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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024132922
(43)【公開日】2024-10-01
(54)【発明の名称】ＰＲＤＸ４発現促進剤
(51)【国際特許分類】
A61K 8/9789 20170101AFI20240920BHJP
A61K 36/61 20060101ALI20240920BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240920BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240920BHJP
【ＦＩ】
A61K8/9789
A61K36/61
A61P43/00 111
A61P17/00
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024030255
(22)【出願日】2024-02-29
(31)【優先権主張番号】P 2023039742
(32)【優先日】2023-03-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】000001959
【氏名又は名称】株式会社 資生堂
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100196977
【弁理士】
【氏名又は名称】上原 路子
(72)【発明者】
【氏名】堀場 聡
(72)【発明者】
【氏名】飛田 亮三
【テーマコード（参考）】
4C083
4C088
【Ｆターム（参考）】
4C083AA111
4C083AA112
4C083EE11
4C088AB57
4C088AC05
4C088BA08
4C088CA06
4C088NA14
4C088ZA89
4C088ZC41
(57)【要約】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ユーカリ抽出物を有効成分として含む、ＰＲＤＸ４発現促進剤。
【請求項2】
ユーカリ抽出物を有効成分として含む、カルボニル化抑制剤。
【請求項3】
ユーカリ抽出物を有効成分として含み、ＰＲＤＸ４発現を促進することによりカルボニル化を抑制する、カルボニル化抑制剤。
【請求項4】
ユーカリ抽出物を有効成分として含む、コラーゲン成熟又は輸送促進剤。
【請求項5】
ユーカリ抽出物を有効成分として含み、ＰＲＤＸ４発現を促進することによりコラーゲンの成熟又は輸送を促進する、コラーゲン成熟又は輸送促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＰＲＤＸ４発現促進剤、特に、ユーカリ抽出物を有効成分として含むＰＲＤＸ４発現促進剤に関する。
【背景技術】
【0002】
ＰＲＤＸ４（Ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ ４、ペルオキシレドキシン４）は、抗酸化酵素のペルオキシレドキシンファミリーのメンバーであり、癌、動脈硬化、糖尿病などに対する抑制効果、創傷治療促進効果、炎症抑制効果等が報告されている（非特許文献１）。また、ＰＲＤＸ４はカルボニル化抑制を介して皮膚のくすみを改善することも報告されている（非特許文献２）。更に、ＰＲＤＸ４がコラーゲンの成熟及び輸送を促進することにより皮膚のハリに寄与する可能性も報告されている（非特許文献３）。これらの効果を奏するべくＰＲＤＸ４を促進することができる物質の探索が望まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ， ３４（１）；２７－３９（２０１２）
【非特許文献2】第４０回日本美容皮膚科学会総会・学術大会要旨集 一般演題２「皮膚老化」Ｏ-７より（２０２２年８月６日発表）
【非特許文献3】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ. ２０１２ Ｏｃｔ １２;４８（１）:３９-５１.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明は、ＰＲＤＸ４発現促進剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者らによる鋭意研究の結果、ユーカリ抽出物にＰＲＤＸ４抑制効果があることが発見された。
【0006】
本願は以下の発明を提供する。
（１）ユーカリ抽出物を有効成分として含む、ＰＲＤＸ４発現促進剤。
（２）ユーカリ抽出物を有効成分として含む、カルボニル化抑制剤。
（３）ユーカリ抽出物を有効成分として含み、ＰＲＤＸ４発現を促進することによりカルボニル化を抑制する、カルボニル化抑制剤。
（４）ユーカリ抽出物を有効成分として含む、コラーゲン成熟又は輸送促進剤。
（５）ユーカリ抽出物を有効成分として含み、ＰＲＤＸ４発現を促進することによりコラーゲンの成熟又は輸送を促進する、コラーゲン成熟又は輸送促進剤。
（１）ユーカリ抽出物を有効成分として含む、ＰＲＤＸ４発現促進剤。
（２）ユーカリ抽出物を有効成分として含む、カルボニル化抑制剤。
（３）ユーカリ抽出物を有効成分として含み、ＰＲＤＸ４発現を促進することによりカルボニル化を抑制する、カルボニル化抑制剤。
（４）ユーカリ抽出物を有効成分として含む、コラーゲン成熟又は輸送促進剤。
（５）ユーカリ抽出物を有効成分として含み、ＰＲＤＸ４発現を促進することによりコラーゲンの成熟又は輸送を促進する、コラーゲン成熟又は輸送促進剤。
【発明の効果】
【0007】
本発明のＰＲＤＸ４発現促進剤の投与により、ＰＲＤＸ４発現を促進することができる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】図１は、実施例実験３の結果であり、ユーカリ抽出物を添加した場合の線維芽細胞におけるＰＲＤＸ４発現量（ＰＲＤＸ４／ＧＡＰＤＨ）について、対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）を１．０とした相対値として示す（＊＊Ｐ＝０．００２３（対応のないｔ検定））。
【発明を実施するための形態】
【0009】
本発明は、ユーカリ抽出物にＰＲＤＸ４発現促進効果があるという本発明者らの発見に基づく。また、ＰＲＤＸ４発現はカルボニル化抑制効果やコラーゲン成熟及び輸送促進効果を示すことが知られている（非特許文献２、３）。したがって、本発明はユーカリ抽出物を有効成分として含む、ＰＲＤＸ４発現促進剤、カルボニル化抑制剤、コラーゲン成熟促進剤、及びコラーゲン輸送促進剤を提供する（以下、本発明のＰＲＤＸ４発現促進剤、カルボニル化抑制剤、コラーゲン成熟促進剤、及びコラーゲン輸送促進剤をまとめて本発明の剤と総称することがある）。本発明のカルボニル化抑制剤は、ＰＲＤＸ４発現を促進することによりカルボニル化を抑制する。本発明のコラーゲン成熟促進剤は、ＰＲＤＸ４発現を促進することによりコラーゲンの成熟を促進する。本発明のコラーゲン輸送促進剤は、ＰＲＤＸ４発現を促進することによりコラーゲンの輸送を促進する。
【0010】
ＰＲＤＸ４発現促進は、例えば、本発明の剤を添加する前または本発明の剤を添加しない対照に比べて、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上、２００％以上、３００％以上、４００％以上、又は５００％以上高いＰＲＤＸ４遺伝子発現量を示すことを指す。
【0011】
ＰＲＤＸ４が欠損するとプロコラーゲンの三重らせん構造の形成が妨げられ、その結果コラーゲン成熟異常が起こることが報告されている（非特許文献３）。また、プロコラーゲンの三重らせん構造の形成が妨げられると輸送も障害されるため、ＰＲＤＸ４発現を促進することによりコラーゲンの成熟及び輸送を促進することが予想される。
【0012】
本明細書において、コラーゲンの成熟促進とは、ＰＲＤＸ４の発現を介しコラーゲンの成熟を促すこと指す。例えば、ＰＲＤＸ４の発現を上昇させることにより、プロコラーゲンの三重らせん構造の形成を促すことを指す。コラーゲンの輸送促進とは、ＰＲＤＸ４の発現を上昇させることにより、三重らせん構造の形成を促すことにより三重らせん構造のプロコラーゲンがゴルジ体を介し細胞外への輸送されることに寄与することを指す。
【0013】
本発明で用いられるユーカリ抽出物は、フトモモ科ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）の植物体の抽出物である。植物体は、好ましくは葉であり、樹皮、花、果実、種子、根等の各種部位であってもよい。
【0014】
ユーカリ抽出物は公知の物質であり、公知の方法により植物体に搾汁、乾燥、精製、抽出等の処理をすることにより得ることができ、また市販品を容易に入手可能である。ユーカリ抽出物に用いる植物体原料は生のままでも乾燥したものでも使用することができるが、使用性、製剤化等の観点から、乾燥物、乾燥粉末、原料の粉末物、搾汁液等として用いることもできる。原料により、いずれの形態を用いるかは適宜選択することができ、必要に応じて殺菌等の処理を施してもよい。
【0015】
例えばユーカリ抽出物の抽出方法は溶媒抽出により行うことができる。溶媒抽出の場合には、好ましくはユーカリの葉、あるいは他の各種部位（樹皮、花、果実、種子、根等）を必要に応じて乾燥させ、更に必要に応じて細断又は粉砕した後、水性抽出剤、水、例えば冷水、温水、又は沸点若しくはそれより低温の熱水、あるいは含水有機溶媒、有機溶媒、例えばエタノール、メタノール、エーテル、１、３－ブチレングリコール等を原料の性質や組成物の用途等により好ましい溶媒を適宜選択して常温で又は加熱して用いることにより抽出される。しかしながら、抽出方法は溶媒抽出に限定されず、当業界で知られている常用の手法によってもよく、本発明で用いる抽出物の抽出方法や抽出物の形態は、本発明の効果を損なわない限り任意である。上記抽出物の形態は、抽出液自体だけでなく、常用の手法により適宜希釈又は濃縮したものであってもよく、更に、抽出液を乾燥することによって得られる粉状あるいは塊状の固体であってもよいし、搾汁液を常用の手法により適宜希釈又は濃縮したものであってもよい。抽出物に発酵又はプロテアーゼやペクチナーゼ等の酵素処理を施してもよいし、デキストリンやアラビアガム等を添加し粉末化してもよい。
【0016】
含水有機溶媒の例として、含水エタノール、含水メタノール、含水エーテル、含水１、３－ブチレングリコール等の含水低級アルコール（例えば、Ｃ１～Ｃ４）を用いてもよく、その場合の含水率は、例えば０～１０ｖ／ｖ％、１０～４０ｖ／ｖ％、２０～３０ｖ／ｖ％、３０～４０ｖ／ｖ％、３０～５０ｖ／ｖ％、６０～７０ｖ／ｖ％、５０～８０ｖ／ｖ％、８０～９９．５ｖ／ｖ％等であってもよい。
【0017】
乾燥粉末を得る方法としては、ユーカリの葉あるいは各種部位（樹皮、花、果実、種子、根等）を細断又は粉砕しその後に乾燥する方法や、植物を乾燥した後に細断又は粉砕して乾燥粉末を得る方法がある。また、植物を細断又は粉砕し、発酵又はプロテアーゼやペクチナーゼ等の酵素処理を施した後、乾燥し、更に必要に応じて所定の粒径にすべく粉砕する方法等を適宜採ることができる。乾燥物にデキストリンやアラビアガム等を添加し粉末化してもよい。
【0018】
上述のように、ＰＲＤＸ４の発現は、癌、動脈硬化、糖尿病などに対する抑制効果、創傷治療促進効果、炎症抑制効果、カルボニル化抑制効果、コラーゲン成熟及び輸送促進効果等などに有用であることが報告されている（非特許文献１～３）。したがって、本発明の剤の適用により、ＰＲＤＸ４発現促進を介して、上記効果を奏することが期待される。例えば、ＰＲＤＸ４はカルボニル化抑制を介して皮膚のくすみを改善すること（非特許文献２）や、コラーゲンの成熟や輸送を促進することにより皮膚のハリに寄与する可能性（非特許文献３）が報告されている。また、実施例にて示されるように、ＰＲＤＸ４陽性かつＶｉｍｅｎｔｉｎ陽性の細胞数とＩ型コラーゲンは正に相関する。よって、ＰＲＤＸ４は、コラーゲンの成熟や輸送促進によりコラーゲンの増加又はコラーゲンの減少抑制を介して皮膚のハリに寄与する可能性も考えられる。したがって、皮膚のＰＲＤＸ４促進により、皮膚コラーゲンのカルボニル化抑制を介して皮膚のくすみ抑制に寄与することや、皮膚コラーゲン成熟や輸送促進又はコラーゲンの増加や減少抑制を介して皮膚のハリ改善に寄与することが期待される。
【0019】
本願は、本発明の剤を含む組成物も提供する。本発明の組成物は、化粧品組成物又は食品組成物であってもよい。本発明の組成物は、例えば、ＰＲＤＸ４発現促進のための組成物、あるいはＰＲＤＸ４発現促進を介した皮膚のくすみ抑制あるいはハリ改善のための組成物であってもよい。
【0020】
化粧品組成物の場合、乳液、クリーム、美容液、ローション、パック、洗顔料、石鹸、ボディソープ、シャンプー等の各種化粧品であってもよく、液状、乳液状、クリーム状、固形状、シート状、スプレー状、ゲル状、泡状、パウダー状等の様々な形態であり得る。食品組成物の場合、粉末、飲料、または錠剤であってもよく、粉末状、液状、固形状、顆粒状、粒状、ペースト状、ゲル状等の様々な形態であり得る。
【0021】
また、本願は、本発明の剤又は組成物を対象に投与することにより、ＰＲＤＸ４発現促進を介した皮膚のくすみ抑制又はハリ改善のための美容方法も提供する。本発明の方法は、美容を目的とする方法であり、医師や医療従事者による治療ではないことがある。また、本願にかかる方法は、対象の美容行為を支援する方法であってもよい。本発明の剤又は組成物は、経皮、経口等各種投与経路で投与でき、皮膚のＰＲＤＸ４発現を増強させたい場合、経皮投与が好ましい。
【0022】
さらに、本発明は、皮膚のくすみ抑制又はハリ改善のための経皮剤といった医薬の製造におけるユーカリ抽出物の使用も提供する。本発明は、皮膚におけるＰＲＤＸ４発現促進による、例えばカルボニル化抑制又はコラーゲン成熟又は輸送促進又はコラーゲンの増加又は減少抑制を介した、皮膚のくすみ抑制又はハリ改善における使用のためのユーカリ抽出物も提供する。
【0023】
本発明の剤又は組成物は、ユーカリ抽出物を本発明の効果が十分発揮されるような量で含むことが好ましく、その配合量は、それらの種類、目的、形態、利用方法などに応じて、適宜決めることができる。例えば、有効成分としてユーカリ抽出物を、総重量当たり０．０００１～１００重量％、０．０００１～９０重量％、０．００１～５０重量％、０．０１～５重量％、０．０１～１重量％、０．０１～０．５重量％、０．０５～０．２重量％、０．１重量％等とすることができるが、本発明の効果が発揮されれば限定されない。ある実施形態では、本発明の剤は、ユーカリ抽出物からなる。
【0024】
また、投与頻度は、４週間に１回、２週間に１回、１週間に１回、３日に１回、２日に１回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、都度投与等任意に選択できるがこれらに限定されない。
【0025】
本発明の剤及び組成物は、その剤形に応じ、賦形剤、担体及び／又は希釈剤等及び他の成分と適宜組み合わせた処方で、常法を用いて製造することができる。必要に応じて添加剤を任意に選択し併用することができる。添加剤としては賦形剤、着色剤、保存剤、増粘剤、結合剤、崩壊剤、分散剤、安定化剤、ゲル化剤、酸化防止剤、界面活性剤、保存剤、ｐＨ調整剤等については、公知のものを適宜選択して使用できる。
【実施例0026】
次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【0027】
実験１：ユーカリ抽出物の調製
ユーカリ抽出物は、含水エタノールを抽出溶媒としてユーカリの葉を抽出し、溶媒を留去後、抽出物を乾燥して得た。
ユーカリ抽出物は、含水エタノールを抽出溶媒としてユーカリの葉を抽出し、溶媒を留去後、抽出物を乾燥して得た。
【0028】
実験２：ヒト新生児由来線維芽細胞の培養
ヒト新生児由来線維芽細胞を２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に１ｘ１０５ ｃｅｌｌｓ ／ｗｅｌｌとなるように１ ｍｌ／ｗｅｌｌの培養液（１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ社製）に播種した。３７℃で２４時間培養後、培養液を除き、ユーカリ抽出物を０．１重量％となるように添加した培養液（１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ社製）を１ｍｌ／ｗｅｌｌで添加し３７℃で更に２４時間培養した。対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）として１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭを使用した。
ヒト新生児由来線維芽細胞を２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に１ｘ１０５ ｃｅｌｌｓ ／ｗｅｌｌとなるように１ ｍｌ／ｗｅｌｌの培養液（１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ社製）に播種した。３７℃で２４時間培養後、培養液を除き、ユーカリ抽出物を０．１重量％となるように添加した培養液（１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ社製）を１ｍｌ／ｗｅｌｌで添加し３７℃で更に２４時間培養した。対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）として１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭを使用した。
【0029】
実験３：ＰＲＤＸ４の発現解析
実験２で培養した線維芽細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてｍＲＮＡを回収した。回収したｍＲＮＡに対し以下ＰＲＤＸ４とＧＡＰＤＨのプライマーを使用し、ＴａｑＭａｎ ＲＮＡ－ｔｏ ＣｔＴＭ １－Ｓｔｅｐ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを実施した。得られた結果よりＰＲＤＸ４／ＧＡＰＤＨの相対値を算出し、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｔ－ｔｅｓｔで対照との有意差検定を実施した（ｎ＝４）。
ＰＲＤＸ４プライマー：Ｈｓ０１０５６０７６＿ｍ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）
ＧＡＰＤＨプライマー：Ｈｓ０２７８６６２４＿ｇ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）
実験２で培養した線維芽細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてｍＲＮＡを回収した。回収したｍＲＮＡに対し以下ＰＲＤＸ４とＧＡＰＤＨのプライマーを使用し、ＴａｑＭａｎ ＲＮＡ－ｔｏ ＣｔＴＭ １－Ｓｔｅｐ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを実施した。得られた結果よりＰＲＤＸ４／ＧＡＰＤＨの相対値を算出し、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｔ－ｔｅｓｔで対照との有意差検定を実施した（ｎ＝４）。
ＰＲＤＸ４プライマー：Ｈｓ０１０５６０７６＿ｍ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）
ＧＡＰＤＨプライマー：Ｈｓ０２７８６６２４＿ｇ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）
【0030】
結果を図１に示す。ユーカリ抽出物を使用すると対照と比較してＰＲＤＸ４の発現が有意に増加した。これらの実験により、ユーカリ抽出物により皮膚線維芽細胞等の試料におけるＰＲＤＸ４の発現が促進されることがわかる。したがって、ユーカリ抽出物によりＰＲＤＸ４発現が促進されれば、カルボニル化抑制、コラーゲン成熟又は輸送促進等の効果が期待される。例えば、皮膚線維芽細胞等の皮膚細胞におけるＰＲＤＸ４発現が促進されれば、カルボニル化抑制、コラーゲン成熟又は輸送促進により、皮膚のくすみ抑制又はハリ改善が期待できる。
【0031】
実験４：皮膚におけるＰＲＤＸ４とコラーゲンの関連性
若齢者（２０代～３０代）及び高齢者（５０代～７０代）の白人由来の目尻の皮膚を凍結切片にし、薄切後ＰＲＤＸ４（ウサギ由来の抗ＰＲＤＸ４抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ））、線維芽細胞のマーカーとしてＶｉｍｅｎｔｉｎ（ニワトリ由来の抗ヒトビメンチン抗体（ａｂｃａｍ））、Ｉ型コラーゲン（マウス由来の抗Ｉ型コラーゲン抗体（ａｂｃａｍ））を染色した。また、細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。染色後、これらの標識について蛍光撮像を行った。撮像した画像をもとにＰＲＤＸ４陽性かつＶｉｍｅｎｔｉｎ陽性の細胞をカウントし、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定で有意差検定を実施した（若齢者、高齢者各ｎ＝６）。また、撮像した画像をもとに画像解析ソフトＩｍａｇｅＪを用いてＩ型コラーゲンシグナルの輝度値を定量した。全サンプル中で最も強い輝度値をもつサンプルを１とした際の各サンプルの輝度値の相対値を算出しＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定で有意差検定を実施した（若齢者、高齢者各ｎ＝１０）。更に、これらのＰＲＤＸ４陽性Ｖｉｍｅｎｔｉｎ陽性細胞数とＩ型コラーゲンシグナルの輝度値をもとに、スピアマンの順位相関係数を用いて相関解析を実施した。
若齢者（２０代～３０代）及び高齢者（５０代～７０代）の白人由来の目尻の皮膚を凍結切片にし、薄切後ＰＲＤＸ４（ウサギ由来の抗ＰＲＤＸ４抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ））、線維芽細胞のマーカーとしてＶｉｍｅｎｔｉｎ（ニワトリ由来の抗ヒトビメンチン抗体（ａｂｃａｍ））、Ｉ型コラーゲン（マウス由来の抗Ｉ型コラーゲン抗体（ａｂｃａｍ））を染色した。また、細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。染色後、これらの標識について蛍光撮像を行った。撮像した画像をもとにＰＲＤＸ４陽性かつＶｉｍｅｎｔｉｎ陽性の細胞をカウントし、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定で有意差検定を実施した（若齢者、高齢者各ｎ＝６）。また、撮像した画像をもとに画像解析ソフトＩｍａｇｅＪを用いてＩ型コラーゲンシグナルの輝度値を定量した。全サンプル中で最も強い輝度値をもつサンプルを１とした際の各サンプルの輝度値の相対値を算出しＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定で有意差検定を実施した（若齢者、高齢者各ｎ＝１０）。更に、これらのＰＲＤＸ４陽性Ｖｉｍｅｎｔｉｎ陽性細胞数とＩ型コラーゲンシグナルの輝度値をもとに、スピアマンの順位相関係数を用いて相関解析を実施した。
【0032】
結果を図２～４に示す。図２により老化に伴いＰＲＤＸ４陽性かつＶｉｍｅｎｔｉｎ陽性の細胞数が減少することが示される。図３により老化に伴いＩ型コラーゲンが減少することが示される。図４によりＰＲＤＸ４陽性かつＶｉｍｅｎｔｉｎ陽性の細胞数とＩ型コラーゲンが正に相関することが示される。したがって、老化に伴う線維芽細胞によるＩ型コラーゲンの減少にはＰＲＤＸ４が関与することが示唆される。
【0033】
ＰＲＤＸ４は、コラーゲン成熟又は輸送促進効果があることが報告されているが、上記結果により線維芽細胞によるＩ型コラーゲン量に寄与することが示唆される。以上により、ユーカリ抽出物により線維芽細胞のＰＲＤＸ４発現が促進されれば、老化に伴う線維芽細胞数によるコラーゲンの減少が抑制され、ひいては皮膚のハリ改善が期待できる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】