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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024134541
(43)【公開日】2024-10-03
(54)【発明の名称】癌関連線維芽細胞増殖抑制剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/50 20060101AFI20240926BHJP
A61K 31/519 20060101ALI20240926BHJP
A61K 31/5395 20060101ALI20240926BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240926BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240926BHJP
【ＦＩ】
A61K31/50 ZNA
A61K31/519
A61K31/5395
A61P35/00
A61P43/00 121
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024043132
(22)【出願日】2024-03-19
(31)【優先権主張番号】P 2023044173
(32)【優先日】2023-03-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】502285457
【氏名又は名称】学校法人順天堂
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】折茂 彰
(72)【発明者】
【氏名】山下 和成
(72)【発明者】
【氏名】王 子旭
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC41
4C086BC72
4C086CB05
4C086GA16
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZB26
4C086ZC75
(57)【要約】
【課題】新たな癌関連線維芽細胞増殖抑制剤を提供すること。
【解決手段】ベルクリン類を有効成分とする癌関連線維芽細胞増殖抑制剤。
【選択図】なし
【解決手段】ベルクリン類を有効成分とする癌関連線維芽細胞増殖抑制剤。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ベルクリン類を有効成分とする癌関連線維芽細胞増殖抑制剤。
【請求項2】
ベルクリン類が、ザルダベリン、アナグレリド、ＤＮＭＤＰ、クアジノン、ＢＡＹ２６６６６０５及びそれらの塩から選ばれる１種以上である請求項１記載の癌関連線維芽細胞増殖抑制剤。
【請求項3】
ＰＤＥ３ＡとＳＬＦＮ１２を高発現しない癌細胞を含む癌組織の癌関連線維芽細胞増殖抑制剤である、請求項１記載の癌関連線維芽細胞増殖抑制剤。
【請求項4】
抗癌剤と併用することを特徴とする請求項１～３のいずれか一項記載の癌関連線維芽細胞増殖抑制剤。
【請求項5】
請求項１～３のいずれか一項記載の癌関連線維芽細胞増殖抑制剤を含有することを特徴とする抗癌剤。
【請求項6】
ベルクリン類を有効成分とする、ＰＤＥ３ＡとＳＬＦＮ１２を高発現しない癌細胞を含む癌組織に対する抗癌剤。
【請求項7】
ベルクリン類が、ザルダベリン、アナグレリド、ＤＮＭＤＰ、クアジノン、ＢＡＹ２６６６６０５及びそれらの塩から選ばれる１種以上である請求項４記載の抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、癌関連線維芽細胞増殖抑制剤に関する。
【背景技術】
【0002】
悪性腫瘍の中には癌細胞だけでなく非癌細胞も多く存在して、癌微小環境を形成していることが知られている。腫瘍中の線維芽細胞は、癌関連線維芽細胞（ＣＡＦｓ）と呼ばれている。ＣＡＦｓは、細胞外マトリックスとサイトカインを分泌して、癌細胞の増殖、浸潤、転移、及び抗癌剤耐性を促進すると考えられている。かかる観点から、ＣＡＦｓの増殖を抑制する新たな薬剤の開発が期待されている（非特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】Ｃａｎｃｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ（ＣＡＦｓ）ｉｎ Ｔｕｍｏｒ Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ（Ｌａｎｄｍａｒｋ Ｅｄ），２０１０ Ｊａｎ １；１５：１６６－７９，ｄｏｉ：１０．２７４１／３６１３．
【非特許文献2】Ｔｕｒｎｉｎｇ ｆｏｅｓ ｔｏ ｆｒｉｅｎｄｓ： ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｖｏｌｕｍｅ １８，ｐａｇｅｓ９９－１１５（２０１９）
【非特許文献3】Ｋｏｊｉｍａ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ ＡｃａｄＳｃｉ ＵＳＡ．２０１０；１０７（４６）：２０００９－１４．
【非特許文献4】Ｙａｎ Ｂ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０２２；２９（６）：９５８－６９ ｅ５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明の課題は、新たなＣＡＦｓ増殖抑制剤、及び当該ＣＡＦｓ増殖抑制剤含有する抗癌剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者は、我々が実験的に作成したＣＡＦｓ（ｅｘｐ－ＣＡＦｓ）（非特許文献３）を用いて数多くの物質をスクリーニングしたところ、ＰＤＥ３Ａ／４Ａ阻害剤として知られているザルダベリン（Ｚａｒｄａｖｅｒｉｎｅ）が優れたＣＡＦｓ増殖抑制作用を有することを見出した。そしてさらに検討したところ、ザルダベリンは、ＰＤＥ３Ａ／４Ａ阻害作用によりＣＡＦｓ増殖抑制作用を示しているのではなく、ベルクリン類（ｖｅｌｃｒｉｎｓ）としてＰＤＥ３Ａ－ＳＬＦＮ１２複合体形成を誘導することによりＣＡＦｓ増殖抑制作用を示していること、及びＰＤＥ３Ａ－ＳＬＦＮ１２複合体形成を誘導するザルダベリン以外のベルクリン類（ｖｅｌｃｒｉｎｓ）もＣＡＦｓ増殖抑制作用を有することを見出した。さらに、ベルクリン類は、ＰＤＥ３ＡとＳＬＦＮ１２を高発現しない癌細胞を含む癌組織のＣＡＦｓ増殖抑制剤として、さらにＰＤＥ３ＡとＳＬＦＮ１２を高発現しない癌細胞を含む癌組織に対する抗癌剤として有用であることを見出し、本発明を完成した。
【0006】
すなわち、本発明は、次の発明［１］～［６］を提供するものである。
［１］ベルクリン類を有効成分とするＣＡＦｓ増殖抑制剤。
［２］ベルクリン類が、ザルダベリン、アナグレリド、ＤＮＭＤＰ、クアジノン、ＢＡＹ２６６６６０５及びそれらの塩から選ばれる１種以上である［１］記載のＣＡＦｓ増殖抑制剤。
［３］ＰＤＥ３ＡとＳＬＦＮ１２を高発現しない癌細胞を含む癌組織のＣＡＦｓ増殖抑制剤である、［１］又は［２］記載のＣＡＦｓ増殖抑制剤。
［４］ベルクリン類を有効成分とする、ＰＤＥ３ＡとＳＬＦＮ１２を高発現しない癌細胞を含む癌組織に対する抗癌剤。
［５］ベルクリン類が、ザルダベリン、アナグレリド、ＤＮＭＤＰ、クアジノン、ＢＡＹ２６６６６０５及びそれらの塩から選ばれる１種以上である［４］記載の抗癌剤。
［６］［１］～［３］のいずれかに記載のＣＡＦｓ増殖抑制剤と他の抗がん剤を組み合わせてなる抗癌剤。
［１］ベルクリン類を有効成分とするＣＡＦｓ増殖抑制剤。
［２］ベルクリン類が、ザルダベリン、アナグレリド、ＤＮＭＤＰ、クアジノン、ＢＡＹ２６６６６０５及びそれらの塩から選ばれる１種以上である［１］記載のＣＡＦｓ増殖抑制剤。
［３］ＰＤＥ３ＡとＳＬＦＮ１２を高発現しない癌細胞を含む癌組織のＣＡＦｓ増殖抑制剤である、［１］又は［２］記載のＣＡＦｓ増殖抑制剤。
［４］ベルクリン類を有効成分とする、ＰＤＥ３ＡとＳＬＦＮ１２を高発現しない癌細胞を含む癌組織に対する抗癌剤。
［５］ベルクリン類が、ザルダベリン、アナグレリド、ＤＮＭＤＰ、クアジノン、ＢＡＹ２６６６６０５及びそれらの塩から選ばれる１種以上である［４］記載の抗癌剤。
［６］［１］～［３］のいずれかに記載のＣＡＦｓ増殖抑制剤と他の抗がん剤を組み合わせてなる抗癌剤。
【発明の効果】
【0007】
本発明のＣＡＦｓ増殖抑制剤は、特にＰＤＥ３ＡとＳＬＦＮ１２を高発現しない癌細胞を含む癌組織のＣＡＦｓ増殖抑制剤として、ＰＤＥ３ＡとＳＬＦＮ１２を高発現しない癌細胞を含む癌組織に対する抗癌剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】ザルダベリン（Ｚａｒｕｄａｖｅｒｉｎｅ）のｅｘｐ－ＣＡＦｓの増殖抑制作用を示す図である。
【図2】ザルダベリン（Ｚａｒｄ）のｅｘｐ－ＣＡＦｓの細胞周期に対する作用を示す図である。
【図3】ｅｘｐ－ＣＡＦｓにおける各種のＰＤＥ遺伝子の発現を示す図である。
【図4】ベルクリン類ではないＰＤＥ３Ａ阻害剤とＰＤＥ４Ａ阻害剤のｅｘｐ－ＣＡＦｓの増殖に対する作用を示す図である。
【図5】ベルクリン類ではないＰＤＥ３Ａ阻害剤とＰＤＥ４Ａ阻害剤の併用（Ｃｉｌｏｓｔａｍｉｄｅ＋Ｒｏｆｌｕｍｉｌａｓｔ）のｅｘｐ－ＣＡＦｓの増殖に対する作用を示す図である。Ｒｏｆｌｕｍｉｌａｓｔ １００μＭの高濃度処理ではその毒性の為に非特異的な細胞死が誘導されている。
【図6】ＰＤＥ３Ａノックダウンのｅｘｐ－ＣＡＦｓの増殖に対する作用を示す図である。（左図）ＰＤＥ３Ａの遺伝子発現（右図）各細胞のｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ（％）
【図7】ＰＤＥ３ＡとＰＤＥ４Ａダブルノックダウンのｅｘｐ－ＣＡＦｓの増殖に対する作用を示す図である。（左図）ＰＤＥ３Ａの遺伝子発現（中央図）ＰＤＥ４Ａの遺伝子発現（右図）各細胞のｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ（％）
【図8】３種類の異なるベルクリン類であるＤＮＭＤＰ、アナグレリド（Ａｎａｇｒｅｌｉｄｅ）、クアジノン（Ｑｕａｚｉｎｏｎｅ）のＣＡＦｓ増殖抑制作用を示す図である。
【図9】ザルダベリン又はＤＮＭＤＰによる増殖抑制が、ＰＤＥ３Ａ阻害剤であるトレキンシン（Ｔｒｅｑｕｉｎｓｉｎ）を一緒に処理することでレスキューされたことを示す図である。
【図10】細胞にｓｉＮＳ（ｎｏｎ－ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｓｉＲＮＡ）を導入して、ベルクリン類（ザルダベリン（Ｚａｒｄ）、ＤＮＭＤＰ、アナグレリド（Ａｎａ））で４８ｈｒ処理すると、ＣＡＦｓの増殖を特異的に抑制した。一方、ｓｉＰＤＥ３Ａ（ＰＤＥ３Ａ―ｓｉＲＮＡ）の２番あるいは５番でノックダウンすると、ベルクリン類（ザルダベリン（Ｚａｒｄ）、ＤＮＭＤＰ、アナグレリド（Ａｎａ））で処理してもＣＡＦの増殖があまり抑制されなかったことを示す図である。
【図11】ＢＡＹ２６６６６０５のｅｘｐ－ＣＡＦｓへの特異的な増殖抑制作用を示す図である。
【図12】ＳＬＦＮ１２に対する２種のｓｉＲＮＡ（ｓｉＳＬＦＮ１２－１， ｓｉＳＬＦＮ１２－３）によるノックダウン効果を示す図である。ｓｉＲＮＡをｃｏｎｔｒｏｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔとｅｘｐ－ＣＡＦにそれぞれ導入し、ＲＴ－ｑＰＣＲによってＳＬＦＮ１２発現量を比較した。Ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔの相対発現量を１とした。
【図13】細胞にｓｉＮＳ（ｎｏｎ－ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｓｉＲＮＡ）を導入して、ベルクリン類（ザルダベリン（Ｚａｒｄ）、ＤＮＭＤＰ、ＢＡＹ２６６６６０５）で４８ｈｒ処理すると、ＣＡＦｓの増殖を特異的に抑制した（上段左）。一方、ｓｉＰＤＥ３Ａ（ＰＤＥ３Ａ―ｓｉＲＮＡ）の２番あるいは５番でノックダウンすると、ベルクリン類（ザルダベリン（Ｚａｒｄ）、ＤＮＭＤＰ、ＢＡＹ２６６６６０５）で処理してもＣＡＦの増殖があまり抑制されなかった（上段中央、上段右）。さらに、ｓｉＳＬＦＮ１２（ＳＬＦＮ１２―ｓｉＲＮＡ）の１番あるいは３番でノックダウンすると、ベルクリン類（ザルダベリン（Ｚａｒｄ）、ＤＮＭＤＰ、ＢＡＹ２６６６６０５）で処理してもＣＡＦの増殖があまり抑制されなかった（下段中央、下段右）。
【図14】ＮＯＧマウス（免疫不全マウス）にＤＣＩＳ．ｃｏｍ（乳癌細胞株）のみを移植、あるいは、ＤＣＩＳ．ｃｏｍとｅｘｐ－ＣＡＦｓを混合して共移植し、腫瘍形成後にＢＡＹ２６６６６０５の投与を行った。細胞移植の７日後から、腫瘍への薬剤の局所投与を行った。３日に一度、注射により薬剤を腫瘍内に直接投与した。細胞移植の２２日後に腫瘍を摘出し、組織切片の免疫染色を行った（左図）。抗体はＶ９モノクローナル抗体を用いており、この抗体はヒトビメンチン蛋白質を特異的に認識し、マウスのビメンチンは認識しない。すなわち、移植したヒト細胞を認識する。ヒトビメンチン弱陽性の敷石状の形態をした癌細胞が占める領域を削除し（左下段）、その他のビメンチン強陽性部をｅｘｐ－ＣＡＦｓと認識して、その面積を定量した（右図）。ＢＡＹ２６６６６０５の投与により、腫瘍内のｅｘｐ－ＣＡＦｓが減少したことが示唆された。
【図15】腫瘍の長径と短径を定量することで腫瘍体積を概算した（左図）。ＤＣＩＳ．ｃｏｍ単独移植に対してはＢＡＹ２６６６６０５の投与は腫瘍縮小効果を示さなかった。この結果から、ＢＡＹ２６６６６０５は癌細胞に直接働くわけではないと考えられる。一方、ＤＣＩＳ．ｃｏｍとｅｘｐ－ＣＡＦｓの共移植群に対しては、ＢＡＹ２６６６６０５の投与による腫瘍縮小効果が認められた。これらの結果から、ベルクリン類は、ＣＡＦの増殖抑制効果を介して腫瘍を縮小させることが示された（右図、摘出された腫瘍の写真）。
【発明を実施するための形態】
【0009】
本発明の一態様は、ベルクリン類を有効成分とするＣＡＦｓ増殖抑制剤である。
ベルクリン類（Ｖｅｌｃｒｉｎｓ）とは、ＰＤＥ３Ａ－ＳＬＦＮ１２複合体形成を誘導することにより、癌細胞（ＰＤＥ３ＡとＳＬＦＮ１２高発現）の細胞死を誘導する低分子化合物である（非特許文献４参照）。ＰＤＥ３Ａ阻害剤などのＰＤＥ３Ａに結合する化合物の一部がベルクリン類に該当する。すなわち、ベルクリン類は、ＰＤＥ３Ａ－ＳＬＦＮ１２複合体形成を誘導することでＲＮＡａｓｅ活性を持つＳＬＦＮ１２蛋白質を安定化させることにより、ＰＤＥ３ＡとＳＬＦＮ１２を高発現する癌細胞のリボソーマルＲＮＡを分解させ、その癌細胞を直接アポトーシスさせる化合物であり、ＣＡＦｓに対する作用は全く知られていない。
ベルクリン類としては、ザルダベリン（Ｚａｒｄａｖｅｒｉｎｅ）、アナグレリド（Ａｎａｇｒｅｌｉｄｅ）、ＤＮＭＤＰ（（４Ｒ）－３－［４－（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ］－４－ｍｅｔｈｙｌ－４，５－ｄｉｈｙｄｒｏ－１Ｈ－ｐｙｒｉｄａｚｉｎ－６－ｏｎｅ）、クアジノン（Ｑｕａｚｉｎｏｎｅ）、ＢＡＹ２６６６６０５（（Ｓ）－５－［４’－Ｆｌｕｏｒｏ－２－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）－４－ｂｉｐｈｅｎｙｌｙｌ］－６－ｍｅｔｈｙｌ－３，６－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ－１，３，４－ｏｘａｄｉａｚｉｎ－２－ｏｎｅ）及びそれらの塩などが挙げられる。このうち、ザルダベリン、アナグレリド、ＤＮＭＤＰ、クアジノン、ＢＡＹ２６６６６０５及びそれらの塩から選ばれる１種以上がより好ましく、ザルダベリン、アナグレリド、ＤＮＭＤＰ、ＢＡＹ２６６６６０５及びそれらの塩から選ばれる１種以上がさらに好ましい。
ベルクリン類（Ｖｅｌｃｒｉｎｓ）とは、ＰＤＥ３Ａ－ＳＬＦＮ１２複合体形成を誘導することにより、癌細胞（ＰＤＥ３ＡとＳＬＦＮ１２高発現）の細胞死を誘導する低分子化合物である（非特許文献４参照）。ＰＤＥ３Ａ阻害剤などのＰＤＥ３Ａに結合する化合物の一部がベルクリン類に該当する。すなわち、ベルクリン類は、ＰＤＥ３Ａ－ＳＬＦＮ１２複合体形成を誘導することでＲＮＡａｓｅ活性を持つＳＬＦＮ１２蛋白質を安定化させることにより、ＰＤＥ３ＡとＳＬＦＮ１２を高発現する癌細胞のリボソーマルＲＮＡを分解させ、その癌細胞を直接アポトーシスさせる化合物であり、ＣＡＦｓに対する作用は全く知られていない。
ベルクリン類としては、ザルダベリン（Ｚａｒｄａｖｅｒｉｎｅ）、アナグレリド（Ａｎａｇｒｅｌｉｄｅ）、ＤＮＭＤＰ（（４Ｒ）－３－［４－（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ］－４－ｍｅｔｈｙｌ－４，５－ｄｉｈｙｄｒｏ－１Ｈ－ｐｙｒｉｄａｚｉｎ－６－ｏｎｅ）、クアジノン（Ｑｕａｚｉｎｏｎｅ）、ＢＡＹ２６６６６０５（（Ｓ）－５－［４’－Ｆｌｕｏｒｏ－２－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）－４－ｂｉｐｈｅｎｙｌｙｌ］－６－ｍｅｔｈｙｌ－３，６－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ－１，３，４－ｏｘａｄｉａｚｉｎ－２－ｏｎｅ）及びそれらの塩などが挙げられる。このうち、ザルダベリン、アナグレリド、ＤＮＭＤＰ、クアジノン、ＢＡＹ２６６６６０５及びそれらの塩から選ばれる１種以上がより好ましく、ザルダベリン、アナグレリド、ＤＮＭＤＰ、ＢＡＹ２６６６６０５及びそれらの塩から選ばれる１種以上がさらに好ましい。
【0010】
ザルダベリンは、下記の化学式を有する化合物であり、ＰＤＥ３Ａ／４Ａ阻害作用を有することが知られている。ＰＤＥ３Ａ／４Ａ阻害剤により、ｃＡＭＰの分解が抑制されてｃＡＭＰの量が増加し、下流のプロテインキナーゼＡが活性化され、気管支拡張作用やインビトロで癌細胞増殖抑制作用を有することが知られているが、ＣＡＦｓに対する作用は全く知られていない。
【0011】
【化1】
【0012】
アナグレリドは、下記の化学式を有する化合物であり、ＰＤＥ３阻害剤であり、血小板血症治療剤として用いられているが、ＣＡＦｓに対する作用は全く知られていない。
【0013】
【化2】
【0014】
ＤＮＭＤＰは、化学名（４Ｒ）－３－［４－（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ］－４－ｍｅｔｈｙｌ－４，５－ｄｉｈｙｄｒｏ－１Ｈ－ｐｙｒｉｄａｚｉｎ－６－ｏｎｅであり、次の化学式で表される。ＤＮＭＤＰは、ＰＤＥ３Ａ阻害剤であることは知られているが、ＣＡＦｓに対する作用は全く知られていない。
【0015】
【化3】
【0016】
クアジノンは、下記の化学式で表される化合物であり、ＰＤＥ３阻害剤であり、強心剤、血管拡張剤であるが、ＣＡＦｓに対する作用は全く知られていない。
【0017】
【化4】
【0018】
ＢＡＹ２６６６６０５は（化学名（Ｓ）－５－［４’－Ｆｌｕｏｒｏ－２－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）－４－ｂｉｐｈｅｎｙｌｙｌ］－６－ｍｅｔｈｙｌ－３，６－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ－１，３，４－ｏｘａｄｉａｚｉｎ－２－ｏｎｅ）は、下記の化学式を有する化合物であり、ＰＤＥ３Ａ／４Ａ阻害作用を有することが知られている。ＰＤＥ３Ａ／４Ａ阻害剤により、癌細胞増殖抑制作用を有することが知られているが、ＣＡＦｓに対する作用は全く知られていない。
【0019】
【化5】
【0020】
前記ベルクリン類の塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの無機酸塩、酢酸塩、乳酸塩などの有機酸塩が挙げられる。また、ベルクリン類には、それらの化合物の水和物、それらの塩の水和物などが含まれる。
【0021】
ベルクリン類は、いずれも既知の化合物であり、既知の方法により製造することができる。また市販品を購入することもできる。
【0022】
後述の実施例に示すように、本発明者は、ザルダベリンが、実験的に作成したＣＡＦｓ（ｅｘｐ－ＣＡＦｓ）を用いたスクリーニング系により、ＣＡＦｓの増殖を特異的に抑制することを見出した。一方、ザルダベリン以外のベルクリン類ではない種々のＰＤＥ３Ａ／４Ａ阻害剤、ＰＤＥ３Ａ阻害剤、ＰＤＥ４Ａ阻害剤、ＰＤＥ３Ａ阻害剤とＰＤＥ４Ａ阻害剤の併用は、いずれもＣＡＦｓ増殖を特異的に抑制しなかった。
従って、ザルダベリンのＣＡＦｓ増殖抑制作用は、ＰＤＥ３Ａ／４Ａ阻害によるものではなかった。
そこで、ＰＤＥ３Ａ－ＳＬＦＮ１２複合体形成を誘導することにより、癌細胞（ＰＤＥ３ＡとＳＬＦＮ１２高発現）の細胞死を誘導する低分子化合物であるベルクリン類に着目し、それらのＣＡＦｓ増殖抑制作用を検討したところ、ザルダベリン以外のベルクリン類（アナグレリド、ＤＮＭＤＰ、クアジノン、ＢＡＹ２６６６６０５）もＣＡＦｓ増殖抑制作用を有することを見出した。
従って、ベルクリン類は、ＣＡＦｓ増殖抑制剤として有用である。
従って、ザルダベリンのＣＡＦｓ増殖抑制作用は、ＰＤＥ３Ａ／４Ａ阻害によるものではなかった。
そこで、ＰＤＥ３Ａ－ＳＬＦＮ１２複合体形成を誘導することにより、癌細胞（ＰＤＥ３ＡとＳＬＦＮ１２高発現）の細胞死を誘導する低分子化合物であるベルクリン類に着目し、それらのＣＡＦｓ増殖抑制作用を検討したところ、ザルダベリン以外のベルクリン類（アナグレリド、ＤＮＭＤＰ、クアジノン、ＢＡＹ２６６６６０５）もＣＡＦｓ増殖抑制作用を有することを見出した。
従って、ベルクリン類は、ＣＡＦｓ増殖抑制剤として有用である。
【0023】
ベルクリン類によるＣＡＦｓの増殖抑制は、ＰＤＥ３Ａ阻害剤を一緒に阻害することにより、またＰＤＥ３Ａ遺伝子又はＳＬＦＮ１２遺伝子をノックダウンすることによりレスキューされた。従って、ベルクリン類は、癌細胞の有無にかかわらず、ＣＡＦｓの増殖を特異的に抑制するから、ＰＤＥ３ＡとＳＬＦＮ１２を高発現しない癌細胞を含む癌組織のＣＡＦｓ増殖抑制剤として有用である。また、ベルクリン類は、ＰＤＥ３ＡとＳＬＦＮ１２を高発現しない癌細胞を含む癌組織に対する抗癌剤として有用である。
【0024】
本発明のＣＡＦｓ増殖抑制剤及び抗癌剤の適応対象となる悪性腫瘍の例としては、頚部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢・胆管癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頚癌、子宮体癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣腫瘍、骨・軟部肉腫、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、皮膚癌、脳腫瘍等が挙げられる。好ましくは、ＣＡＦｓを癌組織内に有する悪性腫瘍が好ましく、特にＣＡＦｓが豊富な悪性腫瘍が好ましい。具体的には、乳癌、膵癌、肝癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌、食道癌、卵巣癌が好ましく、乳癌、膵癌がより好ましく、乳癌がさらに好ましい。また、ＰＤＥ３ＡとＳＬＦＮ１２を高発現しない癌細胞を含む癌組織であっても、癌組織内にＣＡＦｓを含むかぎり、適応対象となる。
【0025】
本発明のＣＡＦｓ増殖抑制剤及び抗癌剤は、ベルクリン類単独でもよいが、必要に応じて薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物の形態とするのが好ましい。該形態としては、例えば、経口剤、注射剤、坐剤、軟膏剤、貼付剤等が挙げられる。これらの投与形態は、各々当業者に公知慣用の製剤方法により製造できる。
【0026】
薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機或いは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等として配合される。また、必要に応じて防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、安定化剤等の製剤添加物を用いることもできる。
【0027】
経口用固形製剤を調製する場合は、前記有効成分に賦形剤、必要に応じて、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。
【0028】
賦形剤としては、乳糖、白糖、Ｄ－マンニトール、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、無水ケイ酸等が挙げられる。
結合剤としては、水、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、α－デンプン液、ゼラチン液、Ｄ－マンニトール、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
崩壊剤としては、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等が挙げられる。
滑沢剤としては、精製タルク、ステアリン酸塩ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、ホウ砂、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
着色剤としては、酸化チタン、酸化鉄等が挙げられる。
矯味・矯臭剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。
結合剤としては、水、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、α－デンプン液、ゼラチン液、Ｄ－マンニトール、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
崩壊剤としては、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等が挙げられる。
滑沢剤としては、精製タルク、ステアリン酸塩ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、ホウ砂、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
着色剤としては、酸化チタン、酸化鉄等が挙げられる。
矯味・矯臭剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。
【0029】
経口用液体製剤を調製する場合は、前記有効成分に矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。この場合矯味・矯臭剤としては、前記に挙げられたものでよく、緩衝剤としては、クエン酸ナトリウム等が、安定剤としては、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。必要により、腸溶性コーティング又は、効果の持続を目的として、経口製剤に公知の方法により、コーティングを施すこともできる。このようなコーティング剤にはヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）等が挙げられる。
【0030】
注射剤を調製する場合は、前記有効成分にｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下、筋肉内及び静脈内用注射剤を製造することができる。この場合のｐＨ調節剤及び緩衝剤としては、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。安定化剤としては、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。局所麻酔剤としては、塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖、Ｄ－マンニトール、グリセリン等が挙げられる。
【0031】
前記の各投与単位形態中に配合されるべき前記有効成分の量は、これを適用すべき患者の症状により、或いはその剤形等により一定ではないが、一般に投与単位形態あたり、経口剤では約０．０５～１０００ｍｇ、注射剤では約０．０１～５００ｍｇ程度である。
また、前記投与形態を有する薬剤の１日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり一概には決定できないが、通常成人（体重６０ｋｇ）１日あたり約０．０５～５０００ｍｇ程度であり、０．１～１０００ｍｇが好ましく、これを１日１回又は２～３回程度に分けて投与するのが好ましい。
また、前記投与形態を有する薬剤の１日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり一概には決定できないが、通常成人（体重６０ｋｇ）１日あたり約０．０５～５０００ｍｇ程度であり、０．１～１０００ｍｇが好ましく、これを１日１回又は２～３回程度に分けて投与するのが好ましい。
【0032】
本発明のＣＡＦｓ増殖抑制剤は、他の抗癌剤と併用して抗癌剤として使用することもできる。すなわち本発明の別の一態様は、前記ＣＡＦｓ増殖抑制剤と他の抗がん剤を組み合わせてなる抗癌剤である。
組み合わせことができる他の抗癌剤としては特に限定はなく、アルキル化剤、白金化合物、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管阻害剤、抗生物質などのいずれでもよく、免疫療法剤でもよい。アルキル化剤としては、シクロフォスファミド、メルファラン、チオテパ、ニムスチン、ラニムスチン、ストレプトゾトシンなど、白金化合物としては、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチンなど、代謝拮抗剤では、５－ＦＵ、チオグアニン、シタラビン、ゲムシタビンなど、トポイソメラーゼ阻害剤としては、イリノテカン、ドキソルビシン、エトポシド、レボフロキサシンなど、微小管阻害剤としては、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、パクリタキセル、ドセタキセルなど、抗生物質としては、マイトマイシン―Ｃ、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノマイシン、ブレオマイシンなどがある。
他の抗癌剤との併用においては、ＣＡＦｓ増殖抑制剤は、抗癌剤と同時に投与されてもよく、抗癌剤投与の前又は後に投与されてもよく、前後両方に投与されてもよい。この場合、必ずしも同じ投与経路である必要はなく、それぞれの製剤に適した投与方法で投与すればよい。また、ＣＡＦｓ増殖抑制剤と他の抗癌剤を同一製剤に含む配合剤としてもよい。
組み合わせことができる他の抗癌剤としては特に限定はなく、アルキル化剤、白金化合物、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管阻害剤、抗生物質などのいずれでもよく、免疫療法剤でもよい。アルキル化剤としては、シクロフォスファミド、メルファラン、チオテパ、ニムスチン、ラニムスチン、ストレプトゾトシンなど、白金化合物としては、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチンなど、代謝拮抗剤では、５－ＦＵ、チオグアニン、シタラビン、ゲムシタビンなど、トポイソメラーゼ阻害剤としては、イリノテカン、ドキソルビシン、エトポシド、レボフロキサシンなど、微小管阻害剤としては、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、パクリタキセル、ドセタキセルなど、抗生物質としては、マイトマイシン―Ｃ、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノマイシン、ブレオマイシンなどがある。
他の抗癌剤との併用においては、ＣＡＦｓ増殖抑制剤は、抗癌剤と同時に投与されてもよく、抗癌剤投与の前又は後に投与されてもよく、前後両方に投与されてもよい。この場合、必ずしも同じ投与経路である必要はなく、それぞれの製剤に適した投与方法で投与すればよい。また、ＣＡＦｓ増殖抑制剤と他の抗癌剤を同一製剤に含む配合剤としてもよい。
【実施例0033】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に何ら限定されるものではない。
【0034】
（方法）
１．ｅｘｐ－ＣＡＦｓの作成及びｅｘｐ－ＣＡＦｓを用いた薬剤スクリーニング方法
本発明者は、まず、ヒト乳腺由来不死化線維芽細胞とヒト乳癌細胞を免疫不全マウスに共移植して腫瘍を形成させ、さらに、この腫瘍よりＣＡＦｓに変化した線維芽細胞を単離培養することで、ｅｘｐ－ＣＡＦｓを樹立した。また、ヒト乳腺由来不死化線維芽細胞を単独で免疫不全マウスへ移植し、その組織より単離培養した線維芽細胞をｃｏｎｔｒｏｌ
ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔとして樹立した（非特許文献３）。これら細胞に、３５１５種の既存薬又は生理活性が明らかな化合物で構成される化合物ライブラリを作用させ、ＷＳＴ－８ ａｓｓａｙ（同仁化学）により細胞増殖を評価した。Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔの増殖をほとんど妨げず、ｅｘｐ－ＣＡＦｓの増殖を抑制する化合物をヒット化合物とした。
１．ｅｘｐ－ＣＡＦｓの作成及びｅｘｐ－ＣＡＦｓを用いた薬剤スクリーニング方法
本発明者は、まず、ヒト乳腺由来不死化線維芽細胞とヒト乳癌細胞を免疫不全マウスに共移植して腫瘍を形成させ、さらに、この腫瘍よりＣＡＦｓに変化した線維芽細胞を単離培養することで、ｅｘｐ－ＣＡＦｓを樹立した。また、ヒト乳腺由来不死化線維芽細胞を単独で免疫不全マウスへ移植し、その組織より単離培養した線維芽細胞をｃｏｎｔｒｏｌ
ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔとして樹立した（非特許文献３）。これら細胞に、３５１５種の既存薬又は生理活性が明らかな化合物で構成される化合物ライブラリを作用させ、ＷＳＴ－８ ａｓｓａｙ（同仁化学）により細胞増殖を評価した。Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔの増殖をほとんど妨げず、ｅｘｐ－ＣＡＦｓの増殖を抑制する化合物をヒット化合物とした。
【0035】
２．ｅｘｐ－ＣＡＦｓにおけるＰＤＥ３Ａ／４Ａ遺伝子の発現の検出
各種細胞よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎＲＮＡ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ社）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、これをＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社）を用いて逆転写し、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ
Ｎｅｘｔ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡）とＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてＰＣＲと定量を行った。使用したプライマーは以下の配列である。
ＰＤＥ３Ａ：５‘－ＣＣＡＣＧＧＣＣＴＣＡＴＴＡＣＣＧＡＣ－３’＆５‘－ＴＴＧＣＴＣＡＣＧＧＣＴＣＴＣＡＡＧＧ－３’（配列番号１及び２）、
ＰＤＥ４Ａ：５‘－ＡＣＡＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＡＡＡＴＧＡＧＣ－３＆５’－ＧＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＣＴＣＣＡＣＴＴＣ－３’（配列番号３及び４）、
ＧＡＰＤＨ：５‘－ＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＴＧＧ－３’＆５‘－ＴＣＴＡＧＡＣＧＧＣＡＧＧＴＣＡＧＧＴＣ－３’（配列番号５及び６）
各種細胞よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎＲＮＡ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ社）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、これをＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社）を用いて逆転写し、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ
Ｎｅｘｔ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡）とＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてＰＣＲと定量を行った。使用したプライマーは以下の配列である。
ＰＤＥ３Ａ：５‘－ＣＣＡＣＧＧＣＣＴＣＡＴＴＡＣＣＧＡＣ－３’＆５‘－ＴＴＧＣＴＣＡＣＧＧＣＴＣＴＣＡＡＧＧ－３’（配列番号１及び２）、
ＰＤＥ４Ａ：５‘－ＡＣＡＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＡＡＡＴＧＡＧＣ－３＆５’－ＧＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＣＴＣＣＡＣＴＴＣ－３’（配列番号３及び４）、
ＧＡＰＤＨ：５‘－ＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＴＧＧ－３’＆５‘－ＴＣＴＡＧＡＣＧＧＣＡＧＧＴＣＡＧＧＴＣ－３’（配列番号５及び６）
【0036】
３．薬剤処理が細胞周期に与える影響の解析
Ｃｏｎｆｌｕｅｎｔに到達しない数量の各種細胞を培養皿に播種し、２４時間培養した。処理群にはＺａｒｄａｖｅｒｉｎｅを終濃度１０μＭで添加し、非処理群のｖｅｈｉｃｌｅ ｃｏｎｔｒｏｌ細胞には同量のＤＭＳＯを添加し、さらに７２時間培養した。トリプシン処理で単離、細胞を２ｍｌの染色液（５０μｇ／ｍＬ ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ，０．１％クエン酸ナトリウム，０．３％ＮＰ－４０，０．０５８％ＮａＣｌ，１Ｕ／ｍＬ ＲＮａｓｅ）で一回洗浄し、２ｍｌの新しい染色液に交換して４℃遮光下で１０分間処理し、３５μｍナイロンメッシュを通過させてからＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で解析した。細胞周期の解析にはＭｏｄｆｉｔ ＬＴ ６．０を使用した。
Ｃｏｎｆｌｕｅｎｔに到達しない数量の各種細胞を培養皿に播種し、２４時間培養した。処理群にはＺａｒｄａｖｅｒｉｎｅを終濃度１０μＭで添加し、非処理群のｖｅｈｉｃｌｅ ｃｏｎｔｒｏｌ細胞には同量のＤＭＳＯを添加し、さらに７２時間培養した。トリプシン処理で単離、細胞を２ｍｌの染色液（５０μｇ／ｍＬ ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ，０．１％クエン酸ナトリウム，０．３％ＮＰ－４０，０．０５８％ＮａＣｌ，１Ｕ／ｍＬ ＲＮａｓｅ）で一回洗浄し、２ｍｌの新しい染色液に交換して４℃遮光下で１０分間処理し、３５μｍナイロンメッシュを通過させてからＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で解析した。細胞周期の解析にはＭｏｄｆｉｔ ＬＴ ６．０を使用した。
【0037】
４．ｓｉＲＮＡによるＰＤＥ３Ａ、ＰＤＥ４Ａのノックダウン
各種細胞の播種より１２時間後にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸを用いてトランスフェクションを行った。ｓｉＲＮＡは終濃度４０ｎＭで用いた。ｎｏｎ－ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｓｉＲＮＡ（ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵ：配列番号７）、ｓｉＰＤＥ３Ａ－２（ＡＡＡＡＡＣＧＵＡＵＡＡＵＧＵＧＡＣＡ：配列番号８）、ｓｉＰＤＥ３Ａ－５（ＧＧＡＵＡＵＧＵＡＵＵＣＵＣＡＡＡＡＡ：配列番号９）
各種細胞の播種より１２時間後にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸを用いてトランスフェクションを行った。ｓｉＲＮＡは終濃度４０ｎＭで用いた。ｎｏｎ－ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｓｉＲＮＡ（ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵ：配列番号７）、ｓｉＰＤＥ３Ａ－２（ＡＡＡＡＡＣＧＵＡＵＡＡＵＧＵＧＡＣＡ：配列番号８）、ｓｉＰＤＥ３Ａ－５（ＧＧＡＵＡＵＧＵＡＵＵＣＵＣＡＡＡＡＡ：配列番号９）
【0038】
（結果）
１．ｅｘｐ－ＣＡＦｓを用いた薬剤スクリーニングの結果
ｅｘｐ－ＣＡＦｓを用いて数多くの薬剤をスクリーニングした結果、図１に示すように、ザルダベリンが、強いＣＡＦｓ増殖抑制作用を有することが判明した（ＩＣ５０は、２．８２±０．８３μＭ）。
ＦＡＣＳを利用して、薬剤で処理された細胞の細胞周期を解析した。１０μＭのザルダベリンで７２ｈｒ処理しても、コントロール線維芽細胞（ｃｏｎ．ｆｉｂｒｏ）の細胞周期はあまり変わらなかった。一方のｅｘｐ－ＣＡＦｓでは、Ｓ，Ｇ２／Ｍが減少して、Ｇ１／Ｇ０が増加することがわかった。また、ｓｕｂ Ｇ１／Ｇ０がないので、ザルダベリンが細胞死の誘導ではなく、細胞の増殖を抑制することがわかった（図２）。
また、ｅｘｐ－ＣＡＦｓにおけるＰＤＥ３Ａ／４Ａ遺伝子の発現を調査したところ、図３に示すように、ｅｘｐ－ＣＡＦｓはＰＤＥ３ＡとＰＤＥ４Ａを高発現していた。（ｅｘｐ－ＣＡＦｓはＰＤＥ５Ａも高発現していた。）
１．ｅｘｐ－ＣＡＦｓを用いた薬剤スクリーニングの結果
ｅｘｐ－ＣＡＦｓを用いて数多くの薬剤をスクリーニングした結果、図１に示すように、ザルダベリンが、強いＣＡＦｓ増殖抑制作用を有することが判明した（ＩＣ５０は、２．８２±０．８３μＭ）。
ＦＡＣＳを利用して、薬剤で処理された細胞の細胞周期を解析した。１０μＭのザルダベリンで７２ｈｒ処理しても、コントロール線維芽細胞（ｃｏｎ．ｆｉｂｒｏ）の細胞周期はあまり変わらなかった。一方のｅｘｐ－ＣＡＦｓでは、Ｓ，Ｇ２／Ｍが減少して、Ｇ１／Ｇ０が増加することがわかった。また、ｓｕｂ Ｇ１／Ｇ０がないので、ザルダベリンが細胞死の誘導ではなく、細胞の増殖を抑制することがわかった（図２）。
また、ｅｘｐ－ＣＡＦｓにおけるＰＤＥ３Ａ／４Ａ遺伝子の発現を調査したところ、図３に示すように、ｅｘｐ－ＣＡＦｓはＰＤＥ３ＡとＰＤＥ４Ａを高発現していた。（ｅｘｐ－ＣＡＦｓはＰＤＥ５Ａも高発現していた。）
【0039】
２．ザルダベリン以外のＰＤＥ３Ａ／４Ａ阻害剤によるＣＡＦｓ増殖抑制作用
ザルダベリン以外のＰＤＥ３Ａ阻害剤（シロスタミド（Ｃｉｌｏｓｔａｍｉｄｅ）、トレキンシン（Ｔｒｅｑｕｉｎｓｉｎ）；ＰＤＥ４Ａ阻害剤（ロフルミラスト（Ｒｏｆｌｕｍｉｌａｓｔ））；ＰＤＥ３Ａ阻害剤とＰＤＥ４Ａ阻害剤の併用（シロスタミド＋ロフルミラスト）のいずれによっても、ＣＡＦｓ増殖抑制作用を示さなかった（シロスタミド、トレキンシン、ロフルミラストの結果を図４に示す）（シロスタミド＋ロフルミラスト併用の結果を図５に示す）。なお、これら化合物はＰＤＥ３Ａと４Ａの阻害剤として働くが、ベルクリン類ではない。
また、ｓｉＲＮＡによるＰＤＥ３Ａ、ＰＤＥ４ＡのノックダウンによるＣＡＦｓの増殖変化を検討したところ、ＰＤＥ３ＡあるいはＰＤＥ４Ａのノックダウン（図６）やＰＤＥ３ＡとＰＤＥ４Ａのダブルノックダウン（図７）は、ＣＡＦｓの増殖をほとんど阻害しなかった。
ザルダベリン以外のＰＤＥ３Ａ阻害剤（シロスタミド（Ｃｉｌｏｓｔａｍｉｄｅ）、トレキンシン（Ｔｒｅｑｕｉｎｓｉｎ）；ＰＤＥ４Ａ阻害剤（ロフルミラスト（Ｒｏｆｌｕｍｉｌａｓｔ））；ＰＤＥ３Ａ阻害剤とＰＤＥ４Ａ阻害剤の併用（シロスタミド＋ロフルミラスト）のいずれによっても、ＣＡＦｓ増殖抑制作用を示さなかった（シロスタミド、トレキンシン、ロフルミラストの結果を図４に示す）（シロスタミド＋ロフルミラスト併用の結果を図５に示す）。なお、これら化合物はＰＤＥ３Ａと４Ａの阻害剤として働くが、ベルクリン類ではない。
また、ｓｉＲＮＡによるＰＤＥ３Ａ、ＰＤＥ４ＡのノックダウンによるＣＡＦｓの増殖変化を検討したところ、ＰＤＥ３ＡあるいはＰＤＥ４Ａのノックダウン（図６）やＰＤＥ３ＡとＰＤＥ４Ａのダブルノックダウン（図７）は、ＣＡＦｓの増殖をほとんど阻害しなかった。
【0040】
３．前記の結果から、ザルダベリンのＣＡＦｓ増殖抑制作用は、ＰＤＥ３Ａ／４Ａの阻害によるものではないことが判明した。そこで、ザルダベリンのＣＡＦｓ増殖抑制作用のメカニズムを解明するために、ザルダベリンがベルクリンとしての活性を持つことに着目し、ザルダベリン以外のベルクリン類のＣＡＦｓ増殖抑制作用を検討した。
ザルダベリン以外のベルクリン類のＤＮＭＤＰ、アナグレリド、クアジノンのＣＡＦｓ増殖抑制作用を図８に示す。いずれもＣＡＦｓ増殖抑制作用を示した。ＤＮＭＤＰのＩＣ５０は、１１８ｎＭであった。
ザルダベリン以外のベルクリン類のＤＮＭＤＰ、アナグレリド、クアジノンのＣＡＦｓ増殖抑制作用を図８に示す。いずれもＣＡＦｓ増殖抑制作用を示した。ＤＮＭＤＰのＩＣ５０は、１１８ｎＭであった。
【0041】
４．ベルクリン類は、ＰＤＥ３Ａ－ＳＬＦＮ１２複合体形成を誘導することにより、癌細胞（ＰＤＥ３ＡとＳＬＦＮ１２高発現）の細胞死を誘導する低分子化合物である。ベルクリン類と非ベルクリンのＰＤＥ３Ａ阻害剤の両者はＰＤＥ３Ａに対する結合部位が同じなので、互いに競合阻害する関係にある。すなわち、もしザルダベリンとＤＮＭＤＰなどが本当にベルクリン類として細胞増殖を抑制しているなら、非ベルクリンのＰＤＥ３Ａ阻害剤でレスキューできると考えられる。そこで、ザルダベリンとＰＤＥ３Ａ阻害剤であるトレキンシン（ｔｒｅｑｕｉｎｓｉｎ）を一緒に処理したところ、ザルダベリン処理による増殖抑制をレスキューした（図９左）。また、ＤＮＭＤＰでも同様で、ＤＮＭＤＰ処理による増殖抑制はトレキンシンの同時処理でレスキューされた。（図９右）。
次にｓｉＰＤＥ３Ａのレスキュー実験を行った。細胞にｓｉＮＳを導入して、ベルクリン類（ザルダベリン、ＤＮＭＤＰ、アナグレリド）で４８ｈｒ処理すると、前記と同じようにＣＡＦｓの増殖を特異的に抑制した（図１０）。一方、ｓｉＰＤＥ３Ａ（２種類の異なるｓｉＲＮＡ配列をもつ２番あるいは５番）でノックダウンすると、ベルクリン類で処理してもＣＡＦの増殖があまり抑制されなかった（図１０）。
従って、ザルダベリン、ＤＮＭＤＰ、アナグレリドなどは、ベルクリン類としてＰＤＥ３Ａ存在下で働いてＣＡＦｓの増殖を抑制していることが明らかになった。
次にｓｉＰＤＥ３Ａのレスキュー実験を行った。細胞にｓｉＮＳを導入して、ベルクリン類（ザルダベリン、ＤＮＭＤＰ、アナグレリド）で４８ｈｒ処理すると、前記と同じようにＣＡＦｓの増殖を特異的に抑制した（図１０）。一方、ｓｉＰＤＥ３Ａ（２種類の異なるｓｉＲＮＡ配列をもつ２番あるいは５番）でノックダウンすると、ベルクリン類で処理してもＣＡＦの増殖があまり抑制されなかった（図１０）。
従って、ザルダベリン、ＤＮＭＤＰ、アナグレリドなどは、ベルクリン類としてＰＤＥ３Ａ存在下で働いてＣＡＦｓの増殖を抑制していることが明らかになった。
【0042】
５．ＢＡＹ２６６６６０５を用いて、ｅｘｐ－ＣＡＦｓに対する増殖抑制作用を検討した。その結果、図１１に示すように、ＢＡＹ２６６６６０５も強いＣＡＦｓに対する増殖抑制作用を示した。
【0043】
６．ｓｉＲＮＡをｃｏｎｔｒｏｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔとｅｘｐ－ＣＡＦｓにそれぞれ導入し、ＲＴ－ｑＰＣＲによってＳＬＦＮ１２発現量を比較した。Ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔの相対発現量を１とした。その結果、図１２に示すように、ＳＬＦＮ１２に対する２種のｓｉＲＮＡ（ｓｉＳＬＦＮ１２－１， ｓｉＳＬＦＮ１２－３）によるノックダウンにより、ＳＬＦＮ１２の遺伝子発現は抑制された。
【0044】
７．細胞にｓｉＮＳ（ｎｏｎ－ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｓｉＲＮＡ）を導入して、ベルクリン類（ザルダベリン（Ｚａｒｄ）、ＤＮＭＤＰ、ＢＡＹ２６６６６０５）で４８ｈｒ処理すると、ＣＡＦｓの増殖を特異的に抑制した（図１３、上段左）。一方、ｓｉＰＤＥ３Ａ（ＰＤＥ３Ａ―ｓｉＲＮＡ）の２番あるいは５番でノックダウンすると、ベルクリン類（ザルダベリン（Ｚａｒｄ）、ＤＮＭＤＰ、ＢＡＹ２６６６６０５）で処理してもＣＡＦの増殖があまり抑制されなかった（図１３、上段中央、上段右）。
さらに、ｓｉＳＬＦＮ１２（ＳＬＦＮ１２―ｓｉＲＮＡ）の１番あるいは３番でノックダウンすると、ベルクリン類（ザルダベリン（Ｚａｒｄ）、ＤＮＭＤＰ、ＢＡＹ２６６６６０５）で処理してもＣＡＦの増殖があまり抑制されなかった（図１３、下段中央、下段右）。
以上より、これら薬剤はＰＤＥ３Ａ阻害剤としてではなく、ベルクリン類としての機能によってＣＡＦの増殖を阻害していることが支持される。
さらに、ｓｉＳＬＦＮ１２（ＳＬＦＮ１２―ｓｉＲＮＡ）の１番あるいは３番でノックダウンすると、ベルクリン類（ザルダベリン（Ｚａｒｄ）、ＤＮＭＤＰ、ＢＡＹ２６６６６０５）で処理してもＣＡＦの増殖があまり抑制されなかった（図１３、下段中央、下段右）。
以上より、これら薬剤はＰＤＥ３Ａ阻害剤としてではなく、ベルクリン類としての機能によってＣＡＦの増殖を阻害していることが支持される。
【0045】
８．ＮＯＧマウス（免疫不全マウス）にＤＣＩＳ．ｃｏｍ（乳癌細胞株）のみを移植、あるいは、ＤＣＩＳ．ｃｏｍとｅｘｐ－ＣＡＦｓを混合して共移植し、腫瘍形成後にＢＡＹ２６６６６０５の投与を行った。細胞移植の７日後から、腫瘍への薬剤の局所投与を行った。３日に一度、注射により薬剤を腫瘍内に直接投与した。
細胞移植の２２日後に腫瘍を摘出し、組織切片の免疫染色を行った結果を、図１４、左図に示す。抗体はＶ９モノクローナル抗体を用いており、この抗体はヒトビメンチン蛋白質を特異的に認識し、マウスのビメンチンは認識しない。すなわち、移植したヒト細胞を認識する。ヒトビメンチン弱陽性の敷石状の形態をした癌細胞が占める領域を削除し（図１４、左下段）、その他のビメンチン強陽性部をｅｘｐ－ＣＡＦｓと認識して、その面積を定量した（図１４、右図）。ＢＡＹ２６６６６０５の投与により、腫瘍内のｅｘｐ－ＣＡＦｓが減少したことが示唆された。
細胞移植の２２日後に腫瘍を摘出し、組織切片の免疫染色を行った結果を、図１４、左図に示す。抗体はＶ９モノクローナル抗体を用いており、この抗体はヒトビメンチン蛋白質を特異的に認識し、マウスのビメンチンは認識しない。すなわち、移植したヒト細胞を認識する。ヒトビメンチン弱陽性の敷石状の形態をした癌細胞が占める領域を削除し（図１４、左下段）、その他のビメンチン強陽性部をｅｘｐ－ＣＡＦｓと認識して、その面積を定量した（図１４、右図）。ＢＡＹ２６６６６０５の投与により、腫瘍内のｅｘｐ－ＣＡＦｓが減少したことが示唆された。
【0046】
９．腫瘍の長径と短径を定量することで腫瘍体積を概算した（図１５、左図）。ＤＣＩＳ．ｃｏｍ単独移植に対してはＢＡＹ２６６６６０５の投与は腫瘍縮小効果を示さなかった。この結果から、ＢＡＹ２６６６６０５は癌細胞に直接働くわけではないと考えられる。一方、ＤＣＩＳ．ｃｏｍとｅｘｐ－ＣＡＦｓの共移植群に対しては、ＢＡＹ２６６６６０５の投与による腫瘍縮小効果が認められた。これら結果から、ベルクリン類は、ＣＡＦの増殖抑制効果を介して腫瘍を縮小させることが示された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】