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特開2024-133657Β－サルコグリカンのアデノ随伴ウイルスベクター送達および筋ジストロフィーの治療
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024133657
(43)【公開日】2024-10-02
(54)【発明の名称】Β－サルコグリカンのアデノ随伴ウイルスベクター送達および筋ジストロフィーの治療
(51)【国際特許分類】
C12N 15/864 20060101AFI20240925BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240925BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240925BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240925BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240925BHJP
【ＦＩ】
C12N15/864 100Z
C12N15/12 ZNA
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12N1/21
C12N15/12
【審査請求】有
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024109621
(22)【出願日】2024-07-08
(62)【分割の表示】P 2021549782の分割
【原出願日】2020-02-26
(31)【優先権主張番号】62/909,564
(32)【優先日】2019-10-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/834,012
(32)【優先日】2019-04-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/881,901
(32)【優先日】2019-08-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/910,779
(32)【優先日】2019-10-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/858,644
(32)【優先日】2019-06-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/810,917
(32)【優先日】2019-02-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】515289842
【氏名又は名称】リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ルイーズ ロディノ－カラパック
(72)【発明者】
【氏名】ジェリー アール． メンデル
(57)【要約】
【課題】Β－サルコグリカンのアデノ随伴ウイルスベクター送達および筋ジストロフィーの治療の提供。
【解決手段】筋ジストロフィーを治療する方法であって、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢベクターを投与することを含む方法、患者においてベータ－サルコグリカン遺伝子を発現する方法、ｒＡＡＶを含む医薬組成物、およびｒＡＡＶを生成する方法が、本明細書に記載される。β－サルコグリカン遺伝子を発現する遺伝子用治療ベクター（例えば、ＡＡＶ）、ならびにβ－サルコグリカンを筋肉に送達し、線維症を低減および／もしくは予防する方法、および／または筋力を増加させる方法、および／または筋ジストロフィーを罹患している哺乳動物対象を治療する方法が本明細書に記載される。
【選択図】なし
【解決手段】筋ジストロフィーを治療する方法であって、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢベクターを投与することを含む方法、患者においてベータ－サルコグリカン遺伝子を発現する方法、ｒＡＡＶを含む医薬組成物、およびｒＡＡＶを生成する方法が、本明細書に記載される。β－サルコグリカン遺伝子を発現する遺伝子用治療ベクター（例えば、ＡＡＶ）、ならびにβ－サルコグリカンを筋肉に送達し、線維症を低減および／もしくは予防する方法、および／または筋力を増加させる方法、および／または筋ジストロフィーを罹患している哺乳動物対象を治療する方法が本明細書に記載される。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２４のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項2】
配列番号２４のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項3】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを含む、プラスミド。
【請求項4】
組換えＡＡＶを生成する方法であって、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを細胞に移入させることを含む、方法。
【請求項5】
パッケージングプラスミドおよび／またはヘルパーウイルスを前記細胞に移入させることをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記細胞が、安定に組み込まれたＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含む、請求項４または５に記載の方法。
【請求項7】
前記細胞が、安定に組み込まれたＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含む、請求項４～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３およびＡＡＶ ｒｈ．７４のカプシドタンパク質、またはその変異体の１つまたは複数を含む、請求項４～７のいずれかに記載の方法。
【請求項9】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを含む、単離された細胞。
【請求項10】
請求項３に記載のプラスミドを含む、単離された細胞。
【請求項11】
前記細胞が、昆虫細胞、カイコ細胞、蚊細胞、細菌細胞または哺乳動物細胞である、請求項９または１０に記載の単離された細胞。
【請求項12】
前記細胞が、Ｓ２細胞、Ｋｃ細胞、Ｂｍｅ２１細胞、Ｃ６／３６細胞、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞またはＫＢ細胞である、請求項９または１０に記載の単離された細胞。
【請求項13】
配列番号１９の配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、ｒＡＡＶ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
この出願は、２０１９年２月２６日に出願された米国仮出願第６２／８１０，９１７号、２０１９年４月１５日に出願された米国仮出願第６２／８３４，０１２号、２０１９年６月７日に出願された米国仮出願第６２／８５８，６４４号、２０１９年８月１日に出願された米国仮出願第６２／８８１，９０１号、２０１９年１０月２日に出願された米国仮出願第６２／９０９，５６４号、および２０１９年１０月４日に出願された米国仮出願第６２／９１０，７７９号に対する優先権を主張し、これらはすべて、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
電子的に提出された資料の参照による組み込み
この出願は、本開示の別個の部分として、参照によりそれらの全体が組み込まれ、以下のように特定されるコンピュータ可読形態での配列表を含む。ファイル名：５４０１６＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、サイズ：３３，４６６バイト、作成日：２０２０年２月１２日。
この出願は、本開示の別個の部分として、参照によりそれらの全体が組み込まれ、以下のように特定されるコンピュータ可読形態での配列表を含む。ファイル名：５４０１６＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、サイズ：３３，４６６バイト、作成日：２０２０年２月１２日。
【0003】
β－サルコグリカンを発現するＡＡＶベクターのような治療ベクター、ならびに筋ジストロフィーに罹患している対象における線維症を軽減し、予防するためにこれらのベクターを使用する方法が本明細書に記載される。
【背景技術】
【0004】
肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）２Ｅ型（ＬＧＭＤ２Ｅ）は、β－サルコグリカン（ＳＧＣＢ）をコードする遺伝子中の変異から生じる常染色体劣性障害であり、機能性タンパク質の喪失を引き起こす。ＬＧＭＤ２Ｅは、米国におけるＬＧＭＤの比較的一般的かつ重篤な形態を表し、全世界で１／２０万～１／３５万の発生率が報告されている。（２）β－サルコグリカンが存在しないと、慢性的な筋線維の喪失、炎症、脂肪置換および線維症（これらはすべて筋肉の強度および機能の悪化を引き起こす）を伴う進行性ジストロフィーを引き起こす。（３、４）複合体として、３５～５０ｋＤのサイズの範囲内であるサルコグリカン（α－、β、γ－、δ－）は、（５）すべて、筋活動中の機械的応力からの保護を提供する筋鞘に安定性をもたらす膜貫通タンパク質である。（３）ＬＧＭＤ２Ｅにおける３－サルコグリカンの喪失は、通常、筋線維の喪失に至る筋膜の脆性に寄与する様々な程度の他のサルコグリカンタンパク質の付随する喪失を引き起こす。１ ＬＧＭＤ２Ｅの臨床的表現型の範囲は様々であるが、診断は典型的には１０歳までに行われ、１０代半ばから後半までに歩行の喪失が起こる。患者は、血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）の上昇、近位筋力低下、床から生じる困難さ、および進行性の歩行喪失を示す。症例の５０％において心臓障害が発生する。
【0005】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、２つの１４５ヌクレオチド逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む約４．７ｋｂ長である。ＡＡＶの複数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は既知である。例えば、ＡＡＶ－１の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００２０７７に提示されており、ＡＡＶ－２の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００１４０１およびＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４｛１９８３）に提示されており、ＡＡＶ－３の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿１８２９に提示されており、ＡＡＶ－４の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００１８２９に提示されており、ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＡＦ０８５７１６に提示されており、ＡＡＶ－６の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００ １８６２に提示されており、ＡＡＶ－７およびＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９に提示されており、ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提示されており、ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に提示されており、ＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提示されている。ＡＡＶ ｒｈ．７４ゲノムの配列は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，４３４，９２８号に提供されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、および宿主細胞染色体組込みを指示するＣｉｓ作用配列は、ＡＡＶ ＩＴＲ内に含有される。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置に対してｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と名付けられる）は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を推進する。単一のＡＡＶイントロンの差異的スプライシング（ヌクレオチド２１０７および２２２７における）と相まって、２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）により、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）が産生される。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連カプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶの生活環および遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）においてレビューされる。
【0006】
ＡＡＶは、例えば、遺伝子療法において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的にする固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性であり、ヒトおよび他の動物の自然感染は、サイレントかつ無症候性である。さらに、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞を感染させ、インビボで多くの異なる組織を標的化する可能性を可能にする。さらに、ＡＡＶは、緩徐に分裂する細胞および非分裂細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外要素）として本質的にそれらの細胞の寿命にわたって存続し得る。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド内のクローニングされたＤＮＡとして挿入される。さらに、ＡＡＶ複製およびゲノムカプシド形成を指示するシグナルが、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含有されるため、内部約４．３ｋｂのゲノム（複製および構造カプシドタンパク質をコードする、ｒｅｐ－ｃａｐ）の一部またはすべてが、外来ＤＮＡで置換されてもよい。ＡＡＶベクターを生成するために、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定した頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥され得る。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性を示さない。
【0007】
複数の研究により、筋肉における長期（１．５年を超える）の組換えＡＡＶ媒介タンパク質発現が実証されている。Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，８：６５９－６６９（１９９７）、Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９３：１４０８２－１４０８７（１９９６）、およびＸｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７０：８０９８－８１０８（１９９６）を参照されたい。Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２：６１９－６２３（２０００）およびＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，４：２１７－２２２（２００１）もまた参照されたい。さらに、筋肉は高度に血管化されているため、Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：５８０４－５８０９（１９９７）、およびＭｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ＵＳＡ，９４：１３９２１－１３９２６（１９９７）に記載されているように、組換えＡＡＶ形質導入により、筋肉内注射後の体循環において導入遺伝子産物が出現する。さらに、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７６：８７６９－８７７５（２００２）は、骨格筋線維が、正しい抗体グリコシル化、折り畳み、および分泌に必要な細胞因子を有することを実証し、筋肉が分泌タンパク質治療薬を安定して発現することができることを示す。
ＬＧＭＤ２Ｅのための療法の新たに出現した形態は、罹患した筋肉への野生型タンパク質を回復するためのウイルス媒介遺伝子送達であり、筋機能の回復をもたらす。患者のサブセットが心筋症を発症する可能性があることを考慮すると（８、９、１０、１３）、これらの患者の長期ケアにおいて考慮する必要がある。以前の報告では、Ｓｇｃｂヌルマウスは十分に特徴付けられていた。Ａｒａｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．３は、サルコスパンだけでなくサルコグリカンすべての喪失を伴い、メロシン、ジストログリカン、およびジストロフィンを少なくともわずかに保存し、ＬＧＭＤ２Ｅにおいて見られる臨床像を再現する、β－サルコグリカン欠損マウスを開発した。この動物モデルにおける組織学的変化は、顕性の骨格筋線維症を含む、臨床的対応のプロトタイプでもあった。（１４）Ｄｒｅｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２５）は、ｒＡＡＶ２．ＣＭＶ．ＳＧＣＢを用いて腹横筋を注射した。げｔｕｔ発現は２１ヶ月間持続し、筋線維は再発性壊死から保護された。導入遺伝子発現を増強するための自己相補的ＡＡＶの使用、１６、骨格筋をより良好に標的化する筋特異的プロモーター（２０、２６）、およびヒトβ－サルコグリカン遺伝子（ｈＳＧＣＢ）の最適化も記載されている。
ＬＧＭＤおよび他の筋ジストロフィーに罹患している患者における機能改善には、遺伝子回復および線維症の軽減の両方が必要である。ＬＧＭＤおよび他の筋ジストロフィーのより効果的な治療のための遺伝子回復法で修復され得る線維症を軽減する方法が必要とされている。
ＵＳＡ，９４：１３９２１－１３９２６（１９９７）に記載されているように、組換えＡＡＶ形質導入により、筋肉内注射後の体循環において導入遺伝子産物が出現する。さらに、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７６：８７６９－８７７５（２００２）は、骨格筋線維が、正しい抗体グリコシル化、折り畳み、および分泌に必要な細胞因子を有することを実証し、筋肉が分泌タンパク質治療薬を安定して発現することができることを示す。
ＬＧＭＤ２Ｅのための療法の新たに出現した形態は、罹患した筋肉への野生型タンパク質を回復するためのウイルス媒介遺伝子送達であり、筋機能の回復をもたらす。患者のサブセットが心筋症を発症する可能性があることを考慮すると（８、９、１０、１３）、これらの患者の長期ケアにおいて考慮する必要がある。以前の報告では、Ｓｇｃｂヌルマウスは十分に特徴付けられていた。Ａｒａｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．３は、サルコスパンだけでなくサルコグリカンすべての喪失を伴い、メロシン、ジストログリカン、およびジストロフィンを少なくともわずかに保存し、ＬＧＭＤ２Ｅにおいて見られる臨床像を再現する、β－サルコグリカン欠損マウスを開発した。この動物モデルにおける組織学的変化は、顕性の骨格筋線維症を含む、臨床的対応のプロトタイプでもあった。（１４）Ｄｒｅｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２５）は、ｒＡＡＶ２．ＣＭＶ．ＳＧＣＢを用いて腹横筋を注射した。げｔｕｔ発現は２１ヶ月間持続し、筋線維は再発性壊死から保護された。導入遺伝子発現を増強するための自己相補的ＡＡＶの使用、１６、骨格筋をより良好に標的化する筋特異的プロモーター（２０、２６）、およびヒトβ－サルコグリカン遺伝子（ｈＳＧＣＢ）の最適化も記載されている。
ＬＧＭＤおよび他の筋ジストロフィーに罹患している患者における機能改善には、遺伝子回復および線維症の軽減の両方が必要である。ＬＧＭＤおよび他の筋ジストロフィーのより効果的な治療のための遺伝子回復法で修復され得る線維症を軽減する方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】米国特許第９，４３４，９２８号明細書
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４｛１９８３）
【非特許文献2】Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）
【非特許文献3】Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）
【非特許文献4】Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）
【非特許文献5】Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）
【非特許文献6】Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，８：６５９－６６９（１９９７）
【非特許文献7】Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９３：１４０８２－１４０８７（１９９６）
【非特許文献8】Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７０：８０９８－８１０８（１９９６）
【非特許文献9】Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２：６１９－６２３（２０００）
【非特許文献10】Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，４：２１７－２２２（２００１）
【非特許文献11】Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：５８０４－５８０９（１９９７）
【非特許文献12】Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：１３９２１－１３９２６（１９９７）
【非特許文献13】Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７６：８７６９－８７７５（２００２）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0010】
β－サルコグリカン遺伝子を発現する遺伝子用治療ベクター（例えば、ＡＡＶ）、ならびにβ－サルコグリカンを筋肉に送達し、線維症を低減および／もしくは予防する方法、および／または筋力を増加させる方法、および／または筋ジストロフィーを罹患している哺乳動物対象を治療する方法が本明細書に記載される。
【0011】
一態様では、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを治療する方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを、必要とする対象に投与するステップを含み、ｒＡＡＶが、全身投与経路を使用して、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づいて、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で、または定量標準としての線状化プラスミドに基づいて、１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与され、対象における血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルが、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に減少する、方法が本明細書に記載される。
【0012】
別の態様では、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを治療する方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを投与するステップを含み、対象の細胞におけるベータ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルが、ｒＡＡＶの投与前のベータ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加し、対象の筋肉組織におけるベータ－サルコグリカン陽性線維の数が、ｒＡＡＶの投与前のベータ－サルコグリカン陽性線維の数と比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加するか、または運動機能が、ｒＡＡＶの投与前のその対象の運動機能と比較して、その対象において改善されており、運動機能が、１００メートルの時間歩行試験によって決定される、方法が提供される。
【0013】
別の態様では、本開示は、肢帯型筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを治療する方法であって、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づいて、約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇもしくは約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または定量標準としての線状化プラスミドに基づいて約１．８５×１０１３ｖｇ／ｋｇもしくは約７．４１×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で、およそ１～２時間かけてｒＡＡＶ静脈内注入を対象に投与することを含み、ｒＡＡＶが、配列番号３または配列番号１９のヌクレオチド配列を含む、方法を提供する。別の態様では、本開示は、対象の細胞においてベータ－サルコグリカン遺伝子を発現する方法であって、配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物を対象に投与することを含む、方法を記載する。一態様では、本開示は、対象の筋肉組織においてベータ－サルコグリカン陽性線維を増加させ、および／またはＣＫレベルを減少させる方法であって、配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0014】
一態様では、アルファ－サルコグリカンの発現の増加を必要とする対象においてそれを行う方法であって、配列番号３または配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を有するｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物を含むｒＡＡＶを対象に投与することを含む、方法が本明細書に記載される。別の態様では、アルファ－サルコグリカンの細胞膜への局在化の増加を必要とする対象においてそれを行う方法であって、配列番号３または配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列を対象に投与することを含む、方法が本明細書に記載される。別の態様では、対象の筋肉組織におけるサルコグリカン発現を増加させるか、または筋肉機能を改善する方法であって、配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶを対象に投与することを含む、方法が提供される。別の態様では、本開示は、対象の筋肉組織におけるサルコグリカン発現を増加させる方法であって、第１のサルコグリカンをコードするヌクレオチド配列を含む構築物を対象に投与することと、第１のサルコグリカンを発現する細胞の細胞膜において少なくとも第２のサルコグリカンの発現の増加を検出することと、を含む、方法を提供する。
【0015】
別の態様では、組成物であって、ｒＡＡＶ ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢベクターと、緩衝剤と、イオン強度剤と、界面活性剤と、を含む組成物が記載される。別の態様では、医薬組成物であって、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを含み、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢが、配列番号１９と少なくとも９０％、９５％または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、医薬組成物が本明細書に記載される。
【0016】
別の態様では、組換えＡＡＶ ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを生成する方法であって、プラスミドを細胞に移入することを含み、プラスミドが、配列番号２４と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、方法が提供される。特に、プラスミドは、配列番号２４のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、プラスミドは、配列番号１９のヌクレオチド配列を含む。
【0017】
別の態様では、β－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶベクターが本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、β－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列は、例えば、配列番号１に記載のヌクレオチド配列と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より典型的には９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一の配列を含み、β－サルコグリカン活性を保持するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、β－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、β－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列からなる。
【0018】
別の態様では、本明細書に記載の組換えＡＡＶベクターは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より典型的には少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、さらにより典型的には少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性である、β－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含み、そのタンパク質は、β－サルコグリカン活性を保持する。
【0019】
別の態様では、ストリンジェントな条件下で配列番号１の核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む機能性β－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列、またはその補体を含む、組換えＡＡＶベクターが本明細書に記載される。
【0020】
「ストリンジェントな」という用語は、ストリンジェントとして当該技術分野において一般に理解される条件を指すために使用される。ハイブリダイゼーションストリンジェシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドなどの変性剤の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄のためのストリンジェントな条件の例は、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、６５～６８℃の０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウムまたは０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、および４２℃の５０％ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照されたい。よりストリンジェントな条件（より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤など）も使用できるが、ハイブリダイゼーションの速度が影響を受ける。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが関係する場合、追加のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例には、３７℃（１４塩基オリゴの場合）、４８℃（１７塩基オリゴの場合）、５５℃（２０塩基オリゴの場合）、および６０℃（２３塩基オリゴの場合）での６×ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸ナトリウムでの洗浄が含まれる。
【0021】
分子量、濃度、または投薬量等の物理的特性について本明細書で範囲が使用される場合、範囲およびその中の特定の実施形態の全ての組み合わせおよび部分的な組み合わせが含まれることが意図される。数値または数値範囲を指す場合の「約」という用語は、参照される数値または数値範囲が実験的変動内（または統計的実験誤差内）の近似値であることを意味し、したがって、数値または数値範囲は、例えば、記載された数値または数値範囲の１％～１５％の間で変動し得る。
【0022】
非特異的および／またはバックグラウンドハイブリダイゼーションを低減する目的で、ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液に他の薬剤を含めることができる。例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニル－ピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ＮａＤｏｄＳＯ４、（ＳＤＳ）、フィコール、デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（または他の非相補的ＤＮＡ）、および硫酸デキストランがあるが、他の適切な薬剤も使用できる。これらの添加物の濃度および種類は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更できる。ハイブリダイゼーション実験は通常、ｐＨ６．８～７．４で行われるが、典型的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーションの速度はｐＨにほとんど依存しない。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｈ．４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照されたい。ハイブリダイゼーション条件は、これらの変数を考慮して、異なる配列類似性のＤＮＡがハイブリッドを形成することを可能にするために、当業者によって調整され得る。
【0023】
別の態様では、本明細書に記載の組換えＡＡＶベクターは、筋特異的制御要素に作動可能に連結され得る。例えば、筋特異的制御要素は、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、ｔＭＣＫ（短縮ＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＭＨＣＫ７（ＭＨＣおよびＭＣＫのハイブリッドバージョン）、Ｃ５－１２（合成プロモーター）、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋トロポニンＩ遺伝子要素、低酸素誘発性核因子、ステロイド誘発性要素、またはグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）である。
【0024】
いくつかの実施形態では、筋特異的プロモーターは、ＭＨＣＫ７（配列番号４）である。本明細書に記載の例示的なｒＡＡＶは、配列番号３のヌクレオチド配列を含むｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＣＧＢである。配列番号３のヌクレオチド配列内で、ＭＣＨＫ７プロモーターは、ヌクレオチド１３０～９２１に広がっており、ＳＶ４０キメライントロン（配列番号２０）は、ヌクレオチド９３１～１０７８に広がっており、β－サルコグリカン配列（配列番号１）は、ヌクレオチド１０９１～２０４７に広がっており、ポリＡ（配列番号２１）は、ヌクレオチド２０５４～２１０６に広がっている。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＣＧＢは、配列番号１９のヌクレオチド配列を含む。配列番号１９のヌクレオチド配列内で、ＭＣＨＫ７プロモーターは、ヌクレオチド１２８～９１９に広がっており、ＳＶ４０キメライントロンは、ヌクレオチド９２９～１０７６に広がっており、β－サルコグリカン配列は、ヌクレオチド１０８６～２０４２に広がっており、ポリＡは、ヌクレオチド２０４９～２１０１に広がっている。
【0025】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＣＧＢは、配列番号３または配列番号１９に記載のヌクレオチド配列と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、または約８９％、より典型的には、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるヌクレオチド配列、または配列番号２と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、または約８９％、より典型的には、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【0026】
一実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ベータ－および／またはアルファ－サルコグリカン活性を含むサルコグリカン活性を保持するタンパク質をコードする。別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ベータ－サルコグリカン活性を保持するタンパク質をコードする。
【0027】
いくつかの実施形態では、筋特異的プロモーターは、ｔＭＣＫ（配列番号６）である。本明細書に記載の例示的なｒＡＡＶは、配列番号５のヌクレオチド配列を含むｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＢである。配列番号５のヌクレオチド配列内で、ｔＭＣＫプロモーターは、ヌクレオチド１４１～８５４に広がっており、ＳＶ４０キメライントロンは、ヌクレオチド８８６～１０１８に広がっており、β－サルコグリカン配列は、ヌクレオチド１０５８～２０１４に広がっており、ポリＡは、ヌクレオチド２０２１～２０７３に広がっている。いくつかの実施形態では、ｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＢをコードするポリヌクレオチド配列は、例えば、配列番号５に記載のヌクレオチド配列と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、または約８９％、より典型的には、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％、またはそれ以上同一の配列を含み、ポリヌクレオチド配列は、限定されないがベータ－および／またはアルファ－サルコグリカン活性を含むサルコグリカン活性を保持するタンパク質をコードする。
【0028】
ＡＡＶは、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３およびＡＡＶｒｈ．７４等の任意の血清型であり得る。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えばＷＯ０１／８３６９２に開示されている。他のタイプのｒＡＡＶ変異体、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。
【0029】
本明細書に記載のｒＡＡＶベクターのいずれかを含む組成物もまた企図される。
【0030】
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号３または配列番号１９に記載のヌクレオチド配列と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、または約８９％、より典型的には、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるヌクレオチド配列を含むか、または配列番号２と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、または約８９％、より典型的には、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＣＧＢ ｒＡＡＶベクターを含む組成物または医薬組成物を提供する。加えて、本開示は、配列番号３または配列番号１９のヌクレオチド配列を含むか、または配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＣＧＢ ｒＡＡＶベクターを含む組成物または医薬組成物を提供する提供する。
【0031】
筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを治療する方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを投与するステップを含み、ｒＡＡＶが、全身投与経路を使用して、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、方法が提供される。
【0032】
筋ジストロフィーを治療するための組成物であって、組成物が、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣを含み、組成物が、全身投与のために製剤化される、組成物も提供される。
【0033】
加えて、筋ジストロフィーを治療するための医薬の調製のための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣの使用であって、医薬が、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量でｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣを含み、医薬が、全身投与のために製剤化される、使用が提供される。
【0034】
提供される方法、組成物および使用のうちのいずれかにおいて、対象の細胞におけるベータ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルが、ｒＡＡＶの投与前のベータ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加し、対象における血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルが、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に減少し、および／または対象の筋肉組織におけるベータ－サルコグリカン陽性線維の数が、ｒＡＡＶの投与前のベータ－サルコグリカン陽性線維の数と比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加する。
【0035】
別の実施形態では、提供される方法、組成物および使用のうちのいずれかにおいて、運動機能が、ｒＡＡＶの投与前のその対象の運動機能と比較して、その対象において改善されており、運動機能が、１００メートルの時間歩行試験によって決定される。例えば、運動機能は、遺伝子移入後１ヶ月または３０日で少なくとも５％、遺伝子移入後２ヶ月または６０日で少なくとも１０％、または遺伝子移入後３ヶ月または９０日で少なくとも１５％改善する。いくつかの実施形態では、運動機能は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、または５０％改善する。
【0036】
例えば、提供される方法、組成物および使用のうちのいずれかにおいて、全身投与経路は、静脈内経路である。例えば、ｒＡＡＶは、静脈内経路を使用して投与され、投与されるｒＡＡＶの用量は、定量標準としての線状化プラスミドに基づいて、約１．８５×１０１３ｖｇ／ｋｇまたは約７．４１×１０１３ｖｇ／ｋｇであるか、または投与されるｒＡＡＶの用量は、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づいて、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇまたは約２×１０１４ｖｇ／ｋｇである。
【0037】
いくつかの実施形態では、静脈内経路を使用して投与されるｒＡＡＶの用量、用量は、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づいて、約約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５×１０１４、または定量標準としての線状化プラスミドに基づいて約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇである。
【0038】
加えて、投与されるｒＡＡＶの用量は、約１．５×１０１３ｖｇ～約２×１０１６ｖｇ、または１．５×１０１３ｖｇ～１×１０１６ｖｇ、または約１．５×１０１３ｖｇ～約２×１０１５ｖｇ、または約１．５×１０１３ｖｇ～約１×１０１５ｖｇである。加えて、方法、提供される方法、組成物および使用のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶの用量は、約１０ｍＬ／ｋｇの濃度で投与される。提供される方法、提供される方法、組成物および使用のうちのいずれかにおいて、筋ジストロフィーは、肢帯型筋ジストロフィーである。
【0039】
加えて、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを治療する方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを投与するステップを含み、ｒＡＡＶが、全身投与経路を使用して、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与され、対象の細胞におけるベータ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルが、ｒＡＡＶの投与前のベータ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加し、対象における血清ＣＫレベルが、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に減少するか、または対象の筋肉組織におけるベータ－サルコグリカン陽性線維の数が、ｒＡＡＶの投与前のベータ－サルコグリカン陽性線維の数と比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加する、方法が提供される。例えば、提供される方法のうちのいずれかにおいて、全身投与経路は、静脈内経路であり、投与されるｒＡＡＶの用量は、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づいて、約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、投与されるｒＡＡＶの用量は、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づいて、約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、投与されるｒＡＡＶの用量は、定量標準としての線状化プラスミドに基づいて、約７．４１ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、投与されるｒＡＡＶの用量は、定量標準としての線状化プラスミドに基づいて、約１．８５×１０１３ｖｇ／ｋｇである。加えて、投与されるｒＡＡＶの用量は、約１．５×１０１３ｖｇ～約２×１０１６ｖｇ、または１．５×１０１３ｖｇ～１×１０１６ｖｇ、または約１．５×１０１３ｖｇ～約２×１０１５ｖｇ、または約１．５×１０１３ｖｇ～約１×１０１５ｖｇである。加えて、方法のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶの用量は、約１０ｍＬ／ｋｇの濃度で投与される。提供される方法のうちのいずれかにおいて、筋ジストロフィーは、肢帯型筋ジストロフィーである。
【0040】
いくつかの実施形態では、本開示は、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを治療する方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを投与するステップを含み、運動機能が、ｒＡＡＶの投与前のその対象の運動機能と比較して、その対象において明らかに改善されており、運動機能が、１００メートルの時間歩行試験によって決定される、方法を含む。いくつかの態様では、運動機能は、遺伝子移入後１ヶ月または３０日で少なくとも５％、遺伝子移入後２ヶ月または６０日で少なくとも１０％、または遺伝子移入後３ヶ月または９０日で少なくとも１５％改善する。いくつかの態様では、運動機能は、少なくとも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約４５％、または約５０％改善する。
【0041】
アルファ－サルコグリカンのレベルの増加を必要とする対象においてそれを行う方法であって、配列番号３または配列番号１９のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物を対象に投与することを含む、方法が提供される。加えて、必要な対象においてアルファ－サルコグリカンのレベルを増加させるための組成物であって、組成物が、配列番号３または配列番号１９のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物を含む、組成物が提供される。また、アルファ－サルコグリカンのレベルの増加を必要とする対象においてそれを行うための医薬の調製のための配列番号３または配列番号１９のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物の使用も提供される。いくつかの態様では、アルファ－サルコグリカンは、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢによってコードされるベータ－サルコグリカンを発現する細胞の膜に共局在化する。
【0042】
いくつかの実施形態では、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物は、イントロン配列を含む。一実施形態では、イントロン配列は、配列番号２０のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物は、ポリＡ配列を含む。一実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号２１のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物は、５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。一実施形態では、５’ＩＴＲ配列は、配列番号２２のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物は、３’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。一実施形態では、３’ＩＴＲ配列は、配列番号２３のヌクレオチド配列を含む。
【0043】
対象の筋肉組織におけるサルコグリカン発現を増加させる方法であって、第１のサルコグリカンをコードするヌクレオチド配列を含む構築物を対象に投与することと、上述の第１のサルコグリカンを発現する細胞の細胞膜において少なくとも第２のサルコグリカンの発現の増加を検出することと、を含む、方法も提供される。いくつかの態様では、第１のサルコグリカンは、β－サルコグリカン（ＳＧＣＢ）であり、上述の第２のサルコグリカンは、α－サルコグリカン（ＳＧＣＡ）、γ－サルコグリカン（ＳＧＣＧ）、またはδ－サルコグリカン（ＳＧＣＤ）である。
【0044】
提供される筋ジストロフィーを治療する方法、使用および組成物のうちのいずれかにおいて、対象は、４～１５歳であり、両方の対立遺伝子においてベータ－サルコグリカン（ＳＧＣＢ）変異が確認されており、ＡＡＶｒｈ７４抗体に対して陰性であり、および／または１００メートル歩行試験が４０％を超えるか、または正常であった。提供される筋ジストロフィーを治療する方法、使用および組成物のうちのいずれかにおいて、対象は、小児対象である。いくつかの実施形態では、対象は、小児対象であり、例えば、１～１０歳の範囲の対象である。いくつかの実施形態では、対象は、４～１５歳である。対象は、一実施形態では、青年期対象であり、例えば、１０～１９歳の範囲の対象である。加えて、対象は、一実施形態では、若年成人対象、例えば、１０代後半または２０代前半の範囲の対象であり、例えば、対象は、１５～２９歳の範囲であってもよい。いくつかの実施形態では、対象は、中年の成人または高齢の対象であり、その結果、中年の成人は、２５～５５歳の範囲であってもよく、高齢の対象は、５０歳を超える範囲であってもよい。
【0045】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、注射、注入、または移植によって投与される。例えば、ｒＡＡＶは、およそ１～２時間にわたる注入によって投与される。加えて、ｒＡＡＶは、末梢四肢静脈を介した静脈内経路によって投与される。
【0046】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを投与するステップを含む、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを治療する方法において、ｒＡＡＶは、全身投与経路を使用して、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づいて、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与され、ｒＡＡＶは、配列番号１のヒトβ－サルコグリカンヌクレオチド配列を含む。加えて、ｒＡＡＶは、配列番号４のＭＨＣＫ７プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、血清型ＡＡＶｒｈ．７４のｒＡＡＶである。加えて、ｒＡＡＶは、配列番号３または配列番号１９のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列を含む。
【0047】
別の実施形態では、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物は、イントロン配列を含む。一実施形態では、イントロン配列は、配列番号２０のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物は、ポリＡ配列を含む。一実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号２１のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物は、５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。一実施形態では、５’ＩＴＲ配列は、配列番号２２のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物は、３’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。一実施形態では、３’ＩＴＲ配列は、配列番号２３のヌクレオチド配列を含む。
【0048】
例示的な実施形態では、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを治療する方法は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを投与するステップを含み、ｒＡＡＶは、全身投与経路を使用して、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与され、対象は、肢帯型筋ジストロフィーに罹患しており、ｒＡＡＶは、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づいて、約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇもしくは約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または定量標準としての線状化プラスミドに基づいて、約１．８５×１０１３ｖｇ／ｋｇもしくは７．４１×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で、およそ１～２時間かけて静脈内注入によって投与され、ｒＡＡＶは、配列番号３または配列番号１９のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列を含む。
【0049】
加えて、本開示は、肢帯型筋ジストロフィーを治療するための組成物であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの用量を含み、ｒＡＡＶが、配列番号３または配列番号１９のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列を含み、組成物が、およそ１～２時間かけた静脈内注入によって、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づいて、約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇもしくは約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または定量標準としての線状化プラスミドに基づいて、約１．８５×１０１３ｖｇ／ｋｇもしくは７．４１×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量を送達するように製剤化される、組成物を提供する。
【0050】
本開示はまた、肢帯型筋ジストロフィーを治療するための医薬の調製のための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの用量の使用であって、ｒＡＡＶの用量定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づいて、約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇもしくは約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または定量標準としての線状化プラスミドに基づいて、約１．８５×１０１３ｖｇ／ｋｇもしくは７．４１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、医薬が、およそ１～２時間かけた静脈内注入によって用量を送達するように製剤化される、使用を提供する。
【0051】
本開示はさらに、対象の運動機能を改善する方法であって、配列番号１、３、５、または１９と少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む構築物を対象に投与することを含む、方法を提供する。加えて、対象の運動機能を改善するための組成物であって、組成物が、配列番号１、３、５、または１９と少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む構築物を含む、組成物が提供される。対象の運動機能を改善するための医薬の調製のための配列番号１、３、５、または１９と少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む構築物の使用も提供される。
【0052】
提供される方法、使用または組成物のうちのいずれかにおいて、対象は、サルコグリカンまたは筋ジストロフィーをコードする遺伝子中の遺伝子変異を有している。いくつかの態様では、サルコグリカンは、β－サルコグリカン（ＳＧＣＢ）、α－サルコグリカン（ＳＧＣＡ）、γ－サルコグリカン（ＳＧＣＧ）、またはδ－サルコグリカン（ＳＧＣＤ）である。いくつかの態様では、サルコグリカンは、β－サルコグリカンまたはα－サルコグリカンである。
【0053】
提供される方法、使用または組成物のうちのいずれかにおいて、対象の細胞におけるベータ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルは、ｒＡＡＶの投与前のベータ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加する。
【0054】
加えて、提供される方法、使用または組成物のうちのいずれかにおいて、細胞におけるベータ－サルコグリカン遺伝子の発現は、ｒＡＡＶ投与の前および後の筋生検におけるウエスタンブロットまたは免疫組織化学でベータ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。
【0055】
提供される方法、使用または組成物のうちのいずれかにおいて、ベータ－サルコグリカンタンパク質のレベルは、ｒＡＡＶ投与後に少なくとも２５％、または少なくとも２６％、または少なくとも２７％、または少なくとも２８％、または少なくとも２９％、または少なくとも３０％、または少なくとも３１％、または少なくとも３２％、または少なくとも３３％、または少なくとも３４％、または少なくともまたは３５％、または少なくとも３６％、または少なくとも３７％、または少なくとも３８％、または少なくとも３９％、または少なくとも４０％、または少なくとも４１％、または少なくとも４２％、または少なくとも４３％、または少なくとも４４％、または少なくとも４５％または少なくとも４６％、または少なくとも４７％、または少なくとも４８％、または少なくとも４９％、または少なくとも５０％、または少なくとも５１％、または少なくとも５２％、または少なくとも５３％、または少なくとも５４％、または少なくとも５５％または少なくとも５６％、または少なくとも５７％、または少なくとも５８％、または少なくとも５９％、または少なくとも６０％、または少なくとも６３％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％増加する。例えば、ベータ－サルコグリカンタンパク質のレベルは、ｒＡＡＶ投与の前および後の筋生検におけるウエスタンブロットでベータ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される場合、少なくとも３３％増加し、またはベータ－サルコグリカンタンパク質のレベルは、ｒＡＡＶ投与の前および後の筋生検における免疫組織化学でベータ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される場合、少なくとも３８％または少なくとも３９％増加する。
【0056】
本明細書で提供される方法、使用または組成物のうちのいずれかにおいて、対象における血清ＣＫレベルが、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に減少する。例えば、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日～９０日、６０日、または９０日に少なくとも５０％、または少なくとも５１％、または少なくとも５２％、または少なくとも５３％、または少なくとも５４％、または少なくとも５５％または少なくとも５６％、または少なくとも５７％、または少なくとも５８％、または少なくとも５９％、または少なくとも６０％、または少なくとも６３％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８１％、または少なくとも８２％、または少なくとも８３％、または少なくとも８４％、または少なくとも８５％、または少なくとも８６％または少なくとも８７％、または少なくとも８８％、または少なくとも８９％、または少なくとも９０％または少なくとも９５％、または少なくとも９８％減少する。
【0057】
本明細書で提供される方法、使用または組成物のうちのいずれかにおいて、対象の筋肉組織におけるベータ－サルコグリカン陽性線維の数は、ｒＡＡＶの投与前のベータ－サルコグリカン陽性線維の数と比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加する。例えば、ベータ－サルコグリカン陽性線維の数は、ｒＡＡＶ投与の前および後の筋生検におけるウエスタンブロットまたは免疫組織化学でベータ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。例えば、対象の筋肉組織におけるベータ－サルコグリカン陽性線維の数は、ｒＡＡＶ投与後に少なくとも２５％、または少なくとも２６％、または少なくとも２７％、または少なくとも２８％、または少なくとも２９％、または少なくとも３０％、または少なくとも３１％、または少なくとも３２％、または少なくとも３３％、または少なくとも３４％、または少なくとも３５％または少なくとも３６％、または少なくとも３７％、または少なくとも３８％、または少なくとも３９％、または少なくとも４０％、または少なくとも４１％、または少なくとも４２％、または少なくとも４３％、または少なくとも４４％、または少なくとも４５％または少なくとも４６％、または少なくとも４７％、または少なくとも４８％、または少なくとも４９％、または少なくとも５０％、または少なくとも５１％、または少なくとも５２％、または少なくとも５３％、または少なくとも５４％、または少なくとも５５％または少なくとも５６％、または少なくとも５７％、または少なくとも５８％、または少なくとも５９％、または少なくとも６０％、または少なくとも６３％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％または少なくとも９５％、または少なくとも９８％増加する。
【0058】
本明細書で提供される方法、組成物および使用のうちのいずれかにおいて、対象におけるアルファ－サルコグリカンのレベルは、ｒＡＡＶの投与前のアルファ－サルコグリカンのレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加する。アルファ－サルコグリカンのレベルは、ｒＡＡＶ投与の前および後の筋生検における免疫組織化学またはウエスタンブロットによってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。
【0059】
別の実施形態は、細胞においてベータ－サルコグリカン遺伝子を発現する方法であって、配列番号３または配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるか、または配列番号３または配列番号１９のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0060】
細胞においてベータ－サルコグリカン遺伝子を発現するための組成物であって、組成物が、配列番号３または配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるか、または配列番号３または配列番号１９のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列を含む、組成物も提供される。
【0061】
本開示はまた、細胞においてベータ－サルコグリカン遺伝子を発現するための医薬の調製のためのｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列の使用であって、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列が、配列番号３または配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるか、または配列番号３または配列番号１９のヌクレオチド配列を含む、使用も提供する。
【0062】
細胞においてベータ－サルコグリカン遺伝子を発現するための提供される方法、使用または組成物のうちのいずれかにおいて、細胞におけるベータ－サルコグリカン遺伝子の発現は、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物の投与の前および後の筋生検におけるウエスタンブロットまたは免疫組織化学でベータ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。例えば、細胞は、１より多いＡＡＶウイルスコピー数を有する。加えて、ベータ－サルコグリカン遺伝子は、核あたり１より多いｒＡＡＶベクターゲノムコピーを検出することによって、対象において測定される。
【0063】
血清ＣＫレベルの減少を必要とする対象においてそれを行うための組成物であって、組成物が、配列番号３または配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるか、または配列番号３または配列番号１９のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列を含む、組成物も提供される。
【0064】
本開示はまた、血清ＣＫレベルの減少を必要とする対象においてそれを行うための医薬の調製のためのｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列の使用であって、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列が、配列番号３または配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるか、または配列番号３または配列番号１９のヌクレオチド配列を含む、使用も提供する。
【0065】
これらの方法、使用および組成物のうちのいずれかにおいて、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日に少なくとも８２％減少する。
【0066】
対象の筋肉組織においてベータ－サルコグリカン陽性線維を増加させる方法であって、配列番号３または配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるか、または配列番号３または配列番号１９のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列を対象に投与することを含む、方法が提供される。
【0067】
対象の筋肉組織においてベータ－サルコグリカン陽性線維を増加させるための組成物であって、組成物が、配列番号３または配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるか、または配列番号３または配列番号１９のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列を含む、組成物も提供される。
【0068】
本開示はまた、対象の筋肉組織においてベータ－サルコグリカン陽性線維を増加させるための医薬の調製のためのｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列の使用であって、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列が、配列番号３または配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるか、または配列番号３または配列番号１９のヌクレオチド配列を含む、使用も提供する。
【0069】
これらの方法、使用および組成物のうちのいずれかにおいて、ベータ－サルコグリカン陽性線維の数は、ｒＡＡＶ投与の前および後の筋生検におけるウエスタンブロットまたは免疫組織化学でベータ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。加えて、方法、使用および組成物のうちのいずれかにおいて、ベータ－サルコグリカン陽性繊維の数は、核あたり１より多いｒＡＡＶベクターゲノムコピーを検出することによって測定される。
【0070】
別の実施形態は、アルファ－サルコグリカンの発現の増加を必要とする対象においてそれを行う方法であって、配列番号３または配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むか、または配列番号３または配列番号１９のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0071】
アルファ－サルコグリカンの発現の増加を必要とする対象においてそれを行うための組成物であって、組成物が、配列番号３または配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるか、または配列番号３または配列番号１９のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列を含む、組成物も提供される。
【0072】
本開示はまた、対象においてアルファ－サルコグリカンの発現を増加させるための医薬の調製のためのｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列の使用であって、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列が、配列番号３または配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるか、または配列番号３または配列番号１９のヌクレオチド配列を含む、使用も提供する。
【0073】
アルファ－サルコグリカンの細胞膜への局在化の増加を必要とする対象においてそれを行う方法であって、配列番号３または配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるか、または配列番号３または配列番号１９のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列を対象に投与することを含む、方法も提供される。
【0074】
アルファ－サルコグリカンの細胞膜への局在化の増加を必要とする対象においてそれを行うための組成物であって、組成物が、配列番号３または配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるか、または配列番号３または配列番号１９のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列を含む、組成物も提供される。
【0075】
本開示はまた、アルファ－サルコグリカンの細胞膜への局在化の増加を必要とする対象においてそれを行うための医薬の調製のためのｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列の使用であって、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列が、配列番号３または配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるか、または配列番号３または配列番号１９のヌクレオチド配列を含む、使用も提供する。
【0076】
これらの方法、使用および組成物のうちのいずれかにおいて、アルファ－サルコグリカンのレベルは、ｒＡＡＶ投与の前および後の筋生検におけるウエスタンブロットまたは免疫組織化学でアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。加えて、提供される方法、使用および組成物のいずれかにおいて、アルファ－サルコグリカンは、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢによってコードされるベータ－サルコグリカンを発現する細胞の膜に共局在化する。
【0077】
別の実施形態は、サルコグリカン発現の増加を必要とする対象の筋肉組織においてそれを行う方法であって、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むか、または配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号１９のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0078】
サルコグリカン発現の増加を必要とする対象の筋肉組織においてそれを行うための組成物であって、組成物が、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるか、または配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号１９のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列を含む、組成物も提供される。
【0079】
本開示はまた、サルコグリカン発現の増加を必要とする対象の筋肉組織においてそれを行うための医薬の調製のためのｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列の使用であって、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるか、または配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号１９のヌクレオチド配列を含む、使用も提供する。
【0080】
筋肉組織においてサルコグリカン発現を増加させるためのこれらの方法、使用および組成物のうちのいずれかにおいて、対象は、サルコグリカンまたは筋ジストロフィーをコードする遺伝子中の遺伝子変異を有している。例えば、これらの方法、使用または組成物のうちのいずれかにおいて、サルコグリカンは、β－サルコグリカン（ＳＧＣＢ）、α－サルコグリカン（ＳＧＣＡ）、γ－サルコグリカン（ＳＧＣＧ）、またはδ－サルコグリカン（ＳＧＣＤ）である。
【0081】
組換えＡＡＶベクター粒子を産生する方法であって、本明細書に記載のプラスミドでトランスフェクトされる細胞を培養することと、トランスフェクトされた細胞の上清から組換えＡＡＶ粒子を回収することと、を含む、方法も提供される。本明細書に記載の組換えＡＡＶベクターのいずれかを含むウイルス粒子もまた企図される。一実施形態では、ＡＡＶベクタープラスミドを宿主細胞に移すことを含む、ｒＡＡＶを生成する方法。別の実施形態では、プラスミドは、配列番号２４と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。別の態様では、本開示は、配列番号２４のヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクタープラスミドを含む細胞を提供する。本明細書に記載の細胞は、昆虫細胞、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞（例えば、Ｓ２細胞またはＫｃ細胞）、カイコ細胞（例えば、Ｂｍｅ２１細胞）、または蚊細胞（例えば、Ｃ６／３６細胞）、または哺乳動物細胞（好ましくはヒト細胞、例えば、ヒト初代細胞または確立された細胞株）を含む。一実施形態では、哺乳動物細胞は、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＫＢ細胞を含む。
【0082】
別の実施形態では、プラスミドは、配列番号１、３、５、または１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクタープラスミドは、配列番号１、３、５、または１９のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクタープラスミドは、宿主細胞において安定して発現される。ＡＡＶベクタープラスミドを安定して保有する宿主細胞を使用して、ｒＡＡＶを生成することができる。一実施形態では、ＡＡＶベクタープラスミドは、ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ．ＫＡＮプラスミドである。
【0083】
本明細書で提供される組換えＡＡＶベクター粒子を産生する方法は、パッケージングプラスミドおよび／またはヘルパーウイルスを宿主細胞に移入するステップをさらに含み得る。例えば、この方法は、パッケージング細胞が、安定に組み込まれたＡＡＶｃａｐ遺伝子を含むステップ、および／またはパッケージング細胞が、安定に組み込まれたＡＡＶｒｅｐ遺伝子を含むステップをさらに含む。本発明はまた、細胞であって、配列番号２４と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むプラスミド、または配列番号２４のヌクレオチド配列を含むプラスミドを含む、細胞を提供する。配列番号１、３、５、または１９のヌクレオチド配列を含む細胞も提供される。
【0084】
それを必要とする哺乳動物の対象における線維症を軽減する方法も提供される。この点について、本方法は、治療有効量の本明細書に記載のＡＡＶベクター（または本明細書に記載のＡＡＶベクターを含む組成物）を、哺乳動物の対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、哺乳動物の対象は、筋ジストロフィーに罹患している。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶベクター（または本明細書に記載のＡＡＶベクターを含む組成物）の投与は、対象の骨格筋または心筋における線維症を軽減する。
【0085】
本明細書で使用される「筋ジストロフィー」という用語は、強度および筋肉量が徐々に低下する障害を指す。筋ジストロフィー疾患の非限定的な例としては、ベッカー型筋ジストロフィー、脛骨筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、エメリー－ドレイフス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、サルコグリカン異常症、部分的ＬＡＭＡ２欠損による先天性筋ジストロフィーのような先天性筋ジストロフィー、メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー、１Ｄ型先天性筋ジストロフィー、福山型先天性筋ジストロフィー、肢帯型１Ａ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ａ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｂ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｃ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｄ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｅ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｆ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｇ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｈ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｉ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｉ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｊ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｋ型筋ジストロフィー、肢帯型ＩＣ型筋ジストロフィー、単純型表皮水疱症を伴う強直性脊椎型筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、ウルリッヒ型先天性筋ジストロフィー、およびウルリッヒ型スクレロアトニック筋ジストロフィーを挙げることができる。いくつかの実施形態では、対象は、肢帯型筋ジストロフィーに罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｅ型（ＬＧＭＤ２Ｅ）に罹患している。
【0086】
本明細書で使用される「線維症」という用語は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の過剰または未制御の沈着ならびに骨格筋、心筋、肝臓、肺、腎臓、および膵臓を含む損傷後の組織における異常な修復プロセスを指す。沈着するＥＣＭ成分には、コラーゲン（例えばコラーゲン１、コラーゲン２、またはコラーゲン３）およびフィブロネクチンが含まれる。
【0087】
別の態様では、治療有効量の本明細書に記載のＡＡＶベクター（または本明細書に記載のＡＡＶベクターを含む組成物）を哺乳動物の対象に投与することを含む、哺乳動物の対象における筋力および／または筋肉量を増加する方法が本明細書に記載される。一実施形態では、対象はヒトである。
【0088】
本発明の方法のいずれかにおいて、対象は、肢帯型筋ジストロフィーまたは任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーのような筋ジストロフィーに罹患している可能性がある。
【0089】
治療有効量の本明細書に記載のＡＡＶベクター（または本明細書に記載のＡＡＶベクターを含む組成物）を哺乳動物の対象に投与することを含む、哺乳動物の対象における筋ジストロフィーを治療する方法も提供される。いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーは、肢帯型筋ジストロフィーである。
【0090】
本発明の方法のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶは、筋肉内注射または静脈内注射により投与される。加えて、本発明の方法のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶは、注射、注入、または移植による非経口投与など、全身投与される。
【0091】
本発明の組成物は、筋肉内注射または静脈内注射用に製剤化される。加えて、本発明の組成物は、注射、注入、または移植による非経口投与など、全身投与用に製剤化される。
【0092】
加えて、組成物のうちのいずれかは、筋ジストロフィー（例えば、肢帯型筋ジストロフィーまたは任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィー）に罹患している対象への投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号９または配列番号８に記載のポリヌクレオチド配列を含む第２の組換えＡＡＶベクターをさらに含み得る。
【0093】
本発明の使用のうちのいずれかにおいて、医薬は、筋肉内注射または静脈内注射用に製剤化される。加えて、本発明の使用のうちのいずれかにおいて、医薬は、注射、注入、または移植による非経口投与など、全身投与用に製剤化される。加えて、医薬のいずれかは、筋ジストロフィー（例えば、肢帯型筋ジストロフィーまたは任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィー）に罹患している対象への投与のために調製され得る。いくつかの実施形態では、医薬は、配列番号９または配列番号８に記載のポリヌクレオチド配列を含む第２の組換えＡＡＶベクターをさらに含み得る。
【0094】
本発明はまた、ＡＡＶｒｈ７４由来のカプシドと、緩衝剤と、イオン強度剤と、界面活性剤と、を含むｒＡＡＶビリオンを含む、製剤または組成物を提供する。提供される製剤または組成物では、ｒＡＡＶは、約１．０×１０１２ｖｇ／ｍｌ～約５．０ｘ１０１４ｖｇ／ｍｌの濃度、または約５．０ｘ１０１２ｖｇ／ｍｌ～約１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｍｌの濃度である。加えて、ｒＡＡＶは、約２．０ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ、４ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ、または５ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌの濃度である。提供される製剤または組成物では、ｒＡＡＶは、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢウイルス粒子またはｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢベクターであってもよい。例えば、提供される製剤または組成物のいずれかでは、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢは、配列番号１９のヌクレオチド配列を含む。
【0095】
提供される製剤または組成物では、緩衝剤は、トリス、トリシン、ビス－トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＴＡＰＳ、ＰＩＰＥＳ、およびＣＡＰＳのうちの１つ以上を含む。例えば、緩衝剤は、約５ｍＭ～約４０ｍＭの濃度でｐＨ８．０のトリスを含むか、または緩衝剤は、約２０ｍＭでｐＨ８．０のトリスを含む。
【0096】
提供される製剤または組成物のうちのいずれかにおいて、イオン強度剤は、塩化カリウム（ＫＣｌ）、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、酢酸マンガン、硫酸マンガン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、酢酸ナトリウム、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、および酢酸リチウムのうちの１つ以上を含む。例えば、イオン強度剤は、約０．２ｍＭ～約４ｍＭの濃度でＭｇＣｌ２を含むか、またはイオン強度剤は、約５０ｍＭ～約５００ｍＭの濃度でＮａＣｌを含むか、またはイオン強度剤は、約０．２ｍＭ～約４ｍＭの濃度でＭｇＣｌ２を含み、約５０ｍＭ～約５００ｍＭの濃度でＮａＣｌを含むか、またはイオン強度剤は、約１ｍＭの濃度でＭｇＣｌ２を含み、約２００ｍＭの濃度でＮａＣｌを含む。
【0097】
提供される製剤または組成物のうちのいずれかにおいて、界面活性剤は、スルホネート、サルフェート、ホスホネート、ホスフェート、ポロキサマー、およびカチオン性界面活性剤のうちの１つ以上を含む。例えば、ポロキサマーは、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８４、ポロキサマー１８８、ポロキサマー２３７、ポロキサマー３３１、ポロキサマー３３８、およびポロキサマー４０７のうちの１つ以上を含む。ポロキサマーは、約０．００００１％～約１％の濃度であってもよい。例示的な界面活性剤は、約０．００１％の濃度のポロキサマー１８８である。
【0098】
前述の段落は、本発明の全ての態様を定義することを意図するものではなく、追加の態様は、詳細な説明のような他のセクションに記載される。文書全体は、統一された開示として関連することが意図されており、特徴の組み合わせがこの文書と同じ文章、または段落、またはセクションで一緒に見られない場合でも、本明細書に記載される特徴のすべての組み合わせが考慮されることを理解されたい。本発明は、追加の態様として、上記の特定の段落で定義される変形よりもいくらか範囲が狭い本発明のすべての実施形態を含む。例えば、本発明の特定の態様が属として記載される場合、属の各メンバーが個々に本発明の態様であると理解されるべきである。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを治療する方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを前記対象に投与するステップを含み、
前記ｒＡＡＶが、全身投与経路を使用して、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づいて、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与され、前記対象における血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルが、前記ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、前記ｒＡＡＶの投与後に減少する、方法。
（項目２）
筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを治療する方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを投与するステップを含み、
前記対象の細胞におけるベータ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルが、前記ｒＡＡＶの投与前の前記ベータ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、前記ｒＡＡＶの投与後に増加し、
前記対象の筋肉組織におけるベータ－サルコグリカン陽性線維の数が、前記ｒＡＡＶの投与前の前記ベータ－サルコグリカン陽性線維の数と比較して、前記ｒＡＡＶの投与後に増加するか、または
運動機能が、前記ｒＡＡＶの投与前の前記対象の前記運動機能と比較して、前記対象において改善されており、前記運動機能が、１００メートルの時間歩行試験によって決定される、方法。
（項目３）
前記運動機能が、遺伝子移入後１ヶ月または３０日で少なくとも５％、遺伝子移入後２ヶ月または６０日で少なくとも１０％、または遺伝子移入後３ヶ月または９０日で少なくとも１５％改善する、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記運動機能が、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、または５０％改善される、項目２または３に記載の方法。
（項目５）
前記ｒＡＡＶが、静脈内経路を使用して投与される、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記ｒＡＡＶが、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づいて、約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇもしくは約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇで投与されるか、または定量標準としての線状化プラスミドに基づいて、約１．８５×１０１３ｖｇ／ｋｇもしくは７．４１×１０１３ｖｇ／ｋｇで投与される、項目１～５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記ｒＡＡＶが、約１０ｍＬ／ｋｇの濃度で投与される、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記ｒＡＡＶが、注射、注入または移植によって投与される、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記ｒＡＡＶが、約１～２時間にわたって注入によって投与される、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記ｒＡＡＶが、末梢四肢静脈を介する静脈内経路によって投与される、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記ｒＡＡＶが、配列番号１のヒトβ－サルコグリカンヌクレオチド配列を含む、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記ｒＡＡＶが、配列番号４のＭＨＣＫ７プロモーター配列を含む、項目１～１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記ｒＡＡＶが、血清型ＡＡＶｒｈ．７４のｒＡＡＶである、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記ｒＡＡＶが、配列番号３または配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、項目１～１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記ｒＡＡＶが、配列番号２０のイントロン配列を含む、項目１～１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記ｒＡＡＶが、配列番号２１のポリＡ配列を含む、項目１～１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記ｒＡＡＶが、配列番号２２の５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む、項目１～１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記ｒＡＡＶが、配列番号２３の３’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む、項目１～１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記筋ジストロフィーが、肢帯型筋ジストロフィーである、項目１～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記筋ジストロフィーが、肢帯型筋ジストロフィー２Ｅ型である、項目１～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
肢帯型筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを治療する方法であって、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づいて、約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇもしくは約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または定量標準としての線状化プラスミドに基づいて、約１．８５×１０１３ｖｇ／ｋｇもしくは７．４１×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で、およそ１～２時間かけてｒＡＡＶ静脈内注入を前記対象に投与することを含み、前記ｒＡＡＶが、配列番号３または配列番号１９のヌクレオチド配列を含む含む、方法。
（項目２２）
対象の細胞においてベータ－サルコグリカン遺伝子を発現する方法であって、配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物を前記対象に投与することを含む、方法。
（項目２３）
対象の筋肉組織においてベータ－サルコグリカン陽性線維を増加させ、および／またはＣＫレベルを減少させる方法であって、配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列を前記対象に投与することを含む、方法。
（項目２４）
前記ベータ－サルコグリカン遺伝子の発現または陽性ベータ－サルコグリカン陽性線維の数が、前記ｒＡＡＶ投与の前および後の筋生検におけるウエスタンブロットでベータ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、項目２２または２３に記載の方法。
（項目２５）
前記ベータ－サルコグリカンタンパク質の発現が、ｒＡＡＶ投与後に少なくとも３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０％増加する、項目２２に記載の方法。
（項目２６）
ベータ－サルコグリカン遺伝子の発現またはベータ－サルコグリカン陽性筋肉線維の数が、前記ｒＡＡＶ投与の前および後の筋生検における免疫組織化学によって前記ベータ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、項目２２～２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記ベータ－サルコグリカンタンパク質の発現が、ｒＡＡＶ投与後に少なくとも３９％増加する、項目２２に記載の方法。
（項目２８）
前記対象の前記筋肉組織におけるベータ－サルコグリカン陽性線維の数が、前記ｒＡＡＶの投与前の前記ベータ－サルコグリカン陽性線維の数と比較して、前記ｒＡＡＶの投与後少なくとも４０、４１、または４２％増加する、項目２３に記載の方法。
（項目２９）
前記細胞が、１より多いＡＡＶウイルスコピー数を有する、項目２２に記載の方法。
（項目３０）
前記対象における前記血清ＣＫレベルが、前記ｒＡＡＶのこの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、前記ｒＡＡＶの投与後に減少する、項目２２～２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記対象における前記血清ＣＫレベルが、前記ｒＡＡＶの投与前の前記血清ＣＫレベルと比較して、前記ｒＡＡＶの投与後６０日～９０日、６０日、または９０日に少なくとも８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、または９０％減少する、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記対象におけるアルファ－サルコグリカンのレベルが、前記ｒＡＡＶの投与前の前記アルファ－サルコグリカンのレベルと比較して、前記ｒＡＡＶの投与後に増加する、項目１～３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
アルファ－サルコグリカンの発現の増加を必要とする対象においてそれを行う方法であって、配列番号３または配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を有するｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物を含むｒＡＡＶを前記対象に投与することを含む、方法。
（項目３４）
アルファ－サルコグリカンの細胞膜への局在化の増加を必要とする対象においてそれを行う方法であって、配列番号３または配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列を前記対象に投与することを含む、方法。
（項目３５）
前記アルファ－サルコグリカンが、前記ｒＡＡＶ投与の前および後の筋生検における免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、項目３３または３４に記載の方法。
（項目３６）
前記アルファ－サルコグリカンが、前記ｒＡＡＶ投与の前および後の筋生検におけるウエスタンブロットによってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、項目３３または３４に記載の方法。
（項目３７）
前記アルファ－サルコグリカンが、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢによってコードされるベータ－サルコグリカンを発現する細胞の膜に共局在化する、項目３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
対象の筋肉組織におけるサルコグリカン発現を増加させるか、または筋肉機能を改善する方法であって、配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶを前記対象に投与することを含む、方法。
（項目３９）
前記対象が、サルコグリカンをコードする遺伝子中に遺伝子変異を有するか、または筋ジストロフィーに罹患している、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記サルコグリカンが、β－サルコグリカン（ＳＧＣＢ）、α－サルコグリカン（ＳＧＣＡ）、γ－サルコグリカン（ＳＧＣＧ）、またはδ－サルコグリカン（ＳＧＣＤ）である、項目３８に記載の方法。
（項目４１）
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１９のポリヌクレオチド配列を含む、項目３８に記載の方法。
（項目４２）
対象の筋肉組織におけるサルコグリカン発現を増加させる方法であって、第１のサルコグリカンをコードするヌクレオチド配列を含む構築物を前記対象に投与することと、前記第１のサルコグリカンを発現する細胞の細胞膜において少なくとも第２のサルコグリカンの発現の増加を検出することと、を含む、方法。
（項目４３）
前記第１のサルコグリカンが、β－サルコグリカン（ＳＧＣＢ）であり、前記第２のサルコグリカンが、α－サルコグリカン（ＳＧＣＡ）、γ－サルコグリカン（ＳＧＣＧ）、および／またはδ－サルコグリカン（ＳＧＣＤ）である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記対象が、４～１５歳のヒト対象である、項目１～４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記対象が、小児対象、青年期対象または若年成人対象である、項目１～４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記対象が、４～１５歳のヒト対象であり、両方の対立遺伝子においてベータ－サルコグリカン（ＳＧＣＢ）変異が確認されており、ＡＡＶｒｈ７４抗体に対して陰性であり、および／または１００メートル歩行試験が４０％を超えるか、または正常であった、項目１～４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記対象が、中年成人または高齢対象である、項目１～４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記対象が、２５～５５歳のヒト対象である、項目１～４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記対象が、５０歳を超えるヒト対象である、項目１～４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
組成物であって、
ｒＡＡＶ ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢベクターと、
緩衝剤と、
イオン強度剤と、
界面活性剤と、を含む、組成物。
（項目５１）
前記ｒＡＡＶが、約１．０×１０１２ｖｇ／ｍｌ～約５．０ｘ１０１４ｖｇ／ｍｌ、または約５．０ｘ１０１２ｖｇ／ｍｌ～約１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｍｌの濃度である、項目５０に記載の組成物。
（項目５２）
前記ｒＡＡＶが、約２．０×１０１３ｖｇ／ｍｌ、４×１０１３ｖｇ／ｍｌ、５×１０１３ｖｇ／ｍｌの濃度である、項目５０に記載の組成物。
（項目５３）
前記緩衝剤が、トリス、トリシン、ビス－トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＴＡＰＳ、ＰＩＰＥＳ、およびＣＡＰＳのうちの１つ以上を含む、項目５０に記載の組成物。
（項目５４）
前記緩衝剤が、約５ｍＭ～約４０ｍＭの濃度でｐＨ８．０の前記トリスを含む、項目５３に記載の組成物。
（項目５５）
前記緩衝剤が、約２０ｍＭでｐＨ８．０の前記トリスを含む、項目５３に記載の組成物。
（項目５６）
前記イオン強度剤が、塩化カリウム（ＫＣｌ）、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、酢酸マンガン、硫酸マンガン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、酢酸ナトリウム、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、および酢酸リチウムのうちの１つ以上を含む、項目５０に記載の組成物。
（項目５７）
前記イオン強度剤が、約０．２ｍＭ～約４ｍＭの濃度でＭｇＣｌ２を含む、項目５０に記載の組成物。
（項目５８）
前記イオン強度剤が、約５０ｍＭ～約５００ｍＭの濃度でＮａＣｌを含む、項目５０に記載の組成物。
（項目５９）
前記イオン強度剤が、約０．２ｍＭ～約４ｍＭの濃度でＭｇＣｌ２を含み、約５０ｍＭ～約５００ｍＭの濃度でＮａＣｌを含む、項目５０に記載の組成物。
（項目６０）
前記イオン強度剤が、約１ｍＭの濃度でＭｇＣｌ２を含み、約２００ｍＭの濃度でＮａＣｌを含む、項目５０に記載の組成物。
（項目６１）
前記界面活性剤が、スルホネート、サルフェート、ホスホネート、ホスフェート、ポロキサマー、およびカチオン性界面活性剤のうちの１つ以上を含む、項目５０に記載の組成物。
（項目６２）
前記ポロキサマーが、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８４、ポロキサマー１８８、ポロキサマー２３７、ポロキサマー３３１、ポロキサマー３３８、およびポロキサマー４０７のうちの１つ以上を含む、項目６１に記載の組成物。
（項目６３）
前記界面活性剤が、約０．００００１％～約１％の濃度で前記ポロキサマーを含む、項目６１に記載の組成物。
（項目６４）
前記界面活性剤が、約０．００１％の濃度でポロキサマー１８８を含む、項目６１に記載の組成物。
（項目６５）
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを含み、前記ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢが、配列番号１９と少なくとも９５％または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、医薬組成物。
（項目６６）
前記ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢが、配列番号１９のヌクレオチド配列を含む、項目６５に記載の医薬組成物。
（項目６７）
組換えＡＡＶ ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを生成する方法であって、プラスミドを細胞に移入することを含み、前記プラスミドが、配列番号２４と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、方法。
（項目６８）
前記プラスミドが、配列番号２４のヌクレオチド配列を含む、項目８３に記載の方法。
（項目６９）
前記プラスミドが、配列番号１、３、または１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、項目６７に記載の方法。
（項目７０）
前記プラスミドが、配列番号１９のヌクレオチド配列を含む、項目６７～６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目７１）
パッケージングプラスミドおよび／またはヘルパーウイルスを前記細胞に移入することをさらに含む、項目６７～７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７２）
前記細胞が、安定に組み込まれたＡＡＶｃａｐ遺伝子を含む、項目６７～７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７３）
前記細胞が、安定に組み込まれたＡＡＶｒｅｐ遺伝子を含む、項目６７～７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
細胞であって、配列番号２４と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むプラスミドを含む、細胞。
（項目７５）
前記プラスミドが、配列番号２４のヌクレオチド配列を含む、項目７４に記載の細胞。
（項目７６）
配列番号１９のヌクレオチド配列を含む、項目７４または７５に記載の細胞。
（項目７７）
前記細胞が、昆虫細胞、蚊細胞、または哺乳動物細胞である、項目７４～７６のいずれか一項に記載の細胞。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを治療する方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを前記対象に投与するステップを含み、
前記ｒＡＡＶが、全身投与経路を使用して、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づいて、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与され、前記対象における血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルが、前記ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、前記ｒＡＡＶの投与後に減少する、方法。
（項目２）
筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを治療する方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを投与するステップを含み、
前記対象の細胞におけるベータ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルが、前記ｒＡＡＶの投与前の前記ベータ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、前記ｒＡＡＶの投与後に増加し、
前記対象の筋肉組織におけるベータ－サルコグリカン陽性線維の数が、前記ｒＡＡＶの投与前の前記ベータ－サルコグリカン陽性線維の数と比較して、前記ｒＡＡＶの投与後に増加するか、または
運動機能が、前記ｒＡＡＶの投与前の前記対象の前記運動機能と比較して、前記対象において改善されており、前記運動機能が、１００メートルの時間歩行試験によって決定される、方法。
（項目３）
前記運動機能が、遺伝子移入後１ヶ月または３０日で少なくとも５％、遺伝子移入後２ヶ月または６０日で少なくとも１０％、または遺伝子移入後３ヶ月または９０日で少なくとも１５％改善する、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記運動機能が、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、または５０％改善される、項目２または３に記載の方法。
（項目５）
前記ｒＡＡＶが、静脈内経路を使用して投与される、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記ｒＡＡＶが、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づいて、約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇもしくは約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇで投与されるか、または定量標準としての線状化プラスミドに基づいて、約１．８５×１０１３ｖｇ／ｋｇもしくは７．４１×１０１３ｖｇ／ｋｇで投与される、項目１～５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記ｒＡＡＶが、約１０ｍＬ／ｋｇの濃度で投与される、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記ｒＡＡＶが、注射、注入または移植によって投与される、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記ｒＡＡＶが、約１～２時間にわたって注入によって投与される、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記ｒＡＡＶが、末梢四肢静脈を介する静脈内経路によって投与される、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記ｒＡＡＶが、配列番号１のヒトβ－サルコグリカンヌクレオチド配列を含む、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記ｒＡＡＶが、配列番号４のＭＨＣＫ７プロモーター配列を含む、項目１～１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記ｒＡＡＶが、血清型ＡＡＶｒｈ．７４のｒＡＡＶである、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記ｒＡＡＶが、配列番号３または配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、項目１～１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記ｒＡＡＶが、配列番号２０のイントロン配列を含む、項目１～１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記ｒＡＡＶが、配列番号２１のポリＡ配列を含む、項目１～１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記ｒＡＡＶが、配列番号２２の５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む、項目１～１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記ｒＡＡＶが、配列番号２３の３’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む、項目１～１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記筋ジストロフィーが、肢帯型筋ジストロフィーである、項目１～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記筋ジストロフィーが、肢帯型筋ジストロフィー２Ｅ型である、項目１～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
肢帯型筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを治療する方法であって、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づいて、約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇもしくは約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または定量標準としての線状化プラスミドに基づいて、約１．８５×１０１３ｖｇ／ｋｇもしくは７．４１×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で、およそ１～２時間かけてｒＡＡＶ静脈内注入を前記対象に投与することを含み、前記ｒＡＡＶが、配列番号３または配列番号１９のヌクレオチド配列を含む含む、方法。
（項目２２）
対象の細胞においてベータ－サルコグリカン遺伝子を発現する方法であって、配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物を前記対象に投与することを含む、方法。
（項目２３）
対象の筋肉組織においてベータ－サルコグリカン陽性線維を増加させ、および／またはＣＫレベルを減少させる方法であって、配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列を前記対象に投与することを含む、方法。
（項目２４）
前記ベータ－サルコグリカン遺伝子の発現または陽性ベータ－サルコグリカン陽性線維の数が、前記ｒＡＡＶ投与の前および後の筋生検におけるウエスタンブロットでベータ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、項目２２または２３に記載の方法。
（項目２５）
前記ベータ－サルコグリカンタンパク質の発現が、ｒＡＡＶ投与後に少なくとも３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０％増加する、項目２２に記載の方法。
（項目２６）
ベータ－サルコグリカン遺伝子の発現またはベータ－サルコグリカン陽性筋肉線維の数が、前記ｒＡＡＶ投与の前および後の筋生検における免疫組織化学によって前記ベータ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、項目２２～２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記ベータ－サルコグリカンタンパク質の発現が、ｒＡＡＶ投与後に少なくとも３９％増加する、項目２２に記載の方法。
（項目２８）
前記対象の前記筋肉組織におけるベータ－サルコグリカン陽性線維の数が、前記ｒＡＡＶの投与前の前記ベータ－サルコグリカン陽性線維の数と比較して、前記ｒＡＡＶの投与後少なくとも４０、４１、または４２％増加する、項目２３に記載の方法。
（項目２９）
前記細胞が、１より多いＡＡＶウイルスコピー数を有する、項目２２に記載の方法。
（項目３０）
前記対象における前記血清ＣＫレベルが、前記ｒＡＡＶのこの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、前記ｒＡＡＶの投与後に減少する、項目２２～２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記対象における前記血清ＣＫレベルが、前記ｒＡＡＶの投与前の前記血清ＣＫレベルと比較して、前記ｒＡＡＶの投与後６０日～９０日、６０日、または９０日に少なくとも８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、または９０％減少する、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記対象におけるアルファ－サルコグリカンのレベルが、前記ｒＡＡＶの投与前の前記アルファ－サルコグリカンのレベルと比較して、前記ｒＡＡＶの投与後に増加する、項目１～３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
アルファ－サルコグリカンの発現の増加を必要とする対象においてそれを行う方法であって、配列番号３または配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を有するｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物を含むｒＡＡＶを前記対象に投与することを含む、方法。
（項目３４）
アルファ－サルコグリカンの細胞膜への局在化の増加を必要とする対象においてそれを行う方法であって、配列番号３または配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列を前記対象に投与することを含む、方法。
（項目３５）
前記アルファ－サルコグリカンが、前記ｒＡＡＶ投与の前および後の筋生検における免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、項目３３または３４に記載の方法。
（項目３６）
前記アルファ－サルコグリカンが、前記ｒＡＡＶ投与の前および後の筋生検におけるウエスタンブロットによってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、項目３３または３４に記載の方法。
（項目３７）
前記アルファ－サルコグリカンが、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢによってコードされるベータ－サルコグリカンを発現する細胞の膜に共局在化する、項目３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
対象の筋肉組織におけるサルコグリカン発現を増加させるか、または筋肉機能を改善する方法であって、配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶを前記対象に投与することを含む、方法。
（項目３９）
前記対象が、サルコグリカンをコードする遺伝子中に遺伝子変異を有するか、または筋ジストロフィーに罹患している、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記サルコグリカンが、β－サルコグリカン（ＳＧＣＢ）、α－サルコグリカン（ＳＧＣＡ）、γ－サルコグリカン（ＳＧＣＧ）、またはδ－サルコグリカン（ＳＧＣＤ）である、項目３８に記載の方法。
（項目４１）
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１９のポリヌクレオチド配列を含む、項目３８に記載の方法。
（項目４２）
対象の筋肉組織におけるサルコグリカン発現を増加させる方法であって、第１のサルコグリカンをコードするヌクレオチド配列を含む構築物を前記対象に投与することと、前記第１のサルコグリカンを発現する細胞の細胞膜において少なくとも第２のサルコグリカンの発現の増加を検出することと、を含む、方法。
（項目４３）
前記第１のサルコグリカンが、β－サルコグリカン（ＳＧＣＢ）であり、前記第２のサルコグリカンが、α－サルコグリカン（ＳＧＣＡ）、γ－サルコグリカン（ＳＧＣＧ）、および／またはδ－サルコグリカン（ＳＧＣＤ）である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記対象が、４～１５歳のヒト対象である、項目１～４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記対象が、小児対象、青年期対象または若年成人対象である、項目１～４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記対象が、４～１５歳のヒト対象であり、両方の対立遺伝子においてベータ－サルコグリカン（ＳＧＣＢ）変異が確認されており、ＡＡＶｒｈ７４抗体に対して陰性であり、および／または１００メートル歩行試験が４０％を超えるか、または正常であった、項目１～４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記対象が、中年成人または高齢対象である、項目１～４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記対象が、２５～５５歳のヒト対象である、項目１～４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記対象が、５０歳を超えるヒト対象である、項目１～４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
組成物であって、
ｒＡＡＶ ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢベクターと、
緩衝剤と、
イオン強度剤と、
界面活性剤と、を含む、組成物。
（項目５１）
前記ｒＡＡＶが、約１．０×１０１２ｖｇ／ｍｌ～約５．０ｘ１０１４ｖｇ／ｍｌ、または約５．０ｘ１０１２ｖｇ／ｍｌ～約１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｍｌの濃度である、項目５０に記載の組成物。
（項目５２）
前記ｒＡＡＶが、約２．０×１０１３ｖｇ／ｍｌ、４×１０１３ｖｇ／ｍｌ、５×１０１３ｖｇ／ｍｌの濃度である、項目５０に記載の組成物。
（項目５３）
前記緩衝剤が、トリス、トリシン、ビス－トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＴＡＰＳ、ＰＩＰＥＳ、およびＣＡＰＳのうちの１つ以上を含む、項目５０に記載の組成物。
（項目５４）
前記緩衝剤が、約５ｍＭ～約４０ｍＭの濃度でｐＨ８．０の前記トリスを含む、項目５３に記載の組成物。
（項目５５）
前記緩衝剤が、約２０ｍＭでｐＨ８．０の前記トリスを含む、項目５３に記載の組成物。
（項目５６）
前記イオン強度剤が、塩化カリウム（ＫＣｌ）、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、酢酸マンガン、硫酸マンガン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、酢酸ナトリウム、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、および酢酸リチウムのうちの１つ以上を含む、項目５０に記載の組成物。
（項目５７）
前記イオン強度剤が、約０．２ｍＭ～約４ｍＭの濃度でＭｇＣｌ２を含む、項目５０に記載の組成物。
（項目５８）
前記イオン強度剤が、約５０ｍＭ～約５００ｍＭの濃度でＮａＣｌを含む、項目５０に記載の組成物。
（項目５９）
前記イオン強度剤が、約０．２ｍＭ～約４ｍＭの濃度でＭｇＣｌ２を含み、約５０ｍＭ～約５００ｍＭの濃度でＮａＣｌを含む、項目５０に記載の組成物。
（項目６０）
前記イオン強度剤が、約１ｍＭの濃度でＭｇＣｌ２を含み、約２００ｍＭの濃度でＮａＣｌを含む、項目５０に記載の組成物。
（項目６１）
前記界面活性剤が、スルホネート、サルフェート、ホスホネート、ホスフェート、ポロキサマー、およびカチオン性界面活性剤のうちの１つ以上を含む、項目５０に記載の組成物。
（項目６２）
前記ポロキサマーが、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８４、ポロキサマー１８８、ポロキサマー２３７、ポロキサマー３３１、ポロキサマー３３８、およびポロキサマー４０７のうちの１つ以上を含む、項目６１に記載の組成物。
（項目６３）
前記界面活性剤が、約０．００００１％～約１％の濃度で前記ポロキサマーを含む、項目６１に記載の組成物。
（項目６４）
前記界面活性剤が、約０．００１％の濃度でポロキサマー１８８を含む、項目６１に記載の組成物。
（項目６５）
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを含み、前記ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢが、配列番号１９と少なくとも９５％または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、医薬組成物。
（項目６６）
前記ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢが、配列番号１９のヌクレオチド配列を含む、項目６５に記載の医薬組成物。
（項目６７）
組換えＡＡＶ ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを生成する方法であって、プラスミドを細胞に移入することを含み、前記プラスミドが、配列番号２４と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、方法。
（項目６８）
前記プラスミドが、配列番号２４のヌクレオチド配列を含む、項目８３に記載の方法。
（項目６９）
前記プラスミドが、配列番号１、３、または１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、項目６７に記載の方法。
（項目７０）
前記プラスミドが、配列番号１９のヌクレオチド配列を含む、項目６７～６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目７１）
パッケージングプラスミドおよび／またはヘルパーウイルスを前記細胞に移入することをさらに含む、項目６７～７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７２）
前記細胞が、安定に組み込まれたＡＡＶｃａｐ遺伝子を含む、項目６７～７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７３）
前記細胞が、安定に組み込まれたＡＡＶｒｅｐ遺伝子を含む、項目６７～７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
細胞であって、配列番号２４と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むプラスミドを含む、細胞。
（項目７５）
前記プラスミドが、配列番号２４のヌクレオチド配列を含む、項目７４に記載の細胞。
（項目７６）
配列番号１９のヌクレオチド配列を含む、項目７４または７５に記載の細胞。
（項目７７）
前記細胞が、昆虫細胞、蚊細胞、または哺乳動物細胞である、項目７４～７６のいずれか一項に記載の細胞。
【図面の簡単な説明】
【0099】
【図1】治療用β－サルコグリカン導入遺伝子カセットの概略図を提供する。コドン最適化ヒトβ－サルコグリカン遺伝子（ｈＳＧＣＢ）を含む自己相補的ＡＡＶベクター。筋特異的ＭＨＣＫ７プロモーターが発現を駆動する。カセットはまた、安定性のためにプロセシングおよびポリアデニル化シグナルを増強するキメライントロンを含む。
【図2A】骨格筋におけるヒトβ－サルコグリカン発現を示す。Ａ）３ｅ１２ｖｇ全用量のｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを静脈内注射したＳＧＣＢ－／－マウス由来の骨格筋、横隔膜、および心臓の免疫蛍光イメージング。すべての筋肉が９８％以上の形質導入を示す、代表的な画像。２０倍画像を示す。Ｂ）臨床用量（７１６番）および高用量（７８５、７８６番）で治療された筋肉におけるｈＳＧＣＢ導入遺伝子（４３ｋＤＡ）の発現を示すウエスタンブロッティング。治療群についてＮ＝６、１００ｋＤａは、α－アクチニンローディング対照に対応する。
【図2B】同上。
【図3-1】高用量ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢによる全身治療が筋肉病変に及ぼす効果を示す。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴ、ＳＧＣＢ－／－、およびｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ治療されたマウス由来の大腿四頭筋および横隔膜筋のＨ＆Ｅ染色、（Ｂ）中心核を有する線維における減少の定量化、（Ｃ）線維分布の正常化、および（Ｄ）平均線維サイズの増加。各群についてＮ＝６、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【図3-2】同上。
【図3-3】同上。
【図4】ＳＧＣＢ－／－マウスの横隔膜における力欠損の矯正を示す。２４週間の治療後、横隔膜筋片をマウスから採取して、刺激後の力の生成を測定した。治療により、力がＷＴレベルまで回復し、以前に研究された用量（１ｅ１２ｖｇ総用量）と比較して、より大きな回復を提供した（ＷＴ：ｎ＝５；ＫＯ：ｎ＝４；低用量：ｎ＝６；高用量：ｎ＝６）。＊＊＝ｐ＜０．０１。
【図5】ｘ平面およびｙ平面における全体的な歩行が、ＫＯマウスにおいて有意に減少し、ＭＨＣＫ７治療マウスにおいてわずかに改善したことを示す。後肢での垂直活動立ち上がりは、ＭＣＨＫ７治療マウス（ｎ＝６）においてわずかに改善した。
【図6】２種類の高用量（２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ）ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを全身注射したＳＧＣＢ－／－マウス由来の筋肉および臓器に対する生体内分布ウエスタンを提供する。４３ｋＤａは、β－サルコグリカンタンパク質に対応する。１２５ｋＤａは、ビンクリンローディング対照に対応する。
【図7】免疫組織化学によって検出され、定量化される場合の、５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇのｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの全身投与後のヒト対象の筋生検におけるβ－サルコグリカンタンパク質発現を提供する。
【図8】ウエスタンブロットによって検出され、定量化される場合の、５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇのｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの全身投与後９０日目のヒト対象の筋生検におけるβ－サルコグリカンタンパク質発現を提供する。
【図9】免疫組織化学によるアルファ－サルコグリカンの検出および定量化によって示される場合に、β－サルコグリカンタンパク質発現がサルコグリカン複合体の発現を上方制御したことを示す。
【図10】試験中の患者３番の膜でのβ－サルコグリカン、α－サルコグリカンの発現の回復、ならびにβ－サルコグリカンおよびα－サルコグリカンの療法の共局在化を示す。
【図11】ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢによる遺伝子移入後の最初の３ヶ月間にわたる３例の対象におけるベースラインからの平均変化パーセントおよび１００メートル時間試験の改善を示す。
【図12A】自然な成長経過の対照群（図１２Ａ）および５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇのｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ投与後の試験対象（図１２Ｂ）についての肢帯型筋ジストロフィー（ＮＳＡＤ）のノーススター評価におけるベースラインからの変化を提供する。６例の個々の自然な成長経過の対照患者についてのＮＳＡＤデータを図１２Ｃに示す。
【図12B】同上。
【図12C】同上。
【図13】ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ．ＫＡＮ ＡＡＶベクタープラスミドの概略マップを提供する。
【発明を実施するための形態】
【0100】
本開示は、β－サルコグリカンを発現するポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターの投与が、肢帯型筋ジストロフィー動物モデルにおける筋線維症の軽減または完全な回復をもたらすという発見に基づいている。実施例に示されているように、本明細書に記載のＡＡＶベクターの投与は、変性線維の減少、炎症の軽減、および増大した力発生による伸張性収縮に対する保護による機能回復の改善を含む、ジストロフィー特徴の回復をもたらした。
【0101】
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの一般的な略語である。アデノ随伴ウイルスは、ある特定の機能が同時感染ヘルパーウイルスによって提供される細胞内でのみ成長する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。現在、特性評価されているＡＡＶの血清型は１３個存在する。ＡＡＶの一般的な情報および概説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８、およびＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）で見つけることができる。しかしながら、様々な血清型が遺伝子レベルでさえも構造的および機能的の両方で非常に密接に関連していることがよく知られているため、これらの同じ原理が追加のＡＡＶ血清型に適用可能であることが十分に予想される。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，ｐｐ．１６５－１７４ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．、およびＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１－６１（１９７４）を参照されたい）。例えば、全てのＡＡＶ血清型は、相同ｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を明らかに呈し、これらは全て、ＡＡＶ２で発現されたもの等の３つの関連カプシドタンパク質を有する。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の広範な交差ハイブリダイゼーション、および「末端逆位配列」（ＩＴＲ）に対応する末端における類似の自己アニーリングセグメントの存在を明らかにするヘテロ二本鎖分析によってさらに示唆される。類似の感染性パターンは、各血清型における複製機能が類似の調節制御下にあることも示唆する。
【0102】
本明細書で使用される「ＡＡＶベクター」とは、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している１つ以上の目的とするポリヌクレオチド（または導入遺伝子）を指す。かかるＡＡＶベクターは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物をコードおよび発現するベクターでトランスフェクトされた宿主細胞中に存在する場合に、感染ウイルス粒子に複製およびパッケージングされ得る。
【0103】
「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶベクター粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質およびカプシド形成されたポリヌクレオチドＡＡＶベクターで構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子等の野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは、典型的には、「ＡＡＶベクター粒子」または単に「ＡＡＶベクター」と称される。したがって、かかるベクターがＡＡＶベクター粒子内に含有されるため、ＡＡＶベクター粒子の産生には、必然的にＡＡＶベクターの産生が含まれる。
【0104】
ＡＡＶ
本発明の組換えＡＡＶゲノムは、本発明の核酸分子および核酸分子に隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ｒＡＡＶゲノム内のＡＡＶ ＤＮＡは、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型からであり得、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、およびＡＡＶ ｒｈ．７４が挙げられるが、これらに限定されない。偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示される。他のタイプのｒＡＡＶ変異体、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上記の背景技術の部分に記載されたように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。骨格筋特異的発現を促進するために、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９を使用することができる。
本発明の組換えＡＡＶゲノムは、本発明の核酸分子および核酸分子に隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ｒＡＡＶゲノム内のＡＡＶ ＤＮＡは、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型からであり得、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、およびＡＡＶ ｒｈ．７４が挙げられるが、これらに限定されない。偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示される。他のタイプのｒＡＡＶ変異体、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上記の背景技術の部分に記載されたように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。骨格筋特異的発現を促進するために、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９を使用することができる。
【0105】
本発明のＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムの感染性ウイルス粒子への組込みのために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）の感染に許容される細胞に導入される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される、ｒＡＡＶ粒子を産生する技術は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型であり得、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型からであり得、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、およびＡＡＶ ｒｈ．７４が挙げられるが、これらに限定されない。偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0106】
パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子の産生に必要な全ての成分を安定して発現する細胞株を作成することである。例えば、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離したＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、およびネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）、または直接平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ＆ Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）などの手順により細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。適切な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノムおよび／またはｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためのプラスミドではなく、アデノウイルスまたはバキュロウイルスを使用する。
【0107】
ｒＡＡＶ生産の一般原則は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９、およびＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９）に概説されている。様々なアプローチは、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５および対応する米国特許第５，６５８，７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、および米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。前述の文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、ｒＡＡＶ産生に関する文書の部分を特に強調する。
【0108】
したがって、本発明は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態では、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、およびＰｅｒＣ．６細胞（同種２９３株）などの安定して形質転換された癌細胞であり得る。別の実施形態では、パッケージング細胞は、形質転換された癌細胞ではない細胞、例えば、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、およびＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。
【0109】
本発明の組換えＡＡＶ（すなわち、感染性カプシド化ｒＡＡＶ粒子）は、ｒＡＡＶゲノムを含む。実施形態としては、これらに限定されないが、配列番号３または配列番号１９に記載のポリヌクレオチド配列を含むｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＣＧＢ、ならびに配列番号５に記載のポリヌクレオチド配列を含むｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＢと呼ばれるｒＡＡＶが挙げられる。
【0110】
ｒＡＡＶは、当該技術分野で標準的な方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配によって精製され得る。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）、Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９ ４２７－４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号、およびＷＯ９８／０９６５７に開示される方法を含む。
【0111】
別の実施形態では、本発明は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物を企図する。本明細書に記載の組成物は、薬学的に許容される担体中にｒＡＡＶを含む。本組成物は、希釈剤およびアジュバント等の他の成分も含み得る。許容される担体、希釈剤、およびアジュバントは、レシピエントに非毒性であり、好ましくは、用いられる投薬量および濃度で不活性であり、リン酸、クエン酸、もしくは他の有機酸等の緩衝剤；アスコルビン酸等の抗酸化剤；低分子量ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトールもしくはソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；ならびに／またはＴｗｅｅｎ、プルロニクス、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が含まれる。
【0112】
本発明の方法で投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与方法、処置目標、個体、および標的とされる細胞型に応じて変化し、当該技術分野における標準の方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、ｍｌあたり、約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３、約１×１０１４から、またはそれ以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であってもよい。投薬量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい。ｒＡＡＶの力価は、スーパーコイルプラスミド定量標準または線状化プラスミド定量標準によって決定されてもよい。
【0113】
インビボまたはインビトロで、標的細胞にｒＡＡＶを形質導入する方法が、本発明によって企図される。インビボ方法は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物の有効用量または有効な複数用量を、それを必要とする動物（ヒトを含む）に投与するステップを含む。用量が、障害／疾患の発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量が、障害／疾患の発症後に投与される場合、投与は治療的である。本発明の実施形態では、有効用量は、治療すべき障害／疾患の状態に関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除もしくは軽減）する用量であり、障害／疾患の状態への進行を緩徐化もしくは予防する用量であり、疾患の範囲を縮小する用量であり、疾患の寛解（部分的もしくは完全な）をもたらす用量であり、ならびに／または生存を延長させる用量である。本発明の方法による予防または治療のために企図される疾患の例は、筋ジストロフィー、例えば肢帯型筋ジストロフィーである。したがって、提供されるのは、配列番号３または１９のヌクレオチド配列を含む、ｒＡＡＶ ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢで標的細胞を形質導入する方法である。
【0114】
併用療法も本発明により企図される。本明細書で使用される併用療法は、同時治療または連続治療を含む。本発明の方法と標準的な医学的治療（例えば、ステロイド、コルチコステロイド、および／または限定されないがプレドニゾン、プレドニゾロン、およびデフラザコートのうちの１つ以上を含むグルココルチコイド）との組み合わせは、新規療法との組み合わせと同様に、具体的に企図される。この観点で、この組み合わせは、本発明の方法のｒＡＡＶを対象に投与する前に、ｒＡＡＶを対象に投与すると同時に、またはｒＡＡＶを対象に投与した後に、１つ以上のステロイド、コルチコステロイド、および／または限定されないがプレドニゾン、プレドニゾロン、およびデフラザコートのうちの１つ以上を含むグルココルチコイドを対象に投与することを含む。
【0115】
本発明によって企図される併用療法の関連する実施形態では、グルココルチコイドとしては、限定されないが、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、またはトリアムシノロンが挙げられる。
【0116】
抗原特異的Ｔ細胞応答は、ｒＡＡＶベクターを投与された対象で起こり得ることが認識されている。これは、遺伝子移入後２～４週間で予想される応答である。このような抗原特異的Ｔ細胞応答に対する１つの考えられる結果は、形質導入された細胞のクリアランスおよび導入遺伝子発現の喪失である。ｒＡＡＶベースの治療に対する宿主の免疫応答を弱めるために、治療前、例えば治療手順の２４時間前に、対象は、およそ１ｍｇ／ｋｇ／日の経口による予防的プレゾニゾンまたは同等のグルココルチコイドから始め、最大用量６０ｍｇ／日で投与することができる。必要に応じて、同等のグルココルチコイドをおよそ１ｍｇ／ｋｇ／日の用量で静脈内投与することも可能である。治療は、およそ１ヶ月続く。プレゾニゾンまたは同等のグルココルチコイドの量を漸減させるプロトコルを、個々の対象の遺伝子移入に対する免疫応答に基づいて実施し、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって、またＧＧＴによる肝機能モニタリングによって評価することができる。
【0117】
ｒＡＡＶベクターの治療有効量は、約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３～約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３～約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３～約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１４～約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、６ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、７ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、８ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または９ｅ１４ｖｇ／ｋｇの範囲のｒＡＡＶの用量である。本発明はまた、これらの範囲のｒＡＡＶベクターを含む組成物も含む。
【0118】
例えば、ｒＡＡＶベクターの治療有効量は、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約２ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約７．４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇおよび５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの用量である。ＡＡＶベクターの力価または投薬量は、定量標準としてのプラスミドＤＮＡの物理的形態に基づいて変化する可能性がある。例えば、力価または投薬量の値は、スーパーコイル標準ｑＰＣＲ力価測定法または線状標準ｑＰＣＲ力価測定法に基づいて変化し得る。一実施形態では、治療有効量のｒＡＡＶは、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づいて５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量、または定量標準としての線状化プラスミドに基づいて１．８５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量である。別の実施形態では、治療有効量のｒＡＡＶは、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づいて２ｅ１４ｖｇ／ｋｇの用量、または定量標準としての線状化プラスミドに基づいて７．４１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量である。別の実施形態では、治療有効量のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢは、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づいて約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３～約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３～約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３～約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１４～約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、６ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、７ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、８ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または９ｅ１４ｖｇ／ｋｇの範囲の用量である。本発明はまた、これらの用量のｒＡＡＶベクターを含む組成物も含む。
【0119】
組成物の有効用量の投与は、筋肉内、非経口、静脈内、経口、頬側、鼻、肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、または膣を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で標準的な経路によるものであり得る。本発明のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（具体的には、ＡＡＶ ＩＴＲおよびカプシドタンパク質）の投与経路および血清型は、治療される感染症および／または疾患状態、ならびにβ－サルコグリカンを発現する標的細胞／組織を考慮して、当業者によって選択および／または適合され得る。
【0120】
本発明は、本発明のｒＡＡＶおよび組成物の有効用量の局所投与および全身投与を提供する。例えば、全身投与とは、全身が影響を受けるように循環系に投与することである。全身投与には、胃腸管を通した吸収のような経腸投与および注射、注入、または移植による非経口投与が含まれる。
【0121】
特に、本発明のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することにより達成され得る。本発明による投与としては、筋肉内への注入、血流への注入、および／または肝臓への直接注入が挙げられるが、これらに限定されない。リン酸緩衝生理食塩水中にｒＡＡＶを単に再懸濁させることが、筋組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与され得る担体または他の成分に対する既知の制限はない（が、ＤＮＡを分解する組成物がｒＡＡＶとの通常の方法で避けられるべきである）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉などの目的の特定の標的組織に標的化されるように修飾されてもよい。例えば、本開示が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい。
【0122】
医薬組成物は、注射可能な製剤として、または経皮輸送により筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉内注射と経皮輸送の両方のための多数の製剤がこれまでに開発されており、本発明の実施において使用することができる。ｒＡＡＶは、投与および取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体と共に使用することができる。したがって、別の態様では、本出願は、ＡＡＶｒｈ７４由来のカプシドを含むｒＡＡＶと、緩衝剤と、イオン強度剤と、界面活性剤と、を含む製剤に関する。一実施形態では、ｒＡＡＶは、約１．０ｘ１０１２ｖｇ／ｍｌ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｍｌの濃度である。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づいて、約５．０ｘ１０１２ｖｇ／ｍｌ～約１．０×１０１４ｖｇ／ｍｌの濃度である。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づいて、約２．０×１０１３ｖｇ／ｍｌの濃度である。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢベクターである。一実施形態では、組成物または製剤中のｒＡＡＶの濃度は、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づいて、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ～２×１０１４ｖｇ／ｍｌである。別の実施形態では、濃度は、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づいて、２×１０１３ｖｇ／ｍｌ、４×１０１３ｖｇ／ｍｌ、または５×１０１３ｖｇ／ｍｌである。一実施形態では、緩衝剤は、トリス、トリシン、ビス－トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＴＡＰＳ、ＰＩＰＥＳ、およびＣＡＰＳのうちの１つ以上を含む。別の実施形態では、緩衝剤は、約５ｍＭ～約４０ｍＭの濃度でｐＨ８．０のトリスを含む。一実施形態では、緩衝剤は、約２０ｍＭでｐＨ８．０のトリスを含む。一実施形態では、イオン強度剤は、塩化カリウム（ＫＣｌ）、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、酢酸マンガン、硫酸マンガン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、酢酸ナトリウム、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、および酢酸リチウムのうちの１つ以上を含む。一実施形態では、イオン強度剤は、約０．２ｍＭ～約４ｍＭの濃度でＭｇＣｌ２を含む。別の実施形態では、イオン強度剤は、約５０ｍＭ～約５００ｍＭの濃度でＮａＣｌを含む。別の実施形態では、イオン強度剤は、約０．２ｍＭ～約４ｍＭの濃度でＭｇＣｌ２を含み、約５０ｍＭ～約５００ｍＭの濃度でＮａＣｌを含む。別の実施形態では、イオン強度剤は、約１ｍＭの濃度でＭｇＣｌ２を含み、約２００ｍＭの濃度でＮａＣｌを含む。一実施形態では、界面活性剤は、スルホネート、サルフェート、ホスホネート、ホスフェート、ポロキサマー、およびカチオン性界面活性剤のうちの１つ以上を含む。一実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８４、ポロキサマー１８８、ポロキサマー２３７、ポロキサマー３３１、ポロキサマー３３８、およびポロキサマー４０７のうちの１つ以上を含む。一実施形態では、界面活性剤は、約０．００００１％～約１％の濃度でポロキサマーを含む。別の実施形態では、界面活性剤は、約０．００１％の濃度でポロキサマー１８８を含む。筋肉内注射を目的として、ゴマ油や落花生油などのアジュバント溶液、または水性プロピレングリコール溶液、および滅菌水溶液を使用することができる。そのような水溶液は、必要に応じて緩衝化することができ、液体希釈剤は最初に生理食塩水またはグルコースで等張にされる。遊離酸（ＤＮＡは酸性リン酸基を含む）または薬理学的に許容される塩としてのｒＡＡＶの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水で調製することができる。ｒＡＡＶの分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、ならびに油中で調製することができる。通常の保存状態および使用下においては、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に周知の標準的な技術により容易に入手可能である。
【0123】
注射用途に適した薬学的形態には、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。あらゆる場合において、この形態は、滅菌でなければならず、容易なシリンジ注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性でなければならない。製造および保管の条件下で安定していなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散剤の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長時間の吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。
【0124】
滅菌されている注射可能な溶液は、必要な量のｒＡＡＶを適切な溶媒に、必要に応じて上に列挙した他の様々な成分と共に組み込み、その後濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は滅菌した活性成分を、基礎的な分散媒および上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルへと混合することによって調製される。滅菌されている注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、それは、活性成分プラス予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。
【0125】
ｒＡＡＶによる形質導入は、インビトロで行うこともできる。一実施形態では、所望の標的筋肉細胞を対象から取り出し、ｒＡＡＶで形質導入し、対象に再導入する。代替的に、同系または異種の筋肉細胞は、それらの細胞が対象において不適切な免疫応答を生成しない場合に使用され得る。
【0126】
対象への形質導入および形質導入細胞の再導入のための好適な方法は、当該技術分野で既知である。一実施形態では、細胞は、例えば適切な培地でｒＡＡＶを筋肉細胞と組み合わせ、サザンブロットおよび／またはＰＣＲなどの従来の技術を使用して、または選択可能なマーカーを使用して目的のＤＮＡを持つ細胞をスクリーニングすることにより、インビトロで形質導入することができる。次に、形質導入された細胞を医薬組成物に製剤化し、組成物を、筋肉内、静脈内、皮下、および腹腔内注射による、または例えばカテーテルを使用して平滑筋および心筋への注射によるなど、様々な技術により対象に導入することができる。
【0127】
本発明のｒＡＡＶでの細胞の形質導入は、β－サルコグリカンの持続発現をもたらす。したがって、本発明は、β－サルコグリカンを発現するｒＡＡＶを哺乳動物の対象、好ましくはヒトに投与／送達する方法を提供する。これらの方法は、本発明の１つ以上のｒＡＡＶでの形質導入組織（筋肉等の組織、肝臓および脳等の臓器、ならびに唾液腺等の腺を含むが、これらに限定されない）を含む。形質導入は、組織特異的制御要素を含む遺伝子カセットで行われ得る。例えば、本発明の一実施形態は、これらに限定されないが、アクチンおよびミオシン遺伝子ファミリー、例えばｍｙｏＤ遺伝子ファミリーに由来するもの［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６１－７６６（１９９１）を参照されたい］、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ－２［Ｃｓｅｒｊｅｓｉ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：４８５４－４８６２（１９９１）］、ヒト骨格筋アクチン遺伝子［Ｍｕｓｃａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：４０８９－４０９９（１９８７）］、心筋アクチン遺伝子、筋クレアチンキナーゼ配列要素［Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９：３３９３－３３９９（１９８９）を参照されたい］、およびマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）要素に由来する制御要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子、および遅筋トロポニンＩ遺伝子に由来する制御要素：低酸素誘発性核内因子（Ｓｅｍｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６８０－５６８４（１９９１））、ステロイド誘発性要素、およびグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）を含むプロモーター（Ｍａｄｅｒ ａｎｄ
Ｗｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５６０３－５６０７（１９９３）を参照されたい）、ならびに他の制御要素を含む、筋特異的制御要素によって誘導される筋細胞および筋組織を形質導入する方法を提供する。
Ｗｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５６０３－５６０７（１９９３）を参照されたい）、ならびに他の制御要素を含む、筋特異的制御要素によって誘導される筋細胞および筋組織を形質導入する方法を提供する。
【0128】
筋肉組織は生命維持に必須な臓器ではなく、アクセスしやすいため、インビボＤＮＡ送達の魅力的な標的である。本発明は、形質導入筋原線維由来のｍｉＲＮＡの持続発現を企図する。
【0129】
「筋肉細胞」または「筋肉組織」とは、あらゆる種類の筋肉（例えば、消化管、膀胱、血管、または心臓組織に由来する骨格筋および平滑筋）に由来する細胞または細胞群を意味する。そのような筋肉細胞は、筋芽細胞、筋細胞、筋管、心筋細胞、および心筋芽細胞など、分化または未分化であり得る。
【0130】
「形質導入」という用語は、レシピエント細胞によるβ－サルコグリカンの発現をもたらす、記載の複製欠損ｒＡＡＶを介するインビボまたはインビトロのいずれかでのレシピエント細胞への目的のポリヌクレオチド（例えば、β－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列）の投与／送達を指すために使用される。
【0131】
したがって、本明細書では、有効用量（または本質的に同時に投与される用量もしくはある間隔で与えられる用量）の、β－サルコグリカンをコードするｒＡＡＶを、それを必要とする哺乳動物の対象に投与する方法も記載される。
【0132】
本明細書で言及される全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、本出願が、本明細書中のいかなる定義も含み、優先される。
【0133】
本発明は、以下の実施例においてさらに説明され、これは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【0134】
別の実施形態では、本開示は、ｒＡＡＶ ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＣＧＢを生成する方法であって、ＡＡＶベクタープラスミドを宿主細胞に移入することを含む、方法を提供する。ＤＮＡを宿主細胞に移入する方法は当該技術分野で知られており、これには、トランスフェクション、感染、形質転換、エレクトロポレーション、および形質導入が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、ベクタープラスミドは、配列番号２４と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、ベクタープラスミドは、配列番号２４のヌクレオチド配列を含む。別の態様では、本開示は、配列番号２４のヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクタープラスミドを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクタープラスミドは、宿主細胞において安定して発現される。ＡＡＶベクタープラスミドを安定して保有する宿主細胞を使用して、ｒＡＡＶを生成することができる。一実施形態では、ＡＡＶベクタープラスミドは、ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ．ＫＡＮプラスミドである。ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ．ＫＡＮプラスミドを図１１に示す。
【0135】
一実施形態では、ベクタープラスミドは、配列番号１、３、５、または１９と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ベクタープラスミドは、配列番号１、３、５、または１９のヌクレオチド配列を含む。ｒＡＡＶを生成する方法は、一実施形態では、パッケージングプラスミドおよび／またはヘルパーウイルスを宿主細胞に移入することをさらに含む。パッケージングプラスミドは、いくつかの実施形態では、プロモーターに作動可能に連結されるＡＡＶｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子を含む。一実施形態では、プロモーターは、ＡＡＶ転写プロモーターである。一実施形態では、宿主細胞は、パッケージング細胞である。一実施形態では、パッケージング細胞は、安定に組み込まれたＡＡＶｃａｐ遺伝子を含む。別の実施形態では、パッケージング細胞は、安定に組み込まれたＡＡＶｒｅｐ遺伝子を含む。
【0136】
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、外因性ＤＮＡ配列を発現するために使用され得る細胞を指す。宿主細胞の非限定的な例は、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および／または哺乳動物細胞を含む。宿主細胞は、ＡＡＶヘルパー構築物、パッケージングプラスミド、ＡＡＶベクタープラスミド、アクセサリー機能ベクター、または他のＤＮＡのレシピエントとして使用することができる。ここで使用される用語は、元の宿主細胞で外因性ＤＮＡ配列を発現した後の元の細胞の子孫を包含する。ＡＡＶ産生のための宿主細胞の非限定的な例には、Ｓｆ９昆虫細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞が含まれる。一実施形態では、本明細書に記載の細胞は、昆虫細胞、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞（例えば、Ｓ２細胞またはＫｃ細胞）、カイコ細胞（例えば、Ｂｍｅ２１細胞）、または蚊細胞（例えば、Ｃ６／３６細胞）、または哺乳動物細胞（好ましくはヒト細胞、例えば、ヒト初代細胞または確立された細胞株）を含む。一実施形態では、哺乳動物細胞は、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＫＢ細胞を含む。ＡＡＶベクタープラスミドは、感染（ウイルスまたはバキュロウイルス）、試薬（例えば、リポソーム、リン酸カルシウム）を使用した一時的なトランスフェクション、または物理的手段（例えば、エレクトロポレーション）、または当該技術分野で知られている他の手段によって、宿主細胞（例えば、Ｓｆ９または２９３Ｔ）に導入することができる。別の実施形態では、宿主細胞株は、それらのゲノムにｒＡＡＶプラスミドと共に安定に組み込まれる。このような安定した細胞株は、選択マーカーをベクタープラスミドに組み込むことによって確立することができる。
【0137】
一実施形態では、宿主細胞は、ＡＡＶウイルス粒子を産生するためのパッケージング細胞である。したがって、別の態様では、本開示は、配列番号２４と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクタープラスミドを含む宿主細胞を提供する。一実施形態では、配列番号２４のヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクタープラスミド。別の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１、３、５、または１９のヌクレオチド配列を含む。
【実施例0138】
ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを使用した前臨床試験は、ＷＯ２０１７／１８０９７６に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0139】
実施例１
材料および方法
動物モデル－すべての手順は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ａｔ Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（プロトコルＡＲ１２－０００４０）によって承認された。Ｂ６．１２９－Ｓｇｃｂ ｔｍ１Ｋｃａｍ／１Ｊヘテロ接合マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ、株＃００６８３２）から購入した。Ｓｇｃｂ－／－マウスは、ヘテロ接合マウスを繁殖させることにより作製した。ＫＯマウスを繁殖させ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ａｔ Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ ＨｏｓｐｉｔａｌのＡｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｏｒｅにおいて標準条件下でホモ接合型動物として維持した。マウスを、１２：１２時間の暗所：明所サイクルで、Ｔｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ（３．８ｚ５食物繊維、１８．８％タンパク質、５％脂肪飼料）で維持した。ＳＧＣＢ－／－マウスの同定は、ＰＣＲを用いた遺伝子型判定により行った。すべての動物を、標準的なマウスケージに入れ、自由に摂食摂水させた。
材料および方法
動物モデル－すべての手順は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ａｔ Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（プロトコルＡＲ１２－０００４０）によって承認された。Ｂ６．１２９－Ｓｇｃｂ ｔｍ１Ｋｃａｍ／１Ｊヘテロ接合マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ、株＃００６８３２）から購入した。Ｓｇｃｂ－／－マウスは、ヘテロ接合マウスを繁殖させることにより作製した。ＫＯマウスを繁殖させ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ａｔ Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ ＨｏｓｐｉｔａｌのＡｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｏｒｅにおいて標準条件下でホモ接合型動物として維持した。マウスを、１２：１２時間の暗所：明所サイクルで、Ｔｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ（３．８ｚ５食物繊維、１８．８％タンパク質、５％脂肪飼料）で維持した。ＳＧＣＢ－／－マウスの同定は、ＰＣＲを用いた遺伝子型判定により行った。すべての動物を、標準的なマウスケージに入れ、自由に摂食摂水させた。
【0140】
ベータ－サルコグリカン遺伝子構築。全長ヒトベータ－サルコグリカンｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＭ＿００３４９９４．３）をコドン最適化し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ
Ｉｎｃ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡにより合成した。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによるコドンの最適化は、転写、ｍＲＮＡプロセシングおよび安定性、翻訳、ならびにタンパク質フォールディングを含むパラメータを考慮するアルゴリズムを使用し、筋組織で最大の発現をもたらすｃＤＮＡ配列を設計する（ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ）。
Ｉｎｃ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡにより合成した。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによるコドンの最適化は、転写、ｍＲＮＡプロセシングおよび安定性、翻訳、ならびにタンパク質フォールディングを含むパラメータを考慮するアルゴリズムを使用し、筋組織で最大の発現をもたらすｃＤＮＡ配列を設計する（ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ）。
【0141】
ｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢ構築物について、次いで、ｃＤＮＡを、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含有するプラスミドにクローニングし、カセットは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列（ＣＣＡＣＣ）と、ＳＶ４０キメライントロンと、合成ポリアデニル化部位（５３ｂｐ）とを含んでいた。組換えｔＭＣＫプロモーターは、Ｄｒ Ｘｉａｏ Ｘｉａｏ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ）からの寄贈であった。これは以前に記載されたＣＫ６プロモーター２７の改変であり、転写因子結合部位を含むプロモーター領域のエンハンサー上流における改変を含む。エンハンサーは２つのＥボックス（右および左）で構成される。ｔＭＣＫプロモーター改変は、左のＥボックスを右のＥボックスへ変換（２Ｒ改変）し、６ｂｐを挿入（Ｓ５改変）する変異を含む。ｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢベクターは、ｐＵＣ５７－ＢＳＧ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｉｎｃ．）からの１０４０ｂｐのＫｐｎＩ／ＸｂａＩ断片のｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ．２６のＫｐｎＩ／ＸｂａＩ部位へのライゲーションによって構築した。
【0142】
ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢベクターは、ＮｏｔＩ／ＫｐｎＩ部位を有するｔＭＣＫプロモーターおよびＳＶ４０キメライントロンを除去し、ＭＨＣＫ７プロモーターおよびＮｏｔＩ／ＫｐｎＩ部位を有する同一のＳＶ４０キメライントロンを含むＰＣＲ増幅断片を挿入することにより構築した。ＭＨＣＫ７は、近位プロモーターを有する内因性筋クレアチンキナーゼ遺伝子（ｅｎｈ３５８ＭＣＫ、５８４ｂｐ）内の転写開始部位の約１．２ｋｂの５’から採取した２０６ｂｐエンハンサーを利用するＭＣＫベースのプロモーターである３、１２。ＭＨＣＫ７プロモーター自体は、心筋発現を増強するために、ＣＫ部分の１８８ｂｐのα－ＭｙＨＣ（α－ミオシン重鎖）エンハンサー５’に連結した遺伝子のＭＣＫファミリーからのこの改変ＣＫ７カセットを含む１２。プロモーター（ＣＫ）のクレアチンキナーゼ部分は、ｔＭＣＫとＭＨＣＫ７との間で９６％同一である。最後に、ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢベクターは、ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ５’ＤＶ４４からの９６０ｂｐのＮｏｔＩ／ＫｐｎＩ ＭＨＣＫ７＋イントロン断片を、ｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢのＮｏｔＩ／ＫｐｎＩ部位に連結することによって構築された（Ｐｏｚｇａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２３：５７－６６，２０１６）。
【0143】
ｒＡＡＶ産生。以前にＲｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．５：４５，２００７）によって報告された、改変クロスパッケージングアプローチを使用して、ｒＡＡＶベクターを産生した。ここで、ＨＥＫ２９３細胞におけるＣａＰＯ４沈殿を伴うトリプルトランスフェクション法は、ＡＡＶ２ ＩＴＲを異なるＡＡＶカプシド血清型にパッケージングすることを可能にする。（２８、２９）産生プラスミドは、（ｉ）ｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢまたはｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ、（ｉｉ）ｃａｐ血清型８様単離ｒｈ．７４をコードするｒｅｐ２－ｃａｐｒｈ．７４改変ＡＡＶヘルパープラスミド、ならびに（ｉｉｉ）アデノウイルスＥ２Ａ、Ｅ４ ＯＲＦ６、およびＶＡ Ｉ／ＩＩ ＲＮＡ遺伝子を発現するアデノウイルス５型ヘルパープラスミド（ｐＡｄｈｅｌｐｅｒ）であった。ベクターを精製し、カプシド化ｖｇ力価を、（Ｐｒｉｓｍ ７５００ Ｔａｑｍａｎ検出器システム、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡを使用して）以前に記載されたように決定した。３０ プライマーおよび蛍光プローブは、ｔＭＣＫプロモーターを標的としており、以下の通りであった。ｔＭＣＫ順方向プライマー、５’－ＡＣＣ ＣＧＡ ＧＡＴ ＧＣＣ
ＴＧＧ ＴＴＡ ＴＡＡ ＴＴ－３’（配列番号１０）、ｔＭＣＫ逆方向プライマー、５’－ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＴＧ ＴＡＣ ＡＧＡ ＧＣＣ ＴＡＡ ＧＡＣ－３’（配列番号１１）、およびｔＭＣＫプローブ、５’－ＦＡＭ－ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＣＴ ＧＡＧ
ＣＣＴ ＧＡＧ ＣＧＧ ＴＴＡ Ｃ－ＴＡＭＲＡ－３’（配列番号１２）。プライマーおよび蛍光プローブは、ＭＨＣＫ７プロモーターを標的としており、以下の通りであった。ＭＨＣＫ７順方向プライマー、５’－ＣＣＡ ＡＣＡ ＣＣＴ ＧＣＴ ＧＣＣ ＴＣＴ ＡＡＡ－３’（配列番号１６）、ＭＨＣＫ７逆方向プライマー、５’－ＧＴＣ ＣＣＣ ＣＡＣ ＡＧＣ ＣＴＴ ＧＴＴ Ｃ－３’（配列番号１７）、およびＭＨＣＫ７プローブ、５’－ＦＡＭ－ＴＧＧ ＡＴＣ ＣＣＣ－Ｚｅｎ－ＴＧＣ ＡＴＧ ＣＧＡ ＡＧＡ ＴＣ－３ＩＡＢＫＦＱ－３’（配列番号１８）。
ＴＧＧ ＴＴＡ ＴＡＡ ＴＴ－３’（配列番号１０）、ｔＭＣＫ逆方向プライマー、５’－ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＴＧ ＴＡＣ ＡＧＡ ＧＣＣ ＴＡＡ ＧＡＣ－３’（配列番号１１）、およびｔＭＣＫプローブ、５’－ＦＡＭ－ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＣＴ ＧＡＧ
ＣＣＴ ＧＡＧ ＣＧＧ ＴＴＡ Ｃ－ＴＡＭＲＡ－３’（配列番号１２）。プライマーおよび蛍光プローブは、ＭＨＣＫ７プロモーターを標的としており、以下の通りであった。ＭＨＣＫ７順方向プライマー、５’－ＣＣＡ ＡＣＡ ＣＣＴ ＧＣＴ ＧＣＣ ＴＣＴ ＡＡＡ－３’（配列番号１６）、ＭＨＣＫ７逆方向プライマー、５’－ＧＴＣ ＣＣＣ ＣＡＣ ＡＧＣ ＣＴＴ ＧＴＴ Ｃ－３’（配列番号１７）、およびＭＨＣＫ７プローブ、５’－ＦＡＭ－ＴＧＧ ＡＴＣ ＣＣＣ－Ｚｅｎ－ＴＧＣ ＡＴＧ ＣＧＡ ＡＧＡ ＴＣ－３ＩＡＢＫＦＱ－３’（配列番号１８）。
【0144】
全身遺伝子送達：全身送達は、ｓｇｃｂ－／－マウスの尾静脈へのベクターの注射によって達成した。３０ゲージの超微細インスリン注射器を使用して、生理食塩水で希釈した３×１０１２ｖｇのｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ（２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ）をマウスに注射した。マウスを保持チューブ内に拘束し、尾を尾部スロットに入れ、注射を容易にするために温めて血管を拡張させた。動脈を尾の中心線の下方に配置した後、尾動脈に沿って走る紫／青色の側静脈の１つに注射を行った。被治療マウスはすべて４～５週齢で注射し、注射の６ヶ月後に安楽死させた。
【0145】
免疫蛍光。クリオスタット切片（１２μｍ）を、モノクローナルヒトベータ－サルコグリカン一次抗体（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｅｗ Ｃａｓｔｌｅ，ＵＫ、カタログ番号ＮＣＬ－Ｌ－ｂ－ＳＡＲＣ）で、ブロック緩衝液（１×ＴＢＳ、１０％ヤギ血清、０．１％Ｔｗｅｅｎ）中での１：５０の希釈で、１時間、室温で、湿潤チャンバにおいてインキュベートした。次いで切片をＴＢＳで３回、それぞれ２０分間洗浄し、３０分間再ブロック化した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５９４複合ヤギ抗マウス二次ＩｇＧ１抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ、カタログ番号Ａ２１１２５）を、１：２５０の希釈で４５分間適用した。切片をＴＢＳで２０分間３回洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄマウンティング培地（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）でマウントした。Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ ＭＲＣ５カメラを使用して、筋肉切片の４つの異なる象限をカバーする４つのランダムな２０倍画像を撮影した。ベータ－サルコグリカン染色（４５０％の筋膜染色強度）の陽性線維の割合を各画像について決定し、各筋肉について平均した。
【0146】
ウエスタンブロット分析。組織切片または筋生検を微量遠心分離機に集め、１００μｌの均質化緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、４％ＳＤＳ、４Ｍ尿素）を用い、１つのプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）存在下で均質化した。均質化後、試料を１０，０００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心分離した。タンパク質をＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で定量化した。タンパク質試料（２０μｇ）を、３～８％のポリアクリルアミドＴｒｉｓ－アセテートゲル（ＮｕＰａｇｅ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）上、１５０Ｖで１時間５分電気泳動し、次いで、３５Ｖで１時間１５分かけてＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）に移した。膜を、ＴＢＳＴ中の５％無脂肪乾燥乳中で１時間ブロックし、次いで、ウサギポリクローナルヒトベータ－サルコグリカン抗体（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ，ＵＳＡ、カタログ番号ＮＢＰ－１－９０３００ １：１００または１：２５０希釈）および１：５０００のモノクローナルマウスガンマ－チューブリン抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ、カタログ番号Ｔ６５５７）または１：５０００希釈のマウスモノクローナルマウスα－アクチニン抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ、カタログ番号Ａ７８１１）でインキュベートした。１：５００希釈のウサギポリクローナルマウス心筋トロポニンＩ抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ、カタログ番号ａｂ４７００３）および１：１０００希釈のウサギモノクローナルマウスビンクリン抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ、カタログ番号７００６２）を使用した。抗マウス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ、カタログ番号ＡＰ３０８Ｐ）および抗ウサギ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号６５６１２０）二次－ＨＲＰ抗体をＥＣＬ免疫検出に使用した。
【0147】
生体内分布ｑＰＣＲ分析。Ｔａｑｍａｎ定量ＰＣＲを行って、以前に記載したような標的化筋肉および標的化されていない反対側筋肉内に存在するベクターゲノムコピーの数を定量化した。（１８、３０）ベクター特異的プライマープローブセットを使用して、固有であり、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢ導入遺伝子カセット内に位置するｔＭＣＫプロモーターからすぐ下流にあるイントロン領域の配列を増幅した。以下のプライマーおよびプローブをこの研究に使用した。ｔＭＣＫおよびＭＨＣＫ７イントロン順方向プライマー５’－ＧＴＧ ＡＧＧ ＣＡＣ ＴＧＧ ＧＣＡ ＧＧＴ ＡＡ－３’（配列番号１３）、ｔＭＣＫおよびＭＨＣＫ７イントロン逆方向プライマー５’－ＡＣＣ ＴＧＴ ＧＧＡ ＧＡＧ ＡＡＡ ＧＧＣ ＡＡＡ Ｇ－３’（配列番号１４）、およびｔＭＣＫおよびＭＨＣＫ７イントロンプローブ５’－６ＦＡＭ－ＡＴＣ ＡＡＧ ＧＴＴ ＡＣＡ ＡＧＡ ＣＡＧ－ＧＴＴ ＴＡＡ ＧＧＡ ＧＡＣ ＣＡＡ ＴＡＧ ＡＡＡ －ｔａｍｒａ－３’（ＩＤＴ）（配列番号１５）。コピー数は、ゲノムＤＮＡの１マイクログラム当たりのベクターゲノムとして報告される。免疫細胞染色のための免疫組織化学。免疫組織化学を用いて免疫細胞を同定した。Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ帯電顕微鏡スライド上の凍結組織切片を、抗ラットＩｇ ＨＲＰ検出キット（ＢＤ
Ｐｈａｒｍａｇｅｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ、Ｃａｔ：５５１０１３）：ＣＤ３（Ｃａｔ：５５５２７３）、ＣＤ４（Ｃａｔ：５５０２８０）、ＣＤ８（Ｃａｔ：５５０２８１）、およびマクロファージ用のＭａｃ－３（Ｃａｔ：５５０２９２）を使用して、ラット抗マウスモノクローナル抗体でインキュベートした。すべての一次抗体をリン酸緩衝生理食塩水で１：２０に希釈した。陽性免疫染色を、ストレプトアビジン－ＨＲＰペルオキシダーゼｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣペルオキシダーゼを含むＤＡＢ緩衝液で希釈したＤＡＢクロモゲンを用いて可視化した。１０個のランダム４０倍画像を各筋肉および各対応する染色について撮影した。単核細胞の数を数え、１ｍｍ２当たりの総数として表した。
Ｐｈａｒｍａｇｅｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ、Ｃａｔ：５５１０１３）：ＣＤ３（Ｃａｔ：５５５２７３）、ＣＤ４（Ｃａｔ：５５０２８０）、ＣＤ８（Ｃａｔ：５５０２８１）、およびマクロファージ用のＭａｃ－３（Ｃａｔ：５５０２９２）を使用して、ラット抗マウスモノクローナル抗体でインキュベートした。すべての一次抗体をリン酸緩衝生理食塩水で１：２０に希釈した。陽性免疫染色を、ストレプトアビジン－ＨＲＰペルオキシダーゼｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣペルオキシダーゼを含むＤＡＢ緩衝液で希釈したＤＡＢクロモゲンを用いて可視化した。１０個のランダム４０倍画像を各筋肉および各対応する染色について撮影した。単核細胞の数を数え、１ｍｍ２当たりの総数として表した。
【0148】
免疫蛍光：心臓と共に、前脛骨筋（ＴＡ）、腓腹筋（ＧＡＳ）、大腿四頭筋（ＱＵＡＤ）、大腰筋（ＰＳＯＡＳ）、腰筋（ＧＬＵＴ）、上腕三頭筋（ＴＲＩ）、および横隔膜筋からのクリオスタット切片（１２μｍ）を、Ｐｏｚｇａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．２３：５７－６６，２０１６に記載されるような本願発明者らの以前に使用されたプロトコルによって、ｈＳＧＣＢ導入遺伝子についての免疫蛍光染色を行った。切片を、マウスモノクローナルヒトベータ－サルコグリカン一次抗体（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｅｗ Ｃａｓｔｌｅ，ＵＫ、カタログ番号ＮＣＬ－Ｌ－ｂ－ＳＡＲＣ）で、１：１００の希釈でインキュベートした。Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ ＭＲＣ５カメラを使用して、筋肉切片の４つの異なる象限をカバーする４つのランダムな２０倍画像を撮影した。ベータ－サルコグリカン染色（＞５０％の筋膜染色）の陽性線維の割合を各画像について決定し、各筋肉について平均した。
【0149】
形態計測分析：分析のために、７ヶ月齢のＣ５７ＢＬ６ ＷＴマウス（ｎ＝５）、ｓｇｃｂ－／－マウス（ｎ＝５）、およびｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢで６ヶ月治療したｓｇｃｂ－／－マウス（ｎ＝５）由来の筋肉の１２μｍ厚の凍結切片に対して、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行った。ＴＡ、ＧＡＳ、ＱＵＡＤ、ＰＳＯＡＳ、ＧＬＵＴ、ＴＲＩ、および横隔膜筋において、中心核を有する筋線維の割合を決定した。さらに、ＧＡＳ、ＰＳＯＡＳ、およびＴＲＩ筋において、筋線維直径を測定した。各動物の筋肉当たり４つのランダム２０倍画像をＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ ＭＲＣ５カメラで撮影した。ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて中心核形成線維を定量化し、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ ＬＥ４ソフトウェアを用いて線維直径を測定した。
【0150】
オープンフィールドケージ活動のＸレーザーモニタリング：オープンフィールド活動チャンバを使用して、実験マウスの全体的な活動を決定した。Ｃ５７ＢＬ６ ＷＴ（ｎ＝６）からの７ヶ月齢マウスおよび未治療ｓｇｃｂ－／－（ｎ＝６）対照群を、ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢで６ヶ月治療したｓｇｃｂ－／－マウス（ｎ＝６）と共に、いくつか改変しつつ、以前に記載したプロトコルに従って、分析した（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５１１－５，２００８、Ｂｅａｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｈｏｌ．１７９：２４６４－７４，２０１１）。全てのマウスを、マウスが最も活動的である早朝からその夜の終わり間近のサイクルで、毎日同じ時間に試験した。全てのマウスを、毎回薄暗い光下で、かつ同じ飼育係により、隔離室で試験した。不安を軽減し、マウスの通常の活動、ひいてはアッセイの結果に影響を与える可能性があり得る可変的行動を最小限に抑えるために、試験されたマウスは、個々に収容しなかった（Ｖｏｉｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｂｒａｉｎ Ｂｅｈａｖ．４：２４０－５２，２００５）。マウスの行動を、Ｐｈｏｔｏｂｅａｍ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して監視した。このシステムは、動物チャンバの前後かつ左右を横断する不可視赤外光線のグリッドを使用して、Ｘ－Ｙ－Ｚ平面内のマウスの位置および動きを監視する。活動を、５分間間隔の１時間サイクルで記録した。マウスを、データ取得開始の数日前に１時間セッションで活動試験室に順応させた。マウスを、４匹１組で、個別のチャンバ内で試験した。試験機器を使用毎に掃除して、我々の結果を変化させ得るマウスの反動的な可変的行動を低減した。収集したデータをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌワークシートに変換し、全ての計算をＥｘｃｅｌプログラム内で行った。各マウスのＸ平面およびＹ平面における動きの個々の光線中断を加算して、合計歩行を表し、Ｚ平面における光線中断を加算して、１時間間隔内での垂直活動を得た。
【0151】
実施例２
ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの構築
図１に示すコドン最適化された全長ヒトＳＣＧＢ ｃＤＮＡを含有する導入遺伝子カセットを構築した。カセットは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列（ＣＣＡＣＣ）、ＳＶ４０キメライントロン、合成ポリアデニル化部位、およびカセットの発現を駆動するのに使用される筋特異的ＭＨＣＫ７を含む。これは、近位プロモーターを有する内因性筋クレアチンキナーゼ遺伝子（ｅｎｈ３５８ＭＣＫ、５８４ｂｐ）内の転写開始部位の約１．２ｋｂの５’から採取した２０６ｂｐエンハンサーを利用するＭＣＫベースのプロモーターである３、１２。カセットを、ＡＡＶ８に対して９３％相同である自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶｒｈ．７４ベクターにパッケージングした。ＡＡＶｒｈ．７４は、マウスおよび非ヒト霊長類において、特に、循環によって筋肉に送達される場合に血液関門を通過する際に、安全かつ効果的であることが示されている（１７、１８、２１）。
ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの構築
図１に示すコドン最適化された全長ヒトＳＣＧＢ ｃＤＮＡを含有する導入遺伝子カセットを構築した。カセットは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列（ＣＣＡＣＣ）、ＳＶ４０キメライントロン、合成ポリアデニル化部位、およびカセットの発現を駆動するのに使用される筋特異的ＭＨＣＫ７を含む。これは、近位プロモーターを有する内因性筋クレアチンキナーゼ遺伝子（ｅｎｈ３５８ＭＣＫ、５８４ｂｐ）内の転写開始部位の約１．２ｋｂの５’から採取した２０６ｂｐエンハンサーを利用するＭＣＫベースのプロモーターである３、１２。カセットを、ＡＡＶ８に対して９３％相同である自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶｒｈ．７４ベクターにパッケージングした。ＡＡＶｒｈ．７４は、マウスおよび非ヒト霊長類において、特に、循環によって筋肉に送達される場合に血液関門を通過する際に、安全かつ効果的であることが示されている（１７、１８、２１）。
【0152】
実施例３
高用量ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ全身送達の長期有効性
１．０×１０１２ｖｇ総用量（５．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ）の用量のｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを用いた以前の研究の強い結果に従って、ベクターを、高用量の３．０×１０１２ｖｇ総用量（２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ）で６匹のＳＧＣＢ－／－マウスに尾静脈注射によって送達し、２４週間の長期間の時間点で全身送達する場合のベクターの導入遺伝子発現および有効性を評価した。マウスに４～５週齢で注射し、注射後２４週間に６匹のマウスすべてに対する完全な剖検を実施した。以下の筋肉が分析のために抽出された：ＴＡ、腓腹筋、大腿四頭筋、臀筋、大ＰＳＯＡＳ、上腕三頭筋、横隔膜、および心臓。毒物学および生体内分布の研究のために臓器も摘出された。要するに、ｈＳＧＣＢ導入遺伝子の発現は、以前に研究した用量（すべての筋肉で９８．１０％）と比較して、この高用量で治療２４週間後に同じくらい高く（すべての筋肉で９８．７７％）、治療したマウスのすべての筋肉が、再びほぼ完全に形質導入された。これは、改善された筋肉組織病理および改善された機能を伴っていた。
高用量ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ全身送達の長期有効性
１．０×１０１２ｖｇ総用量（５．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ）の用量のｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを用いた以前の研究の強い結果に従って、ベクターを、高用量の３．０×１０１２ｖｇ総用量（２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ）で６匹のＳＧＣＢ－／－マウスに尾静脈注射によって送達し、２４週間の長期間の時間点で全身送達する場合のベクターの導入遺伝子発現および有効性を評価した。マウスに４～５週齢で注射し、注射後２４週間に６匹のマウスすべてに対する完全な剖検を実施した。以下の筋肉が分析のために抽出された：ＴＡ、腓腹筋、大腿四頭筋、臀筋、大ＰＳＯＡＳ、上腕三頭筋、横隔膜、および心臓。毒物学および生体内分布の研究のために臓器も摘出された。要するに、ｈＳＧＣＢ導入遺伝子の発現は、以前に研究した用量（すべての筋肉で９８．１０％）と比較して、この高用量で治療２４週間後に同じくらい高く（すべての筋肉で９８．７７％）、治療したマウスのすべての筋肉が、再びほぼ完全に形質導入された。これは、改善された筋肉組織病理および改善された機能を伴っていた。
【0153】
β－サルコグリカン発現
ヒトβ－サルコグリカンの免疫蛍光（ＩＦ）染色を使用し、ｈＳＧＣＢベクターの全身注射を与えた６匹のＫＯマウスすべての横隔膜および心臓に加えて、６種類の骨格筋におけるｈＳＧＣＢ導入遺伝子発現を決定した。これらの筋肉は、ＴＡ、腓腹筋（ＧＡＳ）、大腿四頭筋（ＱＵＡＤ）、臀筋（ＧＬＵＴ）、大腰筋（ＰＳＯＡＳ）、および上腕三頭筋（ＴＲＩ）を含んでいた。発現分析および形質導入効率の目的で、６匹の治療マウス由来の筋肉についての画像を定量化に利用した。各筋肉の４つの２０倍画像を撮影し、各画像についてｈＳＧＣＢ陽性線維のパーセントを決定して、各マウス由来の各筋肉についての平均形質導入率を得て、これらのデータを付録Ｃに示す。以下の図２Ａのパネルに示される結果は、治療マウスからの代表的な画像であり、横隔膜および心臓を含む分析されたすべての筋肉において、ここでも再び９８％以上の形質導入を示す。最後に、図２Ｂにも示されているウエスタンブロットは、初期の臨床用量の送達後に達成されたものと同様である、ＴＡおよびＴＲＩ筋肉におけるｈＳＧＣＢの発現を示す。
ヒトβ－サルコグリカンの免疫蛍光（ＩＦ）染色を使用し、ｈＳＧＣＢベクターの全身注射を与えた６匹のＫＯマウスすべての横隔膜および心臓に加えて、６種類の骨格筋におけるｈＳＧＣＢ導入遺伝子発現を決定した。これらの筋肉は、ＴＡ、腓腹筋（ＧＡＳ）、大腿四頭筋（ＱＵＡＤ）、臀筋（ＧＬＵＴ）、大腰筋（ＰＳＯＡＳ）、および上腕三頭筋（ＴＲＩ）を含んでいた。発現分析および形質導入効率の目的で、６匹の治療マウス由来の筋肉についての画像を定量化に利用した。各筋肉の４つの２０倍画像を撮影し、各画像についてｈＳＧＣＢ陽性線維のパーセントを決定して、各マウス由来の各筋肉についての平均形質導入率を得て、これらのデータを付録Ｃに示す。以下の図２Ａのパネルに示される結果は、治療マウスからの代表的な画像であり、横隔膜および心臓を含む分析されたすべての筋肉において、ここでも再び９８％以上の形質導入を示す。最後に、図２Ｂにも示されているウエスタンブロットは、初期の臨床用量の送達後に達成されたものと同様である、ＴＡおよびＴＲＩ筋肉におけるｈＳＧＣＢの発現を示す。
【0154】
治療された筋肉の組織病理学
以前に議論されたように、ＳＧＣＢ－／－マウス由来の筋肉は、骨格筋および心筋の両方が、壊死の複数の病巣領域を伴う顕著な筋線維萎縮および肥大を含む、広範囲のミオパチーを示す。また、単核細胞の炎症（リンパ球およびマクロファージ、好中球が散在している）の数が増加し、ジストロフィー性石灰化、脂肪浸潤、中心核形成、および線維症も増加する。以下の図３のヘマトキシリン＆エオシン染色は、正常な野生型マウスと比較した場合に、ＳＧＣＢ－／－マウスにおけるこのジストロフィー表現型と、治療後の筋肉病変の改善を示す。組織学的パラメーターの定量化は、β－サルコグリカン遺伝子移入の結果として、多数の異なる骨格筋における中枢核形成（ＣＮ）の減少を示す。筋肉の組織病理学のより詳細な分析により、検査した３つの筋肉（腓腹筋、腰筋、上腕三頭筋）すべてでベクターで治療した罹患マウスの平均線維径の増加を伴う線維サイズ分布の正常化が明らかになる（図３）。
以前に議論されたように、ＳＧＣＢ－／－マウス由来の筋肉は、骨格筋および心筋の両方が、壊死の複数の病巣領域を伴う顕著な筋線維萎縮および肥大を含む、広範囲のミオパチーを示す。また、単核細胞の炎症（リンパ球およびマクロファージ、好中球が散在している）の数が増加し、ジストロフィー性石灰化、脂肪浸潤、中心核形成、および線維症も増加する。以下の図３のヘマトキシリン＆エオシン染色は、正常な野生型マウスと比較した場合に、ＳＧＣＢ－／－マウスにおけるこのジストロフィー表現型と、治療後の筋肉病変の改善を示す。組織学的パラメーターの定量化は、β－サルコグリカン遺伝子移入の結果として、多数の異なる骨格筋における中枢核形成（ＣＮ）の減少を示す。筋肉の組織病理学のより詳細な分析により、検査した３つの筋肉（腓腹筋、腰筋、上腕三頭筋）すべてでベクターで治療した罹患マウスの平均線維径の増加を伴う線維サイズ分布の正常化が明らかになる（図３）。
【0155】
全身送達の機能評価
高用量のｈＳＧＣＢ遺伝子移入が、罹患した筋肉にさらに大きな機能的利益をもたらすかどうかを判断するために、高用量のｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＣＧＢで治療したＳＧＣＢ－／－マウスの横隔膜筋の機能特性。組織病理学が示され、ＳＧＣＢ－／－マウスの横隔膜および心臓における機能的欠損が確立された。β－サルコグリカンＫＯ横隔膜は、ＢＬ６ ＷＴマウスと比較して、比力出力の５０．９％減少を示した（１１６．２４ｍＮ／ｍｍ２対２３６．６７ｍＮ／ｍｍ２）。高用量ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの尾静脈送達により、横隔膜においてほぼ１００％のｈＳＧＣＢ発現が生じ、横隔膜の比力出力が回復し、２５９．９７ｍＮ／ｍｍ２（ｎ＝６）に改善した（図４）。これらのデータは、高用量ｈＳＧＣＢ遺伝子移入が、β－サルコグリカンが欠損した罹患筋肉に対し、より大きな機能的利益をもたらすことを示す。
高用量のｈＳＧＣＢ遺伝子移入が、罹患した筋肉にさらに大きな機能的利益をもたらすかどうかを判断するために、高用量のｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＣＧＢで治療したＳＧＣＢ－／－マウスの横隔膜筋の機能特性。組織病理学が示され、ＳＧＣＢ－／－マウスの横隔膜および心臓における機能的欠損が確立された。β－サルコグリカンＫＯ横隔膜は、ＢＬ６ ＷＴマウスと比較して、比力出力の５０．９％減少を示した（１１６．２４ｍＮ／ｍｍ２対２３６．６７ｍＮ／ｍｍ２）。高用量ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの尾静脈送達により、横隔膜においてほぼ１００％のｈＳＧＣＢ発現が生じ、横隔膜の比力出力が回復し、２５９．９７ｍＮ／ｍｍ２（ｎ＝６）に改善した（図４）。これらのデータは、高用量ｈＳＧＣＢ遺伝子移入が、β－サルコグリカンが欠損した罹患筋肉に対し、より大きな機能的利益をもたらすことを示す。
【0156】
高用量のＡＡＶ．ｈＳＧＣＢ療法が、本願発明者らの臨床用量の送達で発生したように、罹患したＳＧＣＢ－／－マウスに対して全体的な機能的利益をもたらし、最終的にＳＧＣＢ－／－マウスの表現型を改善するかどうかを判断するために、オープンフィールドケージ活動のレーザーモニタリングを、マウスのすべての群で実行した。以下の図５のグラフは、ＷＴと比較して、ＫＯマウスにおいて後肢の垂直立ち上がりが４８．９％減少すると共に、ｘ平面およびｙ平面における全体的な歩行が５８．６％有意に減少することを示す。高用量ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢで治療したマウスは、定性的観察によりＫＯと比較して、全体的により活動的であり、このことは、ＭＣＨＫ７治療したマウス（群あたりｎ＝６）において、全体的な歩行が３６．２％増加し、後肢の垂直立ち上がりが３９．０％増加したという活動の定量化を示している（図５）。
【0157】
より高用量の３．０×１０１２ｖｇの総用量（２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ）でｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを静脈内注射すると、四肢骨格筋、横隔膜、および重要な心筋においてほぼ完全な形質導入およびｈＳＧＣＢ発現の回復を生じた（９８％以上）（図２）。高レベルの形質導入が、自己相補性ＡＡＶベクターおよびｒｈ．７４血清型に起因して比較的低い用量（５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇおよび２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ）を使用して、身体全体のすべての筋肉において達成されたという事実は、この療法をＬＧＭＤ２Ｅ患者へと変更するのに大きな期待を与える。β－サルコグリカンの非存在下、すべての筋肉においてみられる重度のジストロフィー病変は、治療後に有意に改善された（図３）。これらの結果は、横隔膜での比力出力において観察された増加と、オープンフィールドケージ活動の増加につながった（図４、５）。
【0158】
実施例４
毒物学およびベクター生体内分布
この研究の目的は、試験物品ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの送達後２４週間で、雄および雌のＳＧＣＢ－／－マウスにおけるＳＧＣＢ遺伝子療法の潜在的な毒性または安全性の懸念を評価することであった。試験物品は、所望な用量を達成するために、各々５時間離れた２回の２６０μＬの注射に分けられた総体積５２０μＬで、４～５週齢のＳＧＣＢ－／－マウスに静脈内（ＩＶ）経路によって３．０×１０１２ｖｇ総用量（２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ）で与えられた。本願発明者らのベクターの安全性を評価するために、ＬＲＳを注射された２匹のＷＴおよび２匹のＫＯ対象と共に、ベクターで治療された６匹のＳＧＣＢ－／－マウスの群から採取した筋肉組織およびすべての隔離した臓器の凍結切片に対してヘマトキシリン＆エオシン染色を行った（表１）。
毒物学およびベクター生体内分布
この研究の目的は、試験物品ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの送達後２４週間で、雄および雌のＳＧＣＢ－／－マウスにおけるＳＧＣＢ遺伝子療法の潜在的な毒性または安全性の懸念を評価することであった。試験物品は、所望な用量を達成するために、各々５時間離れた２回の２６０μＬの注射に分けられた総体積５２０μＬで、４～５週齢のＳＧＣＢ－／－マウスに静脈内（ＩＶ）経路によって３．０×１０１２ｖｇ総用量（２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ）で与えられた。本願発明者らのベクターの安全性を評価するために、ＬＲＳを注射された２匹のＷＴおよび２匹のＫＯ対象と共に、ベクターで治療された６匹のＳＧＣＢ－／－マウスの群から採取した筋肉組織およびすべての隔離した臓器の凍結切片に対してヘマトキシリン＆エオシン染色を行った（表１）。
【表1】
【0159】
次に、これらの切片は、獣医病理学者によって毒性について正式にレビューされ、２匹の治療されたマウス（７８９番および７９０番）の肝臓において、肝病変のいくつかの病巣領域を除き、任意のマウス由来のほとんどの試料において、有害作用は検出されなかった。タンパク質発現およびベクター生体内分布も、ｑＰＣＲおよぶウエスタンブロッティングを使用して評価され、これらのデータは、７８５番および７８７番の肝臓を除き、任意の非筋肉組織においてｈＳＧＣＢ導入遺伝子の発現がないことを示している。
【0160】
ベクター形質導入した組織の病理組織学的調査
全身送達を使用して２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇのｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの安全性および毒性プロファイルを決定するために、心臓および５つの他の臓器と共に、横隔膜を含む種々の骨格筋をベクターを投与したＳＧＣＢ－／－マウスおよび対照の群から採取し、各組織のＨ＆Ｅ切片は、独立した獣医病理学者によって正式にレビューされた。群の詳細および研究デザインを表１に示す。
全身送達を使用して２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇのｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの安全性および毒性プロファイルを決定するために、心臓および５つの他の臓器と共に、横隔膜を含む種々の骨格筋をベクターを投与したＳＧＣＢ－／－マウスおよび対照の群から採取し、各組織のＨ＆Ｅ切片は、独立した獣医病理学者によって正式にレビューされた。群の詳細および研究デザインを表１に示す。
【0161】
ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ組織病理学研究のための投薬コホート。２匹のＢＬ６ ＷＴマウスおよび２匹のＳＧＣＢ－／－マウスにＬＲＳを注射して、年齢を一致させた適切な対照として機能させた。６匹のＳＧＣＢ－／－は、静脈内によって３．０×１０１２ｖｇ総用量を投与された。注射から２４週間後、エンドポイント年齢２８週でマウスを安楽死させた。
【0162】
まとめると、高用量ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの静脈内注射は、検査された任意の骨格筋の筋線維において、なんら顕微鏡的変化を誘発しなかった。筋肉において注目されたいずれの変化も、治療マウスと対照マウスの両方で見られ、偶発的な所見とみなされた。加えて、組織学的に評価された非筋肉組織のほとんどにおいて、治療に関連する病変はみられず、７８９番および７９０番のマウスの肝臓にのみ、小さな病巣肝臓病変を示した。
【0163】
臨床的肝機能をさらに評価するために、これらの雲母の血清中の肝酵素のレベルを評価した。アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）のレベルを分析して、正常レベルと比較して上昇しているかどうかを判断するための、６匹のｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ治療したマウスと共に、２匹の未治療ＢＬ６ ＷＴマウスおよび２匹の未治療ＳＧＣＢ－／－マウス。以下の表２は、未治療ＳＧＣＢ－／－マウスが、健康なマウスの正常範囲から外れた、それぞれ平均２８８Ｕ／Ｌおよび７８４．５Ｕ／Ｌで上昇したＡＬＴおよびＡＳＴレベルを示すことを示す。しかし、ＡＡＶを投与したＳＧＣＢ－／－マウスは、それぞれＡＬＴおよびＡＳＴについて上昇しておらず、８９．５Ｕ／Ｌおよび３３０．７５Ｕ／Ｌの正常範囲にある平均ＡＬＴおよびＡＳＴレベルを示す。
【0164】
まとめると、これらのデータは、この試験試料が試験対象によって十分に許容されたことを示している。さらに、２匹の年齢を一致させた未治療ＳＧＣＢ－／－マウス由来の参照標本と比較して、独立した組織病理学のレビューは、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの投与が、治療ＳＧＣＢ－／－マウスにおける筋線維萎縮および破壊を実質的に減少させたことを示しており、そのため、試験物品が、ＳＧＣＢの顕著な欠乏に関連するミオパチーの程度を軽減し得ることを示している。
【表2】
【0165】
表２は、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢで治療したＳＧＣＢ－／－マウス（ｎ＝６）と共に、未治療ＢＬ６ ＷＴ（ｎ＝２）およびＳＧＣＢ－／－（ｎ＝２）の血清中のアラニンアミノ基転移酵素およびアスパラギン酸アミノ基転移酵素のレベルの分析を提供する。右端の２つの列に報告されている平均は、３つのコホート各々についてのものである。単位／Ｌで報告される。Ｎ／Ａは、試料が溶血していて分析することができないことを示す。
【0166】
ベクターゲノム生体内分布
リアルタイムの定量的ＰＣＲアッセイ（ｑＰＣＲ）を使用して、試験物品特異的なＤＮＡ配列の存在を調べた。生体内分布分析は、４匹のベクターを投与したＳＧＣＢ－／－動物から集めた組織試料について行われた。陽性シグナルは、検出されたゲノムＤＮＡ１μｇあたり１００以上の一本鎖ＤＮＡコピーのいずれかであった。剖検時に組織を採取し、ＭＨＣＫ７プロモーターの配列に特異的なベクター特異的プライマープローブセットを使用した。表３は、高用量（３．０×１０１２ｖｇ総用量）のｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを注射したマウス（７８５番、７８６番、７８９番、７９０番）由来の各組織試料において検出されたベクターゲノムコピーを、本願発明者らが以前に研究した臨床用量（１．０×１０１２ｖｇ総用量）で治療したマウス（７１２番、７１３番）における同じ組織試料からのｖｇコピー数と共に示す。
リアルタイムの定量的ＰＣＲアッセイ（ｑＰＣＲ）を使用して、試験物品特異的なＤＮＡ配列の存在を調べた。生体内分布分析は、４匹のベクターを投与したＳＧＣＢ－／－動物から集めた組織試料について行われた。陽性シグナルは、検出されたゲノムＤＮＡ１μｇあたり１００以上の一本鎖ＤＮＡコピーのいずれかであった。剖検時に組織を採取し、ＭＨＣＫ７プロモーターの配列に特異的なベクター特異的プライマープローブセットを使用した。表３は、高用量（３．０×１０１２ｖｇ総用量）のｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを注射したマウス（７８５番、７８６番、７８９番、７９０番）由来の各組織試料において検出されたベクターゲノムコピーを、本願発明者らが以前に研究した臨床用量（１．０×１０１２ｖｇ総用量）で治療したマウス（７１２番、７１３番）における同じ組織試料からのｖｇコピー数と共に示す。
【0167】
ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ転写物は、すべての集めた組織において、様々なレベルで検出された。予想通り、最高レベルは骨格筋と心臓で見られた。最低レベルは生殖腺、肺、腎臓、および脾臓で検出された。注目すべきことに、元の臨床用量（５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ）をこの高用量（２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ）コホートと比較した場合、ベクターゲノムのコピー数は、各組織で類似していた。これらのデータは、試験試料がベクター投与マウスの調査された全ての組織に効率的に送達されたことを示している。
【表3】
【0168】
表３は、４匹の高用量治療されたＳＧＣＢ－／－マウスの臓器および筋肉のベクターゲノムコピー数を提供する。値は、ｖｇ／μｇゲノムＤＮＡで示されている。
【0169】
上のｑＰＣＲの結果が示すように、高用量ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを静脈内送達すると、ほとんどの組織においてベクター転写物が様々なレベルで分布するが、最高レベルは、筋肉で発生する。したがって、本研究のこの部分の目的は、これらの組織におけるヒトβ－サルコグリカン導入遺伝子のタンパク質発現を決定し、筋特異的ＭＨＣＫ７プロモーターの機能性を確実にすることであった。ウエスタンブロッティングを使用して、４匹の治療マウス（７８５番、７８７番、７８９番、および７９０番）由来の組織試料におけるβ－サルコグリカン発現を検出した。
【0170】
β－サルコグリカンタンパク質の発現は、すべての骨格筋試料および心臓試料において、さまざまな量で観察され、マウス７８５番および７８７番の肝臓で検出された。（表４、図６。）肝臓での発現をさらに調査するために、β－サルコグリカンタンパク質発現のウエスタンブロッティングを、６匹すべての治療マウス（７８５番、７８６番、７８７番、７８８番、７８９番、および７９０番）由来の肝臓組織で行った。図６に示すこのウエスタンの結果は、ベクター投与マウス（７８５番、７８６番、７８７番、および７８８番）の６つの肝臓のうち４つでβ－サルコグリカンタンパク質の発現がみられることを示す。以下の表５に、完全な生体内分布ウエスタンが実行された６匹すべてのマウス（７８５番、７９６番、７８７番、７８８番、７８９番、および７９０番）からの詳細なβ－サルコグリカンタンパク質発現の結果を列挙している。
【表4】
【0171】
表４は、２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇのｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢで全身治療された６匹のＳＧＣＢ－／－マウス由来の個々の組織におけるβ－サルコグリカンタンパク質の発現を提供する。Ｘは、対応する組織におけるタンパク質発現を示す。ＮＡ＝アッセイは実行されていない。
【0172】
ＭＨＣＫ７プロモーターを使用したこの心臓での発現は、臨床的に適用可能な投薬レベルで非常に有望であり、ＬＧＭＤ２Ｅ患者のβ－サルコグリカン欠損における心臓疾患の高い発生率を考慮すると、全身送達は、これらの患者に臨床的に大きな利益をもたらす。この提案された高用量の３．０×１０１２ｖｇ総用量（２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ）でのｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの静脈内尾静脈注射を受けたＳＧＣＢ－／－マウスを、完全に剖検し、抽出されたすべての筋肉および臓器を、Ｈ＆Ｅによって染色し、レビューのために独立した獣医病理学者に送った。４匹のベクター投与マウス（７８５番、７８６番、７８７番、および７８８番）由来の肝臓は、全身投薬で以前に示されたβ－サルコグリカントランスジェニックタンパク質の発現を示した（Ｓａｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２００７．１５（２）：ｐ．３２０－９）。６匹の治療された動物のうちの２匹（７８９番および７９０番）は、最小限から軽度の病巣肝病変を有すると報告されたが、６匹の治療されたマウスからレビューされた他のすべての臓器および筋肉は、有害作用を示さなかった。マウス７８９番および７９０番由来の肝臓における軽度の肝病変の臨床症状を評価するために、６匹すべての治療マウスの血清中の肝酵素レベルであるアラニンアミノ基転移酵素およびアスパラギン酸アミノ基転移酵素を測定した。表４に示すこの実験の結果は、６匹の治療マウスからの平均ＡＳＴおよびＡＬＴレベルが正常範囲内にあることを示しており、このことは、臨床的な肝酵素異常がないことを示している。動物７８９番および７９０番由来の肝臓は、β－サルコグリカントランスジェニックタンパク質の発現がないことに加えて、より低いｖｇコピー数（表３）を示した。まとめると、このデータは、トランスジェニックβ－サルコグリカンタンパク質が、これら２匹の動物の肝臓から除去された可能性があることを示す。しかし、骨格筋の発現または肝機能への影響はなかった。
【0173】
高用量（２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ）では、肝臓における持続的なβ－サルコグリカン発現がみられるが、低用量（５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ）で治療した動物では観察されなかった。提供されたどの用量でも、明白な毒性は観察されていない。本試験は、ＮＯＡＥＬ用量（５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ）で開始される。患者の肝毒性は綿密にモニタリングされ、肝酵素の上昇は、ＡＡＶを使用した脊髄性筋萎縮症の別の全身送達試験においてコルチコステロイドを使用して効率的に管理されている（Ｍｅｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１７；３７７：１７１３－１７２２）。
【0174】
実施例５
ＬＧＭＤ２Ｅ非盲検試験
筋特異的ＭＨＣＫ７プロモーター（ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ）の制御下にあるヒトＳＧＣＢ遺伝子を保有する組換えＡＡＶｒｈ７４は、末梢静脈からの全身注入を介し、１回送達された。ベクターは、必要に応じて、およそ１０ｍｌ／ｋｇの乳酸Ｒｉｎｇｅｒ中で送達され、およそ１～２時間かけて注入される。患者は、グルココルチコステロイドの副腎抑制があり、３０日後にせいぜいごくわずかであったが、注意のために、各登録者の最大用量を１週間で５０％減らし、停止する前に１週間で再び５０％減らす。
ＬＧＭＤ２Ｅ非盲検試験
筋特異的ＭＨＣＫ７プロモーター（ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ）の制御下にあるヒトＳＧＣＢ遺伝子を保有する組換えＡＡＶｒｈ７４は、末梢静脈からの全身注入を介し、１回送達された。ベクターは、必要に応じて、およそ１０ｍｌ／ｋｇの乳酸Ｒｉｎｇｅｒ中で送達され、およそ１～２時間かけて注入される。患者は、グルココルチコステロイドの副腎抑制があり、３０日後にせいぜいごくわずかであったが、注意のために、各登録者の最大用量を１週間で５０％減らし、停止する前に１週間で再び５０％減らす。
【0175】
コホート１には、両方の対立遺伝子にＳＧＣＢ変異が確認されており、ＡＡＶｒｈ７４抗体に対して陰性であり、正常な１００メートル歩行試験の４０％を超える、４～１５歳の３人の治療対象が含まれていた。各対象は、５×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量を受けた。投薬から６０日後、麻酔専門医（または麻酔医）の助言の下で、前脛骨筋および上腕二頭筋に適切な麻酔をかけて筋生検を行った。生検は、超音波ガイド下で行ってもよい。各対象は、遺伝子移入の１日前に１ｍｇ／ｋｇのプレドニゾンを受け、３０日間、用量を記録した。
【0176】
生検を読み取り、コホート１のすべての対象において、筋繊維の５０％以上が、ＴＡおよび上腕二頭筋においてＳＧＣＢを発現する場合、コホート２において、用量の増加はしない。これらの基準を満たさない場合、コホート２の対象は、２×１０１４ｖｇ／ｋｇを受ける。コホート２の患者のうち３名は、プラセボ乳酸Ｒｉｎｇｅｒを受ける。これらのプラセボ対象は、およそ１年後に、それらのコホートで治療された対象と同じ用量で治療される。
【0177】
注射前のベースライン測定（－６０日目から－２日目まで）
インフォームドコンセントを取得し、登録手順を完了した後、患者が服用しているすべての医薬およびサプリメントの記録を含む、ベースライン患者病歴を集めた。安定したベースラインを確立するためのベースライン機能試験を、ベースライン検査の一貫性について以前の自然な成長経過の検査において集められた機能試験結果と比較した。スクリーニング来院時に、１００ｍの時間試験は、組み入れのために、年齢、身長および体重が一致する健康な対照について予想されるものの４０％以上でなければならない。ある対象がスクリーニングに組み入れられない場合、その対象は、ＬＧＭＤの自然な成長経過の試験に参加し続けてもよい。以下の評価は、この試験についての対象の適格性を確認するために実行される。治療投与前に完了しなければならないベースライン試験には、以下が含まれる。
ベースライン
遺伝子移入前の－６０日目から－２日目まで
・インフォームドコンセント
・病歴
・身体検査／バイタル
・ＥＫＧ
・心臓ＭＲＩ（麻酔なしで行われるが、その手技の忍容性が低く、この疾患における心臓評価の重要性を考慮している場合は、Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ ｐｒｏｔｏｃｏｌで許容可能なプロトコルを使用した、麻酔を行うオプションについて説明する）
・麻酔なしの骨格筋ＭＲＩ
・Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶの抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ）試験
・安全性実験室：
○差次的であり、血小板を含む全血球計算（ＣＢＣ）
○血清総タンパク質
○血清ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）
■ＧＧＴを使用して、ＡＬＴまたはＡＳＴではなく肝酵素をモニタリングする。これらの酵素は損傷した筋肉から供給されるため、レベルは、９～１０倍のＵＬＮに達する場合がある。ＡＬＴおよびＡＳＴは、日々３０～４０％変動する可能性があり、解釈を困難なものにする。ＧＧＴは、筋肉疾患の影響を受けない２２、２３。
○血清総ビリルビン
○グルコース
○クレアチンキナーゼ（ＣＫ）（ＣＫレベルは、好ましくは２日間の来院でのみ採取されるが、ＰＩの裁量により１日の来院で試験される場合がある）
○クレアチニン／ＢＵＮ
○シスタチンＣ
○アルカリホスファターゼ
○アミラーゼ
○ＡＳＴ
○ＡＬＴ
○プロトロンビン時間（ＰＴ）、部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）
○電解質（ナトリウム、カリウム、塩化物、ＣＯ２
○尿検査
・ｒＡＡＶｒｈ７４に対する血清結合抗体
・β－サルコグリカンに対する血清結合抗体
・ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質およびβ－サルコグリカンに対するＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
・妊娠試験（出産の可能性があると調査員が判断した場合）
・膝と肘の屈筋と伸筋、股関節内転筋、および肩外転筋の強度試験（ハンドヘルドダイナモメーター測定）
・ＰＲＯＭＩＳアンケート
・活動モニタリングのための装置を設定する
・肺活量測定を含む肺機能試験（ＰＦＴ）
・時間機能試験［１００メートル時間試験、４段の階段を上る、タイムアップアンドゴー］
・ワークスペース体積
・肢帯型筋ジストロフィー（ＮＳＡＤ）のノーススター評価
・上肢および下肢の筋肉のベースライン筋生検は、ガイド付き超音波を使用する場合がある。患者へのリスクが最も少ない分析に適した筋肉を標的とする臨床所見に応じて選択する。プラセボ遅延対象には、２回目のベースライン筋生検を実施しない。
・胸部Ｘ線
－１日目
・身体検査およびバイタルサイン
・プレドニゾンまたは類似のグルココルチコイドを開始する
・注射部位の可能性がある部位の写真
・安全性実験室：
○差次的であり、血小板を含む全血球計算（ＣＢＣ）
○血清総タンパク質
○血清ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）
■ＧＧＴを使用して、ＡＬＴまたはＡＳＴではなく肝酵素をモニタリングする。これらの酵素は損傷した筋肉から供給されるため、レベルは、９～１０倍のＵＬＮに達する場合がある。ＡＬＴおよびＡＳＴは、日々３０～４０％変動する可能性があり、解釈を困難なものにする。ＧＧＴは、筋肉疾患の影響を受けない２２、２３。
○血清総ビリルビン
○グルコース
○クレアチンキナーゼ（ＣＫ）（ＣＫレベルは、好ましくは２日間の来院でのみ採取されるが、ＰＩの裁量により１日の来院で試験される場合がある）
○クレアチニン／ＢＵＮ
○シスタチンＣ
○アルカリホスファターゼ
○アミラーゼ
○ＡＳＴ
○ＡＬＴ
○プロトロンビン時間（ＰＴ）、部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）
○電解質（ナトリウム、カリウム、塩化物、ＣＯ２）
○尿検査
インフォームドコンセントを取得し、登録手順を完了した後、患者が服用しているすべての医薬およびサプリメントの記録を含む、ベースライン患者病歴を集めた。安定したベースラインを確立するためのベースライン機能試験を、ベースライン検査の一貫性について以前の自然な成長経過の検査において集められた機能試験結果と比較した。スクリーニング来院時に、１００ｍの時間試験は、組み入れのために、年齢、身長および体重が一致する健康な対照について予想されるものの４０％以上でなければならない。ある対象がスクリーニングに組み入れられない場合、その対象は、ＬＧＭＤの自然な成長経過の試験に参加し続けてもよい。以下の評価は、この試験についての対象の適格性を確認するために実行される。治療投与前に完了しなければならないベースライン試験には、以下が含まれる。
ベースライン
遺伝子移入前の－６０日目から－２日目まで
・インフォームドコンセント
・病歴
・身体検査／バイタル
・ＥＫＧ
・心臓ＭＲＩ（麻酔なしで行われるが、その手技の忍容性が低く、この疾患における心臓評価の重要性を考慮している場合は、Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ ｐｒｏｔｏｃｏｌで許容可能なプロトコルを使用した、麻酔を行うオプションについて説明する）
・麻酔なしの骨格筋ＭＲＩ
・Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶの抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ）試験
・安全性実験室：
○差次的であり、血小板を含む全血球計算（ＣＢＣ）
○血清総タンパク質
○血清ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）
■ＧＧＴを使用して、ＡＬＴまたはＡＳＴではなく肝酵素をモニタリングする。これらの酵素は損傷した筋肉から供給されるため、レベルは、９～１０倍のＵＬＮに達する場合がある。ＡＬＴおよびＡＳＴは、日々３０～４０％変動する可能性があり、解釈を困難なものにする。ＧＧＴは、筋肉疾患の影響を受けない２２、２３。
○血清総ビリルビン
○グルコース
○クレアチンキナーゼ（ＣＫ）（ＣＫレベルは、好ましくは２日間の来院でのみ採取されるが、ＰＩの裁量により１日の来院で試験される場合がある）
○クレアチニン／ＢＵＮ
○シスタチンＣ
○アルカリホスファターゼ
○アミラーゼ
○ＡＳＴ
○ＡＬＴ
○プロトロンビン時間（ＰＴ）、部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）
○電解質（ナトリウム、カリウム、塩化物、ＣＯ２
○尿検査
・ｒＡＡＶｒｈ７４に対する血清結合抗体
・β－サルコグリカンに対する血清結合抗体
・ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質およびβ－サルコグリカンに対するＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
・妊娠試験（出産の可能性があると調査員が判断した場合）
・膝と肘の屈筋と伸筋、股関節内転筋、および肩外転筋の強度試験（ハンドヘルドダイナモメーター測定）
・ＰＲＯＭＩＳアンケート
・活動モニタリングのための装置を設定する
・肺活量測定を含む肺機能試験（ＰＦＴ）
・時間機能試験［１００メートル時間試験、４段の階段を上る、タイムアップアンドゴー］
・ワークスペース体積
・肢帯型筋ジストロフィー（ＮＳＡＤ）のノーススター評価
・上肢および下肢の筋肉のベースライン筋生検は、ガイド付き超音波を使用する場合がある。患者へのリスクが最も少ない分析に適した筋肉を標的とする臨床所見に応じて選択する。プラセボ遅延対象には、２回目のベースライン筋生検を実施しない。
・胸部Ｘ線
－１日目
・身体検査およびバイタルサイン
・プレドニゾンまたは類似のグルココルチコイドを開始する
・注射部位の可能性がある部位の写真
・安全性実験室：
○差次的であり、血小板を含む全血球計算（ＣＢＣ）
○血清総タンパク質
○血清ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）
■ＧＧＴを使用して、ＡＬＴまたはＡＳＴではなく肝酵素をモニタリングする。これらの酵素は損傷した筋肉から供給されるため、レベルは、９～１０倍のＵＬＮに達する場合がある。ＡＬＴおよびＡＳＴは、日々３０～４０％変動する可能性があり、解釈を困難なものにする。ＧＧＴは、筋肉疾患の影響を受けない２２、２３。
○血清総ビリルビン
○グルコース
○クレアチンキナーゼ（ＣＫ）（ＣＫレベルは、好ましくは２日間の来院でのみ採取されるが、ＰＩの裁量により１日の来院で試験される場合がある）
○クレアチニン／ＢＵＮ
○シスタチンＣ
○アルカリホスファターゼ
○アミラーゼ
○ＡＳＴ
○ＡＬＴ
○プロトロンビン時間（ＰＴ）、部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）
○電解質（ナトリウム、カリウム、塩化物、ＣＯ２）
○尿検査
【0178】
プレドニゾンの予防的投与
ＡＡＶベクターに対する予想される抗原特異的Ｔ細胞応答は、遺伝子移入後２～４週間の間に予想された。このような抗原特異的Ｔ細胞応答に対する１つの考えられる結果は、形質導入された細胞のクリアランスおよび導入遺伝子発現の喪失であった。ＡＡＶベースの治療に対する宿主の免疫応答を弱めるために、手順の２４時間前に、対象は、およそ１ｍｇ／ｋｇ／日の経口による予防的プレゾニゾンまたは同等のグルココルチコイドから始め、最大用量６０ｍｇ／日で投与することができた。必要に応じて、同等のグルココルチコイドをおよそ１ｍｇ／ｋｇ／日の用量で静脈内投与することも可能である。治療は、およそ１ヶ月続いた。プレゾニゾンまたは同等のグルココルチコイドの量を漸減させるプロトコルを、個々の対象の遺伝子移入に対する免疫応答に基づいて実施し、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって、またＧＧＴによる肝機能モニタリングによって評価した。
ＡＡＶベクターに対する予想される抗原特異的Ｔ細胞応答は、遺伝子移入後２～４週間の間に予想された。このような抗原特異的Ｔ細胞応答に対する１つの考えられる結果は、形質導入された細胞のクリアランスおよび導入遺伝子発現の喪失であった。ＡＡＶベースの治療に対する宿主の免疫応答を弱めるために、手順の２４時間前に、対象は、およそ１ｍｇ／ｋｇ／日の経口による予防的プレゾニゾンまたは同等のグルココルチコイドから始め、最大用量６０ｍｇ／日で投与することができた。必要に応じて、同等のグルココルチコイドをおよそ１ｍｇ／ｋｇ／日の用量で静脈内投与することも可能である。治療は、およそ１ヶ月続いた。プレゾニゾンまたは同等のグルココルチコイドの量を漸減させるプロトコルを、個々の対象の遺伝子移入に対する免疫応答に基づいて実施し、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって、またＧＧＴによる肝機能モニタリングによって評価した。
【0179】
遺伝子移入のプロトコル
ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ遺伝子ベクターは、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ
Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（ＭＯＯＰ）に従って、研究医師によって調製された。臨床現場に輸送される直前に、試験物品の適切な希釈は、薬局によって完了した。ベクターを、乳酸菌Ｒｉｎｇｅｒを使用して希釈し、滅菌６０ｍｌポリプロピレンシリンジで抜き取った。希釈の文書化は、標準的な薬局プロトコルに従って、薬局によって完了した。
ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ遺伝子ベクターは、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ
Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（ＭＯＯＰ）に従って、研究医師によって調製された。臨床現場に輸送される直前に、試験物品の適切な希釈は、薬局によって完了した。ベクターを、乳酸菌Ｒｉｎｇｅｒを使用して希釈し、滅菌６０ｍｌポリプロピレンシリンジで抜き取った。希釈の文書化は、標準的な薬局プロトコルに従って、薬局によって完了した。
【0180】
ベクターを含む注射器は、室温で運ばれ、調製から２４時間以内に対象に投与された。ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの取り扱いは、バイオセーフティーレベル１ベクターのコンプライアンス基準に従った。（ＮＩＨ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｏｒ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ［ＮＩＨ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ］，Ａｐｒｉｌ ２０１６，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｏｌｉｃｙ，Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ。
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｏｒ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ［ＮＩＨ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ］，Ａｐｒｉｌ ２０１６，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｏｌｉｃｙ，Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ。
【0181】
対象は、遺伝子移入の前夜に、ＰＩＣＵまたは肺ＰＩＣＵのいずれかで遺伝子移入が認められ、ＰＩまたはＣｏ－Ｉのいずれかによって検査された（－１日目）。対象は、遺伝子移入手順の前夜の深夜以降に、ＮＰＯを維持した。手順は、病室で、無菌条件下で実施された。
【0182】
ベクターの送達のために、ヘパリンロックを備えた静脈内カテーテルを末梢静脈に配置した。最初の部位に合併症が発生した場合に使用するために、２番目の静脈内カテーテルを配置した。遺伝子移入の日に、これらの場所の写真を撮影した。患者が目覚めている間に、ベクターを静脈内送達した。治験担当医師が必要と判断した場合、患者は、プロトコルに従って意識下での鎮静を受けた。患者は、シリンジポンプを使用して、６０ｍＬポリプロピレンシリンジを介し、およそ約１～２時間にわたって投与されるｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢにより投薬された。患者のバイタルサインは、注入中、１５分ごとに４時間、注入後の残りの２４時間は１時間ごとにモニタリングされた。
【0183】
遺伝子移入後のモニタリング
患者のバイタルサインは、１５分ごとに４時間、注入後の残りの２４時間は１時間ごとにモニタリングされた。手順の翌日、安全性実験室および尿検査をチェックした。併用薬およびすべての有害事象／重篤な有害事象も、注射後にモニタリングされ、文書化された。対象は、遺伝子移入の１日後に退院した（安全性が懸念される副作用が観察されない場合には）。対象は、７、１４、３０、６０、９０、１８０日目および９、１２、１８、２４、３０および３６ヶ月目にフォローアップ来院のために戻ってきた。これらの各々日付での毒性モニタリングには、以下が含まれていた。
・身体検査およびバイタルサイン
・安全性実験室：
○差次的であり、血小板を含む全血球計算（ＣＢＣ）
○血清総タンパク質
○血清ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）＊
■ＧＧＴを使用して、ＡＬＴまたはＡＳＴではなく肝酵素をモニタリングする。これらの酵素は損傷した筋肉から供給されるため、レベルは、９～１０倍のＵＬＮに達する場合がある。ＡＬＴおよびＡＳＴは、日々３０～４０％変動する可能性があり、解釈を困難なものにする。ＧＧＴは、筋肉疾患の影響を受けない２２、２３
○血清総ビリルビン
○グルコース
○クレアチンキナーゼ（ＣＫ）（ＣＫレベルは、好ましくは２日間の来院でのみ採取されるが、ＰＩの裁量により１日の来院で試験される場合がある）
○クレアチニン／ＢＵＮ
○シスタチンＣ
○アルカリホスファターゼ
○アミラーゼ
○ＡＳＴ
○ＡＬＴ
○プロトロンビン時間（ＰＴ）、部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）
○電解質（ナトリウム、カリウム、塩化物、ＣＯ２）
○尿検査
・免疫学検査
・３０日目から始まる理学療法の評価（１００メートル時間試験、強度試験、ＰＲＯＭＩＳアンケート、肢帯型筋ジストロフィー（ＮＳＡＤ）のノーススター評価、４段の階段を上る、タイムアップアンドゴー、およびワークスペース体積）
・尿検査
・注射部位の写真（－１、０、１、７、１４、３０日目）
・有害事象（すべての試験来院で収集）
・ＥＫＧ（１８０日目、１２、２４、３６ヶ月目）
・心筋および骨格筋のＭＲＩ（１２、２４、３６ヶ月目）、
・肺機能試験（６０、１８０日目、１２、２４、３６ヶ月目）
・コホート１および２の場合は６０日目、すべての対象について治療から２年後の遺伝子移入後の筋生検。筋肉の選択は、治療前の生検部位と同じである。リスクによって生検を反対側の肢で行うことを指示しない限り、治療後の生検は、好ましくは同じ側であろう。
患者のバイタルサインは、１５分ごとに４時間、注入後の残りの２４時間は１時間ごとにモニタリングされた。手順の翌日、安全性実験室および尿検査をチェックした。併用薬およびすべての有害事象／重篤な有害事象も、注射後にモニタリングされ、文書化された。対象は、遺伝子移入の１日後に退院した（安全性が懸念される副作用が観察されない場合には）。対象は、７、１４、３０、６０、９０、１８０日目および９、１２、１８、２４、３０および３６ヶ月目にフォローアップ来院のために戻ってきた。これらの各々日付での毒性モニタリングには、以下が含まれていた。
・身体検査およびバイタルサイン
・安全性実験室：
○差次的であり、血小板を含む全血球計算（ＣＢＣ）
○血清総タンパク質
○血清ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）＊
■ＧＧＴを使用して、ＡＬＴまたはＡＳＴではなく肝酵素をモニタリングする。これらの酵素は損傷した筋肉から供給されるため、レベルは、９～１０倍のＵＬＮに達する場合がある。ＡＬＴおよびＡＳＴは、日々３０～４０％変動する可能性があり、解釈を困難なものにする。ＧＧＴは、筋肉疾患の影響を受けない２２、２３
○血清総ビリルビン
○グルコース
○クレアチンキナーゼ（ＣＫ）（ＣＫレベルは、好ましくは２日間の来院でのみ採取されるが、ＰＩの裁量により１日の来院で試験される場合がある）
○クレアチニン／ＢＵＮ
○シスタチンＣ
○アルカリホスファターゼ
○アミラーゼ
○ＡＳＴ
○ＡＬＴ
○プロトロンビン時間（ＰＴ）、部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）
○電解質（ナトリウム、カリウム、塩化物、ＣＯ２）
○尿検査
・免疫学検査
・３０日目から始まる理学療法の評価（１００メートル時間試験、強度試験、ＰＲＯＭＩＳアンケート、肢帯型筋ジストロフィー（ＮＳＡＤ）のノーススター評価、４段の階段を上る、タイムアップアンドゴー、およびワークスペース体積）
・尿検査
・注射部位の写真（－１、０、１、７、１４、３０日目）
・有害事象（すべての試験来院で収集）
・ＥＫＧ（１８０日目、１２、２４、３６ヶ月目）
・心筋および骨格筋のＭＲＩ（１２、２４、３６ヶ月目）、
・肺機能試験（６０、１８０日目、１２、２４、３６ヶ月目）
・コホート１および２の場合は６０日目、すべての対象について治療から２年後の遺伝子移入後の筋生検。筋肉の選択は、治療前の生検部位と同じである。リスクによって生検を反対側の肢で行うことを指示しない限り、治療後の生検は、好ましくは同じ側であろう。
【0184】
長期モニタリング
遺伝子移入後の長期的な対象のフォローアップに関して、最近のＦＤＡガイドラインに従う。議論した通り、ｒＡＡＶまたは導入遺伝子に関する以前の経験に基づいて、遺伝子移入に関連する遅延有害事象の可能性は非常に低い。プロトコルのアクティブフェーズを組み込んだ、３年間にわたる短期間の安全性が評価される。新たに特定されたリスクが、製品に関連している場合、または対象が、この期間中に何らかの有害事象に苦しんでいる場合、ＦＤＡガイドラインに従って長期のフォローアップが開始される。
遺伝子移入後の長期的な対象のフォローアップに関して、最近のＦＤＡガイドラインに従う。議論した通り、ｒＡＡＶまたは導入遺伝子に関する以前の経験に基づいて、遺伝子移入に関連する遅延有害事象の可能性は非常に低い。プロトコルのアクティブフェーズを組み込んだ、３年間にわたる短期間の安全性が評価される。新たに特定されたリスクが、製品に関連している場合、または対象が、この期間中に何らかの有害事象に苦しんでいる場合、ＦＤＡガイドラインに従って長期のフォローアップが開始される。
【0185】
フォローアップ期間を延長する必要がある兆候がある場合は、ＣＢＥＲに通知される。すべての対象には、治験治療または治験参加に関連すると考えられる重篤な有害事象を経験した場合に、治験責任医師または治験コーディネーターに連絡する方法についての書面による指示が提供される。この情報は、インフォームドコンセント文書に含まれている。すべての対象は、住所または連絡先情報の変更を治験責任医師に通知するように指示されている。
【0186】
試験後のフォローアップ
遺伝子移入後の長期的な対象のフォローアップに関して、最近のＦＤＡガイダンスに従う。ガイドラインに示されているように、ベクターは、遺伝子移入に関連する遅延有害事象の可能性は非常に低い。プロトコルのアクティブフェーズを組み込んだ、投薬後３年間にわたる安全性が評価される。新たに特定されたリスクが、本願発明者らの製品に関連している場合、または対象が、この期間中に何らかの有害事象に苦しんでいる場合、ＦＤＡガイドラインに従って長期のフォローアップが開始される。
遺伝子移入後の長期的な対象のフォローアップに関して、最近のＦＤＡガイダンスに従う。ガイドラインに示されているように、ベクターは、遺伝子移入に関連する遅延有害事象の可能性は非常に低い。プロトコルのアクティブフェーズを組み込んだ、投薬後３年間にわたる安全性が評価される。新たに特定されたリスクが、本願発明者らの製品に関連している場合、または対象が、この期間中に何らかの有害事象に苦しんでいる場合、ＦＤＡガイドラインに従って長期のフォローアップが開始される。
【0187】
臨床試験の主要アウトカム
これは、第Ｉ相臨床試験であり、安全性が主要アウトカムである。８週間目の筋生検での定量的免疫蛍光またはイムノブロット分析によって判断されるような（ベースラインの上２０％以上）、β－ＳＧタンパク質発現の実証。
探索的アウトカム
・遺伝子移入から３年後の各参加者について、ベースラインと比較して、１００メートル時間が１０％以上改善。
・遺伝子治療後のＣＫの減少は、探索的アウトカムとして役立つ。ＣＫレベルは、好ましくは２日間の来院でのみ採取されるが、ＰＩの裁量により１日の来院で試験される場合がある。
・ワークスペース体積
・膝と肘の屈筋と伸筋、股関節内転筋、および肩外転筋のハンドヘルドダイナモメーター測定
・ｃＭＲＩで測定した駆出率の改善
・骨格ＭＲＩ
・肺活量測定を含む肺機能試験（ＰＦＴ）
・時間機能試験［４段の階段を上る、タイムアップアンドゴー］
・肢帯型筋ジストロフィー（ＮＳＡＤ）のノーススター評価
○Ｆｉｔｂｉｔまたは同様の活動モニタリングデバイスによって決定された活動レベル
○ＰＲＯＭＩＳ Ｕｐｐｅｒ Ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ ａｎｄ Ｍｏｂｉｌｉｔｙアンケートを使用した身体機能の患者レポート
これは、第Ｉ相臨床試験であり、安全性が主要アウトカムである。８週間目の筋生検での定量的免疫蛍光またはイムノブロット分析によって判断されるような（ベースラインの上２０％以上）、β－ＳＧタンパク質発現の実証。
探索的アウトカム
・遺伝子移入から３年後の各参加者について、ベースラインと比較して、１００メートル時間が１０％以上改善。
・遺伝子治療後のＣＫの減少は、探索的アウトカムとして役立つ。ＣＫレベルは、好ましくは２日間の来院でのみ採取されるが、ＰＩの裁量により１日の来院で試験される場合がある。
・ワークスペース体積
・膝と肘の屈筋と伸筋、股関節内転筋、および肩外転筋のハンドヘルドダイナモメーター測定
・ｃＭＲＩで測定した駆出率の改善
・骨格ＭＲＩ
・肺活量測定を含む肺機能試験（ＰＦＴ）
・時間機能試験［４段の階段を上る、タイムアップアンドゴー］
・肢帯型筋ジストロフィー（ＮＳＡＤ）のノーススター評価
○Ｆｉｔｂｉｔまたは同様の活動モニタリングデバイスによって決定された活動レベル
○ＰＲＯＭＩＳ Ｕｐｐｅｒ Ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ ａｎｄ Ｍｏｂｉｌｉｔｙアンケートを使用した身体機能の患者レポート
【0188】
コホート１の結果
コホート１のすべての対象は、試験の時点で良好であった（対象１および２、注射後の９０日目に検査した、対象３、注射後の６０日目に検査した）。すべての対象は、注射後９ヶ月目まで順調に推移した。この研究では、１例の重篤な有害事象があり、１名の対象が、ステロイドの中止後に、肝酵素およびビリルビンの上昇を示した。この事象は、ステロイドの増加で解決した。対象のうちの２名は、肝酵素が上昇し、ステロイドの増加で解決し、これらのレベルはベースラインに戻った。
コホート１のすべての対象は、試験の時点で良好であった（対象１および２、注射後の９０日目に検査した、対象３、注射後の６０日目に検査した）。すべての対象は、注射後９ヶ月目まで順調に推移した。この研究では、１例の重篤な有害事象があり、１名の対象が、ステロイドの中止後に、肝酵素およびビリルビンの上昇を示した。この事象は、ステロイドの増加で解決した。対象のうちの２名は、肝酵素が上昇し、ステロイドの増加で解決し、これらのレベルはベースラインに戻った。
【0189】
前脛骨筋および上腕二頭筋の筋針生検を使用して、コホート１における６０日目までのベースラインと比較して、導入遺伝子の発現を定量化した。プライマリーエンドポイントは、ＳＧＣＢタンパク質の２０％以上の発現であった。ＳＧＣＢの発現がすべての治療対象においてベースラインを５０％以上上回っている場合、投薬量の増加はしない。ＳＧＣＢの発現がすべての治療対象で５０％未満の場合、コホート２およびプラセボ対象の用量を、２ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇに増加する。可能であれば、治療から２年後の生検は、ベースライン生検と同じ筋肉で行われる。すべての生検試料は、コンピューターで生成されたコードを使用して、検査室長によって盲検化され、コード化された。発現の定量化は、筋生検の直接的な免疫蛍光およびウエスタンブロット検査を使用して行われた。Ｂｉｏｑｕａｎｔ（登録商標）自動化ソフトウェアを使用して、ＳＧＣＢを発現する筋線維の数を定量化する。ベースライン患者背景を表５に示す。
【表5】
【0190】
図７は、ベクター投与の８週間後の３名すべての対象の筋肉における強固なＳＧＣＢ発現を示す代表的な画像を提供する。表６は、各対象におけるＳＧＣＢ陽性線維の平均強度およびパーセンテージを提供する。コホート全体の免疫組織化学染色の平均強度は４７％であり、ＳＧＣＢ陽性線維の平均パーセンテージは５１％であった。図８は、ベクター投与の９０日後の３名の対象におけるβ－サルコグリカン発現の検出を示すウエスタンブロットを提供する。ウエスタンブロットのデータは、遺伝子移入が、完全長のβ－サルコグリカンを送達することを示す。ウエスタンブロットによる定量化を表７に提供し、β－サルコグリカンタンパク質の平均発現が正常と比較して約３６．１％増加していることを示している。
【表6】
【表7】
【0191】
集めた筋生検について、リアルタイムの定量的ＰＣＲアッセイ（ｑＰＣＲ）を使用して、試験物品特異的なＤＮＡ配列の存在を調べた。陽性シグナルは、検出されたゲノムＤＮＡ１μｇあたり１００以上の一本鎖ＤＮＡコピーのいずれかである。筋生検では、ＤＮＡ１μｇあたり平均８．４Ｅ＋０４ベクターコピー、および核あたり０．６コピーが検出された。
【0192】
各対象におけるサルコグリカン複合体の存在も調査された。ウエスタンブロットによって決定されたように、平均マイクロジストロフィン発現は、正常の３６％であった（ｎ＝３）。加えて、アルファ－サルコグリカンの発現は、免疫組織化学によって定量化された。図９は、対象におけるベータ－サルコグリカンの発現が、アルファ－サルコグリカンの発現によって示されるように、サルコグリカン複合体を上方制御したことを示す。
【0193】
対象の血中のクレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルを試験した。表９に示すように、対象のＣＫレベルは平均で約８２％減少した。
【表9】
【0194】
実施例６
β－サルコグリカン遺伝子移入は、膜に対するサルコグリカン複合体を回復させる。
ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢにより治療すると、膜に対するサルコグリカン複合体が回復した（図１０）。図１０は、試験中の患者の膜でのβ－サルコグリカン、α－サルコグリカンの発現の回復、ならびにβ－サルコグリカンおよびα－サルコグリカンの療法の共局在化を示す。β－サルコグリカンとα－サルコグリカンの共局在化は、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢがサルコグリカン複合体を回復させたことを示す。
β－サルコグリカン遺伝子移入は、膜に対するサルコグリカン複合体を回復させる。
ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢにより治療すると、膜に対するサルコグリカン複合体が回復した（図１０）。図１０は、試験中の患者の膜でのβ－サルコグリカン、α－サルコグリカンの発現の回復、ならびにβ－サルコグリカンおよびα－サルコグリカンの療法の共局在化を示す。β－サルコグリカンとα－サルコグリカンの共局在化は、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢがサルコグリカン複合体を回復させたことを示す。
【0195】
実施例７
β－サルコグリカン遺伝子移入で治療されたＬＧＭＤ２Ｅ患者は、投与後３ヶ月目の１００メートル時間試験で改善した。
ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢによる治療は、遺伝子移入からわずか３ヶ月間で、１００メートル時間試験で明らかな改善を患者にもたらした（図１１）。１００メートル時間試験などの時間歩行試験を使用して、筋ジストロフィーを有する対象において機能を測定する。この研究の試験は、治療後の患者のパフォーマンスと比較した、患者のベースラインパフォーマンスを測定した。図１１は、遺伝子移入後の最初の３ヶ月間にわたる３名の対象のベースラインからの平均変化率を示す。このデータは、３ヶ月後にベースラインを超えて１５％を超える平均増加があったことを示しており、β－サルコグリカン遺伝子移入後の運動機能の改善を示している。
β－サルコグリカン遺伝子移入で治療されたＬＧＭＤ２Ｅ患者は、投与後３ヶ月目の１００メートル時間試験で改善した。
ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢによる治療は、遺伝子移入からわずか３ヶ月間で、１００メートル時間試験で明らかな改善を患者にもたらした（図１１）。１００メートル時間試験などの時間歩行試験を使用して、筋ジストロフィーを有する対象において機能を測定する。この研究の試験は、治療後の患者のパフォーマンスと比較した、患者のベースラインパフォーマンスを測定した。図１１は、遺伝子移入後の最初の３ヶ月間にわたる３名の対象のベースラインからの平均変化率を示す。このデータは、３ヶ月後にベースラインを超えて１５％を超える平均増加があったことを示しており、β－サルコグリカン遺伝子移入後の運動機能の改善を示している。
【0196】
実施例８
β－サルコグリカン遺伝子移入で治療されたＬＧＭＤ２Ｅ患者は、投与後９ヶ月で改善された機能測定値を示した。
ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢによる治療は、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの全身投与の９ヶ月後に、明らかな改善を患者にもたらした。３名の患者が、機能試験に参加した。例えば、１００ｍ時間試験では、ベースライン（投与前）で、１名の患者は、１００ｍを走ったときに臀部の伸びおよび屈曲に制限があった。しかし、投与後９ヶ月では、同じ患者が、走ったときに臀部の伸びおよび屈曲が改善され、速度が速くなったことが示された。加えて、トランクコントロール試験では、別の患者は、投与から９ヶ月後に、起き上がるまでの時間の試験で改善を示した。ベースライン時または投与前に、この対象は、トランクコントロールが不良であったが、これも投与から９ヶ月後に改善された。また、座位試験では、患者は、座位から立ち上がるように求められた。例えば、残りの患者は、投与前と比較して、投与から９ヶ月後に、起床時間が短縮された。これらのデータを表１０にまとめている。
β－サルコグリカン遺伝子移入で治療されたＬＧＭＤ２Ｅ患者は、投与後９ヶ月で改善された機能測定値を示した。
ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢによる治療は、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの全身投与の９ヶ月後に、明らかな改善を患者にもたらした。３名の患者が、機能試験に参加した。例えば、１００ｍ時間試験では、ベースライン（投与前）で、１名の患者は、１００ｍを走ったときに臀部の伸びおよび屈曲に制限があった。しかし、投与後９ヶ月では、同じ患者が、走ったときに臀部の伸びおよび屈曲が改善され、速度が速くなったことが示された。加えて、トランクコントロール試験では、別の患者は、投与から９ヶ月後に、起き上がるまでの時間の試験で改善を示した。ベースライン時または投与前に、この対象は、トランクコントロールが不良であったが、これも投与から９ヶ月後に改善された。また、座位試験では、患者は、座位から立ち上がるように求められた。例えば、残りの患者は、投与前と比較して、投与から９ヶ月後に、起床時間が短縮された。これらのデータを表１０にまとめている。
【表10】
【0197】
年齢を一致させた自然な成長経過の試験は、未治療対象（自然な成長経過の対象と示される、表１１を参照）およびｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを投与された対象について、ＮＳＡＤにおいてベースラインからの変化を比較し、本明細書では、「肢帯型筋ジストロフィーのノーススター評価」と示される。図１２Ａ～Ｃに示すように、自然な成長経過の対象は、２００日間にわたってＮＳＡＤの変化が安定して減少したが、一方、治療を受けた対象は、２７０日間にわたってＮＳＡＤの変化の安定した改善を示し（図１２Ａおよび１２Ｃ）、一方、治療を受けた対象は、２７０日間にわたってＮＳＡＤの変化の安定した改善を示した（図１２Ｂ）。
【表11】
【0198】
実施例９
製剤
ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、２００ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、および０．００１％ポロキサマー１８８を含有する緩衝液中で製剤化される。一実施形態では、製剤の情報は、表１２にまとめられている。
製剤
ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、２００ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、および０．００１％ポロキサマー１８８を含有する緩衝液中で製剤化される。一実施形態では、製剤の情報は、表１２にまとめられている。
【表12】
【0199】
医薬製品は、－６０℃以下の温度で凍結液として保存される。凍結した医薬製品は、臨床投与の前に解凍されなければならない。
【0200】
ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢは、－６０℃以下の温度で保存され、この温度では、この物質は、長期保管条件で安定である。ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢバイアルは、室温（２０℃～２５℃）で解凍される。解凍したベクターバイアルをアルコールで拭き、バイオセーフティキャビネットに入れる。ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ製剤は、無菌条件下、クラスＩＩバイオセーフティキャビネット内で無菌的に調製される。
【0201】
静脈内（ＩＶ）注入用のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢは、バイアル（バイアルあたり２ｍＬ）で供給される。総ｖｇ用量は、患者の体重に基づいて計算される。バイアルの適切な数は、５×１０１３ｖｇ／ｋｇまたは２×１０１４ｖｇ／ｋｇの相当量で、および２×１０１３ｖｇ／ｍＬ、５×１０１３ｖｇ／ｍＬ、または４×１０１３ｖｇ／ｍｌのｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢロットについての製品力価で、体重に基づいて各患者について決定される。
【0202】
ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢは、１回のＩＶ注入として投与され、シリンジポンプを介し、末梢四肢静脈におよそ１～２時間かけて送達される。
【0203】
実施例１０
高齢患者および持続性
ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを介する遺伝子置換は、ＬＧＭＤ－２Ｅおよび他の関連疾患の治療において肯定的な結果を示している。この研究は、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢが、より重大な影響を受けた古い筋肉を治療する能力と、ＡＡＶウイルスベクターの長期間持続性を試験するためのものである。まず、長期間持続性試験のために、４週齢のｓｇｃｂ－／－マウスを、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢで全身治療した。治療から２４ヶ月より後で、形質導入されたすべての筋肉で、高レベルのベクターゲノムコピー数がＰＣＲにより検出された。さらに、治療された筋肉の免疫蛍光染色は、以前の時間点と比較して、すべての筋肉においてタンパク質発現レベルの減少を示さず（９５％を超える）、ｈＳＧＣＢタンパク質は、まくに正しく局在化したままであった。
高齢患者および持続性
ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを介する遺伝子置換は、ＬＧＭＤ－２Ｅおよび他の関連疾患の治療において肯定的な結果を示している。この研究は、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢが、より重大な影響を受けた古い筋肉を治療する能力と、ＡＡＶウイルスベクターの長期間持続性を試験するためのものである。まず、長期間持続性試験のために、４週齢のｓｇｃｂ－／－マウスを、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢで全身治療した。治療から２４ヶ月より後で、形質導入されたすべての筋肉で、高レベルのベクターゲノムコピー数がＰＣＲにより検出された。さらに、治療された筋肉の免疫蛍光染色は、以前の時間点と比較して、すべての筋肉においてタンパク質発現レベルの減少を示さず（９５％を超える）、ｈＳＧＣＢタンパク質は、まくに正しく局在化したままであった。
【0204】
第２に、ＬＧＭＤ２Ｅ（β－サルコグリカン）のマウスモデルを、より高齢で（例えば、１２ヶ月）、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢベクターの全身送達により治療する。治療から６ヶ月後のエンドポイントで、これらのマウス由来の筋肉を、タンパク質発現、組織学的救済、および機能改善について評価する。特に、横隔膜および心臓を含め、下肢、上肢、および近位胴体の筋肉全体にわたり、筋肉における遺伝子発現が観察される。さらに、線維症のレベルを、未治療対照と比較する。さらに、機能研究には、前脛骨筋（ＴＡ）および横隔膜（ＤＩＡ）の筋肉の力出力、およびＴＡ筋肉の収縮により誘発される損傷に対する抵抗の評価が含まれる。
【0205】
本開示は特定の実施形態といった点で記載された一方、その変更および修正が生じることが当業者に理解されるだろう。したがって、特許請求の範囲内に見られるようなこのような制限のみが本開示に課せられるべきである。
【0206】
本出願で参照される全ての文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
参考文献：
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１０ Ｍｅｌａｃｉｎｉ Ｐ，Ｆａｎｉｎ Ｍ，Ｄｕｇｇａｎ ＤＪ，Ｆｒｅｄａ ＭＰ，Ｂｅｒａｒｄｉｎｅｌｌｉ Ａ，Ｄａｎｉｅｌｉ ＧＡ ｅｔ ａｌ．Ｈｅａｒｔ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓ ｄｕｅ ｔｏ ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ １９９９；２２：４７３－４７９．
１１ Ｎａｒａｙａｎａｓｗａｍｉ Ｐ，Ｗｅｉｓｓ Ｍ，Ｓｅｌｃｅｎ Ｄ，Ｄａｖｉｄ Ｗ，Ｒａｙｎｏｒ Ｅ，Ｃａｒｔｅｒ Ｇ ｅｔ ａｌ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｓｕｍｍａｒｙ：ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｌｉｍｂ－ｇｉｒｄｌｅ ａｎｄ ｄｉｓｔａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓ：ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｉｓｓｕｅｓ ｒｅｖｉｅｗ ｐａｎｅｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ＆ Ｅｌｅｃｔｒｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１４；８３：１４５３－１４６３．
１２ Ｗｏｎｇ－Ｋｉｓｉｅｌ ＬＣ，Ｋｕｎｔｚ ＮＬ．Ｔｗｏ ｓｉｂｌｉｎｇｓ ｗｉｔｈ ｌｉｍｂ－ｇｉｒｄｌｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｔｙｐｅ
２Ｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｔｏ ｄｅｆｌａｚａｃｏｒｔ．Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃ Ｄｉｓｏｒｄ ２０１０；２０：１２２－１２４．
１３ Ｂａｒｒｅｓｉ Ｒ，Ｄｉ Ｂｌａｓｉ Ｃ，Ｎｅｇｒｉ Ｔ，Ｂｒｕｇｎｏｎｉ
Ｒ，Ｖｉｔａｌｉ Ａ，Ｆｅｌｉｓａｒｉ Ｇ ｅｔ ａｌ．Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｒｔ ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ｓｅｖｅｒｅ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｂｅｔａ ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ ２０００；３７：１０２－１０７．１４ Ｇｉｂｅｒｔｉｎｉ Ｓ，Ｚａｎｏｔｔｉ Ｓ，Ｓａｖａｄｏｒｉ Ｐ，Ｃｕｒｃｉｏ Ｍ，Ｓａｒｅｄｉ Ｓ，Ｓａｌｅｒｎｏ Ｆ ｅｔ ａｌ．Ｆｉｂｒｏｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｒｅ ｇｒｅａｔｅｒ ｉｎ ｍｕｓｃｌｅｓ ｏｆ ｂｅｔａ－ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ－ｎｕｌｌ ｍｏｕｓｅ ｔｈａｎ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ．Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ ２０１４；３５６：４２７－４４３．
１５ ＭｃＣａｒｔｙ ＤＭ，Ｆｕ Ｈ，Ｍｏｎａｈａｎ ＰＥ，Ｔｏｕｌｓｏｎ ＣＥ，Ｎａｉｋ Ｐ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ．Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ （ＴＲ）ｍｕｔａｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｏ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｔｈｅ ｒａｔｅ－ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｓｔｅｐ ｔｏ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００３；１０：２１１２－２１１８．
１６ ＭｃＣａｒｔｙ ＤＭ，Ｍｏｎａｈａｎ ＰＥ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ．Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００１；８：１２４８－１２５４．
１７ Ｃｈｉｃｏｉｎｅ ＬＧ，Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ＬＲ，Ｓｈａｏ Ｇ，Ｘｕ Ｒ，Ｂｒｅｍｅｒ ＷＧ，Ｃａｍｂｏｎｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ＧＡＬＧＴ２ ｔｏ ｔｈｅ ｇａｓｔｒｏｃｎｅｍｉｕｓ ｍｕｓｃｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ
ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ
ａｎｄ ｌａｍｉｎｉｎ ａｌｐｈａ２ ｓｕｒｒｏｇａｔｅｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１４；２２：７１３－７２４．
１８ Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ＬＲ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ ＣＬ，Ｂｒｅｍｅｒ
ＷＧ，Ｓｈｏｎｔｚ ＫＭ，Ｍａｌｉｋ Ｖ，Ｄａｖｉｓ Ｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＦＬＡＧ－ｔａｇｇｅｄ ｍｉｃｒｏ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｉｎ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ
ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌ
Ｔｈｅｒ ２０１０；１８：１０９－１１７．
１９ Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ＬＲ，Ｊａｎｓｓｅｎ ＰＭ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ ＣＬ，Ｃｏｌｅｙ ＢＤ，Ｃｈｉｃｏｉｎｅ ＬＧ，Ｃｌａｒｋ ＫＲ ｅｔ ａｌ．Ａ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｌｉｍｂ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｈｉｇｈ ｖｏｌｕｍｅ ｏｒ ｈｉｇｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２００７；５：４５．
２０ Ｗａｎｇ Ｂ，Ｌｉ Ｊ，Ｆｕ ＦＨ，Ｃｈｅｎ Ｃ，Ｚｈｕ Ｘ，Ｚｈｏｕ Ｌ
ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｐａｃｔ ｍｕｓｃｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｆｏｒ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００８；１５：１４８９－１４９９．
２１ Ｃｈｉｃｏｉｎｅ ＬＧ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ ＣＬ，Ｂｒｅｍｅｒ ＷＧ，Ｓｈｏｎｔｚ ＫＭ，Ｇｒｉｆｆｉｎ ＤＡ，Ｈｅｌｌｅｒ ＫＮ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｓｍａｐｈｅｒｅｓｉｓ ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ ｔｈｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ＡＡＶ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｎ ｍｉｃｒｏ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１４；２２：３３８－３４７．
２２ Ｍａｔｓｕｄａ Ｒ，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ Ａ，Ｔａｎａｋａ Ｈ．Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｍｕｓｃｌｅ ｆｉｂｅｒｓ ｉｎ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ ｂｙ ｖｉｔａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｅｖａｎｓ ｂｌｕｅ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｓｃｌｅ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９５；１１８：９５９－９６４．
２３ Ｓｔｒａｕｂ Ｖ，Ｒａｆａｅｌ ＪＡ，Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ ＪＳ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＫＰ．Ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｓｈｏｗ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９７；１３９：３７５－３８５．
２４ Ｍｅｎｄｅｌｌ ＪＲ，Ｓａｈｅｎｋ Ｚ，Ｍａｌｉｋ Ｖ，Ｇｏｍｅｚ ＡＭ，Ｆｌａｎｉｇａｎ ＫＭ，Ｌｏｗｅｓ ＬＰ ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｈａｓｅ １／２ａ ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｔｒｉａｌ ｆｏｒ ｂｅｃｋｅｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１５；２３：１９２－２０１．
２５ Ｄｒｅｓｓｍａｎ Ｄ，Ａｒａｉｓｈｉ Ｋ，Ｉｍａｍｕｒａ Ｍ，Ｓａｓａｏｋａ Ｔ，Ｌｉｕ ＬＡ，Ｅｎｇｖａｌｌ Ｅ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｌｐｈａ－ａｎｄ ｂｅｔａ－ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ：ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｅｓｃｕｅ
ｏｆ ｍｕｓｃｌｅ，ｂｕｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｈｕｍ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００２；１３：１６３１－１６４６．
２６ Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ＬＲ，Ｌｅｅ ＪＳ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＲＣ，Ｃｌａｒｋ ＫＲ，Ｍｅｎｄｅｌｌ ＪＲ．Ｌａｃｋ ｏｆ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｌｐｈａ－ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｕｐｐｏｒｔｓ
ｃｌｉｎｉｃａｌ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｒｉａｌ ｉｎ ＬＧＭＤ２Ｄ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００８；７１：２４０－２４７．
２７ Ｓｈｉｅｌｄ ＭＡ，Ｈａｕｇｅｎ ＨＳ，Ｃｌｅｇｇ ＣＨ，Ｈａｕｓｃｈｋａ
ＳＤ．Ｅ－ｂｏｘ ｓｉｔｅｓ ａｎｄ ａ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｒｅｇ－ｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｓｃｌｅ ｃｒｅａｔｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｅｘｐｒｅｓ￢ｓｉｏｎ
ｉｎ ｄｉｖｅｒｓｅ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅｓ ａｎｄ ｃａｒｄｉａｃ
ｍｕｓｃｌｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ
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２８ Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ＪＥ，Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｆ，Ｌｉ Ｃ，Ｃｏｎｒａｔｈ Ｈ，Ｘｉａｏ Ｗ，Ｘｉａｏ Ｘ ｅｔ ａｌ．Ｃｒｏｓｓ－ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｏｆ
ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ （ＡＡＶ）ｔｙｐｅ ２ ｖｅｃｔｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｉｎｔｏ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＡＡＶ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｂｒｏａｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００２；７６：７９１－８０１．
２９ Ｇｒｉｅｇｅｒ ＪＣ，Ｃｈｏｉ ＶＷ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２００６；１：１４１２－１４２８．
３０ Ｃｌａｒｋ ＫＲ，Ｌｉｕ Ｘ，ＭｃＧｒａｔｈ ＪＰ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＰＲ．Ｈｉｇｈｌｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｒｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｆｒｅｅ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｈｅｌｐｅｒ ａｎｄ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９９９；１０：１０３１－１０３９．
３１ Ｌｉｕ Ｍ，Ｙｕｅ Ｙ，Ｈａｒｐｅｒ ＳＱ，Ｇｒａｎｇｅ ＲＷ，Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ ＪＳ，Ｄｕａｎ Ｄ．Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｙｏｕｎｇ ｍｄｘ ｍｕｓｃｌｅ ｆｒｏｍ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｊｕｒｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００５；１１：２４５－２５６．
３２ Ｈａｋｉｍ ＣＨ，Ｇｒａｎｇｅ ＲＷ，Ｄｕａｎ Ｄ．Ｔｈｅ ｐａｓｓｉｖｅ
ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｅｎｓｏｒ ｄｉｇｉｔｏｒｕｍ ｌｏｎｇｕｓ ｍｕｓｃｌｅ ａｒｅ ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ ｉｎ ２－ｔｏ ２０－ｍｏ－ｏｌｄ ｍｄｘ ｍｉｃｅ．Ｊ Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ
２０１１；１１０：１６５６－１６６３．
３３ Ｗｅｉｎ Ｎ，Ｖｕｌｉｎ Ａ，Ｆａｌｚａｒａｎｏ ＭＳ，Ｓｚｉｇｙａｒｔｏ
ＣＡ，Ｍａｉｔｉ Ｂ，Ｆｉｎｄｌａｙ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａ ＤＭＤ ｅｘｏｎ ５ ＩＲＥＳ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｉｓｏｆｏｒｍ ｔｈａｔ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎｏｐａｔｈｙ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０１４；２０：９９２－１０００．
参考文献：
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２ Ｍｏｏｒｅ ＳＡ，Ｓｈｉｌｌｉｎｇ ＣＪ，Ｗｅｓｔｒａ Ｓ，Ｗａｌｌ Ｃ，Ｗｉｃｋｌｕｎｄ ＭＰ，Ｓｔｏｌｌｅ Ｃ ｅｔ ａｌ．Ｌｉｍｂ－ｇｉｒｄｌｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ ２００６；６５：９９５－１００３．３ Ａｒａｉｓｈｉ Ｋ，Ｓａｓａｏｋａ Ｔ，Ｉｍａｍｕｒａ Ｍ，Ｎｏｇｕｃｈｉ Ｓ，Ｈａｍａ Ｈ，Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ Ｅ ｅｔ ａｌ．Ｌｏｓｓ ｏｆ ｔｈｅ
ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ｓａｒｃｏｓｐａｎ ｌｅａｄｓ
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５ Ｂｏｎｎｅｍａｎｎ ＣＧ，Ｐａｓｓｏｓ－Ｂｕｅｎｏ ＭＲ，ＭｃＮａｌｌｙ ＥＭ，Ｖａｉｎｚｏｆ Ｍ，ｄｅ Ｓａ Ｍｏｒｅｉｒａ Ｅ，Ｍａｒｉｅ ＳＫ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｂｅｔａ－ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ｍｉｓｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｍａｙ ｃａｕｓｅ ｓｅｖｅｒｅ ｌｉｍｂ－ｇｉｒｄｌｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｔｙｐｅ ２Ｅ（ＬＧＭＤ ２Ｅ）．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １９９６；５：１９５３－１９６１．
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８ Ｆａｎｉｎ Ｍ，Ｍｅｌａｃｉｎｉ Ｐ，Ｂｏｉｔｏ Ｃ，Ｐｅｇｏｒａｒｏ Ｅ，Ａｎｇｅｌｉｎｉ Ｃ．ＬＧＭＤ２Ｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｒｉｓｋ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｄｉｌａｔｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ．Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃ Ｄｉｓｏｒｄ ２００３；１３：３０３－３０９．
９ Ｓｖｅｅｎ ＭＬ，Ｔｈｕｎｅ ＪＪ，Ｋｏｂｅｒ Ｌ，Ｖｉｓｓｉｎｇ Ｊ．Ｃａｒｄｉａｃ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｌｉｍｂ－ｇｉｒｄｌｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｔｙｐｅ ２ ａｎｄ Ｂｅｃｋｅｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ ２００８；６５：１１９６－１２０１．
１０ Ｍｅｌａｃｉｎｉ Ｐ，Ｆａｎｉｎ Ｍ，Ｄｕｇｇａｎ ＤＪ，Ｆｒｅｄａ ＭＰ，Ｂｅｒａｒｄｉｎｅｌｌｉ Ａ，Ｄａｎｉｅｌｉ ＧＡ ｅｔ ａｌ．Ｈｅａｒｔ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓ ｄｕｅ ｔｏ ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ １９９９；２２：４７３－４７９．
１１ Ｎａｒａｙａｎａｓｗａｍｉ Ｐ，Ｗｅｉｓｓ Ｍ，Ｓｅｌｃｅｎ Ｄ，Ｄａｖｉｄ Ｗ，Ｒａｙｎｏｒ Ｅ，Ｃａｒｔｅｒ Ｇ ｅｔ ａｌ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｓｕｍｍａｒｙ：ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｌｉｍｂ－ｇｉｒｄｌｅ ａｎｄ ｄｉｓｔａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓ：ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｉｓｓｕｅｓ ｒｅｖｉｅｗ ｐａｎｅｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ＆ Ｅｌｅｃｔｒｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１４；８３：１４５３－１４６３．
１２ Ｗｏｎｇ－Ｋｉｓｉｅｌ ＬＣ，Ｋｕｎｔｚ ＮＬ．Ｔｗｏ ｓｉｂｌｉｎｇｓ ｗｉｔｈ ｌｉｍｂ－ｇｉｒｄｌｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｔｙｐｅ
２Ｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｔｏ ｄｅｆｌａｚａｃｏｒｔ．Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃ Ｄｉｓｏｒｄ ２０１０；２０：１２２－１２４．
１３ Ｂａｒｒｅｓｉ Ｒ，Ｄｉ Ｂｌａｓｉ Ｃ，Ｎｅｇｒｉ Ｔ，Ｂｒｕｇｎｏｎｉ
Ｒ，Ｖｉｔａｌｉ Ａ，Ｆｅｌｉｓａｒｉ Ｇ ｅｔ ａｌ．Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｒｔ ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ｓｅｖｅｒｅ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｂｅｔａ ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ ２０００；３７：１０２－１０７．１４ Ｇｉｂｅｒｔｉｎｉ Ｓ，Ｚａｎｏｔｔｉ Ｓ，Ｓａｖａｄｏｒｉ Ｐ，Ｃｕｒｃｉｏ Ｍ，Ｓａｒｅｄｉ Ｓ，Ｓａｌｅｒｎｏ Ｆ ｅｔ ａｌ．Ｆｉｂｒｏｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｒｅ ｇｒｅａｔｅｒ ｉｎ ｍｕｓｃｌｅｓ ｏｆ ｂｅｔａ－ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ－ｎｕｌｌ ｍｏｕｓｅ ｔｈａｎ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ．Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ ２０１４；３５６：４２７－４４３．
１５ ＭｃＣａｒｔｙ ＤＭ，Ｆｕ Ｈ，Ｍｏｎａｈａｎ ＰＥ，Ｔｏｕｌｓｏｎ ＣＥ，Ｎａｉｋ Ｐ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ．Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ （ＴＲ）ｍｕｔａｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｏ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｔｈｅ ｒａｔｅ－ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｓｔｅｐ ｔｏ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００３；１０：２１１２－２１１８．
１６ ＭｃＣａｒｔｙ ＤＭ，Ｍｏｎａｈａｎ ＰＥ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ．Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００１；８：１２４８－１２５４．
１７ Ｃｈｉｃｏｉｎｅ ＬＧ，Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ＬＲ，Ｓｈａｏ Ｇ，Ｘｕ Ｒ，Ｂｒｅｍｅｒ ＷＧ，Ｃａｍｂｏｎｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ＧＡＬＧＴ２ ｔｏ ｔｈｅ ｇａｓｔｒｏｃｎｅｍｉｕｓ ｍｕｓｃｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ
ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ
ａｎｄ ｌａｍｉｎｉｎ ａｌｐｈａ２ ｓｕｒｒｏｇａｔｅｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１４；２２：７１３－７２４．
１８ Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ＬＲ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ ＣＬ，Ｂｒｅｍｅｒ
ＷＧ，Ｓｈｏｎｔｚ ＫＭ，Ｍａｌｉｋ Ｖ，Ｄａｖｉｓ Ｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＦＬＡＧ－ｔａｇｇｅｄ ｍｉｃｒｏ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｉｎ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ
ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌ
Ｔｈｅｒ ２０１０；１８：１０９－１１７．
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２０ Ｗａｎｇ Ｂ，Ｌｉ Ｊ，Ｆｕ ＦＨ，Ｃｈｅｎ Ｃ，Ｚｈｕ Ｘ，Ｚｈｏｕ Ｌ
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２１ Ｃｈｉｃｏｉｎｅ ＬＧ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ ＣＬ，Ｂｒｅｍｅｒ ＷＧ，Ｓｈｏｎｔｚ ＫＭ，Ｇｒｉｆｆｉｎ ＤＡ，Ｈｅｌｌｅｒ ＫＮ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｓｍａｐｈｅｒｅｓｉｓ ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ ｔｈｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ＡＡＶ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｎ ｍｉｃｒｏ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１４；２２：３３８－３４７．
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２３ Ｓｔｒａｕｂ Ｖ，Ｒａｆａｅｌ ＪＡ，Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ ＪＳ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＫＰ．Ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｓｈｏｗ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９７；１３９：３７５－３８５．
２４ Ｍｅｎｄｅｌｌ ＪＲ，Ｓａｈｅｎｋ Ｚ，Ｍａｌｉｋ Ｖ，Ｇｏｍｅｚ ＡＭ，Ｆｌａｎｉｇａｎ ＫＭ，Ｌｏｗｅｓ ＬＰ ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｈａｓｅ １／２ａ ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｔｒｉａｌ ｆｏｒ ｂｅｃｋｅｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１５；２３：１９２－２０１．
２５ Ｄｒｅｓｓｍａｎ Ｄ，Ａｒａｉｓｈｉ Ｋ，Ｉｍａｍｕｒａ Ｍ，Ｓａｓａｏｋａ Ｔ，Ｌｉｕ ＬＡ，Ｅｎｇｖａｌｌ Ｅ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｌｐｈａ－ａｎｄ ｂｅｔａ－ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ：ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｅｓｃｕｅ
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ＳＤ．Ｅ－ｂｏｘ ｓｉｔｅｓ ａｎｄ ａ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｒｅｇ－ｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｓｃｌｅ ｃｒｅａｔｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｅｘｐｒｅｓ￢ｓｉｏｎ
ｉｎ ｄｉｖｅｒｓｅ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅｓ ａｎｄ ｃａｒｄｉａｃ
ｍｕｓｃｌｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ
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２８ Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ＪＥ，Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｆ，Ｌｉ Ｃ，Ｃｏｎｒａｔｈ Ｈ，Ｘｉａｏ Ｗ，Ｘｉａｏ Ｘ ｅｔ ａｌ．Ｃｒｏｓｓ－ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｏｆ
ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ （ＡＡＶ）ｔｙｐｅ ２ ｖｅｃｔｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｉｎｔｏ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＡＡＶ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｂｒｏａｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００２；７６：７９１－８０１．
２９ Ｇｒｉｅｇｅｒ ＪＣ，Ｃｈｏｉ ＶＷ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２００６；１：１４１２－１４２８．
３０ Ｃｌａｒｋ ＫＲ，Ｌｉｕ Ｘ，ＭｃＧｒａｔｈ ＪＰ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＰＲ．Ｈｉｇｈｌｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｒｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｆｒｅｅ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｈｅｌｐｅｒ ａｎｄ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９９９；１０：１０３１－１０３９．
３１ Ｌｉｕ Ｍ，Ｙｕｅ Ｙ，Ｈａｒｐｅｒ ＳＱ，Ｇｒａｎｇｅ ＲＷ，Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ ＪＳ，Ｄｕａｎ Ｄ．Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｙｏｕｎｇ ｍｄｘ ｍｕｓｃｌｅ ｆｒｏｍ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｊｕｒｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００５；１１：２４５－２５６．
３２ Ｈａｋｉｍ ＣＨ，Ｇｒａｎｇｅ ＲＷ，Ｄｕａｎ Ｄ．Ｔｈｅ ｐａｓｓｉｖｅ
ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｅｎｓｏｒ ｄｉｇｉｔｏｒｕｍ ｌｏｎｇｕｓ ｍｕｓｃｌｅ ａｒｅ ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ ｉｎ ２－ｔｏ ２０－ｍｏ－ｏｌｄ ｍｄｘ ｍｉｃｅ．Ｊ Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ
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３３ Ｗｅｉｎ Ｎ，Ｖｕｌｉｎ Ａ，Ｆａｌｚａｒａｎｏ ＭＳ，Ｓｚｉｇｙａｒｔｏ
ＣＡ，Ｍａｉｔｉ Ｂ，Ｆｉｎｄｌａｙ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａ ＤＭＤ ｅｘｏｎ ５ ＩＲＥＳ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｉｓｏｆｏｒｍ ｔｈａｔ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎｏｐａｔｈｙ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０１４；２０：９９２－１０００．
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図13】
【配列表】
【外国語明細書】