特開 2024-1350 ＢＤＮＦを含む融合蛋白質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024001350

(43)【公開日】2024-01-09

(54)【発明の名称】ＢＤＮＦを含む融合蛋白質

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20231226BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20231226BHJP

   C07K 14/475 20060101ALI20231226BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20231226BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20231226BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20231226BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20231226BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20231226BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46 ZNA

C07K16/28

C07K14/475

C12N15/62 Z

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N5/10

C12P21/08

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023188680

(22)【出願日】2023-11-02

(62)【分割の表示】P 2022077514の分割

【原出願日】2017-12-26

(31)【優先権主張番号】P 2016252147

(32)【優先日】2016-12-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】000228545

【氏名又は名称】ＪＣＲファーマ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100128381

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 義憲

(74)【代理人】

【識別番号】100176773

【弁理士】

【氏名又は名称】坂西 俊明

(72)【発明者】

【氏名】薗田 啓之

(72)【発明者】

【氏名】高橋 健一

(57)【要約】

【課題】血中に投与したＢＤＮＦが脳内で作用できるよう，血液脳関門を通過可能にしたものである，新規な抗ＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとの融合蛋白質を提供すること。
【解決手段】ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，該抗体が重鎖の可変領域において，（ａ）ＣＤＲ１が配列番号６６又は配列番号６７のアミノ酸配列を含んでなり，（ｂ）ＣＤＲ２が配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸配列を含んでなり，且つ（ｃ）ＣＤＲ３が配列番号１５又は配列番号１６のアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

脳由来神経栄養因子（Brain-derivedneurotrophic factor，ＢＤＮＦ）と抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，該抗体が重鎖の可変領域において，
（ａ）ＣＤＲ１が配列番号６６又は配列番号６７のアミノ酸配列を含んでなり，
（ｂ）ＣＤＲ２が配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸配列を含んでなり，且つ
（ｃ）ＣＤＲ３が配列番号１５又は配列番号１６のアミノ酸配列を含んでなるものである，
融合蛋白質。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は，血液脳関門の通過を可能にしたＢＤＮＦに関し，より詳しくは新規な抗ヒトトランスフェリン受容体抗体とＢＤＮＦとの融合蛋白質，その製造法及びその使用法に関する。

【背景技術】

【0002】

脳室周囲器官（松果体，脳下垂体，最後野等）を含む幾つかの領域を除き脳の大半の組織に血液を供給する毛細血管は，筋肉等その他の組織に存在する毛細血管と異なり，その内皮を形成している内皮細胞同士が強固な細胞間接合によって密着し合っている。そのため，血液から脳への物質の受動輸送が妨げられ，例外はあるものの，脂溶性の高い物質，又は分子量が小さく（２００～５００ダルトン以下）且つ生理ｐＨ付近において電気的に中性な物質以外，毛細血管から脳へ移行しにくい。このような，脳内の毛細血管内皮を介した，血液と脳の組織液との間での物質交換を制限する機構は，血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ－Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ，ＢＢＢ）と呼ばれている。また，血液脳関門は，脳のみならず，脳及び脊髄を含む中枢神経系の組織液と血液との間の物質交換をも制限している。

【0003】

血液脳関門の存在により，中枢神経系の細胞の大半は，血中のホルモン，リンホカイン等の物質の濃度の変動等の影響を受けることなく，その生化学的な恒常性が保たれる。

【0004】

しかしながら，血液脳関門の存在は，薬剤開発のうえで問題を提起する。例えば，脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ；Ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）は，ニューロトロフィンファミリーの一つであり，その二量体が標的細胞表面上にある高親和性ＢＤＮＦ受容体（ＴｒｋＢ；Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅ Ｂ，Ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅ Ｂ，又はＴｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄ Ｋｉｎａｓｅ Ｂとも呼ばれる）に特異的に結合し，中枢および末梢神経系の細胞の分化，機能維持，シナプス形成，および損傷時の再生および修復などに重要な役割を果たすことが知られている（非特許文献１及び２）。このことから，ＢＤＮＦはアルツハイマー病，パーキンソン病，ハンチントン病などの神経変性疾患，筋萎縮性側策硬化症などの脊髄変性疾患，この他，糖尿病性神経障害，脳虚血性疾患，Ｒｅｔｔ症候群などの発達障害，統合失調症，うつ病等，多様な疾患の治療剤としての開発が期待されている。（非特許文献３～８）。しかしながら高分子蛋白質は一般的に血液脳関門を極めて通過し難いため，ＢＤＮＦ自身を中枢神経系の疾患治療薬または中枢神経系に作用する疾患治療薬として末梢投与により用いるには大きな障壁があった。

【0005】

中枢神経系において作用させるべきそのような蛋白質等の高分子物質に血液脳関門を通過させるための方法が，種々開発されている。例えば，神経成長因子の場合，これを内包させたリポソームを脳内毛細血管の内皮細胞の細胞膜と融合させることにより，血液脳関門を通過させる方法が試みられているが，実用化に至っていない（非特許文献９）。α－Ｌ－イズロニダーゼの場合，１回当たりに投与される酵素の量を増加させてその血中濃度を高めることにより，血液脳関門における酵素の受動輸送を高める試みが行われ，ハーラー症候群の動物モデルを用いて，この手法により中枢神経系（ＣＮＳ）の異常が緩解することが示されている（非特許文献１０）。

【0006】

また，血液脳関門を回避し，高分子物質を髄腔内又は脳内に直接投与する試みも行われている。例えば，ハーラー症候群（ムコ多糖症Ｉ型）の患者の髄腔内にヒトα－Ｌ－イズロニダーゼを投与する方法（特許文献１），ニーマン－ピック病の患者の脳室内にヒト酸スフィンゴミエリナーゼを投与する方法（特許文献２），ハンター症候群のモデル動物の脳室内にイズロン酸２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）を投与する方法（特許文献３）が報告されている。このような手法によれば，確実に中枢神経系に薬剤を作用させることができると考えられる一方，侵襲性が極度に高いという問題がある。

【0007】

血液脳関門を通して高分子物質を脳内に到達させる方法として，脳内毛細血管の内皮細胞上に存在する膜蛋白質との親和性を持つように高分子物質を修飾する方法が種々報告されている。脳内毛細血管の内皮細胞上に存在する膜蛋白質としては，インスリン，トランスフェリン，インスリン様成長因子（ＩＧＦ－Ｉ，ＩＧＦ－ＩＩ），ＬＤＬ，レプチン等の化合物に対する受容体が挙げられる。

【0008】

例えば，神経成長因子（ＮＧＦ）をインスリンとの融合蛋白質の形で合成し，インスリン受容体との結合を介してこの融合蛋白質に血液脳関門を通過させる技術が報告されている（特許文献４～６）。また，神経成長因子（ＮＧＦ）を抗インスリン受容体抗体との融合蛋白質の形で合成し，インスリン受容体との結合を介してこの融合蛋白質に血液脳関門を通過させる技術が報告されている（特許文献４及び７）。

【0009】

脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を抗インスリン受容体抗体との融合蛋白質の形で合成し，この融合蛋白質をインスリン受容体との結合を介して血液脳関門を通過させる技術が報告されている（非特許文献１１）。神経成長因子（ＮＧＦ）をトランスフェリンとの融合蛋白質の形に合成し，トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）との結合を介してこの融合蛋白質に血液脳関門を通過させる技術が報告されている（特許文献８）。また，神経成長因子（ＮＧＦ）を抗トランスフェリン受容体抗体（抗ＴｆＲ抗体）との融合蛋白質の形で合成し，ＴｆＲとの結合を介してこの融合蛋白質に血液脳関門を通過させる技術が報告されている（特許文献４及び９）。また，ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を付加した脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）をマウス抗ラットトランスフェリン受容体抗体（抗ＴｆＲ抗体）とストレプトアビジン－ビオチンリンカーを介して化学的に結合したコンジュゲートの形で合成し，ラットにおいて，このコンジュゲートをＴｆＲとの結合を介して血液脳関門を通過させる技術が報告されている（非特許文献１２）。

【0010】

抗ＴｆＲ抗体を用いた技術について更にみると，抗ＴｆＲ抗体と結合させることにより薬剤に血液脳関門を通過させる技術において，ストレプトアビジンを用いた場合は一本鎖抗体を使用できることが報告されている（非特許文献１３）。また，ヒトＴｆＲ（ｈＴｆＲ）との解離定数が比較的大きい抗ｈＴｆＲ抗体（低親和性抗ｈＴｆＲ抗体）が，薬剤をして血液脳関門を通過させる技術において好適に利用できることが報告されている（特許文献１０及び１１，非特許文献１４）。更には，ｈＴｆＲとの親和性がｐＨ依存的に変化する抗ＴｆＲ抗体が，薬剤に血液脳関門を通過させるためキャリアとして使用できることが報告されている（特許文献１２，非特許文献１５）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】特表２００７－５０４１６６号公報

【特許文献2】特表２００９－５２５９６３号公報

【特許文献3】特開２０１２－６２３１２号公報

【特許文献4】米国特許５１５４９２４号公報

【特許文献5】特開２０１１－１４４１７８号公報

【特許文献6】米国特許２００４／０１０１９０４号公報

【特許文献7】特表２００６－５１１５１６号公報

【特許文献8】特開Ｈ０６－２２８１９９号公報

【特許文献9】米国特許５９７７３０７号公報

【特許文献10】ＷＯ２０１２／０７５０３７

【特許文献11】ＷＯ２０１３／１７７０６２

【特許文献12】ＷＯ２０１２／１４３３７９

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Ｍｏｓｅｓ Ｖ． Ｃｈａｏ． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ． ４． ２９９－３０９（２００３）

【非特許文献2】Ｔａｂａｋｍａｎ Ｒ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． １４６． ３８７－４０１（２００４）

【非特許文献3】Ｂｏｌｌｅｎ Ｅ． Ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２５７Ｃ． ８－１２（２０１３）

【非特許文献4】Ａｌｔａｒ Ｃ． Ａｎｔｈｏｎｙ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ６３． １０２１－３２（１９９４）

【非特許文献5】Ｚｕｃｃａｔｏ Ｃ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． ８１． ２９４－３３０（２００７）

【非特許文献6】Ｄａｆａｎｇ Ｗｕ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ． ２． １２０－８（２００５）

【非特許文献7】Ｄａｖｉｄ Ｍ． Ｋａｔｚ． Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ． ２２０． ４８１－９５（２０１４）

【非特許文献8】Ｅ． Ｃａｓｔｒｅｎ． Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ． ２２０．４６１－７９（２０１４）

【非特許文献9】Ｘｉｅ Ｙ． Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ． １０５． １０６－１９（２００５）

【非特許文献10】Ｏｕ Ｌ． Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ． １１１． １１６－２２ （２０１４）

【非特許文献11】Ｒｕｂｅｎ Ｊ．Ｂ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ９７． １３７６－１３８６（２００７）

【非特許文献12】Ｄａｆａｎｇ Ｗ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９６． ２５４－２５９（１９９９）

【非特許文献13】Ｌｉ ＪＹ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． １２． ７８７－９６（１９９９）

【非特許文献14】Ｂｉｅｎ－Ｌｙ Ｎ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． ２１１． ２３３－４４ （２０１４）

【非特許文献15】Ｓａｄａ Ｈ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ． ９． Ｅ９６３４０ （２０１４）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

上記背景の下で，本発明の目的は，血中に投与したＢＤＮＦが脳内で作用できるよう，血液脳関門を通過可能にしたものである，新規な抗ＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとの融合蛋白質，その製造方法，使用方法，及び当該融合蛋白質を投与することによる，所定範囲の疾患の予防及び／又は治療方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0014】

上記目的に向けた研究において，本発明者らは，鋭意検討を重ねた結果，本明細書において詳述する抗体作製法により得られる，ｈＴｆＲの細胞外領域を認識する抗ヒトトランスフェリン受容体抗体（抗ｈＴｆＲ抗体）のものの中で有る特定のもの，取り分け，重鎖のＣＤＲ１が配列番号６６又は配列番号６７のアミノ酸配列を含んでなるものが，更には，それに加えて重鎖のフレームワーク領域３が配列番号６８のアミノ酸配列を含んでなるものが，血中に投与したとき顕著に効率よく血液脳関門を通過することを見出し，しかも当該抗体とＢＤＮＦを融合させたものも血液脳関門を通過することも見出し，本発明を完成した。すなわち，本発明は以下を提供する。

【0015】

１．脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）と抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，該抗体が重鎖の可変領域において，
（ａ）ＣＤＲ１が配列番号６６又は配列番号６７のアミノ酸配列を含んでなり，
（ｂ）ＣＤＲ２が配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸配列を含んでなり，且つ
（ｃ）ＣＤＲ３が配列番号１５又は配列番号１６のアミノ酸配列を含んでなるものである，
融合蛋白質。
２．上記１の融合蛋白質であって，重鎖のフレームワーク領域３が配列番号６８のアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
３．上記１又は２の融合蛋白質であって，但し該重鎖の可変領域において，
ＣＤＲ２の配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸配列に代えてこれに対し８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり，且つ
ＣＤＲ３の配列番号１５又は配列番号１６のアミノ酸配列に代えてこれに対し８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるものである，
融合蛋白質。
４．上記１又は２の融合蛋白質であって，但し該重鎖の可変領域において，
ＣＤＲ２の配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸配列に代えてこれに対し９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり，且つ
ＣＤＲ３の配列番号１５又は配列番号１６のアミノ酸配列に代えてこれに対し９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるものである，
融合蛋白質。
５．上記１又は２の融合蛋白質であって，但し該重鎖の可変領域において，
（ａ）ＣＤＲ１については配列番号６６又は配列番号６７，
（ｂ）ＣＤＲ２については配列番号１３又は配列番号１４，
（ｃ）ＣＤＲ３については配列番号１５又は配列番号１６，及び
（ｄ）フレームワーク領域３については配列番号６８，
のうち少なくとも１つのアミノ酸配列に代えてこれに対し１～５個のアミノ酸の置換，欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものであり，
ここに，ＣＤＲ１については，配列番号６６又は配列番号６７のアミノ酸配列のＮ末端側から５番目に位置するメチオニンが，改変後のアミノ酸配列においても同じ位置にあり，且つ
フレームワーク領域３については，配列番号６８のＮ末端側から１７番目に位置するロイシンが，改変後のアミノ酸配列においても同じ位置にあるものである，
融合蛋白質。
６．上記１又は２の融合蛋白質であって，但し該重鎖の可変領域において，
（ａ）ＣＤＲ１については配列番号６６又は配列番号６７，
（ｂ）ＣＤＲ２については配列番号１３又は配列番号１４，
（ｃ）ＣＤＲ３については配列番号１５又は配列番号１６，及び
（ｄ）フレームワーク領域３については配列番号６８，
のうち少なくとも１つのアミノ酸配列に代えてこれに対し１～３個のアミノ酸の置換，欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものであり，
ここに，ＣＤＲ１については，配列番号６６又は配列番号６７のアミノ酸配列のＮ末端側から５番目に位置するメチオニンが，改変後のアミノ酸配列においても同じ位置にあり，且つフレームワーク領域３については，配列番号６８のＮ末端側から１７番目に位置するロイシンが，改変後のアミノ酸配列においても同じ位置にあるものである，融合蛋白質。
７．上記１の融合蛋白質であって，該重鎖の可変領域が配列番号６９のアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
８．上記７の融合蛋白質であって，但し該重鎖の可変領域のうち，ＣＤＲ１の配列番号６６又は配列番号６７及びフレームワーク領域３の配列番号６８の各アミノ酸配列以外の部分において，該部分に代えて該部分と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
９．上記７の融合蛋白質であって，但し該重鎖の可変領域のうち，ＣＤＲ１の配列番号６６又は配列番号６７及びフレームワーク領域３の配列番号６８の各アミノ酸配列以外の部分において，該部分に代えて該部分と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
１０．上記７の融合蛋白質であって，但し該重鎖の可変領域を構成するアミノ酸配列に代えてこれに対し１～５個のアミノ酸の置換，欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものであり，
ここに，ＣＤＲ１については，配列番号６７のアミノ酸配列のＮ末端から５番目に位置するメチオニンが，改変後のアミノ酸配列においても同じ位置にあり，且つフレームワーク領域３については，配列番号６８のＮ末端側から１７番目に位置するロイシンが，改変後のアミノ酸配列においても同じ位置にあるものである，融合蛋白質。
１１．上記７の融合蛋白質であって，但し該重鎖の可変領域を構成するアミノ酸配列に代えてこれに対し１～３個のアミノ酸の置換，欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものであり，
ここに，ＣＤＲ１については，配列番号６７のアミノ酸配列のＮ末端から５番目に位置するメチオニンが，改変後のアミノ酸配列においても同じ位置にあり，且つフレームワーク領域３については，配列番号６８のＮ末端側から１７番目に位置するロイシンが，改変後のアミノ酸配列においても同じ位置にあるものである，融合蛋白質。
１２．上記７の融合蛋白質であって，該重鎖のアミノ酸配列が，配列番号７０又は配列番号７２のアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
１３．上記１２の融合蛋白質であって，但し該重鎖のうち，ＣＤＲ１の配列番号６６又は配列番号６７及びフレームワーク領域３の配列番号６８の各アミノ酸配列以外の部分に代えて該部分に対し８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
１４．上記１２の融合蛋白質であって，但し該重鎖のうち，ＣＤＲ１の配列番号６６又は配列番号６７及びフレームワーク領域３の配列番号６８の各アミノ酸配列以外の部分に代えて当該部分に対し９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
１５．上記１２の融合蛋白質であって，但し該重鎖を構成するアミノ酸配列に代えてこれに対し１～５個のアミノ酸の置換，欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものであり，
ここに，ＣＤＲ１については，配列番号６７のアミノ酸配列のＮ末端から５番目に位置するメチオニンが，改変後のアミノ酸配列においても同じ位置にあり，且つフレームワーク領域３については，配列番号６８のＮ末端側から１７番目に位置するロイシンが，改変後のアミノ酸配列においても同じ位置にあるものである，融合蛋白質。
１６．上記１２の融合蛋白質であって，但し該重鎖を構成するアミノ酸配列に代えてこれに対し１～３個のアミノ酸の置換，欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものであり，
ここに，ＣＤＲ１については，配列番号６７のアミノ酸配列のＮ末端から５番目に位置するメチオニンが，改変後のアミノ酸配列においても同じ位置にあり，且つフレームワーク領域３については，配列番号６８のＮ末端側から１７番目に位置するロイシンが，改変後のアミノ酸配列においても同じ位置にあるものである，融合蛋白質。
１７．上記１～１６の何れかの融合蛋白質であって，該抗体の軽鎖の可変領域において，
（ａ）ＣＤＲ１が配列番号６又は配列番号７のアミノ酸配列を含んでなり，
（ｂ）ＣＤＲ２が配列番号８若しくは配列番号９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｌｙｓ－Ｖａｌ－Ｓｅｒを含んでなり，且つ
（ｃ）ＣＤＲ３が配列番号１０のアミノ酸配列を含んでなるものである，
融合蛋白質。
１８．上記１７の融合蛋白質であって，但し，該軽鎖の可変領域において，
（ａ）ＣＤＲ１の配列番号６又は配列番号７のアミノ酸配列に代えてこれに対し８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり，
（ｂ）ＣＤＲ２の配列番号８若しくは配列番号９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｌｙｓ－Ｖａｌ－Ｓｅｒに代えてこれに対し８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり，且つ
（ｃ）ＣＤＲ３の配列番号１０のアミノ酸配列に代えてこれに対し８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるものである，
融合蛋白質。
１９．上記１７の融合蛋白質であって，但し，該軽鎖の可変領域において，
（ａ）ＣＤＲ１の配列番号６又は配列番号７のアミノ酸配列に代えてこれに対し９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり，
（ｂ）ＣＤＲ２の配列番号８若しくは配列番号９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｌｙｓ－Ｖａｌ－Ｓｅｒに代えてこれに対し９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり，且つ
（ｃ）ＣＤＲ３の配列番号１０のアミノ酸配列に代えてこれに対し９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるものである，
融合蛋白質。
２０．上記１７の融合蛋白質であって，但し該軽鎖の可変領域において，
（ａ）ＣＤＲ１については配列番号６又は配列番号７，
（ｂ）ＣＤＲ２については配列番号８若しくは配列番号９，又はアミノ酸配列Ｌｙｓ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ，及び
（ｃ）ＣＤＲ３については配列番号１０，
のうち少なくとも１つのアミノ酸配列に代えてこれに対し１～５個のアミノ酸の置換，欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
２１．上記１７の融合蛋白質であって，但し該軽鎖の可変領域において，
（ａ）ＣＤＲ１については配列番号６又は配列番号７，
（ｂ）ＣＤＲ２については配列番号８若しくは配列番号９，又はアミノ酸配列Ｌｙｓ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ，及び
（ｃ）ＣＤＲ３については配列番号１０，
のうち少なくとも１つのアミノ酸配列に代えてこれに対し１～３個のアミノ酸の置換，欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
２２．上記１～１６の何れかの融合蛋白質であって，該抗体の軽鎖の可変領域が，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１又は配列番号２２のアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
２３．上記２２の融合蛋白質であって，但し該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列に代えてこれに対し８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
２４．上記２２の融合蛋白質であって，但し該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列に代えてこれに対し９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
２５．上記２２の融合蛋白質であって，但し該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列に代えてこれに対し１～５個のアミノ酸の置換，欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
２６．上記２２の融合蛋白質であって，但し該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列に代えてこれに対し１～３個のアミノ酸の置換，欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
２７．上記１～１６の何れかの融合蛋白質であって，該抗体の軽鎖が，配列番号２３，配列番号２５，配列番号２７又は配列番号２９のアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
２８．上記２７の融合蛋白質であって，但し該軽鎖のアミノ酸配列に代えてこれに対し８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
２９．上記２７の融合蛋白質であって，但し該軽鎖のアミノ酸配列に代えてこれに対し９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
３０．上記２７の融合蛋白質であって，但し該軽鎖のアミノ酸配列に代えてこれに対し１～５個のアミノ酸の置換，欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
３１．上記２７の融合蛋白質であって，但し該軽鎖のアミノ酸配列に代えてこれに対し１～３個のアミノ酸の置換，欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
３２．上記１～３１の何れかの融合蛋白質であって，該抗体が，Ｆａｂ抗体，Ｆ（ａｂ’）_２抗体，又はＦ（ａｂ’）抗体である，融合蛋白質。
３３．上記１～３１の何れか融合蛋白質であって，該抗体が，ｓｃＦａｂ，ｓｃＦ（ａｂ’），ｓｃＦ（ａｂ’）_２及びｓｃＦｖからなる群から選ばれる一本鎖抗体である，融合蛋白質。
３４．上記３３の融合蛋白質であって，該抗体の軽鎖と重鎖とがリンカー配列を介して結合しているものである，融合蛋白質。
３５．上記３４の融合蛋白質であって，該軽鎖のＣ末端側において，リンカー配列を介して該重鎖が結合しているものである，融合蛋白質。
３６．上記３４の融合蛋白質であって，該重鎖のＣ末端側において，リンカー配列を介して該軽鎖が結合しているものである，融合蛋白質。
３７．上記３４～３６の何れかの融合蛋白質であって，該リンカー配列が，８～５０個のアミノ酸残基からなるものである，融合蛋白質。
３８．上記３７の融合蛋白質であって，該リンカー配列が，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ，配列番号３，配列番号４，及び配列番号５の各アミノ酸配列，配列番号３のアミノ酸配列の３個が連続したものに相当するアミノ酸配列，及びこれらのアミノ酸配列の１０個以下が連続してなる配列からなる群より選ばれるものである，融合蛋白質。
３９．上記１～３８の何れかの融合蛋白質であって，該ＢＤＮＦが，該抗体の軽鎖又は重鎖のＣ末端側又はＮ末端側に結合したものである，融合蛋白質。
４０．上記３９の融合蛋白質であって，該ＢＤＮＦが，該抗体の軽鎖又は重鎖のＣ末端側又はＮ末端側に，直接又はリンカーを介して結合したものである，融合蛋白質。
４１．該リンカーが，１～５０個のアミノ酸残基からなるペプチドである，上記４０の融合蛋白質。
４２．該リンカーが，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，配列番号３，配列番号４，及び配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドである，上記４１の融合蛋白質。
４３．該ＢＤＮＦがヒトＢＤＮＦである，上記１～４２の何れかの融合蛋白質。
４４．該ヒトＢＤＮＦが，配列番号５１のアミノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列を含んでなるものであるか，または配列番号５１で表される蛋白質と同質の機能を有するものである，上記４３の融合蛋白質。
４５．上記１～４４の何れかの融合蛋白質であって，ヒトトランスフェリン受容体の細胞外領域及びサルトランスフェリン受容体の細胞外領域の双方に対して親和性を有するものである，融合蛋白質。
４６．上記４５の融合蛋白質であって，該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が，ヒトトランスフェリン受容体の細胞外領域との解離定数が１×１０^－１０Ｍ以下であり，サルトランスフェリン受容体の細胞外領域との解離定数が１×１０^－９Ｍ以下のものである，融合蛋白質。
４７．上記４３の融合蛋白質であって，
該軽鎖が，配列番号２３のアミノ酸配列を含んでなり，且つ
（ａ）該重鎖が，そのＣ末端側でアミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒからなるリンカーを介して，ヒトＢＤＮＦと結合し，それにより配列番号５２のアミノ酸配列を形成しているものであるか，又は
（ｂ）該重鎖が，そのＣ末端側でアミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒに続いてアミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号３）が５個連続してなる計２７個のアミノ酸からなるリンカーを介して，ヒトＢＤＮＦと結合し，それにより配列番号５４のアミノ酸配列を形成しているものである，
融合蛋白質。
４８．該抗体が抗原結合性断片である，上記１～３１の何れか１項の融合蛋白質。
４９．該抗原結合性断片のＮ末端側に，直接又はリンカーを介して，ヒトＢＤＮＦが結合してなるものである，上記４８の融合蛋白質。
５０．該抗原結合性断片が一本鎖抗体である，上記４８又は４９の融合蛋白質。
５１．上記５０の融合蛋白質であって，該抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域がリンカー配列を介して結合してなるものである，融合蛋白質。
５２．上記５１の融合蛋白質であって，該軽鎖可変領域のＣ末端側に，該リンカー配列を介して，該重鎖可変領域が結合してなるものである，融合蛋白質。
５３．上記５１の融合蛋白質であって，該重鎖可変領域のＣ末端側に，該リンカー配列を介して，該軽鎖可変領域が結合してなるものである，融合蛋白質。
５４．上記５１～５３の何れかの融合蛋白質であって，該リンカー配列が，８～５０個のアミノ酸残基からなるものである，融合蛋白質。
５５．上記５４の融合蛋白質であって，該リンカー配列が，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ，配列番号３，配列番号４，及び配列番号５の各アミノ酸配列，配列番号３のアミノ酸配列の３個が連続したものに相当するアミノ酸配列，及びこれらのアミノ酸配列の１０個以下が連続してなる配列からなる群より選ばれるものである，融合蛋白質。
５６．上記５０～５５の何れかの融合蛋白質であって，該抗体が，配列番号６９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と，配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含んでなるものである，融合蛋白質。
５７．上記５６の融合蛋白質であって，該抗体が，配列番号５７のアミノ酸配列からなり，そのＮ末端側に，直接又はリンカーを介して，ヒトＢＤＮＦが結合してなるものである，融合蛋白質。
５８．上記５７の融合蛋白質であって，該抗体が配列番号５７のアミノ酸配列からなり，そのＮ末端側に，リンカーを介して，ヒトプロＢＤＮＦが結合してなる，配列番号５９のアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
５９．上記５７の融合蛋白質であって，該抗体が配列番号５７のアミノ酸配列からなり，そのＮ末端側に，リンカーを介して，ヒトＢＤＮＦが結合してなる，配列番号６０のアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
６０．該抗原結合性断片が，Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）_２，又はＦ（ａｂ’）の何れかである，上記４８又は４９の融合蛋白質。
６１．上記６０の融合蛋白質であって，Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）_２，又はＦ（ａｂ’）の何れかの軽鎖又は重鎖のＮ末端側に，直接又はリンカーを介して，ヒトＢＤＮＦが結合してなるものである，融合蛋白質。
６２．上記６１の融合蛋白質であって，該抗体の軽鎖が配列番号２３のアミノ酸配列からなり，且つ該抗体の重鎖が配列番号６１のアミノ酸配列からなるＦａｂ重鎖であり，該重鎖のＮ末端側に，直接又はリンカーを介してヒトＢＤＮＦ，が結合してなるものである，融合蛋白質。
６３．上記６２の融合蛋白質であって、該リンカーが，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，配列番号３のアミノ酸配列，配列番号４のアミノ酸配列，及び配列番号５のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドである，融合蛋白質。
６４．上記６２の融合蛋白質であって，
該軽鎖が配列番号２３のアミノ酸配列を含んでなり，且つ
該Ｆａｂ重鎖とそのＮ末端側に，リンカーを介して，結合したヒトプロＢＤＮＦとからなる部分が配列番号６３のアミノ酸配列を形成しているものである，融合蛋白質。
６５．上記６２の融合蛋白質であって，
該軽鎖が配列番号２３のアミノ酸配列を含んでなり，且つ
Ｆａｂ重鎖とそのＮ末端側に，リンカーを介して，結合したヒトＢＤＮＦとからなる部分が配列番号６５のアミノ酸配列を形成しているものである，融合蛋白質。
６６．上記４８～６２の何れかの融合蛋白質であって，ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域又はその一部が，ヒトＢＤＮＦと該抗体との間に導入されてなるものである，融合蛋白質。
６７．上記６６の融合蛋白質であって，ヒトＢＤＮＦのＣ末端側に，直接又はリンカー配列を介して，ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域が結合してなり，且つ，該ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＣ末端側に直接又はリンカー配列を介して該抗体が結合してなるものである，融合蛋白質。
６８．上記６６又は６７の融合蛋白質であって，ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域が配列番号７５で示されるアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
６９．上記６８の融合蛋白質であって，
該重鎖が，ヒトＢＤＮＦのＣ末端側に，直接又はリンカー配列を介して，該ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域が結合してなり，且つ，該ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＣ末端側に直接又はリンカー配列を介して該重鎖が結合したものである，融合蛋白質。
７０．上記６９の融合蛋白質であって，
該軽鎖が，配列番号２３のアミノ酸配列を含んでなり，且つ
該重鎖が，ヒトＢＤＮＦのＣ末端側に，リンカー配列を介して，ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域が結合してなり，且つ，該ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＣ末端側にリンカー配列を介して該重鎖が結合したものであり，それにより配列番号７４のアミノ酸配列を形成しているものである，融合蛋白質。
７１．上記４８～６２の何れかの融合蛋白質であって，さらにアルブミン親和性ペプチドが導入されてなるものである，融合蛋白質。
７２．上記７１の融合蛋白質であって，該抗体のＣ末端側に，直接又はリンカー配列を介して，アルブミン親和性ペプチドが結合してなるものである，融合蛋白質。
７３．上記７１又は７２の融合蛋白質であって，アルブミン親和性ペプチドが配列番号８５で示されるアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
７４．上記７３の融合蛋白質であって，
該重鎖が，ヒトＢＤＮＦのＣ末端側に，直接又はリンカー配列を介して結合してなり，且つ，該重鎖のＣ末端側に直接又はリンカー配列を介してアルブミン親和性ペプチドが結合したものである，融合蛋白質。
７５．上記７４の融合蛋白質であって，
該軽鎖が，配列番号２３のアミノ酸配列を含んでなり，且つ
該重鎖が，ヒトプロＢＤＮＦのＣ末端側に，リンカー配列を介して結合してなり，且つ，該重鎖のＣ末端側にリンカー配列を介してアルブミン親和性ペプチドが結合したものであり，それにより配列番号８７のアミノ酸配列を形成しているものである，融合蛋白質。
７６．上記７４の融合蛋白質であって，
該軽鎖が，配列番号２３のアミノ酸配列を含んでなり，且つ
該重鎖が，ヒトＢＤＮＦのＣ末端側に，リンカー配列を介して結合してなり，且つ，該重鎖のＣ末端側にリンカー配列を介してアルブミン親和性ペプチドが結合したものであり，それにより配列番号８８のアミノ酸配列を形成しているものである，融合蛋白質。
７７．上記１～７６の何れかの融合蛋白質をコードする，ＤＮＡ断片。
７８．上記７７のＤＮＡ断片を組み込んでなる，発現ベクター。
７９．上記７８の発現ベクターで形質転換された哺乳動物細胞。
８０．ＢＤＮＦへの曝露によって利益を得ることができる疾患又は障害の予防及び／又は治療のための薬剤であって，上記１～７６の何れかの融合蛋白質を有効成分として含んでなる，薬剤。
８１．該疾患又は障害が，神経系の疾患又は障害である上記８０の薬剤。
８２．該神経系の疾患又は障害が，神経変性疾患，うつ病，統合失調症，てんかん，自閉症，Ｒｅｔｔ症候群，Ｗｅｓｔ症候群，新生児痙攣，認知症に伴う問題行動，不安症，疼痛，ヒルシュスプルング病又はレム睡眠行動障害である，上記８１の薬剤。
８３．該神経変性疾患が，脳神経変性疾患，脊髄変性疾患，網膜変性疾患又は末梢神経変性疾患である，上記８２の薬剤。
８４．該脳神経変性疾患が，脳神経系の神経変性疾患，脳虚血性疾患，外傷性脳損傷，白質脳症又は多発性硬化症である，上記８３の薬剤。
８５．該脳神経系の神経変性疾患が，アルツハイマー病，パーキンソン病，ハンチントン病，レビー小体型認知症，ピック病，多系統萎縮症，進行性上行性麻痺又はダウン症候群である，上記８４の薬剤。
８６．ＢＤＮＦへの曝露によって利益を得ることができる疾患又は障害の予防及び／又は治療のための，上記１～７６の何れかの融合蛋白質の使用。
８７．ＢＤＮＦへの曝露によって利益を得ることができる疾患又は障害の予防及び／又は治療用の医薬の製造のための，上記１～７６の何れかの融合蛋白質の使用。
８８．ＢＤＮＦへの曝露によって利益を得ることができる疾患又は障害の予防及び／又は治療の方法であって，該疾患又は傷害を有する患者の血中に，上記１～７６の何れかの融合蛋白質の治療上有効量を含有する医薬組成物を投与することを含むものである，方法。

【発明の効果】

【0016】

本発明は，血液脳関門を通過できないものである脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）につき，これを特定の抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質の形とすることにより，血液脳関門を通過可能にする。従って，ＢＤＮＦを，そのような融合蛋白質の形で静脈注射等により血中に投与することによって中枢神経系に作用させることを可能にする。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】抗ｈＴｆＲ抗体を単回静脈内投与した後の，カニクイザルの大脳皮質の，抗ｈＴｆＲ抗体に対する免疫組織化学染色の結果を示す図面代用写真。（ａ）抗ｈＴｆＲ抗体を非投与，（ｂ）抗ｈＴｆＲ抗体番号３を投与。各写真の右下のバーは５０μｍを表すゲージである。

【図2】抗ｈＴｆＲ抗体を単回静脈内投与した後の，カニクイザルの海馬の，抗ｈＴｆＲ抗体に対する免疫組織化学染色の結果を示す図。（ａ）抗ｈＴｆＲ抗体を非投与，（ｂ）抗ｈＴｆＲ抗体番号３を投与。各写真の右下のバーは５０μｍを表すゲージである。

【図3】抗ｈＴｆＲ抗体を単回静脈内投与した後の，カニクイザルの小脳の，抗ｈＴｆＲ抗体に対する免疫組織化学染色の結果を示す図面代用写真。（ａ）抗ｈＴｆＲ抗体を非投与，（ｂ）抗ｈＴｆＲ抗体番号３を投与。各写真の右下のバーは５０μｍを表すゲージである。

【図4】単回静脈内投与した後の，カニクイザルの脳以外の各種臓器へのヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の蓄積量を示す図。縦軸は，各臓器の湿重量当たりのヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の量（μｇ／ｇ湿重量）を示す。白バーは左から順に，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４），及びヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２（ＩｇＧ４）を，それぞれ投与，黒バーは，トラスツズマブ（ハーセプチン^ＴＭ）を投与したサルの各臓器での蓄積量を示す。ＮＤは未測定を意味する。

【図5】単回静脈内投与した後の，カニクイザルの大脳皮質の，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体に対する免疫組織化学染色の結果を示す図面代用写真。（ａ）ハーセプチンを投与，（ｂ）ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３を投与，（ｃ）ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２を投与，（ｄ）ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４）を投与，（ｅ）ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２（ＩｇＧ４）を投与。各写真の右下のバーは２０μｍを表すゲージである。

【図6】単回静脈内投与した後の，カニクイザルの海馬の，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体に対する免疫組織化学染色の結果を示す図。（ａ）ハーセプチンを投与，（ｂ）ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３を投与，（ｃ）ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２を投与，（ｄ）ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４）を投与，（ｅ）ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２（ＩｇＧ４）を投与。各写真の右下のバーは２０μｍを表すゲージである。

【図7】単回静脈内投与した後の，カニクイザルの小脳のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体に対する免疫組織化学染色の結果を示す図。（ａ）ハーセプチンを投与，（ｂ）ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３を投与，（ｃ）ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２を投与，（ｄ）ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４）を投与，（ｅ）ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２（ＩｇＧ４）を投与。各写真の右下のバーは２０μｍを表すゲージである。

【図8】単回静脈内投与した後の，カニクイザルの延髄の，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体に対する免疫組織化学染色の結果を示す図。（ａ）ハーセプチンを投与，（ｂ）ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３を投与，（ｃ）ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２を投与，（ｄ）ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４）を投与，（ｅ）ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２（ＩｇＧ４）を投与。各写真の右下のバーは２０μｍを表すゲージである。

【図9】ＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質を単回静脈内投与した後の，ｈＴｆＲ－ＫＩマウスの脳内濃度推移を示す図面。横軸は投与後の時間（時間），縦軸は脳のグラム重量（湿重量）当たりのＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質の濃度（ｎＭ，二量体換算）を示す。

【図10】ＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質を単回静脈内投与した後の，投与後３時間におけるカニクイザルの脳内の各部位におけるＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質の濃度（ｎＭ，二量体換算）を示す図面。

【図11】ＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質（ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤ）を単回静脈内投与した後の，ｈＴｆＲ－ＫＩマウスの脳内濃度推移を示す図面。横軸は投与後の時間（時間），縦軸は脳のグラム重量（湿重量）当たりのＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質の濃度（ｎＭ，二量体換算）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明において，「抗体」の語は，主としてヒト抗体，マウス抗体，ヒト化抗体，ヒト抗体と他の哺乳動物の抗体とのキメラ抗体，及びマウス抗体と他の哺乳動物の抗体とのキメラ抗体の何れかをいうが，特定の抗原に特異的に結合する性質を有するものである限り，これらに限定されるものではなく，また，抗体の動物種にも特に制限はない。但し，好ましいのは，ヒト化抗体である。

【0019】

本発明において，「ヒト抗体」の語は，その蛋白質全体がヒト由来の遺伝子にコードされている抗体をいう。但し，遺伝子の発現効率を上昇させる等の目的で，元のヒトの遺伝子に，元のアミノ酸配列に変化を与えることなく変異を加えた遺伝子にコードされる抗体も，「ヒト抗体」に含まれる。また，ヒト抗体をコードする２つ以上の遺伝子を組み合わせて，あるヒト抗体の一部を他のヒト抗体の一部に置き換えて作製した抗体も，「ヒト抗体」である。ヒト抗体は，免疫グロブリン軽鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）と免疫グロブリン重鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。免疫グロブリン軽鎖の３箇所のＣＤＲは，Ｎ末端側にあるものから順にＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３という。免疫グロブリン重鎖の３箇所のＣＤＲも，Ｎ末端側にあるものから順にＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３という。あるヒト抗体のＣＤＲを，その他のヒト抗体のＣＤＲに置き換えることにより，ヒト抗体の抗原特異性，親和性等を改変した抗体も，ヒト抗体に含まれる。

【0020】

本発明において，元のヒト抗体の遺伝子を改変することにより，元の抗体のアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の変異を加えた抗体も，「ヒト抗体」に含まれる。元の抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。元の抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えた抗体も，ヒト抗体である。アミノ酸を付加する場合，元の抗体のアミノ酸配列中若しくはＮ末端又はＣ末端に，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個のアミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えた抗体も，ヒト抗体である。変異を加えた抗体のアミノ酸配列は，元の抗体のアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。即ち，本発明において「ヒト由来の遺伝子」というときは，ヒト由来の元の遺伝子に加えて，これに改変を加えることにより得られる遺伝子も含まれる。

【0021】

本発明において，「マウス抗体」というときは，その蛋白質全体がマウス由来の遺伝子にコードされる抗体をいう。但し，遺伝子の発現効率を上昇させる等の目的で，元のマウスの遺伝子に，元のアミノ酸配列に変化を与えることなく変異を加えた遺伝子にコードされる抗体も，「マウス抗体」に含まれる。また，マウス抗体をコードする２つ以上の遺伝子を組み合わせて，あるマウス抗体の一部を他のマウス抗体の一部に置き換えた抗体も，マウス抗体に含まれる。マウス抗体は，免疫グロブリン軽鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）と免疫グロブリン重鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。免疫グロブリン軽鎖の３箇所のＣＤＲは，Ｎ末端側にあるものから順にＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３という。免疫グロブリン重鎖の３箇所のＣＤＲは，Ｎ末端側にあるものから順にＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３という。例えば，あるマウス抗体のＣＤＲを，他のマウス抗体のＣＤＲに置き換えることにより，マウス抗体の抗原特異性，親和性等を改変した抗体も，マウス抗体に含まれる。

【0022】

本発明において，元のマウス抗体の遺伝子を改変することにより，元の抗体のアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の変異を加えた抗体も，「マウス抗体」に含まれる。元の抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。元の抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えた抗体も，「マウス抗体」に含まれる。アミノ酸を付加する場合，元の抗体のアミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個のアミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えた抗体も，「マウス抗体」に含まれる。変異を加えた抗体のアミノ酸配列は，元の抗体のアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。即ち，本発明において「マウス由来の遺伝子」というときは，マウス由来の元の遺伝子に加えて，これに改変を加えることにより得られる遺伝子も含まれる。

【0023】

本発明において，「ヒト化抗体」の語は，可変領域の一部（例えば，特にＣＤＲの全部又は一部）のアミノ酸配列がヒト以外の哺乳動物由来であり，それ以外の領域がヒト由来である抗体のことをいう。例えば，ヒト化抗体として，ヒト抗体を構成する免疫グロブリン軽鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）と免疫グロブリン重鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）を，他の哺乳動物のＣＤＲに置き換えることによって作製された抗体が挙げられる。ヒト抗体の適切な位置に移植されるＣＤＲの由来となる他の哺乳動物の生物種は，ヒト以外の哺乳動物である限り特に限定はないが，好ましくは，マウス，ラット，ウサギ，ウマ，又はヒト以外の霊長類であり，より好ましくはマウス及びラットであり，更に好ましくはマウスである。

【0024】

本発明において，「キメラ抗体」の語は，２つ以上の異なる種に由来する，２つ以上の異なる抗体の断片が連結されてなる抗体のことをいう。

【0025】

ヒト抗体と他の哺乳動物の抗体とのキメラ抗体とは，ヒト抗体の一部がヒト以外の哺乳動物の抗体の一部によって置き換えられた抗体である。抗体は，以下に説明するＦｃ領域，Ｆａｂ領域及びヒンジ部とからなる。このようなキメラ抗体の具体例として，Ｆｃ領域がヒト抗体に由来する一方でＦａｂ領域が他の哺乳動物の抗体に由来するキメラ抗体が挙げられる。ヒンジ部は，ヒト抗体又は他の哺乳動物の抗体のいずれかに由来する。逆に，Ｆｃ領域が他の哺乳動物に由来する一方でＦａｂ領域がヒト抗体に由来するキメラ抗体が挙げられる。ヒンジ部は，ヒト抗体又は他の哺乳動物の抗体のいずれかに由来する。

【0026】

また，抗体は，可変領域と定常領域とからなるということもできる。キメラ抗体の他の具体例として，重鎖の定常領域（Ｃ_Ｈ）と軽鎖の定常領域（Ｃ_Ｌ）がヒト抗体に由来する一方で，重鎖の可変領域（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖の可変領域（Ｖ_Ｌ）が他の哺乳動物の抗体に由来するもの，逆に，重鎖の定常領域（Ｃ_Ｈ）と軽鎖の定常領域（Ｃ_Ｌ）が他の哺乳動物の抗体に由来する一方で，重鎖の可変領域（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖の可変領域（Ｖ_Ｌ）がヒト抗体に由来するものも挙げられる。ここで，他の哺乳動物の生物種は，ヒト以外の哺乳動物である限り特に限定はないが，好ましくは，マウス，ラット，ウサギ，ウマ，又はヒト以外の霊長類であり，例えばマウスである。

【0027】

マウス抗体と他の哺乳動物の抗体とのキメラ抗体とは，マウス抗体の一部がマウス以外の哺乳動物の抗体の一部に置き換えられた抗体である。このようなキメラ抗体の具体例として，Ｆｃ領域がマウス抗体に由来する一方でＦａｂ領域が他の哺乳動物の抗体に由来するキメラ抗体や，逆に，Ｆｃ領域が他の哺乳動物に由来する一方でＦａｂ領域がマウス抗体に由来するキメラ抗体が挙げられる。ここで，他の哺乳動物の生物種は，好ましくはヒトである。

【0028】

ヒト抗体とマウス抗体のキメラ抗体は，特に，「ヒト／マウスキメラ抗体」という。ヒト／マウスキメラ抗体には，Ｆｃ領域がヒト抗体に由来する一方でＦａｂ領域がマウス抗体に由来するキメラ抗体や，逆に，Ｆｃ領域がマウス抗体に由来する一方でＦａｂ領域がヒト抗体に由来するキメラ抗体が挙げられる。ヒンジ部は，ヒト抗体又はマウス抗体のいずれかに由来する。ヒト／マウスキメラ抗体の他の具体例として，重鎖の定常領域（Ｃ_Ｈ）と軽鎖の定常領域（Ｃ_Ｌ）がヒト抗体に由来する一方で，重鎖の可変領域（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖の可変領域（Ｖ_Ｌ）がマウス抗体に由来するもの，逆に，重鎖の定常領域（Ｃ_Ｈ）と軽鎖の定常領域（Ｃ_Ｌ）がマウス抗体に由来する一方で，重鎖の可変領域（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖の可変領域（Ｖ_Ｌ）がヒト抗体に由来するものも挙げられる。

【0029】

抗体は，本来，２本の免疫グロブリン軽鎖と２本の免疫グロブリン重鎖の計４本のポリペプチド鎖からなる基本構造を有する。但し，本発明において，「抗体」というときは，この基本構造を有するものに加え，
（１）１本の免疫グロブリン軽鎖と１本の免疫グロブリン重鎖の計２本のポリペプチド鎖からなるものや，以下に詳述するように，
（２）免疫グロブリン軽鎖のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に免疫グロブリン重鎖を結合させてなるものである一本鎖抗体，及び
（３）免疫グロブリン重鎖のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に免疫グロブリン軽鎖を結合させてなるものである一本鎖抗体も含まれる。また，
（４）本来の意味での抗体の基本構造からＦｃ領域が欠失したものであるＦａｂ領域からなるもの及びＦａｂ領域とヒンジ部の全部若しくは一部とからなるもの（Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）_２を含む）も，本発明における「抗体」に含まれる。

【0030】

ここでＦａｂとは，可変領域とＣ_Ｌ領域（軽鎖の定常領域）を含む軽鎖と，可変領域とＣ_Ｈ１領域（重鎖の定常領域の部分１）を含む重鎖が，それぞれに存在するシステイン残基同士でジスルフィド結合により結合した分子のことをいう。Ｆａｂにおいて，重鎖は，可変領域とＣ_Ｈ１領域（重鎖の定常領域の部分１）に加えて，更にヒンジ部の一部を含んでもよいが，この場合のヒンジ部は，ヒンジ部に存在して抗体の重鎖どうしを結合するシステイン残基を欠くものである。Ｆａｂにおいて，軽鎖と重鎖とは，軽鎖の定常領域（Ｃ_Ｌ領域）に存在するシステイン残基と，重鎖のＣ_Ｈ１領域又はヒンジ部に存在するシステイン残基との間で形成されるジスルフィド結合により結合する。Ｆａｂを形成する重鎖のことを，本明細書において「Ｆａｂ重鎖」という。Ｆａｂは，ヒンジ部に存在して抗体の重鎖どうしを結合するシステイン残基を欠いており，１本の軽鎖と１本の重鎖とからなる。Ｆ（ａｂ’）においては，その重鎖は可変領域とＣ_Ｈ１領域に加えて，重鎖どうしを結合するシステイン残基を含むヒンジ部の全部または一部を含む。Ｆ（ａｂ’）_２は２つのＦ（ａｂ’）が互いのヒンジ部に存在するシステイン残基同士でジスルフィド結合により結合した分子のことをいう。Ｆ（ａｂ’）又はＦ（ａｂ’）_２を形成する重鎖のことを，本明細書において「Ｆａｂ’重鎖」という。また，複数の抗体が直接又はリンカーを介して結合したものである，ニ量体，三量体等の重合体も抗体である。更に，これらに限らず，免疫グロブリン分子の一部を含み，且つ，抗原に特異的に結合する性質を有するものは何れも，本発明でいう「抗体」に含まれる。即ち，本発明において免疫グロブリン軽鎖というときは，免疫グロブリン軽鎖に由来し，その可変領域の全て又は一部のアミノ酸配列を有するものが含まれる。また，免疫グロブリン重鎖というときは，免疫グロブリン重鎖に由来し，その可変領域の全て又は一部のアミノ酸配列を有するものが含まれる。従って，可変領域の全て又は一部のアミノ酸配列を有する限り，例えば，Ｆｃ領域が欠失したものも，免疫グロブリン重鎖である。

【0031】

また，ここでＦｃ又はＦｃ領域とは，抗体分子中の，Ｃ_Ｈ２領域（重鎖の定常領域の部分２），及びＣ_Ｈ３領域（重鎖の定常領域の部分３）からなる断片を含む領域のことをいう。Ｆｃ又はＦｃ領域は，Ｃ_Ｈ２領域とＣ_Ｈ３領域に加えて，ヒンジ部の一部を含んでもよい。

【0032】

更には，本発明において，「抗体」というときは，
（５）上記（４）で示したＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）又はＦ（ａｂ’）_２を構成する軽鎖と重鎖を，リンカー配列を介して結合させて，それぞれ一本鎖抗体としたｓｃＦａｂ，ｓｃＦ（ａｂ’），及びｓｃＦ（ａｂ’）_２も含まれる。ここで，ｓｃＦａｂ，ｓｃＦ（ａｂ’），及びｓｃＦ（ａｂ’）_２にあっては，軽鎖のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に重鎖を結合させてなるものでもよく，また，重鎖のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に軽鎖を結合させてなるものでもよい。更には，軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域をリンカー配列を介して結合させて一本鎖抗体としたｓｃＦｖも，本発明における抗体に含まれる。ｓｃＦｖにあっては，軽鎖の可変領域のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に重鎖の可変領域を結合させてなるものでもよく，また，重鎖の可変領域のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に軽鎖の可変領域を結合させてなるものでもよい。

【0033】

更には，本明細書でいう「抗体」には，完全長抗体，上記（１）～（３）に示されるものに加えて，上記（４）及び（５）を含む概念である完全長抗体の一部が欠損している抗原結合性断片（抗体フラグメント）のいずれの形態も含まれる。

【0034】

「抗原結合性断片」という用語は，抗原との特異的結合活性の少なくとも一部を保持している抗体の断片のことをいう。結合性断片の例としては，例えば上記（４）及び（５）に示されるものに加えて，可変領域（Ｆｖ），重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）と軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）とを適当なリンカーで連結させた一本鎖抗体（ｓｃＦｖ），重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）と軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含むポリペプチドの二量体であるダイアボディ，ｓｃＦｖの重鎖（Ｈ鎖）に定常領域の一部（Ｃ_Ｈ３）が結合したものの二量体であるミニボディ，その他の低分子化抗体等を包含する。但し，抗原との結合能を有している限りこれらの分子に限定されない。また，これらの結合性断片には，抗体蛋白質の全長分子を適当な酵素で処理したもののみならず，遺伝子工学的に改変された抗体遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された蛋白質も含まれる。

【0035】

本発明において，「一本鎖抗体」というときは，免疫グロブリン軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列のＣ末端側にリンカー配列が結合し，更にそのＣ末端側に免疫グロブリン重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列が結合してなり，特定の抗原に特異的に結合することのできる蛋白質をいう。例えば，上記（２），（３）及び（５）に示されるものは一本鎖抗体に含まれる。また，免疫グロブリン重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列のＣ末端側にリンカー配列が結合し，更にそのＣ末端側に免疫グロブリン軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列が結合してなり，特定の抗原に特異的に結合することのできる蛋白質も，本発明における「一本鎖抗体」である。免疫グロブリン重鎖のＣ末端側にリンカー配列を介して免疫グロブリン軽鎖が結合した一本鎖抗体にあっては，通常，免疫グロブリン重鎖は，Ｆｃ領域が欠失している。免疫グロブリン軽鎖の可変領域は，抗体の抗原特異性に関与する相補性決定領域（ＣＤＲ）を３つ有している。同様に，免疫グロブリン重鎖の可変領域も，ＣＤＲを３つ有している。これらのＣＤＲは，抗体の抗原特異性を決定する主たる領域である。従って，一本鎖抗体には，免疫グロブリン重鎖の３つのＣＤＲが全てと，免疫グロブリン軽鎖の３つのＣＤＲの全てとが含まれることが好ましい。但し，抗体の抗原特異的な親和性が維持される限り，ＣＤＲの１個又は複数個を欠失させた一本鎖抗体とすることもできる。

【0036】

一本鎖抗体において，免疫グロブリンの軽鎖と重鎖との間に配置されるリンカー配列は，好ましくは２～５０個，より好ましくは８～５０個，更に好ましくは１０～３０個，更により好ましくは１２～１８個又は１５～２５個，例えば１５個若しくは２５個のアミノ酸残基から構成されるペプチド鎖である。そのようなリンカー配列は，これにより両鎖が連結されてなる抗ｈＴｆＲ抗体がｈＴｆＲに対する親和性を保持する限り，そのアミノ酸配列に限定はないが，好ましくは，グリシンのみ又はグリシンとセリンから構成されるものである。例えば，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号３），アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号４），アミノ酸配列Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号５），又はこれらのアミノ酸配列の２～１０個或いは２～５個が連続したものに相当する配列を含むものが挙げられる。例えば，免疫グロブリン重鎖の可変領域の全領域からなるアミノ酸配列のＣ末端側にリンカー配列を介して免疫グロブリン軽鎖の可変領域を結合させる場合，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号３）の３個が連続したものに相当する計１５個のアミノ酸からなるリンカー配列を含むものが好適である。

【0037】

本発明において，「ヒトトランスフェリン受容体」又は「ｈＴｆＲ」の語は，配列番号１のアミノ酸配列を有する膜蛋白質である。本発明の一実施態様において，ＢＤＮＦと融合させるべき抗ｈＴｆＲ抗体は，配列番号１のアミノ酸配列中Ｎ末端から８９番目のシステイン残基からＣ末端のフェニルアラニンまでの部分（ｈＴｆＲの細胞外領域）に対して特異的に結合するものであるが，これに限定されない。また，本発明において「サルトランスフェリン受容体」又は「サルＴｆＲ」の語は，特に，カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）由来の，配列番号２のアミノ酸配列を有する膜蛋白質である。本発明の抗ｈＴｆＲ抗体は，その一実施態様において，配列番号２のアミノ酸配列の中で，Ｎ末端から８９番目のシステイン残基からＣ末端のフェニルアラニンまでの部分（サルＴｆＲの細胞外領域）に対しても結合するものであるが，これに限定されない。

【0038】

ｈＴｆＲに対する抗体の作製方法としては，ｈＴｆＲ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した細胞を用いて，組換えヒトトランスフェリン受容体（ｒｈＴｆＲ）を作製し，このｒｈＴｆＲを用いてマウス等の動物を免疫して得る方法が一般的である。免疫後の動物からｈＴｆＲに対する抗体産生細胞を取り出し，これとミエローマ細胞とを融合させることにより，抗ｈＴｆＲ抗体産生能を有するハイブリドーマ細胞を作製することができる。

【0039】

また，マウス等の動物より得た免疫系細胞を体外免疫法によりｒｈＴｆＲで免疫することによっても，ｈＴｆＲに対する抗体を産生する細胞を取得できる。体外免疫法を用いる場合，その免疫系細胞が由来する動物種に特に限定はないが，好ましくは，マウス，ラット，ウサギ，モルモット，イヌ，ネコ，ウマ，及びヒトを含む霊長類であり，より好ましくは，マウス，ラット及びヒトであり，更に好ましくはマウス及びヒトである。マウスの免疫系細胞としては，例えば，マウスの脾臓から調製した脾細胞を用いることができる。ヒトの免疫系細胞としては，ヒトの末梢血，骨髄，脾臓等から調製した細胞を用いることができる。ヒトの免疫系細胞を体外免疫法により免疫した場合，ｈＴｆＲに対するヒト抗体を得ることができる。

【0040】

体外免疫法により免疫系細胞を免疫した後，細胞をミエローマ細胞と融合させることにより，抗体産生能を有するハイブリドーマ細胞を作製することができる。また，免疫後の細胞からｍＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成し，このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応により免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅し，これらを用いて人工的に抗体遺伝子を再構築することもできる。

【0041】

上記方法により得られたままのハイブリドーマ細胞には，ｈＴｆＲ以外の蛋白質を抗原として認識する抗体を産生する細胞も含まれる。また，抗ｈＴｆＲ抗体を産生するハイブリドーマ細胞の全てが，ｈＴｆＲに対して高親和性を示す抗ｈＴｆＲ抗体を産生するとも限らない。

【0042】

同様に，人工的に再構築した抗体遺伝子には，ｈＴｆＲ以外の蛋白質を抗原として認識する抗体をコードする遺伝子も含まれる。また，抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子の全てが，ｈＴｆＲに対して高親和性を示す抗ｈＴｆＲ抗体をコードする等の所望の特性を備えるとも限らない。

【0043】

従って，上記で得られたままのハイブリドーマ細胞から，所望の特性（ｈＴｆＲに対する高親和性等）を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択するステップが必要となる。また，人工的に再構築した抗体遺伝子にあっては，当該抗体遺伝子から，所望の特性（ｈＴｆＲに対する高親和性等）を有する抗体をコードする遺伝子を選択するステップが必要となる。ｈＴｆＲに対して高親和性を示す抗体（高親和性抗体）を産生するハイブリドーマ細胞，又は高親和性抗体をコードする遺伝子を選択する方法として，以下に詳述する方法が有効である。なお，ｈＴｆＲに対して高親和性を示す抗体とは，実施例７に記載の方法により測定されるｈＴｆＲとの解離定数（Ｋ_Ｄ）が，好ましくは１×１０^－８Ｍ以下のものであり，より好ましくは１×１０^－９Ｍ以下のものであり，更に好ましくは１×１０^－１０Ｍ以下のものであり，尚も更に好ましくは１×１０^－１１Ｍ以下のものである。例えば好適なものとして，解離定数が１×１０^－１３Ｍ～１×１０^－９Ｍであるもの，１×１０^－１３Ｍ～１×１０^－１０Ｍであるものを挙げることができる。

【0044】

例えば，ｈＴｆＲに対して高親和性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択する場合，組換えｈＴｆＲをプレートに添加してこれに保持させた後，ハイブリドーマ細胞の培養上清を添加し，次いで組換えｈＴｆＲと結合していない抗体をプレートから除去し，プレートに保持された抗体の量を測定する方法が用いられる。この方法によれば，プレートに添加したハイブリドーマ細胞の培養上清に含まれる抗体のｈＴｆＲに対する親和性が高いほど，プレートに保持される抗体の量が多くなる。従って，プレートに保持された抗体の量を測定し，より多くの抗体が保持されたプレートに対応するハイブリドーマ細胞を，ｈＴｆＲに対して相対的に高い親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体を産生する細胞株として選択することができる。この様にして選択された細胞株から，ｍＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成し，このｃＤＮＡを鋳型として，抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法を用いて増幅することにより，高親和性抗体をコードする遺伝子を単離することもできる。

【0045】

上記の人工的に再構築した抗体遺伝子から，高親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を選択する場合は，一旦，人工的に再構築した抗体遺伝子を発現ベクターに組み込み，この発現ベクターをホスト細胞に導入する。このとき，ホスト細胞として用いる細胞としては，人工的に再構築した抗体遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入することにより抗体遺伝子を発現させることのできる細胞であれば原核細胞，真核細胞を問わず特に限定はないが，ヒト，マウス，チャイニーズハムスター等の哺乳動物由来の細胞が好ましく，特にチャイニーズハムスター卵巣由来のＣＨＯ細胞，又はマウス骨髄腫に由来するＮＳ／０細胞が好ましい。また，抗体遺伝子をコードする遺伝子を組み込んで発現させるために用いる発現ベクターは，哺乳動物細胞内に導入させたときに，該遺伝子を発現させるものであれば特に限定なく用いることができる。発現ベクターに組み込まれた該遺伝子は，哺乳動物細胞内で遺伝子の転写の頻度を調節することができるＤＮＡ配列（遺伝子発現制御部位）の下流に配置される。本発明において用いることのできる遺伝子発現制御部位としては，例えば，サイトメガロウイルス由来のプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，ヒト伸長因子－１アルファ（ＥＦ－１α）プロモーター，ヒトユビキチンＣプロモーター等が挙げられる。

【0046】

このような発現ベクターが導入された哺乳動物細胞は，発現ベクターに組み込まれた上述の人工的に再構築した抗体を発現するようになる。このようにして得た，人工的に再構築した抗体を発現する細胞から，ｈＴｆＲに対して高親和性を有する抗体を産生する細胞を選択する場合，組換えｈＴｆＲをプレートに添加してこれに保持させた後，組換えｈＴｆＲに細胞の培養上清を接触させ，次いで，組換えｈＴｆＲと結合していない抗体をプレートから除去し，プレートに保持された抗体の量を測定する方法が用いられる。この方法によれば，細胞の培養上清に含まれる抗体のｈＴｆＲに対する親和性が高いほど，プレートに保持された抗体の量が多くなる。従って，プレートに保持された抗体の量を測定し，より多くの抗体が保持されたプレートに対応する細胞を，ｈＴｆＲに対して相対的に高い親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体を産生する細胞株として選択することができ，ひいては，ｈＴｆＲに対して高親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を選択できる。このようにして選択された細胞株から，抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を，ＰＣＲ法を用いて増幅することにより，高親和性抗体をコードする遺伝子を単離することができる。

【0047】

上記の人工的に再構築した抗体遺伝子からの，高親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子の選択は，人工的に再構築した抗体遺伝子を発現ベクターに組み込み，この発現ベクターを大腸菌に導入し，この大腸菌を培養して得た培養上清又は大腸菌を溶解させて得た抗体を含む溶液を用いて，上述のハイブリドーマ細胞を選択する場合と同様の方法で，所望の遺伝子を有する大腸菌を選択することによってもできる。選択された大腸菌株は，ｈＴｆＲに対して相対的に高い親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を発現するものである。この細胞株から，ｈＴｆＲに対して相対的に高い親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を選択できる。大腸菌の培養上清中に抗体を分泌させる場合には，Ｎ末端側に分泌シグナル配列が結合するように抗体遺伝子を発現ベクターに組み込めばよい。

【0048】

高親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を選択する他の方法として，上述の人工的に再構築した抗体遺伝子にコードされた抗体をファージ粒子上に保持させて発現させる方法がある。このとき，抗体遺伝子は，一本鎖抗体をコードする遺伝子として再構築される。抗体をファージ粒子上に保持する方法は，国際公開公報（ＷＯ１９９７／０９４３６，ＷＯ１９９５／１１３１７）等に記載されており，周知である。人工的に再構築した抗体遺伝子にコードされた抗体を保持するファージから，ｈＴｆＲに対して高親和性を有する抗体を保持するファージを選択する場合，組換えｈＴｆＲを，プレートに添加して保持させた後，ファージを接触させ，次いでプレートから組換えｈＴｆＲと結合していないファージを除去し，プレートに保持されたファージの量を測定する方法が用いられる。この方法によれば，ファージ粒子上に保持された抗体のｈＴｆＲに対する親和性が高いほど，プレートに保持されたファージの量が多くなる。従って，プレートに保持されたファージの量を測定し，より多くのファージが保持されたプレートに対応するファージ粒子を，ｈＴｆＲに対して相対的に高い親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体を産生するファージ粒子として選択することができ，ひいては，ｈＴｆＲに対して高親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を選択できる。このようにして選択されたファージ粒子から，抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を，ＰＣＲ法を用いて増幅することにより，高親和性抗体をコードする遺伝子を単離することができる。

【0049】

酵素免疫測定法（ＥＩＡ，ＥＬＩＳＡ）を用いた直接及び間接サンドイッチアッセイ，フローサイトメトリー，表面プラズモン共鳴法（以下「ＳＰＲ法」という），バイオレイヤー干渉法（以下「ＢＬＩ法」という），又は免疫沈降アッセイ等の周知の結合アッセイを用い，ｈＴｆＲに対して高親和性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択することができる。当該高親和性抗体産生細胞からｃＤＮＡを調製し，これを鋳型として，抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖，又は抗ｈＴｆＲ抗体である一本鎖抗体の，全て又はその一部をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を，ＰＣＲ法等により増幅して単離することができる。同様にして，抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖の可変領域の全て又はその一部をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖の可変領域の全て又はその一部をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を，ＰＣＲ法等により増幅して単離することもできる。

【0050】

この高親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子の全てまたはその一部を，発現ベクターに組み込み，この発現ベクターを用いて哺乳動物細胞等のホスト細胞を形質転換し，得られた形質転換細胞を培養することにより，高親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体を産生させることができる。単離された抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子の塩基配列から抗ｈＴｆＲ抗体のアミノ酸配列を翻訳し，このアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を人工的に合成することもできる。ＤＮＡ断片を人工的に合成する場合，適切なコドンを選択することにより，ホスト細胞における抗ｈＴｆＲ抗体の発現量を増加させることもできる。

【0051】

元の抗ｈＴｆＲ抗体にアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の変異を加えるために，単離されたＤＮＡ断片に含まれる抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子に，適宜変異を加えることもできる。変異を加えた後の抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子は，元の遺伝子と，好ましくは８０％以上の相同性を有するものであり，より好ましくは９０％以上の相同性を有するものであるが，相同性に特に制限はない。アミノ酸配列に変異を加えることにより，抗ｈＴｆＲ抗体と結合する糖鎖の数，糖鎖の種類を改変し，生体内における抗ｈＴｆＲ抗体の安定性を増加させることもできる。

【0052】

抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖の可変領域の全て又はその一部をコードする遺伝子に変異を加える場合にあっては，変異を加えた後の遺伝子は，元の遺伝子と，好ましくは８０％以上の相同性を有するものであり，より好ましくは９０％以上の相同性を有するものであるが，相同性に特に制限はない。軽鎖の可変領域のアミノ酸配列のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個，更により好ましくは１～２個である。軽鎖の可変領域のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個であり，より好ましくは１～５個であり，更に好ましくは１～３個であり，更により好ましくは１～２個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。軽鎖の可変領域にアミノ酸を付加する場合，軽鎖の可変領域のアミノ酸配列中若しくはＮ末端又はＣ末端に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個，更により好ましくは１～２個アミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は，元の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を有し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示す。特に，ＣＤＲのアミノ酸配列のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１～５個，より好ましくは１～３個，更に好ましくは１～２個であり，更により好ましくは１個である。ＣＤＲのアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～５個であり，より好ましくは１～３個であり，更に好ましくは１～２個であり，更により好ましくは１個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。アミノ酸を付加する場合，当該アミノ酸配列中若しくはＮ末端又はＣ末端に，好ましくは１～５個，より好ましくは１～３個，更に好ましくは１～２個，更により好ましくは１個のアミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた各ＣＤＲのアミノ酸配列は，元の各ＣＤＲのアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を有し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示す。

【0053】

抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖の可変領域の全て又はその一部をコードする遺伝子に変異を加える場合にあっては，変異を加えた後の遺伝子は，元の遺伝子と，好ましくは８０％以上の相同性を有するものであり，より好ましくは９０％以上の相同性を有するものであるが，相同性に特に制限はない。重鎖の可変領域のアミノ酸配列のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個，尚も更に好ましくは１～２個である。重鎖の可変領域のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個，尚も更に好ましくは１～２個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。重鎖の可変領域にアミノ酸を付加する場合，重鎖の可変領域のアミノ酸配列中若しくはＮ末端又はＣ末端に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個，更により好ましくは１～２個アミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた重鎖の可変領域のアミノ酸配列は，元の重鎖の可変領域のアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を有し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示す。特に，ＣＤＲのアミノ酸配列のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１～５個であり，より好ましくは１～３個であり，更に好ましくは１～２個であり，更により好ましくは１個である。ＣＤＲのアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～５個であり，より好ましくは１～３個であり，更に好ましくは１～２個であり，更により好ましくは１個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。アミノ酸を付加する場合，当該アミノ酸配列中若しくはＮ末端又はＣ末端に，好ましくは１～５個，より好ましくは１～３個，更に好ましくは１～２個，更により好ましくは１個のアミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた各ＣＤＲのアミノ酸配列は，元の各ＣＤＲのアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を有し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示す。

【0054】

上記の抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖の可変領域への変異と，上記の抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖の可変領域への変異とを組み合わせて，抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖と重鎖の可変領域の両方に変異を加えることもできる。

【0055】

上記の抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列中のアミノ酸の他のアミノ酸による置換としては，例えば，芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ），脂肪族アミノ酸（Ａｌａ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ），極性アミノ酸（Ｇｌｎ，Ａｓｎ），塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｈｉｓ），酸性アミノ酸（Ｇｌｕ，Ａｓｐ），水酸基を有するアミノ酸（Ｓｅｒ，Ｔｈｒ）などの同じグループに分類されるアミノ酸間の置換が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は，蛋白質の表現型に変化をもたらさない（即ち，保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。

【0056】

なお，抗ｈＴｆＲ抗体に変異を加えてＣ末端又はＮ末端にアミノ酸を付加した場合において，その付加したアミノ酸が，抗ｈＴｆＲ抗体をＢＤＮＦと融合させたときに抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとの間に位置することとなった場合，当該付加したアミノ酸は，リンカーの一部を構成する。抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとの融合蛋白質において，抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとの間に配置されるリンカー配列については後に詳述する。

【0057】

上記の方法等によって選択されたｈＴｆＲに対して比較的高い親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体を産生する細胞を培養して得られる抗ｈＴｆＲ抗体，及び，高親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を発現させて得られる抗ｈＴｆＲ抗体は，そのアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の変異を導入することにより所望の特性を有する抗体に改変させることもできる。抗ｈＴｆＲ抗体のアミノ酸配列への変異の導入は，そのアミノ酸配列に対応する遺伝子に変異を加えることによって行われる。

【0058】

抗ｈＴｆＲ抗体は，その抗体の可変領域のアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の変異を加えることにより，抗体のｈＴｆＲに対する親和性を適宜調整することができる。例えば，抗体と抗原との親和性が高く，水性液中での解離定数が著しく低い場合，これを生体内に投与したときに，抗体が抗原と解離せず，その結果，機能上の不都合が生じる可能性がある。このような場合に，抗体の可変領域に変異を導入することにより，解離定数を，元の抗体の２～５倍，５～１０倍，１０～１００倍等と段階的に調整し，目的に合致した最も好ましい抗体を獲得し得る。逆に，当該変異の導入により，解離定数を，元の抗体の１／２～１／５倍，１／５～１／１０倍，１／１０～１／１００倍等と段階的に調整することもできる。

【0059】

抗ｈＴｆＲ抗体のアミノ酸配列への置換，欠失，付加等の変異の導入は，例えば，抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を鋳型にして，ＰＣＲ等の方法により，遺伝子の塩基配列の特定の部位に変異を導入するか，又はランダムに変異を導入することにより行う。

【0060】

抗体とｈＴｆＲとの親和性の調整を目的とした，抗ｈＴｆＲ抗体のアミノ酸配列への変異の導入は，例えば，一本鎖抗体である抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子をファージミドに組み込み，このファージミドを用いてカプシド表面上に一本鎖抗体を発現させたファージを作製し，変異原等を作用させることにより一本鎖抗体をコードする遺伝子上に変異を導入させながらファージを増殖させ，増殖させたファージから，所望の解離定数を有する一本鎖抗体を発現するファージを，上述の方法により選択するか，又は一定条件下で抗原カラムを用いて精製することにより，得ることができる。

【0061】

前記ハイブリドーマ細胞により産生される抗体は，実施例７に記載の方法により測定されるｈＴｆＲとの解離定数（Ｋ_Ｄ）が，好ましくは１×１０^－８Ｍ以下であるものであり，より好ましくは１×１０^－９Ｍ以下であるものであり，更に好ましくは１×１０^－１０Ｍ以下のものであり，尚も更に好ましくは１×１０^－１１Ｍ以下のものである。例えば好適なものとして，解離定数が１×１０^－１３Ｍ～１×１０^－９Ｍであるもの，１×１０^－１３Ｍ～１×１０^－１０Ｍであるものを挙げることができる。抗体が一本鎖抗体であっても同様である。一旦得られた抗体は，その抗体をコードする遺伝子に変異を導入する等して，所望の特性を有するように適宜改変することができる。

【0062】

上記のようにして得られる抗ｈＴｆＲ抗体から，サルＴｆＲに対する親和性を有する抗体を選択することにより，ヒト及びサルのＴｆＲの何れにも親和性を有する抗体を得ることができる。サルＴｆＲに対する親和性を有する抗体は，例えば，遺伝子組換え技術を用いて作製した組換えサルＴｆＲを用いたＥＬＩＳＡ法等により選択することができる。このＥＬＩＳＡ法では，組換えサルＴｆＲをプレートに添加してこれに保持させた後，抗ｈＴｆＲ抗体を接触させ，次いで組換えサルＴｆＲと結合していない抗体をプレートから除去し，プレートに保持された抗体の量を測定する。組換えサルＴｆＲに対する親和性が高いほどプレートに保持される抗体の量が多くなるので，より多くの抗体が保持されたプレートに対応する抗体を，サルＴｆＲに親和性を有する抗体として選択することができる。なお，ここでいう「サル」とは，好ましくはヒトを除く真猿類に分類されるものであり，より好ましくはオナガザル科に分類されるものであり，更に好ましくはマカク属に分類されるものであり，例えば，カニクイザル又はアカゲザルであり，特にカニクイザルは，評価に用いる上で都合が良い。

【0063】

ヒト及びサルのｈＴｆＲのいずれにも親和性を有する抗体は，この抗体とＢＤＮＦとの融合蛋白質を投与したときの生体内での動態を，サルを用いて観察できるという有利な効果を有する。例えば，本発明の抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦの融合蛋白質を医薬開発する場合，当該医薬の薬物動態試験をサルで実施できるため，当該医薬の開発を著しく促進することができる。

【0064】

本発明において，ｈＴｆＲに対して相対的に高い親和性を有し且つサルＴｆＲに対しても親和性を有する抗体は，特に，実施例７に記載の方法により測定したとき，ヒト及びサルのＴｆＲとの解離定数が次のものである：
（ａ）ｈＴｆＲとの解離定数：好ましくは１×１０^－１０Ｍ以下，より好ましくは２．５×１０^－１１Ｍ以下，更に好ましくは５×１０^－１２Ｍ以下，更により好ましくは１×１０^－１２Ｍ以下，
（ｂ）サルＴｆＲとの解離定数：好ましくは１×１０^－９Ｍ以下，より好ましくは５×１０^－１０Ｍ以下，更に好ましくは１×１０^－１０Ｍ以下，例えば７．５×１０^－１１Ｍ以下。

【0065】

例えば，ｈＴｆＲ及びサルＴｆＲとの解離定数が，それぞれ，１×１０^－１０Ｍ以下と１×１０^－９Ｍ以下，１×１０^－１１Ｍ以下と５×１０^－１０Ｍ以下，５×１０^－１２Ｍ以下と１×１０^－１０Ｍ以下，５×１０^－１２Ｍ以下と７．５×１０^－１１Ｍ以下，１×１０^－１２Ｍ以下と１×１０^－１０Ｍ以下，１×１０^－１２Ｍ以下と７．５×１０^－１１Ｍ以下，であるものが挙げられる。ここにおいて，ヒトのＴｆＲとの解離定数に特段明確な下限はないが，例えば，５×１０^－１３Ｍ，１×１０^－１３Ｍ等とすることができる。また，サルのＴｆＲとの解離定数にも特段明確な下限はないが，例えば，１×１０^－１１Ｍ，１×１０^－１２Ｍ等とすることができる。抗体が一本鎖抗体であっても同様である。

【0066】

上記の高親和性抗体を産生する細胞を選択する方法により得られた，ｈＴｆＲに対して相対的に高い親和性を有する抗体は，ヒト以外の動物の抗体である場合，ヒト化抗体とすることができる。ヒト化抗体とは，抗原に対する特異性を維持しつつ，ヒト以外の動物の抗体の可変領域の一部（例えば，特にＣＤＲの全部又は一部）のアミノ酸配列を用い，ヒト抗体の適切な領域を，当該配列で置き換えること（ヒト抗体への当該配列の移植）により得られる抗体のことである。例えば，ヒト化抗体として，ヒト抗体を構成する免疫グロブリン軽鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）と免疫グロブリン重鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）を，他の哺乳動物のＣＤＲで置き換えた抗体が挙げられる。ヒト抗体に組み込まれるＣＤＲが由来する生物種は，ヒト以外の哺乳動物である限り特に限定はないが，好ましくは，マウス，ラット，ウサギ，ウマ，ヒト以外の霊長類であり，より好ましくはマウス及びラットであり，更に好ましくはマウスである。但し，ヒト抗体の一部を他のヒト抗体の一部で置き換えた抗体とすることもできる。

【0067】

ヒト化抗体の作製法は，当該技術分野で周知であり，ウインター（Ｗｉｎｔｅｒ）らが考案した，ヒト抗体の可変領域にある相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を，非ヒト哺乳動物の抗体のＣＤＲに置き換える方法（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ Ｍ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２３９． １５３４－１５３６ （１９８８））に基づくものが，最も一般的である。ここで，非ヒト哺乳動物の抗体のＣＤＲのみならず，ＣＤＲの構造保持あるいは抗原との結合に関与しているＣＤＲ外の領域のアミノ酸配列により，アクセプターとなるヒト抗体の対応する箇所を置き換えることが，ドナー抗体の持つ本来の活性を再現するために必要である場合があることも周知である（Ｑｕｅｅｎ Ｃ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ８６． １００２９－１００３３ （１９８９））。ここで，ＣＤＲ外の領域は，フレームワーク領域（ＦＲ）ともいう。

【0068】

抗体の重鎖と軽鎖の可変領域はいずれも，４個のフレームワーク領域１～４（ＦＲ１～４）を含む。ＦＲ１は，ＣＤＲ１にそのＮ末端側で隣接する領域であり，重鎖及び軽鎖を構成する各ペプチドにおいて，そのＮ末端からＣＤＲ１のＮ末端に隣接するアミノ酸までのアミノ酸配列からなる。ＦＲ２は，重鎖及び軽鎖を構成する各ペプチドにおいて，ＣＤＲ１とＣＤＲ２との間のアミノ酸配列からなる。ＦＲ３は，重鎖及び軽鎖を構成する各ペプチドにおいて，ＣＤＲ２とＣＤＲ３との間のアミノ酸配列からなる。ＦＲ４は，ＣＤＲ３のＣ末端に隣接するアミノ酸から可変領域のＣ末端までのアミノ酸配列からなる。但し，これに限らず，本発明においては，上記の各ＦＲ領域において，そのＮ末端側の１～５個のアミノ酸及び／又はＣ末端側の１～５個のアミノ酸を除いた領域を，フレームワーク領域とすることもできる。

【0069】

ヒト化抗体の作製は，ヒト抗体の可変領域ＣＤＲ（と場合によりその周辺のＦＲ）に代えて，非ヒト哺乳動物の抗体のＣＤＲ（と場合によりその周辺のＦＲ）を移植する作業を含む。この作業において，元となるヒト抗体の可変領域のフレームワーク領域は，生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公共のＤＮＡデータベース等から得ることができる。例えば，ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は，「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系配列データベース（インターネットにおいてｗｗｗ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅで入手可能）から選択することができる。この他，公表された文献，例えば「Ｋａｂａｔ ＥＡ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， 米国保健福祉省， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１－３２４２ （１９９１）」， 「Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ＩＭ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７． ７７６－９８ （１９９２）」，「Ｃｏｘ ＪＰＬ． Ｅｕｒ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４：８２７－８３６ （１９９４）」等に記載されたＤＮＡ配列及びアミノ酸配列から選択することもできる。

【0070】

以上のように，ヒト化抗体において，元のヒト抗体の可変領域に移植される非ヒト哺乳動物の抗体は領域は，一般に，ＣＤＲそれ自体，又はＣＤＲとの周辺のＦＲを含む。但し，ＣＤＲとともに移植されるＦＲも，ＣＤＲの構造保持あるいは抗原との結合に関与しており，実質的に抗体の相補性を決定する機能を有すると考えられることから，本発明において「ＣＤＲ」の語は，ヒト化抗体を作製する場合に，非ヒト哺乳動物の抗体からヒト化抗体に移植される領域，又は移植され得る領域のことをいう。即ち，ＣＤＲには，一般にＦＲとされる領域であっても，それがＣＤＲの構造保持あるいは抗原との結合に関与しており，実質的に抗体の相補性を決定する機能を有していると考えられるものである限り，本発明においてはＣＤＲに含まれる。

【0071】

本発明における抗ｈＴｆＲ抗体は，これを静脈注射等により生体内に投与した場合，脳内の毛細血管の内皮細胞上に存在するｈＴｆＲに効率良く結合することができる。また，ｈＴｆＲと結合した抗体は，エンドサイトーシス，トランスサイトーシス等の機構により血液脳関門を通過して脳内に取り込まれる。従って，ＢＤＮＦを本発明の抗ｈＴｆＲ抗体と結合させておくことにより，ＢＤＮＦに効率良く血液脳関門を通過させて脳内に到達させることができる。また，本発明の抗ｈＴｆＲ抗体は，血液脳関門を通過した後に，大脳の脳実質，海馬の神経様細胞，小脳のプルキンエ細胞等に，または少なくともこれらのいずれかに到達できる。そして，大脳の線条体の神経様細胞及び中脳の黒質の神経様細胞へ到達することも予想される。従って，ＢＤＮＦを，本発明の抗ｈＴｆＲ抗体と結合させることにより，これら組織又は細胞に到達させることができる。

【0072】

通常であれば血液脳関門を通過することができず，そのため静脈内投与では脳内で機能させることができないＢＤＮＦを，血中から脳内に到達させて脳内で機能を発揮させる上で，抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦの融合蛋白質を用いることは有効な手段となり得る。特に，本発明の抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦの融合蛋白質は，血液脳関門を通過した後に，大脳の脳実質，海馬の神経様細胞，小脳のプルキンエ細胞等に，または少なくともこれらのいずれかに到達する。そして，大脳の線条体の神経様細胞及び中脳の黒質の神経様細胞へ到達することも予想される。従って，ＢＤＮＦを本発明の抗ｈＴｆＲ抗体分子と結合した形として静脈内投与等により血中投与することにより，これら脳の組織又は細胞においてＢＤＮＦの機能を発揮させ又は強化することが可能となる。

【0073】

本明細書において，ＢＤＮＦは１９８２年にＢａｒｄｅらによって発見され，１９９０年にＪｏｎｅｓらによってクローニングされた公知の蛋白質であり（ＥＭＢＯ Ｊ， （１９８２） １： ５４９－５５３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９９０） ８７： ８０６０－８０６４），一例として，配列番号５１のヒト成熟ＢＤＮＦのアミノ酸配列を示すが，これと実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質や，他の温血動物（例えば，モルモット，ラット，マウス，ニワトリ，ウサギ，イヌ，ブタ，ヒツジ，ウシ，サルなど）由来のＢＤＮＦであってもよい。

【0074】

また，本明細書において，ＢＤＮＦとは，ヒト成熟ＢＤＮＦを示す特定のアミノ酸配列（配列番号５１）で表される「蛋白質」または「（ポリ）ペプチド」だけでなく，これらと同質の機能を有することを限度として，その同族体（ホモログやスプライスバリアント），変異体，誘導体及びアミノ酸修飾体なども包含される。

【0075】

ここで「同質の機能」とは，例えば生理学的に，あるいは薬理学的にみて，その性質が定性的に同じであることを意味し，機能の程度（例，約０．１～約１０倍，好ましくは０．５～２倍）や，蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。また，天然のＢＤＮＦが有している機能，例えば，（１）ＢＤＮＦ受容体（ＴｒｋＢ）に対する結合親和性，（２）ＢＤＮＦ受容体のリン酸化活性，（３）神経細胞に対する増殖促進作用，（４）神経細胞に対する生存維持作用，（５）神経細胞に対する神経突起伸展作用を有するか，又は（６）配列番号５１のアミノ酸配列からなる蛋白質を特異的に認識する抗体によって認識され得る蛋白質を，ＢＤＮＦと「同質の機能を有する蛋白質」と見なす。

【0076】

上述したＢＤＮＦの機能は，後述の「（２）ＢＤＮＦの機能の評価方法」の項に記載したような公知の種々の評価方法や，本明細書の実施例２３以降に記載した方法を用いて，調べることができる。

【0077】

ここでホモログとしては，ヒトの蛋白質に対応するマウスやラットなど他生物種の蛋白質が例示でき，これらはＭａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ等（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（１９９１）１０：５５８－５６８）により報告されているものの他，ＵｎｉＰｒｏｔに掲載された蛋白質のアミノ酸配列（Ｐ２１２３７－１，Ｐ２３３６３－１，Ｐ２５４２９－１，Ｑ７ＹＲＢ４－１，Ｐ１４０８２－１，Ｑ５ＩＳ７８－１，Ｑ９５１０６－１）等から演繹的に同定することができる。また変異体には，天然に存在するアレル変異体，天然に存在しない変異体，及び人為的に欠失，置換，付加または挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお，上記変異体としては，変異のない蛋白質または（ポリ）ペプチドと，少なくとも７０％，好ましくは８０％，より好ましくは９０％，さらにより好ましくは９５％，いっそう好ましくは９７％，特に好ましくは９８％，最も好ましくは９９％相同なものを挙げることができる。またアミノ酸修飾体には，天然に存在するアミノ酸修飾体，天然に存在しないアミノ酸修飾体が包含され，具体的にはアミノ酸のリン酸化体が挙げられる。

【0078】

更に，本明細書において，「ＢＤＮＦ」とは，ＢＤＮＦと同質の機能を発揮し得る上記ＢＤＮＦの前駆体（プレプロ体）または当該前駆体からシグナル配列が切断されたプロ体であってもよく，ヒトＢＤＮＦ前駆体を示す特定のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｎｏ．Ｐ２３５６０－１）で示される「蛋白質」または「（ポリ）ペプチド」だけでなく，これらと同質の機能を有することを限度として，その同族体（ホモログやスプライスバリアント），変異体，誘導体，プロ体及びアミノ酸修飾体などが包含される。ヒトＢＤＮＦのプロ体（プロＢＤＮＦ）としては，配列番号５６のアミノ酸配列が挙げられる。

【0079】

ここでＢＤＮＦ前駆体と同質の機能とは，ＢＤＮＦ前駆体が有する機能，例えばＢＤＮＦのプロ体（プロＢＤＮＦ）又は成熟ＢＤＮＦを生成し得ることを意味し，ＢＤＮＦのプロ体と同質の機能とは，ＢＤＮＦのプロ体が有する機能，例えばｐ７５受容体に対する結合親和性を意味する。

【0080】

ここでヒトＢＤＮＦ前駆体のスプライスバリアントとしては，ＵｎｉＰｒｏｔに掲載された蛋白質のアミノ酸配列（Ｐ２３５６０－２，Ｐ２３５６０－３，Ｐ２３５６０－４，Ｐ２３５６０－５）などを挙げることができる。また，これらのヒトＢＤＮＦ前駆体蛋白質をコードする遺伝子も公知であり，例えば，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖに掲載された遺伝子の塩基配列（ＮＭ＿００１１４３８０５．１，ＮＭ＿００１１４３８０６．１，ＮＭ＿００１１４３８０７．１，ＮＭ＿００１１４３８０８．１，ＮＭ＿００１１４３８０９．１，ＮＭ＿００１１４３８１０．１，ＮＭ＿００１１４３８１１．１，ＮＭ＿００１１４３８１２．１，ＮＭ＿００１１４３８１３．１，ＮＭ＿００１１４３８１４．１，ＮＭ＿００１１４３８１６．１，ＮＭ＿００１７０９．４，ＮＭ＿１７０７３１．４，ＮＭ＿１７０７３２．４，ＮＭ＿１７０７３３．３，ＮＭ＿１７０７３４．３，ＮＭ＿１７０７３５．５）等を挙げることができる。

【0081】

ＢＤＮＦ前駆体のホモログおよびそのスプライスバリアントとしては，ヒトの蛋白質に対応するマウスやラットなど他生物種の蛋白質およびそのスプライスバリアントが例示でき，これらはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖに掲載された遺伝子の塩基配列（ＮＭ＿００１０４８１３９．１，ＮＭ＿００１０４８１４１．１，ＮＭ＿００１０４８１４２．１，ＮＭ＿００１２８５４１６．１，ＮＭ＿００１２８５４１７．１，ＮＭ＿００１２８５４１８．１，ＮＭ＿００１２８５４１９．１，ＮＭ＿００１２８５４２０．１，ＮＭ＿００１２８５４２１．１，ＮＭ＿００１２８５４２２．１，ＮＭ＿００７５４０．４等のマウスＢＤＮＦ遺伝子の塩基配列，ＮＭ＿００１２７０６３０．１，ＮＭ＿００１２７０６３１．１，ＮＭ＿００１２７０６３２．１，ＮＭ＿００１２７０６３３．１，ＮＭ＿００１２７０６３４．１，ＮＭ＿００１２７０６３５．１，ＮＭ＿００１２７０６３６．１，ＮＭ＿００１２７０６３７．１，ＮＭ＿００１２７０６３８．１，ＮＭ＿０１２５１３．４等のラットＢＤＮＦ遺伝子の塩基配列）等から演繹的に同定することができる。

【0082】

またＢＤＮＦ前駆体の変異体には，天然に存在するアレル変異体，天然に存在しない変異体，及び人為的に欠失，置換，付加または挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお，上記変異体としては，変異のない蛋白質または（ポリ）ペプチドと，少なくとも７０％，好ましくは８０％，より好ましくは９０％，更に好ましくは９５％，尚も更に好ましくは９７％，特に好ましくは９８％，最も好ましくは９９％相同なものを挙げることができる。またアミノ酸修飾体には，天然に存在するアミノ酸修飾体，天然に存在しないアミノ酸修飾体が包含され，具体的にはアミノ酸のリン酸化体が挙げられる。

【0083】

配列番号５１のアミノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列としては，以下の（Ａ）～（Ｅ）が挙げられる：
（Ａ）配列番号５１のアミノ酸配列，
（Ｂ）配列番号５１のアミノ酸配列において，１若しくは複数のアミノ酸が欠失，付加，挿入もしくは置換され，且つ配列番号５１のアミノ酸配列からなる蛋白質と同質の機能を有する又は配列番号５１のアミノ酸配列からなる蛋白質を特異的に認識する抗体によって認識され得る，アミノ酸配列，
（Ｃ）配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有し，且つ配列番号５１のアミノ酸配列からなる蛋白質と同質の機能を有する又は配列番号５１のアミノ酸配列からなる蛋白質を特異的に認識する抗体によって認識され得る，アミノ酸配列，
（Ｄ）配列番号５０の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列，又は
（Ｅ）配列番号５０の塩基配列を有するＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ，かつ配列番号５１のアミノ酸配列からなる蛋白質と同質の機能を有する又は配列番号５１のアミノ酸配列からなる蛋白質を特異的に認識する抗体によって認識され得る，アミノ酸配列。

【0084】

具体的には，配列番号５１のアミノ酸配列からなるヒト蛋白質の他の哺乳動物におけるオルソログのアミノ酸配列，又は配列番号５１のアミノ酸配列からなるヒト蛋白質もしくはそのオルソログのスプライスバリアント，アレル変異体もしくは多型バリアントにおけるアミノ酸配列が挙げられる。

【0085】

ここで「相同性」とは，当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の，最適なアラインメント（好ましくは，該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における，オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸及び類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し，例えば，芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ），脂肪族アミノ酸（Ａｌａ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ），極性アミノ酸（Ｇｌｎ，Ａｓｎ），塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｈｉｓ），酸性アミノ酸（Ｇｌｕ，Ａｓｐ），水酸基を有するアミノ酸（Ｓｅｒ，Ｔｈｒ）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は，蛋白質の表現型に変化をもたらさない（即ち，保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。

【0086】

本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は，相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）を用い，以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては，例えば，Ｋａｒｌｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３－５８７７（１９９３）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）に組み込まれている（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９－３４０２（１９９７））］，Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４－４５３（１９７０）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれている］，Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ，４：１１－１７（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）に組み込まれている］，Ｐｅａｒｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４－２４４８（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＦＡＳＴＡプログラムに組み込まれている］等が挙げられ，それらも同様に好ましく用いられ得る。

【0087】

上記（Ｅ）におけるストリンジェントな条件とは，例えば，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，６．３．１－６．３．６，１９９９に記載される条件，例えば，６×ＳＳＣ（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）／４５℃でのハイブリダイゼーション，次いで０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ／５０～６５℃での一回以上の洗浄等が挙げられるが，当業者であれば，これと同等のストリンジェンシーを与えるハイブリダイゼーションの条件を適宜選択することができる。

【0088】

より好ましくは，「配列番号５１のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列」として，配列番号５１のアミノ酸配列と，約７０％以上，好ましくは約８０％以上，より好ましくは約９０％以上，更に好ましくは約９５％以上，尚も更に好ましくは約９７％以上，特に好ましくは約９８％以上，最も好ましくは約９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。

【0089】

本発明における蛋白質：ＢＤＮＦとして，例えば，
（ｉ）配列番号５１のアミノ酸配列中の１～３０個，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～数（６，５，４，３若しくは２）個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列，
（ｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列に１～３０個，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～数（６，５，４，３若しくは２）個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列，
（ｉｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列に１～３０個，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～数（６，５，４，３若しくは２）個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列，
（ｉｖ）配列番号５１のアミノ酸配列中の１～３０個，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，さらに好ましくは１～数（６，５，４，３若しくは２）個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列，
又は
（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質などのいわゆる変異体も含まれる。

【0090】

上記のようにアミノ酸配列が挿入，欠失，付加又は置換されている場合，その挿入，欠失，付加又は置換の位置は，そのような変更が加えられた蛋白質が，配列番号５１のアミノ酸配列からなる蛋白質と同質の機能を有する，あるいは配列番号５１のアミノ酸配列からなる蛋白質を特異的に認識する抗体によって認識され得る限り，特に限定されない。例えば，配列番号５１のアミノ酸配列から成る成熟ＢＤＮＦの他，そのＮ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ－ＢＤＮＦ等も，配列番号５１のアミノ酸配列からなる蛋白質と同質の機能を有する限り，ＢＤＮＦとして本発明の融合蛋白質に使用しうる。

【0091】

ここでアミノ酸の欠失，付加，挿入又は置換を人為的に行う場合の手法としては，例えば，配列番号５１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに対して慣用の部位特異的変異導入を施し，その後このＤＮＡを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては，例えば，アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，９４４１－９４５６（１９８４）），変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法等が挙げられる。

【0092】

ＢＤＮＦの好ましい例としては，例えば，配列番号５１のアミノ酸配列からなるヒト蛋白質，又はそのアレル変異体若しくは多型バリアントなどがあげられる。

【0093】

「ＢＤＮＦをコードする遺伝子」は，上記（Ａ）～（Ｅ）で示される，配列番号５１のアミノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を表す。具体的には，以下の（Ｆ）～（Ｊ）：
（Ｆ）配列番号５１のアミノ酸配列をコードする塩基配列，
（Ｇ）配列番号５１のアミノ酸配列において，１又は複数のアミノ酸が欠失，付加，挿入若しくは置換され，且つ配列番号５１のアミノ酸配列からなる蛋白質と同質の機能を有する又は配列番号５１のアミノ酸配列からなる蛋白質を特異的に認識する抗体によって認識され得るアミノ酸配列をコードする塩基配列，
（Ｈ）配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有し，かつ，配列番号５１のアミノ酸配列からなる蛋白質と同質の機能を有する又は配列番号５１のアミノ酸配列からなる蛋白質を特異的に認識する抗体によって認識され得るアミノ酸配列をコードする塩基配列，
（Ｉ）配列番号５０の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列をコードする塩基配列，又は
（Ｊ）配列番号５０の塩基配列を有するＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ，かつ配列番号５１のアミノ酸配列からなる蛋白質と同質の機能を有する又は配列番号５１のアミノ酸配列からなる蛋白質を特異的に認識する抗体によって認識され得るアミノ酸配列をコードする塩基配列，を有する遺伝子が挙げられる。

【0094】

尚，ここで遺伝子とは，ｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡ等のＤＮＡ，又はｍＲＮＡ等のＲＮＡのいずれでもよく，また一本鎖の核酸配列及び二本鎖の核酸配列を共に含む概念である。また，本明細書において，配列番号２，配列番号２４，配列番号２６，配列番号２８，配列番号３０，配列番号３８，配列番号４０，配列番号５０，配列番号５３，配列番号５５，配列番号５８，配列番号６４等に示される核酸配列は，便宜的にＤＮＡ配列の形で記載されているが，ｍＲＮＡなどＲＮＡ配列を示す場合には，チミン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）と読み替えられる。

【0095】

また，本発明に使用されるＢＤＮＦとしては，ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の蛋白質安定化作用を有する分子等で修飾された誘導体などであってもよい（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（１９９８）；１３：１７３－１７８）。

【0096】

本発明における抗ｈＴｆＲ抗体とヒトＢＤＮＦとの融合蛋白質の一例として，抗ｈＴｆＲ抗体を構成する「重鎖」のＣ末端側に，リンカー配列を介して，ヒトＢＤＮＦが融合しているタイプのものが挙げられる。このような融合蛋白質として，
（１）ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が，配列番号２３のアミノ酸配列を含んでなり，且つ
ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖が，そのＣ末端側で，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒからなるリンカーを介して，ヒトＢＤＮＦと結合しており，それにより配列番号５２のアミノ酸配列を含んでなるものである，
融合蛋白質；及び
（２）ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が，配列番号２３のアミノ酸配列含んでなり，且つヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖が，そのＣ末端側で，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒに続いてアミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号３）が５個連続してなる計２７個のアミノ酸からなるリンカーを介して，ヒトＢＤＮＦと結合しており，それにより配列番号５４のアミノ酸配列を含んでなるものである，
融合蛋白質，
が例示できる。

【0097】

上記の（１）及び（２）に記載の融合蛋白質は，
（１）配列番号２３のアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖と，配列番号７０のアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＣ末端側に，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒからなるリンカーを介して，配列番号５１のアミノ酸配列を有するヒトＢＤＮＦが結合したものとを含む，融合蛋白質；及び
（２）配列番号２３のアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖と，配列番号７０のアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＣ末端側に，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒに続いてアミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号３）が５個連続してなる計２７個のアミノ酸からなるリンカーを介して，配列番号５１のアミノ酸配列を有するヒトＢＤＮＦが結合したものとを含む，融合蛋白質，
である。
なお，上記（１）及び（２）において，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖を，配列番号７０のアミノ酸配列を有するものから配列番号７２のアミノ酸配列を有するものに置き換えることができる。配列番号７０と７２のアミノ酸配列を有するものは，それぞれＩｇＧ１タイプとＩｇＧ４タイプの抗体である。配列番号７０のアミノ酸配列を有するものをコードする塩基配列としては配列番号７１で示されるものが，配列番号７２のアミノ酸配列を有するものをコードする塩基配列としては配列番号７６で示されるものが例示できる。

【0098】

このような融合蛋白質は，例えば，配列番号５２のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号５３）を有するＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターと，配列番号２３のアミノ酸配列を有する抗ｈＴｆＲ抗体軽鎖をコードする塩基配列（配列番号２４）を有するＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターとで，哺乳動物細胞等のホスト細胞を形質転換させ，このホスト細胞を培養することにより製造することができる。又は，配列番号５４のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号５５）を有するＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターと，配列番号２３のアミノ酸配列を有する抗ｈＴｆＲ抗体軽鎖をコードする塩基配列（配列番号２４）を有するＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターで，哺乳動物細胞等のホスト細胞を形質転換させ，このホスト細胞を培養することにより製造することができる。

【0099】

ヒトＢＤＮＦを結合させる抗ｈＴｆＲ抗体の１つの好ましい態様としては，該抗体の抗原結合性断片，具体的には，一本鎖抗体，Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）_２等が挙げられる。

【0100】

抗ｈＴｆＲ抗体が一本鎖抗体である場合の，本発明におけるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体とヒトＢＤＮＦとの融合蛋白質の具体的な態様の一例として，ヒトＢＤＮＦのＣ末端側に，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒに続いてアミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号３）が５個連続してなる計２７個のアミノ酸からなる第１のリンカー配列を介して，一本鎖抗体が結合したものである，配列番号５９又は６０のアミノ酸配列からなるものが例示できる。ここに，該一本鎖抗体は，配列番号６９のアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域のＣ末端に，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号３）が３個連続してなる計１５個のアミノ酸からなる第２のリンカー配列を介して，配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域が結合したものであり，配列番号５７のアミノ酸配列を有するものである。従って，抗ｈＴｆＲ抗体が一本鎖抗体である場合における，本発明のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体とヒトＢＤＮＦとの融合蛋白質の具体的な態様の一例として，配列番号６９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む一本鎖抗体のＮ末端側に，直接又はリンカーを介して，ヒトＢＤＮＦが結合したものである，融合蛋白質が挙げられる。

【0101】

抗ｈＴｆＲ抗体が一本鎖抗体であるこのような融合蛋白質は，例えば，配列番号５９のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号５８）を有するＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターで哺乳動物細胞等のホスト細胞を形質転換させ，このホスト細胞を培養することにより製造することができる。

【0102】

抗ｈＴｆＲ抗体が一本鎖抗体である場合の，本発明におけるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体とヒトＢＤＮＦとの融合蛋白質の他の具体的な態様の一例として，配列番号６１に記載のアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３ＮのＦａｂ重鎖のＣ末端側に，配列番号３で示されるアミノ酸配列が６回連続するアミノ酸配列にアミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙが続く３２個のアミノ酸からなるリンカーを介して，配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有する抗ｈＴｆＲ抗体軽鎖が結合したものである，配列番号９０に記載のアミノ酸配列を有する一本鎖抗体に、ヒトＢＤＮＦを結合したものが挙げられる。ヒトＢＤＮＦは、この一本鎖抗体のＣ末端側又はＮ末端側の何れに結合させてもよいが、好ましくはＮ末端側である。また、ヒトＢＤＮＦは、この一本鎖抗体に直接又はリンカーを介して結合させることができる。

【0103】

なお，本発明において，１つのペプチド鎖に複数のリンカー配列が含まれる場合，便宜上，各リンカー配列はＮ末端側から順に，第１のリンカー配列，第２のリンカー配列という。

【0104】

抗ｈＴｆＲ抗体がＦａｂである場合における，本発明のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体とヒトＢＤＮＦとの融合蛋白質の具体的な態様の一例として，ヒトＢＤＮＦのＣ末端側に，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号３）が５個連続してなる計２５個のアミノ酸からなるリンカー配列を介して，抗ｈＴｆＲ抗体重鎖の可変領域とＣ_Ｈ１領域を含む領域を融合させたものが挙げられる。このときＣ_Ｈ１領域に加えてヒンジ部の一部が含まれてもよいが，当該ヒンジ部は重鎖間のジスフィルド結合を形成するシステイン残基を含まない。配列番号６３及び６５で示されるものは，その好適な一例である。配列番号６３で示されるものは，配列番号５６で示されるヒトのプロＢＤＮＦのアミノ酸配列を含み，配列番号６５で示されるものは，配列番号５１で示されるヒト成熟ＢＤＮＦのアミノ酸配列を含む。

【0105】

配列番号６３及び６５内の抗ｈＴｆＲ抗体Ｆａｂ重鎖のアミノ酸配列は，配列番号７０で示されるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のアミノ酸配列のＮ末端から１番目～２２６番目の部分に相当し，配列番号６１のアミノ酸配列からなる。なお，配列番号６１のＮ末端から１番目～１１８番目の部分が，可変領域（配列番号６９）に相当し，１１９番目～２１６番目の部分がＣ_Ｈ１領域に相当し，２１７番目～２２６番目の部分がヒンジ部に相当する。抗ｈＴｆＲ抗体がＦａｂである場合の，本発明におけるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体とヒトＢＤＮＦとの融合蛋白質の具体的な態様の一例として，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体のＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）_２又はＦ（ａｂ’）のいずれかの重鎖のＮ末端側に，直接又はリンカーを介してヒトＢＤＮＦが結合したものである，融合蛋白質が好適な一態様として挙げられる。

【0106】

抗ｈＴｆＲ抗体がＦａｂである場合の，本発明におけるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体とヒトＢＤＮＦとの融合蛋白質の具体的な態様の一例として，軽鎖が配列番号２３のアミノ酸配列からなり，且つ重鎖が配列番号６１のアミノ酸配列からなるＦａｂ重鎖であり，該重鎖のＮ末端側に，リンカーを介して，ヒトＢＤＮＦが結合してなるものである，融合蛋白質が挙げられる。より具体的には：
（１）軽鎖が配列番号２３のアミノ酸配列からなり，且つＦａｂ重鎖とそのＮ末端側に，リンカーを介して，結合したヒトプロＢＤＮＦとからなる部分が，配列番号６３のアミノ酸配列からなるものである，融合蛋白質；及び，
（２）軽鎖が配列番号２３のアミノ酸配列からなり，且つＦａｂ重鎖とそのＮ末端側に，リンカーを介して，結合したヒトＢＤＮＦとからなる部分が，配列番号６５のアミノ酸配列からなるものである，融合蛋白質
が挙げられる。

【0107】

抗ｈＴｆＲ抗体がＦａｂであるこのような融合蛋白質は，例えば，配列番号６３のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号６２）を有するＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターと，配列番号２３のアミノ酸配列を有する抗ｈＴｆＲ抗体軽鎖をコードする塩基配列（配列番号２４）を有するＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターで，哺乳動物細胞等のホスト細胞を形質転換させ，このホスト細胞を培養することによっても製造することができる。

【0108】

抗ｈＴｆＲ抗体がＦａｂであるこのような融合蛋白質は，例えば，配列番号６５のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号６４）を有するＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターと，配列番号２３のアミノ酸配列を有する抗ｈＴｆＲ抗体軽鎖をコードする塩基配列（配列番号２４）を有するＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターで，哺乳動物細胞等のホスト細胞を形質転換させ，このホスト細胞を培養することによっても製造することができる。

【0109】

なお，ヒトＢＤＮＦ（ｈＢＤＮＦ）に変異を加えてＣ末端又はＮ末端にアミノ酸を付加した場合において，その付加したアミノ酸が，ｈＢＤＮＦを抗ｈＴｆＲ抗体と融合させたときにｈＢＤＮＦと抗ｈＴｆＲ抗体との間に位置することとなった場合，当該付加したアミノ酸は，リンカーの一部を構成する。

【0110】

抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとを結合させる方法としては，非ペプチドリンカー又はペプチドリンカーを介して結合させる方法がある。非ペプチドリンカーとしては，ポリエチレングリコール，ポリプロピレングリコール，エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体，ポリオキシエチル化ポリオール，ポリビニルアルコール，多糖類，デキストラン，ポリビニルエーテル，生分解性高分子，脂質重合体，キチン類，及びヒアルロン酸，又はこれらの誘導体，若しくはこれらを組み合わせたものを用いることができる。ペプチドリンカーは，ペプチド結合した１～５０個のアミノ酸から構成されるペプチド鎖若しくはその誘導体であって，そのＮ末端とＣ末端が，それぞれ抗ｈＴｆＲ抗体又はＢＤＮＦの何れかと共有結合を形成することにより，抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとを結合させるものである。

【0111】

非ペプチドリンカーとしてＰＥＧを用いて本発明の抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとを結合させたものは，特に，抗ｈＴｆＲ抗体－ＰＥＧ－ＢＤＮＦという。抗ｈＴｆＲ抗体－ＰＥＧ－ＢＤＮＦは，抗ｈＴｆＲ抗体とＰＥＧを結合させて抗ｈＴｆＲ抗体－ＰＥＧを作製し，次いで抗ｈＴｆＲ抗体－ＰＥＧとＢＤＮＦとを結合させることにより製造することができる。又は，抗ｈＴｆＲ抗体－ＰＥＧ－ＢＤＮＦは，ＢＤＮＦとＰＥＧとを結合させてＢＤＮＦ－ＰＥＧを作製し，次いでＢＤＮＦ－ＰＥＧと抗ｈＴｆＲ抗体を結合させることによっても製造することができる。ＰＥＧを抗ｈＴｆＲ抗体及びＢＤＮＦと結合させる際には，カーボネート，カルボニルイミダゾール，カルボン酸の活性エステル，アズラクトン，環状イミドチオン，イソシアネート，イソチオシアネート，イミデート，又はアルデヒド等の官能基で修飾されたＰＥＧが用いられる。これらＰＥＧに導入された官能基が，主に抗ｈＴｆＲ抗体及びＢＤＮＦ分子内のアミノ基と反応することにより，ＰＥＧと抗ｈＴｆＲ抗体及びＢＤＮＦが共有結合する。このとき用いられるＰＥＧの分子量及び形状に特に限定はないが，その平均分子量（ＭＷ）は，好ましくはＭＷ＝５００～６００００であり，より好ましくはＭＷ＝５００～２００００である。例えば，平均分子量が約３００，約５００，約１０００，約２０００，約４０００，約１００００，約２００００等であるＰＥＧは，非ペプチドリンカーとして好適に使用することができる。

【0112】

例えば，抗ｈＴｆＲ抗体－ＰＥＧは，抗ｈＴｆＲ抗体とアルデヒド基変性ＰＥＧ（ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤ）とを，該抗体に対する該変性ＰＥＧのモル比が１１，１２．５，１５，１１０，１２０等になるように混合し，これにＮａＣＮＢＨ_３等の還元剤を添加して反応させることにより得られる。次いで，抗ｈＴｆＲ抗体－ＰＥＧを，ＮａＣＮＢＨ_３等の還元剤の存在下で，ＢＤＮＦと反応させることにより，抗ｈＴｆＲ抗体－ＰＥＧ－ＢＤＮＦが得られる。逆に，先にＢＤＮＦとＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤとを結合させてＢＤＮＦ－ＰＥＧを作製し，次いでＢＤＮＦ－ＰＥＧと抗ｈＴｆＲ抗体を結合させることによっても，抗ｈＴｆＲ抗体－ＰＥＧ－ＢＤＮＦを得ることができる。

【0113】

ＢＤＮＦは，その二量体が標的細胞表面上にある高親和性ＢＤＮＦ受容体に結合するため，二量体で作用すると考えられるが，抗ｈＴｆＲ抗体と結合するＢＤＮＦは，１分子であっても，２分子であってもよい。例えば，抗ｈＴｆＲ抗体に１分子のＢＤＮＦが結合してなる融合蛋白質とＢＤＮＦとを反応させて，２量体としてもよいし，抗ｈＴｆＲ抗体にＢＤＮＦが２分子結合した融合蛋白質としてもよい。また，その結合は，以下に示すように抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦをコードするＤＮＡを発現ベクターに組み込んで得ることも可能であるし，抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦを各々製造したのちに化学的に結合させることで作製してもよい。具体的には，抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとは，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端側又はＮ末端側に，リンカー配列を介して又は直接に，それぞれＢＤＮＦのＮ末端又はＣ末端をペプチド結合により結合させることにより，一体化させることができる。ＢＤＮＦと抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質の１つの好ましい態様としては，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端側に，リンカー配列を介して又は直接に，ＢＤＮＦのＣ末端を結合させた融合蛋白質が挙げられる。

【0114】

前述のとおり，ヒトＢＤＮＦを結合させる抗ｈＴｆＲ抗体の１つの好ましい態様としては，該抗体の抗原結合性断片，具体的には，一本鎖抗体，Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）_２が挙げられる。従って，ＢＤＮＦと抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質の１つの好ましい態様として，以下のようなものを例示することができる。
（１）ＢＤＮＦと抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質であって，該抗ｈＴｆＲ抗体が抗原結合性断片であり，この抗原結合性断片のＮ末端側に，直接又はリンカーを介してヒトＢＤＮＦが結合したものである，融合蛋白質。
（２）ＢＤＮＦと抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質であって，該抗ｈＴｆＲ抗体が一本鎖抗体であり，この一本鎖抗体のＮ末端側に，直接又はリンカーを介してヒトＢＤＮＦが結合したものである，融合蛋白質。
（３）ＢＤＮＦと抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質であって，該抗ｈＴｆＲ抗体がＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）_２，又はＦ（ａｂ’）の何れかであり，これらＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）_２，又はＦ（ａｂ’）の重鎖又は軽鎖のＮ末端側に，直接又はリンカーを介してヒトＢＤＮＦが結合したものである，融合蛋白質。
ここで，上記（３）の場合は，ヒトＢＤＮＦは，抗ｈＴｆＲ抗体のＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）_２，又はＦ（ａｂ’）の何れかの重鎖のＮ末端側と，特に好適に結合させることができる。従って，より具体的には，以下のようなものを例示することができる。
（４）ＢＤＮＦと抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質であって，該抗ｈＴｆＲ抗体がＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）_２，又はＦ（ａｂ’）の何れかであり，これらＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）_２，又はＦ（ａｂ’）の重鎖のＮ末端側に，直接又はリンカーを介してヒトＢＤＮＦが結合したものである，融合蛋白質。

【0115】

融合蛋白質中の抗ｈＴｆＲ抗体がＦａｂの形である場合は，これに更に別のＩｇＧのＦｃ領域を導入した形の新たな融合蛋白質を作製することもできる。それにより，元の融合蛋白質に比べて血中等の生体内での安定性を高めることができる。Ｆｃ領域を含んだそのような融合蛋白質としては，例えば，ヒトＢＤＮＦのＣ末端側に，直接又はリンカー配列を介して，ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域が結合し，次いでそのＣ末端側に，直接又はリンカー配列を介して，該抗ｈＴｆＲ抗体のＦａｂ重鎖が結合してなるものが挙げられる。

【0116】

ヒトＢＤＮＦとヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の間のリンカー配列は，好ましくは１～５０個のアミノ酸から構成される。ここに，アミノ酸の個数は，１～１７個，１～１０個，１０～４０個，２０～３４個，２３～３１個，２５～２９個，２７個等と適宜調整される。このようなリンカー配列は，そのアミノ酸配列に限定はないが，好ましくは，グリシンとセリンから構成されるものである。例えば，グリシン又はセリンのいずれか１個のアミノ酸からなるもの，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号３），アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号４），アミノ酸配列Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号５），又はこれらのアミノ酸配列が１～１０個，あるいは２～５個連結してなる，５０個以下のアミノ酸からなる配列，２～１７個，２～１０個，１０～４０個，２０～３４個，２３～３１個，２５～２９個，又は２５個のアミノ酸からなる配列等を含むものが挙げられる。例えば，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号３）が５個連続してなる計２５個のアミノ酸を含むものは，リンカー配列として好適に用いることができる。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域とＦａｂ重鎖との間のリンカー配列についても同様である。

【0117】

なお，ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含んだ融合蛋白質を作製する場合，ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は元の抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖と軽鎖の何れに結合させてもよい。また，元の抗体は，Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）_２，Ｆ（ａｂ’），及び一本鎖抗体を含む，何れの抗原結合性断片であってもよい。

【0118】

導入されるヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＩｇＧのタイプには特に限定はなく，ＩｇＧ１～ＩｇＧ４のいずれであってもよい。また，導入されるヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は，Ｆｃ領域の全体でもよくその一部であってもよい。斯かるヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の好ましい一実施形態として，ヒトＩｇＧ１のＦｃの全領域である，配列番号７５で示されるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。Ｆｃ領域は，好ましくは，ＢＤＮＦとＦｃ領域とＦａｂ重鎖が，Ｎ末端側からこの順で位置するように導入される。例えば，Ｆｃ領域を導入した融合蛋白質として，ＢＤＮＦのＣ末端側にＦｃ領域の全体，そのＣ末端側に抗ｈＴｆＲ抗体のＦａｂ重鎖が，それぞれリンカー配列を介して結合した配列番号７４で示されるアミノ酸配列を含んでなるものが，一例として挙げられる。

【0119】

抗ｈＴｆＲ抗体とｈＢＤＮＦとの融合蛋白質（抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＢＤＮＦ融合蛋白質）は、アルブミンに対する親和性を有するように改変することもできる。当該改変は、例えば、抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＢＤＮＦ融合蛋白質に、アルブミンに対して親和性を有する物質（例えば、アルブミンに対して親和性を有する化合物、ペプチド及び蛋白質等）を導入することにより行うことができる。当該改変を施した抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＢＤＮＦ融合蛋白質（改変融合蛋白質）は、アルブミンと結合して血中を循環する。アルブミンは、これと結合した蛋白質を安定化させる機能を有する。従って、改変融合蛋白質は、生体内に投与したとき、血中での半減期が長くなるので、その薬効を強化できる。アルブミンに対する親和性を有するように改変することは、抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＢＤＮＦ融合蛋白質中の抗ｈＴｆＲ抗体が、抗体の安定性に寄与するＦｃ領域を欠くものである場合、例えば、Ｆａｂである場合により効果的である。

【0120】

また、抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＢＤＮＦ融合蛋白質が、生体内に投与したときに、免疫原性を示すような場合にも、アルブミンに対する親和性を有するように改変することは効果的である。改変融合蛋白質がアルブミンと結合することにより、抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＢＤＮＦ融合蛋白質中の免疫原性を示す部位が、免疫細胞に提示されることが阻害されるので、免疫原性が軽減される。

【0121】

抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＢＤＮＦ融合蛋白質に、アルブミンに対する親和性を有する物質を導入する場合、当該物質を導入する部分は、抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖、抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖、ｈＢＤＮＦ、及びリンカー部分の何れであってもよく、これらの２以上の部分に導入してもよい。

【0122】

アルブミンに対して親和性を有するペプチド又は蛋白質としては、例えば、配列番号８５で示されるアミノ酸配列を有する、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｔｒａｉｎ Ｇ４１８由来の蛋白質のアルブミン結合ドメイン（Ａｌｍ Ｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ． ５． ６０５－１７（２０１０））を、アルカリ耐性を示すように改変したペプチドを用いることができるが、これに限定されるものではない。アルブミンに対して親和性を有するペプチド又は蛋白質（アルブミン親和性ペプチド）を、抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＢＤＮＦ融合蛋白質と結合させる方法としては，非ペプチドリンカー又はペプチドリンカーを介して結合させる方法がある。非ペプチドリンカーとしては，ポリエチレングリコール，ポリプロピレングリコール，エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体，ポリオキシエチル化ポリオール，ポリビニルアルコール，多糖類，デキストラン，ポリビニルエーテル，生分解性高分子，脂質重合体，キチン類，及びヒアルロン酸，又はこれらの誘導体，若しくはこれらを組み合わせたものを用いることができる。ペプチドリンカーは，ペプチド結合した１～５０個のアミノ酸から構成されるペプチド鎖若しくはその誘導体であって，そのＮ末端とＣ末端が，それぞれアルブミン親和性ペプチド又は融合蛋白質の何れかと共有結合を形成することにより，アルブミン親和性ペプチドと融合蛋白質とを結合させるものである。

【0123】

非ペプチドリンカーとしてＰＥＧを用いてアルブミン親和性ペプチドと抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＢＤＮＦ融合蛋白質とを結合させたものは，特に，アルブミン親和性ペプチド－ＰＥＧ－融合蛋白質という。アルブミン親和性ペプチド－ＰＥＧ－融合蛋白質は，アルブミン親和性ペプチドとＰＥＧを結合させてアルブミン親和性ペプチド－ＰＥＧを作製し，次いでアルブミン親和性ペプチド－ＰＥＧと抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＢＤＮＦ融合蛋白質とを結合させることにより製造することができる。または，アルブミン親和性ペプチド－ＰＥＧ－融合蛋白質は，抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＢＤＮＦ融合蛋白質とＰＥＧとを結合させて抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＢＤＮＦ融合蛋白質－ＰＥＧを作製し，次いで抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＢＤＮＦ融合蛋白質－ＰＥＧとアルブミン親和性ペプチドを結合させることによっても製造することができる。ＰＥＧをアルブミン親和性ペプチド及び抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＢＤＮＦ融合蛋白質と結合させる際には，カーボネート，カルボニルイミダゾール，カルボン酸の活性エステル，アズラクトン，環状イミドチオン，イソシアネート，イソチオシアネート，イミデート，又はアルデヒド等の官能基で修飾されたＰＥＧが用いられる。これらＰＥＧに導入された官能基が，主にアルブミン親和性ペプチド及び抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＢＤＮＦ融合蛋白質分子内のアミノ基と反応することにより，ＰＥＧとアルブミン親和性ペプチド及び抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＢＤＮＦ融合蛋白質が共有結合する。このとき用いられるＰＥＧの分子量及び形状に特に限定はないが，その平均分子量（ＭＷ）は，好ましくはＭＷ＝５００～６００００であり，より好ましくはＭＷ＝５００～２００００である。例えば，平均分子量が約３００，約５００，約１０００，約２０００，約４０００，約１００００，約２００００等であるＰＥＧは，非ペプチドリンカーとして好適に使用することができる。

【0124】

例えば，アルブミン親和性ペプチド－ＰＥＧは，アルブミン親和性ペプチドとアルデヒド基変性ＰＥＧ（ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤ）とを，該アルブミン親和性ペプチドに対する該変性ＰＥＧのモル比が１１，１２．５，１５，１１０，１２０等になるように混合し，これにＮａＣＮＢＨ_３等の還元剤を添加して反応させることにより得られる。次いで，アルブミン親和性ペプチド－ＰＥＧを，ＮａＣＮＢＨ_３等の還元剤の存在下で，抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＢＤＮＦ融合蛋白質と反応させることにより，アルブミン親和性ペプチド－ＰＥＧ－融合蛋白質が得られる。逆に，先に抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＢＤＮＦ融合蛋白質とＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤとを結合させて抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＢＤＮＦ融合蛋白質－ＰＥＧを作製し，次いで抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＢＤＮＦ融合蛋白質－ＰＥＧとアルブミン親和性ペプチドを結合させることによっても，アルブミン親和性ペプチド－ＰＥＧ－融合蛋白質を得ることができる。

【0125】

抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＢＤＮＦ融合蛋白質を、アルブミン親和性ペプチドと融合させることもできる。かかる融合蛋白質（抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＢＤＮＦ－アルブミン親和性ペプチド）は，抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＢＤＮＦ融合蛋白質の重鎖又は軽鎖をコードするｃＤＮＡの３’末端側又は５’末端側に，直接に又はリンカー配列をコードするＤＮＡ断片を介して，アルブミン親和性ペプチドをコードするｃＤＮＡがインフレームで配置されてなるＤＮＡ断片を，哺乳動物細胞用発現ベクターに組み込み，この発現ベクターを導入した哺乳動物細胞を培養することにより得ることができる。アルブミン親和性ペプチドをコードするＤＮＡ断片を重鎖（又は重鎖とｈＢＤＮＦの融合蛋白質）と結合させる場合にあっては，抗ｈＴｆＲ抗体を構成している軽鎖とｈＢＤＮＦの融合蛋白質軽鎖（又は軽鎖）をコードするｃＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクターも同じホスト細胞に併せて導入され，またアルブミン親和性ペプチドをコードするＤＮＡ断片を軽鎖（又は軽鎖とｈＢＤＮＦの融合蛋白質）と結合させる場合にあっては，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖とｈＢＤＮＦの融合蛋白質（又は重鎖）をコードするｃＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用の発現ベクターも同じホスト細胞に併せて導入される。つまり、アルブミン親和性ペプチドは、抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＢＤＮＦ融合蛋白質の重鎖（重鎖とｈＢＤＮＦの融合蛋白質を含む）又は軽鎖（軽鎖とｈＢＤＮＦの融合蛋白質を含む）のＮ末端側又はＣ末端側の何れに結合させてもよいが、ｈＢＤＮＦを抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＮ末端側に結合させる場合にあっては、抗ｈＴｆＲ抗体のＣ末端側に結合させることが好ましく、特に重鎖のＣ末端側に結合させることが好ましい。例えば、アルブミン親和性ペプチドを導入した融合蛋白質として、ヒトＢＤＮＦのＣ末端側に，直接又はリンカー配列を介して抗体の重鎖が結合し，且つ，該重鎖のＣ末端側に直接又はリンカー配列を介してアルブミン親和性ペプチドが結合したものが、一例として挙げられる。

【0126】

抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＢＤＮＦ融合蛋白質をアルブミン親和性ペプチドと融合させる場合、直接又はリンカー配列を介して融合させることができる。ここでリンカー配列は，好ましくは１～５０個のアミノ酸から構成される。ここに，アミノ酸の個数は，１～１７個，１～１０個，１０～４０個，２０～３４個，２３～３１個，２５～２９個，２７個等と適宜調整される。このようなリンカー配列は，そのアミノ酸配列に限定はないが，好ましくは，グリシンとセリンから構成されるものである。例えば，グリシン又はセリンのいずれか１個のアミノ酸からなるもの，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号３），アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号４），アミノ酸配列Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号５），又はこれらのアミノ酸配列が１～１０個，あるいは２～５個連結してなる，５０個以下のアミノ酸からなる配列，２～１７個，２～１０個，１０～４０個，２０～３４個，２３～３１個，２５～２９個，又は２５個のアミノ酸からなる配列等を含むものが挙げられる。例えば，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号３）が３個連続してなる計１５個のアミノ酸を含むものは，リンカー配列として好適に用いることができる。

【0127】

アルブミン親和性ペプチドを導入した抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＢＤＮＦ融合蛋白質の一例として、配列番号５６で示されるアミノ酸配列を有するｈＢＤＮＦのプロ体のＣ末端側に、配列番号３で示されるアミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒが５回繰り返される計２５個のアミノ酸からなるリンカー配列を介して，配列番号６１で示されるアミノ酸配列の第１番目から第２１６番目に対応するアミノ酸配列（配列番号８４）を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体３ＮＦａｂ重鎖を融合させ、更に、そのＣ末端側に、配列番号３で示されるアミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒが３回繰り返される計１５個のアミノ酸からなるリンカー配列を介して，配列番号８５で示されるアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を融合させた融合蛋白質がある。

【0128】

アルブミン親和性ペプチドを導入した抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＢＤＮＦ融合蛋白質のアルブミンとの結合親和性は、実施例７に記載のバイオレイヤー干渉法により測定したとき，好ましくは１×１０^－７Ｍ以下，より好ましくは５×１０^－７Ｍ以下，更に好ましくは１×１０^－８Ｍ以下，更により好ましくは１×１０^－９Ｍ以下である。

【0129】

Ｆａｂ抗体は，Ｆｃ領域又はアルブミン親和性ペプチドの導入以外の方法でも血中で安定化させることができる。例えば，Ｆａｂ抗体は，Ｆａｂ抗体自体，又はＦａｂ抗体と他の蛋白質の融合体をＰＥＧ修飾させることにより安定化させることができる。かかる手法は，蛋白質医薬の分野で一般的に実施されており，ＰＥＧ化されたエリスロポエチン，インターフェロン等が医薬品として実用化されている。また，Ｆａｂ抗体は，これに変異を導入することによっても安定化させることができる。例えば，軽鎖のＮ末端側から4番目のメチオニンをロイシンに置換することによりＦａｂ抗体を安定化させることができる。但し，変異の導入方法はこれに限定されず，重鎖に変異を導入してもよい。また，Ｆａｂ抗体の安定化方法はこれらのものに限られず，周知の手法は全て利用可能である。

【0130】

抗ｈＴｆＲ抗体を構成している「軽鎖」のＮ末端側にＢＤＮＦを結合させたタイプの融合蛋白質は，抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が，軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と，重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含むものであり，ＢＤＮＦが，軽鎖のＮ末端側に結合したものである。ここで抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖とＢＤＮＦとは，直接結合してもよく，リンカーを介して結合してもよい。

【0131】

抗ｈＴｆＲ抗体を構成している「重鎖」のＮ末端側にＢＤＮＦを結合させたタイプの融合蛋白質は，抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が，軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と，重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含むものであり，ＢＤＮＦが，重鎖のＮ末端側に結合したものである。ここで抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖とＢＤＮＦとは，直接結合してもよく，リンカーを介して結合してもよい。

【0132】

抗ｈＴｆＲ抗体を構成している「軽鎖」のＣ末端側にＢＤＮＦを結合させたタイプの融合蛋白質は，抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が，軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と，重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含むものであり，ＢＤＮＦが，軽鎖のＣ末端側に結合したものである。ここで抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖とＢＤＮＦとは，直接結合してもよく，リンカーを介して結合してもよい。

【0133】

抗ｈＴｆＲ抗体を構成している「重鎖」のＣ末端側にＢＤＮＦを結合させたタイプの融合蛋白質は，抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が，軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と，重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含むものであり，ＢＤＮＦが，重鎖のＣ末端側に結合したものである。ここで抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖とＢＤＮＦとは，直接結合してもよく，リンカーを介して結合してもよい。

【0134】

このような抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとの融合蛋白質は，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖又は軽鎖をコードするｃＤＮＡの３’末端側又は５’末端側に，直接に又はリンカー配列をコードするＤＮＡ断片を介して，ＢＤＮＦをコードするｃＤＮＡ（配列番号５０）がインフレームで配置されてなるＤＮＡ断片を，哺乳動物細胞用発現ベクターに組み込み，この発現ベクターを導入した哺乳動物細胞を培養することにより得ることができる。ＢＤＮＦをコードするＤＮＡ断片を重鎖と結合させる場合にあっては，抗ｈＴｆＲ抗体を構成している軽鎖をコードするｃＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクターも同じホスト細胞に併せて導入され，またＢＤＮＦをコードするＤＮＡ断片を軽鎖と結合させる場合にあっては，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖をコードするｃＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用の発現ベクターも同じホスト細胞に併せて導入される。

【0135】

ここで，哺乳動物細胞には，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖（又は軽鎖）のＣ末端に直接又はリンカー配列を介してＢＤＮＦを結合してなる融合蛋白質をコードするｃＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクターと，抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖（又は重鎖）をコードするｃＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクターとを，同じホスト細胞に併せて導入することにより，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖（又は軽鎖）のＣ末端側にＢＤＮＦが結合した融合蛋白質と，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖（又は軽鎖）とからなる，融合蛋白質を作製することができる。

【0136】

また，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖（又は軽鎖）のＮ末端に直接又はリンカー配列を介してＢＤＮＦを結合してなる融合蛋白質をコードするｃＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクターと，抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖（又は重鎖）をコードするｃＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクターとを，同一のホスト細胞に導入することにより，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖（又は軽鎖）のＮ末端側にＢＤＮＦが結合してなる融合蛋白質と，抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖（重鎖）とからなる融合蛋白質を作製することもできる。

【0137】

抗ｈＴｆＲ抗体が一本鎖抗体である場合，抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとを結合させてなる融合蛋白質は，ＢＤＮＦをコードするｃＤＮＡの５’末端又は３’末端に，直接又はリンカー配列をコードするＤＮＡ断片を介して，一本鎖抗ｈＴｆＲ抗体をコードするｃＤＮＡを連結したＤＮＡ断片を，哺乳動物細胞，酵母等の真核生物又は大腸菌等の原核生物細胞用の発現ベクターに組み込み，この発現ベクターを導入したそれら対応する細胞中で発現させることにより，得ることができる。

【0138】

抗ｈＴｆＲ抗体がＦａｂである場合，抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとを結合させた融合蛋白質は，ＢＤＮＦをコードするｃＤＮＡの５’末端又は３’末端に直接又はリンカー配列をコードするＤＮＡ断片を介して当該Ｆａｂの重鎖と軽鎖の何れか一方をコードするｃＤＮＡ断片を連結してなるＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクター（哺乳動物細胞，酵母等の真核生物又は大腸菌等の原核生物細胞用）と，当該Ｆａｂ重鎖と軽鎖の他方をコードするｃＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターとを，同じホスト細胞に導入し，細胞中で発現させることにより，得ることができる。

【0139】

抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとの間にリンカー配列を配置する場合，リンカー配列は，好ましくは１～５０個のアミノ酸から構成される。ここに，アミノ酸の個数は，１～１７個，１～１０個，１０～４０個，２０～３４個，２３～３１個，２５～２９個，２７個等と適宜調整される。そのようなリンカー配列は，これにより連結された抗ｈＴｆＲ抗体がｈＴｆＲと親和性を保持し，且つ連結されたＢＤＮＦが，生理的条件下でその生理活性を発揮できる限り，そのアミノ酸配列に限定はないが，好ましくは，グリシンとセリンから構成されるものである。例えば，グリシン又はセリンのいずれか１個のアミノ酸からなるもの，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号３），アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号４），アミノ酸配列Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号５），又はこれらのアミノ酸配列が１～１０個，あるいは２～５個連結してなる，５０個以下のアミノ酸からなる配列，２～１７個，２～１０個，１０～４０個，２０～３４個，２３～３１個，２５～２９個，又は２５個のアミノ酸からなる配列等を含むものが挙げられる。例えば，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号３）が５個連続してなる計２５個のアミノ酸を含むものは，リンカー配列として好適に用いることができる。

【0140】

抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦの融合蛋白質において，抗ｈＴｆＲ抗体が一本鎖抗体である場合，免疫グロブリン軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と免疫グロブリン重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とは，一般にリンカー配列を介して結合される。このとき，抗ｈＴｆＲ抗体のｈＴｆＲに対する親和性が保持される限り，免疫グロブリン軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列のＣ末端側にリンカー配列が結合し，更にそのＣ末端側に免疫グロブリン重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列が結合したものであってもよく，また免疫グロブリン重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列のＣ末端側にリンカー配列が結合し，更にそのＣ末端側に免疫グロブリン軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列が結合したものであってもよい。

【0141】

免疫グロブリンの軽鎖と重鎖の間に配置されるリンカー配列は，好ましくは２～５０個，より好ましくは８～５０個，更に好ましくは１０～３０個，更により好ましくは１２～１８個又は１５～２５個，例えば１５個若しくは２５個のアミノ酸から構成される。そのようなリンカー配列は，これにより両鎖が連結されてなる抗ｈＴｆＲ抗体がｈＴｆＲと親和性を保持し，且つ当該抗体に結合したＢＤＮＦが，生理的条件下でその生理活性を発揮できる限り，アミノ酸配列に限定はないが，好ましくは，グリシンのみ又はグリシンとセリンから構成されるものである。例えば，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号３），アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号４），アミノ酸配列Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号５），又はこれらのアミノ酸配列が２～１０個，或いは２～５個連続してなる配列を含むものが挙げられる。例えば，免疫グロブリン重鎖の可変領域の全領域からなるアミノ酸配列のＣ末端側にリンカー配列を介して免疫グロブリン軽鎖の可変領域を結合させる場合，配列番号３で示されるアミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号３）が３個連続してなる計１５個のアミノ酸を含むものがリンカー配列として好適である。

【0142】

抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとの融合蛋白質の具体的な態様の一例として，抗ｈＴｆＲ抗体重鎖のＣ末端にリンカー配列としてアミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒを介してヒトＢＤＮＦを融合させてなる，配列番号５２のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。この融合蛋白質をコードする配列番号５３の塩基配列を有するＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターと，配列番号２３のアミノ酸配列を有する抗ｈＴｆＲ抗体軽鎖をコードする配列番号２４の塩基配列を有するＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターとを合わせて導入して形質転換したホスト細胞を用いることにより，抗ｈＴｆＲ抗体とヒトＢＤＮＦの融合蛋白質を作製することができる。

【0143】

抗ｈＴｆＲ抗体が，ヒト以外の動物のものである場合，これをヒトに投与したときに，当該抗体に対する抗原抗体反応を惹起し，好ましくない副作用が生じるおそれが高い。ヒト以外の動物の抗体は，ヒト化抗体とすることにより，そのような抗原性を減少させることができ，ヒトに投与したときの抗原抗体反応に起因する副作用の発生を抑制できる。また，サルを用いた実験によれば，ヒト化抗体は，マウス抗体と比較して，血中でより安定であることが報告されており，治療効果をそれだけ長期間持続させることができると考えられる。抗原抗体反応に起因する副作用の発生は，抗ｈＴｆＲ抗体としてヒト抗体を用いることによっても抑制することができる。

【0144】

抗ｈＴｆＲ抗体が，ヒト化抗体又はヒト抗体である場合について，以下に更に詳しく説明する。ヒト抗体の軽鎖には，λ鎖とκ鎖がある。抗ｈＴｆＲ抗体を構成する軽鎖は，λ鎖とκ鎖のいずれであってもよい。また，ヒト抗体の重鎖には，γ鎖，μ鎖，α鎖，σ鎖及びε鎖があり，それぞれ，ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ及びＩｇＥに対応している。抗ｈＴｆＲ抗体を構成する重鎖は，γ鎖，μ鎖，α鎖，σ鎖及びε鎖のいずれであってもよいが，好ましくはγ鎖である。更に，ヒト抗体の重鎖のγ鎖には，γ１鎖，γ２鎖，γ３鎖及びγ４鎖があり，それぞれ，ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３及びＩｇＧ４に対応している。抗ｈＴｆＲ抗体を構成する重鎖がγ鎖である場合，そのγ鎖は，γ１鎖，γ２鎖，γ３鎖及びγ４鎖のいずれであってもよいが，好ましくは，γ１鎖又はγ４鎖である。抗ｈＴｆＲ抗体が，ヒト化抗体又はヒト抗体であり，且つＩｇＧである場合，ヒト抗体の軽鎖はλ鎖とκ鎖のいずれでもあってもよく，ヒト抗体の重鎖は，γ１鎖，γ２鎖，γ３鎖及びγ４鎖のいずれであってもよいが，好ましくは，γ１鎖又はγ４鎖である。例えば，好ましい抗ｈＴｆＲ抗体の一つの態様として，軽鎖がλ鎖であり重鎖がγ１鎖である抗ｈＴｆＲ抗体が挙げられる。

【0145】

抗ｈＴｆＲ抗体がヒト化抗体又はヒト抗体である場合，抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとは，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端（又はＣ末端）に，リンカー配列を介して又は直接に，ＢＤＮＦのＣ末端（又はＮ末端）をそれぞれペプチド結合により結合させることにより，連結することができる。ＢＤＮＦを抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＮ末端側（又はＣ末端側）に結合させる場合，抗ｈＴｆＲ抗体のγ鎖，μ鎖，α鎖，σ鎖又はε鎖のＮ末端（又はＣ末端）に，リンカー配列を介し又は直接に，ＢＤＮＦのＣ末端（又はＮ末端）がペプチド結合によりそれぞれ結合される。抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖のＮ末端側（又はＣ末端側）にＢＤＮＦを結合させる場合，抗ｈＴｆＲ抗体のλ鎖とκ鎖のＮ末端（又はＣ末端）に，リンカー配列を介し又は直接に，ＢＤＮＦのＣ末端（又はＮ末端）がペプチド結合によりそれぞれ結合される。但し，抗ｈＴｆＲ抗体が，Ｆｃ領域を欠失したものであるＦａｂ領域からなるもの又はＦａｂ領域とヒンジ部の全部若しくは一部とからなるもの（Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）_２）の場合，ＢＤＮＦは，Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）_２及びＦ（ａｂ’）を構成する重鎖又は軽鎖のＮ末端（又はＣ末端）に，リンカー配列を介して又は直接に，そのＣ末端又はＮ末端をペプチド結合によりそれぞれ結合させることができる。

【0146】

抗ｈＴｆＲ抗体（ヒト化抗体又はヒト抗体である）の「軽鎖」のＣ末端側又はＮ末端側にＢＤＮＦを結合させたタイプの融合蛋白質において，抗ｈＴｆＲ抗体は，軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と，重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含むものであり，ＢＤＮＦが，この軽鎖のＣ末端側又はＮ末端側に結合したものである。ここで抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖とＢＤＮＦとは，直接結合してもよく，リンカーを介して結合してもよい。

【0147】

抗ｈＴｆＲ抗体（ヒト化抗体又はヒト抗体である）の「重鎖」のＣ末端側又はＮ末端側にＢＤＮＦを結合させたタイプの融合蛋白質において，抗ヒトトランスフェリン受容体抗体は，軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と，重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含むものであり，ＢＤＮＦが，この重鎖のＣ末端側又はＮ末端側に結合したものである。ここで抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖とＢＤＮＦとは，直接結合してもよく，リンカーを介して結合してもよい。

【0148】

抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとの間にリンカー配列を配置する場合，リンカー配列は，好ましくは１～５０個，より好ましくは１０～４０個，更に好ましくは２０～３４個，例えば２７個のアミノ酸から構成される。リンカー配列を構成するアミノ酸の個数は，１～１７個，１～１０個，１０～４０個，２０～３４個，２３～３１個，２５～２９個，２７個等と適宜調整される。そのようなリンカー配列は，これにより連結された抗ｈＴｆＲ抗体がｈＴｆＲに対する親和性を保持し，連結されたＢＤＮＦが，生理的条件下でその生理活性を発揮できる限り，アミノ酸配列に限定はないが，好ましくは，グリシンとセリンから構成されるものである。例えば，グリシン又はセリンのいずれか１個のアミノ酸からなるもの，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号３），アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号４），アミノ酸配列Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号５），又はこれらのアミノ酸配列が１～１０個，或いは２～５個連続してなる，５０個以下のアミノ酸からなる配列，２～１７個，２～１０個，１０～４０個，２０～３４個，２３～３１個，２５～２９個，又は２５個のアミノ酸からなる配列等を含むものが挙げられる。例えば，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号３）が５個連続してなる計２５個のアミノ酸を含むものは，リンカー配列として好適に用いることができる。

【0149】

抗ｈＴｆＲ抗体のｈＴｆＲに対する特異的親和性は，主に抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖及び軽鎖のＣＤＲのアミノ酸配列に依存する。それらＣＤＲのアミノ酸配列は，抗ｈＴｆＲ抗体がｈＴｆＲに加えてサルＴｆＲに対する特異的な親和性を有するものである限り，特に制限はない。

【0150】

本発明において，抗ｈＴｆＲ抗体がヒト化抗体又はヒト抗体である場合において，ｈＴｆＲに対して相対的に高い親和性を有し且つサルＴｆＲに対しても親和性を有する抗体は，特に，実施例７に記載の方法により測定したとき，ヒト及びサルのＴｆＲとの解離定数が次のものである：
（ａ）ｈＴｆＲとの解離定数：好ましくは１×１０^－１０Ｍ以下，より好ましくは２．５×１０^－１１Ｍ以下，更に好ましくは５×１０^－１２Ｍ以下，更により好ましくは１×１０^－１２Ｍ以下
（ｂ）サルＴｆＲとの解離定数：好ましくは１×１０^－９Ｍ以下，より好ましくは５×１０^－１０Ｍ以下，更に好ましくは１×１０^－１０Ｍ以下，例えば７．５×１０^－１１Ｍ以下。

【0151】

例えば，ｈＴｆＲ及びサルＴｆＲとの解離定数が，それぞれ，１×１０^－１０Ｍ以下と１×１０^－９Ｍ以下，１×１０^－１１Ｍ以下と５×１０^－１０Ｍ以下，５×１０^－１２Ｍ以下と１×１０^－１０Ｍ以下，５×１０^－１２Ｍ以下と７．５×１０^－１１Ｍ以下，１×１０^－１２Ｍ以下と１×１０^－１０Ｍ以下，１×１０^－１２Ｍ以下と７．５×１０^－１１Ｍ以下，であるものが挙げられる。ここにおいて，ヒトのＴｆＲとの解離定数に特段明確な下限はないが，例えば，５×１０^－１３Ｍ，１×１０^－１３Ｍ等とすることができる。また，サルのＴｆＲとの解離定数にも特段明確な下限はないが，例えば，５×１０^－１１Ｍ，１×１０^－１１Ｍ，１×１０^－１２Ｍ等とすることができる。抗体が一本鎖抗体であっても同様である。

【0152】

ＢＤＮＦと融合させるべき，ｈＴｆＲに親和性を有する抗体の好ましい実施形態として，抗体の重鎖のＣＤＲが以下に示すアミノ酸配列を有するものが例示できる。すなわち：
ＣＤＲ１が配列番号６６又は配列番号６７のアミノ酸配列を含んでなり，ＣＤＲ２が配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸配列を含んでなり，且つＣＤＲ３が配列番号１５又は配列番号１６のアミノ酸配列を含んでなるもの。

【0153】

ｈＴｆＲに親和性を有する抗体のより具体的な実施形態として，抗体の重鎖のＣＤＲが以下に示すアミノ酸配列を有するものが例示できる。すなわち：
ＣＤＲ１が配列番号６６のアミノ酸配列を含んでなり，ＣＤＲ２が配列番号１３のアミノ酸配列を含んでなり，及びＣＤＲ３が配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含んでなるもの。

【0154】

上記の好ましい実施形態において，抗体の重鎖のフレームワーク領域３のアミノ酸配列として好適なものに，配列番号６８のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。

【0155】

ｈＴｆＲに親和性を有する抗体の好ましい軽鎖と重鎖の組み合わせとしては，ＣＤＲが以下に示すアミノ酸配列を有するものが例示できる。すなわち：
ＣＤＲ１が配列番号６又は配列番号７のアミノ酸配列を含んでなり，ＣＤＲ２が配列番号８若しくは配列番号９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｌｙｓ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ，及びＣＤＲ３として配列番号１０のアミノ酸配列を含んでなるものである軽鎖と，ＣＤＲ１が配列番号６６又は配列番号６７のアミノ酸配列，ＣＤＲ２が配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸配列を含んでなり，及びＣＤＲ３として配列番号１５又は配列番号１６のアミノ酸配列を含んでなるものである重鎖との組み合わせ。

【0156】

ｈＴｆＲに親和性を有する抗体の軽鎖と重鎖の組み合わせの具体的態様としては，ＣＤＲが以下に示すアミノ酸配列を有するものが例示できる。すなわち：
ＣＤＲ１が配列番号６のアミノ酸配列を含んでなり，ＣＤＲ２が配列番号８のアミノ酸配列を含んでなり，及びＣＤＲ３が配列番号１０のアミノ酸配列を含んでなるものである軽鎖と，ＣＤＲ１が配列番号６６のアミノ酸配列を含んでなり，ＣＤＲ２が配列番号１３のアミノ酸配列を含んでなり，及びＣＤＲ３が配列番号１５のアミノ酸配列を含んでなるものである重鎖の組み合わせ。

【0157】

ｈＴｆＲに親和性を有するヒト化抗体の好ましい実施形態としては，以下に示すアミノ酸配列を有するものが例示できる。すなわち：
抗ｈＴｆＲ抗体であって，軽鎖の可変領域が，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，及び配列番号２２で示されるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含んでなり，重鎖の可変領域が，配列番号６９で示されるアミノ酸配列を含んでなるものである，抗ｈＴｆＲ抗体。

【0158】

配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，及び配列番号２２で示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列は，ＣＤＲ１が配列番号６又は７，ＣＤＲ２が配列番号８又は配列番号９，及びＣＤＲ３が配列番号１０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである。但し，配列番号１７～２２のアミノ酸配列において，ＣＤＲのアミノ酸配列はこれらに限定されるものではなく，これらＣＤＲのアミノ酸配列を含む領域，これらＣＤＲのアミノ酸配列の任意の連続した３個以上のアミノ酸を含むアミノ酸配列もＣＤＲとし得る。

【0159】

配列番号６９で示される重鎖可変領域のアミノ酸配列は，ＣＤＲ１が配列番号６６又は配列番号６７，ＣＤＲ２が配列番号１３又は配列番号１４，及びＣＤＲ３が配列番号１５又は配列番号１６のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである。但し，配列番号６９のアミノ酸配列において，ＣＤＲのアミノ酸配列はこれらに限定されるものではなく，これらＣＤＲのアミノ酸配列を含む領域，これらＣＤＲのアミノ酸配列の任意の連続した３個以上のアミノ酸を含むアミノ酸配列もＣＤＲとし得る。

【0160】

ｈＴｆＲに親和性を有するヒト化抗体のより具体的な実施形態の例としては，
（１ａ）軽鎖の可変領域が配列番号１８のアミノ酸配列を含み且つ重鎖の可変領域が配列番号６９のアミノ酸配列を含むもの，
（１ｂ）軽鎖の可変領域が配列番号２０のアミノ酸配列を含み且つ重鎖の可変領域が配列番号６９のアミノ酸配列を含むもの，
（１ｃ）軽鎖の可変領域が配列番号２１のアミノ酸配列を含み且つ重鎖の可変領域が配列番号６９のアミノ酸配列を含むもの，及び
（１ｄ）軽鎖の可変領域が配列番号２２のアミノ酸配列を含み且つ重鎖の可変領域が配列番号６９のアミノ酸配列を含むものが挙げられる。

【0161】

ｈＴｆＲに親和性を有するヒト化抗体のより具体的な実施形態の例としては，
（２ａ）軽鎖が配列番号２３のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号７０又は７２のアミノ酸配列を含むもの，
（２ｂ）軽鎖が配列番号２５のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号７０又は７２のアミノ酸配列を含むもの，
（２ｃ）軽鎖が配列番号２７のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号７０又は７２のアミノ酸配列を含むもの，
（２ｄ）軽鎖が配列番号２９のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号７０又は７２のアミノ酸配列を含むものが挙げられる。

【0162】

ｈＴｆＲに親和性を有するＦａｂであるヒト化抗体のより具体的な実施形態の例としては，
（３ａ）軽鎖が配列番号２３のアミノ酸配列を含み且つＦａｂ重鎖が配列番号６１のアミノ酸配列を含むもの，
（３ｂ）軽鎖が配列番号２５のアミノ酸配列を含み且つＦａｂ重鎖が配列番号６１のアミノ酸配列を含むもの，
（３ｃ）軽鎖が配列番号２７のアミノ酸配列を含み且つＦａｂ重鎖が配列番号６１のアミノ酸配列を含むもの，
（３ｄ）軽鎖が配列番号２９のアミノ酸配列を含み且つＦａｂ重鎖が配列番号６１のアミノ酸配列を含むものが挙げられる。

【0163】

抗ｈＴｆＲ抗体がＦａｂである場合において，別のＦｃ領域を融合蛋白質に導入したものの具体的な実施形態の例としては，
（４ａ）軽鎖が配列番号２３のアミノ酸配列を含み且つＦｃ領域を導入したＦａｂ重鎖が配列番号８１のアミノ酸配列を含むもの，
（４ｂ）軽鎖が配列番号２５のアミノ酸配列を含み且つＦｃ領域を導入したＦａｂ重鎖が配列番号８１のアミノ酸配列を含むもの，
（４ｃ）軽鎖が配列番号２７のアミノ酸配列を含み且つＦｃ領域を導入したＦａｂ重鎖が配列番号８１のアミノ酸配列を含むもの，
（４ｄ）軽鎖が配列番号２９のアミノ酸配列を含み且つＦｃ領域を導入したＦａｂ重鎖が配列番号８１のアミノ酸配列を含むものが挙げられる。

【0164】

なお，配列番号８１で示されるアミノ酸配列は，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体３ＮのＦａｂ重鎖のアミノ酸配列（アミノ酸配列６１）のＮ末端側に，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号３）が５個連続してなる計２５個のアミノ酸を含むリンカー配列を介して，配列番号７５で示されるアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を結合させたものである。

【0165】

上記（４ａ）～（４ｄ）において，例えば，ヒトＢＤＮＦのＣ末端側に直接又はリンカー配列を介してヒトＩｇＧ Ｆｃ領域が結合され，更に，該ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＣ末端側に直接又はリンカー配列を介して抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が結合される。

【0166】

ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の好ましい一実施形態として，配列番号７５のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。また，ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を導入した融合蛋白質として，ＢＤＮＦのＣ末端側にＦｃ領域，そのＣ末端側に抗ｈＴｆＲ抗体のＦａｂ重鎖が，それぞれリンカー配列を介して結合した配列番号７４のアミノ酸配列を有するものが一例として挙げられる。

【0167】

抗ｈＴｆＲ抗体がＦａｂである場合おいて、アルブミン親和性ペプチドを融合蛋白質に導入したものの具体的な実施形態の例としては，
アルブミン親和性ペプチドが配列番号８５で示されるアミノ酸配列を有するアルブミン結合ドメインであり，
（５ａ）軽鎖が配列番号２３のアミノ酸配列を含み，且つアルブミン親和性ペプチドを導入したＦａｂ重鎖が配列番号８９のアミノ酸配列を含むもの，
（５ｂ）軽鎖が配列番号２５のアミノ酸配列を含み，且つアルブミン親和性ペプチドを導入したＦａｂ重鎖が配列番号８９のアミノ酸配列を含むもの，
（５ｃ）軽鎖が配列番号２７のアミノ酸配列を含み，且つアルブミン親和性ペプチドを導入したＦａｂ重鎖が配列番号８９のアミノ酸配列を含むもの，
（５ｄ）軽鎖が配列番号２９のアミノ酸配列を含み，且つアルブミン親和性ペプチドを導入したＦａｂ重鎖が配列番号８９のアミノ酸配列を含むものが挙げられる。

【0168】

なお，配列番号８９で示されるアミノ酸配列は，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体３ＮのＦａｂ重鎖のアミノ酸配列（アミノ酸配列６１）のＣ末端側に，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号３）が３個連続してなる計１５個のアミノ酸を含むリンカー配列を介して，配列番号８５で示されるアミノ酸配列を有するアルブミン親和性ペプチドを結合させたものである。

【0169】

上記（５ａ）～（５ｄ）において，例えば，ヒトＢＤＮＦのＣ末端側に直接又はリンカー配列を介して抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が結合され，更に，該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体のＣ末端側に直接又はリンカー配列を介してアルブミン親和性ペプチドが結合される。

【0170】

アルブミン親和性ペプチドの好ましい一実施形態として，配列番号８５のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。また、アルブミン親和性ペプチドを導入した融合蛋白質として、ヒトプロＢＤＮＦ又はヒトＢＤＮＦのＣ末端側にＦａｂ重鎖，そのＣ末端側にアルブミン親和性ペプチドが，それぞれリンカー配列を介して結合した配列番号８７又は配列番号８８のアミノ酸配列を有するものが一例として挙げられる。

【0171】

ｈＴｆＲに親和性を有するヒト化抗体の好ましい実施形態を上記のごとく例示した。これらの抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖及び重鎖は，その可変領域のアミノ酸配列に，抗ｈＴｆＲ抗体とｈＴｆＲの親和性を所望なものに調整等する目的で，適宜，置換，欠失，付加等の変異を加えることができる。又，ｈＢＤＮＦの機能等を所望なものに調整する目的で，ｈＢＤＮＦに適宜，置換，欠失，付加等の変異を加えることもできる。

【0172】

軽鎖の可変領域のアミノ酸配列のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個，更により好ましくは１～２個である。軽鎖の可変領域のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個，尚も更に好ましくは１～２個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。

【0173】

軽鎖の可変領域にアミノ酸を付加する場合，軽鎖の可変領域のアミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個，更により好ましくは１～２個のアミノ酸が付加される。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は，元の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を有し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示す。

【0174】

特に，軽鎖の各ＣＤＲ又は各フレームワーク領域のそれぞれのアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１～５個であり，より好ましくは１～３個であり，更に好ましくは１～２個であり，更により好ましくは１個である。各ＣＤＲ又は各フレームワーク領域のそれぞれのアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～５個であり，より好ましくは１～３個であり，更に好ましくは１～２個であり，更により好ましくは１個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。

【0175】

軽鎖の各ＣＤＲ又は各フレームワーク領域のそれぞれのアミノ酸配列中にアミノ酸を付加させる場合，当該アミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，好ましくは１～５個，より好ましくは１～３個，更に好ましくは１～２個，更により好ましくは１個のアミノ酸が付加される。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた各ＣＤＲ又は各フレームワーク領域のそれぞれのアミノ酸配列は，元の各ＣＤＲのアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を有し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示す。

【0176】

重鎖の可変領域である配列番号６９で示されるアミノ酸配列のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させる場合，置換させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個であり，より好ましくは１～５個であり，更に好ましくは１～３個，更により好ましくは１～２個である。重鎖の可変領域のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個であり，より好ましくは１～５個であり，更に好ましくは１～３個であり，更により好ましくは１～２個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。

【0177】

重鎖の可変領域である配列番号６９で示されるアミノ酸配列にアミノ酸を付加させる場合，重鎖の可変領域のアミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個，更により好ましくは１～２個アミノ酸が付加される。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた重鎖の可変領域のアミノ酸配列は，元の重鎖の可変領域のアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を有し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示す。

【0178】

特に，配列番号６９で示されるアミノ酸配列中の，各ＣＤＲ又は各フレームワーク領域のそれぞれのアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させる場合，置換させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～５個であり，より好ましくは１～３個であり，更に好ましくは１～２個であり，更により好ましくは１個である。各ＣＤＲのそれぞれのアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～５個であり，より好ましくは１～３個であり，更に好ましくは１～２個であり，更により好ましくは１個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。

【0179】

配列番号６９で示されるアミノ酸配列中の，各ＣＤＲ又は各フレームワーク領域のそれぞれのアミノ酸配列中にアミノ酸を付加させる場合，当該アミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，好ましくは１～５個，より好ましくは１～３個，更に好ましくは１～２個，更により好ましくは１個のアミノ酸が付加される。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた各ＣＤＲのそれぞれのアミノ酸配列は，元の各ＣＤＲのアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を有し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示す。

【0180】

なお，上記のごとく抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖の可変領域である配列番号６９で示されるアミノ酸配列に，置換，欠失，付加等の変異を加える場合において，元となるＣＤＲ１のＮ末端側から５番目のアミノ酸であるメチオニンと，フレームワーク領域３のＮ末端側から１７番目のアミノ酸であるロイシンは，変異前と同位置に保存される。また，重鎖のＣＤＲ１及びフレームワーク領域３のアミノ酸配列は保存されることが好ましい。

【0181】

上記の抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖の可変領域への変異と，上記の抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖の可変領域への変異とを組み合わせて，抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖と重鎖の可変領域の両方に変異を加えることもできる。

【0182】

上記の抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列中のアミノ酸の他のアミノ酸による置換としては，例えば，芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ），脂肪族アミノ酸（Ａｌａ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ），極性アミノ酸（Ｇｌｎ，Ａｓｎ），塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｈｉｓ），酸性アミノ酸（Ｇｌｕ，Ａｓｐ），水酸基を有するアミノ酸（Ｓｅｒ，Ｔｈｒ）などの同じグループに分類されるアミノ酸間の置換が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は，蛋白質の表現型に変化をもたらさない（即ち，保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。但し，本発明者が先に見出し本願発明と同種の効果を有することを確認している抗体番号３（本願出願時点において未公開）のｈＴｆＲのフレームワーク領域３のアミノ酸配列である配列番号８３は，その第１７番目がＴｒｐであり，これに対し本願発明における抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎの重鎖のフレームワーク領域３は配列番号６８のアミノ酸配列を有し，そのＮ末端側から第１７番目がＬｅｕに置換されたものである。また，ＣＤＲ１のアミノ酸配列においては，配列番号１２の第５番目のＴｈｒが，配列番号６６で示されるようにＭｅｔに置換されたものである。ＴｒｐとＬｅｕとは上記の類似関係にはなく，そしてＴｈｒとＭｅｔも上記の類似関係にはない。ところが後述するように，当該置換を含む抗体番号３Ｎは，予想外にも，抗体番号３と効果の点で同種であり，しかも一層優れた効果を示す。

【0183】

なお，抗ｈＴｆＲ抗体又はｈＢＤＮＦに変異を加えてＣ末端又はＮ末端にアミノ酸を付加した場合において，その付加したアミノ酸が，抗ｈＴｆＲ抗体をＢＤＮＦと融合させたときに抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとの間に位置することとなった場合，当該付加したアミノ酸は，リンカーの一部を構成する。

【0184】

（１）融合蛋白質の製造方法
本発明の融合蛋白質は，後述の実施例に記載された方法又は本分野で周知の方法により製造することができる。
例えば，本明細書の実施例１６及び１７に記載したように取得した抗ヒトトランスフェリン抗体の重鎖のＮ末端に，直接又はリンカー（例えば，配列番号３が５回繰り返される２５個のアミノ酸からなるもの）を介して，ＢＤＮＦのＣ末端を融合させたものである融合蛋白質をコードするＤＮＡを有する発現用ベクターと，当該抗体の軽鎖をコードするＤＮＡを有する動植物細胞発現用ベクターをそれぞれ構築して，適当なホスト細胞に併せて導入することにより，本発明の融合蛋白質を産生する細胞あるいはトランスジェニック動植物を得ることができる。あるいは，取得した抗ヒトトランスフェリン抗体の軽鎖のＮ末端に，直接又はリンカー（例えば，配列番号３が５回繰り返される２５個のアミノ酸からなるもの）を介してＢＤＮＦのＣ末端を融合させたものである融合蛋白質をコードするＤＮＡを有する発現用ベクターと，当該抗体の重鎖をコードするＤＮＡを有する発現用ベクターをそれぞれ構築して，適当なホスト細胞に併せて導入することにより，本発明の融合蛋白質を産生する細胞あるいはトランスジェニック動植物を得ることができる。

【0185】

前記のように構築した融合蛋白質遺伝子は，公知の方法により発現させ，取得することができる。融合蛋白質の発現量を最大化するため，融合蛋白質遺伝子の塩基配列は，融合蛋白質の発現に使用される細胞又は動物種のコドン使用頻度に合わせ，最適化してもよい。哺乳類細胞の場合，常用される有用なプロモーター，発現される抗体遺伝子，その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させたＤＮＡ又はそれを含むベクターにより発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては，ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。

【0186】

また，その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして，レトロウイルス，ポリオーマウイルス，アデノウイルス，シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスプロモーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター１α（ｈＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサーを用いればよい。

【0187】

例えば，ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合，Ｍｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｒ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８－１１４），また，ｈＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合，Ｍｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ． ａｎｄ Ｎａｇａｔａ，Ｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）に従えば，容易に実施することができる。

【0188】

大腸菌の場合，常用される有用なプロモーター，抗体分泌のためのシグナル配列，発現させるべき抗体遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては，ｌａｃＺプロモーター，ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃＺプロモーターを使用する場合，Ｗａｒｄらの方法（Ｗａｒｄ， Ｅ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４－５４６；Ｗａｒｄ， Ｅ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．（１９９２）６，２４２２－２４２７），ａｒａＢプロモーターを使用する場合，Ｂｅｔｔｅｒらの方法（Ｂｅｔｔｅｒ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１－１０４３）に従えばよい。

【0189】

抗体分泌のためのシグナル配列としては，大腸菌のペリプラズムに産生させる場合，ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ， Ｓ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９－４３８３）を使用すればよい。（例えば，国際公開第９６／３０３９４号を参照）。

【0190】

複製起源としては，ＳＶ４０，ポリオーマウイルス，アデノウイルス，ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ，さらに，ホスト細胞系で遺伝子コピー数増幅のため，発現ベクターは選択マーカーとして，アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子，チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子，大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子，ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。

【0191】

真核細胞を使用する場合，動物細胞，植物細胞，又は真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞としては，（１）哺乳類細胞，例えば，ＣＨＯ，ＨＥＫ２９３，ＣＯＳ，ミエローマ，ＢＨＫ（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ），ＨｅＬａ，Ｖｅｒｏなど，（２）両生類細胞，例えば，アフリカツメガエル卵母細胞，又は（３）昆虫細胞，例えば，ｓｆ９，ｓｆ２１，Ｔｎ５などが知られている。植物細胞としては，ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が知られており，これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては，酵母，例えば，サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属，例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ），糸状菌，例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属，例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）などが知られている。

【0192】

原核細胞を使用する場合，細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては，大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ），枯草菌が知られている。

【0193】

これらの細胞に，目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し，形質転換された細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。培養は，公知の方法に従い行う。例えば，培養液として，ＤＭＥＭ，ＭＥＭ，ＲＰＭＩ１６４０，ＩＭＤＭを使用することができ，ウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。また，抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔等へ移すことにより，ｉｎ ｖｉｖｏにて抗体を産生してもよい。

【0194】

ｉｎ ｖｉｖｏの産生系としては，動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。動物を使用する場合，哺乳類動物，昆虫を用いる産生系などがある。

【0195】

哺乳類動物としては，ヤギ，ブタ，ヒツジ，マウス，ウシなどを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ Ｇｌａｓｅｒ， ＳＰＥＣＴＲＵＭ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また，昆虫としては，カイコを用いることができる。植物を使用する場合，例えばタバコを用いることができる。

【0196】

これらの動物又は植物に融合蛋白質遺伝子を導入し，動物又は植物の体内で融合蛋白質を産生させ，回収する。例えば，融合蛋白質遺伝子をヤギβ－カゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し，この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から所望の融合蛋白質を得る。トランスジェニックヤギから産生される所望の融合蛋白質を含む乳汁量を増加させるために，適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ， Ｋ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９－７０２）。

【0197】

また，カイコを用いる場合，目的の融合蛋白質遺伝子を挿入したバキュロウイルスをカイコに感染させ，このカイコの体液より所望の抗体を得る（Ｍａｅｄａ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２－５９４）。さらに，タバコを用いる場合，目的の融合蛋白質遺伝子を植物発現用ベクター，例えばｐＭＯＮ ５３０に挿入し，このベクターをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ，例えばＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍに感染させ，本タバコの葉より所望の融合蛋白質を得る（Ｊｕｌｉａｎ，Ｋ．－Ｃ．Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１－１３８）。

【0198】

前記のように産生，発現された融合蛋白質は，細胞内外，ホスト細胞から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される融合蛋白質の分離，精製はアフィニティークロマトグラフィーにより行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては，例えば，プロテインＡカラム，プロテインＧカラム，プロテインＬカラムが挙げられる。プロテインＡカラムに用いる担体として，例えば，Ｈｙｐｅｒ Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．等が挙げられる。その他，通常の蛋白質で使用されている分離，精製方法を使用すればよく，何ら限定されるものではない。必要に応じて，上記アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィー，濾過，限外濾過，塩析，透析等を組み合わせることにより，本発明に使用される抗体を分離，精製することもできる。クロマトグラフィーとしては，例えば，イオン交換クロマトグラフィー，疎水性クロマトグラフィー，ゲルろ過等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）に適用し得る。また，逆相ＨＰＬＣ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｈａｓｅ ＨＰＬＣ）を用いてもよい。

【0199】

ＢＤＮＦは，そのホモ二量体が標的細胞表面上にあるＢＤＮＦ受容体（ＴｒｋＢ）へ特異的に結合し，中枢および末梢神経系の細胞の分化，機能維持，シナプス形成，および損傷時の再生および修復などに重要な役割を果たす（非特許文献１，非特許文献２）。このような作用から，ＢＤＮＦは，中枢及び末梢の神経に障害を有する疾患の治療に広く応用可能な蛋白質として注目されている。

【0200】

また，ハンチントン病，パーキンソン病，アルツハイマー病等，種々の神経系の疾患においてＢＤＮＦの発現低下や量の低下が報告されており（Ｎｕｅｒｏｓｃｉ． Ｌｅｔｔ．（１９９９）２７０：４５－４８），浸透圧ポンプ等を用いこれらの疾患モデル動物の脳内又は髄腔内へＢＤＮＦを持続的に注入すると線条体の神経細胞死の抑制，運動障害の改善，記憶能力の改善などの効果を示すことが知られている（Ｊ． Ｎｕｅｒｏｓｃｉ．（２００４）２４：７７２７－７７３９，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｉ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１１３４７－１１３５１，Ｎａｔ． Ｍｅｄ．（２００９）１５：３３１－３３７）。

【0201】

さらには，ＢＤＮＦは歯の関連細胞や血管内皮細胞の増殖，分化促進，摂食調節，糖代謝等，多様な作用を有することも知られている（Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．（２００５）１１：１６１８－６２９，肥満研究（２００９）１５：９７－９９）。

【0202】

このことから，ＢＤＮＦは，アルツハイマー病，パーキンソン病，ハンチントン病などの神経変性疾患，筋萎縮性側策硬化症などの脊髄変性疾患，この他，糖尿病性神経障害，脳虚血性疾患，Ｒｅｔｔ症候群などの発達障害，統合失調症，うつ病等，様々な疾患の治療剤としての開発が期待されている（非特許文献３，非特許文献４，非特許文献５，非特許文献６，非特許文献７，非特許文献８，ＷＯ９１／０３５６８）。

【0203】

ＢＤＮＦは血液脳関門（ＢＢＢ；Ｂｌｏｏｄ－Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ）を通過することができないが，本発明の融合蛋白質（ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質）はＢＢＢを通過することが可能であるため，末梢投与した本発明の融合蛋白質が脳内に移行し，ＢＤＮＦが本来有する効果を発揮し得る。このようなＢＤＮＦの機能は，以下のような方法で確認することができる。

【0204】

（２）ＢＤＮＦの機能の評価方法
ＢＤＮＦの機能は，ＢＤＮＦ受容体（ＴｒｋＢ）に対する結合親和性（Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（１９９４）６：１３８９－１４０５），ＢＤＮＦ受容体のリン酸化を指標としたＢＤＮＦ受容体の活性化（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ（２０１５）１８５２：８６２－８７２），ＢＤＮＦ受容体の活性化に伴う細胞内カルシウム増加等の細胞内シグナル伝達増強活性（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）１０：８５０－８６０），ＴｒｋＢ発現神経細胞に対する増殖促進作用（岐阜薬科大学紀要（２００６）５５：５３－５４），生存維持作用（Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ（２０１５）６０：１１－１７），神経突起伸展作用（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２００７）２８２：３４５２５－３４５３４）等を調べることによりインビトロで評価できる。インビトロで用いる細胞としては，ＴｒｋＢを内在性に発現する細胞であっても外来性に強制発現させた細胞であってもよい。例えば，ＢＡＦ細胞，ＣＨＯ細胞，ＰＣ－１２細胞等にＴｒｋＢ遺伝子を導入して強制発現させた細胞や，海馬や線条体等の初代培養神経細胞を用いることができる。

【0205】

また，ＢＤＮＦの機能は，パーキンソン病，ハンチントン病，アルツハイマー病等の疾患モデル動物に対する治療効果（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｉ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９９４）９１：８９２０－８９２４）を調べることによりインビボで評価することができる。例えば，本発明の融合蛋白質（ＴｆＲ抗体－ＢＤＮＦ融合蛋白質）のｉｎ ｖｉｖｏでのＢＤＮＦ生物活性は，実施例２～５に記載するような方法を用いてパーキンソン病モデル動物における運動機能障害改善作用，線条体ドパミン量回復効果，線条体ドパミン神経再生効果等を調べることにより評価できる。パーキンソン病モデルとしては，ドパミン神経を特異的に破壊することが知られているＭＰＴＰ処置を行ったマウスおよびサルが利用できる。

【0206】

（３）融合蛋白質の用途
なお，ある疾患モデル動物，例えばパーキンソン病モデル動物において本発明の融合蛋白質（ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質）を末梢から投与することにより当該疾患又は障害が改善されたということは，ＢＤＮＦが本来有する効果を発揮し得る程度に本発明の融合蛋白質が必要部位（例えば脳内）に到達したことを示しており，このことは，本発明の融合蛋白質は，当該疾患に限らず，ＢＤＮＦへの曝露によって利益を得ることができる疾患および障害を治療するのに広く使用することができることを意味する。

【0207】

本発明は，本発明の融合蛋白質の治療有効量を有効成分として含有する医薬組成物を投与することによって，ＢＤＮＦの曝露によって利益を得ることができる疾患又は障害を治療するのに使用することができる。従って，本発明はまた，本発明の融合蛋白質を有効成分として含有してなるＢＤＮＦの曝露によって利益を得ることができる疾患又は障害の予防及び／又は治療剤を提供する。ここで「治療」なる用語は，完全治癒だけでなく症状の改善をも含む意味である。

【0208】

本発明の融合蛋白質への曝露によって利益を得ることができる疾患又は障害としては，ＢＤＮＦの発現もしくは量が低下することによって起こる疾患又は障害だけでなく，ＢＤＮＦが作用することによって治療可能な疾患又は障害も含まれ，例えば，神経系の疾患又は障害（神経変性疾患，うつ病，統合失調症，てんかん，自閉症，Ｒｅｔｔ症候群，Ｗｅｓｔ症候群，新生児痙攣，認知症に伴う問題行動（例，徘徊，攻撃的行為など），不安症，疼痛，ヒルシュスブルング病，レム睡眠行動障害等）およびその他の疾患又は障害が挙げられる。神経変性疾患としては，以下の脳神経変性疾患，脊髄変性疾患，網膜変性疾患，末梢神経変性疾患等が挙げられる。

【0209】

脳神経変性疾患としては，例えば，脳神経系の神経変性疾患（アルツハイマー病，パーキンソン病，ハンチントン病，レビー小体型認知症，ピック病，多系統萎縮症，進行性上行性麻痺，ダウン症候群など），脳虚血性疾患（脳卒中，脳梗塞，一過性脳虚血発作，クモ膜下出血，虚血性脳症，脳梗塞（ラクナ梗塞，アテローム血栓性脳梗塞，心原性脳梗塞症，出血性脳梗塞，その他の梗塞）など），外傷性脳損傷，白質脳症，および多発性硬化症などが挙げられる。

【0210】

脊髄変性疾患としては，例えば，筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ），脊髄損傷，種々の原因による脊髄障害，脊髄性進行性筋萎縮症，および脊髄小脳変性症などが挙げられる。網膜変性疾患としては，例えば，加齢黄斑変性症（ＡＭＤ），糖尿病性網膜症，網膜色素変性症，高血圧性網膜症，および緑内症などが挙げられる。

【0211】

末梢神経変性疾患としては，例えば，糖尿病性神経障害，末梢神経損傷，外傷性末梢神経障害，中毒，他の毒性物質による末梢神経障害，がん化学治療法による末梢神経障害，Ｇｕｉｌｌａｉｎ－Ｂａｒｒｅ症候群，ビタミン等の欠乏による末梢神経障害，アミロイド末梢神経障害，虚血性末梢神経障害，悪性腫瘍に伴う末梢神経障害，尿毒症性末梢神経障害，物理的原因による末梢神経障害，Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ－Ｔｏｏｔｈ病，アルコール性末梢神経障害，自律神経異常（無自覚性低血糖，胃不全麻痺，神経因性下痢および便秘，勃起不全，起立性低血圧，不整脈，心不全，無痛性心筋梗塞，発汗異常，神経因性膀胱など），膀胱機能障害（例，無抑制膀胱，反射性膀胱，自律性膀胱，知覚麻痺性膀胱，運動麻痺性膀胱など）などが挙げられる。

【0212】

その他の疾患又は障害としては，例えば，歯周病，糖尿病，糖尿病性心筋症，糖尿病性足病変，炎症性腸疾患（例，潰瘍性大腸炎，クローン病など），聴覚障害，骨疾患（例，骨粗しょう症など），関節疾患（例，シャルコー関節，変形性関節症，リウマチなど）などが挙げられる。

【0213】

本発明の融合蛋白質は，血中に投与して中枢神経系（ＣＮＳ）において薬効を発揮させるべき薬剤として使用することができる。かかる薬剤は，概ね点滴静脈注射等による静脈注射，皮下注射，筋肉注射により患者に投与されるが，投与経路には特に限定はない。

【0214】

（４）投与形態，投与量，投与方法
本発明の融合蛋白質は，薬剤として，凍結乾燥品，又は水性液剤等の形態で医療機関に供給することができる。水性液剤の場合，薬剤を，安定化剤，緩衝剤，等張化剤を含有する溶液に予め溶解したものを，バイアル又は注射器に封入した製剤として供給できる。注射器に封入された製剤は，一般にプレフィルドシリンジ製剤と呼称される。プレフィルドシリンジ製剤とすることにより，患者自身による薬剤の投与を簡易にすることができる。

【0215】

水性液剤として供給される場合，水性液剤に含有される抗ｈＴｆＲ抗体と結合させたＢＤＮＦの濃度は，用法用量によって適宜調整されるべきものであるが，例えば０．０１～５ｍｇ／ｍＬである。また，水性液剤に含有される安定化剤は，薬剤学的に許容し得るものである限り特に限定はないが，非イオン性界面活性剤が好適に使用できる。このような非イオン性界面活性剤としては，ポリソルベート，ポロキサマー等を単独で又はこれらを組合せて使用できる。ポリソルベートとしてはポリソルベート２０，ポリソルベート８０が，ポロキサマーとしてはポロキサマー１８８（ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール）が特に好適である。また，水性液剤に含有される非イオン性界面活性剤の濃度は，０．０１～１ｍｇ／ｍＬであることが好ましく，０．０１～０．５ｍｇ／ｍＬであることがより好ましく，０．１～０．５ｍｇ／ｍＬであることが更に好ましい。安定化剤として，ヒスチジン，アルギニン，メチオニン，グリシン等のアミノ酸を使用することもできる。安定化剤として使用する場合の，水性液剤に含有されるアミノ酸の濃度は，０．１～４０ｍｇ／ｍＬであることが好ましく，０．２～５ｍｇ／ｍＬであることがより好ましく，０．５～４ｍｇ／ｍＬであることが更に好ましい。水性液剤に含有される緩衝剤は，薬剤学的に許容し得るものである限り特に限定はないが，リン酸塩緩衝剤が好ましく，特にリン酸ナトリウム緩衝剤が好ましい。緩衝剤としてリン酸ナトリウム緩衝剤を使用する場合の，リン酸ナトリウムの濃度は，好ましくは０．０１～０．０４Ｍである。また，緩衝剤によって調整される水性液剤のｐＨは，好ましくは５．５～７．２である。水性液剤に含有される等張化剤は，薬剤学的に許容し得るものである限り特に限定はないが，塩化ナトリウム，マンニトールを単独で又は組み合わせて等張化剤として好適に使用できる。

【0216】

本発明の融合蛋白質を含有する上記医薬の投与量は，投与対象，対象疾患，症状，投与ルートなどによっても異なるが，例えば，神経変性疾患の治療・予防のために使用する場合には，投与量は，有効量，例えば，治療有効量として，脳内のＢＤＮＦとしての濃度が，少なくとも約０．００１ｎｇ／ｇ以上，好ましくは０．０１，０．１，１，１０又は１００ｎｇ／ｇ脳を上回るようにする。また，１回投与してから数日間（１，２，３，４，５，６，７日間），２週間，さらには１ヶ月間を過ぎてもＢＤＮＦの脳内レベルが上昇したまま維持されることが好ましく，脳内維持濃度として例えば，約１ｎｇ／ｇ脳，約１０ｎｇ／ｇ脳，約１００ｎｇ／ｇ脳，または約１００ｎｇ／ｇ脳を上回ったまま維持されることが好ましい。

【0217】

例えば，投与量は，これらに限定されるものではないが，いくつかの実施形態では，１回投与量として，０．０００１～１，０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内で選択することができる。あるいは，患者あたり，０．００１～１００，０００ｍｇの範囲内で選択することもできる。通常，約０．０１～１０００ｍｇ，約０．１～１００ｍｇ，約１～１００ｍｇ，約０．０５～５００ｍｇ，約０．５～５０ｍｇ，または約５ｍｇ～５０ｍｇの投与量で，例えば，静脈内投与で投与される。症状が特に重い場合には，その症状に応じて増量してもよい。

【0218】

本発明の組成物，例えば，本発明の融合蛋白質は，単独で用いてもよいし，または，本発明の効果を損なわない範囲において，必要に応じ，他の医薬品又は他の治療法と共に，同一の製剤内または別々の組成物として，患者に投与される。例えば，アルツハイマー型認知症において本発明の医薬組成物と併用される医薬としては，アルツハイマー病治療薬，例えば，塩酸ドネペジル，リバスチグミン，ガランタミン臭化水素塩酸などのアセチルコリンエステラーゼ阻害薬，もしくはメマンチン塩酸塩が挙げられる。また，現在臨床開発段階にあるソラネズマブ（Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．（２０１４）３７０：３１１－２１）やガンテネルマブ（Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ．（２０１２）６９：１９８－２０７）などの抗Ａβ抗体や，ベルベセスタット（ＡＡＩＣ ２０１３，Ｂｏｓｔｏｎ：Ａｂｓ ０１－０６－０５，Ｊｕｌ ２０１３）やＡＺＤ－３２９３（ＡＡＩＣ ２０１４， Ｃｏｐｅｎｈａｒｇｅｎ：ＡｂｓＰ１－３６３，Ｊｕｌ ２０１４）などのβアミロイド産生阻害剤なども挙げられる。アルツハイマー型認知症において本発明の医薬組成物と併用される治療法としては，脳活性型リハビリテーション療法などが挙げられる。パーキンソン病において本発明の医薬組成物と併用される医薬としては，パーキンソン病治療薬，例えば，レボドパなどのドパミン補充療法薬，タリペキソール，プラミペキソール，ブロモクリプチンなどのドパミン受容体作動薬，ＭＡＯ－Ｂ阻害剤やＣＯＭＴ阻害剤などのドパミン分解酵素阻害薬，アマンタジンやノウリアストなどのドパミン遊離促進薬が挙げられる。パーキンソン病において本発明の医薬組成物と併用される治療法としては，視床刺激術，淡蒼球刺激術，視床下核刺激術などが挙げられる。ハンチントン病において本発明の医薬組成物と併用される医薬としては，ハンチントン病治療薬，例えば，テトラベナジンなどのモノアミン小胞トランスポーター２阻害薬が挙げられる。脳虚血性疾患において本発明の医薬組成物と併用される医薬としては，ラジカットなどの脳保護薬，が挙げられる。脳虚血性疾患において本発明の医薬組成物と併用される治療法としては，血栓溶解療法，リハビリテーション療法などが挙げられる。

【0219】

本発明の医薬組成物を投与するタイミングは特に限定は無く，適宜他医薬の投与もしくは治療の前後もしくは同時であってよい。

【実施例0220】

以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。なお，実施例１～１５－３は，参考例（抗体番号３）についてのものである。

【0221】

〔実施例１〕ｈＴｆＲ発現用ベクターの構築
ヒト脾臓Ｑｕｉｃｋ Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を鋳型として，プライマーｈＴｆＲ５’（配列番号４１）及びプライマーｈＴｆＲ３’（配列番号４２）を用いて，ＰＣＲによりヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）をコードする遺伝子断片を増幅させた。増幅させたｈＴｆＲをコードする遺伝子断片を，ＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化し，ｐＣＩ－ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のＭｌｕＩとＮｏｔＩ間に挿入した。得られたベクターを，ｐＣＩ－ｎｅｏ（ｈＴｆＲ）と名付けた。次いで，このベクターを，ＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化して，ｈＴｆＲをコードする遺伝子断片を切り出し，国際公開公報（ＷＯ２０１２／０６３７９９）に記載された発現ベクターであるｐＥ－ｍＩＲＥＳ－ＧＳ－ｐｕｒｏのＭｌｕＩとＮｏｔＩの間に組み込むことにより，ｈＴｆＲ発現用ベクターであるｐＥ－ｍＩＲＥＳ－ＧＳ－ｐｕｒｏ（ｈＴｆＲ）を構築した。

【0222】

〔実施例２〕組換えｈＴｆＲの作製
エレクトロポレーション法により，ＣＨＯ－Ｋ１細胞にｐＥ－ｍＩＲＥＳ－ＧＳ－ｐｕｒｏ（ｈＴｆＲ）を導入した後，メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）及びピューロマイシンを含むＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ^ＴＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて細胞の選択培養を行い，組換えｈＴｆＲ発現細胞を得た。この組換えｈＴｆＲ発現細胞を培養して，組換えｈＴｆＲを調製した。

【0223】

〔実施例３〕組換えｈＴｆＲを用いたマウスの免疫
実施例２で調製した組換えｈＴｆＲを抗原として用いてマウスを免疫した。免疫は，マウスに抗原を静脈内投与又は腹腔内投与して行った。

【0224】

〔実施例４〕ハイブリドーマの作製
最後に細胞を投与した日の約１週間後にマウスの脾臓を摘出してホモジナイズし，脾細胞を分離した。得られた脾細胞をマウスミエローマ細胞株（Ｐ３．Ｘ６３．Ａｇ８．６５３）とポリエチレングリコール法を用いて細胞融合させた。細胞融合終了後，（１Ｘ）ＨＡＴサプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及び１０％ Ｕｌｔｒａ ｌｏｗ ＩｇＧウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に細胞を懸濁させ，細胞懸濁液を９６ウェルプレート２０枚に２００μＬ／ウェルずつ分注した。炭酸ガス培養器（３７℃，５％ＣＯ_２）で細胞を１０日間培養した後，各ウェルを顕微鏡下で観察し，単一のコロニーが存在するウェルを選択した。

【0225】

各ウェルの細胞がほぼコンフルエントになった時点で培養上清を回収し，これをハイブリドーマの培養上清として，以下のスクリーニングに供した。

【0226】

〔実施例５〕高親和性抗体産生細胞株のスクリーニング
組換えｈＴｆＲ溶液（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）を５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５～９．６）で希釈して５μｇ／ｍＬの濃度に調整し，これを固相溶液とした。固相溶液を，Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ^ＴＭ ｆｌａｔ－ｂｏｔｔｏｍ ９６ウェルプレート（基材：ポリスチレン，Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに５０μＬずつ添加した後，プレートを室温で１時間静置し，組換えｈＴｆＲをプレートに吸着させて固定した。固相溶液を捨て，各ウェルを２５０μＬの洗浄液（ＰＢＳ－Ｔ：０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄した後，各ウェルにブロッキング液（１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ）を２００μＬずつ添加し，プレートを室温で１時間静置した。

【0227】

ブロッキング液を捨て，各ウェルを２５０μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後，各ウェルにハイブリドーマの培養上清を５０μＬずつ添加し，プレートを室温で１時間静置し，培養上清に含まれるマウス抗ｈＴｆＲ抗体を組換えｈＴｆＲに結合させた。このとき，コントロールとして，マウス抗ｈＴｆＲ抗体を産生しないハイブリドーマの培養上清をウェルに５０μＬ添加したものを置いた。また，各培養上清を加えたウェルの横のウェルに，ハイブリドーマの培養用培地を５０μＬ添加したものを置き，これをモックウェルとした。測定はｎ＝２で実施した。次いで，溶液を捨て，各ウェルを２５０μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。

【0228】

上記の各ウェルに１００μＬのＨＲＰ標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体溶液（プロメガ社）を添加し，プレートを室温で１分間静置した。次いで，溶液を捨て，各ウェルを２５０μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。次いで，各ウェルに５０μＬの発色用基質液ＴＭＢ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｏｒ Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（プロメガ社）を添加し，室温で１０～２０分間静置した。次いで，各ウェルに１００μＬの停止液（２Ｎ硫酸）を添加した後，プレートリーダーを用いて各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。各培養上清及びコントロールの２つのウェルの平均値をとり，これらの平均値から，各培養上清及びコントロール毎に置いた２つのモックウェルの平均値をそれぞれ減じたものを測定値とした。

【0229】

高い測定値を示したウェルに添加した培養上清に対応する１４種類のハイブリドーマ細胞を，ｈＴｆＲに対して高親和性を示す抗体（高親和性抗ｈＴｆＲ抗体）を産生する細胞株（高親和性抗体産生細胞株）として選択した。これら１４種の細胞株を，クローン１株～クローン１４株と番号付けた。これら細胞株からクローン３株を選択し，以下の実験に用いた。また，クローン３株が産生する抗ｈＴｆＲ抗体を，抗ｈＴｆＲ抗体番号３とした。

【0230】

〔実施例６〕高親和性抗ｈＴｆＲ抗体の可変領域のアミノ酸配列の解析
実施例５で選択したクローン３株からｃＤＮＡを調製し，このｃＤＮＡを鋳型として抗体の軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子を増幅させた。増幅させた遺伝子の塩基配列を翻訳し，この細胞株の産生する抗ｈＴｆＲ抗体番号３の抗体について，軽鎖及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列を決定した。

【0231】

抗ｈＴｆＲ抗体番号３は，軽鎖の可変領域に配列番号４８に記載のアミノ酸配列と，重鎖の可変領域に配列番号４９に記載のアミノ酸配列とを含むものであった。また，その軽鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号６又は７，ＣＤＲ２に配列番号８又は９，及びＣＤＲ３に配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含んでなり，その重鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号１１又は１２，ＣＤＲ２に配列番号１３又は１４，及びＣＤＲ３に配列番号１５又は１６に記載のアミノ酸配列を含んでなるものであった。但し，ＣＤＲは上記のアミノ酸配列に限られず，これらのアミノ酸配列を含む領域，これらのアミノ酸配列の一部を含む連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列もＣＤＲとすることができると考えられた。

【0232】

抗ｈＴｆＲ抗体番号３の，軽鎖の可変領域のＣＤＲ１～３と重鎖の可変領域のＣＤＲ１～３に含まれるアミノ酸配列の配列番号を，表１にまとめて示す。但し，表１は各ＣＤＲのアミノ酸配列を例示するものであり，各ＣＤＲのアミノ酸配列は表１に記載のアミノ酸配列に限られるものではなく，これらのアミノ酸配列を含む領域のアミノ酸配列，これらのアミノ酸配列の一部を含む連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列もＣＤＲとし得ると考えられる。

【0233】

【表1】

【0234】

〔実施例７〕抗ｈＴｆＲ抗体のヒトＴｆＲ及びサルＴｆＲへの親和性の測定
抗ｈＴｆＲ抗体とヒトＴｆＲ及びサルＴｆＲへの親和性の測定は，バイオレイヤー干渉法（ＢｉｏＬａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ：ＢＬＩ）を用いた生体分子相互作用解析システムであるＯｃｔｅｔＲＥＤ９６（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社，ａ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて実施した。バイオレイヤー干渉法の基本原理について，簡単に説明する。センサーチップ表面に固定された生体分子の層（レイヤー）に特定波長の光を投射したとき，生体分子のレイヤーと内部の参照となるレイヤーの二つの表面から光が反射され，光の干渉波が生じる。測定試料中の分子がセンサーチップ表面の生体分子に結合することにより，センサー先端のレイヤーの厚みが増加し，干渉波に波長シフトが生じる。この波長シフトの変化を測定することにより，センサーチップ表面に固定された生体分子に結合する分子数の定量及び速度論的解析をリアルタイムで行うことができる。測定は，概ねＯｃｔｅｔＲＥＤ９６に添付の操作マニュアルに従って実施した。ヒトＴｆＲとしては，Ｎ末端にヒスチジンタグが付加した，配列番号１に示されるアミノ酸配列の中でＮ末端側から８９番目のシステイン残基からＣ末端のフェニルアラニンまでの，ｈＴｆＲの細胞外領域のアミノ酸配列を有する組換えヒトＴｆＲ（ｒヒトＴｆＲ：Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）を用いた。サルＴｆＲとしては，Ｎ末端にヒスチジンタグが付加した，配列番号２に示されるアミノ酸配列の中でＮ末端側から８９番目のシステイン残基からＣ末端のフェニルアラニンまでの，カニクイザルのＴｆＲの細胞外領域のアミノ酸配列を有する組換えサルＴｆＲ（ｒサルＴｆＲ：Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）を用いた。

【0235】

実施例５で選択したクローン３株を，細胞濃度が約２×１０^５個／ｍＬとなるように，（１Ｘ）ＨＡＴサプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及び１０％ Ｕｌｔｒａ ｌｏｗ ＩｇＧウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で希釈し，１Ｌの三角フラスコに２００ｍＬの細胞懸濁液を加え，３７℃で，５％ＣＯ_２と９５％空気からなる湿潤環境で約７０ｒｐｍの撹拌速度で６～７日間培養した。培養液を遠心操作した後に，０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過して，培養上清を回収した。回収した培養上清を，予め１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むカラム体積３倍容の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化しておいたＰｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（カラム体積：１ｍＬ，ＧＥヘルスケア社）に負荷した。次いで，カラム体積の５倍容の同緩衝液によりカラムを洗浄した後，１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むカラム体積の４倍容の５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ２．８）で，吸着した抗体を溶出させ，溶出画分を採取した。溶出画分を１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加してｐＨ７．０に調整した。これを抗ｈＴｆＲ抗体番号３の精製品としてとして以下の実験に用いた。

【0236】

抗ｈＴｆＲ抗体番号３の精製品を，ＨＢＳ－Ｐ＋（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５０μＭ ＥＤＴＡ及び０．０５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０を含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）で２段階希釈し，０．７８１２５～５０ｎＭ（０．１１７～７．５μｇ／ｍＬ）の７段階の濃度の抗体溶液を調製した。この抗体溶液をサンプル溶液とした。ｒヒトＴｆＲとｒサルＴｆＲとを，それぞれＨＢＳ－Ｐ＋で希釈し，２５μｇ／ｍＬの溶液を調製し，それぞれｒヒトＴｆＲ－ＥＣＤ（Ｈｉｓｔａｇ）溶液及びｒサルＴｆＲ－ＥＣＤ（Ｈｉｓｔａｇ）溶液とした。

【0237】

上記２段階希釈して調製したサンプル溶液を，９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ， ｂｌａｃｋ（ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏｏｎｅ社）に２００μＬ／ウェルずつ添加した。また，上記調製したｒヒトＴｆＲ－ＥＣＤ（Ｈｉｓｔａｇ）溶液及びｒサルＴｆＲ－ＥＣＤ（Ｈｉｓｔａｇ）溶液を，所定のウェルにそれぞれ２００μＬ／ウェルずつ添加した。ベースライン，解離用及び洗浄用のウェルには，ＨＢＳ－Ｐ＋を２００μＬ／ウェルずつ添加した。再生用のウェルには，１０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ，ｐＨ１．７を２００μＬ／ウェルずつ添加した。活性化用のウェルには，０．５ｍＭ ＮｉＣｌ_２溶液を２００μＬ／ウェルずつ添加した。このプレートと，バイオセンサー（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ／Ｎｉ－ＮＴＡ：ＦｏｒｔｅＢｉｏ社，ａ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を，ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６の所定の位置に設置した。

【0238】

ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６を下記の表２に示す条件で作動させてデータを取得後，ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６付属の解析ソフトウェアを用いて，結合反応曲線を１：１結合モデルあるいは２：１結合モデルにフィッティングし，抗ｈＴｆＲ抗体と，ｒヒトＴｆＲ及びｒサルＴｆＲに対する会合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）を測定し，解離定数（Ｋ_Ｄ）を算出した。なお，測定は２５～３０℃の温度下で実施した。

【0239】

【表2】

【0240】

表３に抗ｈＴｆＲ抗体番号３のヒトＴｆＲ及びサルＴｆＲに対する会合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）の測定結果，及び解離定数（Ｋ_Ｄ）を示す。

【0241】

【表3】

【0242】

抗ｈＴｆＲ抗体のヒトＴｆＲへの親和性の測定の結果，抗ｈＴｆＲ抗体番号３のヒトＴｆＲとの解離定数は１×１０^－１２Ｍ以下であり，サルＴｆＲとの解離定数も１×１０^－１２Ｍ以下であった。これらの結果は，抗ｈＴｆＲ抗体番号３がヒトＴｆＲのみならずサルＴｆＲとも高い親和性を有する抗体であることを示す。

【0243】

〔実施例７－２〕抗ｈＴｆＲ抗体のマウスを用いた脳移行評価
次いで，抗ｈＴｆＲ抗体番号３について，各抗体がＢＢＢを通過して脳内に移行することを，マウストランスフェリン受容体の細胞外領域をコードする遺伝子をヒトトランスフェリン受容体遺伝子の細胞外領域をコードする遺伝子に置換したｈＴｆＲノックインマウス（ｈＴｆＲ－ＫＩマウス）を用いて評価した。ｈＴｆＲ－ＫＩマウスは，概ね下記の方法で作製した。また，抗ｈＴｆＲ抗体番号３としては，実施例７で調製した精製品を用いた。

【0244】

細胞内領域がマウスＴｆＲのアミノ酸配列であり，細胞外領域がヒトＴｆＲのアミノ酸配列であるキメラｈＴｆＲをコードするｃＤＮＡの３’側に，ｌｏｘＰ配列で挟み込んだネオマイシン耐性遺伝子を配置した，配列番号４５で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を化学的に合成した。このＤＮＡ断片を，５’アーム配列として配列番号４６で示される塩基配列，３’アーム配列として配列番号４７で示される塩基配列を有するターゲッティングベクターに，常法により組み込み，これをマウスＥＳ細胞にエレクトロポレーション法により導入した。遺伝子導入後のマウスＥＳ細胞を，ネオマイシン存在下で選択培養し，ターゲッティングベクターが相同組換えにより染色体に組み込まれたマウスＥＳ細胞を選択した。得られた遺伝子組換えマウスＥＳ細胞を，ＩＣＲマウスの８細胞期胚（宿主胚）へ注入し，精管結紮を行ったマウスとの交配によって得られた偽妊娠マウス（レシピエントマウス）に移植した。得られた産仔（キメラマウス）について毛色判定を行い，ＥＳ細胞が生体の形成に高効率で寄与した個体，すなわち全体毛に対する白色毛の占める比率の高い個体を選別した。このキメラマウス個体をＩＣＲマウスと掛け合わせてＦ１マウスを得た。白色のＦ１マウスを選別し，尻尾の組織より抽出したＤＮＡを解析し，染色体上でマウストランスフェリン受容体遺伝子がキメラｈＴｆＲに置き換わっているマウスをｈＴｆＲ－ＫＩマウスとした。

【0245】

抗ｈＴｆＲ抗体番号３の精製品を，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ_２（同仁化学研究所）を用いて，添付の操作マニュアルに従ってフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）により蛍光標識した。このＦＩＴＣ蛍光標識した抗体を含むＰＢＳ溶液を調製した。この抗体溶液を，投与される抗ｈＴｆＲ抗体の用量が３ｍｇ／ｋｇとなるように，１匹のｈＴｆＲ－ＫＩマウス（雄，１０～１２週齢）に静脈注射した。また，コントロールとして，同様にして調製したＦＩＴＣ蛍光標識したマウスＩｇＧ１（シグマ社）を含むＰＢＳ溶液を，３ｍｇ／ｋｇの用量で１匹のｈＴｆＲ－ＫＩマウス（雄，１０～１２週齢）に静脈注射した。静脈注射してから約８時間後に生理食塩液で全身潅流し，脳（大脳と小脳を含む部分）を採取した。摘出した脳の重量（湿重量）を測定した後，Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（シグマ社）を含むＴ－ＰＥＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加して脳組織をホモジネートした。ホモジネートを遠心して上清を回収し，上清中に含まれるＦＩＴＣ蛍光標識した抗体の量を以下の方法で測定した。まず，抗ＦＩＴＣ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社）をＨｉｇｈ Ｂｉｎｄ Ｐｌａｔｅ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）の各ウェルに１０μＬずつ添加し，１時間静置してプレートに固定させた。次いで，各ウェルにＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ｉｎ ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を１５０μＬずつ添加し，１時間振盪してプレートをブロッキングした。次いで，各ウェルに脳組織のホモジネートの上清を２５μＬずつ添加し，１時間振盪した。次いで，各ウェルにＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ抗体（Ｇｏａｔ）（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を２５μＬずつ添加し，１時間振盪した。次いで，各ウェルにＲｅａｄ ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を１５０μＬずつ添加し，Ｓｅｃｔｏｒ^ＴＭ Ｉｍａｇｅｒ ６０００ ｒｅａｄｅｒを用いて各ウェルからの発光量を測定した。濃度既知のＦＩＴＣ蛍光標識した抗ｈＴｆＲ抗体の標準試料の測定値から検量線を作成し，これに各検体の測定値を内挿することにより，脳のグラム重量（湿重量）当たりに含まれる抗体の量（脳組織中の抗ｈＴｆＲ抗体の濃度）を算出した。その結果を表４に示す。

【0246】

コントロールと比較して，抗ｈＴｆＲ抗体番号３の脳組織中の濃度は，約２７．８倍であった。この結果は，抗ｈＴｆＲ抗体番号３が，ＢＢＢを積極的に通過して脳内に移行する性質を有することを示すものである。

【0247】

【表4】

【0248】

〔実施例８〕抗ｈＴｆＲ抗体のサルを用いた薬物動態解析
抗ｈＴｆＲ抗体番号３を，５．０ｍｇ／ｋｇの用量で雄性カニクイザルに単回静脈内投与し，投与８時間後に生理食塩液で全身潅流を実施した。また，陰性対照として，抗ｈＴｆＲ抗体を非投与の１匹の個体を同様に全身潅流した。潅流後，延髄を含む脳組織を摘出した。この脳組織を用いて，以下の抗ｈＴｆＲ抗体の濃度測定及び免疫組織化学染色を行った。抗ｈＴｆＲ抗体番号３としては，実施例７に記載の抗体の精製品を用いた。

【0249】

脳組織中の抗ｈＴｆＲ抗体の濃度測定は，概ね以下の手順で行った。採取した組織を，脳組織を大脳，小脳，海馬及び延髄に分けてから，それぞれＰｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含むＲＩＰＡ Ｂｕｆｆｅｒ（和光純薬工業株式会社）でホモジネートし遠心して上清を回収した。Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｆｃγ ｐＡｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）をＨｉｇｈ Ｂｉｎｄ Ｐｌａｔｅ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）の各ウェルに１０μＬずつ添加し，１時間静置してプレートに固定した。次いで，各ウェルにＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ｉｎ ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を１５０μＬずつ添加し，１時間振盪し，プレートをブロッキングした。次いで，各ウェルに脳組織のホモジネートの上清を２５μＬずつ添加し，１時間振盪した。次いで，各ウェルにＡｆｆｉｎｉｐｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｆａｂ－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を２５μＬずつ添加し，１時間振盪した。次いで，各ウェルにＳＵＬＦＯ－Ｔａｇ－Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を２５μＬずつ添加し，０．５時間振盪した。各ウェルにＲｅａｄ ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を１５０μＬずつ添加し，Ｓｅｃｔｏｒ^ＴＭ Ｉｍａｇｅｒ ６０００ ｒｅａｄｅｒ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いて各ウェルからの発光量を測定した。濃度既知の抗ｈＴｆＲ抗体の標準試料の測定値から検量線を作成し，これに各検体の測定値を内挿することにより，各脳組織のグラム重量（湿重量）当たりに含まれる抗体の量（脳組織中の抗ｈＴｆＲ抗体の濃度）を算出した。

【0250】

脳組織中の抗ｈＴｆＲ抗体の濃度測定の結果を表５に示す。大脳，小脳，海馬及び頸髄のすべてにおいて，抗ｈＴｆＲ抗体番号３の蓄積が認められた。これらの結果は，抗ｈＴｆＲ抗体番号３が血液脳関門を通過して脳組織に蓄積する性質を有することを示すものであり，脳組織内で機能させるべき薬剤をこれらの抗体と結合させることにより，その薬剤を効率良く脳組織に蓄積させることができることを示すものである。

【0251】

【表5】

【0252】

脳組織中の抗ｈＴｆＲ抗体の免疫組織化学染色は，概ね以下の手順で行った。ティシューテッククライオ３ＤＭ（サクラファインテック株式会社）を用いて，採取した組織を－８０℃にまで急速冷凍し，組織の凍結ブロックを作製した。この凍結ブロックを４μｍに薄切後，ＭＡＳコートスライドガラス（松浪ガラス株式会社）に貼り付けた。組織薄片に４％パラホルムアルデヒド（和光純薬工業株式会社）を４℃で５分間反応させ，組織薄片をスライドガラス上に固定した。続いて，組織薄片に０．３％過酸化水素水を含むメタノール溶液（和光純薬工業株式会社）を３０分間反応させ，内因性ペルオキシダーゼを失活させた。次いでスライドガラスをＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ｉｎ ＰＢＳに３０分間室温で反応させてブロッキングした。次いで，組織薄片にＭｏｕｓｅ ＩｇＧ－ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を１時間室温で反応させた。組織薄片を，ＤＡＢ基質（３，３’－ジアミノベンジジン，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）で発色させ，マイヤー・ヘマトキシリン（Ｍｅｒｃｋ社）で対比染色を行い，脱水，透徹した後に封入し，光学顕微鏡で観察した。

【0253】

図１に大脳皮質の抗ｈＴｆＲ抗体の免疫組織化学染色の結果を示す。抗ｈＴｆＲ抗体番号３を投与したサルの大脳皮質では，血管の特異的な染色が確認された（図１ｂ）。更に，脳血管外の脳実質領域にも広範に特異的な染色が確認された。一方，コントロールとしておいた抗ｈＴｆＲ抗体を非投与のサルの大脳皮質では染色は認められず，バックグラウンドの染色は殆どないことが示された（図１ａ）。

【0254】

図２に海馬の抗ｈＴｆＲ抗体の免疫組織化学染色の結果を示す。抗ｈＴｆＲ抗体番号３を投与したサルの大脳皮質では，血管の特異的な染色が確認された（図２ｂ）。更に，神経様細胞にも特異的な染色が確認され，また，脳血管外の脳実質領域にも広範に特異的な染色が確認された。一方，コントロールとしておいた抗ｈＴｆＲ抗体を非投与のサルの海馬では染色は認められず，バックグラウンドの染色は殆どないことが示された（図２ａ）。

【0255】

図３に小脳の抗ｈＴｆＲ抗体の免疫組織化学染色の結果を示す。抗ｈＴｆＲ抗体番号３を投与したサルの大脳皮質では，血管の特異的な染色が確認された（図３ｂ）。更に，プルキンエ細胞にも特異的な染色が確認された。一方，コントロールとしておいた抗ｈＴｆＲ抗体を非投与のサルの小脳では染色は認められず，バックグラウンドの染色は殆どないことが示された（図３ａ）。

【0256】

以上の大脳，海馬及び小脳の免疫組織化学染色の結果から，抗ｈＴｆＲ抗体番号３は，脳血管内皮表面に存在するｈＴｆＲへ結合することができ，且つ，ｈＴｆＲへの結合後，血液脳関門を通過して脳実質内へ移行し，さらに海馬においては脳実質内から神経様細胞にまで，小脳においてはプルキンエ細胞にまで取り込まれることがわかった。

【0257】

〔実施例９〕ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の作製
抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖及び重鎖の可変領域に含まれるアミノ酸配列のヒト化を試みた。そうして，配列番号１７～配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有するヒト化された軽鎖の可変領域と，配列番号３１～配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有するヒト化された重鎖の可変領域を得た（ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列１～６，及びヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列１～６）。

【0258】

〔実施例１０〕ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子の構築
上記の抗ｈＴｆＲ抗体番号３について，それぞれヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域を含む，軽鎖及び重鎖の全長をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を人工的に合成した。このとき，軽鎖の全長をコードする遺伝子の５’側には，５’端から順にＭｌｕＩ配列とリーダーペプチドをコードする配列とを，３’側にはＮｏｔＩ配列を導入した。また，重鎖の全長をコードする遺伝子の５’側には，５’端から順にＭｌｕＩ配列とリーダーペプチドをコードする配列とを，３’側にはＮｏｔＩ配列を導入した。なお，ここで導入したリーダーペプチドは，ヒト化抗体の軽鎖及び重鎖をホスト細胞である哺乳動物細胞で発現させたときに，軽鎖及び重鎖が細胞外に分泌されるように，分泌シグナルとして機能するものである。

【0259】

抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖については，可変領域に配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有する，配列番号２３で示されるアミノ酸配列の軽鎖（以下，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖）の全長をコードするＤＮＡ断片（配列番号２４）を合成した。抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖については，可変領域に配列番号３２で示されるアミノ酸配列を有する，配列番号３７で示されるアミノ酸配列の重鎖（以下，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖）の全長をコードするＤＮＡ断片（配列番号３８）を合成した。配列番号３８で示されるＤＮＡ断片にコードされるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖はＩｇＧ１である。

【0260】

抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖については，可変領域に配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有する，配列番号２５で示されるアミノ酸配列の軽鎖（以下，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２の軽鎖）の全長をコードするＤＮＡ断片（配列番号２６）と，可変領域に配列番号２１で示されるアミノ酸配列を有する，配列番号２７で示されるアミノ酸配列の軽鎖（以下，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－３の軽鎖）の全長をコードするＤＮＡ断片（配列番号２８）と，可変領域に配列番号２２で示されるアミノ酸配列を有する，配列番号２９で示されるアミノ酸配列の軽鎖（以下，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－４の軽鎖）の全長をコードするＤＮＡ断片（配列番号３０）も合成した。

【0261】

更に，抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖については，可変領域に配列番号３２で示されるアミノ酸配列を有する，配列番号３９で示されるアミノ酸配列の重鎖（以下，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＩｇＧ４）の全長をコードするＤＮＡ断片（配列番号４０）を合成した。この配列番号４０で示されるＤＮＡ断片にコードされるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖はＩｇＧ４である。

【0262】

〔実施例１１〕ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体発現ベクターの構築
ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｎｕｃベクター（インビトロジェン社）を，ＫｐｎＩとＮｃｏＩで消化し，ＥＦ－１αプロモーターおよびその第一イントロンを含む領域を切り出し，これをＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理した。ｐＣＩ－ｎｅｏ（インビトロジェン社）を，ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化して，ＣＭＶのエンハンサー／プロモーターおよびイントロンを含む領域を切除した後に，Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理した。これに，上記のＥＦ－１αプロモーターおよびその第一イントロンを含む領域を挿入して，ｐＥ－ｎｅｏベクターを構築した。ｐＥ－ｎｅｏベクターを，ＳｆｉＩおよびＢｓｔＸＩで消化し，ネオマイシン耐性遺伝子を含む約１ｋｂｐの領域を切除した。ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）（インビトロジェン社）を鋳型にしてプライマーＨｙｇ－Ｓｆｉ５’（配列番号４３）およびプライマーＨｙｇ－ＢｓｔＸ３’（配列番号４４）を用いて，ＰＣＲ反応によりハイグロマイシン遺伝子を増幅した。増幅したハイグロマイシン遺伝子を，ＳｆｉＩおよびＢｓｔＸＩで消化し，上記のネオマイシン耐性遺伝子を切除したｐＥ－ｎｅｏベクターに挿入して，ｐＥ－ｈｙｇｒベクターを構築した。

【0263】

ｐＥ－ｈｙｇｒベクター及びｐＥ－ｎｅｏベクターをそれぞれＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化した。実施例１０で合成したヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖をコードするＤＮＡ断片（配列番号２４）と重鎖をコードするＤＮＡ断片（配列番号３８）をＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化し，それぞれｐＥ－ｈｙｇｒベクターとｐＥ－ｎｅｏベクターのＭｌｕＩ－ＮｏｔＩ間に挿入した。得られたベクターを，それぞれヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖発現用ベクターのｐＥ－ｈｙｇｒ（ＬＣ３），ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖発現用ベクターのｐＥ－ｎｅｏ（ＨＣ３）として以下の実験に用いた。

【0264】

更に，抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖については，実施例１０で合成したヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２の軽鎖をコードするＤＮＡ断片（配列番号２６），ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－３の軽鎖をコードするＤＮＡ断片（配列番号２８），及びヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－４の軽鎖をコードするＤＮＡ断片（配列番号３０）をＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化し，ｐＥ－ｈｙｇｒベクターのＭｌｕＩ－ＮｏｔＩ間に挿入し，それぞれヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２の軽鎖発現用ベクターのｐＥ－ｈｙｇｒ（ＬＣ３－２），ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－３の軽鎖発現用ベクターのｐＥ－ｈｙｇｒ（ＬＣ３－３），及びヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－４の軽鎖発現用ベクターのｐＥ－ｈｙｇｒ（ＬＣ３－４）を構築した。

【0265】

更に同様に，抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖については，実施例１０で合成したヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＩｇＧ４をコードするＤＮＡ断片（配列番号４０）をＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化し，ｐＥ－ｎｅｏベクターのＭｌｕＩ－ＮｏｔＩ間に挿入し，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＩｇＧ４発現用ベクターのｐＥ－ｎｅｏ（ＨＣ３－ＩｇＧ４）を構築した。

【0266】

〔実施例１２〕ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体発現用細胞の構築
ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－Ｋ１：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手）を，下記の方法により，ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いて，実施例１１で構築した軽鎖発現用ベクターｐＥ－ｈｙｇｒ（ＬＣ３）及び重鎖発現用ベクターｐＥ－ｎｅｏ（ＨＣ３）で形質転換した。細胞の形質転換は概ね以下の方法で行った。５×１０^５個のＣＨＯ－Ｋ１細胞をＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ^ＴＭ培地（ライフテクノロジー社）を添加した３．５ｃｍ培養ディッシュに播種し，３７℃，５％ＣＯ_２の条件下で一晩培養した。培地をＯｐｔｉ－ＭＥＭ^ＴＭ Ｉ培地（ライフテクノロジー社）に交換し，細胞を５×１０^６細胞／ｍＬの密度となるように懸濁した。細胞懸濁液１００μＬを採取し，これにＯｐｔｉ－ＭＥＭ^ＴＭ Ｉ培地で１００μｇ／ｍＬに希釈したｐＥ－ｈｙｇｒ（ＬＣ３）及びｐＥ－ｎｅｏ（ＨＣ３）プラスミドＤＮＡ溶液を５μＬずつ添加した。ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いて，エレクトロポレーションを実施し，細胞にプラスミドを導入した。細胞を，３７℃，５％ＣＯ_２の条件下で一晩培養した後，０．５ｍｇ／ｍＬのハイグロマイシン及び０．８ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を添加したＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ^ＴＭ培地で選択培養した。
次いで，限界希釈法により，１ウェルあたり１個以下の細胞が播種されるように，９６ウェルプレート上に選択培養で選択された細胞を播種し，各細胞が単クローンコロニーを形成するように約１０日間培養した。単クローンコロニーが形成されたウェルの培養上清を採取し，培養上清中のヒト化抗体含量をＥＬＩＳＡ法にて調べ，ヒト化抗体高発現細胞株を選択した。

【0267】

このときのＥＬＩＳＡ法は概ね以下の方法で実施した。９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ社）の各ウェルに，ヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体溶液を０．０５Ｍ炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ９．６）で４μｇ／ｍＬに希釈したものを１００μＬずつ加え，室温で少なくとも１時間静置して抗体をプレートに吸着させた。次いで，ＰＢＳ－Ｔで各ウェルを３回洗浄後，Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ（ＰＢＳ） Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を各ウェルに２００μＬずつ加えてプレートを室温で３０分静置した。各ウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後，ＰＢＳに０．５％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を添加したもの（ＰＢＳ－ＢＴ）で適当な濃度に希釈した培養上清又はヒトＩｇＧ標準品を，各ウェルに１００μＬずつ加え，プレートを室温で少なくとも１時間静置した。プレートをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後，ＰＢＳ－ＢＴで希釈したＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧポリクロ－ナル抗体溶液を，各ウェルに１００μＬずつ加え，プレートを室温で少なくとも１時間静置した。ＰＢＳ－Ｔで各ウェルを３回洗浄後，リン酸－クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を含む０．４ｍｇ／ｍＬ ｏ－フェニレンジアミンを１００μＬずつ各ウェルに加え，室温で８～２０分間静置した。次いで，１ｍｏｌ／Ｌ硫酸を１００μＬずつ各ウェルに加えて反応を停止させ，９６ウェルプレートリーダーを用いて，各ウェルの４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。高い測定値を示したウェルに対応する細胞を，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の高発現細胞株とした。これを抗体番号３発現株とした。

【0268】

更に同様にして，実施例１１で構築した軽鎖発現用ベクターｐＥ－ｈｙｇｒ（ＬＣ３－２）及び重鎖発現用ベクターｐＥ－ｎｅｏ（ＨＣ３）を用いてＣＨＯ細胞を形質転換させて，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２の高発現細胞株を得た。これを抗体番号３－２発現株とした。

【0269】

更に同様にして，実施例１１で構築した軽鎖発現用ベクターｐＥ－ｈｙｇｒ（ＬＣ３－３）及び重鎖発現用ベクターｐＥ－ｎｅｏ（ＨＣ３）を用いてＣＨＯ細胞を形質転換させて，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－３の高発現細胞株を得た。これを抗体番号３－３発現株とした。

【0270】

更に同様にして，実施例１１で構築した軽鎖発現用ベクターｐＥ－ｈｙｇｒ（ＬＣ３－４）及び重鎖発現用ベクターｐＥ－ｎｅｏ（ＨＣ３）を用いてＣＨＯ細胞を形質転換させて，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－４の高発現細胞株を得た。これを抗体番号３－４発現株とした。

【0271】

更に同様にして，実施例１１で構築した軽鎖発現用ベクターｐＥ－ｈｙｇｒ（ＬＣ３）及び重鎖発現用ベクターｐＥ－ｎｅｏ（ＨＣ３－ＩｇＧ４）を用いてＣＨＯ細胞を形質転換させて，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４）の高発現細胞株を得た。これを抗体番号３（ＩｇＧ４）発現株とした。

【0272】

更に同様にして，実施例１１で構築した軽鎖発現用ベクターｐＥ－ｈｙｇｒ（ＬＣ３－２）及び重鎖発現用ベクターｐＥ－ｎｅｏ（ＨＣ３－ＩｇＧ４）を用いてＣＨＯ細胞を形質転換させて，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２（ＩｇＧ４）の高発現細胞株を得た。これを抗体番号３－２（ＩｇＧ４）発現株とした。

【0273】

〔実施例１３〕ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の精製
実施例１２で得られた抗体番号３発現株，抗体番号３－２発現株，抗体番号３－３発現株及び抗体番号３－４発現株を，それぞれ細胞濃度が約２×１０^５個／ｍＬとなるように，ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ^ＴＭ培地で希釈し，１Ｌの三角フラスコに２００ｍＬの細胞懸濁液を加え，３７℃で，５％ＣＯ_２と９５％空気からなる湿潤環境で約７０ｒｐｍの撹拌速度で６～７日間培養した。培養上清を遠心操作により回収し，０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過して，培養上清とした。回収した培養上清に，１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５倍容の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加し，予め１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むカラム体積３倍容の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化しておいたＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（カラム体積：１ｍＬ，Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）に負荷した。次いで，カラム体積の５倍容の同緩衝液によりカラムを洗浄した後，１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むカラム体積の４倍容の５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ２．８）で，吸着したヒト化抗体を溶出させ，溶出画分を採取した。溶出画分に１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して中和して，これを抗体の精製品とした。

【0274】

ここで，抗体番号３発現株の培養上清から精製された抗体は，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３とした。抗体番号３－２発現株の培養上清から精製された抗体は，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２とした。抗体番号３－３発現株の培養上清から精製された抗体は，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－３とした。また，抗体番号３－４発現株の培養上清から精製された抗体は，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－４とした。

【0275】

また，実施例１２で得られた抗体番号３（ＩｇＧ４）発現株，及び抗体番号３－２（ＩｇＧ４）発現株についても上記と同様に培養して，その培養上清から，それぞれ精製されたヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４）及びヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２（ＩｇＧ４）を得た。これら２種の抗体は，実施例１５に記載されたサルを用いた薬物動態解析に用いた。

【0276】

〔実施例１４〕ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体のヒトＴｆＲ及びサルＴｆＲへの親和性の測定
実施例１３で得たヒト化抗ｈＴｆＲ抗体のヒトＴｆＲ及びサルＴｆＲへの親和性を，実施例７に記載の方法で測定した。表６にヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３～３－４（表中，Ｎｏ．３～３－４にそれぞれ対応）のヒトＴｆＲに対する会合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）の測定結果，及び解離定数（Ｋ_Ｄ）を示す。

【0277】

【表6】

【0278】

表７にヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３～３－４（表中，抗体番号３～３－４にそれぞれ対応）のサルＴｆＲに対する会合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）の測定結果，及び解離定数（Ｋ_Ｄ）を示す。

【0279】

【表7】

【0280】

ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３～３－４のヒトＴｆＲへの親和性の測定の結果，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３及び３－４抗体で，ヒトＴｆＲとの解離定数は１×１０^－１２Ｍ未満であった（表６）。また，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２及び３－３のヒトＴｆＲとの解離定数は，それぞれ２．３９×１０^－１１Ｍと２．０９×１０^－１１Ｍであった。一方，これら抗体に対応するヒト化前の抗ｈＴｆＲ抗体（抗体番号３）のヒトＴｆＲとの解離定数は，１×１０^－１２Ｍ未満であった（表３）。これらの結果は，抗ｈＴｆＲ抗体のヒトＴｆＲへの高い親和性が，抗体をヒト化する前後で維持されることを示すものである。

【0281】

次いで，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体のサルＴｆＲへの親和性の測定の結果をみると，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３～３－４は，ヒト化前のこれら抗体に対応する抗ｈＴｆＲ抗体番号３のサルＴｆＲとの解離定数が１×１０^－１２Ｍ未満であったものが，ヒト化後は２．６０×１０^－１０Ｍ～１．９１×１０^－９Ｍと，サルＴｆＲへの親和性の低下が観察された（表３，表７）。ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３では，サルＴｆＲへの親和性の低下が観察されたものの，これらの結果は，抗ｈＴｆＲ抗体のサルＴｆＲへの高い親和性は，抗体をヒト化する前後で喪失することなく概ね維持されることを示すものである。

【0282】

〔実施例１５〕ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体のサルを用いた薬物動態解析
ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４）及びヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２（ＩｇＧ４）の４種の抗体を用いて，サルを用いた薬物動態解析を行った。なお，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３は重鎖がＩｇＧ１であり，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４）はヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖を可変領域はそのままにしてＩｇＧ４としたものである。また，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２は重鎖がＩｇＧ１であり，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２（ＩｇＧ４）はヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２の重鎖を可変領域はそのままにしてＩｇＧ４としたものである。これら４種の抗体を，それぞれ，５．０ｍｇ／ｋｇの用量でそれぞれ雄性カニクイザルに単回静脈内投与し，投与前，投与後２分，３０分，２時間，４時間及び８時間後に末梢血を採取し，採血後に全身潅流を実施した。また，陰性対照として，ＨＥＲ２蛋白に対するヒト化抗体であるトラスツズマブ（ハーセプチン^ＴＭ，中外製薬）を，同様にして一匹の個体に投与し，投与前，投与後２分，３０分，２時間，４時間及び８時間後に末梢血を採取し，採血後に全身潅流を実施した。潅流後，延髄を含む脳組織，脊髄組織及びその他の組織（肝臓，心臓，脾臓及び骨髄を含む）を摘出した。この脳組織，脊髄組織及びその他の組織を用いて，以下のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の濃度測定及び免疫組織化学染色を行った。

【0283】

組織中及び末梢血中のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の濃度測定は，概ね以下の手順で行った。なお，脳については採取した組織を，大脳皮質，小脳，海馬及び延髄に分けてからヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の濃度測定を行った。採取した組織を，それぞれＰｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含むＲＩＰＡ Ｂｕｆｆｅｒ（和光純薬工業株式会社）でホモジネートし遠心して上清を回収した。末梢血については血清を分離した。Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ Ｋａｐｐａ Ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎ Ｇｏａｔ ＩｇＧ Ｂｉｏｔｉｎ（株式会社免疫生物研究所），Ｓｕｌｆｏ－ｔａｇ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｅｔｈｙｌ社）及び脳組織ホモジネートをＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ｉｎ ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）でブロッキングを実施したストレプトアビジンプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）に添加し，１時間振盪してプレートに固定した。次いで，各ウェルにＲｅａｄ ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を１５０μＬずつ添加し，Ｓｅｃｔｏｒ^ＴＭ Ｉｍａｇｅｒ ６０００ ｒｅａｄｅｒを用いて各ウェルからの発光量を測定した。濃度既知の抗ｈＴｆＲ抗体の標準試料の測定値から検量線を作成し，これに各検体の測定値を内挿することにより，各組織中及び末梢血中に含まれる抗体の量を算出した。濃度の測定は各サンプルにつき３回繰り返し行った。

【0284】

脳組織及び脊髄組織中のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の濃度測定の結果を表８に示す。

【0285】

【表8】

【0286】

ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４）及びヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２（ＩｇＧ４）の抗体ともに，大脳皮質，小脳，海馬，延髄及び脊髄での蓄積が認められた（表８）。その量は，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３では，陰性対照のトラスツズマブ（ハーセプチン^ＴＭ）と比較して，大脳皮質で約８２倍，小脳で約６８倍，海馬で約９２倍，延髄で約５４倍，脊髄で約３．１倍であり，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２では，陰性対照のトラスツズマブと比較して，大脳皮質で約１２８倍，小脳で約８０倍，海馬で約１３６倍，延髄で約６３倍，脊髄で約３．１倍であり，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４）では，陰性対照のトラスツズマブと比較して，大脳皮質で約７９倍，小脳で約６６倍，海馬で約１０６倍，延髄で約５４倍，脊髄で約３．１倍であり，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２（ＩｇＧ４）では，陰性対照のトラスツズマブと比較して，大脳皮質で約９３倍，小脳で約６３倍，海馬で約１１７倍，延髄で約６６倍，脊髄で約３．２倍であった（表９）。これらの結果は，これら４種のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体が，血液脳関門を通過して脳組織に蓄積する性質を有することを示すものであり，脳組織内で機能させるべき薬剤をこれらの抗体と結合させることにより，その薬剤を効率良く脳組織に蓄積させることができること示すものである。

【0287】

【表9】

【0288】

次いで，肝臓，心臓，脾臓及び骨髄の各組織中のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の濃度測定の結果を図４に示す。肝臓，及び脾臓では，４種類のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体及び陰性対照のトラスツズマブのいずれにおいても蓄積が認められたが，その量はヒト化抗ｈＴｆＲ抗体とトラスツズマブで同等であった。心臓では，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体が陰性対照のトラスツズマブと比較して，蓄積量が多い傾向にあったが，その量は陰性対照の１．５倍～２．８倍程度に留まった。骨髄では，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体が，陰性対照のトラスツズマブと比較して，顕著に蓄積量が多い傾向にあり，その量は陰性対照の３．５～１６倍であった。骨髄へのヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の蓄積は，造血器官である骨髄ではＴｆＲの発現量が多く，ＴｆＲと結合することにより多くのヒト化抗ｈＴｆＲ抗体が陰性対照と比較して蓄積したためと考えられる。これらのデータは，これら４種のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体が，中枢神経系である大脳，小脳，海馬及び延髄に特異的に蓄積する性質を有することを示すものであり，脳組織内で機能させるべき薬剤をこれらの抗体と結合させることにより，その薬剤を効率良く脳組織に蓄積させることができること示すものである。

【0289】

次いで，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の血中動態の測定結果を表９－２に示す。４種類のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体は，陰性対照のトラスツズマブと同様に，投与後８時間においても血中濃度が６０μｇ／ｍＬ以上の高値を示し，血中で安定であることが示された（表９－２）。

【0290】

【表9-2】

【0291】

脳組織中のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の免疫組織化学染色は，実施例８に記載の方法で行った。但し，このとき，Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）に替えてＨｕｍａｎ ＩｇＧ－ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いた。

【0292】

図５に大脳皮質のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の免疫組織化学染色の結果を示す。ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４）及びヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２（ＩｇＧ４）を投与したサルの大脳皮質では，血管及び神経様細胞の特異的な染色が確認された（それぞれ図５ｂ～ｅ）。特に，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２を投与したサルの大脳皮質（図５ｃ）では，脳血管外の脳実質領域にも広範に特異的な染色が確認された。なお，コントロールとしておいたハーセプチンを投与したサルの大脳皮質では染色は認められず，図５ｂ～ｅで観察された組織染色が，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体に特異的なものであることが示された（図５ａ）。

【0293】

図６に海馬のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の免疫組織化学染色の結果を示す。ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４）及びヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２（ＩｇＧ４）を投与したサルの海馬では，血管及び神経様細胞の特異的な染色が確認された（それぞれ図６ｂ～ｅ）。なお，コントロールとしておいたハーセプチンを投与したサルの海馬では染色は認められず，図６ｂ～ｅで観察された組織染色が，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体に特異的なものであることが示された（図６ａ）。

【0294】

図７に小脳のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の免疫組織化学染色の結果を示す。ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４）及びヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２（ＩｇＧ４）を投与したサルの小脳では，血管及びプルキンエ細胞の特異的な染色が確認された（それぞれ図７ｂ～ｅ）。なお，コントロールとしておいたハーセプチンを投与したサルの小脳では染色は認められず，図７ｂ～ｅで観察された組織染色が，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体に特異的なものであることが示された（図７ａ）。

【0295】

図８に延髄のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の免疫組織化学染色の結果を示す。ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４）及びヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３－２（ＩｇＧ４）を投与したサルの延髄では，血管及び神経様細胞の特異的な染色が確認された（それぞれ図８ｂ～ｅ）。なお，コントロールとしておいたハーセプチンを投与したサルの延髄では染色は認められず，図８ｂ～ｅで観察された組織染色が，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体に特異的なものであることが示された（図８ａ）。

【0296】

上記実施例８の大脳及び小脳の免疫組織化学染色の結果からは，ヒト化前のマウス抗体である抗ｈＴｆＲ抗体番号３は，脳血管内皮表面に存在するｈＴｆＲへ結合することができ，且つ，ｈＴｆＲへの結合後，血液脳関門を通過して脳実質内へ移行し，さらに海馬においては脳実質内から神経様細胞にまで，小脳においてはプルキンエ細胞にまで，取り込まれることを示すものであった。

【0297】

実施例１５の大脳，海馬，小脳及び延髄の免疫組織化学染色の結果からは，実験に供した抗ｈＴｆＲ抗体番号３をヒト化して得られた４種類のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体は，脳血管内皮表面に存在するｈＴｆＲへ結合し，且つ，ｈＴｆＲへの結合後，血液脳関門を通過して脳実質内へ移行し，さらに大脳皮質においては神経様細胞にまで，海馬においては脳実質内から神経様細胞にまで，小脳においてはプルキンエ細胞にまで，延髄においては神経様細胞に取り込まれることがわかった。

【0298】

〔実施例１５－２〕ｈＢＤＮＦ－ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質（ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質）発現用細胞の作製
配列番号５６で示されるアミノ酸配列を有するｈＢＤＮＦのプロ体のＣ末端側に，Ｇｌｙ－Ｓｅｒに続いて配列番号３で示されるアミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒが５回繰り返される計２７個のアミノ酸からなるリンカー配列を介して，配列番号７７で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体Ｆａｂ重鎖を融合させた融合蛋白質をコードする遺伝子を含む，配列番号７８で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を人工的に合成した。ここで，配列番号７７で示されるアミノ酸配列は，配列番号３７で示されるアミノ酸配列のＮ末端側から１番目～２２６番目に相当する。ここでＮ末端側から１番目～１１８番目のアミノ酸配列が配列番号３２（ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列２）に相当し，１１９番目～２１６番目のアミノ酸配列がＣＨ１領域に相当し，２１７番目～２２６番目のアミノ酸配列がヒンジ部に相当する。

【0299】

このＤＮＡ断片は，配列番号７９で示されるアミノ酸配列を有するｈＢＤＮＦのプロ体とヒト化抗ｈＴｆＲ抗体Ｆａｂ重鎖の融合蛋白質をコードする。配列番号７９で示されるアミノ酸配列を有する融合蛋白質は，発現後にプロセシングを受けて，配列番号８０で示されるアミノ酸配列を有するｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体Ｆａｂ重鎖の融合蛋白質となる。配列番号７９で示されるアミノ酸配列において，Ｎ末端側から１番目～１１０番目のアミノ酸配列が，ｈＢＤＮＦがプロ体から成熟型へプロセシングされる際に除去される部分である。このＤＮＡ断片をＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化し，ｐＥ－ｎｅｏベクターのＭｌｕＩとＮｏｔＩの間に組み込み，ｐＥ－ｎｅｏ（ＢＤＮＦ－Ｆａｂ ＨＣ－１）を構築した。

【0300】

ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－Ｋ１：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手）を，実施例１２に記載方法により，ｐＥ－ｎｅｏ（ＢＤＮＦ－Ｆａｂ ＨＣ－１）と実施例１１で構築したｐＥ－ｈｙｇｒ（ＬＣ３）で形質転換し，ｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質を発現する細胞株を得た。この細胞株を，ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３）１発現株とした。この細胞株が発現するｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質をｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３）１とした。

【0301】

〔実施例１５－３〕ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３）１の作製
実施例１５－２で得られたｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３）１発現株を用いて，実施例１３に記載の方法で，ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３）１の精製品を得た。

【0302】

〔実施例１６〕ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖への変異導入
配列番号３７で示されるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖の可変領域において，ＣＤＲ１を配列番号１２で示されるものとしたときの，当該ＣＤＲ１のアミノ酸配列を１個置換するとともに，フレームワーク領域３のアミノ酸配列を１個置換するヒト化抗体の重鎖を作成した。この新たな抗体の重鎖は，ＣＤＲ１に配列番号６６（又はこれを含む配列番号６７）のアミノ酸配列を含み，フレームワーク領域３に配列番号６８のアミノ酸配列を含むものであり，従って，配列番号３７で示されるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖のアミノ酸配列を構成するアミノ酸を２個置換したものである。この新たな抗体（ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎ）の重鎖は，配列番号７０のアミノ酸配列を含み，その可変領域は配列番号６９で示されるアミノ酸配列を含んでなる。

【0303】

表１０にヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖における配列番号１２のＣＤＲ１とヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎの重鎖における配列番号６６のＣＤＲ１とのアラインメントを示した。当該アラインメントにおいて，Ｎ末端側から５番目のアミノ酸が，トレオニンからメチオニンに置換されている。

【0304】

表１１には，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖におけるフレームワーク領域３（配列番号８３）とヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎの重鎖におけるフレームワーク領域３（配列番号６８）のアミノ酸配列のアラインメントを示す。当該アラインメントにおいて，Ｎ末端側から１７番目のアミノ酸が，トリプトファンからロイシンに置換されている。

【0305】

【表10】

【0306】

【表11】

【0307】

〔実施例１７〕ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎ発現用細胞の構築
配列番号７０で示されるアミノ酸配列からなる抗体の重鎖をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号７１）を人工的に合成した。このＤＮＡ断片の５’側には，５’端から順にＭｌｕＩ配列とリーダーペプチドをコードする配列とを，３’側にはＮｏｔＩ配列を導入した。こうして合成したＤＮＡを実施例１１に記載の方法でｐＥ－ｎｅｏベクターに組み込み，得られたベクターを，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎの重鎖発現用ベクターのｐＥ－ｎｅｏ（ＨＣ３）Ｎとした。このｐＥ－ｎｅｏ（ＨＣ３）Ｎと実施例１１で構築した軽鎖発現用ベクターｐＥ－ｈｙｇｒ（ＬＣ３）とを用いて，実施例１２に記載の方法でＣＨＯ細胞を形質転換させて，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎ発現株を得た。

【0308】

〔実施例１８〕ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎの精製
実施例１７で得られたヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎ発現株を用いて，実施例１３に記載の方法で，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎの精製品を得た。なお，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎは，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖のアミノ酸配列中，表１０及び表１１で示される２箇所のアミノ酸を置換したものである。一方，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖のアミノ酸配列は同一である。

【0309】

〔実施例１９〕ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３とヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３ＮのヒトＴｆＲ及びサルＴｆＲへの親和性の比較
実施例１３で得たヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３と実施例１７で得たヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３ＮのヒトＴｆＲへの親和性を，実施例７に記載の方法で測定した。表１２にそれぞれの抗体のヒトＴｆＲに対する会合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）の測定結果，及び解離定数（Ｋ_Ｄ）を示す。なお，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３のヒトＴｆＲへの親和性を示す測定値は，表６に示されたものと異なるが，実験誤差である。

【0310】

【表12】

【0311】

実施例１３で得たヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３と実施例１８で得たヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３ＮのサルＴｆＲへの親和性を，実施例７に記載の方法で測定した。表１３にそれぞれの抗体のサルＴｆＲに対する会合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）の測定結果，及び解離定数（Ｋ_Ｄ）を示す。なお，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３のサルＴｆＲへの親和性を示す測定値は，表７に示されたものと異なるが，実験誤差である。

【0312】

【表13】

【0313】

ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎ及びヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３のサルＴｆＲとのＫ_Ｄ値を比較すると，前者が５．０７×１０^－１１Ｍであり後者が１．３２×１０^－９Ｍであり，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３ＮとサルＴｆＲとのＫ_Ｄ値は，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３のそれと比較して，約３０分の１であった。一方，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎ及びヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３のヒトＴｆＲとのＫ_Ｄ値を比較すると，いずれも１×１０^－１２Ｍ未満であり，いずれの抗体もヒトＴｆＲに高い親和性を有するものであった。また，いずれの抗体もサルＴｆＲへの親和性よりもヒトＴｆＲに高い親和性を有する。

【0314】

ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体を薬剤として開発する際に実施する非臨床試験の一環として，サルを用いた薬理試験を実施する場合が多い。ここで，サルを用いた薬理試験の結果は，ヒトを用いた臨床試験を実施する妥当性を判断するために用いられるので，サル体内での挙動が，ヒトに投与したときの挙動とより近似するものであることが好ましい。上記の結果のとおり，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎは，サルＴｆＲへの親和性がヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の約３０倍の高値を示すことから，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎのサル体内での挙動は，ヒトに投与したときの挙動とより近似するといえる。従って，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎを用いることにより，サルを用いた試験で，よりヒトに投与したときの挙動を反映した結果が得られる。従って，サルを用いた試験により，ヒトを用いた臨床試験を実施する際の判断材料として，より有益な結果が得られることになる。

【0315】

〔実施例２０〕ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３とヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎのサルを用いた脳組織への移行性の比較
実施例１３で得たヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３と実施例１７で得たヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎを，それぞれ，５．０ｍｇ／ｋｇの用量でそれぞれ雄性カニクイザルに単回静脈内投与し，投与８時間後に全身潅流を実施した。潅流後，延髄を含む脳組織及び脊髄組織を摘出した。脳組織については，摘出後に大脳皮質，小脳，海馬及び延髄に分けた。

【0316】

各組織に含まれるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の濃度測定は，実施例１５に記載の測定法に準じて行った。

【0317】

脳組織中の抗ｈＴｆＲ抗体の濃度測定の結果を表１４に示す。ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の大脳，小脳，海馬における濃度を比較すると，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎの濃度は，大脳においては約１．４２倍，小脳においては約１．５６倍，海馬においては約１．２９倍と，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３よりも高い値を示した。延髄においては両者の濃度はほぼ同等だった。頸椎においても，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎの濃度は，約１．４７倍と，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３よりも高い値を示した。これらの結果は，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎがヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３と比較して，より効率よく血液脳関門を通過して大脳，小脳，海馬等の脳組織に蓄積する性質を有することを示すものである。すなわち，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎは，脳組織内で機能させるべき薬剤をこれらの抗体と結合させることにより，その薬剤を効率良く脳組織に蓄積させることができる性質を有することを示すものである。

【0318】

【表14】

【0319】

〔実施例２０－２〕ｈＦｃ－ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体発現用細胞の作製
配列番号８１で示されるアミノ酸配列からなるヒトＩｇＧ Ｆｃ領域が導入されたヒト化抗ｈＴｆＲ抗体３ＮのＦａｂ重鎖のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号８２）を人工的に合成した。このＤＮＡ断片の５’側には，５’端から順にＭｌｕＩ配列とリーダーペプチドをコードする配列とが，３’側にはＮｏｔＩ配列が導入されている。こうして合成したＤＮＡを実施例１１に記載の方法でｐＥ－ｎｅｏベクターに組み込み，得られたベクターをｐＥ－ｎｅｏ（Ｆｃ－Ｆａｂ ＨＣ（３Ｎ））とした。このｐＥ－ｎｅｏ（Ｆｃ－Ｆａｂ ＨＣ（３Ｎ））と実施例１１で構築した軽鎖発現用ベクターｐＥ－ｈｙｇｒ（ＬＣ３）とを用いて，実施例１２に記載の方法でＣＨＯ細胞を形質転換させて，Ｆｃ－Ｆａｂ（３Ｎ）発現株を得た。

【0320】

〔実施例２０－３〕ｈＦｃ－ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の作製
Ｆｃ－Ｆａｂ（３Ｎ）発現株を用いて，実施例１３に記載の方法で，Ｆｃ－Ｆａｂ（３Ｎ）の精製品を得た。

【0321】

〔実施例２０－４〕ｈＦｃ－ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体のヒトＴｆＲ及びサルＴｆＲへの親和性の比較
実施例２０－３で得られたＦｃ－Ｆａｂ（３Ｎ）の精製品のヒトＴｆＲ及びサルＴｆＲへの親和性を，実施例７に記載の方法で測定した。結果を表１４－２に示す。この結果は，Ｆｃ－Ｆａｂ（３Ｎ）は，脳組織内で機能させるべき薬剤をこれらの抗体と結合させることにより，その薬剤を効率良く脳組織に蓄積させることができる性質を有することを示すものである。

【0322】

【表14-2】

【0323】

〔実施例２０－５〕ｈＦｃ－ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体のサルを用いた脳組織への移行性の測定
実施例２０－３で得られたＦｃ－Ｆａｂ（３Ｎ）を，５．０ｍｇ／ｋｇの用量で雄性カニクイザルに単回静脈内投与し，投与８時間後に全身潅流を実施した。潅流後，延髄を含む脳組織及び脊髄組織を摘出した。脳組織については，摘出後に大脳皮質，小脳，海馬及び延髄に分けた。

【0324】

各組織に含まれるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の濃度測定は，実施例１５に記載の測定法に準じて行った。

【0325】

脳組織中の抗ｈＴｆＲ抗体の濃度測定の結果を表１４－３に示す。Ｆｃ－Ｆａｂ（３Ｎ）の大脳，小脳，海馬における濃度は、それぞれ、０．８０μｇ／ｇ湿重量、０．８０μｇ／ｇ湿重量、及び１．０５μｇ／ｇ湿重量であった。また、延髄及び頸髄における濃度は、それぞれ、０．６７μｇ／ｇ湿重量及び０．６８μｇ／ｇ湿重量であった。これらの結果は、Ｆａｂであるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体のＮ末端側にＦｃ領域を結合させた場合であっても、抗ｈＴｆＲ抗体がＢＢＢを通過できることを示すものである。したがって、ＦａｂにＢＤＮＦを結合させた結合体が、生体内に投与したときに不安定である場合に、ＦａｂのＮ末端側にＦｃ領域に結合させることにより、ＢＢＢを通過する特性を維持させつつ、かかる結合体を生体内で安定化、例えば、当該結合体の血中半減期を増加させることができる。

【0326】

【表14-3】

【0327】

〔実施例２１〕ｈＢＤＮＦ－ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質（ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質）発現用細胞の作製
（１）配列番号５６で示されるアミノ酸配列を有するｈＢＤＮＦのプロ体のＣ末端側に，配列番号３で示されるアミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒが５回繰り返される計２５個のアミノ酸からなるリンカー配列を介して，配列番号６１で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体３ＮＦａｂ重鎖を融合させた融合蛋白質をコードする遺伝子を含む，配列番号６２で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を人工的に合成した。ここで，配列番号６１で示されるアミノ酸配列は，配列番号７０で示されるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎの重鎖のアミノ酸配列のＮ末端側から１番目～２２６番目に相当する。ここでＮ末端側から１番目～１１８番目のアミノ酸配列が配列番号６９（ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎの重鎖の可変領域のアミノ酸配列）に相当し，１１９番目～２１６番目のアミノ酸配列がＣ_Ｈ１領域に相当し，２１７番目～２２６番目のアミノ酸配列がヒンジ部に相当する。

【0328】

このＤＮＡ断片は，配列番号６３で示されるアミノ酸配列を有する，ｈＢＤＮＦのプロ体とヒト化抗ｈＴｆＲ抗体３ＮＦａｂ重鎖の融合蛋白質をコードする。配列番号６３で示されるアミノ酸配列を有する融合蛋白質は，発現後にプロセシングを受けて，配列番号６５で示されるアミノ酸配列を有するｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体Ｆａｂ重鎖の融合蛋白質となる。配列番号６３で示されるアミノ酸配列において，Ｎ末端側から１番目～１１０番目のアミノ酸配列が，ｈＢＤＮＦがプロ体から成熟型へプロセシングされる際に除去される部分である。このＤＮＡ断片をＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化し，ｐＥ－ｎｅｏベクターのＭｌｕＩとＮｏｔＩの間に組み込み，ｐＥ－ｎｅｏ（ＢＤＮＦ－Ｆａｂ ＨＣ（３Ｎ））を構築した。

【0329】

（２）また，配列番号５６で示されるアミノ酸配列を有するｈＢＤＮＦのプロ体のＣ末端側に，配列番号３で示されるアミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒが５回繰り返される計２５個のアミノ酸からなるリンカー配列を介して，配列番号７５のＦｃ領域の配列，配列番号３で示されるアミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒが５回繰り返される計２５個のアミノ酸からなるリンカー配列，及び，配列番号６１で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体３ＮＦａｂ重鎖を，Ｎ末端側からＣ末端側にこの順で融合させた融合蛋白質をコードする遺伝子を含む，配列番号７３で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を人工的に合成した。

【0330】

このＤＮＡ断片は，配列番号７４で示される融合蛋白質をコードする。配列番号７４で示されるアミノ酸配列を有する融合蛋白質は，発現後にプロセシングを受けて，ｈＢＤＮＦのプロ体部分がｈＢＤＮＦとなる。配列番号７４で示されるアミノ酸配列において，Ｎ末端側から１番目～１１０番目のアミノ酸配列が，ｈＢＤＮＦがプロ体から成熟型へプロセシングされる際に除去される部分である。このＤＮＡ断片をＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化し，ｐＥ－ｎｅｏベクターのＭｌｕＩとＮｏｔＩの間に組み込み，ｐＥ－ｎｅｏ（ＢＤＮＦ－Ｆｃ－Ｆａｂ ＨＣ（３Ｎ））を構築した。

【0331】

ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－Ｋ１： Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手）を，ｐＥ－ｎｅｏ（ＢＤＮＦ－Ｆａｂ ＨＣ（３Ｎ））と実施例１１で構築したｐＥ－ｈｙｇｒ（ＬＣ３）とにより形質転換し，ｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体３Ｎとの融合蛋白質を発現する細胞株を得た。この細胞株を，ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１発現株とした。この細胞株が発現するｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質をｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１とした。また，ＣＨＯ細胞を，ｐＥ－ｎｅｏ（ＢＤＮＦ－Ｆｃ－Ｆａｂ ＨＣ（３Ｎ））と実施例１１で構築したｐＥ－ｈｙｇｒ（ＬＣ３）とにより形質転換し，別のｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体３Ｎとの融合蛋白質を発現する細胞株を得た。この細胞株を，ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）２発現株とした。この細胞株が発現するｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質をｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）２とした。

【0332】

〔実施例２１－２〕アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）付加型ｈＢＤＮＦ－ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質の発現用細胞の作製
配列番号５６で示されるアミノ酸配列を有するｈＢＤＮＦのプロ体のＣ末端側に、配列番号３で示されるアミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒが５回繰り返される計２５個のアミノ酸からなるリンカー配列を介して，配列番号６１で示されるアミノ酸配列の第１番目から第２１６番目に対応するアミノ酸配列（配列番号８４）を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体３ＮＦａｂ重鎖を融合させ、更に、そのＣ末端側に、配列番号３で示されるアミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒが３回繰り返される計１５個のアミノ酸からなるリンカー配列を介して，配列番号８５で示されるＡＢＤを融合させた融合蛋白質をコードする遺伝子を含む，配列番号８６で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を人工的に合成した。ここで，配列番号８４で示されるアミノ酸配列は，配列番号７０で示されるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎの重鎖のアミノ酸配列のＮ末端側から１番目～２１６番目に相当する。ここでＮ末端側から１番目～１１８番目のアミノ酸配列が配列番号６９（ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎの重鎖の可変領域のアミノ酸配列）に相当し，１１９番目～２１６番目のアミノ酸配列がＣ_Ｈ１領域に相当する。

【0333】

このＤＮＡ断片は，配列番号８７で示されるアミノ酸配列を有する，ｈＢＤＮＦのプロ体とヒト化抗ｈＴｆＲ抗体３ＮＦａｂ重鎖の融合蛋白質のＣ末端側にＡＢＤが付加した融合蛋白質をコードする。配列番号８７で示されるアミノ酸配列を有する融合蛋白質は，発現後にプロセシングを受けて，配列番号８８で示されるアミノ酸配列を有するｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体Ｆａｂ重鎖の融合蛋白質のＣ末端側にＡＢＤが付加した融合蛋白質となる。配列番号８７で示されるアミノ酸配列において，Ｎ末端側から１番目～１１０番目のアミノ酸配列が，ｈＢＤＮＦがプロ体から成熟型へプロセシングされる際に除去される部分である。このＤＮＡ断片をＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化し，ｐＥ－ｎｅｏベクターのＭｌｕＩとＮｏｔＩの間に組み込み，ｐＥ－ｎｅｏ（ＢＤＮＦ－Ｆａｂ ＨＣ（３Ｎ））ＡＢＤを構築した。

【0334】

ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－Ｋ１： Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手）を，ｐＥ－ｎｅｏ（ＢＤＮＦ－Ｆａｂ ＨＣ（３Ｎ））ＡＢＤと実施例１１で構築したｐＥ－ｈｙｇｒ（ＬＣ３）とにより形質転換し，ｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体３Ｎとの融合蛋白質のＣ末端側にＡＢＤが付加した融合蛋白質を発現する細胞株を得た。この細胞株を，ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤ発現株とした。この細胞株が発現するｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質のＣ末端側にＡＢＤが付加した融合蛋白質をｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤとした。

【0335】

〔実施例２２〕ｈＢＤＮＦ－ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質の製造
ｈＢＤＮＦ－ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質は，以下の方法で製造した。実施例２１で得たｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１発現株を，細胞濃度が約２×１０^５個／ｍＬとなるように，ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ^ＴＭ培地で希釈し，１Ｌの三角フラスコに２００ｍＬの細胞懸濁液を加え，３７℃で，５％ＣＯ_２と９５％空気からなる湿潤環境で約７０ｒｐｍの撹拌速度で６～７日間培養した。培養上清を遠心操作により回収し，０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過して，培養上清とした。上記の回収した培養上清に，カラム体積の５倍容の１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加し，カラム体積３倍容の１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化しておいたＰｒｏｔｅｉｎＬカラム（カラム体積：１ｍＬ，ＧＥヘルスケア社）に負荷した。次いで，カラム体積の５倍容の同緩衝液を供給してカラムを洗浄した後，１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むカラム体積の４倍容の５０ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ２．８）で，吸着したｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１を溶出させた。溶出後直ちに１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いてｐＨ７．０に調整した。これをｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１の精製品として以下の試験に用いた。
ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）２についてもｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１と同様の手法で精製品を得た。

【0336】

〔実施例２２－２〕ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤの製造
ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質は，以下の方法で製造した。実施例２１－２で得たｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤ発現株を，細胞濃度が約２×１０^５個／ｍＬとなるように，ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ^ＴＭ培地で希釈し，１Ｌの三角フラスコに２００ｍＬの細胞懸濁液を加え，３７℃で，５％ＣＯ_２と９５％空気からなる湿潤環境で約７０ｒｐｍの撹拌速度で６～７日間培養した。培養上清を遠心操作により回収し，０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過して，培養上清とした。

【0337】

回収した培養上清を，カラム体積の５倍容の５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨＲ－Ｓカラム（カラム体積：５ｍＬ，Ｂｉｏ Ｒａｄ社）に負荷した。次いで，カラム体積の５倍容の同緩衝液を供給してカラムを洗浄した後，カラム体積の１５倍容の１ＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．２）で，吸着したｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤを溶出させ、ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤを含む画分を回収した。この工程を４回実施した。

【0338】

上記の溶出画分を４倍容の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を加えて希釈した。この希釈した溶出画分を、カラム体積の５倍容の５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＮｕｖｉａ ｃＰｒｉｍｅカラム（カラム体積：５ｍＬ，Ｂｉｏ Ｒａｄ社）に負荷した。カラム体積の２５倍容の１Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．２）を供給してカラムを洗浄した後，１５倍容の２ＭのＮａＣｌ、０．４Ｍアルギニンを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で，吸着したｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤを溶出させ、ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤを含む画分を回収した。こうして回収したものを、ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤの精製品として、以下の実験に用いた。

【0339】

〔実施例２３〕ＢＤＮＦ受容体（ＴｒｋＢ）発現細胞を用いたｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質のＢＤＮＦ活性の評価
実施例１６，実施例２２及び実施例２２－２で製造したｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質が有するＢＤＮＦ生物活性は，ＴｒｋＢ遺伝子をチャイニーズハムスター卵巣由来細胞（ＣＨＯ細胞）に導入したＣＨＯ－ＴｒｋＢ細胞におけるＣａ濃度変化を指標とした細胞内シグナル伝達増強活性の測定により評価した。

【0340】

ＣＨＯ細胞を継代用培地（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２ Ｈａｍ，１０％ウシ胎児血清）にて培養した。その後，評価用培地（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２ Ｈａｍ，３％ウシ胎児血清，１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４））へ交換し，細胞懸濁液を作製した。細胞にアポエクオリンおよびヒトＴｒｋＢ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＰ＿００１０１８０７４．１）を発現するウイルスを導入し，２×１０^３細胞／ウェルとなるように黒色３８４細胞培養用ｂｏｔｔｏｍ ｃｌｅａｒ ｐｌａｔｅに播種後，ＣＯ_２インキュベーター（３７℃，９５％Ａｉｒ，５％ＣＯ_２）内で一晩静置培養した。

【0341】

１μＭのＶｉｖｉｒｅｎ（プロメガ）を含むＨＨＢＳ液（１×Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））を２０μＬ／ｗｅｌｌで添加し，室温にて４時間静置した。０．１％のＢｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎを含むＨＨＢＳ液で，ＢＤＮＦおよびｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質（ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１及び２，並びにｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤ）を，それぞれ目的の濃度へ希釈し，添加後，ＦＤＳＳ７０００（浜松ホトニクス）で経時的に発光強度を測定した。１１１ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ（＃４５０－０２，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）が示す発光強度を１００％として，得られた発光強度から相対的なＴｒｋＢ作動活性を計算し，その用量反応曲線からＥＣ５０を算出してＢＤＮＦ活性とした。表１５にｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質の評価結果を示す。

【0342】

【表15】

【0343】

〔実施例２４〕ラット初代培養神経細胞を用いたｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質のＴｒｋＢ受容体シグナル増強作用の評価
実施例２２及び実施例２２－２で製造したｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質が有するＢＤＮＦ生物活性を，ラット初代培養神経細胞におけるＥｒｋのリン酸化作用を指標とした細胞内シグナル伝達増強活性の測定により評価した。初代培養神経細胞は，マウスあるいはラット胎児の脳の各部位，例えば線条体，皮質，あるいは海馬などから調製するか，あるいは販売されている初代培養神経細胞を購入して使用するが、今回はラット胎児の線条体より調製した。

【0344】

胎生１５－１９日の仔ラット脳より線条体を採取し，氷冷ｃＨＢＳＳ液（１ｍＭ ピルビン酸，０．５％ Ｄ（＋）グルコースおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ含有Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に浸した。ｃＨＢＳＳ液を除去し，０．１ｍｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅ Ｉ，５ｍＭ ＭｇＣｌ_２および０．３ｍｇ／ｍＬパパインを含むｃＨＢＳＳ液（酵素反応液）を添加して３７℃で１－５分間インキュベーションした。酵素反応液を除去し，氷冷１０％ＦＢＳ含有ＮＧＰＳ液（０．５ｍＭ Ｌ－グルタミン酸およびペニシリン・ストレプトマイシン液（ＤＳファーマバイオメディカル）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）を添加し，酵素反応を停止させた。１０％ＦＢＳ含有ＮＧＰＳ液を除き，氷冷ｃＨＢＳＳ液で３回洗浄した。続いて氷冷ｃＨＢＳＳ液中で神経細胞を分散させ，７０μｍセルストレイナー（Ｆａｌｃｏｎ ２３５０）へ添加し，さらにｃＨＢＳＳ液を追加してろ過した。ろ過液を遠心（１０００ｒｐｍ，４分間，室温）して沈渣を集め，ｃＨＢＳＳ液に再懸濁し，懸濁液中の細胞数をカウントした。１×１０^６細胞／ｍＬとなるようにＢ－２７^ＴＭ（Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ （５０Ｘ），インビトロジェン）を含むＮＧＰＳ液で希釈し，Ｐｏｌｙ－Ｄ－Ｌｙｓｉｎｅプレートへ播種後，ＣＯ_２インキュベーター（３７℃，９５％Ａｉｒ，５％ＣＯ_２）内で１週間静置培養した。

【0345】

各ウェルから培養液を取り除き，ＮＧＰＳ液で細胞を洗浄後，ＮＧＰＳ液を添加してＣＯ_２インキュベーター（３７℃，９５％Ａｉｒ，５％ＣＯ_２）内で２時間静置した。ＮＧＰＳ液でＢＤＮＦおよびｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質をそれぞれ目的の濃度へ希釈し，添加後，ＣＯ_２インキュベーター（３７℃，９５％Ａｉｒ，５％ＣＯ_２）内で３０分間静置した。反応後，プレートを氷上に置き，氷冷Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅで洗浄した。洗浄後，Ｈａｌｔ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を含むＲＩＰＡバッファー（Ｐｉｅｒｃｅ）を添加して１０分間氷上に静置した。セルスクレイパーを用いて細胞をかき取り，チューブへ回収し，ボルテックスにて撹拌後１０分間氷上に静置した。遠心（１３，５００ｒｐｍ，１０分間，４℃）して上清を採取し，Ｅｒｋリン酸化アッセイまで－８０℃で凍結保存した（一部を用いてタンパク定量を行った）。

【0346】

タンパク定量は，Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて行った。上記採取サンプルをタンパク濃度が検出範囲内となるように蒸留水にて希釈し，９６穴プレートへ１０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注した。また，Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｒｅａｇｅｎｔ Ａ：Ｒｅａｇｅｎｔ Ｂ＝５０：１混合液）を２００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加した。３７℃で３０分間インキュベート後，プレートリーダーを用いて吸光度（５６２ｎｍ）を測定し，同時に測定したＢｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ標準液の吸光度より作製した検量線から蛋白濃度を算出した。

【0347】

Ｅｒｋリン酸化アッセイは，Ｅｒｋ １／２ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｔｅｐ（ｐＴ２０２／Ｙ２０４＋Ｔｏｔａｌ）（アブカム）を用いて行った。上記採取サンプルをＨａｌｔ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｔｈｅｒｍｏ）を含むＲＩＰＡバッファー（Ｐｉｅｒｃｅ）で０．５ｍｇ／ｍＬとなるように希釈し，アッセイキットに付属されているＳｉｍｐｌｅ Ｓｔｅｐ Ｐｒｅ－Ｃｏａｔｅｄ ９６穴プレートに５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注した。Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｃｋｔａｉｌを５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加して撹拌しながら室温にて１時間インキュベートした。Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（３５０μＬ／ｗｅｌｌ）でｗｅｌｌ内を洗浄後，ＴＭＢ ｓｕｂｓｔｒａｔｅを１００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し，撹拌しながら室温遮光下で１５分間インキュベートした。Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加して反応を停止させ，プレートリーダーを用いて吸光度を測定した（４５０ｎｍ）。溶媒処置にて確認されるリン酸化Ｅｒｋレベルに対して，ＢＤＮＦあるいはｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質によるリン酸化Ｅｒｋレベルの相対的な増加量を評価することによりｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質が有するＢＤＮＦ生物活性を評価した。表１５－２にＥｒｋリン酸化活性の評価結果を示す。

【0348】

【表15-2】

【0349】

〔実施例２５〕ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１のヒトＴｆＲ及びサルＴｆＲへの親和性の測定
実施例２２で製造したｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１のヒトＴｆＲ及びサルＴｆＲへの親和性を測定した。測定は概ね下記の方法で行った。
ビオチン標識されたウサギ抗ヒトＢＤＮＦポリクローナル抗体（抗ヒトＢＤＮＦ抗体：ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）をＨＢＳ－Ｐ＋（１％ＢＳＡ）（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５０μＭ ＥＤＴＡ，０．０５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０及び１％ＢＳＡを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）で希釈し，１５μｇ／ｍＬの溶液を調製し，この溶液をリガンド溶液１とした。抗ｈＴｆＲ抗体融合ＢＤＮＦ（ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１）の精製品を，ＨＢＳ－Ｐ＋（１％ＢＳＡ）で希釈し，この溶液をリガンド溶液２とした。また、対照物質として、実施例１５－３で得たｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３）１の精製品についてもＨＢＳ－Ｐ＋（１％ＢＳＡ）で希釈したリガンド溶液３を調製した。ｒヒトＴｆＲとｒサルＴｆＲとを，それぞれＨＢＳ－Ｐ＋（１％ＢＳＡ）で２段階希釈し，０．７８１２５～５０ｎＭ（０．５８５～３．７４μｇ／ｍＬ）の７段階の濃度の溶液を調製した。このＴｆＲ溶液をサンプル溶液とした。

【0350】

上記２段階希釈して調製したサンプル溶液を，９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ， ｂｌａｃｋ（ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏｏｎｅ社）に２００μＬ／ウェルずつ添加した。また，上記調製したリガンド溶液１、リガンド溶液２及びリガンド溶液３を，所定のウェルにそれぞれ２００μＬ／ウェルずつ添加した。ベースライン，解離用及び洗浄用のウェルには，ＨＢＳ－Ｐ＋（１％ＢＳＡ）を２００μＬ／ウェルずつ添加した。このプレートと，バイオセンサー（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ／ＳＡ：ＦｏｒｔｅＢｉｏ社，ａ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を，ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６の所定の位置に設置した。

【0351】

ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６を下記の表１５－３に示す条件で作動させて抗ヒトＢＤＮＦ抗体をセンサーに固相化した。つづいて，ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６を下記の表１５－４に示す条件で作動させてデータを取得後，ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６付属の解析ソフトウェアを用いて，結合反応曲線を１：１結合モデルあるいは２：１結合モデルにフィッティングし，抗ｈＴｆＲ抗体融合ＢＤＮＦと，ｒヒトＴｆＲ及びｒサルＴｆＲに対する会合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）を測定し，解離定数（Ｋ_Ｄ）を算出した。なお，測定は２５～３０℃の温度下で実施した。

【0352】

【表15-3】

【0353】

【表15-4】

【0354】

表１６にｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１のヒトＴｆＲ及びサルＴｆＲに対する会合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）の測定結果，及び解離定数（Ｋ_Ｄ）を示す。ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１のヒトＴｆＲとの解離定数は７．４２×１０^－１２Ｍであり，サルＴｆＲとの解離定数は７．９４×１０^－１０Ｍであった。これらの結果は，ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１が，ヒトＴｆＲ及びサルＴｆＲに対し高い親和性を有するものであることを示す。また、ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３）１のヒトＴｆＲ及びサルＴｆＲに対する解離定数は、それぞれ２．５１×１０^－１０Ｍと３．９４×１０^－８Ｍであった。すなわち、ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１は、ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３）１と比較して、ヒトＴｆＲ及びサルＴｆＲに対して極めて高い親和性を有することが理解できる。

【0355】

【表16】

【0356】

〔実施例２５－２〕ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤのヒトＴｆＲ、サルＴｆＲ及びＨＳＡへの親和性の測定
ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤと，ヒトＴｆＲ，サルＴｆＲ及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）への親和性の測定は，実施例２５と同様に、バイオレイヤー干渉法（ＢｉｏＬａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ：ＢＬＩ）を用いた生体分子相互作用解析システムであるＯｃｔｅｔＲＥＤ９６（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社，ａ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて実施した。測定は，概ねＯｃｔｅｔＲＥＤ９６に添付の操作マニュアルに従って実施した。以下に詳述する。

【0357】

ビオチン標識されたウサギ抗ヒトＢＤＮＦポリクローナル抗体（抗ヒトＢＤＮＦ抗体：ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）をＨＢＳ－Ｐ＋（１％ＢＳＡ）（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５０μＭ ＥＤＴＡ，０．０５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０及び１％ＢＳＡを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）で希釈し，２５μｇ／ｍＬの溶液を調製し，この溶液をリガンド溶液１とした。ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤの精製品を，ＨＢＳ－Ｐ＋で希釈し，この溶液をリガンド溶液２とした。ｒヒトＴｆＲとｒサルＴｆＲとを，それぞれＨＢＳ－Ｐ＋で２段階希釈し，０．７８１２５～５０ｎＭ（０．０５８５～３．７４μｇ／ｍＬ）の７段階の濃度の溶液を調製した。このＴｆＲ溶液をＴｆＲサンプル溶液とした。なお、ｒヒトＴｆＲとｒサルＴｆＲは実施例７に記載のものを用いた。また、ＨＳＡ（人血清アルブミン製剤（献血アルブミン２５－ニチヤク－，日本製薬株式会社）を、ＨＢＳ－Ｐ＋で２段階希釈し，３．１３～２００ｎＭ（０．２０８～１３．３μｇ／ｍＬ）の７段階の濃度の溶液を調製した。このＨＳＡ溶液をＨＳＡサンプル溶液とした。

【0358】

上記２段階希釈して調製したＴｆＲサンプル溶液及びＨＳＡサンプル溶液を，それぞれ９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ， ｂｌａｃｋ（ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ社）に２００μＬ／ウェルずつ添加した。また，上記調製したリガンド溶液１及びリガンド溶液２を，所定のウェルにそれぞれ２００μＬ／ウェルずつ添加した。ベースライン，解離用及び洗浄用のウェルには，ＨＢＳ－Ｐ＋を２００μＬ／ウェルずつ添加した。このプレートと，バイオセンサー（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ／ＳＡ：ＦｏｒｔｅＢｉｏ社，ａ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を，ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６の所定の位置に設置した。

【0359】

ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６を実施例２５に記載の表１５－３に示す条件で作動させて抗ヒトＢＤＮＦ抗体をセンサーに固相化した。次いで，ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６を表１６－２に示す条件で作動させてデータを取得後，ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６付属の解析ソフトウェアを用いて，結合反応曲線を１：１結合モデルにフィッティングし，ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤと，ｒヒトＴｆＲ，ｒサルＴｆＲ及びＨＳＡに対する会合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）を測定し，解離定数（Ｋ_Ｄ）を算出した。なお，測定は２５～３０℃の温度下で実施した。

【0360】

【表16-2】

【0361】

表１６－３にｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤのヒトＴｆＲ、サルＴｆＲ及びＨＳＡに対する会合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）の測定結果，及び解離定数（Ｋ_Ｄ）を示す。

【0362】

【表16-3】

【0363】

ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤの、ヒトＴｆＲ及びサルＴｆＲとの解離定数は、それぞれ５．６６×１０^－１１Ｍ及び６．２６×１０^－１０Ｍであった。これらの結果は、ｈＢＤＮＦと抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質のＣ末端側にＡＢＤを付加させても、当該融合蛋白質のヒトＴｆＲ及びサルＴｆＲへの高親和性が維持されることを示す。また、ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤの、ＨＳＡとの解離定数は、１．３５×１０^－８Ｍであった。これらの結果は、ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤが、ＴｆＲ（ヒト及びサル）とＨＳＡのいずれにも高親和性を有することを示すものである。すなわち、ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤを、ヒトの血中に投与したときに、ＡＢＤを介して血中に存在するアルブミンと結合することにより血中半減期が上昇すること、及びＴｆＲを介してＢＢＢを通過することのいずれもが達成されることを示す。更には、アルブミンと結合することにより、ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）の免疫原性を低下させることもできることを示す。

【0364】

〔実施例２６〕ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１のマウスを用いた脳移行評価
ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１について，ＢＢＢを通過して脳内に移行することを，マウストランスフェリン受容体の細胞外領域をコードする遺伝子をヒトトランスフェリン受容体遺伝子の細胞外領域をコードする遺伝子に置換したｈＴｆＲノックインマウス（ｈＴｆＲ－ＫＩマウス）を用いて評価した。ｈＴｆＲ－ＫＩマウスは，概ね下記の方法で作製した。また，ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１としては，実施例２２に記載の精製品を用いた。

【0365】

細胞内領域がマウスｈＴｆＲのアミノ酸配列であり，細胞外領域がヒトｈＴｆＲのアミノ酸配列であるキメラｈＴｆＲをコードするｃＤＮＡの３’側に，ｌｏｘＰ配列で挟み込んだネオマイシン耐性遺伝子を配置した，配列番号４５で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を化学的に合成した。このＤＮＡ断片を，５’アーム配列として配列番号４６で示される塩基配列，３’アーム配列として配列番号４７で示される塩基配列を有するターゲッティングベクターに，常法により組み込み，これをマウスＥＳ細胞にエレクトロポレーション法により導入した。遺伝子導入後のマウスＥＳ細胞を，ネオマイシン存在下で選択培養し，ターゲッティングベクターが相同組換えにより染色体に組み込まれたマウスＥＳ細胞を選択した。得られた遺伝子組換えマウスＥＳ細胞を，ＩＣＲマウスの８細胞期胚（宿主胚）へ注入し，精管結紮を行ったマウスとの交配によって得られた偽妊娠マウス（レシピエントマウス）に移植した。得られた産仔（キメラマウス）について毛色判定を行い，ＥＳ細胞が生体の形成に高効率で寄与した個体，すなわち全体毛に対する白色毛の占める比率の高い個体を選別した。このキメラマウス個体をＩＣＲマウスと掛け合わせてＦ１マウスを得た。白色のＦ１マウスを選別し，尻尾の組織より抽出したＤＮＡを解析し，染色体上でマウストランスフェリン受容体遺伝子がキメラｈＴｆＲに置き換わっているマウスをｈＴｆＲ－ＫＩマウスとした。

【0366】

ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１溶液を，投与される用量が５ｍｇ／ｋｇとなるように，各時点３匹のｈＴｆＲ－ＫＩマウス（雄，２１～２８週齢）に静脈内投与した。静脈内投与してから投与後０．１７，１，３，８，２４，４８時間後に末梢血を採取し，採取後に生理食塩液で全身潅流し，脳（大脳と小脳を含む部分）を採取した。摘出した脳の重量（湿重量）を測定した後，Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌを含むＲＩＰＡバッファー（ナカライテスク）を添加して脳組織をホモジネートした。ホモジネートを遠心して上清を回収し，上清中に含まれるｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１の量を以下の方法で測定した。

【0367】

まず，Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ ｐｒｅ－ａｄｓｏｒｂｅｄ（Ａｂｃａｍ社）をＳｔａｎｄａｒｄ Ｐｌａｔｅ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）の各ウェルに２５μＬずつ添加し，１時間静置してプレートに固定させた。次いで，各ウェルにＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ＰＢＳ） Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを１５０μＬずつ添加し，１時間振盪してプレートをブロッキングした。次いで，各ウェルをＴｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄し，脳組織のホモジネートの上清を５０μＬずつ添加し，１時間振盪した。次いで，各ウェルにＳｕｌｆｏ－ｔａｇ標識されたＡｎｔｉ－ＢＤＮＦ 抗体［３５９２８．１１］（ａｂ１０５０５）（アブカム社）を５０μＬずつ添加し，１時間振盪した。次いで，各ウェルにＲｅａｄ ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を１５０μＬずつ添加し，Ｓｅｃｔｏｒ^ＴＭ Ｉｍａｇｅｒ ６０００ ｒｅａｄｅｒで各ウェルからの発光量を測定した。濃度既知の標準試料の測定値から検量線を作成し，これに各検体の測定値を内挿することにより，脳のグラム重量（湿重量）当たりに含まれる融合蛋白質の量を算出した。

【0368】

脳組織中のｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１の濃度測定の結果を図９に示す。なお，ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１は二量体を形成して生体内でその機能を発揮することから，図９において，二量体に換算した値をｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１の濃度（モル濃度）とした。以下，図１０，表１７，及び表１８に示されるｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１の濃度についても同様である。ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１は，投与後２４時間においても脳内濃度が５．７ｎＭと高値を示した。また，脳内濃度の半減期は２９時間であった。本結果は，ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１が血液脳関門を通過して脳組織に蓄積する性質を有することを示すものであり，脳組織内で機能させるべき薬剤であるＢＤＮＦを抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１又はその抗原結合性断片（抗体フラグメント）と結合させることにより，その薬剤を効率良く脳組織に蓄積させることができること示すものである。

【0369】

次いで，ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１の血中動態の測定結果を表１７に示す。ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１は，投与後１時間においても血中濃度が１５ｎＭと高値を示し，血中で安定であることが示された（表１７）。また，血中濃度の半減期は０．４時間であった。この結果は，脳内濃度の半減期は，血中濃度の半減期よりも顕著に長いことを示すものである。また，Ｆｃ－Ｆａｂ（３Ｎ）についても同様の試験にてｈＴｆＲ－ＫＩマウスにおける血中動態を測定したところ，血中濃度の半減期は５．３時間であった。この結果は，ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を導入することにより血中濃度の半減期が顕著に延長し得ることを示すものである。

【0370】

【表17】

【0371】

〔実施例２７〕ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１のカニクイザルを用いた脳移行評価
ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１を，５．０ｍｇ／ｋｇの用量でそれぞれ雄性カニクイザルに単回静脈内投与し投与後０．０８３，０．５，１，３，２４，７２時間後に末梢血を採取し，採取後に生理食塩液で脳潅流を実施した。潅流後，脳組織を摘出した。
この脳組織を用いて，以下のｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１の濃度測定及び免疫組織化学染色を行った。また，ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１としては，実施例２２に記載の精製品を用いた。

【0372】

脳組織中のｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１の濃度測定は，概ね以下の手順で行った。採取した組織を，脳組織を大脳皮質，小脳，海馬及び線条体等に分けてから，それぞれＰｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含むＲＩＰＡ Ｂｕｆｆｅｒ（ナカライテスク社）でホモジネートし遠心して上清を回収した。Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ Ｋａｐｐａ Ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎ Ｇｏａｔ ＩｇＧ Ｂｉｏｔｉｎ（株式会社免疫生物研究所）， Ｓｕｌｆｏｔａｇ ａｎｔｉ－ＢＤＮＦ ａｎｔｉｂｏｄｙ（アブカム社）及び脳組織ホモジネートをＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ｉｎ ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）でブロッキングを実施したストレプトアビジンプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）に添加し，１時間静置してプレートに固定した。次いで，各ウェルにＲｅａｄ ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を１５０μＬずつ添加し，ＳｅｃｔｏｒＴＭ Ｉｍａｇｅｒ ６０００ ｒｅａｄｅｒ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いて各ウェルからの発光量を測定した。濃度既知の標準試料の測定値から検量線を作成し，これに各検体の測定値を内挿することにより，各脳組織のグラム重量（湿重量）当たりに含まれる融合蛋白質の量（脳組織中濃度）を算出した。

【0373】

脳組織中のｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１の濃度測定の結果を図１０に示す。本結果は，ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１が血液脳関門を通過して脳組織に蓄積する性質を有することを示すものであり，脳組織内で機能させるべき薬剤であるＢＤＮＦを抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１又はその抗原結合性断片（抗体フラグメント）と結合させることにより，その薬剤を効率良く脳組織に蓄積させることができること示すものである。

【0374】

次いで，ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１の血中動態の測定結果を表１８に示す。ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）１は，投与後１時間においても血中濃度が３０ｎＭと高値を示し，血中で安定であることが示された（表１８）。

【0375】

【表18】

【0376】

脳組織中のｈＢＤＮＦ－ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質の免疫組織化学染色は，実施例１５に記載の方法で行うことができる。

【0377】

〔実施例２８〕ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤのマウスを用いた脳移行評価
ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤについて，ＢＢＢを通過して脳内に移行することを，マウストランスフェリン受容体の細胞外領域をコードする遺伝子をヒトトランスフェリン受容体遺伝子の細胞外領域をコードする遺伝子に置換したｈＴｆＲノックインマウス（ｈＴｆＲ－ＫＩマウス）を用いて評価した。ｈＴｆＲ－ＫＩマウスは，概ね実施例７－２に記載の方法で作製した。また，ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤとしては，実施例２２－２に記載の精製品を用いた。

【0378】

ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤ溶液を，投与される用量が２．１５ｍｇ／ｋｇとなるように，各時点３匹のｈＴｆＲ－ＫＩマウス（雄，１９～２１週齢）に静脈内投与した。静脈内投与してから投与後０．１６７、１、３、８、２４、４８、７２時間後に生理食塩液で全身灌流し，脳（大脳と小脳を含む部分）を採取した。摘出した脳の重量（湿重量）を測定した後，Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌを含むＲＩＰＡバッファー（ナカライテスク）を添加して脳組織をホモジネートした。ホモジネートを遠心して上清を回収し，上清中に含まれるｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤの量を以下の方法で測定した。

【0379】

まず，Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ ｐｒｅ－ａｄｓｏｒｂｅｄ （Ａｂｃａｍ社）をＳｔａｎｄａｒｄ Ｐｌａｔｅ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）の各ウェルに２５μＬずつ添加し，４℃で一晩静置してプレートに固定させた。次いで，各ウェルにＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ＰＢＳ） Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを１５０μＬずつ添加し，１時間振盪してプレートをブロッキングした。次いで，各ウェルをＴｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄し、脳組織のホモジネートの上清を５０μＬずつ添加し，１時間振盪した。次いで，各ウェルにＳｕｌｆｏ－ｔａｇ標識したＡｎｔｉ－ＢＤＮＦ 抗体［３５９２８．１１］（ａｂ１０５０５）（Ａｂｃａｍ社）を５０μＬずつ添加し，１時間振盪した。次いで，各ウェルにＲｅａｄ ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を１５０μＬずつ添加し，Ｓｅｃｔｏｒ^ＴＭ Ｉｍａｇｅｒ ６０００ ｒｅａｄｅｒで各ウェルからの発光量を測定した。濃度既知の標準試料の測定値から検量線を作成し，これに各検体の測定値を内挿することにより，脳のグラム重量（湿重量）当たりに含まれる抗体の量を算出した。

【0380】

脳組織中のｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤの濃度測定の結果を図１１に示す。ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤの脳内濃度は、投与８時間後に２．９８ｎＭのＣ_ｍａｘを示し、投与７２時間に０．７ｎＭであった。

【0381】

本結果は，ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤが血液脳関門を通過して脳組織に蓄積する性質を有することを示すものであり，脳組織内で機能させるべき薬剤であるＢＤＮＦをこれらの抗体と結合させることにより，その薬剤を効率良く脳組織に蓄積させることができること示すものである。

【0382】

次いで，ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤの血中動態の測定結果を表１９に示す。ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体（３Ｎ）ＡＢＤの血中濃度は，投与1時間後に１７９．８ｎＭ、３時間後においても５３．４ｎＭと高値を示し，血中で安定であることが示された（表１９）。この結果は，アルブミン親和性ペプチドを導入することにより血中の安定性が向上し、血中半減期が顕著に延長し得ることを示すものである。

【0383】

【表19】

【0384】

〔実施例２９〕１－メチル－４－フェニル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）処置パーキンソン病モデルマウスを用いた本発明の融合蛋白質による運動機能改善作用の検討
実施例２２で製造したｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質のｉｎ ｖｉｖｏ でのＢＤＮＦ生物活性は，例えば，以下に記載するような方法を用いてＭＰＴＰ処置したｈＴｆＲ－ＫＩマウスにおけるパーキンソン病症状改善効果によって評価できる。

【0385】

（１）パーキンソン病モデルマウスの作成
実施例２６に記載したｈＴｆＲ－ＫＩマウス（いずれも８－１５週齢）を用いる。検疫・順化が終了したマウスに対し，生理的食塩液もしくは生理的食塩液に溶解させたＭＰＴＰ（２５あるいは３０ｍｇ／ｋｇ）を，１日１回，５日間腹腔内投与，あるいは２０ｍｇ／ｋｇを１日の内に２時間おきに４回腹腔内投与する。
最終投与の３日以後に，Ｐｏｌｅ試験によりブラジキネジア症状を，またはロータロッド（Ｒｏｔａ－ｒｏｄ）試験により協調運動能の低下を評価する。

【0386】

（２）Ｐｏｌｅ試験
ＭＰＴＰ処置マウスを，垂直に立てた木製の棒の上部５ｃｍ付近に頭部を上向きにつかまらせる。マウスが棒につかまってから下向きへ向きを変えるまでの時間（Ｔｔｕｒｎ），およびつかまってから床面に下りるまでの時間（ＴＬＡ）を測定する。加えて，マウスの動きを観察し，その症状を以下のようにスコア付けする。
０：四肢を上手に使って下りる／正常な動き。
１：棒の上部で向きを変える際にぎこちなさが見られる。
２：棒を跨ぎきれずに横すべりのような行動を取る。
３：落下する。

【0387】

初めに１回トレーニングを行った後，５分毎に１回，試験を３回繰り返し行う。３回の平均時間を群分け用データに用いる。体重とＰｏｌｅ試験のデータを元に，多変数完全無作為化割り付けによりＭＰＴＰ処置マウスを３又は４群に分ける。

【0388】

生理的食塩液処置マウス（溶媒処置群），ＭＰＴＰ処置マウス（溶媒処置群，本発明の融合蛋白質処置群）の計４～５群において，１週間に１～２回，４～８週間，反復静脈内投与を行う。最終投与から１週間後に再びＰｏｌｅ試験（上記の群分け用データ取り時と同じプロトコール）を行い，ブラジキネジア症状の改善作用を評価する。静脈内に投与した本発明の融合蛋白質が脳内に移行し，脳内でＢＤＮＦ活性を発揮することにより，パーキンソン病モデル動物におけるブラジキネジア等の運動機能の障害を改善し得る。

【0389】

このようにして静脈内に投与した本発明の融合蛋白質が疾患モデル動物の脳内に移行してＢＤＮＦ活性を発揮し得ることを確認できる。

【0390】

（３）ロータロッド（Ｒｏｔａ－ｒｏｄ）試験
マウスをＲｏｔａ－ｒｏｄ装置（ＭＫ－６１０Ａ，室町機械）の回転軸に１レーン毎に１匹ずつ乗せ，３０秒間静置したのち１分間８ｒｐｍで軸の回転に順化させ，その後，３分間で２５ｒｐｍまで回転数が上がる条件でトレーニングを行う。トレーニングの１時間後に以下の評価試験を行う。

【0391】

本試験では，８ｒｐｍで回転する軸の動きに３０秒間マウスを順化させたのち，５分間で４０ｒｐｍまで回転数が上がる条件で軸よりマウスが落下するまでの時間を測定する。１時間の間隔をあけて本試験を３回繰り返し，３回の平均時間を群分け用データに用いる。体重とＲｏｔａ－ｒｏｄ試験のデータを元に，多変数完全無作為化割り付けによりＭＰＴＰ処置マウスを３又は４群に分ける。

【0392】

生理的食塩液処置マウス（溶媒処置群），ＭＰＴＰ処置マウス（溶媒処置群，本発明の融合蛋白質処置群）の計４～５群において，１週間に１～２回，４～８週間，反復静脈内投与を行う。最終投与から１週間後に再びＲｏｔａ－Ｒｏｄ試験（上記の群分け用データ取り時と同じプロトコール）を行い，協調運動能力の改善作用を評価する。静脈内に投与した本発明の融合蛋白質が脳内に移行し，脳内でＢＤＮＦ活性を発揮することにより，パーキンソン病モデル動物における協調運動能力等の運動機能の障害を改善し得る。

【0393】

このようにして静脈内に投与した本発明の融合蛋白質が疾患モデル動物の脳内に移行してＢＤＮＦ活性を発揮し得ることを確認できる。

【0394】

〔実施例３０〕１－メチル－４－フェニル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）処置パーキンソン病モデルサルを用いた本発明の融合蛋白質による運動機能改善効果の検討
実施例２２で製造したｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質のｉｎ ｖｉｖｏ でのＢＤＮＦ生物活性は，例えば，以下に記載するような方法を用いてＭＰＴＰ処置したサルにおけるパーキンソン病様症状改善効果によって評価できる。

【0395】

ＭＰＴＰ処置前の５日間，正常な行動をあらかじめ評価した雄性アカゲザル（５～８歳）あるいはカニクイザル（４～８歳）にＭＰＴＰ（０．２ｍｇ／ｋｇあるいはそれ以上で，２ｍｇ／ｋｇを上限とする）を１週間に最大連続５日間，４週間以上の静脈内投与，あるいは筋肉内投与，もしくは皮下投与を行い，ＵＰＤＲＳのスコアの低下あるいは運動量の低下を確認する。もしくは，内頸動脈の片側のみにＭＰＴＰ（０．２ｍｇ／ｋｇあるいはそれ以上で，２ｍｇ／ｋｇを上限とする）を１回あるいは投与間隔を５～１０日間空けて２回投与し，ＵＰＤＲＳスコア（Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０００； ９６：７１－７６），運動量，さらに旋回運動量を指標にして，パーキンソン病様症状を確認し，ＭＰＴＰの処置を終了する。

【0396】

ＭＰＴＰの最終投与から１週間後以降でパーキンソン病様症状が安定したのを確認した後，１週間に１回あるいは２回，ｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質（０．０３～１０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内あるいは皮下投与し，ＵＰＤＲＳ，運動量，もしくは旋回運動の評価によって運動機能の改善度を評価する。静脈内または皮下に投与したｈＢＤＮＦ－抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質が脳内に移行し，脳内でＢＤＮＦ活性を発揮することにより，パーキンソン病モデル動物における運動機能の障害を改善し得る。

【0397】

このようにして静脈内に投与した本発明の融合蛋白質が疾患モデル動物（サル）の脳内に移行してＢＤＮＦ活性を発揮し得ることを確認できる。

【産業上の利用可能性】

【0398】

本発明のｈＢＤＮＦと抗ｈＴｆＲ抗体の融合蛋白質は，血液脳関門を効率的に通過させることができるので，ｈＢＤＮＦを中枢神経系において作用させる改良された手段を提供するものとして有用性が高い。

【配列表フリーテキスト】

【0399】

配列番号３：リンカー例１のアミノ酸配列
配列番号４：リンカー例２のアミノ酸配列
配列番号５：リンカー例３のアミノ酸配列
配列番号６：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号７：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号８：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号９：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号１０：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１１：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号１２：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号１３：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号１４：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号１５：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列１
配列番号１６：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列２
配列番号１７：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列１
配列番号１８：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列２
配列番号１９：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列３
配列番号２０：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列４
配列番号２１：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列５
配列番号２２：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列６
配列番号２３：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の，可変領域としてアミノ酸配列２を含む軽鎖のアミノ酸配列
配列番号２４：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の，可変領域としてアミノ酸配列２を含む軽鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号２５：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の，可変領域としてアミノ酸配列４を含む軽鎖のアミノ酸配列
配列番号２６：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の，可変領域としてアミノ酸配列４を含む軽鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号２７：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の，可変領域としてアミノ酸配列５を含む軽鎖のアミノ酸配列
配列番号２８：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の，可変領域としてアミノ酸配列５を含む軽鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号２９：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の，可変領域としてアミノ酸配列６を含む軽鎖のアミノ酸配列
配列番号３０：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の，可変領域としてアミノ酸配列６を含む軽鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号３１：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列１
配列番号３２：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列２
配列番号３３：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列３
配列番号３４：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列４
配列番号３５：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列５
配列番号３６：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列６
配列番号３７：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の，可変領域としてアミノ酸配列２を含む重鎖のアミノ酸配列
配列番号３８：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の，可変領域としてアミノ酸配列２を含む重鎖のアミノ酸配列コードする塩基配列，合成配列
配列番号３９：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の，可変領域としてアミノ酸配列２を含む重鎖（ＩｇＧ４）のアミノ酸配列
配列番号４０：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の，可変領域としてアミノ酸配列２を含む重鎖（ＩｇＧ４）のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号４１：プライマーｈＴｆＲ５’，合成配列
配列番号４２：プライマーｈＴｆＲ３’，合成配列
配列番号４３：プライマーＨｙｇ－Ｓｆｉ５’，合成配列
配列番号４４：プライマーＨｙｇ－ＢｓｔＸ３’，合成配列
配列番号４５：キメラｈＴｆＲをコードするｃＤＮＡの３’側にｌｏｘＰ配列で挟み込んだネオマイシン耐性遺伝子を配置したＤＮＡの塩基配列，合成配列
配列番号４６：ターゲッティングベクターの５’アーム配列，合成配列
配列番号４７：ターゲッティングベクターの３’アーム配列，合成配列
配列番号４８：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号４９：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号５２：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎの重鎖とｈＢＤＮＦの融合蛋白質（１）のアミノ酸配列
配列番号５３：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎの重鎖とｈＢＤＮＦの融合蛋白質（１）のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号５４：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎの重鎖とｈＢＤＮＦの融合蛋白質（２）のアミノ酸配列
配列番号５５：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎの重鎖とｈＢＤＮＦの融合蛋白質（２）のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号５７：１本鎖ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎのアミノ酸配列
配列番号５８：ｈＢＤＮＦのプロ体と１本鎖ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎの融合蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号５９：ｈＢＤＮＦのプロ体と１本鎖ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎの融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号６０：ｈＢＤＮＦと１本鎖ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎの融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号６１：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３ＮのＦａｂ重鎖のアミノ酸配列
配列番号６２：ｈＢＤＮＦのプロ体とヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３ＮのＦａｂ重鎖との融合蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号６３：ｈＢＤＮＦのプロ体とヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３ＮのＦａｂ重鎖との融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号６４：ｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３ＮのＦａｂ重鎖との融合蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号６５：ｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３ＮのＦａｂ重鎖との融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号６６：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎの重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号６７：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎの重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号６８：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎの重鎖フレームワーク領域３のアミノ酸配列
配列番号６９：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎの重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号７０：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎの重鎖のアミノ酸配列
配列番号７１：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎの重鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号７２：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎの重鎖（ＩｇＧ４）のアミノ酸配列
配列番号７３：ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を導入したｈＢＤＮＦのプロ体とヒト化抗ｈＴｆＲ抗体３ＮのＦａｂ重鎖との融合蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号７４：ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を導入したｈＢＤＮＦのプロ体とヒト化抗ｈＴｆＲ抗体３ＮのＦａｂ重鎖との融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号７５：ヒトＩｇＧのＦｃ領域のアミノ酸配列の一例
配列番号７６：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎの重鎖（ＩｇＧ４）のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号７７：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体３のＦａｂ重鎖のアミノ酸配列
配列番号７８：ｈＢＤＮＦのプロ体とヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３のＦａｂ重鎖との融合蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号７９：ｈＢＤＮＦのプロ体とヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３のＦａｂ重鎖との融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号８０：ｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３のＦａｂ重鎖との融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号８１：ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を導入したヒト化抗ｈＴｆＲ抗体３ＮのＦａｂ重鎖のアミノ酸配列
配列番号８２：ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を導入したヒト化抗ｈＴｆＲ抗体３ＮのＦａｂ重鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号８３：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖フレームワーク領域３のアミノ酸配列
配列番号８４：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３ＮのＦａｂ重鎖のアミノ酸配列（２）
配列番号８５：アルブミン結合ドメインのアミノ酸配列
配列番号８６：ｈＢＤＮＦのプロ体、ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３ＮのＦａｂ重鎖、及びＡＢＤの融合蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号８７：ｈＢＤＮＦのプロ体、ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３ＮのＦａｂ重鎖、及びＡＢＤの融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号８８：ｈＢＤＮＦ、ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３ＮのＦａｂ重鎖、及びＡＢＤの融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号８９：アルブミン親和性ペプチドを導入したＦａｂ重鎖のアミノ酸配列
配列番号９０：１本鎖ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３Ｎ（２）のアミノ酸配列

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

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