特開2024-134417標的核酸の存在状態の判定方法、標的生物の存在状態の判定方法、生物の同定方法、及び標的核酸の存在状態を判定するためのキット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024134417
(43)【公開日】2024-10-03
(54)【発明の名称】標的核酸の存在状態の判定方法、標的生物の存在状態の判定方法、生物の同定方法、及び標的核酸の存在状態を判定するためのキット
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6851 20180101AFI20240926BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240926BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6851 Z ZNA
C12N15/113 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】21
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023044715
(22)【出願日】2023-03-20
(71)【出願人】
【識別番号】000005887
【氏名又は名称】三井化学株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】藤井 亮太
(72)【発明者】
【氏名】西山 泰貴
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR14
(57)【要約】
【課題】非特異的な核酸増幅を抑制可能な、標的核酸の存在状態の判定方法、並びに当該方法を用いた標的生物の存在状態の判定方法、生物の同定方法、及びキットを提供する。
【解決手段】試料と、第１の鋳型ＤＮＡ、第２の鋳型ＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、ニッキング用エンドヌクレアーゼ、及びラムダエキソヌクレアーゼと、を混合し、検出用のシグナル配列を含むシグナルＤＮＡの遺伝子核酸増幅反応を行うことと、前記シグナルＤＮＡの存在状態を判定することと、を含み、前記核酸増幅反応の系中の前記ラムダエキソヌクレアーゼの濃度が１．０Ｕ／ｍＬ～２００Ｕ／ｍＬである、試料中の標的核酸の存在状態の判定方法；並びに、当該方法を用いた標的生物の存在状態の判定方法、生物の同定方法、及びキット。
【選択図】図１
【解決手段】試料と、第１の鋳型ＤＮＡ、第２の鋳型ＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、ニッキング用エンドヌクレアーゼ、及びラムダエキソヌクレアーゼと、を混合し、検出用のシグナル配列を含むシグナルＤＮＡの遺伝子核酸増幅反応を行うことと、前記シグナルＤＮＡの存在状態を判定することと、を含み、前記核酸増幅反応の系中の前記ラムダエキソヌクレアーゼの濃度が１．０Ｕ／ｍＬ～２００Ｕ／ｍＬである、試料中の標的核酸の存在状態の判定方法；並びに、当該方法を用いた標的生物の存在状態の判定方法、生物の同定方法、及びキット。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料と、第１の鋳型ＤＮＡ、第２の鋳型ＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、ニッキング用エンドヌクレアーゼ、及びラムダエキソヌクレアーゼと、を混合し、検出用のシグナル配列を含むシグナルＤＮＡの核酸増幅反応を行うことと、
前記シグナルＤＮＡの存在状態を判定することと、を含み、
前記核酸増幅反応の系中の前記ラムダエキソヌクレアーゼの濃度が１．０Ｕ／ｍＬ～２００Ｕ／ｍＬである、試料中の標的核酸の存在状態の判定方法。
前記シグナルＤＮＡの存在状態を判定することと、を含み、
前記核酸増幅反応の系中の前記ラムダエキソヌクレアーゼの濃度が１．０Ｕ／ｍＬ～２００Ｕ／ｍＬである、試料中の標的核酸の存在状態の判定方法。
【請求項2】
前記第１の鋳型ＤＮＡは、前記シグナル配列に相補的な第１の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記標的核酸に相補的な配列と、を含み、
前記第２の鋳型ＤＮＡは、前記シグナル配列に相補的な第２の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記シグナル配列に相補的な第３の配列と、を含み、
前記核酸増幅反応は、
（Ａ）前記第１の鋳型ＤＮＡにおける前記標的核酸に相補的な配列と、前記標的核酸と、がハイブリダイズし、前記ＤＮＡポリメラーゼによって前記標的核酸からの核酸鎖の伸長が起こり、
前記伸長された核酸鎖の前記ニッキング用エンドヌクレアーゼによる切断、及び前記切断部位からの前記ＤＮＡポリメラーゼによる核酸鎖の伸長を繰り返して、前記シグナルＤＮＡが増幅される、第一段階増幅と、
（Ｂ）前記第２の鋳型ＤＮＡにおける前記シグナル配列に相補的な第３の配列と、前記シグナルＤＮＡと、がハイブリダイズし、前記ＤＮＡポリメラーゼによって前記シグナルＤＮＡからの核酸鎖の伸長が起こり、
前記伸長された核酸鎖の前記ニッキング用エンドヌクレアーゼによる切断、及び前記切断部位からの前記ＤＮＡポリメラーゼによる核酸鎖の伸長を繰り返して、前記シグナルＤＮＡがさらに増幅される、第二段階増幅と、
を含む、
請求項１に記載の判定方法。
前記第２の鋳型ＤＮＡは、前記シグナル配列に相補的な第２の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記シグナル配列に相補的な第３の配列と、を含み、
前記核酸増幅反応は、
（Ａ）前記第１の鋳型ＤＮＡにおける前記標的核酸に相補的な配列と、前記標的核酸と、がハイブリダイズし、前記ＤＮＡポリメラーゼによって前記標的核酸からの核酸鎖の伸長が起こり、
前記伸長された核酸鎖の前記ニッキング用エンドヌクレアーゼによる切断、及び前記切断部位からの前記ＤＮＡポリメラーゼによる核酸鎖の伸長を繰り返して、前記シグナルＤＮＡが増幅される、第一段階増幅と、
（Ｂ）前記第２の鋳型ＤＮＡにおける前記シグナル配列に相補的な第３の配列と、前記シグナルＤＮＡと、がハイブリダイズし、前記ＤＮＡポリメラーゼによって前記シグナルＤＮＡからの核酸鎖の伸長が起こり、
前記伸長された核酸鎖の前記ニッキング用エンドヌクレアーゼによる切断、及び前記切断部位からの前記ＤＮＡポリメラーゼによる核酸鎖の伸長を繰り返して、前記シグナルＤＮＡがさらに増幅される、第二段階増幅と、
を含む、
請求項１に記載の判定方法。
【請求項3】
前記第一段階増幅と前記第二段階増幅において、同一又は異なるニッキング用エンドヌクレアーゼにより伸長された核酸鎖が切断される、請求項２に記載の判定方法。
【請求項4】
前記第二段階増幅において、前記第２の鋳型ＤＮＡにおける前記シグナル配列に相補的な第３の配列と、前記シグナルＤＮＡと、がハイブリダイズしてなる二本鎖の、前記第２の鋳型ＤＮＡの３’端側の末端が５’突出末端を有する、請求項２に記載の判定方法。
【請求項5】
前記ＤＮＡポリメラーゼが鎖置換活性を有する、請求項１に記載の判定方法。
【請求項6】
前記核酸増幅反応は、等温増幅反応である、請求項１に記載の判定方法。
【請求項7】
前記等温増幅反応が１０℃～４０℃で行われる、請求項６に記載の判定方法。
【請求項8】
前記核酸増幅反応の系中の前記ラムダエキソヌクレアーゼの濃度が２．５Ｕ／ｍＬ～１００Ｕ／ｍＬである、請求項１に記載の判定方法。
【請求項9】
前記標的核酸の存在状態の判定が、前記標的核酸の存在量の判定である、請求項１に記載の判定方法。
【請求項10】
前記標的核酸の塩基数が５～５００である、請求項１に記載の判定方法。
【請求項11】
前記標的核酸が、標的生物において特異的な発現を示すｓＲＮＡである、請求項１に記載の判定方法。
【請求項12】
前記ｓＲＮＡが、配列番号９～４８で表されるｓＲＮＡのうちの少なくとも１種類を含む、請求項１１に記載の判定方法。
【請求項13】
前記ｓＲＮＡが、配列番号１３～１５及び３４で表されるｓＲＮＡのうちの少なくとも１種類を含む、請求項１１に記載の判定方法。
【請求項14】
前記標的生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍからなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項１１に記載の判定方法。
【請求項15】
前記ｓＲＮＡは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するＥＣ－５ｐ－３６、配列番号２で表されるヌクレオチド配列を有するＥＣ－３ｐ－４０、配列番号７で表されるヌクレオチド配列を有するＥＣ－５ｐ－７９、配列番号８で表されるヌクレオチド配列を有するＥＣ－３ｐ－３９３、配列番号６で表されるヌクレオチド配列を有するｆｏｘ＿ｍｉｌＲＮＡ＿５、配列番号４で表されるヌクレオチド配列を有するｍｉＲ１５６、及び配列番号５で表されるヌクレオチド配列を有するｍｉＲ７１６ｂからなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項１１に記載の判定方法。
【請求項16】
前記第１の鋳型ＤＮＡが、５’末端から順に、前記シグナル配列に相補的な第１の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記標的核酸に相補的な配列と、を含み、
前記第２の鋳型ＤＮＡが、５’末端から順に、前記シグナル配列に相補的な第２の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記シグナル配列に相補的な第３の配列と、を含む、請求項２に記載の判定方法。
前記第２の鋳型ＤＮＡが、５’末端から順に、前記シグナル配列に相補的な第２の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記シグナル配列に相補的な第３の配列と、を含む、請求項２に記載の判定方法。
【請求項17】
請求項１～１６のいずれか１項に記載の判定方法により標的生物に特異的な発現を示すｓＲＮＡの存在状態を判定することを含む、試料中の標的生物の存在状態の判定方法。
【請求項18】
請求項１～１６のいずれか１項に記載の判定方法によりｓＲＮＡの存在状態を判定することを含む、試料中の生物の同定方法。
【請求項19】
第１の鋳型ＤＮＡを含む容器、第２の鋳型ＤＮＡを含む容器、ＤＮＡポリメラーゼを含む容器、ニッキング用エンドヌクレアーゼを含む容器、及びラムダエキソヌクレアーゼを含む容器、を備える、標的核酸の存在状態を判定するためのキット。
【請求項20】
検出用のシグナル配列を含むシグナルＤＮＡの存在状態の判定によって前記標的核酸の存在状態を判定するためのキットであって、
前記第１の鋳型ＤＮＡは、前記シグナル配列に相補的な第１の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記標的核酸に相補的な配列と、を含み、
前記第２の鋳型ＤＮＡは、前記シグナル配列に相補的な第２の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記シグナル配列に相補的な第３の配列と、を含む、
請求項１９に記載のキット。
前記第１の鋳型ＤＮＡは、前記シグナル配列に相補的な第１の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記標的核酸に相補的な配列と、を含み、
前記第２の鋳型ＤＮＡは、前記シグナル配列に相補的な第２の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記シグナル配列に相補的な第３の配列と、を含む、
請求項１９に記載のキット。
【請求項21】
前記第１の鋳型ＤＮＡが、５’末端から順に、前記シグナル配列に相補的な第１の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記標的核酸に相補的な配列と、を含み、
前記第２の鋳型ＤＮＡが、５’末端から順に、前記シグナル配列に相補的な第２の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記シグナル配列に相補的な第３の配列と、を含む、請求項２０に記載のキット。
前記第２の鋳型ＤＮＡが、５’末端から順に、前記シグナル配列に相補的な第２の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記シグナル配列に相補的な第３の配列と、を含む、請求項２０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、標的核酸の存在状態の判定方法、標的生物の存在状態の判定方法、生物の同定方法、及び標的核酸の存在状態を判定するためのキットに関する。
【背景技術】
【0002】
核酸の検出は、医療分野や生物学の分野をはじめ幅広い技術分野で有用に用いられている。例えば、特許文献１には、液体試料中のｓＲＮＡの存在状態に基づいて生物の存在状態を判定する方法が記載されている。
【0003】
核酸の高感度な検出方法としては、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）等の核酸増幅を用いる方法が一般的に知られている。また、温度サイクルを必要とするＰＣＲに代わり、ＳＤＡ法（Strand Displacement Amplification；鎖置換型増幅法）、ＬＡＭＰ法（Loop-Mediated Isothermal Amplification）、ＩＣＡＮ法（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）等の等温増幅反応を用いる方法も知られている。
【0004】
増幅対象の核酸を鋳型として外部からプライマーを添加して核酸を増幅する方法とは異なり、外部から鋳型を添加して増幅対象の核酸をプライマーとして使用し、検出対象のシグナルとなる核酸を増幅させる方法も知られている。特許文献２では、ＥＸＰＡＲ（Exponential Amplification Reaction）法と呼ばれる方法を利用して、２種類の鋳型を用いて、試料中の標的核酸をプライマーとして、ニッキング用エンドヌクレアーゼの存在下で核酸増幅を行い、得られた核酸を検出することを含む試料中の標的核酸の検出方法が記載されている。
【0005】
さらなる核酸検出方法として、特許文献３には、二次サイクル増幅により高い感度でマイクロＲＮＡを検出可能な核酸検出方法が記載されている。特許文献４には、核酸の等温増幅、増幅産物のニッキング増幅及び一本鎖核酸の生成、前記一本鎖核酸のプローブとのハイブリダイゼーション、並びに余剰核酸の分解を経て核酸を検出する核酸検出方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】国際公開第２０２０／１７９８２３号
【特許文献2】国際公開第２０１２／０７７８１９号
【特許文献3】中国特許第１０３０８８１２８号明細書
【特許文献4】国際公開第２０２２／０３３３３１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
発明者らは、ＥＸＰＡＲ法を利用して試料中の標的核酸の存在状態を高感度で判定する方法の開発を試みた。ＥＸＰＡＲ法では、核酸増幅過程においてしばしば非特異的な核酸増幅（以下、「バックグラウンド増幅」とも記す。）が発生し、不十分な感度の原因となっていた。かかる状況に鑑み、本開示は、非特異的な核酸増幅を抑制可能な、標的核酸の存在状態の判定方法、並びに当該方法を用いた標的生物の存在状態の判定方法、生物の同定方法、及びキットの提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本開示は以下の態様を含む。
＜１＞ 試料と、第１の鋳型ＤＮＡ、第２の鋳型ＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、ニッキング用エンドヌクレアーゼ、及びラムダエキソヌクレアーゼと、を混合し、検出用のシグナル配列を含むシグナルＤＮＡの核酸増幅反応を行うことと、
前記シグナルＤＮＡの存在状態を判定することと、を含み、
前記核酸増幅反応の系中の前記ラムダエキソヌクレアーゼの濃度が１．０Ｕ／ｍＬ～２００Ｕ／ｍＬである、
試料中の標的核酸の存在状態の判定方法。
＜２＞ 前記第１の鋳型ＤＮＡは、前記シグナル配列に相補的な第１の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記標的核酸に相補的な配列と、を含み、
前記第２の鋳型ＤＮＡは、前記シグナル配列に相補的な第２の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記シグナル配列に相補的な第３の配列と、を含み、
前記核酸増幅反応は、
（Ａ）前記第１の鋳型ＤＮＡにおける前記標的核酸に相補的な配列と、前記標的核酸と、がハイブリダイズし、前記ＤＮＡポリメラーゼによって前記標的核酸からの核酸鎖の伸長が起こり、
前記伸長された核酸鎖の前記ニッキング用エンドヌクレアーゼによる切断、及び前記切断部位からの前記ＤＮＡポリメラーゼによる核酸鎖の伸長を繰り返して、前記シグナルＤＮＡが増幅される、第一段階増幅と、
（Ｂ）前記第２の鋳型ＤＮＡにおける前記シグナル配列に相補的な第３の配列と、前記シグナルＤＮＡと、がハイブリダイズし、前記ＤＮＡポリメラーゼによって前記シグナルＤＮＡからの核酸鎖の伸長が起こり、
前記伸長された核酸鎖の前記ニッキング用エンドヌクレアーゼによる切断、及び前記切断部位からの前記ＤＮＡポリメラーゼによる核酸鎖の伸長を繰り返して、前記シグナルＤＮＡがさらに増幅される、第二段階増幅と、
を含む、
＜１＞に記載の判定方法。
＜３＞ 前記第一段階増幅と前記第二段階増幅において、同一又は異なるニッキング用エンドヌクレアーゼにより伸長された核酸鎖が切断される、＜２＞に記載の判定方法。
＜４＞ 前記第二段階増幅において、前記第２の鋳型ＤＮＡにおける前記シグナル配列に相補的な第３の配列と、前記シグナルＤＮＡと、がハイブリダイズしてなる二本鎖の、前記第２の鋳型ＤＮＡの３’端側の末端が５’突出末端を有する、＜２＞に記載の判定方法。
＜５＞ 前記ＤＮＡポリメラーゼが鎖置換活性を有する、＜１＞～＜４＞のいずれか１項に記載の判定方法。
＜６＞ 前記核酸増幅反応は、等温増幅反応である、＜１＞～＜５＞のいずれか１項に記載の判定方法。
＜７＞ 前記等温増幅反応が１０℃～４０℃で行われる、＜６＞に記載の判定方法。
＜８＞ 前記核酸増幅反応の系中の前記ラムダエキソヌクレアーゼの濃度が２．５Ｕ／ｍＬ～１００Ｕ／ｍＬである、＜１＞～＜７＞のいずれか１項に記載の判定方法。
＜９＞ 前記標的核酸の存在状態の判定が、前記標的核酸の存在量の判定である、＜１＞～＜８＞のいずれか１項に記載の判定方法。
＜１０＞ 前記標的核酸の塩基数が５～５００である、＜１＞～＜９＞のいずれか１項に記載の判定方法。
＜１１＞ 前記標的核酸が、標的生物において特異的な発現を示すｓＲＮＡである、＜１＞～＜１０＞のいずれか１項に記載の判定方法。
＜１２＞ 前記ｓＲＮＡが、配列番号９～４８で表されるｓＲＮＡのうちの少なくとも１種類を含む、＜１１＞に記載の判定方法。
＜１３＞ 前記ｓＲＮＡが、配列番号１３～１５及び３４で表されるｓＲＮＡのうちの少なくとも１種類を含む、＜１１＞又は＜１２＞に記載の判定方法。
＜１４＞ 前記標的生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍからなる群より選択される少なくとも１つを含む、＜１１＞～＜１３＞のいずれか1項に記載の判定方法。
＜１５＞ 前記ｓＲＮＡは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するＥＣ－５ｐ－３６、配列番号２で表されるヌクレオチド配列を有するＥＣ－３ｐ－４０、配列番号７で表されるヌクレオチド配列を有するＥＣ－５ｐ－７９、配列番号８で表されるヌクレオチド配列を有するＥＣ－３ｐ－３９３、配列番号６で表されるヌクレオチド配列を有するｆｏｘ＿ｍｉｌＲＮＡ＿５、配列番号４で表されるヌクレオチド配列を有するｍｉＲ１５６、及び配列番号５で表されるヌクレオチド配列を有するｍｉＲ７１６ｂからなる群より選択される少なくとも１種を含む、＜１１＞～＜１４＞のいずれか１項に記載の判定方法。
＜１６＞ 前記第１の鋳型ＤＮＡが、５’末端から順に、前記シグナル配列に相補的な第１の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記標的核酸に相補的な配列と、を含み、
前記第２の鋳型ＤＮＡが、５’末端から順に、前記シグナル配列に相補的な第２の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記シグナル配列に相補的な第３の配列と、を含む、＜２＞に記載の判定方法。
＜１７＞ ＜１＞～＜１６＞のいずれか１項に記載の判定方法により標的生物に特異的な発現を示すｓＲＮＡの存在状態を判定することを含む、試料中の標的生物の存在状態の判定方法。
＜１８＞ ＜１＞～＜１６＞のいずれか１項に記載の判定方法によりｓＲＮＡの存在状態を判定することを含む、試料中の生物の同定方法。
＜１９＞ 第１の鋳型ＤＮＡを含む容器、第２の鋳型ＤＮＡを含む容器、ＤＮＡポリメラーゼを含む容器、ニッキング用エンドヌクレアーゼを含む容器、及びラムダエキソヌクレアーゼを含む容器、を備える、標的核酸の存在状態を判定するためのキット。
＜２０＞ 検出用のシグナル配列を含むシグナルＤＮＡの存在状態の判定によって前記標的核酸の存在状態を判定するためのキットであって、
前記第１の鋳型ＤＮＡは、前記シグナル配列に相補的な第１の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記標的核酸に相補的な配列と、を含み、
前記第２の鋳型ＤＮＡは、前記シグナル配列に相補的な第２の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記シグナル配列に相補的な第３の配列と、を含む、
＜１９＞に記載のキット。
＜２１＞ 前記第１の鋳型ＤＮＡが、５’末端から順に、前記シグナル配列に相補的な第１の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記標的核酸に相補的な配列と、を含み、
前記第２の鋳型ＤＮＡが、５’末端から順に、前記シグナル配列に相補的な第２の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記シグナル配列に相補的な第３の配列と、を含む、＜２０＞に記載のキット。
＜１＞ 試料と、第１の鋳型ＤＮＡ、第２の鋳型ＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、ニッキング用エンドヌクレアーゼ、及びラムダエキソヌクレアーゼと、を混合し、検出用のシグナル配列を含むシグナルＤＮＡの核酸増幅反応を行うことと、
前記シグナルＤＮＡの存在状態を判定することと、を含み、
前記核酸増幅反応の系中の前記ラムダエキソヌクレアーゼの濃度が１．０Ｕ／ｍＬ～２００Ｕ／ｍＬである、
試料中の標的核酸の存在状態の判定方法。
＜２＞ 前記第１の鋳型ＤＮＡは、前記シグナル配列に相補的な第１の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記標的核酸に相補的な配列と、を含み、
前記第２の鋳型ＤＮＡは、前記シグナル配列に相補的な第２の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記シグナル配列に相補的な第３の配列と、を含み、
前記核酸増幅反応は、
（Ａ）前記第１の鋳型ＤＮＡにおける前記標的核酸に相補的な配列と、前記標的核酸と、がハイブリダイズし、前記ＤＮＡポリメラーゼによって前記標的核酸からの核酸鎖の伸長が起こり、
前記伸長された核酸鎖の前記ニッキング用エンドヌクレアーゼによる切断、及び前記切断部位からの前記ＤＮＡポリメラーゼによる核酸鎖の伸長を繰り返して、前記シグナルＤＮＡが増幅される、第一段階増幅と、
（Ｂ）前記第２の鋳型ＤＮＡにおける前記シグナル配列に相補的な第３の配列と、前記シグナルＤＮＡと、がハイブリダイズし、前記ＤＮＡポリメラーゼによって前記シグナルＤＮＡからの核酸鎖の伸長が起こり、
前記伸長された核酸鎖の前記ニッキング用エンドヌクレアーゼによる切断、及び前記切断部位からの前記ＤＮＡポリメラーゼによる核酸鎖の伸長を繰り返して、前記シグナルＤＮＡがさらに増幅される、第二段階増幅と、
を含む、
＜１＞に記載の判定方法。
＜３＞ 前記第一段階増幅と前記第二段階増幅において、同一又は異なるニッキング用エンドヌクレアーゼにより伸長された核酸鎖が切断される、＜２＞に記載の判定方法。
＜４＞ 前記第二段階増幅において、前記第２の鋳型ＤＮＡにおける前記シグナル配列に相補的な第３の配列と、前記シグナルＤＮＡと、がハイブリダイズしてなる二本鎖の、前記第２の鋳型ＤＮＡの３’端側の末端が５’突出末端を有する、＜２＞に記載の判定方法。
＜５＞ 前記ＤＮＡポリメラーゼが鎖置換活性を有する、＜１＞～＜４＞のいずれか１項に記載の判定方法。
＜６＞ 前記核酸増幅反応は、等温増幅反応である、＜１＞～＜５＞のいずれか１項に記載の判定方法。
＜７＞ 前記等温増幅反応が１０℃～４０℃で行われる、＜６＞に記載の判定方法。
＜８＞ 前記核酸増幅反応の系中の前記ラムダエキソヌクレアーゼの濃度が２．５Ｕ／ｍＬ～１００Ｕ／ｍＬである、＜１＞～＜７＞のいずれか１項に記載の判定方法。
＜９＞ 前記標的核酸の存在状態の判定が、前記標的核酸の存在量の判定である、＜１＞～＜８＞のいずれか１項に記載の判定方法。
＜１０＞ 前記標的核酸の塩基数が５～５００である、＜１＞～＜９＞のいずれか１項に記載の判定方法。
＜１１＞ 前記標的核酸が、標的生物において特異的な発現を示すｓＲＮＡである、＜１＞～＜１０＞のいずれか１項に記載の判定方法。
＜１２＞ 前記ｓＲＮＡが、配列番号９～４８で表されるｓＲＮＡのうちの少なくとも１種類を含む、＜１１＞に記載の判定方法。
＜１３＞ 前記ｓＲＮＡが、配列番号１３～１５及び３４で表されるｓＲＮＡのうちの少なくとも１種類を含む、＜１１＞又は＜１２＞に記載の判定方法。
＜１４＞ 前記標的生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍからなる群より選択される少なくとも１つを含む、＜１１＞～＜１３＞のいずれか1項に記載の判定方法。
＜１５＞ 前記ｓＲＮＡは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するＥＣ－５ｐ－３６、配列番号２で表されるヌクレオチド配列を有するＥＣ－３ｐ－４０、配列番号７で表されるヌクレオチド配列を有するＥＣ－５ｐ－７９、配列番号８で表されるヌクレオチド配列を有するＥＣ－３ｐ－３９３、配列番号６で表されるヌクレオチド配列を有するｆｏｘ＿ｍｉｌＲＮＡ＿５、配列番号４で表されるヌクレオチド配列を有するｍｉＲ１５６、及び配列番号５で表されるヌクレオチド配列を有するｍｉＲ７１６ｂからなる群より選択される少なくとも１種を含む、＜１１＞～＜１４＞のいずれか１項に記載の判定方法。
＜１６＞ 前記第１の鋳型ＤＮＡが、５’末端から順に、前記シグナル配列に相補的な第１の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記標的核酸に相補的な配列と、を含み、
前記第２の鋳型ＤＮＡが、５’末端から順に、前記シグナル配列に相補的な第２の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記シグナル配列に相補的な第３の配列と、を含む、＜２＞に記載の判定方法。
＜１７＞ ＜１＞～＜１６＞のいずれか１項に記載の判定方法により標的生物に特異的な発現を示すｓＲＮＡの存在状態を判定することを含む、試料中の標的生物の存在状態の判定方法。
＜１８＞ ＜１＞～＜１６＞のいずれか１項に記載の判定方法によりｓＲＮＡの存在状態を判定することを含む、試料中の生物の同定方法。
＜１９＞ 第１の鋳型ＤＮＡを含む容器、第２の鋳型ＤＮＡを含む容器、ＤＮＡポリメラーゼを含む容器、ニッキング用エンドヌクレアーゼを含む容器、及びラムダエキソヌクレアーゼを含む容器、を備える、標的核酸の存在状態を判定するためのキット。
＜２０＞ 検出用のシグナル配列を含むシグナルＤＮＡの存在状態の判定によって前記標的核酸の存在状態を判定するためのキットであって、
前記第１の鋳型ＤＮＡは、前記シグナル配列に相補的な第１の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記標的核酸に相補的な配列と、を含み、
前記第２の鋳型ＤＮＡは、前記シグナル配列に相補的な第２の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記シグナル配列に相補的な第３の配列と、を含む、
＜１９＞に記載のキット。
＜２１＞ 前記第１の鋳型ＤＮＡが、５’末端から順に、前記シグナル配列に相補的な第１の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記標的核酸に相補的な配列と、を含み、
前記第２の鋳型ＤＮＡが、５’末端から順に、前記シグナル配列に相補的な第２の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記シグナル配列に相補的な第３の配列と、を含む、＜２０＞に記載のキット。
【発明の効果】
【0009】
本開示によれば、非特異的な核酸増幅を抑制可能な、標的核酸の存在状態の判定方法、並びに当該方法を用いた標的生物の存在状態の判定方法、生物の同定方法、及びキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】本開示の判定方法の原理を説明する概略図を示す。
【図2】実施例における、ラムダエキソヌクレアーゼ未添加の際の核酸増幅反応に伴う蛍光強度の経時変化を示す。
【図3】実施例における、０．０１５Ｕ／μＬ（１５Ｕ／ｍＬ）のラムダエキソヌクレアーゼを添加した際の核酸増幅反応に伴う蛍光強度の経時変化を示す。
【図4】実施例における、ラムダエキソヌクレアーゼ濃度とバックグラウンド発生換算濃度との関係を示す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、本開示の実施形態を実施するための形態について詳細に説明する。但し、本開示の実施形態は以下の実施形態に限定されるものではない。以下の実施形態において、その構成要素（要素ステップ等も含む）は、特に明示した場合を除き、必須ではない。数値及びその範囲についても同様であり、本開示の実施形態を制限するものではない。
【0012】
本開示において「工程」との語には、他の工程から独立した工程に加え、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の目的が達成されれば、当該工程も含まれる。
本開示において「～」を用いて示された数値範囲には、「～」の前後に記載される数値がそれぞれ最小値及び最大値として含まれる。
本開示中に段階的に記載されている数値範囲において、一つの数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
本開示において、複数の要素が、「又は」又は「若しくは」を用いて列挙されている場合、特に明示されている場合を除き、技術的な矛盾が生じない限りは複数の要素を組み合わせて選択することを排除しない。
本開示において要素が単数形で表記されている場合であっても、特に明示されている場合を除き、技術的な矛盾が生じない限りは複数の存在を排除しない。
本開示において、別個に記載されている複数の例示的態様は、互いに矛盾しない限り、互いに組み合わせて新たな態様を構成してもよい。
本開示において実施形態を図面を参照して説明する場合、当該実施形態の構成は図面に示された構成に限定されない。また、各図における部材の大きさは概念的なものであり、部材間の大きさの相対的な関係はこれに限定されない。
本開示において、「核酸」は、あらゆる核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらの類似体、天然物、人工物）と、あらゆる核酸に低分子化合物、基、核酸以外の分子、構造物などが連結している核酸とを含む用語である。
本開示において、核酸の文脈における「相補的」な塩基対は、核酸分子のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの間の、ワトソン－クリック（ＡＴ対、ＡＵ対、又はＣＧ対）又はフーグスティーン型塩基対を意味する。一方、配列が「相補的」であるという場合、当該配列が相補的な塩基対を有することを意味し、完全に相補的である（すなわち、ミスマッチを含まない）場合に加え、本開示の趣旨を逸脱しない範囲のミスマッチ(例えば１塩基、２塩基以下、又は３塩基以下のミスマッチ）を含む場合をも包含する。「相補的」な配列は完全に相補的であることが好ましい。
本開示において「～」を用いて示された数値範囲には、「～」の前後に記載される数値がそれぞれ最小値及び最大値として含まれる。
本開示中に段階的に記載されている数値範囲において、一つの数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
本開示において、複数の要素が、「又は」又は「若しくは」を用いて列挙されている場合、特に明示されている場合を除き、技術的な矛盾が生じない限りは複数の要素を組み合わせて選択することを排除しない。
本開示において要素が単数形で表記されている場合であっても、特に明示されている場合を除き、技術的な矛盾が生じない限りは複数の存在を排除しない。
本開示において、別個に記載されている複数の例示的態様は、互いに矛盾しない限り、互いに組み合わせて新たな態様を構成してもよい。
本開示において実施形態を図面を参照して説明する場合、当該実施形態の構成は図面に示された構成に限定されない。また、各図における部材の大きさは概念的なものであり、部材間の大きさの相対的な関係はこれに限定されない。
本開示において、「核酸」は、あらゆる核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらの類似体、天然物、人工物）と、あらゆる核酸に低分子化合物、基、核酸以外の分子、構造物などが連結している核酸とを含む用語である。
本開示において、核酸の文脈における「相補的」な塩基対は、核酸分子のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの間の、ワトソン－クリック（ＡＴ対、ＡＵ対、又はＣＧ対）又はフーグスティーン型塩基対を意味する。一方、配列が「相補的」であるという場合、当該配列が相補的な塩基対を有することを意味し、完全に相補的である（すなわち、ミスマッチを含まない）場合に加え、本開示の趣旨を逸脱しない範囲のミスマッチ(例えば１塩基、２塩基以下、又は３塩基以下のミスマッチ）を含む場合をも包含する。「相補的」な配列は完全に相補的であることが好ましい。
【0013】
≪標的核酸の存在状態の判定方法≫
一態様において、本開示は、試料と、第１の鋳型ＤＮＡ、第２の鋳型ＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、ニッキング用エンドヌクレアーゼ、及びラムダエキソヌクレアーゼと、を混合し、検出用のシグナル配列を含むシグナルＤＮＡの核酸増幅反応を行うことと、前記シグナルＤＮＡの存在状態を判定することと、を含み、前記核酸増幅反応の系中の前記ラムダエキソヌクレアーゼの濃度が１．０Ｕ／ｍＬ～２００Ｕ／ｍＬである、試料中の標的核酸の存在状態の判定方法を提供する。以下、上記判定方法を「本判定方法」とも記す。なお、本判定方法は増幅された核酸の存在状態を判定するものであるため、上記「核酸増幅反応を行う」との表現は、増幅対象の核酸が存在する場合に前記核酸が増幅可能な条件となるように調整することを意味し、必ずしも増幅対象の核酸が増幅されることを意味するものではない。
一態様において、本開示は、試料と、第１の鋳型ＤＮＡ、第２の鋳型ＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、ニッキング用エンドヌクレアーゼ、及びラムダエキソヌクレアーゼと、を混合し、検出用のシグナル配列を含むシグナルＤＮＡの核酸増幅反応を行うことと、前記シグナルＤＮＡの存在状態を判定することと、を含み、前記核酸増幅反応の系中の前記ラムダエキソヌクレアーゼの濃度が１．０Ｕ／ｍＬ～２００Ｕ／ｍＬである、試料中の標的核酸の存在状態の判定方法を提供する。以下、上記判定方法を「本判定方法」とも記す。なお、本判定方法は増幅された核酸の存在状態を判定するものであるため、上記「核酸増幅反応を行う」との表現は、増幅対象の核酸が存在する場合に前記核酸が増幅可能な条件となるように調整することを意味し、必ずしも増幅対象の核酸が増幅されることを意味するものではない。
【0014】
本開示において、「存在状態」とは、単に存在の有無を指してもよく、存在量（存在量０、つまり存在しない場合も含む）を指していてもよい。したがって、「存在状態を判定すること」とは、存在するかしないかというバイナリーな判定を行うことであってもよく、存在するかしないかに加えて存在する場合の存在量の判定までも行うものであってもよい。ここで、「存在量」は、絶対的な存在量には限定されず、ネガティブコントロール又はポジティブコントロール等の比較対象に対する相対存在量であってもよい。
【0015】
一態様において、第１の鋳型ＤＮＡは、シグナル配列に相補的な第１の配列と、ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、標的核酸に相補的な配列と、を含み、第２の鋳型ＤＮＡは、シグナル配列に相補的な第２の配列と、ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、シグナル配列に相補的な第３の配列と、を含み、核酸増幅反応は、
（Ａ）第１の鋳型ＤＮＡにおける標的核酸に相補的な配列と、標的核酸と、がハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによって標的核酸からの核酸鎖の伸長が起こり、伸長された核酸鎖のニッキング用エンドヌクレアーゼによる切断、及び切断部位からのＤＮＡポリメラーゼによる核酸鎖の伸長を繰り返して、シグナルＤＮＡが増幅される、第一段階増幅と、
（Ｂ）第２の鋳型ＤＮＡにおけるシグナル配列に相補的な第３の配列と、シグナルＤＮＡと、がハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによってシグナルＤＮＡからの核酸鎖の伸長が起こり、伸長された核酸鎖のニッキング用エンドヌクレアーゼによる切断、及び切断部位からのＤＮＡポリメラーゼによる核酸鎖の伸長を繰り返して、シグナルＤＮＡがさらに増幅される、第二段階増幅と、を含む。
（Ａ）第１の鋳型ＤＮＡにおける標的核酸に相補的な配列と、標的核酸と、がハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによって標的核酸からの核酸鎖の伸長が起こり、伸長された核酸鎖のニッキング用エンドヌクレアーゼによる切断、及び切断部位からのＤＮＡポリメラーゼによる核酸鎖の伸長を繰り返して、シグナルＤＮＡが増幅される、第一段階増幅と、
（Ｂ）第２の鋳型ＤＮＡにおけるシグナル配列に相補的な第３の配列と、シグナルＤＮＡと、がハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによってシグナルＤＮＡからの核酸鎖の伸長が起こり、伸長された核酸鎖のニッキング用エンドヌクレアーゼによる切断、及び切断部位からのＤＮＡポリメラーゼによる核酸鎖の伸長を繰り返して、シグナルＤＮＡがさらに増幅される、第二段階増幅と、を含む。
【0016】
本判定方法の原理を、図１を用いて説明する。なお、図１は例示による説明のための図であり、本開示の実施形態を限定するものではない。
試料中に標的核酸が存在する場合、第一段階増幅（Ａ）と第二段階増幅（Ｂ）の２段階の増幅反応を経てシグナルＤＮＡが増幅される。
第一段階増幅（Ａ）は、第１の鋳型ＤＮＡにおける標的核酸に相補的な配列と、標的核酸と、のハイブリダイズ（ａ１）により開始する。続いて、ＤＮＡポリメラーゼによって標的核酸からの核酸鎖の伸長が進行する（ａ２）。さらに、ニッキング用エンドヌクレアーゼによって、伸長した片側鎖が切断される（ａ３）。その結果、ニッキングされた片側鎖において新たな３’端が生じるため、その箇所を起点としてＤＮＡポリメラーゼによる新たな鎖伸長が開始する。その後、熱変性、ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換反応等によって、シグナルＤＮＡを含む片側鎖が二本鎖から解離する。これらの伸長された核酸鎖のニッキング用エンドヌクレアーゼによる切断、及び切断部位からのＤＮＡポリメラーゼによる核酸鎖の伸長を繰り返して、シグナルＤＮＡが増幅される。第一段階増幅（Ａ）におけるシグナルＤＮＡの増幅は、一次関数的な増幅である。
第二段階増幅（Ｂ）は、第２の鋳型ＤＮＡにおけるシグナル配列に相補的な第３の配列と、シグナルＤＮＡと、のハイブリダイズ（ｂ１）により開始する。続いて、ＤＮＡポリメラーゼにより核酸鎖の伸長が進行する（ｂ２）。さらに、ニッキング用エンドヌクレアーゼによって、伸長した片側鎖が切断される。その結果、ニッキングされた片側鎖において新たな３’端が生じるため、その箇所を起点としてＤＮＡポリメラーゼによる新たな鎖伸長が開始する。その後、熱変性、ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換反応等によって、シグナルＤＮＡを含む片側鎖が二本鎖から解離する（ｂ３）。これらの伸長された核酸鎖のニッキング用エンドヌクレアーゼによる切断、及び切断部位からのＤＮＡポリメラーゼによる核酸鎖の伸長を繰り返して、シグナルＤＮＡがさらに増幅される。第２の鋳型ＤＮＡ上に、２つのシグナルＤＮＡハイブリダイゼーション部位が設けられている結果、シグナルＤＮＡ一本鎖分子の濃度が上昇すると、シグナルＤＮＡの増幅量も増え、つまり鎖伸長反応の起点の量自体がさらに増加する。したがって、第二段階増幅（Ｂ）におけるシグナルＤＮＡの増幅は指数関数的な増幅である。
このようにして増幅されたシグナルＤＮＡの存在状態は標的核酸の存在状態の指標となるため、増幅されたシグナルＤＮＡの存在状態を判定することによって、標的核酸の存在状態が判定される。例えば、試料中に標的核酸が存在しない場合には増幅反応が起こらず、上記反応によりシグナルＤＮＡが増幅されないが、試料中に標的核酸が存在する場合には、上記反応によりシグナルＤＮＡが増幅される。増幅したシグナルＤＮＡを検出することで、感度の高い標的核酸の検出が可能となる。
試料中に標的核酸が存在する場合、第一段階増幅（Ａ）と第二段階増幅（Ｂ）の２段階の増幅反応を経てシグナルＤＮＡが増幅される。
第一段階増幅（Ａ）は、第１の鋳型ＤＮＡにおける標的核酸に相補的な配列と、標的核酸と、のハイブリダイズ（ａ１）により開始する。続いて、ＤＮＡポリメラーゼによって標的核酸からの核酸鎖の伸長が進行する（ａ２）。さらに、ニッキング用エンドヌクレアーゼによって、伸長した片側鎖が切断される（ａ３）。その結果、ニッキングされた片側鎖において新たな３’端が生じるため、その箇所を起点としてＤＮＡポリメラーゼによる新たな鎖伸長が開始する。その後、熱変性、ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換反応等によって、シグナルＤＮＡを含む片側鎖が二本鎖から解離する。これらの伸長された核酸鎖のニッキング用エンドヌクレアーゼによる切断、及び切断部位からのＤＮＡポリメラーゼによる核酸鎖の伸長を繰り返して、シグナルＤＮＡが増幅される。第一段階増幅（Ａ）におけるシグナルＤＮＡの増幅は、一次関数的な増幅である。
第二段階増幅（Ｂ）は、第２の鋳型ＤＮＡにおけるシグナル配列に相補的な第３の配列と、シグナルＤＮＡと、のハイブリダイズ（ｂ１）により開始する。続いて、ＤＮＡポリメラーゼにより核酸鎖の伸長が進行する（ｂ２）。さらに、ニッキング用エンドヌクレアーゼによって、伸長した片側鎖が切断される。その結果、ニッキングされた片側鎖において新たな３’端が生じるため、その箇所を起点としてＤＮＡポリメラーゼによる新たな鎖伸長が開始する。その後、熱変性、ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換反応等によって、シグナルＤＮＡを含む片側鎖が二本鎖から解離する（ｂ３）。これらの伸長された核酸鎖のニッキング用エンドヌクレアーゼによる切断、及び切断部位からのＤＮＡポリメラーゼによる核酸鎖の伸長を繰り返して、シグナルＤＮＡがさらに増幅される。第２の鋳型ＤＮＡ上に、２つのシグナルＤＮＡハイブリダイゼーション部位が設けられている結果、シグナルＤＮＡ一本鎖分子の濃度が上昇すると、シグナルＤＮＡの増幅量も増え、つまり鎖伸長反応の起点の量自体がさらに増加する。したがって、第二段階増幅（Ｂ）におけるシグナルＤＮＡの増幅は指数関数的な増幅である。
このようにして増幅されたシグナルＤＮＡの存在状態は標的核酸の存在状態の指標となるため、増幅されたシグナルＤＮＡの存在状態を判定することによって、標的核酸の存在状態が判定される。例えば、試料中に標的核酸が存在しない場合には増幅反応が起こらず、上記反応によりシグナルＤＮＡが増幅されないが、試料中に標的核酸が存在する場合には、上記反応によりシグナルＤＮＡが増幅される。増幅したシグナルＤＮＡを検出することで、感度の高い標的核酸の検出が可能となる。
【0017】
従来の方法では、上記核酸増幅反応においてバックグラウンド増幅が少なからず発生してしまい、標的核酸を検出する際に不十分な感度の原因となっていた。バックグラウンド増幅は、標的核酸とは異なる系中の核酸が非特異的に鋳型ＤＮＡにハイブリダイズしてしまうことが一因と考えられた。そこで、発明者らは、反応系にラムダエキソヌクレアーゼを添加することでバックグラウンド増幅を抑制することを発案した。ラムダエキソヌクレアーゼは２本鎖ＤＮＡの５’末端から核酸を分解するエキソヌクレアーゼ活性を有するが、１本鎖ＤＮＡやＲＮＡには殆ど作用しない。そのため、標的核酸は第１の鋳型ＤＮＡとハイブリダイゼーションしても分解されず、一方、第１の鋳型ＤＮＡに非特異的に結合するＤＮＡの多くは分解される。その結果、標的核酸の鋳型への特異的ハイブリダイゼーションを阻害せずに、非特異的結合を抑制できると考えられる。また、発明者らの検討により、核酸増幅反応の系中のラムダエキソヌクレアーゼの濃度が１．０Ｕ／ｍＬ～２００Ｕ／ｍＬである場合に、良好に上記効果が奏されることが見出された。
【0018】
加えて、ラムダエキソヌクレアーゼは平滑末端や３’突出末端を有する２本鎖ＤＮＡにおける５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するが、５’突出末端には作用しない。そのため、シグナルＤＮＡと第２の鋳型ＤＮＡにおけるシグナル配列に相補的な第３の配列とがハイブリダイズしてなる二本鎖ＤＮＡが５’突出末端を有するように鋳型ＤＮＡ及びシグナルＤＮＡを設計すれば、これらのハイブリダイゼーションを阻害せずに非特異的結合を特に良好に抑制できる。
以下、本判定方法の各工程及び関与する物質について詳述する。
以下、本判定方法の各工程及び関与する物質について詳述する。
【0019】
＜核酸増幅反応＞
（第１の鋳型ＤＮＡ）
第１の鋳型ＤＮＡは、標的核酸をプライマーとした核酸増幅の鋳型となる一本鎖ＤＮＡである。一態様において、第１の鋳型ＤＮＡは、シグナル配列に相補的な第１の配列と、ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、標的核酸に相補的な配列と、を含む。好ましくは、第１の鋳型ＤＮＡは、５’末端から順に、前記シグナル配列に相補的な第１の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記標的核酸に相補的な配列と、を含む。
（第１の鋳型ＤＮＡ）
第１の鋳型ＤＮＡは、標的核酸をプライマーとした核酸増幅の鋳型となる一本鎖ＤＮＡである。一態様において、第１の鋳型ＤＮＡは、シグナル配列に相補的な第１の配列と、ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、標的核酸に相補的な配列と、を含む。好ましくは、第１の鋳型ＤＮＡは、５’末端から順に、前記シグナル配列に相補的な第１の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記標的核酸に相補的な配列と、を含む。
【0020】
シグナルＤＮＡは、前記核酸増幅反応により増幅されて、後述する検出用に用いられるＤＮＡである。シグナルＤＮＡはシグナル配列を含む。シグナル配列は好ましくはシグナルＤＮＡの３’末端から６～５０塩基、より好ましくは７～３０塩基、さらに好ましくは８～１５塩基の配列を指す。シグナル配列は任意に設計可能であり、反応条件に即した融解温度（melting temperature、Ｔｍ値）、高次構造の融解温度等を考慮して設計することが好ましい。シグナル配列に相補的な第１の配列は、シグナル配列の全長と相補的であることが好ましい。
シグナルＤＮＡと鋳型の結合における融解温度は反応温度＋５℃（反応温度３７℃の場合４２℃）を中心に±１５℃であることが好ましく、±１０℃であることがさらに好ましく、±５℃であることがさらに好ましい。
シグナル配列及びこれに相補的な配列の塩基数は、それぞれ、６～５０であることが好ましく、７～３０であることがより好ましく、８～１５であることがさらに好ましい。
シグナルＤＮＡと鋳型の結合における融解温度は反応温度＋５℃（反応温度３７℃の場合４２℃）を中心に±１５℃であることが好ましく、±１０℃であることがさらに好ましく、±５℃であることがさらに好ましい。
シグナル配列及びこれに相補的な配列の塩基数は、それぞれ、６～５０であることが好ましく、７～３０であることがより好ましく、８～１５であることがさらに好ましい。
【0021】
ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列は、後述のニッキング用エンドヌクレアーゼの種類に応じて決定される。なお、本開示において、鋳型上の「ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列」とは、ニッキング用エンドヌクレアーゼが２本鎖ＤＮＡを切断対象として認識した場合における、ニッキングされる鎖とは反対の鎖における、ニッキング用エンドヌクレアーゼが認識する核酸領域の配列をいう。すなわち、ニッキング用エンドヌクレアーゼは、鋳型の相補鎖側を切断する。なお、ニッキング用エンドヌクレアーゼの切断部位は、前記２本鎖ＤＮＡの切断対象として認識した配列内に存在してもよく、当該認識した配列の近傍に存在してもよい。認識配列は、特異性に優れる観点からは、３塩基以上であることが好ましく、４塩基以上であることがより好ましく、５塩基以上であることがさらに好ましく、６塩基以上であることが特に好ましく、７塩基以上であることが極めて好ましい。入手容易性の観点からは、認識配列は、１０塩基以下でもよく、９塩基以下でもよく、８塩基以下でもよく、７塩基以下でもよく、６塩基以下でもよい。
【0022】
ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列は、２種類の塩基からなってもよく、３種類の塩基からなってもよく、４種類の塩基からなってもよい。「認識配列が２種類の塩基からなる」とは、例えば、前記認識配列がＧとＣの２種類のみを塩基として有する場合が挙げられる。「認識配列が３種類の塩基からなる」とは、例えば、前記認識配列がＧとＣとＡの３種類のみを塩基として有する場合が挙げられる。「認識配列が４種類の塩基からなる」とは、例えば、前記認識配列がＧとＣとＡとＴの４種類を塩基として有する場合である。
【0023】
標的核酸に相補的な配列は、標的核酸の塩基配列に応じて設計され、例えば、特異性の観点からは、標的核酸の３’末端から６塩基以上、好ましくは７塩基以上、より好ましくは８塩基以上の配列と相補的な配列を有する。また、標的核酸に相補的な配列は、例えば、融解温度の観点からは、標的核酸の３’末端から２００基以下、好ましくは１００塩基以下、より好ましくは３０塩基以下の配列と相補的な配列を有する。したがって、標的核酸に相補的な配列の塩基数は上記範囲であり得る。
【0024】
第１の鋳型ＤＮＡは、シグナル配列に相補的な第１の配列と、ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、標的核酸に相補的な配列に加えて、核酸増幅反応の進行を大きく妨げない範囲で、各配列の間に任意の介在配列を有してもよい。介在配列の塩基数は、それぞれ０～２であってもよく、３～５であってもよく、６～２０であってもよい。
【0025】
第１の鋳型ＤＮＡにおいて、シグナル配列に相補的な第１の配列と、ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列とは、一部重複していてもよく、重複していなくてもよい。また、ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、標的核酸に相補的な配列とは、一部重複していてもよく、重複していなくてもよい。
【0026】
第１の鋳型ＤＮＡの塩基数は特に制限されず、扱いやすさの観点からは、５～５０であることが好ましく、５～３０であることがより好ましく、１０～３０であることがさらに好ましい。
【0027】
第１の鋳型ＤＮＡの５’末端はリン酸化されていないことが好ましい。これにより、第１の鋳型ＤＮＡの５’末端がラムダエキソヌクレアーゼから好適に保護される。
【0028】
第１の鋳型ＤＮＡの３’末端側には、３’末端側より伸長反応が起こらないように、３’末端を修飾しておくことが好ましい。末端の修飾としては、ＴＡＭＲＡ、ＤＡＢＣＹＬ、ＦＡＭ等が挙げられる。その他、ビオチン化、蛍光色素、リン酸化、チオール化、アミノ化等による修飾であってもよい。
【0029】
第１の鋳型ＤＮＡは当業者に知られる任意の方法で作製することができる。例えば、ホスホアミダイト法、リン酸トリエステル法、Ｈ－ホスホネート法、チオホスホネート法等を用いて合成することができる。
【0030】
核酸増幅反応の系中の第１の鋳型ＤＮＡの濃度は適宜調整可能である。一態様において、第１の鋳型ＤＮＡを十分量とする観点からは、前記濃度は０．０１ｎＭ以上が好ましく、０．１ｎＭ以上がより好ましく、１ｎＭ以上がさらに好ましい。一態様において、前記濃度は１００ｎＭ以下でもよく、１０ｎＭ以下でもよく、５ｎＭ以下でもよい。
【0031】
核酸増幅反応において、第１の鋳型ＤＮＡは１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。例えば、２種以上の標的核酸の存在状態を判定する場合（例えば、後述のように、試料中の生物の同定を行う場合）、２種以上の第１の鋳型ＤＮＡを併用することで効率的な判定が可能である。２種以上の第１の鋳型ＤＮＡを併用する場合としては、第１の配列、ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列、及び標的核酸に相補的な配列のうち、標的核酸に相補的な配列のみが異なる２種以上の第１の鋳型ＤＮＡを併用する場合、標的核酸に相補的な配列及び第１の配列の両方が異なる２種以上の第１の鋳型ＤＮＡを併用する場合等が挙げられる。
【0032】
（第２の鋳型ＤＮＡ）
第２の鋳型ＤＮＡは、シグナルＤＮＡをプライマーとした核酸増幅の鋳型となる一本鎖ＤＮＡである。一態様において、第２の鋳型ＤＮＡは、シグナル配列に相補的な第２の配列と、ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、シグナル配列に相補的な第３の配列と、を含む。好ましくは、第２の鋳型ＤＮＡは、５’末端から順に、前記シグナル配列に相補的な第２の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記シグナル配列に相補的な第３の配列と、を含む。
第２の鋳型ＤＮＡは、シグナルＤＮＡをプライマーとした核酸増幅の鋳型となる一本鎖ＤＮＡである。一態様において、第２の鋳型ＤＮＡは、シグナル配列に相補的な第２の配列と、ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、シグナル配列に相補的な第３の配列と、を含む。好ましくは、第２の鋳型ＤＮＡは、５’末端から順に、前記シグナル配列に相補的な第２の配列と、前記ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、前記シグナル配列に相補的な第３の配列と、を含む。
【0033】
シグナル配列に相補的な第２の配列は、シグナル配列の全長と相補的であることが好ましい。シグナル配列に相補的な第２の配列の詳細は第１の鋳型ＤＮＡにおけるシグナル配列に相補的な第１の配列の詳細と同様である。
【0034】
シグナル配列に相補的な第３の配列は、シグナル配列の全長と相補的であることが好ましい。シグナル配列に相補的な第３の配列の詳細は第１の鋳型ＤＮＡにおけるシグナル配列に相補的な第１の配列の詳細と同様である。
【0035】
第１の鋳型ＤＮＡにおけるシグナル配列に相補的な第１の配列、並びに第２の鋳型ＤＮＡにおけるシグナル配列に相補的な第２及び第３の配列は、いずれも同一の配列であっても、いずれか２つが同一で１つが異なっても、全てが異なってもよい。
【0036】
ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列の詳細は第１の鋳型ＤＮＡの項で説明したものと同様である。なお、第一段階増幅と第二段階増幅とでは同一のニッキング用エンドヌクレアーゼを用いても異なるニッキング用エンドヌクレアーゼを用いてもよいため、第１の鋳型ＤＮＡにおけるニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と第２の鋳型ＤＮＡにおけるニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列とは同一でも異なってもよい。１種類のニッキング用エンドヌクレアーゼを用いて簡便に核酸増幅反応を行える観点からは、第１の鋳型ＤＮＡにおけるニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と第２の鋳型ＤＮＡにおけるニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列とは同一であることが好ましい。
【0037】
第２の鋳型ＤＮＡは、シグナル配列に相補的な第２の配列と、ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、シグナル配列に相補的な第３の配列に加えて、核酸増幅反応の進行を大きく妨げない範囲で、各配列の間に任意の介在配列を有してもよい。介在配列の塩基数は、それぞれ１～４であってもよく、５～１０であってもよく、１１～３０であってもよい。
【0038】
第２の鋳型ＤＮＡにおいて、シグナル配列に相補的な第２の配列と、ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列とは、一部重複していてもよく、重複していなくてもよい。また、ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、シグナル配列に相補的な第３の配列とは、一部重複していてもよく、重複していなくてもよい。
【0039】
第２の鋳型ＤＮＡの塩基数は特に制限されず、扱いやすさの観点からは、５～５０であることが好ましく、５～３０であることがより好ましく、１０～３０であることがさらに好ましい。
【0040】
第２の鋳型ＤＮＡの５’末端はリン酸化されていないことが好ましい。これにより、第２の鋳型ＤＮＡの５’末端がラムダエキソヌクレアーゼから好適に保護される。
【0041】
第２の鋳型ＤＮＡの３’末端側には、３’末端側より伸長反応が起こらないように、３’末端を修飾しておくことが好ましい。末端の修飾方法は、第１の鋳型ＤＮＡの項で説明した方法が挙げられる。
【0042】
第２の鋳型ＤＮＡは当業者に知られる任意の方法で作製することができる。例えば、第１の鋳型ＤＮＡの項で説明した方法が挙げられる。
【0043】
核酸増幅反応の系中の第２の鋳型ＤＮＡの濃度は適宜調整可能である。一態様において、第２の鋳型ＤＮＡを十分量とする観点からは、前記濃度は０．１ｎＭ以上であることが好ましく、１ｎＭ以上であることがより好ましく、２０ｎＭ以上であることがさらに好ましい。一態様において、前記濃度は１００ｎＭ以下であってもよく、５０ｎＭ以下であってもよく、２０ｎＭ以下であってもよい。
【0044】
核酸増幅反応において、第２の鋳型ＤＮＡは１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。例えば、第１の配列の異なる２種以上の第１の鋳型ＤＮＡを用いる場合、２種以上の第２の鋳型ＤＮＡを併用して核酸増幅反応を行うことができる。
【0045】
（ＤＮＡポリメラーゼ）
本判定方法で用いられるＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ鎖を伸長できるものであれば特に制限されない。なかでも、ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有することが好ましい。ＤＮＡポリメラーゼが鎖置換活性を有することで、シグナルＤＮＡの解離のための温度調整を要することなく、例えば等温で、核酸増幅反応を実施できる。ＤＮＡポリメラーゼは、常温性、中温性、又は耐熱性のいずれのものであってもよい。ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有しないものであることが好ましい。ＤＮＡポリメラーゼとしては、大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させた変異体を含む）、バチルス・ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、バチルス・カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。
本判定方法で用いられるＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ鎖を伸長できるものであれば特に制限されない。なかでも、ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有することが好ましい。ＤＮＡポリメラーゼが鎖置換活性を有することで、シグナルＤＮＡの解離のための温度調整を要することなく、例えば等温で、核酸増幅反応を実施できる。ＤＮＡポリメラーゼは、常温性、中温性、又は耐熱性のいずれのものであってもよい。ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有しないものであることが好ましい。ＤＮＡポリメラーゼとしては、大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させた変異体を含む）、バチルス・ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、バチルス・カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。
【0046】
核酸増幅反応の系中のＤＮＡポリメラーゼの濃度は適宜調節可能である。一態様において、良好な核酸増幅反応の観点からは、前記濃度は１Ｕ／ｍＬ以上であることが好ましく、前記濃度は１０Ｕ／ｍＬ以上であることがより好ましく、前記濃度は２０Ｕ／ｍＬ以上であることがさらに好ましい。一態様において、前記濃度は１００Ｕ／ｍＬ以下であってもよく、５０Ｕ／ｍＬ以下であってもよく、３０Ｕ／ｍＬ以下であってもよい。
【0047】
（ニッキング用エンドヌクレアーゼ）
ニッキング用エンドヌクレアーゼは、ニッキング活性を有するエンドヌクレアーゼを意味する。ニッキング活性とは、二本鎖核酸のいずれか一方の鎖のみを切断する活性である。ニッキング用エンドヌクレアーゼは、ニッキング活性を有するエンドヌクレアーゼであれば制限されない。ニッキングに用い得る多くのエンドヌクレアーゼが認識配列とともに知られており、これらのエンドヌクレアーゼの中から適宜選択して使用することができる。ニッキング用エンドヌクレアーゼとしては、ニッキングエンドヌクレアーゼ及び制限酵素が挙げられる。
ニッキング用エンドヌクレアーゼは、ニッキング活性を有するエンドヌクレアーゼを意味する。ニッキング活性とは、二本鎖核酸のいずれか一方の鎖のみを切断する活性である。ニッキング用エンドヌクレアーゼは、ニッキング活性を有するエンドヌクレアーゼであれば制限されない。ニッキングに用い得る多くのエンドヌクレアーゼが認識配列とともに知られており、これらのエンドヌクレアーゼの中から適宜選択して使用することができる。ニッキング用エンドヌクレアーゼとしては、ニッキングエンドヌクレアーゼ及び制限酵素が挙げられる。
【0048】
ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列の好ましい態様は上述の通りである。
【0049】
ニッキング用エンドヌクレアーゼの反応至適温度は、増幅反応の簡便性の観点からは、１０℃～６０℃であることが好ましく、２０℃～５０℃であることがより好ましく、３０℃～４５℃であることがさらに好ましい。反応至適温度は、反応温度と反応速度の相関曲線により確認できる。
【0050】
ＤＮＡポリメラーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、及び必要に応じて用いられる他の酵素の反応を好適に進行させやすい観点からは、ニッキング用エンドヌクレアーゼが活性を有するｐＨ範囲は広いほど好ましい。前記ｐＨ範囲は、ｐＨ６．０～９．０の範囲を包含することが好ましく、ｐＨ６．５～８．５の範囲を包含することがより好ましく、ｐＨ７．０～８．０の範囲を包含することがさらに好ましい。
【0051】
ニッキングエンドヌクレアーゼとしては、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｓｓＳＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ等が挙げられる。
【0052】
制限酵素は、通常は二本鎖の両方の鎖を切断する酵素であるが、例えば、制限酵素によって切断されない化学修飾を二本鎖核酸の一方の鎖に施すことにより、他方の鎖のみを切断するニッキング反応に用いることができる。例えば、一方の鎖のホスホジエステル結合の酸素原子を硫黄原子に置換することにより、ニッキング反応に用いることが可能となる。この場合は、第１の鋳型ＤＮＡ及び／又は第２の鋳型ＤＮＡを上記の通り修飾しておけばよい。
【0053】
第一段階増幅と第二段階増幅では、同一又は異なるニッキング用エンドヌクレアーゼにより伸長された核酸配列が切断される。したがって、ニッキング用エンドヌクレアーゼは、１種のみを用いても２種を用いてもよい。
【0054】
核酸増幅反応の系中のニッキング用エンドヌクレアーゼの濃度は適宜調節可能である。一態様において、良好な核酸増幅反応の観点からは、前記濃度は１０Ｕ／ｍＬ以上であることが好ましく、１００Ｕ／ｍＬ以上であることがより好ましく、２００Ｕ／ｍＬ以上であることがさらに好ましい。一態様において、前記濃度は１０００Ｕ／ｍＬ以下であってもよく、５００Ｕ／ｍＬ以下であってもよく、３００Ｕ／ｍＬ以下であってもよい。
【0055】
（ラムダエキソヌクレアーゼ）
ラムダエキソヌクレアーゼは、２本鎖ＤＮＡに特異的な５’→３’エキソヌクレアーゼである。
ラムダエキソヌクレアーゼは、２本鎖ＤＮＡに特異的な５’→３’エキソヌクレアーゼである。
【0056】
核酸増幅反応の系中のラムダエキソヌクレアーゼの濃度は１．０Ｕ／ｍＬ～２００Ｕ／ｍＬである。一態様において、検出感度の観点からは、前記濃度は１５０Ｕ／ｍＬ以下であることが好ましく、１００Ｕ／ｍＬ以下であることがより好ましく、５０Ｕ／ｍＬ以下であることがさらに好ましく、２５Ｕ／ｍＬ以下であることが特に好ましい。エキソヌクレアーゼ活性を良好に発揮し、バックグラウンド増幅をより好適に抑制する観点からは、前記濃度は２．５Ｕ／ｍＬ以上であることが好ましく、１０Ｕ／ｍＬ以上がより好ましく、１５Ｕ／ｍＬ以上であることがさらに好ましい。なかでも、前記濃度は２．５Ｕ／ｍＬ～１００Ｕ／ｍＬであることが好ましく、５Ｕ／ｍＬ～１００Ｕ／ｍＬであることがより好ましく、１０Ｕ／ｍＬ～１００Ｕ／ｍＬであることがさらに好ましく、１５Ｕ／ｍＬ～５０Ｕ／ｍＬであることが特に好ましく、１５Ｕ／ｍＬ～２５Ｕ／ｍＬであることが極めて好ましい。
【0057】
（他の試薬）
核酸増幅反応に用いられるその他の試薬としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の金属塩；ｄＮＴＰミックス等の基質；トリス塩酸バッファー、トライシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー等の緩衝液等を使用することができる。さらに、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）やベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）等の添加物、国際公開第９９／５４４５５号に記載の酸性物質、陽イオン錯体等を使用してもよい。
核酸増幅反応に用いられるその他の試薬としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の金属塩；ｄＮＴＰミックス等の基質；トリス塩酸バッファー、トライシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー等の緩衝液等を使用することができる。さらに、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）やベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）等の添加物、国際公開第９９／５４４５５号に記載の酸性物質、陽イオン錯体等を使用してもよい。
【0058】
（試料）
試料は標的核酸が存在し得る試料であれば特に制限されず、生物由来試料、ウイルス由来試料、環境由来試料、食品、医薬品（生物学的製剤等）等が挙げられる。また、試料は天然試料であっても、人工試料（合成ＲＮＡ、合成ＤＮＡを含み得る試料等）であってもよい。
生物由来試料としては、動物（哺乳類（例えばヒト及び非ヒト哺乳類動物）、鳥類、両生類、爬虫類、魚類、脊索動物、節足動物等）、植物（イネ、コムギ、タバコ等）、真菌（カビ、酵母等）、細菌等の生物に由来する試料が挙げられる。生物由来試料としては、具体的には、血液、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織等の生物由来試料；生物体（菌体等）；細胞培養物等が挙げられる。
環境由来試料としては、土壌、水（生活排水、河川水、海水、地下水、水道水等）、空気等に由来する試料が挙げられる。
試料は標的核酸が存在し得る試料であれば特に制限されず、生物由来試料、ウイルス由来試料、環境由来試料、食品、医薬品（生物学的製剤等）等が挙げられる。また、試料は天然試料であっても、人工試料（合成ＲＮＡ、合成ＤＮＡを含み得る試料等）であってもよい。
生物由来試料としては、動物（哺乳類（例えばヒト及び非ヒト哺乳類動物）、鳥類、両生類、爬虫類、魚類、脊索動物、節足動物等）、植物（イネ、コムギ、タバコ等）、真菌（カビ、酵母等）、細菌等の生物に由来する試料が挙げられる。生物由来試料としては、具体的には、血液、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織等の生物由来試料；生物体（菌体等）；細胞培養物等が挙げられる。
環境由来試料としては、土壌、水（生活排水、河川水、海水、地下水、水道水等）、空気等に由来する試料が挙げられる。
【0059】
試料は標的核酸の存在状態について分析したい対象物（以下、「分析対象物」とも記す。）であっても、分析対象物から任意の処理により調製した試料であってもよい。作業の簡便性の観点からは、試料は分析対象物であることが好ましい。分析対象物は固体、液体、気体のいずれでもよい。
分析対象物から任意の処理により調製した試料としては、分析対象物である固体を液体に浸漬して得られた液体；分析対象物である液体の希釈物；気体中の浮遊物を収集して得られた試料（空気の濾過フィルタ上に捕集された捕集物等）；分析対象物の表面を拭いたワイプ、綿棒等、又は該捕集物を液体に浸漬して得られた液体；周囲雰囲気に開放された容器内に付着した付着物などが挙げられる。分析対象物から調製した試料としては、試料からＲＮＡを抽出、精製等して標的核酸を富化した調製物も挙げられる。
分析対象物から任意の処理により調製した試料としては、分析対象物である固体を液体に浸漬して得られた液体；分析対象物である液体の希釈物；気体中の浮遊物を収集して得られた試料（空気の濾過フィルタ上に捕集された捕集物等）；分析対象物の表面を拭いたワイプ、綿棒等、又は該捕集物を液体に浸漬して得られた液体；周囲雰囲気に開放された容器内に付着した付着物などが挙げられる。分析対象物から調製した試料としては、試料からＲＮＡを抽出、精製等して標的核酸を富化した調製物も挙げられる。
【0060】
一態様において、分析対象物は、衛生管理の必要とされる現場（食品製造、医療、福祉、家庭等）において存在が衛生管理上の問題となりうる生物であってもよい。そのような生物としては、病原性微生物、腐敗微生物が挙げられる。病原性微生物は病原性真菌であってもよく、その例としては、白癬菌、カンジダ、アスペルギルス等が挙げられる。病原性微生物は病原性細菌であってもよく、その例としては、グラム陽性菌（例えばブドウ球菌、レンサ球菌、肺炎球菌、腸球菌、ジフテリア菌、結核菌、らい菌、炭疽菌、枯草菌、ウェルシュ菌、破傷風菌、ボツリヌス菌等）、グラム陰性菌（淋菌、脳膜炎菌、サルモネラ菌、大腸菌、緑膿菌、赤痢菌、インフルエンザ菌、百日咳菌、コレラ菌、腸炎ビブリオ菌、アシネトバクター、カンピロバクター、レジオネラ菌、ヘリコバクター等）等が挙げられる。病原性細菌はベロ毒素生産菌であってもよい。腐敗微生物としては、魚介類の場合、シュードモナス、マイクロコッカス、ビブリオ、フラボバクテリウム等の各属の細菌が、畜肉類の場合、シュードモナス、アクロモバクター、マイクロコッカス、フラボバクテリウム等の各属の細菌が、米飯及びめん類の場合、バチルス属の細菌が挙げられる。
【0061】
ある実施形態においては、分析対象物となる生物は、腸内細菌科に属する細菌であってもよい。その例としては、Citrobacter freundii等のCitrobacter属の細菌、Edwardsiella tarda等のEdwardsiella属の細菌、Enterobacter aerogenes、E. cloacae、E. gergoviae、及びE. sakazakii等のEnterobacter属の細菌、Escherichia coli及びE. albertii等のEscherichia属の細菌、Hafnia alvei等のHafnia属の細菌、Klebsiella oxytoca及びK. pneumoniae等のKlebsiella属の細菌、Kluyvera ascorbata及びK. cryocrescens等のKluyvera属の細菌、Morganella morganii等のMorganella属の細菌、Proteus mirabilis及びP. vulgaris等のProteus属の細菌、Providencia alcalifaciens、P. rettgeri、及びP. stuartii等のProvidencia属の細菌、Salmonella enterica等のSalmonella属の細菌、Serratia liquefaciens及びS. marcescens等のSerratia属の細菌、Shigella boydii、S. dysenteriae、S. flexneri、及びS. sonnei等のShigella属の細菌、並びにYersinia enterocolitica、Y. pestis、及びY. pseudotuberculosis等のYersinia属の細菌が挙げられる。前記生物はEscherichia coli、Citrobacter freundii、及びSalmonella gallinarumからなる群より選ばれる少なくとも一種を含むことが好ましい。別のある実施形態においては、前記生物は植物を含み、前記植物はクロマツであってもよい。別のある実施形態においては、前記生物はベロ毒素生産菌を含む。
【0062】
分析対象物は細胞壁を有する生物であってもよい。分析対象物が細胞壁を有する生物である場合の試料の具体例及び調製方法は、例えば特開第２０２２－０４３９３４号公報、特開第２０２２－０４３９３５号公報、特開第２０２２－０４３９３６号公報、国際公開第２０２０／１７９８２３号等に記載の事項を採用できる。
【0063】
一態様において、標的核酸の塩基数は、５～５００であることが好ましく、８～５００であることがより好ましく、１０～２００であることがさらに好ましく、１２～１００であることが特に好ましく、１５～３０であることが極めて好ましい。
【0064】
標的核酸の種類は特に制限されず、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ａＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、合成ＲＮＡ、全ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＤＮＡ・ＲＮＡのハイブリッド等のいずれであってもよい。標的核酸の３’末端は、非修飾な水酸基であっても修飾された水酸基であってもよいが、ＤＮＡポリメラーゼによる核酸増幅が起こりやすいよう、非修飾な水酸基であることが好ましい。一態様において、標的核酸は、標的生物において特異的な発現を示すｓＲＮＡであってもよい。かかるｓＲＮＡの存在状態を判定することにより、試料中の標的生物の存在状態を判定したり、試料中の生物を同定したりすることができる。標的生物において特異的な発現を示すｓＲＮＡの詳細は後述する。
一態様において、標的核酸の５’末端は、ラムダエキソヌクレアーゼが作用しにくい形状（非修飾形状、リン酸基以外の修飾でキャップされた形状、第一の鋳型ＤＮＡと結合した際に１塩基以上の突出末端を有する形状、ＲＮＡ等）であることが好ましい。
５’末端の化学修飾はリン酸基以外の核酸増幅を阻害することができればいずれの保護基であってもよい。５’末端の化学修飾の一様態としてＡｍｉｎｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｒ（Ｃ３，Ｃ６，Ｃ１２等）、５’－Ｂｉｏｔｉｎ、Ｓｐａｃｅｒ（３、９、１８、ｄ等）、標識プローブ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＢＨＱ１等）、Ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄＴ等が挙げられる。
一態様において、標的核酸の５’末端は、ラムダエキソヌクレアーゼが作用しにくい形状（非修飾形状、リン酸基以外の修飾でキャップされた形状、第一の鋳型ＤＮＡと結合した際に１塩基以上の突出末端を有する形状、ＲＮＡ等）であることが好ましい。
５’末端の化学修飾はリン酸基以外の核酸増幅を阻害することができればいずれの保護基であってもよい。５’末端の化学修飾の一様態としてＡｍｉｎｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｒ（Ｃ３，Ｃ６，Ｃ１２等）、５’－Ｂｉｏｔｉｎ、Ｓｐａｃｅｒ（３、９、１８、ｄ等）、標識プローブ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＢＨＱ１等）、Ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄＴ等が挙げられる。
【0065】
〔反応条件〕
試料及び増幅反応に用いられる各試薬の混合のタイミング及び順序は特に制限されず、任意のタイミング及び順序で混合することができる。
試料及び増幅反応に用いられる各試薬の混合のタイミング及び順序は特に制限されず、任意のタイミング及び順序で混合することができる。
【0066】
核酸増幅反応の温度は特に制限されず、等温下で行なうことが好ましい。すなわち、核酸増幅反応は等温増幅反応であることが好ましい。第一段階増幅と第二段階増幅は、一連の等温増幅反応であることが好ましい。等温増幅反応は、増幅のための機器（温度サイクルに合わせて温度を変動させる機器）を用意する必要がない観点から好ましい。本開示において、「等温増幅反応」とは、核酸のアニーリング、伸長、及び解離のための温度サイクルを要する核酸増幅反応とは対照的に、酵素及びプライマーが実質的に機能しうるほぼ一定の温度条件で行われる核酸増幅反応を意味する。ここで、「ほぼ一定の温度条件」とは、設定された温度を正確に保持した温度条件のみならず、酵素及びプライマーの実質的な機能を損なわない範囲での変動（例えば設定温度±１０℃、好ましくは±５℃の変動）を許容した温度条件を意味する。
このような等温増幅反応は、使用する酵素の活性を維持できる温度に保つことにより実施することができる。反応が進行するにつれ酵素活性が減衰する場合であっても、意図される核酸増幅反応を実施できる温度であればよい。
このような等温増幅反応は、使用する酵素の活性を維持できる温度に保つことにより実施することができる。反応が進行するにつれ酵素活性が減衰する場合であっても、意図される核酸増幅反応を実施できる温度であればよい。
【0067】
等温増幅反応の温度は、１０℃～７５℃が好ましく、簡便性の観点からは、１０℃～４０℃がより好ましい。簡便性の観点から、等温増幅反応は常温（例えば２０℃～４０℃）で行ってもよい。
【0068】
核酸増幅反応のｐＨは、使用する酵素の種類に応じて調整すればよい。一態様において、核酸増幅反応のｐＨはｐＨ６．０～９．０が好ましく、ｐＨ６．５～８．５がより好ましく、ｐＨ７．０～８．０がさらに好ましい。
【0069】
一態様において、第二段階増幅において、第２の鋳型ＤＮＡにおけるシグナル配列に相補的な第３の配列と、シグナルＤＮＡと、がハイブリダイズしてなる二本鎖の、第２の鋳型ＤＮＡの３’端側の末端が５’突出末端を有することが好ましい。第一段階増幅によって得られたシグナルＤＮＡと、第２の鋳型ＤＮＡと、をハイブリダイズしてなる二本鎖ＤＮＡが５’突出末端を有するように、シグナルＤＮＡ及び第２の鋳型ＤＮＡを設計することで、非特異的結合のみをラムダエキソヌクレアーゼによってより良好に分解することができ、バックグラウンド増幅がより好適に抑制できる。
【0070】
＜シグナルＤＮＡの存在状態の判定＞
増幅されたシグナルＤＮＡの存在状態の判定は、オリゴヌクレオチドを検出する任意の方法を採用して行うことができる。例えば、ゲル電気泳動及びエチジウムブロマイド染色、蛍光偏光、イムノアッセイ、蛍光共鳴エネルギー転移、酵素標識（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミン等）、ケミルミネッセンス、バイオルミネッセンス等を使用してもよい。また、Ｔａｑｍａｎプローブ、分子ビーコン等を利用して検出してもよい。ビオチン等で標識した標識ヌクレオチドを使用して増幅産物を検出してもよい。この場合、増幅産物中のビオチンは、蛍光標識アビジン又は酵素標識アビジン等を用いて検出することができる。また、酸化還元型インターカレーターを使用することで、電極により増幅産物を検出してもよい。また、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）を用いて増幅産物を検出してもよい。
増幅されたシグナルＤＮＡの存在状態の判定は、オリゴヌクレオチドを検出する任意の方法を採用して行うことができる。例えば、ゲル電気泳動及びエチジウムブロマイド染色、蛍光偏光、イムノアッセイ、蛍光共鳴エネルギー転移、酵素標識（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミン等）、ケミルミネッセンス、バイオルミネッセンス等を使用してもよい。また、Ｔａｑｍａｎプローブ、分子ビーコン等を利用して検出してもよい。ビオチン等で標識した標識ヌクレオチドを使用して増幅産物を検出してもよい。この場合、増幅産物中のビオチンは、蛍光標識アビジン又は酵素標識アビジン等を用いて検出することができる。また、酸化還元型インターカレーターを使用することで、電極により増幅産物を検出してもよい。また、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）を用いて増幅産物を検出してもよい。
【0071】
一態様において、シグナルＤＮＡは定量してもよい。シグナルＤＮＡの定量によって、標的核酸の存在量を判定することができる。シグナルＤＮＡの定量は、例えば、蛍光を測定することによりシグナルＤＮＡの存在状態を判定する場合には、蛍光強度を指標として行うことができる。
標的核酸の存在量の判定は、例えば、濃度が既知の標的核酸を用いて同様の条件で核酸増幅反応を行って標的核酸濃度と増幅開始時間の相関を示す検量線を作成し、濃度が未知の標的核酸を用いて本判定方法を実施して検量線と比較することで行うことができる。
標的核酸の存在量の判定は、例えば、濃度が既知の標的核酸を用いて同様の条件で核酸増幅反応を行って標的核酸濃度と増幅開始時間の相関を示す検量線を作成し、濃度が未知の標的核酸を用いて本判定方法を実施して検量線と比較することで行うことができる。
【0072】
≪標的生物の存在状態の判定方法、及び生物の同定方法≫
一態様において、本開示は、前述の本判定方法により標的生物に特異的な発現を示すｓＲＮＡの存在状態を判定することを含む、試料中の標的生物の存在状態の判定方法を提供する。
一態様において、本開示は、前述の本判定方法によりｓＲＮＡの存在状態を判定することを含む、試料中の生物の同定方法を提供する。
一態様において、本開示は、前述の本判定方法により標的生物に特異的な発現を示すｓＲＮＡの存在状態を判定することを含む、試料中の標的生物の存在状態の判定方法を提供する。
一態様において、本開示は、前述の本判定方法によりｓＲＮＡの存在状態を判定することを含む、試料中の生物の同定方法を提供する。
【0073】
本判定方法を生物の同定に用いる場合、例えば、２種以上の第１の鋳型ＤＮＡを併用することにより生物を同定してもよい。
例えば、第１の配列、ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列、及び標的核酸に相補的な配列のうち、標的核酸に相補的な配列のみが異なる２種以上の第１の鋳型ＤＮＡを用いてもよい。この場合、例えば、検出対象の生物毎に、対応するｓＲＮＡに相補的な配列を有する第１の鋳型ＤＮＡを含む反応系で核酸増幅反応を行い、本判定方法を適用してもよい。
また、第１の配列、ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列、及び標的核酸に相補的な配列のうち、標的核酸に相補的な配列及び第１の配列の両方が異なる２種以上の第１の鋳型ＤＮＡを用いてもよい。この場合、例えば、１つの反応系で、前記２種以上の第１の鋳型ＤＮＡ及び対応して設計される２種以上の第２の鋳型ＤＮＡを用いて核酸増幅反応を行い、検出対象の生物毎に異なるシグナルＤＮＡを検出してもよい。
例えば、第１の配列、ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列、及び標的核酸に相補的な配列のうち、標的核酸に相補的な配列のみが異なる２種以上の第１の鋳型ＤＮＡを用いてもよい。この場合、例えば、検出対象の生物毎に、対応するｓＲＮＡに相補的な配列を有する第１の鋳型ＤＮＡを含む反応系で核酸増幅反応を行い、本判定方法を適用してもよい。
また、第１の配列、ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列、及び標的核酸に相補的な配列のうち、標的核酸に相補的な配列及び第１の配列の両方が異なる２種以上の第１の鋳型ＤＮＡを用いてもよい。この場合、例えば、１つの反応系で、前記２種以上の第１の鋳型ＤＮＡ及び対応して設計される２種以上の第２の鋳型ＤＮＡを用いて核酸増幅反応を行い、検出対象の生物毎に異なるシグナルＤＮＡを検出してもよい。
【0074】
ｓＲＮＡはｓｍａｌｌ ＲＮＡとも称され、細胞に含まれる短鎖のＲＮＡである。標的核酸が標的生物において特異的な発現を示すｓＲＮＡである場合、当該ｓＲＮＡの存在状態を判定することにより、試料中の標的生物の存在状態を判定することができる。また、当該ＲＮＡの存在状態を判定することにより、試料中の生物を同定することができる。
【0075】
ｓＲＮＡの塩基数は上述した標的核酸の塩基数の範囲であることが好ましい。なお、ｓＲＮＡの中には、真核細胞に含まれる２０塩基～３０塩基程度のＲＮＡであるｍｉｃｒｏ ＲＮＡ等もある。また、原核生物でも同程度の特に短いｓＲＮＡのことをｍｉｃｒｏＲＮＡ－ｓｉｚｅ ｓｍａｌｌ ＲＮＡと呼ぶ場合もある。
【0076】
標的生物において特異的な発現を示すｓＲＮＡの配列情報は、Rfam(EMBL EBI) 、Small RNA Database(MD Anderson Cancer Center) 、miRBase(Griffiths-Jones lab at the Faculty of Biology, Medicine and Health, University of Manchester)、National Center for Biotechnology Information (NCBI)のデータベース等のデータベースに蓄積されている他、学術論文にも種々報告されている。このため、各種の生物に含まれるｓＲＮＡの情報は、データベース検索を始めとする公知の方法で得ることが可能である（杏林医会誌４１巻１号ｐｐ．１３～１８ ２０１０年４月参照）。例えば、National Center for Biotechnology Information (NCBI)のデータベースに含まれる核酸配列と、検索対象の核酸配列とを、Nucleotide BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)を用いて比較及び同一配列の検索（当該同一配列の由来となる生物の情報を含む）をすることができる。
【0077】
ｓＲＮＡは、生物の種類に応じて差示的に発現する。例えば、Rfam、Small RNA Database、miRBase、National Center for Biotechnology Information (NCBI)データベース等の配列データベースを参照すると、特定のｓＲＮＡがどの生物において発現しているかを検索することができ、また、特定の生物においてどのｓＲＮＡが発現しているかを検索することができる。ｓＲＮＡは、関心のある特定の生物において特異的な発現状態を示すものであることが好ましい。このようにすることで、ｓＲＮＡの存在状態から生物の存在状態をよりよく判定できる。
【0078】
「標的生物に特異的な発現を示すｓＲＮＡ」は、標的生物に特異的に発現するｓＲＮＡであっても、標的生物に特異的に非発現であるｓＲＮＡであってもよい。存在状態を判定する少なくとも１種類は、標的生物に特異的に発現するｓＲＮＡであることが好ましい。
また、「標的生物において特異的な発現を示すｓＲＮＡ」は、標的生物においてのみ発現するｓＲＮＡであってもよく、標的生物においてのみ発現しないｓＲＮＡであってもよく、標的生物を含む特定の生物群においてのみ発現する、又は標的生物を含む特定の生物群においてのみ発現しないｓＲＮＡといった、標的生物にのみに完全に特異的であるわけではないｓＲＮＡであってもよい。
また、「標的生物において特異的な発現を示すｓＲＮＡ」は、標的生物においてのみ発現するｓＲＮＡであってもよく、標的生物においてのみ発現しないｓＲＮＡであってもよく、標的生物を含む特定の生物群においてのみ発現する、又は標的生物を含む特定の生物群においてのみ発現しないｓＲＮＡといった、標的生物にのみに完全に特異的であるわけではないｓＲＮＡであってもよい。
【0079】
試料中に特定の生物に特異的なｓＲＮＡが検出されることは、試料中における当該生物の存在を示唆する。試料中における特定の生物に特異的なｓＲＮＡの存在量の情報からは、試料中における当該生物の存在量についての情報を得ることもできる。
【0080】
ｓＲＮＡがどの生物で発現するかは、例えば以下のようにして知ることができる。前記ｓＲＮＡの核酸配列を基準配列として、National Center for Biotechnology Information (NCBI)のデータベースから、基準配列と類似する核酸配列をNucleotide BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)を用いて比較する。得られた比較結果の中から、基準配列としたｓＲＮＡと核酸配列が１００％一致するｓＲＮＡを含む生物が、前記ｓＲＮＡを発現する生物ということになる。
【0081】
なお、１種類のｓＲＮＡが１種類の生物に完全に特異的であるとは限らず、同じｓＲＮＡを発現する生物が複数種類存在する場合もある。しかし、１種類の生物におけるｓＲＮＡの発現プロファイルはｓＲＮＡ毎に異なるため、複数種類のｓＲＮＡそれぞれの存在状態を基にすれば、存在する可能性のある生物の種類をより絞り込むことができる。このため、複数種類のｓＲＮＡそれぞれの存在状態に基づいて、標的生物の存在状態を判定してもよい。この判定においては、標的生物において特異的に非発現であるｓＲＮＡの発現状態も用いることができる。標的生物において特異的に非発現であるｓＲＮＡが検出されること又はされないことは、単独では、前記生物の存在状態を示唆するものではないが、前記生物において特異的に発現するｓＲＮＡの存在状態についての情報と組み合わせることで、それらｓＲＮＡの発現プロファイルを示す生物の候補をより絞り込むことができる。
【0082】
存在状態を判定するｓＲＮＡとして、その発現プロファイルを基に関心のある特定の生物が、他の生物からよりよく判別されるようなｓＲＮＡを選択することが好ましい。
【0083】
生物の同定にあたっては、試料中に存在する生物の候補を１種類に限定してもよく、複数種類の生物からなる候補群を同定してもよい。後者は、複数種類の生物それぞれの存在状態を個別に判定するのではなく、複数種類の生物の存在状態を総体的に判定するものである。したがって、生物の同定は、複数種類の生物のうちどれが実際に存在しているかまでは判定できないとしても、候補群（グループ）を構成する複数種類の生物のうち少なくとも１種類が存在していることを判定できればよい。
【0084】
したがって、試料中の標的生物の存在状態の判定方法は、２種類以上の生物の総体的な存在状態を判定するものであってもよい。
また、試料中の生物の同定方法は、試料中の２種類以上の生物を総体的に同定するものであってもよい。
また、試料中の生物の同定方法は、試料中の２種類以上の生物を総体的に同定するものであってもよい。
【0085】
ｓＲＮＡの存在状態の検出の際に、ｓＲＮＡの存在量についても判定することで、生物の存在量の判定も可能となる。ｓＲＮＡの存在量の判定方法は上述した通りである。
【0086】
試料中のｓＲＮＡの存在状態に基づく生物の同定の一例について説明する。ｓＲＮＡであるＥＣ－５ｐ－３６（配列番号１；５’－ＵＧＵＧＧＧＣＡＣＵＣＧＡＡＧＡＵＡＣＧＧＡＵ－３’、Ｃｕｒｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１３ Ｎｏｖ；６７（５）：６０９－１３参照）は、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＬＡＳＴ検索によれば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属細菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属細菌、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌において共通して発現している。このことから、液体試料中にＥＣ－５ｐ－３６が存在すると検出された場合、存在している生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属細菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属細菌、及びＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌のうち１種類以上であると同定できる。また、ｓＲＮＡであるＥＣ－３ｐ－４０は、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＬＡＳＴ検索によれば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属細菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属細菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌、及びＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌に加えて、Ｋｌｅｂｓｉｌｌａ属細菌にも共通して発現する。このため、ＥＣ－３ｐ－４０（配列番号２；５’－ＧＵＵＧＵＧＡＧＧＵＵＡＡＧＣＧＡＣＵ－３’）が液体試料中に存在すると検出された場合、存在する生物はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属細菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属細菌、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌、及びＫｌｅｂｓｉｌｌａ属細菌のうち１種類以上であると同定できる。また、これらの結果を組み合わせて同定を行ってもよい。例えば、ＥＣ－５ｐ－３６はＫｌｅｂｓｉｌｌａ属細菌では発現しないが、ＥＣ－３ｐ－４０はＫｌｅｂｓｉｌｌａ属細菌で発現するので、液体試料中にＥＣ－３ｐ－４０は存在するがＥＣ－５ｐ－３６は存在しないと検出された場合は、存在する生物はＫｌｅｂｓｉｌｌａ属細菌であると同定できる。
【0087】
また、生物の同定は、特定の機能を有するｓＲＮＡの存在状態に基づいて同定してもよい。例えば、腸管出血性大腸菌（Ｏ－１５７等）の毒素（ベロ毒素。シガトキシンとも呼ばれる）に関与するｓＲＮＡである２４Ｂ＿１（配列番号３；５’－ＵＡＡＣＧＵＵＡＡＧＵＵＧＡＣＵＣＧＧＧ－３’、Scientific Reports volume 5, Article number: 10080 (2015)参照）は、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂｌａｓｔ検索によればベロ毒素（シガトキシン）生産菌に共通して発現する。このため、液体試料中に２４Ｂ＿１が存在すると検出された場合は、存在する生物はベロ毒素保有菌であると同定できる。
【0088】
また、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属細菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属細菌、及びＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の総体的な存在状態（いずれも存在しないか、１種類以上が存在するか等）を判定したい場合には、ＥＣ－５ｐ－３６の存在状態を判定するようにすればよい。Ｋｌｅｂｓｉｌｌａ属細菌の存在状態を判定したい場合には、ＥＣ－３ｐ－４０及びＥＣ－５ｐ－３６の存在状態を判定するようにすればよい。
【0089】
その他、ｓＲＮＡであるＥＣ－５ｐ－７９（配列番号７；５’－ＵＵＵＧＣＵＣＵＵＵＡＡＡＡＡＵＣ－３’）及びＥＣ－３ｐ－３９３（配列番号８；５’－ＣＵＣＧＡＡＧＡＵＡＣＧＧＡＵＵＣＵＵＡＡＣ－３’）は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍにおいて発現している。以上のことから、ｓＲＮＡと生物種の対応関係として、ＥＣ－５ｐ－３６、ＥＣ－３ｐ－４０、ＥＣ－５ｐ－７９、及びＥＣ－３ｐ－３９３からなる群より選択される少なくとも１種類と、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍからなる群より選択される少なくとも一種との組み合わせ、配列番号６（５’－ＵＣＣＧＧＵＡＵＧＧＵＧＵＡＧＵＧＧＣ－３’、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１４ Ａｕｇ ２０；９（８）：ｅ１０４９５６．参照）で表されるヌクレオチド配列を有するｆｏｘ＿ｍｉｌＲＮＡ＿５とＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍとの組み合わせ、配列番号４（５’－ＣＡＧＡＡＧＡＵＡＧＡＧＡＧＣＡＣＡＵＣ－３’；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／；ｐｔａ－ｍｉＲ１５６ａを参照）で表されるヌクレオチド配列を有するｍｉＲ１５６とクロマツとの組み合わせ、並びに配列番号５（５’－ＧＡＧＡＵＣＵＵＧＧＵＧＧＵＡＧＵＡＧＣＡＡＡＵＡ－３’；Ｓｃｉ． Ｒｅｐ．， ２０１５，５，７７６３参照）で表されるヌクレオチド配列を有するｍｉＲ７１６ｂとＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとの組み合わせが挙げられる。
【0090】
その他、以下の表１及び表２に記載したｓＲＮＡは、腸内細菌科の細菌、例えば大腸菌において発現することが判明している。特に、ｓＲＮＡ１３～ｓＲＮＡ３２は、ｔＲＮＡの配列である。
【0091】
【表1】
【0092】
【表2】
【0093】
また、ｓＲＮＡ９、１０、１３～１５、１７～１９、２１～２４、２６、及び２７について、その発現が確認されている生物をその属名（カンジダ属については種名）により以下の表３及び表４に示す。表３及び表４中「Ｙｅｓ」はその生物においてｓＲＮＡが発現することを表す。
【0094】
【表3】
【0095】
【表4】
【0096】
表１及び表２に記載されたｓＲＮＡも本判定方法に用いることができる。存在状態を判定するｓＲＮＡは、配列番号９～４８で表されるｓＲＮＡのうちの少なくとも１種類（つまりｓＲＮＡ９～ｓＲＮＡ４８のうちの少なくとも１種類）を含むことが好ましい。存在状態を判定するｓＲＮＡは、配列番号１３～１５及び３４で表されるｓＲＮＡのうちの少なくとも１種類（つまりｓＲＮＡ１３～ｓＲＮＡ１５及びｓＲＮＡ３４のうちの少なくとも１種類）を含むことがより好ましい。
【0097】
一態様において、存在状態を判定するｓＲＮＡは、配列番号９～４８で表されるｓＲＮＡのうちの少なくとも１種類（つまりｓＲＮＡ９～ｓＲＮＡ４８のうちの少なくとも１種類）に加えて、他のｓＲＮＡも含んでいてもよい。他のｓＲＮＡもさらに含むことによって、さらに判定又は同定の精度を上げること、及び／又はより幅広い生物種について生物の存在状態の判定又は生物の同定を行うことができる。
【0098】
このため、例えば、存在状態を判定するｓＲＮＡは、配列番号９～４８で表されるｓＲＮＡのうちの少なくとも１種類（好ましくは配列番号１３～１５及び３４で表されるｓＲＮＡのうちの少なくとも１種類）に加えて、配列番号１～８のｓＲＮＡのうちの少なくとも１種類をさらに含んでいてもよい。
【0099】
なお、上記以外のｓＲＮＡについても、判定又は同定に必要なｓＲＮＡと生物との対応関係は、学術論文、上述のデータベース等から容易に入手することができる。
【0100】
本開示の標的生物の存在状態の判定方法及び生物の同定方法によれば、核酸増幅によるｓＲＮＡの検出を行うことで、生物の１６Ｓ ｒＲＮＡを取り出す方法よりも少ない手間で、標的生物の存在状態を判定することができ、また、試料中に存在する生物を同定することができる。
【0101】
上記のように標的生物において特異的な発現を示すｓＲＮＡの存在状態を判定する方法によれば、培養法とは異なり、試料に含まれる可能性のある生物を培養する必要がない。このため、短時間での判定又は同定が可能でありながら、核酸増幅を用いるため高い感度を実現することも可能である。さらに、培養が困難な細菌等にも本方法を適用することができる。また、培養法とは異なり、本方法においては、必要なサンプル量が少なく、処理に用いた資材の廃棄も容易である。本方法では、遺伝子法の利点を維持しつつ、さらに従来の遺伝子法よりも簡便な操作で生物の存在状態の判定及び試料中に含まれる生物の同定をすることができる。
【0102】
本方法は、例えば、衛生管理の必要とされる現場（食品製造、医療、福祉、家庭等）での簡便な微生物検査のために用いることができる。その例としては、食品製造工程における腐敗変敗菌検査による製品の衛生管理、食中毒事故時のすみやかな原因特定、医療施設のベッドや待合室における食中毒菌検出による二次感染予防、児童福祉施設や老人福祉施設における食中毒菌の二次感染予防、家庭に食中毒患者がいる場合における食中毒菌の検出による二次感染予防等が挙げられる。
【0103】
≪キット≫
一態様において、本開示は、第１の鋳型ＤＮＡを含む容器、第２の鋳型ＤＮＡを含む容器、ＤＮＡポリメラーゼを含む容器、ニッキング用エンドヌクレアーゼを含む容器、及びラムダエキソヌクレアーゼを含む容器、を備える、標的核酸の存在状態を判定するためのキットを提供する。キットは、上述の本判定方法、並びに標的生物の存在状態の判定方法及び生物の同定方法に用いることができる。第１の鋳型ＤＮＡ、第２の鋳型ＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、ニッキング用エンドヌクレアーゼ、及びラムダエキソヌクレアーゼの詳細は上述した通りである。また、キットは、上述した、核酸増幅反応に用いられるその他の各種試薬を含んでもよい。キットは、使用説明書を備えていてもよい。
第１の鋳型ＤＮＡ、第２の鋳型ＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、ニッキング用エンドヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、及び任意のその他の試薬は、それぞれ個別の容器に含まれていてもよく、２種以上の試薬が同じ容器に含まれていてもよい。容器としては、エッペンドルフ（登録商標）チューブなどのマイクロチューブ、遠沈管、スピッツ管、バイアル、アンプル、投薬瓶、点滴瓶、点眼瓶等、一般的に用いられる容器を使用できる。
一態様において、本開示は、第１の鋳型ＤＮＡを含む容器、第２の鋳型ＤＮＡを含む容器、ＤＮＡポリメラーゼを含む容器、ニッキング用エンドヌクレアーゼを含む容器、及びラムダエキソヌクレアーゼを含む容器、を備える、標的核酸の存在状態を判定するためのキットを提供する。キットは、上述の本判定方法、並びに標的生物の存在状態の判定方法及び生物の同定方法に用いることができる。第１の鋳型ＤＮＡ、第２の鋳型ＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、ニッキング用エンドヌクレアーゼ、及びラムダエキソヌクレアーゼの詳細は上述した通りである。また、キットは、上述した、核酸増幅反応に用いられるその他の各種試薬を含んでもよい。キットは、使用説明書を備えていてもよい。
第１の鋳型ＤＮＡ、第２の鋳型ＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、ニッキング用エンドヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、及び任意のその他の試薬は、それぞれ個別の容器に含まれていてもよく、２種以上の試薬が同じ容器に含まれていてもよい。容器としては、エッペンドルフ（登録商標）チューブなどのマイクロチューブ、遠沈管、スピッツ管、バイアル、アンプル、投薬瓶、点滴瓶、点眼瓶等、一般的に用いられる容器を使用できる。
【0104】
一態様において、第１の鋳型ＤＮＡは、シグナル配列に相補的な第１の配列と、ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、標的核酸に相補的な配列と、を含み、第２の鋳型ＤＮＡは、シグナル配列に相補的な第２の配列と、ニッキング用エンドヌクレアーゼの認識配列と、シグナル配列に相補的な第３の配列とを含む。第１の鋳型ＤＮＡ及び第２の鋳型ＤＮＡの詳細は上述の通りである。
【実施例0105】
次に本開示の実施形態を実施例により具体的に説明するが、本開示の実施形態はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0106】
以下の試薬を準備した。
・第１の鋳型ＤＮＡ：ジーンデザイン社製（配列：ＣＧＣＡＣＧＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＧＣＡＧＴＣＧＣＴＴＡＡＣＣＴＣＡＣＡＡＣ－（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄＴ）－ （ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄＴ））（配列番号４９）
・第２の鋳型ＤＮＡ：ＩＤＴ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製（配列：ＣＧＣＡＣＧＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＧＣＡＣＧＣＡＧ［３ＳｐＣ３］（配列番号５０）、ＰＡＧＥ－ＨＰＬＣ Ｄｕａｌ精製品）
・ＤＮＡポリメラーゼ：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製、Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
・ニッキング用エンドヌクレアーゼ：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製、Ｎｂ．ＢｂｖＣｌ（鋳型上の認識配列：ＣＣＴＣＡＧＣ）
・ラムダエキソヌクレアーゼ：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製
・ｄＮＴＰ：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製
・第１の鋳型ＤＮＡ：ジーンデザイン社製（配列：ＣＧＣＡＣＧＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＧＣＡＧＴＣＧＣＴＴＡＡＣＣＴＣＡＣＡＡＣ－（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄＴ）－ （ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄＴ））（配列番号４９）
・第２の鋳型ＤＮＡ：ＩＤＴ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製（配列：ＣＧＣＡＣＧＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＧＣＡＣＧＣＡＧ［３ＳｐＣ３］（配列番号５０）、ＰＡＧＥ－ＨＰＬＣ Ｄｕａｌ精製品）
・ＤＮＡポリメラーゼ：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製、Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
・ニッキング用エンドヌクレアーゼ：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製、Ｎｂ．ＢｂｖＣｌ（鋳型上の認識配列：ＣＣＴＣＡＧＣ）
・ラムダエキソヌクレアーゼ：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製
・ｄＮＴＰ：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製
【0107】
なお、第１の鋳型ＤＮＡ及び第２の鋳型ＤＮＡにおける各領域の配列、並びにシグナルＤＮＡの配列は以下の通りである。
第１の鋳型ＤＮＡにおける第１の配列、並びに第２の鋳型ＤＮＡにおける第２及び第３の配列：ＣＧＣＡＣＧＣＡＧ
第１の鋳型ＤＮＡにおける標的核酸に相補的な配列：ＧＣＡＧＴＣＧＣＴＴＡＡＣＣＴＣＡＣＡＡＣ（配列番号５１）
シグナルＤＮＡ：ＴＧＡＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧ（配列番号５２）
第１の鋳型ＤＮＡにおける第１の配列、並びに第２の鋳型ＤＮＡにおける第２及び第３の配列：ＣＧＣＡＣＧＣＡＧ
第１の鋳型ＤＮＡにおける標的核酸に相補的な配列：ＧＣＡＧＴＣＧＣＴＴＡＡＣＣＴＣＡＣＡＡＣ（配列番号５１）
シグナルＤＮＡ：ＴＧＡＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧ（配列番号５２）
【0108】
＜ラムダエキソヌクレアーゼ添加によるバックグラウンド発生抑制効果の評価＞
ラムダエキソヌクレアーゼ添加によるバックグラウンド発生抑制効果の評価を試みた。 終濃度が０Ｕ／μＬ～２．５Ｕ／μＬとなるように、ラムダエキソヌクレアーゼをＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ水で希釈した。さらに、１サンプルあたり、ＰＣＲチューブ内に、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ水を４．４μＬ、１０×ＮＥＢ＃２ ｂｕｆｆｅｒを１μＬ、１０％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を１μＬ、２０×ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）を０．１μＬ、５０ｎＭの第１の鋳型ＤＮＡを０．１μＬ、２０００ｎＭの第２の鋳型ＤＮＡを１μＬ、１２５μＭのｄＡＴＰを０．０２μＬ、２ｍＭのｄＴＴＰを０．０２μＬ、１００ｍＭのｄＣＴＰを０．１μＬ、１００ｍＭのｄＧＴＰを０．０２μＬ、１０Ｕ／μＬのニッキング用エンドヌクレアーゼを０．２μＬ、及び８Ｕ／μＬのＤＮＡポリメラーゼを０．０５μＬ混合し、プレミックスを調製した。このプレミックスに、各濃度のラムダエキソヌクレアーゼを１μＬ添加し、反応液を調製した。この反応液に１０ｐＭの合成ＥＣ－５ｐ－３６（配列番号１；ユーロフィンジェノミクス社製）を１μＬ添加したものを強陽性サンプルとした。また、前記反応液に、１００ｆＭの合成ＥＣ－５ｐ－３６（配列番号１；ユーロフィンジェノミクス社製）を１μＬ添加したものを弱陽性サンプルとした。さらに、前記反応液に、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ水を１μＬ添加したものをバックグラウンドサンプルとした。
強陽性サンプル、弱陽性サンプル、及びバックグラウンドサンプルを、それぞれ、リアルタイムＰＣＲ装置ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）を用いて、３７℃で５時間インキュベートし、増幅開始時間を測定した。続いて、強陽性サンプル及び弱陽性サンプルの結果をもとに作成した検量線から、バックグラウンドサンプルの増幅開始時間に相当する核酸濃度を算出した。
ラムダエキソヌクレアーゼ添加によるバックグラウンド発生抑制効果の評価を試みた。 終濃度が０Ｕ／μＬ～２．５Ｕ／μＬとなるように、ラムダエキソヌクレアーゼをＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ水で希釈した。さらに、１サンプルあたり、ＰＣＲチューブ内に、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ水を４．４μＬ、１０×ＮＥＢ＃２ ｂｕｆｆｅｒを１μＬ、１０％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を１μＬ、２０×ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）を０．１μＬ、５０ｎＭの第１の鋳型ＤＮＡを０．１μＬ、２０００ｎＭの第２の鋳型ＤＮＡを１μＬ、１２５μＭのｄＡＴＰを０．０２μＬ、２ｍＭのｄＴＴＰを０．０２μＬ、１００ｍＭのｄＣＴＰを０．１μＬ、１００ｍＭのｄＧＴＰを０．０２μＬ、１０Ｕ／μＬのニッキング用エンドヌクレアーゼを０．２μＬ、及び８Ｕ／μＬのＤＮＡポリメラーゼを０．０５μＬ混合し、プレミックスを調製した。このプレミックスに、各濃度のラムダエキソヌクレアーゼを１μＬ添加し、反応液を調製した。この反応液に１０ｐＭの合成ＥＣ－５ｐ－３６（配列番号１；ユーロフィンジェノミクス社製）を１μＬ添加したものを強陽性サンプルとした。また、前記反応液に、１００ｆＭの合成ＥＣ－５ｐ－３６（配列番号１；ユーロフィンジェノミクス社製）を１μＬ添加したものを弱陽性サンプルとした。さらに、前記反応液に、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ水を１μＬ添加したものをバックグラウンドサンプルとした。
強陽性サンプル、弱陽性サンプル、及びバックグラウンドサンプルを、それぞれ、リアルタイムＰＣＲ装置ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）を用いて、３７℃で５時間インキュベートし、増幅開始時間を測定した。続いて、強陽性サンプル及び弱陽性サンプルの結果をもとに作成した検量線から、バックグラウンドサンプルの増幅開始時間に相当する核酸濃度を算出した。
【0109】
ラムダエキソヌクレアーゼ未添加の場合の蛍光強度の経時変化を図２に示し、０．０１５Ｕ／μＬ（１５Ｕ／ｍＬ）のラムダエキソヌクレアーゼを添加した場合の蛍光強度の経時変化を図３に示す。図２と比較して図３では、バックグラウンド発生開始時間が強陽性サンプル及び弱陽性サンプルと比較して相対的に遅れている。この結果より、ラムダエキソヌクレアーゼを添加すると、バックグラウンド発生が抑制されることがわかる。
【0110】
また、ラムダエキソヌクレアーゼ濃度とバックグラウンド発生の核酸相当濃度との関係を表１に示し、そのプロットを図４に示す。この結果から、酵素未添加の条件と比較して、ラムダエキソヌクレアーゼ濃度が２．５Ｕ／ｍＬ～１００Ｕ／ｍＬの範囲においてバックグラウンド発生が抑制されることが示された。
【0111】
【表5】
【0112】
以上の結果より、２種の鋳型ＤＮＡを用いるＥＸＰＡＲ法において、ラムダエキソヌクレアーゼを用いると、ラムダエキソヌクレアーゼを添加しない場合と比べて、バックグラウンド増幅が抑制されることがわかった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】