特開 2024-132961 発毛又は育毛促進用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024132961

(43)【公開日】2024-10-01

(54)【発明の名称】発毛又は育毛促進用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/745 20150101AFI20240920BHJP

   A61P 17/14 20060101ALI20240920BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240920BHJP

   A61K 8/99 20170101ALI20240920BHJP

   A61Q 7/00 20060101ALI20240920BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20240920BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20240920BHJP

   C12Q 1/6851 20180101ALI20240920BHJP

【ＦＩ】

A61K35/745

A61P17/14

A61P43/00 111

A61K8/99

A61Q7/00

C12N1/00 T ZNA

C12N1/20 E

C12Q1/6851 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】7

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024036473

(22)【出願日】2024-03-11

(31)【優先権主張番号】P 2023061022

(32)【優先日】2023-03-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(71)【出願人】

【識別番号】000210067

【氏名又は名称】池田食研株式会社

(72)【発明者】

【氏名】荒木 俊雄

(72)【発明者】

【氏名】山田 健太

(72)【発明者】

【氏名】眞田 浩一

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4C083

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QQ06

4B063QQ20

4B063QQ52

4B063QQ53

4B063QR08

4B063QR62

4B063QR66

4B063QS25

4B063QS36

4B063QX02

4B065AA21X

4B065AC14

4B065BA22

4B065BD01

4B065CA44

4B065CA50

4C083AA031

4C083AA032

4C083CC37

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC59

4C087NA14

4C087ZA89

4C087ZC41

(57)【要約】

【課題】 本発明は、天然物由来の発毛又は育毛促進用組成物、及びＶＥＧＦ産生促進用組成物を提供する。
【解決手段】 ビフィドバクテリウム属に属する菌の破砕物に発毛又は育毛促進効果、及びＶＥＧＦ産生促進効果があることを見出し、本発明を完成した。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ビフィドバクテリウム属に属する菌の破砕物を有効成分とする、発毛又は育毛促進用組成物。

【請求項2】

ビフィドバクテリウム・ビフィダムの破砕物を有効成分とする、請求項１記載の発毛又は育毛促進用組成物。

【請求項3】

分子量が１万以上の成分である、請求項１又は２記載の発毛又は育毛促進用組成物。

【請求項4】

ビフィドバクテリウム属に属する菌の破砕物を有効成分とする、ＶＥＧＦ産生促進用組成物。

【請求項5】

ビフィドバクテリウム・ビフィダムの破砕物を有効成分とする、請求項４記載のＶＥＧＦ産生促進用組成物。

【請求項6】

分子量が１万以上の成分である、請求項４又は５記載のＶＥＧＦ産生促進用組成物。

【請求項7】

発毛又は育毛を促進するための候補株であるビフィドバクテリウム属に属する菌を選択する方法であって、
ビフィドバクテリウム属に属する菌の破砕物を毛乳頭細胞に添加し、ＶＥＧＦ発現量を測定する工程、ならびに、
ＶＥＧＦ産生促進効果を有する少なくとも一つの候補株を選択する工程を含む、ビフィドバクテリウム属に属する菌を選択する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ビフィドバクテリウム属に属する菌の破砕物を有効成分とする発毛又は育毛促進用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

壮年性脱毛症における発毛、育毛及び脱毛（抜け毛）の進行予防効果を有する有効成分として、ミノキシジルが厚生労働省で認可されている。非特許文献１には、毛髪の長さと太さは主に毛包サイクルの成長期毛包の期間の長さで決まり、成長期はＶＥＧＦ、ＦＧＦ－５Ｓ、ＩＧＦ－１、ＫＧＦ等の細胞成長因子で維持されているが、男性型脱毛症は遺伝的背景の下に男性ホルモンによって、より早期に成長期が終了する事によっておこる毛包の矮小化であり、ミノキシジルの発毛効果はｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＳＵＲ）を作動させ、１．血管平滑筋ＡＴＰ感受性Ｋチャネル開放による毛組織血流改善、２．毛乳頭細胞からのＶＥＧＦなど細胞成長因子の産生促進、３．ミトコンドリアＡＴＰ感受性Ｋチャネル開放による毛母細胞アポトーシス抑制、のいずれかを誘起し、成長期期間を延長して、矮小化毛包を改善することによると推察されることが記載されている。

【0003】

特許文献１では、発毛促進活性を示すペプチドが、ＶＥＧＦ等の発毛関連成長因子の発現を増加させることが記載されており、該ペプチドを有効成分とする発毛又は育毛促進用組成物等が開示されている。また、特許文献２では、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ クレモリス Ｈ－６１株の発酵代謝物を有効成分として含有する血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）産生促進剤が知られている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特許第６８６８７２３号公報

【特許文献2】特開２０１６－１１７６８３号公報

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】小友進、“ミノキシジルの発毛作用について”、日薬理誌（Ｆｏｌｉａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｊｐｎ．）、２００２年、第１１９巻、第３号、ｐ．１６７－１７４

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、天然物由来の発毛又は育毛促進用組成物、及びＶＥＧＦ産生促進用組成物を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

発明者らは、ビフィドバクテリウム属に属する菌の破砕物に発毛又は育毛促進効果、及びＶＥＧＦ産生促進効果があることを見出し、本発明を完成した。

【0008】

すなわち、本発明は、以下の［１］～［７］の構成からなる。
［１］ビフィドバクテリウム属に属する菌の破砕物を有効成分とする、発毛又は育毛促進用組成物。
［２］ビフィドバクテリウム・ビフィダムの破砕物を有効成分とする、［１］記載の発毛又は育毛促進用組成物。
［３］分子量が１万以上の成分である、［１］又は［２］記載の発毛又は育毛促進用組成物。
［４］ビフィドバクテリウム属に属する菌の破砕物を有効成分とする、ＶＥＧＦ産生促進用組成物。
［５］ビフィドバクテリウム・ビフィダムの破砕物を有効成分とする、［４］記載のＶＥＧＦ産生促進用組成物。
［６］分子量が１万以上の成分である、［４］又は［５］記載のＶＥＧＦ産生促進用組成物。
［７］発毛又は育毛を促進するための候補株であるビフィドバクテリウム属に属する菌を選択する方法であって、
ビフィドバクテリウム属に属する菌の破砕物を毛乳頭細胞に添加し、ＶＥＧＦ発現量を測定する工程、ならびに、
ＶＥＧＦ産生促進効果を有する少なくとも一つの候補株を選択する工程を含む、ビフィドバクテリウム属に属する菌を選択する方法。

【発明の効果】

【0009】

本発明によって、天然物由来の発毛又は育毛促進用組成物、及びＶＥＧＦ産生促進用組成物を提供できる。また、有効成分が化学合成品ではなく、食経験のある菌のため、継続した長期的な使用が望ましい発毛若しくは育毛促進用組成物、又はＶＥＧＦ産生促進用組成物として最適である。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】ビフィドバクテリウム・ビフィダムＮＢＲＣ１０００１５株の破砕物によるＶＥＧＦ産生試験の結果を示す。

【図2】ビフィドバクテリウム・ビフィダムＧ９－１株の破砕物によるＶＥＧＦ産生試験の結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本発明の組成物は、ビフィドバクテリウム属に属する菌の破砕物を有効成分とするものであり、発毛若しくは育毛促進効果、又はＶＥＧＦ産生促進効果を発揮できる、発毛若しくは育毛促進用組成物、又はＶＥＧＦ産生促進用組成物である。

【0012】

本発明に記載の破砕物とするビフィドバクテリウム属に属する菌は、前記組成物の有効成分となれば、特に限定されないが、例えば、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・ティシエリ（Ｂ．ｔｉｓｓｉｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・サイミリイシウレイ（Ｂ．ｓａｉｍｉｒｉｉｓｃｉｕｒｅｉ）等のビフィズス菌が挙げられる。破砕物は、ビフィドバクテリウム属に属する菌の菌体を破砕することで得られ、例えば、ビーズミル、超高圧噴射、超音波等の物理的破砕、酵素処理による破砕等、又はそれらの組み合わせにより菌体を破砕した破砕物を使用してもよく、破砕後、遠心により沈殿を除去し、遠心上清を回収して使用してもよい。さらに、該遠心上清を０．４５μｍ等のフィルターでろ過して回収したろ液が好ましく、分画分子量が好ましくは３，０００以上、より好ましくは５，０００以上、さらに好ましくは１０，０００以上の限外ろ過膜を用いて濃縮した、分子量が好ましくは３，０００以上、より好ましくは５，０００以上、さらに好ましくは１０，０００以上の破砕物が好ましい。該破砕物は、ドラムドライ、エアードライ、噴霧乾燥、真空乾燥若しくは凍結乾燥、又はそれらの組み合わせ等により乾燥させた粉末としてもよい。

【0013】

ビフィドバクテリウム属に属する菌の培養には、通常の培地が使用でき、炭素源、窒素源、無機物、その他ビフィドバクテリウム属に属する菌が必要とする微量栄養素等を含有するものであれば、合成培地、天然培地の何れでも使用可能である。例えば、ＭＲＳ培地、ＢＬ培地、ＥＧ培地等が例示でき、培養条件は、適宜設定できるが、嫌気的条件で液体培養するのが好ましく、培養温度は例えば２０～５０℃が例示でき、３０～４０℃が好ましく、培養時間は例えば２～７２時間が例示でき、４～４８時間が好ましく、６～３６時間がより好ましく、培地のｐＨは例えば５．０～９．０が例示でき、５．５～８．５が好ましい。

【0014】

本発明の発毛若しくは育毛促進用組成物、又はＶＥＧＦ産生促進用組成物はその有効成分が天然物由来であり、かつ、製造が容易なため、広く利用でき、各種製品に添加が可能で、液状で添加してもよく、粉末で添加してもよく、発毛若しくは育毛促進効果、又はＶＥＧＦ産生促進効果を有する飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品等を調製することができる。発毛若しくは育毛促進用組成物、又はＶＥＧＦ産生促進用組成物の投与量は、発毛若しくは育毛促進効果、又はＶＥＧＦ産生促進効果が認められる量であれば特に限定されないが、成人１日用量として、１μｇ～１ｇが好ましく、１０μｇ～０．１ｇがより好ましい。

【実施例0015】

以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の例によって限定されるものではない。尚、本発明において、％は別記がない限り全て重量％である。

【0016】

［実施例１］
（１．菌体（ビフィドバクテリウム・ビフィダム）破砕物の調製）
（１－１．ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＮＢＲＣ１０００１５株）
１０ｍＬ容ねじ口試験管に入れたＭＲＳ培地（ベクトン・ディッキンソン社）に、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＮＢＲＣ１０００１５株のグリセロールストックを１％植菌し、３７℃で９２時間静置培養した前々培養液を、２５０ｍＬ容メジュームビンに入れたＭＲＳ培地に、１％植菌し、３７℃で約７３時間振盪培養し、前培養液とした。次に、５Ｌジャーファーメンターに入れた、ポリグリセリン脂肪酸エステル（サンソフト（登録商標）Ｑ－１７Ｓ、太陽化学株式会社製）を０．０５％含む、３．２ＬのＭＲＳ培地に、前培養液を１％植菌し、二酸化炭素通気下で、ｐＨを約７．０に調整しながら、３７℃で４８時間撹拌培養した。培養終了後、菌体を遠心（１０，０００×ｇ、１５分）により集菌した後、６倍量の超純水を添加・懸濁し、遠心（１０，０００×ｇ、１５分）し、上清を除去した。この操作を３回繰り返すことで、培地成分を除去した洗浄済み菌体を回収した。

【0017】

洗浄済み菌体に超純水を添加・懸濁して調製した２５g菌体／Ｌの菌体懸濁液を２つに分けて、それぞれに２０ｍｇ／ｍＬ卵白リゾチーム溶液を終濃度０．１ｍｇ/ｍＬになるように添加し、混和した。一方の菌体懸濁液のみに、ＥＤＴＡ（株式会社同仁化学研究所製）を終濃度５ｍＭになるように添加してＥＤＴＡ（＋）とし、もう一方はＥＤＴＡ（－）とし、何れも恒温振盪培養器にて、５０℃、１３０ｒｐｍ、ロータリーで約２１時間、撹拌することで、菌体を破砕した後、遠心(１０，０００×ｇ、３０分)し、上清を回収した。回収した上清を０．４５μｍフィルターでろ過し、ろ液を回収した後、ペリコン（メルクミリポア社）の分画分子量１０，０００の限外ろ過モジュールにて、限外ろ過を行い、濃縮して得られた各サンプルをフリーズドライすることで、以下の各粉末を調製した。
・ＮＢＲＣ１０００１５株：Ｌ－Ｃｏ（菌体破砕物（ＥＤＴＡ（－））：膜濃縮品（分子量１万以上））
・ＮＢＲＣ１０００１５株：Ｅ－Ｃｏ（菌体破砕物（ＥＤＴＡ（＋））：膜濃縮品（分子量１万以上））

【0018】

（１－２．ビフィドバクテリウム・ビフィダム Ｇ９－１株）
終濃度０．０５％となるようにＬ－システイン塩酸塩一水和物（富士フイルム和光純薬株式会社）を添加したＭＲＳ培地（オクソイド社）を１０ｍＬ容ねじ口試験管に入れ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム Ｇ９－１株のグリセロールストックを５％植菌し、３７℃で２４時間静置培養した前々培養液を、２５０ｍＬ容メジュームビンに入れたＭＲＳ培地に、５％植菌し、３７℃で約２４時間静置培養し、前培養液とした。次に、２Ｌジャーファーメンターに入れた、１．４ＬのＭＲＳ培地に、前培養液を５％植菌し、二酸化炭素通気下で、ｐＨを約７．０に調整しながら、３７℃で４８時間撹拌培養した。培養終了後、菌体を遠心（１５，０００×ｇ、１５分）により集菌した後、６倍量の超純水を添加・懸濁し、遠心（１０，０００×ｇ、１５分）し、上清を除去した。この操作を３回繰り返すことで、培地成分を除去した洗浄済み菌体を回収した。

【0019】

洗浄済み菌体に超純水を添加・懸濁して調製した２５g菌体／Ｌの菌体懸濁液に、２０ｍｇ／ｍＬ卵白リゾチーム溶液を終濃度０．１ｍｇ/ｍＬになるように添加し、混和した後、恒温振盪培養器にて、５０℃、１３０ｒｐｍ、ロータリーで約２１時間、撹拌することで、菌体を破砕した後、遠心(１０，０００×ｇ、３０分)し、上清を回収した。回収した上清を０．４５μｍフィルターでろ過し、ろ液を回収した後、ペリコン（メルクミリポア社）の分画分子量１０，０００の限外ろ過モジュールにて、限外ろ過を行い、濃縮して得られたサンプルをフリーズドライすることで、以下の粉末を調製した。
・Ｇ９－１株：Ｌ－Ｃｏ（菌体破砕物（ＥＤＴＡ（－））：膜濃縮品（分子量１万以上））

【0020】

（２．ＶＥＧＦ産生試験）
ＮＢＲＣ１０００１５株由来の前記菌体破砕物：Ｌ－Ｃｏ及びＥ－Ｃｏ、並びにＧ９－１株由来の前記菌体破砕物：Ｌ－Ｃｏについて、ヒト毛乳頭細胞における血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の産生誘導能を検討することとした。ヒト毛乳頭細胞（Ｈｕｍａｎ Ｆｏｌｌｉｃｌｅ Ｄｅｒｍａｌ Ｐａｐｉｌｌａ Ｃｅｌｌｓ：ＨＦＤＰＣ）は、ドナーの側面頭皮由来の真皮から単離された初代培養細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を用いた。ＨＦＤＰＣの培養にはＦｏｌｌｉｃｌｅ Ｄｅｒｍａｌ Ｐａｐｉｌｌａ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｋｉｔ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を用いた。また、細胞のプレートからの剥離および回収には、Ｄｅｔａｃｈ Ｋｉｔ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を用いた。

【0021】

ＨＦＤＰＣは１０ｃｍ ｄｉｓｈを用いてプレート培養した。細胞がコンフルエントになる直前に、２ｍＬのＨｅｐｅｓＢＳＳ（３０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液）で細胞を洗浄し、その後、２ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加して室温で１０分間静置して、細胞を剥離した。さらに２ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えた後、ＰＢＳ緩衝液を１０ｍＬ添加し、１，５００ｒｐｍ、５分間にて遠心を行い、上清を廃棄した。細胞ペレットにＦｏｌｌｉｃｌｅ Ｄｅｒｍａｌ Ｐａｐｉｌｌａ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍを添加し、細胞をカウントして２×１０^４／ｍＬになるように新しい１０ｃｍ ｄｉｓｈに播種した。

【0022】

ＨＦＤＰＣを、１０％ＦＢＳを含むＤ－ＭＥＭ培地で１×１０^５／ｍＬに調整し、９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１００μＬ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩インキュベートした。翌日、前記菌体破砕物３種類の粉末を各々ＰＢＳ緩衝液で溶解後、０．４５μｍフィルター滅菌し、終濃度１０μｇ／ｍｌになるように各ｗｅｌｌに添加後、さらに７２時間、インキュベートした。また、菌体破砕物の代わりにＰＢＳ緩衝液のみを添加したｗｅｌｌをコントロールとした。

【0023】

細胞からＲＮＡの回収と逆転写反応には、ＳｕｐｅｒＰｒｅｐ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ＆ＲＴ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いた。インキュベートした各細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄した後、３０μＬのｌｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ及びｇＤＮＡ ｒｅｍｏｖｅｒ含有）を各ｗｅｌｌに添加し、室温で５分間静置することで、細胞を溶解した。該細胞溶解液４μＬをＰＣＲチューブに添加後、ＲＴ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘを１６μＬ加え、３７℃で１５分間、５０℃で５分間及び９８℃で５分間反応させることで逆転写反応を行った後、リアルタイムＰＣＲを行った。
リアルタイムＰＣＲによるＶＥＧＦの発現定量解析で使用するＰＣＲ試薬には、ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）を使用した。

【0024】

以下の組成にて、ＰＣＲ溶液を調製し、表１記載のプライマーを用いて、リアルタイムＰＣＲ装置であるＲｏｔｏｒ－ｇｅｎｅ Ｑ（キアゲン社製）にて増幅を行った。反応条件は、９５℃、３０秒間反応させた後、９５℃で１５秒、５７℃で３０秒の２ステップ、４０サイクルとした。また、内部標準としてβ－アクチンを用いた。各菌体破砕物を添加した試験群とコントロールとのＶＥＧＦ遺伝子の発現量を比較した。ＮＢＲＣ１０００１５株由来の各サンプルはＮ数＝４、Ｇ９－１株由来のサンプルはＮ数＝５で実験し、Ｔ検定にて、統計的解析を行った。結果を図１に示す。

【0025】

（ＰＣＲ溶液組成）
cDNA 1.0μL
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix 5.0μL
プライマーミックス（終濃度 0.4 μM） 0.4μL
滅菌水 3.6μL
トータル 10.0μL

【0026】

【表1】

【0027】

図１及び図２に示したとおり、ＮＢＲＣ１０００１５株由来及びＧ９－１株由来の何れのサンプルにおいても、コントロールと比較して、有意なＶＥＧＦ遺伝子の有意な発現の増加が認められた。これらの結果から、本発明の菌体破砕物が、ヒト毛乳頭細胞におけるＶＥＧＦ産生促進効果を有することがわかり、脱毛防止若しくは改善用、又は発毛若しくは育毛促進用として有用であると考えられる。

【図1】

【図2】

【配列表】

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