知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特開2024-134295核酸増幅方法、一本鎖核酸定量法、核酸定量キット及び核酸増幅装置
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024134295
(43)【公開日】2024-10-03
(54)【発明の名称】核酸増幅方法、一本鎖核酸定量法、核酸定量キット及び核酸増幅装置
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6844 20180101AFI20240926BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20240926BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240926BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6844 Z
C12M1/00 A
C12N15/09 Z ZNA
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023044523
(22)【出願日】2023-03-20
(71)【出願人】
【識別番号】000003078
【氏名又は名称】株式会社東芝
(74)【代理人】
【識別番号】110001737
【氏名又は名称】弁理士法人スズエ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】奥村 周
(72)【発明者】
【氏名】石原 美津子
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029BB20
4B029FA10
4B029FA12
4B029FA15
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR14
4B063QR32
4B063QR62
4B063QS24
4B063QS28
4B063QS34
4B063QS36
4B063QS38
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】核酸変換連鎖増幅方法、一本鎖核酸定量法、核酸定量キット及び核酸増幅装置を提供する。
【解決手段】実施形態の核酸変換連鎖増幅方法は、試料中の一本鎖の標的核酸の配列を、置換配列に変換し増幅するための方法である。ニッカーゼ認識部位を３’側に接続した人工的な核酸配列を２種類以上連続して接続し、その３’側に標的核酸が接続している変換用テンプレートと、標的核酸とをハイブリダイズさせ、ポリメラーゼによる伸長と、ニッカーゼによる切断とにより、変換用テンプレート上のニッカーゼ認識部位とそれに続く当該人工的な核酸配列を連続的に複製する。
【選択図】 図１
【解決手段】実施形態の核酸変換連鎖増幅方法は、試料中の一本鎖の標的核酸の配列を、置換配列に変換し増幅するための方法である。ニッカーゼ認識部位を３’側に接続した人工的な核酸配列を２種類以上連続して接続し、その３’側に標的核酸が接続している変換用テンプレートと、標的核酸とをハイブリダイズさせ、ポリメラーゼによる伸長と、ニッカーゼによる切断とにより、変換用テンプレート上のニッカーゼ認識部位とそれに続く当該人工的な核酸配列を連続的に複製する。
【選択図】 図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中の標的核酸の配列を増幅するために、
ニッカーゼ認識部位を３’側に接続した人工的な核酸配列の相補配列を２種類以上連続して接続し、さらにその３’側に直列に前記標的核酸の相補的配列が接続している変換用テンプレートと、当該標的核酸とをハイブリダイズさせることと、
ポリメラーゼによって、当該変換用テンプレート上の当該ニッカーゼ認識部位とそれに続く当該人工的な核酸配列を連続的に複製することと、
複製された配列中のニッカーゼ認識部位をニッカーゼで切断しニッカーゼ切断部位を生成させること、
当該ポリメラーゼによって、当該ニッカーゼ切断部位からの伸長によって、当該ニッカーゼ認識部位と続く人工的な核酸配列を遊離させながら、更なる当該ニッカーゼ認識部位と続く人工的な核酸配列を連続的に複製すること
当該遊離したニッカーゼ認識部位と続く人工的な核酸配列を、当該変換用テンプレートにハイブリダイズさせることと、
当該ポリメラーゼによって、当該変換用テンプレート上の当該ニッカーゼ認識部位とそれに続く当該人工的な核酸配列を連続的に複製することと
を備える核酸増幅方法。
ニッカーゼ認識部位を３’側に接続した人工的な核酸配列の相補配列を２種類以上連続して接続し、さらにその３’側に直列に前記標的核酸の相補的配列が接続している変換用テンプレートと、当該標的核酸とをハイブリダイズさせることと、
ポリメラーゼによって、当該変換用テンプレート上の当該ニッカーゼ認識部位とそれに続く当該人工的な核酸配列を連続的に複製することと、
複製された配列中のニッカーゼ認識部位をニッカーゼで切断しニッカーゼ切断部位を生成させること、
当該ポリメラーゼによって、当該ニッカーゼ切断部位からの伸長によって、当該ニッカーゼ認識部位と続く人工的な核酸配列を遊離させながら、更なる当該ニッカーゼ認識部位と続く人工的な核酸配列を連続的に複製すること
当該遊離したニッカーゼ認識部位と続く人工的な核酸配列を、当該変換用テンプレートにハイブリダイズさせることと、
当該ポリメラーゼによって、当該変換用テンプレート上の当該ニッカーゼ認識部位とそれに続く当該人工的な核酸配列を連続的に複製することと
を備える核酸増幅方法。
【請求項2】
（ａ）試料に含まれる標的核酸上に標的配列ｘを設定することと、
（ｂ）前記試料中に存在しない配列であり、且つ互いに異なる配列で示されるＣ種類の人工配列α～人工配列ｎ（ここでＣは２～１０の整数であり、ｎはＣ番目のギリシャ文字である）を設計することと、
（ｃ）変換用テンプレートを準備することと；
ここで、変換用テンプレートは、３’から５’の向きで、前記標的配列xの相補配列ｘ’と、Ｃ種類の前記人工配列の相補配列α’～ｎ’とを含み、更に、これらの当該相補配列ｘ’、α’～ｎ’間にそれぞれ介在しているＣ個のニッカーゼ認識部位を含む、
（ｄ）反応場に、当該試料、前記変換用テンプレート、ニッカーゼ及びポリメラーゼを持ち込み、以下の（ｉ）～（ｖ）を含む反応を進行させることにより、所望の時間に亘り連続的に当該Ｃ種類の人工配列α～ｎを複製することと；
（ｉ）当該標的配列ｘを前記変換用テンプレートに沿って伸長させ、第１の伸長鎖を得ること、
（ii）当該第１の伸長鎖に含まれる当該ニッカーゼ認識部位を当該ニッカーゼで切断すること、及び
（iii）切断された第１の伸長鎖に由来する当該標的配列を、当該ポリメラーゼの鎖置換反応によって、当該変換用テンプレートに沿って伸長させること；並びに
（iv）前記切断された第１の伸長鎖に由来する人工配列α～人工配列ｎをそれぞれ前記変換用テンプレートに沿って伸長させ、第２の伸長鎖～第ｎの伸長鎖を得ること、
（ｖ）前記第２の伸長鎖～第ｎの伸長鎖にそれぞれ含まれる当該ニッカーゼ認識部位を当該ニッカーゼで切断すること、
（vi）切断された第２の伸長鎖～第ｎの伸長鎖にそれぞれ由来する人工配列α～人工配列ｎを当該ポリメラーゼの鎖置換反応によって、当該変換用テンプレートに沿って伸長させること、
（ｅ）当該変換用テンプレートによって変換された当該標的核酸についての情報を得ることと、
（ｄ）得られた情報に基づいて、当該試料中の当該標的核酸量を算出することと、
を備える、一本鎖核酸定量法。
（ｂ）前記試料中に存在しない配列であり、且つ互いに異なる配列で示されるＣ種類の人工配列α～人工配列ｎ（ここでＣは２～１０の整数であり、ｎはＣ番目のギリシャ文字である）を設計することと、
（ｃ）変換用テンプレートを準備することと；
ここで、変換用テンプレートは、３’から５’の向きで、前記標的配列xの相補配列ｘ’と、Ｃ種類の前記人工配列の相補配列α’～ｎ’とを含み、更に、これらの当該相補配列ｘ’、α’～ｎ’間にそれぞれ介在しているＣ個のニッカーゼ認識部位を含む、
（ｄ）反応場に、当該試料、前記変換用テンプレート、ニッカーゼ及びポリメラーゼを持ち込み、以下の（ｉ）～（ｖ）を含む反応を進行させることにより、所望の時間に亘り連続的に当該Ｃ種類の人工配列α～ｎを複製することと；
（ｉ）当該標的配列ｘを前記変換用テンプレートに沿って伸長させ、第１の伸長鎖を得ること、
（ii）当該第１の伸長鎖に含まれる当該ニッカーゼ認識部位を当該ニッカーゼで切断すること、及び
（iii）切断された第１の伸長鎖に由来する当該標的配列を、当該ポリメラーゼの鎖置換反応によって、当該変換用テンプレートに沿って伸長させること；並びに
（iv）前記切断された第１の伸長鎖に由来する人工配列α～人工配列ｎをそれぞれ前記変換用テンプレートに沿って伸長させ、第２の伸長鎖～第ｎの伸長鎖を得ること、
（ｖ）前記第２の伸長鎖～第ｎの伸長鎖にそれぞれ含まれる当該ニッカーゼ認識部位を当該ニッカーゼで切断すること、
（vi）切断された第２の伸長鎖～第ｎの伸長鎖にそれぞれ由来する人工配列α～人工配列ｎを当該ポリメラーゼの鎖置換反応によって、当該変換用テンプレートに沿って伸長させること、
（ｅ）当該変換用テンプレートによって変換された当該標的核酸についての情報を得ることと、
（ｄ）得られた情報に基づいて、当該試料中の当該標的核酸量を算出することと、
を備える、一本鎖核酸定量法。
【請求項3】
前記標的核酸の長さが、５塩基～３０塩基である短鎖核酸である請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記標的核酸が、ＲＮＡ又はＤＮＡである請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記標的核酸が、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｏｌｉｇｏＤＮＡである請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項6】
当該反応温度が、３０～６０℃の間の等温である請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項7】
試料中の標的核酸を増幅又は定量を行うための核酸反応キットであって、
変換用テンプレート、ニッカーゼ試薬及び鎖置換ポリメラーゼ試薬を含み、
前記標的核酸が標的配列ｘを有するとき、
前記変換用テンプレートは、３’から５’の向きで、前記標的配列ｘの相補配列ｘ’と、Ｃ種類の人工配列の相補配列α’～ｎ’とを含み、更に、これらの当該相補配列ｘ’、α’～ｎ’の配列間にあるＣ個のニッカーゼ認識部位を含み、
ここで、人工配列α～ｎ（ここでＣは２～１０の整数であり、ｎはＣ－１の整数である）は、前記試料中に存在しない配列であり、且つ互いに異なる配列で示される、
核酸反応キット。
変換用テンプレート、ニッカーゼ試薬及び鎖置換ポリメラーゼ試薬を含み、
前記標的核酸が標的配列ｘを有するとき、
前記変換用テンプレートは、３’から５’の向きで、前記標的配列ｘの相補配列ｘ’と、Ｃ種類の人工配列の相補配列α’～ｎ’とを含み、更に、これらの当該相補配列ｘ’、α’～ｎ’の配列間にあるＣ個のニッカーゼ認識部位を含み、
ここで、人工配列α～ｎ（ここでＣは２～１０の整数であり、ｎはＣ－１の整数である）は、前記試料中に存在しない配列であり、且つ互いに異なる配列で示される、
核酸反応キット。
【請求項8】
検出対象としての試料と、請求項７に記載の核酸反応キットとを持ち込むための入力部と、
前記入力部から持ち込まれた試料及び当該核酸反応キットを受け取り、請求項１又は２に記載の核酸変換連鎖増幅に従って前記人工配列α～ｎを複製することにより、前記試料中の標的配列の情報を変換増幅する核酸増幅ユニットと、
前記核酸増幅ユニットにおいて増幅された人工的な核酸配列ｎを有する核酸断片の核酸量を定量する核酸測定ユニットと
を備える核酸定量検出装置。
前記入力部から持ち込まれた試料及び当該核酸反応キットを受け取り、請求項１又は２に記載の核酸変換連鎖増幅に従って前記人工配列α～ｎを複製することにより、前記試料中の標的配列の情報を変換増幅する核酸増幅ユニットと、
前記核酸増幅ユニットにおいて増幅された人工的な核酸配列ｎを有する核酸断片の核酸量を定量する核酸測定ユニットと
を備える核酸定量検出装置。
【請求項9】
前記核酸増幅ユニットが、そこにおいて核酸反応を行うように構成された反応部と、前記反応部の温度を制御する温度管理部とを備え、前記核酸測定ユニットが、核酸からの信号を検知する測定部と得られた信号に基づいて核酸量を決定する計算部とを備える、請求項８に記載の核酸定量検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明の実施形態は、核酸増幅方法、一本鎖核酸定量法、核酸定量キット及び核酸増幅装置に関する。
【背景技術】
【0002】
癌をはじめとする疾患の早期発見において、体液中のバイオマーカーを検出するリキッドバイオプシーは、侵襲性の低さ、判定の速さから注目されている。
【0003】
例えば、ｍｉＲＮＡやｃｔＤＮＡなどの腫瘍に由来する短い核酸は、早期診断のほか、分子標的薬の選択や、病態モニタリングなど、幅広い用途へのバイオマーカーとしての適用が期待されている。一般的に、このようなｍｉＲＮＡやｃｔＤＮＡは、検体中の含有量が少なく、その検出には増幅が必要とされる。
【0004】
一方、核酸の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）などの温度変化サイクルを利用する方法や、ＬＡＭＰ法、ＲＰＡ法、ＳＤＡ法、ＨＤＡ法及びＥＸＰＲ法などの等温核酸増幅方法を利用する方法などが利用されている。短い核酸は、これらの増幅法に必要とされるプライマーセットの全ての要素を十分に設計することが難しい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、核酸増幅方法、一本鎖核酸定量法、核酸定量キット及び核酸増幅装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
実施形態の核酸増幅方法は、試料中の一本鎖の標的核酸の配列を、置換配列に変換し増幅するための方法である。
当該方法は、
ニッカーゼ認識部位を３’側に接続した人工的な核酸配列の相補配列を２種類以上連続して接続し、さらにその３’側に直列に前記標的核酸の相補的配列が接続している変換用テンプレートと、当該標的核酸とをハイブリダイズさせることと、
ポリメラーゼによって、当該変換用テンプレート上の当該ニッカーゼ認識部位とそれに続く当該人工的な核酸配列を連続的に複製することと、
複製された配列中のニッカーゼ認識部位をニッカーゼで切断してニッカーゼ切断部位を生成させること、
当該ポリメラーゼによるニッカーゼ切断部位からの伸長によって、当該ニッカーゼ認識部位と続く人工的な核酸配列を遊離させながら、更なる当該ニッカーゼ認識部位と続く人工的な核酸配列を連続的に複製すること
当該遊離したニッカーゼ認識部位と続く人工的な核酸配列を、当該変換用テンプレートにハイブリダイズさせることと、
当該ポリメラーゼによって、当該変換用テンプレート上の当該ニッカーゼ認識部位とそれに続く当該人工的な核酸配列を連続的に複製することと
を備える。
当該方法は、
ニッカーゼ認識部位を３’側に接続した人工的な核酸配列の相補配列を２種類以上連続して接続し、さらにその３’側に直列に前記標的核酸の相補的配列が接続している変換用テンプレートと、当該標的核酸とをハイブリダイズさせることと、
ポリメラーゼによって、当該変換用テンプレート上の当該ニッカーゼ認識部位とそれに続く当該人工的な核酸配列を連続的に複製することと、
複製された配列中のニッカーゼ認識部位をニッカーゼで切断してニッカーゼ切断部位を生成させること、
当該ポリメラーゼによるニッカーゼ切断部位からの伸長によって、当該ニッカーゼ認識部位と続く人工的な核酸配列を遊離させながら、更なる当該ニッカーゼ認識部位と続く人工的な核酸配列を連続的に複製すること
当該遊離したニッカーゼ認識部位と続く人工的な核酸配列を、当該変換用テンプレートにハイブリダイズさせることと、
当該ポリメラーゼによって、当該変換用テンプレート上の当該ニッカーゼ認識部位とそれに続く当該人工的な核酸配列を連続的に複製することと
を備える。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】第１の実施形態の核酸変換連鎖増幅方法の一例を示すスキームである。
【図2】第１の実施形態の核酸変換連鎖増幅方法の一例を示す模式図である。
【図3A】第２の実施形態の一例を示すワークフローである。
【図3B】第２の実施形態の一例を示すワークフローである。
【図4】第２及び第３の実施形態の一例を示す模式図である。
【図5】第３の実施形態の一例を示す模式図である。
【図6】例１のシミュレーション結果を示すグラフである。
【図7】例２の実験結果を示すグラフである。
【図8】例３の実験結果を示すグラフである。
【図9】例４の実験結果を示すグラフである。
【図10】例５の実験結果を示すグラフである。
【図11】第４の実施形態の一例を示すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【0008】
以下に、図面を参照しながら、種々の実施形態について説明する。なお、実施形態を通して共通の構成には同一の符号を付すものとし、重複する説明は省略する。また、各図は実施形態とその理解を促すための模式図であり、その形状や寸法、比などは実際と異なる個所があるが、これらは以下の説明と公知の技術を参酌して適宜、設計変更することができる。
【0009】
（第１の実施形態）
第１の実施形態の核酸増幅方法は、詳しくは、核酸変換連鎖増幅方法とも称する。第1の実施形態の１例について図１用いて説明する。図１に示すように、第１の実施形態に従う当該方法は、以下のような４つの工程を備える。即ち、ニッカーゼ認識部位を３’側に接続した人工的な核酸配列を２種類以上連続して接続し、さらにその３’側に直列に前記標的核酸の相補的配列が接続している変換用テンプレートと、標的核酸とをハイブリダイズすること（Ｓ１１）、ポリメラーゼによって、変換用テンプレート上の当該ニッカーゼ認識部位とそれに接続する人工的な核酸配列を連続的に複製すること（Ｓ１２）、複製された配列を、ニッカーゼ認識部位でニッカーゼにより切断すること（Ｓ１３）及びポリメラーゼの鎖置換反応によって、所望の時間に亘り、人工的な核酸配列が複製されること（Ｓ１４）。
第１の実施形態の核酸増幅方法は、詳しくは、核酸変換連鎖増幅方法とも称する。第1の実施形態の１例について図１用いて説明する。図１に示すように、第１の実施形態に従う当該方法は、以下のような４つの工程を備える。即ち、ニッカーゼ認識部位を３’側に接続した人工的な核酸配列を２種類以上連続して接続し、さらにその３’側に直列に前記標的核酸の相補的配列が接続している変換用テンプレートと、標的核酸とをハイブリダイズすること（Ｓ１１）、ポリメラーゼによって、変換用テンプレート上の当該ニッカーゼ認識部位とそれに接続する人工的な核酸配列を連続的に複製すること（Ｓ１２）、複製された配列を、ニッカーゼ認識部位でニッカーゼにより切断すること（Ｓ１３）及びポリメラーゼの鎖置換反応によって、所望の時間に亘り、人工的な核酸配列が複製されること（Ｓ１４）。
【0010】
詳しくは、当該方法は、図２に示すように、
ニッカーゼ認識部位を３’側に接続した人工的な核酸配列の相補配列を２種類以上連続して接続し、さらにその３’側に直列に前記標的核酸の相補的配列が接続している変換用テンプレートと、当該標的核酸とをハイブリダイズさせることと（ａ）及び（ｂ）、
ポリメラーゼによって、当該変換用テンプレート上の当該ニッカーゼ認識部位とそれに続く当該人工的な核酸配列を連続的に複製することと（ｂ）、
複製された配列中のニッカーゼ認識部位をニッカーゼで切断すること（ｃ）、
当該ポリメラーゼの鎖置換反応による、ニッカーゼ切断部位からの伸長によって（ｄ）、当該ニッカーゼ認識部位と続く人工的な核酸配列を遊離させながら（ｆ）、更なる当該ニッカーゼ認識部位と続く人工的な核酸配列を連続的（ｃ～ｅ、ｆ）に複製することと（ｅ）、
当該遊離したニッカーゼ認識部位と続く人工的な核酸配列を、当該変換用テンプレートにハイブリダイズさせることと（ｇ）、
当該ポリメラーゼによって、当該変換用テンプレート上の当該ニッカーゼ認識部位とそれに続く当該人工的な核酸配列を連続的に複製することと（ｈ～ｊ、ｋ）
を含む。
ニッカーゼ認識部位を３’側に接続した人工的な核酸配列の相補配列を２種類以上連続して接続し、さらにその３’側に直列に前記標的核酸の相補的配列が接続している変換用テンプレートと、当該標的核酸とをハイブリダイズさせることと（ａ）及び（ｂ）、
ポリメラーゼによって、当該変換用テンプレート上の当該ニッカーゼ認識部位とそれに続く当該人工的な核酸配列を連続的に複製することと（ｂ）、
複製された配列中のニッカーゼ認識部位をニッカーゼで切断すること（ｃ）、
当該ポリメラーゼの鎖置換反応による、ニッカーゼ切断部位からの伸長によって（ｄ）、当該ニッカーゼ認識部位と続く人工的な核酸配列を遊離させながら（ｆ）、更なる当該ニッカーゼ認識部位と続く人工的な核酸配列を連続的（ｃ～ｅ、ｆ）に複製することと（ｅ）、
当該遊離したニッカーゼ認識部位と続く人工的な核酸配列を、当該変換用テンプレートにハイブリダイズさせることと（ｇ）、
当該ポリメラーゼによって、当該変換用テンプレート上の当該ニッカーゼ認識部位とそれに続く当該人工的な核酸配列を連続的に複製することと（ｈ～ｊ、ｋ）
を含む。
【0011】
このような方法は、更に図２を参照しながら言い換えれば、
ニッカーゼ認識部位を３’側に接続した人工的な核酸配列の相補配列を２種類以上連続して接続し、さらにその３’側に直列に前記標的核酸の相補配列が接続している当該置換配列を有する変換用テンプレート２（２ａ、２ｂ）と、当該標的核酸１とをハイブリダイズさせることと（ｂ）、
前記ハイブリダイズした標的核酸をポリメラーゼ３によって伸長させ（ｂ）、当該ニッカーゼ認識部位とそれに続く前記人工的な核酸配列を連続して複製させることと（ｃ～ｅ、ｆ）、
前記複製された配列に含まれる当該ニッカーゼ認識部位を対応するニッカーゼ５で切断することと（ｃ）、
前記切断されたニッカーゼ切断部位に当該ポリメラーゼ３を結合させ、鎖置換反応によって、当該ニッカーゼ認識部位とそれに続く当該人工的な核酸配列を複製する（ｄ）のと同時に、当該ニッカーゼ認識部位とそれに続く当該人工的な核酸配列１１１ａ、１１２ａを当該変換用テンプレートから遊離させることと（ｆ）、
当該遊離された人工的な核酸配列１１１ａと当該変換用テンプレート２ｂとをハイブリダイズさせることと（ｇ）、
前記ハイブリダイズした当該人工的な核酸配列１１１ａをポリメラーゼ３によって伸長させ（ｈ）、当該ニッカーゼ認識部位とそれに接続する前記人工的な核酸配列を連続して複製させることと（ｈ～ｊ、ｋ）、
を備える。
ニッカーゼ認識部位を３’側に接続した人工的な核酸配列の相補配列を２種類以上連続して接続し、さらにその３’側に直列に前記標的核酸の相補配列が接続している当該置換配列を有する変換用テンプレート２（２ａ、２ｂ）と、当該標的核酸１とをハイブリダイズさせることと（ｂ）、
前記ハイブリダイズした標的核酸をポリメラーゼ３によって伸長させ（ｂ）、当該ニッカーゼ認識部位とそれに続く前記人工的な核酸配列を連続して複製させることと（ｃ～ｅ、ｆ）、
前記複製された配列に含まれる当該ニッカーゼ認識部位を対応するニッカーゼ５で切断することと（ｃ）、
前記切断されたニッカーゼ切断部位に当該ポリメラーゼ３を結合させ、鎖置換反応によって、当該ニッカーゼ認識部位とそれに続く当該人工的な核酸配列を複製する（ｄ）のと同時に、当該ニッカーゼ認識部位とそれに続く当該人工的な核酸配列１１１ａ、１１２ａを当該変換用テンプレートから遊離させることと（ｆ）、
当該遊離された人工的な核酸配列１１１ａと当該変換用テンプレート２ｂとをハイブリダイズさせることと（ｇ）、
前記ハイブリダイズした当該人工的な核酸配列１１１ａをポリメラーゼ３によって伸長させ（ｈ）、当該ニッカーゼ認識部位とそれに接続する前記人工的な核酸配列を連続して複製させることと（ｈ～ｊ、ｋ）、
を備える。
【0012】
このような核酸増幅方法、即ち、核酸変換連鎖増幅方法について、図２を参照しながら説明する。このような方法は、試料中の一本鎖の標的核酸ｘ１の配列を、異なる核酸配列に変換し増幅するための方法である。ここで、変換されるべき異なる核酸配列とは、変換連鎖増幅テンプレート２に相補配列として含まれる人工的な核酸配列α及びβである。「変換連鎖増幅テンプレート」は、「変換用テンプレート」及び「CCAテンプレート（Conversion Chain Amplification template）」とも称し、これらの名称は交換可能に使用される。変換連鎖増幅テンプレート２は、ニッカーゼ認識部位を３’側に接続した人工的な核酸配列を２種類以上連続して接続し、さらにその３’側に直列に標的核酸ｘの相補的配列ｘ’が接続している。言い換えれば、変換連鎖増幅テンプレートは、３’端から５’側に向けて、標的核酸ｘの相補的配列ｘ’、ニッカーゼ認識部位、第１の人工的な配列の相補配列α’、ニッカーゼ認識部位、第２の人工的な配列の相補配列β’を有する（ａ）。この変換連鎖増幅テンプレート２ａに対して、標的核酸ｘ１がハイブリダイズすると、ポリメラーゼ３によって伸長４ａが始まる（ｂ）。その結果得られた伸長鎖１０１ａは、続いて、ニッカーゼ認識部位、この場合、２か所の認識部位がニッカーゼ５によって切断される（ｃ）。切断によって露出した標的核酸ｘ１の３’末端にポリメラーゼ３が結合し（ｄ）、当該ポリメラーゼの鎖置換反応４ｂが生じる。標的核酸ｘ１が変換連鎖増幅テンプレート２ａに沿って伸長４ｂされ、伸長鎖１０１ｂが生じる（ｄ）。同時に、鎖置換反応によって（ｄ）、第１の人工的な配列断片α１１１ａと第２の人工的な配列断片β１１２ａがテンプレート２ａから遊離される（ｆ）。生じた伸長鎖１０１ｂ（ｅ）は、ニッカーゼ５により切断される（ｃ）。（ｃ）～（ｅ）及び（ｆ）は反応場における反応が続く限り繰り返す。一方、遊離された第１の人工的な配列断片α１１１ａは、別途テンプレート２ｂにハイブリダイズし、ポリメラーゼ３によって伸長４ａされる（ｇ）。得られた伸長鎖１０２ａの認識部位は、ニッカーゼ５によって切断される（ｈ）。切断により３’末端が切り出された人工的な配列αの３’末端にポリメラーゼ３が結合し、鎖置換反応によって伸長４ｂされ、伸長鎖１０２ｂが形成される（ｉ）。この鎖置換反応は、伸長４ｂと同時に第２の人工的な配列β断片１１２ｂを遊離する（ｋ）。伸長４ｂにより得られた伸長鎖１０２ｂは（ｊ）、ニッカーゼ５によって切断される（ｈ）。ポリメラーゼによる伸長とニッカーゼによる切断（ｈ～ｊ及びｋ）は、反応を停止するまで、或いは酵素又は基質などによる至適条件が失われるまで繰り返す。このような変換連鎖増幅法（Conversion Chain Amplification、CCA）は、大きな温度変化やサーマルサイクラーを必要としない、等温増幅反応を含む等温増幅方法である。反応温度の例は、３０℃～６０℃の間の等温である。
【0013】
第１の実施形態の核酸変換連鎖増幅方法によれば、標的核酸に関する情報を、べき乗的に増幅することが可能である。その結果、ｐＭ単位で少量で試料に存在する標的核酸に関する情報が、例えば、より容易に測定可能な大きさの情報に変換することが可能である。また、標的核酸の長さが、一般的な増幅反応に必要なプライマー結合部位を設計するには短すぎるような場合であっても、その情報をテンプレート上に変換することによって増幅することが可能である。
【0014】
（第２の実施形態）
第１の実施形態の核酸変換連鎖増幅方法を利用して、標的核酸を検出又は定量することが可能である。第２の実施形態として、そのような標的核酸の定量方法の１例である一本鎖核酸定量法を図３Ａ及び図３Ｂを参照しながら説明する。
第１の実施形態の核酸変換連鎖増幅方法を利用して、標的核酸を検出又は定量することが可能である。第２の実施形態として、そのような標的核酸の定量方法の１例である一本鎖核酸定量法を図３Ａ及び図３Ｂを参照しながら説明する。
【0015】
まず、一本鎖核酸定量法において定量されるべき１本鎖の標的核酸を決定する。その標的核酸上の標的配列ｘを設定する（Ｓ２１）。標的配列ｘの長さは、変換用テンプレートへのハイブリダイズが可能な長さであればよく、標的核酸の全長であっても、標的核酸の一部分であってもよい。標的配列ｘの長さは、例えば、約５塩基長～約１００塩基長、或いは例えば、約１５塩基長～約２５塩基長の範囲であってもよい。また、標的核酸は、ＲＮＡ、例えば、ｍｉＲＮＡ及び／又はｓｉＲＮＡであっても、ＤＮＡ、例えば、ｏｌｉｇｏＤＮＡなどであってもよいが、これに限定されるものではない。実施形態によれば、標的核酸の種類に関係なく、変換用テンプレートとのハイブリダイズから始まる反応に持ち込むことが可能である。即ち、例えば、標的核酸がＲＮＡであっても逆転写することなく当該反応に供される。その点においても、実施形態は、簡便且つ有用性に優れる。
【0016】
続いて、試料中に存在しない配列であり、且つ互いに異なる配列で示されるＣ種類の人工配列α～ｎ（ここでＣは、２以上の整数、例えば、２～１０の整数であり、ｎはＣ番目のギリシャ文字である）を設計する（Ｓ２２）。この人工配列α～ｎは、変換用テンプレートに使用するための人工配列である。ここにおいて「人工配列」又は「人工的な配列」とは、少なくとも試験の対象となる試料中に存在しない配列であればよい。従って、天然に存在しない全くの人工的な配列を設計してもよく、或いは天然に存在する配列のうち、試料中に存在しない配列を選択してもよい。また例えば、Ｃ＝２の場合には、図２（ｂ）に示すように２種類の人工配列、即ち、人工配列α、人工配列βが設計される。ここにおいて同じアルファベット又はギリシャ文字に対して付与される「’」は、互いの配列が相補的であることを示す。従って、配列ｘと配列ｘ’は互いに相補的であり、配列αと配列α’も互いに相補的関係にあると理解されればよい。最小単位としての人工配列の長さは、例えば、５０塩基長未満、或いは例えば、約２５塩基長未満、或いは例えば、約１２塩基長未満範囲であってよく、１つの変換用テンプレートに含まれる複数種類の人工配列の長さは、全て同塩基長であっても、異なる長さであってもよい。１つの変換用テンプレートに含まれる「複数種類の」又は「複数部位に存在する」人工配列の塩基配列を総称して、「複数ユニット」とも解され得る。
【0017】
続くＳ２３では、変換用テンプレートを準備する。変換用テンプレートは、３’から５’の向きで、前記標的配列xの相補配列x’と、Ｃ種類の前記人工配列の相補配列α’～ｎ’とを含み、更に、これらの当該相補配列x’、α’～ｎ’間にそれぞれ介在しているＣ個のニッカーゼ認識部位を含む。例えば、Ｃ＝２の場合の例は、図２（ｂ）に示し、上述した通りである。Ｃ＝４の例は、後述する図５に示すとおりであり、３’端に標的配列xの相補配列x’、そこから５’側に向けて、ニッカーゼ認識部位、人工配列αの相補配列α’、ニッカーゼ認識部位、人工配列βの相補配列β’、ニッカーゼ認識部位、人工配列γの相補配列γ’、ニッカーゼ認識部位、人工配列δの相補配列δ’が連結している。従って、変換用テンプレートの５’端の配列は、人工配列δの相補配列δ’である。これを５’→３’の方向で示すと、人工配列δの相補配列δ’、ニッカーゼ認識部位、人工配列γの相補配列γ’ニッカーゼ認識部位、人工配列βの相補配列β’ニッカーゼ認識部位、人工配列αの相補配列α’、ニッカーゼ認識部位、標的配列xの相補配列x’となる。ここで、「ニッカーゼ認識部位」とは、変換用テンプレートとその相補鎖である伸長鎖との二本鎖が形成されたときに、ニッカーゼにより認識される部位であり、その部分の配列を指す。実施形態においては、ニッカーゼにより認識される認識部位の二本鎖のうち、常に伸長鎖側のニッカーゼ認識部位が切断される。例えば、そのような切断部分は、５’端から２つ目の塩基と３つ目の塩基の間であり得るが、これに限定するものではない。変換用テンプレートと伸長鎖とに含まれるニッカーゼ認識部位に係る配列は互いに相補配列であるが、上記の事情から「ニッカーゼ認識部位」又は「ニッカーゼ認識配列」の「相補配列」とは記載しない。
【0018】
設計される変換用テンプレートは、例えばＤＮＡなどであるが、ＲＮＡもしくは、ＬＮＡなどの人工核酸を一部含んでいてもよい。使用される反応温度が５０℃前後であれば、ＤＮＡ配列の長さが１０～２０塩基であることが望ましい。また、化学反応の干渉やリークを防ぐため、試料内に含まれる配列を避けるような配列を設定することが望ましい。また、増幅工程において、自身で二次構造体を形成したり、テンプレート同士がハイブリダイズしたりして、テンプレートの３’末端から伸長が起きることにより、非特異的に増幅が始まることがある。したがって、テンプレートの３’はポリメラーゼによる伸長を防ぐために修飾されていることが望ましい。リン酸化、蛍光色素、クエンチャ―、ビオチン、チオールなどが考えられるが、伸長が起きない効果を得られるならば、これらの形態に限定されない。変換用テンプレートに含ませる複数個所に配置されるニッカーゼ認識部位は、何れも同じ配列であればよい。
【0019】
Ｓ２４において、反応場に、試料、変換用テンプレート、ニッカーゼ及びポリメラーゼを持ち込み、至適反応温度に維持し、後述する（ｉ）～（vi）を含む反応を進行させることにより、所望の時間に亘り連続的にＣ種類の人工配列α～ｎを複製する。ここでＣは２以上の整数、例えば、２～９の整数であり、ｎはＣ番目のギリシャ文字である。
【0020】
反応に使用されるマスターミックスの条件は次の通りである。ｄＮＴＰの濃度域は、低濃度すぎると十分なＤＮＡ増幅が得られず、逆に高濃度すぎても、非特異的な増幅が起きやすくなる。望ましい濃度域は１０μＭ以上５００μＭ以下、より望ましくは１００μＭである。テンプレート濃度域も同様の傾向があり、望ましい濃度域は１～５０ｎＭ、より望ましい濃度１０ｎＭである。
【0021】
ポリメラーゼは鎖置換性もつポリメラーゼであってもよい。また、エキソヌクレアーゼ活性を欠かせたポリメラーゼであってもよい。例として、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ－）ポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｂｃａポリメラーゼなどが挙げられる。
【0022】
ニッキング酵素は二本鎖ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡだけを切断するものから選択できる。例えば、ＮＢ．ＢｓｍＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、ＮＢ．ＢｓｓＳＩ、ＮＢ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩを利用することができる。
【0023】
Ｓ２４にて進行する反応について、図３Ｂ並びに図４を参照しながら説明する。反応場に試料及び変換用テンプレートを入力する（図４（ａ））。試料中に標的核酸ｘ１が存在するとき、反応場を至適反応条件とすることにより、次のような反応が進行する。至適反応条件は、予め定めた反応に相応しいマスターミックス、ポリメラーゼ、ニッカーゼ、ｐＨ、温度などに反応場をセットすることで達成されてよい。
【0024】
Ｓ３１において、（ｉ）標的配列ｘ１を変換用テンプレートに沿って伸長させ、第１の伸長鎖４ａを得る（図４（ｂ））。（ii）第１の伸長鎖４ａに含まれるニッカーゼ認識部位をニッカーゼ５で切断する（Ｓ３２、図４（ｃ））。（iii）切断された第１の伸長鎖４ａに由来する標的配列を、変換用テンプレートに沿って再伸長させる（Ｓ３３、（ｄ））。ここで、Ｓ３３及び図４（ｄ）における、ポリメラーゼによる再伸長４ｂと同時に、切断されたニッカーゼ認識部位を有する第１の人工配列α１１１a～第Ｃの人工配列ｎ１１２ａがそれぞれ核酸断片として遊離する（ｆ）。（iv）切断された第１の伸長鎖１１１ａに由来する人工配列α～人工配列ｎ－１をそれぞれ変換用テンプレートに沿って伸長させ（ｇ）、第２の伸長鎖～第Ｃ－１の伸長鎖１０２ａ～１０２aｎを得る（Ｓ３４、（ｈ））、（ｖ）第２の伸長鎖～第Ｃ－１の伸長鎖にそれぞれ含まれるニッカーゼ認識部位をニッカーゼで切断する（Ｓ３５、（ｈ））。（vi）切断された第２の伸長鎖～第ｃ－１の伸長鎖にそれぞれ由来する人工配列α～人工配列ｎ－１を当該ポリメラーゼの鎖置換反応によって、当該変換用テンプレートに沿って再伸長させること（Ｓ３６（ｉ））。ここで、Ｓ３６及び図４（ｉ）における、ポリメラーゼによる再伸長と同時に、切断されたニッカーゼ認識部位を有する第Ｃの人工配列ｎ１１２ｂが核酸断片として遊離する（ｋ）。
【0025】
このような反応によって出力されるのは、図４（ｆ）において遊離された、人工配列α断片～人工配列ｎ断片、並びに同（ｋ）の人工配列ｎ断片である。このうちの人工配列α断片～人工配列ｎ－１断片は、変換用テンプレートにハイブリダイズして伸長反応に利用される。従って、最終的には、標的核酸ｘとして入力された情報は、人工配列ｎ断片に変換され、且つその情報量は連鎖する増幅反応によって増幅される。この増幅に関しては、図５を用いて後述する。
【0026】
以上のような図３Ｂに示した反応の後、操作プロセスは、図３ＡのＳ２５へと進む。Ｓ２５では、変換用テンプレートにより変換された標的核酸についての情報を得る。即ち、ここでは、例えば、出力された人工配列ｎ断片の核酸量を測定すればよい。この測定は、人工配列ｎを特異的に定量する何れの方法を使用することも可能である。例えば、標識された人工配列ｎの相補配列ｎ’をハイブリダイズさせることにより検出してもよい。或いは、人工配列ｎ断片を特異的に捕捉し、定量してもよい。或いは、必要に応じて、反応場において増幅／複製された人工配列α～人工配列ｎ、及び／又は人工配列α断片～人工配列ｎ断片に関して、一括又は個別に核酸量を検出してもよい。
【0027】
Ｓ２５において核酸量を検出した後に、Ｓ２６に進み、得られた情報に基づいて、当該試料中の当該標的核酸量を得る（Ｓ２６）。例えば、予め定めた演算式、対応づけを示したテーブル及び／又は検量線などを使用して、Ｓ２５において得られた核酸量、即ち、測定値から標的核酸量を得る、例えば、算出して、操作手続きを終了する。
【0028】
ところで、一本鎖核酸定量法の操作手続きとしては、実行毎に、Ｓ２１の設定から手続きが開始されてもよく、或いは、Ｓ２１～Ｓ２３の手続きは予め行っておき、実際に実行する際には、Ｓ２４の反応場に試料及び変換用テンプレートを入力（図４（ａ））から手続きを開始してもよい。
【0029】
図５を参照しながら、変換連鎖増幅法（Conversion Chain Amplification）における変換効率について説明する。ＣＣＡテンプレートの例を図５に示した。これは上述した通り、４種類の人工配列α～δを用いる例である。即ち、Ｃ＝４であり、ｎ＝δの例である。３’末端には、標的核酸の相補配列ｘ’が配置され、各配列の間にはニッカーゼ認識部位が配置されている。このようなＣＣＡテンプレートに含まれるニッカーゼ認識部位はＣ個、即ち、４個である。
【0030】
（第３の実施形態）
第３の実施形態は、図５に示すようなＣＣＡテンプレートである。上述した通り、ＣＣＡテンプレートは、「変換連鎖増幅テンプレート」は、「変換用テンプレート」とも称される。詳しい構成は、上述した通りである。このようなＣＣＡテンプレートを使用する実施形態に従う反応における増幅効率について、以下、図５を用いて説明する。
第３の実施形態は、図５に示すようなＣＣＡテンプレートである。上述した通り、ＣＣＡテンプレートは、「変換連鎖増幅テンプレート」は、「変換用テンプレート」とも称される。詳しい構成は、上述した通りである。このようなＣＣＡテンプレートを使用する実施形態に従う反応における増幅効率について、以下、図５を用いて説明する。
【0031】
反応場に存在する増幅産物濃度［Ｐ］と、基質濃度［Ｓ］の関係は、ミカエリス＝メンテンの式によって表される。ここで、基質とは、標的核酸ｘ又は各人工配列α～δである。Ｖmaxは基質濃度が無限大のときの反応速度である。Ｋｍは、ミカエリス・メンテン定数であり、ｖ＝Ｖmax／２（最大速度の半分の速度）を与える基質濃度を表す。反応時間全体において基質濃度が低いとし、［Ｓ］＜＜Ｋｍであり、反応速度ｖは濃度に比例させた。これらの式から、Ｃ＝１、即ち、１種類の人工配列の場合には、［α］＝［Ｘ］ｋｘｔとなり、標的核酸の濃度がそのままの量で情報変換されることが分かる。Ｃ＝２の場合には、［β］＝［Ｘ］ｋ１ｔ２ととなり、Ｃ＝３の場合には、［γ］＝［Ｘ］ｋ２ｔ３となり、Ｃ＝４の場合には、［γ］＝［Ｘ］ｋ３ｔ４となり、Ｃ＝ｎの場合には、［ｎ］＝［Ｘ］ｋｎ－１ｔｎとなる。従って、標的核酸の濃度は、使用する人工配列の種類数のべき乗で増幅される。実施形態に従う、核酸変換連鎖増幅方法及び一本鎖核酸定量法においては、増幅反応は、所望の反応時間の間維持され、即ち、所望の時間に亘り連続的に複製が繰り返される。所定の時間が経過した時点で、最下流となるＣ番目の人工配列ｎ、Ｃ＝４のこの場合には、人工配列δに関して、即ち、出力された人工配列δ断片の濃度を測定する。即ち、エンドポイントで人工配列ｎ断片を定量することで、増幅又は試験対象とした試料中に存在する標的核酸の濃度を、使用する人工配列の種類数のべき乗という増幅効率で観察することが可能となる。この増幅効率について以下に図６に示すグラフを用いて、以下、例１として説明する。
【0032】
（例１）
例１として、初期濃度に対する増幅率のシミュレーション結果を図６に示す。図６（ａ）のグラフは、縦軸にＤＮＡコピー数、横軸に増幅回数（＝増幅時間）としたときの増幅産物の濃度をプロットした。人工配列の種類数が増えることで増幅効率が著しく増大することが分かる。図６（ｂ）には、増幅時間１００をエンドポイントとしたときの、ＤＮＡコピー数を縦軸に、人工配列の種類数を横軸にプロットした。これらのグラフから、人工配列の種類数が増えることで増幅効率が著しく増大することが分かる。図６（ｂ）には、増幅時間１００をエンドポイントとしたときの、ＤＮＡコピー数を縦軸に、人工配列の種類数を横軸にプロットした。これらの結果から任意の時間で精度よく標的核酸を定量する方法の優れた増幅効率が理解される。特に、任意の時間における人工配列α～δの濃度が、初期濃度ｘと比例関係にあることも注目されたい。演算等の設定において簡便性を提供できる。指数関数増幅と違い、定量にリアルタイム観察を必要とせず、エンドポイントで定量することが可能であり、また、線形増幅よりも増幅率が良好である。
例１として、初期濃度に対する増幅率のシミュレーション結果を図６に示す。図６（ａ）のグラフは、縦軸にＤＮＡコピー数、横軸に増幅回数（＝増幅時間）としたときの増幅産物の濃度をプロットした。人工配列の種類数が増えることで増幅効率が著しく増大することが分かる。図６（ｂ）には、増幅時間１００をエンドポイントとしたときの、ＤＮＡコピー数を縦軸に、人工配列の種類数を横軸にプロットした。これらのグラフから、人工配列の種類数が増えることで増幅効率が著しく増大することが分かる。図６（ｂ）には、増幅時間１００をエンドポイントとしたときの、ＤＮＡコピー数を縦軸に、人工配列の種類数を横軸にプロットした。これらの結果から任意の時間で精度よく標的核酸を定量する方法の優れた増幅効率が理解される。特に、任意の時間における人工配列α～δの濃度が、初期濃度ｘと比例関係にあることも注目されたい。演算等の設定において簡便性を提供できる。指数関数増幅と違い、定量にリアルタイム観察を必要とせず、エンドポイントで定量することが可能であり、また、線形増幅よりも増幅率が良好である。
【0033】
（例２）
３種類の人工配列α、β、γを使用する場合の核酸増幅について実際に実験を行った結果を図７に示す。図７（ａ）に標的核酸と、ＣＣＡテンプレートの構成を示す。標的核酸としての入力ＤＮＡαを段階的な濃度（０、１４２ｐＭ、２８２ｐＭ、４２３ｐＭ）で用意した。これらの試料について増幅反応を行った。
３種類の人工配列α、β、γを使用する場合の核酸増幅について実際に実験を行った結果を図７に示す。図７（ａ）に標的核酸と、ＣＣＡテンプレートの構成を示す。標的核酸としての入力ＤＮＡαを段階的な濃度（０、１４２ｐＭ、２８２ｐＭ、４２３ｐＭ）で用意した。これらの試料について増幅反応を行った。
【0034】
最終濃度が１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、かつ、２５℃でｐＨ７．９のＮＥＢｕｆｆｅｒ３．１ｒ（New England Biolabs）を緩衝液として用いた。ポリメラーゼとして、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ－）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（New England Biolabs）を使用し、最終濃度は原液の１％の濃度となるようにした。ニッキング酵素として、ＮＢ．ＢｓｍＩ（New England Biolabs）を使用し、最終濃度は原液の４％の濃度となるようにした。ｄＮＴＰが１００μＭ、ＣＣＡテンプレートａ（表１を参照されたい）が１０ｎＭ、蛍光レポーター（表１を参照されたい）が１００ｎＭの最終濃度となるように調製した。
【0035】
【表1】
【0036】
反応体積１０μｌ、反応温度４８．５℃として、リアルタイムＰＣＲ装置Ｓｔｅｐ ｏｎｅ ｐｌｕｓ（Applied Biosystems）で出力ＤＮＡδ濃度の経時変化を蛍光測定した。結果を図７に示す。その結果、例１のシミュレーションと同様の良好な結果を得られた。図７（ａ）は、縦軸に蛍光強度、横軸にサイクル数、ここでは４８．５℃で等温反応を行ったので、言い換えると、横軸は１サイクルを３０秒とした反応時間である。標的核酸αの濃度が０の場合には、何れの時間においても蛍光強度の増加は見られず、従って、増幅産物は生じないことが明らかとなった。一方、標的核酸αの各濃度１４２ｐＭ、２８２ｐＭ、４２３ｐＭの試料についての蛍光強度は、増幅回数が増えるに従って初期濃度に比例したべき乗の増幅関数で増加した。図７（ｃ）には、縦軸に蛍光強度、横軸に標的核酸αの濃度として５０、１００、１５０及び２００サイクルの各反応サイクル時の結果をプロットした。何れの結果も理論値に近い結果であった。標的ＤＮＡαの存在に特異的な増幅産物の定量が可能であることが明らかとなった。
【0037】
従来では、短い核酸を定量的に増幅することは困難であったが、実施形態によれば、短い核酸についても定量することが可能となった。また、実施形態に従えば、単一時間測定で、短い核酸を定量可能な等温増幅法が提供されることが明らかとなった。簡便な設計により、２～３個以上直列化させて配置した人工配列について同時に増幅を進行させることで、変換反応を標的配列ｘから、人工配列α、人工配列β、人工配列γ、人工配列δと順に進めることが可能である。これにより、最終産物である人工配列δを出力することで簡便に短い核酸についても増幅及び／または定量することが可能となる。また、変換反応を連鎖させていくことにより、べき乗の関数で核酸を増幅することが可能となる。これにより、繰り返し配列や短鎖核酸を、低濃度の場合であっても容易にエンドポイント定量することができるようになる。また、エンドポイント定量であるので、高額な機器を導入することなく、簡便に定量することが可能である。電気消費やランニングコストも抑えることが可能である。従来のＰＣＲの場合、例えば、繰り返し配列を検出する場合などには、標的核酸を増幅しづらく、コンタミネーションのリスクもあるが、そのようなリスクも回避することが可能である。設計されるべき配列は、ＣＣＡテンプレートであるので、従来のプライマー設定と比べて設計が簡単である。実施形態によれば、安価、低エネルギーコストで標的核酸を定量する方法が提供された。
【0038】
（例３）
続いて、異なる温度条件について検討した。標的ＤＮＡα（濃度はそれぞれ０、１００ｐＭ）の存在下で、異なる温度条件で増幅反応を行った。
続いて、異なる温度条件について検討した。標的ＤＮＡα（濃度はそれぞれ０、１００ｐＭ）の存在下で、異なる温度条件で増幅反応を行った。
【0039】
最終濃度が１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、かつ２５℃でｐＨ７．９のＮＥＢｕｆｆｅｒ３．１ｒ（New England Biolabs）を緩衝液として用いた。ポリメラーゼとして、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ－）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（New England Biolabs）を使用し、最終濃度は原液の１％の濃度となるようにした。また、ニッキング酵素として、ＮＢ．ＢｓｍＩ（New England Biolabs）を使用し、最終濃度は原液の４％の濃度となるようにした。また、ｄＮＴＰが１００μＭ、ＣＣＡテンプレートａが１０ｎＭ、蛍光レポーターが１００ｎＭの最終濃度となるように調製した。
【0040】
反応体積１０μｌ、反応温度４８．５℃，５０℃，５２．５℃，５５℃として、リアルタイムＰＣＲ装置Ｓｔｅｐ ｏｎｅ ｐｌｕｓで出力ＤＮＡδ濃度の経時変化を蛍光測定した。
【0041】
結果を図８に示した。図８（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）は、反応温度４８．５℃、５２．５℃、５０℃、５５℃の場合にそれぞれ得られた結果について、縦軸に蛍光強度、横軸に反応サイクル数（反応時間）としてプロットした。標的ＤＮＡαの濃度が０の場合には蛍光強度の増加はみられなかった。標的ＤＮＡαの濃度が１００ｐＭの場合には、反応温度４８．５℃、５０℃、５２．５℃、５５℃の順番で測定される蛍光強度が小さい結果となった。これらの結果から、以上の条件において、標的ＤＮＡαの存在に特異的な増幅反応に温度依存性があることが明らかになった。使用した核酸配列条件では、４８．５℃、５０℃、５２．５℃、５５℃の順に蛍光強度が小さくなった。核酸配列に応じた至適温度を設定することが望ましい。
【0042】
（例４）
検出限界について検討するために、標的DNAαの濃度を変えて増幅反応を行った。最終濃度はそれぞれ次の通りである；０，１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭ）。温度条件は４８．５℃とした。
検出限界について検討するために、標的DNAαの濃度を変えて増幅反応を行った。最終濃度はそれぞれ次の通りである；０，１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭ）。温度条件は４８．５℃とした。
【0043】
最終濃度が１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、かつ２５℃でｐＨ７．９のＮＥＢｕｆｆｅｒ３．１ｒ（New England Biolabs）を緩衝液として用いた。ポリメラーゼとして、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ－）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（New England Biolabs）を使用し、最終濃度は原液の１％の濃度となるようにした。また、ニッキング酵素として、ＮＢ．ＢｓｍＩ（New England Biolabs）を使用し、最終濃度は原液の４％の濃度となるようにした。また、ｄＮＴＰが１００μＭ、ＣＣＡテンプレートａが１０ｎＭ、蛍光レポーターが１００ｎＭの最終濃度となるように調製した。
【0044】
反応体積１０μｌ、反応温度４８．５℃として、リアルタイムＰＣＲ装置Ｓｔｅｐ ｏｎｅ ｐｌｕｓで出力ＤＮＡδ濃度の経時変化を蛍光測定した。
【0045】
結果を図９に示した。この結果から、Ｃ＝３の３連鎖型のＣＣＡテンプレートの場合には、１００ｆＭ、１ｐＭの濃度では、蛍光強度の変化はほとんど見られず、増幅率が十分ではないことが考えられた。これに対して、１０ｐＭ及び１００ｐＭの場合には、反応時間に依存した蛍光強度の増加を観察することが可能であった。従って、この条件においては、１０ｐＭ程度までの検出が可能であることが明らかとなった。
【0046】
（例５）
異なる連鎖数による増幅効率の違いを検討した。図１０（ａ）に設計したＣＣＡテンプレートを模式的に示した。実験には、Ｃ＝３～９までのＣＣＡテンプレートをそれぞれ使用した。
異なる連鎖数による増幅効率の違いを検討した。図１０（ａ）に設計したＣＣＡテンプレートを模式的に示した。実験には、Ｃ＝３～９までのＣＣＡテンプレートをそれぞれ使用した。
【0047】
１ｐＭの標的ＤＮＡαの存在下での増幅反応を行った。最終濃度が１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、かつ２５℃でｐＨ７．９のＮＥＢｕｆｆｅｒ３．１ｒ（New England Biolabs）を緩衝液として用いた。ポリメラーゼとして、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ－）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（New England Biolabs）を使用し、最終濃度は原液の３％の濃度となるようにした。また、ニッキング酵素として、ＮＢ．ＢｓｍＩ（New England Biolabs）を使用し、最終濃度は原液の４％の濃度となるようにした。また、ｄＮＴＰが１００μＭ、蛍光レポーター（表２を参照されたい）が１００ｎＭの最終濃度となるように調製した。さらに、表２に記載の異なる配列を有するＣＣＡテンプレート（Ｃ＝３、４、５、６、７、９）を、最終濃度10nMになるようにそれぞれ調製した。
【0048】
【表2】
【0049】
反応体積１０μｌ、反応温度４８．５℃として、リアルタイムＰＣＲ装置Ｓｔｅｐ ｏｎｅ ｐｌｕｓ（Applied Biosystems）で出力ＤＮＡδ濃度の経時変化を蛍光測定した。
【0050】
結果を図１０に記載する。図１０（ａ）は、蛍光強度を縦軸、反応サイクル数（反応時間）を横軸に結果をプロットした。図１０（ｃ）は、蛍光強度を縦軸、ＣＣＡテンプレート中の人工配列の繰り返し回数（Ｃ）として結果をプロットした。
【0051】
１ｐＭの濃度はＣ＝３の変換数では増幅レベルが非常に低かったが、連鎖数を増やすことにより、増幅速度の増加を確認することができた。連鎖数がＣ＝３からＣ＝６のケースにおいては、連鎖数を増やすことで、増幅速度も増えることが示された。その一方で、Ｃ＝７以上になると、増幅反応の伸びがゆるやかになった。本反応においては、変換反応にポリメラーゼやｄＮＴＰが大量に使われることが考えられる。連鎖数が多すぎる場合、これらの分子がより上流の連鎖で大量に使われてしまうため、一番下流の出力ＤＮＡの産出速度が低下してしまうのではないかと考えられた。
【0052】
（第４の実施形態）
第４の実施形態として核酸定量検出システムが提供される。図１１に示すように、核酸定量検出システム２００は、入力部２１０と、核酸増幅ユニット２２０と、核酸測定ユニット２３０とを備える。入力部２１０は、検出対象である試料、変換用テンプレート、ポリメラーゼ及びニッカーゼ、並びに反応に必要な物質を反応場に持ち込むための投入口であり得る。核酸増幅ユニット２２０は、そこにおいて核酸反応を行うことが可能な反応場、温度調整機構、送液機構、溶液保持層、廃液層などを含んでよい（図示せず）。反応場は、これらに限定するものではないが、反応容器、反応流路、反応アレイ、平面上に形成された凹部などであり得る。温度調整機構は、ヒーターなどであってよい。核酸測定ユニット２３０は、核酸増幅ユニット２２０において得られた増幅産物を検出及び定量する測定機構を備える。測定機構は、蛍光（例えば、スペクトル選択的に）、化学発光、色彩情報（例えば、カラメトリー測定手段により）、形態変化などの光学的信号、電気化学的信号などのなどを測定することにより、目的とする増幅産物を検出するように構成され得る。そのような手段は、それ自身公知の何れかの手段を使用することが可能である。例えば、一般的に生化学分野において使用される情報の可視化手段を用いることも可能である。また、入力（検出対象）の核酸増幅ユニットで増幅する前のステップとして、検出対象を人工的に設計した塩基配列に変換するステップを設けてもよい。そのようなステップを行うための線形増幅器又は単純変換器（図示せず）を核酸増幅ユニット２２０が含んでいてもよい。即ち、これにより、まずは検出対象を人工ＤＮＡに変換する反応が行われる。例えば、検出対象がｍＲＮＡなどの長い塩基配列であった場合や、ｄｓＤＮＡなどで直接ハイブリダイズさせることが難しい場合には、変換反応を用いて一旦人工塩基にしたのち、それを変換連鎖増幅してもよい。このような線形増幅器及び単純変換器は、上述した核酸増幅ユニットと同様の構成を有し得る。例えば、核酸増幅ユニット、線形増幅器及び単純変換器がそれぞれ独立して反応を行うように３つの反応場が配置されてもよい。１つの反応場が、核酸増幅ユニット、線形増幅器及び単純変換器の役割を担ってもよい。或いは、核酸増幅ユニット２２０とは独立して、核酸定量検出システム２００が、線形増幅器又は単純変換器を備えてもよい。その場合、入力部２１０と、核酸増幅ユニット２２０との間に配置されてもよい（図示せず）。
第４の実施形態として核酸定量検出システムが提供される。図１１に示すように、核酸定量検出システム２００は、入力部２１０と、核酸増幅ユニット２２０と、核酸測定ユニット２３０とを備える。入力部２１０は、検出対象である試料、変換用テンプレート、ポリメラーゼ及びニッカーゼ、並びに反応に必要な物質を反応場に持ち込むための投入口であり得る。核酸増幅ユニット２２０は、そこにおいて核酸反応を行うことが可能な反応場、温度調整機構、送液機構、溶液保持層、廃液層などを含んでよい（図示せず）。反応場は、これらに限定するものではないが、反応容器、反応流路、反応アレイ、平面上に形成された凹部などであり得る。温度調整機構は、ヒーターなどであってよい。核酸測定ユニット２３０は、核酸増幅ユニット２２０において得られた増幅産物を検出及び定量する測定機構を備える。測定機構は、蛍光（例えば、スペクトル選択的に）、化学発光、色彩情報（例えば、カラメトリー測定手段により）、形態変化などの光学的信号、電気化学的信号などのなどを測定することにより、目的とする増幅産物を検出するように構成され得る。そのような手段は、それ自身公知の何れかの手段を使用することが可能である。例えば、一般的に生化学分野において使用される情報の可視化手段を用いることも可能である。また、入力（検出対象）の核酸増幅ユニットで増幅する前のステップとして、検出対象を人工的に設計した塩基配列に変換するステップを設けてもよい。そのようなステップを行うための線形増幅器又は単純変換器（図示せず）を核酸増幅ユニット２２０が含んでいてもよい。即ち、これにより、まずは検出対象を人工ＤＮＡに変換する反応が行われる。例えば、検出対象がｍＲＮＡなどの長い塩基配列であった場合や、ｄｓＤＮＡなどで直接ハイブリダイズさせることが難しい場合には、変換反応を用いて一旦人工塩基にしたのち、それを変換連鎖増幅してもよい。このような線形増幅器及び単純変換器は、上述した核酸増幅ユニットと同様の構成を有し得る。例えば、核酸増幅ユニット、線形増幅器及び単純変換器がそれぞれ独立して反応を行うように３つの反応場が配置されてもよい。１つの反応場が、核酸増幅ユニット、線形増幅器及び単純変換器の役割を担ってもよい。或いは、核酸増幅ユニット２２０とは独立して、核酸定量検出システム２００が、線形増幅器又は単純変換器を備えてもよい。その場合、入力部２１０と、核酸増幅ユニット２２０との間に配置されてもよい（図示せず）。
【0053】
核酸定量検出システム２００の１つの例において、前記核酸増幅ユニット２２０は、そこにおいて核酸反応を行うように区画された反応部と、前記反応部の温度を制御する温度管理部とを備え、前記核酸測定ユニット２３０が、核酸からの信号を検知する測定部と得られた信号に基づいて核酸量を決定する計算部とを備えてもよい（図示せず）。
【0054】
また核酸定量検出システム２００は、測定結果を表示するディスプレイなどや結果を所望の通信場所へ送る通信手段などの出力部（図示せず）を備えてもよい。入力部２１０は、物理的な入力に加えて、電気的信号を入力可能なパネル、キーボード及びスイッチ等の入力手段を更に備えてもよい。核酸定量検出システム２００は、入力部２１０、核酸増幅ユニット２２０及び核酸測定ユニット２３０の働きをコントロールする制御部（図示せず）を備えてもよい。そのような制御部は、例えば、ＣＰＵやコンピュータであってよく、そのような制御は、予め定められたプログラムやデータベース、並びに入力される情報に基づいて行われ得る。
【0055】
（第５の実施形態）
核酸定量検出システム２００は、核酸定量検出装置として提供されてもよい。核酸定量検出装置は、上述した核酸定量検出システム２００と同様の構成を備えればよい。
核酸定量検出システム２００は、核酸定量検出装置として提供されてもよい。核酸定量検出装置は、上述した核酸定量検出システム２００と同様の構成を備えればよい。
【0056】
（第６の実施形態）
第６の実施形態の核酸定量キットは、実施形態に従う核酸変換連鎖増幅方法及び一本鎖核酸定量法に使用するためのアッセイキットである。核酸定量キットは、標的核酸に応じて設計された変換用テンプレート、ポリメラーゼ及びニッカーゼを含む。更に、核酸定量キットは、至適反応のためのｄＮＴＰ、緩衝液若しくは緩衝液用の組成物混合物、及び／又は検出用標識物質などを任意に含んでもよい。
第６の実施形態の核酸定量キットは、実施形態に従う核酸変換連鎖増幅方法及び一本鎖核酸定量法に使用するためのアッセイキットである。核酸定量キットは、標的核酸に応じて設計された変換用テンプレート、ポリメラーゼ及びニッカーゼを含む。更に、核酸定量キットは、至適反応のためのｄＮＴＰ、緩衝液若しくは緩衝液用の組成物混合物、及び／又は検出用標識物質などを任意に含んでもよい。
【0057】
（第７の実施形態）
上述した実施形態の核酸定量キットは、試料中の標的核酸を増幅又は定量を行うための核酸反応キットとして提供されてもよい。そのような核酸反応キットは、変換用テンプレート、ニッカーゼ試薬及び鎖置換ポリメラーゼ試薬を含む。標的核酸が、標的配列ｘを有しているとき、変換用テンプレートは、３’から５’の向きで、標的配列ｘの相補配列ｘ’と、Ｃ種類の人工配列の相補配列α’～ｎ’とを含み、更に、これらの相補配列ｘ’、α’～ｎ’の配列間にあるＣ個のニッカーゼ認識部位を含む。ここで、人工配列α～ｎ（ここでＣは２～９の整数であり、ｎはＣ－１の整数である）は、試料中に存在しない配列であり、且つ互いに異なる配列で示される。
上述した実施形態の核酸定量キットは、試料中の標的核酸を増幅又は定量を行うための核酸反応キットとして提供されてもよい。そのような核酸反応キットは、変換用テンプレート、ニッカーゼ試薬及び鎖置換ポリメラーゼ試薬を含む。標的核酸が、標的配列ｘを有しているとき、変換用テンプレートは、３’から５’の向きで、標的配列ｘの相補配列ｘ’と、Ｃ種類の人工配列の相補配列α’～ｎ’とを含み、更に、これらの相補配列ｘ’、α’～ｎ’の配列間にあるＣ個のニッカーゼ認識部位を含む。ここで、人工配列α～ｎ（ここでＣは２～９の整数であり、ｎはＣ－１の整数である）は、試料中に存在しない配列であり、且つ互いに異なる配列で示される。
【0058】
本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
【符号の説明】
【0059】
１…標的核酸、２，２ａ，２ｂ…変換連鎖増幅テンプレート、３…ポリメラーゼ、４…伸長、５…ニッカーゼ、１０１ａ，１０１ｂ，１０２ａ，１０２ｂ…伸長鎖、１１１ａ，１１２ａ，１１２ｂ…人工的な配列断片
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】