特開 2024-137006 マイタケ由来のβ－グルカンの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024137006

(43)【公開日】2024-10-04

(54)【発明の名称】マイタケ由来のβ－グルカンの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C08B 37/00 20060101AFI20240927BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240927BHJP

   A61K 31/716 20060101ALI20240927BHJP

【ＦＩ】

C08B37/00 C

A61P37/04

A61P35/00

A61K31/716

【審査請求】未請求

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023048337

(22)【出願日】2023-03-24

(71)【出願人】

【識別番号】521471198

【氏名又は名称】株式会社将軍まいたけジャパン

(74)【代理人】

【識別番号】100091373

【弁理士】

【氏名又は名称】吉井 剛

(72)【発明者】

【氏名】大平 喜信

【テーマコード（参考）】

4C086

4C090

【Ｆターム（参考）】

4C086AA01

4C086AA04

4C086EA20

4C086NA14

4C086ZB09

4C086ZB26

4C090AA04

4C090BA21

4C090BB02

4C090BB12

4C090BB33

4C090BB52

4C090BC02

4C090CA09

4C090CA19

4C090DA23

(57)【要約】

【課題】本発明はマイタケ由来のβ－グルカンを高抽出率で得るものである。
【解決手段】マイタケの菌糸体または子実体を３５℃～６０℃の温度帯を除いて乾燥し得られた乾燥物を粉砕加水して加圧下８０℃以上の温度で抽出処理し、得られた抽出画分にアルコールを添加して析出する沈殿物を水に溶解し、さらにアルコールを添加して析出する沈殿物を乾燥させるマイタケ由来のβ－グルカンの製造方法。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

マイタケの菌糸体または子実体を３５℃～６０℃の温度帯を除いて乾燥し得られた乾燥物を粉砕加水して加圧下８０℃以上の温度で抽出処理し、得られた抽出画分にアルコールを添加して析出する沈殿物を水に溶解し、さらにアルコールを添加して析出する沈殿物を乾燥させることを特徴とするマイタケ由来のβ－グルカンの製造方法。

【請求項2】

マイタケの菌糸体または子実体を３５℃～６０℃の温度帯を除いて乾燥し得られた乾燥物を粉砕加水して加圧下８０℃以上の温度で抽出処理し、得られた抽出画分にアルコールを添加して放置することにより浮遊する物質を除去し、上清を除いて析出する沈殿物を水に溶解し、さらにアルコールを添加して析出する沈殿物を乾燥させることを特徴とするマイタケ由来のβ－グルカンの製造方法。

【請求項3】

マイタケの菌糸体または子実体を３５℃～６０℃の温度帯を除いて乾燥し、得られた乾燥物を粉砕し、水に懸濁して加圧下８０℃以上の温度で抽出処理し、得られた抽出画分にアルコールを２０％～７０％の最終容量濃度になるように添加して１℃～３５℃の温度で放置することにより浮遊する物質を除去し、上清を除いて析出する沈殿物を水に溶解し、さらにアルコールを７５％～８５％の最終容量濃度になるように添加し１℃～２５℃で放置して析出する沈殿物を乾燥させることを特徴とするマイタケ由来のβ－グルカンの製造方法。

【請求項4】

マイタケの菌糸体または子実体を３５℃～６０℃の温度帯を除いて乾燥し、得られた乾燥物を粉砕し、水に懸濁して１～２気圧下８０℃以上の温度で抽出処理し、得られた抽出画分にアルコールを２０％～７０％の最終容量濃度になるように添加して１℃～１０℃の温度で放置することにより浮遊する物質を除去し、上清を除いて析出する沈殿物を水に溶解し、さらにアルコールを７５％～８５％の最終容量濃度になるように添加し２５℃程度で放置して析出する沈殿物を乾燥させることを特徴とするマイタケ由来のβ－グルカンの製造方法。

【請求項5】

請求項１～４いずれか１項に記載のマイタケ由来のβ－グルカンの製造方法において、３５℃～６０℃の温度帯を除いたマイタケの菌糸体または子実体の乾燥は、真空凍結乾燥、３０℃以下の低温乾燥、８０℃以上の高温乾燥のいずれかであることを特徴とするマイタケ由来のβ－グルカンの製造方法。

【請求項6】

請求項１～４いずれか１項に記載のマイタケ由来のβ－グルカンの製造方法において、アルコールを添加して析出する沈殿物の乾燥は、凍結乾燥、０℃～１００℃の減圧乾燥、８０℃～２００℃の熱風乾燥のいずれかであることを特徴とするマイタケ由来のβ－グルカンの製造方法。

【請求項7】

請求項１～４いずれか１項に記載のマイタケ由来のβ－グルカンの製造方法において、β－グルカンの抽出率が１％（重量）～１.１％（重量）であることを特徴とするマイタケ由来のβ－グルカンの製造方法。

【請求項8】

請求項１～４いずれか１項に記載のマイタケ由来のβ－グルカンの製造方法において、マイタケ（Grifola frondosa）、白マイタケ（Grifola albicans Imaz.）、チョレイマイタケ（Dendropolyporus umbellatus）にいずれかを採用することを特徴とするマイタケ由来のβ－グルカンの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、マイタケの菌糸体または子実体から抽出した免疫賦活性および抗腫瘍活性を有するマイタケ由来のβ－グルカンの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

これまで免疫賦活性および抗腫瘍活性を有するマイタケ由来のβ－グルカン、詳細には、β－１,６グルカン、β－１,３グルカンが知れており（詳細には、β－１,３主鎖、β－１,６分岐および、β－１,６主鎖、β－１,３分岐のグルカンが報告されている。）、その製造方法として特許第２８５９８４３号が提案されている。

【0003】

また、他にβ－グルカンの抽出精製方法として以下が知られている。
The Chemical Structure of an Antitumor Polysaccharide in Fruit Bodies
of Grifola
frondosa(Maitake)Chem.Pharm.Bull.35(3)1162-1168(1987)

【0004】

ところで、マイタケには免疫を亢進させる高分子画分に、α－グルカンおよびβ－グルカンが存在する。

【0005】

高分子α－グルカンについては、抗インフルエンザ活性で評価して、その効果が認められている（マイタケα－グルカンのインフルエンザ治療効果：日本醸造協会誌 108(6),401-412,2013）。

【0006】

また、抗がん効果（薬理効果）は、「マウス腫瘍における抗腫瘍免疫応答の刺激による経口投与されたマイタケα－グルカンの抗腫瘍活性」（PLOS ONE Published:March 9,2017）に示されている。

【0007】

この高分子α－グルカンはマイタケに内在するアミラーゼ（内在酵素）によって分解され、主に二糖類であるマルトースに分解される。したがって、この高分子のα－グルカンは、マイタケの内在酵素による分解により、免疫活性は低下する。

【0008】

一方、高分子β－グルカンは従来から、強力な抗がん作用が知られている（「マイタケ由来のβ－グルカンによるマウスの宿主介在抗腫瘍活性の増強」（Potentiation of Host-Mediated Antitumor Activity in Mice by β-Glucan Obtained from Grifola frondosa(Maitake)）。なお、その他の論文はメモリアルスローン－ケタリングのホームページ、Maitakeの項のReferencesに詳しい（https://www.mskcc.org/cancer-care/integrative-medicine/herbs/maitake）。

【0009】

したがって、高分子β－グルカンが同様に内在酵素（β－グルカナーゼ）により分解されると、効果を示す高分子β－グルカンの量が減じてしまい、抽出物の免疫増強作用が弱くなる。

【0010】

ところで、高分子β－グルカンは水に溶解しにくく、電子顕微鏡下に観察すると粒状になっていることが確認されている。また、分子量の小さい水溶性β－グルカンは免疫亢進作用が認められない（「粒子状および可溶性酵母由来β－グルカンによる先天的および適応的抗腫瘍免疫応答を調節する異なる経路」（Differential pathways regulating innate and adaptive antitumor immune responses by particulate and soluble yeast-derived β-glucans）。

【0011】

したがって、大きな分子量のβ－グルカン（粒状）が内在酵素により分解されて低分子（水溶性）になると免疫亢進作用はなくなる。もちろん、全部分解されればグルコースとなり、全く免疫を亢進しないのは明白である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】特許第２８５９８４３号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

本発明者は、種々の実験により、上記特許第２８５９８４３号にかかる製造方法によれば、想定した免疫賦活性および抗腫瘍活性のないβ－グルカンが得られる場合があり、品質の安定性に欠けると言う問題点を確認した。

【0014】

これは、上記特許第２８５９８４３号にかかる製造方法は、マイタケが含有するβグルカン分解酵素β－１,６グルカナーゼ（以下、「β－１,６グルカン分解酵素」という。）の活性温度４５℃～５０℃、β－１,３グルカナーゼ（以下、「β－１,３グルカン分解酵素」という。）の活性温度４５℃での処理を含み、β－１,６グルカン分解酵素、β－１,３グルカン分解酵素の活性コントロールをしていないからである。

【0015】

すなわち、この活性温度を避けないと、これらの酵素活性により短時間で高分子物質であるβ－グルカンが低分子化してしまう。具体的には、「β－１,６グルカン分解酵素」、「β－１,３グルカン分解酵素」の活性温度を避けずに乾燥及び抽出を行った場合、高分子物質であるβ－グルカンがこれらの酸素活性により、減少または消失することを実験により確認した。

【0016】

本発明は上記問題点を解決したマイタケ由来のβ－グルカンの製造方法を提供するものである。

【課題を解決するための手段】

【0017】

添付図面を参照して本発明の要旨を説明する。

【0018】

マイタケの菌糸体または子実体を３５℃～６０℃の温度帯を除いて乾燥し得られた乾燥物を粉砕加水して加圧下８０℃以上の温度で抽出処理し、得られた抽出画分にアルコールを添加して析出する沈殿物を水に溶解し、さらにアルコールを添加して析出する沈殿物を乾燥させることを特徴とするマイタケ由来のβ－グルカンの製造方法に係るものである。

【0019】

また、マイタケの菌糸体または子実体を３５℃～６０℃の温度帯を除いて乾燥し得られた乾燥物を粉砕加水して加圧下８０℃以上の温度で抽出処理し、得られた抽出画分にアルコールを添加して放置することにより浮遊する物質を除去し、上清を除いて析出する沈殿物を水に溶解し、さらにアルコールを添加して析出する沈殿物を乾燥させることを特徴とするマイタケ由来のβ－グルカンの製造方法に係るものである。

【0020】

また、マイタケの菌糸体または子実体を３５℃～６０℃の温度帯を除いて乾燥し、得られた乾燥物を粉砕し、水に懸濁して加圧下８０℃以上の温度で抽出処理し、得られた抽出画分にアルコールを２０％～７０％の最終容量濃度になるように添加して１℃～３５℃の温度で放置することにより浮遊する物質を除去し、上清を除いて析出する沈殿物を水に溶解し、さらにアルコールを７５％～８５％の最終容量濃度になるように添加し１℃～２５℃で放置して析出する沈殿物を乾燥させることを特徴とするマイタケ由来のβ－グルカンの製造方法に係るものである。

【0021】

また、マイタケの菌糸体または子実体を３５℃～６０℃の温度帯を除いて乾燥し、得られた乾燥物を粉砕し、水に懸濁して１～２気圧下８０℃以上の温度で抽出処理し、得られた抽出画分にアルコールを２０％～７０％の最終容量濃度になるように添加して１℃～１０℃の温度で放置することにより浮遊する物質を除去し、上清を除いて析出する沈殿物を水に溶解し、さらにアルコールを７５％～８５％の最終容量濃度になるように添加し２５℃程度で放置して析出する沈殿物を乾燥させることを特徴とするマイタケ由来のβ－グルカンの製造方法に係るものである。

【0022】

また、請求項１～４いずれか１項に記載のマイタケ由来のβ－グルカンの製造方法において、３５℃～６０℃の温度帯を除いたマイタケの菌糸体または子実体の乾燥は、真空凍結乾燥、３０℃以下の低温乾燥、８０℃以上の高温乾燥のいずれかであることを特徴とするマイタケ由来のβ－グルカンの製造方法に係るものである。

【0023】

また、請求項１～４いずれか１項に記載のマイタケ由来のβ－グルカンの製造方法において、アルコールを添加して析出する沈殿物の乾燥は、凍結乾燥、０℃～１００℃の減圧乾燥、８０℃～２００℃の熱風乾燥のいずれかであることを特徴とするマイタケ由来のβ－グルカンの製造方法に係るものである。

【0024】

また、請求項１～４いずれか１項に記載のマイタケ由来のβ－グルカンの製造方法において、β－グルカンの抽出率が１％（重量）～１.１％（重量）であることを特徴とするマイタケ由来のβ－グルカンの製造方法に係るものである。

【0025】

また、請求項１～４いずれか１項に記載のマイタケ由来のβ－グルカンの製造方法において、マイタケ（Grifola frondosa）、白マイタケ（Grifola albicans Imaz.）、チョレイマイタケ（Dendropolyporus umbellatus）にいずれかを採用することを特徴とするマイタケ由来のβ－グルカンの製造方法に係るものである。

【発明の効果】

【0026】

本発明は上述のようにしたから、高い免疫賦活性および抗腫瘍活性を有するマイタケ由来のβ－グルカンを安定的に製造することができる方法となる。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】比較例の乾燥マイタケ粉末の水抽出画分に関するチャートである。

【図2】実施例１の乾燥マイタケ粉末の水抽出画分に関するチャートである。

【図3】実施例２の乾燥マイタケ粉末の水抽出画分に関するチャートである。

【図4】消失実験に係るチャートである。

【図5】消失実験に係るチャートである。

【図6】消失実験に係るチャートである。

【図7】消失実験に係るチャートである。

【図8】消失実験に係るチャートである。

【発明を実施するための形態】

【0028】

マイタケの菌糸体または子実体を３５℃～６０℃の温度帯を除いて乾燥し、得られた乾燥物を粉砕し、水に懸濁して１気圧～２気圧下１００℃以上の温度で抽出処理し、得られた抽出画分にアルコールを２０％～７０％の最終容量濃度になるように添加して１℃～１０℃の温度で放置することにより浮遊する物質を除去し、上清を除いて析出する沈殿物を水に溶解し、さらにアルコールを７５％～８５％の最終容量濃度になるように添加し２５℃程度で放置して析出する沈殿物を乾燥させてマイタケ由来のβ－グルカンを得る。

【0029】

使用するマイタケは、マイタケ（Grifola frondosa）、白マイタケ（Grifola albicans Imaz.）、チョレイマイタケ（Dendropolyporus umbellatus）いずれでも良い。

【0030】

生マイタケは呼吸しているため、発熱して劣化が進んでしま、また、経時的にタンパク質分解酵素が働くため、適期収穫と収穫後速やかに乾燥作業を進める事で有効成分が安定する。

【0031】

マイタケは９０％（重量）が水分である。したがって、乾燥させると１／１０の重量となるが、この乾燥処理の温度はβ－１,６グルカン分解酵素、β－１,３グルカン分解酵素の至適温度帯３５℃～６０℃を避けなければならない。

【0032】

以下はすべてβ－１,６グルカン分解酵素、β－１,３グルカン分解酵素の至適温度を避ける乾燥方法である。

【0033】

マイタケは真空凍結乾燥方法により、０℃以下の温度で乾燥させたものを使用すれば酵素活性は生じない。

【0034】

また、低温乾燥（乾燥室温度３０℃以下）でもよく、その場合、湿度１５％～５０％の空気を吹き込む。これにより気化熱でマイタケは室温２５℃位で乾燥するため、酵素活性は低い。

【0035】

また、高温乾燥させる場合は、前記至適温度を避け、８０℃低湿度空気（１５％～５０％）下、短時間（３～６時間程度）で乾燥させれば酵素の至適温度を避けることができる。

【0036】

β－１,６グルカン分解酵素の至適温度は４５℃～５０℃であるから、処理は、至適温度付近の温度帯３５℃～６０℃を避ける。また、β－１,３グルカン分解酵素の至適温度は４５℃であるから、処理は、４５℃付近を避ける。すなわち、３５℃以下または６０℃以上で処理する。高分子β－グルカン（１００万以上）が各分解酵素によって分解し、機能を有する高分子β－グルカンが減少または消失してしまうことを防ぐためである。したがって、上記β－グルカン分解酵素が働く至適温度帯３５℃～６０℃を避ける処理が必須となる。

【0037】

８０℃以上の温度で抽出処理する際の加圧は、１気圧～２気圧で行う。２気圧の場合、水は１２１℃まで上昇するため、高分子グルカン類の抽出率が上昇するとともに、熱に強い芽胞菌なども死滅させることができる。なお、１気圧の場合は１００℃以上の温度で抽出処理をする。１００℃未満では抽出率が低下するからである。

【0038】

具体的には、抽出は抽出槽内の水を８５℃以上まで加温してから上記マイタケ乾燥粉末を抽出槽（乾燥マイタケ重量の５倍から５０倍の湯）中に投入することで酵素活性は抑えられる。抽出時の湯量は、マイタケ粉末の抽出は、５倍から５０倍程度、望ましくは７倍から１５倍が良い。

【0039】

抽出槽内の温度は、β－１,６グルカン分解酵素、β－１,３グルカン分解酵素の至適温度帯とならないように８０℃を下回らないようにする。なお、８０℃以上で投入することにより、β－１,６グルカン分解酵素、β－１,３グルカン分解酵素は失活する。

【0040】

抽出液に加える２０％～７０％容量濃度のエタノールは、浮遊物（免疫抑制物質を含む。）を除去するため、および低分子物質（単糖、オリゴ糖やアミノ酸、オリゴタンパクなど）の除去のためである。この処理は１℃～３５℃で行うが、浮遊物が再び溶け込まないように１℃～１０℃程度が望ましい。

【0041】

また、２回目のエタノールの添加は、７５％～８５％の容量濃度においては、主に高分子α－グルカンや核酸系物質は溶解しているため、これらを除くために行う。この処理は１℃～２５℃程度で行う。

【0042】

高分子β－グルカンは沈殿するので、上清は遠心分離後に除き、沈殿物からβ－グルカンを得る。

【0043】

このようにして得たβ‐グルカンを乾燥する場合、２００℃以上の熱風を噴霧して乾燥させると焦げるため、β－グルカンが変質して機能が低下する。能率は落ちるが、凍結乾燥、減圧乾燥（０℃～１００℃程度）、あるいは８０℃～２００℃の熱風、望ましくは２００℃程度（具体的な機器はスプレードライヤー）で乾燥させれば、β－グルカンの機能は低下しない。

【0044】

比較例は、β－１,６グルカン分解酵素、β－１,３グルカン分解酵素の至適温度帯を避けない処理をした場合（図１参照）、実施例１、２はβ－１,６グルカン分解酵素、β－１,３グルカン分解酵素の至適温度帯を避けた処理をした場合である（図２、図３参照）。

【0045】

消失実験は、β－１,６グルカン分解酵素、β－１,３グルカン分解酵素の至適温度を避けないと１２時間以内でβ－グルカンが減少または消失することを確認する実験である（図４～図８参照）。

【0046】

上清ではβ－グルカンが溶解しているためＨＰＬＣで測定できるが、最終的に得た画分は水に不溶のためＨＰＬＣでは測定できない。なお、最終的に得た画分は核磁気共鳴スペクトル測定でβ－グルカンと同定している。

【0047】

＜比較例＞
β－１,６グルカン分解酵素、β－１,３グルカン分解酵素の至適温度帯３５℃～６０℃を避けずに得たマイタケ粉末を使用する。すなわち、生マイタケを室温から徐々に温度を上げ８５℃くらいにし、１日程度かけて乾燥させたマイタケ粉末からβ－グルカンを取得した。具体的には以下のとおり。

【0048】

（１）熱風乾燥マイタケ１６０ｇを室温の１.６Ｌの水に懸濁し、室温でオートクレー
ブに入れた後に昇温し、１２１℃、３０分間加熱抽出を行った。

【0049】

（２）懸濁液を遠心分離し（７,５００ｒｐｍ、１５分間）、上清を得た。この上清を
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析したところ、β－グルカンは保
持時間６分程度に出現するが、ピークは小さかった。即ち、分解されたことが分
かる（図１参照）。

【0050】

詳細は以下のとおり。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）島津製作所製
ＨＰＬＣ本体：ＳＣＬ－１０Ａ ｖｐ
カラムオーブン：ＣＴＯ－１０ＡＳ ｖｐ
ＵＶ：ＳＰＤ－２０Ａ
示唆屈折率検出器：ＲＩＤ－１０Ａ
ポンプ：ＬＣ－２０ＡＴ
デガッサー（溶媒に含まれる気体発生を防ぐ装置）：ＤＧＵ－２０Ａ３
ＨＰＬＣ分析条件：溶離液：０.１Ｍ ＮａＮ０３（０.０２％ ＮａＮ３）水溶
液
分析カラム：ＳＢ－８０６Ｍ ＨＱ（カラムオーブン温度：４０.０℃）
流速：１,０００ｍｌ／ｍｉｎ

【0051】

上記示唆屈折計検出器は紫外線検出器の様に物質の紫外線吸収波長によるピーク
の増減が変化することがなく、また、ピークの大きさが物質の量を示すものであ
る。

【0052】

（３）上記上清を８５０ｍｌまで濃縮し、同量のエタノールを撹拌しながら徐々に加え
、室温で静置した。

【0053】

（４）出現した浮遊物（フラクション）をデカンテーションで除き、５００ｍｌの遠沈
管２本に均等に分けて遠心分離し（１０,０００ｒｐｍ、２０分間）、沈殿物を
１８.３ｇ（湿重量）得た。

【0054】

（５）遠心後の上清はＨＰＬＣを測定した。

【0055】

（６）得られた上記沈殿物１８.３ｇを３６６ｍｌの水を加え、ホットスターラ（目盛
１２０℃）で溶解し、温度が室温に低下（約４０℃）した後に９２.５ｍｌ（最
終ＥｔＯＨ濃度２０％）の水を加え、室温撹拌後に遠心分離した（１０,０００
ｒｐｍ、２０分間）。

【0056】

（７）遠心分離し上清を除去し、１２.８３ｇ（湿重量）の沈殿物を得た。

【0057】

（８）上記（７）の沈殿物を１２１℃、１０分間加熱し、溶解ならびにエタノールを減
圧化に留去し、冷却後、凍結乾燥した（収量０.７７ｇ、抽出率０.４８％；β－
グルカン画分）。この画分は、核磁気共鳴スペクトルにより、β－グルカン画分
であることを確認した。

【0058】

＜実施例１＞
β－１,６グルカン分解酵素、β－１,３グルカン分解酵素の至適温度帯を避けるため、生マイタケを凍結乾燥した乾燥マイタケ粉末からβ－グルカンを取得した。具体的には以下のとおり。

【0059】

（１）８１.３ｇの凍結乾燥舞茸を撹拌下に８１３ｍｌの１００℃のお湯に投入する。

【0060】

（２）８０℃に予熱したオートクレーブで１２１℃、３０分抽出する。この抽出方法に
より、β－１,６グルカン分解酵素、β－１,３グルカン分解酵素の内在酵素は失
活する。

【0061】

（３）室温冷却後に７,５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。

【0062】

（４）上清をグラスフィルターペーパー（ＧＦＰ、φ６０ｍｍ）でろ過し、ＨＰＬＣで
測定したところ、β－グルカンは保持時間６分程度に出現するが、ピークの高さ
は比較例より高い（図２参照）。

【0063】

（５）上清を６５０ｍｌまで濃縮し、エタノールを９７５ｍｌ（最終エタノール濃度６
０％）加えて冷蔵庫（５℃）で、一晩静置したところ、浮遊物（フラクション）
は認められなかった。

【0064】

（６）得られた溶液（沈殿を含む）を１０,０００ｒｐｍで２０分間遠心し、２３.４ｇ
（湿重量）を得た。

【0065】

（７）上記（６）の沈殿を水４７０ｍｌ加えて溶解しようとしたが、溶解しにくく、裏
ごしをかけ（更に９０ｍｌの水を追加⇒全量５６０ｍｌ）、更に超音波（室温、
＞３０分間）処理を行い溶解した。

【0066】

（８）上記（７）の溶液に、撹拌下、エタノールを１４０ｍｌ（最終濃度エタノール：
２０％）加えて撹拌後、遠心分離（１０,０００ｒｐｍ、２０分間）し、沈殿８.
６８ｇ（湿重量）を得た。

【0067】

（９）上記（８）で得た８.６８ｇの沈殿（湿重量）を水に懸濁し、１２１℃、１０分
。更に超音波をかけたが溶解せず、８０℃－９０℃のホットスターラ上で撹拌し
たが溶けにくいので、更に２００ｍｌの湯を注加後に良く撹拌して熱時ろ過した
。

【0068】

（１０）５００ｍｌのナスフラスコに入れて重量５８.４６ｇまで濃縮し、凍結乾燥後
に８.８８０ｍｇ（抽出率１.０８％）の画分を得た。この画分は核磁気共鳴スペ
クトルによりβ－グルカン画分であることを確認した。

【0069】

＜実施例２＞
β－１,６グルカン分解酵素、β－１,３グルカン分解酵素の至適温度帯を避けるため、生マイタケを２８℃～３０℃で７時間低温乾燥した乾燥マイタケを粉砕したマイタケ粉末からβ－グルカンを取得した。具体的には以下のとおり。

【0070】

（１）低温乾燥したマイタケ粉末１６０ｇを、沸騰水を５Ｌのポリプロピレン（ＰＰ）
ビーカー中にメカニカル撹拌下に分散するようにゆっくり加え塊の無いように良
く撹拌した。

【0071】

（２）予め９０℃に予熱したオートクレーブに５ＬのＰＰビーカーを入れ、１２１℃、
３０分間抽出した。

【0072】

（３）遠心管に均等に入れ（５００ｍｌ×４本）、室温で、７,０００ｒｐｍ、２０分
間遠心分離し、上清を得た。この上清をＨＰＬＣで測定したところ、β－グルカ
ンは保持時間６分程度のピークであり、ピークの高さは実施例１と略同等である
（図３参照）。

【0073】

（４）上記（３）で得られた上清１.２３Ｌに撹拌下エタノール１.２３Ｌを加え冷蔵庫
（５℃）に一晩静置したところ、浮遊物（フラクション）は出現せず、沈殿のみ
観察された。

【0074】

（５）得られた溶液（沈殿を含む）を室温で、７,０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離し
湿重量で３２.４ｇの沈殿を得た。

【0075】

（６）上記（５）の沈殿３０ｇを６００ｍｌの水に懸濁し、１２１℃で１０分間加熱後
、１００℃の湯浴で撹拌して溶解し室温に戻し、撹拌下にエタノールを加え（最
終エタノール濃度：２０％）、析出した沈殿を室温で、１０,０００ｒｐｍ、２
０分間遠心分離した。

【0076】

（７）上記（６）で得られた沈殿は、凍結乾燥し、１.６２ｇ（抽出率１.０１％）の画
分を得た。この画分は核磁気共鳴スペクトルによりβ－グルカンであることを確
認した。

【0077】

以上からβ－１,６グルカン分解酵素、β－１,３グルカン分解酵素の至適温度帯を避けた処理をすることで高い免疫賦活性および抗腫瘍活性を呈する高分子β－グルカンが高抽出率で得られた。具体的には、実施例１は１.０８％（重量）、実施例２は１.０１％（重量）である（比較例の抽出率は０.４８％（重量））。

【0078】

＜消失実験＞
凍結乾燥マイタケ粉末をβ－１,６グルカン分解酵素、β－１,３グルカン分解酵素の至適温度帯に属する５０℃で保温した時に、β－グルカンおよびα－グルカンが酵素分解されるか否かを時間経過に従って確認した。具体的には以下のとおり。

【0079】

凍結乾燥粉末５.０ｇを１００ｍｌの蒸留水に溶解し、温度を５０℃に設定して０分、０.５時間、１時間、６時間および１２時間の時点でサンプリングしてＨＰＬＣを測定した。前記のとおり、β－グルカンは６分程度のピークである（図４～図８参照）。

【0080】

以上から、凍結乾燥粉末を蒸留水に懸濁し５０℃で保温し、ＨＰＬＣで測定するとα‐グルカンは短時間で減少することがわかる。しかしながら、β－グルカンはα－グルカンがほとんど消失する６時間でもピークとして存在する。ただし、１２時間後のＨＰＬＣによる測定では明らかなピークとしてほとんど観測されない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】