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特開2024-137797物質をスクリーニングする方法、物質のスクリーニングシステム、幹細胞からクランプを製造する方法、及び分化細胞を製造する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024137797
(43)【公開日】2024-10-07
(54)【発明の名称】物質をスクリーニングする方法、物質のスクリーニングシステム、幹細胞からクランプを製造する方法、及び分化細胞を製造する方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20240927BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240927BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02
C12N5/10
【審査請求】未請求
【請求項の数】58
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024038478
(22)【出願日】2024-03-12
(31)【優先権主張番号】63/491,876
(32)【優先日】2023-03-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】515238909
【氏名又は名称】田邊 剛士
(71)【出願人】
【識別番号】517123221
【氏名又は名称】アイ ピース，インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】田邊 剛士
(72)【発明者】
【氏名】玉置 さくら
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA18
4B063QA20
4B063QQ20
4B063QR77
4B063QS40
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA01
4B065BB40
4B065BC09
4B065BD50
4B065CA44
4B065CA50
(57)【要約】
【課題】幹細胞を用いて物質をスクリーニングする方法を提供する。
【解決手段】本開示によれば、対象の体細胞から多能性幹細胞を誘導することと、多能性幹細胞から分化細胞を誘導することと、分化細胞に物質を添加して培養することと、物質に対する分化細胞の応答に基づいて、対象に物質を投与又は塗布するか否かを決定することと、を含む、物質をスクリーニングする方法が提供される。
【選択図】なし
【解決手段】本開示によれば、対象の体細胞から多能性幹細胞を誘導することと、多能性幹細胞から分化細胞を誘導することと、分化細胞に物質を添加して培養することと、物質に対する分化細胞の応答に基づいて、対象に物質を投与又は塗布するか否かを決定することと、を含む、物質をスクリーニングする方法が提供される。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象の体細胞から多能性幹細胞を誘導することと、
前記多能性幹細胞から分化細胞を誘導することと、
前記分化細胞に物質を添加して前記分化細胞を培養することと、
前記物質に対する前記分化細胞の応答に基づいて、前記対象に前記物質を投与又は塗布するか否かを決定することと、
を含む、物質をスクリーニングする方法。
前記多能性幹細胞から分化細胞を誘導することと、
前記分化細胞に物質を添加して前記分化細胞を培養することと、
前記物質に対する前記分化細胞の応答に基づいて、前記対象に前記物質を投与又は塗布するか否かを決定することと、
を含む、物質をスクリーニングする方法。
【請求項2】
前記体細胞を供給する前記対象と、前記物質を投与又は塗布される前記対象と、が、同一人である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記物質が、美容商品、化粧品、養毛剤、又は育毛剤の添加物である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記物質が、医薬品の添加物である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記物質がビタミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記物質が、アスコルビン酸及びレチノールの少なくともいずれかである、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記物質が防腐剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記分化細胞が皮膚細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記分化細胞の応答が、前記分化細胞による産生物の産生である、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記産生物が、コラーゲンである、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記分化細胞の応答が、前記分化細胞の生存率である、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
対象の体細胞から多能性幹細胞を誘導することと、
前記多能性幹細胞から分化細胞を誘導することと、
前記分化細胞に物質を添加して前記分化細胞を培養することと、
前記物質に対する前記分化細胞の応答に基づいて、前記対象に前記物質を投与又は塗布するか否かを決定することと、
投与又は塗布すると決定された前記物質を前記対象に投与又は塗布することと、
を含む、物質の投与又は塗布方法。
前記多能性幹細胞から分化細胞を誘導することと、
前記分化細胞に物質を添加して前記分化細胞を培養することと、
前記物質に対する前記分化細胞の応答に基づいて、前記対象に前記物質を投与又は塗布するか否かを決定することと、
投与又は塗布すると決定された前記物質を前記対象に投与又は塗布することと、
を含む、物質の投与又は塗布方法。
【請求項13】
前記体細胞を供給する前記対象と、前記物質を投与又は塗布される前記対象と、が、同一人である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記物質が、美容商品、化粧品、養毛剤、又は育毛剤の添加物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
前記物質が、医薬品の添加物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項16】
前記物質がビタミンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項17】
前記物質が、アスコルビン酸及びレチノールの少なくともいずれかである、請求項１２に記載の方法。
【請求項18】
前記物質が防腐剤である、請求項１２に記載の方法。
【請求項19】
前記分化細胞が皮膚細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項20】
前記分化細胞の応答が、前記分化細胞による産生物の産生である、請求項１２に記載の方法。
【請求項21】
前記産生物が、コラーゲンである、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記分化細胞の応答が、前記分化細胞の生存率である、請求項１２に記載の方法。
【請求項23】
対象の体細胞から誘導された多能性幹細胞から誘導された分化細胞に物質を添加して前記分化細胞を培養した際の前記分化細胞の応答のデータを取得するデータ取得部と、
前記分化細胞の応答のデータに基づいて、前記物質を評価する評価部と、
前記評価に基づいて、前記対象に前記物質を投与又は塗布するか否かを決定する決定部と、
を備える、物質のスクリーニングシステム。
前記分化細胞の応答のデータに基づいて、前記物質を評価する評価部と、
前記評価に基づいて、前記対象に前記物質を投与又は塗布するか否かを決定する決定部と、
を備える、物質のスクリーニングシステム。
【請求項24】
前記体細胞を供給する前記対象と、前記物質を投与又は塗布される前記対象と、が、同一人である、請求項２３に記載のシステム。
【請求項25】
前記物質が、美容商品、化粧品、養毛剤、又は育毛剤の添加物である、請求項２３に記載のシステム。
【請求項26】
前記物質が、医薬品の添加物である、請求項２３に記載のシステム。
【請求項27】
前記物質がビタミンである、請求項２３に記載のシステム。
【請求項28】
前記物質が、アスコルビン酸及びレチノールの少なくともいずれかである、請求項２３に記載のシステム。
【請求項29】
前記物質が防腐剤である、請求項２３に記載のシステム。
【請求項30】
前記分化細胞が皮膚細胞である、請求項２３に記載のシステム。
【請求項31】
前記分化細胞の応答が、前記分化細胞による産生物の産生である、請求項２３に記載のシステム。
【請求項32】
前記産生物が、コラーゲンである、請求項３１に記載のシステム。
【請求項33】
前記分化細胞の応答が、前記分化細胞の生存率である、請求項２３に記載のシステム。
【請求項34】
表面が低接着性である培養器に、幹細胞をシングルセルで播種することと、
前記培養器内の細胞外基質を含む培地中で前記幹細胞を三次元培養し、前記幹細胞からクランプを形成することと、
を含む、幹細胞からクランプを製造する方法。
前記培養器内の細胞外基質を含む培地中で前記幹細胞を三次元培養し、前記幹細胞からクランプを形成することと、
を含む、幹細胞からクランプを製造する方法。
【請求項35】
前記幹細胞がｉＰＳ細胞である、請求項３４に記載の幹細胞からクランプを製造する方法。
【請求項36】
前記細胞外基質がラミニンを含む、請求項３４に記載の幹細胞からクランプを製造する方法。
【請求項37】
前記培養器の前記表面が低接着性である、請求項３４に記載の幹細胞からクランプを製造する方法。
【請求項38】
表面が低接着性である第１の培養器に、幹細胞を播種することと、
前記第１の培養器内の培地中で前記幹細胞を三次元培養し、前記幹細胞からクランプを形成することと、
前記クランプを第２の培養器に播種し、前記クランプから分化細胞を誘導することと、
を含む、分化細胞を製造する方法。
前記第１の培養器内の培地中で前記幹細胞を三次元培養し、前記幹細胞からクランプを形成することと、
前記クランプを第２の培養器に播種し、前記クランプから分化細胞を誘導することと、
を含む、分化細胞を製造する方法。
【請求項39】
前記播種することにおいて、前記幹細胞をシングルセルで播種する、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
前記幹細胞がｉＰＳ細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項41】
前記ｉＰＳ細胞が皮膚細胞由来である、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記培地が細胞外基質を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項43】
前記第１の培養器の前記表面が低接着性である、請求項３８に記載の方法。
【請求項44】
前記第２の培養器の表面がゼラチンでコートされている、請求項３８に記載の方法。
【請求項45】
前記分化細胞が皮膚細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項46】
前記皮膚細胞が真皮細胞又は表皮細胞である、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
幹細胞を攪拌培養器に播種することと、
前記攪拌培養器の底面に前記幹細胞が接着せず、かつ、前記幹細胞の少なくとも２０％以上が前記攪拌培養器の前記底面に接触する速度で、前記攪拌培養器内の培地を攪拌することと、
前記攪拌培養器内で前記幹細胞からクランプを形成することと、
を含む、幹細胞からクランプを製造する方法。
前記攪拌培養器の底面に前記幹細胞が接着せず、かつ、前記幹細胞の少なくとも２０％以上が前記攪拌培養器の前記底面に接触する速度で、前記攪拌培養器内の培地を攪拌することと、
前記攪拌培養器内で前記幹細胞からクランプを形成することと、
を含む、幹細胞からクランプを製造する方法。
【請求項48】
前記幹細胞がｉＰＳ細胞である、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
前記幹細胞を前記攪拌培養器に播種することにおいて、前記幹細胞が凍結している、請求項４７に記載の方法。
【請求項50】
前記幹細胞を前記攪拌培養器に播種することにおいて、凍結液とともに前記幹細胞を前記攪拌培養器に播種する、請求項４７に記載の方法。
【請求項51】
前記クランプを内胚葉、中胚葉、及び外胚葉の少なくともいずれかに分化させることをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項52】
幹細胞を攪拌培養器に播種することと、
前記攪拌培養器の底面に前記幹細胞が接着せず、かつ、前記幹細胞の少なくとも２０％以上が前記攪拌培養器の前記底面に接触する速度で、前記攪拌培養器内の培地を攪拌することと、
前記攪拌培養器内で前記幹細胞からクランプを形成することと、
前記クランプを培養器に播種し、二次元培養により、前記クランプから分化細胞を誘導することと、
を含む、分化細胞を製造する方法。
前記攪拌培養器の底面に前記幹細胞が接着せず、かつ、前記幹細胞の少なくとも２０％以上が前記攪拌培養器の前記底面に接触する速度で、前記攪拌培養器内の培地を攪拌することと、
前記攪拌培養器内で前記幹細胞からクランプを形成することと、
前記クランプを培養器に播種し、二次元培養により、前記クランプから分化細胞を誘導することと、
を含む、分化細胞を製造する方法。
【請求項53】
前記幹細胞がｉＰＳ細胞である、請求項５２に記載の方法。
【請求項54】
前記ｉＰＳ細胞が皮膚細胞由来である、請求項５３に記載の方法。
【請求項55】
前記分化細胞が皮膚細胞である、請求項５２に記載の方法。
【請求項56】
前記皮膚細胞が真皮細胞又は表皮細胞である、請求項５５に記載の方法。
【請求項57】
前記幹細胞を前記攪拌培養器に播種することにおいて、前記幹細胞が凍結している、請求項５２に記載の方法。
【請求項58】
前記幹細胞を前記攪拌培養器に播種することにおいて、凍結液とともに前記幹細胞を前記攪拌培養器に播種する、請求項５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞技術に関し、物質をスクリーニングする方法、物質のスクリーニングシステム、幹細胞からクランプを製造する方法、及び分化細胞を製造する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞とは、二つの特徴的な能力を有する細胞である。一つは、体を構成するあらゆる細胞へと変化することができる能力である。もう一つは、半永久的な増殖能を有することである。ｉＰＳ細胞はこの二つの能力を有するため、自己の体細胞からｉＰＳ細胞を作製し、目的の体細胞へ変化させることで、拒絶反応のない移植治療へと応用することができる。そのためｉＰＳ細胞は、再生医療の有力な技術になると考えられている（例えば、特許文献１から４及び非特許文献１、２参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】国際公開第２０００／７００７０号
【特許文献2】国際公開第２０１０／００８０５４号
【特許文献3】国際公開第２０１２／０２９７７０号
【特許文献4】国際公開第２０１５／０４６２２９号
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Nature 448, 313-317
【非特許文献2】Nature Biotechnol 26(3): 313-315, 2008.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、幹細胞を用いて物質をスクリーニングする方法、物質のスクリーニングシステム、幹細胞からクランプを製造する方法、及び幹細胞から分化細胞を製造する方法を提供することを目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明の実施形態に係る物質をスクリーニングする方法は、対象の体細胞から多能性幹細胞を誘導することと、多能性幹細胞から分化細胞を誘導することと、分化細胞に物質を添加して分化細胞を培養することと、物質に対する分化細胞の応答に基づいて、対象に物質を投与又は塗布するか否かを決定することと、を含む。
【0007】
上記の物質をスクリーニングする方法において、体細胞を供給する対象と、物質を投与又は塗布される対象と、が、同一人であってもよい。
【0008】
上記の物質をスクリーニングする方法において、物質が、美容商品、化粧品、養毛剤、又は育毛剤の添加物であってもよい。
【0009】
上記の物質をスクリーニングする方法において、物質が、医薬品の添加物であってもよい。
【0010】
上記の物質をスクリーニングする方法において、物質がビタミンであってもよい。
【0011】
上記の物質をスクリーニングする方法において、物質が、アスコルビン酸及びレチノールの少なくともいずれかであってもよい。
【0012】
上記の物質をスクリーニングする方法において、物質が防腐剤であってもよい。
【0013】
上記の物質をスクリーニングする方法において、分化細胞が皮膚細胞であってもよい。
【0014】
上記の物質をスクリーニングする方法において、分化細胞の応答が、分化細胞による産生物の産生であってもよい。
【0015】
上記の物質をスクリーニングする方法において、産生物が、コラーゲンであってもよい。
【0016】
上記の物質をスクリーニングする方法において、分化細胞の応答が、分化細胞の生存率であってもよい。
【0017】
本発明の実施形態に係る物質の投与又は塗布方法は、対象の体細胞から多能性幹細胞を誘導することと、多能性幹細胞から分化細胞を誘導することと、分化細胞に物質を添加して分化細胞を培養することと、物質に対する分化細胞の応答に基づいて、対象に物質を投与又は塗布するか否かを決定することと、投与又は塗布すると決定された物質を対象に投与又は塗布することと、を含む。
【0018】
上記の物質の投与又は塗布方法において、体細胞を供給する対象と、物質を投与又は塗布される対象と、が、同一人であってもよい。
【0019】
上記の物質の投与又は塗布方法において、物質が、美容商品、化粧品、養毛剤、又は育毛剤の添加物であってもよい。
【0020】
上記の物質の投与又は塗布方法において、物質が、医薬品の添加物であってもよい。
【0021】
上記の物質の投与又は塗布方法において、物質がビタミンであってもよい。
【0022】
上記の物質の投与又は塗布方法において、物質が、アスコルビン酸及びレチノールの少なくともいずれかであってもよい。
【0023】
上記の物質の投与又は塗布方法において、物質が防腐剤であってもよい。
【0024】
上記の物質の投与又は塗布方法において、分化細胞が皮膚細胞であってもよい。
【0025】
上記の物質の投与又は塗布方法において、分化細胞の応答が、分化細胞による産生物の産生であってもよい。
【0026】
上記の物質の投与又は塗布方法において、産生物が、コラーゲンであってもよい。
【0027】
上記の物質の投与又は塗布方法において、分化細胞の応答が、分化細胞の生存率であってもよい。
【0028】
本発明の実施形態に係る物質のスクリーニングシステムは、対象の体細胞から誘導された多能性幹細胞から誘導された分化細胞に物質を添加して分化細胞を培養した際の分化細胞の応答のデータを取得するデータ取得部と、分化細胞の応答のデータに基づいて、物質を評価する評価部と、評価に基づいて、対象に物質を投与又は塗布するか否かを決定する決定部と、を備える。
【0029】
上記の物質のスクリーニングシステムにおいて、体細胞を供給する対象と、物質を投与又は塗布される対象と、が、同一人であってもよい。
【0030】
上記の物質のスクリーニングシステムにおいて、物質が、美容商品、化粧品、養毛剤、又は育毛剤の添加物であってもよい。
【0031】
上記の物質のスクリーニングシステムにおいて、物質が、医薬品の添加物であってもよい。
【0032】
上記の物質のスクリーニングシステムにおいて、物質がビタミンであってもよい。
【0033】
上記の物質のスクリーニングシステムにおいて、物質が、アスコルビン酸及びレチノールの少なくともいずれかであってもよい。
【0034】
上記の物質のスクリーニングシステムにおいて、物質が防腐剤であってもよい。
【0035】
上記の物質のスクリーニングシステムにおいて、分化細胞が皮膚細胞であってもよい。
【0036】
上記の物質のスクリーニングシステムにおいて、分化細胞の応答が、分化細胞による産生物の産生であってもよい。
【0037】
上記の物質のスクリーニングシステムにおいて、産生物が、コラーゲンであってもよい。
【0038】
上記の物質のスクリーニングシステムにおいて、分化細胞の応答が、分化細胞の生存率であってもよい。
【0039】
本発明の実施形態に係る幹細胞からクランプを製造する方法は、表面が低接着性である培養器に、幹細胞をシングルセルで播種することと、培養器内の細胞外基質を含む培地中で幹細胞を三次元培養し、幹細胞からクランプを形成することと、を含む。
【0040】
上記の幹細胞からクランプを製造する方法において、幹細胞がｉＰＳ細胞であってもよい。
【0041】
上記の幹細胞からクランプを製造する方法において、細胞外基質がラミニンを含んでいてもよい。
【0042】
上記の幹細胞からクランプを製造する方法において、培養器の表面が低接着性であってもよい。
【0043】
本発明の実施形態に係る分化細胞を製造する方法は、表面が低接着性である第１の培養器に、幹細胞を播種することと、第１の培養器内の培地中で幹細胞を三次元培養し、幹細胞からクランプを形成することと、クランプを第２の培養器に播種し、クランプから分化細胞を誘導することと、を含む。
【0044】
上記の分化細胞を製造する方法において、播種することにおいて、幹細胞をシングルセルで播種してもよい。
【0045】
上記の分化細胞を製造する方法において、幹細胞がｉＰＳ細胞であってもよい。
【0046】
上記の分化細胞を製造する方法において、ｉＰＳ細胞が皮膚細胞由来であってもよい。
【0047】
上記の分化細胞を製造する方法において、培地が細胞外基質を含んでいてもよい。細胞外基質がラミニンを含んでいてもよい。
【0048】
上記の分化細胞を製造する方法において、第１の培養器の表面が低接着性であってもよい。
【0049】
上記の分化細胞を製造する方法において、第２の培養器の表面がゼラチンでコートされていてもよい。
【0050】
上記の分化細胞を製造する方法において、分化細胞が皮膚細胞であってもよい。
【0051】
上記の分化細胞を製造する方法において、皮膚細胞が真皮細胞又は表皮細胞であってもよい。
【0052】
本発明の実施形態に係る幹細胞からクランプを製造する方法は、幹細胞を攪拌培養器に播種することと、攪拌培養器の底面に幹細胞が接着せず、かつ、幹細胞の少なくとも２０％以上が攪拌培養器の底面に接触する速度で、攪拌培養器内の培地を攪拌することと、攪拌培養器内で幹細胞からクランプを形成することと、を含む。
【0053】
上記の幹細胞からクランプを製造する方法において、幹細胞がｉＰＳ細胞であってもよい。
【0054】
上記の幹細胞からクランプを製造する方法において、幹細胞を攪拌培養器に播種することにおいて、幹細胞が凍結していてもよい。
【0055】
上記の幹細胞からクランプを製造する方法において、幹細胞を攪拌培養器に播種することにおいて、凍結液とともに幹細胞を攪拌培養器に播種してもよい。
【0056】
上記の幹細胞からクランプを製造する方法が、クランプを内胚葉、中胚葉、及び外胚葉の少なくともいずれかに分化させることをさらに含んでいてもよい。
【0057】
本発明の実施形態に係る分化細胞を製造する方法は、幹細胞を攪拌培養器に播種することと、攪拌培養器の底面に幹細胞が接着せず、かつ、幹細胞の少なくとも２０％以上が攪拌培養器の底面に接触する速度で、攪拌培養器内の培地を攪拌することと、攪拌培養器内で幹細胞からクランプを形成することと、クランプを培養器に播種し、二次元培養により、クランプから分化細胞を誘導することと、を含む。
【0058】
上記の分化細胞を製造する方法において、幹細胞がｉＰＳ細胞であってもよい。
【0059】
上記の分化細胞を製造する方法において、ｉＰＳ細胞が皮膚細胞由来であってもよい。
【0060】
上記の分化細胞を製造する方法において、分化細胞が皮膚細胞であってもよい。
【0061】
上記の分化細胞を製造する方法において、皮膚細胞が真皮細胞又は表皮細胞であってもよい。
【0062】
上記の分化細胞を製造する方法において、幹細胞を攪拌培養器に播種することにおいて、幹細胞が凍結していてもよい。
【0063】
上記の分化細胞を製造する方法において、幹細胞を攪拌培養器に播種することにおいて、凍結液とともに幹細胞を攪拌培養器に播種してもよい。
【発明の効果】
【0064】
本発明によれば、幹細胞を用いて物質をスクリーニングする方法、物質のスクリーニングシステム、幹細胞からクランプを製造する方法、及び幹細胞から分化細胞を製造する方法を提供可能である。
【図面の簡単な説明】
【0065】
【発明を実施するための形態】
【0066】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお以下の示す実施形態は、この発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、この発明の技術的思想は構成部材の組み合わせ等を下記のものに特定するものではない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲において種々の変更を加えることができる。
【0067】
（幹細胞からクランプを製造する方法の第１実施形態）
幹細胞からクランプを製造する方法の第１実施形態は、表面が低接着性である培養器に幹細胞を播種することと、表面が低接着性である培養器内の細胞外基質を含む培地中で幹細胞を三次元培養（浮遊培養）し、幹細胞からクランプを形成することと、を含む。クランプは、胚葉体（ＥＢ）ともいう。クランプは、例えば、内胚葉のマーカーが陽性である。クランプは、例えば、中胚葉のマーカーが陽性である。クランプは、例えば、外胚葉のマーカーが陽性である。内胚葉のマーカーの例としては、ＳＯＸ１７が挙げられる。中胚葉のマーカーの例としては、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｔ）が挙げられる。外胚葉のマーカーの例としては、ＰＡＸ６が挙げられる。
幹細胞からクランプを製造する方法の第１実施形態は、表面が低接着性である培養器に幹細胞を播種することと、表面が低接着性である培養器内の細胞外基質を含む培地中で幹細胞を三次元培養（浮遊培養）し、幹細胞からクランプを形成することと、を含む。クランプは、胚葉体（ＥＢ）ともいう。クランプは、例えば、内胚葉のマーカーが陽性である。クランプは、例えば、中胚葉のマーカーが陽性である。クランプは、例えば、外胚葉のマーカーが陽性である。内胚葉のマーカーの例としては、ＳＯＸ１７が挙げられる。中胚葉のマーカーの例としては、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｔ）が挙げられる。外胚葉のマーカーの例としては、ＰＡＸ６が挙げられる。
【0068】
幹細胞は、例えば、多能性幹細胞である。多能性幹細胞は、例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）である。幹細胞は、ヒト由来であってもよいし、非ヒト動物由来であってもよい。ｉＰＳ細胞は、例えば、皮膚細胞、血液細胞、歯髄幹細胞、ケラチノサイト、毛乳頭細胞、口腔上皮細胞、体性幹前駆細胞、又は膀胱上皮細胞由来であってもよい。
【0069】
皮膚細胞は、線維芽細胞等の真皮細胞、及びケラチノサイト等の表皮細胞であってもよい。皮膚細胞は、線維芽細胞であってもよい。血液細胞は、例えば、単核球細胞（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、好中球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、及びリンパ球等の有核細胞であり、赤血球、顆粒球、及び血小板を含まない。血液細胞は、例えば血管内皮前駆細胞、血液幹・前駆細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞であってもよい。Ｔ細胞は、例えばαβＴ細胞である。
【0070】
表面が低接着性である培養器に幹細胞を播種することにおいて、培養器に幹細胞をシングルセルで播種してもよい。幹細胞は、例えば、細胞解離剤を含む溶液中で懸濁されることにより、シングルセルに解離される。幹細胞をシングルセルで培養器に播種することにより、幹細胞がクランプを形成するときに、クランプ同士が凝集することを抑制することが可能である。細胞解離剤は、例えば細胞解離酵素である。細胞解離剤の例としては、ＴｒｙｐＬＥ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）及びトリプシンが挙げられる。なお、幹細胞をシングルセルに解離する方法は、細胞解離酵素を使用する方法に限定されない。例えば、例えば、細胞解離剤として０．１から１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を使用して、幹細胞をシングルセルに解離してもよい。酵素ではない細胞解離剤を用いることにより、細胞の生存率と、クランプの形成能が向上し得る。幹細胞は、例えば、細胞外基質を含む培地中にシングルセルで懸濁され、培養器に播種される。ただし、培養器に幹細胞をシングルセルにしないで播種してもよい。
【0071】
表面が低接着性である培養器は、細胞、タンパク質、ペプチド、及び低分子化合物に対して低接着性である。表面が低接着性である培養器は、例えば、表面が親水性である培養器である。表面が親水性である培養器は、例えば、培養器の表面を、親水性ポリマーでコーティングすることにより製造される。親水性ポリマーは、架橋により培養器の表面に結合していてもよい。表面が親水性である培養器に幹細胞をシングルセルで播種することにより、幹細胞が培養液の表面に接着することなく、幹細胞を三次元培養することが可能である。表面が親水性である培養器の例としては、ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標、住友ベークライト）が挙げられる。
【0072】
培地としては、例えば、Ｐｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ(ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ)等のヒトＥＳ／ｉＰＳ培地等の幹細胞培地を使用可能である。
【0073】
ただし、幹細胞培地は、これに限定されず、種々の幹細胞培地が使用可能である。例えばＰｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｒｅｐｒｏｓｔｅｍ、ＲｅｐｒｏＦＦ、ＲｅｐｒｏＦＦ２、ＲｅｐｒｏＸＦ（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ）、ｍＴｅＳＲ１、ＴｅＳＲ２、ＴｅＳＲＥ８、ＲｅｐｒｏＴｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）Ｈｕｍａｎ ＥＳ／ｉＰＳ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｅｒｃｋ）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ （登録商標）ＸＦ／ＦＦ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ ｉＰＳ ａｎｄ ＥＳ Ｃｅｌｌｓ、Ｐｌｕｒｉｔｏｎ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）、Ｓｔｅｍｆｉｔ ＡＫ０２Ｎ、Ｓｔｅｍｆｉｔ ＡＫ０３（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）、ＥＳＣ－Ｓｕｒｅ（登録商標）ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｆｅｅｄｅｒ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｈＥＳＣ／ｉＰＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ ＳｔｅｍＣｅｌｌ）、Ｌ７（登録商標）ｈＰＳＣ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ （ＬＯＮＺＡ）、及びＰｌｕｒｉＱ（ＭＴＩ－ＧｌｏｂａｌＳｔｅｍ）等を利用してもよい。
【0074】
細胞外基質の例としては、ラミニン、コラーゲン、カドヘリン、フィブロネクチン、及びビトロネクチン、ＰＥＧ、ＰＶＡが挙げられる。細胞外基質は、マトリゲル（登録商標、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に含まれていてもよい。培地に細胞外基質を添加することにより、幹細胞がクランプを効率的に形成する。
【0075】
（幹細胞からクランプを製造する方法の第２実施形態）
幹細胞からクランプを製造する方法の第２実施形態は、幹細胞を攪拌培養器に播種することと、攪拌培養器の底面に幹細胞が接着せず、かつ、幹細胞の少なくとも２０％以上が攪拌培養器の底面に接触する速度で、攪拌培養器内の培地を攪拌することと、攪拌培養器内で幹細胞からクランプを形成することと、を含む。クランプは、例えば、内胚葉のマーカーが陽性である。クランプは、例えば、中胚葉のマーカーが陽性である。クランプは、例えば、外胚葉のマーカーが陽性である。
幹細胞からクランプを製造する方法の第２実施形態は、幹細胞を攪拌培養器に播種することと、攪拌培養器の底面に幹細胞が接着せず、かつ、幹細胞の少なくとも２０％以上が攪拌培養器の底面に接触する速度で、攪拌培養器内の培地を攪拌することと、攪拌培養器内で幹細胞からクランプを形成することと、を含む。クランプは、例えば、内胚葉のマーカーが陽性である。クランプは、例えば、中胚葉のマーカーが陽性である。クランプは、例えば、外胚葉のマーカーが陽性である。
【0076】
幹細胞は、第１実施形態と同様である。また、第２実施形態においては、凍結している幹細胞を凍結液とともに攪拌培養器に播種してもよい。
【0077】
攪拌培養器は、内部に培地を格納する容器と、容器内の培地を攪拌する攪拌装置と、を備える。バイオリアクターを攪拌培養器として使用してもよい。バイオリアクターの例としては、ＡＢＬＥ（登録商標、ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ）が挙げられる。第２実施形態において、攪拌培養器に入れられる培地は、第１実施形態と同様である。ただし、第２実施形態においては、培地が細胞外基質を含んでいてもよいし、培地が細胞外基質を含んでいなくてもよい。
【0078】
攪拌培養器は、攪拌装置で容器内の培地を攪拌することにより、容器内の幹細胞が、容器の内部の表面に接着しないようにしながら、幹細胞を培養する。ここで、培地の攪拌速度が速いと、容器内で幹細胞は浮遊し、培地の攪拌速度が遅いと、容器内で幹細胞を沈殿する。
【0079】
攪拌培養器は、容器内部の底面に幹細胞が接着せず、かつ、幹細胞の少なくとも２０％以上１００％未満、２０％以上９５％以下、２０％以上９０％以下、２０％以上８０％以下、３０％以上１００％未満、３０％以上９５％以下、３０％以上９０％以下、３０％以上８０％以下、５０％以上１００％未満、５０％以上９５％以下、５０％以上９０％以下、５０％以上８０％以下、８０％以上１００％未満、８０％以上９５％以下、８０％以上９０％以下、８５％以上１００％未満、８５％以上９５％以下、８５％以上９０％以下、９０％以上１００％未満、９０％以上９５％以下、又は９５％以上１００％未満が容器内部の底面に接触する速度で、容器内の培地を攪拌する。ここで、接触とは、幹細胞が培地の攪拌により移動可能に底面に接していることをいう。幹細胞は、容器内部の底面に接しながら、底面上を移動してもよい。幹細胞の少なくとも２０％以上が容器の底面に接触する速度で培地を攪拌することにより、幹細胞がクランプを効率的に形成する。
【0080】
クランプが形成された後は、クランプの２０％未満が容器内部の底面に接触する速度に、攪拌速度を上げてもよい。クランプが形成された後に攪拌速度を上げることにより、複数のクランプ間で大きさが均一になり、三胚葉への分化効率が向上する傾向にある。
【0081】
（分化細胞を製造する方法）
分化細胞を製造する方法の実施形態は、幹細胞からクランプを製造する方法の第１又は第２実施形態で製造されたクランプを培養器に播種し、クランプから分化細胞を誘導することを含む。１ｃｍ2あたり１個以上、２個以上、あるいは５個以上のクランプを培養器に播種してもよい。クランプから分化細胞を誘導する際、細胞は二次元培養されてもよいし、三次元培養されてもよい。分化細胞は、例えば皮膚細胞である。皮膚細胞を製造する場合、クランプを形成するｉＰＳ細胞は皮膚細胞由来であることが好ましい。皮膚細胞は、真皮細胞、及び表皮細胞であってもよい。皮膚細胞は、線維芽細胞であってもよい。クランプを播種される培養器の内部の表面は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、カドヘリン、フィブロネクチン、又はビトロネクチンでコートされていてもよい。培養器はディッシュであってもよい。クランプから皮膚細胞を誘導する際の培地の例としては、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）が挙げられるが、特に限定されない。
分化細胞を製造する方法の実施形態は、幹細胞からクランプを製造する方法の第１又は第２実施形態で製造されたクランプを培養器に播種し、クランプから分化細胞を誘導することを含む。１ｃｍ2あたり１個以上、２個以上、あるいは５個以上のクランプを培養器に播種してもよい。クランプから分化細胞を誘導する際、細胞は二次元培養されてもよいし、三次元培養されてもよい。分化細胞は、例えば皮膚細胞である。皮膚細胞を製造する場合、クランプを形成するｉＰＳ細胞は皮膚細胞由来であることが好ましい。皮膚細胞は、真皮細胞、及び表皮細胞であってもよい。皮膚細胞は、線維芽細胞であってもよい。クランプを播種される培養器の内部の表面は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、カドヘリン、フィブロネクチン、又はビトロネクチンでコートされていてもよい。培養器はディッシュであってもよい。クランプから皮膚細胞を誘導する際の培地の例としては、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）が挙げられるが、特に限定されない。
【0082】
培養器内で細胞がコンフルエントになったところで、トリプシン等の剥離剤で細胞を培養器から剥がし、細胞をシングルセルにしてから継代培養してもよい。継代を繰り返してもよい。その後、ＣＤ１３等の線維芽細胞マーカーを用いて、細胞が線維芽細胞に分化したことを確認してもよい。また、ＴＲＡ１－６０、ＳＳＥＡ－４、及びＳＳＥＡ－５等の未分化マーカーを用いて、細胞に未分化のｉＰＳ細胞が残っていないかを確認してもよい。
【0083】
（物質をスクリーニングする方法）
物質をスクリーニングする方法は、対象の体細胞から多能性幹細胞を誘導することと、多能性幹細胞から分化細胞を誘導することと、分化細胞に物質を添加して分化細胞を培養することと、物質に対する分化細胞の応答に基づいて、対象に物質を投与又は塗布するか否かを決定することと、を含む。
物質をスクリーニングする方法は、対象の体細胞から多能性幹細胞を誘導することと、多能性幹細胞から分化細胞を誘導することと、分化細胞に物質を添加して分化細胞を培養することと、物質に対する分化細胞の応答に基づいて、対象に物質を投与又は塗布するか否かを決定することと、を含む。
【0084】
対象はヒトである。対象の体細胞は、予め対象から取得される。体細胞は、特に限定されないが、例えば、皮膚細胞、血液細胞、歯髄幹細胞、ケラチノサイト、毛乳頭細胞、口腔上皮細胞、体性幹前駆細胞、又は膀胱上皮細胞である。体細胞は、好ましくは、皮膚細胞である。対象の体細胞から多能性幹細胞を誘導することは、体外で実施される。
【0085】
体細胞から多能性幹細胞を誘導する方法は、特に限定されない。例えば、体細胞にリプログラミング因子を導入することにより、ｉＰＳ細胞が体細胞から誘導される。
【0086】
体細胞に導入されるリプログラミング因子は、例えば、ＲＮＡである。ＲＮＡは、例えば、ｍＲＮＡである。細胞に導入されるリプログラミング因子は、例えば、ＯＣＴ３／４等のＯＣＴ、ＳＯＸ２等のＳＯＸ、ＫＬＦ４等のＫＬＦ、及びｃ－ＭＹＣ等のＭＹＣを含む。リプログラミング因子として、ＯＣＴ３／４を改良したＭ3Ｏを使用してもよい。また、リプログラミング因子は、ＬＩＮ２８Ａ、ＦＯＸＨ１、ＬＩＮ２８Ｂ、ＧＬＩＳ１、ｐ５３－ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ、ｐ５３－Ｐ２７５Ｓ、Ｌ－ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、ＤＰＰＡ５、ＺＩＣ３、ＢＣＬ－２、Ｅ－ＲＡＳ、ＴＰＴ１、ＳＡＬＬ２、ＮＡＣ１、ＤＡＸ１、ＴＥＲＴ、ＺＮＦ２０６、ＦＯＸＤ３、ＲＥＸ１、ＵＴＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、ＥＳＲＲＢ、ｍｉＲ－２９１－３ｐ、ｍｉＲ－２９４、ｍｉＲ－２９５、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＴＢＸ３、ＭＢＤ３ｓｈ、ＴＨ２Ａ、ＴＨ２Ｂ、及びＰ５３ＤＤからなる群から選択される少なくとも一つの因子をさらに含んでいてもよい。
【0087】
多能性幹細胞から分化細胞を誘導する方法は、特に限定されない。例えば、上記の幹細胞からクランプを製造する方法の第１又は第２実施形態に従って、多能性幹細胞からクランプを製造し、上記の分化細胞を製造する方法の実施形態に従って、クランプから分化細胞を製造してもよい。分化細胞は、例えば皮膚細胞である。
【0088】
誘導された分化細胞は、物質を添加された培地中で培養される。物質は、自家の幹細胞培養上清、他家の幹細胞培養上清、美容商品、化粧品、養毛剤、又は育毛剤に添加可能な物質である。あるいは、物質は、医薬品に添加可能な物質である。物質の例としては、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、及び生理食塩水が挙げられる。賦形剤の例としては、乳糖、デンプン、ソルビトール、Ｄ－マンニトール、及び白糖が挙げられる。崩壊剤の例としては、カルボキシメチルセルロース、及び炭酸カルシウムが挙げられる。緩衝剤の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、及び酢酸塩が挙げられる。乳化剤の例としては、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、及びトラガントが挙げられる。
【0089】
懸濁剤の例としては、モノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、及びラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。無痛化剤の例としては、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びソルビトールが挙げられる。安定剤の例としては、プロピレングリコール、及びアスコルビン酸が挙げられる。保存剤の例としては、フェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びメチルパラベンが挙げられる。防腐剤の例としては、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、及びクロロブタノールが挙げられる。
【0090】
また、物質の他の例としては、幹細胞を培養した培地、幹細胞を培養した培地の上清、水、アルコール、界面活性剤（カチオン、アニオン、ノニオン、及び両性界面活性剤等）、保湿剤（グリセリン、１，３－ブチレングリコール、プロピレングリコール、プロパンジオール、ペンタンジオール、ポリクオタニウム、アミノ酸、尿素、ピロリドンカルボン酸塩、核酸類、単糖類、及び少糖等、並びにそれらの誘導体等）、増粘剤（多糖類、ポリアクリル酸塩、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、キチン、キトサン、アルギン酸、カラギーナン、キサンタンガム、及びメチルセルロース等、並びにそれらの誘導体等）、ワックス、ワセリン、炭化水素飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、及びシリコン油等、並びにそれらの誘導体、トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリル、及びトリオクタン酸グリセリル等のトリグリセライド類、ステアリン酸イソプロピル等のエステル油類、天然油脂類（オリブ油、椿油、アボガド油、アーモンド油、カカオ脂、月見草油、ブドウ種子油、マカデミアンナッツ油、ユーカリ油、ローズヒップ油、スクワラン、オレンジラフィー油、ラノリン、及びセラミド等）、防腐剤（オキシ安息香酸誘導体、デヒドロ酢酸塩、感光素、ソルビン酸、及びフェノキシエタノール等、並びにそれらの誘導体等）、殺菌剤（イオウ、トリクロカルバアニリド、サリチル酸、ジンクピリチオン、及びヒノキチオール等、並びにそれらの誘導体等）、紫外線吸収剤（パラアミノ安息香酸、及びメトキシケイ皮酸等、並びにそれらの誘導体等）、抗炎症剤（アラントイン、ビサボロール、ε－アミノカプロン酸、アセチルファネシルシスティン、及びグリチルリチン酸等、並びにそれらの誘導体等）、抗酸化剤（トコフェロール、ＢＨＡ、ＢＨＴ、及びアスタキサンチン等、並びにそれらの誘導体等）、キレート剤（エデト酸、及びヒドロキシエタンジホスホン酸等、並びにそれらの誘導体等）、動植物エキス（アシタバ、アロエ、エイジツ、オウゴン、オウバク、海藻、カリン、カミツレ、甘草、キウイ、キュウリ、クワ、シラカバ、トウキ、ニンニク、ボタン、ホップ、マロニエ、ラベンダー、ローズマリー、ユーカリ、ミルク、各種ペプタイド、プラセンタ、ローヤルゼリー、ユーグレナエキス、加水分解ユーグレナエキス、及びユーグレナ油等、並びにこれらの含有成分精製物又は発酵物等）、ｐＨ調整剤（無機酸、無機酸塩、有機酸、及び有機酸塩等、並びにそれらの誘導体等）、ビタミン類（ビタミンＡ類、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＤ類、ユビキノン、及びニコチン酸アミド等、並びにそれらの誘導体等）、酵母、麹菌及び乳酸菌の発酵液、ガラクトミセス培養液、美白剤（トラネキサム酸、トラネキサム酸セチル塩酸塩、４－ｎ－ブチルレゾルシノール、アルブチン、コウジ酸、エラグ酸、カンゾウフラボノイド、ナイアシンアミド、及びビタミンＣ誘導体等）、セラミド・セラミド誘導体、抗シワ剤（レチノール、及びレチナール、並びにそれらの誘導体、ニコチン酸アミド、及びオリゴぺプチド等、並びにそれらの誘導体等、好中球エラスターゼ阻害、並びにＭＭＰ－１及びＭＭＰ－２阻害作用のある天然及び合成成分等）、酸化チタン、タルク、マイカ、シリカ、酸化亜鉛、酸化鉄、シリコン、及びこれらを加工処理した粉体類等が挙げられる。
【0091】
物質の別の例としては、基剤（カオリン、及びベントナイト等）、ゲル化剤（ポリアクリル酸塩、及びポリビニルアルコール等）、硫酸塩、炭酸水素塩、ホウ酸塩、及び色素が挙げられる。
【0092】
分化細胞を培養する際の培地は、特に限定されないが、分化細胞が皮膚細胞である場合、例えばＦＢＳを添加したＤＭＥＭである。
【0093】
物質に対する分化細胞の応答に基づいて、対象に物質を投与又は塗布するか否かが決定される。例えば、物質に対して、分化細胞が好ましい応答をした場合、対象に物質を投与又は塗布すると決定される。物質に対して、分化細胞が好ましくない応答をした場合、対象に物質を投与又は塗布しないと決定される。
【0094】
分化細胞の応答は、例えば、分化細胞による産生物の産生であってもよい。分化細胞が皮膚細胞である場合、産生物の例としては、コラーゲン、ヒアルロン酸、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリー、及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）が挙げられる。分化細胞に物質を添加することにより、産生物の産生量が増加した場合、分化細胞が好ましい応答をしたと判断され、対象に物質を塗布又は投与すると決定される。分化細胞に物質を添加することにより、産生物の産生量が減少した場合、分化細胞が好ましくない応答をしたと判断され、対象に物質を塗布又は投与しないと決定される。
【0095】
分化細胞の応答は、例えば、分化細胞の生存率であってもよい。分化細胞に物質を添加することにより、分化細胞の生存率が上昇した場合、分化細胞が好ましい応答をしたと判断され、対象に物質を塗布又は投与すると決定される。分化細胞に物質を添加することにより、分化細胞の生存率が下降した場合、分化細胞が好ましくない応答をしたと判断され、対象に物質を塗布又は投与しないと決定される。
【0096】
体細胞を供給する対象と、物質を塗布又は投与される対象と、は、同一人である。物質に対する分化細胞の応答は、人によって異なり得る。これに対し、対象の体細胞由来の分化細胞における物質の応答を観察し、分化細胞が好ましい応答を示す物質を同一の対象に提供することにより、対象に適した物質をオーダーメイドで提供することが可能となる。
【0097】
（物質のスクリーニングシステム）
図１に示すように、物質のスクリーニングシステムの実施形態は、対象の体細胞から誘導された多能性幹細胞から誘導された分化細胞に物質を添加して分化細胞を培養した際の分化細胞の応答のデータを取得するデータ取得部３０１と、分化細胞の応答のデータに基づいて、物質を評価する評価部３０２と、評価に基づいて、対象に物質を塗布又は投与するか否かを決定する決定部３０３と、を備える。データ取得部３０１、評価部３０２、及び決定部３０３は、例えば、中央演算処理装置（ＣＰＵ）３００に含まれる。
図１に示すように、物質のスクリーニングシステムの実施形態は、対象の体細胞から誘導された多能性幹細胞から誘導された分化細胞に物質を添加して分化細胞を培養した際の分化細胞の応答のデータを取得するデータ取得部３０１と、分化細胞の応答のデータに基づいて、物質を評価する評価部３０２と、評価に基づいて、対象に物質を塗布又は投与するか否かを決定する決定部３０３と、を備える。データ取得部３０１、評価部３０２、及び決定部３０３は、例えば、中央演算処理装置（ＣＰＵ）３００に含まれる。
【0098】
データ取得部３０１は、例えば、上記の物質をスクリーニングする方法で説明した、物質に対する分化細胞の応答のデータを取得する。例えば、データ取得部３０１は、複数の物質のそれぞれに対する分化細胞の応答のデータを取得してもよい。また、データ取得部３０１は、コントロールとして、物質を添加しなかった場合の分化細胞の応答のデータを取得してもよい。
【0099】
評価部３０２は、物質に対して、分化細胞が好ましい応答をしたか否かを評価する。例えば、コントロールと比較して、物質を添加された分化細胞が、産生物の産生を増加させた場合、評価部３０２は、分化細胞が好ましい応答をしたと評価する。また、コントロールと比較して、物質を添加された分化細胞が、産生物の産生を減少させた場合、評価部３０２は、分化細胞が好ましくない応答をしたと評価する。
【0100】
また、例えば、コントロールと比較して、物質を添加された分化細胞の生存率が上昇した場合、評価部３０２は、分化細胞が好ましい応答をしたと評価する。また、コントロールと比較して、物質を添加された分化細胞の生存率が低下した場合、評価部３０２は、分化細胞が好ましくない応答をしたと評価する。
【0101】
あるいは、評価部３０２は、複数の物質を比較して、分化細胞が好ましい応答を示す物質を抽出する。例えば、複数の物質のうち、第１の物質と比較して、第２の物質を添加された分化細胞の生存率が上昇した場合、評価部３０２は、第２の物質に対して分化細胞が好ましい応答をしたと評価する。また、評価部３０２は、第１の物質に対して分化細胞が好ましくない応答をしたと評価する。
【0102】
また、例えば、複数の物質のうち、第１の物質と比較して、第２の物質を添加された分化細胞の生存率が上昇した場合、評価部３０２は、第２の物質に対して分化細胞が好ましい応答をしたと評価する。また、評価部３０２は、第１の物質に対して分化細胞が好ましくない応答をしたと評価する。
【0103】
決定部３０３は、評価部３０２によって、分化細胞が好ましい応答をしたと評価された物質を対象に物質を塗布又は投与することを決定し、分化細胞が好ましい応答をしなかったと評価された物質を対象に物質を塗布又は投与しないことを決定する。決定部３０３は、決定した事項を、出力装置に送信してもよい。
【0104】
（実施例１）
フィーダーフリーでｉＰＳ細胞を培養した。培地は、８０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦと１％の抗生物質（Ｇｉｂｃｏ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ （１００Ｘ）、登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含む培地（Ｐｕｅｌ、Ｉ Ｐｅａｃｅ，Ｉｎｃ）（以下、「幹細胞培地」という。）を用いた。以下の培地において用いられる抗生物質は同じである。８０％から９０％コンフルエントになってから、培地にＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で５分から１０分静置して、ｉＰＳ細胞を培養器から剥がし、ピペットマンでｉＰＳ細胞を含む幹細胞培地を懸濁して、ｉＰＳ細胞をシングルセルにした。培養器に幹細胞培地を追加してシングルセルのｉＰＳ細胞を回収し、ｉＰＳ細胞を含む幹細胞培地を遠心して、ｉＰＳ細胞を回収した。
フィーダーフリーでｉＰＳ細胞を培養した。培地は、８０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦと１％の抗生物質（Ｇｉｂｃｏ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ （１００Ｘ）、登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含む培地（Ｐｕｅｌ、Ｉ Ｐｅａｃｅ，Ｉｎｃ）（以下、「幹細胞培地」という。）を用いた。以下の培地において用いられる抗生物質は同じである。８０％から９０％コンフルエントになってから、培地にＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で５分から１０分静置して、ｉＰＳ細胞を培養器から剥がし、ピペットマンでｉＰＳ細胞を含む幹細胞培地を懸濁して、ｉＰＳ細胞をシングルセルにした。培養器に幹細胞培地を追加してシングルセルのｉＰＳ細胞を回収し、ｉＰＳ細胞を含む幹細胞培地を遠心して、ｉＰＳ細胞を回収した。
【0105】
１％の抗生物質を含み、ｂＦＧＦを含まないＰｕｅｌをＥＢ培地として用意した。ｉＰＳ細胞を０．１％のＲＯＣＫ阻害剤を添加したＥＢ培地に懸濁し、ｉＰＳ細胞をシングルセルにした。１×１０6個のｉＰＳ細胞を０．１％のＲＯＣＫ阻害剤及び１％のマトリゲルを添加した４ｍＬのＥＢ培地に懸濁し、ｉＰＳ細胞をシングルセルでＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ ３Ｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ６０ｍｍディッシュ（以下、「第１のディッシュ」という。）に播種した。２日後、ディッシュに４ｍＬのＥＢ培地を追加した。ｉＰＳ細胞を第１のディッシュに播種してから２日目のクランプの写真を図２Ａに示す。その後、クランプが形成されるまで、第１のディッシュ内のＥＢ培地の半量を２日おきに交換した。ｉＰＳ細胞を第１のディッシュに播種してから６日目のクランプの写真を図２Ｂに示す。
【0106】
２０％のＦＢＳ、６４μｇ／ｍＬのアスコルビン酸、及び１％の抗生物質を添加し、ＲＯＣＫ阻害剤を含まないＤＭＥＭ（高グルコース）を第１線維芽細胞培地として用意した。また、内部表面がゼラチン等の細胞外基質でコートされたディッシュを第２のディッシュとして用意した。第１のディッシュ内のＥＢ培地とクランプをチューブに移し、ＥＢ培地とクランプを遠心して、クランプを回収した。クランプを第１線維芽細胞培地に懸濁し、９ｃｍ2あたり１０個以上のクランプを第２のディッシュに播種して、３７℃で細胞を培養した。第２のディッシュ内の第１線維芽細胞培地を２日おきに交換した。第２のディッシュにクランプを播種してから８日目に、図３に示すように、クランプから細胞が外に張り出してくるのが観察された。
【0107】
１０％のＦＢＳ、及び１％の抗生物質を添加し、ＲＯＣＫ阻害剤を含まないＤＭＥＭ（高グルコース）を第２線維芽細胞培地として用意した。また、内部表面がゼラチン等の細胞外基質でコートされていないディッシュを第３のディッシュとして用意した。第２のディッシュにおいて、クランプから外に張り出した細胞が増殖してから、以下の手順で細胞を継代した。
【0108】
第２のディッシュから第１線維芽細胞培地を吸引し、ＰＢＳを第２のディッシュに入れて、ＰＢＳで細胞を洗浄した。第２のディッシュからＰＢＳを吸引し、０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡを第２のディッシュに入れ、３７℃で３分間静置した。細胞が第２のディッシュから剥がれたら、５０％以上の細胞がシングルセルになるようにディソシエーションした後、第１線維芽細胞培地を第２のディッシュに入れ、細胞が懸濁している第１線維芽細胞培地を第２のディッシュから吸引した。細胞が懸濁している第１線維芽細胞培地を遠心し、細胞を回収した。回収した細胞を第２線維芽細胞培地に懸濁し、第３のディッシュに１Ｘ１０4個／ｃｍから５Ｘ１０4個／ｃｍで播種した。
【0109】
その後、細胞が８０％から９０％コンフルエントになるまで、第３のディッシュ内の第２線維芽細胞培地を２日おきに交換した。４から７日に１回、上記の手順と同じ手順で、細胞を継代した。１回目の継代後の細胞の写真を図４Ａに、３回目の継代後の細胞の写真を図４Ｂに、４回目の継代後の細胞の写真を図４Ｃに示す。継代が進むにつれて、細胞の形態が線維芽細胞の形態を示すようになり、ＴＲＡ－１－６０陽性細胞及び上皮様細胞がなくなった。４回目の継代後の細胞を、フローサイトメトリーで分析したところ、図５に示すように、線維芽細胞のマーカーであるＣＤ１３が陽性であった。
【0110】
（比較例１）
ＥＢ培地にマトリゲルを添加しなかった以外は、実施例１と同様に、ｉＰＳ細胞をシングルセルで第１のディッシュに播種し、ｉＰＳ細胞を培養した。この場合、図６に示すように、クランプがほぼ形成されなかった。
ＥＢ培地にマトリゲルを添加しなかった以外は、実施例１と同様に、ｉＰＳ細胞をシングルセルで第１のディッシュに播種し、ｉＰＳ細胞を培養した。この場合、図６に示すように、クランプがほぼ形成されなかった。
【0111】
（実施例２）
実施例１と同じＥＢ培地を用意した。また、３０ｍＬのバイオリアクター（ＡＢＬＥ、ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ）を用意した。バイオリアクターに、０．１％のＲＯＣＫ阻害剤を添加した２０ｍＬのＥＢ培地を入れた。凍結溶液（ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ）中で凍結している４×１０6個のｉＰＳ細胞を、遠心をして凍結液を洗浄することなく、凍結液に懸濁された状態でバイオリアクター内のＥＢ培地に播種した。３７℃で回転速度を１６に設定して、細胞を培養した。回転速度を１６に設定した場合、ｉＰＳ細胞の一部は浮遊せず、ｉＰＳ細胞の少なくとも２０％以上がバイオリアクターの底面に接触していた。２日後、１０ｍＬのＥＢ培地をバイオリアクター内に追加した。その後、クランプが形成されるまで、バイオリアクター内のＥＢ培地の半量を２日おきに交換した。ｉＰＳ細胞をバイオリアクターに播種してから３日目のクランプの写真を図７Ａに、ｉＰＳ細胞をバイオリアクターに播種してから４日目のクランプの写真を図７Ｂに、ｉＰＳ細胞をバイオリアクターに播種してから８日目のクランプの写真を図７Ｃに示す。
実施例１と同じＥＢ培地を用意した。また、３０ｍＬのバイオリアクター（ＡＢＬＥ、ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ）を用意した。バイオリアクターに、０．１％のＲＯＣＫ阻害剤を添加した２０ｍＬのＥＢ培地を入れた。凍結溶液（ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ）中で凍結している４×１０6個のｉＰＳ細胞を、遠心をして凍結液を洗浄することなく、凍結液に懸濁された状態でバイオリアクター内のＥＢ培地に播種した。３７℃で回転速度を１６に設定して、細胞を培養した。回転速度を１６に設定した場合、ｉＰＳ細胞の一部は浮遊せず、ｉＰＳ細胞の少なくとも２０％以上がバイオリアクターの底面に接触していた。２日後、１０ｍＬのＥＢ培地をバイオリアクター内に追加した。その後、クランプが形成されるまで、バイオリアクター内のＥＢ培地の半量を２日おきに交換した。ｉＰＳ細胞をバイオリアクターに播種してから３日目のクランプの写真を図７Ａに、ｉＰＳ細胞をバイオリアクターに播種してから４日目のクランプの写真を図７Ｂに、ｉＰＳ細胞をバイオリアクターに播種してから８日目のクランプの写真を図７Ｃに示す。
【0112】
ｉＰＳ細胞をバイオリアクターに播種してから３日目の細胞をフローサイトメトリーで分析したところ、図８に示すように、多能性幹細胞のマーカーであるＴＲＡ１－６０が陽性であった。また、ｉＰＳ細胞をバイオリアクターに播種してから１１日目に、クランプからＲＮＡを抽出し、定量ＰＣＲにより、ＰＡＸ６、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、及びＳＯＸ１７の発現量を分析した。コントロールとしては未分化のｉＰＳ細胞を行った。ＰＡＸ６は、外胚葉（神経系）のマーカーである。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙは、中胚葉のマーカーである。ＳＯＸ１７は、内胚葉（肺、肝臓、膵臓、筋肉、及び胃や腸等の消化器官）のマーカーである。
【0113】
図９Ａ、図９Ｂ、及び図９Ｃに、未分化のｉＰＳ細胞におけるＰＡＸ６、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、及びＳＯＸ１７の発現量を１に正規化した場合の、クランプにおけるＰＡＸ６、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、及びＳＯＸ１７の発現量を示す。クランプにおいては、ＰＡＸ６、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、及びＳＯＸ１７は陽性であった。したがって、本実施例に係るバイオリアクターで、ｉＰＳ細胞から三胚葉を誘導できることが示された。なお、クランプが形成された後は、クランプの２０％未満がバイオリアクターの底面に接触しないようにバイオリアクターの回転速度を上げたほうが、バイオリアクターの回転速度を上げなかった場合と比較して、複数のクランプ間で大きさが均一となり、三胚葉への分化効率が上昇した。
【0114】
図７Ｃに示すようなクランプが形成された後、実施例１と同様の方法で、クランプを内部表面がゼラチンでコートされたディッシュに播種し、細胞を継代培養した。クランプを内部表面がゼラチンでコートされたディッシュに播種してから２日目の細胞の写真を図１０Ａに、８日目の細胞の写真を図１０Ｂに示す。また、１回目の継代後の細胞の写真を図１１Ａに、２回目の継代後の細胞の写真を図１１Ｂに、３回目の継代後の細胞の写真を図１１Ｃに、４回目の継代後の細胞の写真を図１１Ｄに示す。継代が進むにつれて、細胞の形態が線維芽細胞の形態を示すようになった。また、１から４回目の継代後の細胞のそれぞれを、フローサイトメトリーで分析したところ、図１２に示すように、線維芽細胞のマーカーであるＣＤ１３の陽性率が上昇していた。
【0115】
（比較例２）
バイオリアクターの攪拌装置の回転速度を速くし、ｉＰＳ細胞をＥＢ培地中で浮遊させ、ｉＰＳ細胞の少なくとも２０％未満がバイオリアクターの底面に接触するようにした以外は、実施例２と同様に、ｉＰＳ細胞を培養した。この場合、図１３に示すように、クランプがほぼ形成されなかった。
バイオリアクターの攪拌装置の回転速度を速くし、ｉＰＳ細胞をＥＢ培地中で浮遊させ、ｉＰＳ細胞の少なくとも２０％未満がバイオリアクターの底面に接触するようにした以外は、実施例２と同様に、ｉＰＳ細胞を培養した。この場合、図１３に示すように、クランプがほぼ形成されなかった。
【0116】
（実施例３）
ヒトの対象１とヒトの対象２から皮膚細胞を採取し、それぞれからｉＰＳ細胞を誘導した。さらに、実施例２と同様の方法により、ヒトの対象１由来のｉＰＳ細胞から線維芽細胞を誘導し、ヒトの対象２由来のｉＰＳ細胞から線維芽細胞を誘導した。ヒトの対象１由来の誘導線維芽細胞にビタミンＣ、レチノール、及びｉＰＳ細胞培地の上清をそれぞれ添加したところ、図１４Ａに示すように、添加しなかったコントロールと比較して、コラーゲンの産生量が増加した。また、ヒトの対象２由来の誘導線維芽細胞にビタミンＣ、レチノール、及びｉＰＳ細胞培地の上清をそれぞれ添加したところ、図１４Ｂに示すように、添加しなかったコントロールと比較して、コラーゲンの産生量が増加した。しかし、図１４Ａと図１４Ｂを比較すると、ヒトの対象１由来の誘導線維芽細胞では、ビタミンＣが最もコラーゲンの産生量の増加に有効であったが、ヒトの対象２由来の誘導線維芽細胞では、ｉＰＳ細胞培地が最もコラーゲンの産生量の増加に有効であった。この結果は、ヒトの対象１に提供される化粧品にはビタミンＣを添加することが好ましく、ヒトの対象２に提供される化粧品にはｉＰＳ細胞培地を添加することが好ましいことを示している。
ヒトの対象１とヒトの対象２から皮膚細胞を採取し、それぞれからｉＰＳ細胞を誘導した。さらに、実施例２と同様の方法により、ヒトの対象１由来のｉＰＳ細胞から線維芽細胞を誘導し、ヒトの対象２由来のｉＰＳ細胞から線維芽細胞を誘導した。ヒトの対象１由来の誘導線維芽細胞にビタミンＣ、レチノール、及びｉＰＳ細胞培地の上清をそれぞれ添加したところ、図１４Ａに示すように、添加しなかったコントロールと比較して、コラーゲンの産生量が増加した。また、ヒトの対象２由来の誘導線維芽細胞にビタミンＣ、レチノール、及びｉＰＳ細胞培地の上清をそれぞれ添加したところ、図１４Ｂに示すように、添加しなかったコントロールと比較して、コラーゲンの産生量が増加した。しかし、図１４Ａと図１４Ｂを比較すると、ヒトの対象１由来の誘導線維芽細胞では、ビタミンＣが最もコラーゲンの産生量の増加に有効であったが、ヒトの対象２由来の誘導線維芽細胞では、ｉＰＳ細胞培地が最もコラーゲンの産生量の増加に有効であった。この結果は、ヒトの対象１に提供される化粧品にはビタミンＣを添加することが好ましく、ヒトの対象２に提供される化粧品にはｉＰＳ細胞培地を添加することが好ましいことを示している。
【0117】
また、それぞれ防腐剤であるフェノキシエタノール、パラベン、ベンザルコニウムクロリド、及びサリチル酸ナトリウムを用意した。ヒトの対象１由来の誘導線維芽細胞に、フェノキシエタノール、パラベン、ベンザルコニウムクロリド、及びサリチル酸ナトリウムをそれぞれ添加したところ、図１５Ａに示すように、フェノキシエタノールを添加された細胞の生存率が最も高かった。ヒトの対象２由来の誘導線維芽細胞に、フェノキシエタノール、パラベン、ベンザルコニウムクロリド、及びサリチル酸ナトリウムをそれぞれ添加したところ、図１５Ｂに示すように、サリチル酸ナトリウムを添加された細胞の生存率が最も高かった。この結果は、ヒトの対象１に提供される化粧品にはフェノキシエタノールを添加することが好ましく、ヒトの対象２に提供される化粧品にはサリチル酸ナトリウムを添加することが好ましいことを示している。
【符号の説明】
【0118】
３００・・・ＣＰＵ、３０１・・・データ取得部、３０２・・・評価部、３０３・・・決定部
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
