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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024133022
(43)【公開日】2024-10-01
(54)【発明の名称】大規模逆相ＨＰＬＣ精製のための新規の固定相
(51)【国際特許分類】
C01B 33/18 20060101AFI20240920BHJP
B01J 20/281 20060101ALI20240920BHJP
G01N 30/88 20060101ALI20240920BHJP
C07K 1/16 20060101ALI20240920BHJP
B01J 20/287 20060101ALI20240920BHJP
【ＦＩ】
C01B33/18 E
B01J20/281 G
G01N30/88 J
B01J20/281 X
C07K1/16
B01J20/287
【審査請求】有
【請求項の数】15
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024040625
(22)【出願日】2024-03-15
(31)【優先権主張番号】23162706
(32)【優先日】2023-03-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(71)【出願人】
【識別番号】509131443
【氏名又は名称】ヌーリオン ケミカルズ インターナショナル ベスローテン フェノーツハップ
【氏名又は名称原語表記】Ｎｏｕｒｙｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂ．Ｖ．
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100128484
【弁理士】
【氏名又は名称】井口 司
(72)【発明者】
【氏名】テレーセ レ ビン トラン
(72)【発明者】
【氏名】ベリエ シグヴァード ペルソン
(72)【発明者】
【氏名】ジョアキム エリック パトリック ホグブロム
【テーマコード（参考）】
4G072
4H045
【Ｆターム（参考）】
4G072AA25
4G072BB05
4G072DD04
4G072DD05
4G072GG01
4G072HH11
4G072HH14
4G072JJ39
4G072JJ42
4G072JJ47
4G072LL15
4G072MM23
4G072MM31
4G072QQ06
4G072RR12
4G072TT01
4G072TT08
4G072UU11
4H045AA20
4H045AA50
4H045EA20
4H045GA21
(57)【要約】 （修正有）
【課題】大規模逆相ＨＰＬＣ精製、特に、ＧＬＰ－１受容体作動薬及びＧＬＰ－２類似体などの、修飾複合ペプチドの精製のための、新規の固定相を開示する。特に、本発明は、大規模逆相ＨＰＬＣ精製のための固定相として使用され得る、シリカ粒子を提供する。
【解決手段】微細孔径が１～２５０オングストローム（Å）、粒子径が０．１μｍ～１００μｍのシリカ粒子であり、アルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、及びヘテロアルキルアリールからなる群から各々独立して選択される２つの基を含む。当該シリカ粒子は、ＧＬＰ－１作動薬又はＧＬＰ－２類似体などの、修飾複合ペプチドの精製に適する。
【選択図】なし
【解決手段】微細孔径が１～２５０オングストローム（Å）、粒子径が０．１μｍ～１００μｍのシリカ粒子であり、アルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、及びヘテロアルキルアリールからなる群から各々独立して選択される２つの基を含む。当該シリカ粒子は、ＧＬＰ－１作動薬又はＧＬＰ－２類似体などの、修飾複合ペプチドの精製に適する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
１～２５０オングストローム（Å）の微細孔径を有し、以下の一般式に従うシラン基を含むシリカ粒子であって：
式中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、アルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、及びヘテロアルキルアリールからなる群から選択され、
Ｒは、水素又はシリカであり、及び
ＳｉＯ２は、シリカである、シリカ粒子。
【化1】
Ｒは、水素又はシリカであり、及び
ＳｉＯ２は、シリカである、シリカ粒子。
【請求項2】
前記微細孔径が、５０～１５０オングストローム（Å）である、請求項１に記載のシリカ粒子。
【請求項3】
Ｒ１及びＲ２が、同一である、請求項１又は２に記載のシリカ粒子。
【請求項4】
Ｒ１及びＲ２が、アルキル、好ましくは、Ｃ２～Ｃ２０分岐又は非分岐アルキルである、請求項１～３のいずれかに記載のシリカ粒子。
【請求項5】
Ｒ１及びＲ２が、Ｃ２～Ｃ１０非分岐アルキル、好ましくは、Ｃ４～Ｃ８非分岐アルキルである、請求項１～４のいずれかに記載のシリカ粒子。
【請求項6】
前記シリカ粒子が、０．１～１００μｍ、好ましくは、１～５０μｍの平均粒子径を有する、請求項１～５のいずれかに記載のシリカ粒子。
【請求項7】
シリカ粒子を調製するための方法であって、
（ｉ）１～２５０オングストローム（Å）の微細孔径を有する、シリカ粒子を提供する工程と、及び
（ｉｉ）シリカ粒子を、次式の化合物で修飾する工程であって、
式中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、アルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、及びヘテロアルキルアリールからなる群から選択され、及び
Ｘ１及びＸ２は、各々独立して、ハロゲン又はアルコキシ基である、工程とを含む、方法を記載する。
（ｉ）１～２５０オングストローム（Å）の微細孔径を有する、シリカ粒子を提供する工程と、及び
（ｉｉ）シリカ粒子を、次式の化合物で修飾する工程であって、
【化2】
Ｘ１及びＸ２は、各々独立して、ハロゲン又はアルコキシ基である、工程とを含む、方法を記載する。
【請求項8】
前記微細孔径が、５０～１５０オングストローム（Å）である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
Ｒ１及びＲ２が、同一である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項10】
Ｒ１及びＲ２が、アルキル、好ましくは、Ｃ２～Ｃ２０分岐又は非分岐アルキル、より好ましくは、Ｃ２～Ｃ１０非分岐アルキル、更により好ましくは、Ｃ４～Ｃ８非分岐アルキルである、請求項７～９のいずれかに記載の方法。
【請求項11】
Ｘ１及びＸ２が、塩素である、請求項７～１０のいずれかに記載の方法。
【請求項12】
請求項７～１１のいずれかに記載の方法によって得られる、シリカ粒子。
【請求項13】
請求項１～６のいずれかに記載のシリカ粒子、又は請求項７～１１のいずれかに記載の方法によって得られるシリカ粒子を含む、クロマトグラフィー用の分離カラム。
【請求項14】
修飾複合ペプチド、好ましくは、ＧＬＰ－１作動薬又はＧＬＰ－２類似体を、精製するための固定相としての、請求項１～６のいずれかに記載のシリカ粒子、又は請求項７～１１のいずれかに記載の方法によって得られるシリカ粒子の使用。
【請求項15】
前記修飾複合ペプチドが、セマグルチド又はリラグルチドである、請求項１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、１～２５０オングストローム（Å）の微細孔径を有し、アルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、及びヘテロアルキルアリールからなる群から各々独立して選択される２つの基を含む、シラン基を含むシリカ粒子に関する。本発明は更に、こうしたシリカ粒子を調製する方法、並びにＧＬＰ－１作動薬又はＧＬＰ－２類似体などの、修飾複合ペプチドを精製するための固定相としての、こうしたシリカ粒子の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
逆相ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）は、所与の混合物中に含有される全ての成分を、分離、特定、及び定量化するために、一般的に使用される技術である。医薬分野では、ＨＰＬＣは、医薬、特に、修飾複合ペプチドなどの、より高い分子量を有する医薬の、必要な高グレードの精製を達成するのに特に好適である。ＨＰＬＣの基本原理は、精製される混合物が、一般的にシリカ系材料である固体吸着材料で充填されたカラム、いわゆる固定相を通して、圧力下で液体溶媒と共にポンプ注入されることである。分離される混合物の各構成要素は、通常、構成要素と、吸収材料の表面及び／又は吸収材料の細孔径との、多かれ少なかれ顕著な物理的化学的相互作用に起因して、吸着材料とわずかに異なる相互作用をする。この相互作用は、異なる構成要素に対して異なる流速を引き起こし、混合物構成要素の分離をもたらす。次いで、異なる構成要素は、カラムから流出する時、異なる画分で収集されてもよい。
【0003】
ＨＰＬＣカラムには、多くの異なる吸着材料が利用可能である。分離結果から、コスト、原材料の可用性の観点から非常に好適であることが判明しているシリカ粒子には、特に注意が払われている。これらのシリカ粒子をＨＰＬＣ使用のために最適化する際の特定の焦点は、粒子径及び粒子の細孔径にも置かれている。しかしながら、固定相における吸収材料と、分離される混合物中の任意の潜在的な構成要素との、物理的化学的相互作用を微調整するために、官能基でシリカ粒子を修飾するいくつかの取組みがなされてきた。例えば、米国特許第９，６７０，０６７ Ｂ２号は、ハロヒドリン基を含む有機基を用いた、シリカ粒子の修飾を記載している。同様に、米国特許第１０，６９０，６３６５ Ｂ２号は、Ｃ８基又はＣ１８基で修飾された、シリカ粒子を開示している。米国特許第７，５３７，７０３ Ｂ２号では、シリカ粒子は、ｎ－ブチル基で修飾されている。
【0004】
修飾複合ペプチドは、その精製に関して困難であることが見出されている。これは、その比較的高い分子量のためであり、これは、所望のペプチドを、いくらか類似した分子量の不純物ペプチドから分離するのを煩雑にすると想定される。こうした複合ペプチドの精製には、通常、２つ以上の精製工程が必要である。しかしながら、商業的観点からは、精製工程の数は、理想的には２つのみに限定され、同時に、高度に精製された複合ペプチドの、商業的に許容可能な収率を達成するべきである。医薬領域では、通常、少なくとも＞９９．５％の純度、すなわち選択性が標的とされる。したがって、固定相に好適な市販のシリカは、混合物の構成要素を、理想的には、１つの純粋な構成要素（すなわち、少なくとも＞９９．５％の純度を有する）を含有する画分のみに分離するのに好適であるべきであり、その結果、同一の高い選択性及び高い回収率、すなわち、この１つの純粋な化合物の全体的な収率が達成される。換言すれば、市販の好適なＨＰＬＣ固定相については、一部の画分が高純度の化合物を含有することでは、十分ではない場合がある。むしろ、高純度を有するこの化合物の全体的な収率も、重要な因子である。商業的に関連する全収率は、例えば、少なくとも７０％であり、好ましくは、少なくとも７５％、更により好ましくは、少なくとも８０％である。
【0005】
薬学的に関心のある、複合ペプチドの例は、例えば、ＧＬＰ－１（グルカゴン様ペプチド１）受容体作動薬、及びＧＬＰ－２（グルカゴン様ペプチド２）類似体である。これらのタイプの複合ペプチドは、肥満治療に使用される。商業的に関連するＧＬＰ－１受容体作動薬は、例えば、２型糖尿病の治療に使用される抗糖尿病薬であり、長期体重管理のための抗肥満薬である、セマグルチドである。別の商業的に関連するＧＬＰ－１受容体作動薬は、リラグルチド（Ｎ－ε－（γ－Ｇｌｕ（Ｎ－α－ヘキサデカノイル）））－Ｌｙｓ２６Ａｒｇ３４－ＧＬＰ－１（７－３７）であり、ＮＮ２２１１としても知られる。リラグルチドは、２型糖尿病の治療及び成人における肥満の治療のために承認されている。
【0006】
しかしながら、複合ペプチドを精製する際に、既に上述した概して遭遇する問題に加えて、グルカゴン様ペプチドの精製は、特に酸性ｐＨで凝集体を形成する傾向があるため、特に困難であることが見出されている。
【0007】
要約すると、ＨＰＬＣ用途、特に、高分子量分子などの医薬、例えば、ＧＬＰ－１受容体作動薬及びＧＬＰ－２類似体などの修飾複合ペプチド、特に、リラグルチド及びセマグルチドの精製のための、改善された固定相に対する必要性が依然として存在する。特に、選択性（すなわち、純度）及び回収率（すなわち、収率）に関して改善された分離性能を有し、同時に、理想的には容易にアクセス可能であり、容易に利用可能であり、かつ環境的に無害である、ＨＰＬＣ用途のための改善されたシリカ粒子に対する必要性が存在する。更に、ＧＬＰ－１受容体作動薬及びＧＬＰ－２類似体などの修飾複合ペプチドの、成功的かつ効率的な精製のために、ＨＰＬＣ用途で使用され得る、こうした改善されたシリカ粒子を調製するための方法を提供する必要性も存在する。
【0008】
したがって、本発明は、こうした改善されたシリカ粒子、及びシリカ粒子を生成するための方法を見出すことを対象とする。上記の問題は、１～２５０オングストローム（Å）の微細孔径を有し、アルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、及びヘテロアルキルアリールからなる群から各々独立して選択される２つの基を含む、シラン基を含む改善されたシリカ粒子によって解決され得ることが見出された。
【発明の概要】
【0009】
第一の態様では、本発明は、１～２５０オングストローム（Å）の微細孔径を有し、次式によるシラン基を含む、シリカ粒子を対象とし、
式中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、アルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、及びヘテロアルキルアリールからなる群から選択され、Ｒは、水素又はシリカであり、ＳｉＯ２は、シリカである。
【化1】
【0010】
第二の態様では、本発明は、シリカ粒子を調製するための方法であって、
（ｉ）１～２５０オングストローム（Å）の微細孔径を有する、シリカ粒子を提供する工程と、及び
（ｉｉ）シリカ粒子を、次式の化合物で修飾する工程であって、
式中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、アルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、及びヘテロアルキルアリールからなる群から選択され、及び、Ｘ１及びＸ２は、独立して、ハロゲン又はアルコキシ基である、工程とを含む、方法を対象とする。
（ｉ）１～２５０オングストローム（Å）の微細孔径を有する、シリカ粒子を提供する工程と、及び
（ｉｉ）シリカ粒子を、次式の化合物で修飾する工程であって、
【化2】
【0011】
本発明は更に、第一の態様によるシリカ粒子、又は第二の態様による方法によって得られたシリカ粒子を、修飾複合ペプチド、好ましくは、ＧＬＰ－１作動薬又はＧＬＰ－２類似体を、精製するための固定相として使用することを対象とする。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【発明を実施するための形態】
【0013】
第一の態様では、本発明は、大規模逆相ＨＰＬＣ精製、特に、ＧＬＰ－１受容体作動薬及びＧＬＰ－２類似体などの、修飾複合ペプチドの精製のための、新規の固定相を開示する。特に、本発明は、大規模逆相ＨＰＬＣ精製のための固定相として使用され得る、シリカ粒子を提供する。
【0014】
本発明による新規の固定相は、１～２５０オングストローム（Å）の微細孔径を有し、次式によるシラン基を含む、シリカ粒子を含む：
式中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、アルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、及びヘテロアルキルアリールからなる群から選択され、Ｒは、水素又はシリカであり、ＳｉＯ２は、シリカである。
【化3】
【0015】
驚くべきことに、このような修飾シリカ粒子は、ＨＰＬＣ用途の固定相に使用可能であり、特に、修飾複合ペプチド、例えば、ＧＬＰ－１受容体作動薬及びＧＬＰ－２類似体、特に、リラグルチド及びセマグルチドなどの、修飾複合ペプチドについて、改善された分離特性を達成できることが見出された。これらの新規な修飾シリカ粒子がＨＰＬＣ用途の固定相にあることで、リラグルチド及びセマグルチドなどの粗活性医薬成分中の特定の困難な不純物は、例えば、アルカリ条件下で、第一のクロマトグラフ工程で、既に首尾よく除去されてもよい。これによって、サイクル当たり及び１時間当たり、既により精製された活性医薬成分を、第二のクロマトグラフ工程に送達することができ、これは次いで、第二のＨＰＬＣ精製工程において、既に＞９９．５％の医薬産業の純度要求、及び＜０．１％の単一不純物量を、同時に、商業的に許容可能な全収率で満たす可能性を増加させる。換言すれば、本発明の修飾シリカ粒子は、選択性並びに回収性を著しく増加させ、全体的に、有意に改善された分離生産性をもたらす。
【0016】
上記の式Ｉでは、残りのＲ１及びＲ２は、各々独立して、アルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、及びヘテロアルキルアリールからなる群から選択される。
【0017】
「アルキル」という用語は、１～３０個（例えば、１～２０個、又は１～４個）の炭素原子を有する、直鎖状、分岐鎖状、及び／又は環状（「シクロアルキル」）炭化水素を指す。１～４個の炭素を有するアルキル部分は、「低級アルキル」と呼ばれる。アルキル部分の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、４，４－ジメチルペンチル、オクチル、２，２，４－トリメチルペンチル、ノニル、デシル、ウンデシル、及びドデシルが挙げられる。シクロアルキル部分としては、単環式又は多環式であってもよく、例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、及びアダマンチルが挙げられる。アルキル部分の追加の例としては、直鎖状、分岐鎖状、及び／又は環状部分（例えば、１－エチル－４－メチル－シクロヘキシル）が挙げられる。本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、飽和炭化水素及び不飽和炭化水素、好ましくは、飽和炭化水素を含む。
【0018】
「アリール」という用語は、炭素原子及び水素原子から構成される、芳香族環、又は芳香族若しくは部分的芳香族環系を指す。アリール部分は、共に結合又は融合された、複数の環を含んでもよい。アリール部分の例としては、アントラセニル、アズレニル、ビフェニル、フルオレニル、インダン、インデニル、ナフチル、フェナントレニル、フェニル、１，２，３，４－テトラヒドロ－ナフタレン、及びトリルが挙げられる。
【0019】
「アルキルアリール」という用語は、少なくとも１つのアルキル基及び少なくとも１つのアリール基を含む部分、例えば、アリール部分に結合されたアルキル部分を指し、ここで、「アルキル」及び「アリール」という用語は、上記に定義した通りである。
【0020】
「ヘテロアルキル」という用語は、窒素、酸素、リン、硫黄、及び／又はホウ素原子などの、少なくとも１つのヘテロ原子も含有するアルキル基を指し、ここで、「アルキル」という用語は、上記に定義した通りである。
【0021】
「ヘテロアリール」という用語は、窒素、酸素、リン、硫黄、及び／又はホウ素原子などの、少なくとも１つのヘテロ原子も含有するアリール基を指し、ここで、「アリール」という用語は、上記に定義した通りである。例えば、「ヘテロアリール」という用語は、好ましくは、その炭素原子の少なくとも１つが、窒素、酸素、又は硫黄で置換された、アリール基を指す。ヘテロアリール部分の例としては、アクリジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾキナゾリニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、フリル、イミダゾリル、インドリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、フタラジニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリミジル、ピロリル、キナゾリニル、キノリニル、テトラゾリル、チアゾリル、及びトリアジニルが挙げられる。
【0022】
「ヘテロアルキルアリール」という用語は、少なくとも１つのアルキル基、少なくとも１つのアリール基、及び窒素、酸素、リン、硫黄、及び／又はホウ素原子などの、少なくとも１つのヘテロ原子を含む部分を指し、ここで、「アルキル」及び「アリール」という用語は、上記に定義した通りである。
【0023】
上記の基、アルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、及びヘテロアルキルアリールのいずれもが、非置換であってもよく、又は更に置換されてもよい。
【0024】
「置換」という用語は、 化学構造又は部分を記載するために使用される場合、その構造又は部分の誘導体を指し、その水素原子の１つ以上が、原子、化学的部分、又は官能性部分、例えば、以下に限定されないが、アルコール、アルデヒルデ、アルコキシ、アルカノイルオキシ、アルコキシカルボニル、アルケニル、アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ｔ－ブチル）、アルキニル、アルキルカルボニルオキシ（－ＯＣ（Ｏ）アルキル）、アミド（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－アルキル－、又は－アルキル－ＮＨＣ（Ｏ）アルキル）、アミジニル（－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ－アルキル、又は－Ｃ（ＮＲ）ＮＨ２）、アミン（一級、二級、及び三級、例えば、アルキルアミノ、アリールアミノ、アリールアルキルアミノ）、アロイル、アリール、アリールオキシ、アゾ、カルバモイル（－ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ－アルキル－、又は－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ－アルキル）、カルバミル（例えば、ＣＯＮＨ２、並びにＣＯＮＨ－アルキル、ＣＯＮＨ－アリール、及びＣＯＮＨ－アリールアルキル）、カルボニル、カルボキシル、カルボン酸、カルボン酸無水物、カルボン酸塩化物、シアノ、エステル、エポキシド、エーテル（例えば、メトキシ、 エトキシ）、グアニジノ、ハロ、ハロアルキル（例えば、－ＣＣｌ３、－ＣＦ３、－Ｃ（ＣＦ３）３）、ヘテロアルキル、ヘミアセタール、イミン（一級、及び二級）、ケトン、ニトリル、ニトロ、酸素（すなわち、オキソ部分を提供する）、ホスホジエステル、硫化物、スルホンアミド（例えば、ＳＯ２ＮＨ２）、スルホン、スルホニル（アルキルスルホニル、アリールスルホニル、及びアリールアルキルスルホニルを含む）、スルホキシド、チオール（例えば、スルフヒドリル、 チオエーテル）、及び尿素（－ＮＨＣＯＮＨ－アルキル－）で置換される。
【0025】
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、両方とも独立して、２～２０個の炭素原子を含む。
【0026】
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、好ましくは、両方とも独立して、アルキル及びヘテロアルキルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、両方とも独立して、アルキルであり、例えば、Ｃ２～Ｃ２０分岐又は非分岐アルキル、好ましくは、Ｃ２～Ｃ１０－分岐又は非分岐アルキル、例えば、Ｃ３～Ｃ１０－分岐若しくは非分岐アルキル、又はＣ３～Ｃ８－分岐若しくは非分岐アルキル、及び、更により好ましくは、Ｃ４～Ｃ８－分岐又は非分岐アルキル、例えば、Ｃ４－分岐アルキル又は非分岐アルキル、Ｃ５－分岐又は非分岐アルキル、Ｃ６－分岐又は非分岐アルキル、Ｃ７－分岐又は非分岐アルキル、又はＣ８－分岐若しくは非分岐アルキル、又は、例えば、Ｃ４～Ｃ６－分岐又は非分岐アルキルである。特に好ましくは、非分岐アルキルであり、例えば、Ｃ２～Ｃ２０－非分岐アルキル、Ｃ２～Ｃ１０－非分岐アルキル、Ｃ３～Ｃ１０－非分岐アルキル、Ｃ３～Ｃ８－非分岐アルキル、又は、更に、Ｃ４～Ｃ８－非分岐アルキル、例えば、Ｃ４－非分岐アルキル、Ｃ５－非分岐アルキル、Ｃ６－非分岐アルキル、Ｃ７－非分岐アルキル、若しくはＣ８－非分岐アルキル、又は、例えば、Ｃ４～Ｃ６－非分岐アルキルである。特に好ましい実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、両方とも独立して、Ｃ４－、Ｃ６－、及び／又はＣ８－分岐若しくは非分岐アルキルであり、更により好ましくは、Ｃ４－、Ｃ６－、及び／又はＣ８－非分岐アルキルである。別の好ましい実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、両方とも同一である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、両方とも、Ｃ４－、Ｃ６－、又はＣ８－分岐若しくは非分岐アルキル、例えば、Ｃ４－又はＣ８－分岐若しくは非分岐アルキルであり、及び更により好ましくは、Ｃ４－、Ｃ６－、又はＣ８－非分岐アルキル、例えば、Ｃ４－又はＣ８－非分岐アルキルである。
【0027】
上記の式Ｉの「ＳｉＯ２」は、シリカを意味する。これは、式Ｉのシラン基が、Ｏ－Ｓｉ結合を介して、シリカ構造、すなわち、シリカ粒子に結合していることを意味する。
【0028】
シリカ又はシリカの粒子は、例えば、沈降シリカ、マイクロシリカ（シリカヒューム）、焼成シリカ（フュームドシリカ）、シリカゾル又はシリカゲル、及びそれらの混合物に由来してもよい。シリカの粒子は、多孔質粒子の形態であってもよい。
【0029】
好適には、シリカの粒子は、２０～１５００、好ましくは、５０～９００、最も好ましくは、７０～８００ｍ２／ｇの比表面積を有する。比表面積は、Ｓｅａｒｓ ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８（１９５６）， １２， １９８１－１９８３、及び米国特許第 第５，１７６，８９１号に記載されている、水酸化ナトリウムによる滴定によって、測定されてもよい。したがって、所与の面積は、粒子の平均比表面積を表す。
【0030】
上記の式の残りのＲは、水素又はシリカのいずれかである。「シリカ」は、この文脈において、式Ｉのシラン基が、更なるＯ－Ｓｉ結合を介して、シリカ又はシリカ粒子に結合していることを意味する。
【0031】
本発明のシリカ粒子は、１～２５０オングストローム（Å）の微細孔径、例えば、１０～２００Å、又は５０～２５０Å、又は６０～２００Å、又は、更に７０～１８０Åなどを有する。特に好ましくは、８０～１５０Åの微細孔径、例えば、１００～１３０Å、特に、約１００Å、又は約１２０Åの微細孔径である。２５０Åを超える微細孔径は、ＨＰＬＣカラム内のシリカ粒子の全体的な分離生産性を著しく損ない、すなわち、精製された構成要素の全体的な収率が低い傾向があることが見出された。本明細書で使用される微細孔径への全ての言及は、平均微細孔径を指す。シリカ粒子の微細孔径を決定するための方法は、当業者に一般的に知られており、例えば、Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ社製の装置、ＴｒｉＳｔａｒ ＩＩ Ｐｌｕｓを使用することによる、例えば、ブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）法を含む。
【0032】
本発明のシリカ粒子の粒子径は、特に限定されない。例えば、本発明のシリカ粒子は、０．１～１００μｍ、好ましくは、１～５０μｍの平均粒子径を有してもよい。いくつかの実施形態では、それは更に、１．８～２５μｍの範囲の平均粒子径を有してもよい。シリカ粒子の平均粒子径を決定するための方法は、当業者に一般的に知られている。例えば、粒子径は、比表面積、及びｌｌｅｒにおける粒子径に関連する式から計算されてもよい（Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｓｉｌｉｃａ， Ｗｉｌｅｙ， １９７９）。シリカ化学において従来的なように、粒子径は一次粒子の平均径を指す。粒子径はまた、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製のＭｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ４ｅ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒにおける、コールター原理を介して測定されてもよい。
【0033】
修飾シリカの粒子の細孔容積は、好適には、０．１～４ｍｌ／ｇ、好ましくは、０．２～２ｍｌ／ｇ、最も好ましくは、０．３～１．２ｍｌ／ｇである。
【0034】
修飾シリカ含有粒子の比表面積（ＢＥＴ法）は、好適には、１～１０００ｍ２／ｇ、好ましくは、２５～７００ｍ２／ｇ、最も好ましくは、５０～５００ｍ２／ｇである。
【0035】
表面積、細孔容量、及び平均微細孔径（表面積 及び細孔容量から）を測定する好適な方法は、これも窒素吸着／脱着に基づく、ブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）法によるものであり、表面積は、典型的には、等温線の直線部分から計算される。こうした方法の例は、ＩＳＯ９２７７：２０１０（ＢＥＴの場合）、及びＩＳＯ１５９０１－２：２００６（ガス吸着／脱着の場合）に提供されている。好ましくは、表面積、細孔容量、及び平均微細孔径は、ＩＳＯ９２７７：２０１０を使用して測定される。
【0036】
別の態様では、本発明は、シリカ粒子を調製するための方法であって、
（ｉ）１～２５０オングストローム（Å）の微細孔径を有する、シリカ粒子を提供する工程と、及び
（ｉｉ）シリカ粒子を、次式の化合物で修飾する工程であって、
式中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、アルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、及びヘテロアルキルアリールからなる群から選択され、及び
Ｘ１及びＸ２は、各々独立して、ハロゲン又はアルコキシ基である、工程とを含む、方法を記載する。
（ｉ）１～２５０オングストローム（Å）の微細孔径を有する、シリカ粒子を提供する工程と、及び
（ｉｉ）シリカ粒子を、次式の化合物で修飾する工程であって、
【化4】
Ｘ１及びＸ２は、各々独立して、ハロゲン又はアルコキシ基である、工程とを含む、方法を記載する。
【0037】
この方法では、上述の本発明の第一の態様による、シリカ粒子を得ることが可能である。したがって、本発明はまた、本発明のこの態様による上述の方法によって得られる、シリカ粒子を対象とする。
【0038】
本発明の第二の態様による方法の工程（ｉ）で提供されるシリカ粒子は、上述の通りでもよく、本発明の第一の態様の文脈で上述したものと同一の、好ましい微細孔径を有してもよい。
【0039】
シリカ粒子を修飾するために、本発明の第二の態様による方法の工程（ｉ）ｉで使用される、式ＩＩに記載の化合物は、アルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、及びヘテロアルキルアリールからなる群から各々独立して選択される、２つの基Ｒ１及びＲ２、並びにハロゲン又はアルコキシ基である、２つの更なる基Ｘ１及びＸ２を含む、シランである。
【0040】
基Ｒ１及びＲ２は、本発明の第一の態様の文脈において上述したものと、同一であってもよい。
【0041】
基Ｘ１及びＸ２は、各々独立して、ハロゲン又はアルコキシ基、好ましくは、ハロゲンである。
【0042】
ハロゲンには、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素が含まれ、塩素が特に好ましい。
【0043】
「アルコキシ基」という用語は、－Ｏ－アルキル部分を指し、アルキル基は、本発明の第一の態様の文脈において上記に定義した通りであってもよい。好ましくは、アルキル部分が、１～４個の炭素原子など、１～８個の炭素原子を有する、アルコキシ基が好ましい。アルコキシ部分の例としては、－ＯＣＨ３、－ＯＣＨ２ＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）３ＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）４ＣＨ３、及び－Ｏ（ＣＨ２）５ＣＨ３が挙げられる。
【0044】
このように修飾反応は、当業者に既知であり、必要に応じて調整されてもよい。例えば、式ＩＩの化合物とシリカ粒子との反応は、反応を実施するのに好適な温度、好ましくは、４０～１８０、より好ましくは、６０～１６０、最も好ましくは、８０～１４０℃で実施される。
【0045】
好ましくは、式ＩＩの化合物は、好適な量の式ＩＩの化合物が添加されるまで、攪拌下で、制御された速度で、シリカ粒子に添加されてもよい。反応時間は、１～２４時間であってもよい。
【0046】
式ＩＩの化合物とシリカ粒子との反応は、有機溶媒中で、好ましくは、撹拌下で行われてもよい。こうした有機溶媒は、好ましくは、非プロトン性溶媒である。こうした非プロトン性溶媒の例としては、アセトニトリル、アセトン、キシレン、又はトルエン、好ましくは、トルエン、又はそれらの混合物であってもよい。
【0047】
シリカ粒子は溶媒に添加されてもよく、その後、存在する任意の水を蒸発させる、任意選択的な工程が続く。次いで、式ＩＩの化合物を溶媒に添加し、その後、それを、シリカ粒子及び溶媒の分散液に添加してもよい。
【0048】
式ＩＩの化合物の比率は、シリカ表面の粒子１ｍ２当たり、４～８μモルであってもよい。溶媒の量は、好ましくは、分散液中のシリカ粒子の量が、５～２０重量％となるように選択される。
【0049】
シリカ粒子上のシラノール表面部分は、式ＩＩの化合物と反応して、シリカと式ＩＩの化合物との間に共有結合を形成する。
【0050】
修飾シリカ粒子の分散液が形成された時、分散液は、例えば、限外濾過によって、又は例えば、トルエン、エタノール、若しくはギ酸を使用することにより洗浄することによって、冷却及び精製されてもよい。次いで、分散液は、例えば、４０～１００℃で、好ましくは、６０～９０℃で、２～３０時間、好ましくは、１０～２５時間乾燥されてもよい。
【0051】
なお更なる態様によれば、本発明は、本発明のシリカ粒子、すなわち、本発明の第一の態様によるシリカ粒子、又は本発明の第二の態様による方法によって得られるシリカ粒子を含む、クロマトグラフィーのための分離カラムに関する。この態様では、本発明のシリカ粒子は、分離カラムに充填されている。したがって、この態様では、本発明のシリカ粒子は、クロマトグラフィーの固定相に使用される。したがって、シリカ粒子は、ＨＰＬＣ、超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）、及び移動床（ＳＭＢ）のシミュレーションなどの、任意のタイプのクロマトグラフィー分離方法のための、分離カラムで使用されてもよい。
【0052】
なお更なる態様によれば、本発明は、本発明の第一の態様によるシリカ粒子、又は本発明の第二の態様による方法によって得られたシリカ粒子を、修飾複合ペプチド、好ましくは、ＧＬＰ－１作動薬又はＧＬＰ－２類似体を、精製するための固定相として使用することに関する。本発明の第一の態様によるシリカ粒子、又は本発明の第二の態様による方法によって得られたシリカ粒子は、セマグルチド又はリラグルチドを精製するための固定相として使用されることが、特に好ましい。
【実施例0053】
実施例１：修飾シリカ粒子の調製
以下の市販のＫｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）粒子（Ｎｏｕｒｙｏｎ Ｂ．Ｖ．社製）を出発材料として使用して、異なる修飾シリカ粒子を調製した。
以下の市販のＫｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）粒子（Ｎｏｕｒｙｏｎ Ｂ．Ｖ．社製）を出発材料として使用して、異なる修飾シリカ粒子を調製した。
【0054】
平均粒子径５μｍ、平均細孔径１００Å、比表面積３１５ｍ２／ｇを有する、シリカ粒子（Ｎｏｕｒｙｏｎ Ｂ．Ｖ．社製、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）ＫＲ－１００－５ ＳＩＬ）。
【0055】
平均粒子径１０μｍ、平均細孔径１００Å、比表面積３２０ｍ２／ｇを有する、シリカ粒子（Ｎｏｕｒｙｏｎ Ｂ．Ｖ．社製、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）ＫＲ－１００－１０ ＳＩＬ）。
【0056】
平均粒子径５μｍ、平均細孔径２００Å、比表面積１９５ｍ２／ｇを有する、シリカ粒子（Ｎｏｕｒｙｏｎ Ｂ．Ｖ．社製、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）ＫＲ－２００－５ ＳＩＬ）。
【0057】
平均粒子径１０μｍ、平均細孔径３００Å、比表面積１０５ｍ２／ｇを有する、シリカ粒子（Ｎｏｕｒｙｏｎ Ｂ．Ｖ．社製、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）ＫＲ－３００－１０ ＳＩＬ）。
【0058】
実施例１ａ）
２０ｇのＫＲ－１００－５ ＳＩＬ、及び１０．３ｇのイミダゾールを、１７５ｇのトルエンに添加した。得られた分散液を加熱して、２０ｇのトルエンを蒸発させた。加熱後、分散液を８０℃に冷却した。８ｇのジブチルジクロロシランを、撹拌下で、トルエン、シリカ、及びイミダゾールの分散液に添加した。温度を上昇させ、分散液を一晩還流させた。反応物を７０℃に冷却し、３２ｇのエタノールを添加して、シランを不活性化した。分散液を、８７ｇのトルエン、及び２×７９ｇのエタノールで洗浄した。シリカを、実験室オーブン内で、９０℃で一晩乾燥させた。得られた粉末は白色であり、本明細書では、更に、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－５－ｄｉＣ４と呼ばれる。炭素の元素分析により、８．３重量％のＣを得た。
２０ｇのＫＲ－１００－５ ＳＩＬ、及び１０．３ｇのイミダゾールを、１７５ｇのトルエンに添加した。得られた分散液を加熱して、２０ｇのトルエンを蒸発させた。加熱後、分散液を８０℃に冷却した。８ｇのジブチルジクロロシランを、撹拌下で、トルエン、シリカ、及びイミダゾールの分散液に添加した。温度を上昇させ、分散液を一晩還流させた。反応物を７０℃に冷却し、３２ｇのエタノールを添加して、シランを不活性化した。分散液を、８７ｇのトルエン、及び２×７９ｇのエタノールで洗浄した。シリカを、実験室オーブン内で、９０℃で一晩乾燥させた。得られた粉末は白色であり、本明細書では、更に、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－５－ｄｉＣ４と呼ばれる。炭素の元素分析により、８．３重量％のＣを得た。
【0059】
実施例１ｂ）
ＫＲ－１００－１０ ＳＩＬを、ＫＲ－１００－５ ＳＩＬについて実施例１ａ）で上述した同一の方法で、ジブチルジクロロシランで修飾した。得られた粉末は白色であり、本明細書では、更に、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－１０－ｄｉＣ４と呼ばれる。炭素の元素分析により、８．４重量％のＣを得た。
ＫＲ－１００－１０ ＳＩＬを、ＫＲ－１００－５ ＳＩＬについて実施例１ａ）で上述した同一の方法で、ジブチルジクロロシランで修飾した。得られた粉末は白色であり、本明細書では、更に、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－１０－ｄｉＣ４と呼ばれる。炭素の元素分析により、８．４重量％のＣを得た。
【0060】
実施例１ｃ）
ＫＲ－１００－１０ ＳＩＬを、５．７ｇのブチルジメチルクロロシラン及び４．１ｇのトリメチルクロロシランを、ジブチルジクロロシランの代わりに、表面修飾として添加したことを除いて、実施例１ａ）で上述した同一の方法で修飾した。得られた粉末は白色であり、本明細書では、更に、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－１０－Ｃ４と呼ばれる。炭素の元素分析により、７．７重量％のＣを得た。
ＫＲ－１００－１０ ＳＩＬを、５．７ｇのブチルジメチルクロロシラン及び４．１ｇのトリメチルクロロシランを、ジブチルジクロロシランの代わりに、表面修飾として添加したことを除いて、実施例１ａ）で上述した同一の方法で修飾した。得られた粉末は白色であり、本明細書では、更に、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－１０－Ｃ４と呼ばれる。炭素の元素分析により、７．７重量％のＣを得た。
【0061】
実施例１ｄ）
ＫＲ－２００－５ ＳＩＬを、ＫＲ－１００－５ ＳＩＬについて実施例１ａ）で上述した同一の方法で、５．０ｇのジブチルジクロロシランで修飾した。得られた粉末は白色であり、本明細書では、更に、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）２００－５－ｄｉＣ４と呼ばれる。炭素の元素分析により、５．２重量％のＣを得た。
ＫＲ－２００－５ ＳＩＬを、ＫＲ－１００－５ ＳＩＬについて実施例１ａ）で上述した同一の方法で、５．０ｇのジブチルジクロロシランで修飾した。得られた粉末は白色であり、本明細書では、更に、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）２００－５－ｄｉＣ４と呼ばれる。炭素の元素分析により、５．２重量％のＣを得た。
【0062】
実施例１ｅ）
ＫＲ－１００－５ ＳＩＬを、１２．４ｇのジオクチルジクロロシランを、ジブチルジクロロシランの代わりに使用したことを除いて、実施例１ａ）で上述した同一の方法で修飾した。得られた粉末は白色であり、本明細書では、更に、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－５－ｄｉＣ８と呼ばれる。炭素の元素分析により、１４．８重量％のＣを得た。
ＫＲ－１００－５ ＳＩＬを、１２．４ｇのジオクチルジクロロシランを、ジブチルジクロロシランの代わりに使用したことを除いて、実施例１ａ）で上述した同一の方法で修飾した。得られた粉末は白色であり、本明細書では、更に、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－５－ｄｉＣ８と呼ばれる。炭素の元素分析により、１４．８重量％のＣを得た。
【0063】
実施例１ｆ）
ＫＲ－１００－５ ＳＩＬを、１０．２ｇのジヘキシルジクロロシランを、ジブチルジクロロシランの代わりに使用したことを除いて、実施例１ａ）で上述した同一の方法で修飾した。得られた粉末は白色であり、本明細書では、更に、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－５－ｄｉＣ６と呼ばれる。炭素の元素分析により、１１．９重量％のＣを得た。
ＫＲ－１００－５ ＳＩＬを、１０．２ｇのジヘキシルジクロロシランを、ジブチルジクロロシランの代わりに使用したことを除いて、実施例１ａ）で上述した同一の方法で修飾した。得られた粉末は白色であり、本明細書では、更に、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－５－ｄｉＣ６と呼ばれる。炭素の元素分析により、１１．９重量％のＣを得た。
【0064】
実施例１ｇ）
ＫＲ－３００－１０ ＳＩＬを、ＫＲ－１００－５ ＳＩＬについて実施例１ａ）で上述した同一の方法で、２．７ｇのジブチルジクロロシランで修飾した。得られた粉末は白色であり、本明細書では、更に、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）３００－１０－ｄｉＣ４と呼ばれる。炭素の元素分析により、３．１重量％のＣを得た。
ＫＲ－３００－１０ ＳＩＬを、ＫＲ－１００－５ ＳＩＬについて実施例１ａ）で上述した同一の方法で、２．７ｇのジブチルジクロロシランで修飾した。得られた粉末は白色であり、本明細書では、更に、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）３００－１０－ｄｉＣ４と呼ばれる。炭素の元素分析により、３．１重量％のＣを得た。
【0065】
実施例２：リラグルチドの二段階精製
以下の全ての実施例では、精製される試料は、５．０ｍｇｍＬ－１の粗リラグルチド（純度≦１０％）を含有する混合物であり、これは、８０ｍｇの粗リラグルチドを、１６ｍＬのＮＨ４ＨＣＯ３緩衝液（０．１ｍｏｌＬ－１、ｐＨ７．０）／アセトニトリル（９５：５）中に溶解することによって調製し、０．４５μｍのシリンジフィルターを通して濾過し、カラム内に直接注入した。
以下の全ての実施例では、精製される試料は、５．０ｍｇｍＬ－１の粗リラグルチド（純度≦１０％）を含有する混合物であり、これは、８０ｍｇの粗リラグルチドを、１６ｍＬのＮＨ４ＨＣＯ３緩衝液（０．１ｍｏｌＬ－１、ｐＨ７．０）／アセトニトリル（９５：５）中に溶解することによって調製し、０．４５μｍのシリンジフィルターを通して濾過し、カラム内に直接注入した。
【0066】
実施例２ａ）：Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－１０－ｄｉＣ４上の、リラグルチドの二段階精製
第一の精製工程を、炭酸水素アンモニウムを用いてｐＨ７で実施し、第二の精製を、ｐＨ８で酢酸アンモニウムを緩衝液として実施し、両方の系で、アセトニトリルを有機修飾剤として使用した。精製は、自動分取装置を備えた、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０システム上で実施された。両方の精製工程を、実施例１ｂ）からの、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－１０－ｄｉＣ４を充填した、４．６×２５０ｍｍカラム上で行った。
第一の精製工程を、炭酸水素アンモニウムを用いてｐＨ７で実施し、第二の精製を、ｐＨ８で酢酸アンモニウムを緩衝液として実施し、両方の系で、アセトニトリルを有機修飾剤として使用した。精製は、自動分取装置を備えた、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０システム上で実施された。両方の精製工程を、実施例１ｂ）からの、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－１０－ｄｉＣ４を充填した、４．６×２５０ｍｍカラム上で行った。
【0067】
第一の精製工程：粗リラグルチド試料（純度≦１０％）を、カラム（３２ｍｇ／ｇの固定相）上に装填し、移動相は、０．１Ｍの炭酸水素アンモニウム（ｐＨ７）及びアセトニトリルからなる。精製を、以下の配列に従って、勾配溶出下で実施した。５％アセトニトリルを、５分間、５分～１３８分の間に装填する工程で、アセトニトリル濃度を、２９．４％～３９．８％に直線的に増加させた。１２８分後、アセトニトリル濃度を、８０％に、１１分間増加させて、強く吸着した成分を溶出し、カラムを洗浄した後、アセトニトリル濃度を５％に減少させて、カラムを平衡化した。リラグルチドを、１０５分～１１５分の間に収集し、プールした画分は、９７．１％の純度を示し、８１％の回収率を示した。得られたクロマトグラムを、図１ａに示す。
【0068】
第二の精製工程：第一の精製からのプールした画分を、約１０％アセトニトリルに希釈し、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－１０－ｄｉＣ４を含有するカラムに装填し、移動相は、０．１Ｍの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ８）及び有機修飾剤としてのアセトニトリルからなる。精製を勾配溶出下で実施し、以下の配列Ａに従って、５％アセトニトリルを、５分間、５分～９５分の間に装填する工程で、アセトニトリル濃度を、３０．５％～４１．３％に直線的に増加させた。９５分後、アセトニトリル濃度を、８０％に、１１分間で増加させて、強く吸着した成分を溶出し、カラムを洗浄した後、アセトニトリル濃度を５％に減少させて、カラムを平衡化した。リラグルチドを、７９分～８６分の間に収集し、プールした画分は、≧９９．５％の純度を示し、９８．２％の回収率を示した。したがって、両方の精製工程にわたる総回収率は、７９．６％であった。得られたクロマトグラムを、図１ｂに示す。
【0069】
実施例２ｂ）：Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－５－ｄｉＣ８上の、リラグルチドの二段階精製
第一の精製工程を、炭酸アンモニウムを用いてｐＨ７で実施し、第二の精製を、ｐＨ８で酢酸アンモニウムを緩衝液として実施し、両方の系で、アセトニトリルを有機修飾剤として使用した。精製は、自動分取装置を備えた、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０システム上で実施された。両方の精製工程を、上記実施例１ｅ）からの、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－５－ｄｉＣ８を充填した、４．６×１５０ｍｍカラム上で行った。
第一の精製工程を、炭酸アンモニウムを用いてｐＨ７で実施し、第二の精製を、ｐＨ８で酢酸アンモニウムを緩衝液として実施し、両方の系で、アセトニトリルを有機修飾剤として使用した。精製は、自動分取装置を備えた、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０システム上で実施された。両方の精製工程を、上記実施例１ｅ）からの、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－５－ｄｉＣ８を充填した、４．６×１５０ｍｍカラム上で行った。
【0070】
第一の精製工程：粗リラグルチド試料（純度≦１０％）を、カラム（１２ｍｇ／ｇの固定相）上に装填し、移動相は、０．１Ｍの炭酸水素アンモニウム（ｐＨ７）及びアセトニトリルからなる。精製を、以下の配列に従って、勾配溶出下で実施した。５％アセトニトリルを、５分間、５分～４５分の間に装填する工程で、アセトニトリル濃度を、２９．８％～４０．２％に直線的に増加させた。４５分後、アセトニトリル濃度を、７０％に、１１分間で増加させて、強く吸着した成分を溶出し、カラムを洗浄した後、アセトニトリル濃度を５％に減少させて、カラムを平衡化した。リラグルチドを、３７分～４０分の間に収集し、プールした画分は、９６．４％の純度を示し、９６％の回収率を示した。得られたクロマトグラムを、図２ａに示す。
【0071】
第二の精製工程：第一の精製からのプールした画分を、約１０％のアセトニトリルに希釈し、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－５－ｄｉＣ８を含有するカラムに装填し、移動相は、０．１Ｍの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ８）及び有機修飾剤としてのアセトニトリルからなる。精製を、以下の配列に従って、勾配溶出下で実施した。５％アセトニトリルを、５分間、５分～４５分の間に装填する工程で、アセトニトリル濃度を、２９．８％～４０．２％に直線的に増加させた。４５分後、アセトニトリル濃度を、７０％に、１１分間で増加させて、強く吸着した成分を溶出し、カラムを洗浄した後、アセトニトリル濃度を５％に減少させて、カラムを平衡化した。リラグルチドを、４３分～４５分の間に収集し、プールした画分は、９９．６％の純度を示し、両方の精製工程にわたって、７９％の総回収率であった。得られたクロマトグラムを、図２ｂに示す。得られたクロマトグラムを、図２ｂに示す。
【0072】
実施例２ｃ）：Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－１０－Ｃ４上の、リラグルチドの二段階精製（比較例）
上記の実施例１ｃ）からの、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－１０－Ｃ４上の、リラグルチド試料の二段階精製を、同一溶媒勾配及び装置パラメータを使用して、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－１０－ｄｉＣ４上の、リラグルチドの二段階精製のために、実施例２ａ）で上述した同一の方法で実施した。
上記の実施例１ｃ）からの、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－１０－Ｃ４上の、リラグルチド試料の二段階精製を、同一溶媒勾配及び装置パラメータを使用して、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－１０－ｄｉＣ４上の、リラグルチドの二段階精製のために、実施例２ａ）で上述した同一の方法で実施した。
【0073】
第一の精製工程では、画分を、１００～１２５分の間、毎分収集した。画分番号１２～１７を、第二の精製工程のために共にプールした。プールされた画分は、９６．５％の純度を示し、回収率は８７．４％であった。
【0074】
第二の精製工程では、画分を３０秒毎に、７７～８７分の間に収集した。プールされた画分番号１２～１６は、９９．５％の純度を示し、回収率は６５．６％であった。したがって、両方の精製工程にわたる総回収率は、わずか５７．３％であった。これは、例えば、７９．６％の総回収率が達成された、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－１０－ｄｉＣ４（上記実施例２ａ）を参照）を使用することによって達成される総回収率よりもかなり低い。
【0075】
実施例２ｄ）：Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）３００－１０－ｄｉＣ４上の、リラグルチドの二段階精製（比較例）
上記の実施例１ｇ）からの、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）３００－１０－ｄｉＣ４上の、リラグルチド試料の二段階精製を、同一溶媒勾配及び装置パラメータを使用して、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－１０－ｄｉＣ４上の、リラグルチドの二段階精製のために、実施例２ａ）で上述した同一の方法で行った。
上記の実施例１ｇ）からの、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）３００－１０－ｄｉＣ４上の、リラグルチド試料の二段階精製を、同一溶媒勾配及び装置パラメータを使用して、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－１０－ｄｉＣ４上の、リラグルチドの二段階精製のために、実施例２ａ）で上述した同一の方法で行った。
【0076】
第一の精製工程では、画分を、９２～１０９分の間、毎分収集した。画分番号３～７を、第二の精製工程のために共にプールした。プールされた画分は、９４．５％の純度を示し、回収率は７３．８％であった。
【0077】
第二の精製工程では、画分を３０秒毎に、７１～８６分の間に収集した。画分番号１６のみが、９９．５％の許容可能な純度を示し、回収率は４．７％であった。したがって、両方の精製工程にわたる総回収率は、わずか３．４％であった。これは、例えば、７９．６％の総回収率が達成された、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－１０－ｄｉＣ４（上記実施例２ａ）を参照）を使用することによって達成される総回収率よりもかなり低い。
【0078】
実施例３：Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－１０－ｄｉＣ４上の、セマグルチドの二段階精製
第一の精製工程を、炭酸水素アンモニウムを用いてｐＨ７で実施し、第二の精製を、ｐＨ８で酢酸アンモニウムを緩衝液として実施し、両方の系で、アセトニトリルを有機修飾剤として使用した。精製は、自動画分収集器を備えた、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０システム上で実施した。両方の精製工程を、実施例１ｃ）からの、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－１０－ｄｉＣ４を充填した、４．６×２５０ｍｍカラム上で行った。精製されるセマグルチド試料は、５．０ｍｇｍＬ－１の粗セマグルチド（純度≦６０％）を含有する混合物であり、これは、８０ｍｇのセマグルチドを、１６ｍＬのＮＨ４ＨＣＯ３緩衝液（０．１ｍｏｌＬ－１、ｐＨ７．０）／アセトニトリル（９５：５）中に溶解することによって調製し、０．４５μｍのシリンジフィルターを通して濾過し、カラム内に直接注入した。
第一の精製工程を、炭酸水素アンモニウムを用いてｐＨ７で実施し、第二の精製を、ｐＨ８で酢酸アンモニウムを緩衝液として実施し、両方の系で、アセトニトリルを有機修飾剤として使用した。精製は、自動画分収集器を備えた、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０システム上で実施した。両方の精製工程を、実施例１ｃ）からの、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－１０－ｄｉＣ４を充填した、４．６×２５０ｍｍカラム上で行った。精製されるセマグルチド試料は、５．０ｍｇｍＬ－１の粗セマグルチド（純度≦６０％）を含有する混合物であり、これは、８０ｍｇのセマグルチドを、１６ｍＬのＮＨ４ＨＣＯ３緩衝液（０．１ｍｏｌＬ－１、ｐＨ７．０）／アセトニトリル（９５：５）中に溶解することによって調製し、０．４５μｍのシリンジフィルターを通して濾過し、カラム内に直接注入した。
【0079】
第一の精製工程：粗セマグルチド試料（純度≦６０％）を、カラム（３４ｍｇ／ｇの固定相）上に装填し、移動相は、０．１Ｍの炭酸水素アンモニウム（ｐＨ７）及びアセトニトリルからなる。精製を、以下の配列に従って、勾配溶出下で実施した。５％アセトニトリルを、５分間、５分～１３８分の間に装填する工程で、アセトニトリル濃度を、３０％～４０．５％に直線的に増加させた。１２８分後、アセトニトリル濃度を、８０％に、１１分間増加させて、強く吸着した成分を溶出し、カラムを洗浄した後、アセトニトリル濃度を５％に減少させて、カラムを平衡化した。セマグルチドを、５０分～７０分の間に収集し、プールされた画分は、９８．１％の純度を示し、回収率は９５％であった。得られたクロマトグラムを、図３ａに示す。
【0080】
第二の精製工程：第一の精製からのプールした画分を、約１０％アセトニトリルに希釈し、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－１０－ｄｉＣ４を含有するカラムに装填し、移動相は、０．１Ｍの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ８）及び有機修飾剤としてのアセトニトリルからなる。精製を、以下の配列に従って、勾配溶出下で実施した。５％アセトニトリルを、５分間、５分～９５分の間に装填する工程で、アセトニトリル濃度を、３０．５％～４１．３％に直線的に増加させた。９５分後、アセトニトリル濃度を、８０％に、１１分間で増加させて、強く吸着した成分を溶出し、カラムを洗浄した後、アセトニトリル濃度を５％に減少させて、カラムを平衡化した。リラグルチドを、４０分～６５分の間に収集し、プールした画分は、９９．６％の純度を示し、両方の精製工程にわたって、総回収率は７６％であった。得られたクロマトグラムを、図３ｂに示す。
【0081】
実施例４：リラグルチドの更なる一工程精製試験
本発明の様々なシリカ粒子が、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％など、少なくとも９５％のリラグルチドの第一の精製工程純度レベルにおいて、第一の精製工程について、商業的に許容可能な収率で、既に達成するのに好適であることを確認するために、更なる実験を行った。精製されるリラグルチド試料、溶媒勾配、及び装置パラメータは、実施例２ａ）について上述したものと同一であった。単に、ＨＰＬＣカラムで固定相として使用されるシリカ粒子が、変更された。実施例４ａ）では、上記の実施例１ａ）からの、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－５－ｄｉＣ４を使用した。実施例４ｂ）では、上記の実施例１ｄ）からの、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）２００－５－ｄｉＣ４を使用した。実施例４ｃ）では、上記の実施例１ｆ）からの、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－５－ｄｉＣ６を使用した。
本発明の様々なシリカ粒子が、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％など、少なくとも９５％のリラグルチドの第一の精製工程純度レベルにおいて、第一の精製工程について、商業的に許容可能な収率で、既に達成するのに好適であることを確認するために、更なる実験を行った。精製されるリラグルチド試料、溶媒勾配、及び装置パラメータは、実施例２ａ）について上述したものと同一であった。単に、ＨＰＬＣカラムで固定相として使用されるシリカ粒子が、変更された。実施例４ａ）では、上記の実施例１ａ）からの、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－５－ｄｉＣ４を使用した。実施例４ｂ）では、上記の実施例１ｄ）からの、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）２００－５－ｄｉＣ４を使用した。実施例４ｃ）では、上記の実施例１ｆ）からの、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）１００－５－ｄｉＣ６を使用した。
【0082】
表１は、結果を要約し、上記の実施例２及び３の結果も組み込む。
【表1】
【0083】
本発明のシリカ粒子は、少なくとも７０％の商業的に許容可能な収率で、第一の精製工程で９５％を超える純度を既に達成するのに特に好適であることが、上記の表１から明らかである。更に、本発明のシリカ粒子はまた、少なくとも９９．５％という医薬的に関連する純度で、７５％を遥かに超える全回収率（すなわち、収率）を達成する。
【図1a】
【図1b】
【図2a】
【図2b】
【図3a】
【図3b】
【手続補正書】
【提出日】2024-05-20
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
１～２５０オングストローム（Å）の微細孔径を有し、以下の一般式に従うシラン基を含むシリカ粒子であって：
式中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、アルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、及びヘテロアルキルアリールからなる群から選択され、
Ｒは、水素又はシリカであり、及び
ＳｉＯ２は、シリカである、シリカ粒子。
【化1】
Ｒは、水素又はシリカであり、及び
ＳｉＯ２は、シリカである、シリカ粒子。
【請求項2】
前記微細孔径が、５０～１５０オングストローム（Å）である、請求項１に記載のシリカ粒子。
【請求項3】
Ｒ１及びＲ２が、同一である、請求項１に記載のシリカ粒子。
【請求項4】
Ｒ１及びＲ２が、アルキル、好ましくは、Ｃ２～Ｃ２０分岐又は非分岐アルキルである、請求項１に記載のシリカ粒子。
【請求項5】
Ｒ１及びＲ２が、Ｃ２～Ｃ１０非分岐アルキル、好ましくは、Ｃ４～Ｃ８非分岐アルキルである、請求項１に記載のシリカ粒子。
【請求項6】
前記シリカ粒子が、０．１～１００μｍ、好ましくは、１～５０μｍの平均粒子径を有する、請求項１に記載のシリカ粒子。
【請求項7】
シリカ粒子を調製するための方法であって、
（ｉ）１～２５０オングストローム（Å）の微細孔径を有する、シリカ粒子を提供する工程と、及び
（ｉｉ）シリカ粒子を、次式の化合物で修飾する工程であって、
式中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、アルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、及びヘテロアルキルアリールからなる群から選択され、及び
Ｘ１及びＸ２は、各々独立して、ハロゲン又はアルコキシ基である、工程とを含む、方法を記載する。
（ｉ）１～２５０オングストローム（Å）の微細孔径を有する、シリカ粒子を提供する工程と、及び
（ｉｉ）シリカ粒子を、次式の化合物で修飾する工程であって、
【化2】
Ｘ１及びＸ２は、各々独立して、ハロゲン又はアルコキシ基である、工程とを含む、方法を記載する。
【請求項8】
前記微細孔径が、５０～１５０オングストローム（Å）である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
Ｒ１及びＲ２が、同一である、請求項７に記載の方法。
【請求項10】
Ｒ１及びＲ２が、アルキル、好ましくは、Ｃ２～Ｃ２０分岐又は非分岐アルキル、より好ましくは、Ｃ２～Ｃ１０非分岐アルキル、更により好ましくは、Ｃ４～Ｃ８非分岐アルキルである、請求項７に記載の方法。
【請求項11】
Ｘ１及びＸ２が、塩素である、請求項７に記載の方法。
【請求項12】
請求項７～１１のいずれかに記載の方法によって得られる、シリカ粒子。
【請求項13】
請求項１～６のいずれかに記載のシリカ粒子、又は請求項７～１１のいずれかに記載の方法によって得られるシリカ粒子を含む、クロマトグラフィー用の分離カラム。
【請求項14】
修飾複合ペプチド、好ましくは、ＧＬＰ－１作動薬又はＧＬＰ－２類似体を、精製するための固定相としての、請求項１～６のいずれかに記載のシリカ粒子、又は請求項７～１１のいずれかに記載の方法によって得られるシリカ粒子の使用。
【請求項15】
前記修飾複合ペプチドが、セマグルチド又はリラグルチドである、請求項１４に記載の使用。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0083】
本発明のシリカ粒子は、少なくとも７０％の商業的に許容可能な収率で、第一の精製工程で９５％を超える純度を既に達成するのに特に好適であることが、上記の表１から明らかである。更に、本発明のシリカ粒子はまた、少なくとも９９．５％という医薬的に関連する純度で、７５％を遥かに超える全回収率（すなわち、収率）を達成する。
本願発明には以下の態様が含まれる。
項１．
１～２５０オングストローム（Å）の微細孔径を有し、以下の一般式に従うシラン基を含むシリカ粒子であって：
式中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、アルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、及びヘテロアルキルアリールからなる群から選択され、
Ｒは、水素又はシリカであり、及び
ＳｉＯ２は、シリカである、シリカ粒子。
項２．
前記微細孔径が、５０～１５０オングストローム（Å）である、項１に記載のシリカ粒子。
項３．
Ｒ１及びＲ２が、同一である、項１又は２に記載のシリカ粒子。
項４．
Ｒ１及びＲ２が、アルキル、好ましくは、Ｃ２～Ｃ２０分岐又は非分岐アルキルである、項１～３のいずれかに記載のシリカ粒子。
項５．
Ｒ１及びＲ２が、Ｃ２～Ｃ１０非分岐アルキル、好ましくは、Ｃ４～Ｃ８非分岐アルキルである、項１～４のいずれかに記載のシリカ粒子。
項６．
前記シリカ粒子が、０．１～１００μｍ、好ましくは、１～５０μｍの平均粒子径を有する、項１～５のいずれかに記載のシリカ粒子。
項７．
シリカ粒子を調製するための方法であって、
（ｉ）１～２５０オングストローム（Å）の微細孔径を有する、シリカ粒子を提供する工程と、及び
（ｉｉ）シリカ粒子を、次式の化合物で修飾する工程であって、
式中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、アルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、及びヘテロアルキルアリールからなる群から選択され、及び
Ｘ１及びＸ２は、各々独立して、ハロゲン又はアルコキシ基である、工程とを含む、方法を記載する。
項８．
前記微細孔径が、５０～１５０オングストローム（Å）である、項７に記載の方法。
項９．
Ｒ１及びＲ２が、同一である、項７又は８に記載の方法。
項１０．
Ｒ１及びＲ２が、アルキル、好ましくは、Ｃ２～Ｃ２０分岐又は非分岐アルキル、より好ましくは、Ｃ２～Ｃ１０非分岐アルキル、更により好ましくは、Ｃ４～Ｃ８非分岐アルキルである、項７～９のいずれかに記載の方法。
項１１．
Ｘ１及びＸ２が、塩素である、項７～１０のいずれかに記載の方法。
項１２．
項７～１１のいずれかに記載の方法によって得られる、シリカ粒子。
項１３．
項１～６のいずれかに記載のシリカ粒子、又は項７～１１のいずれかに記載の方法によって得られるシリカ粒子を含む、クロマトグラフィー用の分離カラム。
項１４．
修飾複合ペプチド、好ましくは、ＧＬＰ－１作動薬又はＧＬＰ－２類似体を、精製するための固定相としての、項１～６のいずれかに記載のシリカ粒子、又は項７～１１のいずれかに記載の方法によって得られるシリカ粒子の使用。
項１５．
前記修飾複合ペプチドが、セマグルチド又はリラグルチドである、項１４に記載の使用。
本願発明には以下の態様が含まれる。
項１．
１～２５０オングストローム（Å）の微細孔径を有し、以下の一般式に従うシラン基を含むシリカ粒子であって：
【化1】
Ｒは、水素又はシリカであり、及び
ＳｉＯ２は、シリカである、シリカ粒子。
項２．
前記微細孔径が、５０～１５０オングストローム（Å）である、項１に記載のシリカ粒子。
項３．
Ｒ１及びＲ２が、同一である、項１又は２に記載のシリカ粒子。
項４．
Ｒ１及びＲ２が、アルキル、好ましくは、Ｃ２～Ｃ２０分岐又は非分岐アルキルである、項１～３のいずれかに記載のシリカ粒子。
項５．
Ｒ１及びＲ２が、Ｃ２～Ｃ１０非分岐アルキル、好ましくは、Ｃ４～Ｃ８非分岐アルキルである、項１～４のいずれかに記載のシリカ粒子。
項６．
前記シリカ粒子が、０．１～１００μｍ、好ましくは、１～５０μｍの平均粒子径を有する、項１～５のいずれかに記載のシリカ粒子。
項７．
シリカ粒子を調製するための方法であって、
（ｉ）１～２５０オングストローム（Å）の微細孔径を有する、シリカ粒子を提供する工程と、及び
（ｉｉ）シリカ粒子を、次式の化合物で修飾する工程であって、
【化2】
Ｘ１及びＸ２は、各々独立して、ハロゲン又はアルコキシ基である、工程とを含む、方法を記載する。
項８．
前記微細孔径が、５０～１５０オングストローム（Å）である、項７に記載の方法。
項９．
Ｒ１及びＲ２が、同一である、項７又は８に記載の方法。
項１０．
Ｒ１及びＲ２が、アルキル、好ましくは、Ｃ２～Ｃ２０分岐又は非分岐アルキル、より好ましくは、Ｃ２～Ｃ１０非分岐アルキル、更により好ましくは、Ｃ４～Ｃ８非分岐アルキルである、項７～９のいずれかに記載の方法。
項１１．
Ｘ１及びＸ２が、塩素である、項７～１０のいずれかに記載の方法。
項１２．
項７～１１のいずれかに記載の方法によって得られる、シリカ粒子。
項１３．
項１～６のいずれかに記載のシリカ粒子、又は項７～１１のいずれかに記載の方法によって得られるシリカ粒子を含む、クロマトグラフィー用の分離カラム。
項１４．
修飾複合ペプチド、好ましくは、ＧＬＰ－１作動薬又はＧＬＰ－２類似体を、精製するための固定相としての、項１～６のいずれかに記載のシリカ粒子、又は項７～１１のいずれかに記載の方法によって得られるシリカ粒子の使用。
項１５．
前記修飾複合ペプチドが、セマグルチド又はリラグルチドである、項１４に記載の使用。
【外国語明細書】