特開 2024-133476 ＲＵＶＣドメインを有する酵素

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024133476

(43)【公開日】2024-10-02

(54)【発明の名称】ＲＵＶＣドメインを有する酵素

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20240925BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20240925BHJP

   C12N 15/55 20060101ALN20240925BHJP

   C12N 9/22 20060101ALN20240925BHJP

   C12N 15/10 20060101ALN20240925BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 100

C12N15/11 Z ZNA

C12N15/55

C12N9/22

C12N15/10 200Z

C12N15/11 Z

【審査請求】有

【請求項の数】27

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024091759

(22)【出願日】2024-06-05

(62)【分割の表示】P 2023146414の分割

【原出願日】2020-02-14

(31)【優先権主張番号】62/805,868

(32)【優先日】2019-02-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/805,878

(32)【優先日】2019-02-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/805,899

(32)【優先日】2019-02-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/874,414

(32)【優先日】2019-07-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】522185863

【氏名又は名称】メタゲノミ，インク．

(74)【代理人】

【識別番号】110003797

【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】トーマス，ブライアン

(72)【発明者】

【氏名】ブラウン，クリストファー

(72)【発明者】

【氏名】カンター，ローズ

(72)【発明者】

【氏名】デヴォート，オードラ

(72)【発明者】

【氏名】バターフィールド，クリスティーナ

(72)【発明者】

【氏名】アレクサンダー，リサ

(72)【発明者】

【氏名】ゴルツマン，ダニエラ エス．エー．

(72)【発明者】

【氏名】リュー，ジェイソン

(57)【要約】      （修正有）

【課題】際立ったドメイン特徴を有するエンドヌクレアーゼ酵素、ならびにそのような酵素またはその変異体を使用する方法を提供する。
【解決手段】操作されたヌクレアーゼシステムであって、前記操作されたヌクレアーゼシステムは、（ａ）ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含むエンドヌクレアーゼであって、ここで、前記エンドヌクレアーゼは、特定の配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、エンドヌクレアーゼと、（ｂ）前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成される、操作されたガイドリボ核酸構造であって、前記操作されたガイドリボ核酸構造は、（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列と、（ｉｉ）前記エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列と、を含む操作されたガイドリボ核酸構造と、を含む、操作されたヌクレアーゼシステムである。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

操作されたヌクレアーゼシステムであって、前記操作されたヌクレアーゼシステムは、
（ａ）ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインとＨＮＨドメインとを含むエンドヌクレアーゼであって、ここで、前記エンドヌクレアーゼは難培養性微生物に由来し、ここで、前記エンドヌクレアーゼは、クラス２のＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、エンドヌクレアーゼと、
（ｂ）前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成される、操作されたガイドリボ核酸構造であって、前記操作されたガイドリボ核酸構造は、
（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列と、
（ｉｉ）前記エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列と、を含む、操作されたガイドリボ核酸構造と、を含む、
操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項2】

前記ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：１８２７－３６３７のいずれか１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項3】

操作されたヌクレアーゼシステムであって、前記操作されたヌクレアーゼシステムは、
（ａ）配列番号：１８２７－３６３７のいずれか１つに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含むエンドヌクレアーゼと、
（ｂ）前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成される、操作されたガイドリボ核酸構造であって、前記操作されたガイドリボ核酸構造は、
（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列と、
（ｉｉ）前記エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列と、を含む、操作されたガイドリボ核酸構造と、を含む、
操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項4】

操作されたヌクレアーゼシステムであって、前記操作されたヌクレアーゼシステムは、
（ａ）配列番号：５５１２－５５３７を含むプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に結合するように構成されたエンドヌクレアーゼであって、ここで、前記エンドヌクレアーゼはクラス２のＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、エンドヌクレアーゼと、
（ｂ）前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成される、操作されたガイドリボ核酸構造であって、前記操作されたガイドリボ核酸構造は、
（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列と、
（ｉｉ）前記エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列と、を含む、操作されたガイドリボ核酸構造と、を含む、
操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項5】

前記エンドヌクレアーゼは難培養性微生物に由来する、請求項４に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項6】

前記エンドヌクレアーゼは、異なるＰＡＭ配列に結合するように操作されていない、請求項４－５のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項7】

前記エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｄエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｃエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓ１３ｄエンドヌクレアーゼではない、請求項４に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項8】

前記エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに対して８０％未満の同一性を有する、請求項４に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項9】

前記エンドヌクレアーゼはＨＮＨドメインをさらに含む、請求項３－８のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項10】

前記ｔｒａｃｒリボ核酸配列は、配列番号：５４７６－５５１１および配列番号：５５３８のいずれか１つから選択される約６０～９０の連続するヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１－９のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項11】

操作されたヌクレアーゼシステムであって、前記操作されたヌクレアーゼシステムは、
（ａ）操作されたガイドリボ核酸構造であって、前記操作されたガイドリボ核酸構造は、
（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列と、
（ｉｉ）エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列であって、ここで、前記ｔｒａｃｒリボ核酸配列は、配列番号：５４７６－５５１１および配列番号：５５３８のいずれか１つから選択される約６０～９０の連続するヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、ｔｒａｃｒリボ核酸配列と、を含む、
操作されたガイドリボ核酸構造と、
（ｂ）前記操作されたガイドリボ核酸に結合するように構成されたクラス２のＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、を含む、
操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項12】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５１２－５５３７を含む群から選択されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に結合するように構成される、請求項１－３または１１のいずれかに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項13】

前記操作されたガイドリボ核酸構造は、少なくとも２つのリボ核酸ポリヌクレオチドを含む、請求項１－１１のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項14】

前記操作されたガイドリボ核酸構造は、前記ガイドリボ核酸配列と前記ｔｒａｃｒリボ核酸配列とを含む１つのリボ核酸ポリヌクレオチドを含む、請求項１－１１のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項15】

前記ガイドリボ核酸配列は、原核生物、細菌、古細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳動物、またはヒトのゲノム配列に相補的である、請求項１－１４のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項16】

前記ガイドリボ核酸配列は１５～２４ヌクレオチド長である、請求項１－１５のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項17】

前記エンドヌクレアーゼは、前記エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端の近位にある１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を含む、請求項１－１６のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項18】

前記ＮＬＳは、配列番号：５５９７－５６１２から選択される配列を含む、請求項１－１７のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項19】

５’から３’に、前記標的デオキシリボ核酸配列の５’に少なくとも２０のヌクレオチドの配列を含む第１の相同性アームと、少なくとも１０のヌクレオチドの合成ＤＮＡ配列と、前記標的デオキシリボ核酸配列の３’に少なくとも２０のヌクレオチドの配列を含む第２の相同性アームとを含む、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ修復鋳型をさらに含む、請求項１－１８のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項20】

前記第１の相同性アームまたは前記第２の相同性アームは、少なくとも４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１，０００のヌクレオチドの配列を含む、請求項１９に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項21】

前記操作されたヌクレアーゼシステムは、Ｍｇ^２＋の供給源をさらに含む、請求項１－２０のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項22】

前記エンドヌクレアーゼおよび前記ｔｒａｃｒリボ核酸配列は、同じ門内の別個の細菌種に由来する、請求項１－２１のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項23】

前記エンドヌクレアーゼは、Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒ属に属する細菌に由来する、請求項１－２２のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項24】

前記エンドヌクレアーゼは、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ門、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ門、またはＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｌａｉｎａｂａｃｔｅｒｉａ門に属する細菌に由来する、請求項１－２２のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項25】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５９２－５５９５のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含む細菌に由来する、請求項１－２２のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項26】

前記ＨＮＨドメインは、配列番号：５６３８－５４６０のいずれか１つに対して少なくとも７０％または少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項１－２５のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項27】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：１－１８２６またはそられに対して少なくとも５５％の同一性を有するその変異体を含む、請求項１－２６のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項28】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：１８２７－１８３０あるいは配列番号：１８２７－２１４０からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項29】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：３６３８－３６４１あるいは配列番号：３６３８－３９５４からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％同一である配列を含む、請求項１－２８のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項30】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５６１５－５６３２からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのペプチドモチーフを含む、請求項１－２９のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項31】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：１－４あるいは配列番号：１－３１９からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－３０のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項32】

前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４６１－５４６４、配列番号：５４７６－５４７９、あるいは配列番号：５４７６－５４８９からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－３１のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項33】

前記ガイドＲＮＡ構造は、ステムおよびループからなるヘアピンを含むと予想されるＲＮＡ配列を含み、ここで、前記ステムは、少なくとも１０、少なくとも１２、または少なくとも１４の塩基対のリボヌクレオチド、および前記ループの４つの塩基対以内の非対称バルジを含む、請求項１－３２のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項34】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５１２－５５１５あるいは配列番号：５５２７－５５３０からなる群から選択される配列を含むＰＡＭに結合するように構成される、請求項１－３３のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項35】

ａ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：１８２７に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、
ｂ）前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４６１あるいは配列番号：５４７６の少なくとも１つに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、および、
ｃ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５１２あるいは配列番号：５５２７を含むＰＡＭに結合するように構成される、請求項１－３４のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項36】

ａ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：１８２８に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、
ｂ）前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４６２あるいは配列番号：５４７７の少なくとも１つに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、および、
ｃ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５１３あるいは配列番号：５５２８を含むＰＡＭに結合するように構成される、請求項１－３４のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項37】

ａ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：１８２９に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、
ｂ）前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４６３あるいは配列番号：５４７８の少なくとも１つに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、および、
ｃ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５１４あるいは配列番号：５５２９を含むＰＡＭに結合するように構成される、請求項１－３４のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項38】

ａ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：１８３０に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、
ｂ）前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４６４あるいは配列番号：５４７９の少なくとも１つに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、および、
ｃ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５１５あるいは配列番号：５５３０を含むＰＡＭに結合するように構成される、請求項１－３４のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項39】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：２１４１－２１４２あるいは配列番号：２１４１－２２４１からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項40】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：３９５５－３９５６あるいは配列番号：３９５５－４０５５からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または３９のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項41】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５６３２－５６３８からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのペプチドモチーフを含む、請求項１－２７または３９－４０のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項42】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：３２０－３２１あるいは配列番号：３２０－４２０からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または３９－４１のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項43】

前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４６５、配列番号：５４９０－５４９１、あるいは配列番号：５４９０－５４９４からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または３９－４２のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項44】

前記ガイドＲＮＡ構造は、少なくとも８、少なくとも１０、または少なくとも１２の塩基対のリボヌクレオチドを含むヘアピンを含む、ｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む、請求項１－２７または３９－４３のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項45】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５１６および配列番号：５５３１からなる群から選択される配列を含むＰＡＭに結合するように構成される、請求項１－２７または３９－４４のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項46】

ａ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：２１４１に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み、
ｂ）前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４９０に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み、および、
ｃ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５３１を含むＰＡＭに結合するように構成される、請求項１－２７または３９－４５のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項47】

ａ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：２１４２に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み、
ｂ）前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４６５あるいは配列番号：５４９１に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み、および、
ｃ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５１６を含むＰＡＭに結合するように構成される、請求項１－２７または３９－４５のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項48】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：２２４５－２２４６からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項49】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：４０５９－４０６０からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または４８のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項50】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５６３９－５６４８からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのペプチドモチーフを含む、請求項１－２７または４８－４９のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項51】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：４２４－４２５からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または４８－５０のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム

【請求項52】

前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４９８－５４９９および配列番号：５５３９からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または４８－５１のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項53】

前記ガイドＲＮＡ構造は、ガイドリボ核酸配列の少なくとも８つのヌクレオチドおよびｔｒａｃｒリボ核酸配列の少なくとも８つのヌクレオチドを含む中断されていない塩基対領域を有するヘアピンを含むと予想されるガイドリボ核酸配列を含み、ここで、前記ｔｒａｃｒリボ核酸配列は、５’から３’に、第１のヘアピンと第２のヘアピンとを含み、ここで、前記第１のヘアピンは前記第２のヘアピンよりも長いステムを有する、請求項１－２７または４８－５２のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項54】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：２２４２－２２４４あるいは配列番号：２２４７－２２４９からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項55】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：４０５６－４０５８および配列番号：４０６１－４０６３からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または５４のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項56】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５６３９－５６４８からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのペプチドモチーフを含む、請求項１－２７または５４－５５のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項57】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：４２１－４２３あるいは配列番号：４２６－４２８からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または５４－５６のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項58】

前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４６６－５４６７、配列番号：５４９５－５４９７、配列番号：５５００－５５０２、および配列番号：５５３９からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または５４－５７のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項59】

前記ガイドＲＮＡ構造は、ガイドリボ核酸配列の少なくとも８つのヌクレオチドおよびｔｒａｃｒリボ核酸配列の少なくとも８つのヌクレオチドを含む中断されていない塩基対領域を有するヘアピンを含むと予想されるガイドリボ核酸配列を含み、ここで、前記ｔｒａｃｒリボ核酸配列は、５’から３’に、第１のヘアピンと第２のヘアピンとを含み、ここで、前記第１のヘアピンは前記第２のヘアピンよりも長いステムを有する、請求項１－２７または５４－５８のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項60】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５１７－５５１８あるいは配列番号：５５３２－５５３４からなる群から選択される配列を含むＰＡＭに結合するように構成される、請求項１－２７または５４－５９のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項61】

ａ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：２２４７に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み、
ｂ）前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５５００に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み、および、
ｃ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５１７あるいは配列番号：５５３２を含むＰＡＭに結合するように構成される、請求項１－２７または５４－６０のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項62】

ａ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：２２４８に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み、
ｂ）前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５５０１に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み、および、
ｃ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５１８あるいは配列番号：５５３３を含むＰＡＭに結合するように構成される、請求項１－２７または５４－６０のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項63】

ａ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：２２４９に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み、
ｂ）前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５５０２に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み、および、
ｃ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５３４を含むＰＡＭに結合するように構成される、請求項１－２７または５４－６０のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項64】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：２２５３あるいは配列番号：２２５３－２４８１からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項65】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：４０６７あるいは配列番号：４０６７－４２９５からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または６４のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項66】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５６４９のペプチドモチーフを含む、請求項１－２７または６４－６５のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項67】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：４３２あるいは配列番号：４３２－６６０からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または６４－６６のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項68】

前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４６８あるいは配列番号：５５０３からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または６４－６７のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項69】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５１９からなる群から選択される配列を含むＰＡＭに結合するように構成される、請求項１－２７または６４－６８のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項70】

ａ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：２２５３に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み、
ｂ）前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４６８あるいは配列番号：５５０３に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み、および、
ｃ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５１９を含むＰＡＭに結合するように構成される、請求項１－２７または６４－６９のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項71】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：２４８２－２４８９からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項72】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：４２９６－４３０３からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または７１のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項73】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：６６１－６６８からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または７１－７２のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項74】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：２４９０－２４９８からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項75】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：４３０４－４３１２からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または７４のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項76】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：６６９－６７７からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または７４－７５のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項77】

前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５５０４からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または７４－７６のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項78】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：２４９９あるいは配列番号：２４９９－２７５０からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項79】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：４３１３あるいは配列番号：４３１３－４５６４からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または７８のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項80】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５６５０－５６６７からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのペプチドモチーフを含む、請求項１－２７または７８－７９のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項81】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：６７８あるいは配列番号：６７８－９２９からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または７８－８０のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項82】

前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４６９あるいは配列番号：５５０５に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または７８－８１のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項83】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５２０あるいは配列番号：５５３５を含むＰＡＭに結合するように構成される、請求項１－２７または７８－８２のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項84】

ａ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：２４９９に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み、
ｂ）前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４６９あるいは配列番号：５５０５に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み、および、
ｃ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５２０あるいは配列番号：５５３５を含むＰＡＭに結合するように構成される、請求項１－２７または７８－８３のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項85】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：２７５１あるいは配列番号：２７５１－２９１３からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項86】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：４５６５あるいは配列番号：４５６５－４７２７からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または８５のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項87】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５６６８－５６７８からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのペプチドモチーフを含む、請求項１－２７または８５－８６のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項88】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：９３０あるいは配列番号：９３０－１０９２からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または８５－８７のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項89】

前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４７０あるいは配列番号：５５０６に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または８５－８８のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項90】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５２１あるいは配列番号：５５３６からなる群から選択される配列を含むＰＡＭに結合するように構成される、請求項１－２７または８５－８９のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項91】

ａ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：２７５１に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み、
ｂ）前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４７０あるいは配列番号：５５０６に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み、および、
ｃ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５２１あるいは配列番号：５５３６を含むＰＡＭに結合するように構成される、請求項１－２７または８５－９０のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項92】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：２９１４あるいは配列番号：２９１４－３１７４からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項93】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：４７２８あるいは配列番号：４７２８－４９８８からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または９２のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項94】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５６７６－５６７８からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのペプチドモチーフを含む、請求項１－２７または９２－９３のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項95】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：１０９３あるいは配列番号：１０９３－１３５３からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または９２－９４のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項96】

前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４７１、配列番号：５５０７、および配列番号：５５４０－５５４２からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または９２－９５のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項97】

前記ガイドＲＮＡ構造は、５つ未満の塩基対のリボヌクレオチドを含む少なくとも２つのヘアピンを含むと予想されるｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む、請求項１－２７または９２－９６のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項98】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５２２を含むＰＡＭに結合するように構成される、請求項１－２７または９２－９７のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項99】

ａ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：２９１４に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み、
ｂ）前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４７１あるいは配列番号：５５０７に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み、および、
ｃ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５２２を含むＰＡＭに結合するように構成される、請求項１－２７または９２－９８のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項100】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：３１７５あるいは配列番号：３１７５－３３３０からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項101】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：４９８９あるいは配列番号：４９８９－５１４６からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または１００のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項102】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５６７９－５６８６からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのペプチドモチーフを含む、請求項１－２７または１００－１０１のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項103】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：１３５４あるいは配列番号：１３５４－１５１１からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または１００－１０２のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項104】

前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４７２あるいは配列番号：５５０８からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または１００－１０３のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項105】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５２３あるいは配列番号：５５３７からなる群から選択される配列を含むＰＡＭに結合するように構成される、請求項１－２７または１００－１０４のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項106】

ａ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：３１７５に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み、
ｂ）前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４７２あるいは配列番号：５５０８に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み、および、
ｃ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５２３あるいは配列番号：５５３７を含むＰＡＭに結合するように構成される、請求項１－２７または１００－１０５のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項107】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：３３３１あるいは配列番号：３３３１－３４７４からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項108】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５１４７あるいは配列番号：５１４７－５２９０からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または１０７のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム

【請求項109】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５６７４－５６７５および配列番号：５６８７－５６９３からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのペプチドモチーフを含む、請求項１－２７または１０７－１０８のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項110】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：１５１２あるいは配列番号：１５１２－１６５５からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または１０７－１０９のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項111】

前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４７３あるいは配列番号：５５０９からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または１０７－１１０のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項112】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５２４を含むＰＡＭに結合するように構成される、請求項１－２７または１０７－１１１のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項113】

ａ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：３３３１に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み、
ｂ）前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４７３あるいは配列番号：５５０９に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み、および、
ｃ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５２４を含むＰＡＭに結合するように構成される、請求項１－２７または１０７－１１２のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項114】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：３４７５あるいは配列番号：３４７５－３５６８からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項115】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５２９１あるいは配列番号：５２９１－５３８９からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または１１４のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項116】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５６９４－５６９９からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのペプチドモチーフを含む、請求項１－２７または１１４－１１５のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項117】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：１６５６あるいは配列番号：１６５６－１７５５からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または１１４－１１６のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項118】

前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４７４あるいは配列番号：５５１０に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または１１４－１１７のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項119】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５２５を含むＰＡＭに結合するように構成される、請求項１－２７または１１４－１１８のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項120】

ａ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：３４７５に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み、
ｂ）前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４７４あるいは配列番号：５５１０に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み、および、
ｃ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５２５を含むＰＡＭに結合するように構成される、請求項１－２７または１１４－１１９のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項121】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：３５６９あるいは配列番号：３５６９－３６３７からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項122】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５３９０あるいは配列番号：５３９０－５４６０からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または１２１のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項123】

前記エンドヌクレアーゼは配列番号：５７００－５７１７からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのペプチドモチーフを含む、請求項１－２７または１２１－１２２のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項124】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：１７５６あるいは配列番号：１７５６－１８２６からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または１２１－１２３のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項125】

前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４７５あるいは配列番号：５５１１に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む、請求項１－２７または１２１－１２４のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項126】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５２６を含むＰＡＭに結合するように構成される、請求項１－２７または１２１－１２５のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項127】

ａ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：３５６９に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み、
ｂ）前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４７５あるいは配列番号：５５１１に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み、および、
ｃ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５２６を含むＰＡＭに結合するように構成される、請求項１－２７または１２１－１２６のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項128】

配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される、請求項１－１２７のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項129】

前記配列同一性は、３のｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ（Ｗ）、１０のｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ（Ｅ）のパラメータ、および、１１のｅｘｉｓｔｅｎｃｅ、１のｅｘｔｅｎｓｉｏｎでギャップコストを設定するＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用して、ならびに、条件付き組成スコアマトリックス調整を使用して、ＢＬＡＳＴＰ相同性検索アルゴリズムによって決定される、請求項１２８に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項130】

操作されたガイドリボ核酸ポリヌクレオチドであって、前記操作されたガイドリボ核酸ポリヌクレオチドは、
ａ）標的ＤＮＡ分子中の標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡを標的とするセグメントと、
ｂ）ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）二重鎖を形成するヌクレオチドの２つの相補的なストレッチを含む、タンパク質結合セグメントであって、
ここで、前記ヌクレオチドの２つの相補的なストレッチは介在ヌクレオチドで互いに共有結合し、および、
ここで、前記操作されたガイドリボ核酸ポリヌクレオチドは、配列番号：１８２７－３６３７のいずれか１つに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含むエンドヌクレアーゼと複合体を形成し、前記複合体を標的ＤＮＡ分子の標的配列に標的化するように構成される、
操作されたガイドリボ核酸ポリヌクレオチド。

【請求項131】

前記ＤＮＡ標的化セグメントは、前記ヌクレオチドの２つの相補的なストレッチの両方の５’に位置する、請求項１３０に記載の操作されたガイドリボ核酸ポリヌクレオチド。

【請求項132】

ａ）前記タンパク質結合セグメントは、配列番号：５４７６－５４７９あるいは配列番号：５４７６－５４８９からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、
ｂ）前記タンパク質結合セグメントは （配列番号：５４９０－５４９１あるいは配列番号：５４９０－５４９４）および配列番号：５５３８からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、
ｃ）前記タンパク質結合セグメントは、配列番号：５４９８－５４９９からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、
ｄ）前記タンパク質結合セグメントは、配列番号：５４９５－５４９７および配列番号：５５００－５５０２からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、
ｅ）前記タンパク質結合セグメントは、配列番号：５５０３に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、
ｆ）前記タンパク質結合セグメントは、配列番号：５５０４に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、
ｇ）前記タンパク質結合セグメントは、配列番号：５５０５に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、
ｈ）タンパク質結合セグメントは、配列番号：５５０６に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、
ｉ）タンパク質結合セグメントは、配列番号：５５０７に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、
ｊ）前記タンパク質結合セグメントは、配列番号：５５０８に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、
ｋ）前記タンパク質結合セグメントは、配列番号：５５０９に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、
ｌ）前記タンパク質結合セグメントは、配列番号：５５１０に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、または、
ｍ）前記タンパク質結合セグメントは、配列番号：５５１１に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項１３０－１３１のいずれかに記載の操作されたガイドリボ核酸ポリヌクレオチド。

【請求項133】

ａ）前記ガイドリボ核酸ポリヌクレオチドは、ステムとループとを含むヘアピンを含むＲＮＡ配列を含み、ここで、前記ステムは、少なくとも１０、少なくとも１２、または少なくとも１４の塩基対のリボヌクレオチド、および前記ループの４つの塩基対内の非対称バルジを含み、
ｂ）前記ガイドリボ核酸ポリヌクレオチドは、少なくとも８、少なくとも１０、または少なくとも１２の塩基対のリボヌクレオチドを含むヘアピンを含むと予想されるｔｒａｃｒリボ核酸配列を含み、
ｃ）前記ガイドリボ核酸ポリヌクレオチドは、ガイドリボ核酸配列の少なくとも８つのヌクレオチドとｔｒａｃｒリボ核酸配列の少なくとも８つのヌクレオチドとを含む中断されていない塩基対領域を有するヘアピンを含むと予想されるガイドリボ核酸配列を含み、ここで、前記ｔｒａｃｒリボ核酸配列は、５’から３’に、第１のヘアピンと第２のヘアピンとを含み、ここで、前記第１のヘアピンは前記第２のヘアピンよりも長いステムを有し、または、
ｄ）前記ガイドリボ核酸ポリヌクレオチドは、５つ未満の塩基対のリボヌクレオチドを含む少なくとも２つのヘアピンを含むと予想されるｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む、請求項１３０－１３２のいずれかに記載の操作されたガイドリボ核酸ポリヌクレオチド。

【請求項134】

請求項１３０－１３３のいずれか１つに記載の操作されたガイドリボ核酸ポリヌクレオチドをコードする、デオキシリボ核酸ポリヌクレオチド。

【請求項135】

生物における発現のために最適化された、操作された核酸配列を含む核酸であって、ここで、前記核酸は、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインとＨＮＨドメインとを含むクラス２のＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードし、ここで、前記クラス２のＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼは難培養性微生物に由来する、核酸。

【請求項136】

生物における発現のために最適化された、操作された核酸配列を含む核酸であって、ここで、前記核酸は、配列番号：１８２７－３６３７のいずれか１つに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含むエンドヌクレアーゼをコードする、核酸。

【請求項137】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：３６３８－５４６０のいずれか１つに対して少なくとも７０％または少なくとも８０％の配列同一性を有するＨＮＨドメインを含む、請求項１３５－１３６のいずれか１つに記載の核酸。

【請求項138】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５７２－５５９１またはそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項１３５－１３７のいずれか１つに記載の核酸。

【請求項139】

前記エンドヌクレアーゼは、前記エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端の近位にある１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）をコードする配列を含む、請求項１３５－１３８のいずれか１つに記載の核酸。

【請求項140】

前記ＮＬＳは、配列番号：５５９７－５６１２から選択される配列を含む、請求項１３９に記載の核酸。

【請求項141】

前記生物は、原核生物、細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳動物、げっ歯類、またはヒトである、請求項１３５－１４０のいずれか１つに記載の核酸。

【請求項142】

前記生物は大腸菌であり、ここで、
ａ）前記核酸配列は、配列番号：５５７２－５５７５からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％の同一性を有する、
ｂ）前記核酸配列は、配列番号：５５７６－５５７７からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％の同一性を有する、
ｃ）前記核酸配列は、配列番号：５５７８－５５８０からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％の同一性を有する、
ｄ）前記核酸配列は、配列番号：５５８１に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％の同一性を有する、
ｅ）前記核酸配列は、配列番号：５５８２に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％の同一性を有する、
ｆ）前記核酸配列は、配列番号：５５８３に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％の同一性を有する、
ｇ）前記核酸配列は、配列番号：５５８４に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％の同一性を有する、
ｈ）前記核酸配列は、配列番号：５５８５に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％の同一性を有する、
ｉ）前記核酸配列は、配列番号：５５８６に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％の同一性を有する、あるいは、
ｊ）前記核酸配列は、配列番号：５５８７に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％の同一性を有する、請求項１４１に記載の核酸。

【請求項143】

前記生物はヒトであり、ここで、
ａ）前記核酸配列は、配列番号：５５８８あるいは配列番号：５５８９に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％の同一性を有する、あるいは、
ｂ）前記核酸配列は、配列番号：５５９０あるいは配列番号：５５９１に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％の同一性を有する、請求項１４１に記載の核酸。

【請求項144】

ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインとＨＮＨドメインとを含むクラス２のＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むベクターであって、前記クラス２のＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、難培養性微生物に由来する、ベクター。

【請求項145】

請求項１３５－１４３のいずれかに記載の核酸を含むベクター。

【請求項146】

前記クラス２のＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成される操作されたガイドリボ核酸構造をコードする核酸をさらに含み、前記操作されたガイドリボ核酸構造は、
ａ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列と、
ｂ）前記クラス２のＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼに結合するように構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列と、
を含む、請求項１４４－１４５のいずれかに記載のベクター。

【請求項147】

前記ベクターは、プラスミド、ミニサークル、ＣＥＬｉＤ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来のビリオン、またはレンチウイルスである、請求項１４４－１４６のいずれかに記載のベクター。

【請求項148】

請求項１４４－１４７のいずれかに記載のベクターを含む細胞。

【請求項149】

エンドヌクレアーゼを製造する方法であって、前記方法は、請求項１４６の前記細胞を培養する工程を含む、方法。

【請求項150】

二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを結合、切断、標識、または修飾するための方法であって、前記方法は、
（ａ）クラス２のＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよび前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドに結合するように構成される操作されたガイドリボ核酸構造と複合体を形成するクラス２のＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼに、前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを接触させる工程を含み、
（ｂ）前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含み、および、
（ｃ）前記ＰＡＭは、配列番号：５５１２－５５２６あるいは配列番号：５５２７－５５３７からなる群から選択される配列を含む、
方法。

【請求項151】

前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドは、前記操作されたガイドリボ核酸構造の配列に相補的な配列を含む第１の鎖と、ＰＡＭを含む第２の鎖とを含む、請求項１４９に記載の方法。

【請求項152】

前記ＰＡＭは、前記操作されたガイドリボ核酸構造の前記配列に相補的な前記配列の３’末端に直接隣接している、請求項１５１に記載の方法。

【請求項153】

前記クラス２のＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｄエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｃエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓ１３ｄエンドヌクレアーゼではない、請求項１４９－１５２のいずれか１つに記載の方法。

【請求項154】

前記クラス２のＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、難培養性微生物に由来する、請求項１４９－１５３のいずれか１つに記載の方法。

【請求項155】

前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドは、真核生物、植物、真菌、哺乳動物、げっ歯類、またはヒトの二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドである、請求項１４９－１５４のいずれか１つに記載の方法。

【請求項156】

ａ）前記ＰＡＭは、配列番号：５５１２－５５１５および配列番号：５５２７－５５３０からなる群から選択される配列を含む、
ｂ）前記ＰＡＭは配列番号：５５１６あるいは配列番号：５５３１を含む、
ｃ）前記ＰＡＭは配列番号：５５３９を含む、
ｄ）前記ＰＡＭは配列番号：５５１７あるいは配列番号：５５１８を含む、
ｅ）前記ＰＡＭは配列番号：５５１９を含む、
ｆ）前記ＰＡＭは配列番号：５５２０あるいは配列番号：５５３５を含む、
ｇ）前記ＰＡＭは配列番号：５５２１あるいは配列番号：５５３６を含む、
ｈ）前記ＰＡＭは配列番号：５５２２を含む、
ｉ）前記ＰＡＭは配列番号：５５２３あるいは配列番号：５５３７を含む、
ｊ）前記ＰＡＭは配列番号：５５２４を含む、
ｋ）前記ＰＡＭは配列番号：５５２５を含む、または、
ｌ）前記ＰＡＭは配列番号：５５２６を含む、
請求項１４９－１５５のいずれか１つに記載の方法。

【請求項157】

標的核酸遺伝子座を改変する方法であって、前記方法は、請求項１－１２９のいずれか１つに記載の前記操作されたヌクレアーゼシステムのいずれかを、前記標的核酸遺伝子座に送達する工程を含み、ここで、前記エンドヌクレアーゼは、前記操作されたガイドリボ核酸構造と複合体を形成するように構成され、ここで、前記複合体は、前記複合体が前記標的核酸遺伝子座に結合すると、前記複合体が前記標的核酸遺伝子座を改変するように構成される、方法。

【請求項158】

前記標的核酸遺伝子座を改変することは、前記標的核酸遺伝子座を結合、ニッキング、切断、または標識することを含む、請求項１５６に記載の方法。

【請求項159】

前記標的核酸遺伝子座は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、請求項１５６－１５８のいずれかに記載の方法。

【請求項160】

前記標的核酸は、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、または細菌ＤＮＡを含む、請求項１５９に記載の方法。

【請求項161】

前記標的核酸遺伝子座はインビトロにある、請求項１５６－１６０のいずれか１つに記載の方法。

【請求項162】

前記標的核酸遺伝子座は細胞内にある、請求項１５６－１６０のいずれか１つに記載の方法。

【請求項163】

前記細胞は、原核細胞、細菌細胞、真核細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、霊長類細胞、またはヒト細胞である、請求項１６２に記載の方法。

【請求項164】

前記操作されたヌクレアーゼシステムを前記標的核酸遺伝子座に送達する工程は、請求項１３５－１４０のいずれかに記載の核酸または請求項１４２－１４６のいずれかに記載のベクターを送達することを含む、請求項１６２－１６３のいずれか１つに記載の方法。

【請求項165】

前記操作されたヌクレアーゼシステムを前記標的核酸遺伝子座に送達する工程は、前記エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を送達することを含む、請求項１６２－１６３のいずれか１つに記載の方法。

【請求項166】

前記核酸は、前記エンドヌクレアーゼをコードする前記オープンリーディングフレームが動作可能に連結されるプロモーターを含む、請求項１６４に記載の方法。

【請求項167】

前記操作されたヌクレアーゼシステムを前記標的核酸遺伝子座に送達する工程は、前記エンドヌクレアーゼをコードする前記オープンリーディングフレームを含むキャップされたｍＲＮＡを送達することを含む、請求項１６２－１６３のいずれか１つに記載の方法。

【請求項168】

前記操作されたヌクレアーゼシステムを前記標的核酸遺伝子座に送達する工程は、翻訳されたポリペプチドを送達することを含む、請求項１６２－１６３のいずれか１つに記載の方法。

【請求項169】

前記操作されたヌクレアーゼシステムを前記標的核酸遺伝子座に送達する工程は、リボ核酸（ＲＮＡ）ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターに動作可能に連結される前記操作されたガイドリボ核酸構造をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を送達することを含む、請求項１６２－１６３のいずれか１つに記載の方法。

【請求項170】

前記エンドヌクレアーゼは、前記標的核酸遺伝子座で、またはその近位で、一本鎖切断または二本鎖切断を引き起こす、請求項１５６－１６９のいずれか１つに記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、２０１９年２月１４日に出願された「ＭＧ１ ＥＮＺＹＭＥＳ ＷＩＴＨ ＲＵＶＣ ＤＯＭＡＩＮＳ」と題される米国仮出願第６２／８０５，８６８号、および２０１９年７月１５日に出願された「ＭＧ１ ＥＮＺＹＭＥＳ ＷＩＴＨ ＲＵＶＣ ＤＯＭＡＩＮＳ」と題される米国仮出願第６２／８７４，４１４号、および、２０１９年２月１４日に出願された「ＭＧ２ ＥＮＺＹＭＥＳ ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ ＲＵＶＣ ＤＯＭＡＩＮＳ」と題される米国仮出願第６２／８０５，８７８号、および２０１９年２月１４日に出願された「ＭＧ３ ＥＮＺＹＭＥＳ ＷＩＴＨ ＲＵＶＣ ＤＯＭＡＩＮＳ」と題される米国仮出願第６２／８０５，８９９号の利益を主張し、これらの各々は、参照により完全に本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

Ｃａｓ酵素は、それらの関連するクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ガイドリボ核酸（ＲＮＡ）とともに、原核生物免疫系に広がる（～４５％の細菌、～８４％の古細菌）構成成分であり、ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡガイド核酸切断（ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ ｇｕｉｄｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｌｅａｖａｇｅ）によって、感染性ウイルスおよびプラスミドなどの非自己核酸からそのような微生物を保護する役割を果たすように思われる。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡエレメントをコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エレメントは、構造と長さが比較的保存されている場合があるが、それらのＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質は非常に多様であり、種々様々な核酸相互作用ドメインを含有している。ＣＲＩＳＰＲ ＤＮＡエレメントは早くとも１９８７年には観察されていたが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体のプログラム可能なエンドヌクレアーゼ切断能力は比較的最近になって認識され、多様なＤＮＡ操作および遺伝子編集の用途における、組換えＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用につながっている。

【0003】

配列表
本出願は配列表を含んでおり、この配列表はＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩのコピーは、２０２０年２月１３日に作成され、５５９２１－７０３＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔというファイル名であり、２３，３６３，１１３バイトのサイズである。

【発明の概要】

【0004】

いくつかの態様では、本開示は操作されたヌクレアーゼシステムを提供し、上記操作されたヌクレアーゼシステムは：（ａ）ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインとＨＮＨドメインとを含むエンドヌクレアーゼであって、ここで、上記エンドヌクレアーゼは難培養性微生物（ｕｎｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）に由来し、ここで、上記エンドヌクレアーゼは、クラス２のＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、エンドヌクレアーゼと；（ｂ）上記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成される、操作されたガイドリボ核酸構造であって、上記操作されたガイドリボ核酸構造は：（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列と；（ｉｉ）上記エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列とを含む、操作されたガイドリボ核酸構造と、を含む。いくつかの実施形態では、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：１８２７－３６３７のいずれか１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。

【0005】

いくつかの態様では、本開示は操作されたヌクレアーゼシステムを提供し、上記操作されたヌクレアーゼシステムは：（ａ）配列番号：１８２７－３６３７のいずれか１つに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含むエンドヌクレアーゼと；（ｂ）上記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成される、操作されたガイドリボ核酸構造であって、上記操作されたガイドリボ核酸構造は：（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列と；（ｉｉ）上記エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列と、を含む、ガイドリボ核酸構造と、を含む。

【0006】

いくつかの態様では、本開示は操作されたヌクレアーゼシステムを提供し、上記操作されたヌクレアーゼシステムは：（ａ）配列番号：５５１２－５５３７を含むプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に結合するように構成されたエンドヌクレアーゼであって、ここで、上記エンドヌクレアーゼはクラス２のＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、エンドヌクレアーゼと；（ｂ）上記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成される、操作されたガイドリボ核酸構造であって、上記操作されたガイドリボ核酸構造は：（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列と；（ｉｉ）上記エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列と、を含む、操作されたガイドリボ核酸構造と、を含む。

【0007】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは難培養性微生物に由来する。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、異なるＰＡＭ配列に結合するように操作されていない。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｄエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｃエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓ１３ｄエンドヌクレアーゼではない。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに対して８０％未満の同一性を有する。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼはＨＮＨドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒリボ核酸配列は、配列番号：５４７６－５５１１および配列番号：５５３８のいずれか１つから選択される約６０～９０の連続するヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。

【0008】

いくつかの態様では、本開示は操作されたヌクレアーゼシステムを提供し、上記操作されたヌクレアーゼシステムは、（ａ）操作されたガイドリボ核酸構造であって、上記操作されたガイドリボ核酸構造は：（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列と；（ｉｉ）エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列であって、ここで、上記ｔｒａｃｒリボ核酸配列は、配列番号：５４７６－５５１１および配列番号：５５３８のいずれか１つから選択される約６０～９０の連続するヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、ｔｒａｃｒリボ核酸配列と；を含む、操作されたガイドリボ核酸構造と、（ｂ）操作されたガイドリボ核酸に結合するように構成されたクラス２のＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５１２－５５３７を含む群から選択されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に結合するように構成される。

【0009】

いくつかの実施形態では、操作されたガイドリボ核酸構造は、少なくとも２つのリボ核酸ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、操作されたガイドリボ核酸構造は、ガイドリボ核酸配列とｔｒａｃｒリボ核酸配列とを含む１つのリボ核酸ポリヌクレオチドを含む。

【0010】

いくつかの実施形態では、ガイドリボ核酸配列は、原核生物、細菌、古細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳動物、またはヒトのゲノム配列に相補的である。いくつかの実施形態では、ガイドリボ核酸配列は、１５～２４ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端の近位にある１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列番号：５５９７－５６１２から選択される配列を含む。

【0011】

いくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼシステムは、５’から３’に、標的デオキシリボ核酸配列の５’に少なくとも２０のヌクレオチドの配列を含む第１の相同性アームと、少なくとも１０のヌクレオチドの合成ＤＮＡ配列と、標的デオキシリボ核酸配列の３’に少なくとも２０のヌクレオチドの配列を含む第２の相同性アームとを含む、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ修復鋳型をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１または第２の相同性アームは、少なくとも４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１，０００のヌクレオチドの配列を含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、上記操作されたヌクレアーゼシステムは、Ｍｇ^２＋の供給源（ｓｏｕｒｃｅ）をさらに含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼおよびｔｒａｃｒリボ核酸配列は、同じ門内の別個の細菌種に由来する。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒ属に属する細菌に由来する。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ門、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ門、またはＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｌａｉｎａｂａｃｔｅｒｉａ門に属する細菌に由来する。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５９２－５５９５のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含む細菌に由来する。

【0014】

いくつかの実施形態では、ＨＮＨドメインは、配列番号：５６３８－５４６０のいずれか１つに対して少なくとも７０％または少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１－１８２６またはそれらに対して少なくとも５５％の同一性を有するその変異体を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１８２７－１８３０あるいは配列番号：１８２７－２１４０からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。

【0015】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：３６３８－３６４１あるいは配列番号：３６３８－３９５４からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５６１５－５６３２からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのペプチドモチーフを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１－４あるいは配列番号：１－３１９からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４６１－５４６４、配列番号：５４７６－５４７９、あるいは配列番号：５４７６－５４８９からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ構造は、ステムおよびループからなるヘアピンを含むと予想されるＲＮＡ配列を含み、ここで、上記ステムは、少なくとも１０、少なくとも１２、または少なくとも１４の塩基対のリボヌクレオチド、および上記ループの４つの塩基対以内の非対称バルジを含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５１２－５５１５あるいは配列番号：５５２７－５５３０からなる群から選択される配列を含むＰＡＭに結合するように構成される。

【0018】

いくつかの実施形態では、（ａ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：１８２７に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み；（ｂ）ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４６１あるいは配列番号：５４７６の少なくとも１つに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み；および（ｃ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５１２あるいは配列番号：５５２７を含むＰＡＭに結合するように構成される。いくつかの実施形態では、（ａ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：１８２８に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み；（ｂ）ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４６２あるいは配列番号：５４７７の少なくとも１つに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、あるいは少なくとも９０％同一である配列を含み；および（ｃ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５１３あるいは配列番号：５５２８を含むＰＡＭに結合するように構成される。いくつかの実施形態では、（ａ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：１８２９に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、あるいは少なくとも９０％同一である配列を含み；（ｂ）ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４６３あるいは配列番号：５４７８の少なくとも１つに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、あるいは少なくとも９０％同一である配列を含み；および、（ｃ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５１４あるいは配列番号：５５２９を含むＰＡＭに結合するように構成される。いくつかの実施形態では、（ａ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：１８３０に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、あるいは少なくとも９０％同一である配列を含み；（ｂ）ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４６４あるいは配列番号：５４７９の少なくとも１つに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、あるいは少なくとも９０％同一である配列を含み；および、（ｃ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５１５あるいは配列番号：５５３０を含むＰＡＭに結合するように構成される。

【0019】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：２１４１－２１４２あるいは配列番号：２１４１－２２４１からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：３９５５－３９５６あるいは配列番号：３９５５－４０５５からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５６３２－５６３８からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのペプチドモチーフを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：３２０－３２１あるいは配列番号：３２０－４２０からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４６５、配列番号：５４９０－５４９１、あるいは配列番号：５４９０－５４９４からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ構造は、少なくとも８、少なくとも１０、または少なくとも１２の塩基対のリボヌクレオチドを含むヘアピンを含む、ｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５１６および配列番号：５５３１からなる群から選択される配列を含むＰＡＭに結合するように構成される。いくつかの実施形態では、（ａ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：２１４１に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み；（ｂ）ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４９０に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み；および（ｃ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５３１を含むＰＡＭに結合するように構成される。いくつかの実施形態では、（ａ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：２１４２に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み；（ｂ）ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４６５あるいは配列番号：５４９１に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み；および（ｃ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５１６を含むＰＡＭに結合するように構成される。

【0020】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：２２４５－２２４６からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４０５９－４０６０からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５６３９－５６４８からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのペプチドモチーフを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４２４－４２５からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４９８－５４９９および配列番号：５５３９からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ構造は、ガイドリボ核酸配列の少なくとも８つのヌクレオチドおよびｔｒａｃｒリボ核酸配列の少なくとも８つのヌクレオチドを含む中断されていない塩基対領域を有するヘアピンを含むと予想されるガイドリボ核酸配列を含み、ここで、上記ｔｒａｃｒリボ核酸配列は、５’から３’に、第１のヘアピンと第２のヘアピンとを含み、ここで、上記第１のヘアピンは上記第２のヘアピンよりも長いステムを有する。

【0021】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：２２４２－２２４４あるいは配列番号：２２４７－２２４９からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４０５６－４０５８および配列番号：４０６１－４０６３からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５６３９－５６４８からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのペプチドモチーフを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４２１－４２３あるいは配列番号：４２６－４２８からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４６６－５４６７、配列番号：５４９５－５４９７、配列番号：５５００－５５０２、および配列番号：５５３９からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ構造は、ガイドリボ核酸配列の少なくとも８つのヌクレオチドおよびｔｒａｃｒリボ核酸配列の少なくとも８つのヌクレオチドを含む中断されていない塩基対領域を有するヘアピンを含むと予想されるガイドリボ核酸配列を含み、ここで、上記ｔｒａｃｒリボ核酸配列は、５’から３’に、第１のヘアピンと第２のヘアピンとを含み、ここで、上記第１のヘアピンは上記第２のヘアピンよりも長いステムを有する。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５１７－５５１８あるいは配列番号：５５３２－５５３４からなる群から選択される配列を含むＰＡＭに結合するように構成される。いくつかの実施形態では、（ａ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：２２４７に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み；（ｂ）ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５５００に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み；および（ｃ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５１７あるいは配列番号：５５３２を含むＰＡＭに結合するように構成される。いくつかの実施形態では、（ａ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：２２４８に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み；（ｂ）ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５５０１に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み；および（ｃ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５１８あるいは配列番号：５５３３を含むＰＡＭに結合するように構成される。いくつかの実施形態では、（ａ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：２２４９に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み；（ｂ）ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５５０２に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み；および（ｃ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５３４を含むＰＡＭに結合するように構成される。

【0022】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：２２５３あるいは配列番号：２２５３－２４８１からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４０６７あるいは配列番号：４０６７－４２９５からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５６４９のペプチドモチーフを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４３２あるいは配列番号：４３２－６６０からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４６８あるいは配列番号：５５０３からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５１９からなる群から選択される配列を含むＰＡＭに結合するように構成される。いくつかの実施形態では、（ａ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：２２５３に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み；（ｂ）ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４６８あるいは配列番号：５５０３に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み；および（ｃ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５１９を含むＰＡＭに結合するように構成される。

【0023】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：２４８２－２４８９からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４２９６－４３０３からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：６６１－６６８からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：２４９０－２４９８からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４３０４－４３１２からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：６６９－６７７からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５５０４からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。

【0024】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：２４９９あるいは配列番号：２４９９－２７５０からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４３１３あるいは配列番号：４３１３－４５６４からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５６５０－５６６７からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのペプチドモチーフを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：６７８あるいは配列番号：６７８－９２９からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４６９あるいは配列番号：５５０５に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５２０あるいは配列番号：５５３５を含むＰＡＭに結合するように構成される。いくつかの実施形態では、（ａ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：２４９９に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み；（ｂ）ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４６９あるいは配列番号：５５０５に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み；および（ｃ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５２０あるいは配列番号：５５３５を含むＰＡＭに結合するように構成される。

【0025】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：２７５１あるいは配列番号：２７５１－２９１３からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４５６５あるいは配列番号：４５６５－４７２７からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５６６８－５６７８からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのペプチドモチーフを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：９３０あるいは配列番号：９３０－１０９２からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４７０あるいは配列番号：５５０６に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５２１あるいは配列番号：５５３６からなる群から選択される配列を含むＰＡＭに結合するように構成される。いくつかの実施形態では、（ａ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：２７５１に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み；（ｂ）ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４７０あるいは配列番号：５５０６に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み；および（ｃ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５２１あるいは配列番号：５５３６を含むＰＡＭに結合するように構成される。

【0026】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：２９１４あるいは配列番号：２９１４－３１７４からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４７２８あるいは配列番号：４７２８－４９８８からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５６７６－５６７８からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのペプチドモチーフを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１０９３あるいは配列番号：１０９３－１３５３からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４７１、配列番号：５５０７、および配列番号：５５４０－５５４２からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ構造は、５つ未満の塩基対のリボヌクレオチドを含む少なくとも２つのヘアピンを含むと予想されるｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５２２を含むＰＡＭに結合するように構成される。いくつかの実施形態では、（ａ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：２９１４に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み；（ｂ）ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４７１あるいは配列番号：５５０７に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み；および（ｃ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５２２を含むＰＡＭに結合するように構成される。

【0027】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：３１７５あるいは配列番号：３１７５－３３３０からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４９８９あるいは配列番号：４９８９－５１４６からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５６７９－５６８６からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのペプチドモチーフを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１３５４あるいは配列番号：１３５４－１５１１からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４７２あるいは配列番号：５５０８からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５２３あるいは配列番号：５５３７からなる群から選択される配列を含むＰＡＭに結合するように構成される。いくつかの実施形態では、（ａ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：３１７５に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み；（ｂ）ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４７２あるいは配列番号：５５０８に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み；および（ｃ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５２３あるいは配列番号：５５３７を含むＰＡＭに結合するように構成される。

【0028】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：３３３１あるいは配列番号：３３３１－３４７４からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５１４７あるいは配列番号：５１４７－５２９０からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５６７４－５６７５および配列番号：５６８７－５６９３からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのペプチドモチーフを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１５１２あるいは配列番号：１５１２－１６５５からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４７３あるいは配列番号：５５０９からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５２４を含むＰＡＭに結合するように構成される。いくつかの実施形態では、（ａ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：３３３１に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み；（ｂ）ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４７３あるいは配列番号：５５０９に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み；および（ｃ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５２４を含むＰＡＭに結合するように構成される。

【0029】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：３４７５あるいは配列番号：３４７５－３５６８からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５２９１あるいは配列番号：５２９１－５３８９からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５６９４－５６９９からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのペプチドモチーフを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１６５６あるいは配列番号：１６５６－１７５５からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４７４あるいは配列番号：５５１０に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５２５を含むＰＡＭに結合するように構成される。いくつかの実施形態では、（ａ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：３４７５に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み；（ｂ）ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４７４あるいは配列番号：５５１０に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み；および（ｃ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５２５を含むＰＡＭに結合するように構成される。

【0030】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：３５６９あるいは配列番号：３５６９－３６３７からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５３９０あるいは配列番号：５３９０－５４６０からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは配列番号：５７００－５７１７からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのペプチドモチーフを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１７５６あるいは配列番号：１７５６－１８２６からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４７５あるいは配列番号：５５１１に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５２６を含むＰＡＭに結合するように構成される。いくつかの実施形態では、（ａ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：３５６９に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み；（ｂ）ガイドＲＮＡ構造は、配列番号：５４７５あるいは配列番号：５５１１に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％同一である配列を含み；および（ｃ）エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５２６を含むＰＡＭに結合するように構成される。いくつかの実施形態では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。いくつかの実施形態では、配列同一性は、３のｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ（Ｗ）、１０のｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ（Ｅ）のパラメータ、および１１のｅｘｉｓｔｅｎｃｅ、１のｅｘｔｅｎｓｉｏｎでギャップコストを設定するＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスのパラメータを使用して、ならびに条件付き組成スコアマトリックス調整（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）を使用して、ＢＬＡＳＴＰ相同性検索アルゴリズムによって決定される。

【0031】

いくつかの態様では、本開示は操作されたガイドリボ核酸ポリヌクレオチドを提供し、上記操作されたガイドリボ核酸ポリヌクレオチドは：（ａ）標的ＤＮＡ分子中の標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化セグメントと；（ｂ）ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）二重鎖を形成するヌクレオチドの２つの相補的なストレッチを含むタンパク質結合セグメントであって、ここで、上記ヌクレオチドの２つの相補的なストレッチは介在ヌクレオチドで互いに共有結合し、ここで、上記操作されたガイドリボ核酸ポリヌクレオチドは、配列番号：１８２７－３６３７のいずれか１つに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含むエンドヌクレアーゼと複合体を形成し、上記複合体を標的ＤＮＡ分子の標的配列に標的化するように構成される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的化セグメントは、ヌクレオチドの２つの相補的なストレッチの両方の５’に位置する。

【0032】

いくつかの実施形態では、（ａ）タンパク質結合セグメントは、配列番号：５４７６－５４７９あるいは配列番号：５４７６－５４８９からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み；（ｂ）タンパク質結合セグメントは、（配列番号：５４９０－５４９１あるいは配列番号：５４９０－５４９４）および配列番号：５５３８からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み；（ｃ）タンパク質結合セグメントは、配列番号：５４９８－５４９９からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み；（ｄ）タンパク質結合セグメントは、配列番号：５４９５－５４９７および配列番号：５５００－５５０２からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み；（ｅ）タンパク質結合セグメントは、配列番号：５５０３に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み；（ｆ）タンパク質結合セグメントは、配列番号：５５０４に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み；（ｇ）タンパク質結合セグメントは、配列番号：５５０５に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み；（ｈ）タンパク質結合セグメントは、配列番号：５５０６に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み；（ｉ）タンパク質結合セグメントは、配列番号：５５０７に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み；（ｊ）タンパク質結合セグメントは、配列番号：５５０８に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み；（ｋ）タンパク質結合セグメントは、配列番号：５５０９に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み；（ｌ）タンパク質結合セグメントは、配列番号：５５１０に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み；あるいは、（ｍ）タンパク質結合セグメントは、配列番号：５５１１に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。

【0033】

いくつかの実施形態では、（ａ）ガイドリボ核酸ポリヌクレオチドは、ステムとループとを含むヘアピンを含むＲＮＡ配列を含み、ここで、上記ステムは、少なくとも１０、少なくとも１２、または少なくとも１４の塩基対のリボヌクレオチド、および上記ループの４つの塩基対内の非対称バルジを含み；（ｂ）ガイドリボ核酸ポリヌクレオチドは、少なくとも８、少なくとも１０、または少なくとも１２の塩基対のリボヌクレオチドを含むヘアピンを含むと予想されるｔｒａｃｒリボ核酸配列を含み；（ｃ）ガイドリボ核酸ポリヌクレオチドは、ガイドリボ核酸配列の少なくとも８つのヌクレオチドとｔｒａｃｒリボ核酸配列の少なくとも８つのヌクレオチドとを含む中断されていない塩基対領域を有するヘアピンを含むと予想されるガイドリボ核酸配列を含み、ここで、上記ｔｒａｃｒリボ核酸配列は、５’から３’に、第１のヘアピンと第２のヘアピンとを含み、ここで、上記第１のヘアピンは上記第２のヘアピンよりも長いステムを有し；あるいは、（ｄ）ガイドリボ核酸ポリヌクレオチドは、５つ未満の塩基対のリボヌクレオチドを含む少なくとも２つのヘアピンを含むと予想されるｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む。

【0034】

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される操作されたガイドリボ核酸ポリヌクレオチドのいずれかをコードするデオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを提供する。

【0035】

いくつかの態様では、本開示は、生物における発現のために最適化された、操作された核酸配列を含む核酸を提供し、ここで、上記核酸は、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインとＨＮＨドメインとを含むクラス２のＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードし、ここで、上記クラス２のＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、難培養性微生物に由来する。

【0036】

いくつかの態様では、本開示は、生物における発現のために最適化された、操作された核酸配列を含む核酸を提供し、ここで、上記核酸は、配列番号：１８２７－３６３７のいずれか１つに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含むエンドヌクレアーゼをコードする。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：３６３８－５４６０のいずれか１つに対して少なくとも７０％または少なくとも８０％の配列同一性を有するＨＮＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５７２－５５９１またはそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するその変異体を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端の近位にある１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列番号：５５９７－５６１２から選択される配列を含む。

【0037】

いくつかの実施形態では、生物は、原核生物、細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳動物、げっ歯類、またはヒトである。いくつかの実施形態では、生物は大腸菌であり、および：（ａ）核酸配列は、配列番号：５５７２－５５７５からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％の同一性を有する；（ｂ）核酸配列は、配列番号：５５７６－５５７７からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％の同一性を有する；（ｃ）核酸配列は、配列番号：５５７８－５５８０からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％の同一性を有する；（ｄ）核酸配列は、配列番号：５５８１に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％の同一性を有する；（ｅ）核酸配列は、配列番号：５５８２に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％の同一性を有する；（ｆ）核酸配列は、配列番号：５５８３に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％の同一性を有する；（ｇ）核酸配列は、配列番号：５５８４に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％の同一性を有する；（ｈ）核酸配列は、配列番号：５５８５に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％の同一性を有する；（ｉ）核酸配列は、配列番号：５５８６に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％の同一性を有する；あるいは、（ｊ）核酸配列は、配列番号：５５８７に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、生物はヒトであり、および：（ａ）核酸配列は、配列番号：５５８８あるいは配列番号：５５８９に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％の同一性を有する；あるいは、（ｂ）核酸配列は、配列番号：５５９０あるいは配列番号：５５９１に対して少なくとも７０％、８０％、または９０％の同一性を有する。

【0038】

いくつかの態様では、本開示は、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインとＨＮＨドメインとを含むクラス２のＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むベクターを提供し、ここで、上記エンドヌクレアーゼは難培養性微生物に由来する。

【0039】

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される核酸のいずれかを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成される操作されたガイドリボ核酸構造をコードする核酸をさらに含み、上記操作されたガイドリボ核酸構造は：（ａ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列と；（ｂ）エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミド、ミニサークル、ＣＥＬｉＤ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来のビリオン、またはレンチウイルスである。

【0040】

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されるベクターのいずれかを含む細胞を提供する。

【0041】

いくつかの態様では、本開示は、エンドヌクレアーゼを製造する方法を提供し、上記方法は、本明細書に記載される細胞のいずれかを培養する工程を含む。

【0042】

いくつかの態様では、本開示は、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを結合、切断、標識、または修飾するための方法を提供し、上記方法は：（ａ）クラス２のＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよび上記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドに結合するように構成される操作されたガイドリボ核酸構造と複合体を形成するクラス２のＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼに、上記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを接触させる工程を含み；（ｂ）ここで、上記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含み；（ｃ）上記ＰＡＭは、配列番号：５５１２－５５２６あるいは配列番号：５５２７－５５３７からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドは、操作されたガイドリボ核酸構造の配列に相補的な配列を含む第１の鎖と、ＰＡＭを含む第２の鎖とを含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、操作されたガイドリボ核酸構造の配列に相補的な配列の３’末端に直接隣接している。

【0043】

いくつかの実施形態では、クラス２のＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｄエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｃエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓ１３ｄエンドヌクレアーゼではない。いくつかの実施形態では、クラス２のＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、難培養性微生物に由来する。いくつかの実施形態では、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドは、真核生物、植物、真菌、哺乳動物、げっ歯類、またはヒトの二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドである。

【0044】

いくつかの実施形態では、（ａ）ＰＡＭは、配列番号：５５１２－５５１５および配列番号：５５２７－５５３０からなる群から選択される配列を含む；（ｂ）ＰＡＭは配列番号：５５１６あるいは配列番号：５５３１を含む；（ｃ）ＰＡＭは配列番号：５５３９を含む；（ｄ）ＰＡＭは配列番号：５５１７あるいは配列番号：５５１８を含む；（ｅ）ＰＡＭは配列番号：５５１９を含む；（ｆ）ＰＡＭは配列番号：５５２０あるいは配列番号：５５３５を含む；（ｇ）ＰＡＭは配列番号：５５２１あるいは配列番号：５５３６を含む；（ｈ）ＰＡＭは配列番号：５５２２を含む；（ｉ）ＰＡＭは配列番号：５５２３あるいは配列番号：５５３７を含む；（ｊ）ＰＡＭは配列番号：５５２４を含む；（ｋ）ＰＡＭは配列番号：５５２５を含む；または、（ｌ）ＰＡＭは配列番号：５５２６を含む。

【0045】

いくつかの態様では、本開示は、標的核酸遺伝子座を改変するための方法を提供し、上記方法は、本明細書に記載される操作されたヌクレアーゼシステムのいずれかを上記標的核酸遺伝子座に送達する工程を含み、ここで、エンドヌクレアーゼは、操作されたガイドリボ核酸構造と複合体を形成するように構成され、ここで、上記複合体は、上記複合体が上記標的核酸遺伝子座に結合すると、上記複合体が標的核酸遺伝子座を改変するように構成される。いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座を改変することは、標的核酸遺伝子座を結合、ニッキング、切断、標識することを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、または細菌ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座はインビトロである。いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座は細胞内にある。いくつかの実施形態では、細胞は、原核細胞、細菌細胞、真核細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、霊長類細胞、またはヒト細胞である。

【0046】

いくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼシステムを標的核酸遺伝子座に送達することは、請求項１３５－１４０のいずれかに記載の核酸または請求項１４２－１４６のいずれかに記載のベクターを送達することを含む。いくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼシステムを標的核酸遺伝子座に送達することは、エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を送達することを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームが動作可能に連結されるプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座への操作されたヌクレアーゼシステムは、エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含有するキャップされたｍＲＮＡ（ｃａｐｐｅｄ ｍＲＮＡ）を送達することを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座への操作されたヌクレアーゼシステムは、翻訳されたポリペプチドを送達することを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座への操作されたヌクレアーゼシステムは、リボ核酸（ＲＮＡ）ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターに動作可能に連結される操作されたガイドリボ核酸構造をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を送達することを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、標的遺伝子座で、またはその近位で、一本鎖切断または二本鎖切断を引き起こす。

【0047】

本開示のさらなる態様および利点は、以下の詳細な説明から当業者に容易に明白となり、ここでは、本開示の例示的な実施形態のみが示され、説明されている。理解されるように、本開示は、他の実施形態および異なる実施形態においても可能であり、その様々な詳細は、そのすべてが本開示から逸脱することなく様々な明白な点で修正することができる。したがって、図面および説明は本来、例示的なものとしてみなされ、限定的なものであるとはみなされない。

【0048】

参照による組み込み
本明細書で言及される全ての出版物、特許、および特許出願は、あたかも個々の出版物、特許、または特許出願が参照によって組み込まれるよう具体的かつ個別に示されるかのように、同じ程度まで参照により本明細書に組み込まれる。

【図面の簡単な説明】

【0049】

本発明の新規な特徴は、とりわけ、添付の特許請求の範囲内に明記される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が用いられる例示的実施形態を説明する以下の詳細な説明と、以下の添付図面（本明細書では「図（”Ｆｉｇｕｒｅ”および”ＦＩＧ．”）」とも称される）とを参照することによって得られるであろう。

【0050】

【図1】様々なクラスおよび型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座の典型的な組織を示す。

【図2】両方が結合されるハイブリッドｓｇＲＮＡと比較した、天然のクラス２／ＩＩ型ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡペアの構造を示す。

【図3】ＭＧ１ファミリーからの酵素をコードするＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の構成を示す概念図を示す。

【図4】ＭＧ２ファミリーからの酵素をコードするＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の構成を示す概念図を示す。

【図5】ＭＧ３ファミリーからの酵素をコードするＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の構成を示す概念図を示す。

【図6】黄色ブドウ球菌からのＣａｓ９（配列番号：５６１３）に対する、本開示（ＭＧ１－１）の酵素の構造に基づいたアラインメントを示す。

【図7】黄色ブドウ球菌からのＣａｓ９（配列番号：５６１３）に対する、本開示（ＭＧ２－１）の酵素の構造に基づいたアラインメントを示す。

【図8】Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉからのＣａｓ９（配列番号：５６１４）に対する、本開示（ＭＧ３－１）の酵素の構造に基づいたアラインメントを示す。

【図9A】ＭＧ１ファミリー酵素ＭＧ１－１～ＭＧ１－６（配列番号：５、６、９、１、２、および３）の構造に基づいたアラインメントを示す。

【図9B】ＭＧ１ファミリー酵素ＭＧ１－１～ＭＧ１－６（配列番号：５、６、９、１、２、および３）の構造に基づいたアラインメントを示す。

【図9C】ＭＧ１ファミリー酵素ＭＧ１－１～ＭＧ１－６（配列番号：５、６、９、１、２、および３）の構造に基づいたアラインメントを示す。

【図9D】ＭＧ１ファミリー酵素ＭＧ１－１～ＭＧ１－６（配列番号：５、６、９、１、２、および３）の構造に基づいたアラインメントを示す。

【図9E】ＭＧ１ファミリー酵素ＭＧ１－１～ＭＧ１－６（配列番号：５、６、９、１、２、および３）の構造に基づいたアラインメントを示す。

【図9F】ＭＧ１ファミリー酵素ＭＧ１－１～ＭＧ１－６（配列番号：５、６、９、１、２、および３）の構造に基づいたアラインメントを示す。

【図9G】ＭＧ１ファミリー酵素ＭＧ１－１～ＭＧ１－６（配列番号：５、６、９、１、２、および３）の構造に基づいたアラインメントを示す。

【図9H】ＭＧ１ファミリー酵素ＭＧ１－１～ＭＧ１－６（配列番号：５、６、９、１、２、および３）の構造に基づいたアラインメントを示す。

【図10】様々な長さの標的化配列を含有するその対応するｓｇＲＮＡと複合体を形成するＭＧ１－４による、ＤＮＡのインビトロ切断を示す。

【図11】ＭＧ１－４とその対応するｓｇＲＮＡを使用した、大腸菌ゲノムＤＮＡの細胞切断を示す。標的スペーサーまたは非標的スペーサーと共にＭＧ１－４で形質転換された細胞の希釈系列が示される（上）；下パネルは定量化されたデータを示し、左のバーは非標的ｓｇＲＮＡを表し、右のバーは標的ｓｇＲＮＡを表す。

【図12】ヒトゲノム中の様々な位置を標的とする様々な異なる標的化配列を含有するそれらの対応するｓｇＲＮＡと一緒に、実施例１１に記載されるＭＧ１－４またはＭＧ１－６の構築物を用いたＨＥＫ細胞のトランスフェクションによって生成された細胞インデル形成を示す。

【図13】様々な長さの標的化配列を含有するその対応するｓｇＲＮＡと複合体を形成するＭＧ３－６によるＤＮＡのビトロ切断を示す。

【図14】ＭＧ３－７とその対応するｓｇＲＮＡを使用した、大腸菌ゲノムＤＮＡの細胞切断を示す。標的スペーサーまたは非標的スペーサーと共にＭＧ３－７で形質転換された細胞の希釈系列が示される（上）；下パネルは定量化されたデータを示し、左のバーは非標的ｓｇＲＮＡを表し、右のバーは標的ｓｇＲＮＡを表す。

【図15】ヒトゲノム中の様々な位置を標的とする様々な異なる標的化配列を含有するそれらの対応するｓｇＲＮＡと一緒に、実施例１３に記載されるＭＧ３－７の構築物を用いたＨＥＫ細胞のトランスフェクションによって生成された細胞インデル形成を示す。

【図16】様々な長さの標的化配列を含有するその対応するｓｇＲＮＡと複合体を形成するＭＧ１５－１によるＤＮＡのインビトロ切断を示す。

【図17】アガロースゲルを示し、これは、様々なＭＧファミリーのヌクレアーゼおよびそれらの対応するｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを含有するＴＸＴＬ抽出物の存在下でのＰＡＭベクターライブラリー切断の結果を示す。

【図18】アガロースゲルを示し、これは、様々なＭＧファミリーのヌクレアーゼおよびそれらの対応するｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを含有するＴＸＴＬ抽出物の存在下でのＰＡＭベクターライブラリー切断の結果を示す。

【図19】アガロースゲルを示し、これは、様々なＭＧファミリーのヌクレアーゼおよびそれらの対応するｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを含有するＴＸＴＬ抽出物の存在下でのＰＡＭベクターライブラリー切断の結果を示す。

【図20】アガロースゲルを示し、これは、様々なＭＧファミリーのヌクレアーゼおよびそれらの対応するｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを含有するＴＸＴＬ抽出物の存在下でのＰＡＭベクターライブラリー切断の結果を示す。

【図21】本明細書に記載されるＭＧ酵素の対応するｓｇＲＮＡの予想される構造（例えば、実施例７でのように予想される）を示す。

【図22】本明細書に記載されるＭＧ酵素の対応するｓｇＲＮＡの予想される構造（例えば、実施例７でのように予想される）を示す。

【図23】本明細書に記載されるＭＧ酵素の対応するｓｇＲＮＡの予想される構造（例えば、実施例７でのように予想される）を示す。

【図24】本明細書に記載されるＭＧ酵素の対応するｓｇＲＮＡの予想される構造（例えば、実施例７でのように予想される）を示す。

【図25】本明細書に記載されるＭＧ酵素の対応するｓｇＲＮＡの予想される構造（例えば、実施例７でのように予想される）を示す。

【図26】本明細書に記載されるＭＧ酵素の対応するｓｇＲＮＡの予想される構造（例えば、実施例７でのように予想される）を示す。

【図27】本明細書に記載される（例えば、実施例６に記載される）ＮＧＳを介して導き出されたＰＡＭ配列のｓｅｑＬｏｇｏ表現を示す。

【図28】本明細書に記載される（例えば、実施例６に記載される）ＮＧＳを介して導き出されたＰＡＭ配列のｓｅｑＬｏｇｏ表現を示す。

【図29】本明細書に記載される（例えば、実施例６に記載される）ＮＧＳを介して導き出されたＰＡＭ配列のｓｅｑＬｏｇｏ表現を示す。

【図30】本明細書に記載される（例えば、実施例６に記載される）ＮＧＳを介して導き出されたＰＡＭ配列のｓｅｑＬｏｇｏ表現を示す。

【図31】本明細書に記載される（例えば、実施例６に記載される）ＮＧＳを介して導き出されたＰＡＭ配列のｓｅｑＬｏｇｏ表現を示す。

【図32】本明細書に記載される（例えば、実施例６に記載される）ＮＧＳを介して導き出されたＰＡＭ配列のｓｅｑＬｏｇｏ表現を示す。

【図33】本明細書に記載される（例えば、実施例６に記載される）ＮＧＳを介して導き出されたＰＡＭ配列のｓｅｑＬｏｇｏ表現を示す。

【図34】ＭＧ２－７とその対応するｓｇＲＮＡを使用した、大腸菌ゲノムＤＮＡの細胞切断を示す。標的スペーサーまたは非標的スペーサーと共にＭＧ２－７で形質転換された細胞の希釈系列が示される（上）；下パネルは定量化されたデータを示し、右のバーは非標的ｓｇＲＮＡを表し、左のバーは標的ｓｇＲＮＡを表す。

【図35】ＭＧ１４－１とその対応するｓｇＲＮＡを使用した、大腸菌ゲノムＤＮＡの細胞切断を示す。標的スペーサーまたは非標的スペーサーと共にＭＧ１４－１で形質転換された細胞の希釈系列が示される（上）；下パネルは定量化されたデータを示し、右のバーは非標的ｓｇＲＮＡを表し、左のバーは標的ｓｇＲＮＡを表す。

【図36】ＭＧ１５－１とその対応するｓｇＲＮＡを使用した、大腸菌ゲノムＤＮＡの細胞切断を示す。標的スペーサーまたは非標的スペーサーと共にＭＧ１５－１で形質転換された細胞の希釈系列が示される（上）；下パネルは定量化されたデータを示し、右のバーは非標的ｓｇＲＮＡを表し、左のバーは標的ｓｇＲＮＡを表す。

【0051】

配列表の簡単な説明
本明細書とともに出願された配列表は、本開示の方法、組成物、およびシステムで使用される例示的なポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を提供する。以下は配列表における配列の例示的な説明である。

【0052】

ＭＧ１

【0053】

配列番号：１－３１９は、ＭＧ１ヌクレアーゼの完全長ペプチド配列を示す。

【0054】

配列番号：１８２７－２１４０は、上記のＭＧ１ヌクレアーゼのＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインのペプチド配列を示す。

【0055】

配列番号：３６３８－３９５５は、上記のＭＧ１ヌクレアーゼのＨＮＨドメインのペプチドを示す。

【0056】

配列番号：５４７６－５４７９は、上記のＭＧ１ヌクレアーゼと同じ遺伝子座（例えば、それぞれ配列番号：１－４と同じ遺伝子座）に由来するＭＧ１ ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。

【0057】

配列番号：５４６１－５４６４は、ＭＧ１ヌクレアーゼ（例えば、それぞれ配列番号：１－４）と機能するように操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示し、ここで、Ｎｓは標的化配列のヌクレオチドを表示する。

【0058】

配列番号：５５７２－５５７５は、ＭＧ１ファミリー酵素（配列番号：１－４）の大腸菌のコドン最適化コード配列のヌクレオチド配列を示す。

【0059】

配列番号：５５８８－５５８９は、ＭＧ１ファミリー酵素（配列番号：１および３）のヒトのコドン最適化コード配列のヌクレオチド配列を示す。

【0060】

配列番号：５６１６－５６３２は、ＭＧ１ファミリー酵素のペプチドモチーフ特性を示す。

【0061】

ＭＧ２

【0062】

配列番号：３２０－４２０は、ＭＧ２ヌクレアーゼの完全長ペプチド配列を示す。

【0063】

配列番号：２１４１－２２４１は、上記のＭＧ２ヌクレアーゼのＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインのペプチド配列を示す。

【0064】

配列番号：３９５５－４０５５は、上記のＭＧ２ヌクレアーゼのＨＮＨドメインのペプチドを示す。

【0065】

配列番号：５４９０－５４９４は、上記のＭＧ２ヌクレアーゼと同じ遺伝子座（例えば、それぞれ配列番号：３２０、３２１、３２３、３２５、および３２６と同じ遺伝子座）に由来するＭＧ２ ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。

【0066】

配列番号：５４６５は、ＭＧ２ヌクレアーゼ（例えば、上記の配列番号：３２１）と機能するように操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。

【0067】

配列番号：５５７２－５５７５は、ＭＧ２ファミリー酵素の大腸菌のコドン最適化コード配列のヌクレオチド配列を示す。

【0068】

配列番号：５６３１－５６３８は、ＭＧ２ファミリー酵素のペプチド配列特性を示す。

【0069】

ＭＧ３

【0070】

配列番号：４２１－４３１は、ＭＧ３ヌクレアーゼの完全長ペプチド配列を示す。

【0071】

配列番号：２２４２－２２５１は、上記のＭＧ３ヌクレアーゼのＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインのペプチド配列を示す。

【0072】

配列番号：４０５６－４０６６は、上記のＭＧ３ヌクレアーゼのＨＮＨドメインのペプチドを示す。

【0073】

配列番号：５４９５－５５０２は、上記のＭＧ３ヌクレアーゼと同じ遺伝子座（例えば、それぞれ配列番号：４２１－４２８と同じ遺伝子座）に由来するＭＧ３ ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。

【0074】

配列番号：５４６６－５４６７は、ＭＧ３ヌクレアーゼ（例えば、配列番号：４２１－４２３）と機能するように操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。

【0075】

配列番号：５５７８－５５８０は、ＭＧ３ファミリー酵素の大腸菌のコドン最適化コード配列のヌクレオチド配列を示す。

【0076】

配列番号：５６３９－５６４８は、ＭＧ３ファミリー酵素のペプチド配列特性を示す。

【0077】

ＭＧ４

【0078】

配列番号：４３２－６６０は、ＭＧ４ヌクレアーゼの完全長ペプチド配列を示す。

【0079】

配列番号：２２５３－２４８１は、上記のＭＧ４ヌクレアーゼのＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインのペプチド配列を示す。

【0080】

配列番号：４０６７－４２９５は、上記のＭＧ４ヌクレアーゼのＨＮＨドメインのペプチドを示す。

【0081】

配列番号：５５０３は、上記のＭＧ４ヌクレアーゼと同じ遺伝子座に由来するＭＧ４ ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。

【0082】

配列番号：５４６８は、ＭＧ４ヌクレアーゼと機能するように操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。

【0083】

配列番号：５６４９は、ＭＧ４ファミリー酵素のペプチド配列特性を示す。

【0084】

ＭＧ６

【0085】

配列番号：６６１－６６８は、ＭＧ６ヌクレアーゼの完全長ペプチド配列を示す。

【0086】

配列番号：２４８２－２４８９は、上記のＭＧ６ヌクレアーゼのＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインのペプチド配列を示す。

【0087】

配列番号：４２９６－４３０３は、上記のＭＧ３ヌクレアーゼのＨＮＨドメインのペプチドを示す。

【0088】

ＭＧ７

【0089】

配列番号：６６９－６７７は、ＭＧ７ヌクレアーゼの完全長ペプチド配列を示す。

【0090】

配列番号：２４９０－２４９８は、上記のＭＧ７ヌクレアーゼのＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインのペプチド配列を示す。

【0091】

配列番号：４３０４－４３１２は、上記のＭＧ３ヌクレアーゼのＨＮＨドメインのペプチドを示す。

【0092】

配列番号：５５０４は、上記のＭＧ７ヌクレアーゼと同じ遺伝子座に由来するＭＧ７ ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。

【0093】

ＭＧ１４配列番号：６７８－９２９は、ＭＧ１４ヌクレアーゼの完全長ペプチド配列を示す。

【0094】

配列番号：２４９９－２７５０は、上記のＭＧ１４ヌクレアーゼのＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインのペプチド配列を示す。

【0095】

配列番号：４３１３－４５６４は、上記のＭＧ１４ヌクレアーゼのＨＮＨドメインのペプチドを示す。

【0096】

配列番号：５５０５は、上記のＭＧ１４ヌクレアーゼと同じ遺伝子座に由来するＭＧ１４ ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。

【0097】

配列番号：５５８１は、ＭＧ１４ファミリー酵素の大腸菌のコドン最適化コード配列のヌクレオチド配列を示す。

【0098】

配列番号：５６５０－５６６７は、ＭＧ１４ファミリー酵素のペプチド配列特性を示す。

【0099】

ＭＧ１５

【0100】

配列番号：９３０－１０９２は、ＭＧ１５ヌクレアーゼの完全長ペプチド配列を示す。

【0101】

配列番号：２７５１－２９１３は、上記のＭＧ１５ヌクレアーゼのＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインのペプチド配列を示す。

【0102】

配列番号：４５６５－４７２７は、上記のＭＧ１５ヌクレアーゼのＨＮＨドメインのペプチドを示す。

【0103】

配列番号：５５０６は、上記のＭＧ１５ヌクレアーゼと同じ遺伝子座に由来するＭＧ１５ ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。

【0104】

配列番号：５４７０は、ＭＧ１５ヌクレアーゼと機能するように操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。

【0105】

配列番号：５５８２は、ＭＧ１５ファミリー酵素の大腸菌のコドン最適化コード配列のヌクレオチド配列を示す。

【0106】

配列番号：５６６８－５６７５は、ＭＧ１５ファミリー酵素のペプチド配列特性を示す。

【0107】

ＭＧ１６

【0108】

配列番号：１０９３－１３５３は、ＭＧ１６ヌクレアーゼの完全長ペプチド配列を示す。

【0109】

配列番号：２９１４－３１７４は、上記のＭＧ１６ヌクレアーゼのＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインのペプチド配列を示す。

【0110】

配列番号：４７２８－４９８８は、上記のＭＧ１６ヌクレアーゼのＨＮＨドメインのペプチドを示す。

【0111】

配列番号：５５０７は、上記のＭＧ３ヌクレアーゼと同じ遺伝子座に由来するＭＧ１６ ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。

【0112】

配列番号：５４７１は、ＭＧ１６ヌクレアーゼと機能するように操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。

【0113】

配列番号：５５８３は、ＭＧ１６ファミリー酵素の大腸菌のコドン最適化コード配列のヌクレオチド配列を示す。

【0114】

配列番号：５６７６－５６７８は、ＭＧ１６ファミリー酵素のペプチド配列特性を示す。

【0115】

ＭＧ１８

【0116】

配列番号：１３５４－１５１１は、ＭＧ１８ヌクレアーゼの完全長ペプチド配列を示す。

【0117】

配列番号：３１７５－３３３０は、上記のＭＧ１８ヌクレアーゼのＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインのペプチド配列を示す。

【0118】

配列番号：４９８９－５１４６は、上記のＭＧ１８ヌクレアーゼのＨＮＨドメインのペプチドを示す。

【0119】

配列番号：５５０８は、上記のＭＧ１８ヌクレアーゼと同じ遺伝子座に由来するＭＧ１８ ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。

【0120】

配列番号：５４７２は、ＭＧ１８ヌクレアーゼと機能するように操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。

【0121】

配列番号：５５８４は、ＭＧ１８ファミリー酵素の大腸菌のコドン最適化コード配列のヌクレオチド配列を示す。

【0122】

配列番号：５６７９－５６８６は、ＭＧ１８ファミリー酵素のペプチド配列特性を示す。

【0123】

ＭＧ２１

【0124】

配列番号：１５１２－１６５５は、ＭＧ２１ヌクレアーゼの完全長ペプチド配列を示す。

【0125】

配列番号：３３３１－３４７４は、上記のＭＧ２１ヌクレアーゼのＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインのペプチド配列を示す。

【0126】

配列番号：５１４７－５２９０は、上記のＭＧ２１ヌクレアーゼのＨＮＨドメインのペプチドを示す。

【0127】

配列番号：５５０９は、上記のＭＧ２１ヌクレアーゼと同じ遺伝子座に由来するＭＧ２１ ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。

【0128】

配列番号：５４７３は、ＭＧ２１ヌクレアーゼと機能するように操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。

【0129】

配列番号：５５８５は、ＭＧ２１ファミリー酵素の大腸菌のコドン最適化コード配列のヌクレオチド配列を示す。

【0130】

配列番号：５６８７－５６９２および５６７４－５６７５は、ＭＧ２１ファミリー酵素のペプチド配列特性を示す。

【0131】

ＭＧ２２

【0132】

配列番号：１６５６－１７５５は、ＭＧ２２ヌクレアーゼの完全長ペプチド配列を示す。

【0133】

配列番号：３４７５－３５６８は、上記のＭＧ２２ヌクレアーゼのＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインのペプチド配列を示す。

【0134】

配列番号：５２９１－５３８９は、上記のＭＧ２２ヌクレアーゼのＨＮＨドメインのペプチドを示す。

【0135】

配列番号：５５１０は、上記のＭＧ２２ヌクレアーゼと同じ遺伝子座に由来するＭＧ２２ ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。

【0136】

配列番号：５４７４は、ＭＧ２２ヌクレアーゼと機能するように操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。

【0137】

配列番号：５５８６は、ＭＧ２２ファミリー酵素の大腸菌のコドン最適化コード配列のヌクレオチド配列を示す。

【0138】

配列番号：５６９４－５６９９は、ＭＧ２２ファミリー酵素のペプチド配列特性を示す。

【0139】

ＭＧ２３

【0140】

配列番号：１７５６－１８２６は、ＭＧ２３ヌクレアーゼの完全長ペプチド配列を示す。

【0141】

配列番号：３５６９－３６３７は、上記のＭＧ２３ヌクレアーゼのＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインのペプチド配列を示す。

【0142】

配列番号：５３９０－５４６０は、上記のＭＧ２３ヌクレアーゼのＨＮＨドメインのペプチドを示す。

【0143】

配列番号：５５１１は、上記のＭＧ２３ヌクレアーゼと同じ遺伝子座に由来するＭＧ２３ ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。

【0144】

配列番号：５４７５は、ＭＧ２３ヌクレアーゼと機能するように操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。

【0145】

配列番号：５５８７は、ＭＧ２３ファミリー酵素の大腸菌のコドン最適化コード配列のヌクレオチド配列を示す。

【0146】

配列番号：５７００－５７１７は、ＭＧ２３ファミリー酵素のペプチド配列特性を示す。

【発明を実施するための形態】

【0147】

本発明の様々な実施形態が本明細書中で示され、かつ説明されているが、このような実施形態はほんの一例として提供されるものであることは、当業者には明らかであろう。多数の変形、変更、および置き換えは、本発明から逸脱することなく、当業者によって想到され得る。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が利用され得ることを理解されたい。

【0148】

本明細書で開示されるいくつかの方法の実施は、特段の定めのない限り、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、および組換えＤＮＡの技術を利用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（２０１０）））（これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0149】

本明細書で使用されるように、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上他の意味を明白に示すものでない限り、同様に複数形を含むことを意図している。さらに、用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「含んだ（ｗｉｔｈ）」、または、その変異形態が詳細な記載および／または請求項のいずれかで使用される程度には、上記のような用語は「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」との用語に類似する手法で包括的であることを意図している。

【0150】

「約」または「およそ」との用語は、当業者によって決定されるような特定の値の許容可能な誤差範囲内であることを意味し、その誤差範囲は、その値がどのように測定または決定されるか、つまり、測定システムの制限に部分的に依存する。例えば、「約」とは、当該技術分野での実践につき１または１を超える標準偏差を意味し得る。代替的に、「約」は、任意の値の最大２０％、最大１５％、最大１０％、最大５％、または最大１％の範囲を意味する場合がある。

【0151】

本明細書で使用されるように、「細胞」とは一般に、生体細胞を指す。細胞は、生体の基本構造単位、機能単位、および／または生物学的単位であり得る。細胞は、１つ以上の細胞を有する任意の生物に起源を持つ場合がある。いくつかの非限定的な例としては、原核細胞、真核細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単一細胞の真核生物の細胞、原生動物細胞、植物の細胞（例えば、作物、果物、野菜、穀類、ダイズ、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、小麦、種子、トマト、イネ、キャッサバ、サトウキビ、カボチャ、干し草、ジャガイモ、綿、アサ、タバコ、顕花植物、針葉樹、裸子植物、シダ、ヒカゲノカズラ類、ツノゴケ類、苔類、蘚類の細胞）、藻細胞（例えば、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｐａｔｅｎｓ Ｃ．Ａｇａｒｄｈなど）、海草（例えば、ケルプ）、真菌細胞（例えば、酵母菌細胞、キノコからの細胞）、動物細胞、無脊髄動物（例えば、ショウジョウバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫など）の細胞、脊椎動物（例えば、魚、両生類、爬虫類、鳥、哺乳動物）の細胞、哺乳動物（例えば、ブタ、雌ウシ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯類、ラット、マウス、非ヒト霊長類、ヒトなど）の細胞などが挙げられる。細胞は、天然の生物に起源を持たないこともある（例えば、細胞は合成的に作られ、人工細胞と呼ばれることもある）。

【0152】

「ヌクレオチド」との用語は、本明細書で使用されるように、一般に、塩基－糖－リン酸塩の組み合わせを指す。ヌクレオチドは合成ヌクレオチドを含むことがある。ヌクレオチドは合成ヌクレオチドアナログを含むことがある。ヌクレオチドは、核酸配列（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ））の単量体単位である場合がある。ヌクレオチドとの用語には、リボヌクレオシド三リン酸アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シトシン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはそれらの誘導体が含まれ得る。そのような誘導体は、例えば、［αＳ］ｄＡＴＰ、７－デアザ－ｄＧＴＰおよび７－デアザ－ｄＡＴＰ、および、それらを含有する核酸分子にヌクレアーゼ耐性を与えるヌクレオチド誘導体を含む場合がある。ヌクレオチドとの用語は、本明細書に使用されるように、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）およびそれらの誘導体を指し得る。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の例示的な例としては、限定されないが、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴＰが挙げられ得る。ヌクレオチドは標識されない場合があるか、または、光学的に検出可能な部分（例えば、フルオロフォア）を含む部分を使用するなどして、検出できるように標識される場合がある。標識化はまた、量子ドットを用いて実施されてもよい。検出可能な標識としては、例えば、放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、および酵素標識が挙げられ得る。ヌクレオチドの蛍光標識としては、限定されないが、フルオレセイン、５－カルボキシフルオセイン（ＦＡＭ）、２’７’－ジメトキシ－４’５－ジクロロ－６－カルボキシフルオセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、６－カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、４－（４’ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、シアニン、および５－（２’－アミノエチル）アミノナフタレン－１－スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）が挙げられ得る。蛍光標識されたヌクレオチドの特定の例としては、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ）から利用可能な［Ｒ６Ｇ］ｄＵＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＵＴＰ、［Ｒ１１０］ｄＣＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＣＴＰ、［ＪＯＥ］ｄｄＡＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄｄＡＴＰ、［ＦＡＭ］ｄｄＣＴＰ、［Ｒ１１０］ｄｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、［ＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ、［ｄＲ６Ｇ］ｄｄＡＴＰ、［ｄＲ１１０］ｄｄＣＴＰ、［ｄＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、および［ｄＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ；Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉｌｌ）から利用可能なＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ ＤｅｏｘｙＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ３－ｄＣＴＰ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５－ｄＣＴＰ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｆｌｕｏｒ Ｘ－ｄＣＴＰ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ３－ｄＵＴＰ、およびＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５－ｄＵＴＰ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）から利用可能なフルオレセイン－１５－ｄＡＴＰ、フルオレセイン－１２－ｄＵＴＰ、テトラメチル－ｒｏｄａｍｉｎｅ－６－ｄＵＴＰ、ＩＲ７７０－９－ｄＡＴＰ、フルオレセイン－１２－ｄｄＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ＵＴＰ、およびフルオレセイン－１５－２’－ｄＡＴＰ；および、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ）から利用可能なＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ－４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ－１４－ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ－１４－ｄＵＴＰ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ－７－ＵＴＰ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ－７－ｄＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ｄＵＴＰ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８－５－ｄＵＴＰ、ローダミン Ｇｒｅｅｎ－５－ＵＴＰ、ローダミン Ｇｒｅｅｎ－５－ｄＵＴＰ、テトラメチルローダミン６－ＵＴＰ、テトラメチルローダミン６－ｄＵＴＰ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ－５－ＵＴＰ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ－５－ｄＵＴＰ、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄ－１２－ｄＵＴＰが挙げられ得る。ヌクレオチドも化学修飾によって標識（ｌａｂｅｌｅｄ）または標識（ｍａｒｋｅｄ）され得る。化学的に修飾された単一ヌクレオチドはビオチンｄＮＴＰである場合がある。ビオチン化されたｄＮＴＰのいくつかの非限定的な例としては、ビオチン－ｄＡＴＰ（例えば、ｂｉｏ－Ｎ６－ｄｄＡＴＰ、ｂｉｏｔｉｎ－１４－ｄＡＴＰ）、ビオチン－ｄＣＴＰ（例えば、ビオチン－１１－ｄＣＴＰ、ビオチン－１４－ｄＣＴＰ）、およびビオチン－ｄＵＴＰ（例えば、ビオチン－１１－ｄＵＴＰ、ビオチン－１６－ｄＵＴＰ、ビオチン－２０－ｄＵＴＰ）が挙げられ得る。

【0153】

「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」との用語は、一般に、一本鎖、二本鎖、あるいは多重鎖（ｍｕｌｔｉ－ｓｔｒａｎｄｅｄ）の形態のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドの高分子形態（（デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか）、またはそのアナログを指すために交換可能に使用される。ポリヌクレオチドは、細胞に対して外因性または内因性であり得る。ポリヌクレオチドは、無細胞環境に存在することがある。ポリヌクレオチドは、遺伝子またはその断片であることがある。ポリヌクレオチドはＤＮＡであることがある。ポリヌクレオチドはＲＮＡであることがある。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造も有していてもよく、任意の機能を実施してもよい。ポリヌクレオチドは、１つ以上のアナログ（例えば、改変された骨格、糖、または核酸塩基）を含むことがある。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する改変は、ポリマーのアセンブリの前または後で与えられ得る。アナログのいくつかの非限定的な例としては、５－ブロモウラシル、ペプチド核酸、ｘｅｎｏ核酸、モルフォリノ、ロックド核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、ジデオキシヌクレオチド、コルジセピン、７－デアザ－ＧＴＰ、フルオロフォア（例えば、糖に結合したローダミンまたはフルオレセイン）、ヌクレオチドを含有するチオール、ビオチン結合ヌクレオチド、蛍光塩基アナログ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｂａｓｅ ａｎａｌｏｇｓ）、ＣｐＧアイランド、メチル－７－グアノシン、メチル化ヌクレオチド、イノシン、チオウリジン、シュードウリジン（ｐｓｅｕｄｏｕｒｄｉｎｅ）、ジヒドロウリジン、キューオシン、およびワイオシンが挙げられる。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子あるいは遺伝子断片のコード領域あるいは非コード領域、連鎖解析から定義された遺伝子座、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む無細胞のポリヌクレオチド、および無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断される場合がある。

【0154】

「トランスフェクション」または「トランスフェクトされた」との用語は、一般に、非ウイルスベースの方法あるいはウイルスベースの方法によって、核酸を細胞内に導入することを指す。核酸分子は、完全タンパク質あるいはその機能性部分をコードする遺伝子配列であり得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１８．１－１８．８８を参照されたい。

【0155】

「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」との用語は、一般に、ペプチド結合によって結合された少なくとも２つのアミノ酸残基のポリマーを指すために、本明細書において交換可能に使用される。この用語は、ポリマーの特定の長さを暗示せず、また、ペプチドが組換え技術、化学的合成あるいは酵素的合成を使用して産生されるか、または天然に存在するかを暗示または識別することを意図しない。この用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマー、ならびに、少なくとも１つの修飾されたアミノ酸を含むアミノ酸ポリマーに適用される。場合によっては、ポリマーが非アミノ酸によって中断される場合がある。この用語には、完全長のタンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖、ならびに、２次構造および／または３次構造（例えば、ドメイン）を有するまたは有していないタンパク質が含まれる。この用語はまた、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質修飾、アセチル化、リン酸化、酸化、および他の操作、例えば、標識化成分とのコンジュゲートによって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。「アミノ酸」との用語は、本明細書で使用されるように、一般に、天然アミノ酸、および、修飾されたアミノ酸およびアミノ酸アナログを含む非天然アミノ酸を指す。修飾されたアミノ酸は、天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含むことがあり、これは自然に存在しない基あるいは化学的部分をアミノ酸上に含むように化学的に修飾されている。アミノ酸アナログはアミノ酸誘導体を指すこともある。「アミノ酸」との用語には、Ｄ－アミノ酸とＬ－アミノ酸の両方が含まれる。

【0156】

本明細書で使用されるように、「非天然」とは、一般に、天然の核酸またはタンパク質では見られない核酸またはポリペプチド配列を指す。非天然はアフィニティータグを指すことがある。非天然は融合を指すことがある。非天然は、突然変異、挿入、および／または欠失を含む天然に存在する核酸またはポリペプチド配列を指すことがある。非天然の配列は、非天然の配列が融合される核酸および／またはポリペプチド配列によって示される可能性がある活性（例えば、酵素活性、メチルトランスフェラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性など）を示す、および／またはコードする場合がある。非天然の核酸またはポリペプチド配列は、遺伝子操作によって、天然に存在する核酸またはポリペプチド配列（あるいは、その変異体）に結合され、キメラ核酸、および／または、キメラ核酸ならびに／あるいはポリペプチドをコードするポリペプチド配列を生成する場合がある。

【0157】

「プロモーター」との用語は、本明細書で使用されるように、一般に、遺伝子の転写または発現を制御する調節ＤＮＡ領域を指し、ＲＮＡ転写が開始されるヌクレオチドあるいはヌクレオチドの領域に隣接または重複して位置する場合がある。プロモーターは、しばしば転写因子とも呼ばれる、タンパク質因子に結合する特異的ＤＮＡ配列を含有する場合があり、これは、ＤＮＡへのＲＮＡポリメラーゼの結合を促進し、遺伝子転写を引き起こす。「コアプロモーター」とも呼ばれる「基本プロモーター」は、一般に、動作可能に連結されたポリヌクレオチドの転写発現を促進するために必要な基本的な要素をすべて含有しているプロモーターを指す。真核生物の基本プロモーターは典型的に、必ずしもそうとは限らないが、ＴＡＴＡボックスおよび／またはＣＡＡＴボックスを含有している。

【0158】

「発現」との用語は、本明細書で使用されるように、一般に、ＤＮＡ鋳型から核酸配列またはポリヌクレオチドが（ｍＲＮＡあるいは他のＲＮＡ転写物などに）転写されるプロセス、および／または、転写されたｍＲＮＡがその後、ペプチド、ポリペプチド、あるいはタンパク質へと翻訳されるプロセスを指す。転写産物およびコードされたポリペプチドは、まとめて「遺伝子産物」と呼ばれることがある。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含むことがある。

【0159】

本明細書で使用されるように、「動作可能に連結する」、「動作可能な連結」、または「動作可能なように連結する」、またはその文法的等価物は一般に、遺伝要素、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列などの並置を指し、これらの要素は、それらが予期された方法で動作することを可能にする関係にある。例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー配列を含み得る調節エレメントは、その調節エレメントがコード配列の転写を始めるのを支援する場合、コード領域に動作可能に連結される。この機能的関係が維持される限り、調節エレメントとコード領域の間に介在する残基が存在する場合がある。

【0160】

「ベクター」とは、本明細書で使用されるように、一般に、ポリヌクレオチドを含むか、あるいはポリヌクレオチドと会合する高分子または高分子の集合体（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を指し、細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介するために使用され得る。ベクターの例としては、プラスミド、ウイルスベクター、リポソーム、および他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。ベクターは一般に、標的中の遺伝子の発現を促進するために遺伝子に動作可能に連結された遺伝エレメント、例えば、調節エレメントを含む。

【0161】

本明細書で使用されるように、「発現カセット」および「核酸カセット」は一般に、ともに発現されるか、あるいは発現のために動作可能に連結される核酸配列または要素の組み合わせを指すために交換可能に使用される。場合によっては、発現カセットは、調節エレメントと、それらが発現のために動作可能に連結される遺伝子との組み合わせを指す。

【0162】

ＤＮＡまたはタンパク質配列の「機能的断片」とは一般に、完全長のＤＮＡまたはタンパク質配列の生物学的活性に実質的に類似する生物学的活性（機能的または構造的）を保持する断片を指す。ＤＮＡ配列の生物学的活性は、完全長の配列に起因すると知られている様式で発現に影響を与えるその能力であり得る。

【0163】

本明細書で使用されるように、「操作された」対象は一般に、その対象がヒトの介入によって改変されていることを示す。非限定的な例によると、核酸は、その配列を自然界で生じない配列に変更することによって改変される場合がある；核酸は、ライゲーションされた産物がもとの核酸には存在しない機能を保有するように、その核酸を、その核酸が自然界では会合しない核酸にライゲーションすることによって改変される場合がある；操作された核酸は、自然界では存在しない配列とインビトロで合成される場合がある；タンパク質は、そのアミノ酸配列を自然界では存在しない配列に変更することによって改変される場合がある；操作されたタンパク質は、新しい機能あるいは特性を得る場合がある。「操作された」システムは、少なくとも１つの操作された構成要素を含む。

【0164】

本明細書で使用されるように、「合成」および「人工」は、天然に存在するヒトタンパク質に対して低い配列同一性（例えば、５０％未満の配列同一性、２５％未満の配列同一性、１０％未満の配列同一性、５％未満の配列同一性、１％未満の配列同一性）を有するタンパク質またはそのドメインを指すために交換可能に使用される。例えば、ＶＰＲとＶＰ６４のドメインは、合成トランス活性化ドメインである。

【0165】

「ｔｒａｃｒＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒ配列」との用語は、本明細書で使用されるように、一般に、野生型の例示的なｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、黄色ブドウ球菌などからのｔｒａｃｒＲＮＡ、または配列番号：５４７６－５５１１）に対して少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する核酸、および／またはその野生型の例示的なｔｒａｃｒＲＮＡ配列に類似する配列を指す場合がある。ｔｒａｃｒＲＮＡは、野生型の例示的なｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、黄色ブドウ球菌などからのｔｒａｃｒＲＮＡ）に対して最大で約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、あるいは１００％の配列同一性を有する核酸、および／またはその野生型の例示的なｔｒａｃｒＲＮＡ配列に類似する配列を指す場合がある。ｔｒａｃｒＲＮＡは、欠失、挿入、または置換などのヌクレオチド変化、変異体、突然変異、あるいはキメラを含む、ｔｒａｃｒＲＮＡの改変された形態を指す場合がある。ｔｒａｃｒＲＮＡは、少なくとも６つの連続するヌクレオチドのストレッチにわたって、野生型の例示的なｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、黄色ブドウ球菌などからのｔｒａｃｒＲＮＡ）配列に対して少なくとも約６０％同一である核酸を指す場合がある。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６つの連続するヌクレオチドのストレッチにわたって、野生型の例示的なｔｒａｃｒＲＮＡ（例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、黄色ブドウ球菌などからのｔｒａｃｒＲＮＡ）配列に対して少なくとも約６０％同一、少なくとも約６５％同一、少なくとも約である７０％同一、少なくとも約である７５％同一、少なくとも約である８０％同一、少なくとも約である８５％同一、少なくとも約である９０％同一、少なくとも約である９５％同一、少なくとも約である９８％、少なくとも約９９％同一、または１００％同一である場合がある。ＩＩ型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、隣接したＣＲＩＳＰＲアレイ中の反復配列の一部に相補性を有する領域を同定することによって、ゲノム配列上で予測することができる。

【0166】

本明細書で使用されるように、「ガイド核酸」は一般に、別の核酸にハイブリダイズすることができる核酸を指す場合がある。ガイド核酸はＲＮＡであることがある。ガイド核酸はＤＮＡであることがある。ガイド核酸は、核酸の配列に部位特異的に結合するようにプログラムされてもよい。標的とされた核酸または標的核酸は、ヌクレオチドを含むことがある。ガイド核酸はヌクレオチドを含むことがある。標的核酸の一部は、ガイド核酸の一部に相補的であり得る。ガイド核酸に相補的であり、そのガイド核酸とハイブリダイズする二本鎖標的ポリヌクレオチドの鎖は、相補鎖と呼ばれることがある。相補鎖に相補的であり、したがって、ガイド核酸に相補的でない場合がある二本鎖標的ポリヌクレオチドの鎖は、非相補鎖（ｎｏｎｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｎｄ）と呼ばれることがある。ガイド核酸は、１つのポリヌクレオチド鎖を含む場合があり、「単一ガイド核酸（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」と呼ばれることがある。ガイド核酸は、２つのポリヌクレオチド鎖を含む場合があり、「二重ガイド核酸（ｄｏｕｂｌｅ ｇｕｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」と呼ばれることがある。特に明記しない限り、「ガイド核酸」との用語は包括的であり、単一ガイド核酸および二重ガイド核酸の両方を指す場合がある。ガイド核酸は、「核酸を標的とするセグメント」または「核酸を標的とする配列」と呼ばれることがある、セグメントを含んでいてもよい。核酸を標的とするセグメントは、「タンパク質結合セグメント」または「タンパク質結合配列」または「Ｃａｓタンパク質結合セグメント」と呼ばれることがあるサブセグメントを含んでいてもよい。

【0167】

２つ以上の核酸あるいはポリペプチド配列の文脈において、「配列同一性」または「パーセント同一性」との用語は一般に、２つ（例えば、ペアワイズアラインメント）、またはそれ以上（例えば、多重配列アライメント）の配列を指し、それらの配列は、配列比較アルゴリズムを使用して測定されるように、局所的または全体的な比較ウィンドウにわたる最大の対応のために比較または整列されたとき、同じであるか、あるいは同じアミノ酸残基またはヌクレオチドの指定された割合を有する。ポリペプチド配列に適切な配列比較アルゴリズムには、例えば、３のｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ（Ｗ）、１０のｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ（Ｅ）、および１１のｅｘｉｓｔｅｎｃｅ、１のｅｘｔｅｎｓｉｏｎでギャップコストを設定するＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスのパラメータを使用する、および３０の残基よりも長いポリペプチド配列の条件付き組成スコアマトリックス調整（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）を使用するＢＬＡＳＴＰ；２のｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ（Ｗ）、１００００００のｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ（Ｅ）のパラメータ、および３０残基未満の配列に対してギャップを開くために９で、ギャップを拡張するために１でギャップコストを設定するＰＡＭ３０スコアリングマトリックスを使用するＢＬＡＳＴＰ（これらは、ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで利用可能なＢＬＡＳＴ ｓｕｉｔｅにおけるＢＬＡＳＴＰのデフォルトパラメータである）；パラメータを用いるＣＬＵＳＴＡＬＷ；２のｍａｔｃｈ、－１のｍｉｓｍａｔｃｈ、および－１のｇａｐのパラメータを用いるＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズム；デフォルトパラメータを用いるＭＵＳＣＬＥ；２のｒｅｔｒｅｅおよび１０００のｍａｘｉｔｅｒａｔｉｏｎｓのパラメータを用いるＭＡＦＦＴ；デフォルトパラメータを用いるＮｏｖａｆｏｌｄ；デフォルトパラメータを用いるＨＭＭＥＲ ｈｍｍａｌｉｇｎが含まれる。

【0168】

本明細書で使用されるように、「ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメイン」との用語は一般に、ＲｕｖＣエンドヌクレアーゼドメイン（３つの不連続セグメントであるＲｕｖＣ＿Ｉ、ＲｕｖＣ＿ＩＩ、およびＲｕｖＣ＿ＩＩＩで構成されているＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン）の３つ目の不連続セグメントを指す。ＲｕｖＣドメインまたはそのセグメントは一般に、既知のドメイン配列に対するアラインメント、注釈されたドメインを有するタンパク質に対する構造アラインメントによって、あるいは、既知のドメイン配列に基づいて構築された隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）（例えば、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩではＰｆａｍ ＨＭＭ ＰＦ１８５４１）との比較によって、同定することができる。

【0169】

本明細書で使用されるように、「ＨＮＨドメイン」との用語は一般に、特徴的なヒスチジンおよびアスパラギン残基を有するエンドヌクレアーゼドメインを指す。ＨＮＨドメインは一般に、既知のドメイン配列に対するアラインメント、注釈されたドメインを有するタンパク質に対する構造アラインメントによって、あるいは、既知のドメイン配列に基づいて構築された隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）（例えば、ドメインＨＮＨではＰｆａｍ ＨＭＭ ＰＦ０１８４４）との比較によって同定することができる。

【0170】

概要

【0171】

特有の機能および構造を有する新しいＣａｓ酵素の発見は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）編集技術をさらに混乱させる（ｄｉｓｒｕｐｔ）可能性を提示し、速度、特異性、機能性、および使いやすさを改善することができる。微生物における、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムの予測された有病率（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）および多種多様な微生物種と比較して、機能的に特徴づけられたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、文献には比較的ほとんど存在しない。これは部分的に、莫大な数の微生物種が実験室条件で容易に培養されない可能性があるためである。多くの微生物種を表す自然環境的ニッチからのメタゲノム配列決定により、既知の新しいＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの数が急激に増加し、新しいオリゴヌクレオチド編集機能の発見が促進される可能性が提示され得る。そのようなアプローチの有益さの最近の例は、天然微生物群のメタゲノム解析からのＣａｓＸ／ＣａｓＹ ＣＲＩＳＰＲシステムの２０１６年の発見によって示される。

【0172】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、微生物中の適応免疫系として機能すると説明されている、ＲＮＡ指向性ヌクレアーゼ複合体である。それらの自然な文脈では、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムがＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）オペロンまたは遺伝子座に生じ、これは一般に２つの部分：（ｉ）ＲＮＡベースの標的化要素をコードする、等しく短いスペーサー配列によって分離された短い反復配列のアレイ（３０－４０ｂｐ）と；（ｉｉ）アクセサリータンパク質／アクセサリー酵素とともに、ＲＮＡベースの標的化要素によって向けられたヌクレアーゼポリペプチドをコードするＣａｓをコードするＯＲＦとを含む。特定の標的核酸配列の効率的なヌクレアーゼ標的化は一般に、（ｉ）標的の最初の６～８の核酸（標的シード（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｅｄ））とｃｒＲＮＡガイドとの間の相補的なハイブリダイゼーションと；（ｉｉ）標的シードの定義された近傍内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の存在（ＰＡＭは一般に、宿主ゲノム内では一般的に表されない配列である）との両方を必要とする。上記システムの正確な機能および構成に応じて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、共有される機能特性および進化の類似性に基づいて、２つのクラス、５つの型、および１６の亜型へと一般的に組織化される。

【0173】

クラスＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、大きなマルチサブユニットエフェクター複合体を有しており、Ｉ型、ＩＩＩ型、およびＩＶ型を含む。

【0174】

Ｉ型のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、構成要素の観点から中程度の複雑さであると考えられる。Ｉ型のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムでは、ＲＮＡを標的とする要素のアレイは長い前駆体ｃｒＲＮＡ（プレｃｒＲＮＡ）として転写され、これは反復要素で処理されて、短く成熟したｃｒＲＮＡを遊離し、この短く成熟したｃｒＲＮＡは、それらの後にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる適切な短いコンセンサス配列が続くと、ヌクレアーゼ複合体を核酸標的に向ける。この処理は、カスケードと呼ばれる大きなエンドヌクレアーゼ複合体のエンドリボヌクレアーゼサブユニット（Ｃａｓ６）を介して行われ、これはさらに、ｃｒＲＮＡ指向性ヌクレアーゼ複合体のヌクレアーゼ（Ｃａｓ３）タンパク質成分を含む。Ｃａｓ Ｉヌクレアーゼは、ＤＮＡヌクレアーゼとして主に機能する。

【0175】

ＩＩＩ型のＣＲＩＳＰＲシステムは、ＣｓｍまたはＣｍｒのタンパク質サブユニットを含むリピート関連ミステリアスタンパク質（ｒｅｐｅａｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｙｓｔｅｒｉｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＲＡＭＰ）とともに、Ｃａｓ１０として知られる中央ヌクレアーゼの存在を特徴とする場合がある。Ｉ型のシステムのように、成熟したｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ６のような酵素を使用してプレｃｒＲＮＡから処理される。Ｉ型およびＩＩ型のシステムとは異なり、ＩＩＩ型のシステムは、ＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖（ＲＮＡポリメラーゼの鋳型として使用されるＤＮＡ鎖など）を標的とし、切断するように思われる。

【0176】

ＩＶ型のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、高度に還元された（ｈｉｇｈｌｙ ｒｅｄｕｃｅｄ）大サブユニットヌクレアーゼ（ｃｓｆ１）と、Ｃａｓ５（ｃｓｆ３）とＣａｓ７（ｃｓｆ２）の群のＲＡＭＰタンパク質の２つの遺伝子と、場合によっては、予測された小サブユニットの１つの遺伝子とからなるエフェクター複合体を持ち；そのようなシステムは一般的に、内因性のプラスミド上で見られる。

【0177】

クラスＩＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは一般に、単一のポリペプチドのマルチドメインヌクレアーゼエフェクターを有しており、ＩＩ型、Ｖ型、およびＶＩ型を含む。

【0178】

ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、構成要素の観点から最も単純であると考えられる。ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムでは、ＣＲＩＳＰＲアレイを成熟したｃｒＲＮＡに処理するには、アレイ反復配列に相補的な領域を有する小さなトランスコードされた（ｔｒａｎｓ－ｅｎｃｏｄｅｄ）ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）ではなく、特別なエンドヌクレアーゼサブユニットの存在が必要となり；ｔｒａｃｒＲＮＡは、その対応するエフェクターヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）と反復配列の両方と相互作用することで前駆体ｄｓＲＮＡ構造を形成し、この前駆体ｄｓＲＮＡ構造は、内因性のＲＮＡｓｅ ＩＩＩによって切断されて、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの両方がロードされた成熟したエフェクター酵素を生成する。Ｃａｓ ＩＩヌクレアーゼはＤＮＡヌクレアーゼとして知られている。２型エフェクターは一般に、無関係なＨＮＨヌクレアーゼドメインがＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインのフォールド内に挿入されたＲＮａｓｅ Ｈフォールドを採用する、ＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインからなる構造を示す。ＲｕｖＣ様ドメインは、標的（例えば、ｃｒＲＮＡ相補的な）ＤＮＡ鎖の切断の原因となり、一方で、ＨＮＨドメインは置換されたＤＮＡ鎖の切断の原因となる。

【0179】

Ｖ型のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＲｕｖＣ様ドメインを含む、ＩＩ型エフェクターのヌクレアーゼエフェクターと類似するヌクレアーゼエフェクター（例えば、Ｃａｓ１２）構造を特徴とする。ＩＩ型と同様に、ほとんどの（しかし、すべてでない）Ｖ型のＣＲＩＳＰＲシステムは、プレｃｒＲＮＡを成熟したｃｒＲＮＡへと処理するためにｔｒａｃｒＲＮＡを使用する；しかし、プレｃｒＲＮＡを切断して複数のｃｒＲＮＡにするためにＲＮＡｓｅ ＩＩＩを必要とするＩＩ型のシステムとは異なり、Ｖ型のシステムは、プレｃｒＲＮＡを切断するために、エフェクターヌクレアーゼそれ自体を使用することができる。ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと同様に、Ｖ型のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムはＤＮＡヌクレアーゼとしても知られている。ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムとは異なり、いくつかのＶ型酵素（例えば、Ｃａｓ１２ａ）は、二本鎖標的配列の第１のｃｒＲＮＡ指向性切断によって活性化される、頑強な一本鎖の非特異的なデオキシリボヌクレアーゼ活性を有するように思われる。

【0180】

ＶＩ型のＣＲＩＰＳＲ－Ｃａｓシステムは、ＲＮＡガイドＲＮＡエンドヌクレアーゼ（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ）を有する。ＲｕｖＣ様ドメインの代わりに、ＶＩ型のシステム（例えば、Ｃａｓ１３）の単一のポリペプチドエフェクターは、２つのＨＥＰＮリボヌクレアーゼドメインを含む。ＩＩ型およびＶ型のシステムの両方とは異なり、ＶＩ型のシステムは、プレｃｒＲＮＡをｃｒＲＮＡへと処理するために、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要としないように思われる。しかし、Ｖ型のシステムと同様に、いくつかのＶＩ型のシステム（例えば、Ｃ２Ｃ２）は、標的ＲＮＡの第１のｃｒＲＮＡ指向性切断によって活性化された、頑強な一本鎖の非特異的ヌクレアーゼ（リボヌクレアーゼ）活性を持つように思われる。

【0181】

クラスＩＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓは、そのより単純な構造ゆえに、デザイナーヌクレアーゼ（ｄｅｓｉｇｎｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）／ゲノム編集用途として、エンジニアリングおよび開発のために最も広く採用されている。

【0182】

インビトロでの使用のためのそのようなシステムの初期の適応のうちの１つは、Ｊｉｎｅｋら（Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２ Ａｕｇ １７；３３７（６０９６）：８１６－２、これは参照によって完全に本明細書に組み込まれる）において見ることができる。Ｊｉｎｅｋの試験では、（ｉ）Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＳＦ３７０から単離された、組換え的に（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙ）発現されて精製された完全長のＣａｓ９（例えば、クラスＩＩのＩＩ型Ｃａｓ酵素）、（ｉｉ）切断されることが望まれる標的ＤＮＡ配列に相補的な～２０ｎｔ５’配列と、それに続く３’ｔｒａｃｒ結合配列とを有する、精製された成熟～４２ｎｔ ｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ全体が、Ｔ７プロモーター配列を有する合成ＤＮＡ鋳型からインビトロで転写される）；（ｉｉｉ）Ｔ７プロモーター配列を有する合成ＤＮＡ鋳型からインビトロで転写された、精製されたｔｒａｃｒＲＮＡ、および（ｉｖ）Ｍｇ２＋を含むシステムが最初に説明された。Ｊｉｎｅｋは、その後、改善された操作されたシステムを説明し、そのシステムでは、それ自体でＣａｓ９を標的に向けることができる単一の融合された合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を形成するために、（ｉｉ）のｃｒＲＮＡが、リンカー（例えば、ＧＡＡＡ）によって、（ｉｉｉ）の５’末端に結合される（図２の上パネルと下パネルを比較する）。

【0183】

Ｍａｌｉら（Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８２３－８２６．）（これは、参照により完全に本明細書に組み込まれる）は、その後、（ｉ）Ｃ末端の核局在化配列（例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳ）および適切なポリアデニル化シグナル（例えば、ＴＫ ｐＡシグナル）を有する適切な哺乳動物プロモーター下で、コドン最適化Ｃａｓ９（例えば、クラスＩＩのＩＩ型Ｃａｓ酵素）をコードするＯＲＦと；（ｉｉ）適切なポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６プロモーター）下でｓｇＲＮＡをコードするＯＲＦ（Ｇで始まる５’配列と、それに続く相補的な標的化核酸配列の２０ｎｔと、それに結合した３’ｔｒａｃｒ結合配列と、リンカーと、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを有する）とをコードするＤＮＡベクターを提供することによって、哺乳動物細胞で使用するためにこのシステムを適合させた。

【0184】

ＭＧ１酵素

【0185】

一態様では、本開示は、（ａ）エンドヌクレアーゼを含む操作されたヌクレアーゼシステムを提供する。場合によっては、エンドヌクレアーゼはＣａｓエンドヌクレアーゼである。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＩＩ型のクラスＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼである。エンドヌクレアーゼはＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含む場合があり、ここで、前記ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：１８２７－２１４０のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の配列同一性を有する。場合によっては、エンドヌクレアーゼはＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含む場合があり、ここで、上記ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：１８２７－２１４０．のいずれか１つに対して少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有する。場合によっては、エンドヌクレアーゼはＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含む場合があり、ここで、配列番号：１８２７－２１４０のいずれか１つに実質的に同一である。エンドヌクレアーゼは、配列番号：１８２７－１８３１のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の配列同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含む場合がある。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１８２７－１８３１のいずれか１つに対して少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含む場合がある。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１８２７－１８３１のいずれか１つと実質的に同一のＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含む場合がある。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１８２７に対して少なくとも約７０％、、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含む場合がある。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１８２８に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含む場合がある。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１８２９に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含む場合がある。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１８３０に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含む場合がある。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１８３１に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含む場合がある。

【0186】

エンドヌクレアーゼは、配列番号：３６３８－３９５５のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含む場合がある。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：３６３８－３９５５のいずれか１つに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するＨＮＨドメインを含む場合がある。エンドヌクレアーゼは、配列番号：３６３８－３９５５のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含む場合がある。エンドヌクレアーゼは、配列番号：３６３８－３９５５のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含む場合がある。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：３６３８－３９５５のいずれか１つに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するＨＮＨドメインを含む場合がある。エンドヌクレアーゼは、配列番号：３６３８－３９５５のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含む場合がある。エンドヌクレアーゼは、配列番号：３６３８－３６４１のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含む場合がある。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：３６３８－３６４１のいずれか１つに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するＨＮＨドメインを含む場合がある。エンドヌクレアーゼは、配列番号：３６３８－３６４１のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含む場合がある。エンドヌクレアーゼは、配列番号：３６３８のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含む場合がある。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：３６３８のいずれか１つに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するＨＮＨドメインを含む場合がある。エンドヌクレアーゼは、配列番号：３６３８のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含む場合がある。エンドヌクレアーゼは、配列番号：３６３９のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含む場合がある。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：３６３９のいずれか１つに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するＨＮＨドメインを含む場合がある。エンドヌクレアーゼは、配列番号：３６３９のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含む場合がある。エンドヌクレアーゼは、配列番号：３６４０のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含む場合がある。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：３６４０のいずれか１つに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するＨＮＨドメインを含む場合がある。エンドヌクレアーゼは、配列番号：３６４０のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含む場合がある。エンドヌクレアーゼは、配列番号：３６４１のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含む場合がある。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：３６４１のいずれか１つに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するＨＮＨドメインを含む場合がある。エンドヌクレアーゼは、配列番号：３６４１のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含む場合がある。

【0187】

場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１－６あるいは９－３１９のいずれか１つに対して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含む場合がある。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１－６あるいは９－３１９のいずれか１つと実質的に同一である場合がある。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１－４のいずれか１つに対して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含む場合がある。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１－４のいずれか１つと実質的に同一の場合がある。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５６１５、５６１６、あるいは５６１７のいずれか１つと実質的に同一のペプチドモチーフを含む場合がある。

【0188】

場合によっては、エンドヌクレアーゼは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を有する変異体を含むことがある。ＮＬＳは、前記エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端の近位にあり得る。ＮＬＳは、配列番号：１－６あるいは９－３１９のいずれか１つのＮ末端あるいはＣ末端に付加され得るか、あるいは、配列番号：１－３１９のいずれか１つに対して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体のＮ末端あるいはＣ末端に付加され得る。ＮＬＳはＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳである場合がある。ＮＬＳはｃ－ｍｙｃ ＮＬＳである場合がある。ＮＬＳは、配列番号：５５９３－５６０８のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む場合がある。ＮＬＳは、配列番号：５５９３－５６０８のいずれか１つと実質的に同一の配列を含む場合がる。ＮＬＳは、下記の表１中の配列のいずれか、またはその組み合わせを含み得る。

【0189】

【表1】

場合によっては、エンドヌクレアーゼは、組換え型であり得る（例えば、大腸菌中の発現とそれに続くエピトープタグ精製などの適切な方法によって、クローン化され、発現され、および精製される）。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５９２－５５９５のいずれか１つに対して少なくとも約９０％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌に由来する場合がある。エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５９２－５５９５のいずれか１つと少なくとも約８０％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する種に由来する場合がある。エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５９２－５５９５のいずれか１つと実質的に同一の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する種に由来する場合がある。エンドヌクレアーゼは、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ門またはＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ門に属する細菌に由来する場合がある。

【0190】

場合によっては、配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、Ｎｏｖａｆｏｌｄ、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定され得る。配列同一性は、３のｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ（Ｗ）、１０のｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ（Ｅ）のパラメータを使用して、および１１のｅｘｉｓｔｅｎｃｅ、１のｅｘｔｅｎｓｉｏｎでギャップコストを設定するＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用して、および条件付き組成スコアマトリックス調整（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）を使用して、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムによって決定される場合がある。

【0191】

場合によっては、上記のシステムは、（ｂ）所望の切断配列に相補的な５’標的化領域を有するエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができる、少なくとも１つの操作された合成ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）を含む場合がある。場合によっては、５’標的化領域は、エンドヌクレアーゼと適合可能なＰＡＭ配列を含み得る。場合によっては、標的化領域の最も５’側（５’ｍｏｓｔ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）のヌクレオチドはＧである場合がある。場合によっては、５’標的化領域は１５～２３ヌクレオチド長である場合がある。ガイド配列およびｔｒａｃｒ配列は、別個のリボ核酸（ＲＮＡ）あるいは単一のリボ核酸（ＲＮＡ）として供給され得る。ガイドＲＮＡは、標的化領域の３’にｃｒＲＮＡ ｔｒａｃｒＲＮＡ結合配列を含んでもよい。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ ｔｒａｃｒＲＮＡ結合領域の３’に４－ヌクレオチドリンカーが先行するｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含んでいてもよい。ｓｇＲＮＡは、５’から３’に：細胞中の標的配列にハイブリダイズすることができる非天然のガイド核酸配列と；ｔｒａｃｒ配列とを含み得る。場合によっては、非天然ガイド核酸配列およびｔｒａｃｒ配列は共有結合される。

【0192】

場合によっては、ｔｒａｃｒ配列は特定の配列を有する場合がある。ｔｒａｃｒ配列は、天然のｔｒａｃｒＲＮＡ配列の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して、少なくとも約８０％を有する。ｔｒａｃｒ配列は、配列番号：５４７６－５４８９のいずれか１つの少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して少なくとも約８０％の配列同一性を有することがある。場合によっては、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５４７６－５４８９のいずれか１つの少なくとも約６０～９０（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する場合がある。場合によっては、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５４７６－５４８９のいずれか１つの少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドと実質的に同一である場合がある。ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５４７６－５４８９のいずれかを含む場合がある。

【0193】

場合によっては、エンドヌクレアーゼと複合体を形成することができる、少なくとも１つの操作された合成ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）は、配列番号：５４６１－５４６４のいずれか１つに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列を含む場合がある。ｓｇＲＮＡは、配列番号：５４６１－５４６４のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む場合がる。ｓｇＲＮＡは、配列番号：５４６１－５４６４のいずれか１つと実質的に同一の配列を含む場合がある。

【0194】

場合によっては、上記のシステムは、標的ＤＮＡ遺伝子座における切断のために第１の領域および第２の領域を標的とする２つの異なるｓｇＲＮＡを含む場合があり、ここで、第２の部位は第１の部位の３’である。場合によっては、上記のシステムは、５’～３’まで、第１の領域の５’に少なくとも約２０（例えば、少なくとも約４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、あるいは１ｋｂ）のヌクレオチドの配列を含む第１の相同性アームと、少なくとも約１０のヌクレオチドの合成ＤＮＡ配列と、第２の領域の３’に少なくとも約２０（例えば、少なくとも約４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、あるいは１ｋｂ）のヌクレオチドの配列を含む第２の相同性アームとを含む、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ修復鋳型を含む場合がある。

【0195】

他の態様では、本開示は、標的核酸遺伝子座を改変するための方法を提供する。上記方法は、酵素および本明細書で開示される少なくとも１つの合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む、本明細書で開示される非天然のシステムのいずれかを、標的核酸遺伝子座に送達する工程を含み得る。酵素は、少なくとも１つのｓｇＲＮＡと複合体を形成し、その複合体が標的核酸遺伝子座に結合すると、標的核酸遺伝子座を改変する場合がある。前記遺伝子座に酵素を送達することは、上記システムまたは上記システムをコードする核酸で細胞をトランスフェクトすることを含み得る。前記遺伝子座にヌクレアーゼを送達することは、上記システムまたは上記システムをコードする核酸で細胞を電気穿孔することを含み得る。前記遺伝子座にヌクレアーゼを送達することは、対象の遺伝子座を含む核酸と上記システムを緩衝液中でインキュベートすることを含み得る。場合によっては、標的核酸遺伝子座は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。標的核酸遺伝子座は、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、または細菌ＤＮＡを含むことがある。標的核酸遺伝子座は細胞内にあることがある。標的核酸遺伝子座はインビトロであることがある。標的核酸遺伝子座は、真核細胞または原核細胞内にあることがある。細胞は、動物細胞、ヒト細胞、細菌細胞、古細菌細胞、または植物細胞であることがある。酵素は、対象の標的遺伝子座で、またはその近位で、一本鎖切断または二本鎖切断を引き起こすことがある。

【0196】

標的核酸遺伝子座が細胞内にある可能性がある場合、酵素は、配列番号：１８２７－２１４０のいずれか１つに対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％）の同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを有する酵素をコードするオープンリーディングフレームを含有する核酸として供給されてもよい。前記エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含有するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、配列番号：５５７２－５５７５のいずれか１つ、または、配列番号：５５７２－５５７５のいずれか１つに対して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、あるいは少なくとも約９９％の同一性を有するその変異体と実質的に同一の配列を含み得る。場合によっては、核酸は、エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームが動作可能に連結されるプロモーターを含む。プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、ヒトβアクチン、ＣＡＧ、ＴＲＥ、またはＣａＭＫＩＩａプロモーターである場合がある。エンドヌクレアーゼは、前記エンドヌクレアーゼをコードする前記オープンリーディングフレームを含有する、キャップされたｍＲＮＡとして供給されてもよい。エンドヌクレアーゼは、翻訳されたポリペプチドとして供給されてもよい。少なくとも１つの操作されたｓｇＲＮＡは、リボ核酸（ＲＮＡ）ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターに動作可能に連結された前記少なくとも１つの操作されたｓｇＲＮＡをコードする遺伝子配列を含有するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）として供給されてもよい。場合によっては、生物を真核生物であってもよい。場合によっては、生物を真菌であってもよい。場合によっては、生物をヒトであってもよい。

【0197】

場合によっては、本開示は、本明細書で開示されるシステムを含む発現カセット、または本明細書に記載される核酸を提供し得る。場合によっては、発現カセットまたは核酸はベクターとして供給されてもよい。場合によっては、発現カセット、核酸、またはベクターは、細胞中で供給されてもよい。場合によっては、細胞は、配列番号：５５９２－５５９５のいずれか１つに対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９９％）の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する、細菌細胞である。

【0198】

ＭＧ２酵素

【0199】

一態様では、本開示は、（ａ）エンドヌクレアーゼを含む、操作されたヌクレアーゼシステムを提供する。場合によっては、エンドヌクレアーゼはＣａｓエンドヌクレアーゼである。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＩＩ型のクラスＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼである。エンドヌクレアーゼはＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含む場合があり、ここで、前記ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：２１４１－２２４１のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の配列同一性を有する。場合によっては、エンドヌクレアーゼはＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含む場合があり、ここで、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：２１４１－２２４１のいずれか１つに対して少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有する。場合によっては、エンドヌクレアーゼはＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含む場合があり、配列番号：２１４１－２１４２のいずれか１つと実質的に同一である。エンドヌクレアーゼは、配列番号：２１４１－２１４２のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の配列同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含む場合がある。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：２１４１－２１４２のいずれか１つに対して少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有する、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含む場合がある。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：２１４１－２１４２のいずれか１つと実質的に同一のＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含む場合がある。

【0200】

エンドヌクレアーゼは、配列番号：３９５５－４０５５のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含む場合がある。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：３９５５－４０５５のいずれか１つに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるＨＮＨドメインを含む場合がある。エンドヌクレアーゼは、配列番号：３９５５－４０５５のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含む場合がある。エンドヌクレアーゼは、配列番号：３９５５－３９５６のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含む場合がある。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：３９５５－３９５６のうちのいずれか１つに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるＨＮＨドメインを含む場合がある。エンドヌクレアーゼは、配列番号：３９５５－３９５６のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含む場合がある。

【0201】

場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：３２０－４２０のいずれか１つに対して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：３２０－４２０のいずれか１つと実質的に同一であってもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：３２０－３２１のいずれか１つに対して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：３２０－３２１のいずれか１つと実質的に同一であってもよい。

【0202】

場合によっては、エンドヌクレアーゼは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を有する変異体を含んでもよい。ＮＬＳは前記エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端の近位であってもよい。ＮＬＳは、配列番号：３２０－４２０のいずれか１つのＮ末端またはＣ末端で、あるいは、配列番号：３２０－４２０のいずれか１つに対して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体のＮ末端またはＣ末端で付加されてもよい。ＮＬＳはＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳであってもよい。ＮＬＳはｃ－ｍｙｃ ＮＬＳであってもよい。ＮＬＳは、配列番号：５５９３－５６０８のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ＮＬＳは配列番号：５５９３－５６０８のいずれか１つと実質的に同一の配列を含むことができる。ＮＬＳは、表１の配列のいずれか、またはその組み合わせを含むことができる：

【0203】

場合によっては、配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、Ｎｏｖａｆｏｌｄ、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定されてもよい。配列同一性は、３のｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ（Ｗ）、１０のｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ（Ｅ）のパラメータを使用し、および１１のｅｘｉｓｔｅｎｃｅ、１のｅｘｔｅｎｓｉｏｎでギャップコストを設定するＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを使用し、および条件付き組成スコアマトリクス調整を使用して、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで決定することができる。

【0204】

場合によっては、上記システムは、（ｂ）所望の切断配列に相補的な５’標的化領域を有するエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができる、少なくとも１つの操作された合成ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）を含んでもよい。場合によっては、５’標的化領域は、エンドヌクレアーゼと適合可能なＰＡＭ配列を含んでもよい。場合によっては、標的化領域の５’のほとんどのヌクレオチドがＧであってもよい。場合によっては、５’標的化領域は１５～２３ヌクレオチド長であってもよい。ガイド配列およびｔｒａｃｒ配列は、別のリボ核酸（ＲＮＡ）または単一リボ核酸（ＲＮＡ）として供給されてもよい。ガイドＲＮＡは、標的化領域の３’にｃｒＲＮＡ ｔｒａｃｒＲＮＡ結合配列を含んでもよい。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ ｔｒａｃｒＲＮＡ結合領域の３’に４－ヌクレオチドリンカーが先行するｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは、５’から３’に、細胞の標的配列にハイブリダイズすることができる非天然ガイド核酸配列、および、ｔｒａｃｒ配列を含んでもよい。場合によっては、非天然ガイド核酸配列およびｔｒａｃｒ配列は共有結合される。

【0205】

場合によっては、ｔｒａｃｒ配列は特別な配列を有していてもよい。ｔｒａｃｒ配列は、天然のｔｒａｃｒＲＮＡ配列の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して少なくとも約８０％を有してもよい。ｔｒａｃｒ配列は、配列番号：５４９０－５４９４のいずれか１つの少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して少なくとも約８０％の配列同一性を有してもよい。場合によっては、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５４９０－５４９４のいずれか１つの少なくとも約６０～９０（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有してもよい。場合によっては、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５４９０－５４９４のいずれか１つの少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドと実質的に同一であってもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５４９０－５４９４のいずれかを含んでもよい。

【0206】

場合によっては、エンドヌクレアーゼと複合体を形成することができる少なくとも１つの操作された合成ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）は、配列番号：５４６５に対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは、配列番号：５４６５に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは配列番号：５４６５と実質的に同一の配列を含んでもよい。

【0207】

いくつかの態様では、上記システムは、標的ＤＮＡ遺伝子座における切断のために第１の領域および第２の領域を標的とする２つの異なるｓｇＲＮＡを含んでいてもよく、ここで、第２の領域は第１の領域に対して３’である。場合によっては、上記システムは、５’から３’に、第１の領域の５’に少なくとも約２０（例えば、少なくとも約４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１ｋｂ）のヌクレオチドの配列を含む第１の相同性アーム、少なくとも約１０ヌクレオチドの合成ＤＮＡ配列、および、第２の領域の３’に少なくとも約２０（例えば、少なくとも約４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１ｋｂ）のヌクレオチドの配列を含む第２の相同性アームを含む、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ修復鋳型を含んでいてもよい。

【0208】

他の態様では、本開示は、所望の標的核酸遺伝子座を改変するための方法を提供する。本方法は、本明細書に開示された酵素および少なくとも１つの合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む本明細書で開示された非天然のシステムのいずれかを、標的核酸遺伝子座に送達する工程を含んでもよい。酵素は、少なくとも１つのｓｇＲＮＡと複合体を形成してもよく、複合体が所望の標的核酸遺伝子座に結合すると、所望の標的核酸遺伝子座を改変してもよい。酵素を前記遺伝子座に送達することは、上記システムまたは上記システムをコードする核酸で細胞をトランスフェクトすることを含んでもよい。ヌクレアーゼを前記遺伝子座に送達することは、上記システムまたは上記システムをコードする核酸で細胞をエレクトロポレーションすることを含んでもよい。ヌクレアーゼを前記遺伝子座に送達することは、所望の遺伝子座を含む核酸を有する緩衝液中でシステムをインキュベートすることを含んでもよい。場合によっては、標的核酸遺伝子座は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。標的核酸遺伝子座は、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、または細菌ＤＮＡを含んでもよい。標的核酸遺伝子座は細胞内にあってもよい。標的核酸遺伝子座はインビトロであってもよい。標的核酸遺伝子座は、真核細胞内にあっても、原核細胞内にあってもよい。細胞は、動物細胞、ヒト細胞、細菌細胞、古細菌細胞、または植物細胞であってもよい。酵素は、所望の標的遺伝子座で、またはその近辺で、一本鎖または二本鎖の切断を誘導してもよい。

【0209】

標的核酸の遺伝子座が細胞内にあり得る場合では、酵素は、配列番号：２１４１－２２４１のいずれか１つに対して、少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％）の同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを有する酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸として供給されてもよい。前記エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、配列番号：５５７６－５５７７のいずれか１つと実質的に同一の配列、あるいは、配列番号：５５７６－５５７７のいずれか１つに対して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでもよい。場合によっては、核酸は、エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームが動作可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、ヒトβアクチン、ＣＡＧ、ＴＲＥ、またはＣａＭＫＩＩａプロモーターであってもよい。エンドヌクレアーゼは、前記エンドヌクレアーゼをコードする前記オープンリーディングフレームを含むキャップされたｍＲＮＡとして供給されてもよい。エンドヌクレアーゼは、翻訳されたポリペプチドとして提供されてもよい。少なくとも１つの操作されたｓｇＲＮＡは、リボ核酸（ＲＮＡ）ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターに動作可能に連結された前記少なくとも１つの操作されたｓｇＲＮＡをコードする遺伝子配列を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）として供給されてもよい。場合によっては、生物は真核生物であってもよい。場合によっては、生物は真菌であってもよい。場合によっては、生物はヒトであってもよい。

【0210】

ＭＧ３酵素

【0211】

一態様では、本開示は、（ａ）エンドヌクレアーゼを含む操作されたヌクレアーゼシステムを提供する。場合によっては、エンドヌクレアーゼはＣａｓエンドヌクレアーゼである。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＩＩ型のクラスＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼである。エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、前記ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：２２４２－２２５１のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の配列同一性を有する。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：２２４２－２２５１のいずれか１つに対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有する。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、配列番号：２２４２－２２５１のいずれか１つに実質的に同一である。エンドヌクレアーゼは、配列番号：２２４２－２２４４のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の配列同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：２２４２－２２４４のいずれか１つに対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：２２４２－２２４４のいずれか１つに実質的に同一であるＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。

【0212】

エンドヌクレアーゼは、配列番号：４０５６－４０６６のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４０５６－４０６６のいずれか１つに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは配列番号：４０５６－４０６６のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは、配列番号：４０５６－４０５８のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４０５６－４０５８のいずれか１つに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは配列番号：４０５６－４０５８のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含んでいてもよい。

【0213】

場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４２１－４３１のいずれか１つに対して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４２１－４３１のいずれか１つと実質的に同一であってもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４２１－４２３のいずれか１つに対して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４２１－４２３のいずれか１つと実質的に同一であってもよい。

【0214】

場合によっては、エンドヌクレアーゼは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を有する変異体を含んでもよい。ＮＬＳは前記エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端の近位であってもよい。ＮＬＳは、配列番号：４２１－４３１のいずれか１つのＮ末端またはＣ末端で、あるいは、配列番号：４２１－４３１のいずれか１つに対して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体のＮ末端またはＣ末端で付加されてもよい。ＮＬＳはＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳであってもよい。ＮＬＳはｃ－ｍｙｃ ＮＬＳであってもよい。ＮＬＳは、配列番号：５５９３－５６０８のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ＮＬＳは配列番号：５５９３－５６０８のいずれか１つと実質的に同一の配列を含むことができる。ＮＬＳは、表１の配列のいずれか、またはその組み合わせを含むことができる：

【0215】

場合によっては、配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、Ｎｏｖａｆｏｌｄ、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定されてもよい。配列同一性は、３のｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ（Ｗ）、１０のｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ（Ｅ）のパラメータを使用し、および１１のｅｘｉｓｔｅｎｃｅ、１のｅｘｔｅｎｓｉｏｎでギャップコストを設定するＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを使用し、および条件付き組成スコアマトリクス調整を使用して、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで決定することができる。

【0216】

場合によっては、上記システムは、（ｂ）所望の切断配列に相補的な５’標的化領域を有するエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができる、少なくとも１つの操作された合成ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）を含んでもよい。場合によっては、５’標的化領域は、エンドヌクレアーゼと適合可能なＰＡＭ配列を含んでもよい。場合によっては、標的化領域の５’のほとんどのヌクレオチドがＧであってもよい。場合によっては、５’標的化領域は１５～２３ヌクレオチド長であってもよい。ガイド配列およびｔｒａｃｒ配列は、別のリボ核酸（ＲＮＡ）または単一リボ核酸（ＲＮＡ）として供給されてもよい。ガイドＲＮＡは、標的化領域の３’にｃｒＲＮＡ ｔｒａｃｒＲＮＡ結合配列を含んでもよい。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ ｔｒａｃｒＲＮＡ結合領域の３’に４－ヌクレオチドリンカーが先行するｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは、５’から３’に、細胞の標的配列にハイブリダイズすることができる非天然ガイド核酸配列、および、ｔｒａｃｒ配列を含んでもよい。場合によっては、非天然ガイド核酸配列およびｔｒａｃｒ配列は共有結合される。

【0217】

場合によっては、ｔｒａｃｒ配列は特別な配列を有していてもよい。ｔｒａｃｒ配列は、天然のｔｒａｃｒＲＮＡ配列の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して少なくとも約８０％を有してもよい。ｔｒａｃｒ配列は、配列番号：５４９５－５５０２のいずれか１つの少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して少なくとも約８０％の配列同一性を有してもよい。場合によっては、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５４９５－５５０２のいずれか１つの少なくとも約６０～９０（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有してもよい。場合によっては、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５４９５－５５０２のいずれか１つの少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドと実質的に同一であってもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５４９５－５５０２のいずれかを含んでもよい。

【0218】

場合によっては、エンドヌクレアーゼと複合体を形成することができる少なくとも１つの操作された合成ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）は、配列番号：５４６６－５４６７のいずれか１つに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは、配列番号：５４６６－５４６７のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは配列番号：５４６６－５４６７のいずれか１つと実質的に同一の配列を含んでもよい。

【0219】

場合によっては、上記システムは、標的ＤＮＡ遺伝子座における切断のために第１の領域および第２の領域を標的とする２つの異なるｓｇＲＮＡを含んでいてもよく、ここで、第２の領域は第１の領域に対して３’である。場合によっては、上記システムは、５’から３’に、第１の領域の５’に少なくとも約２０（例えば、少なくとも約４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１ｋｂ）のヌクレオチドの配列を含む第１の相同性アーム、少なくとも約１０ヌクレオチドの合成ＤＮＡ配列、および、第２の領域の３’に少なくとも約２０（例えば、少なくとも約４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１ｋｂ）のヌクレオチドの配列を含む第２の相同性アームを含む、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ修復鋳型を含んでいてもよい。

【0220】

他の態様では、本開示は、所望の標的核酸遺伝子座を改変するための方法を提供する。本方法は、本明細書に開示された酵素および少なくとも１つの合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む本明細書で開示された非天然のシステムのいずれかを、標的核酸遺伝子座に送達する工程を含んでもよい。酵素は、少なくとも１つのｓｇＲＮＡと複合体を形成してもよく、複合体が所望の標的核酸遺伝子座に結合すると、所望の標的核酸遺伝子座を改変してもよい。酵素を前記遺伝子座に送達することは、上記システムまたは上記システムをコードする核酸で細胞をトランスフェクトすることを含んでもよい。ヌクレアーゼを前記遺伝子座に送達することは、上記システムまたは上記システムをコードする核酸で細胞をエレクトロポレーションすることを含んでもよい。ヌクレアーゼを前記遺伝子座に送達することは、所望の遺伝子座を含む核酸を有する緩衝液中でシステムをインキュベートすることを含んでもよい。場合によっては、標的核酸遺伝子座は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。標的核酸遺伝子座は、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、または細菌ＤＮＡを含んでもよい。標的核酸遺伝子座は細胞内にあってもよい。標的核酸遺伝子座はインビトロであってもよい。標的核酸遺伝子座は、真核細胞内にあっても、原核細胞内にあってもよい。細胞は、動物細胞、ヒト細胞、細菌細胞、古細菌細胞、または植物細胞であってもよい。酵素は、所望の標的遺伝子座で、またはその近辺で、一本鎖または二本鎖の切断を誘導してもよい。

【0221】

標的核酸の遺伝子座が細胞内にあり得る場合では、酵素は、配列番号：２２４２－２２５１のいずれか１つに対して、少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％）の同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを有する酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸として供給されてもよい。前記エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、配列番号：５５７８－５５８０のいずれか１つと実質的に同一の配列、あるいは、配列番号：５５７８－５５８０のいずれか１つに対して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでもよい。場合によっては、核酸は、エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームが動作可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、ヒトβアクチン、ＣＡＧ、ＴＲＥ、またはＣａＭＫＩＩａプロモーターであってもよい。エンドヌクレアーゼは、前記エンドヌクレアーゼをコードする前記オープンリーディングフレームを含むキャップされたｍＲＮＡとして供給されてもよい。エンドヌクレアーゼは、翻訳されたポリペプチドとして提供されてもよい。少なくとも１つの操作されたｓｇＲＮＡは、リボ核酸（ＲＮＡ）ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターに動作可能に連結された前記少なくとも１つの操作されたｓｇＲＮＡをコードする遺伝子配列を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）として供給されてもよい。場合によっては、生物は真核生物であってもよい。場合によっては、生物は真菌であってもよい。場合によっては、生物はヒトであってもよい。

【0222】

ＭＧ４酵素

【0223】

一態様では、本開示は、（ａ）エンドヌクレアーゼを含む操作されたヌクレアーゼシステムを提供する。場合によっては、エンドヌクレアーゼはＣａｓエンドヌクレアーゼである。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＩＩ型のクラスＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼである。エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、前記ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：２２５３－２４８１のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の配列同一性を有する。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：２２５３－２４８１のいずれか１つに対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有する。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、配列番号：２２５３－２４８１のいずれか１つに実質的に同一である。エンドヌクレアーゼは、配列番号：２２５３－２４８１のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の配列同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：２２５３－２４８１のいずれか１つに対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：２２５３－２４８１のいずれか１つに実質的に同一であるＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。

【0224】

エンドヌクレアーゼは、配列番号：４０６７－４２９５のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４０６７－４２９５のいずれか１つに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは配列番号：４０６７－４２９５のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは、配列番号：４０６７－４２９５のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４０６７－４２９５のいずれか１つに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは配列番号：４０６７－４２９５のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含んでいてもよい。

【0225】

場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４３２－６６０のいずれか１つに対して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４３２－６６０のいずれか１つと実質的に同一であってもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４３２－６６０のいずれか１つに対して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４３２－６６０のいずれか１つと実質的に同一であってもよい。

【0226】

場合によっては、エンドヌクレアーゼは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を有する変異体を含んでもよい。ＮＬＳは前記エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端の近位であってもよい。ＮＬＳは、配列番号：４３２－６６０のいずれか１つのＮ末端またはＣ末端で、あるいは、配列番号：４３２－６６０のいずれか１つに対して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体のＮ末端またはＣ末端で付加されてもよい。ＮＬＳはＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳであってもよい。ＮＬＳはｃ－ｍｙｃ ＮＬＳであってもよい。ＮＬＳは、配列番号：５５９３－５６０８のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ＮＬＳは配列番号：５５９３－５６０８のいずれか１つと実質的に同一の配列を含むことができる。ＮＬＳは、表１の配列のいずれか、またはその組み合わせを含むことができる：

【0227】

場合によっては、配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、Ｎｏｖａｆｏｌｄ、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定されてもよい。配列同一性は、３のｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ（Ｗ）、１０のｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ（Ｅ）のパラメータを使用し、および１１のｅｘｉｓｔｅｎｃｅ、１のｅｘｔｅｎｓｉｏｎでギャップコストを設定するＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを使用し、および条件付き組成スコアマトリクス調整を使用して、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで決定することができる。

【0228】

場合によっては、上記システムは、（ｂ）所望の切断配列に相補的な５’標的化領域を有するエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができる、少なくとも１つの操作された合成ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）を含んでもよい。場合によっては、５’標的化領域は、エンドヌクレアーゼと適合可能なＰＡＭ配列を含んでもよい。場合によっては、標的化領域の５’のほとんどのヌクレオチドがＧであってもよい。場合によっては、５’標的化領域は１５～２３ヌクレオチド長であってもよい。ガイド配列およびｔｒａｃｒ配列は、別のリボ核酸（ＲＮＡ）または単一リボ核酸（ＲＮＡ）として供給されてもよい。ガイドＲＮＡは、標的化領域の３’にｃｒＲＮＡ ｔｒａｃｒＲＮＡ結合配列を含んでもよい。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ ｔｒａｃｒＲＮＡ結合領域の３’に４－ヌクレオチドリンカーが先行するｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは、５’から３’に、細胞の標的配列にハイブリダイズすることができる非天然ガイド核酸配列、および、ｔｒａｃｒ配列を含んでもよい。場合によっては、非天然ガイド核酸配列およびｔｒａｃｒ配列は共有結合される。

【0229】

場合によっては、ｔｒａｃｒ配列は特別な配列を有していてもよい。ｔｒａｃｒ配列は、天然のｔｒａｃｒＲＮＡ配列の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して少なくとも約８０％を有してもよい。ｔｒａｃｒ配列は、配列番号：５５０３の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して少なくとも約８０％の配列同一性を有してもよい。場合によっては、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５５０３の少なくとも約６０～９０（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有してもよい。場合によっては、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５５０３の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドと実質的に同一であってもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５５０３を含んでもよい。

【0230】

場合によっては、エンドヌクレアーゼと複合体を形成することができる少なくとも１つの操作された合成ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）は、配列番号：５４６８に対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは、配列番号：５４６８に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは配列番号：５４６８と実質的に同一の配列を含んでもよい。

【0231】

場合によっては、上記システムは、標的ＤＮＡ遺伝子座における切断のために第１の領域および第２の領域を標的とする２つの異なるｓｇＲＮＡを含んでいてもよく、ここで、第２の領域は第１の領域に対して３’である。場合によっては、上記システムは、５’から３’に、第１の領域の５’に少なくとも約２０（例えば、少なくとも約４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１ｋｂ）のヌクレオチドの配列を含む第１の相同性アーム、少なくとも約１０ヌクレオチドの合成ＤＮＡ配列、および、第２の領域の３’に少なくとも約２０（例えば、少なくとも約４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１ｋｂ）のヌクレオチドの配列を含む第２の相同性アームを含む、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ修復鋳型を含んでいてもよい。

【0232】

他の態様では、本開示は、所望の標的核酸遺伝子座を改変するための方法を提供する。本方法は、本明細書に開示された酵素および少なくとも１つの合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む本明細書で開示された非天然のシステムのいずれかを、標的核酸遺伝子座に送達する工程を含んでもよい。酵素は、少なくとも１つのｓｇＲＮＡと複合体を形成してもよく、複合体が所望の標的核酸遺伝子座に結合すると、所望の標的核酸遺伝子座を改変してもよい。酵素を前記遺伝子座に送達することは、上記システムまたは上記システムをコードする核酸で細胞をトランスフェクトすることを含んでもよい。ヌクレアーゼを前記遺伝子座に送達することは、上記システムまたは上記システムをコードする核酸で細胞をエレクトロポレーションすることを含んでもよい。ヌクレアーゼを前記遺伝子座に送達することは、所望の遺伝子座を含む核酸を有する緩衝液中でシステムをインキュベートすることを含んでもよい。場合によっては、標的核酸遺伝子座は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。標的核酸遺伝子座は、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、または細菌ＤＮＡを含んでもよい。標的核酸遺伝子座は細胞内にあってもよい。標的核酸遺伝子座はインビトロであってもよい。標的核酸遺伝子座は、真核細胞内にあっても、原核細胞内にあってもよい。細胞は、動物細胞、ヒト細胞、細菌細胞、古細菌細胞、または植物細胞であってもよい。酵素は、所望の標的遺伝子座で、またはその近辺で、一本鎖または二本鎖の切断を誘導してもよい。

【0233】

標的核酸の遺伝子座が細胞内にあり得る場合では、酵素は、配列番号：２２５３－２４８１のいずれか１つに対して、少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％）の同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを有する酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸として供給されてもよい。場合によっては、核酸は、エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームが動作可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、ヒトβアクチン、ＣＡＧ、ＴＲＥ、またはＣａＭＫＩＩａプロモーターであってもよい。エンドヌクレアーゼは、前記エンドヌクレアーゼをコードする前記オープンリーディングフレームを含むキャップされたｍＲＮＡとして供給されてもよい。エンドヌクレアーゼは、翻訳されたポリペプチドとして提供されてもよい。少なくとも１つの操作されたｓｇＲＮＡは、リボ核酸（ＲＮＡ）ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターに動作可能に連結された前記少なくとも１つの操作されたｓｇＲＮＡをコードする遺伝子配列を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）として供給されてもよい。場合によっては、生物は真核生物であってもよい。場合によっては、生物は真菌であってもよい。場合によっては、生物はヒトであってもよい。

【0234】

ＭＧ６酵素

【0235】

一態様では、本開示は、（ａ）エンドヌクレアーゼを含む操作されたヌクレアーゼシステムを提供する。場合によっては、エンドヌクレアーゼはＣａｓエンドヌクレアーゼである。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＩＩ型のクラスＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼである。エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、前記ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：２４８２－２４８９のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の配列同一性を有する。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：２４８２－２４８９のいずれか１つに対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有する。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、配列番号：２４８２－２４８９のいずれか１つに実質的に同一である。

【0236】

エンドヌクレアーゼは、配列番号：４２９６－４３０３のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４２９６－４３０３のいずれか１つに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは配列番号：４０５６－４０６６のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含んでいてもよい。

【0237】

場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：６６１－６６８のいずれか１つに対して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：６６１－６６８のいずれか１つと実質的に同一であってもよい。

【0238】

場合によっては、エンドヌクレアーゼは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を有する変異体を含んでもよい。ＮＬＳは前記エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端の近位であってもよい。ＮＬＳは、配列番号：６６１－６６８のいずれか１つのＮ末端またはＣ末端で、あるいは、配列番号：６６１－６６８のいずれか１つに対して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体のＮ末端またはＣ末端で付加されてもよい。ＮＬＳはＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳであってもよい。ＮＬＳはｃ－ｍｙｃ ＮＬＳであってもよい。ＮＬＳは、配列番号：５５９３－５６０８のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ＮＬＳは配列番号：５５９３－５６０８のいずれか１つと実質的に同一の配列を含むことができる。ＮＬＳは、表１の配列のいずれか、またはその組み合わせを含むことができる：

【0239】

場合によっては、配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、Ｎｏｖａｆｏｌｄ、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定されてもよい。配列同一性は、３のｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ（Ｗ）、１０のｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ（Ｅ）のパラメータを使用し、および１１のｅｘｉｓｔｅｎｃｅ、１のｅｘｔｅｎｓｉｏｎでギャップコストを設定するＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを使用し、および条件付き組成スコアマトリクス調整を使用して、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで決定することができる。

【0240】

場合によっては、上記システムは、（ｂ）所望の切断配列に相補的な５’標的化領域を有するエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができる、少なくとも１つの操作された合成ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）を含んでもよい。場合によっては、５’標的化領域は、エンドヌクレアーゼと適合可能なＰＡＭ配列を含んでもよい。場合によっては、標的化領域の５’のほとんどのヌクレオチドがＧであってもよい。場合によっては、５’標的化領域は１５～２３ヌクレオチド長であってもよい。ガイド配列およびｔｒａｃｒ配列は、別のリボ核酸（ＲＮＡ）または単一リボ核酸（ＲＮＡ）として供給されてもよい。ガイドＲＮＡは、標的化領域の３’にｃｒＲＮＡ ｔｒａｃｒＲＮＡ結合配列を含んでもよい。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ ｔｒａｃｒＲＮＡ結合領域の３’に４－ヌクレオチドリンカーが先行するｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは、５’から３’に、細胞の標的配列にハイブリダイズすることができる非天然ガイド核酸配列、および、ｔｒａｃｒ配列を含んでもよい。場合によっては、非天然ガイド核酸配列およびｔｒａｃｒ配列は共有結合される。

【0241】

場合によっては、ｔｒａｃｒ配列は特別な配列を有していてもよい。ｔｒａｃｒ配列は、天然のｔｒａｃｒＲＮＡ配列の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して少なくとも約８０％を有してもよい。

【0242】

場合によっては、上記システムは、標的ＤＮＡ遺伝子座における切断のために第１の領域および第２の領域を標的とする２つの異なるガイドＲＮＡを含んでいてもよく、ここで、第２の領域は第１の領域に対して３’である。場合によっては、上記システムは、５’から３’に、第１の領域の５’に少なくとも約２０（例えば、少なくとも約４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１ｋｂ）のヌクレオチドの配列を含む第１の相同性アーム、少なくとも約１０ヌクレオチドの合成ＤＮＡ配列、および、第２の領域の３’に少なくとも約２０（例えば、少なくとも約４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１ｋｂ）のヌクレオチドの配列を含む第２の相同性アームを含む、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ修復鋳型を含んでいてもよい。

【0243】

他の態様では、本開示は、所望の標的核酸遺伝子座を改変するための方法を提供する。本方法は、本明細書に開示された酵素および少なくとも１つの合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む本明細書で開示された非天然のシステムのいずれかを、標的核酸遺伝子座に送達する工程を含んでもよい。酵素は、少なくとも１つのｓｇＲＮＡと複合体を形成してもよく、複合体が所望の標的核酸遺伝子座に結合すると、所望の標的核酸遺伝子座を改変してもよい。酵素を前記遺伝子座に送達することは、上記システムまたは上記システムをコードする核酸で細胞をトランスフェクトすることを含んでもよい。ヌクレアーゼを前記遺伝子座に送達することは、上記システムまたは上記システムをコードする核酸で細胞をエレクトロポレーションすることを含んでもよい。ヌクレアーゼを前記遺伝子座に送達することは、所望の遺伝子座を含む核酸を有する緩衝液中でシステムをインキュベートすることを含んでもよい。場合によっては、標的核酸遺伝子座は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。標的核酸遺伝子座は、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、または細菌ＤＮＡを含んでもよい。標的核酸遺伝子座は細胞内にあってもよい。標的核酸遺伝子座はインビトロであってもよい。標的核酸遺伝子座は、真核細胞内にあっても、原核細胞内にあってもよい。細胞は、動物細胞、ヒト細胞、細菌細胞、古細菌細胞、または植物細胞であってもよい。酵素は、所望の標的遺伝子座で、またはその近辺で、一本鎖または二本鎖の切断を誘導してもよい。

【0244】

標的核酸の遺伝子座が細胞内にあり得る場合では、酵素は、配列番号：２４８２－２４８９のいずれか１つに対して、少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％）の同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを有する酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸として供給されてもよい。場合によっては、核酸は、エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームが動作可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、ヒトβアクチン、ＣＡＧ、ＴＲＥ、またはＣａＭＫＩＩａプロモーターであってもよい。エンドヌクレアーゼは、前記エンドヌクレアーゼをコードする前記オープンリーディングフレームを含むキャップされたｍＲＮＡとして供給されてもよい。エンドヌクレアーゼは、翻訳されたポリペプチドとして提供されてもよい。少なくとも１つの操作されたｓｇＲＮＡは、リボ核酸（ＲＮＡ）ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターに動作可能に連結された前記少なくとも１つの操作されたｓｇＲＮＡをコードする遺伝子配列を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）として供給されてもよい。場合によっては、生物は真核生物であってもよい。場合によっては、生物は真菌であってもよい。場合によっては、生物はヒトであってもよい。

【0245】

ＭＧ７酵素

【0246】

一態様では、本開示は、（ａ）エンドヌクレアーゼを含む操作されたヌクレアーゼシステムを提供する。場合によっては、エンドヌクレアーゼはＣａｓエンドヌクレアーゼである。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＩＩ型のクラスＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼである。エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、前記ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：２４９０－２４９８のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の配列同一性を有する。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：２４９０－２４９８のいずれか１つに対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有する。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、配列番号：２４９０－２４９８のいずれか１つに実質的に同一である。エンドヌクレアーゼは、配列番号：２４９０－２４９８のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の配列同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：２４９０－２４９８のいずれか１つに対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：２４９０－２４９８のいずれか１つに実質的に同一であるＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。

【0247】

エンドヌクレアーゼは、配列番号：４３０４－４３１２のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４３０４－４３１２のいずれか１つに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは配列番号：４３０４－４３１２のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは、配列番号：４３０４－４３１２のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４３０４－４３１２のいずれか１つに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは配列番号：４３０４－４３１２のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含んでいてもよい。

【0248】

場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：６６９－６７７のいずれか１つに対して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：６６９－６７７のいずれか１つと実質的に同一であってもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：６６９－６７７のいずれか１つに対して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：６６９－６７７のいずれか１つと実質的に同一であってもよい。

【0249】

場合によっては、エンドヌクレアーゼは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を有する変異体を含んでもよい。ＮＬＳは前記エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端の近位であってもよい。ＮＬＳは、配列番号：６６９－６７７のいずれか１つのＮ末端またはＣ末端で、あるいは、配列番号：６６９－６７７のいずれか１つに対して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体のＮ末端またはＣ末端で付加されてもよい。ＮＬＳはＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳであってもよい。ＮＬＳはｃ－ｍｙｃ ＮＬＳであってもよい。ＮＬＳは、配列番号：５５９３－５６０８のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ＮＬＳは配列番号：５５９３－５６０８のいずれか１つと実質的に同一の配列を含むことができる。ＮＬＳは、表１の配列のいずれか、またはその組み合わせを含むことができる：

【0250】

場合によっては、配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、Ｎｏｖａｆｏｌｄ、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定されてもよい。配列同一性は、３のｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ（Ｗ）、１０のｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ（Ｅ）のパラメータを使用し、および１１のｅｘｉｓｔｅｎｃｅ、１のｅｘｔｅｎｓｉｏｎでギャップコストを設定するＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを使用し、および条件付き組成スコアマトリクス調整を使用して、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで決定することができる。

【0251】

場合によっては、上記システムは、（ｂ）所望の切断配列に相補的な５’標的化領域を有するエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができる、少なくとも１つの操作された合成ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）を含んでもよい。場合によっては、５’標的化領域は、エンドヌクレアーゼと適合可能なＰＡＭ配列を含んでもよい。場合によっては、標的化領域の５’のほとんどのヌクレオチドがＧであってもよい。場合によっては、５’標的化領域は１５～２３ヌクレオチド長であってもよい。ガイド配列およびｔｒａｃｒ配列は、別のリボ核酸（ＲＮＡ）または単一リボ核酸（ＲＮＡ）として供給されてもよい。ガイドＲＮＡは、標的化領域の３’にｃｒＲＮＡ ｔｒａｃｒＲＮＡ結合配列を含んでもよい。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ ｔｒａｃｒＲＮＡ結合領域の３’に４－ヌクレオチドリンカーが先行するｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは、５’から３’に、細胞の標的配列にハイブリダイズすることができる非天然ガイド核酸配列、および、ｔｒａｃｒ配列を含んでもよい。場合によっては、非天然ガイド核酸配列およびｔｒａｃｒ配列は共有結合される。

【0252】

場合によっては、ｔｒａｃｒ配列は特別な配列を有していてもよい。ｔｒａｃｒ配列は、天然のｔｒａｃｒＲＮＡ配列の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して少なくとも約８０％を有してもよい。ｔｒａｃｒ配列は、配列番号：５５０４の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して少なくとも約８０％の配列同一性を有してもよい。場合によっては、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５５０４の少なくとも約６０～９０（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有してもよい。場合によっては、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５５０４の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドと実質的に同一であってもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５５０４を含んでもよい。

【0253】

場合によっては、上記システムは、標的ＤＮＡ遺伝子座における切断のために第１の領域および第２の領域を標的とする２つの異なるｓｇＲＮＡを含んでいてもよく、ここで、第２の領域は第１の領域に対して３’である。場合によっては、上記システムは、５’から３’に、第１の領域の５’に少なくとも約２０（例えば、少なくとも約４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１ｋｂ）のヌクレオチドの配列を含む第１の相同性アーム、少なくとも約１０ヌクレオチドの合成ＤＮＡ配列、および、第２の領域の３’に少なくとも約２０（例えば、少なくとも約４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１ｋｂ）のヌクレオチドの配列を含む第２の相同性アームを含む、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ修復鋳型を含んでいてもよい。

【0254】

他の態様では、本開示は、所望の標的核酸遺伝子座を改変するための方法を提供する。本方法は、本明細書に開示された酵素および少なくとも１つの合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む本明細書で開示された非天然のシステムのいずれかを、標的核酸遺伝子座に送達する工程を含んでもよい。酵素は、少なくとも１つのｓｇＲＮＡと複合体を形成してもよく、複合体が所望の標的核酸遺伝子座に結合すると、所望の標的核酸遺伝子座を改変してもよい。酵素を前記遺伝子座に送達することは、上記システムまたは上記システムをコードする核酸で細胞をトランスフェクトすることを含んでもよい。ヌクレアーゼを前記遺伝子座に送達することは、上記システムまたは上記システムをコードする核酸で細胞をエレクトロポレーションすることを含んでもよい。ヌクレアーゼを前記遺伝子座に送達することは、所望の遺伝子座を含む核酸を有する緩衝液中でシステムをインキュベートすることを含んでもよい。場合によっては、標的核酸遺伝子座は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。標的核酸遺伝子座は、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、または細菌ＤＮＡを含んでもよい。標的核酸遺伝子座は細胞内にあってもよい。標的核酸遺伝子座はインビトロであってもよい。標的核酸遺伝子座は、真核細胞内にあっても、原核細胞内にあってもよい。細胞は、動物細胞、ヒト細胞、細菌細胞、古細菌細胞、または植物細胞であってもよい。酵素は、所望の標的遺伝子座で、またはその近辺で、一本鎖または二本鎖の切断を誘導してもよい。

【0255】

標的核酸の遺伝子座が細胞内にあり得る場合では、酵素は、配列番号：２４９０－２４９８のいずれか１つに対して、少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％）の同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを有する酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸として供給されてもよい。場合によっては、核酸は、エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームが動作可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、ヒトβアクチン、ＣＡＧ、ＴＲＥ、またはＣａＭＫＩＩａプロモーターであってもよい。エンドヌクレアーゼは、前記エンドヌクレアーゼをコードする前記オープンリーディングフレームを含むキャップされたｍＲＮＡとして供給されてもよい。エンドヌクレアーゼは、翻訳されたポリペプチドとして提供されてもよい。少なくとも１つの操作されたｓｇＲＮＡは、リボ核酸（ＲＮＡ）ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターに動作可能に連結された前記少なくとも１つの操作されたｓｇＲＮＡをコードする遺伝子配列を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）として供給されてもよい。場合によっては、生物は真核生物であってもよい。場合によっては、生物は真菌であってもよい。場合によっては、生物はヒトであってもよい。

【0256】

ＭＧ１４酵素

【0257】

一態様では、本開示は、（ａ）エンドヌクレアーゼを含む操作されたヌクレアーゼシステムを提供する。場合によっては、エンドヌクレアーゼはＣａｓエンドヌクレアーゼである。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＩＩ型のクラスＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼである。エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、前記ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：２４９９－２７５０のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の配列同一性を有する。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：２４９９－２７５０のいずれか１つに対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有する。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、配列番号：２４９９－２７５０のいずれか１つに実質的に同一である。エンドヌクレアーゼは、配列番号：２４９９－２７５０のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の配列同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：２４９９－２７５０のいずれか１つに対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：２４９９－２７５０のいずれか１つに実質的に同一であるＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。

【0258】

エンドヌクレアーゼは、配列番号：４３１３－４５６４のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４３１３－４５６４のいずれか１つに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは配列番号：４３１３－４５６４のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは、配列番号：４３１３－４５６４のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４０６７－４２９５のいずれか１つに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは配列番号：４３１３－４５６４のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含んでいてもよい。

【0259】

場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：６７８－９２９のいずれか１つに対して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：６７８－９２９のいずれか１つと実質的に同一であってもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：６７８－９２９のいずれか１つに対して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：６７８－９２９のいずれか１つと実質的に同一であってもよい。

【0260】

場合によっては、エンドヌクレアーゼは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を有する変異体を含んでもよい。ＮＬＳは前記エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端の近位であってもよい。ＮＬＳは、配列番号：６７８－９２９のいずれか１つのＮ末端またはＣ末端で、あるいは、配列番号：６７８－９２９のいずれか１つに対して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体のＮ末端またはＣ末端で付加されてもよい。ＮＬＳはＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳであってもよい。ＮＬＳはｃ－ｍｙｃ ＮＬＳであってもよい。ＮＬＳは、配列番号：５５９３－５６０８のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ＮＬＳは配列番号：５５９３－５６０８のいずれか１つと実質的に同一の配列を含むことができる。ＮＬＳは、表１の配列のいずれか、またはその組み合わせを含むことができる：

【0261】

場合によっては、配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、Ｎｏｖａｆｏｌｄ、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定されてもよい。配列同一性は、３のｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ（Ｗ）、１０のｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ（Ｅ）のパラメータを使用し、および１１のｅｘｉｓｔｅｎｃｅ、１のｅｘｔｅｎｓｉｏｎでギャップコストを設定するＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを使用し、および条件付き組成スコアマトリクス調整を使用して、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで決定することができる。

【0262】

場合によっては、上記システムは、（ｂ）所望の切断配列に相補的な５’標的化領域を有するエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができる、少なくとも１つの操作された合成ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）を含んでもよい。場合によっては、５’標的化領域は、エンドヌクレアーゼと適合可能なＰＡＭ配列を含んでもよい。場合によっては、標的化領域の５’のほとんどのヌクレオチドがＧであってもよい。場合によっては、５’標的化領域は１５～２３ヌクレオチド長であってもよい。ガイド配列およびｔｒａｃｒ配列は、別のリボ核酸（ＲＮＡ）または単一リボ核酸（ＲＮＡ）として供給されてもよい。ガイドＲＮＡは、標的化領域の３’にｃｒＲＮＡ ｔｒａｃｒＲＮＡ結合配列を含んでもよい。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ ｔｒａｃｒＲＮＡ結合領域の３’に４－ヌクレオチドリンカーが先行するｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは、５’から３’に、細胞の標的配列にハイブリダイズすることができる非天然ガイド核酸配列、および、ｔｒａｃｒ配列を含んでもよい。場合によっては、非天然ガイド核酸配列およびｔｒａｃｒ配列は共有結合される。

【0263】

場合によっては、ｔｒａｃｒ配列は特別な配列を有していてもよい。ｔｒａｃｒ配列は、天然のｔｒａｃｒＲＮＡ配列の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して少なくとも約８０％を有してもよい。ｔｒａｃｒ配列は、配列番号：５５０５の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して少なくとも約８０％の配列同一性を有してもよい。場合によっては、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５５０５の少なくとも約６０～９０（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有してもよい。場合によっては、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５５０５の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドと実質的に同一であってもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５５０５を含んでもよい。

【0264】

場合によっては、エンドヌクレアーゼと複合体を形成することができる少なくとも１つの操作された合成ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）は、配列番号：５４６９に対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは、配列番号：５４６９に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは配列番号：５４６９と実質的に同一の配列を含んでもよい。

【0265】

場合によっては、上記システムは、標的ＤＮＡ遺伝子座における切断のために第１の領域および第２の領域を標的とする２つの異なるｓｇＲＮＡを含んでいてもよく、ここで、第２の領域は第１の領域に対して３’である。場合によっては、上記システムは、５’から３’に、第１の領域の５’に少なくとも約２０（例えば、少なくとも約４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１ｋｂ）のヌクレオチドの配列を含む第１の相同性アーム、少なくとも約１０ヌクレオチドの合成ＤＮＡ配列、および、第２の領域の３’に少なくとも約２０（例えば、少なくとも約４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１ｋｂ）のヌクレオチドの配列を含む第２の相同性アームを含む、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ修復鋳型を含んでいてもよい。

【0266】

他の態様では、本開示は、所望の標的核酸遺伝子座を改変するための方法を提供する。本方法は、本明細書に開示された酵素および少なくとも１つの合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む本明細書で開示された非天然のシステムのいずれかを、標的核酸遺伝子座に送達する工程を含んでもよい。酵素は、少なくとも１つのｓｇＲＮＡと複合体を形成してもよく、複合体が所望の標的核酸遺伝子座に結合すると、所望の標的核酸遺伝子座を改変してもよい。酵素を前記遺伝子座に送達することは、上記システムまたは上記システムをコードする核酸で細胞をトランスフェクトすることを含んでもよい。ヌクレアーゼを前記遺伝子座に送達することは、上記システムまたは上記システムをコードする核酸で細胞をエレクトロポレーションすることを含んでもよい。ヌクレアーゼを前記遺伝子座に送達することは、所望の遺伝子座を含む核酸を有する緩衝液中でシステムをインキュベートすることを含んでもよい。場合によっては、標的核酸遺伝子座は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。標的核酸遺伝子座は、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、または細菌ＤＮＡを含んでもよい。標的核酸遺伝子座は細胞内にあってもよい。標的核酸遺伝子座はインビトロであってもよい。標的核酸遺伝子座は、真核細胞内にあっても、原核細胞内にあってもよい。細胞は、動物細胞、ヒト細胞、細菌細胞、古細菌細胞、または植物細胞であってもよい。酵素は、所望の標的遺伝子座で、またはその近辺で、一本鎖または二本鎖の切断を誘導してもよい。

【0267】

標的核酸の遺伝子座が細胞内にあり得る場合では、酵素は、配列番号：２４９９－２７５０のいずれか１つに対して、少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％）の同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを有する酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸として供給されてもよい。前記エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、配列番号：５５８１と実質的に同一の配列、あるいは、配列番号：５５８１に対して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでもよい。場合によっては、核酸は、エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームが動作可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、ヒトβアクチン、ＣＡＧ、ＴＲＥ、またはＣａＭＫＩＩａプロモーターであってもよい。エンドヌクレアーゼは、前記エンドヌクレアーゼをコードする前記オープンリーディングフレームを含むキャップされたｍＲＮＡとして供給されてもよい。エンドヌクレアーゼは、翻訳されたポリペプチドとして提供されてもよい。少なくとも１つの操作されたｓｇＲＮＡは、リボ核酸（ＲＮＡ）ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターに動作可能に連結された前記少なくとも１つの操作されたｓｇＲＮＡをコードする遺伝子配列を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）として供給されてもよい。場合によっては、生物は真核生物であってもよい。場合によっては、生物は真菌であってもよい。場合によっては、生物はヒトであってもよい。

【0268】

ＭＧ１５酵素

【0269】

一態様では、本開示は、（ａ）エンドヌクレアーゼを含む操作されたヌクレアーゼシステムを提供する。場合によっては、エンドヌクレアーゼはＣａｓエンドヌクレアーゼである。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＩＩ型のクラスＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼである。エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、前記ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：２７５１－２９１３のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の配列同一性を有する。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：２７５１－２９１３のいずれか１つに対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有する。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、配列番号：２７５１－２９１３のいずれか１つに実質的に同一である。エンドヌクレアーゼは、配列番号：２７５１－２９１３のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の配列同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：２７５１－２９１３のいずれか１つに対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：２７５１－２９１３のいずれか１つに実質的に同一であるＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。

【0270】

エンドヌクレアーゼは、配列番号：４５６５－４７２７のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４５６５－４７２７のいずれか１つに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは配列番号：４５６５－４７２７のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは、配列番号：４５６５－４７２７のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４５６５－４７２７のいずれか１つに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは配列番号：４５６５－４７２７のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含んでいてもよい。

【0271】

場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：９３０－１０９２のいずれか１つに対して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：９３０－１０９２のいずれか１つと実質的に同一であってもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：９３０－１０９２のいずれか１つに対して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：９３０－１０９２のいずれか１つと実質的に同一であってもよい。

【0272】

場合によっては、エンドヌクレアーゼは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を有する変異体を含んでもよい。ＮＬＳは前記エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端の近位であってもよい。ＮＬＳは、配列番号：９３０－１０９２のいずれか１つのＮ末端またはＣ末端で、あるいは、配列番号：９３０－１０９２のいずれか１つに対して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体のＮ末端またはＣ末端で付加されてもよい。ＮＬＳはＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳであってもよい。ＮＬＳはｃ－ｍｙｃ ＮＬＳであってもよい。ＮＬＳは、配列番号：５５９３－５６０８のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ＮＬＳは配列番号：５５９３－５６０８のいずれか１つと実質的に同一の配列を含むことができる。ＮＬＳは、表１の配列のいずれか、またはその組み合わせを含むことができる：

【0273】

場合によっては、配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、Ｎｏｖａｆｏｌｄ、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定されてもよい。配列同一性は、３のｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ（Ｗ）、１０のｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ（Ｅ）のパラメータを使用し、および１１のｅｘｉｓｔｅｎｃｅ、１のｅｘｔｅｎｓｉｏｎでギャップコストを設定するＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを使用し、および条件付き組成スコアマトリクス調整を使用して、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで決定することができる。

【0274】

場合によっては、上記システムは、（ｂ）所望の切断配列に相補的な５’標的化領域を有するエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができる、少なくとも１つの操作された合成ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）を含んでもよい。場合によっては、５’標的化領域は、エンドヌクレアーゼと適合可能なＰＡＭ配列を含んでもよい。場合によっては、標的化領域の５’のほとんどのヌクレオチドがＧであってもよい。場合によっては、５’標的化領域は１５～２３ヌクレオチド長であってもよい。ガイド配列およびｔｒａｃｒ配列は、別のリボ核酸（ＲＮＡ）または単一リボ核酸（ＲＮＡ）として供給されてもよい。ガイドＲＮＡは、標的化領域の３’にｃｒＲＮＡ ｔｒａｃｒＲＮＡ結合配列を含んでもよい。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ ｔｒａｃｒＲＮＡ結合領域の３’に４－ヌクレオチドリンカーが先行するｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは、５’から３’に、細胞の標的配列にハイブリダイズすることができる非天然ガイド核酸配列、および、ｔｒａｃｒ配列を含んでもよい。場合によっては、非天然ガイド核酸配列およびｔｒａｃｒ配列は共有結合される。

【0275】

場合によっては、ｔｒａｃｒ配列は特別な配列を有していてもよい。ｔｒａｃｒ配列は、天然のｔｒａｃｒＲＮＡ配列の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して少なくとも約８０％を有してもよい。ｔｒａｃｒ配列は、配列番号：５５０６の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して少なくとも約８０％の配列同一性を有してもよい。場合によっては、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５５０６の少なくとも約６０～９０（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有してもよい。場合によっては、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５５０６の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドと実質的に同一であってもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５５０６を含んでもよい。

【0276】

場合によっては、エンドヌクレアーゼと複合体を形成することができる少なくとも１つの操作された合成ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）は、配列番号：５４７０に対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは、配列番号：５４７０に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは配列番号：５４７０と実質的に同一の配列を含んでもよい。

【0277】

場合によっては、上記システムは、標的ＤＮＡ遺伝子座における切断のために第１の領域および第２の領域を標的とする２つの異なるｓｇＲＮＡを含んでいてもよく、ここで、第２の領域は第１の領域に対して３’である。場合によっては、上記システムは、５’から３’に、第１の領域の５’に少なくとも約２０（例えば、少なくとも約４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１ｋｂ）のヌクレオチドの配列を含む第１の相同性アーム、少なくとも約１０ヌクレオチドの合成ＤＮＡ配列、および、第２の領域の３’に少なくとも約２０（例えば、少なくとも約４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１ｋｂ）のヌクレオチドの配列を含む第２の相同性アームを含む、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ修復鋳型を含んでいてもよい。

【0278】

他の態様では、本開示は、所望の標的核酸遺伝子座を改変するための方法を提供する。本方法は、本明細書に開示された酵素および少なくとも１つの合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む本明細書で開示された非天然のシステムのいずれかを、標的核酸遺伝子座に送達する工程を含んでもよい。酵素は、少なくとも１つのｓｇＲＮＡと複合体を形成してもよく、複合体が所望の標的核酸遺伝子座に結合すると、所望の標的核酸遺伝子座を改変してもよい。酵素を前記遺伝子座に送達することは、上記システムまたは上記システムをコードする核酸で細胞をトランスフェクトすることを含んでもよい。ヌクレアーゼを前記遺伝子座に送達することは、上記システムまたは上記システムをコードする核酸で細胞をエレクトロポレーションすることを含んでもよい。ヌクレアーゼを前記遺伝子座に送達することは、所望の遺伝子座を含む核酸を有する緩衝液中でシステムをインキュベートすることを含んでもよい。場合によっては、標的核酸遺伝子座は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。標的核酸遺伝子座は、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、または細菌ＤＮＡを含んでもよい。標的核酸遺伝子座は細胞内にあってもよい。標的核酸遺伝子座はインビトロであってもよい。標的核酸遺伝子座は、真核細胞内にあっても、原核細胞内にあってもよい。細胞は、動物細胞、ヒト細胞、細菌細胞、古細菌細胞、または植物細胞であってもよい。酵素は、所望の標的遺伝子座で、またはその近辺で、一本鎖または二本鎖の切断を誘導してもよい。

【0279】

標的核酸の遺伝子座が細胞内にあり得る場合では、酵素は、配列番号：２７５１－２９１３のいずれか１つに対して、少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％）の同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを有する酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸として供給されてもよい。前記エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、配列番号：５５８２と実質的に同一の配列、あるいは、配列番号：５５８２に対して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでもよい。場合によっては、核酸は、エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームが動作可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、ヒトβアクチン、ＣＡＧ、ＴＲＥ、またはＣａＭＫＩＩａプロモーターであってもよい。エンドヌクレアーゼは、前記エンドヌクレアーゼをコードする前記オープンリーディングフレームを含むキャップされたｍＲＮＡとして供給されてもよい。エンドヌクレアーゼは、翻訳されたポリペプチドとして提供されてもよい。少なくとも１つの操作されたｓｇＲＮＡは、リボ核酸（ＲＮＡ）ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターに動作可能に連結された前記少なくとも１つの操作されたｓｇＲＮＡをコードする遺伝子配列を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）として供給されてもよい。場合によっては、生物は真核生物であってもよい。場合によっては、生物は真菌であってもよい。場合によっては、生物はヒトであってもよい。

【0280】

ＭＧ１６酵素

【0281】

一態様では、本開示は、（ａ）エンドヌクレアーゼを含む操作されたヌクレアーゼシステムを提供する。場合によっては、エンドヌクレアーゼはＣａｓエンドヌクレアーゼである。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＩＩ型のクラスＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼである。エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、前記ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：２９１４－３１７４のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の配列同一性を有する。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：２９１４－３１７４のいずれか１つに対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有する。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、配列番号：２９１４－３１７４のいずれか１つに実質的に同一である。エンドヌクレアーゼは、配列番号：２９１４－３１７４のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の配列同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：２９１４－３１７４のいずれか１つに対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：２９１４－３１７４のいずれか１つに実質的に同一であるＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。

【0282】

エンドヌクレアーゼは、配列番号：４７２８－４９８８のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４７２８－４９８８のいずれか１つに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは配列番号：４７２８－４９８８のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは、配列番号：４７２８－４９８８のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４７２８－４９８８のいずれか１つに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは配列番号：４７２８－４９８８のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含んでいてもよい。

【0283】

場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１０９３－１３５３のいずれか１つに対して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１０９３－１３５３のいずれか１つと実質的に同一であってもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１０９３－１３５３のいずれか１つに対して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１０９３－１３５３のいずれか１つと実質的に同一であってもよい。

【0284】

場合によっては、エンドヌクレアーゼは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を有する変異体を含んでもよい。ＮＬＳは前記エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端の近位であってもよい。ＮＬＳは、配列番号：１０９３－１３５３のいずれか１つに対してＮ末端またはＣ末端で、あるいは、配列番号：１０９３－１３５３のいずれか１つに対して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体に、付加されてもよい。ＮＬＳはＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳであってもよい。ＮＬＳはｃ－ｍｙｃ ＮＬＳであってもよい。ＮＬＳは、配列番号：５５９３－５６０８のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ＮＬＳは配列番号：５５９３－５６０８のいずれか１つと実質的に同一の配列を含むことができる。ＮＬＳは、表１の配列のいずれか、またはその組み合わせを含むことができる：

【0285】

場合によっては、配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、Ｎｏｖａｆｏｌｄ、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定されてもよい。配列同一性は、３のｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ（Ｗ）、１０のｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ（Ｅ）のパラメータを使用し、および１１のｅｘｉｓｔｅｎｃｅ、１のｅｘｔｅｎｓｉｏｎでギャップコストを設定するＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを使用し、および条件付き組成スコアマトリクス調整を使用して、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで決定することができる。

【0286】

場合によっては、上記システムは、（ｂ）所望の切断配列に相補的な５’標的化領域を有するエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができる、少なくとも１つの操作された合成ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）を含んでもよい。場合によっては、５’標的化領域は、エンドヌクレアーゼと適合可能なＰＡＭ配列を含んでもよい。場合によっては、標的化領域の５’のほとんどのヌクレオチドがＧであってもよい。場合によっては、５’標的化領域は１５～２３ヌクレオチド長であってもよい。ガイド配列およびｔｒａｃｒ配列は、別のリボ核酸（ＲＮＡ）または単一リボ核酸（ＲＮＡ）として供給されてもよい。ガイドＲＮＡは、標的化領域の３’にｃｒＲＮＡ ｔｒａｃｒＲＮＡ結合配列を含んでもよい。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ ｔｒａｃｒＲＮＡ結合領域の３’に４－ヌクレオチドリンカーが先行するｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは、５’から３’に、細胞の標的配列にハイブリダイズすることができる非天然ガイド核酸配列、および、ｔｒａｃｒ配列を含んでもよい。場合によっては、非天然ガイド核酸配列およびｔｒａｃｒ配列は共有結合される。

【0287】

場合によっては、ｔｒａｃｒ配列は特別な配列を有していてもよい。ｔｒａｃｒ配列は、天然のｔｒａｃｒＲＮＡ配列の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して少なくとも約８０％を有してもよい。ｔｒａｃｒ配列は、配列番号：５５０７の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して少なくとも約８０％の配列同一性を有してもよい。場合によっては、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５５０７の少なくとも約６０～９０（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有してもよい。場合によっては、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５５０７の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドと実質的に同一であってもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５５０７を含んでもよい。

【0288】

場合によっては、エンドヌクレアーゼと複合体を形成することができる少なくとも１つの操作された合成ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）は、配列番号：５４７１に対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは、配列番号：５４７１に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは配列番号：５４７１と実質的に同一の配列を含んでもよい。

【0289】

場合によっては、上記システムは、標的ＤＮＡ遺伝子座における切断のために第１の領域および第２の領域を標的とする２つの異なるｓｇＲＮＡを含んでいてもよく、ここで、第２の領域は第１の領域に対して３’である。場合によっては、上記システムは、５’から３’に、第１の領域の５’に少なくとも約２０（例えば、少なくとも約４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１ｋｂ）のヌクレオチドの配列を含む第１の相同性アーム、少なくとも約１０ヌクレオチドの合成ＤＮＡ配列、および、第２の領域の３’に少なくとも約２０（例えば、少なくとも約４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１ｋｂ）のヌクレオチドの配列を含む第２の相同性アームを含む、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ修復鋳型を含んでいてもよい。

【0290】

他の態様では、本開示は、所望の標的核酸遺伝子座を改変するための方法を提供する。本方法は、本明細書に開示された酵素および少なくとも１つの合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む本明細書で開示された非天然のシステムのいずれかを、標的核酸遺伝子座に送達する工程を含んでもよい。酵素は、少なくとも１つのｓｇＲＮＡと複合体を形成してもよく、複合体が所望の標的核酸遺伝子座に結合すると、所望の標的核酸遺伝子座を改変してもよい。酵素を前記遺伝子座に送達することは、上記システムまたは上記システムをコードする核酸で細胞をトランスフェクトすることを含んでもよい。ヌクレアーゼを前記遺伝子座に送達することは、上記システムまたは上記システムをコードする核酸で細胞をエレクトロポレーションすることを含んでもよい。ヌクレアーゼを前記遺伝子座に送達することは、所望の遺伝子座を含む核酸を有する緩衝液中でシステムをインキュベートすることを含んでもよい。場合によっては、標的核酸遺伝子座は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。標的核酸遺伝子座は、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、または細菌ＤＮＡを含んでもよい。標的核酸遺伝子座は細胞内にあってもよい。標的核酸遺伝子座はインビトロであってもよい。標的核酸遺伝子座は、真核細胞内にあっても、原核細胞内にあってもよい。細胞は、動物細胞、ヒト細胞、細菌細胞、古細菌細胞、または植物細胞であってもよい。酵素は、所望の標的遺伝子座で、またはその近辺で、一本鎖または二本鎖の切断を誘導してもよい。

【0291】

標的核酸の遺伝子座が細胞内にあり得る場合では、酵素は、配列番号：２９１４－３１７４のいずれか１つに対して、少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％）の同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを有する酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸として供給されてもよい。前記エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、配列番号：５５８３と実質的に同一の配列、あるいは、配列番号：５５８３に対して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでもよい。場合によっては、核酸は、エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームが動作可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、ヒトβアクチン、ＣＡＧ、ＴＲＥ、またはＣａＭＫＩＩａプロモーターであってもよい。エンドヌクレアーゼは、前記エンドヌクレアーゼをコードする前記オープンリーディングフレームを含むキャップされたｍＲＮＡとして供給されてもよい。エンドヌクレアーゼは、翻訳されたポリペプチドとして提供されてもよい。少なくとも１つの操作されたｓｇＲＮＡは、リボ核酸（ＲＮＡ）ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターに動作可能に連結された前記少なくとも１つの操作されたｓｇＲＮＡをコードする遺伝子配列を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）として供給されてもよい。場合によっては、生物は真核生物であってもよい。場合によっては、生物は真菌であってもよい。場合によっては、生物はヒトであってもよい。

【0292】

ＭＧ１８酵素

【0293】

一態様では、本開示は、（ａ）エンドヌクレアーゼを含む操作されたヌクレアーゼシステムを提供する。場合によっては、エンドヌクレアーゼはＣａｓエンドヌクレアーゼである。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＩＩ型のクラスＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼである。エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、前記ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：３１７５－３３００のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の配列同一性を有する。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：３１７５－３３００のいずれか１つに対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有する。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、配列番号：３１７５－３３００のいずれか１つに実質的に同一である。エンドヌクレアーゼは、配列番号：３１７５－３３００のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の配列同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：３１７５－３３００のいずれか１つに対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：３１７５－３３００のいずれか１つに実質的に同一であるＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。

【0294】

エンドヌクレアーゼは、配列番号：４９８９－５１４６のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４９８９－５１４６のいずれか１つに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは配列番号：４９８９－５１４６のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは、配列番号：４９８９－５１４６のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：４９８９－５１４６のいずれか１つに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは配列番号：４９８９－５１４６のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含んでいてもよい。

【0295】

場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１３５４－１５１１のいずれか１つに対して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１３５４－１５１１のいずれか１つと実質的に同一であってもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１３５４－１５１１のいずれか１つに対して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１３５４－１５１１のいずれか１つと実質的に同一であってもよい。

【0296】

場合によっては、エンドヌクレアーゼは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を有する変異体を含んでもよい。ＮＬＳは前記エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端の近位であってもよい。ＮＬＳは、配列番号：１３５４－１５１１のいずれか１つのＮ末端またはＣ末端で、あるいは、配列番号：１３５４－１５１１のいずれか１つに対して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体のＮ末端またはＣ末端で付加されてもよい。ＮＬＳはＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳであってもよい。ＮＬＳはｃ－ｍｙｃ ＮＬＳであってもよい。ＮＬＳは、配列番号：５５９３－５６０８のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ＮＬＳは配列番号：５５９３－５６０８のいずれか１つと実質的に同一の配列を含むことができる。ＮＬＳは、表１の配列のいずれか、またはその組み合わせを含むことができる：

【0297】

場合によっては、配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、Ｎｏｖａｆｏｌｄ、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定されてもよい。配列同一性は、３のｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ（Ｗ）、１０のｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ（Ｅ）のパラメータを使用し、および１１のｅｘｉｓｔｅｎｃｅ、１のｅｘｔｅｎｓｉｏｎでギャップコストを設定するＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを使用し、および条件付き組成スコアマトリクス調整を使用して、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで決定することができる。

【0298】

場合によっては、上記システムは、（ｂ）所望の切断配列に相補的な５’標的化領域を有するエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができる、少なくとも１つの操作された合成ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）を含んでもよい。場合によっては、５’標的化領域は、エンドヌクレアーゼと適合可能なＰＡＭ配列を含んでもよい。場合によっては、標的化領域の５’のほとんどのヌクレオチドがＧであってもよい。場合によっては、５’標的化領域は１５～２３ヌクレオチド長であってもよい。ガイド配列およびｔｒａｃｒ配列は、別のリボ核酸（ＲＮＡ）または単一リボ核酸（ＲＮＡ）として供給されてもよい。ガイドＲＮＡは、標的化領域の３’にｃｒＲＮＡ ｔｒａｃｒＲＮＡ結合配列を含んでもよい。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ ｔｒａｃｒＲＮＡ結合領域の３’に４－ヌクレオチドリンカーが先行するｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは、５’から３’に、細胞の標的配列にハイブリダイズすることができる非天然ガイド核酸配列、および、ｔｒａｃｒ配列を含んでもよい。場合によっては、非天然ガイド核酸配列およびｔｒａｃｒ配列は共有結合される。

【0299】

場合によっては、ｔｒａｃｒ配列は特別な配列を有していてもよい。ｔｒａｃｒ配列は、天然のｔｒａｃｒＲＮＡ配列の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して少なくとも約８０％を有してもよい。ｔｒａｃｒ配列は、配列番号：５５０８の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して少なくとも約８０％の配列同一性を有してもよい。場合によっては、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５５０８の少なくとも約６０～９０（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有してもよい。場合によっては、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５５０８の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドと実質的に同一であってもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５５０８を含んでもよい。

【0300】

場合によっては、エンドヌクレアーゼと複合体を形成することができる少なくとも１つの操作された合成ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）は、配列番号：５４７２に対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは、配列番号：５４７２に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは配列番号：５４７２と実質的に同一の配列を含んでもよい。

【0301】

場合によっては、上記システムは、標的ＤＮＡ遺伝子座における切断のために第１の領域および第２の領域を標的とする２つの異なるｓｇＲＮＡを含んでいてもよく、ここで、第２の領域は第１の領域に対して３’である。場合によっては、上記システムは、５’から３’に、第１の領域の５’に少なくとも約２０（例えば、少なくとも約４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１ｋｂ）のヌクレオチドの配列を含む第１の相同性アーム、少なくとも約１０ヌクレオチドの合成ＤＮＡ配列、および、第２の領域の３’に少なくとも約２０（例えば、少なくとも約４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１ｋｂ）のヌクレオチドの配列を含む第２の相同性アームを含む、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ修復鋳型を含んでいてもよい。

【0302】

他の態様では、本開示は、所望の標的核酸遺伝子座を改変するための方法を提供する。本方法は、本明細書に開示された酵素および少なくとも１つの合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む本明細書で開示された非天然のシステムのいずれかを、標的核酸遺伝子座に送達する工程を含んでもよい。酵素は、少なくとも１つのｓｇＲＮＡと複合体を形成してもよく、複合体が所望の標的核酸遺伝子座に結合すると、所望の標的核酸遺伝子座を改変してもよい。酵素を前記遺伝子座に送達することは、上記システムまたは上記システムをコードする核酸で細胞をトランスフェクトすることを含んでもよい。ヌクレアーゼを前記遺伝子座に送達することは、上記システムまたは上記システムをコードする核酸で細胞をエレクトロポレーションすることを含んでもよい。ヌクレアーゼを前記遺伝子座に送達することは、所望の遺伝子座を含む核酸を有する緩衝液中でシステムをインキュベートすることを含んでもよい。場合によっては、標的核酸遺伝子座は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。標的核酸遺伝子座は、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、または細菌ＤＮＡを含んでもよい。標的核酸遺伝子座は細胞内にあってもよい。標的核酸遺伝子座はインビトロであってもよい。標的核酸遺伝子座は、真核細胞内にあっても、原核細胞内にあってもよい。細胞は、動物細胞、ヒト細胞、細菌細胞、古細菌細胞、または植物細胞であってもよい。酵素は、所望の標的遺伝子座で、またはその近辺で、一本鎖または二本鎖の切断を誘導してもよい。

【0303】

標的核酸の遺伝子座が細胞内にあり得る場合では、酵素は、配列番号：３１７５－３３００のいずれか１つに対して、少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％）の同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを有する酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸として供給されてもよい。前記エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、配列番号：５５８４と実質的に同一の配列、あるいは、配列番号：５５８４に対して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでもよい。場合によっては、核酸は、エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームが動作可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、ヒトβアクチン、ＣＡＧ、ＴＲＥ、またはＣａＭＫＩＩａプロモーターであってもよい。エンドヌクレアーゼは、前記エンドヌクレアーゼをコードする前記オープンリーディングフレームを含むキャップされたｍＲＮＡとして供給されてもよい。エンドヌクレアーゼは、翻訳されたポリペプチドとして提供されてもよい。少なくとも１つの操作されたｓｇＲＮＡは、リボ核酸（ＲＮＡ）ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターに動作可能に連結された前記少なくとも１つの操作されたｓｇＲＮＡをコードする遺伝子配列を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）として供給されてもよい。場合によっては、生物は真核生物であってもよい。場合によっては、生物は真菌であってもよい。場合によっては、生物はヒトであってもよい。

【0304】

ＭＧ２１酵素

【0305】

一態様では、本開示は、（ａ）エンドヌクレアーゼを含む操作されたヌクレアーゼシステムを提供する。場合によっては、エンドヌクレアーゼはＣａｓエンドヌクレアーゼである。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＩＩ型のクラスＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼである。エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、前記ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：３３３１－３４７４のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の配列同一性を有する。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：３３３１－３４７４のいずれか１つに対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有する。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、配列番号：３３３１－３４７４のいずれか１つに実質的に同一である。エンドヌクレアーゼは、配列番号：３３３１－３４７４のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の配列同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：３３３１－３４７４のいずれか１つに対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：３３３１－３４７４のいずれか１つに実質的に同一であるＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。

【0306】

エンドヌクレアーゼは、配列番号：５１４７－５２９０のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５１４７－５２９０のいずれか１つに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは配列番号：５１４７－５２９０のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは、配列番号：５１４７－５２９０のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５１４７－５２９０のいずれか１つに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは配列番号：５１４７－５２９０のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含んでいてもよい。

【0307】

場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１５１２－１６５５のいずれか１つに対して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１５１２－１６５５のいずれか１つと実質的に同一であってもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１５１２－１６５５のいずれか１つに対して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１５１２－１６５５のいずれか１つと実質的に同一であってもよい。

【0308】

場合によっては、エンドヌクレアーゼは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を有する変異体を含んでもよい。ＮＬＳは前記エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端の近位であってもよい。ＮＬＳは、配列番号：１５１２－１６５５のいずれか１つのＮ末端またはＣ末端で、あるいは、配列番号：１５１２－１６５５のいずれか１つに対して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体のＮ末端またはＣ末端で付加されてもよい。ＮＬＳはＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳであってもよい。ＮＬＳはｃ－ｍｙｃ ＮＬＳであってもよい。ＮＬＳは、配列番号：５５９３－５６０８のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ＮＬＳは配列番号：５５９３－５６０８のいずれか１つと実質的に同一の配列を含むことができる。ＮＬＳは、表１の配列のいずれか、またはその組み合わせを含むことができる：

【0309】

場合によっては、配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、Ｎｏｖａｆｏｌｄ、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定されてもよい。配列同一性は、３のｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ（Ｗ）、１０のｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ（Ｅ）のパラメータを使用し、および１１のｅｘｉｓｔｅｎｃｅ、１のｅｘｔｅｎｓｉｏｎでギャップコストを設定するＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを使用し、および条件付き組成スコアマトリクス調整を使用して、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで決定することができる。

【0310】

場合によっては、上記システムは、（ｂ）所望の切断配列に相補的な５’標的化領域を有するエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができる、少なくとも１つの操作された合成ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）を含んでもよい。場合によっては、５’標的化領域は、エンドヌクレアーゼと適合可能なＰＡＭ配列を含んでもよい。場合によっては、標的化領域の５’のほとんどのヌクレオチドがＧであってもよい。場合によっては、５’標的化領域は１５～２３ヌクレオチド長であってもよい。ガイド配列およびｔｒａｃｒ配列は、別のリボ核酸（ＲＮＡ）または単一リボ核酸（ＲＮＡ）として供給されてもよい。ガイドＲＮＡは、標的化領域の３’にｃｒＲＮＡ ｔｒａｃｒＲＮＡ結合配列を含んでもよい。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ ｔｒａｃｒＲＮＡ結合領域の３’に４－ヌクレオチドリンカーが先行するｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは、５’から３’に、細胞の標的配列にハイブリダイズすることができる非天然ガイド核酸配列、および、ｔｒａｃｒ配列を含んでもよい。場合によっては、非天然ガイド核酸配列およびｔｒａｃｒ配列は共有結合される。

【0311】

場合によっては、ｔｒａｃｒ配列は特別な配列を有していてもよい。ｔｒａｃｒ配列は、天然のｔｒａｃｒＲＮＡ配列の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して少なくとも約８０％を有してもよい。ｔｒａｃｒ配列は、配列番号：５５０９の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して少なくとも約８０％の配列同一性を有してもよい。場合によっては、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５５０９の少なくとも約６０～９０（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有してもよい。場合によっては、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５５０９の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドと実質的に同一であってもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５５０９を含んでもよい。

【0312】

場合によっては、エンドヌクレアーゼと複合体を形成することができる少なくとも１つの操作された合成ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）は、配列番号：５４７３に対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは、配列番号：５４７３に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは配列番号：５４７３と実質的に同一の配列を含んでもよい。

【0313】

場合によっては、上記システムは、標的ＤＮＡ遺伝子座における切断のために第１の領域および第２の領域を標的とする２つの異なるｓｇＲＮＡを含んでいてもよく、ここで、第２の領域は第１の領域に対して３’である。場合によっては、上記システムは、５’から３’に、第１の領域の５’に少なくとも約２０（例えば、少なくとも約４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１ｋｂ）のヌクレオチドの配列を含む第１の相同性アーム、少なくとも約１０ヌクレオチドの合成ＤＮＡ配列、および、第２の領域の３’に少なくとも約２０（例えば、少なくとも約４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１ｋｂ）のヌクレオチドの配列を含む第２の相同性アームを含む、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ修復鋳型を含んでいてもよい。

【0314】

他の態様では、本開示は、所望の標的核酸遺伝子座を改変するための方法を提供する。本方法は、本明細書に開示された酵素および少なくとも１つの合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む本明細書で開示された非天然のシステムのいずれかを、標的核酸遺伝子座に送達する工程を含んでもよい。酵素は、少なくとも１つのｓｇＲＮＡと複合体を形成してもよく、複合体が所望の標的核酸遺伝子座に結合すると、所望の標的核酸遺伝子座を改変してもよい。酵素を前記遺伝子座に送達することは、上記システムまたは上記システムをコードする核酸で細胞をトランスフェクトすることを含んでもよい。ヌクレアーゼを前記遺伝子座に送達することは、上記システムまたは上記システムをコードする核酸で細胞をエレクトロポレーションすることを含んでもよい。ヌクレアーゼを前記遺伝子座に送達することは、所望の遺伝子座を含む核酸を有する緩衝液中でシステムをインキュベートすることを含んでもよい。場合によっては、標的核酸遺伝子座は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。標的核酸遺伝子座は、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、または細菌ＤＮＡを含んでもよい。標的核酸遺伝子座は細胞内にあってもよい。標的核酸遺伝子座はインビトロであってもよい。標的核酸遺伝子座は、真核細胞内にあっても、原核細胞内にあってもよい。細胞は、動物細胞、ヒト細胞、細菌細胞、古細菌細胞、または植物細胞であってもよい。酵素は、所望の標的遺伝子座で、またはその近辺で、一本鎖または二本鎖の切断を誘導してもよい。

【0315】

標的核酸の遺伝子座が細胞内にあり得る場合では、酵素は、配列番号：３３３１－３４７４のいずれか１つに対して、少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％）の同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを有する酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸として供給されてもよい。前記エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、配列番号：５５８５と実質的に同一の配列、あるいは、配列番号：５５８５に対して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでもよい。場合によっては、核酸は、エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームが動作可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、ヒトβアクチン、ＣＡＧ、ＴＲＥ、またはＣａＭＫＩＩａプロモーターであってもよい。エンドヌクレアーゼは、前記エンドヌクレアーゼをコードする前記オープンリーディングフレームを含むキャップされたｍＲＮＡとして供給されてもよい。エンドヌクレアーゼは、翻訳されたポリペプチドとして提供されてもよい。少なくとも１つの操作されたｓｇＲＮＡは、リボ核酸（ＲＮＡ）ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターに動作可能に連結された前記少なくとも１つの操作されたｓｇＲＮＡをコードする遺伝子配列を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）として供給されてもよい。場合によっては、生物は真核生物であってもよい。場合によっては、生物は真菌であってもよい。場合によっては、生物はヒトであってもよい。

【0316】

ＭＧ２２酵素

【0317】

一態様では、本開示は、（ａ）エンドヌクレアーゼを含む操作されたヌクレアーゼシステムを提供する。場合によっては、エンドヌクレアーゼはＣａｓエンドヌクレアーゼである。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＩＩ型のクラスＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼである。エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、前記ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：３４７５－３５６８のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の配列同一性を有する。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：３４７５－３５６８のいずれか１つに対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有する。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、配列番号：３４７５－３５６８のいずれか１つに実質的に同一である。エンドヌクレアーゼは、配列番号：３４７５－３５６８のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の配列同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：３４７５－３５６８のいずれか１つに対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：３４７５－３５６８のいずれか１つに実質的に同一であるＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。

【0318】

エンドヌクレアーゼは、配列番号：５２９１－５３８９のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５２９１－５３８９のいずれか１つに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは配列番号：５２９１－５３８９のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは、配列番号：５２９１－５３８９のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５２９１－５３８９のいずれか１つに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは配列番号：５２９１－５３８９のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含んでいてもよい。

【0319】

場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１６５６－１７５５のいずれか１つに対して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１６５６－１７５５のいずれか１つと実質的に同一であってもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１６５６－１７５５のいずれか１つに対して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１６５６－１７５５のいずれか１つと実質的に同一であってもよい。

【0320】

場合によっては、エンドヌクレアーゼは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を有する変異体を含んでもよい。ＮＬＳは前記エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端の近位であってもよい。ＮＬＳは、配列番号：４３２－６６０のいずれか１つのＮ末端またはＣ末端で、あるいは、配列番号：１６５６－１７５５のいずれか１つに対して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体のＮ末端またはＣ末端で付加されてもよい。ＮＬＳはＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳであってもよい。ＮＬＳはｃ－ｍｙｃ ＮＬＳであってもよい。ＮＬＳは、配列番号：５５９３－５６０８のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ＮＬＳは配列番号：５５９３－５６０８のいずれか１つと実質的に同一の配列を含むことができる。ＮＬＳは、表１の配列のいずれか、またはその組み合わせを含むことができる：

【0321】

場合によっては、配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、Ｎｏｖａｆｏｌｄ、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定されてもよい。配列同一性は、３のｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ（Ｗ）、１０のｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ（Ｅ）のパラメータを使用し、および１１のｅｘｉｓｔｅｎｃｅ、１のｅｘｔｅｎｓｉｏｎでギャップコストを設定するＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを使用し、および条件付き組成スコアマトリクス調整を使用して、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで決定することができる。

【0322】

場合によっては、上記システムは、（ｂ）所望の切断配列に相補的な５’標的化領域を有するエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができる、少なくとも１つの操作された合成ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）を含んでもよい。場合によっては、５’標的化領域は、エンドヌクレアーゼと適合可能なＰＡＭ配列を含んでもよい。場合によっては、標的化領域の５’のほとんどのヌクレオチドがＧであってもよい。場合によっては、５’標的化領域は１５～２３ヌクレオチド長であってもよい。ガイド配列およびｔｒａｃｒ配列は、別のリボ核酸（ＲＮＡ）または単一リボ核酸（ＲＮＡ）として供給されてもよい。ガイドＲＮＡは、標的化領域の３’にｃｒＲＮＡ ｔｒａｃｒＲＮＡ結合配列を含んでもよい。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ ｔｒａｃｒＲＮＡ結合領域の３’に４－ヌクレオチドリンカーが先行するｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは、５’から３’に、細胞の標的配列にハイブリダイズすることができる非天然ガイド核酸配列、および、ｔｒａｃｒ配列を含んでもよい。場合によっては、非天然ガイド核酸配列およびｔｒａｃｒ配列は共有結合される。

【0323】

場合によっては、ｔｒａｃｒ配列は特別な配列を有していてもよい。ｔｒａｃｒ配列は、天然のｔｒａｃｒＲＮＡ配列の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して少なくとも約８０％を有してもよい。ｔｒａｃｒ配列は、配列番号：５５１０の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して少なくとも約８０％の配列同一性を有してもよい。場合によっては、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５５１０の少なくとも約６０～９０（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有してもよい。場合によっては、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５５１０の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドと実質的に同一であってもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５５１０を含んでもよい。

【0324】

場合によっては、エンドヌクレアーゼと複合体を形成することができる少なくとも１つの操作された合成ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）は、配列番号：５４７４に対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは、配列番号：５４７４に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは配列番号：５４７４と実質的に同一の配列を含んでもよい。

【0325】

場合によっては、上記システムは、標的ＤＮＡ遺伝子座における切断のために第１の領域および第２の領域を標的とする２つの異なるｓｇＲＮＡを含んでいてもよく、ここで、第２の領域は第１の領域に対して３’である。場合によっては、上記システムは、５’から３’に、第１の領域の５’に少なくとも約２０（例えば、少なくとも約４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１ｋｂ）のヌクレオチドの配列を含む第１の相同性アーム、少なくとも約１０ヌクレオチドの合成ＤＮＡ配列、および、第２の領域の３’に少なくとも約２０（例えば、少なくとも約４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１ｋｂ）のヌクレオチドの配列を含む第２の相同性アームを含む、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ修復鋳型を含んでいてもよい。

【0326】

他の態様では、本開示は、所望の標的核酸遺伝子座を改変するための方法を提供する。本方法は、本明細書に開示された酵素および少なくとも１つの合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む本明細書で開示された非天然のシステムのいずれかを、標的核酸遺伝子座に送達する工程を含んでもよい。酵素は、少なくとも１つのｓｇＲＮＡと複合体を形成してもよく、複合体が所望の標的核酸遺伝子座に結合すると、所望の標的核酸遺伝子座を改変してもよい。酵素を前記遺伝子座に送達することは、上記システムまたは上記システムをコードする核酸で細胞をトランスフェクトすることを含んでもよい。ヌクレアーゼを前記遺伝子座に送達することは、上記システムまたは上記システムをコードする核酸で細胞をエレクトロポレーションすることを含んでもよい。ヌクレアーゼを前記遺伝子座に送達することは、所望の遺伝子座を含む核酸を有する緩衝液中でシステムをインキュベートすることを含んでもよい。場合によっては、標的核酸遺伝子座は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。標的核酸遺伝子座は、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、または細菌ＤＮＡを含んでもよい。標的核酸遺伝子座は細胞内にあってもよい。標的核酸遺伝子座はインビトロであってもよい。標的核酸遺伝子座は、真核細胞内にあっても、原核細胞内にあってもよい。細胞は、動物細胞、ヒト細胞、細菌細胞、古細菌細胞、または植物細胞であってもよい。酵素は、所望の標的遺伝子座で、またはその近辺で、一本鎖または二本鎖の切断を誘導してもよい。

【0327】

標的核酸の遺伝子座が細胞内にあり得る場合では、酵素は、配列番号：３４７５－３５６８のいずれか１つに対して、少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％）の同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを有する酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸として供給されてもよい。前記エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、配列番号：５５８６と実質的に同一の配列、あるいは、配列番号：５５８６に対して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでもよい。場合によっては、核酸は、エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームが動作可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、ヒトβアクチン、ＣＡＧ、ＴＲＥ、またはＣａＭＫＩＩａプロモーターであってもよい。エンドヌクレアーゼは、前記エンドヌクレアーゼをコードする前記オープンリーディングフレームを含むキャップされたｍＲＮＡとして供給されてもよい。エンドヌクレアーゼは、翻訳されたポリペプチドとして提供されてもよい。少なくとも１つの操作されたｓｇＲＮＡは、リボ核酸（ＲＮＡ）ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターに動作可能に連結された前記少なくとも１つの操作されたｓｇＲＮＡをコードする遺伝子配列を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）として供給されてもよい。場合によっては、生物は真核生物であってもよい。場合によっては、生物は真菌であってもよい。場合によっては、生物はヒトであってもよい。

【0328】

ＭＧ２３酵素

【0329】

一態様では、本開示は、（ａ）エンドヌクレアーゼを含む操作されたヌクレアーゼシステムを提供する。場合によっては、エンドヌクレアーゼはＣａｓエンドヌクレアーゼである。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＩＩ型のクラスＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼである。エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、前記ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：３５６９－３６３７のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の配列同一性を有する。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：３５６９－３６３７のいずれか１つに対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有する。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよく、ここで、配列番号：３５６９－３６３７のいずれか１つに実質的に同一である。エンドヌクレアーゼは、配列番号：３５６９－３６３７のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の配列同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：３５６９－３６３７のいずれか１つに対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：３５６９－３６３７のいずれか１つに実質的に同一であるＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含んでいてもよい。

【0330】

エンドヌクレアーゼは、配列番号：５３９０－５６４０のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５３９０－５４６０のいずれか１つに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは配列番号：５３９０－５４６０のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは、配列番号：５３９０－５４６０のいずれか１つに対して少なくとも約７０％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：５３９０－５４６０のいずれか１つに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するＨＮＨドメインを含んでいてもよい。エンドヌクレアーゼは配列番号：５３９０－５４６０のいずれか１つと実質的に同一のＨＮＨドメインを含んでいてもよい。

【0331】

場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１７５６－１８２６のいずれか１つに対して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１７５６－１８２６のいずれか１つと実質的に同一であってもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１７５６－１８２６のいずれか１つに対して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、配列番号：１７５６－１８２６のいずれか１つと実質的に同一であってもよい。

【0332】

場合によっては、エンドヌクレアーゼは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を有する変異体を含んでもよい。ＮＬＳは前記エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端の近位であってもよい。ＮＬＳは、配列番号：１７５６－１８２６のいずれか１つのＮ末端またはＣ末端で、あるいは、配列番号：１７５６－１８２６のいずれか１つに対して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体のＮ末端またはＣ末端で付加されてもよい。ＮＬＳはＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳであってもよい。ＮＬＳはｃ－ｍｙｃ ＮＬＳであってもよい。ＮＬＳは、配列番号：５５９３－５６０８のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ＮＬＳは配列番号：５５９３－５６０８のいずれか１つと実質的に同一の配列を含むことができる。ＮＬＳは、表１の配列のいずれか、またはその組み合わせを含むことができる：

【0333】

場合によっては、配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、Ｎｏｖａｆｏｌｄ、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定されてもよい。配列同一性は、３のｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ（Ｗ）、１０のｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ（Ｅ）のパラメータを使用し、および１１のｅｘｉｓｔｅｎｃｅ、１のｅｘｔｅｎｓｉｏｎでギャップコストを設定するＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを使用し、および条件付き組成スコアマトリクス調整を使用して、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで決定することができる。

【0334】

場合によっては、上記システムは、（ｂ）所望の切断配列に相補的な５’標的化領域を有するエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができる、少なくとも１つの操作された合成ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）を含んでもよい。場合によっては、５’標的化領域は、エンドヌクレアーゼと適合可能なＰＡＭ配列を含んでもよい。場合によっては、標的化領域の５’のほとんどのヌクレオチドがＧであってもよい。場合によっては、５’標的化領域は１５～２３ヌクレオチド長であってもよい。ガイド配列およびｔｒａｃｒ配列は、別のリボ核酸（ＲＮＡ）または単一リボ核酸（ＲＮＡ）として供給されてもよい。ガイドＲＮＡは、標的化領域の３’にｃｒＲＮＡ ｔｒａｃｒＲＮＡ結合配列を含んでもよい。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ ｔｒａｃｒＲＮＡ結合領域の３’に４－ヌクレオチドリンカーが先行するｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは、５’から３’に、細胞の標的配列にハイブリダイズすることができる非天然ガイド核酸配列、および、ｔｒａｃｒ配列を含んでもよい。場合によっては、非天然ガイド核酸配列およびｔｒａｃｒ配列は共有結合される。

【0335】

場合によっては、ｔｒａｃｒ配列は特別な配列を有していてもよい。ｔｒａｃｒ配列は、天然のｔｒａｃｒＲＮＡ配列の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して少なくとも約８０％を有してもよい。ｔｒａｃｒ配列は、配列番号：５５１１の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して少なくとも約８０％の配列同一性を有してもよい。場合によっては、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５５１１の少なくとも約６０～９０（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有してもよい。場合によっては、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５５１１の少なくとも約６０～１００（例えば、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０）の連続するヌクレオチドと実質的に同一であってもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号：５５１１を含んでもよい。

【0336】

場合によっては、エンドヌクレアーゼと複合体を形成することができる少なくとも１つの操作された合成ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）は、配列番号：５４７５に対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは、配列番号：５４７５に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ｓｇＲＮＡは配列番号：５４７５と実質的に同一の配列を含んでもよい。

【0337】

場合によっては、上記システムは、標的ＤＮＡ遺伝子座における切断のために第１の領域および第２の領域を標的とする２つの異なるｓｇＲＮＡを含んでいてもよく、ここで、第２の領域は第１の領域に対して３’である。場合によっては、上記システムは、５’から３’に、第１の領域の５’に少なくとも約２０（例えば、少なくとも約４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１ｋｂ）のヌクレオチドの配列を含む第１の相同性アーム、少なくとも約１０ヌクレオチドの合成ＤＮＡ配列、および、第２の領域の３’に少なくとも約２０（例えば、少なくとも約４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１ｋｂ）のヌクレオチドの配列を含む第２の相同性アームを含む、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ修復鋳型を含んでいてもよい。

【0338】

他の態様では、本開示は、所望の標的核酸遺伝子座を改変するための方法を提供する。本方法は、本明細書に開示された酵素および少なくとも１つの合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む本明細書で開示された非天然のシステムのいずれかを、標的核酸遺伝子座に送達する工程を含んでもよい。酵素は、少なくとも１つのｓｇＲＮＡと複合体を形成してもよく、複合体が所望の標的核酸遺伝子座に結合すると、所望の標的核酸遺伝子座を改変してもよい。酵素を前記遺伝子座に送達することは、上記システムまたは上記システムをコードする核酸で細胞をトランスフェクトすることを含んでもよい。ヌクレアーゼを前記遺伝子座に送達することは、上記システムまたは上記システムをコードする核酸で細胞をエレクトロポレーションすることを含んでもよい。ヌクレアーゼを前記遺伝子座に送達することは、所望の遺伝子座を含む核酸を有する緩衝液中でシステムをインキュベートすることを含んでもよい。場合によっては、標的核酸遺伝子座は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。標的核酸遺伝子座は、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、または細菌ＤＮＡを含んでもよい。標的核酸遺伝子座は細胞内にあってもよい。標的核酸遺伝子座はインビトロであってもよい。標的核酸遺伝子座は、真核細胞内にあっても、原核細胞内にあってもよい。細胞は、動物細胞、ヒト細胞、細菌細胞、古細菌細胞、または植物細胞であってもよい。酵素は、所望の標的遺伝子座で、またはその近辺で、一本鎖または二本鎖の切断を誘導してもよい。

【0339】

標的核酸の遺伝子座が細胞内にあり得る場合では、酵素は、配列番号：３５６９－３６３７のいずれか１つに対して、少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％）の同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを有する酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸として供給されてもよい。前記エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、配列番号：５５８７と実質的に同一の配列、あるいは、配列番号：５５８７に対して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含んでもよい。場合によっては、核酸は、エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームが動作可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、ヒトβアクチン、ＣＡＧ、ＴＲＥ、またはＣａＭＫＩＩａプロモーターであってもよい。エンドヌクレアーゼは、前記エンドヌクレアーゼをコードする前記オープンリーディングフレームを含むキャップされたｍＲＮＡとして供給されてもよい。エンドヌクレアーゼは、翻訳されたポリペプチドとして提供されてもよい。少なくとも１つの操作されたｓｇＲＮＡは、リボ核酸（ＲＮＡ）ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターに動作可能に連結された前記少なくとも１つの操作されたｓｇＲＮＡをコードする遺伝子配列を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）として供給されてもよい。場合によっては、生物は真核生物であってもよい。場合によっては、生物は真菌であってもよい。場合によっては、生物はヒトであってもよい。

【実施例0340】

実施例１．－新規なタンパク質のためのメタゲノム解析
メタゲノム試料を堆積物、土壌、および動物から集めた。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を、ＺｙｍｏｂｉｏｍｉｃｓのＤＮＡ ｍｉｎｉ－ｐｒｅｐ ｋｉｔを用いて抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑＲ ２５００で配列決定した。所有者の同意を得て試料を採取した。公的な情報源からの生の配列データは、動物のマイクロバイオーム、堆積物、土壌、温泉、熱水噴出孔、海洋、泥炭湿地、永久凍土、および下水のシーケンスを含んでいた。メタゲノム配列データは、タイプＩＩのＣａｓエフェクタータンパク質を含む既知のＣａｓタンパク質配列に基づいて生成された隠れマルコフモデルを用いて検索された。検索により同定された新規なエフェクタータンパク質を、既知のタンパク質にアラインメントして、潜在的な活性部位を特定した。このメタゲノムワークフローにより、本明細書に記載されるクラスＩＩ、タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼのＭＧ１、ＭＧ２、ＭＧ３、ＭＧ４、ＭＧ６、ＭＧ１４、ＭＧ１５、ＭＧ１６、ＭＧ１８、ＭＧ２１、ＭＧ２２、およびＭＧ２３のファミリーを解明した。

【0341】

実施例２Ａ．－ＣＲＩＳＰＲシステムのＭＧ１ファミリーの発見
実施例１のメタゲノム解析のデータを解析すると、当初は６つのメンバー（それぞれ配列番号：５、６、１、２、および３として記録されたＭＧ１－１、ＭＧ１－２、ＭＧ１－３、ＭＧ１－４、ＭＧ１－５、およびＭＧ１－６）を含むこれまでに記載されていない推定ＣＲＩＳＰＲシステムの新しいクラスターが明らかとなった。このファミリーは、ＨＮＨドメインとＲｕｖＣドメインを有する酵素を特徴としている。このファミリーのＲｕｖＣドメインは、これまでに記載されたＣａｓ９ファミリーメンバーとの相同性が低いＲｕｖＣ＿ＩＩＩ部分を有している。当初のファミリーメンバーは最大５６．８％の同一性を有しているが、６つの酵素はすべてＲｕｖＣドメインのＲｕｖＣ＿ＩＩＩ部分が分岐しており、ＲＨＨＡＬＤＡＭＶ（配列番号：５６１５）、ＫＨＨＡＬＤＡＭＣ（配列番号：５６１６）、またはＫＨＨＡＬＤＡＩＣ（配列番号：５６１７）の共通モチーフを持っている。これらのモチーフは、記載されている他のＣａｓ９様酵素には見られないものである。これらの新しい酵素とその関連するサブドメインに対応するタンパク質と核酸の配列は、配列表に提示されている。推定ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、他の遺伝子との相対的な位置関係に基づいて同定され、配列番号：５４７６－５４７９として提示されている。酵素システムは、ＣＲＩＳＰＲシステムを含むゲノムビンからの１６Ｓ ｒＲＮＡの配列に基づいて、Ｐｈｙｌｕｍ Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｐｈｙｌｕｍ Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ、またはＰｈｙｌｕｍ Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｌａｉｎａｂａｃｔｅｒｉａに由来すると思われる。１６Ｓ ｒＲＮＡの配列は、配列番号：５５９２－５５９６として提示されている。Ｓｈｍａｋｏｖらによって記載された特徴を呼び起こすＣＲＩＳＰＲシステム配列の詳細なドメインレベルのアラインメント（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１５ Ｎｏｖ ５；６０（３）：３８５－９７）が図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ、および９Ｈに描かれている。ＭＧ１－１、１－２、および１－３と、追加の独自のタンパク質データセットとを比較すると、配列番号：７－３１９として提示されている類似のアーキテクチャを有する追加のタンパク質配列が明らかになった。これらのＭＧ１タンパク質の配列により、配列番号：５６１８－５６３２に示されるような追加のＭＧ１モチーフが発見された。

【0342】

実施例２Ｂ．－ＣＲＩＳＰＲシステムのＭＧ２ファミリーの発見
実施例１のメタゲノム解析からのデータを解析すると、６つのメンバー（ＭＧ２－１、ＭＧ２－２、ＭＧ２－３、ＭＧ２－５、およびＭＧ２－６）を含むこれまでに記載されていない推定ＣＲＩＳＰＲシステムの新しいクラスターが明らかになった。これらの新しい酵素と例示的なサブドメインに対応するタンパク質と核酸の配列は、配列番号：３２０、３２２－３２５として提示されている。他の遺伝子との相対的な位置関係から、推定ｔｒａｃｒＲＮＡ配列がオペロン内で同定され、配列番号：５４９０、５４９２－５４９４、および５５３８として提示されている。これらの配列対Ｃａｓ９の詳細なドメインレベルのアラインメントは、Ｓｈｍａｋｏｖらにより示されているように（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ． ２０１５ Ｎｏｖ ５；６０（３）：３８５－９７．）、図７に描かれている。

【0343】

ＭＧ２－１、ＭＧ２－２、ＭＧ２－３、ＭＧ２－５、およびＭＧ２－６の組み合わせと、追加の独自のタンパク質データセットとを比較すると、配列番号：３２１および３２６－４２０として提示されている類似のアーキテクチャを有する追加のタンパク質配列が明らかになった。ＭＧ２ファミリーメンバーによく見られるモチーフは、配列番号：５６３１－５６３８として提示されている。

【0344】

実施例２Ｃ．－ＣＲＩＳＰＲシステムのＭＧ３ファミリーの発見
実施例１のメタゲノム解析のデータを解析すると、新たにこれまでに記載されていない推定ＣＲＩＳＰＲシステム：ＭＧ３－１が明らかになった。この新しい酵素とその例示的なサブドメインの対応するアミノ酸配列は、配列番号：４２４、２２４５、および４０５９として提示されている。オペロンの他の要素との近接性に基づいて、推定ｔｒａｃｒＲＮＡ含有配列が同定され、配列番号：５４９８として含まれている。この配列対Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ由来のＣａｓ９とのドメインレベルの詳細なアラインメントが図８に示されている。

【0345】

ＭＧ３－１と、その他の独自のタンパク質データセットを比較すると、ＳＥＱ ＮＯ：４２１－４２３、４２５－４３１として提示されている、類似した構造のさらなるタンパク質配列が明らかになった。

【0346】

実施例２Ｄ．－ＣＲＩＳＰＲシステムのＭＧ４、７、１４、１５、１６、１８、２１、２２、２３ファミリーの発見
実施例１のメタゲノム解析のデータを解析すると、１メンバーずつの９ファミリー（ＭＧ４－５、ＭＧ７－２、ＭＧ１４－１、ＭＧ１５－１、ＭＧ１６－２、ＭＧ１８－１、ＭＧ２１－１、ＭＧ２２－１、ＭＧ２３－１）を含む、これまでに記載されていない推定ＣＲＩＳＰＲシステムの新たなクラスターが明らかになった。これらの新しい酵素とその例示的なサブドメインに対応するタンパク質および核酸の配列は、配列番号：４３２、６６９、６７８、９３０、１０９３、１３５４、１５１２、１６５６、１７５６として提示されている。オペロンの他の要素との近接性に基づいて、各ファミリーについて推定ｔｒａｃｒ含有配列が同定された。これらの配列は、それぞれ配列番号：５５０３－５５１１として配列表に提示されている。

【0347】

ＭＧ４－５、ＭＧ７－２、ＭＧ１４－１、ＭＧ１５－１、ＭＧ１６－２、ＭＧ１８－１、ＭＧ２１－１、ＭＧ２２－１、ＭＧ２３－１と、その他の独自のタンパク質データセットを比較すると、ＳＥＱ ＮＯ：４３３－６６０、６７０－６７７、６７９－９２９、９３１－１０９２、１０９４－１３５３、１３５５－１５１１、１５１３－１６５５、１６５７－１７５５、および１７５７－１８２６として提示されている、類似のアーキテクチャを持つ追加のタンパク質配列が明らかになった。これらのセットのＣＲＩＳＰＲシステムのヌクレアーゼに共通するモチーフは、ＭＧ４については配列番号：５６４９、ＭＧ１４については配列番号：５６５０－５６６７、ＭＧ１５については配列番号：５６６８－５６７５、ＭＧ１６については配列番号：５６７６－５６７８、ＭＧ１８については配列番号：５６７９－５６８６、ＭＧ２１については配列番号：５６８７－５６９３および配列番号：５６７４－５６７５、ＭＧ２２については配列番号：５６９４－５６９９、ならびにＭＧ２３については配列番号：５７００－５７１７として提示されている。

【0348】

実施例３．－予言的（Ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ）－－プロトスペーサー隣接モチーフ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ－Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ）の決定．
実験は、Ｋａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１７ Ｍａｙ １５；１２１－１２２：３－８（参照により本明細書に全体として組み込まれる）の例のいずれかのように行われ、本明細書に記載される新規の酵素に対するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列特異性を特定して、最適な合成配列の標的化を可能にする。

【0349】

一例（インビボスクリーン）では、本明細書に記載されている酵素のいずれかをコードするプラスミドと、プロトスペーサーを標的とするガイドＲＮＡとを有する細胞は、抗生物質耐性遺伝子を含むプラスミドライブラリ、およびランダム化されたＰＡＭ配列と隣接しているプロトスペーサー配列で同時形質転換される。機能的なＰＡＭを含むプラスミドは、酵素によって切断され、細胞死に至る。生き残った細胞から単離された酵素切断抵抗性プラスミドプールをディープシーケンシングすると、機能的な切断を可能にするＰＡＭを含む枯渇したプラスミドのセットが示される。

【0350】

別の例（インビトロスクリーニング）では、ＤＮＡプラスミドまたは鎖状体リピートの形態のＰＡＭライブラリは、インビトロまたは細胞溶解物中で組み立てられたＲＮＰ複合体（例えば、酵素、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ、または酵素およびハイブリッドｓｇＲＮＡを含む）による切断に晒される。成功した切断事象から生じる遊離ＤＮＡ末端は、アダプターライゲーションによって捕捉され、その後、ＰＡＭ側の生成物のＰＣＲ増幅に晒される。増幅された機能的ＰＡＭのライブラリは、ディープシーケンシングにかけられ、ＤＮＡの切断をライセンス化するＰＡＭが同定される。

【0351】

実施例４．－予言的－－ゲノム編集のための哺乳動物細胞における本明細書に記載される合成ＣＲＩＳＰＲシステムの使用例
ｉ）細胞適合性のあるＣ末端核局在化配列（例えば、ヒト細胞の場合はＳＶ４０ ＮＬＳ）および適切なポリアデニル化シグナル（例えば、ヒト細胞の場合はＴＫ ｐＡシグナル）を有する細胞適合性のあるプロモーターの下で、コドン最適化酵素をコードするＯＲＦ、および、（ｉｉ）適切なポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、哺乳動物細胞の場合はＵ６プロモーター）の下で、ｓｇＲＮＡ（Ｇで始まる５’配列と、続いてゲノムＤＮＡを標的とする相補的な標的化核酸配列２０ｎｔと、その後、実施例３を介して同定された対応する適合性のあるＰＡＭと、３’ｔｒａｃｒ結合配列、リンカー、およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列を有する）をコードするＯＲＦ、をコードするＤＮＡ／ＲＮＡ配列が調製される。いくつかの実施形態では、これらの配列は、同じまたは別々のプラスミドベクター上で調製され、これらのプラスミドベクターは、適切な技術を介して真核細胞にトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、これらの配列は、別々のＤＮＡ配列として調製され、これが細胞にトランスフェクトされるか、または微量注入される。いくつかの実施形態では、これらの配列は、細胞にトランスフェクトされるか、微量注入される、合成ＲＮＡまたはインビトロ転写ＲＮＡとして調製される。いくつかの実施形態では、これらの配列は、タンパク質に翻訳され、細胞にトランスフェクトされるか、または微量注入される。

【0352】

いずれのトランスフェクション方法が選択されても、（ｉ）と（ｉｉ）は細胞内に導入される。酵素および／またはｓｇＲＮＡが活性形態に転写および／または翻訳されるように、インキュベーション期間を経過させる。インキュベーション期間後、標的化配列の近傍にあるゲノムＤＮＡが（例えば、配列決定によって）解析される。酵素を媒介とした切断と非相同末端結合の結果、標的化配列の近傍にあるゲノムＤＮＡにインデルが導入される。

【0353】

いくつかの実施形態では、（ｉ）および（ｉｉ）は、２５ｂｐ以上のサイズの切断部位に隣接しているゲノムの領域をコードする第３の修復ヌクレオチドとともに細胞に導入されることで、相同性指向の修復が促進される。これらの隣接配列内には、単一の塩基対突然変異、機能的な遺伝子断片、発現のための外来性または天然の遺伝子、あるいは生化学的経路を構成する複数の遺伝子が含まれることがある。

【0354】

実施例５．－予言的－－インビトロの本明細書に記載される合成ＣＲＩＳＰＲシステムの使用
本明細書に記載される酵素のいずれかは、精製タグを含む適切な大腸菌発現プラスミドにクローン化され、大腸菌で組換え発現され、組換えタグを用いて精製される。５’Ｇと、続いて２０ｎｔの標的化配列とＰＡＭ配列、適合性のあるｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ結合領域、ＧＡＡＡリンカー、および適合性のあるｔｒａｃｒＲＮＡを含むＲＮＡは、適切な固相ＲＮＡ合成方法によって合成される。組換え酵素とｓｇＲＮＡは、Ｍｇ２＋を含む適切な切断緩衝液（例えば、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ、５％グリセロール）に配合され、標的化配列とＰＡＭ配列に相補的な配列を含む標的ＤＮＡを導入することで、反応が開始する。ＤＮＡの切断は、適切なアッセイ（例えば、アガロースゲル電気泳動と、その後の臭化エチジウム染色（または同様に作用するＤＮＡ挿入剤）およびＵＶ可視化）によってモニタリングされる。

【0355】

実施例６．－（一般プロトコル）本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼのＰＡＭ配列同定／確認
ＰＡＭ配列は、大腸菌ライセートベースの発現システム（ｍｙＴＸＴＬ、Ａｒｂｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で発現した推定エンドヌクレアーゼで切断できるランダムに生成されたＰＡＭ配列を含むプラスミドを配列決定することによって決定された。このシステムでは、大腸菌コドン最適化ヌクレオチド配列が、Ｔ７プロモーターの制御下でＰＣＲ断片から転写および翻訳された。Ｔ７プロモーター下でｔｒａｃｒ配列と、Ｔ７プロモーターとその後のリピート－スペーサー－リピート配列から構成される最小ＣＲＩＳＰＲアレイとを有する第２のＰＣＲ断片が同じ反応で転写された。ＴＸＴＬシステムにおけるエンドヌクレアーゼとｔｒａｃｒ配列の発現に成功し、その後のＣＲＩＳＰＲアレイ処理を行うことで、インビトロで活性のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ複合体が得られた。

【0356】

最小限のアレイに一致するスペーサー配列と、その後の８Ｎの混合塩基（推定ＰＡＭ配列）とを含む標的プラスミドのライブラリは、ＴＸＴＬ反応の出力と一緒にインキュベートされた。１－３時間後に反応を停止し、ＤＮＡクリーンアップキット、例えば、Ｚｙｍｏ ＤＣＣ、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ｂｅａｄｓ、ＱｉａＱｕｉｃｋなどを用いてＤＮＡを回収した。アダプター配列は、エンドヌクレアーゼによって切断された活性なＰＡＭ配列を持つＤＮＡに平滑末端ライゲーションされ、一方、切断されなかったＤＮＡはライゲーションに利用できなかった。次に、活性なＰＡＭ配列を含むＤＮＡセグメントは、ライブラリとアダプター配列に特異的なプライマーを用いてＰＣＲで増幅された。ＰＣＲ増幅産物をゲル上で分離させ、切断事象に対応するアンプリコンを同定した。切断反応の増幅セグメントは、ＮＧＳライブラリを調製するための鋳型としても使用された。最初の８Ｎライブラリのサブセットであった、この結果として生じたライブラリを配列決定することで、活性なＣＲＩＳＰＲ複合体の正確なＰＡＭを含む配列が明らかになった。単一のＲＮＡコンストラクトを用いたＰＡＭテストでは、インビトロで転写されたＲＮＡがプラスミドライブラリとともに加えられ、ｔｒａｃｒ／最少ＣＲＩＳＰＲアレイ鋳型が省略された以外は、同じ手順が繰り返された。ＮＧＳライブラリが調製されたエンドヌクレアーゼについては、ｓｅｑＬｏｇｏ（例えば、Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１５ Ｆｅｂ；１２（２）：１１５－２１）の表現が構築され、図２７、３８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、および３５で提示されている。これらの表現を構築するために使用されるｓｅｑＬｏｇｏモジュールは、ＤＮＡ配列モチーフ（例えば、ＰＡＭ配列）の位置特異的重み行列（ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ）を取り、ＳｃｈｎｅｉｄｅｒとＳｔｅｐｈｅｎｓが導入した対応する配列ロゴをプロットする（例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０ Ｏｃｔ ２５；１８（２０）：６０９７－１００を参照）。ｓｅｑＬｏｇｏ表現における配列を表す文字は，アラインメントされた配列（例えば、ＰＡＭ配列）の各位置について互いに重ねられている。各文字の高さはその頻度に比例しており、最も多いものが上にくるように文字を並べ替えている。

【0357】

実施例７．－（一般的なプロトコル）ｔｒａｃｒＲＮＡとｓｇＲＮＡの構造のＲＮＡ折り畳み
ガイドＲＮＡ配列の３７℃での折り畳み構造は、Ａｎｄｒｏｎｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００７ Ｊｕｌ １；２３（１３）：ｉ１９－２８の方法を用いて計算された。本明細書に記載される例示的なｓｇＲＮＡの予測構造を、図２１、２２、２３、２４、２５、および２６に示す。

【0358】

実施例８．－（一般的なプロトコル）ＭＧ ＣＲＩＳＰＲ複合体のインビトロ切断効率
エンドヌクレアーゼは、プロテアーゼ欠損大腸菌Ｂ株において、誘導性Ｔ７プロモーターからＨｉｓタグ付けされた融合タンパク質として発現した。Ｈｉｓタグ付けされたタンパク質を発現する細胞を超音波で溶解し、Ｈｉｓタグ付けされたタンパク質は、ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ ＦＰＬＣ（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）上のＨｉｓＴｒａｐ ＦＦカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）でのＮｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製された。溶出物をアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上でＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分解し、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ Ｕｌｔｒａｆａｓｔクーマシー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。純度は、ＩｍａｇｅＬａｂソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いたタンパク質バンドの濃度測定を用いて決定された。精製されたエンドヌクレアーゼは、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、３００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＴＣＥＰ、５％グリセロール；ｐＨ７．５からなる保存緩衝液に透析され、－８０℃で保存された。

【0359】

スペーサー配列とＰＡＭ配列（例えば、実施例６のように決定される）を含む標的ＤＮＡはＤＮＡ合成により構築された。代表的な１つのＰＡＭは、ＰＡＭが縮重塩基を有する場合に、試験のために選択された。標的ＤＮＡは、一端から７００ｂｐに位置するＰＡＭとスペーサーを用いたＰＣＲ増幅によってプラスミドから得られた２２００ｂｐの直鎖状ＤＮＡを含んでいた。切断に成功すると、７００ｂｐと１５００ｂｐの断片が得られた。標的ＤＮＡ、インビトロ転写された単一のＲＮＡ、および精製された組換えタンパク質を、余剰なタンパク質とＲＮＡを含む切断緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２）で組み合わせ、５分から３時間、通常は１時間インキュベートした。反応を、ＲＮＡｓｅ Ａの添加と６０分でのインキュベーションによって停止させた。その後、反応物を１．２％ＴＡＥアガロースゲルで分解し、ＩｍａｇｅＬａｂソフトウェアで切断された標的ＤＮＡの割合を定量化する。

【0360】

実施例９．－（一般的なプロトコル）大腸菌中のＭＧ ＣＲＩＳＰＲ複合体のゲノム切断活性の試験
大腸菌は、二本鎖ＤＮＡの切断を効率的に修復する能力を持っていない。そのため、ゲノムＤＮＡの切断は致死的な事象となり得る。この現象を利用して、ゲノムＤＮＡにスペーサー／標的配列とＰＡＭ配列を組み込んだ標的株でエンドヌクレアーゼとｔｒａｃｒＲＮＡを組換え発現させることによって、大腸菌においてエンドヌクレアーゼ活性を試験した。

【0361】

このアッセイでは、ＰＡＭ配列は、実施例６に記載される方法で決定されたように試験対象のエンドヌクレアーゼに特異的である。ｓｇＲＮＡ配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡの配列と予測される構造に基づいて決定された。リピートの５’末端から始めて、８～１２ｂｐ（一般的には１０ｂｐ）のリピート－アンチリピートの対を選択した。残りのリピートの３’末端とｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端をテトラループに置き換えた。一般に、テトラループはＧＡＡＡであったが、特にＧＡＡＡ配列が折り畳みを阻害すると予測される場合には、他のテトラループを使用することができる。このような場合には、ＴＴＣＧテトラループを用いた。

【0362】

ゲノムＤＮＡにＰＡＭ配列を組み込んだ組換え株を、エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡで形質転換した。その後、形質転換体を化学的に適合させ、標的配列に特異的（「オンターゲット（ｏｎ ｔａｒｇｅｔ）」）または標的に非特異的（「ノンターゲット（ｎｏｎ ｔａｒｇｅｔ）」）な単一のガイドＲＮＡ５０ｎｇを用いて、形質転換した。熱ショック後、形質転換体をＳＯＣ中で３７℃にて２時間回収した。その後、ヌクレアーゼ効率は、誘導培地で培養した５倍希釈系列によって決定された。コロニーは３連で（ｉｎ ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）希釈系列から定量化された。

【0363】

実施例１０．－（一般的なプロトコル）哺乳動物細胞中のＭＧ ＣＲＩＳＰＲ複合体のゲノム切断活性の試験
哺乳動物細胞における標的化および切断活性を示すために、ＭＧ Ｃａｓエフェクタータンパク質配列を２つの哺乳動物発現ベクター：（ａ）Ｃ末端のＳＶ４０ ＮＬＳと２Ａ－ＧＦＰタグを有するものと、（ｂ）ＧＦＰタグを持たず、Ｎ末端に１つとＣ末端に１つの、２つのＳＶ４０ ＮＬＳ配列を有するもので試験した。いくつかの例では、エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、哺乳動物細胞での発現にコドン最適化されている。

【0364】

標的化配列が付加された対応する単一のガイドＲＮＡ配列（ｓｇＲＮＡ）を、第２の哺乳動物発現ベクターにクローン化する。２つのプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトする。発現プラスミドとｓｇＲＮＡ標的化プラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトしてから７２時間後に、ＤＮＡを抽出し、ＮＧＳ－ライブラリの作成に使用する。哺乳動物細胞における酵素の標的化効率を実証するために、標的部位の配列決定におけるインデルを介してパーセントＮＨＥＪを測定する。各タンパク質の活性を試験するために、少なくとも１０の異なる標的部位が選択された。

【0365】

実施例１１．－ＭＧ１ファミリーメンバーの特徴付け
ＰＡＭ特異性、ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ検証

【0366】

ＭＧ１ファミリーエンドヌクレアーゼシステムの標的となるエンドヌクレアーゼ活性は、実施例６に記載したｍｙＴＸＴＬシステムを用いて確認された。このアッセイでは、切断された標的プラスミドのＰＣＲ増幅により、図１７－２０に示すように、ゲル中で約１７０ｂｐで遊走する産物が得られる。増幅産物は、ＭＧ１－４（二重ガイド：ゲル１、レーン３を参照、単一ガイド：ゲル６、レーン２を参照）、ＭＧ１－５（ゲル２、レーン１０）、ＭＧ１－６（二重ガイド：ゲル５、レーン６を参照、単一ガイド：ゲル６、レーン５を参照）、ＭＧ１－７（二重ガイド：ゲル３、レーン１３を参照、単一ガイド：ゲル３、レーン２を参照）（それぞれタンパク質配列番号：１－４）について観察された。ＰＣＲ産物の配列決定により、表２に示されるように、これらの酵素の活性ＰＡＭ配列が明らかになった。

【0367】

【表2】

【0368】

合成単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、ｔｒａｃｒＲＮＡの配列と予測される構造に基づいて設計され、配列番号：５４６１－５４６４として提示されている。実施例６のＰＡＭ配列スクリーンは、ｓｇＲＮＡを用いて繰り返された。この実験の結果は表２にも示されており、ｓｇＲＮＡを使用するとＰＡＭの特異性がわずかに変化したことが明らかになっている。

【0369】

インビトロでの標的となるエンドヌクレアーゼ活性

【0370】

ＰＡＭ配列ＣＡＧＧＡＡＧＧを有する標的ＤＮＡに対する、ＭＧ１－４エンドヌクレアーゼシステム（ｓｇＲＮＡ 配列番号：５４６１を有する、タンパク質配列番号：１）のインビトロ活性が、実施例８の方法を用いて実証された。上記で報告されている単一ガイド配列（配列番号：５４６１）を使用し、配列のＮｓを置き換えてスペーサー／標的化配列の長さを１８～２４ｎｔの範囲で変化させた。その結果を図１０に示す。左パネルは、異なる標的化配列長（１８～２４ｎｔ）を有する対応する単一ガイドｓｇＲＮＡと組み合わせたＭＧ１－４によるＤＮＡ切断を実証するゲルを示し、右パネルは、同じデータを棒グラフとして定量化したものを示す。このデータは、１８～２４ヌクレオチドの標的化配列がＭＧ１－４／ｓｇＲＮＡシステムで機能的であることを実証した。

【0371】

細菌細胞における標的となるエンドヌクレアーゼ活性

【0372】

ＭＧ１－４エンドヌクレアーゼシステム（タンパク質配列番号：１、ｓｇＲＮＡ 配列番号：５４６１）のインビボ活性は、実施例９と同様にＰＡＭ配列ＣＡＧＧＡＡＧＧを用いて試験された。形質転換した大腸菌を連続希釈でプレーティングし、その結果（左パネルに大腸菌の連続希釈を示し、右パネルに定量化した成長を示す）を図１１に提示する。非標的ｓｇＲＮＡを発現する大腸菌と比較して、オンターゲットｓｇＲＮＡを発現する大腸菌の増殖の大幅な減少は、ゲノムＤＮＡが大腸菌細胞内でエンドヌクレアーゼによって特異的に切断されたことを示している。

【0373】

哺乳動物細胞における標的となるエンドヌクレアーゼ活性

【0374】

実施例１０の方法を用いて、哺乳動物細胞における標的化および切断活性を実証した。ＭＧ１－４（タンパク質配列番号：５５２７）およびＭＧ１－６（タンパク質配列番号：５５２９）の配列をコードするオープンリーディングフレームは、Ｃ末端ＳＶ４０ ＮＬＳと２Ａ－ＧＦＰタグを有するもの（大腸菌ＭＧ－ＢＢ）と、ＧＦＰタグを持たず、Ｎ末端に１つとＣ末端に１つの２つのＮＬＳ配列を持つもの（大腸菌ｐＭＧ５－ＢＢ）の２つの哺乳動物発現ベクターにクローン化された。ＭＧ１－６については、オープンリーディングフレームはさらに哺乳動物の発現のためにコドン最適化され（配列番号：５５８９）、２－ＮＬＳプラスミド骨格にクローン化された（ＭＧ－１６ｈｓ）。この実験の結果を図１２に示す。エンドヌクレアーゼ発現ベクターは、エンドヌクレアーゼに特異的なｔｒａｃｒ配列と表３～４から選択されたガイド配列とを有するｓｇＲＮＡ（例えば、配列番号：５５１２または５５１５）を発現させるための第２のベクターとともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトされた。コトランスフェクションの７２時間後に、ＤＮＡを抽出し、ＮＧＳ－ライブラリの調製に使用した。切断活性は、標的部位の配列に近接の内部欠失（ＮＨＥＪレムナント）の出現により検出された。哺乳動物細胞における酵素の標的化効率を実証するために、標的部位の配列におけるインデルを介してＮＨＥＪの割合を測定し、図１２に示した。

【0375】

【表3】

【0376】

【表4】

【0377】

実施例１２．－ＭＧ２ファミリーメンバーの特徴付け
ＰＡＭ特異性、ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｓｇＲＮＡの検証

【0378】

ＭＧ２ファミリーメンバーの標的となるエンドヌクレアーゼ活性は、実施例６に記載されたようにｍｙＴＸＴＬシステムで確認された。このアッセイの結果を図１７～２０で示す。図１７～２０に示すアッセイでは、ライブラリの切断に成功した活性タンパク質は、ゲル中におよそ１７０ｂｐのバンドを生じさせる。ＭＧ２－１（ゲル２、レーン１１、およびゲル４、レーン６を参照）およびＭＧ２－７（ゲル１１、レーン１０を参照）について増幅産物が観察された（それぞれ配列番号：３２０および３２１）。ＰＣＲ産物の配列決定により、以下の表５に示す活性ＰＡＭ配列が明らかになった。

【0379】

【表5】

【0380】

細菌細胞における標的となるエンドヌクレアーゼ活性

【0381】

ｓｇＲＮＡを有するＭＧ２－７エンドヌクレアーゼシステム（エンドヌクレアーゼ配列番号：３２１；ｓｇＲＮＡ 配列番号：５４６５）およびＡＧＣＧＴＡＡＧ ＰＡＭ配列のインビボ活性は、実施例９に記載される方法を用いて確認された。形質転換した大腸菌を連続希釈でプレーティングし、その結果（左パネルに大腸菌の連続希釈を示し、右パネルに定量化した成長を示す）を図３４に提示する。非標的ｓｇＲＮＡを発現する大腸菌と比較して、オンターゲットｓｇＲＮＡを発現する大腸菌の増殖の大幅な減少は、ゲノムＤＮＡが大腸菌細胞内でＭＧ１－４エンドヌクレアーゼによって特異的に切断されたことを示している。

【0382】

実施例１３．－ＭＧ３ファミリーメンバーの特徴付け

【0383】

ＰＡＭ特異性、ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｓｇＲＮＡの検証

【0384】

ＭＧ３ファミリーメンバーの標的となるエンドヌクレアーゼ活性は、ｔｒａｃｒ配列およびＣＲＩＳＰＲアレイを使用して、実施例６に記載されたようなｍｙＴＸＴＬシステムを使用して確認された。このアッセイでは、切断された標的プラスミドのＰＣＲ増幅により、図１７～２０に示すように、ゲル中で約１７０ｂｐで遊走する産物が得られる。ＭＧ３－６（二重ガイド：ゲル２、レーン８を参照、単一ガイド：ゲル３、レーン３を参照）、ＭＧ３－７（二重ガイド：ゲル２、レーン３を参照、単一ガイド：ゲル３、レーン４を参照）、ＭＧ３－８（二重ガイド：ゲル９、レーン５を参照）では、増幅産物が観察された（それぞれ配列番号：４２１、４２２、および４２３）。ＰＣＲ産物の配列決定により、以下の表６に示す活性ＰＡＭ配列が明らかになった。

【0385】

【表6】

【0386】

合成単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、ｔｒａｃｒＲＮＡの配列と予測される構造に基づいて設計され、配列番号：５４６６－５４６７として提示されている。実施例６のＰＡＭ配列スクリーンは、ｓｇＲＮＡを用いて繰り返された。この実験の結果は表６にも示されており、ｓｇＲＮＡを使用するとＰＡＭの特異性がわずかに変化したことが明らかになっている。

【0387】

インビトロでの標的となるエンドヌクレアーゼ活性

【0388】

ＭＧ３－６（エンドヌクレアーゼ配列番号：４２１）のインビトロ活性は、実施例８の方法を使用して、ＰＡＭ配列ＧＴＧＧＧＴＴＡで実証された。上記で報告されている単一ガイド配列（配列番号：５４６６）を使用し、配列のＮｓを置き換えてスペーサー／標的化配列の長さを１８～２４ｎｔの範囲で変化させた。その結果を図１３に示す。上パネルは、異なる標的化配列長（１８～２４ｎｔ）を有する様々なｓｇＲＮＡと組み合わせたＭＧ３－６によるＤＮＡ切断を実証するゲルを示し、下パネルは、同じデータを棒グラフとして定量化したものを示す。このデータは、１８～２４ヌクレオチドの標的化配列がＭＧ３－６／ｓｇＲＮＡシステムで機能的であることを実証した。

【0389】

細菌細胞における標的となるエンドヌクレアーゼ活性

【0390】

ＭＧ３－７エンドヌクレアーゼシステム（タンパク質配列番号：４２２、ｓｇＲＮＡ 配列番号：５４６７）のインビボ活性は、実施例９の方法を使用してＰＡＭ配列ＴＧＧＡＣＣＴＧを用いて試験された。形質転換した大腸菌を連続希釈でプレーティングし、その結果（上パネルに大腸菌の連続希釈を示し、下パネルに定量化した成長を示す）を図１４に提示する。非標的ｓｇＲＮＡを発現する大腸菌と比較して、オンターゲットｓｇＲＮＡを発現する大腸菌の増殖の大幅な減少は、ゲノムＤＮＡがＭＧ３－７エンドヌクレアーゼシステムによって特異的に切断されていたことを示している。

【0391】

哺乳動物細胞における標的となるエンドヌクレアーゼ活性

【0392】

実施例１０の方法を用いて、哺乳動物細胞における標的化および切断活性を実証した。ＭＧ３－７（タンパク質配列番号：４２２）の配列をコードするオープンリーディングフレームは、Ｃ末端ＳＶ４０ ＮＬＳと２Ａ－ＧＦＰタグを有するもの（大腸菌ＭＧ－ＢＢ）と、ＧＦＰタグを持たず、Ｎ末端に１つとＣ末端に１つの２つのＮＬＳを持つもの（大腸菌ｐＭＧ５－ＢＢ）の２つの哺乳動物発現ベクターにクローン化された。エンドヌクレアーゼ発現ベクターは、表７から選択されたガイド配列を用いて上記のｓｇＲＮＡを発現するための第２のベクターでＨＥＫ２９３Ｔ細胞へコトランスフェクトされた。この実験の結果を図１２に示す。コトランスフェクションの７２時間後に、ＤＮＡを抽出し、ＮＧＳ－ライブラリの調製に使用した。切断活性は、標的部位の近傍にある内部欠失（ＮＨＥＪレムナント）の出現により検出された。結果を図１５に示す。

【0393】

ｓｇＲＮＡプラスミド上でコードされた標的部位を以下の表７に示す。

【0394】

【表7】

【0395】

実施例１３．－ＭＧ４ファミリーメンバーの特徴付け
ＰＡＭ特異性、ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｓｇＲＮＡの検証

【0396】

ＭＧ４ファミリーエンドヌクレアーゼシステムの標的となるエンドヌクレアーゼ活性は、実施例６に記載されるようなｍｙＴＸＴＬシステムを用いて確認された。このアッセイでは、切断された標的プラスミドのＰＣＲ増幅により、図１７～２０に示すように、ゲル中で約１７０ｂｐで遊走する産物が得られる。ＭＧ４－２（二重ガイド：ゲル２、レーン９、単一ガイド：ゲル１０、レーン７を参照）について増幅産物が観察された（配列番号：４３２）。ＰＣＲ産物の配列決定により、以下の表８に示される活性ＰＡＭ配列が明らかになった。

【0397】

【表8】

【0398】

実施例１４．ＭＧ１４ファミリーメンバーの特徴付け
ＰＡＭ特異性、ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｓｇＲＮＡの検証

【0399】

ＭＧ１４ファミリーメンバーの標的となるエンドヌクレアーゼ活性は、実施例６に記載されるようなｍｙＴＸＴＬシステムを用いて確認された。このアッセイでは、切断された標的プラスミドのＰＣＲ増幅により、図１７～２０に示すように、ゲル中で約１７０ｂｐで遊走する産物が得られる。ＭＧ１４－１（二重ガイド：ゲル２、１レーン４、単一ガイド：ゲル３、レーン８を参照）について増幅産物が観察された（配列番号：６７８）。ＰＣＲ産物の配列決定により、以下の表９に示される活性ＰＡＭ配列特異性が明らかになった。

【0400】

【表9】

【0401】

細菌細胞における標的となるエンドヌクレアーゼ活性

【0402】

ｓｇＲＮＡを有するＭＧ１４－１エンドヌクレアーゼシステム（エンドヌクレアーゼ配列番号：６７８；ｓｇＲＮＡ 配列番号：５４６９）およびＧＧＣＧＧＧＧＡ ＰＡＭ配列のインビボ活性は、実施例９に記載される方法を用いて確認された。形質転換した大腸菌を連続希釈でプレーティングし、その結果（左パネルに大腸菌の連続希釈を示し、右パネルに定量化した成長を示す）を図３５に提示する。非標的ｓｇＲＮＡを発現する大腸菌と比較して、オンターゲットｓｇＲＮＡを発現する大腸菌の増殖の大幅な減少は、ゲノムＤＮＡが大腸菌細胞内でＭＧ１－４エンドヌクレアーゼによって特異的に切断されたことを示している。

【0403】

実施例１５．－ＭＧ１５ファミリーメンバーの特徴付け
ＰＡＭ特異性、ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｓｇＲＮＡの検証

【0404】

ＭＧ１５ファミリーメンバーの標的となるエンドヌクレアーゼ活性は、実施例６に記載されるようなｍｙＴＸＴＬシステムを用いて確認された。このアッセイでは、切断された標的プラスミドのＰＣＲ増幅により、図１７～２０に示すように、ゲル中で約１７０ｂｐで遊走する産物が得られる。ＭＧ１５－１（二重ガイド：ゲル２、レーン７、単一ガイド：ゲル３、レーン９を参照）について増幅産物が観察された（配列番号：９３０）。ＰＣＲ産物の配列決定により、以下の表１０で詳細に説明される活性ＰＡＭ配列特異性が明らかになった。

【0405】

【表10】

【0406】

インビトロ活性

【0407】

ＭＧ１５－１エンドヌクレアーゼシステム（タンパク質配列番号：９３０、ｓｇＲＮＡ 配列番号：５４７０）のインビトロ活性は、実施例８の方法を使用してＰＡＭ配列ＧＧＧＴＣＡＡＡを用いて試験された。上記で報告されている単一ガイド配列（配列番号：５４７０）を使用し、配列のＮｓを置き換えてスペーサー／標的化配列の長さを１８～２４ｎｔの範囲で変化させた。その結果を図１６に示す。上パネルは、異なる標的化配列長（１８～２４ｎｔ）を有する様々なｓｇＲＮＡと組み合わせたＭＧ１５－１によるＤＮＡ切断を実証するゲルを示し、下パネルは、同じデータを棒グラフとして定量化したものを示す。このデータは、１８～２４ヌクレオチドの標的化配列がＭＧ１５－１／ｓｇＲＮＡシステムで機能的であることを実証した。

【0408】

細菌細胞における標的となるエンドヌクレアーゼ活性

【0409】

ｓｇＲＮＡを有するＭＧ１５－１エンドヌクレアーゼシステム（エンドヌクレアーゼ配列番号：９３０；ｓｇＲＮＡ 配列番号：５４７０）およびＧＧＧＴＣＡＡＡ ＰＡＭ配列のインビボ活性は、実施例９に記載される方法を用いて確認された。形質転換した大腸菌を連続希釈でプレーティングし、その結果（左パネルに大腸菌の連続希釈を示し、右パネルに定量化した成長を示す）を図３５に提示する。非標的ｓｇＲＮＡを発現する大腸菌と比較して、オンターゲットｓｇＲＮＡを発現する大腸菌の増殖の大幅な減少は、ゲノムＤＮＡが大腸菌細胞内でＭＧ１－４エンドヌクレアーゼによって特異的に切断されたことを示している。

【0410】

実施例１６．－ＭＧ１６ファミリーメンバーの特徴付け
ＰＡＭ特異性、ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｓｇＲＮＡの検証

【0411】

ＭＧ１６ファミリーメンバーの標的となるエンドヌクレアーゼ活性は、実施例６に記載されるようなｍｙＴＸＴＬシステムを用いて確認された。このアッセイでは、切断された標的プラスミドのＰＣＲ増幅により、図１７～２０に示すように、ゲル中で約１７０ｂｐで遊走する産物が得られる。増幅産物は、ＭＧ１６－２（ゲル１１、レーン１７を参照）（配列番号：１０９３）について観察された。ＰＣＲ産物の配列決定により、以下の表１１で詳細に説明される活性ＰＡＭ配列特異性が明らかになった。

【0412】

【表11】

【0413】

実施例１７．－ＭＧ１８ファミリーメンバーの特徴付け
ＰＡＭ特異性、ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｓｇＲＮＡの検証

【0414】

ＭＧ１８ファミリーメンバーの標的となるエンドヌクレアーゼ活性は、実施例６に記載されるようなｍｙＴＸＴＬシステムを用いて確認された。このアッセイでは、切断された標的プラスミドのＰＣＲ増幅により、図１７～２０に示すように、ゲル中で約１７０ｂｐで遊走する産物が得られる。ＭＧ１８－１（二重ガイド：ゲル２、レーン９、単一ガイド：ゲル１１、レーン１２を参照）について増幅産物が観察された（配列番号：１３５４）。ＰＣＲ産物の配列決定により、以下の表１２で詳細に説明される活性ＰＡＭ配列特異性が明らかになった。

【0415】

【表12】

【0416】

実施例１８．－ＭＧ２１ファミリーメンバーの特徴付け
ＰＡＭ特異性、ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｓｇＲＮＡの検証

【0417】

ＭＧ２１ファミリーの標的となるエンドヌクレアーゼ活性は、実施例６に記載されるようなｍｙＴＸＴＬシステムを用いて確認された。このアッセイでは、切断された標的プラスミドのＰＣＲ増幅により、図１７～２０に示すように、ゲル中で約１７０ｂｐで遊走する産物が得られる。増幅産物は、ＭＧ２１－１（ゲル１１、レーン２を参照）について観察された（配列番号：１５１２）。ＰＣＲ産物の配列決定により、以下の表１３で詳細に説明される活性ＰＡＭ配列特異性が明らかになった。

【0418】

【表13】

【0419】

実施例１９．－ＭＧ２２ファミリーメンバーの特徴付け
ＰＡＭ特異性、ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｓｇＲＮＡの検証

【0420】

ＭＧ２２ファミリーメンバーの標的となるエンドヌクレアーゼ活性は、実施例６に記載されるようなｍｙＴＸＴＬシステムを用いて確認された。このアッセイでは、切断された標的プラスミドのＰＣＲ増幅により、図１７～２０に示すように、ゲル中で約１７０ｂｐで遊走する産物が得られる。図１７～２０に示すアッセイでは、ライブラリの切断に成功した活性タンパク質は、ゲル中におよそ１７０ｂｐのバンドを生じさせる。増幅産物は、ＭＧ２２－１（ゲル１１、レーン３を参照）について観察された（タンパク質配列番号：１６５６）。ＰＣＲ産物の配列決定により、以下の表１４で詳細に説明される活性ＰＡＭ配列特異性が明らかになった。

【0421】

【表14】

【0422】

実施例２０．－ＭＧ２３ファミリーメンバーの特徴付け
ＰＡＭ特異性、ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｓｇＲＮＡの検証

【0423】

ＭＧ２３ファミリーメンバーの標的となるエンドヌクレアーゼ活性は、実施例６に記載されるようなｍｙＴＸＴＬシステムを用いて確認された。このアッセイでは、切断された標的プラスミドのＰＣＲ増幅により、図１７～２０に示すように、ゲル中で約１７０ｂｐで遊走する産物が得られる。増幅産物は、ＭＧ２３－１（ゲル１１、レーン４を参照）について観察された（配列番号：１７５６）。ＰＣＲ産物の配列決定により、以下の表１５で詳細に説明されるこれらの酵素について活性ＰＡＭ配列特異性が明らかになった。

【0424】

【表15】

本開示のシステムは、例えば、核酸編集（例えば、遺伝子編集）、核酸分子への結合（例えば、配列特異的結合）など、様々な用途に使用することができる。このようなシステムは、例えば、ウイルスゲノムを標的とすることでウイルスを不活性化したり、宿主細胞に感染できないようにしたりするために、価値の高い低分子、高分子、または二次代謝産物を生成するように生物を操作するべく遺伝子を追加したり、代謝経路を変更したりするために、進化的選択のための遺伝子駆動要素を確立するために、バイオセンサーとして外来の低分子およびヌクレオチドによる細胞摂動を検出するために、特定のヌクレオチド配列（例えば、細菌における抗生物質耐性をコードする配列）を標的とするとともに検出するためにプローブと組み合わせた不活性化酵素のように、疾患を引き起こす遺伝的要素を検出するための診断ツールとして（例えば、逆転写されたウイルスＲＮＡまたは疾患を引き起こす突然変異をコードする増幅されたＤＮＡ配列の切断を介して）、被験体において疾患を引き起こす可能性のある遺伝的に受け継がれた突然変異をアドレス指定（例えば、除去または置換）して、遺伝子を不活性化することで細胞内での遺伝子の機能を確認するために使用されてもよい。

【0425】

本発明の好ましい実施形態が本明細書中で示され、記載されてきたが、このような実施形態はほんの一例として提供されているに過ぎないことが当業者に明らかであろう。本発明が明細書内で提供される特定の例によって制限されることは意図していない。本発明は前述の明細書に関して記載されているが、本明細書中の実施形態の記載および例示は、限定的な意味で解釈されることを目的としていない。当業者であれば、多くの変更、変化、および置換が、本発明から逸脱することなく思いつくだろう。さらに、本発明のすべての態様は、様々な条件および変数に依存する、本明細書で説明された特定の描写、構成、または相対的な比率に限定されないことが理解されよう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代替案が、本発明の実施に際して利用され得ることを理解されたい。それゆえ、本発明は、任意のそのような代替物、修正物、変形物、または同等物にも及ぶものと企図される。以下の請求項は本発明の範囲を定義するものであり、この請求項とその均等物の範囲内の方法、および構造体がそれによって包含されるものであるということが意図されている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図9F】

【図9G】

【図9H】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-07-05

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

操作されたヌクレアーゼシステムであって、前記操作されたヌクレアーゼシステムは、
（ａ）ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含むエンドヌクレアーゼであって、ここで、前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：４２３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、エンドヌクレアーゼと、
（ｂ）前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成される、操作されたガイドリボ核酸構造であって、前記操作されたガイドリボ核酸構造は、
（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列と、
（ｉｉ）前記エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列と、を含む操作されたガイドリボ核酸構造と、
を含む、操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項2】

前記ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：２２４４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項3】

前記ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号：２２４４のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項4】

前記エンドヌクレアーゼはＨＮＨドメインを含む、請求項１－３のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項5】

前記ＨＮＨドメインは配列番号：４０６３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項6】

前記ＨＮＨドメインは、配列番号：４０６３のアミノ酸配列を含む、請求項４または５に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項7】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：４２３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１－６のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項8】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：４２３を含む、請求項１－７のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項9】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号：５５３４のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に結合するように構成される、請求項１－８のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項10】

前記エンドヌクレアーゼは、前記エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端の近位にある１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）をさらに含む、請求項１－９のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項11】

前記１つ以上のＮＬＳは、配列番号：５５９７－５６１２のいずれか１つから選択される配列を含む、請求項１０に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項12】

前記ｔｒａｃｒリボ核酸配列は、配列番号：５４９７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１－１１のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項13】

前記ｔｒａｃｒリボ核酸配列は、配列番号：５４９７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１－１２のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項14】

前記ｔｒａｃｒリボ核酸配列は、配列番号：５４９７の配列を含む、請求項１－１３のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項15】

前記操作されたガイドリボ核酸構造は、少なくとも２つのリボ核酸ポリヌクレオチドを含む、請求項１－１４のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項16】

前記操作されたガイドリボ核酸構造は、前記ガイドリボ核酸配列と前記ｔｒａｃｒリボ核酸配列とを含む１つのリボ核酸ポリヌクレオチドを含む、請求項１－１４のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項17】

前記ガイドリボ核酸配列は、原核生物、細菌、古細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳動物、またはヒトのゲノム配列に相補的である、請求項１－１６のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項18】

前記ガイドリボ核酸配列は１５～２４ヌクレオチド長である、請求項１－１７のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項19】

５’から３’に、前記標的デオキシリボ核酸配列の５’の配列を含む第１の相同性アームと、合成デオキシリボ核酸配列と、前記標的デオキシリボ核酸配列の３’の配列を含む第２の相同性アームとを含む、一本鎖または二本鎖のデオキシリボ核酸配列の修復鋳型をさらに含む、請求項１－１８のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項20】

前記第１の相同性アームまたは前記第２の相同性アームは、少なくとも２０、４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１，０００のヌクレオチドの配列を含む、請求項１９に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項21】

前記操作されたヌクレアーゼシステムは、Ｍｇ ^２＋ の供給源をさらに含む、請求項１－２０のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項22】

前記エンドヌクレアーゼおよび前記ｔｒａｃｒリボ核酸配列は、同じ門内の別個の細菌種に由来する、請求項１－２１のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項23】

前記操作されたガイドリボ核酸構造は、ステムおよびループからなるヘアピンを含み、ここで、前記ステムは、少なくとも１０の塩基対のリボヌクレオチド、および前記ループの４つの塩基対以内の非対称バルジを含む、請求項１－２２のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項24】

前記ｔｒａｃｒリボ核酸配列は、少なくとも８の塩基対のリボヌクレオチドを含むヘアピンを含む、請求項１－２２のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項25】

前記操作されたガイドリボ核酸構造は、前記ガイドリボ核酸配列の少なくとも８つのヌクレオチドおよび前記ｔｒａｃｒリボ核酸配列の少なくとも８つのヌクレオチドを含む中断されていない塩基対領域を有するヘアピンを含み、ここで、前記ｔｒａｃｒリボ核酸配列は、５’から３’に、第１のヘアピンと第２のヘアピンとを含み、ここで、前記第１のヘアピンは前記第２のヘアピンよりも長いステムを有する、請求項１－２２のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項26】

前記配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される、請求項１－２５のいずれか１つに記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【請求項27】

前記配列同一性は、３のｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ（Ｗ）、１０のｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ（Ｅ）のパラメータ、および、１１のｅｘｉｓｔｅｎｃｅ、１のｅｘｔｅｎｓｉｏｎでギャップコストを設定するＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用して、ならびに、条件付き組成スコアマトリックス調整を使用して、前記ＢＬＡＳＴＰ相同性検索アルゴリズムによって決定される、請求項２６に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。

【外国語明細書】