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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024136647
(43)【公開日】2024-10-04
(54)【発明の名称】ナノバブルの製造方法
(51)【国際特許分類】
C07K 14/76 20060101AFI20240927BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20240927BHJP
A61K 9/00 20060101ALI20240927BHJP
A61K 49/22 20060101ALI20240927BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20240927BHJP
C12N 9/24 20060101ALN20240927BHJP
【ＦＩ】
C07K14/76
A61K47/42
A61K9/00
A61K49/22
C07K16/00
C12N9/24
【審査請求】未請求
【請求項の数】14
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023047819
(22)【出願日】2023-03-24
(71)【出願人】
【識別番号】522348941
【氏名又は名称】貴田 浩志
(71)【出願人】
【識別番号】523107802
【氏名又は名称】立花 克郎
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100151301
【弁理士】
【氏名又は名称】戸崎 富哉
(74)【代理人】
【識別番号】100152308
【弁理士】
【氏名又は名称】中 正道
(74)【代理人】
【識別番号】100201558
【弁理士】
【氏名又は名称】亀井 恵二郎
(72)【発明者】
【氏名】貴田 浩志
(72)【発明者】
【氏名】立花 克郎
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA99
4C076EE41
4C076FF70
4C085HH09
4C085JJ20
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045AA40
4H045CA40
4H045DA70
4H045DA75
4H045DA89
4H045EA20
4H045EA34
4H045FA71
(57)【要約】
【課題】安全性の高いバブル製剤を簡便に調製するための方法の構築。
【解決手段】ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するマイクロバブルとナノバブルとの混合物を凍結乾燥する工程を含む、ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するナノバブルの製造方法。
【選択図】なし
【解決手段】ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するマイクロバブルとナノバブルとの混合物を凍結乾燥する工程を含む、ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するナノバブルの製造方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するマイクロバブルとナノバブルとの混合物を凍結乾燥する工程を含む、ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有する乾燥状態のナノバブルの製造方法。
【請求項2】
ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するマイクロバブルとナノバブルとの混合物を、浮力を利用した分離工程に供さないことを特徴とする、請求項１記載の製造方法。
【請求項3】
凍結乾燥が、真空凍結乾燥である、請求項１または２記載の製造方法。
【請求項4】
ペプチドまたはタンパク質が、アルブミン、免疫グロブリンＧ、およびリゾチームからなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項記載の製造方法。
【請求項5】
ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するマイクロバブルとナノバブルとの混合物を凍結乾燥する工程を含む、ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するマイクロバブルとナノバブルとの混合物からマイクロバブルを除去する方法。
【請求項6】
ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するマイクロバブルとナノバブルとの混合物を、浮力を利用した分離工程に供さないことを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項7】
凍結乾燥が、真空凍結乾燥である、請求項５または６記載の方法。
【請求項8】
ペプチドまたはタンパク質が、アルブミン、免疫グロブリンＧ、およびリゾチームからなる群から選択される、請求項５～７のいずれか一項記載の方法。
【請求項9】
ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するナノバブルを凍結乾燥する工程を含む、ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するナノバブルの微細化方法。
【請求項10】
凍結乾燥が、真空凍結乾燥である、請求項９記載の微細化方法。
【請求項11】
ペプチドまたはタンパク質が、アルブミン、免疫グロブリンＧ、およびリゾチームからなる群から選択される、請求項９または１０記載の微細化方法。
【請求項12】
ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有する乾燥状態のナノバブル、またはそれを含む組成物。
【請求項13】
請求項１２記載の組成物であって、ここで、当該組成物に含まれるマイクロバブルの残存率が１％以下であり、且つ、当該ナノバブルの平均粒子径が１～１０００ｎｍ未満である、組成物。
【請求項14】
ペプチドまたはタンパク質が、アルブミン、免疫グロブリンＧ、およびリゾチームからなる群から選択される、請求項１２または１３記載のナノバブルまたは組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ナノバブルの製造方法等に関し、より詳細には、ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するナノバブルの製造方法等に関する。
【背景技術】
【0002】
ＩＳＯの定義において、直径１００μｍ未満の気泡は、ファインバブル（Ｆｉｎｅ Ｂｕｂｂｌｅ：ＦＢ）と定義される。また、ファインバブルのうち、直径１μｍ～１００μｍのものは「マイクロバブル」、直径１μｍ未満の気泡は、ウルトラファインバブル（Ｕｌｔｒａ Ｆｉｎｅ Ｂｕｂｂｌｅ：ＵＦＢ、「ナノバブル」とも称される）と定義されている。マイクロバブルおよびナノバブルは様々な分野への応用が検討されており、その主要な一分野として、医学研究分野や医療分野が挙げられる。医学研究分野や医療分野において、マイクロバブルやナノバブルは、検査、診断、または治療のためのツールとして用いられている。
【0003】
マイクロバブルの医療応用の一つとして、超音波画像診断における超音波造影剤としての応用が挙げられる。マイクロバブルは柔軟な表面を有し超音波に共鳴することから、強いエコー原性を有している。この特性を利用して、マイクロバブルは超音波画像診断に適用されている。
【0004】
また、マイクロバブルの医療分野における別の応用例として、薬物送達システム（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ：ＤＤＳ）が挙げられる。液中に存在するマイクロバブルに対して超音波を照射すると、マイクロバブルは周波数に同期して膨張と収縮を繰り返しながら周囲の気体分子を取り込み成長し、最終的に破裂する。この一連の流れは「音響キャビテーション」と称される。音響キャビテーションの結果として破裂したマイクロバブルはマイクロ液体ジェット流を発生させるが、このマイクロ液体ジェット流は多様な用途に用いることができる。例えば、本発明者らはマイクロ液体ジェット流を利用することで薬物の薬効を増強できることを報告している（非特許文献１）。
【0005】
また、細胞の近傍でマイクロバブルの破裂に伴うマイクロ液体ジェット流を発生させると、当該マイクロ液体ジェット流によって細胞膜上に一時的に穿孔を生じせしめることができ、かかる穿孔を利用して細胞内へ薬剤を送達させる技術（「ソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）」）が開発されている。
【0006】
ソノポレーションの強みは、低分子化合物、遺伝子（例、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなど）、抗体、ペプチドなどの様々な治療モダリティを細胞内へ送達可能な点である。特にソノポレーションによるＤＤＳが有利な状況としては、巨大分子の細胞内送達が簡便に行える点が挙げられる。例えば、プラスミドＤＮＡなどの巨大分子を細胞内へ送達する手段としては、ソノポレーション以外では、ウイルスベクター、リポソームあるいは高分子ミセルなどの化学的キャリアの使用が一般的である。しかしながら、これらの手段は送達しようとする巨大分子に加えて、それを搭載する化学的キャリアをも調製する必要があり、プロセスの煩雑化や高コスト化につながる。一方で、ソノポレーションはキャリアフリーの様式で巨大分子を細胞内へ送達することができるため簡便且つ低コストでのＤＤＳを可能とする。
【0007】
マイクロバブルと超音波を用いた薬物送達のもう一つの強みは、送達部位を厳密に制御可能な点である。ＭＲＩガイド下集束超音波（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ-ｇｕｉｄｅｄ ＦＵＳ：ＭＲｇＦＵＳ）を用いることにより、超音波の照射部位をｍｍ単位で制御することができる。その応用例の一つがＢＢＢオープニング（Ｂｌｏｏｄ ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｏｐｅｎｉｎｇ：ＢＢＢＯ）である。脳動脈は、血管内皮細胞同士が密に結合した血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ：ＢＢＢ）と呼ばれる構造を有しており、物質の脳内への送達を制限している。ＢＢＢＯでは、薬物とともにマイクロバブルを血管内に投与し、ＭＲｇＦＵＳで超音波を脳深部に向けて照射する。標的部位でマイクロバブルを収縮、膨張、破裂させ、一時的にＢＢＢを開裂させることにより、薬物を脳内へ送達させることができる。
【0008】
ところで近年マイクロバブルよりもさらに微細なナノバブルの応用が鋭意検討されている。ナノバブルは非常に微細で観察が困難であることなどを理由にその物理的性質は未だ十分に解明されていないが、マイクロバブルと同様に超音波造影剤やソノポレーションを含むＤＤＳへ応用できることが報告されている。尚、本発明者らは、ナノバブルを用いたソノポレーションによりキャリアフリーの様式でｍＲＮＡを細胞内へ送達できることを報告している（非特許文献２）。
【0009】
マイクロバブルやナノバブルはこれまでに様々な改良がなされてきた。例えば、気泡内に内包されるガスとして初期段階では空気が用いられていたが、その後、パーフルオロプロパン（Ｃ３Ｆ８）、パーフルオロブタン（Ｃ４Ｆ１０）、六フッ化硫黄（ＳＦ６）などの高分子量を有する溶解度の低いガスが用いられるようになり、その結果、気泡の安定性が大幅に向上し、造影効果の持続時間の延長に寄与した。また、気泡殻として初期段階ではヒト血清アルブミンが用いられていたが、その後、乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、パルミチン酸、またはリン脂質などが殻成分として用いられるようになり、マイクロバブルの特性の多様化に貢献した。さらには、気泡殻表面にＰＥＧ等の化学修飾を施すことでマイクロバブルの滞留性能を向上させたり、気泡殻表面に抗体等の特定の標的に対して親和性を有する分子を結合させることで、マイクロバブルに標的指向性を付与したりすることも可能となっている。
【0010】
上述のとおり、これまでにマイクロバブルやナノバブルに対して様々な観点から鋭意検討がなされ、多数の学術的知見が蓄積されてきた。しかしながら一方で、安全性やコスト等の問題から、現時点において臨床で実際に使用可能なバブル製剤は数種類しかなく、また、その用途も極めて制限されている。
【0011】
バブル製剤の上市が困難な理由の一つとして、バブルサイズの均一化が困難である点が挙げられる。例えば、ナノバブル溶液を調製する際に、少数でもマイクロバブルが混入してしまうと、バブル溶液全体の物性に大きな影響を与えてしまう可能性がある。計算上、バブルの内包ガス体積はその中空半径の３乗に比例する。仮に中空半径１００ｎｍのナノバブルと中空半径でその１０倍の１μｍのマイクロバブルの体積を比較した場合、後者の内包ガス体積は前者の１０００倍に相当する。したがって、ナノバブル溶液の中に少数でもマイクロバブルが混入する場合、その物理的・生理的な作用への影響は極めて大きくなる。ナノバブル溶液の作用を均一化するためには、溶液中に混入するマイクロバブルを可能な限り、除去することが重要となる。従って、安全性が高いバブル製剤を低コストで調製できる新規のバブル製造手段の確立には極めて強いニーズが存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0012】
【非特許文献1】K. Tachibana et al., Circulation. 1995 Sep 1;92(5):1148-50.
【非特許文献2】H. Kida et al., Front Pharmacol. 2022 Jun 1;13:855495.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
かかる背景から、本発明は、安全性の高いバブル製剤（特に、ナノバブル製剤）を簡便に調製するための方法の構築をその目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0014】
本発明者らは、上記課題に対して鋭意検討した結果、安全性の高いアルブミンからなる殻を有するマイクロバブルおよびナノバブルを含む水溶液を凍結乾燥することにより、
（１）マイクロバブルを選択的に崩壊させ、ナノバブルのみを維持させることができること、
（２）凍結乾燥したナノバブルは４～２５℃程度の温度帯で長期保存が可能であること、
（３）長期保存後のナノバブルは、蒸留水などに再溶解して再生させることにより、凍結乾燥前のナノバブルと同様に、超音波造影剤やソノポレーションに使用することが可能であること等を見出した。
（１）マイクロバブルを選択的に崩壊させ、ナノバブルのみを維持させることができること、
（２）凍結乾燥したナノバブルは４～２５℃程度の温度帯で長期保存が可能であること、
（３）長期保存後のナノバブルは、蒸留水などに再溶解して再生させることにより、凍結乾燥前のナノバブルと同様に、超音波造影剤やソノポレーションに使用することが可能であること等を見出した。
【0015】
バブル製剤の製造において、凍結乾燥は高い柔軟性を有するリン脂質からなる気泡殻を有するバブルに対して一般的に用いられる手法であり、アルブミン殻等の比較的柔軟性の低い気泡殻を有するバブルに対してはバブルを崩壊させてしまうと考えられていた。そのような技術常識の存在を理由として、凍結乾燥はアルブミン殻を有するバブルにおいてはほとんど適用されてこなかった。従って、凍結乾燥処理が、アルブミン殻マイクロバブルを選択的に崩壊させ、一方でアルブミン殻ナノバブルを維持させることができる事実や、凍結乾燥したアルブミン殻ナノバブルが冷蔵から室温の温度帯で長期保存可能であるとの本発明者らの発見は極めて驚くべきものであった。本発明者らは、かかる知見に基づいてさらに研究を進めることによって本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の通りである。
【0016】
［１］
ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するマイクロバブルとナノバブルとの混合物を凍結乾燥する工程を含む、ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有する乾燥状態のナノバブルの製造方法。
［２］
ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するマイクロバブルとナノバブルとの混合物を、浮力を利用した分離工程に供さないことを特徴とする、［１］記載の製造方法。
［３］
凍結乾燥が、真空凍結乾燥である、［１］または［２］記載の製造方法。
［４］
ペプチドまたはタンパク質が、アルブミン、免疫グロブリンＧ、およびリゾチームからなる群から選択される、［１］～［３］のいずれか記載の製造方法。
［５］
ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するマイクロバブルとナノバブルとの混合物を凍結乾燥する工程を含む、ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するマイクロバブルとナノバブルとの混合物からマイクロバブルを除去する方法。
［６］
ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するマイクロバブルとナノバブルとの混合物を、浮力を利用した分離工程に供さないことを特徴とする、［５］記載の方法。
［７］
凍結乾燥が、真空凍結乾燥である、［５］または［６］記載の方法。
［８］
ペプチドまたはタンパク質が、アルブミン、免疫グロブリンＧ、およびリゾチームからなる群から選択される、［５］～［７］のいずれか記載の方法。
［９］
ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するナノバブルを凍結乾燥する工程を含む、ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するナノバブルの微細化方法。
［１０］
凍結乾燥が、真空凍結乾燥である、［９］記載の微細化方法。
［１１］
ペプチドまたはタンパク質が、アルブミン、免疫グロブリンＧ、およびリゾチームからなる群から選択される、［９］または［１０］記載の微細化方法。
［１２］
ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有する乾燥状態のナノバブル、またはそれを含む組成物。
［１３］
［１２］記載の組成物であって、ここで、当該組成物に含まれるマイクロバブルの残存率が１％以下であり、且つ、当該ナノバブルの平均粒子径が１～１０００ｎｍ未満である、組成物。
［１４］
ペプチドまたはタンパク質が、アルブミン、免疫グロブリンＧ、およびリゾチームからなる群から選択される、［１２］または［１３］記載のナノバブルまたは組成物。
ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するマイクロバブルとナノバブルとの混合物を凍結乾燥する工程を含む、ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有する乾燥状態のナノバブルの製造方法。
［２］
ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するマイクロバブルとナノバブルとの混合物を、浮力を利用した分離工程に供さないことを特徴とする、［１］記載の製造方法。
［３］
凍結乾燥が、真空凍結乾燥である、［１］または［２］記載の製造方法。
［４］
ペプチドまたはタンパク質が、アルブミン、免疫グロブリンＧ、およびリゾチームからなる群から選択される、［１］～［３］のいずれか記載の製造方法。
［５］
ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するマイクロバブルとナノバブルとの混合物を凍結乾燥する工程を含む、ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するマイクロバブルとナノバブルとの混合物からマイクロバブルを除去する方法。
［６］
ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するマイクロバブルとナノバブルとの混合物を、浮力を利用した分離工程に供さないことを特徴とする、［５］記載の方法。
［７］
凍結乾燥が、真空凍結乾燥である、［５］または［６］記載の方法。
［８］
ペプチドまたはタンパク質が、アルブミン、免疫グロブリンＧ、およびリゾチームからなる群から選択される、［５］～［７］のいずれか記載の方法。
［９］
ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するナノバブルを凍結乾燥する工程を含む、ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するナノバブルの微細化方法。
［１０］
凍結乾燥が、真空凍結乾燥である、［９］記載の微細化方法。
［１１］
ペプチドまたはタンパク質が、アルブミン、免疫グロブリンＧ、およびリゾチームからなる群から選択される、［９］または［１０］記載の微細化方法。
［１２］
ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有する乾燥状態のナノバブル、またはそれを含む組成物。
［１３］
［１２］記載の組成物であって、ここで、当該組成物に含まれるマイクロバブルの残存率が１％以下であり、且つ、当該ナノバブルの平均粒子径が１～１０００ｎｍ未満である、組成物。
［１４］
ペプチドまたはタンパク質が、アルブミン、免疫グロブリンＧ、およびリゾチームからなる群から選択される、［１２］または［１３］記載のナノバブルまたは組成物。
【発明の効果】
【0017】
アルブミン殻を有するナノバブルの凍結乾燥製剤はこれまでに存在していなかったが、本発明によりこれを調製することができる。また、アルブミン殻を有するマイクロバブルとナノバブルの混合物からナノバブルの混合物を分離するにはこれまで両者の浮力の差を用いることが一般的であったが、浮力の差による分離では、マイクロバブルとナノバブルの混合物からナノバブルのみを高純度に分離することは非常に困難であり、結果として、夾雑物としてマイクロバブルを実質的に伴わない高純度のアルブミン殻ナノバブル組成物を調製することは容易ではなかった。しかし、本発明によれば、静置や遠心分離などのマイクロバブルの浮力を利用した分離を行うことなく、凍結乾燥のみによって、高純度のアルブミン殻を有するナノバブルを極めて容易に調製することができる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】図１は、９６ウェルプレートにおけるナノバブルに対するソニケーション処理方法またはソノポレーション方法の略図である。（Ａ）ナノバブルに対するソニケーション処理方法。ナノバブルに対する超音波照射。（Ｂ－Ｆ）ソノポレーション方法。（Ｂ）ＨＳＣ－２細胞を播種した９６マルチウェルプレートのウェルからインキュベーション培地を除去。（Ｃ）ナノバブルを含有する溶液をウェルに充填。（Ｄ）超音波照射による遺伝子トランスフェクション。（Ｅ－１）ソニケーションされた培地の吸引。（Ｅ－２）新しいインキュベーション培地を添加。（Ｆ）２４時間のインキュベーション後、レポーターアッセイ用の上清を回収。（Ｇ）９６ウェルプレート上の、細胞が播種されたウェルの配置（色付きで示される）および超音波照射エリア（破線の円の内側）。
【図4】図４は、バブリングを伴う、またはバブリングを伴わないアルブミン溶液の凍結乾燥物のＳＥＭイメージを示す図である。バブリングを伴う凍結乾燥物の低倍率（Ａ：×１，０００）、高倍率（Ｂ：×１０，０００）および超高倍率（Ｃ：×３０，０００）。バブリングを伴わない凍結乾燥物の低倍率（Ｄ：×１，０００）、高倍率（Ｅ：×１０，０００）および超高倍率（Ｆ：×３０，０００）。
【図5】図５は、凍結乾燥前後での溶液中のバブルの特性における変化を示す図である。（Ａ）ＦＣＭ測定における、バブル濃度およびバブル分布の比較。（Ｂ）ＮＴＡ計測における、バブル濃度および粒子サイズの比較。（Ｃ）ＲＭＭ測定における、バブル濃度およびバブル浮遊質量の比較。ＬＰｈ（－）：凍結乾燥前の溶液、ＬＰｈ（＋）：凍結乾燥後の溶液。
【図6】図６は、ソニケーションによる凍結乾燥後の溶液中のバブルの特性の変化を示す図である。（Ａ）ＦＣＭ測定における、バブル濃度およびサイズ分布の比較。（Ｂ）ＮＴＡ計測における、バブル濃度および粒子サイズの比較。（Ｃ）ＲＭＭ測定における、バブル濃度およびバブル浮遊質量の比較。
【図7】図７は、凍結乾燥物から再生されたナノバブルを伴う、または伴わない溶液によるフローファントム管におけるエコー輝度変化の検出を示す図である。（Ａ）Ｂモードのみ。（Ｂ）Ｃｏｄｅｄ Ｈａｒｍｏｎｉｃ Ａｎｇｉｏを伴うＢモード。（Ｃ）Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎを伴うＢモード。ＮＢｓ（－）：ナノバブル伴わない溶液、ＮＢｓ（＋）ナノバブルを伴う溶液。
【発明を実施するための形態】
【0019】
以下、本発明を詳細に説明する。尚、本明細書において「マイクロバブル」とは、直径１～１００μｍ未満の気泡を意味するものとし、また、「ナノバブル」とは、直径１μｍ未満の気泡を意味するものとする。なお、本明細書においてマイクロバブルは「ＭＢ」或いは「ＭＢｓ」と、ナノバブルは「ＮＢ」或いは「ＮＢｓ」と称することがある。
【0020】
１．ナノバブルの製造方法
本発明は、ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するマイクロバブルとナノバブルとの混合物を凍結乾燥する工程を含む、ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するナノバブルの製造方法（以下、「本発明の製造方法」と称することがある）を提供する。
本発明は、ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するマイクロバブルとナノバブルとの混合物を凍結乾燥する工程を含む、ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するナノバブルの製造方法（以下、「本発明の製造方法」と称することがある）を提供する。
【0021】
本発明の製造方法において用いられるマイクロバブルやナノバブルは、その殻がアミノ酸（好ましくは、天然アミノ酸）から構成されるペプチドまたはタンパク質である。
【0022】
本発明の製造方法において用いられるマイクロバブルやナノバブルの殻を構成するペプチドとしては、通常２～３６残基、好ましくは４～２４残基の直鎖又は分岐アミノ酸配列を有するペプチドが用いられ得る。
【0023】
一態様において、ペプチドは疎水性であり得、疎水性配列としては特にイソロイシンの連続配列が好ましい場合がある。また、ペプチドは一部に非天然アミノ酸や修飾が施されていても良い。
【0024】
また、別の一態様において、ペプチドは、Ｃ末端およびＮ末端のいずれか又は両方において、親水性のアミノ酸配列（２～８残基）を有していてもよい。或いは、別の一実態様において、ペプチドは、Ｃ末端およびＮ末端のいずれか又は両方において、疎水性のアミノ酸配列(２～８残基)を有していてもよい。好ましい一態様において、ペプチドは、一方の末端に親水性のアミノ酸配列（２～８残基）を有しており、且つ、他方の末端に疎水性のアミノ酸配列（２～８残基）を有していてもよい。本構造を有するペプチドは両親媒性となり、界面活性剤として機能して、気液界面に配置されると推測される。
【0025】
なお、理論に拘束されることを望むものではないが、疎水性の高いアミノ酸配列は、薬物や遺伝子の細胞内送達に際し、その効率を向上させることが知られている。従って、本発明の製造方法により調製したナノバブルをＤＤＳの目的に使用する場合は、ナノバブルの殻を構成するペプチドまたはタンパク質における疎水性アミノ酸の割合を高めることが望ましい場合がある。そのような疎水性の高いアミノ酸配列からなるナノバブルの調製は自体公知の方法を用いればよい。一例としては、フェニルアラニンやイソロイシンの連続配列を有するようにペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列を改変する方法が挙げられるが、これに限定されない。
【0026】
本発明の製造方法において用いられるマイクロバブルやナノバブルの外殻を構成するペプチドまたはタンパク質は、アミノ酸（好ましくは天然のアミノ酸）からなるペプチドまたはタンパク質であって、バブルの外殻を構成でき、且つ、本発明の所望の効果を奏するものである限り特に限定されないが、一例としては、アルブミン、免疫グロブリンＧおよびリゾチーム、またはこれらの断片であって、バブルの外殻を構成できるもの等が挙げられる。
【0027】
アルブミンは、任意の動物由来のアルブミンであってよく、好ましくは、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、またはオボアルブミンであり得る。尚、バブルの外殻を構成できる限り、アルブミンの断片であってもよい。
【0028】
免疫グロブリンＧ（以下、ＩｇＧと称することがある）は、任意の動物由来のＩｇＧであってよいが、好ましくは哺乳動物由来のＩｇＧであり、より好ましくはヒト由来のＩｇＧである。ＩｇＧは、ヒト化ＩｇＧであってもよい。また、ＩｇＧは、いずれのサブタイプのものであってもよい。具体的には、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のいずれであってもよい。
【0029】
リゾチームは、任意の動物由来のリゾチームであってよいが、好ましくはヒト由来のリゾチームであり得る。
【0030】
本発明の製造方法における好ましい一態様において、マイクロバブルやナノバブルは、アルブミンからなる殻を有するマイクロバブルまたはナノバブルであり得る。より好ましくは、マイクロバブルまたはナノバブルは、ヒト血清アルブミンからなる殻を有するマイクロバブルまたはナノバブルであり得る。
【0031】
上述した通り、本発明の製造方法において用いられるマイクロバブルやナノバブルは、その殻がアミノ酸（好ましくは、天然アミノ酸）から構成されるペプチドまたはタンパク質であるが、換言すれば、本発明の製造方法において用いられるマイクロバブルやナノバブルは、その外殻として、アミノ酸からなるペプチドまたはタンパク質以外の成分を実質的に含まない。
【0032】
かかるアミノ酸からなるペプチドまたはタンパク質以外の成分としては、例えば、脂質（特に、リン脂質）、界面活性剤、およびＰＬＧＡ(乳酸・グリコール酸共重合体)などが挙げられ、本発明の製造方法において用いられるマイクロバブルやナノバブルでは、これらの成分を外殻として含まない。
【0033】
なお、脂質としては、例えば、以下の脂質またはその誘導体が例示される：
（１）ホスファチジルエタノールアミン（例、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジアラキドイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＡＰＥ）、ジリノレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）等）；
（２）ホスファチジルコリン（例、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジアラキドイルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）等）；
（３）ホスファチジルセリン（例、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジアラキドイルホスファチジルセリン（ＤＡＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）、ジオレイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）等）；
（４）ホスファチジン酸（例、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、ジアラキドイルホスファチジン酸（ＤＡＰＡ）等）；
（５）ホスファチジルグリセロール（例、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジオレイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）等）；
（６）ホスファチジルイノシトール（例、ジラウロイルホスファチジルイノシトール（ＤＬＰＩ）、ジアラキドイルホスファチジルイノシトール（ＤＡＰＩ）、ジミリストイルホスファチジルイノシトール（ＤＭＰＩ）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（ＤＰＰＩ）、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（ＤＳＰＩ）、ジオレイルホスファチジルイノシトール（ＤＯＰＩ）等）。
（１）ホスファチジルエタノールアミン（例、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジアラキドイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＡＰＥ）、ジリノレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）等）；
（２）ホスファチジルコリン（例、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジアラキドイルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）等）；
（３）ホスファチジルセリン（例、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジアラキドイルホスファチジルセリン（ＤＡＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）、ジオレイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）等）；
（４）ホスファチジン酸（例、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、ジアラキドイルホスファチジン酸（ＤＡＰＡ）等）；
（５）ホスファチジルグリセロール（例、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジオレイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）等）；
（６）ホスファチジルイノシトール（例、ジラウロイルホスファチジルイノシトール（ＤＬＰＩ）、ジアラキドイルホスファチジルイノシトール（ＤＡＰＩ）、ジミリストイルホスファチジルイノシトール（ＤＭＰＩ）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（ＤＰＰＩ）、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（ＤＳＰＩ）、ジオレイルホスファチジルイノシトール（ＤＯＰＩ）等）。
【0034】
また、界面活性剤としては、例えば、以下の界面活性剤またはその誘導体が例示される：
（１）アニオン性界面活性剤（例、ラウリル硫酸ナトリウム等）；
（２）非イオン性界面活性剤（例、グリセリン脂肪酸エステル（例、モノステアリン酸グリセリン等）、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル（例、モノステアリン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン等）、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン（硬化）ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例、ポリオキシエチレンソルビタンラウリン酸エステル（例、ポリソルベート２０等）、ポリオキシエチレンソルビタンオレイン酸エステル（例、ポリソルベート８０等）等）、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（例、ポリオキシエチレンラウリルエーテル等）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル（例、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（例、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等）、マクロゴール類、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（例、ポロクサマー４０７、ポロクサマー２３５、ポロクサマー１８８、ポロキサミン等）等）；
（３）カチオン性界面活性剤（例、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化デカリニウム等）；
（４）両性界面活性剤（例、コカミドプロピルベタイン、コカミドプロピルヒドロキシスルタイン等）。
（１）アニオン性界面活性剤（例、ラウリル硫酸ナトリウム等）；
（２）非イオン性界面活性剤（例、グリセリン脂肪酸エステル（例、モノステアリン酸グリセリン等）、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル（例、モノステアリン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン等）、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン（硬化）ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例、ポリオキシエチレンソルビタンラウリン酸エステル（例、ポリソルベート２０等）、ポリオキシエチレンソルビタンオレイン酸エステル（例、ポリソルベート８０等）等）、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（例、ポリオキシエチレンラウリルエーテル等）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル（例、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（例、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等）、マクロゴール類、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（例、ポロクサマー４０７、ポロクサマー２３５、ポロクサマー１８８、ポロキサミン等）等）；
（３）カチオン性界面活性剤（例、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化デカリニウム等）；
（４）両性界面活性剤（例、コカミドプロピルベタイン、コカミドプロピルヒドロキシスルタイン等）。
【0035】
本発明の製造方法におけるマイクロバブルやナノバブルに封入される気体としては、バブルの製造に使用することが可能である任意の気体を用いることができる。例えば、気体として、パーフルオロ炭化水素（例、パーフルオロプロパン（Ｃ３Ｆ８）、パーフルオロブタン等）、空気、窒素、オゾン、酸素、アルゴン、二酸化炭素、プロパン（Ｃ３Ｈ８）、一酸化炭素（ＣＯ）、およびヘリウム等から選ばれる１種または２種以上の混合物等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、パーフルオロ炭化水素（例、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン等）、空気、窒素、オゾン、酸素、アルゴンが挙げられる。より好ましくは、パーフルオロ炭化水素（例、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン等）、空気等である。気体として空気を用いる場合、安価、かつ、容易にナノバブルを製造することができる。さらに好ましくは、気体はパーフルオロプロパンまたはパーフルオロブタンである。
【0036】
凍結乾燥前のマイクロバブルとナノバブルとを含む混合物は通常液状である。換言すれば、凍結乾燥前のマイクロバブルとナノバブルは通常液体に含有された状態で存在する。本発明の製造方法において、マイクロバブルとナノバブルを含有するかかる液体は特に限定されないが、例えば、水道水、脱イオン水、蒸留水、滅菌蒸留水、注射用精製水または超純水等であり得る。また、液体にはマイクロバブルおよびナノバブル以外の他の成分が含まれていてもよい。
【0037】
マイクロバブルとナノバブルとの混合物を製造する方法は自体公知である。一般的な手法としては、気体を高速旋回（或いは高速振動）で破砕してマイクロバブルとナノバブルの混合物を発生させる方法（高速旋回液流式）や、気体を加圧して過飽和で溶解させた液を急速減圧してマイクロバブルとナノバブルを析出させる方法（加圧溶解式）などが例示される。また、マイクロバブルやナノバブルを発生させる装置は多数市販されており、これらを用いてもよい。市販される装置の例としては、オーラテック社製ＯＭ４－ＭＤ５－０４５、ニクニ社製マイクロバブルジェネレータ、バイ・クリーン社製ＹＪ、アクアエアー社製マイクロバブル発生装置、ローヤル電機社製マイクロブレードなどが挙げられるがこれらに限定されない。一例として以下にヒト血清アルブミン殻を有するマイクロバブルとナノバブルとの混合物を高速振動により調製する方法を具体的に説明するが、アルブミン殻を有するマイクロバブルとナノバブルとの混合物の製造方法はこれに限定されるものではない。
【0038】
（１）パーフルオロプロパンガス（Ｃ３Ｆ８）を空のガラスバイアルに注入し、ゴム栓等を用いて密封する。
（２）注射針等を用いて、ゴム栓を通じて、追加のパーフルオロプロパンガスとヒト血清アルブミン水溶液を充填する。
（３）バイアルを高速振動させる。
（４）振動後、バイアルを遠心し、氷上で冷却する。
（５）振動、遠心、冷却を複数回繰り返し、バブルを発生させる。
（２）注射針等を用いて、ゴム栓を通じて、追加のパーフルオロプロパンガスとヒト血清アルブミン水溶液を充填する。
（３）バイアルを高速振動させる。
（４）振動後、バイアルを遠心し、氷上で冷却する。
（５）振動、遠心、冷却を複数回繰り返し、バブルを発生させる。
【0039】
尚、上述の（２）において用いられるヒト血清アルブミン水溶液におけるヒト血清アルブミンの濃度の下限は、通常０．００１％以上であり、好ましくは０．００５％以上、０．０１％以上、０．０２％以上、０．０３％以上、または０．０４％以上であり、より好ましくは０．０５％以上である。また、ヒト血清アルブミンの濃度の上限は、通常０．９％以下、好ましくは０．８５％以下、０．８％以下、０．７５％以下、０．７％以下、または０．６５％以下であり、より好ましくは０．６％以下である。溶液のヒト血清アルブミンの濃度が１％以上である場合、当該溶液の粘度が高まり、高速振動によってナノバブルを発生させることが難しくなる場合がある。一態様において、ヒト血清アルブミン溶液におけるヒト血清アルブミンの濃度は、０．００１～０．９％であり、好ましくは０．００５～０．８５％、０．０１～０．８％、０．０２～０．７５％、０．０３～０．７％、または０．０４～０．６５％であり、より好ましくは０．０５～０．６％である。
【0040】
マイクロバブルとナノバブルの混合物からナノバブルを分離するために、従前はマイクロバブルとナノバブルの浮力に関する特性の違いが利用されていた。マイクロバブルは浮力を有する一方で、ナノバブルは浮力を有さないので、マイクロバブルとナノバブルを含む液を静置したり、遠心分離したりすることで、マイクロバブルは浮上させ、ナノバブルは液中に残留させることにより、両者を分離することができる。しかし、かかるマイクロバブルの浮力を利用する従前の方法では、ナノバブル分画にマイクロバブルが残存してしまい、高純度のナノバブルを調製することが大きな課題であった。
【0041】
本発明の製造方法においては、マイクロバブルとナノバブルの混合物（或いは、混合液）を凍結乾燥することを特徴とする。マイクロバブルとナノバブルの混合物を凍結乾燥することで、実質的にすべてのマイクロバブルを崩壊させつつ、ナノバブルは維持させることができる。
【0042】
マイクロバブルとナノバブルとの混合物の凍結乾燥は自体公知の方法を用いて行えばよい。一般的には、例えば、液体窒素などを用いて混合物を冷凍し、次いでこれを真空乾燥することにより、混合物を凍結乾燥することができる。混合物の冷凍に用いられる温度および時間は特に限定されず、マイクロバブルとナノバブルの混合物が十分に冷凍される温度および時間であればいかなるものであってもよい。また、冷凍物の乾燥に用いられる圧力および時間などもまた特に限定されず、冷凍されたマイクロバブルとナノバブルの混合物を十分に乾燥させ得る圧力および時間であればいかなるものであってもよい。本発明の好ましい一態様において、マイクロバブルとナノバブルとの混合物の凍結乾燥は、真空凍結乾燥であり得る。真空凍結乾燥もまた、自体公知の方法を用いればよい。
【0043】
上述した通り、本発明の製造方法においては、マイクロバブルとナノバブルの混合物からナノバブルを分離させる工程において、マイクロバブルとナノバブルの浮力における特性の違いを利用しないことを特徴とする。従って、本発明の製造方法の一態様において、本発明の製造方法は、マイクロバブルとナノバブルとの混合物を遠心分離に供する工程を含まないことを特徴とする。
【0044】
本発明の製造方法により製造されるナノバブルは、夾雑物としてのマイクロバブルを実質的に含まないことを特徴とする。換言すれば、本発明の製造方法によりナノバブルを製造した場合の夾雑物としてのマイクロバブルの残存率を次式：
【0045】
マイクロバブルの残存率（％）＝（凍結乾燥後のマイクロバブル濃度/凍結乾燥前のマイクロバブル濃度)×１００
【0046】
で定義するとき、マイクロバブルの残存率は、通常１％以下、好ましくは０．８％以下、０．６％以下、または０．４％以下、より好ましくは０．３％以下、特に好ましくは０．１％以下であり得る。一態様において、マイクロバブルの残存率は、通常０～１％であり、好ましくは０～０．８％、０～０．６％、０～０．４％または０～０．３％であり、特に好ましくは０～０．１％であり得る。
【0047】
尚、かかるマイクロバブルの残存率の低減は、換言すれば、マイクロバブルの除去と捉えることもできる。この観点において、マイクロバブルの除去率は次式で定義することができる。
【0048】
マイクロバブルの除去率（％）=１００－（マイクロバブルの残存率）
【0049】
マイクロバブルの除去率は、通常９９％以上、好ましくは９９．２％以上、９９．４％以上、または９９．６％以上、より好ましくは９９．７％以上、特に好ましくは９９．９％以上であり得る。一態様において、マイクロバブルの除去率は、通常９９～１００％であり、好ましくは９９．２～１００％、９９．４～１００％、９９．６～１００％または９９．７～１００％であり、特に好ましくは９９．９～１００％であり得る。
【0050】
また、本発明の製造方法により製造されるナノバブルの中空径は、通常１ｎｍ以上、好ましくは１０ｎｍ以上、２０ｎｍ以上、３０ｎｍ以上、４０ｎｍ以上、または５０ｎｍ以上、より好ましくは６０ｎｍ以上、７０ｎｍ以上、８０ｎｍ以上、９０ｎｍ以上、または９５ｎｍ以上、特に好ましくは１００ｎｍ以上であり得る。また、ナノバブルの中空径の上限は、通常１０００ｎｍ未満、好ましくは９００ｎｍ以下、８００ｎｍ以下、７００ｎｍ以下、６００ｎｍ以下、または５００ｎｍ以下、より好ましくは４００ｎｍ以下、３５０ｎｍ以下、３３０ｎｍ以下、３２０ｎｍ以下、または３１０ｎｍ以下、特に好ましくは３００ｎｍ以下であり得る。一態様において、本発明の製造方法により製造されるナノバブルの中空径は、通常１～１０００ｎｍ未満、好ましくは１０～９００ｎｍ以下、２０～８００ｎｍ以下、３０～７００ｎｍ以下、４０～６００ｎｍ以下、５０～５００ｎｍ以下、より好ましくは６０～４００ｎｍ以下、７０～３５０ｎｍ以下、８０～３３０ｎｍ以下、９０～３２０ｎｍ以下、９５～３１０ｎｍ以下、特に好ましくは１００～３００ｎｍ以下であり得るがこれらに限定されない。
【0051】
また、一態様において、本発明の製造方法により製造されるナノバブルは、その中空径とマイクロバブルの残存率が次の条件を満たし得る：
［１］
中空径：１～１０００ｎｍ未満、且つ、
残存率：０～１％、０～０．８％、０～０．６％、０～０．４％、０～０．３％、０～０．１％、または０％
［２］
中空径：１０～９００ｎｍ以下、且つ、
残存率：０～１％、０～０．８％、０～０．６％、０～０．４％、０～０．３％、０～０．１％、または０％
［３］
中空径：２０～８００ｎｍ以下、且つ、
残存率：０～１％、０～０．８％、０～０．６％、０～０．４％、０～０．３％、０～０．１％、または０％
［４］
中空径：３０～７００ｎｍ以下、且つ、
残存率：０～１％、０～０．８％、０～０．６％、０～０．４％、０～０．３％、０～０．１％、または０％
［５］
中空径：４０～６００ｎｍ以下、且つ、
残存率：０～１％、０～０．８％、０～０．６％、０～０．４％、０～０．３％、０～０．１％、または０％
［６］
中空径：５０～５００ｎｍ以下、且つ、
残存率：０～１％、０～０．８％、０～０．６％、０～０．４％、０～０．３％、０～０．１％、または０％
［７］
中空径：６０～４００ｎｍ以下、且つ、
残存率：０～１％、０～０．８％、０～０．６％、０～０．４％、０～０．３％、０～０．１％、または０％
［８］
中空径：７０～３５０ｎｍ以下、且つ、
残存率：０～１％、０～０．８％、０～０．６％、０～０．４％、０～０．３％、０～０．１％、または０％
［９］
中空径：８０～３３０ｎｍ以下、且つ、
残存率：０～１％、０～０．８％、０～０．６％、０～０．４％、０～０．３％、０～０．１％、または０％
［１０］
中空径：９０～３２０ｎｍ以下、且つ、
残存率：０～１％、０～０．８％、０～０．６％、０～０．４％、０～０．３％、０～０．１％、または０％
［１１］
中空径：９５～３１０ｎｍ以下、且つ、
残存率：０～１％、０～０．８％、０～０．６％、０～０．４％、０～０．３％、０～０．１％、または０％
［１２］
中空径：１００～３００ｎｍ以下、且つ、
残存率：０～１％、０～０．８％、０～０．６％、０～０．４％、０～０．３％、０～０．１％、または０％
［１］
中空径：１～１０００ｎｍ未満、且つ、
残存率：０～１％、０～０．８％、０～０．６％、０～０．４％、０～０．３％、０～０．１％、または０％
［２］
中空径：１０～９００ｎｍ以下、且つ、
残存率：０～１％、０～０．８％、０～０．６％、０～０．４％、０～０．３％、０～０．１％、または０％
［３］
中空径：２０～８００ｎｍ以下、且つ、
残存率：０～１％、０～０．８％、０～０．６％、０～０．４％、０～０．３％、０～０．１％、または０％
［４］
中空径：３０～７００ｎｍ以下、且つ、
残存率：０～１％、０～０．８％、０～０．６％、０～０．４％、０～０．３％、０～０．１％、または０％
［５］
中空径：４０～６００ｎｍ以下、且つ、
残存率：０～１％、０～０．８％、０～０．６％、０～０．４％、０～０．３％、０～０．１％、または０％
［６］
中空径：５０～５００ｎｍ以下、且つ、
残存率：０～１％、０～０．８％、０～０．６％、０～０．４％、０～０．３％、０～０．１％、または０％
［７］
中空径：６０～４００ｎｍ以下、且つ、
残存率：０～１％、０～０．８％、０～０．６％、０～０．４％、０～０．３％、０～０．１％、または０％
［８］
中空径：７０～３５０ｎｍ以下、且つ、
残存率：０～１％、０～０．８％、０～０．６％、０～０．４％、０～０．３％、０～０．１％、または０％
［９］
中空径：８０～３３０ｎｍ以下、且つ、
残存率：０～１％、０～０．８％、０～０．６％、０～０．４％、０～０．３％、０～０．１％、または０％
［１０］
中空径：９０～３２０ｎｍ以下、且つ、
残存率：０～１％、０～０．８％、０～０．６％、０～０．４％、０～０．３％、０～０．１％、または０％
［１１］
中空径：９５～３１０ｎｍ以下、且つ、
残存率：０～１％、０～０．８％、０～０．６％、０～０．４％、０～０．３％、０～０．１％、または０％
［１２］
中空径：１００～３００ｎｍ以下、且つ、
残存率：０～１％、０～０．８％、０～０．６％、０～０．４％、０～０．３％、０～０．１％、または０％
【0052】
本発明により製造されるナノバブルは凍結乾燥状態で長期保存することができる。従前、アミノ酸から構成されるペプチドまたはタンパク質からなる外殻を有するナノバブル（例、アルブミン殻を有するナノバブル等）は、凍結乾燥が難しいと考えられており、それ故、年単位で保存が可能な製品は開発されていなかった。しかし、本発明によりアミノ酸から構成されるペプチドまたはタンパク質からなる外殻を有するナノバブルをマイクロバブルの夾雑を抑えた状態、且つ、長期保存可能な状態で調製することが可能となった。
【0053】
尚、本発明により製造されたナノバブルは、凍結乾燥した状態から蒸留水等で復水することで容易に再生することができる。以下の実施例で実証する通り、凍結乾燥後に再生させたナノバブルは凍結乾燥前のナノバブルと同様の機能を維持している。
【0054】
さらに、凍結乾燥に調製したナノバブルの再生時に、ナノバブルを溶解させる液体（例、蒸留水）の量を適宜調節することで、所望のナノバブル濃度を有するナノバブル溶液を製造することもできる。従前、マイクロバブルを夾雑物として実質的に含まない高濃度のナノバブル溶液を製造するためには比較的長時間および高コストを要したが、本発明によれば、実質的には凍結乾燥工程を行うことにより簡便に高濃度のナノバブル溶液を製造できるようになる。この側面に着目すれば、本発明は、「ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するマイクロバブルとナノバブルとの混合物を凍結乾燥する工程と、凍結乾燥で得られたナノバブルを再生用の溶液に浸漬させることを含む、ナノバブル水の濃度調製方法」をも提供する。
【0055】
加えて、本発明における、ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するマイクロバブルとナノバブルとの混合物を凍結乾燥することによりマイクロバブルのみを崩壊させナノバブルの純度を高めるとの側面に着目すれば、本発明は、「ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するマイクロバブルとナノバブルとの混合物からマイクロバブルを除去する方法（以下、「本発明の除去方法」とも称することがある）」と言い換えることができる。
【0056】
尚、本発明の除去方法におけるマイクロバブルの除去率は、本発明の製造方法において説明したものと同様である。
【0057】
或いは、マイクロバブルとナノバブルとの混合物を凍結乾燥に供すると、マイクロバブルが崩壊するとともに、比較的サイズの大きいナノバブルについても一部崩壊し、その結果、本発明の製造方法により製造されたナノバブルの平均粒子径（ナノバブルの中空径の平均）は、凍結乾燥前のナノバブルの平均粒子径よりも減少する。本発明におけるこの側面に着目すれば、本発明は、「ナノバブルの微細化方法（以下、「本発明の微細化方法」と称することがある）」と解釈することもできる。
【0058】
本発明の微細化方法において、ナノバブルの平均粒子径は、通常１ｎｍ以上、好ましくは１０ｎｍ以上、２０ｎｍ以上、３０ｎｍ以上、４０ｎｍ以上、５０ｎｍ以上、６０ｎｍ以上、７０ｎｍ以上、８０ｎｍ以上、９０ｎｍ以上、１００ｎｍ以上、１１０ｎｍ以上、１２０ｎｍ以上、１３０ｎｍ以上、１４０ｎｍ以上、１５０ｎｍ以上、１６０ｎｍ以上、１７０ｎｍ以上、１８０ｎｍ以上、１９０ｎｍ以上、２００ｎｍ以上、２１０ｎｍ以上、２２０ｎｍ以上、２３０ｎｍ以上、２４０ｎｍ以上、２５０ｎｍ以上、２６０ｎｍ以上、２７０ｎｍ以上、２８０ｎｍ以上、２９０ｎｍ以上、３００ｎｍ以上、３１０ｎｍ以上、３２０ｎｍ以上、３３０ｎｍ以上、３４０ｎｍ以上、３５０ｎｍ以上、３６０ｎｍ以上、３７０ｎｍ以上、３８０ｎｍ以上、３９０ｎｍ以上、４００ｎｍ以上、４１０ｎｍ以上、４２０ｎｍ以上、４３０ｎｍ以上、４４０ｎｍ以上、４５０ｎｍ以上、４６０ｎｍ以上、４７０ｎｍ以上、４８０ｎｍ以上、４９０ｎｍ以上、５００ｎｍ以上、５１０ｎｍ以上、５２０ｎｍ以上、５３０ｎｍ以上、５４０ｎｍ以上、５５０ｎｍ以上、５６０ｎｍ以上、５７０ｎｍ以上、５８０ｎｍ以上、５９０ｎｍ以上、６００ｎｍ以上、６１０ｎｍ以上、６２０ｎｍ以上、６３０ｎｍ以上、６４０ｎｍ以上、６５０ｎｍ以上、６６０ｎｍ以上、６７０ｎｍ以上、６８０ｎｍ以上、６９０ｎｍ以上、７００ｎｍ以上、７１０ｎｍ以上、７２０ｎｍ以上、７３０ｎｍ以上、７４０ｎｍ以上、７５０ｎｍ以上、７６０ｎｍ以上、７７０ｎｍ以上、７８０ｎｍ以上、７９０ｎｍ以上、８００ｎｍ以上、８１０ｎｍ以上、８２０ｎｍ以上、８３０ｎｍ以上、８４０ｎｍ以上、８５０ｎｍ以上、８６０ｎｍ以上、８７０ｎｍ以上、８８０ｎｍ以上、８９０ｎｍ以上、又は９００ｎｍ以上であり得る。また、ナノバブルの平均粒子径の上限は、通常１０００ｎｍ未満、好ましくは９９０ｎｍ以下、９８０ｎｍ以下、９７０ｎｍ以下、９６０ｎｍ以下、９５０ｎｍ以下、９４０ｎｍ以下、９３０ｎｍ以下、９２０ｎｍ以下、９１０ｎｍ以下、９００ｎｍ以下、８９０ｎｍ以下、８８０ｎｍ以下、８７０ｎｍ以下、８６０ｎｍ以下、８５０ｎｍ以下、８４０ｎｍ以下、８３０ｎｍ以下、８２０ｎｍ以下、８１０ｎｍ以下、８００ｎｍ以下、７９０ｎｍ以下、７８０ｎｍ以下、７７０ｎｍ以下、７６０ｎｍ以下、７５０ｎｍ以下、７４０ｎｍ以下、７３０ｎｍ以下、７２０ｎｍ以下、７１０ｎｍ以下、７００ｎｍ以下、６９０ｎｍ以下、６８０ｎｍ以下、６７０ｎｍ以下、６６０ｎｍ以下、６５０ｎｍ以下、６４０ｎｍ以下、６３０ｎｍ以下、６２０ｎｍ以下、６１０ｎｍ以下、６００ｎｍ以下、５９０ｎｍ以下、５８０ｎｍ以下、５７０ｎｍ以下、５６０ｎｍ以下、５５０ｎｍ以下、５４０ｎｍ以下、５３０ｎｍ以下、５２０ｎｍ以下、５１０ｎｍ以下、５００ｎｍ以下、４９０ｎｍ以下、４８０ｎｍ以下、４７０ｎｍ以下、４６０ｎｍ以下、４５０ｎｍ以下、４４０ｎｍ以下、４３０ｎｍ以下、４２０ｎｍ以下、４１０ｎｍ以下、４００ｎｍ以下、３９０ｎｍ以下、３８０ｎｍ以下、３７０ｎｍ以下、３６０ｎｍ以下、３５０ｎｍ以下、３４０ｎｍ以下、３３０ｎｍ以下、３２０ｎｍ以下、３１０ｎｍ以下、３００ｎｍ以下、２９０ｎｍ以下、２８０ｎｍ以下、２７０ｎｍ以下、２６０ｎｍ以下、２５０ｎｍ以下、２４０ｎｍ以下、２３０ｎｍ以下、２２０ｎｍ以下、２１０ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１９０ｎｍ以下、１８０ｎｍ以下、１７０ｎｍ以下、１６０ｎｍ以下、１５０ｎｍ以下、１４０ｎｍ以下、１３０ｎｍ以下、１２０ｎｍ以下、１１０ｎｍ以下、又は１００ｎｍ以下であり得る。一態様において、本発明の微細化方法により得られるナノバブルの平均粒子径は、通常１～１０００ｎｍ未満、好ましくは１０～９００ｎｍ以下、１０～８００ｎｍ以下、１０～７００ｎｍ以下、１０～６００ｎｍ以下、１０～５００ｎｍ以下、より好ましくは１０～４００ｎｍ以下、１０～３５０ｎｍ以下、５０～３５０ｎｍ以下、１００～３５０ｎｍ以下、１５０～３５０ｎｍ以下、又は１５０～３００ｎｍ以下であり得るがこれらに限定されない。
【0059】
２．乾燥状態のナノバブルまたはそれを含む組成物
本発明はまた、ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有する乾燥状態のナノバブル、またはそれを含む組成物（以下、「本発明のナノバブル」または「本発明の組成物」と称することがある）を提供する。
本発明はまた、ペプチドまたはタンパク質からなる殻を有する乾燥状態のナノバブル、またはそれを含む組成物（以下、「本発明のナノバブル」または「本発明の組成物」と称することがある）を提供する。
【0060】
本発明のナノバブルは、本発明の製造方法により製造されたペプチドまたはタンパク質からなる殻を有するナノバブルそのもの（則ち、凍結乾燥状態のナノバブル）である。また、本発明の組成物は、当該本発明のナノバブルを適当な溶液に浸漬し、乾燥状態のナノバブルを再生させたものである。ナノバブルの純度や平均粒子径等の用語は、本発明の製造方法や本発明の微細化方法において説明したものと同様である。
【0061】
本発明の組成物は、本発明の所望の効果を奏する限り、本発明のナノバブル以外の他の成分を含んでいてもよい。
【0062】
本発明のナノバブルや本発明の組成物は、ＤＤＳにおける薬物機能の増強を目的として用いることができるだけでなく、その他の目的に用いてもよい。例えば、マイクロバブルやナノバブルを用いて微生物の増殖を抑制する手法が報告されており、医薬品や食品の製造分野において利用されるほか湖沼などの水質改善にも利用されているが、以下の実施例において実証する通り、本発明の組成物は、バイオフィルム形成抑制効果を有しているので、かかる用途に用いることもできる。
【0063】
以下の実施例において本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
【実施例0064】
［材料および方法］
【0065】
１．アルブミン殻を有するマイクロバブルとナノバブルの混合物の調製
アルブミン殻を有するマイクロバブルおよびナノバブルの混合物を次のように調製した。
５ｍＬのパーフルオロプロパンガス（Ｃ３Ｆ８、高千穂化学工業株式会社）を空のガラスバイアルに注入した。ゴム栓で閉じ、かつアルミニウムキャップでシールされたバイアルに、２３ゲージ針を用いてゴム栓を通じて、追加の１．５ｍＬパーフルオロプロパンガスおよび３．６ｍＬの０．０６％ヒト血清アルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎａｒ ２５、ＣＳＬベーリングＬＬＣ）蒸留水溶液を充填した。次いで、そのバイアルを高速振動型組織ホモジナイザー装置（Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、Ｂｅｒｔｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）中へ配置し、６０００ｒｐｍで８０秒間振動させた。振動後、バイアルを１００Ｇで２分間遠心し（ＭＸ－４０１、ＴＯＭＹ）、氷上で３分間冷却した。振動、遠心、および冷却を３回繰り返し、最後に振動フェイズを１回追加した。１８ゲージ針をバイアルのゴム栓に挿入し圧力を低下させた。振動および冷却によるヒト血清アルブミン水溶液の温度変化はデジタル温度計（ＴＸ１００３、横河計測株式会社）を用いて経時的に測定した。
アルブミン殻を有するマイクロバブルおよびナノバブルの混合物を次のように調製した。
５ｍＬのパーフルオロプロパンガス（Ｃ３Ｆ８、高千穂化学工業株式会社）を空のガラスバイアルに注入した。ゴム栓で閉じ、かつアルミニウムキャップでシールされたバイアルに、２３ゲージ針を用いてゴム栓を通じて、追加の１．５ｍＬパーフルオロプロパンガスおよび３．６ｍＬの０．０６％ヒト血清アルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎａｒ ２５、ＣＳＬベーリングＬＬＣ）蒸留水溶液を充填した。次いで、そのバイアルを高速振動型組織ホモジナイザー装置（Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、Ｂｅｒｔｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）中へ配置し、６０００ｒｐｍで８０秒間振動させた。振動後、バイアルを１００Ｇで２分間遠心し（ＭＸ－４０１、ＴＯＭＹ）、氷上で３分間冷却した。振動、遠心、および冷却を３回繰り返し、最後に振動フェイズを１回追加した。１８ゲージ針をバイアルのゴム栓に挿入し圧力を低下させた。振動および冷却によるヒト血清アルブミン水溶液の温度変化はデジタル温度計（ＴＸ１００３、横河計測株式会社）を用いて経時的に測定した。
【0066】
穴の開いたゴム栓を有するバイアル中にマイクロバブルおよびナノバブルを含む水溶液を液体窒素中に浸漬し急速凍結した。凍結物を凍結乾燥機（Ｆｒｅｅ Ｚｏｎｅ４．５、Ｌａｂｃｏｎｃｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で４８時間、２０Ｐａの真空圧、コレクター温度－５０℃で凍結乾燥した。
【0067】
凍結乾燥したナノバブルを含有するバイアルを再びゴム栓で閉じ、アルミニウムキャップでシールすることで吸湿を防ぎ、４℃で保存した。
【0068】
凍結乾燥しない場合（則ち、対照）は、バブルを含有する懸濁液はピペッティングにより均一に混合し２時間以内に４℃で保存し、測定に供した。
【0069】
２．走査型電子顕微鏡を用いたナノバブルの凍結乾燥物の形態学的観察
ナノバブルの凍結乾燥物と対照をピンセットで慎重に引きちぎり、断面を上向きにしてカーボンテープが貼られたアルミニウムスタブ上にマウントした。凍結乾燥物断片を、ＯＰＣ－８０オスミウムプラズマコーター（Ｎｉｐｐｏｎ Ｌａｓｅｒ ＆ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｌａｂ）オスミウム層でコートした。サンプルを走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（ＪＳＭ－７５００Ｆ、ＪＥＯＬ）を用いて５ｋＶで観察した。凍結乾燥物の領域はランダムに選択し、１０００×～３００００×のレンジの倍率で観察した。
ナノバブルの凍結乾燥物と対照をピンセットで慎重に引きちぎり、断面を上向きにしてカーボンテープが貼られたアルミニウムスタブ上にマウントした。凍結乾燥物断片を、ＯＰＣ－８０オスミウムプラズマコーター（Ｎｉｐｐｏｎ Ｌａｓｅｒ ＆ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｌａｂ）オスミウム層でコートした。サンプルを走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（ＪＳＭ－７５００Ｆ、ＪＥＯＬ）を用いて５ｋＶで観察した。凍結乾燥物の領域はランダムに選択し、１０００×～３００００×のレンジの倍率で観察した。
【0070】
３．再生されたナノバブルの物理的特性と残存の評価
ナノバブルを含有する凍結乾燥物を凍結乾燥前と同様に３．６ｍＬの蒸留水に溶解させた。ナノ粒子トラッキング解析、フローサイトメトリー解析、および共鳴質量測定を用いて当該サンプルを解析することで、ナノバブルの物理的特性を評価した。
ナノバブルを含有する凍結乾燥物を凍結乾燥前と同様に３．６ｍＬの蒸留水に溶解させた。ナノ粒子トラッキング解析、フローサイトメトリー解析、および共鳴質量測定を用いて当該サンプルを解析することで、ナノバブルの物理的特性を評価した。
【0071】
[ナノ粒子トラッキング解析]
ナノバブルの粒子サイズはナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）装置（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＬＭ１０、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により測定した。ナノ粒子懸濁液に６３８ｎｍの波長の赤色レーザーを照射した。ナノ粒子運動は、ＣＣＤカメラ（Ｃ１１４４０－５０Ｂ、浜松ホトニクス株式会社）光散乱とブラウン運動により可視化した。このシステムは、ブラウン運動下の平均移動距離の計算するために、ナノ粒子のセンターポジションを自動的に検出し二次元平面において各粒子運動を追跡する。ＮＴＡでの粒子運動のイメージは、室温で６０秒間記録した。ＮＴＡ法の粒子サイズ測定の範囲は１０ｎｍ～１０００ｎｍに調節した。粒子サイズはストークス‐アインシュタインの式に対する平均運動距離によって評価した。０．５ｍＬのナノバブル懸濁液を、１．０ｍＬ体積のプラスチックシリンジ（テルモ）でＮａｎｏＳｉｇｈｔシステムのサンプル測定チャンバーへインジェクトした。サンプルイメージキャプチャリングおよびデータ解析は測定アプリケーションソフトウェア（ＮＴＡ ３．２ Ｄｅｖ Ｂｕｉｌｄ３．２．１６）を用いて行った。すべてのサンプル測定は、各サンプルに対して独立に行った。粒子サイズは、３回の測定の平均の、平均および最頻値±標準誤差として示した。再溶解後のナノバブルサイズは凍結乾燥していない遠心分離サンプルと比較した。
ナノバブルの粒子サイズはナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）装置（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＬＭ１０、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により測定した。ナノ粒子懸濁液に６３８ｎｍの波長の赤色レーザーを照射した。ナノ粒子運動は、ＣＣＤカメラ（Ｃ１１４４０－５０Ｂ、浜松ホトニクス株式会社）光散乱とブラウン運動により可視化した。このシステムは、ブラウン運動下の平均移動距離の計算するために、ナノ粒子のセンターポジションを自動的に検出し二次元平面において各粒子運動を追跡する。ＮＴＡでの粒子運動のイメージは、室温で６０秒間記録した。ＮＴＡ法の粒子サイズ測定の範囲は１０ｎｍ～１０００ｎｍに調節した。粒子サイズはストークス‐アインシュタインの式に対する平均運動距離によって評価した。０．５ｍＬのナノバブル懸濁液を、１．０ｍＬ体積のプラスチックシリンジ（テルモ）でＮａｎｏＳｉｇｈｔシステムのサンプル測定チャンバーへインジェクトした。サンプルイメージキャプチャリングおよびデータ解析は測定アプリケーションソフトウェア（ＮＴＡ ３．２ Ｄｅｖ Ｂｕｉｌｄ３．２．１６）を用いて行った。すべてのサンプル測定は、各サンプルに対して独立に行った。粒子サイズは、３回の測定の平均の、平均および最頻値±標準誤差として示した。再溶解後のナノバブルサイズは凍結乾燥していない遠心分離サンプルと比較した。
【0072】
［フローサイトメトリー解析］
ナノバブルのサイズ比率および個数はフローサイトメーター（ＣｙｔｏＦＬＥＸ、ベックマン・コールター）を用いて測定した。フローサイトメーターはナノ粒子の検出のため４０５ｎｍ（ｖｉｏｌｅｔ）レーザーを備えており、ナノ粒子検出の増強を目的として、ｖｉｏｌｅｔレーザーから側方散乱（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＳＳ）を測定するようセットアップした（ｖｉｏｌｅｔ ＳＳ）。粒子検出に対するＶｉｏｌｅｔ ＳＳシグナル分解能限界は２００ｎｍであった。優れた分解能は前方散乱（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＦＳ）シグナルよりもＳＳで得ることができ、小型粒子（例えば、ナノスケール粒子）の測定に好適である。Ｖｉｏｌｅｔ－ＳＳ Ｖｉｏｌｅｔ側方散乱エリア（ＳＳ－Ａ）を粒子サイズと関連付けるために、既知のサイズのビーズでフローサイトメーターを較正した（Ｗｉｓｇｒｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ．２０１６ Ｊｕｌ；８９（７）：６６３－７２．；Ｚｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ．２０１６ Ｆｅｂ；８９（２）：１６９－８３．）。フポリスチレンスタンダードビーズ（５００ｎｍ、ｑＮａｎｏ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅ、Ｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１０００ｎｍ、Ａｒｃｈｉｍｅｄｅｓ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ ｂｅａｄｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を超純水中に懸濁させ、フローサイトメーターで事前に測定した。得られたナノバブルのＶｉｏｌｅｔ ＳＳ－Ａシグナルを次いでＣｙｔＥｘｐｅｒｔソフトウェアｖｅｒｓｉｏｎ２．０（ベックマン・コールター株式会社）により解析した。実験前に、ナノバブルのサイズを決定するために５００～１０００ｎｍにおける各スタンダードビーズのサイズに基づきＶｉｏｌｅｔ ＳＳＣ－Ａ値のゲートを創出した。これらのデータを用いて、各サイズのシグナルバンドに存在するナノバブルの個数を測定した。ナノバブルの粒子の個数は測定前に１０倍希釈し、ストック懸濁液の濃度を遡及的に逆算した。凍結乾燥していない遠心後の水溶液中のナノバブルの濃度に基づいて、総数および各サイズレンジのついて凍結乾燥－溶解後に残存する割合を計算した。希釈していない原液を直接測定し、１０００ｎｍのスタンダードビーズのＶｉｏｌｅｔ ＳＳＣ－Ａ値のゲートを超える範囲の粒子をマイクロバブルとしてカウントし、マイクロバブル濃度を算出した。マイクロバブル・ナノバブル混合溶液の作製直後および凍結乾燥－溶解後のマイクロバブル濃度から、その残存率と除去率を計算した。
ナノバブルのサイズ比率および個数はフローサイトメーター（ＣｙｔｏＦＬＥＸ、ベックマン・コールター）を用いて測定した。フローサイトメーターはナノ粒子の検出のため４０５ｎｍ（ｖｉｏｌｅｔ）レーザーを備えており、ナノ粒子検出の増強を目的として、ｖｉｏｌｅｔレーザーから側方散乱（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＳＳ）を測定するようセットアップした（ｖｉｏｌｅｔ ＳＳ）。粒子検出に対するＶｉｏｌｅｔ ＳＳシグナル分解能限界は２００ｎｍであった。優れた分解能は前方散乱（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＦＳ）シグナルよりもＳＳで得ることができ、小型粒子（例えば、ナノスケール粒子）の測定に好適である。Ｖｉｏｌｅｔ－ＳＳ Ｖｉｏｌｅｔ側方散乱エリア（ＳＳ－Ａ）を粒子サイズと関連付けるために、既知のサイズのビーズでフローサイトメーターを較正した（Ｗｉｓｇｒｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ．２０１６ Ｊｕｌ；８９（７）：６６３－７２．；Ｚｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ．２０１６ Ｆｅｂ；８９（２）：１６９－８３．）。フポリスチレンスタンダードビーズ（５００ｎｍ、ｑＮａｎｏ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅ、Ｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１０００ｎｍ、Ａｒｃｈｉｍｅｄｅｓ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ ｂｅａｄｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を超純水中に懸濁させ、フローサイトメーターで事前に測定した。得られたナノバブルのＶｉｏｌｅｔ ＳＳ－Ａシグナルを次いでＣｙｔＥｘｐｅｒｔソフトウェアｖｅｒｓｉｏｎ２．０（ベックマン・コールター株式会社）により解析した。実験前に、ナノバブルのサイズを決定するために５００～１０００ｎｍにおける各スタンダードビーズのサイズに基づきＶｉｏｌｅｔ ＳＳＣ－Ａ値のゲートを創出した。これらのデータを用いて、各サイズのシグナルバンドに存在するナノバブルの個数を測定した。ナノバブルの粒子の個数は測定前に１０倍希釈し、ストック懸濁液の濃度を遡及的に逆算した。凍結乾燥していない遠心後の水溶液中のナノバブルの濃度に基づいて、総数および各サイズレンジのついて凍結乾燥－溶解後に残存する割合を計算した。希釈していない原液を直接測定し、１０００ｎｍのスタンダードビーズのＶｉｏｌｅｔ ＳＳＣ－Ａ値のゲートを超える範囲の粒子をマイクロバブルとしてカウントし、マイクロバブル濃度を算出した。マイクロバブル・ナノバブル混合溶液の作製直後および凍結乾燥－溶解後のマイクロバブル濃度から、その残存率と除去率を計算した。
【0073】
［共鳴質量測定］
凍結乾燥－溶解後に存在するナノ粒子が実際に浮遊性バブルであることを確認するために、本発明者らの既報（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ.,Ｈｅｌｉｙｏｎ ２０１９，５，ｅ０１９０７．）に基づき、粒子質量を共鳴質量測定（ＲＭＭ）システム（Ａｒｃｈｉｍｅｄｅｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ）により測定した。ＲＭＭはサンプル溶液がカンチレバー内のマイクロ流体フローチャネルを通過するように用いられる。マイクロ流体フローチャネルを通過する粒子は、溶液と異なる密度の粒子の通過により引き起こされる質量変化に関連する、カンチレバーの共鳴周波数における瞬間的なシフトに依拠して検出した。周波数シフトの方向によれば、正浮力を有する粒子と負浮力を有する粒子を明確に区別できる（Ｐａｔｅｌ，Ａ．Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１２，８４，６８３３－６８４０．，Ｂｕｒｇ，Ｔ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２００７，４４６，１０６６－１０６９．）。本実施例においては、２×２ μｍ２の内部マイクロ流体フローチャネル次元を有するＡｒｃｈｉｍｅｄｅｓ Ｈｉ－Ｑ ｎａｎｏ ｓｅｎｓｏｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ）における共鳴装置を用いた。全ての測定に対して、コントロールサンプルであるＰＢＳ溶液において観察されたベースラインノイズに基づいて、方向の限定または０．０１Ｈｚのスレッシュホールドを手動で選択した。ナノバブル懸濁液をＨｉ－Ｑ ｎａｎｏｓｅｎｓｏｒに供給し、２０分間、室温で測定を継続した。浮遊質量（ｂｕｏｙａｎｔ ｍａｓｓ）は、Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｌａｂ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １．９．８１（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ）を用いることにより、一時的な共鳴周波数シフトから計算した。
凍結乾燥－溶解後に存在するナノ粒子が実際に浮遊性バブルであることを確認するために、本発明者らの既報（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ.,Ｈｅｌｉｙｏｎ ２０１９，５，ｅ０１９０７．）に基づき、粒子質量を共鳴質量測定（ＲＭＭ）システム（Ａｒｃｈｉｍｅｄｅｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ）により測定した。ＲＭＭはサンプル溶液がカンチレバー内のマイクロ流体フローチャネルを通過するように用いられる。マイクロ流体フローチャネルを通過する粒子は、溶液と異なる密度の粒子の通過により引き起こされる質量変化に関連する、カンチレバーの共鳴周波数における瞬間的なシフトに依拠して検出した。周波数シフトの方向によれば、正浮力を有する粒子と負浮力を有する粒子を明確に区別できる（Ｐａｔｅｌ，Ａ．Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１２，８４，６８３３－６８４０．，Ｂｕｒｇ，Ｔ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２００７，４４６，１０６６－１０６９．）。本実施例においては、２×２ μｍ２の内部マイクロ流体フローチャネル次元を有するＡｒｃｈｉｍｅｄｅｓ Ｈｉ－Ｑ ｎａｎｏ ｓｅｎｓｏｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ）における共鳴装置を用いた。全ての測定に対して、コントロールサンプルであるＰＢＳ溶液において観察されたベースラインノイズに基づいて、方向の限定または０．０１Ｈｚのスレッシュホールドを手動で選択した。ナノバブル懸濁液をＨｉ－Ｑ ｎａｎｏｓｅｎｓｏｒに供給し、２０分間、室温で測定を継続した。浮遊質量（ｂｕｏｙａｎｔ ｍａｓｓ）は、Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｌａｂ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １．９．８１（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ）を用いることにより、一時的な共鳴周波数シフトから計算した。
【0074】
４．再生されたナノバブルの超音波（ＵＳ）応答性
凍結乾燥し溶解後に存在するナノ粒子が実際にUS応答性バブルであることを確認するために、ナノ粒子のサイズ分布をソニケーションの前後で測定した。ソニケーションは本発明者らの既報（Ｋｉｄａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２０２２，１３．）に基づいた。簡潔には、ナノバブル懸濁液（１００μＬ）を、音響的に透過性のフィルムベースの９６穴マルチウェル細胞培養プレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ）内に配置した。カルチャープレートを音響透過ゲル（アクアソニック１００ゲル、Ｐａｒｋｅｒ ｌａｂ）を介してＵＳトランスデューサの表面上に固定した。トランスデューサ（直径１．６ｃｍ）、駆動周波数１ＭＨｚ、バースト率１００Ｈｚ、および５０％デューティレシオで、ソノポレーター（ＳＰ１００、Ｓｏｎｉｄｅｌ Ｌｉｍｉｔｅｄ）によりＵＳを照射した（図１Ａ）。ＵＳ照射の方法は、以下に記載される、培養細胞を含む９６穴マルチウェルプレートを用いたマイクロスケールインビトロソノポレーションシステムと同様である。ナノバブルの直径は、様々な強度（０、１、２、または５Ｗ／ｃｍ２）での３０秒間のソニケーション後に測定された。ＵＳ照射前後のナノバブル粒子の個数および分布の変化は、上述したナノ粒子トラッキング解析、フローサイトメトリー解析および共鳴質量測定を用いて測定した。
凍結乾燥し溶解後に存在するナノ粒子が実際にUS応答性バブルであることを確認するために、ナノ粒子のサイズ分布をソニケーションの前後で測定した。ソニケーションは本発明者らの既報（Ｋｉｄａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２０２２，１３．）に基づいた。簡潔には、ナノバブル懸濁液（１００μＬ）を、音響的に透過性のフィルムベースの９６穴マルチウェル細胞培養プレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ）内に配置した。カルチャープレートを音響透過ゲル（アクアソニック１００ゲル、Ｐａｒｋｅｒ ｌａｂ）を介してＵＳトランスデューサの表面上に固定した。トランスデューサ（直径１．６ｃｍ）、駆動周波数１ＭＨｚ、バースト率１００Ｈｚ、および５０％デューティレシオで、ソノポレーター（ＳＰ１００、Ｓｏｎｉｄｅｌ Ｌｉｍｉｔｅｄ）によりＵＳを照射した（図１Ａ）。ＵＳ照射の方法は、以下に記載される、培養細胞を含む９６穴マルチウェルプレートを用いたマイクロスケールインビトロソノポレーションシステムと同様である。ナノバブルの直径は、様々な強度（０、１、２、または５Ｗ／ｃｍ２）での３０秒間のソニケーション後に測定された。ＵＳ照射前後のナノバブル粒子の個数および分布の変化は、上述したナノ粒子トラッキング解析、フローサイトメトリー解析および共鳴質量測定を用いて測定した。
【0075】
５．再生されたナノバブルのインビトロ超音波イメージキャラクタリゼーション
ＵＳ造影剤としての再生されたナノバブルの機能を評価するために、ＵＳイメージングを行った。ＵＳゲルパッド（Ａｑｕａｆｌｅｘ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｇｅｌ ｐａｄ；Ｐａｒｋｅｒ ｌａｂ）で作られたフローファントム（７ｃｍ×８ｃｍ×１１ｃｍ）（図２）をＵＳ造影増強イメージング実験セットアップ用にカスタムメイドした。ナノバブル水溶液を流すための直径５ｍｍの２つの平行な流管を、ファントムの水平長軸方向における表面から１.５ｃｍの深さで２ｃｍ離して製造した。再生されたナノバブル溶液または対照を蒸留水で３倍希釈してシリンジに充填し、オートインジェクター（ＹＳＰ－２０１、テルモ）により、流管の穴に接続された内径３．１ｍｍの塩化ポリビニルチューブ（ＳＦ０ＥＴ２０２２Ｌ、テルモ）を通じて、２ｍＬ／ｍｉｎの流速で、同じ向きに流管に直接インジェクトした。再生されたナノバブルの音響評価は、広域スペクトル術中リニアアレイＬ８－１８ｉ－Ｄプローブ（４～１４ＭＨｚ）を有する診断用ＵＳイメージングシステム（ＬＯＧＩＱ Ｅ９、ＧＥヘルスケア）により行った。ＵＳプローブはフローファントムの上面に配置し固定した。ＵＳフローファントムのＵＳ Ｂモード画像は、Ｃｏｄｅｄ Ｈａｒｍｏｎｉｃ Ａｎｇｉｏ（ＣＨＡ、ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｉｎｄｅｘ ０．６）またはＡｍｐｌｉｔｕｄｅ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ（ＡＭ、ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｉｎｄｅｘ ０．２８）の造影モードを用いる場合と用いない場合で取得した。
ＵＳ造影剤としての再生されたナノバブルの機能を評価するために、ＵＳイメージングを行った。ＵＳゲルパッド（Ａｑｕａｆｌｅｘ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｇｅｌ ｐａｄ；Ｐａｒｋｅｒ ｌａｂ）で作られたフローファントム（７ｃｍ×８ｃｍ×１１ｃｍ）（図２）をＵＳ造影増強イメージング実験セットアップ用にカスタムメイドした。ナノバブル水溶液を流すための直径５ｍｍの２つの平行な流管を、ファントムの水平長軸方向における表面から１.５ｃｍの深さで２ｃｍ離して製造した。再生されたナノバブル溶液または対照を蒸留水で３倍希釈してシリンジに充填し、オートインジェクター（ＹＳＰ－２０１、テルモ）により、流管の穴に接続された内径３．１ｍｍの塩化ポリビニルチューブ（ＳＦ０ＥＴ２０２２Ｌ、テルモ）を通じて、２ｍＬ／ｍｉｎの流速で、同じ向きに流管に直接インジェクトした。再生されたナノバブルの音響評価は、広域スペクトル術中リニアアレイＬ８－１８ｉ－Ｄプローブ（４～１４ＭＨｚ）を有する診断用ＵＳイメージングシステム（ＬＯＧＩＱ Ｅ９、ＧＥヘルスケア）により行った。ＵＳプローブはフローファントムの上面に配置し固定した。ＵＳフローファントムのＵＳ Ｂモード画像は、Ｃｏｄｅｄ Ｈａｒｍｏｎｉｃ Ａｎｇｉｏ（ＣＨＡ、ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｉｎｄｅｘ ０．６）またはＡｍｐｌｉｔｕｄｅ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ（ＡＭ、ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｉｎｄｅｘ ０．２８）の造影モードを用いる場合と用いない場合で取得した。
【0076】
６．インビトロでのルシフェラーゼｍＲＮＡトランスフェクションおよび発現の評価
［ｍＲＮＡトランスフェクション］
再生されたナノバブルのＵＳ応答性によるｍＲＮＡの細胞内送達の効果を確認する目的で、本発明者らの既報（Ｋｉｄａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２０２２，１３．）に基づいて実験を行った。凍結乾燥させたナノバブル含有物を、凍結乾燥前の水溶液と等量のｏｐｔｉ－ＭＥＭに溶解した。Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするｍＲＮＡをナノバブルまたはコントロール溶液にそれぞれ終濃度１０μｇ／ｍＬ添加した。本実験のすべての工程の略図を図１に示す。音響透過性の底面を有する９６ウェルプレートの各口腔扁平上皮癌細胞（ＨＳＣ－２）培養培地を、５００ｎｇのｍＲＮＡを含有する再生されたナノバブル培地５０μＬに置き換えた（図１ＢおよびＣ）。ＵＳ（ＳＰ１００、Ｓｏｎｉｄｅｌ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を、ＨＳＣ－２細胞、ナノバブルおよび遺伝子を含む当該培地プレート底面に対して照射した（図１Ｄ）。ＵＳ照射処理後、ナノバブルを含有する溶液を除去した。次いで、１００μＬの培養培地を各培養ウェエルに再充填し、加湿された５％ＣＯ２雰囲気において、３７℃でインキュベートした（図１Ｅ）。２４時間後、ルシフェラーゼ発現アッセイおよび細胞生存アッセイを行った（図１ＦおよびＧ）。
［ｍＲＮＡトランスフェクション］
再生されたナノバブルのＵＳ応答性によるｍＲＮＡの細胞内送達の効果を確認する目的で、本発明者らの既報（Ｋｉｄａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２０２２，１３．）に基づいて実験を行った。凍結乾燥させたナノバブル含有物を、凍結乾燥前の水溶液と等量のｏｐｔｉ－ＭＥＭに溶解した。Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするｍＲＮＡをナノバブルまたはコントロール溶液にそれぞれ終濃度１０μｇ／ｍＬ添加した。本実験のすべての工程の略図を図１に示す。音響透過性の底面を有する９６ウェルプレートの各口腔扁平上皮癌細胞（ＨＳＣ－２）培養培地を、５００ｎｇのｍＲＮＡを含有する再生されたナノバブル培地５０μＬに置き換えた（図１ＢおよびＣ）。ＵＳ（ＳＰ１００、Ｓｏｎｉｄｅｌ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を、ＨＳＣ－２細胞、ナノバブルおよび遺伝子を含む当該培地プレート底面に対して照射した（図１Ｄ）。ＵＳ照射処理後、ナノバブルを含有する溶液を除去した。次いで、１００μＬの培養培地を各培養ウェエルに再充填し、加湿された５％ＣＯ２雰囲気において、３７℃でインキュベートした（図１Ｅ）。２４時間後、ルシフェラーゼ発現アッセイおよび細胞生存アッセイを行った（図１ＦおよびＧ）。
【0077】
［ルシフェラーゼ発現アッセイ］
インビトロのルシフェラーゼ活性は、Ｓｐａｒｋ（登録商標）マルチモードマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ）を用いて決定した。細胞ソニケーション後２４時間インキュベート後、１０μＬの培養上清を、Ｃｏｓｔａｒ ９６ ｗｅｌｌ ｗｈｉｔｅ ｓｏｌｉｄ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ)の各インキュベーションウェルから回収した。０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０／０．１ ｍＭ ＥＤＴＡ/ＰＢＳに溶解させた１００μＬ／１００μＬのセレンテラジン（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）溶液を各ウェルに添加した。添加後２～１２秒間の相対発光単位（ＲＬＵ）値をプロットし合計した。
インビトロのルシフェラーゼ活性は、Ｓｐａｒｋ（登録商標）マルチモードマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ）を用いて決定した。細胞ソニケーション後２４時間インキュベート後、１０μＬの培養上清を、Ｃｏｓｔａｒ ９６ ｗｅｌｌ ｗｈｉｔｅ ｓｏｌｉｄ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ)の各インキュベーションウェルから回収した。０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０／０．１ ｍＭ ＥＤＴＡ/ＰＢＳに溶解させた１００μＬ／１００μＬのセレンテラジン（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）溶液を各ウェルに添加した。添加後２～１２秒間の相対発光単位（ＲＬＵ）値をプロットし合計した。
【0078】
［細胞生存率アッセイ］
細胞毒性アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅ－ｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ））における生存している細胞数を決定するために、生存しているＨＳＣ－２細胞の数を３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－５－（３－ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－２－（４－ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）－２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＭＴＳ）を用いた比色法により測定した。一部の上清がルシフェラーゼアッセイのために取り除かれた各ウェルに対して２０μＬのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを加えた。２時間のインキュベーション後、９６ウェルプレートリーダーＭｕｌｔｉｓｋａｎ（商標） Ｇｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、吸光度を４９０ｎｍにて記録した。処理された細胞の生存率は、コントロールの非処理生存細胞の数に対する生存細胞数の比として計算した。
細胞毒性アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅ－ｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ））における生存している細胞数を決定するために、生存しているＨＳＣ－２細胞の数を３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－５－（３－ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－２－（４－ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）－２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＭＴＳ）を用いた比色法により測定した。一部の上清がルシフェラーゼアッセイのために取り除かれた各ウェルに対して２０μＬのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを加えた。２時間のインキュベーション後、９６ウェルプレートリーダーＭｕｌｔｉｓｋａｎ（商標） Ｇｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、吸光度を４９０ｎｍにて記録した。処理された細胞の生存率は、コントロールの非処理生存細胞の数に対する生存細胞数の比として計算した。
【0079】
７．統計解析
測定データは平均±平均の標準誤差（s.e.m）として表示した。データは、Ｗｅｌｃｈ’ｓ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎを伴う対応のないｔ検定を用いて解析した。複数のグループ間の統計学的に有意な差は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ２２１２、 Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を用いて解析した。ｐ値＜０．０５の確率値を統計学的有意とした。
測定データは平均±平均の標準誤差（s.e.m）として表示した。データは、Ｗｅｌｃｈ’ｓ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎを伴う対応のないｔ検定を用いて解析した。複数のグループ間の統計学的に有意な差は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ２２１２、 Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を用いて解析した。ｐ値＜０．０５の確率値を統計学的有意とした。
【0080】
[実施例１]ヒト血清アルブミンベースのナノバブルの殻は凍結乾燥において保持される。
最大２５℃、４バイブレーションサイクルでバブリングしたＨＳＡ溶液を急速凍結および真空乾燥した（図９）。得られた凍結乾燥物は、バブルの有無にかかわらず、肉眼的にはわたあめ様（ｃｏｔｔｏｎ－ｌｉｋｅ）であった（図３）。これらの構造物は柔らかく、ピンセットでつまむと容易に引きちぎれた。ピンセットでの硬さの目視検査や目視観察ではこれら２つは区別はできなかった。
最大２５℃、４バイブレーションサイクルでバブリングしたＨＳＡ溶液を急速凍結および真空乾燥した（図９）。得られた凍結乾燥物は、バブルの有無にかかわらず、肉眼的にはわたあめ様（ｃｏｔｔｏｎ－ｌｉｋｅ）であった（図３）。これらの構造物は柔らかく、ピンセットでつまむと容易に引きちぎれた。ピンセットでの硬さの目視検査や目視観察ではこれら２つは区別はできなかった。
【0081】
バブルを含む溶液から調製された凍結乾燥物の低倍率ＳＥＭ（×１,０００）において、直径１μｍを超える乾燥バブル殻が多数検出された。これらのマイクロバブルの大多数においては殻孔（shell pores）が観察された（図４Ａ）。高倍率ＳＥＭ（×１０,０００）ではナノバブルと思われる球体物が示されている（図４Ｂ）。ＨＳＡ－ナノバブルに交じって存在する、不規則で絡み合った形状のアルブミン凝集物からそれらを完全に区別するのは困難ではあるものの、超高倍率ＳＥＭ（×３０,０００）には、殻に孔を有する球体上のＨＳＡ－ナノバブルが確認された（図４Ｃ）。一方で、気泡しなかった溶液の凍結乾燥物の低～超高倍率ＳＥＭ（×１,０００～×３０,０００）での観察では、マイクロバブルやナノバブルと思われる構造は存在せず、不規則な形状のアルブミン凝集体のみが存在した（図４Ｄ～Ｆ）。
【0082】
［実施例２］ヒト血清アルブミン殻のバブルを含有する凍結乾燥物の溶解によってナノバブルは再生する。
ＨＳＡナノバブルを含有する凍結乾燥物を凍結乾燥前と等量の蒸留水に再溶解させた。凍結乾燥前後の粒子濃度および粒子分布をＦＣＭ１０倍希釈での測定値から逆算した（図５Ａ、表１）。真空凍結乾燥前の溶液中のＨＳＡナノバブルの濃度は１．２×１０９／ｍＬであった。比較して、再生されたナノバブル溶液におけるバブルの濃度は７．８×１０８／ｍＬであった。すなわち、ナノバブルの６４．５％が凍結乾燥操作によって保持されていたことが分かった。直径２００ｎｍ未満のナノバブルは、１０２．０％（３．０×１０８／ｍＬ ｔｏ ３．１×１０８／ｍＬ）保存されていた。直径２００～５００ｎｍのナノバブルおよび直径５００ｎｍを超えるナノバブルは、それぞれ、５７．３％（７．９×１０８／ｍＬ ｔｏ ４．５×１０８／ｍＬ）および１７．７％（１．２×１０８／ｍＬ ｔｏ ２．２×１０７／ｍＬ）保存されていた。ＮＴＡ計測において、ナノバブルの濃度は、凍結乾燥前の１３．８×１０９／ｍＬから、凍結乾燥後４．８×１０９／ｍＬ（３４．８％）に減少した（図５Ｂ）。平均ナノバブルサイズ（ａｖｅｒａｇｅ ｎａｎｏ－ｂｕｂｂｌｅ ｓｉｚｅ）は、真空凍結乾燥前は２６６．７±１７．１ｎｍであったが、真空凍結乾燥後は２２４．８±１３．８ｎｍに低下した。ＲＭＭ測定において、ナノバブルの濃度は凍結乾燥前１１．５×１０７／ｍＬから凍結乾燥後９．６×１０７／ｍＬ（８３．２％）に減少した（図５Ｃ）。真空凍結乾燥前に存在するナノバブルの１００．０％が正浮力を有しており、平均浮遊質量は－２．６ｆｇであった。一方で、真空凍結乾燥後に存在するナノバブルの９７．７％が正浮力を有しており、平均浮遊質量は－２．１ｆｇであった。
ＨＳＡナノバブルを含有する凍結乾燥物を凍結乾燥前と等量の蒸留水に再溶解させた。凍結乾燥前後の粒子濃度および粒子分布をＦＣＭ１０倍希釈での測定値から逆算した（図５Ａ、表１）。真空凍結乾燥前の溶液中のＨＳＡナノバブルの濃度は１．２×１０９／ｍＬであった。比較して、再生されたナノバブル溶液におけるバブルの濃度は７．８×１０８／ｍＬであった。すなわち、ナノバブルの６４．５％が凍結乾燥操作によって保持されていたことが分かった。直径２００ｎｍ未満のナノバブルは、１０２．０％（３．０×１０８／ｍＬ ｔｏ ３．１×１０８／ｍＬ）保存されていた。直径２００～５００ｎｍのナノバブルおよび直径５００ｎｍを超えるナノバブルは、それぞれ、５７．３％（７．９×１０８／ｍＬ ｔｏ ４．５×１０８／ｍＬ）および１７．７％（１．２×１０８／ｍＬ ｔｏ ２．２×１０７／ｍＬ）保存されていた。ＮＴＡ計測において、ナノバブルの濃度は、凍結乾燥前の１３．８×１０９／ｍＬから、凍結乾燥後４．８×１０９／ｍＬ（３４．８％）に減少した（図５Ｂ）。平均ナノバブルサイズ（ａｖｅｒａｇｅ ｎａｎｏ－ｂｕｂｂｌｅ ｓｉｚｅ）は、真空凍結乾燥前は２６６．７±１７．１ｎｍであったが、真空凍結乾燥後は２２４．８±１３．８ｎｍに低下した。ＲＭＭ測定において、ナノバブルの濃度は凍結乾燥前１１．５×１０７／ｍＬから凍結乾燥後９．６×１０７／ｍＬ（８３．２％）に減少した（図５Ｃ）。真空凍結乾燥前に存在するナノバブルの１００．０％が正浮力を有しており、平均浮遊質量は－２．６ｆｇであった。一方で、真空凍結乾燥後に存在するナノバブルの９７．７％が正浮力を有しており、平均浮遊質量は－２．１ｆｇであった。
【0083】
【表1】
【0084】
（表１：凍結乾燥によるナノバブル濃度の変化。括弧内の値は凍結乾燥前の濃度から維持された割合を示す。ＮＢｓ：ナノバブル。）
【0085】
［実施例３］凍結乾燥によってマイクロバブル・ナノバブル混合液から高効率にマイクロバブルを除去できる。
作製直後のマイクロバブル・ナノバブル混合液および、凍結乾燥物を等量の純水で再溶解した溶液に含まれるマイクロバブル濃度を、ＦＣＭ測定を用いて比較した。結果を図１０に示す。凍結乾燥前の溶液に含まれるマイクロバブルの濃度は１．４×１０７／ｍＬであった。凍結乾燥後に等量の純水で再溶解した溶液に含まれるマイクロバブルの濃度は５．６×１０４／ｍＬであった。凍結乾燥処置前後でのマイクロバブル残存率は０．４１％、除去率は９９．５９％であった。
作製直後のマイクロバブル・ナノバブル混合液および、凍結乾燥物を等量の純水で再溶解した溶液に含まれるマイクロバブル濃度を、ＦＣＭ測定を用いて比較した。結果を図１０に示す。凍結乾燥前の溶液に含まれるマイクロバブルの濃度は１．４×１０７／ｍＬであった。凍結乾燥後に等量の純水で再溶解した溶液に含まれるマイクロバブルの濃度は５．６×１０４／ｍＬであった。凍結乾燥処置前後でのマイクロバブル残存率は０．４１％、除去率は９９．５９％であった。
【0086】
[実施例４]凍結乾燥物から任意の濃度に濃縮あるいは希釈してナノバブルを再生可能である。
凍結乾燥物を、乾燥前の溶液量と等量および１／３量の純水で溶解し、再生したナノバブルの濃度を、ＦＣＭ測定を用いて比較した。結果を図１１に示す。当量の純水での溶解した場合のナノバブルの濃度は６．９ｘ１０８／ｍＬであった。それに対し、１／３量の純水での溶解した場合のナノバブルの濃度は１．２ｘ１０９／ｍＬであり、等量の純水で再溶解した場合の１．７倍の濃度に濃縮された。
凍結乾燥物を、乾燥前の溶液量と等量および１／３量の純水で溶解し、再生したナノバブルの濃度を、ＦＣＭ測定を用いて比較した。結果を図１１に示す。当量の純水での溶解した場合のナノバブルの濃度は６．９ｘ１０８／ｍＬであった。それに対し、１／３量の純水での溶解した場合のナノバブルの濃度は１．２ｘ１０９／ｍＬであり、等量の純水で再溶解した場合の１．７倍の濃度に濃縮された。
【0087】
[実施例５]凍結乾燥状態から再生したナノバブルはバイオフィルム形成抑制効果を有する。
凍結乾燥状態のナノバブルを再生して得られた濃縮ナノバブルおよび同濃度のアルブミン溶液を用いて、細菌によるバイオフィルムの形成抑制効果を調べた（ｎ＝６）。
凍結乾燥状態のナノバブルを再生して得られた濃縮ナノバブルおよび同濃度のアルブミン溶液を用いて、細菌によるバイオフィルムの形成抑制効果を調べた（ｎ＝６）。
【0088】
ナノバブルの凍結乾燥物を乾燥前の溶液量の１／３の液量のＭＨＢ培地に溶解し、ナノバブルを再生した。再生されたナノバブルを含むＭＨＢ培地に表皮ブドウ球菌：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを１．５×１０8 ＣＦＵ/ｍＬとなるように希釈し、１８０μＬ／ｗｅｌｌずつ、９６ｍｕｌｔｉ－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに添加し、Ｂｉｏｆｉｌｍ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ(同仁化学研究所)のピンプレートを装着した。３７℃で培養開始から２４時間の時点で、新鮮なナノバブルを含むＭＨＢ培地に交換し、さらに７２時間培養した。培養終了後に、０．１％ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｖｉｏｌｅｔ溶液を用いて、ピンプレート上に形成されたバイオフィルムを染色した。ピンプレートを、生理食塩水で洗浄後に、エタノールを満たした新しい９６ ｍｕｌｔｉ－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに浸して、Ｃｒｙｓｔａｌ Ｖｉｏｌｅｔを抽出した。Ｃｒｙｓｔａｌ Ｖｉｏｌｅｔが抽出されたエタノールの５９０ｎｍの吸光度を測定した。同濃度のアルブミンを含むＭＨＢ培地を用いて培養した条件の吸光度から計算されるバイオフィルム形成量を１００％とし、ナノバブルを含むＨＭＢ培地を用いて培養した条件におけるバイオフィルムの形成率を計算した。結果を図１２に示す。ナノバブルを含む培地を用いて細菌を培養した場合、バイオフィルムの形成率が２１．６％抑制された。
【0089】
［実施例６］凍結乾燥物から再生されたナノバブルは超音波照射により崩壊する。
凍結乾燥物から再生されたナノバブル溶液に超音波を照射した。１、２または５Ｗ／ｃｍ２でのＵＳ照射は、ＦＣＭ測定において、ナノバブルの濃度を６．３×１０８／ｍＬから、それぞれ、２．１×１０８／ｍＬ（３３．３％）、１．６×１０８／ｍＬ（２４．７％）または９．９×１０７／ｍＬ（１５．７％）に低下させた（図６Ａ、表２）。５Ｗ／ｃｍ２のＵＳ照射により、直径２００ｎｍ未満のナノバブルについては、２．０×１０８／ｍＬから７．１×１０７／ｍＬ（３４．７％）へ、直径２００～５００ｎｍのナノバブルについては、４．０×１０８／ｍＬから２．５×１０７／ｍＬ（６．２％）へ、直径５００ｎｍを超えるナノバブルについては、２．２×１０７／ｍＬから２．５×１０６／ｍＬ（１１．３％）へ、それぞれ、濃度が減少した。ＮＴＡ計測においては、１、２または５Ｗ／ｃｍ２でのＵＳ照射は、３５．３×１０８／ｍＬのナノバブルの濃度から、それぞれ、１８．１×１０８／ｍＬ（５１．３％）、７．１×１０８／ｍＬ（２０．０％）および５．２×１０８／ｍＬ（１４．８％）へ低下させた（図６Ｂ）。平均ナノバブルサイズは、２６６．１±６．７ｎｍから、それぞれ、１８９．３±１１．１ｎｍ、１９２．５±３．６ｎｍ、および１６６．８±２．２ｎｍに減少した。ＲＭＭ測定では、ナノバブルの濃度は、９５．７×１０６／ｍＬから、それぞれ、２６．０×１０６／ｍＬ（２７．２％）、４．４×１０６／ｍＬ（４．６％）および５．４９×１０６／ｍＬ（５．７％）へ減少した。ナノバブルの平均浮遊質量は、ソニケーション前で－２．１ｆｇであり、ソニケーション後は、それぞれ、－１．９ｆｇ、－０．３ｆｇおよび－１．２５であった。正浮力を有する粒子はソニケーション前は９７．７％であり、ソニケーション後は、それぞれ、９８．４％、７６．５％および１００．０％であった（図６Ｃ）。
凍結乾燥物から再生されたナノバブル溶液に超音波を照射した。１、２または５Ｗ／ｃｍ２でのＵＳ照射は、ＦＣＭ測定において、ナノバブルの濃度を６．３×１０８／ｍＬから、それぞれ、２．１×１０８／ｍＬ（３３．３％）、１．６×１０８／ｍＬ（２４．７％）または９．９×１０７／ｍＬ（１５．７％）に低下させた（図６Ａ、表２）。５Ｗ／ｃｍ２のＵＳ照射により、直径２００ｎｍ未満のナノバブルについては、２．０×１０８／ｍＬから７．１×１０７／ｍＬ（３４．７％）へ、直径２００～５００ｎｍのナノバブルについては、４．０×１０８／ｍＬから２．５×１０７／ｍＬ（６．２％）へ、直径５００ｎｍを超えるナノバブルについては、２．２×１０７／ｍＬから２．５×１０６／ｍＬ（１１．３％）へ、それぞれ、濃度が減少した。ＮＴＡ計測においては、１、２または５Ｗ／ｃｍ２でのＵＳ照射は、３５．３×１０８／ｍＬのナノバブルの濃度から、それぞれ、１８．１×１０８／ｍＬ（５１．３％）、７．１×１０８／ｍＬ（２０．０％）および５．２×１０８／ｍＬ（１４．８％）へ低下させた（図６Ｂ）。平均ナノバブルサイズは、２６６．１±６．７ｎｍから、それぞれ、１８９．３±１１．１ｎｍ、１９２．５±３．６ｎｍ、および１６６．８±２．２ｎｍに減少した。ＲＭＭ測定では、ナノバブルの濃度は、９５．７×１０６／ｍＬから、それぞれ、２６．０×１０６／ｍＬ（２７．２％）、４．４×１０６／ｍＬ（４．６％）および５．４９×１０６／ｍＬ（５．７％）へ減少した。ナノバブルの平均浮遊質量は、ソニケーション前で－２．１ｆｇであり、ソニケーション後は、それぞれ、－１．９ｆｇ、－０．３ｆｇおよび－１．２５であった。正浮力を有する粒子はソニケーション前は９７．７％であり、ソニケーション後は、それぞれ、９８．４％、７６．５％および１００．０％であった（図６Ｃ）。
【0090】
【表2】
【0091】
（表２：ソニケーションによる再生されたナノバブル濃度の変化。括弧内の値はソニケーション前の濃度から維持された割合を示す。ＮＢｓ：ナノバブル。）
【0092】
［実施例７］凍結乾燥物から再生されたナノバブルはエコー原性である。
凍結乾燥物から再生されたナノバブルを含む、または含まない希釈溶液をそれぞれフローファントムの管に還流させ、それらのエコー原性を観察した。Ｂモードイメージングのみの場合、ナノバブルを含むまたは含まない溶液のいずれも管内のエコー輝度の変化は検出できなかった（図７Ａ）。輝度の上昇は、ＣＨＡモードでのナノバブル含有溶液の還流においてのみ検出された（図７Ｂ）。一方で、ＡＭモードでは、ナノバブルを含むまたは含まない溶液のいずれにおいても管内の輝度の上昇は観察されなかった（図７Ｃ）。
凍結乾燥物から再生されたナノバブルを含む、または含まない希釈溶液をそれぞれフローファントムの管に還流させ、それらのエコー原性を観察した。Ｂモードイメージングのみの場合、ナノバブルを含むまたは含まない溶液のいずれも管内のエコー輝度の変化は検出できなかった（図７Ａ）。輝度の上昇は、ＣＨＡモードでのナノバブル含有溶液の還流においてのみ検出された（図７Ｂ）。一方で、ＡＭモードでは、ナノバブルを含むまたは含まない溶液のいずれにおいても管内の輝度の上昇は観察されなかった（図７Ｃ）。
【0093】
［実施例８］凍結乾燥物から再生されたナノバブルはｍＲＮＡソノポレーションにおいてキャビテーション核として働く。
インビトロソノポレーションにおいて、ナノバブルを伴う場合または伴わない場合のいずれでも、ｍＲＮＡトランスフェクション効率は、ＵＳとの音響強度における段階的な増加（１、２または５Ｗ／ｃｍ２）に応じて段階的に増加したが（図８Ａ）、ソニケーションによるｍＲＮＡトランスフェクション効率の増加は、ナノバブルを伴う条件においてより大きく増加した。ナノバブルを伴い且つ５Ｗ／ｃｍ２との最大音響強度でＵＳ照射を行う条件において、ＲＬＵ値は２．６±０．１（×１０７）に達した。この値は、ナノバブルを伴なわない溶液を用いて同じ強度でＵＳ照射するトランスフェクション条件の値と比較して７．５倍高かった（ｐ＝０．０００２）。５Ｗ／ｃｍ２でのＵＳ照射後の細胞生存率は、それぞれ、ナノバブルを伴う場合は８４．９％であり、ナノバブルを伴わない場合は９０．７％であった（ｐ＝０．６２５５）（図８Ｂ）。
インビトロソノポレーションにおいて、ナノバブルを伴う場合または伴わない場合のいずれでも、ｍＲＮＡトランスフェクション効率は、ＵＳとの音響強度における段階的な増加（１、２または５Ｗ／ｃｍ２）に応じて段階的に増加したが（図８Ａ）、ソニケーションによるｍＲＮＡトランスフェクション効率の増加は、ナノバブルを伴う条件においてより大きく増加した。ナノバブルを伴い且つ５Ｗ／ｃｍ２との最大音響強度でＵＳ照射を行う条件において、ＲＬＵ値は２．６±０．１（×１０７）に達した。この値は、ナノバブルを伴なわない溶液を用いて同じ強度でＵＳ照射するトランスフェクション条件の値と比較して７．５倍高かった（ｐ＝０．０００２）。５Ｗ／ｃｍ２でのＵＳ照射後の細胞生存率は、それぞれ、ナノバブルを伴う場合は８４．９％であり、ナノバブルを伴わない場合は９０．７％であった（ｐ＝０．６２５５）（図８Ｂ）。
【産業上の利用可能性】
【0094】
本発明によれば、アルブミン等の安全性の高い生体由来のタンパク質などからなる殻を有するナノバブルを高純度に調製することができる。ナノバブルは造影剤として使用でき、また、細胞へ遺伝子や薬剤を送達するために使用することができる。従って、本発明は、例えば、疾患の診断または治療にかかる技術分野において極めて有用である。或いは、本発明を用いて調製されたナノバブルは、バイオフィルム形成抑制効果を有することから、食品及び医薬品の製造における衛生管理や微生物による環境汚染の改善などにも適用可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
