特開 2024-138361 線維化疾患の治療に関連する標的及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024138361

(43)【公開日】2024-10-08

(54)【発明の名称】線維化疾患の治療に関連する標的及びその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 48/00 20060101AFI20241001BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20241001BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241001BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20241001BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20241001BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20241001BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20241001BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20241001BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20241001BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241001BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20241001BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20241001BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241001BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241001BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241001BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241001BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241001BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241001BHJP

   A01K 67/0278 20240101ALI20241001BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20241001BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20241001BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20241001BHJP

【ＦＩ】

A61K48/00

A61P25/00 ZNA

A61P43/00 111

A61P11/00

A61P1/16

A61P9/00

A61P13/12

A61P7/00

A61P17/00

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K38/16

C07K16/28

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A01K67/0278

C12Q1/02

A61K38/17

A61K45/00

A61P25/00

【審査請求】有

【請求項の数】10

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024108679

(22)【出願日】2024-07-05

(62)【分割の表示】P 2022545034の分割

【原出願日】2021-01-25

(31)【優先権主張番号】202010076729.2

(32)【優先日】2020-01-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】202011212639.8

(32)【優先日】2020-11-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(71)【出願人】

【識別番号】522293490

【氏名又は名称】シャンハイ シンヴィダ バイオテクノロジー カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110004381

【氏名又は名称】弁理士法人ＩＴＯＨ

(72)【発明者】

【氏名】リウ，ジュンリン

(72)【発明者】

【氏名】ファン，シュエメイ

(72)【発明者】

【氏名】ゴン，ヤン

(72)【発明者】

【氏名】リ，リン

(57)【要約】

【課題】
本発明が解決した課題は、Ｐｅａｒ１、及びヒトＰｅａｒ１に関連する疾患の治療薬における線維化疾患の標的としてのその使用である。
【解決手段】
本発明は、Ｐｅａｒ１、及びヒトＰｅａｒ１に関連する疾患の治療薬における線維化疾患の標的としてのその使用である。Ｐｅａｒ１を標的とする抗体又はその変異体、あるいはそれを含む組成物及びその使用も開示した。本発明は、ヒト化Ｐｅａｒ１トランスジェニックマウスモデル及びその構築方法と使用を開示した。本発明の技術的方案は、線維芽細胞の活性化を調節することができ、線維化疾患及びそれに伴う拘束性疾患の治療において幅広い応用が期待される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

１）線維化疾患を治療する薬剤の調製、２）線維芽細胞活性化シグナル伝達経路をダウンレギュレート及び／又は阻害する薬剤の調製、及び／又は３）線維芽細胞活性化を阻害する薬剤の調製における、Ｐｅａｒ１遺伝子、それによってコードされるタンパク質、又はそのアゴニストの使用。

【請求項2】

前記線維化疾患が、肺線維症、肝線維症、心線維症、腎線維症、骨髄線維症、皮膚瘢痕及び／又は軟部組織線維症を含むことを特徴とする、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む；前記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８に示される；前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４５、ＧＡＴ、配列番号４６に示され、あるいは、前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４７、ＧＴＳ、配列番号４８に示され、あるいは、前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４９、ＤＴＳ、配列番号５０に示され、あるいは、前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５１、ＧＡＴ、配列番号５２に示され、あるいは、前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５３、ＬＶＳ、配列番号５４に示されることを特徴とする、Ｐｅａｒ１を標的とする単離された抗体又はその変異体。

【請求項4】

請求項３に記載の抗体又はその変異体をコードする単離された核酸。

【請求項5】

請求項４に記載の単離された核酸を含む組換え発現ベクター。

【請求項6】

請求項４に記載の単離された核酸又は請求項５に記載の組換え発現ベクターを含む形質転換体。

【請求項7】

請求項３に記載の抗体又はその変異体を含む医薬品。

【請求項8】

１）線維化疾患を治療する薬剤の調製、２）線維芽細胞活性化シグナル伝達経路をダウンレギュレート及び／又は阻害する薬剤の調製、及び／又は３）線維芽細胞活性化を阻害する薬剤の調製における、請求項３に記載の抗体又はその変異体、請求項４に記載の核酸、請求項５に記載の組換え発現ベクター、請求項６に記載の形質転換体及び／又は請求項７に記載の医薬品の使用。

【請求項9】

ヒトＰｅａｒ１遺伝子で動物Ｐｅａｒ１遺伝子を置き換えることを含むことを特徴とする、ヒト化Ｐｅａｒ１トランスジェニック動物モデルを構築する方法。

【請求項10】

（１）試験群及び対照群の線維芽細胞の培養系に、候補分子をそれぞれ添加する、又は添加しない工程と；（２）試験群及び対照群の線維芽細胞の活性化状況を比較する工程と；（３）試験群の線維芽細胞の活性化が対照群よりも著しく低い場合、当該候補分子がＰｅａｒ１アゴニストであると判断する工程と、を含むことを特徴とする、Ｐｅａｒ１アゴニストをスクリーニングする方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、出願日が２０２０年１月２３日の中国特許出願２０２０１００７６７２９．２及び出願日が２０２０年１１月３日の中国特許出願２０２０１１２１２６３９．８に基づく優先権を主張する。本出願は、上記中国特許出願の全文を引用する。

【背景技術】

【0002】

臓器や組織の損傷はいずれも、細胞や分子の複雑な反応を引き起こし、最終的に組織の線維化に至る。このような組織線維化反応は、短期的に適応的な組織修復特性を持つ場合もあるが、長期的に線維化が進行すると、臓器や組織の瘢痕が生じ、最終的に組織細胞の機能障害や臓器不全に至る。皮膚、肺、肝臓、心臓、腎臓、膵臓、脾臓、神経系、骨髄などの人体のほとんどの臓器や組織において、既知又は未知の理由により線維化は発生し、人間の健康に深刻な脅威を与える可能性があり、その主要な病理学的変化は、臓器や組織における線維性結合組織の増加と実質細胞の減少であり、引き続き進行すると、臓器の構造破壊や機能低下、ひいては不全に繋がり、人間の健康や生命に深刻な脅威を与える。世界的に見れば、組織線維化は多くの疾患において障害や死亡の要因となっており、様々な疾患による患者の死亡の４５％近くは、組織線維増生疾患に起因すると言える。これらの臓器における線維化の主要なメカニズムは、線維芽細胞の増殖と大量の細胞外マトリックスの蓄積によるもので、炎症性損傷や組織構造の破壊を伴うことを主要な特徴としている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

しかし、線維芽細胞とその細胞外マトリックスによる正常組織の構造的・機能的な破壊に臨み、現在でこれを予防・回復する有効な薬剤はまだなく、線維化疾患の発症・進行・悪化を改善して元の組織・臓器の正常な機能を回復させる薬剤の開発が切望されている。

【課題を解決するための手段】

【0004】

本発明は、線維化疾患の発症・進行・悪化を改善して元の組織・臓器の正常な機能を回復させることができる薬剤が欠けているという先行技術の欠陥に鑑み、線維化疾患の治療に関連する標的であるＰｅａｒ１及びその使用、特にＰｅａｒ１を標的とする線維化関連疾患治療用抗体を提供する。

【0005】

本発明の第一の様態は、１）線維化疾患を治療する薬剤の調製、２）線維芽細胞活性化シグナル伝達経路をダウンレギュレート及び／又は阻害する薬剤の調製、及び／又は３）線維芽細胞の活性化を阻害する薬剤の調製における、Ｐｅａｒ１（Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １、血小板内皮凝集受容体１）遺伝子、タンパク質又はそのアゴニストの使用を提供する。

【0006】

もう一つの実施形態において、前記線維化疾患は、肺線維症、肝線維症、心線維症、腎線維症、骨髄線維症、皮膚瘢痕及び／又は軟部組織線維症を含む。
もう一つの実施形態において、前記肺線維症は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）である。好ましくは、前記肺線維症は、肺線維症に伴う拘束性肺疾患をさらに含む。
もう一つの実施形態において、前記心線維症は、心筋線維症、特に心筋梗塞後の心筋線維症である。
もう一つの実施形態において、前記皮膚線維症は、外傷性要因により、皮膚や軟部組織において正常な組織細胞が線維芽細胞に置き換わる疾患を含む。
もう一つの実施形態において、前記外傷性要因は、外傷、火傷、手術や美容整形による瘢痕、若しくはケロイド症の人の皮膚に形成したケロイド、強皮症などを含む。

【0007】

もう一つの実施形態において、前記アゴニストは、Ｐｅａｒ１タンパク質アゴニストである。
もう一つの実施形態において、前記アゴニストは、Ｐｅａｒ１の発現及び／又は活性を強化させる。
もう一つの実施形態において、前記アゴニストは、Ｐｅａｒ１を標的とする抗体又はその変異体、ＦｃεＲ１α、デキストラン硫酸、フコイダン又はそれらの組み合わせを含む。
もう一つの実施形態において、前記アゴニストは、Ｐｅａｒ１を標的とする抗体又はその変異体を含む。
もう一つの実施形態において、前記アゴニストは、本発明の第二の様態に記載の抗体又はその変異体である。

【0008】

もう一つの実施形態において、前記Ｐｅａｒ１は、Ｐｅａｒ１遺伝子及び／又はそれによってコードされるタンパク質を含む。
もう一つの実施形態において、前記Ｐｅａｒ１遺伝子又はそれによってコードされるタンパク質は、哺乳動物から由来する。
もう一つの実施形態において、前記Ｐｅａｒ１遺伝子又はそれによってコードされるタンパク質は、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、サル、ラクダ、アルパカ又はそれらの組み合わせから由来する。

【0009】

もう一つの実施形態において、前記Ｐｅａｒ１遺伝子又はそれによってコードされるタンパク質は、ヒト又はマウスから由来する。

【0010】

もう一つの実施形態において、前記線維芽細胞活性化シグナル伝達経路は、ＰＩ３ｋ／ａｋｔシグナル伝達経路、ＭＡＰＫシグナル伝達経路及び／又はＳｍａｄシグナル伝達経路を含む。

【0011】

本発明の第二の様態は、Ｐｅａｒ１を標的とする単離された抗体又はその変異体を提供し、前記抗体は、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む；前記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８に示される；前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４５、ＧＡＴ、配列番号４６に示され、あるいは、前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４７、ＧＴＳ、配列番号４８に示され、あるいは、前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４９、ＤＴＳ、配列番号５０に示され、あるいは、前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５１、ＧＡＴ、配列番号５２に示され、あるいは、前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５３、ＬＶＳ、配列番号５４に示される。

【0012】

もう一つの実施形態において、前記変異体は、前記抗体のＣＤＲ、ＦＲ又は完全長配列において、一つないし複数の、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個以下のアミノ酸残基が付加、欠失又は置換された配列である。

【0013】

もう一つの実施形態において、前記変異体は、Ｐｅａｒ１を標的として活性化する活性を有する又は実質的に有する。

【0014】

もう一つの実施形態において、前記変異体のＨＣＤＲ１では、配列番号２６に示されるアミノ酸配列の第三位におけるＳがＡ又はＴに突然変異され、第六位におけるＧがＤに突然変異され、及び／又は第八位におけるＰがＴ又はＹに突然変異された；及び／又は、前記変異体のＨＣＤＲ２では、配列番号２７に示されるアミノ酸配列の第三位におけるＰがＳ又はＧに突然変異され、第四位におけるＹがＮに突然変異され、及び／又は第八位におけるＴがＡに突然変異された；及び／又は、前記変異体のＨＣＤＲ３では、配列番号２８に示されるアミノ酸配列の第九位におけるＡがＤに突然変異され、及び／又は、第十位におけるＹがＦに突然変異された。

【0015】

もう一つの実施形態において、前記抗体又はその変異体のＨＣＤＲ１は、配列番号２６、３１、３３、３６及び配列番号３９に示されるアミノ酸配列からなる群れから選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含む；ＨＣＤＲ２は、配列番号２７、３０、３４、３７及び配列番号４０－４４に示されるアミノ酸配列からなる群れから選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含む；及び、ＨＣＤＲ３は、配列番号２８、２９、３２、３５及び配列番号３８に示されるアミノ酸配列からなる群れから選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含む；及び／又は、
前記抗体又はその変異体のＬＣＤＲ１は、配列番号４５、４７、４９、５１及び配列番号５３に示されるアミノ酸配列からなる群れから選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含む；ＬＣＤＲ２は、ＧＡＴ、ＳＡＳ、ＤＴＳ及びＬＶＳに示されるアミノ酸配列からなる群れから選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含む；及び、ＬＣＤＲ３は、配列番号４６、４８、５０、５２及び配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなる群れから選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含む。
もう一つの実施形態において、前記抗体又はその変異体のＨＦＲ（重鎖可変領域フレームワーク領域）１は、配列番号１１４、１１５及び配列番号１１６に示されるアミノ酸配列からなる群れから選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含む；ＨＦＲ２は、配列番号１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４及び配列番号１２５に示されるアミノ酸配列からなる群れから選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含む；及び、ＨＦＲ３は、配列番号１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４及び配列番号１３５に示されるアミノ酸配列からなる群れから選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含む；及び、ＨＦＲ４は、配列番号１３６及び配列番号１３７に示されるアミノ酸配列からなる群れから選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含む；及び／又は、
もう一つの実施形態において、前記抗体又はその変異体のＬＦＲ（軽鎖可変領域フレームワーク領域）１は、配列番号１３８、１３９、１４０、１４１、１４２及び配列番号１４３に示されるアミノ酸配列からなる群れから選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含む；ＬＦＲ２は、配列番号１４４、１４５、１４６、１４７、１４８及び配列番号１４９に示されるアミノ酸配列からなる群れから選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含む；及び、ＬＦＲ３は、配列番号１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６及び配列番号１５７に示されるアミノ酸配列からなる群れから選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含む；及び、ＬＦＲ４は、配列番号１５８、１５９、１６０、１６１及び配列番号１６２に示されるアミノ酸配列からなる群れから選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含む；及び／又は、
もう一つの実施形態において、前記抗体又はその変異体は、アミノ酸配列として、下記のものを含む：
配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号４５、ＧＡＴ、配列番号４６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号２６、配列番号２７、配列番号２９に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号４５、ＧＡＴ、配列番号４６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号２６、配列番号３０、配列番号２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号４７、ＧＴＳ、配列番号４８に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号２６、配列番号２７、配列番号２９に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号４９、ＤＴＳ、配列番号５０に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号２６、配列番号４０、配列番号２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号４９、ＧＡＴ、配列番号５４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号２６、配列番号４１、配列番号２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号４９、ＳＡＳ、配列番号５４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号２６、配列番号４２、配列番号２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号４９、ＬＶＳ、配列番号５２に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号２６、配列番号４３、配列番号３２に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号４５、ＧＡＴ、配列番号５４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号３１、配列番号２７、配列番号３２に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号５１、ＧＡＴ、配列番号５２に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号３１、配列番号３７、配列番号３２に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号５３、ＬＶＳ、配列番号４６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号３１、配列番号３４、配列番号３２に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号４５、ＳＡＳ、配列番号５０に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号３１、配列番号３０、配列番号３５に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号４７、ＧＡＴ、配列番号５０に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号３１、配列番号４２、配列番号２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号４９、ＤＴＳ、配列番号５４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号４５、ＧＡＴ、配列番号４６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号３３、配列番号３７、配列番号３２に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号５３、ＬＶＳ、配列番号４６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号３３、配列番号３０、配列番号３５に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号４７、ＧＡＴ、配列番号５０に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号３３、配列番号４２、配列番号２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号４９、ＤＴＳ、配列番号５４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号５３、ＬＶＳ、配列番号５４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号３６、配列番号３４、配列番号３２に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号４５、ＳＡＳ、配列番号５０に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号３６、配列番号３０、配列番号３５に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号４７、ＧＡＴ、配列番号５０に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号３６、配列番号４２、配列番号２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号４９、ＤＴＳ、配列番号５４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号３９、配列番号２７、配列番号２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号４５、ＧＡＴ、配列番号４６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号３９、配列番号３２に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号４５、ＳＡＳ、配列番号５０に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号３９、配列番号３０、配列番号３５に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号４７、ＧＡＴ、配列番号５０に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号３９、配列番号４２、配列番号２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号４９、ＤＴＳ、配列番号５４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号３９、配列番号３７、配列番号２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号４９、ＧＡＴ、配列番号４８に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号３９、配列番号４０、配列番号２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号４５、ＧＡＴ、配列番号４６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号３９、配列番号４１、配列番号２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号４５、ＧＡＴ、配列番号４６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号３９、配列番号４２、配列番号２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号４５、ＧＡＴ、配列番号４６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号３９、配列番号４３、配列番号２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号４５、ＧＡＴ、配列番号４６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは、
配列番号３９、配列番号４４、配列番号２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、配列番号４５、ＧＡＴ、配列番号４６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３。

【0016】

もう一つの実施形態において、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１６及び配列番号１に示される；あるいは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１６及び配列番号２に示される；あるいは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１７及び配列番号３に示される；あるいは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１８及び配列番号２に示される；あるいは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９及び配列番号４に示される；あるいは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２０及び配列番号５に示される；あるいは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２１及び配列番号６に示される；あるいは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２２及び配列番号７に示される；あるいは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２３及び配列番号７に示される；あるいは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２４及び配列番号７に示される；あるいは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２５及び配列番号７に示される；あるいは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２２及び配列番号８に示される；あるいは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２３及び配列番号８に示される；あるいは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２４及び配列番号８に示される；あるいは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２５及び配列番号８に示される；あるいは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２２及び配列番号９に示される；あるいは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２３及び配列番号９に示される；あるいは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２４及び配列番号９に示される；あるいは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２５及び配列番号９に示される；あるいは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２２及び配列番号１０に示される；あるいは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２３及び配列番号１０に示される；あるいは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２４及び配列番号１０に示される；あるいは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２５及び配列番号１０に示される；あるいは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２２及び配列番号１１に示される；あるいは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２２及び配列番号１２に示される；あるいは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２２及び配列番号１３に示される；あるいは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２２及び配列番号１４に示される；あるいは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２２及び配列番号１５に示される。

【0017】

もう一つの実施形態において、前記変異体は、前記抗体のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。
もう一つの実施形態において、前記抗体は、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ（例えばｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、多重特異性抗体、又は単一ドメイン抗体、あるいは前記抗体から調製されるモノクロナール抗体又はポリクロナール抗体である。
もう一つの実施形態において、前記抗体又はその変異体は、完全長抗体であり、前記完全長抗体の重鎖定常領域は、ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３若しくはｈＩｇＧ４の重鎖定常領域あるいはそれらから誘導される配列からなる群れから選ばれる。

【0018】

もう一つの実施形態において、前記抗体の軽鎖定常領域は、κ鎖又はλ鎖あるいはそれらから誘導される配列からなる群れから選ばれる。

【0019】

もう一つの実施形態において、前記重鎖定常領域から誘導される配列は、前記ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３若しくはｈＩｇＧ４の重鎖定常領域において、一つないし複数の、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個以下のアミノ酸残基が付加、欠失又は置換された配列である。
もう一つの実施形態において、前記重鎖定常領域から誘導される配列は、ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３若しくはｈＩｇＧ４の重鎖定常領域と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。
もう一つの実施形態において、前記完全長抗体の重鎖定常領域は、ｈＩｇＧ３若しくはｈＩｇＧ４の重鎖定常領域あるいはそれらから誘導される配列である。
もう一つの実施形態において、前記の誘導される配列は、ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３若しくはｈＩｇＧ４の重鎖定常領域において、１～２個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列である。
もう一つの実施形態において、前記の誘導される配列は、ｈＩｇＧ４のＳ２２８Ｐ突然変異体である。
もう一つの実施形態において、前記軽鎖定常領域は、ヒトκ鎖である。

【0020】

本発明の第三の様態は、本発明の第二の様態のいずれか一項に記載の抗体又はその変異体をコードする単離された核酸を提供する。

【0021】

本発明の第四の様態は、本発明の第三の様態に記載の単離された核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。

【0022】

本発明の第五の様態は、本発明の第三の様態に記載の単離された核酸又は本発明の第四の様態に記載の組換え発現ベクターを含む形質転換体を提供する。
もう一つの実施形態において、前記形質転換体の宿主は、原核細胞又は真核細胞である。
もう一つの実施形態において、前記原核細胞は、大腸菌を含む。
もう一つの実施形態において、前記真核細胞は、酵母、例えば出芽酵母、ピキア酵母、アスペルギルスやトリコデルマ、又はそれらの組み合わせを含む。

【0023】

本発明の第六の様態は、本発明の第二の様態に記載の抗体又はその変異体を含む医薬品を提供する。
もう一つの実施形態において、前記医薬品は、医薬組成物である。
もう一つの実施形態において、前記医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
もう一つの実施形態において、前記医薬組成物は、一又はそれ以上のＰｅａｒ１アゴニストを含む。
もう一つの実施形態において、前記医薬組成物は、Ｐｅａｒ１アゴニストとして、ＦｃεＲ１α、デキストラン硫酸、フコイダン、アプタマー及び小分子化合物から選ばれる一又はそれ以上をさらに含む；より好ましくは、ＦｃεＲ１α、デキストラン硫酸及びフコイダンを含む。

【0024】

もう一つの実施形態において、前記医薬組成物は、前記のＰｅａｒ１を標的とする抗体を含み、抗体は、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ（例えばｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、多重特異性抗体、単一ドメイン抗体、あるいは前記抗体から調製されるモノクロナール抗体又はポリクロナール抗体を含み、好ましくは、ＦｃεＲ１α、デキストラン硫酸、フコイダン、アプタマー又は小分子化合物をさらに含む；あるいは、前記医薬組成物は、前記のＰｅａｒ１を標的とする抗体を含み、抗体は、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ（例えばｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、多重特異性抗体、単一ドメイン抗体、あるいは前記抗体から調製されるモノクロナール抗体又はポリクロナール抗体を含み、好ましくは、ＦｃεＲ１α、デキストラン硫酸、フコイダン、アプタマー及び／又は小分子化合物をさらに含む。より好ましくは、ＦｃεＲ１α、デキストラン硫酸及びフコイダンを投与することを含む。

【0025】

本発明の第七の様態は、１）線維化疾患を治療する薬剤の調製、２）線維芽細胞活性化シグナル伝達経路をダウンレギュレート及び／又は阻害する薬剤の調製、及び／又は３）線維芽細胞活性化を阻害する薬剤の調製における、本発明の第二の様態のいずれか一項に記載の抗体又はその変異体、本発明の第五の様態に記載の形質転換体、又は本発明の第六の様態に記載の医薬品の使用を提供する。

【0026】

もう一つの実施形態において、前記線維化疾患は、肺線維症、肝線維症、心線維症、腎線維症、骨髄線維症、皮膚瘢痕及び／又は軟部組織線維症を含む。
もう一つの実施形態において、前記肺線維症は、肺線維症に伴う拘束性肺疾患をさらに含む。
もう一つの実施形態において、前記皮膚線維症は、外傷性要因により、皮膚や軟部組織において、線維芽細胞が活性化されて瘢痕が発生する疾患、及び／又は正常な組織細胞が線維芽細胞に置き換わる疾患を含む。

【0027】

もう一つの実施形態において、前記の要因は、感染、外傷、薬剤、放射線、異物、免疫亢進から選ばれる一又はそれ以上を含む。

【0028】

本発明の第八の様態は、Ｐｅａｒ１遺伝子、その発現産物又はそのアゴニストを培養されている線維芽細胞に転化することで、線維芽細胞活性化を阻害する工程を含む、インビトロで線維芽細胞活性化を非治療的に阻害する方法を提供する。
もう一つの実施形態において、前記線維芽細胞活性化は、線維芽細胞が上皮間葉転換を起こし、正常な組織細胞を置き換えることを含む。
もう一つの実施形態において、前記Ｐｅａｒ１遺伝子、その発現産物又はそのアゴニストの濃度は、０．００１ｎＭ～１Ｍである。

【0029】

本発明の第九の様態は、その必要のある個体又は対象に、本発明の第二の様態に記載の抗体又はその変異体、本発明の第六の様態に記載の医薬品を投与することを含む、線維化疾患を治療する方法を提供する。

【0030】

もう一つの実施形態において、本発明は、１）線維化疾患を治療すること、２）線維芽細胞活性化シグナル伝達経路をダウンレギュレート及び／又は阻害すること、及び／又は３）線維芽細胞活性化を阻害することにおける、本発明の第二の様態のいずれか一項に記載の抗体又はその変異体、本発明の第五の様態に記載の形質転換体、又は本発明の第六の様態に記載の医薬品の使用を提供する。
もう一つの実施形態において、前記のその必要のある個体又は対象は、線維化疾患が既に発症した個体又は対象を含む。
もう一つの実施形態において、前記のその必要のある個体又は対象は、あらゆる原因によって引き起こされる肺炎、肝炎、腎炎、心筋梗塞、手術及び／又はの外傷を経験している又は経験した個体又は対象を含む。

【0031】

もう一つの実施形態において、前記投与される製剤は、吸入投与製剤、局所投与製剤、胃腸外投与製剤又はそれらの組み合わせを含む。
もう一つの実施形態において、前記吸入投与製剤は、エアゾル、スプレー、点鼻剤、粉末剤又はそれらの組み合わせを含む。
もう一つの実施形態において、前記胃腸外投与製剤は、点滴剤、ゲル、エマルジョン、クリーム、パッチ、フィルム、注射剤又はそれらの組み合わせを含む。
もう一つの実施形態において、前記胃腸外投与は、局所塗布、滴下、注射又はそれらの組み合わせ、例えば皮下注射を含む。

【0032】

本発明の第十の様態は、ヒトＰｅａｒ１遺伝子で動物Ｐｅａｒ１遺伝子を置き換えることを含む、ヒト化Ｐｅａｒ１トランスジェニック動物モデルを構築する方法を提供する。

【0033】

もう一つの実施形態において、前記方法は、（ｉ）動物Ｐｅａｒ１遺伝子のエクソンを選択する工程と；（ｉｉ）動物Ｐｅａｒ１遺伝子のエクソンで、相同組換えにより、動物Ｐｅａｒ１遺伝子をヒトＰｅａｒ１遺伝子に置き換える工程と、を含む。
もう一つの実施形態において、前記動物は、非ヒト哺乳動物である。
もう一つの実施形態において、前記動物は、マウス、ラット、ネコ、イヌ、サル、ラクダ、アルパカ又はそれらの組み合わせである。
もう一つの実施形態において、前記Ｐｅａｒ１遺伝子のエクソンは、マウスＰｅａｒ１遺伝子のエクソン４～６である。

【0034】

もう一つの実施形態において、工程（ｉ）は、マウスコーディング領域のエクソン１－ＡＴＧ付近に標的部位を設計し、相同組換えテンプレートの存在下でマウスＰｅａｒ１遺伝子をヒトＰｅａｒ１ ｃＤＮＡに置き換えることを含む。

【0035】

もう一つの実施形態において、ヒトＰｅａｒ１ ｃＤＮＡの後ろにＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ転写終了シグナルを付加することで、マウスＰｅａｒ１の全転写物を完全にヒトＰｅａｒ１ ｃＤＮＡに置き換える；ヒトＰｅａｒ１遺伝子をマウスＰｅａｒ１遺伝子のプロモーターの制御下に配置することで、ヒトＰｅａｒ１遺伝子をマウスの各組織や臓器で正常に発現させる。

【0036】

好ましくは、前記方法はさらに、（ｉｉｉ）ヒト化マウスが成功に構築されたか否かを判断する工程を含む：プライマーによりヒトＰｅａｒ１遺伝子を増幅し、ヒトＰｅａｒ１遺伝子が増幅できる場合、構築が成功したと判断する；より好ましくは、前記プライマーは、配列番号１１０～１１３に示される。

【0037】

本発明の第十一の様態は、前記方法によって構築されたヒト化Ｐｅａｒ１トランスジェニックマウスモデルをさらに提供する。
本発明の第十二の様態は、ヒトＰｅａｒ１に関連する疾患を治療する薬剤のスクリーニング／評価における、本発明の第十一の様態に記載のヒト化Ｐｅａｒ１トランスジェニックマウスモデルの使用を提供する。
本発明の第十三の様態は、ヒトＰｅａｒ１に対する薬剤の治療効果評価用の動物モデルとしての、本発明の第十一の様態に記載のヒト化Ｐｅａｒ１トランスジェニックマウスモデルの使用をさらに提供する。

【0038】

本発明の第十四の様態は、（１）試験群及び対照群の線維芽細胞の培養系に、候補分子をそれぞれ添加する、又は添加しない工程と；（２）試験群及び対照群の線維芽細胞の活性化状況を比較する工程と；（３）試験群の線維芽細胞の活性化が対照群よりも著しく低い場合、当該候補分子がＰｅａｒ１アゴニストであると判断する工程と、を含む、Ｐｅａｒ１アゴニストをスクリーニングする方法を提供する。

【0039】

もう一つの実施形態において、前記線維芽細胞の活性化とは、対照群における線維芽細胞の量（Ａ０）に対する試験群における上皮間葉転換を起こした線維芽細胞の量（Ａ１）の比率は、少なくとも１．２を超え、又は少なくとも１．５を超え、又は少なくとも２．０～１０．０を超えることを意味する。
もう一つの実施形態において、前記線維芽細胞の活性化とは、対照群における線維芽細胞の細胞外マトリックスの量（Ｅ０）に対する試験群における線維芽細胞が産生した細胞外マトリックスの量（Ｅ１）の比率は、少なくとも１．２を超え、又は少なくとも１．５を超え、又は少なくとも２．０～１０．０を超えることを意味する。

【0040】

本発明の第十五の様態は、（１）本発明の第十一の様態に記載のヒト化Ｐｅａｒ１トランスジェニック動物モデル、又は本発明の第十の様態に記載の方法によって得られるヒト化Ｐｅａｒ１トランスジェニック動物モデルを得る工程と；（２）工程（１）における前記動物において、線維化疾患の症状の発生を誘発する工程と；（３）工程（２）における前記動物に、候補分子を投与する工程と；（４）前記動物の線維化疾患の改善度を観察することで、前記分子がＰｅａｒ１を標的として線維化疾患を治療するための候補薬剤であるか否かを判断する工程と、を含む、Ｐｅａｒ１を標的として線維化疾患を治療するための候補薬剤をスクリーニングする方法を提供する。
もう一つの実施形態において、前記動物は、非ヒト哺乳動物である。
もう一つの実施形態において、前記工程（２）と（３）は、互換しても良い。
もう一つの実施形態において、前記誘発は、薬剤による誘発、化学的な誘発、放射線による誘発から選ばれる一又はそれ以上を含む。
もう一つの実施形態において、前記誘発は、ブレオマイシンによる誘発である。本発明は、Ｐｅａｒ１を標的とする抗体、抗体（Ｆａｂ）_２及びＦａｂフラグメント、ＦｃεＲ１α、デキストラン硫酸、フコイダン、アプタマー又は小分子化合物を提供する。

【0041】

本発明は、Ｐｅａｒ１を標的とする抗体、抗体（Ｆａｂ）_２及びＦａｂフラグメント、ＦｃεＲ１α、デキストラン硫酸、フコイダン、アプタマー又は小分子化合物を含む医薬組成物を提供する。
本発明は、線維芽細胞活性化の阻害、肺線維症や肺線維症に伴う拘束性肺疾患など及びその他の線維化関連疾患の治療、損傷修復及び／又は創傷治癒の促進におけるＰｅａｒ１標的の使用を提供する。
本発明は、線維芽細胞活性化の阻害、肺線維症や肺線維症に伴う拘束性肺疾患など及びその他の線維化関連疾患の治療、損傷修復及び／又は創傷治癒の促進における、Ｐｅａｒ１を標的とする抗体、抗体（Ｆａｂ）_２及びＦａｂフラグメント、ＦｃεＲ１α、デキストラン硫酸、フコイダン、アプタマー又は小分子化合物の使用を提供する。
本発明は、Ｐｅａｒ１を標的として線維芽細胞活性化を阻害し、肺線維症や肺線維症に伴う拘束性肺疾患など及びその他の線維化関連疾患を治療し、損傷修復及び／又は創傷治癒を促進する方法であって、その必要のある個体に、Ｐｅａｒ１を標的とする抗体、抗体（Ｆａｂ）_２及びＦａｂフラグメント、ＦｃεＲ１α、デキストラン硫酸、フコイダン、アプタマー又は小分子化合物を投与することを含む方法を提供する。
もう一つの実施形態において、前記投与は、吸入投与、肺部へのエアゾル投与、局所注射、経皮吸収、皮下注射、局所塗布を含む。

【0042】

本発明の範囲内であれば、本発明の上記各技術的特徴及び以下（例えば実施例）で具体的に開示される各技術的特徴は、互いに組み合わせて、新たな又は好ましい技術方案を構成してもよいことは理解されるべきである。ここでは便宜上、詳細な陳述を省略する。

【図面の簡単な説明】

【0043】

【図1】Ｐｅａｒ１遺伝子欠損は、老齢マウスに肺機能低下を誘発する。ａ、Ｐｅａｒ１遺伝子ノックアウトマウスの構築策略。ｂ、Ｐｅａｒ１の発現レベルを検出するためのイムノブロッティングアッセイの結果から分かるように、Ｐｅａｒ１遺伝子ノックアウトマウスではＰｅａｒ１タンパク質が完全に欠失している。ｃ、Ｐｅａｒ１遺伝子欠損は老齢マウスにおいて、努力性肺活量（ＦＶＣ）と０．１秒間の努力性呼気量（ＦＥＶ０．１）の減少を誘発する。ｄ、Ｐｅａｒ１遺伝子欠損は、マウスの肺部において、明らかにコラーゲン成分を蓄積させる。

【図2】Ｐｅａｒ１遺伝子欠損は、ブレオマイシンによって誘発されるマウス肺線維症を悪化させる。ａ、Ｐｅａｒ１遺伝子欠損は、ブレオマイシンによって誘発されるマウスの死亡率を悪化させる。ｂ、Ｐｅａｒ１遺伝子欠損は、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ、Ｂｌｅｏ）によって誘発されるマウスの体重減少を悪化させる。ｃ、Ｐｅａｒ１遺伝子欠損は、ブレオマイシンによって誘発されるマウスにおいて、明らかに努力性肺活量と０．１秒間の努力性呼気量の減少を悪化させる。ｄ、Ｐｅａｒ１遺伝子欠損は、ブレオマイシンによって誘発されるマウスの肺部において、明らかにコラーゲン成分の蓄積を悪化させる。

【図3】Ｐｅａｒ１は、線維芽細胞の上皮間葉転換（ＥＭＴ、Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）の過程を介して、線維芽細胞の活性化と細胞外マトリックスの合成を制御する。ａ、Ｐｅａｒ１遺伝子欠損は、ブレオマイシンによって誘発されるマウスにおいて、明らかに肺線維芽細胞（ＣＤ１４０ａ＋）の割合が増加し且つ上皮細胞（ＣＤ３２６＋）の割合が低減するように影響するが、Ｃｄ４５＋細胞及び内皮細胞（ＣＤ３１＋）にはほとんど影響を与えない。ｂ、Ｐｅａｒ１は、インビトロで培養されるマウス肺線維芽細胞で顕著に発現している。ｃ、イムノブロッティングにより、肺線維芽細胞におけるＰｅａｒ１の発現は実証される。ｄ、ブレオマイシンによって誘発されるマウス肺線維芽細胞の遺伝子発現プロファイルのＲＮＡ－ｓｅｑ解析によれば、Ｐｅａｒ１欠損は、ブレオマイシンによって誘発されるマウス肺線維芽細胞の上皮間葉転換を顕著に促進する。ｅ、ＱＰＣＲにより、Ｐｅａｒ１欠損は、ブレオマイシンによって誘発されるマウス肺線維芽細胞による細胞外マトリックスタンパク質の合成を顕著に促進することがさらに実証される。

【図4】Ｐｅａｒ１欠損は、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）受容体、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体、及び線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体に仲介される細胞内シグナル伝達を顕著に促進させる。Ｐｅａｒ１欠損は顕著に、ＴＧＦβ受容体に仲介されるＳｍａｄ２／３リン酸化とＥＲＫ１／２、ＪＮＫ、Ｐ３８リン酸化を促進させる；ＰＤＧＦ受容体に仲介されるＥＲＫ１／２、ＪＮＫ、Ｐ３８リン酸化とＡｋｔリン酸化を促進させる；ＦＧＦ受容体に仲介されるＥＲＫ１／２、ＪＮＫ、Ｐ３８リン酸化とＡｋｔリン酸化を促進させる。

【図5】Ｐｅａｒ１活性化は、線維芽細胞による細胞外マトリックスタンパク質の発現を阻害する。ＦｃεＲ１α、デキストラン硫酸、フコイダンはいずれも、ヒト肺線維芽細胞の細胞外マトリックス遺伝子ペリオスチン（Ｐｏｓｔｎ）、Ｃｏｌ５ａ３及びＴｉｍｐ１の発現を阻害できる。

【図6】抗ヒトＰｅａｒ１抗体のヒトＰｅａｒ１に対する親和性の比較。ＥＬＩＳＡプレートをヒトｐｅａｒ１ ＥＣＤタンパク質でコートし、異なる濃度（２０００ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／ｍｌ、６２．５ｎｇ／ｍｌ、３１．２５ｎｇ／ｍｌ、１５．６２５ｎｇ／ｍｌ、７．８１２５ｎｇ／ｍｌ、３．９０６２５ｎｇ／ｍｌ、１．９５３１２５ｎｇ／ｍｌ、０．９７６５６２５ｎｇ／ｍｌ）で抗体をヒトｐｅａｒ１ ＥＣＤタンパク質と反応させ、ＯＤ値を測定し、抗原抗体結合のＥＣ５０値を得る。

【図7】抗ヒトＰｅａｒ１抗体は、ブレオマイシンによって誘発されるヒトＰｅａｒ１トランスジェニックマウスにおける肺線維化の過程を顕著に改善する。ａ、Ｐｅａｒ１ヒト化トランスジェニックマウスの構築策略。ｂ、マウス肺線維芽細胞を調製して溶解し、イムノブロッティングによりマウスＰｅａｒ１及びヒトＰｅａｒ１の発現レベルを検出した実験結果により、Ｐｅａｒ１ヒト化トランスジェニックマウスが成功に構築されたことは実証される。

【図8】抗ヒトＰｅａｒ１モノクローナル抗体は、様々な組織から由来のヒト線維芽細胞による細胞外マトリックスタンパク質の発現を阻害する。ａ、ＬＦ２モノクローナル抗体は、ヒト腎線維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｋｉｄｎｅｙ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）による細胞外マトリックスタンパク質の発現を阻害する。ｂ、ＬＦ２モノクローナル抗体は、ヒト心臓線維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｃａｒｄｉａｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）による細胞外マトリックスタンパク質の発現を阻害する。ｃ、ＬＦ２モノクローナル抗体は、ヒト肝線維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）による細胞外マトリックスタンパク質の発現を阻害する。ｄ、ＬＦ２モノクローナル抗体は、ヒト皮膚線維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）による細胞外マトリックスタンパク質の発現を阻害する。

【発明を実施するための形態】

【0044】

本発明者らは、幅広く深く研究し、その結果としては、意外なことに、Ｐｅａｒ１遺伝子及びそのタンパク質が線維芽細胞に発現し、線維化疾患において重要な役割を果たすことを初めて発見した。具体的には、本発明者らが構築したＰｅａｒ１遺伝子ノックアウトマウスは、野生型と比較して、ブレオマイシンによって誘導されると、肺線維化症状が明らかに悪化し、肺機能が顕著に低下する；さらに、本発明者らは、Ｐｅａｒ１遺伝子欠損が線維芽細胞の上皮間葉転換及び線維芽細胞の細胞外マトリックス合成能を大きく促進し、正常な臓器や組織において過剰な結合組織状態（ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ）及び臓器線維化を引き起こすことを病理的に実証した。より重要なことに、本発明者らは、Ｐｅａｒ１を活性化することにより、線維芽細胞による細胞外マトリックス合成を阻害し、線維化の症状を軽減することができ、ひいては線維化を逆転できることを実証した。

【0045】

また、本発明者らは、線維化疾患関連シグナル伝達経路におけるＰｅａｒ１遺伝子の役割について検討し、Ｐｅａｒ１遺伝子欠損は、ＰＩ３ｋ／ａｋｔシグナル伝達経路、ＭＡＰＫシグナル伝達経路、及びＳｍａｄシグナル伝達経路から選ばれる一又はそれ以上を含む既知の線維化関連シグナル伝達経路をアップレギュレートすることができることから、Ｐｅａｒ１遺伝子欠損は、線維化関連シグナルのアップレギュレーションに繋がり、線維芽細胞の過剰活性化、細胞外マトリックスの放出、及び細胞マトリックスの生成／分解のバランスに重要な役割を果たすことを、実験により実証した。

【0046】

以上の研究により、本発明者らは、Ｐｅａｒ１を標的とする抗体をＰｅａｒ１アゴニストとして構築した。本発明にかかる抗体又はその変異体は、細胞学レベル及び動物学レベルで、明確なＰｅａｒ１活性化作用を有し、線維化疾患関連経路を調節し（特にＰＩ３ｋ／ａｋｔシグナル伝達経路、ＭＡＰＫシグナル伝達経路、及びＳｍａｄシグナル伝達経路から選ばれる一又はそれ以上をダウンレギュレートし）、優れた抗線維化作用を示すことを実証したと同時に、別の観点から線維化疾患におけるＰｅａｒ１の重要な役割を証明した。
それらに基づき、本発明を完成した。

【0047】

用語
本文に用いられるように、特に断らない限り、単数形の「一つ」、「一つの」及び「当該」は、複数の指示物を含む。
本文に用いられるように、用語の「実質的」は本文において、あらゆる定量的な比較、値、測定、若しくはその他の表現に起因する固有の不確実性を表す。用語の「実質的」は本文において、検討される主題の実質的な機能の変化を引き起こすことなく、定量的表現が記載された参照から変化し得る程度も表す。例えば、「Ｐｅａｒ１を標的として活性化する活性を実質的に有する」とは、前記抗体がＰｅａｒ１と相互作用し、例えばＰｅａｒ１タンパク質に結合し、且つ程度の差こそあれ、Ｐｅａｒ１を介して線維芽細胞活性化シグナル伝達経路を阻害できることを意味する。Ｐｅａｒ１及びそれと線維芽細胞活性化との関連性の教示に従って、当業者であれば、従来の技術的手段により、本発明のスクリーニングモデルを用いてＰｅａｒ１アゴニストを得ることができる。

【0048】

本文に用いられるように、用語の「抗体又はその変異体」とは、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子から由来のタンパク質、抗体フラグメント又はポリペプチド配列を意味する。抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル、多本鎖又は一本鎖、あるいは完全の免疫グロブリンであってもよく、天然由来又は遺伝子組換え由来のものであってもよい。一つの具体的な実施形態において、本発明にかかる「抗体又はその変異体」は、単離されたもので、且つ遺伝子組換え由来のものである。

【0049】

本文に用いられるように、用語の「抗体フラグメント」とは、抗原と特異的に（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布により）相互作用する能力を保留した抗体の少なくとも一部を意味する。抗体フラグメントの実例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＨとＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、線形抗体、単一ドメイン抗体、抗体フラグメント（例えば、ヒンジ領域でジスルフィド結合を介して接続した二つのＦａｂフラグメントの２価フラグメントを含む）から形成した多重特異性抗体、並びに抗体の単離されたＣＤＲ又はその他のエピトープ結合性フラグメントを含むが、それらに限定されない。抗原結合性フラグメントは、単一ドメイン抗体、最大抗体、マイクロ抗体、ナノ抗体、細胞内抗体、二重抗体、キメラ抗体に組み込むこともできる。

【0050】

本文に用いられるように、用語の「誘導配列」とは、元の抗体／タンパク質／ポリペプチド配列に対して、１つ又は複数（例えば１０つ以内）のアミノ酸が付加、欠失又は保存的置換された新規配列；及び／又は元の抗体／タンパク質／ポリペプチドの活性が変化する若しくは実質的に変化することなく、元の抗体／タンパク質／ポリペプチド配列が修飾された新規配列を意味する。保存的置換は通常、当業者に広く知られるものであり、例えば下記のものがある：

【0051】

【表1】

本文に用いられるように、用語の「核酸」又は「ポリヌクレオチド」とは、一本鎖又は二本鎖の形態のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）及びそれらのポリマーを意味する。特に断らない限り、特定の核酸配列には、その保存的修飾（例えば縮重コドン置換）された変異体、アレル、オーソログ、ＳＮＰと相補配列、及び明確的に指定された配列も非明示的に含まれる。

【0052】

本文に用いられるように、用語の「発現ベクター」又は「組換え発現ベクター」は、互換的に用いることができ、発現しようとするヌクレオチド配列と有効に連結する発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチド含有ベクターを意味する。発現ベクターは、発現のためのシスエレメントを十分に含んでいる；発現のための他のエレメントは、宿主細胞又はインビトロ発現系で提供されてもよい。発現ベクターは、組換えポリヌクレオチドが組み込まれたコスミド、プラスミド（例えば裸又はリポソームに内包されるもの）及びウイルス（例えばレンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）を含む、本分野で既知のものを全て含む。

【0053】

本文に用いられるように、用語の「シグナル伝達経路」又は「シグナル経路」は、互換的に用いることができ、細胞のある部分から別の部分へのシグナル伝達において役割を果たす複数のシグナル伝達分子の間の生化学的な関係を意味する。「細胞表面受容体」という言葉は、細胞膜を越えてシグナルを受信・伝達できる分子及び分子複合体を含む。

【0054】

本文に用いられるように、用語の「特異的に結合する」とは、サンプル中に存在するパートナー（例えばＰｅａｒ１）タンパク質を認識して結合するが、サンプルにおける他の分子を実質的に認識・結合しない抗体又はリガンドを意味する。

【0055】

本文に用いられるように、用語の「被験者」又は「対象」は、互換的に用いることができ、免疫応答を引き出すことができる生体（例えばマウス、ラット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ラクダ、サル、アルパカ又はヒトなどの哺乳動物）を含むように意味する。

【0056】

本文に用いられるように、用語の「有効量」、「安全有効量」又は「治療有効量」は、本文において互換的に用いることができ、本文に記載されるように、特定の生物学的結果を有効に実現し、且つ被験者に許容できる有害反応を有する物質、製剤、薬剤又は医薬組成物の量を意味する。例えば、当業者（例えば経験豊富な臨床医）であれば、被験者に応じて「安全有効量」を調整することができる。

【0057】

本文に用いられるように、用語の「標的として活性化する」とは、試験される分子が標的である遺伝子、タンパク質又はそれらの活性に活性化作用を有し、それによってそれらの発現又は活性をアップレギュレートできることを意味する。通常、「標的として活性化する」ことは、その遺伝子又はタンパク質の発現量、活性レベル、下流影響経路や分泌物質などの一又はそれ以上の手段によって測定することができる。
本文に用いられるように、用語の「治療」とは、一又はそれ以上の療法（例えばアゴニストや抗体又はその変異体などの一又はそれ以上の治療薬）の投与により、線維化疾患の進行、重篤度及び／又は継続期間が遅延又は改善されること、あるいは線維化疾患の一又はそれ以上の症状（好ましくは一又はそれ以上の識別可能な症状）が改善されることを意味する。

【0058】

範囲：
本開示を通じて、本発明の各様態はいずれ、範囲の形式を取ることができる。範囲の形式での記述は、便宜上及び簡潔上のためのものに過ぎず、本発明の範囲を変更不能に限定するものと見なすべきではないことを、理解すべきである。従って、範囲の記述は、全ての可能なサブ範囲及び当該範囲内の単独な数値を特別に開示したと見做すべきである。例えば、１～６のような範囲の記述は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などのサブ範囲、及び１、２、２．７、３、４、５、５．３、６のような当該範囲内の単独な数値を具体的に開示したと見做すべきである。別の実例として、９５～９９％の同一性などの範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する範囲を含み、且つ９６～９９％、９６～９８％、９６～９７％、９７～９９％、９７～９８％及び９８～９９％の同一性のようなサブ範囲を含む。これは、範囲の幅を問わずに適用される。

【0059】

線維化疾患
本文に用いられるように、用語の「線維化疾患」とは、正常な組織細胞が損傷を受け、組織又は臓器中の線維芽細胞が組織修復を開始して過剰に又は異常に活性化し、それによって線維芽細胞の上皮間葉転換や細胞外マトリックス合成の増加が引き起こされることで、正常組織が瘢痕組織に置き換わって正常組織の機能が失われる疾患を意味する。

【0060】

通常、線維芽細胞は様々な正常組織に広く分布しているため、正常組織の細胞が損傷を受けると、線維芽細胞の活性化、ひいては過剰な又は異常な活性化が引き起こされ、例えば、肺、肝臓、腎臓の炎症に伴って発生する著しい肺線維症、肝線維症及び腎線維症、あるいは手術や外傷などによる皮膚、筋肉又は結合組織の増殖性瘢痕、並びに心筋梗塞後の心筋線維症状、骨髄増殖性疾患に関連する骨髄線維症などが挙げられる。よって、「線維化疾患」とは、正常組織の損傷を修復するために、線維芽細胞が過剰に又は異常に活性化して残した、全身の臓器や組織に広がって元の臓器や組織の正常な機能を直接的に制限する「瘢痕」である。

【0061】

メカニズムからみて、線維化疾患は、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＦＢ）が傷口に移動し、及び／又は炎症性損傷と組織構造の破壊を伴う増殖と大量の細胞外マトリックスの蓄積を引き起こすことを特徴とするため、ＦＢは線維化疾患の過程で極めて重要な直接的役割を担っている。ＦＢは結合組織中の最も主要な細胞成分であり、胎芽期の間葉系細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌｌ）から分化されたものであるが、線維芽細胞もまた、成熟した静止状態での線維細胞（ｆｉｂｒｏｃｙｔｅ）としても存在し、線維芽細胞と線維細胞は一定の条件下で互いに転換することができる。また、文献の報告によると、ＦＢは線維化過程において、上皮細胞、マクロファージ、血液単球、内皮細胞などの他の正常細胞の上皮間葉転換（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙ－ｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ、ＥＭＴ）によって形成することができ、これらの分化転換過程は、線維化疾患過程におけるＦＢ産生の重要な方法の一つであるかもしれない。

【0062】

ＦＢは生理的条件下で、細胞外マトリックス（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ、ＥＣＭ）成分を合成して放出し、組織の構成、臓器の形態や生理的機能の維持、損傷後の組織の修復に関与する。病理的条件下では、ＦＢは活性化線維芽細胞への異常増殖・転換を通じて、ＥＣＭタンパク質を大量に合成して分泌し、過剰な結合組織化や臓器線維化を誘発することができる。さらに、ＥＣＭのレベルは、その分解酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼ（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＭＭＰ）とマトリックスメタロプロテアーゼ組織阻害剤（ＴＩＭＰＳ）の間のバランスによって制御されている。生理的状態下では、肺内部のＥＣＭの合成と分解はバランスの取れた状態にあるが、肺線維症の過程において、ＭＭＰ／ＴＩＭＰＳ系のバランスが崩れ、ＥＣＭが過剰に蓄積して瘢痕構造を形成し、それも線維化の発生・進行の肝心な要因である。よって、ＦＢ及びＭＭＰ／ＴＩＭＰＳバランスは、線維化疾患において重要な役割を担っている。

【0063】

肺線維症
肺線維症は、線維化疾患の中で最もよく見られ、且つ最も重篤な疾患であり、肺胞組織の損傷の異常修復により線維芽細胞が異常に活性化し、瘢痕を形成する肺疾患を指す。肺線維症は、乾性咳嗽や進行性の呼吸困難を主症状として、人体の呼吸機能に深刻な影響を与え、且つ病状の進行に伴い、肺の損傷が重篤化し、患者の呼吸機能が悪化していく。その主な死因は、呼吸機能の急性悪化及びそれに伴う合併症である。

【0064】

肺線維症の患者の大多数は原因不明であるため、特発性（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ）間質性肺炎と呼ばれる。特発性間質性肺炎のうち、肺線維化病変を主症状とする疾患の種類は、特発性肺線維症（Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ、ＩＰＦ）と呼ばれ、ＩＰＦによる持続的なびまん性肺胞炎と肺胞構造障害の原因で、肺間質が線維化して永久な瘢痕を形成し、肺機能が不可逆的に低下し続き、最終的に呼吸不全で死に至る。ＩＰＦは中高年層に、特に５０～７０歳の男性に多く見られる。統計によると、全人口における発症率は、毎年に約（２～２９）／１０万で、且つ１年あたりに約１１％の割合で年々増加している。ＩＰＦの病因は不明であるが、現在のところ、環境要因や放射線治療薬の使用などが関係していると考えられる；また、急性発作の誘因として、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫などによる繰返し感染が関連している可能性もある。さらに、エリテマトーデスなどの自己免疫疾患も当該疾患の発症の一因となる。ＩＰＦは予後不良であり、生存期間中央値は２～３年で、５年生存率は３０％未満であるので、「腫瘍様疾患」と呼ばれる。

【0065】

ＩＰＦは進行が予測不可能であるため、治療が非常に困難である。ＩＰＦに対する療法は主に、禁煙、酸素療法、機械的換気、緩和ケア、肺リハビリテーションなどの非薬物療法と、ホルモン療法、制酸剤療法、Ｎ－アセチルシステイン療法などの薬物療法がある；グルココルチコイドは５０年以上も前から肺線維症の治療に使用されてきたが、最近の研究によると、大量のグルココルチコイドの長期使用によって引き起こされる深刻な有害反応により、患者の２０％にしか有効でないことは実証された。また、研究結果のメタアナリシスから分かるように、、Ｎ－アセチルシステイン単剤療法は患者の死亡率を低下させることもできないし、努力性肺活量（ｆｏｒｃｅｄ ｖｉｔａｌ ｃａｐａｃｉｔｙ、ＦＶＣ）の変化値やＱＯＬを改善することもできない。近年、米国ＦＤＡは、ＩＰＦの治療のために、抗腫瘍剤であるピルフェニドンとニンテダニブをオーファンドラッグとして承認したが、それらのうち、ピルフェニドンは、抗炎症、抗線維化、抗酸化の特性を持つ多面的なピリジン系小分子化合物である。ピルフェニドンは、努力性肺活量の低下速度を顕著に遅延させることができ、ピルフェニドンを５２週間継続的に投与する療法により、患者の肺機能パラメータの低下を遅延させ、患者の無増悪生存期間（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ－Ｆｒｅｅ－Ｓｕｒｖｉｖａｌ、ＰＦＳ）を延長させると共に、患者の死亡リスクを低下できるが、副作用として光過敏症、疲労、発疹、胃部不快感、食欲不振などがある。ニンテダニブは、マルチターゲットチロシンキナーゼ小分子阻害剤であり、ＩＰＦ患者におけるＦＶＣの減少の絶対値を顕著に低減させ、疾患進行をある程度緩和することができる。ニンテダニブとピルフェニドンは共に肺機能の悪化速度を抑え、患者のＱＯＬを改善することができるが、ニンテダニブとピルフェニドンは患者の肺機能低下速度を遅延させることにしか適応せず、どちらも呼吸器症状を改善できるものではなく、軽度から中等度の肺機能障害を有するＩＰＦ患者にのみ適応性があり、重度のＩＰＦ患者に適用できない。また、ピルフェニドンは腎機能障害のある患者に、ニンテダニブは肝機能障害のある患者に使用できないため、この２種類の薬剤の使用はさらに制限される。

【0066】

他の臓器の線維症
肝線維症は、肝損傷の異常修復・治癒に起因する病理学的プロセスであり、肝損傷による肝臓内の結合組織星状細胞（即ち肝線維芽細胞）の異常増殖と大量の細胞外マトリックスの分泌がその主な原因であり、肝線維症状が長持ちすると、肝硬変、門脈圧亢進症、肝がんなどに繋がる。

【0067】

心筋線維症は、虚血や低酸素により心筋細胞が壊死し、心筋間線維芽細胞の異常増殖と大量の細胞外マトリックスの分泌が誘発され、瘢痕が形成したことを指し、心筋線維症は、心臓を硬くし、徐々に肥大化させ、不整脈や心不全などを誘発する。

【0068】

腎線維症は、外傷、感染症、血液循環障害、免疫炎症反応などの原因により腎細胞が損傷を受け、腎臓の結合組織線維芽細胞の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が異常に沈着して瘢痕を形成し、腎実質の硬化と機能喪失に繋がる。

【0069】

骨髄線維症は、骨髄の線維組織の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が異常に沈着して起こる疾患で、造血機能に深刻な影響を与える骨髄増殖性疾患である。

【0070】

皮膚や軟部組織の瘢痕形成は、皮膚の結合組織中の線維芽細胞が皮膚や軟部組織の損傷部位に移動し、大量の細胞外マトリックスを産生して沈着させることによって起こるものであり、異常な瘢痕形成は、傷口の慢性癒合不全又は線維化を引き起こす。通常、皮膚や軟部組織に損傷を与える原因はいずれも、異常な瘢痕を形成させることができ、一般的には、手術、外傷、熱傷、局所又はびまん性炎症（例えば自己免疫疾患、強皮症など）などによる皮膚や軟部組織の過剰な結合組織化が挙げられる。

【0071】

Ｐｅａｒ１遺伝子又はそのタンパク質
Ｐｅａｒ１、即ち血小板内皮凝集受容体１（Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １、ＧｅｎｅＩＤ： ３７５０３３）は、１５０ ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質で、マルチ上皮成長因子様ドメイン受容体ファミリー（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭＥＧＦ）というタンパク質ファミリーの一員である。ヒトＰｅａｒ１は１０３７個のアミノ酸（ａａ）を含有し、２０ａａのシグナル配列、７３５ａａの細胞外ドメイン（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ、ＥＣＤ）、２１ａａの膜貫通領域、２６１ａａの細胞質領域を含む。Ｐｅａｒ１はあらゆる哺乳動物に存在し、且つ高い類似性を持っており、例えばヒトＰｅａｒ１はマウスＰｅａｒ１（Ｇｅｎｅ ＩＤ： ７３１８２）と８４％の類似性を持っている。

【0072】

Ｐｅａｒ１は最初から、血管内皮細胞及び血小板に発現されることが判明され、血小板同士が直接接触する過程において、血小板表面のＰｅａｒ１受容体がそのＥＭＩドメインを介して、接触した別の血小板表面の潜在的リガンドと結合し、細胞内シグナル伝達を引き起こして血小板を活性化させる。しかし、近年、Ｐｅａｒ１の一塩基多型がヒトの血小板活性に直接関係しない可能性も文献で報告された。現在、Ｐｅａｒ１が主に血小板の活性化過程に関係している可能性のほか、Ｐｅａｒ１が新生血管形成や死んだ神経細胞の除去を調節する能力を持つことも文献で報告されたため、上記の研究から、Ｐｅａｒ１は組織や臓器によって全く異なる生物学的機能を果た可能性があると考えられる。

【0073】

一方、本発明者らは、現在で実証された血管内皮細胞における発現に加え、Ｐｅａｒ１が線維芽細胞でも発現し、且つ線維芽細胞の活性化に対して負の調節作用を有することを初めて見出した。

【0074】

本発明では、マウスのＰｅａｒ１遺伝子をノックアウトし、ヒト化Ｐｅａｒ１トランスジェニックマウスを構築するなどの手段により、Ｐｅａｒ１遺伝子欠損は、既知の線維化関連シグナル伝達経路（ＰＩ３ｋ／ａｋｔシグナル伝達経路、ＭＡＰＫシグナル伝達経路、及びＳｍａｄシグナル伝達経路から選ばれる一又はそれ以上を含む）をアップレギュレートでき、線維芽細胞活性化シグナル伝達経路のアップレギュレーションに繋がることを実証し、これにより、Ｐｅａｒ１遺伝子が線維芽細胞活性化、細胞マトリックス放出、及び細胞マトリックス生成／分解のバランスにおいて重要な役割を果たすことを示した。

【0075】

そこで、本発明では、Ｐｅａｒ１を標的として利用し、Ｐｅａｒ１活性を増強する抗体を構築し、線維芽細胞過剰活性化経路を阻害することで、線維化疾患の治療という目的を果たした。

【0076】

線維芽細胞活性化シグナル伝達経路
線維芽細胞の活性化は、様々なサイトカインがそれらの受容体を介した細胞内シグナルによって制御されることが知られており、このような線維芽細胞活性化シグナル伝達経路は主に、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）受容体に仲介されるＳｍａｄシグナル伝達経路とＭＡＰＫシグナル伝達経路（ＥＲＫ１／２、ＪＮＫ、Ｐ３８シグナル伝達経路を含む）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体に仲介されるＭＡＰＫシグナル伝達経路（ＥＲＫ１／２、ＪＮＫ、Ｐ３８シグナル伝達経路を含む）とＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体に仲介されるＭＡＰＫシグナル伝達経路（ＥＲＫ１／２、ＪＮＫ、Ｐ３８シグナル伝達経路を含む）とＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路などを含む。

【0077】

以上の経路は生体内に広く存在する細胞シグナル伝達経路であり、細胞の増殖や分化に重要な役割を担っている。例えば、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路は、初期胚発生や組織・臓器の形成、免疫、組織修復、恒常性維持に重要な役割を担っている。もう一つの例として、ＭＡＰＫシグナル伝達経路は主に、ＥＲＫ１／２、ＪＮＫｓ、ｐ３８ｓ、ＥＲＫ５という４つの下流シグナル分子を含む。ＥＲＫ１／２、ＪＮＫｓ、ｐ３８ｓ及びＥＲＫ５は、免疫炎症、細胞分化、アポトーシスや増殖などの過程と密接に関連している。もう一つの例として、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路は、細胞の増殖、分化、アポトーシスを制御し、細胞の移動、接着、血管新生、細胞外マトリックスの合成と分泌の過程に肝心な役割を担っている。既存又は開発中の薬剤の殆どは、これらのシグナル伝達経路の活性化を阻害することで作用するものであり、例えば、肺線維症治療薬として承認されたニンテダニブは、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）に仲介される上記ＭＡＰＫシグナル伝達経路とＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路の全てを阻害して作用するが、同時に重篤な全身性副作用を引き起こす。

【0078】

本発明者らは、Ｐｅａｒ１遺伝子が上記シグナル伝達経路に直接関与していることを実験により証明し、これらの経路の活性化を直接的に阻害又はダウンレギュレートする従来の薬剤と異なり、Ｐｅａｒ１遺伝子又はそのタンパク質が上記線維芽細胞活性化シグナル伝達経路において負の調節（阻害）作用を有することを実証した。即ち、Ｐｅａｒ１遺伝子をノックアウトするとこれらのシグナル伝達経路の活性化を促進できるが、Ｐｅａｒ１アゴニストを採用するとこれらのシグナル伝達経路の活性化を一部ダウンレギュレートでき、これにより線維芽細胞の異常な活性化を制御し、線維化疾患を治療又は改善できる。

【0079】

アゴニスト及び医薬品
本文に用いられるように、用語の「アゴニスト」、「Ｐｅａｒ１アゴニスト」又は「Ｐｅａｒ１遺伝子又はそのタンパク質のアゴニスト」は、互換的に用いることができ、いずれも、Ｐｅａｒ１遺伝子又はそのタンパク質の活性を強化でき、及び／又はＰｅａｒ１タンパク質に結合でき、及び／又はＰｅａｒ１による線維芽細胞活性化シグナル伝達経路の阻害を促進でき、及び／又は線維芽細胞によるＥＣＭの放出を低減できる物質を意味する。本発明は、既知のＰｅａｒ１アゴニストに加え、Ｐｅａｒ１と特異的に結合する新規抗体を提供する。

【0080】

好ましくは、本発明で提供されるアゴニストは、Ｐｅａｒ１遺伝子又はそのタンパク質に結合してＰｅａｒ１の構造を変化させることにより、線維芽細胞の活性化を阻害できるアゴニストである。好ましくは、前記アゴニストは、線維芽細胞が発現するＰｅａｒ１タンパク質を標的として結合するアゴニストである。

【0081】

一つの好ましい実施例において、本発明にかかる抗体に加えて、本発明にかかるアゴニストはさらに、Ｐｅａｒ１に対して活性化作用を有することが知られている物質、例えばＦｃεＲ１α（即ちＩｇＥ受容体ＩａのＦｃフラグメント）、デキストラン硫酸、フコイダン又はそれらの組み合わせを含んでも良く、Ｐｅａｒ１の天然アプタマー及び／又は小分子化合物を含んでも良く、より好ましくは、肺線維芽細胞による細胞外マトリックスの合成を顕著に阻害して肺機能を改善し生存率を向上させるように、ＦｃεＲ１α、デキストラン硫酸及びフコイダンを含む。

【0082】

本発明にかかるＰｅａｒ１標的を用いれば、当業者は、Ｐｅａｒ１に対する様々なアゴニストを設計することが可能となり、小分子アゴニスト、抗体又はその活性フラグメント、ｍｉＲＮＡなどを含むが、それらに限定されない。また、本発明において、前記小分子化合物とは、天然に存在する又は人工的に開発されるＰｅａｒ１受容体の小分子アゴニストを指すこともできる。

【0083】

本発明において、前記アプタマー（Ａｐｔａｍｅｒ）とは、インビトロスクリーニング技術である指数的濃縮によるリガンドの系統的進化技術（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ、ＳＥＬＥＸ）によって得られる、対応する標的分子（タンパク質、ウイルス、最近、細胞、重金属イオンなど）に厳密な認識能と高い親和性を有する構造化オリゴヌクレオチド配列（ＲＮＡ又はＤＮＡ）を意味する。

【0084】

本発明は、安全有効量の本発明にかかる抗体又はその変異体を含む医薬品をさらに提供する。本発明に記載の医薬品は、一又はそれ以上のＰｅａｒ１アゴニストを含む医薬組成物であってもよい。もう一つの実施形態において、前記医薬組成物は、本発明にかかるＰｅａｒ１を標的とする抗体又はその変異体、例えば抗体（Ｆａｂ）_２及びＦａｂフラグメント、ＦｃεＲ１α、デキストラン硫酸、フコイダン、アプタマー又は小分子化合物を含む。

【0085】

もう一つの実施形態において、前記医薬品は医薬組成物であり、即ち薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む。本発明に記載の薬学的に許容される担体は、本発明にかかるアゴニストの構造的及び機能的安定性を維持し、投与を容易にするために用いることができ、当業者であれば、必要に応じて選択及び配合することができ、このような担体としては、食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール及びそれらの組合せを含むが、それらに限定されない。

【0086】

本発明にかかるアゴニスト、抗体及びその変異体、並びにそれらを含む医薬品及び／又は医薬組成物は、種々の経路で所要の対象に投与（使用）することができ、前記投与は、吸入、局所投与、及び／又は胃腸外投与を含むが、それらに限定されない。

【0087】

一つの好ましい実施形態において、当業者は、投与経路に応じて投与される製剤の種類を決定することができ、例えば吸入投与製剤、局所投与製剤、胃腸外投与製剤又はそれらの組み合わせを含む。前記吸入投与製剤は、エアゾル、スプレー、点鼻剤、粉末剤又はそれらの組み合わせを含む。前記局所投与製剤及び／又は胃腸外投与製剤は、点滴剤、ゲル、エマルジョン、クリーム、パッチ、フィルム、注射剤又はそれらの組み合わせを含む。一つの好ましい実施形態において、局所塗布、滴下、血管内注射、局所注射などの種々の経路で投与することができる。

【0088】

抗体又はその変異体
本発明は、Ｐｅａｒ１タンパク質を特異的に結合する／標的とする抗体又はその変異体を提供する。好ましくは、本発明にかかる抗体又はその変異体は、マウス由来のモノクローナル抗体であり、また、組換え、ポリクローナル、多本鎖又は一本鎖、あるいは完全の免疫グロブリンであってもよい。好ましくは、本発明にかかる抗体又はその変異体はヒト化のものである。好ましくは、本発明にかかる抗体は、キメラ抗体である。好ましくは、本発明にかかる抗体又はその変異体は、表３．２、３．３、４、５に示される。

【0089】

前記Ｐｅａｒ１を標的とする抗体は、完全長抗体及び抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ（例えばｓｃＦｖ））を含むが、それらを含む二重特異性抗体、多重特異性抗体、単一ドメイン抗体、あるいは前記抗体から調製されるモノクロナール抗体又はポリクロナール抗体も含む。

【0090】

本発明において、前記抗体Ｆａｂフラグメント（Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）は、抗原結合性フラグメントとも呼ばれ、抗体構造の中で抗原と結合できる領域である。Ｆａｂフラグメントは、完全な軽鎖と重鎖のＶＨ及びＣＨ１構造ドメインからなる。パパインの作用により、抗体は２つのＦａｂフラグメントと１つのＦｃフラグメントに分解されるが、ペプシンの作用により、抗体は（Ｆａｂ）_２フラグメントとＦｃフラグメントに分解される。

【0091】

本発明にかかる抗体又はその変異体に用いられるＦａｂのＦＲフラグメントは特に限定されるものではなく、好ましくは、本発明では、ヒトＩｇＧ４のＦＲ及び複数の変異したＦＲ配列を用いた結果、ＦＲの配列を変えても抗体に対する抗原結合力があまり変化しない。よって、本発明にかかる抗体のＣＤＲフラグメントは、Ｐｅａｒ１タンパク質に対して非常に特異的且つ安定な結合機能を有することが分かる。本発明のＰｅａｒ１標的及びそれと線維化疾患との関連性の教示に従って、当業者であれば、本発明にかかる抗体又はその変異体のＣＤＲを利用し、現在で既知の様々なＦＲを用いて構成される抗体をスクリーニングすることができ、このように得られる本発明にかかる抗体又はその変異体と一致した若しくは実質的に一致した活性を有する抗体も、本発明の保護範囲に含まれる。

【0092】

本発明に用いることのできる抗体又はその変異体の定常領域には、特に制限がない。本発明のＰｅａｒ１標的及びそれと線維化疾患との関連性の教示に従って、当業者であれば、本発明にかかる抗体又はその変異体を含むのに適した定常領域フラグメントをスクリーニングすることにより、本発明の抗体又は変異体と一致した若しくは実質的に一致した活性を有する完全な抗体を得ることができる。

【0093】

治療方法
本発明は、線維化疾患を治療する方法を提供する。前記方法は、その必要のある個体又は対象に、本発明にかかる抗体又はその変異体あるいは本発明にかかる医薬品を投与することを含む。もう一つの実施形態において、前記の治療方法は、肺線維症、肺線維症に伴う拘束性肺疾患を治療する方法であり、肺部へのエアゾル投与により本発明にかかる抗体又はその変異体あるいは本発明にかかる医薬品を投与することを含むが、それらに限定されない。

【0094】

もう一つの実施形態において、前記治療方法は、皮膚又は軟部組織の線維化を治療する方法であり、局所注射、外用、塗布、浸潤、経皮吸収等により本発明にかかる抗体又はその変異体あるいは本発明にかかる医薬品を投与することを含むが、それらに限定されない。好ましくは、例えば外傷、火傷、手術や美容整形などによる皮膚瘢痕、又はケロイド症の人の皮膚に形成したケロイド、強皮症などを治療する方法である。また、上記の方法は、組織や臓器の損傷の修復及び／又は創傷治癒にも適する。

【0095】

もう一つの実施形態において、前記治療方法は、肝臓、心臓又は腎臓の線維化を治療する方法であり、局所注射、塗布、浸潤等により本発明にかかる抗体又はその変異体あるいは本発明にかかる医薬品を投与することを含むが、それらに限定されない。

【0096】

本発明にかかる抗体又はその変異体あるいは本発明にかかる医薬品の投与時期は特に限定されないが、好ましくは線維化の発症直後である。さらに、本発明にかかる抗体又はその変異体あるいは本発明にかかる医薬品は、他の全身用又は局所用の薬剤と組み合わせて投与することもでき、それらの投与順序は特に限定されない。

【0097】

ヒトＰｅａｒ１トランスジェニック動物モデル及び薬剤スクリーニング方法
本発明は、新規な線維化薬剤のスクリーニング・同定モデルをさらに提供する。本発明者らは、Ｐｅａｒ１遺伝子及びそのタンパク質と線維化疾患との関連性の発見により、相同組換えによりマウスＰｅａｒ１遺伝子をヒトＰｅａｒ１遺伝子に置き換えることで、当該モデルを作製した。本発明の教示に従って、当業者であれば、他の異なる方法でヒトＰｅａｒ１遺伝子によって置換された他のトランスジェニック動物を構築し、線維化疾患の研究や線維化薬剤のスクリーニングのためのモデルとして使用することでできることを、理解すべきである。

【0098】

さらに、本発明は、薬剤スクリーニング方法、例えばＰｅａｒ１アゴニストのスクリーニング方法をさらに提供し、当該方法は、Ｐｅａｒ１を標的として利用し、且つ線維芽細胞におけるＰｅａｒ１の役割を利用し、線維芽細胞培養系における候補Ｐｅａｒ１アゴニストの作用を探究することができる。Ｐｅａｒ１の活性化と、線維芽細胞の上皮間葉転換メカニズム及び線維芽細胞による細胞外マトリックスの分泌との間の関連性が本発明により判明された以上、このような薬剤スクリーニング方法によりＰｅａｒ１アゴニストをスクリーニングすることができる。勿論、本発明にかかるトランスジェニック動物モデルを用いた薬効の評価方法も含む。即ち、本発明にかかるヒトＰｅａｒ１トランスジェニック動物モデルに候補Ｐｅａｒ１アゴニストを添加し、且つ対照を設定し、動物の線維化症状の改善を示すものは潜在的なＰｅａｒ１アゴニストと見做される。線維化の症状は、肺、心臓、腎臓、骨髄、皮膚、軟部組織などの部位や臓器の構造的・機能的な改善を含むが、それらに限定されない。このような構造的・機能的な改善は、熟練した当業者（例えば実験者又は臨床医）が様々な部位又は臓器の状況も考慮して判断することができる。

【0099】

以下、具体的な実施例及び図面に参照して本発明をさらに詳しく説明するが、本発明の保護の内容は、以下の実施例に限定されるものではない。発明構想の精神及び範囲から逸脱しない限り、当業者によって想到され得る変更及び利点は、いずれも本発明に含まれ、且つ添付の特許請求の範囲を保護の範囲とする。一般的には、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験マニュアル（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００２）に記載される通常の条件、あるいはメーカーの薦めの条件で行われる。

【0100】

実験の材料と方法
１、試薬、抗体の調製及び細胞株
抗マウスＰｅａｒ１モノクローナル抗体及び抗ヒトＰｅａｒ１モノクローナル抗体は、実験室でヒトＰｅａｒ１細胞外タンパクを用いてＰｅａｒ１ノックアウトマウス及びＢＡＬＢ／ｃマウスをそれぞれ免疫し、標準的なマウス脾臓細胞及びマウスミエローマ細胞融合技術によって高親和性のモノクローナルハイブリドーマ細胞を作成し、免疫不全マウスにハイブリドーマ細胞を注射することにより、腹水を得てＰｒｏｔｅｉｎＡ／Ｇビーズを用いて抗体を精製し、関連実験に用いられた。Ｈｉｓタグ付きＦｃεＲ１αタンパク質はＲ＆Ｄ社から購入した。ポリペプチドはＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ（上海）有限会社で合成された。ヒト肺線維芽細胞、ヒト皮膚線維芽細胞、心臓線維芽細胞、腎線維芽細胞、肝線維芽細胞はＡＴＣＣ細胞バンクから購入した。

【0101】

２、マウス肺機能の測定
ペントバルビタール（１００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によりマウスを麻酔した後，ＡｎｉＲｅｓ２００５肺機能解析システム（Ｂｅｓｔｌａｂ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０、ＡｎｉＲｅｓ２００５、中国）のメーカーの指示に従って，各マウスを気管カニューレを介してコンピュータに制御されている小動物ベンチレーターに接続した。体積トレーシングチャンバー内の圧力変化は、圧力センサー付き接続チューブのポートから測定し、努力性肺活量（ＦＶＣ）と０．１秒間の努力性呼気量（ＦＥＶ０．１）を肺機能の指標とした。

【0102】

３、初代マウス肺線維芽細胞の単離と培養
ブレオマイシンによって誘発された及び誘発されていないマウスの新鮮な肺組織を細かく切断した後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（１００Ｕ／ｍｌのＩ型コラゲナーゼ、２．５ｍｇ／ｍｌのＩＶ型コラゲナーゼ、０．３ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼ及び０．１ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅを含有するもの）中で、３７℃のインキュベーターで酵素消化を２時間行なった。その後、２％の牛血清アルブミンを添加し、８００ｒｐｍの遠心により懸濁液を５分間消化し、１０％牛胎児血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を添加し、Ｉ型コラーゲンでコートされた細胞培養ディッシュ中で、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で２日間培養した。実験に使用したマウス初代肺線維芽細胞は、全て第２世代～第３世代の細胞であった。

【0103】

４、プラスミドの構築とタンパク質の発現
ｆｌａｇタグとＨｉｓタグ付きヒト又はマウスＰｅａｒ１－ｐｃＤＮＡ３．１過剰発現プラスミドを構築し、２９３ｓ細胞をＰＥＩで一時的トランスフェクトし、細胞を無血清で懸濁培養し、上澄を抽出し、ニッケルカラムでタンパク質を精製した。

【0104】

５、フローサイトメトリー
新鮮な肺組織を採取し、フローサイトメトリーにより解析実験を行った。新鮮なマウス肺を細かく切断して消化し、マウス肺単一細胞を調製し、セルフィルターで遠心分離して収集した。ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ３２６、ＣＤ１４０ａ、Ｐｅａｒ１蛍光標識抗体とインキュベートし、フローサイトメトリーにより各細胞の割合を解析した。全てのフローサイトメトリー実験は、上海交通大学公共技術プラットフォームＡｒｉａ ＩＩＩで行い、フローサイトメトリーのデータはＦｌｏｗｊｏソフトウェアで解析した。

【0105】

６、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）とマッソン染色
マウス肺と肝臓を４％パラホルムアルデヒドで４８時間固定化し、パラフィンで埋め込んでから、半自動ロータリーミクロトーム（ｌｅｉｃａ；ｒｍ２２３５とｃｍ１９５０）でスライスし、室温で脱パラフィンし、勾配エタノールで再水和し、ＨＥとマッソン染色を施した。

【0106】

７、ＲＮＡ－ｓｅｑとバイオインフォマティクス解析
ＴＲＩｚｏｌ法（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｒｌｓｂａｄ、ｃａ）を用いて、標準実験法に従ってマウス肺ＣＤ１４０^＋線維芽細胞から全ｍＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ－ｓｅｑとバイオインフォマティクス解析、及び差次的発現遺伝子（ｄｅｇ）の同定、シグナル伝達経路の解析、遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）などを、上海交通大学医学部公共技術サービスプラットフォームで行った。

【0107】

８、定量的リアルタイムＰＣＲ
ＴＲＩｚｏｌ法（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｒｌｓｂａｄ、ｃａ）を用いて、標準プロトコールに従って線維芽細胞から全ｍＲＮＡを抽出した。逆転写酵素（Ｔａｋａｒａ）を利用して相補的ＤＮＡを合成した。ＡＢＩ ７０００リアルタイムＰＣＲ装置（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて遺伝子発現を検出し、ＰＣＲプライマー配列を表１に示す。ヒトグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇａｐｄｈ）又は１８ｓＲＮＡ遺伝子を内部参照とした。

【0108】

【表2】

９、統計方法
全てのデータは、ＳＰＳＳ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓソフトウェアバージョン１３．０を用いて統計的に解析された。２つのデータセットの比較には、両側ｔ検定を採用した。生存率解析には、カプラン・マイヤー（ｋａｐｌａｎ－ｍｅｉｅｒ）解析を採用した。全てのデータの比較において、ｐ値が０．０５未満の場合は、統計的に有意であるとみなされた。

【実施例0109】

Ｐｅａｒ１遺伝子ノックアウトマウスの構築
Ｐｅａｒ１遺伝子ノックアウトマウス（Ｐｅａｒ１遺伝子欠損マウス）は、Ｆｉｒｓｔ－Ｋｎｏｃｋｏｕｔ技術によって構築した。構築策略は図１ａに示す。ＩＲＥＳフラグメント（レポーター遺伝子ｌａｃＺとプロモーター駆動型ｎｅｏを含むもの）を元の遺伝子のイントロンに挿入することで、Ｐｅａｒ１遺伝子の機能を破壊した。マウスの遺伝子型は、本分野で公認のＰＣＲ法によって同定した。表２の配列に示すように、上流プライマー（Ｐｅａｒ１－Ｆ）はＰｅａｒ１遺伝子のエクソン６領域に、下流プライマーは挿入されたフラグメントＦｒｔ領域（Ｐｅａｒ１ ＫＯ－Ｒ）又はイントロン６領域（Ｐｅａｒ１ ＷＴ－Ｒ）にそれぞれ設計し、それぞれＫＯバンド又はＷＴバンドの増幅に使用した。本発明では、８～１０週齢のマウスは使用され、マウスは特定病原体不在（ｓｐｆ）条件下で飼育された。マウスの使用は、上海交通大学医学部動物倫理委員会によって承認した。構築の概念図は図１ａに示す。イムノブロッティングの結果により、Ｐｅａｒ１遺伝子ノックアウトマウスでは、Ｐｅａｒ１タンパク質が完全に欠損したことが実証された（図１ｂ）。

【0110】

【表3】

ただし、Ｐｅａｒ１－Ｆ、Ｐｅａｒ１－ＫＯ－Ｒ及びＰｅａｒ１－ＷＴ－Ｒは、Ｐｅａｒ１ノックアウトマウスの遺伝子型の同定に使用した。ＨＰｅａｒ１－ＷＴ－Ｆ、ＨＰｅａｒ１－ＫＩ－ＬＤ－Ｒ、ＨＰｅａｒ１－ＫＩ－ＲＤ－Ｆ、ＨＰｅａｒ１－ＷＴ－Ｒは、ヒト化Ｐｅａｒ１マウスの遺伝子型の同定に使用した。

【実施例0111】

マウス肺機能に対するＰｅａｒ１欠損の影響
実施例１のＰｅａｒ１遺伝子ノックアウトマウスの肺機能への影響を測定した。まず、本発明では、野生型（ＷＴ）マウスとＰｅａｒ１遺伝子ノックアウト老齢マウスの肺機能及びコラーゲン沈着を比較した。

【0112】

その結果、Ｐｅａｒ１欠損は１２ヶ月齢のマウスにおいて、努力性肺活量（ＦＶＣ）と０．１秒間の努力性呼気量（ＦＥＶ_０．１）を著しく低下させた（図１ｃ参照）；努力性肺活量と努力性呼気量は肺機能評価のための重要な指標である；１２ヶ月齢の野生型（ＷＴ）対照マウスのＦＶＣとＦＥＶ０．１の平均値はそれぞれ０．５６と０．７８であったのに対し、１２ヶ月齢のＰｅａｒ１遺伝子ノックアウトマウスのＦＶＣとＦＥＶ０．１の平均値はそれぞれ０．７９と０．６９であった（ｐ＜０．１）ことから、老齢Ｐｅａｒ１遺伝子ノックアウトマウスの呼吸機能は、野生型対照マウスよりも有意に劣った。

【0113】

免疫組織化学アッセイにより実証されたように、Ｐｅａｒ１遺伝子ノックアウトマウスの肺にはより多くのコラーゲンが蓄積していた（図１ｄ参照）；マッソン染色はコラーゲン染色の古典的な方法で、コラーゲンは緑色に染色できるため、コラーゲン沈着状況は緑色の領域の面積百分率（コラーゲン沈着百分率、Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ）で反映することができる；統計によると、１２ヶ月齢の野生型マウスのコラーゲン沈着の割合は３％であったのに対し、Ｐｅａｒ１遺伝子ノックアウトマウスのコラーゲン沈着の割合は７％であり、野生型（ＷＴ）対照マウスを著しく上回った。

【0114】

以上の結果から、Ｐｅａｒ１欠損老齢マウスでは、肺組織の線維化が自発的に発生し、マウスの呼吸機能を損なうことが分かった。