特開 2024-133793 Ｏ結合型糖タンパク質及び／または糖ペプチドからＯ結合型糖鎖を効率よく切断し、ピラゾロン標識化する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024133793

(43)【公開日】2024-10-03

(54)【発明の名称】Ｏ結合型糖タンパク質及び／または糖ペプチドからＯ結合型糖鎖を効率よく切断し、ピラゾロン標識化する方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20240926BHJP

   G01N 27/62 20210101ALN20240926BHJP

   C07D 231/22 20060101ALN20240926BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68

G01N27/62 V

C07D231/22 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】3

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023043758

(22)【出願日】2023-03-20

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 令和４年１０月１日に第４１回日本糖質学会年会のポスターにて発表 〔刊行物等〕 令和４年１１月１１日に第９５回日本生化学会大会のポスターにて発表

(71)【出願人】

【識別番号】000173924

【氏名又は名称】公益財団法人野口研究所

(72)【発明者】

【氏名】黒河内 政樹

【テーマコード（参考）】

2G041

2G045

【Ｆターム（参考）】

2G041CA01

2G041EA04

2G041FA12

2G041JA02

2G041JA04

2G045BB01

2G045DA44

2G045FB06

2G045FB07

(57)【要約】

【課題】Ｏ結合型糖鎖が修飾された糖タンパク質及び／または糖ペプチドから効率よくＯ結合型糖鎖を切断し、解析することである。
【解決手段】本発明者は、糖鎖のβ脱離とピラゾロン標識を同時に行う手法を検討した結果、塩基試薬を塩基強度が弱い水酸化リチウムを用いて、反応を開放系にして加熱する事により、溶媒の蒸発が起こる事によって、反応が劇的に進行し、糖鎖誘導体の回収量が向上した。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｏ結合型糖鎖で修飾された糖タンパク質及び／または糖ペプチドを、ピラゾロン誘導体と水酸化リチウムを含む反応溶液中、開放系で加熱する事により、Ｏ結合型糖鎖を糖タンパク質及び糖ペプチドから切断し、標識するための方法。

【請求項2】

反応溶媒が１０～５０ｖ／ｖ％の有機溶媒を含む水との混合溶媒、反応温度が９０～１２０℃であることを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項3】

有機溶媒がメタノールまたはピリジンであることを特徴とする請求項２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｏ結合型糖タンパク質及び／または糖ペプチドからＯ結合型糖鎖の解析方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、生体分子として、糖鎖が注目されている。生体内で、糖鎖は複合糖質として糖タンパク質、糖脂質、遊離糖鎖等で存在しており、細胞間や生体分子の認識、シグナル伝達において非常に重要な役割を果たしている。糖タンパク質の糖鎖は大きくＮ結合型糖鎖とＯ結合型糖鎖に分類される。糖タンパク質からの糖鎖切断手法については、一般的手法としてＮ結合型糖鎖を網羅的に切断できるエンドグリコシダーゼ（ＰＮＧａｓｅＦやグリコペプチダーゼＡ）が用いられている。一方、Ｏ結合型糖鎖は、タンパク質のセリン、スレオニンの側鎖に結合しており、その糖鎖構造はムチン型のコア１型、コア２型、コア３型、コア４型等の様々な種類が存在しており、Ｏ結合型糖鎖を網羅的に切断できる酵素が存在しないことから、一般的には化学反応による糖鎖切断手法が利用されている。

【0003】

この化学反応は、アルカリ溶液を利用したβ脱離反応が用いられているが、糖鎖の切断効率が低い問題と遊離した糖鎖の分解（ピーリング反応）が起きてしまう問題がある。この問題を解決する手段として、遊離した糖を直ちに還元してアルジトールに変換する事でピーリング反応を防ぐ手段がある。こちらは、糖の還元末端側に標識試薬を導入する事が出来ないので、アルジトールの全てのヒドロキシ基をメチル化（完全メチル化）することによって、イオン化能を向上させ、質量分析計で分析する事が一般的であるが、この完全メチル化する条件が非水系である為、特殊な反応装置が必要になり、作業工程に手間がかかるという問題点がある。

【0004】

上記と同様にピーリング反応が起きる前に糖の還元末端側を保護する戦略からアルカリ条件下で還元末端のアルデヒド基を３－メチル－１－フェニル－５－ピラゾロン（ＰＭＰ）で保護するという手法が報告された（非特許文献１）。そして、アミン化合物とピロゾロン誘導体を混合させた状態で反応させる事により糖タンパク質からのＯ結合型糖鎖の切断と遊離した糖鎖の還元末端アルデヒド基へのピラゾロン誘導体の標識化反応を同時に行った手法が報告された（特許文献１）。その後、糖鎖の標識と同時に糖鎖が結合していたアミノ酸部位にピラゾロン誘導体を標識する手法の開発が行われ（特許文献２）、その糖鎖切断の効率を上げたマイクロ波照射装置を用いた手法が報告されている（特許文献３）。そして、またヒドロキシルアミン存在下で塩基性触媒を用いて３７～５０℃、短時間反応する事によって、糖鎖の切断と同時にヒドロキシルアミンを糖の還元末端に導入してピーリング反応を抑制する手法が開発された（特許文献４）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】ＷＯ２０１１－０３８８７４

【特許文献2】特許第６０１３１９７号

【特許文献3】特許第６４９９５８０号

【特許文献4】特開２０２０－７３６７０

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｈｏｎｄａ Ｓ， Ｓｕｚｕｋｉ Ｓ，Ｔａｇａ Ａ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ａｎａｌ， ３０， １６８９－１７１４， ２００３

【非特許文献2】Ｆｕｒｕｋａｗａ Ｊ－ｉ， Ｐｉａｏ Ｊ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ８７， ７５２４－７５２８， ２０１５

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の目的は、Ｏ結合型糖鎖が修飾された糖タンパク質及び／または糖ペプチドから効率よくＯ結合型糖鎖を切断し、標識することである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

糖鎖のβ脱離とピラゾロン標識を効率よく行う手法は、通常、長い反応時間（１０～２４時間）か、特殊なマイクロ波照射装置が必要とされており、汎用装置を用いて短時間で効率よくＯ結合型糖鎖を切断と修飾が可能な手法の報告はされていない。本発明者は、汎用装置を用いて短時間で効率よくＯ結合型糖鎖を切断と修飾が可能な手法について種々検討した結果、塩基試薬を水酸化リチウムにして、反応系を開放系にして加熱する事により、溶媒の蒸発が起こる事によって、Ｏ結合型糖鎖の切断と修飾の反応が収率良く進行し、かつピーリング反応を抑制することにより、ＰＭＰ標識化糖鎖誘導体の回収量が従来法よりも向上する事を見出し、本発明を完成するに到った。

【0009】

すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］Ｏ結合型糖鎖が修飾された糖タンパク質及び／または糖ペプチドをピラゾロン誘導体と水酸化リチウムを含む有機溶媒の混合溶液を加えて、１１０℃で２時間、開放系で加熱する事により、Ｏ結合型糖鎖を切断し、標識するための方法。
［２］前記の溶液を１００～３００ ｍＭ水酸化リチウム、２００～７００ ｍＭピラゾロン誘導体の１０～５０％メタノール水溶液とすることを特徴とする［１］に記載の方法。
［３］前記の溶液を１００～３００ ｍＭ水酸化リチウム、２００～７００ ｍＭピラゾロン誘導体の１０～５０％ピリジン水溶液とすることを特徴とする［１］に記載の方法。

【発明の効果】

【0010】

本発明の方法により、安全かつ安価な試薬と汎用装置の使用によって、ピーリング反応を抑制しつつ、短時間の処理時間で糖タンパク質及び／または糖ペプチドから糖鎖を切断させ、標識化された糖鎖誘導体を回収することが可能である。

【0011】

これによって、バイオ医薬品や細胞等のＯ結合型糖鎖の定量解析が可能となり、バイオ医薬品や細胞のＯ結合型糖鎖の品質管理も可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムを塩基試薬として用いた場合のブタ胃ムチン（ＰＳＭ）のＯ結合型糖鎖のプロファイル（ａ）単位タンパク質当たりの各種糖鎖の回収量（ｐｍｏｌ／μｇ）（ｂ）それぞれの糖鎖割合（％）

【図2】ＭｅＯＨ、ＤＭＡ、ＤＭＳＯ、ピリジンをＰＭＰ試薬の調製溶媒として用いた場合のブタ胃ムチン（ＰＳＭ）のＯ結合型糖鎖の単位タンパク質当たりの各種糖鎖の回収量（ｐｍｏｌ／μｇ）

【図3】ＭｅＯＨをＰＭＰ試薬の調製溶媒として用いた場合の各種反応温度（１００℃、１０５℃、１１０℃、１１５℃、１２０℃）と反応時間（０．５，１，２，３，５時間）のブタ胃ムチン（ＰＳＭ）のＯ結合型糖鎖の１８種類の糖鎖回収量の合計値（ｐｍｏｌ／μｇ）

【図4】ピリジンをＰＭＰ試薬の調製溶媒として用いた場合の各種反応温度（１００℃、１０５℃、１１０℃、１１５℃、１２０℃）と反応時間（０．５，１，２，３，５時間）のブタ胃ムチン（ＰＳＭ）のＯ結合型糖鎖の１８種類の糖鎖回収量の合計値（ｐｍｏｌ／μｇ）

【図5】水酸化ナトリウムを用いた７５℃、１６時間の密閉系の反応条件と、水酸化ナトリウムを用いたマイクロ波照射装置で１２０℃、２時間の密閉系の反応条件、及び水酸化リチウムを用いた１１０℃、２時間の開放系の反応条件におけるブタ胃ムチン（ＰＳＭ）のＯ結合型糖鎖のプロファイル（ａ）単位タンパク質当たりの各種糖鎖の回収量（ｐｍｏｌ／μｇ）（ｂ）それぞれの糖鎖割合（％）

【発明を実施するための形態】

【0013】

以下、本発明を実施する為の形態について詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施する事ができる。
本発明のＯ結合型糖タンパク質及び／または糖ペプチドからＯ結合型糖鎖を効率よく切断し、ピラゾロン標識化する方法は、Ｏ結合型糖鎖が修飾された糖タンパク質及び／または糖ペプチドをピラゾロン誘導体と水酸化リチウムを含む溶液を加えて、１００～１２０℃で１～３時間、開放系で加熱する事により、Ｏ結合型糖鎖を切断し、標識するための方法である。

【0014】

以下に、Ｏ結合型糖鎖がタンパク質から切断され、ピラゾロン誘導体（ＰＭＰ）によって、標識される反応の例を示す。

【化1】

【0015】

本明細書において、「糖タンパク質及び／または糖ペプチド」とは、タンパク質・ペプチドのアミノ酸中にＯ結合型糖鎖が少なくとも１つ以上結合しているタンパク質・ペプチドをいう。本発明に適用可能な糖タンパク質及び／または糖ペプチドは、天然由来であっても、合成したものでも良く、複数の分子の混合物でも良い。

【0016】

本発明においてＯ結合型糖鎖とは、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）残基の側鎖ヒドロキシ基に結合している糖鎖である。

【0017】

本発明では、セリン、スレオニンの側鎖に結合したＯ結合型糖鎖をβ脱離反応をさせる際に、アルカリ金属の水酸化物の中で塩基強度が低い水酸化リチウムを１００～３００ｍＭの濃度と、水酸化リチウムよりも濃度が高いピラゾロン誘導体を混合させ、高温条件下（１００～１２０℃）、短時間（０．５～３時間）、開放系で行う事により、標識化された糖鎖誘導体の回収量を劇的に向上させる事ができる。

【0018】

本発明の方法では、従来のβ脱離反応に使用する塩基強度の高い水酸化ナトリウムを使用するのではなく、塩基強度の低い水酸化リチウムを用いる事で塩基性条件によるピーリング反応を低減させ、糖鎖誘導体の回収量を向上させている。また、反応を開放系にする事で溶媒が蒸発し、反応系内の塩基濃度、ピラゾロン誘導体の試薬濃度が向上する事によって、反応が加速され、糖鎖誘導体の回収量を向上させていると考える。

【0019】

本発明による糖鎖誘導体の解析手法は、高速液体クロマトグラフィーを用いて行う事が出来、質量分析計（ＭＳ）や紫外線吸光度系（ＵＶ）などの検出器を用いる事ができる。

【0020】

本発明の方法では、汎用装置であるアルミブロック型恒温槽で行える為、同時に多くの試料を短時間に効率よく処理する事が出来る為、迅速かつ多検体を分析する場合に非常に効果を発揮する事ができる。また、本発明の方法では、糖鎖誘導体の回収量を向上させている為、他の手法よりも高感度に糖鎖誘導体の解析を行う事ができ、糖鎖の構造解析や定量分析をより向上させることができる。

【実施例0021】

以下に本発明の実施例を挙けるが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞ Ｏ結合型糖鎖誘導体の回収量に塩基強度が低い水酸化リチウムが与える影響について検討した。

【0022】

ブタ胃ムチン（ＰＳＭ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｔ１７７８，２０ｍｇ／ｍＬ，２５μＬ）に０．６Ｍ 水酸化リチウム（５０μＬ）と５００ｍＭ ３－メチル－１－フェニル－５－ピラゾロン（ＰＭＰ）のメタノール溶液（７５μＬ）を加え、アルミブロック型恒温槽を用いて１２０℃、開放系で２時間反応させた。その後、内部標準として１．２５μＭＧＮ４－ＰＭＰ２誘導体（５００μＬ）を加え、４Ｍの酢酸水溶液（７.５μＬ）を加えて、水－クロロホルムの分液操作を行い、水相をクロロホルム（５００μＬ）で３回洗浄した。その溶液（ＰＳＭ４μｇ相当分）をＬＣ－ＥＳＩ ＭＳに導入して、解析した。ＬＣ－ＥＳＩ ＭＳの測定条件は、Ｚｏｒｂａｘ Ｅｘｔｅｎｄ−Ｃ１８ １．０×１５０ｍｍ カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を繋げたＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製ＬＣ−ＥＳＩ ＭＳ装置（Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００＋ＶｅｌｏｓＰｒｏ）を用いてｎｅｇａｔｉｖｅモードでＭＳ測定、ＭＳ／ＭＳ測定を行い、Ｏ結合型糖鎖の誘導体を観測した。ＬＣの溶出条件は流速：５０μｌ／ｍｉｎで、Ａ液：２０ｍＭ ギ酸アンモニウム、Ｂ液：０．１％ギ酸水溶液、Ｃ液：アセトニトリルの３液を使用した系で、０－１ｍｉｎ：Ａ１００％，１－３ｍｉｎ：Ｃ１５％，Ｂ８５％，３－１８ｍｉｎ：Ｃ１５－３０％，Ｂ８５－７０％，１８－２０ｍｉｎ：Ｃ３０－８０％，Ｂ７０－２０％，２０－２５ｍｉｎ：Ａ１００％を１測定のメソッドとした。その結果、ＰＳＭ由来のＯ結合型糖鎖が、Ｈｅｘ１の構成糖である糖鎖誘導体として、ｍ／ｚ：５０９、ＨｅｘＮＡｃ１の構成糖である糖鎖誘導体として、ｍ／ｚ：５５０、Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１の構成糖である糖鎖誘導体としてｍ／ｚ：７１２、Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１ｄＨｅｘ１の構成糖である糖鎖誘導体としてｍ／ｚ：８５８、Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ２の構成糖である糖鎖誘導体としてｍ／ｚ：９１５、Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１ＮｅｕＡｃ１の構成糖である糖鎖誘導体としてｍ／ｚ：１００３．４、Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ２ｄＨｅｘ１の構成糖である糖鎖誘導体としてｍ／ｚ：１０６１、Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ２の構成糖である糖鎖誘導体としてｍ／ｚ：１０７７、Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ３の構成糖である糖鎖誘導体としてｍ／ｚ：１１１８、Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ２ｄＨｅｘ１＋ＳＯ３の構成糖である糖鎖誘導体としてｍ／ｚ：１１４１、Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ２ＮｅｕＡｃ１の構成糖である糖鎖誘導体としてｍ／ｚ：１２０６、Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ２ｄＨｅｘ１の構成糖である糖鎖誘導体としてｍ／ｚ：１２２３、Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ１の構成糖である糖鎖誘導体としてｍ／ｚ：１２６４、Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ３の構成糖である糖鎖誘導体としてｍ／ｚ：１２８０、Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ４の構成糖である糖鎖誘導体としてｍ／ｚ：１３２１、Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ２ｄＨｅｘ２の構成糖である糖鎖誘導体としてｍ／ｚ：１３６９、Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ１の構成糖である糖鎖誘導体としてｍ／ｚ：１４２６、Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ４の構成糖である糖鎖誘導体としてｍ／ｚ：１４８３の１８種類の糖鎖誘導体が検出され、また内部標準として加えたＧＮ４－ＰＭＰ２誘導体がｍ／ｚ：１１１５９に検出された。このように、得られた糖鎖誘導体のイオン量をモル量に変換して、内部標準で補正する事によって、回収された糖鎖誘導体の量をタンパク質当たりに換算して算出した。それぞれの試料はｎ＝３で行った。また、１８種類の糖鎖を１００％として、それぞれの糖鎖割合を算出した。

【0023】

＜比較例１＞ 塩基試薬として塩基強度が高い水酸化ナトリウムもしくは水酸化カリウムを用いた場合の検討を行った。
ブタ胃ムチン（ＰＳＭ，２０ｍｇ／ｍＬ，２５μＬ）に０．６Ｍ 水酸化ナトリウムもしくは水酸化カリウム（５０μＬ）と５００ｍＭ ＰＭＰのメタノール溶液（７５μＬ）を加え、アルミブロック型恒温槽を用いて１２０℃、開放系で２時間反応させた。反応後の処理と解析は、上記の手法と同様である。

【0024】

塩基試薬として水酸化リチウム、水酸化ナトリウムと水酸化カリウムを用いた反応系を比較した結果、水酸化リチウムで反応を行った系が一番糖鎖誘導体の回収量が多い事が分かり、塩基強度が高くなるにつれて回収量が悪くなっていた。また、糖鎖割合を比較するとピーリング反応による糖鎖分解物であるｍ／ｚ：５５０，７１２であらわされる糖鎖が塩基強度の強い水酸化ナトリウムと水酸化カリウムで増えている事が分かった。

【0025】

これにより、水酸化リチウムが糖鎖回収量の向上に適した塩基試薬であると分かった（（図１参照）。

【0026】

＜実施例２＞ Ｏ結合型糖鎖誘導体の回収量に有機溶媒の与える影響について検討した。
ブタ胃ムチン（ＰＳＭ，２０ｍｇ／ｍＬ，２５μＬ）に０．６Ｍ 水酸化リチウム（５０μＬ）と５００ｍＭ ＰＭＰのメタノール（ＭｅＯＨ）溶液（７５μＬ）もしくは７５０ｍＭ ＰＭＰのＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）溶液（５０μＬ）もしくは７５０ｍＭ ＰＭＰのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液（５０μＬ）もしくは７５０ｍＭ ＰＭＰのピリジン溶液（５０μＬ）を加え、アルミブロック型恒温槽を用いて１２０℃、開放系で２時間反応させた。反応後の処理と解析は、上記の手法と同様である。メタノール溶液だけは、ＰＭＰの溶解が５００ｍＭまでなので、モル当量を合わせる為に液量を７５μＬにしている。

【0027】

ＰＭＰ試薬を調製する有機溶媒としてＭｅＯＨ，ＤＭＡ，ＤＭＳＯ，ピリジンを用いた反応系を比較した結果、ＭｅＯＨとピリジンで反応を行った系が糖鎖誘導体の回収量が多い事が分かり、高沸点の有機溶媒であるＤＭＡとＤＭＳＯが反応に向いていないことが分かった。これによって、開放系で素早く溶媒が蒸発するＭｅＯＨとピリジンが糖鎖回収量を向上させるのに適している事が分かった（図２参照）。

【0028】

＜実施例３＞ 混合溶液の有機溶媒にＭｅＯＨを用いた場合のＯ結合型糖鎖誘導体の回収量に反応温度と反応時間の与える影響について検討した。

【0029】

ブタ胃ムチン（ＰＳＭ，２０ｍｇ／ｍＬ，２５μＬ）に０．６Ｍ 水酸化リチウム（５０μＬ）と５００ｍＭ ＰＭＰのＭｅＯＨ溶液（７５μＬ）を加え、アルミブロック型恒温槽を用いて１００℃、１０５℃、１１０℃、１１５℃、１２０℃のそれぞれを開放系で０．５，１，２，３，５時間反応させた。反応後の処理と解析は、上記の手法と同様である。そして、１８種類の糖鎖の回収量を算出し、反応時間と反応温度で折れ線グラフを作成した。

【0030】

１８種類の糖鎖回収量に着目した結果、１１０℃２時間反応した試料の糖鎖回収量が一番多かった。これによって、糖鎖切断と糖鎖標識を同時に行うＭｅＯＨ溶媒を用いた反応条件では、１１０℃２時間が適している事が分かった（図３参照）。

【0031】

＜実施例４＞ 混合溶液の有機溶媒にピリジンを用いた場合のＯ結合型糖鎖誘導体の回収量に反応温度と反応時間の与える影響について検討した。

【0032】

ブタ胃ムチン（ＰＳＭ，２０ｍｇ／ｍＬ，２５μＬ）に０．６Ｍ 水酸化リチウム（５０μＬ）と７５０ｍＭ ＰＭＰのピリジン溶液（５０μＬ）を加え、アルミブロック型恒温槽を用いて１００℃、１０５℃、１１０℃、１１５℃、１２０℃のそれぞれを開放系で０．５，１，２，３，５時間反応させた。反応後の処理と解析は、上記の手法と同様である。そして、１８種類の糖鎖の回収量を算出し、反応時間と反応温度で折れ線グラフを作成した。

【0033】

１８種類の糖鎖回収量に着目した結果、１１０℃２時間反応した試料の糖鎖回収量が一番多かった。これによって、糖鎖切断と糖鎖標識を同時に行うピリジン溶媒を用いた反応条件では、１１０℃２時間が適している事が分かった（図４参照）。

【0034】

＜実施例５＞ 他の反応条件と開放系１１０℃２時間の反応条件の糖鎖回収量の比較を行う。

【0035】

ブタ胃ムチン（ＰＳＭ，２０ｍｇ／ｍＬ，７５μＬ）に０．６Ｍ 水酸化リチウム（１５０μＬ）と５００ｍＭ ＰＭＰのメタノールピリジン溶液（２２５μＬ）を加え、アルミブロック型恒温槽を用いて１２０℃、開放系で２時間反応させた。その後、内部標準として３．７５μＭＧＮ４－ＰＭＰ２誘導体（５００μＬ）を加え、４Ｍの酢酸水溶液（２０μＬ）を加えて、水－クロロホルムの分液操作を行い、水相をクロロホルム（５００μＬ）で３回洗浄した。反応後の解析は、上記の手法と同様である。

【0036】

＜比較例２＞ 非特許文献２で行われている反応条件で糖鎖回収量を算出した。

【0037】

ブタ胃ムチン（ＰＳＭ，２０ｍｇ／ｍＬ，１００μＬ）に０．４Ｍ 水酸化ナトリウム（２００μＬ）と５００ｍＭ ＰＭＰのメタノール溶液（２００μＬ）を加え、アルミブロック型恒温槽を用いて７５℃、密閉系で１６時間反応させた。その後、内部標準として５μＭＧＮ４－ＰＭＰ２誘導体（５００μＬ）を加え、４Ｍの酢酸水溶液（２０μＬ）を加えて、水－クロロホルムの分液操作を行い、水相をクロロホルム（５００μＬ）で３回洗浄した。反応後の解析は、上記の手法と同様である。

【0038】

＜比較例３＞ 非特許文献３で行われている反応条件で糖鎖回収量を算出した。

【0039】

ブタ胃ムチン（ＰＳＭ，２０ｍｇ／ｍＬ，１００μＬ）に０．４Ｍ 水酸化ナトリウム（２００μＬ）と５００ｍＭ ＰＭＰのメタノール溶液（２００μＬ）を加え、マイクロ波（ＭＷ）照射反応装置（アントンパール社製Ｍｏｎｏｗａｖｅ４００）を用いて１２０℃、密閉系で２時間反応させた。その後、内部標準として５μＭＧＮ４－ＰＭＰ２誘導体（５００μＬ）を加え、４Ｍの酢酸水溶液（２０μＬ）を加えて、水－クロロホルムの分液操作を行い、水相をクロロホルム（５００μＬ）で３回洗浄した。反応後の解析は、上記の手法と同様である。

【0040】

水酸化ナトリウムを用いた７５℃１６時間の密閉系の反応条件と水酸化ナトリウムを用いたＭＷ装置１２０℃２時間の密閉系の反応条件と本発明の水酸化リチウムを用いた１１０℃２時間の開放系の反応条件の糖鎖回収量を比較した結果、１８種類の糖鎖の回収量の合計は、水酸化ナトリウムを用いた７５℃１６時間の密閉系で約１４．２ｐｍｏｌ／μｇ、水酸化ナトリウムを用いたＭＷ装置１２０℃２時間の密閉系で約３４．７ｐｍｏｌ／μｇ、本発明の水酸化リチウムを用いた１１０℃２時間の開放系で約１３１．５ｐｍｏｌ／μｇであるので、本発明の手法の反応条件が一番糖鎖誘導体の回収量が多い事が分かった。

【0041】

非特許文献２によるとＭＷ装置のＭＷ照射の効果よりも温度上昇の効果が高いという事なので、図１によるＮａＯＨの塩基試薬の１２０℃２時間の開放系の糖鎖回収量と図５のＭＷ装置１２０℃２時間の密閉系の糖鎖回収量を比較すると、密閉系と開放系の比較になる。図１によるＮａＯＨの塩基試薬の１２０℃２時間の開放系の１８種類の糖鎖の回収量の合計は、約６８．３ｐｍｏｌ／μｇという事なので、密閉系より開放系で溶媒が蒸発する事による試薬濃度の上昇の影響によって、糖鎖回収量が増えている事が推察される。また、糖鎖割合を比較すると７５℃１６時間の密閉系の反応とＭＷ装置１２０℃２時間の密閉系の反応と１１０℃２時間の開放系の反応によるピーリング反応の糖鎖分解物であるｍ／ｚ：５５０，７１２であらわされる糖鎖の割合はほとんど変わらなかった（図５参照）。

【0042】

これにより、１１０℃２時間の開放系の反応によって、糖鎖回収量が向上していると分かった。

【産業上の利用可能性】

【0043】

本発明は、Ｏ結合型糖タンパク質及び／または糖ペプチドからＯ結合型糖鎖の解析方法に関する。これは、Ｏ結合型糖鎖が結合している糖タンパク質の品質評価やＯ結合型糖鎖が絡むタンパク質の解析などに適用でき、医薬品業界等においても利用可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】