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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024134181
(43)【公開日】2024-10-03
(54)【発明の名称】がんの有機アニオン系輸送体機能画像診断薬
(51)【国際特許分類】
A61K 49/04 20060101AFI20240926BHJP
A61K 31/343 20060101ALI20240926BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240926BHJP
【ＦＩ】
A61K49/04 210
A61K31/343
A61P35/00
【審査請求】未請求
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023044359
(22)【出願日】2023-03-20
(71)【出願人】
【識別番号】504160781
【氏名又は名称】国立大学法人金沢大学
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100151301
【弁理士】
【氏名又は名称】戸崎 富哉
(74)【代理人】
【識別番号】100152308
【弁理士】
【氏名又は名称】中 正道
(74)【代理人】
【識別番号】100201558
【弁理士】
【氏名又は名称】亀井 恵二郎
(72)【発明者】
【氏名】川井 恵一
(72)【発明者】
【氏名】玉井 郁巳
(72)【発明者】
【氏名】小林 正和
(72)【発明者】
【氏名】水谷 明日香
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 翔
【テーマコード（参考）】
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C085HH03
4C085KB18
4C085KB55
4C085LL18
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA06
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA20
4C086ZB26
(57)【要約】 （修正有）
【課題】大腸がん等の早期発見を目的とした新規ながん診断薬等を提供すること。
【解決手段】放射性同位体ヨウ素で標識された２－エチル－３－（４－ヒドロキシベンゾイル）ベンゾフランまたはその薬学的に許容される塩を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】放射性同位体ヨウ素で標識された２－エチル－３－（４－ヒドロキシベンゾイル）ベンゾフランまたはその薬学的に許容される塩を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（Ｉ）
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、同一または異なって、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲンまたはニトロを表し、Ｒ５は、低級アルキルまたはヒドロキシ低級アルキルを表し、Ｒ１０は、水素、または置換若しくは非置換の低級アルキルを表す）で表される３－ベンゾイルベンゾフラン誘導体の同位体標識化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、がん診断薬。
【化1】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、同一または異なって、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲンまたはニトロを表し、Ｒ５は、低級アルキルまたはヒドロキシ低級アルキルを表し、Ｒ１０は、水素、または置換若しくは非置換の低級アルキルを表す）で表される３－ベンゾイルベンゾフラン誘導体の同位体標識化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、がん診断薬。
【請求項2】
Ｒ５が低級アルキルであり、Ｒ１０が水素である、請求項１に記載の診断薬。
【請求項3】
同位体が放射性同位体である、請求項１に記載の診断薬。
【請求項4】
放射性同位体が放射性同位体ヨウ素である、請求項３に記載の診断薬。
【請求項5】
同位体標識化合物が、放射性同位体ヨウ素で標識された２－エチル－３－（４－ヒドロキシベンゾイル）ベンゾフランである、請求項１に記載の診断薬。
【請求項6】
同位体標識化合物が、２－エチル－３－（４－ヒドロキシベンゾイル）ベンゾフランの構造中のヒドロキシ部分以外における１つの水素原子が放射性同位体ヨウ素で標識された化合物である、請求項５に記載の診断薬。
【請求項7】
放射性同位体ヨウ素が１２５Ｉである、請求項６に記載の診断薬。
【請求項8】
がんが有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ）１（ＯＡＴ１）を発現するがんである、請求項１～７のいずれか一項に記載の診断薬。
【請求項9】
がんが大腸がんまたは肺腺がんである、請求項１～７のいずれか一項に記載の診断薬。
【請求項10】
放射性同位体ヨウ素で標識された２－エチル－３－（４－ヒドロキシベンゾイル）ベンゾフランまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項11】
２－エチル－３－（４－ヒドロキシベンゾイル）ベンゾフラン構造中のヒドロキシ部分以外における１つの水素原子が放射性同位体ヨウ素で標識された化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項12】
放射性同位体ヨウ素が１２５Ｉである、請求項１０または１１に記載の２－エチル－３－（４－ヒドロキシベンゾイル）ベンゾフランまたはその薬学的に許容される塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、がん診断薬等に関する。
【背景技術】
【0002】
日本での死因の第１位は悪性新生物（がん）であり、その中で、大腸がんは症状が現れてからではなく、そのはるか前に早期発見することが重要である。大腸がんの早期発見手段としては、便潜血検査を用いた大腸がん検診が主流であるが、便潜血検査では偽陰性となることもあり、大腸がんの早期発見を目的とした新規診断薬の開発は急務である。
【0003】
例えば、陽電子放射断層撮影（Ｐｏｓｉｔｒｏｎ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＰＥＴ））による画像診断用の診断薬として、［メチル－１１Ｃ］メチオニン（Ｍｅｔ）、［１８Ｆ］フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ）、２－アミノ－［３－１１Ｃ］イソ酪酸等が知られており（特許文献１）、Ｍｅｔ、ＦＤＧ等は、臨床用腫瘍核医学画像診断薬としても使用されている（非特許文献１）。
【0004】
２－エチル－３－（４－ヒドロキシベンゾイル）ベンゾフラン（ベンザロン）は、かつて血管障害治療薬として販売されていたが、服用患者において劇症肝炎が発現したことにより販売中止となった。一方で、近年の研究ではベンザロンが大腸がんの治療に利用できるという報告がある。非特許文献２では、大腸がんに取り込まれたベンザロンが、複数のがんにおいて腫瘍形成および進行に関与しているｅｙｅｓ ａｂｓｅｎｔ ｈｏｍｏｌｏｇｓ ａｎｄ ｓｉｎｅ ｏｃｕｌｉｓ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｈｏｍｏｌｏｇｓ（ＥＹＡ－ＳＩＸ）を破壊することを確認している。
【0005】
また、ベンザロン誘導体でもある３－（３，５－ジブロモ－４－ヒドロキシベンゾイル）－２－エチルベンゾフラン（ベンズブロマロン）は、有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ）として知られている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開２０１２－２４６２５５号公報
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｊｉ Ｈｏｏｎ Ｊｕｎｇ， Ｂｙｅｏｎｇ Ｃｈｅｏｌ Ａｈｎ， “Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｆｏｒ Ｐｏｓｉｔｒｏｎ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒｓ”， Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ， ２０１８ Ｏｃｔ； ６（２）： ４７－５３
【非特許文献2】Ｙａｎｇ Ｃ， Ｌｉｕ Ｈ．， “Ｂｏｔｈ ａ ｈｙｐｏｘｉａ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ＥＹＡ３ ａｎｄ ａ ｈｉｓｔｏｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｐ３００ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｓ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｏｆ ＳＩＸ５ ｔｏ ｍｅｄｉａｔｅ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ”， Ａｎｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ， ２０２２ Ｊｕｌｙ； １０（１３）： ７５２
【非特許文献3】Ｔａｎ ＨＬ， Ｔａｎｇ ＬＷＴ， Ｃｈｉｎ ＳＹ， ｅｔ ａｌ．， “Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｃａｎｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｏｒｇａｎｉｃ ａｎｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ３ ｂｙ ｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ ａｎｔｉａｒｒｈｙｔｈｍｉｃ ａｇｅｎｔｓ”， Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ， ２０２１ Ｊｕｎｅ； ３８： １００３９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、大腸がん等の早期発見等を目的とした新規ながん診断薬等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、上記課題に対して鋭意検討した結果、２－エチル－３－（４－ヒドロキシベンゾイル）ベンゾフランを用いることにより、大腸がんおよび肺腺がんを簡便に診断し得ることを見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を進めることによって、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
【0010】
［１］ 式（Ｉ）
【0011】
【化1】
【0012】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、同一または異なって、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲンまたはニトロを表し、Ｒ５は、低級アルキルまたはヒドロキシ低級アルキルを表し、Ｒ１０は、水素、または置換若しくは非置換の低級アルキルを表す）で表される３－ベンゾイルベンゾフラン誘導体の同位体標識化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、がん診断薬。
［２］ Ｒ５が低級アルキルであり、Ｒ１０が水素である、上記［１］に記載の診断薬。
［３］ 同位体が放射性同位体である、上記［１］または［２］に記載の診断薬。
［４］ 放射性同位体が放射性同位体ヨウ素である、上記［３］に記載の診断薬。
［５］ 同位体標識化合物が、放射性同位体ヨウ素で標識された２－エチル－３－（４－ヒドロキシベンゾイル）ベンゾフランである、上記［１］に記載の診断薬。
［６］ 同位体標識化合物が、２－エチル－３－（４－ヒドロキシベンゾイル）ベンゾフランの構造中のヒドロキシ部分以外における１つの水素原子が放射性同位体ヨウ素で標識された化合物である、上記［５］に記載の診断薬。
［７］ 放射性同位体ヨウ素が１２５Ｉである、上記［４］～［６］のいずれかに記載の診断薬。
［８］ がんが有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ）１（ＯＡＴ１）を発現するがんである、上記［１］～［７］のいずれかに記載の診断薬。
［９］ がんが大腸がんまたは肺腺がんである、上記［１］～［７］のいずれかに記載の診断薬。
［１０］ 放射性同位体ヨウ素で標識された２－エチル－３－（４－ヒドロキシベンゾイル）ベンゾフランまたはその薬学的に許容される塩。
［１１］ ２－エチル－３－（４－ヒドロキシベンゾイル）ベンゾフランの構造中のヒドロキシ部分以外における１つの水素原子が放射性同位体ヨウ素で標識された化合物またはその薬学的に許容される塩。
［１２］ 放射性同位体ヨウ素が１２５Ｉである、上記［１０］または［１１］に記載の２－エチル－３－（４－ヒドロキシベンゾイル）ベンゾフランまたはその薬学的に許容される塩。
［２］ Ｒ５が低級アルキルであり、Ｒ１０が水素である、上記［１］に記載の診断薬。
［３］ 同位体が放射性同位体である、上記［１］または［２］に記載の診断薬。
［４］ 放射性同位体が放射性同位体ヨウ素である、上記［３］に記載の診断薬。
［５］ 同位体標識化合物が、放射性同位体ヨウ素で標識された２－エチル－３－（４－ヒドロキシベンゾイル）ベンゾフランである、上記［１］に記載の診断薬。
［６］ 同位体標識化合物が、２－エチル－３－（４－ヒドロキシベンゾイル）ベンゾフランの構造中のヒドロキシ部分以外における１つの水素原子が放射性同位体ヨウ素で標識された化合物である、上記［５］に記載の診断薬。
［７］ 放射性同位体ヨウ素が１２５Ｉである、上記［４］～［６］のいずれかに記載の診断薬。
［８］ がんが有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ）１（ＯＡＴ１）を発現するがんである、上記［１］～［７］のいずれかに記載の診断薬。
［９］ がんが大腸がんまたは肺腺がんである、上記［１］～［７］のいずれかに記載の診断薬。
［１０］ 放射性同位体ヨウ素で標識された２－エチル－３－（４－ヒドロキシベンゾイル）ベンゾフランまたはその薬学的に許容される塩。
［１１］ ２－エチル－３－（４－ヒドロキシベンゾイル）ベンゾフランの構造中のヒドロキシ部分以外における１つの水素原子が放射性同位体ヨウ素で標識された化合物またはその薬学的に許容される塩。
［１２］ 放射性同位体ヨウ素が１２５Ｉである、上記［１０］または［１１］に記載の２－エチル－３－（４－ヒドロキシベンゾイル）ベンゾフランまたはその薬学的に許容される塩。
【発明の効果】
【0013】
本発明により、３－ベンゾイルベンゾフラン誘導体の同位体標識化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、がん診断薬等を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図2】図２は、各ＳＬＣ（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ）トランスポーター高発現細胞における１２５Ｉ－ベンザロンの取り込み量を示す棒グラフである。縦軸は、細胞の蛋白量１ｍｇあたりに換算した１２５Ｉ－ベンザロンの集積（％ＩＤ（１２５Ｉ－ベンザロンの取り込み放射能量÷細胞に添加した１２５Ｉ－ベンザロンの放射能量×１００）／ｍｇ蛋白質で補正）を表す。横軸は、各ＳＬＣトランスポーターを高発現する細胞を表し、ＨＥＫ－ｍｏｃｋおよびＦｌｐ－ｍｏｃｋは、それぞれ遺伝子操作をしていないコントロール細胞を表す。＊＊は、Ｆｌｐ－ｍｏｃｋ細胞の場合と比較して有意差（ｎ＝６，ｐ＜０．０５ Ｗｅｌｃｈ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）があったことを示す。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図3】図３は、ＯＡＴ１高発現細胞における１２５Ｉ－ベンザロンの取り込み量をプロベネシドの非存在下および存在下で比較した棒グラフである。縦軸は、細胞の蛋白量１ｍｇあたりに換算した１２５Ｉ－ベンザロンの集積（％ＩＤ／ｍｇ蛋白質で補正）を表す。横軸のＦｌｐ－ｍｏｃｋは、遺伝子操作をしていないコントロール細胞を表し、ＯＡＴ１は、ＯＡＴ１高発現する細胞を表す。また、ｃｏｎｔｒｏｌは、プロベネシド非存在下を表し、ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎは、プロベネシド存在下を表す。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図4】図４は、各ヒト由来がん細胞への１２５Ｉ－ベンザロン経時的集積を示すグラフである。縦軸は、生細胞数で補正した放射能の集積（％ＩＤ／ｃｅｌｌ×１０－６で補正）を表し、横軸は、経過時間（分）を表す。エラーバーは、標準誤差を示す。
【発明を実施するための形態】
【0015】
１．がん診断薬
本発明は、式（Ｉ）
本発明は、式（Ｉ）
【0016】
【化2】
【0017】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、同一または異なって、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲンまたはニトロを表し、Ｒ５は、低級アルキルまたはヒドロキシ低級アルキルを表し、Ｒ１０は、水素、または置換若しくは非置換の低級アルキルを表す）で表される３－ベンゾイルベンゾフラン誘導体の同位体標識化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、がん診断薬（以下、「本発明の診断薬」ともいう）を提供する。
【0018】
以下、式（Ｉ）表される化合物を化合物（Ｉ）という。
式（Ｉ）の各基の定義において、
低級アルキルとしては、例えば直鎖または分枝状の炭素数１～６のアルキルがあげられ、具体的にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等があげられる。
式（Ｉ）の各基の定義において、
低級アルキルとしては、例えば直鎖または分枝状の炭素数１～６のアルキルがあげられ、具体的にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等があげられる。
【0019】
低級アルコキシおよびヒドロキシ低級アルキルにおける低級アルキル部分は、前記低級アルキルと同義である。ヒドロキシ低級アルキルにおけるヒドロキシの置換位置は、特に限定されない。
【0020】
ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素の各原子を意味する。
【0021】
置換低級アルキルにおける置換基としては、同一または異なって、例えば置換数１～３のヒドロキシ、カルボキシ、低級アルコキシ、低級アルカノイル、低級アルコキシカルボニル等があげられる。置換基の置換位置は、特に限定されない。ここで、低級アルコキシ、低級アルカノイルおよび低級アルコキシカルボニルにおける低級アルキルは、前記低級アルキルと同義である。
【0022】
化合物（Ｉ）の中でも、Ｒ５が低級アルキルであり、Ｒ１０が水素である化合物が好ましく、中でもＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６およびＲ９が水素であり、Ｒ７およびＲ８が同一または異なって水素またはハロゲンである化合物がより好ましく、ベンザロンとしても知られる２－エチル－３－（４－ヒドロキシベンゾイル）ベンゾフラン（ＣＡＳ番号：１４７７－１９－６；以下、「ベンザロン」ということもある）またはベンズブロマロンとしても知られる３－（３，５－ジブロモ－４－ヒドロキシベンゾイル）－２－エチルベンゾフランがさらに好ましく、ベンザロンが特に好ましい。
【0023】
なお、当業者であれば、本発明の目的が達せられる範囲内で、化合物（Ｉ）における各置換基を適宜変更し得ることが、容易に理解できる。
【0024】
同位体標識化合物における同位体としては、特に限定されないが、例えば、各核種の安定同位体および各核種の放射性同位体があげられる。診断がコンピュータ断層撮影（Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＣＴ））等による画像診断の場合は、各核種の安定同位体が好ましく、診断が単一光子放射断層撮影（Ｓｉｎｇｌｅ Ｐｈｏｔｏｎ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＳＰＥＣＴ））、陽電子放射断層撮影（Ｐｏｓｉｔｒｏｎ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＰＥＴ））等による画像診断の場合は、各核種の放射性同位体が好ましい。また、同位体標識化合物における同位体が安定同位体の場合には、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容される塩は、がん治療剤としても使用し得、同位体標識化合物における同位体が放射性同位体の場合には、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容される塩は、核医学治療薬としても使用し得る。
【0025】
安定同位体としては、ヨウ素の安定同位体（１２７Ｉ）が好ましい。放射性同位体としては、ヨウ素の放射性同位体（１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ等）、アスタチンの放射性同位体（２１１Ａｔ等）、炭素の放射性同位体（１４Ｃ）、硫黄の放射性同位体（３５Ｓ）、水素の放射性同位体（トリチウム；３Ｈ）等が好ましく、ヨウ素の放射性同位体（１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉまたは１３１Ｉ）またはアスタチンの放射性同位体（２１１Ａｔ）がより好ましい。
【0026】
ベンザロンの同位体標識化合物としては、放射性同位体ヨウ素で標識されたベンザロンが好ましく、ベンザロンの構造中のヒドロキシ部分以外における１つの水素原子が放射性同位体ヨウ素で標識された化合物がより好ましく、ベンザロンの構造中のベンゾイル基の３位が放射性同位体ヨウ素で標識された化合物がさらに好ましい。また、一態様においては、ベンザロンの構造中のヒドロキシ部分以外における１つの水素原子が１２５Ｉで標識された化合物（以下、「１２５Ｉ－ベンザロン」ともいう）が好ましく、ベンザロンのベンゾイル基の３位が１２５Ｉで標識された化合物２－エチル－３－（４－ヒドロキシ［３－１２５Ｉ］ベンゾイル）ベンゾフランがより好ましい。
【0027】
薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される金属塩、薬学的に許容されるアンモニウム塩、薬学的に許容される有機アミン付加塩等を包含する。
【0028】
薬学的に許容される金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等があげられ、薬学的に許容されるアンモニウム塩としては、アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等の塩があげられ、薬学的に許容される有機アミン付加塩としては、モルホリン、ピペリジン等の付加塩があげられる。
【0029】
次に、化合物（Ｉ）の同位体標識化合物またはその薬学的に許容される塩の製造方法について説明する。
【0030】
化合物（Ｉ）の同位体標識化合物を製造する方法は、特に限定されないが、（１）化合物（Ｉ）を製造した後、当該化合物（Ｉ）中の特定の原子（例えば、水素原子）を同位体で交換する方法、（２）適切な同位体標識原料を使用して化合物（Ｉ）を製造する方法またはそれに準じて得る方法等の、同位体標識化合物を製造する公知の方法を使用することができる。同位体の半減期が短い場合は、上記方法（１）が好ましい。
【0031】
上記方法（１）は、例えば、以下のように実施することができる。
【0032】
化合物（Ｉ）を製造する方法は、特に限定されないが、例えば、特開昭５９－７３５７９号公報、特開平１－２１６９８４号公報、特開平３－２６１７７８号公報等に記載の方法、またはそれらに準じて実施することができる。
【0033】
次いで、得られた化合物（Ｉ）中の特定の原子（例えば、水素原子）を、自体公知の方法またはそれに準じて目的の同位体で交換することにより、化合物（Ｉ）の同位体標識化合物を得ることができる。
【0034】
より具体的には、例えば化合物（Ｉ）の同位体標識化合物が放射性同位体ヨウ素で標識されたベンザロンの場合、放射性同位体ヨウ素で標識されたベンザロンは、ベンザロンの構造中のヒドロキシ部分以外における１つの水素原子を放射性同位体ヨウ素で交換することにより、得ることができる。
【0035】
ベンザロンの製造方法は、公知であり、特に限定されないが、例えば、特開昭５９－７３５７９号公報等に記載の方法またはそれらに準じた方法によりベンザロンを得ることができる。また、東京化成工業（株）等、各社からの市販品として入手することもできる。
【0036】
ベンザロンの構造中のヒドロキシ部分以外における１つの水素原子を放射性同位体ヨウ素で交換する方法は、特に限定されないが、例えば、以下の方法があげられる。
【0037】
ベンザロンを溶媒に溶解し、得られた溶液に、放射性同位体ヨウ素標識化剤および酸化剤を溶媒に溶解した溶液を加え、反応させる。次いで、反応後の溶液から高速液体クロマトグラフィー等により分離精製して、放射性同位体ヨウ素で標識されたベンザロンを得る。
【0038】
ベンザロンを溶解する溶液としては、例えば、メタノール、エタノール等のアルコール、アセトニトリル等があげられ、中でも、アセトニトリルが好ましい。放射性同位体ヨウ素標識化剤および酸化剤を溶解する溶液としては、例えば、水、塩酸水溶液等があげられ、中でも、水が好ましく、超純水がより好ましい。
【0039】
放射性同位体ヨウ素標識化剤としては、例えば、放射性同位体ヨウ素で標識されたＮａＩ（１２５Ｉ－ＮａＩ等）があげられる。酸化剤としては、例えば、過酸化水素、クロラミンＴ等があげられ、中でも、クロラミンＴが好ましい。
【0040】
反応温度は、特に限定されないが、例えば１０℃～５０℃があげられ、２０℃～４５℃がより好ましく、３０℃～４０℃がさらに好ましい。反応時間は、特に限定されないが、例えば、１分～１２時間があげられ、１０分～６時間がより好ましく、３０分～４時間がさらに好ましく、１時間～３時間がさらにより好ましい。
【0041】
上記方法（２）は、例えば、以下のように実施することができる。
【0042】
適切な同位体標識原料を用いて、例えば、特開昭５９－７３５７９号公報、特開平１－２１６９８４号公報、特開平３－２６１７７８号公報等に記載の化合物（Ｉ）を製造する方法またはそれに準じる方法で、化合物（Ｉ）の同位体標識化合物を得ることができる。
【0043】
より具体的には、例えば化合物（Ｉ）の同位体標識化合物が放射性同位体ヨウ素で標識されたベンザロンの場合、放射性同位体ヨウ素で標識されたベンザロンは、放射性同位体ヨウ素で標識された適切な原料、例えば放射性同位体ヨウ素で標識された４－メトキシベンゾイルクロライド等を用いて、例えば、特開昭５９－７３５７９号公報等に記載の方法またはそれらに準じた方法により、得ることができる。
【0044】
化合物（Ｉ）の同位体標識化合物の塩を取得したいとき、化合物（Ｉ）の同位体標識化合物が塩の形で得られるときはそのまま精製すればよく、また、遊離の形で得られるときは、化合物（Ｉ）の同位体標識化合物を適当な溶媒に溶解または懸濁し、塩基を加えて単離、精製すればよい。
【0045】
また、化合物（Ｉ）の同位体標識化合物およびその薬学的に許容される塩は、水または各種溶媒との付加物の形で存在することもあるが、これらの付加物も本発明の診断薬等に使用することができる。
【0046】
「がん」は、特に限定されないが、有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ）１（ＯＡＴ１）を発現するがんであるのが好ましく、例えば、大腸がん、肺がん等であるのが好ましい。
【0047】
本発明の診断薬は、化合物（Ｉ）の同位体標識化合物またはその薬学的に許容される塩の他に、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、水、生理食塩水、植物油可溶化剤、等張化剤、保存剤、抗酸化剤等のその他の成分を適宜用いて常法により調製することができる。
【0048】
錠剤の調製にあたっては、例えば乳糖等の賦形剤、澱粉等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を常法に従って用いればよい。
【0049】
注射剤の調製にあたっては、水、生理食塩水、大豆油等の植物油、各種の溶剤、可溶化剤、等張化剤、保存剤、抗酸化剤等を常法に従って用いればよい。
【0050】
本発明の診断薬を投与する対象は、特に限定されないが、例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等の哺乳動物等があげられ、好ましくはヒトである。
【0051】
本発明の診断薬を、経口的に、例えば錠剤としてヒトに投与する場合、化合物（Ｉ）の同位体標識化合物またはその薬学的に許容される塩を、例えば、成人一人当たり、０．０１～１０００ｍｇ、好ましくは０．０５～５００ｍｇ、さらに好ましくは０．１～２００ｍｇ投与する。
【0052】
本発明の診断薬を、非経口的に、例えば注射剤としてヒトに投与する場合、化合物（Ｉ）の同位体標識化合物またはその薬学的に許容される塩を、例えば、成人一人当たり、０．００１～１０００ｍｇ、好ましくは０．００５～５００ｍｇ、さらに好ましくは０．０１～２００ｍｇ投与する。
【0053】
また、同位体が放射性同位体である本発明の診断薬を投与する際の放射能濃度は、放射性同位体の種類、投与する対象、投与の形態・経路、目的等により適宜調整することができるが、例えば同位体が１２３Ｉまたは１３１Ｉである本発明の診断薬をヒトに投与する場合は、放射能濃度が３７ＭＢｑ／ヒト～７４０ＭＢｑ／ヒトとなるように投与することが好ましく、１８５ＭＢｑ／ヒト～３７０ＭＢｑ／ヒトとなるように投与することがより好ましい。
【0054】
本発明の診断薬の投与後、同位体標識化合物における同位体が安定同位体の場合は、公知の方法（例えば、Ｐｅｎｇ Ｚｈａｎｇ， Ｘｉｎｙｕ Ｍａ， ｅｔ ａｌ． “Ｏｒｇａｎｉｃ Ｎａｎｏｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ Ｉｏｄｉｎａｔｅｄ Ｃｏｎｔｒａｓｔ Ｍｅｄｉａ ｉｎ ＣＴ Ｉｍａｇｉｎｇ”， Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ２０２１； ２６（２３）： ７０６３等）により例えば本発明の診断薬をＸ線造影剤として用いるＣＴ等による診断を行うことができ、同位体標識化合物における同位体が放射性同位体の場合は、公知の方法（例えば、Ｇｅｏｒｇｅ Ｃｒｉｓａｎ， Ｎａｓｔａｓｉａ Ｓａｎｄａ Ｍｏｌｄｏｖｅａｎ－Ｃｉｏｒｏｉａｎｕ， ｅｔ ａｌ． “Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｆｏｒ ＰＥＴ ａｎｄ ＳＰＥＣＴ Ｉｍａｇｉｎｇ： Ａ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｖｅｒ ｔｈｅ Ｌａｓｔ Ｄｅｃａｄｅ” Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ， ２０２２； ２３（９）： ５０２３等）により例えば本発明の診断薬を診断用放射性医薬品として用いるＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ等による画像診断等を行うことができる。
【0055】
本発明の診断薬はまた、化合物（Ｉ）の同位体標識化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、がん診断用キットとして提供することもできる。
【0056】
キットは、例えば保存する際に外部の温度や光による内容物である成分の変性、容器からの化学成分の溶出等がみられない容器であれば材質、形状等は特に限定されない２つ以上の容器（例えばバイアル、バッグ等）と内容物とからなり、内容物である化合物（Ｉ）の同位体標識化合物またはその薬学的に許容される塩およびその他の成分の一部とその他の成分の残りとが別々の容器中に格納されたな形態を有するものである。具体的には、錠剤、注射剤等のキットがあげられる。
【0057】
次に、本発明を実施例等により具体的に説明するが、本発明はこれらの例によって何ら限定されるものではない。
【実施例0058】
後述する試験例で用いる細胞株としては、各試験例等において特に断りのない限り、以下を使用した。
・ＨＥＫ細胞：ヒト胎児腎細胞（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌ）ＨＥＫ２９３株（ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入）
・Ｆｌｐ細胞：Ｆｌｐ－ｉｎ－２９３細胞（ＨＥＫ２９３株の遺伝子を改変した細胞；サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）から購入）
・ＨＥＫ細胞：ヒト胎児腎細胞（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌ）ＨＥＫ２９３株（ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入）
・Ｆｌｐ細胞：Ｆｌｐ－ｉｎ－２９３細胞（ＨＥＫ２９３株の遺伝子を改変した細胞；サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）から購入）
【0059】
・各ＳＬＣトランスポーターを高発現させたＨＥＫ細胞：上記ＨＥＫ細胞に各ＳＬＣトランスポーターのプラスミドを導入した強制発現系細胞
当該細胞の作製方法は、以下のとおりである。
１．ｐｃＤＮＡ３．１ベクターを制限酵素処理し、目的遺伝子を組み込んだ。
２．目的遺伝子を組み込んだｐｃＤＮＡ３．１ベクターを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック（株））を用いてＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。
３．ＨＥＫ２９３細胞は、１０％ ＦＢＳ、１×１０５Ｕ／ＬペニシリンＧ、１００ｍｇ／Ｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭで１ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８の存在下で約２週間培養し、単一のコロニーを単離した。
当該細胞の作製方法は、以下のとおりである。
１．ｐｃＤＮＡ３．１ベクターを制限酵素処理し、目的遺伝子を組み込んだ。
２．目的遺伝子を組み込んだｐｃＤＮＡ３．１ベクターを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック（株））を用いてＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。
３．ＨＥＫ２９３細胞は、１０％ ＦＢＳ、１×１０５Ｕ／ＬペニシリンＧ、１００ｍｇ／Ｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭで１ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８の存在下で約２週間培養し、単一のコロニーを単離した。
【0060】
＜遺伝子情報＞
ＯＡＴＰ１Ｂ１：ＮＭ＿００６４４６．５
ＯＡＴＰ２Ｂ１：ＮＭ＿００７２５６．５
ＯＡＴＰ１Ｂ３：ＮＭ＿０１９８４４．４
ＯＡＴ２：ＮＭ＿１５３３２０．２
ＯＣＴ１：ＮＭ＿００３０５７．３
ＯＣＴ２：ＮＭ＿００３０５８．４
ＯＣＴＮ２：ＮＭ＿００３０６０．４
ＯＡＴＰ１Ｂ１：ＮＭ＿００６４４６．５
ＯＡＴＰ２Ｂ１：ＮＭ＿００７２５６．５
ＯＡＴＰ１Ｂ３：ＮＭ＿０１９８４４．４
ＯＡＴ２：ＮＭ＿１５３３２０．２
ＯＣＴ１：ＮＭ＿００３０５７．３
ＯＣＴ２：ＮＭ＿００３０５８．４
ＯＣＴＮ２：ＮＭ＿００３０６０．４
【0061】
・各ＳＬＣトランスポーターを高発現させたＦｌｐ細胞：上記Ｆｌｐ細胞に各ＳＬＣトランスポーターのプラスミドを導入した強制発現系細胞
当該細胞の作製方法は、以下のとおりである。
１．ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙを鋳型として、目的遺伝子をＰＣＲにより増幅した。
２．増幅したインサートを、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターにライゲーションした。
３．ｐｃＤＮＡ３．１ベクター中の目的遺伝子のｃＤＮＡを制限酵素処理し、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴベクターにライゲーションした。
４．得られた目的遺伝子を組み込んだｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴベクターを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎを用いてＦｌｐ－ｉｎ ２９３細胞にｐＯＧ４４と共トランスフェクトした。
５．Ｆｌｐ－ｉｎ ２９３細胞は、１０％ ＦＢＳ、１×１０５Ｕ／ＬペニシリンＧ、１００ｍｇ／Ｌストレプトマイシン、２００ｍｇ／ＬハイグロマイシンＢを含むＤＭＥＭで１ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８の存在下で約２週間培養し、単一のコロニーを単離した。
当該細胞の作製方法は、以下のとおりである。
１．ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙを鋳型として、目的遺伝子をＰＣＲにより増幅した。
２．増幅したインサートを、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターにライゲーションした。
３．ｐｃＤＮＡ３．１ベクター中の目的遺伝子のｃＤＮＡを制限酵素処理し、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴベクターにライゲーションした。
４．得られた目的遺伝子を組み込んだｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴベクターを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎを用いてＦｌｐ－ｉｎ ２９３細胞にｐＯＧ４４と共トランスフェクトした。
５．Ｆｌｐ－ｉｎ ２９３細胞は、１０％ ＦＢＳ、１×１０５Ｕ／ＬペニシリンＧ、１００ｍｇ／Ｌストレプトマイシン、２００ｍｇ／ＬハイグロマイシンＢを含むＤＭＥＭで１ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８の存在下で約２週間培養し、単一のコロニーを単離した。
【0062】
＜遺伝子情報＞
ＯＡＴ１：ＮＭ＿１５３２７６．３
ＯＡＴ３：ＮＭ＿００４２５４．４
ＯＡＴ１：ＮＭ＿１５３２７６．３
ＯＡＴ３：ＮＭ＿００４２５４．４
【0063】
合成例１：１２５Ｉ－ベンザロンの合成
ベンザロン（東京化成工業（株））２．６×１０－４ｇ（１．０×１０－６ｍｏｌ）をアセトニトリル（ナカライテスク（株））１００μＬに溶解し、得られた溶液に１２５Ｉ－ＮａＩ（３．７ＭＢｑ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）およびと酸化剤としてのクロラミンＴ（ナカライテスク（株））２．８×１０－５ｇ（１．０×１０－７ｍｏｌ）を超純水１００μＬに溶解した溶液を加え、３７．０℃で３０分間反応させた。また、反応時間を６０分間若しくは１２０分とし、またはクロラミンＴの添加量を１．０×１０－８ｍｏｌ若しくは１．０×１０－６ｍｏｌに変化させ、同様に反応させた。
ベンザロン（東京化成工業（株））２．６×１０－４ｇ（１．０×１０－６ｍｏｌ）をアセトニトリル（ナカライテスク（株））１００μＬに溶解し、得られた溶液に１２５Ｉ－ＮａＩ（３．７ＭＢｑ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）およびと酸化剤としてのクロラミンＴ（ナカライテスク（株））２．８×１０－５ｇ（１．０×１０－７ｍｏｌ）を超純水１００μＬに溶解した溶液を加え、３７．０℃で３０分間反応させた。また、反応時間を６０分間若しくは１２０分とし、またはクロラミンＴの添加量を１．０×１０－８ｍｏｌ若しくは１．０×１０－６ｍｏｌに変化させ、同様に反応させた。
【0064】
次いで、上記で得られた各反応溶液から、以下の条件の高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いて、１２５Ｉ－ベンザロンを分離精製した。なお、ＨＰＬＣのクロマトグラムは、ＰｏｗｅｒＣｈｒｏｍ（ｅＤＡＱ社）を用いて解析した。また、以降の実験においては、分離精製後に窒素還流してアセトニトリルを除去したものを使用した。
【0065】
ＨＰＬＣ条件
カラム：５Ｃ１８－ＡＲ－ＩＩ １０ｍｍ Ｉ．Ｄ．－２５０ｍｍ（ナカライテスク（株））
溶出液：２０％リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．０）：８０％アセトニトリル
流速：１．０ｍＬ／分
検出：ＵＶ（２５６ｎｍ）
カラム：５Ｃ１８－ＡＲ－ＩＩ １０ｍｍ Ｉ．Ｄ．－２５０ｍｍ（ナカライテスク（株））
溶出液：２０％リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．０）：８０％アセトニトリル
流速：１．０ｍＬ／分
検出：ＵＶ（２５６ｎｍ）
【0066】
上記各条件下での１２５Ｉ－ベンザロン標識率を表１に示す。
【0067】
【表1】
【0068】
表１に示すように、反応時間１２０分、クロラミンＴの添加量１．０×１０－７ｍｏｌで、６２．１±１．６％の最も良い標識率が得られた。
【0069】
試験例１：１２５Ｉ－ベンザロンの放射化学的純度検定および安定性試験
合成例１において反応時間１２０分、クロラミンＴの添加量１．０×１０－７ｍｏｌの条件で調製した１２５Ｉ－ベンザロンについて、その放射化学的純度を薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）（固定相：シリカゲル薄層板（Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ Ｆ２５６（Ｍｅｒｃｋ社））移動相：クロロホルム：ジエチルエーテル＝１：１）にて分析した。その結果、放射化学的純度は、９７．３±０．５％であった。
合成例１において反応時間１２０分、クロラミンＴの添加量１．０×１０－７ｍｏｌの条件で調製した１２５Ｉ－ベンザロンについて、その放射化学的純度を薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）（固定相：シリカゲル薄層板（Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ Ｆ２５６（Ｍｅｒｃｋ社））移動相：クロロホルム：ジエチルエーテル＝１：１）にて分析した。その結果、放射化学的純度は、９７．３±０．５％であった。
【0070】
また、上記１２５Ｉ－ベンザロンを７日間冷凍保存したときの放射化学的純度の変化を、図１に示す。
【0071】
図１に示すように、、上記１２５Ｉ－ベンザロンの放射化学的純度は、精製後７日目の時点でも９６．９±０．５％であり、安定していることがわかった。
【0072】
試験例２：１２５Ｉ－ベンザロンの各ＳＬＣ（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ）トランスポーターへの親和性検討
ＯＡＴ１またはＯＡＴ３を強制的に高発現させたＦｌｐ細胞、遺伝子操作をしていないコントロール細胞であるＦｌｐ－ｍｏｃｋ細胞、ＯＡＴＰ１Ｂ１、ＯＡＴＰ１Ｂ３、ＯＡＴＰ２Ｂ１、ＯＡＴ２、ＯＣＴ１、ＯＣＴ２またはＯＣＴＮ２をそれぞれ強制的に高発現させたＨＥＫ細胞、および遺伝子操作をしていないコントロール細胞であるＨＥＫ－ｍｏｃｋ細胞のそれぞれを、Ｄ－ＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、富士フイルム和光純薬（株））中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。得られた細胞をコラーゲンコーティングされた１２ｗｅｌｌ細胞培養用マルチｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ播き、約２４時間培養後に実験を行った。
ＯＡＴ１またはＯＡＴ３を強制的に高発現させたＦｌｐ細胞、遺伝子操作をしていないコントロール細胞であるＦｌｐ－ｍｏｃｋ細胞、ＯＡＴＰ１Ｂ１、ＯＡＴＰ１Ｂ３、ＯＡＴＰ２Ｂ１、ＯＡＴ２、ＯＣＴ１、ＯＣＴ２またはＯＣＴＮ２をそれぞれ強制的に高発現させたＨＥＫ細胞、および遺伝子操作をしていないコントロール細胞であるＨＥＫ－ｍｏｃｋ細胞のそれぞれを、Ｄ－ＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、富士フイルム和光純薬（株））中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。得られた細胞をコラーゲンコーティングされた１２ｗｅｌｌ細胞培養用マルチｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ播き、約２４時間培養後に実験を行った。
【0073】
培養用培地を除去した後、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を４５０μＬ加えて約１０分間プレインキュベーションを行った。その後、３７ｋＢｑの１２５Ｉ－ベンザロン溶液５０μＬを投与し、５分間インキュベーションを行った。インキュベーション後に、１２５Ｉ－ベンザロンを含むＰＢＳを除去し、細胞が入ったｗｅｌｌをＰＢＳ６００μＬで２回洗浄した。細胞を０．１Ｍ ＮａＯＨ５００μＬで溶解させ、放射能をオートウェルγカウンタ（ＡｃｃｕＦＬＥＸ ７０００（Ａｌｏｋａ ｍｅｄｉｃａｌ社））で測定した。
【0074】
また、解析結果を各細胞の蛋白量１ｍｇあたりに換算した１２５Ｉ－ベンザロンの集積量で表すため、ＴａＫａＲａ ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（タカラバイオ（株））を用いて、蛋白定量を行った。キットに付属しているウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１００μＬおよび０．１Ｍ ＮａＯＨ１００μＬを加えてよく撹拌し、ＢＳＡ １．０ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。その後、調製したＢＳＡ溶液を希釈して検量線用ＢＳＡ溶液を作成した。検量線用ＢＳＡおよび細胞溶解液を９６ｗｅｌｌマルチウェルプレートに１ｗｅｌｌあたり２５μＬずつ加え、次いでキットに付属しているｒｅａｇｅｎｔ Ａおよびｒｅａｇｅｎｔ Ｂをｒｅａｇｅｎｔ Ａ：ｒｅａｇｅｎｔ Ｂ＝１００：１で調製したｗｏｒｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔを１ｗｅｌｌあたり２００μＬずつ加えた後、３７℃で３０分間インキュベーションを行った。プレートを室温で１０分間放置した後、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣ 吸光マイクロプレートリーダ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で吸光度を測定し、ＳｋａｎＩｔ（商標） Ｓｏｆｔｗａｒｅ ２．５．１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で解析を行い、蛋白量を算出した。検量線の直線相関率は、０．９９０以上のデータを用いた。統計解析は、Ｇｒａｐｈ ｐａｄ Ｐｒｉｓｍを用いてＷｅｌｃｈ－ｔ検定を行い、有意差の判定は、Ｐ＜０．０５（ｎ＝６，Ｗｅｌｃｈ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）とした。
その結果を、図２に示す。
その結果を、図２に示す。
【0075】
図２に示すように、５分間のインキュベーション後において、特定のＳＬＣトランスポーターを高発現させていないＭｏｃｋ細胞と比較して、ＯＡＴ１高発現細胞においてのみ有意に１２５Ｉ－ベンザロンの取り込み量が高いことが確認された。このことから、１２５Ｉ－ベンザロンの取り込みにはＯＡＴ１が関与している可能性が示された。
【0076】
試験例３：１２５Ｉ－ベンザロンのＯＡＴ１への親和性に対するＯＡＴ阻害剤の影響の検討
ＯＡＴ１を強制発現させたＦｌｐ細胞を、Ｄ－ＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、富士フイルム和光純薬（株））中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。得られた細胞をコラーゲンコーティングされた１２ｗｅｌｌ細胞培養用マルチｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ播き、約２４時間培養後に実験を行った。
ＯＡＴ１を強制発現させたＦｌｐ細胞を、Ｄ－ＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、富士フイルム和光純薬（株））中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。得られた細胞をコラーゲンコーティングされた１２ｗｅｌｌ細胞培養用マルチｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ播き、約２４時間培養後に実験を行った。
【0077】
培養用培地を除去した後、ｐＨ７．４のＰＢＳ４００μＬを加えて約１０分間プレインキュベーションを行った。その後、ＯＡＴ阻害剤であるプロベネシド（東京化成工業（株））溶液５０μＬを加え、その３０秒後に３７ｋＢｑの１２５Ｉ－ベンザロン溶液５０μＬを投与し、５分間インキュベーションを行った。なお、プロベネシド溶液としては、プロベネシドをＰＢＳに溶解し、培養細胞に加えた後、最終濃度１．０ｍＭになるように調整したものを用いた。インキュベーション後に、プロベネシドおよび１２５Ｉ－ベンザロンを含むＰＢＳを除去し、細胞が入ったｗｅｌｌをＰＢＳ６００μＬで２回洗浄した。細胞を０．１Ｍ ＮａＯＨ５００μＬで溶解させ、放射能をオートウェルγカウンタ（ＡｃｃｕＦＬＥＸ ７０００（Ａｌｏｋａ ｍｅｄｉｃａｌ社））で測定した。
【0078】
また、蛋白定量および統計解析は、試験例２と同様にして行った。
その結果を、図３に示す。
その結果を、図３に示す。
【0079】
図３に示すように、ＯＡＴ１を高発現させたＦｌｐ細胞にＯＡＴ阻害剤であるプロベネシドを加えた場合、Ｆｌｐ－ｍｏｃｋ細胞と比較して、１２５Ｉ－ベンザロンの取り込み量における有意差は確認できなかった。すなわち、試験例２および３の結果から、１２５Ｉ－ベンザロンの取り込みに関与しているＳＬＣトランスポーターはＯＡＴ１であることが、確認された。
【0080】
試験例４：ヒト由来がん細胞への１２５Ｉ－ベンザロンの集積検討
（ヒト由来がん細胞の培養）
ヒト由来がん細胞としては、ＯＡＴ１が高発現しているヒト由来結腸腺がん培養細胞株ＤＬＤ－１（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））、ヒト由来肺腺がん培養細胞株Ｈ４４１（ＡＴＣＣ）、ヒト由来肺腺がん培養細胞株ＰＣ－１４（理化学研究所）、および比較対象としてＯＡＴ１低発現のヒト由来結腸腺がん培養細胞株ＬＳ１８０（ＡＴＣＣ）を用いた。ＤＬＤ－１、ＰＣ－１４およびＬＳ１８０は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社））１０％を混合したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ－ＭＥＭ（富士フイルム和光純薬（株））、Ｈ４４１は、ＦＢＳ １０％およびピルビン酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬（株））１％を混合したロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）－１６４０（富士フイルム和光純薬（株））の培地を用いて培養した。
（ヒト由来がん細胞の培養）
ヒト由来がん細胞としては、ＯＡＴ１が高発現しているヒト由来結腸腺がん培養細胞株ＤＬＤ－１（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））、ヒト由来肺腺がん培養細胞株Ｈ４４１（ＡＴＣＣ）、ヒト由来肺腺がん培養細胞株ＰＣ－１４（理化学研究所）、および比較対象としてＯＡＴ１低発現のヒト由来結腸腺がん培養細胞株ＬＳ１８０（ＡＴＣＣ）を用いた。ＤＬＤ－１、ＰＣ－１４およびＬＳ１８０は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社））１０％を混合したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ－ＭＥＭ（富士フイルム和光純薬（株））、Ｈ４４１は、ＦＢＳ １０％およびピルビン酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬（株））１％を混合したロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）－１６４０（富士フイルム和光純薬（株））の培地を用いて培養した。
【0081】
上記４種類のヒト由来がん培養細胞を、細胞培養用１０ｃｍ２ペトリディッシュにおいて３７℃、５％ＣＯ２で培養した。細胞増殖が９０％コンフルエントな状態で培地を除去し、ＰＢＳ１０ｍＬで細胞表面を２回洗浄後、０．２５ｗ／ｖ％トリプシン－ＥＤＴＡ ４Ｎａ溶液（富士フイルム和光純薬）３．０ｍＬで細胞を剥離し、細胞を遠沈させてトリプシンを除去した。次いで、遠心分離機を用いて４℃、３０００ｒｐｍで５分間遠心して、１７５ｃｍ２の細胞培養フラスコに継代した。
【0082】
（ヒト由来がん細胞への１２５Ｉ－ベンザロンの経時的集積実験）
上記で培養・継代した各ヒト由来がん細胞を、コラーゲンコーティングされた１２ｗｅｌｌ細胞培養用マルチｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ播き、約２４時間培養後に実験を行った。
上記で培養・継代した各ヒト由来がん細胞を、コラーゲンコーティングされた１２ｗｅｌｌ細胞培養用マルチｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ播き、約２４時間培養後に実験を行った。
【0083】
培養用培地を除去した後、ｐＨ７．４のＰＢＳ４５０μＬを加えて約１０分間プレインキュベーションを行った。その後、３７ｋＢｑの１２５Ｉ－ベンザロン溶液５０μＬを加え、５、１０、３０および６０分間インキュベーションを行った。インキュベーション後に、１２５Ｉ－ベンザロンを含むＰＢＳを除去し、細胞が入ったｗｅｌｌをＰＢＳ６００μＬで２回洗浄した。細胞を０．１ Ｍ ＮａＯＨ５００μＬで溶解させ、放射能をオートウェルγカウンタ（ＡｃｃｕＦＬＥＸ ７０００（Ａｌｏｋａ ｍｅｄｉｃａｌ社））で測定した。
【0084】
４種のヒト由来がん細胞株の細胞数を全自動細胞測定装置（ＬＵＮＡ ＦＸ７（Ｌｏｇｏ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社））で測定し、算出した生細胞数を用いて得られた放射能を補正した。
その結果を、図４に示す。
その結果を、図４に示す。
【0085】
また、別途行ったヒト由来がん細胞ＤＬＤ－１、Ｈ４４１、ＰＣ－１４およびＬＳ１８０への３Ｈ－Ｌ－メチオニン（３Ｈ－Ｌ－Ｍｅｔ）の集積実験、並びにＨ４４１およびＰＣ－１４への１８Ｆ－フルオロデオキシグルコース（１８Ｆ－ＦＤＧ）の集積実験の結果と、上記した１２５Ｉ－ベンザロンの集積実験の結果を比較した。
その結果を、図５に示す。
その結果を、図５に示す。
【0086】
図４および図５に示すように、４種全てのヒト由来がん細胞株において、１２５Ｉ－ベンザロンの集積が確認された。４種のヒト由来がん細胞株の中で、ＤＬＤ－１への集積は、他の細胞株への集積と比較して少なかった（図４）。ＤＬＤ－１においては、５分～１０分間のインキュベーションの間に集積が増加し、その後、集積は低下した（図５（Ａ））。Ｈ４４１においては、５分～１０分間のインキュベーションの間に集積が急増し、その後は緩やかな集積増加に変化し（図５（Ｂ））、ＰＣ－１４においては、５分～１０分間のインキュベーションの間に集積が急増し、その後は一度集積が低下してから再び緩やかに集積が増加した（図５（Ｃ））。ＬＳ１８０においては、５分～１０分間のインキュベーションの早期における集積は少なかったが、時間経過とともに集積が増加した（図５（Ｄ））。４種全てのヒト由来がん細胞株において、ＤＬＤ－１における６０分間のインキュベーション後を除き、３Ｈ－Ｌ－Ｍｅｔおよび１８Ｆ－ＦＤＧの集積よりも１２５Ｉ－ベンザロンの集積が顕著であることが確認された。
【0087】
試験例５：ヒト由来がん細胞への１２５Ｉ－ベンザロンの集積に対するＯＡＴ阻害剤の影響の検討
試験例４で培養・継代した各ヒト由来がん細胞を、コラーゲンコーティングされた１２ｗｅｌｌ細胞培養用マルチｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ播き、約２４時間培養後に実験を行った。
試験例４で培養・継代した各ヒト由来がん細胞を、コラーゲンコーティングされた１２ｗｅｌｌ細胞培養用マルチｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ播き、約２４時間培養後に実験を行った。
【0088】
培養用培地を除去した後、ｐＨ７．４のＰＢＳ４００μＬを加えて約１０分間プレインキュベーションを行った。その後、ＯＡＴの阻害剤であるプロベネシド（東京化成工業（株））溶液５０μＬを加え、その３０秒後に３７ｋＢｑの１２５Ｉ－ベンザロン溶液５０μＬを加え、５分間インキュベーションを行った。なお、プロベネシド溶液としては、プロベネシドをＰＢＳに溶解し、培養細胞に加えた後、最終濃度１．０ｍＭになるように調整したものを用いた。インキュベーション後に、１２５Ｉ－ベンザロンを含むＰＢＳを除去し、細胞が入ったｗｅｌｌを氷冷したＰＢＳ６００μＬで２回洗浄した。細胞を０．１ Ｍ ＮａＯＨ５００μＬで溶解させ、放射能をオートウェルγカウンタ（ＡｃｃｕＦＬＥＸ ７０００（Ａｌｏｋａ ｍｅｄｉｃａｌ社））で測定し、試験例４と同様にして、生細胞数を用いて補正した。
その結果を、図６に示す。
その結果を、図６に示す。
【0089】
図６に示すように、ＯＡＴ阻害剤であるプロベネシドを加え場合、全てのヒト由来がん細胞株において、１２５Ｉ－ベンザロンの顕著な集積増加が確認された。
【0090】
ＯＡＴ阻害剤として用いたプロベネシドは、排泄型のトランスポーターである多剤耐性関連蛋白質（ＭＲＰ）の阻害剤としても報告されており（Ｋｉｍ ＨＳ， Ｍｉｎ ＹＤ， Ｃｈｏｉ ＣＨ，Ｄｏｕｂｌｅ－ｅｄｇｅｄ ｓｗｏｒｄ ｏｆ ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ： ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＲＰ） ｉｎ ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｎ ＭＲＰ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．，２００２ Ａｐｒ；２８３（１）：６４－７１）、図６においてプロベネシドを加えたＬＳ１８０への集積の増加が確認されたことから、１２５Ｉ－ベンザロンは、ＭＲＰトランスポーターにも関与していることが示された。また、図６において４種全てのヒト由来がん細胞株で集積増加を確認できたことから、１２５Ｉ－ベンザロンの細胞集積には、取り込み型のＯＡＴ１単一でなく、排泄型のＭＲＰトランスポーターも関与しているものと推測された。
【0091】
上記のように、１２５Ｉ－ベンザロンは、画像診断用放射性ヨウ素標識薬剤として有望であると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【0092】
本発明により、大腸がん等の早期発見を目的とした新規ながん診断薬等を提供することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
