0029】
２．ゲノム抽出
２．１．ファージのゲノム抽出
ＬＢ液体培地２０ｍＬに宿主菌の一晩培養液を１００μＬ加え、ＯＤ値（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ、光学濃度）が０．１に上がるまで振盪培養（３７℃、２００ｒｐｍ）した。その後、１０６～１０７ＰＦＵ／ｍＬファージ液と１ｍＭ ＣａＣｌ２を加え、再び振盪培養（３７℃、２００ｒｐｍ）した。ファージが溶菌して培養液が透明になったところで培養液を遠心分離（２０℃、８，０００×ｇ、１５分）し、上清を回収した。上清を０．４５μｍ濾過膜で濾過し、濾過液に核酸分解酵素（１Ｕ／ｍＬ ＤＮａｓｅＩ［ニッポンジーン、日本］、１０μｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＡ［ニッポンジーン］）を加えて３７℃で１時間静置した。続いて、サンプルに同量のポリエチレングリコール液（１０％［ｗ／ｖ］ＰＥＧ８０００、１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、５ｍＭ ＭｇＳＯ４）を加え、４℃で一晩反応させた。サンプルを遠心分離（４℃、１０，０００×ｇ、２０分）し、上清を除去した。残った溶液で沈殿を懸濁し、再び遠心分離（４℃、１０，０００×ｇ、１５分）をした。沈澱を５００μＬのＳＭバッファー（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、７ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．０１％［ｗ／ｖ］ゼラチン）で溶かした。続いて、以下の手順でフェノール・クロロホルム法によるＤＮＡ抽出を行った。サンプルに５００μＬのＴＥ飽和フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加えて十分に混合し、遠心分離（２０℃、１０，０００×ｇ、３分）をして上清を新しいチューブに移した。中間のタンパク質層が見えなくなるまでこのステップを２～３回繰り返した。次に、同量のクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を加えて十分に混合した後、遠心分離（２０℃、１２，０００×ｇ、１０分）をして上清を新しいチューブに移した。回収した上清を同量のイソプロパノールと混合し、遠心分離（４℃、１０，０００×ｇ、１０分）で上清を除去した。沈殿を７０％エタノールで洗浄し、遠心分離（４℃、１０，０００ｒｐｍ、１０分）の後、上清を完全に取り除いた。最後に沈殿を風乾し、ＤＮＡを５０μＬのＴＥバッファーで溶出した。
２．１．ファージのゲノム抽出
ＬＢ液体培地２０ｍＬに宿主菌の一晩培養液を１００μＬ加え、ＯＤ値（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ、光学濃度）が０．１に上がるまで振盪培養（３７℃、２００ｒｐｍ）した。その後、１０６～１０７ＰＦＵ／ｍＬファージ液と１ｍＭ ＣａＣｌ２を加え、再び振盪培養（３７℃、２００ｒｐｍ）した。ファージが溶菌して培養液が透明になったところで培養液を遠心分離（２０℃、８，０００×ｇ、１５分）し、上清を回収した。上清を０．４５μｍ濾過膜で濾過し、濾過液に核酸分解酵素（１Ｕ／ｍＬ ＤＮａｓｅＩ［ニッポンジーン、日本］、１０μｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＡ［ニッポンジーン］）を加えて３７℃で１時間静置した。続いて、サンプルに同量のポリエチレングリコール液（１０％［ｗ／ｖ］ＰＥＧ８０００、１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、５ｍＭ ＭｇＳＯ４）を加え、４℃で一晩反応させた。サンプルを遠心分離（４℃、１０，０００×ｇ、２０分）し、上清を除去した。残った溶液で沈殿を懸濁し、再び遠心分離（４℃、１０，０００×ｇ、１５分）をした。沈澱を５００μＬのＳＭバッファー（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、７ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．０１％［ｗ／ｖ］ゼラチン）で溶かした。続いて、以下の手順でフェノール・クロロホルム法によるＤＮＡ抽出を行った。サンプルに５００μＬのＴＥ飽和フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加えて十分に混合し、遠心分離（２０℃、１０，０００×ｇ、３分）をして上清を新しいチューブに移した。中間のタンパク質層が見えなくなるまでこのステップを２～３回繰り返した。次に、同量のクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を加えて十分に混合した後、遠心分離（２０℃、１２，０００×ｇ、１０分）をして上清を新しいチューブに移した。回収した上清を同量のイソプロパノールと混合し、遠心分離（４℃、１０，０００×ｇ、１０分）で上清を除去した。沈殿を７０％エタノールで洗浄し、遠心分離（４℃、１０，０００ｒｐｍ、１０分）の後、上清を完全に取り除いた。最後に沈殿を風乾し、ＤＮＡを５０μＬのＴＥバッファーで溶出した。
【0030】
２．２．細菌のゲノム抽出
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７臨床分離株は、ＭｏｎｏＦａｓ（登録商標）バクテリアゲノム ＤＮＡ抽出キット ＶＩＩ（アニモス、日本）を用いてゲノム抽出した。Ｏ１５７：Ｈ７（ＡＴＣＣ ４３８８８）のゲノム抽出にはＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標） ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ（タカラバイオ、日本）を使用した。
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７臨床分離株は、ＭｏｎｏＦａｓ（登録商標）バクテリアゲノム ＤＮＡ抽出キット ＶＩＩ（アニモス、日本）を用いてゲノム抽出した。Ｏ１５７：Ｈ７（ＡＴＣＣ ４３８８８）のゲノム抽出にはＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標） ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ（タカラバイオ、日本）を使用した。
【0031】
＜３．組換えファージ合成＞
３．１．ＰＣＲによるＤＮＡ断片の作製
Ｔ７（４０ｋｂ）及びＯ１５７ ｃｏｌｉｐｈａｇｅ ｖＢ＿Ｅｃｏ４Ｍ－７（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＭＮ１７６２１７）（６８ｋｂ）（以下、Ｏ１５７ｖＢと記載する）のゲノムをテンプレートとしてＰＣＲを行い、各々５～８本のＤＮＡ断片を作製した。隣り合うＤＮＡ断片が末端に相同配列（Ｔ７：４０ｂｐ、Ｏ１５７ファージ：３０ｂｐ～）を持つようにプライマーを設計した。ＨｉＢｉＴタグ（Ｐｒｏｍｅｇａ、アメリカ）付きのＯ１５７ｖＢ合成では、ＨｉＢｉＴ配列を組み込んだプライマーでＰＣＲを行い、標的タンパク質のＣ末端にタグを付加させた。ＰＣＲの後、ＦａｓｔＧｅｎｅ Ｇｅｌ／ＰＣＲ ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（日本ジェネティクス、日本）を用いてＤＮＡ断片のゲル切り出し精製を行った。
３．１．ＰＣＲによるＤＮＡ断片の作製
Ｔ７（４０ｋｂ）及びＯ１５７ ｃｏｌｉｐｈａｇｅ ｖＢ＿Ｅｃｏ４Ｍ－７（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＭＮ１７６２１７）（６８ｋｂ）（以下、Ｏ１５７ｖＢと記載する）のゲノムをテンプレートとしてＰＣＲを行い、各々５～８本のＤＮＡ断片を作製した。隣り合うＤＮＡ断片が末端に相同配列（Ｔ７：４０ｂｐ、Ｏ１５７ファージ：３０ｂｐ～）を持つようにプライマーを設計した。ＨｉＢｉＴタグ（Ｐｒｏｍｅｇａ、アメリカ）付きのＯ１５７ｖＢ合成では、ＨｉＢｉＴ配列を組み込んだプライマーでＰＣＲを行い、標的タンパク質のＣ末端にタグを付加させた。ＰＣＲの後、ＦａｓｔＧｅｎｅ Ｇｅｌ／ＰＣＲ ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（日本ジェネティクス、日本）を用いてＤＮＡ断片のゲル切り出し精製を行った。
【0032】
３．２．アセンブリ
ＤＮＡ断片間の相同配列を使ってアセンブリを行った。各ＤＮＡ断片５０ｆｍｏｌとＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、アメリカ）を３０μＬの反応系で混ぜ、５０℃で３時間反応させた。アセンブリ反応を評価するため、酵素の代わりに超純水を加えたサンプルも用意した。アセンブリ後、反応液の一部を電気泳動に利用した。
ＤＮＡ断片間の相同配列を使ってアセンブリを行った。各ＤＮＡ断片５０ｆｍｏｌとＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、アメリカ）を３０μＬの反応系で混ぜ、５０℃で３時間反応させた。アセンブリ反応を評価するため、酵素の代わりに超純水を加えたサンプルも用意した。アセンブリ後、反応液の一部を電気泳動に利用した。
【0033】
３．３．エレクトロポレーション
アセンブリ酵素あり（＋）のサンプルは原液～１００倍希釈液、酵素なし（－）のサンプルは原液を使い、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｅｌｅｃｔｒｏ－Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションにはＥＬＥＰＯ２１（ネッパジーン、日本）を使用し、電気条件はＰｏｒｉｎｇ Ｐｕｌｓｅ（電圧：１，５００Ｖ、パルス幅：２．５ｍｓｅｃ、パルス間隔：５０ｍｓ、回数：１回、極性：＋）、Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐｕｌｓｅ（電圧：１５０Ｖ、パルス幅：５０ｍｓｅｃ、パルス間隔：５０ｍｓ、回数：５回、極性：＋／－）にした。サンプルを１ｍＬのＳＯＣ培地に加え、振盪培養（３７℃、２００ｒｐｍ、Ｔ７：２０分、Ｏ１５７ｖＢ：２０分～１時間）した。Ｔ７は、３ｍＬのＬＴＡに培養液を全量加え、ＬＢ寒天培地１５ｍＬへ重層した後、３７℃で５時間静置培養した。Ｏ１５７ｖＢは、３ｍＬのＬＴＡに培養液５００μＬ～１ｍＬとＯ１５７：Ｈ７株（ＡＴＣＣ ４３８８８）の一晩培養液２００～３００μＬを加え、ＬＢ寒天培地１５ｍＬに重層した後、３７℃で一晩培養した。培養後、プラークの数を数え、希釈液を使ってエレクトロポレーションをした場合は原液のプラーク数に換算した。Ｏ１５７ｖＢ合成ファージはプラークをＳＭバッファー１００μＬに回収した。
アセンブリ酵素あり（＋）のサンプルは原液～１００倍希釈液、酵素なし（－）のサンプルは原液を使い、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｅｌｅｃｔｒｏ－Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションにはＥＬＥＰＯ２１（ネッパジーン、日本）を使用し、電気条件はＰｏｒｉｎｇ Ｐｕｌｓｅ（電圧：１，５００Ｖ、パルス幅：２．５ｍｓｅｃ、パルス間隔：５０ｍｓ、回数：１回、極性：＋）、Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐｕｌｓｅ（電圧：１５０Ｖ、パルス幅：５０ｍｓｅｃ、パルス間隔：５０ｍｓ、回数：５回、極性：＋／－）にした。サンプルを１ｍＬのＳＯＣ培地に加え、振盪培養（３７℃、２００ｒｐｍ、Ｔ７：２０分、Ｏ１５７ｖＢ：２０分～１時間）した。Ｔ７は、３ｍＬのＬＴＡに培養液を全量加え、ＬＢ寒天培地１５ｍＬへ重層した後、３７℃で５時間静置培養した。Ｏ１５７ｖＢは、３ｍＬのＬＴＡに培養液５００μＬ～１ｍＬとＯ１５７：Ｈ７株（ＡＴＣＣ ４３８８８）の一晩培養液２００～３００μＬを加え、ＬＢ寒天培地１５ｍＬに重層した後、３７℃で一晩培養した。培養後、プラークの数を数え、希釈液を使ってエレクトロポレーションをした場合は原液のプラーク数に換算した。Ｏ１５７ｖＢ合成ファージはプラークをＳＭバッファー１００μＬに回収した。
【0034】
３．４．Ｔ７を用いた合成方法の条件検討
ファージ合成方法を最適化するため、ＤＮＡ断片の精製方法、ＤＮＡ断片間の相同配列の長さ、アセンブリ時のＤＮＡインプット量について条件検討を行った。ＤＮＡ断片の精製方法については、ＰＣＲで断片５本を３組作製し、未精製・カラム精製（ＦａｓｔＧｅｎｅ Ｇｅｌ／ＰＣＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）・ゲル切り出し精製の３つに分けた。アセンブリ以降は全て同様の方法で合成を行った。断片間の相同配列の長さ検討では、相同配列が２０，４０，６０，８０，１００ｂｐになるようにそれぞれプライマーを設計し、ＰＣＲで５組の５断片を作成した。精製以降は全て同様に合成した。ＤＮＡインプット量の比較では、ゲル切り出し精製済みのＤＮＡ断片５本を５，２５，５０，７５，１００ｆｍｏｌずつ等モルで混合し、３０μＬのＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ反応系で５０℃、３時間反応させた。アセンブリ後は同様の方法で合成した。それぞれの合成条件で得られたプラーク数を数え、合成効率を比較した。
ファージ合成方法を最適化するため、ＤＮＡ断片の精製方法、ＤＮＡ断片間の相同配列の長さ、アセンブリ時のＤＮＡインプット量について条件検討を行った。ＤＮＡ断片の精製方法については、ＰＣＲで断片５本を３組作製し、未精製・カラム精製（ＦａｓｔＧｅｎｅ Ｇｅｌ／ＰＣＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）・ゲル切り出し精製の３つに分けた。アセンブリ以降は全て同様の方法で合成を行った。断片間の相同配列の長さ検討では、相同配列が２０，４０，６０，８０，１００ｂｐになるようにそれぞれプライマーを設計し、ＰＣＲで５組の５断片を作成した。精製以降は全て同様に合成した。ＤＮＡインプット量の比較では、ゲル切り出し精製済みのＤＮＡ断片５本を５，２５，５０，７５，１００ｆｍｏｌずつ等モルで混合し、３０μＬのＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ反応系で５０℃、３時間反応させた。アセンブリ後は同様の方法で合成した。それぞれの合成条件で得られたプラーク数を数え、合成効率を比較した。
【0035】
＜４．ファージのシーケンシング＞
４．１．全ゲノムシーケンシング
Ｏ１５７ｖＢ（天然ファージ及び合成ファージ）と大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＡＴＣＣ ４３８８８及び臨床分離株）について、ケミカル同仁（日本）によりＮｏｖａＳｅｑ６０００Ｓｙｓｔｅｍ（１５０ｂｐ×２ペアエンドリード）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、アメリカ）で微生物全ゲノムシーケンシングが行われた。シーケンスデータは以下の通りに解析した。シーケンスの生データをＳｈｏｖｉｌｌ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｔｓｅｅｍａｎｎ／ｓｈｏｖｉｌｌ）（ｖ１．０．９及びｖ１．１．０）のデフォルト設定でアセンブリした。続いて、アセンブリされたコンディグファイルを用いてＰｒｏｋｋａ（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｕ１５３）（ｖ１．１４．６）でアノテーションを行った。
４．１．全ゲノムシーケンシング
Ｏ１５７ｖＢ（天然ファージ及び合成ファージ）と大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＡＴＣＣ ４３８８８及び臨床分離株）について、ケミカル同仁（日本）によりＮｏｖａＳｅｑ６０００Ｓｙｓｔｅｍ（１５０ｂｐ×２ペアエンドリード）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、アメリカ）で微生物全ゲノムシーケンシングが行われた。シーケンスデータは以下の通りに解析した。シーケンスの生データをＳｈｏｖｉｌｌ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｔｓｅｅｍａｎｎ／ｓｈｏｖｉｌｌ）（ｖ１．０．９及びｖ１．１．０）のデフォルト設定でアセンブリした。続いて、アセンブリされたコンディグファイルを用いてＰｒｏｋｋａ（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｕ１５３）（ｖ１．１４．６）でアノテーションを行った。
【0036】
４．２．ＨｉＢｉＴタグ挿入箇所の確認
ＨｉＢｉＴタグを付加したＯ１５７ｖＢ合成ファージについて、タグが標的タンパク質に付加されているかを確認した。ＨｉＢｉＴタグの上流と下流それぞれ２００ｂｐを含めて増幅させるようなプライマーを設計し、合成で得られたプラークをテンプレートとしてＰＣＲを行った。約５００ｂｐのＰＣＲ産物をカラム精製（ＦａｓｔＧｅｎｅ Ｇｅｌ／ＰＣＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）し、サンガー法シーケンシング（ユーロフィンジェノミクス、日本）をした。
ＨｉＢｉＴタグを付加したＯ１５７ｖＢ合成ファージについて、タグが標的タンパク質に付加されているかを確認した。ＨｉＢｉＴタグの上流と下流それぞれ２００ｂｐを含めて増幅させるようなプライマーを設計し、合成で得られたプラークをテンプレートとしてＰＣＲを行った。約５００ｂｐのＰＣＲ産物をカラム精製（ＦａｓｔＧｅｎｅ Ｇｅｌ／ＰＣＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）し、サンガー法シーケンシング（ユーロフィンジェノミクス、日本）をした。
【0037】
実施例２
＜５．Ｏ１５７：Ｈ７の検出＞
９６穴プレートで細菌（１０７ＣＦＵ／ｍＬ）にＨｉＢｉＴタグ付きのＯ１５７ｖＢファージ（１０７ＰＦＵ／ｍＬ）を加え、２００μＬの培養系で振盪培養（３７℃、６００ｒｐｍ）をした。このとき、１プレートにつきＬＢ液体培地だけのウェルを３つ以上用意した。２時間培養後、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ＨｉＢｉＴ Ｌｙｔｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてファージに付加したＨｉＢｉＴタグを検出した。白色の９６穴プレートに培養液５０μＬと２×Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ＨｉＢｉＴ Ｌｙｔｉｃ Ｒｅａｇｅｎｔ ５０μＬを加え、遮光しながら振盪（５００ｒｐｍ、１０分）した後、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で発光を測定した（測定時間：２秒）。ＬＢ液体培地の発光量（３点の平均値）を測定のバックグラウンドとし、サンプルの発光量から引いた。Ｏ１５７：Ｈ７検出限界の測定では、細菌の一晩培養液を１０倍ずつ段階希釈し、それぞれにＯ１５７ｖＢファージ（ｇｐ２７にＨｉＢｉＴタグを付加した合成Ｏ１５７ｖＢ、１０７ＰＦＵ／ｍＬ）を加えて２時間培養した。
また、１ＣＦＵ／ｍＬ Ｏ１５７：Ｈ７の検出では、前培養の時間を０（前培養なし），１，２，３，４，５，６，７，８時間の９点に分け、何時間でＯ１５７：Ｈ７を検出できるか確かめた。Ｏ１５７：Ｈ７（ＡＴＣＣ ４３８８８、１ ＣＦＵ／ｍＬ）を１０ｍＬの培養系で前培養し（３７℃、２００ｒｐｍ）、培養開始から８時間後にそれぞれのサンプルにＯ１５７ｖＢファージ（ｇｐ２７にＨｉＢｉＴタグを付加したＯ１５７ｖＢ、１０７ＰＦＵ／ｍＬ）を加えた。細菌とファージを２時間培養した後、上述の方法でファージに付加したＨｉＢｉＴタグの検出を行った。
＜５．Ｏ１５７：Ｈ７の検出＞
９６穴プレートで細菌（１０７ＣＦＵ／ｍＬ）にＨｉＢｉＴタグ付きのＯ１５７ｖＢファージ（１０７ＰＦＵ／ｍＬ）を加え、２００μＬの培養系で振盪培養（３７℃、６００ｒｐｍ）をした。このとき、１プレートにつきＬＢ液体培地だけのウェルを３つ以上用意した。２時間培養後、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ＨｉＢｉＴ Ｌｙｔｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてファージに付加したＨｉＢｉＴタグを検出した。白色の９６穴プレートに培養液５０μＬと２×Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ＨｉＢｉＴ Ｌｙｔｉｃ Ｒｅａｇｅｎｔ ５０μＬを加え、遮光しながら振盪（５００ｒｐｍ、１０分）した後、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で発光を測定した（測定時間：２秒）。ＬＢ液体培地の発光量（３点の平均値）を測定のバックグラウンドとし、サンプルの発光量から引いた。Ｏ１５７：Ｈ７検出限界の測定では、細菌の一晩培養液を１０倍ずつ段階希釈し、それぞれにＯ１５７ｖＢファージ（ｇｐ２７にＨｉＢｉＴタグを付加した合成Ｏ１５７ｖＢ、１０７ＰＦＵ／ｍＬ）を加えて２時間培養した。
また、１ＣＦＵ／ｍＬ Ｏ１５７：Ｈ７の検出では、前培養の時間を０（前培養なし），１，２，３，４，５，６，７，８時間の９点に分け、何時間でＯ１５７：Ｈ７を検出できるか確かめた。Ｏ１５７：Ｈ７（ＡＴＣＣ ４３８８８、１ ＣＦＵ／ｍＬ）を１０ｍＬの培養系で前培養し（３７℃、２００ｒｐｍ）、培養開始から８時間後にそれぞれのサンプルにＯ１５７ｖＢファージ（ｇｐ２７にＨｉＢｉＴタグを付加したＯ１５７ｖＢ、１０７ＰＦＵ／ｍＬ）を加えた。細菌とファージを２時間培養した後、上述の方法でファージに付加したＨｉＢｉＴタグの検出を行った。
【0038】
タグ配列をＯ１５７ファージの遺伝子の様々な遺伝子領域に付加させることができた。
また、本発明ではさらに開発したＯ１５７ファージ合成法を利用し、様々なファージ由来遺伝子に検出用タグを付けたファージを合成することができた。これまでタグを付ける遺伝子はカプシドが主流であったが、テールや溶菌酵素にタグを付けたファージの方が、検出感度が高くなることがわかった。スクリーニング実験により、Ｏ１５７の検出効率が、タグを付加するファージの遺伝子の領域に大きく依存することがわかった。例えば、溶菌酵素やファージテールに付加したファージによる検出感度は、ファージカプシド遺伝子に検出タグを付加したファージによる検出感度の１０倍以上であった。合成を行ったファージを表１に示した。また、Ｏ１５７：Ｈ７実験株に対する検出感度の比較結果を図１に示した。臨床分離株３株に対して行った比較検討も同様の結果となりました。Ｏ１５７ファージにおいて、最も効率的にＯ１５７を検出したファージは、テール遺伝子に検出タグを付加したものであった。ただし、検出タグ付加に最適な遺伝子は、ファージの種類によって異なる可能性がある。
また、本発明ではさらに開発したＯ１５７ファージ合成法を利用し、様々なファージ由来遺伝子に検出用タグを付けたファージを合成することができた。これまでタグを付ける遺伝子はカプシドが主流であったが、テールや溶菌酵素にタグを付けたファージの方が、検出感度が高くなることがわかった。スクリーニング実験により、Ｏ１５７の検出効率が、タグを付加するファージの遺伝子の領域に大きく依存することがわかった。例えば、溶菌酵素やファージテールに付加したファージによる検出感度は、ファージカプシド遺伝子に検出タグを付加したファージによる検出感度の１０倍以上であった。合成を行ったファージを表１に示した。また、Ｏ１５７：Ｈ７実験株に対する検出感度の比較結果を図１に示した。臨床分離株３株に対して行った比較検討も同様の結果となりました。Ｏ１５７ファージにおいて、最も効率的にＯ１５７を検出したファージは、テール遺伝子に検出タグを付加したものであった。ただし、検出タグ付加に最適な遺伝子は、ファージの種類によって異なる可能性がある。
【0039】
【表1】
【産業上の利用可能性】
【0040】
本発明の検出方法は、Ｏ１５７等による感染症の迅速診断に利用可能である。安価で簡便なため、さまざまな医療機関で利用できる。Ｏ１５７による汚染の検出は、食品、水、乳製品、家畜等の領域でも重要である。本検出法は非常に高感度であるため、Ｉｎ ｖｉｖｏ診断も可能である。これまでのファージセラピーの実績から、ファージはヒトに投与しても安全であることが知られている。投与経路も血中投与、経口投与、塗布等、限定されない。本発明の組換えファージをヒトに投与することで、患者が病原細菌に感染しているか否か、また感染している場合、どの臓器に細菌が集積しているかといった情報が得られる。
【図1】
