特開2024-138368超分子ＩＫＶＡＶマトリックス内の動力学は、ヒトＩＰＳＣ由来のニューロンの機能的成熟と再生を増強する
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024138368
(43)【公開日】2024-10-08
(54)【発明の名称】超分子ＩＫＶＡＶマトリックス内の動力学は、ヒトＩＰＳＣ由来のニューロンの機能的成熟と再生を増強する
(51)【国際特許分類】
C07K 7/08 20060101AFI20241001BHJP
C12N 5/0793 20100101ALI20241001BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241001BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20241001BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20241001BHJP
A61K 47/62 20170101ALI20241001BHJP
A61K 47/65 20170101ALI20241001BHJP
【ＦＩ】
C07K7/08 ZNA
C12N5/0793
C12N5/10
A61K38/08
A61P25/00
A61K47/62
A61K47/65
C07K7/08
【審査請求】有
【請求項の数】50
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024108888
(22)【出願日】2024-07-05
(62)【分割の表示】P 2021543194の分割
【原出願日】2020-01-24
(31)【優先権主張番号】62/796,425
(32)【優先日】2019-01-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＭＡＴＬＡＢ
(71)【出願人】
【識別番号】513208191
【氏名又は名称】ノースウエスタン ユニバーシティ
【氏名又は名称原語表記】ＮＯＲＴＨＷＥＳＴＥＲＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】６３３ Ｃｌａｒｋ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｅｖａｎｓｔｏｎ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ６０２０８，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】ピント，ザイダ アルヴァレズ
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 浩平
(72)【発明者】
【氏名】オルテガ カノ，フアン アルベルト
(72)【発明者】
【氏名】キスキニス，エヴァンゲロス
(72)【発明者】
【氏名】スタップ，サミュエル アイ．
(57)【要約】 （修正有）
【課題】生物学的マトリックスの構造および機能をより効率的に模倣することができる合成物質の設計を提供する。
【解決手段】本明細書では、生理活性ペプチドを含んでいるペプチド両親媒性物質（ＰＡ）、生理活性ＰＡを呈しているナノファイバー、およびそれらの使用方法が提供される。開示されたペプチド両親媒性物質は、疎水性尾部、構造ペプチドセグメント、荷電ペプチドセグメント、および生理活性ＩＫＶＡＶペプチドを含んでいる。開示されたＰＡは、細胞培養方法において、および中枢神経系損傷を治療する方法において使用され得る。
【選択図】なし
【解決手段】本明細書では、生理活性ペプチドを含んでいるペプチド両親媒性物質（ＰＡ）、生理活性ＰＡを呈しているナノファイバー、およびそれらの使用方法が提供される。開示されたペプチド両親媒性物質は、疎水性尾部、構造ペプチドセグメント、荷電ペプチドセグメント、および生理活性ＩＫＶＡＶペプチドを含んでいる。開示されたＰＡは、細胞培養方法において、および中枢神経系損傷を治療する方法において使用され得る。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
疎水性尾部、
４以下のβシート構造形成に関する全体の傾向を有している構造ペプチドセグメント、
荷電ペプチドセグメント、および
生理活性ペプチド
を含んでいる、ペプチド両親媒性物質。
４以下のβシート構造形成に関する全体の傾向を有している構造ペプチドセグメント、
荷電ペプチドセグメント、および
生理活性ペプチド
を含んでいる、ペプチド両親媒性物質。
【請求項2】
前記疎水性尾部が、炭素数８～２４のアルキル鎖（Ｃ８－２４）を含んでいる、請求項１に記載のペプチド両親媒性物質。
【請求項3】
前記疎水性尾部が、炭素数１６のアルキル鎖（Ｃ１６）を含んでいる、請求項２に記載のペプチド両親媒性物質。
【請求項4】
前記構造ペプチドセグメントが、３．５以下のβシート構造形成に関する全体の傾向を有している、請求項１～３のいずれか１項に記載のペプチド両親媒性物質。
【請求項5】
前記構造ペプチドセグメントが、３以下のβシート構造形成に関する全体の傾向を有している、請求項４に記載のペプチド両親媒性物質。
【請求項6】
前記構造ペプチドセグメントが、Ａ２Ｇ２を含んでいる、請求項１～５のいずれか１項に記載のペプチド両親媒性物質。
【請求項7】
前記荷電ペプチドセグメントが、酸性、塩基性、または両性イオン性のペプチドセグメントを含んでいる、請求項１～６のいずれか１項に記載のペプチド両親媒性物質。
【請求項8】
前記荷電ペプチドセグメントが、Ｅ２－４を含んでいる、請求項１～７のいずれか１項に記載のペプチド両親媒性物質。
【請求項9】
前記生理活性ペプチドが、ＩＫＶＡＶを含んでいる、請求項１～８のいずれか１項に記載のペプチド両親媒性物質。
【請求項10】
前記生理活性ペプチドが、リンカーによって前記荷電ペプチドセグメントに取り付けられている、請求項１～９のいずれか１項に記載のペプチド両親媒性物質。
【請求項11】
前記リンカーが、単一のグリシン（Ｇ）残基である、請求項１０に記載のペプチド両親媒性物質。
【請求項12】
前記ペプチド両親媒性物質が、Ｃ８‐２４‐Ａ２Ｇ２Ｅ４（Ｇ）ＩＫＶＡＶを含んでいる、請求項１～１１のいずれか１項に記載のペプチド両親媒性物質。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか１項に記載のペプチド両親媒性物質を含んでいる、ナノファイバー。
【請求項14】
１つ以上のフィラーペプチド両親媒性物質をさらに含み、
前記フィラーペプチド両親媒性物質が生理活性部分を含まない、請求項１３に記載のナノファイバー。
前記フィラーペプチド両親媒性物質が生理活性部分を含まない、請求項１３に記載のナノファイバー。
【請求項15】
前記フィラーペプチド両親媒性物質が、疎水性非ペプチド尾部、構造ペプチドセグメント、および荷電ペプチドセグメントを含んでいる、請求項１４に記載のナノファイバー。
【請求項16】
請求項１～１２のいずれか１項に記載のペプチド両親媒性物質または請求項１３～１５のいずれか１項に記載のナノファイバーを含んでいる、薬学的組成物。
【請求項17】
被検体における神経系損傷の治療のために用いられる、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項18】
前記神経系損傷が中枢神経系損傷である、請求項１７に記載の薬学的組成物。
【請求項19】
前記神経系損傷が脊髄損傷である、請求項１７に記載の薬学的組成物。
【請求項20】
前記組成物が非経口的投与のために製剤化された、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項21】
被検体における神経系損傷の治療のために用いられる薬学的組成物であって、
自己集合したペプチド両親媒性物質のナノファイバーを含み、
前記ペプチド両親媒性物質の少なくとも一部が、疎水性尾部、構造ペプチドセグメント、荷電ペプチドセグメント、およびＩＫＶＡＶ生理活性ペプチドを含んでおり、
前記構造ペプチドセグメントが、４以下のβシート構造形成に関する全体の傾向を有している、薬学的組成物。
自己集合したペプチド両親媒性物質のナノファイバーを含み、
前記ペプチド両親媒性物質の少なくとも一部が、疎水性尾部、構造ペプチドセグメント、荷電ペプチドセグメント、およびＩＫＶＡＶ生理活性ペプチドを含んでおり、
前記構造ペプチドセグメントが、４以下のβシート構造形成に関する全体の傾向を有している、薬学的組成物。
【請求項22】
前記疎水性尾部が、炭素数８～２４のアルキル鎖（Ｃ８－２４）を含んでいる、請求項２１に記載の薬学的組成物。
【請求項23】
前記疎水性尾部が、炭素数１６のアルキル鎖（Ｃ１６）を含んでいる、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項24】
前記構造ペプチドセグメントが、３．５以下のβシート構造形成に関する全体の傾向を有している、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項25】
前記構造ペプチドセグメントが、３以下のβシート構造形成に関する全体の傾向を有している、請求項２１～２４のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項26】
前記荷電ペプチドセグメントが、酸性、塩基性、または両性イオン性のペプチドセグメントを含んでいる、請求項２１～２５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項27】
前記荷電ペプチドセグメントが、Ｅ２－４を含んでいる、請求項２１～２６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項28】
前記構造ペプチドセグメントがＡＡＧＧを含んでいる、請求項２１～２７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項29】
前記ペプチド両親媒性物質が、Ｃ８‐２４‐Ａ２Ｇ２Ｅ４（Ｇ）ＩＫＶＡＶを含んでいる、請求項２８に記載の薬学的組成物。
【請求項30】
前記神経系損傷が、中枢神経系損傷である、請求項２１～２９のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項31】
前記神経系損傷が、脊髄損傷である、請求項３０に記載の薬学的組成物。
【請求項32】
前記薬学的組成物が、非経口的投与のために製剤化された、請求項２１～３１のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項33】
自己集合したペプチド両親媒性物質のナノファイバーを含み、
前記ペプチド両親媒性物質の少なくとも一部が、疎水性尾部、構造ペプチドセグメント、荷電ペプチドセグメント、およびＩＫＶＡＶ生理活性ペプチドを含んでおり、前記構造ペプチドセグメントが、４以下のβシート構造形成に関する全体の傾向を有している、
いる、スキャフォールド。
前記ペプチド両親媒性物質の少なくとも一部が、疎水性尾部、構造ペプチドセグメント、荷電ペプチドセグメント、およびＩＫＶＡＶ生理活性ペプチドを含んでおり、前記構造ペプチドセグメントが、４以下のβシート構造形成に関する全体の傾向を有している、
いる、スキャフォールド。
【請求項34】
前記疎水性尾部が、炭素数８～２４のアルキル鎖（Ｃ８－２４）を含んでいる、請求項３３に記載のスキャフォールド。
【請求項35】
前記疎水性尾部が、炭素数１６のアルキル鎖（Ｃ１６）を含んでいる、請求項３３に記載のスキャフォールド。
【請求項36】
前記構造ペプチドセグメントが、３．５以下のβシート構造形成に関する全体の傾向を有している、請求項３３～３５のいずれか１項に記載のスキャフォールド。
【請求項37】
前記構造ペプチドセグメントが、３以下のβシート構造形成に関する全体の傾向を有している、請求項３３～３６のいずれか１項に記載のスキャフォールド。
【請求項38】
前記荷電ペプチドセグメントが、酸性、塩基性、または両性イオン性のペプチドセグメントを含んでいる、請求項３３～３７のいずれか１項に記載のスキャフォールド。
【請求項39】
前記荷電ペプチドセグメントが、Ｅ２－４を含んでいる、請求項３３～３８のいずれか１項に記載のスキャフォールド。
【請求項40】
前記構造ペプチドセグメントがＡＡＧＧを含んでいる、請求項３３～３９のいずれか１項に記載のスキャフォールド。
【請求項41】
前記ペプチド両親媒性物質が、Ｃ８‐２４‐Ａ２Ｇ２Ｅ４（Ｇ）ＩＫＶＡＶを含んでいる、請求項４０に記載のスキャフォールド。
【請求項42】
請求項３３～４１のいずれか１項に記載のスキャフォールド上で培養した細胞。
【請求項43】
前記細胞がニューロンである、請求項４２に記載の細胞。
【請求項44】
前記細胞がｈｉＰＳＣ由来の運動ニューロンである、請求項４２に記載の細胞。
【請求項45】
細胞を、請求項３３～４１のいずれか１項に記載のスキャフォールドと接触させることを含んでいる、細胞を培養する方法。
【請求項46】
前記細胞がニューロンである、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
前記細胞がｈｉＰＳＣ由来の運動ニューロンである、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
請求項３３～４１のいずれか１項に記載のスキャフォールドと、
前記スキャフォールド上で培養した細胞と、
を含んでいるシステム。
前記スキャフォールド上で培養した細胞と、
を含んでいるシステム。
【請求項49】
前記細胞がニューロンである、請求項４８に記載のシステム。
【請求項50】
前記細胞がｈｉＰＳＣ由来の運動ニューロンである、請求項４９に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１９年１月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／７９６，４２５号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年１月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／７９６，４２５号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
［技術分野］
本明細書では、生理活性ペプチドを含んでいるペプチド両親媒性物質（ＰＡ）、生理活性ＰＡを呈しているナノファイバー、およびそれらの使用方法が提供される。いくつかの実施形態において、細胞培養方法において使用するためのペプチド両親媒性物質が、本明細書中に提供される。他の実施形態において、神経系損傷を治療する方法において使用するためのペプチド両親媒性物質が、本明細書中に提供される。
本明細書では、生理活性ペプチドを含んでいるペプチド両親媒性物質（ＰＡ）、生理活性ＰＡを呈しているナノファイバー、およびそれらの使用方法が提供される。いくつかの実施形態において、細胞培養方法において使用するためのペプチド両親媒性物質が、本明細書中に提供される。他の実施形態において、神経系損傷を治療する方法において使用するためのペプチド両親媒性物質が、本明細書中に提供される。
【0003】
［背景］
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、水、マトリックスタンパク質、および他の化学因子の階層的環境であり、細胞の挙動を調整し、損傷および疾患だけでなく、発達中および成体の中枢神経系（ＣＮＳ）において必須の役割を果たす微小環境を提供する。ＥＣＭの分子の複雑性と動的組織化により、多くの特異的な膜貫通型受容体に時空間的に結合することが可能となり、次には、シグナル伝達として知られるプロセスを介して、複数の生命維持に必要な細胞応答を引き起こす。近年の合成物質の急速な進化は、実質的に改善されたインビトロ細胞培養プラットフォームおよび組織工学アプローチを有するＥＣＭの様相を再現することを可能にした。伝統的な合成基質およびマトリックスは、その大部分において、発達、成熟、疾患の進行、およびホメオスタシスの維持などの異なるインビボ状況においてＥＣＭの動的特性を捕捉できないために、有用性が限られていることが証明されている。生物学的マトリックスの構造および機能をより効率的に模倣することができる合成物質の設計は、依然として困難な目標のままである。
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、水、マトリックスタンパク質、および他の化学因子の階層的環境であり、細胞の挙動を調整し、損傷および疾患だけでなく、発達中および成体の中枢神経系（ＣＮＳ）において必須の役割を果たす微小環境を提供する。ＥＣＭの分子の複雑性と動的組織化により、多くの特異的な膜貫通型受容体に時空間的に結合することが可能となり、次には、シグナル伝達として知られるプロセスを介して、複数の生命維持に必要な細胞応答を引き起こす。近年の合成物質の急速な進化は、実質的に改善されたインビトロ細胞培養プラットフォームおよび組織工学アプローチを有するＥＣＭの様相を再現することを可能にした。伝統的な合成基質およびマトリックスは、その大部分において、発達、成熟、疾患の進行、およびホメオスタシスの維持などの異なるインビボ状況においてＥＣＭの動的特性を捕捉できないために、有用性が限られていることが証明されている。生物学的マトリックスの構造および機能をより効率的に模倣することができる合成物質の設計は、依然として困難な目標のままである。
【0004】
［概要］
生理活性ペプチドを含んでいるペプチド両親媒性物質（ＰＡ）、生理活性ＰＡを呈しているナノファイバー、およびそれらの使用方法が本明細書中に提供される。いくつかの実施形態において、ペプチド両親媒性物質は、ニューロン細胞を生成する方法において使用され得る。他の実施形態において、ペプチド両親媒性物質は、脊髄損傷などの中枢神経系損傷を治療する方法において使用され得る。
生理活性ペプチドを含んでいるペプチド両親媒性物質（ＰＡ）、生理活性ＰＡを呈しているナノファイバー、およびそれらの使用方法が本明細書中に提供される。いくつかの実施形態において、ペプチド両親媒性物質は、ニューロン細胞を生成する方法において使用され得る。他の実施形態において、ペプチド両親媒性物質は、脊髄損傷などの中枢神経系損傷を治療する方法において使用され得る。
【0005】
いくつかの実施形態において、ペプチド両親媒性物質が本明細書中に提供される。ペプチド両親媒性物質は、疎水性尾部、構造ペプチドセグメント、荷電ペプチドセグメント、および生理活性ペプチドを含んでいる。本明細書に記載されるペプチド両親媒性物質を含んでいるナノファイバーが、さらに本明細書中に記載される。ナノファイバーは、１つ以上のフィラーペプチド両親媒性物質をさらに含んでもよい。フィラーペプチド両親媒性物質は、疎水性尾部、構造ペプチドセグメント、および荷電ペプチドセグメントを含んでいる。フィラーペプチド両親媒性物質は、生理活性部分を含んでいない。
【0006】
いくつかの実施形態において、疎水性尾部が、炭素数８～２４のアルキル鎖（Ｃ８－２４）を含み得る。いくつかの実施形態において、疎水性尾部は炭素数１６のアルキル鎖（Ｃ１６）を含んでいる。
【0007】
いくつかの実施形態において、構造ペプチドセグメントは、Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、またはＶＥＶＡ２を含んでいる。いくつかの実施形態において、構造ペプチドセグメントは、隣接する構造ペプチドセグメントとβシート様構造または他の安定化相互作用（例えば、隣接するナノファイバーの自己集合を促進する）を形成する傾向を有している。いくつかの実施形態において、構造ペプチドセグメントは、４以下のβシート構造形成に関する全体の傾向を有している。
【0008】
いくつかの実施形態において、荷電ペプチドセグメントは、酸性、塩基性、または両性イオン性ペプチドセグメントを含んでいる。いくつかの実施形態において、荷電ペプチドセグメントは、２～４個のグルタミン酸（Ｅ）残基を含んでいる。例えば、荷電ペプチドセグメントは、ＥＥ、ＥＥＥ、またはＥＥＥＥを含み得る。
【0009】
いくつかの実施形態において、生理活性ペプチドはＩＫＶＡＶを含んでいる。生理活性ペプチドは、リンカーによって荷電ペプチドセグメントに取り付けられ得る。例えば、リンカーは、単一のグリシン（Ｇ）残基であり得る。
【0010】
いくつかの実施形態において、ペプチド両親媒性物質は、ＩＫＶＡＶ（Ｇ）Ｅ４Ｖ２Ａ２－Ｃ８－２４を含んでいる。他の実施形態において、ペプチド両親媒性物質は、ＩＫＶＡＶ（Ｇ）Ｅ４Ａ２Ｇ２－Ｃ８－２４を含んでいる。他のいくつかの実施形態において、ペプチド両親媒性物質は、ＩＫＶＡＶ（Ｇ）Ｅ４ＶＥＶＡ２－Ｃ８－２４を含んでいる。
【0011】
いくつかの実施形態において、フィラーペプチド両親媒性物質は、Ｅ４Ｖ２Ａ２－Ｃ８－２４を含んでいる。いくつかの実施形態において、フィラーペプチド両親媒性物質は、Ｅ４Ａ２Ｇ２－Ｃ８－２４を含んでいる。いくつかの他の実施形態において、フィラーペプチド両親媒性物質は、Ｅ４ＶＥＶＡ２－Ｃ８－２４を含んでいる。
【0012】
いくつかの実施形態において、開示されたペプチド両親媒性物質またはペプチド両親媒性物質ナノファイバーは、細胞培養方法において使用され得る。例えば、開示されたペプチド両親媒性物質またはペプチド両親媒性物質ナノファイバーは、ニューロン細胞培養方法において使用され得る。いくつかの実施形態において、開示されたペプチド両親媒性物質またはペプチド両親媒性物質ナノファイバーは、運動ニューロンの培養に使用され得る。
【0013】
いくつかの実施形態において、中枢神経系（ＣＮＳ）損傷を治療する方法が本明細書中に提供され、ＣＮＳ損傷を患っている被験体に、本明細書中に開示されたペプチド両親媒性物質を含んでいる薬学的組成物を投与することを含んでいる。いくつかの実施形態において、ＣＮＳ損傷は脊髄損傷である。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は非経口的に投与される。
【0014】
［図面の簡単な説明］
図１Ａ～Ｌ。ペプチド両親媒性物質（ＰＡ）によって形成された超分子ナノファイバーの特徴付け。（Ａ）ＩＫＶＡＶ ＰＡの概略の分子構造、ＩＫＶＡＶ ＰＡは、（Ｂ）Ｖ２Ａ２、（Ｃ）Ａ２Ｇ２、および（Ｄ）ＶＥＶＡ２を含んでいる。（Ｅ～Ｇ）ＫＣｌおよびＮａＣｌ水溶液の中の（Ｅ）Ｖ２Ａ２、（Ｆ）Ａ２Ｇ２、および（Ｇ）ＶＥＶＡ２の極低温ＴＥＭ顕微鏡写真（［ＰＡ］＝０．０１ｗｔ％、［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）。（Ｈ～Ｊ）（Ｈ）Ｖ２Ａ２、（Ｉ）Ａ２Ｇ２、および（Ｊ）ＶＥＶＡ２のＳＥＭ顕微鏡写真。（Ｋ）Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、およびＶＥＶＡ２（オレンジ色）のフィルムサンプルのＦＴ－ＩＲスペクトル（１５００～１８００ｃｍ－１）。（Ｌ）ＫＣｌおよびＮａＣｌ水溶液中のＶ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、およびＶＥＶＡ２（オレンジ色）のＷＡＸＳプロファイル（［ＰＡ］＝５．３ｍＭ、［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）。
図１Ａ～Ｌ。ペプチド両親媒性物質（ＰＡ）によって形成された超分子ナノファイバーの特徴付け。（Ａ）ＩＫＶＡＶ ＰＡの概略の分子構造、ＩＫＶＡＶ ＰＡは、（Ｂ）Ｖ２Ａ２、（Ｃ）Ａ２Ｇ２、および（Ｄ）ＶＥＶＡ２を含んでいる。（Ｅ～Ｇ）ＫＣｌおよびＮａＣｌ水溶液の中の（Ｅ）Ｖ２Ａ２、（Ｆ）Ａ２Ｇ２、および（Ｇ）ＶＥＶＡ２の極低温ＴＥＭ顕微鏡写真（［ＰＡ］＝０．０１ｗｔ％、［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）。（Ｈ～Ｊ）（Ｈ）Ｖ２Ａ２、（Ｉ）Ａ２Ｇ２、および（Ｊ）ＶＥＶＡ２のＳＥＭ顕微鏡写真。（Ｋ）Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、およびＶＥＶＡ２（オレンジ色）のフィルムサンプルのＦＴ－ＩＲスペクトル（１５００～１８００ｃｍ－１）。（Ｌ）ＫＣｌおよびＮａＣｌ水溶液中のＶ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、およびＶＥＶＡ２（オレンジ色）のＷＡＸＳプロファイル（［ＰＡ］＝５．３ｍＭ、［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）。
【0015】
図２Ａ～Ｉ。超分子ＩＫＶＡＶ ＰＡ内の動力学は、ヒト運動ニューロン（ＭＮ）信号に対して異なる効果を誘導する。（Ａ）ＫＣｌおよびＮａＣｌ水溶液中のＶ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、およびＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡに包埋されたＤＰＨ（２．８μＭ）の２５℃での蛍光脱分極プロファイル（λｅｘ＝３３６ｎｍ、λｅｍ＝４５０ｎｍ）（［ＰＡ］＝１００μＭ、［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）。（Ｂ）１０μ秒後のＶ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、およびＶＥＶＡ２（オレンジ色）ＰＡを含んでいる、単一ＩＫＶＡＶ ＰＡファイバーの自己集合構造および粗視化表示。顕微鏡写真は、（青色で）シミュレーションボックス内にファイバー形成軸を通る部分的な周期的画像を含んでいる。水およびイオンは、明確にするために省略されている。（Ｃ）Ｂにおいて形成された、Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、およびＶＥＶＡ２（オレンジ色）構造を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡの動力学解析。（Ｄ）ＫＣｌおよびＮａＣｌ水溶液中のＶ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡに包埋されたＤＰＨ（２．８μＭ）の２５℃での蛍光発光スペクトル（λｅｘ＝３３６ｎｍ）（［ＰＡ］＝１００μＭ、［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）。（Ｅ）Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡの含水量分析。（Ｆ）Ａ２Ｇ２およびラミニン上で培養した、ｂ－１インテグリン（ピンク、ＩＴＧＢ１）を含んでいるＭＮ神経突起（ＴＵＪ－１、緑色）の代表的な三次元ＳＩＭ顕微鏡写真（左側）および陰影再構成（右側）。（Ｇ）７２時間でのＡ２Ｇ２（青色）およびラミニン（黒色）マトリックス上で培養したＭＮにおけるＩＴＧＢ１の強度解析。７２時間での、Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいる超分子ＩＫＶＡＶマトリックス上で培養したＭＮにおけるＩＴＧＢ１および下流キナーゼ（ＩＬＫ、ｐＦＡＫ、ＦＡＫ）のウエスタンブロット解析（Ｈ）および（Ｉ）正規化されたタンパク質レベル。スケールバー：１０ｍｍ。データは、少なくとも４つの独立した分化の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【0016】
図３Ａ～Ｏ。ヒト運動ニューロン（ＭＮ）成熟に対するＡ２Ｇ２含有ＩＫＶＡＶ ＰＡの分子間凝集力の影響。（Ａ）超分子マトリックス上でのヒトＭＮ分化およびその培養の概略図。Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいる超分子ＩＫＶＡＶマトリックスおよびラミニン（黒色）上で培養したＭＮにおけるインテグリン活性化（ＩＴＧＢ１）、シグナル伝達経路（ＩＬＫ）および運動ニューロン成熟（ＣｈＡＴ）に関連する（Ｂ）ウエスタンブロットおよび（Ｃ）正規化されたタンパク質発現レベル（６０日後）。全ての値はアクチンに対して正規化した。（Ｄ）Ａ２Ｇ２含有ＩＫＶＡＶの動的提示に際して細胞挙動を媒介するインテグリンおよびシグナル伝達経路の概略図。全ての値はアクチンまたは総ＦＡＫ発現に対して正規化した。（Ｅ）Ａ２Ｇ２対ラミニン上で培養したＭＮのプロテオミクス変化を呈しているボルカノプロット。平均ｌｏｇ２（倍 変化）対Ｐ値（－ｌｏｇ１０）を示す。２倍変化およびＦＤＲ＜０．０５によって上方制御および下方制御されたタンパク質を、それぞれ緑色および赤色のドットによって標識する。（Ｆ）Ａ２Ｇ２コーティング対ラミニンコーティング中で培養したＭＮにおいて同定されたタンパク質の上方制御グループおよび下方制御グループにおいて濃縮された最も有意なＧＯタームのサブセット。（Ｇ）細胞培地中に放出されたＬＤＨ濃度によって評価した細胞生存率（６０日目）。（Ｈ）Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡおよびラミニン（黒色）マトリックス上で培養したＭＮ中のＣｈＡＴ＋細胞の定量（６０日後）。（Ｉ，Ｊ）（Ｉ）Ａ２Ｇ２および（Ｊ）ラミニンマトリックス上で培養したヒトのＭＮの共焦点顕微鏡画像。（Ｋ）Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡおよびラミニン（黒色）マトリックス上で培養したヒトＭＮの総神経突起プロセスの分析（６０日後）。（Ｌ）Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）およびラミニン（灰色）上で、インビトロで６０日間培養したＭＮの樹状突起分岐のＳｈｏｌｌ分析。（Ｍ）Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡおよびラミニン（白色）マトリックス上で培養したヒトＭＮの代表的な代表的な共焦点顕微鏡写真（６０日後）。細胞を、運動ニューロンマーカーＣｈＡＴ（緑色）、微小管関連タンパク質－２（ＭＡＰ－２、赤色）および核（ＤＡＰＩ）で染色した。（Ｎ）Ｍに示される画像のＤＡＰＩチャネル顕微鏡写真。（Ｏ）ＭおよびＮにおいて参照された異なるマトリックス上の細胞分布のヒストグラム分析。スケールバー：（Ｍ、Ｎ）１００μｍ。データは、少なくとも３つの独立した分化の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【0017】
図４Ａ～Ｐ。機能的成熟および再生に対する超分子集合体内の分子動力学の影響。（Ａ、Ｂ）（Ａ）Ａ２Ｇ２および（Ｂ）ラミニンマトリックス上で培養したヒトＭＮ神経突起に沿って分布したシナプス小胞（シナプス後ＰＳ９５およびシナプス前ＳＹＮ－１）の代表的な共焦点顕微鏡写真（５０日目）。（Ｃ）Ａ２Ｇ２およびラミニンコーティング上で培養したＭＮ上のＰＳＤ９５およびＳＹＮ－１の強度解析。Ａ２Ｇ２（青色）およびラミニン（黒色）上で培養したヒトＭＮにおけるシナプス前マーカーおよびシナプス後マーカー（それぞれＳＹＮ－１およびＰＳ９５）の（Ｄ）ウエスタンブロットおよび（Ｅ）正規化されたタンパク質レベル。全ての値はアクチンに対して正規化した。（Ｆ）Ａ２Ｇ２超分子ペプチド両親媒性物質でコーティングしたＭＥＡプレート上で４０日間培養したヒトＭＮの明視野画像。種々のＩＫＶＡＶ ＰＡ、ラミニンまたはグリアコーティング中のＭＮ培養物における、（Ｇ）スパイク数の差および（Ｈ）電極当たりのバースト数および（Ｉ）同調性指数を表すプロット。（Ｊ）Ａ２Ｇ２およびラミニンマトリックス上で培養し、パッチ電極を通してＴｅｘａｓ Ｒｅｄデキストランで満たした、ヒトＭＮの２光子顕微鏡画像（４８～４９日目）。（Ｋ）活動電位を繰り返し発火することができる、Ａ２Ｇ２およびラミニンマトリックス上で成長したニューロンのパーセンテージ。（Ｌ）Ａ２Ｇ２およびラミニンマトリックス上で成長したＭＮ由来の活動電位の代表的な例。Ａ２Ｇ２上で成長したＭＮは有意に大きく、上昇速度および降下速度がより速かった。（Ｍ）マウス脊髄における背腹性の挫傷の概略図。（Ｎ）生理食塩水溶液（コントロール）、Ｖ２Ａ２（赤色）Ａ２Ｇ２（青色）で処理した動物のＢａｓｓｏ Ｍｏｕｓｅ Ｓｃａｌｅ（ＢＭＳ）スコア。生理食塩水溶液（コントロール）、Ｖ２Ａ２（赤色）およびＡ２Ｇ２（青色）で処理した脊髄におけるβ－１インテグリン受容体（ＩＴＧＢ１）、種々のＥＣＭタンパク質（フィブロネクチンおよびラミニン）、アストログリアＧＦＡＰおよびニューロンＧＡＰ４３マーカーの（Ｏ）ウエスタンブロットおよび（Ｐ）正規化されたタンパク質レベル。全ての値は、ＧＡＰＤＨに対して正規化した。インビボデータは、少なくとも８匹の動物の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【0018】
図５Ａ～Ｆ。（ａ）Ｖ２Ａ２、（ｂ）Ａ２Ｇ２、（ｃ）ＶＥＶＡ２および（ｄ）ＶＥ（－）ＶＡ２のためのＭＡＲＴＩＮＩビーズタイプおよび電荷。（ｅ）ＰＡの電荷量。（ｆ）Ｖ２Ａ２（挿入物）の各骨格ビーズのための生の半径方向分布関数であり、第１の溶媒和球のための水接触を与えるために統合された領域を青色で示している。
【0019】
図６Ａ～Ｆ。ＩＫＶＡＶ ＰＡの液体クロマトグラフィー－質量分析。（ａ－ｃ）精製された（ａ）Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶ、（ｂ）Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶ（ｃ）Ｃ１６ＶＥＶＡ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶの分析用高性能液体クロマトグラフィー（分析用ＨＰＬＣ）トレース。（ｄ～ｆ）（ｄ）Ｃ１６－Ｖ２Ａ２Ｅ４－ＧＩＫＶＡＶ、（ｅ）Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶおよび（ｆ）Ｃ１６ＶＥＶＡ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）。
【0020】
図７Ａ～Ｉ。ＩＫＶＡＶ ＰＡの極低温－ＴＥＭおよびＳＥＭ画像。（ａ～ｃ）概略的な分子構造、（ａ、ｄ、ｇ）Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶ、（ｂ、ｅ、ｈ）Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶ（ｃ、ｆ、ｉ）Ｃ１６ＶＥＶＡ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶの、（ｄ～ｆ）極低温－ＴＥＭおよび（ｇ～ｉ）ＳＥＭ顕微鏡写真。
【0021】
図８Ａ～Ｄ。ＤＰＨ包埋ＩＫＶＡＶ ＰＡのＴＥＭ画像。（ａ）１，６－ジフェニル－１，３，５－ヘキサトリエン（ＤＰＨ）の概略の分子構造。（ｂ～ｄ）酢酸ウラニルで染色した、ＤＰＨ包埋ＰＡ（ｂ）Ｃ１６－Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶ、（ｃ）Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶおよび（ｄ）Ｃ１６ＶＥＶＡ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶのＴＥＭ顕微鏡写真（ＫＣｌおよびＮａＣｌ水溶液（［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）中、［ＰＡ］＝１００μＭ、［ＤＰＨ］＝２．８μＭ）。
【0022】
図９Ａ～Ｆ。ＴＭＡ－ＤＰＨ包埋ＩＫＶＡＶ ＰＡのＴＥＭ画像。（ａ）１－（４－トリメチルアンモニウムフェニル）－６－フェニル－１，３，５－ヘキサトリエンｐ－トルエンスルホネート（ＴＭＡ－ＤＰＨ）の概略的な分子構造。（ｂ～ｄ）酢酸ウラニルで染色した、ＴＭＡ－ＤＰＨ包埋ＩＫＶＡＶ ＰＡ（ｂ）Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶ（Ｖ２Ａ２）、（ｃ）Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶ（Ａ２Ｇ２）および（ｄ）Ｃ１６ＶＥＶＡ２ＧＩＫＶＡＶ（ＶＥＶＡ２）のＴＥＭ顕微鏡写真（ＫＣｌおよびＮａＣｌ水溶液（［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）中、［ＰＡ］＝１００μＭ、［ＴＭＡ－ＤＰＨ］＝２．８μＭ）。（ｅ）ＫＣｌおよびＮａＣｌ水溶液中で、Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２およびＶＥＶＡ２に埋め込まれた、ＴＭＡ－ＤＰＨ（２．８μＭ）の２５℃での蛍光脱分極プロファイル（λｅｘ＝３３６ｎｍ、λｅｍ＝ ４５０ｎｍ）（［ＰＡ］＝１００μＭ、［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）。（ｆ）ＫＣｌおよびＮａＣｌ水溶液中で、Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２およびＶＥＶＡ２に埋め込まれた、ＴＭＡ－ＤＰＨ（２．８μＭ）の２５℃での蛍光発光スペクトル（λｅｘ＝３３６ｎｍ）（［ＰＡ］＝１００μＭ、［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）。
【0023】
図１０。脂質二重層内の炭化水素尾部へのＤＰＨ位置。
【0024】
図１１Ａ～Ｆ。ＩＫＶＡＶ ＰＡナノファイバーのシミュレーション結果。（ａ～ｃ）１０μ秒後の、（ａ）Ｖ２Ａ２、（ｂ）Ａ２Ｇ２、および（ｃ）ＶＥＶＡ２ＩＫＶＡＶ ＰＡの単一ファイバーの自己集合構造および粗視化表示。ファイバーは、パッチコアを示すために、Ｃ１６尾部以外全て透明で表される。顕微鏡写真は、ファイバー形成軸を通る部分的な周期的画像を含んでいる。シミュレーションボックスは青色で表示される。水およびイオンは、明確にするために省略されている。（ｄ～ｆ）（ｄ）Ｖ２Ａ２、（ｅ）Ａ２Ｇ２および（ｆ）ＶＥＶＡ２の二乗平均平方偏差（ＲＭＳＤ）対時間を表すグラフ。ＲＭＳＤプロットは、５つの独立したシミュレーションの平均である。
【0025】
図１２Ａ～Ｅ。βシート領域に置かれたＥに荷電したＶＥ（－）ＶＡ２ ＰＡのシミュレーション結果。（ａ、ｂ）１０μ秒後の、ＶＥ（－）ＶＡ２ファイバーの自己集合構造。（ａ）βシート領域はオレンジ色で表され、ＩＫＶＡＶは緑色で表され、ファイバーの残りは黒色で表される。（ｂ）ファイバーはパッチコアを示すために、Ｃ１６尾部以外全て透明で表される。顕微鏡写真は、ファイバー形成軸を通る部分的な周期的画像を含む。シミュレーションボックスは青色で表示される。水およびイオンは、明確にするために省略されている。（ｃ）Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２と比較したＶＥ（－）ＶＡ２の水接触グラフ。（ｄ）（ａ～ｂ）Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２と比較したＶＥ（－）ＶＡ２のダイナミズム解析の二乗平均平方偏差（ＲＭＳＤ）対時間を表すグラフ。ｃ～ｄにおける分析は、５つの独立したシミュレーションの結果である。
【0026】
図１３Ａ～Ｆ。スクランブルＶＫＩＶＡ ＰＡの液体クロマトグラフィー－質量分析。（ａ～ｃ）精製した（ａ）Ｃ１６－Ｖ２Ａ２Ｅ４－ＧＶＫＩＶＡ、（ｂ）Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＶＫＩＶＡ（ｃ）Ｃ１６ＶＥＶＡ２Ｅ４ＧＶＫＩＶＡの分析用高性能液体クロマトグラフィー（分析用ＨＰＬＣ）トレース。（ｄ～ｆ）（ｄ）Ｃ１６－Ｖ２Ａ２Ｅ４－ＧＩＫＶＡＶ、（ｅ）Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＶＫＩＶＡおよび（ｆ）Ｃ１６ＶＥＶＡ２Ｅ４ＧＶＫＩＶＡのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）。
【0027】
図１４Ａ～Ｈ。スクランブルＶＫＩＶＡ－ＰＡのシミュレーション結果。（ａ～ｆ）１０μ秒後の、（Ａ、ｂ）Ｖ２Ａ２（赤色）、（ｃ、ｄ）Ａ２Ｇ２（青色）、および（ｅ，ｆ）ＶＥＶＡ２（オレンジ色）ＶＫＩＶＡの単一ファイバーの自己集合構造および粗視化表示。カラーコードは、ＰＡ配列において表示される。顕微鏡写真は、ファイバー形成軸を通る部分的な周期的画像を含む。シミュレーションボックスは青色で表示される。水およびイオンは、明確にするために省略されている。（ｂ、ｄ、ｆ）ファイバーは、そのパッチ性を示すために、Ｃ１６尾部以外全て透明で表示される。Ａ２Ｇ２平衡化構造は、典型的なファイバー構造とは異なる。（ｇ）ＩＫＶＡＶおよびＶＫＩＶＡ－ＰＡの水接触グラフ。（ｈ）スクランブルＶＫＩＶＡおよびＩＫＶＡＶ ＰＡのＣ１６クラスター解析。Ｃ１６クラスターの数の定量は、不規則性の定性的測定として使用されてきた。
【0028】
図１５Ａ～Ｆ。スクランブルＶＫＩＶＡ－ＰＡのＣｒｙｏ－ＴＥＭ顕微鏡写真。スクランブルＩＫＶＡＶ配列（ａ、ｄ）Ｃ１６－Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＶＫＩＶＡ、（ｂ、ｅ）Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＶＫＩＶＡ（ｃ、ｆ）Ｃ１６ＶＥＶＡ２Ｅ４ＧＶＫＩＶＡの（ａ～ｃ）概略的な分子構造および（ｄ～ｆ）Ｃｒｙｏ－ＴＥＭ顕微鏡写真。スケールバー：５００ｎｍ。
【0029】
図１６Ａ～Ｆ。骨格ＰＡの液体クロマトグラフィー－質量分析。（ａ～ｃ）精製した、（ａ）Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４、（ｂ）Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４（ｃ）Ｃ１６ＶＥＶＡ２Ｅ４の分析用高性能液体クロマトグラフィー（分析用ＨＰＬＣ）トレース。（ｄ～ｆ）（ｄ）Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４、（ｅ）Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４および（ｆ）Ｃ１６ＶＥＶＡ２Ｅ４のエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）。
【0030】
図１７Ａ～Ｆ。骨格－ＰＡのＣｒｙｏ－ＴＥＭ顕微鏡写真。骨格配列（ａ、ｄ）Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４、（ｂ、ｅ）Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４（ｃ、ｆ）Ｃ１６ＶＥＶＡ２Ｅ４の（ａ～ｃ）概略的な分子構造および（ｄ～ｆ）Ｃｒｙｏ－ＴＥＭ顕微鏡写真。
【0031】
図１８Ａ～Ｋ。他のラミニン模倣配列の分析。（ａ、ｃ、ｅ、ｇ、ｉ）１０μ秒後の、生理活性エピトープ（ａ、ｂ）ＬＧＴＩＰＧ、（ｃ、ｄ）ＬＲＧＤＮ、（ｅ、ｆ）ＰＤＧＳＲ、（ｇ、ｈ）ＲＧＤ、（ｉ、ｊ）ＹＩＧＳＲ配列を有するＣ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４Ｇファイバーの極低温ＴＥＭ顕微鏡写真および（ｂ、ｄ、ｆ、ｈ、ｊ）自己集合構造顕微鏡写真。シミュレートされた顕微鏡写真は、ファイバー形成軸を通る部分的な周期的画像を含む。シミュレーションボックスは青色で表示される。水およびイオンは、明確にするために省略されている。（ｋ）ＬＧＴＩＰＧ、ＬＲＧＤＮ、ＰＤＧＳＲ、ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲ配列についての水接触分析。ＩＫＶＡＶを参照として使用した。
【0032】
図１９Ａ～Ｉ。ＩＫＶＡＶ ＰＡマトリックス上のｈｉＰＳＣ由来ＭＮの短期分析（７２時間）。（ａ）実験パラダイムの概略図。（ｂ）７２時間後に、ａｌｅｘａ－４８８色素（緑色）に共有結合したＡ２Ｇ２ ＩＫＶＡＶ ＰＡ上のＴＵＪ－１（赤色）で標識したＭＮのスペクトル照明顕微鏡写真。（ｃ）７２時間での、種々の条件下での細胞数／ｍｍ２の定量。（ｄ、ｅ）Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡ超分子ファイバーおよびラミニン（白色）コーティング上で培養したＭＮの代表的な共焦点顕微鏡写真。（ｄ、ｅ）細胞を、ニューロン（ＴＵＪ－１およびＭＡＰ－２、赤色）および運動ニューロン（ＩＳＬ１／２およびＣｈＡＴ、緑色）マーカーで一貫して染色した。核ＤＮＡをＤＡＰＩ、青色で染色した。（ｆ～ｈ）７２時間での、Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡ超分子ファイバーおよびラミニン（黒色）コーティング上で培養した、（ｆ）ＩＳＬ１／２＋および（ｇ）ＣｈＡＴ＋（ｈ）ＴＵＪ－１＋ＭＮパーセンテージの定量化。（ｉ）細胞生存率は、７２時間で、ＬＤＨアッセイによって評価した。スケールバー：５０μｍ。データは、少なくとも４つの独立した分化の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）、ｎ．ｓ：有意ではない。
【0033】
図２０Ａ～Ｉ。ＩＫＶＡＶ ＰＡマトリックス上のＦＯＸＡ２集団の短期分析。（ａ、ｂ）７２時間での、（ａ）Ａ２Ｇ２ ＩＫＶＡＶ ＰＡおよび（ｂ）ラミニンマトリックス上で培養したＭＮの代表的な共焦点顕微鏡写真。細胞を、底板細胞マーカーＦＯＸＡ－２（緑色）、ニューロンマーカーＴＵＪ－１（赤色）および核マーカーＤＡＰＩ（青色）で染色した。７２時間での、Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡ超分子ファイバーおよびラミニン（黒色）上で培養したＭＮ中の底板マーカーＦＯＸＡ－２および増殖マーカーＰＨ３に関連するタンパク質発現の（ｃ）ウエスタンブロットおよび（ｄ）正規化されたレベル。（ｅ、ｆ）７２時間での、（ｅ）Ａ２Ｇ２ ＩＫＶＡＶ ＰＡおよび（ｆ）ラミニンマトリックス上で培養したＭＮの代表的な共焦点顕微鏡写真。細胞を、底板マーカーＦＯＸＡ－２（緑色）、ニューロンマーカーＴＵＪ－１（白色）、増殖マーカーＫＩ６７（赤色）および核マーカーＤＡＰＩ（青色）で染色した。（ｇ～ｉ）７２時間での、Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡ超分子ファイバーおよびラミニン（黒色）マトリックス上で培養した、（ｇ）ＦＯＸＡ２＋、（ｈ）ＫＩ６７＋および（ｉ）ＦＯＸＡ２＋／ＫＩ６７＋ＭＮパーセンテージの定量。全ての値をアクチンに対して正規化した。スケールバー：２５μｍ。データは、少なくとも３つの独立した分化の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【0034】
図２１Ａ～Ｇ。ＩＫＶＡＶ ＰＡ上で培養したヒトＭＮにおけるＩＴＧＢ１発現。（ａ～ｄ）７２時間での、Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡ超分子ファイバーおよびラミニンコーティング上で培養したＭＮ（緑色でＴＵＪ－１で標識した）の神経突起におけるＩＴＧＢ１受容体の発現の代表的な三次元共焦点顕微鏡写真。（ｆ、ｇ）ｃおよびｄにおいて参照された共焦点画像条件の３次元陰影再構成（Three-dimensional shadow reconstructions）。（ｅ）７２時間での、Ｖ２Ａ２（赤色）とＶＥＶＡ２（オレンジ色）マトリックス上で培養したＭＮにおけるＩＴＧＢ１の強度解析。スケールバー：２μｍ。
【0035】
図２２Ａ～Ｆ。ＩＫＶＡＶ ＰＡへの付着および生存ＭＮに対するαＩＴＧＢ１遮断抗体の影響。（ａ）７２時間のαβ－１またはβ－４ ＩＴＧ抗体の存在下での超分子マトリックス上でのｈｉＰＳＣ由来ＭＮ分化およびその後の培養の概略図。（ｂ）７２時間で細胞培地中に放出されたＬＤＨレベルによって評価した、ＩＴＧＢ１で処理したＭＮの細胞生存率。（ｃ、ｄ）７２時間での、Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡ超分子ファイバーおよびラミニン（黒色）マトリックス上で培養した、（ｃ）β－１インテグリンまたは（ｄ）β－４インテグリン遮断抗体で処理したＭＮの代表的な共焦点顕微鏡写真。細胞をニューロンマーカーＴＵＪ－１（赤色）、運動ニューロンマーカーＩＳＬ１／２（緑色）で染色し、核をＤＡＰＩ（青色）で染色した。（ｅ、ｆ）ｃおよびｄにおいてそれぞれ参照された状態の細胞数／ｍｍ２の定量化。スケールバー：５０μｍ。データは、３つの独立した分化の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）、ｎ．ｓ：有意ではない。
【0036】
図２３Ａ～Ｆ。ラミニン関連シグナル伝達に対する機械的特性の影響。（ａ）ｈｉＰＳＣ由来ＭＮ分化および異なる超分子マトリックスの厚さに対するその培養の概略図。（ｂ）Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２およびＶＥＶＡ２を含んでいる超分子ＩＫＶＡＶマトリックスの薄いコーティングおよび厚いゲルの弾性率（灰色および白色のグラフ）および貯蔵弾性率（濃い灰色のグラフ）。７２時間での、Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２を含んでいる超分子ＩＫＶＡＶマトリックスの（ｃ、ｄ）厚いコーティングまたは（ｅ、ｆ）薄いコーティング上で培養したヒトＭＮにおけるＩＴＧＢ１受容体活性化およびシグナル伝達経路（ＩＬＫ、ｐ－ＦＡＫ、ＦＡＫ）の（ｃ、ｅ）ウエスタンブロット解析および（ｄ、ｆ）正規化された発現レベル。ラミニンのコーティングをコントロールとして使用した。データは、少なくとも３回の独立した実験または分化の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【0037】
図２４Ａ～Ｉ。ＩＫＶＡＶ ＰＡおよびラミニンコーティングのプロフィロメトリー。（ａ～ｈ）インビトロにおける３日後（上部画像）後および６０日後（底部画像）の、（ａ、ｂ）Ｖ２Ａ２、（ｃ、ｄ）Ａ２Ｇ２、（ｅ、ｆ）ＶＥＶＡ２を含んでいるＩＫＶＡＶ
ＰＡおよび（ｇ、ｈ）ラミニンコーティングの代表的な画像。（ｉ）ａ～ｈにおいて参照したＩＫＶＡＶ ＰＡおよびラミニンコーティングの厚さ分析。データは、４回の独立した実験の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊＊＊Ｐ＜０．００１）で示す。
ＰＡおよび（ｇ、ｈ）ラミニンコーティングの代表的な画像。（ｉ）ａ～ｈにおいて参照したＩＫＶＡＶ ＰＡおよびラミニンコーティングの厚さ分析。データは、４回の独立した実験の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊＊＊Ｐ＜０．００１）で示す。
【0038】
図２５Ａ～Ｌ。薄いＩＫＶＡＶ ＰＡゲルおよび厚いＩＫＶＡＶ ＰＡゲルのＦＭ特徴付け。（Ａ～ｃ）Ｖ２Ａ２、（ｂ）Ａ２Ｇ２および（ｃ）ＶＥＶＡ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡの薄いコーティングのＡＦＭトポグラフィー画像；（ｄ～ｆ）ａ～ｃに由来する薄いコーティングの弾性率分布；（ｇ～ｉ）Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２およびＶＥＶＡ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡインデンテーション実験の厚いゲルの光学顕微鏡画像；（ｊ～ｌ）ｇ～ｉにおいて参照された状態の厚いゲルの弾性率分布。
【0039】
図２６Ａ～Ｆ。ＩＫＶＡＶ ＰＡゲルのレオロジー測定。（ａ～ｃ）（ａ）Ｖ２Ａ２、（ｂ）Ａ２Ｇ２、および（ｃ）ＶＥＶＡ２を含んでいる超分子ＩＫＶＡＶ ＰＡの０～１００の範囲のせん断ひずみにおける貯蔵弾性率Ｇ’、および損失弾性率Ｇ’’を示すひずみ掃引。（ｄ～ｆ）ａ～ｃにおいて参照された状態の０～１００ｒａｄ／ｓの範囲の角周波数についての貯蔵弾性率Ｇ’を示す周波数掃引。データは、ｎ＝３ゲルの平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す。
【0040】
図２７Ａ～Ｃ。ＩＫＶＡＶ ＰＡマトリックス上で培養したヒトＭＮの時間経過。インビトロで（ａ）３０日、（ｂ）４５日および（ｃ）６０日での、Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡ超分子ファイバーおよびラミニン（黒色）マトリックス上で培養したＭＮの代表的な共焦点顕微鏡写真。細胞をニューロンマーカーＭＡＰ－２（赤色）、運動ニューロンマーカーＣｈＡＴ（緑色）で染色し、核をＤＡＰＩ（青色）で染色した。スケールバー：１００μｍ。
【0041】
図２８Ａ～Ｆ。ＩＫＶＡＶ ＰＡマトリックス上でのヒトＭＮの長期培養。インビトロで（ａ、ｂ）３０日、（ｃ、ｄ）４５日および（ｅ、ｆ）６０日での、Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡ超分子ファイバーおよびラミニンマトリックス上で培養したＭＮの（ａ、ｃ、ｅ）代表的な明視野画像および（ｂ、ｄ、ｆ）共焦点顕微鏡写真。細胞をニューロンマーカーＭＡＰ－２（赤色）、運動ニューロンマーカーＣｈＡＴ（緑色）で染色し、核をＤＡＰＩ（青色）で染色した。スケールバー：２５μｍ。データは、６つの独立した分化の平均である。
【0042】
図２９Ａ～Ｄ。異なる時点でのＩＫＶＡＶ ＰＡ上のヒトＭＮの特徴付け。Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいる超分子ＩＫＶＡＶマトリックス上で培養したヒトＭＮにおける（ａ、ｂ）ＩＴＧＢ１受容体活性化、運動ニューロンマーカーＣｈＡＴおよびＩＳＬ１／２ならびに（ＩＬＫ－１）、および（ｃ、ｄ）ニューロンマーカーＭＡＰ－２およびＴＵＪ－１の（ａ、ｃ）ウエスタンブロット解析および（ｂ、ｄ）正規化されたタンパク質レベル。データは、少なくとも３つの独立した分化の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）、ｎ．ｓ：有意ではない。
【0043】
図３０Ａ～Ｃ。Ａ２Ｇ２ ＩＫＶＡＶ ＰＡおよびラミニン上で培養したヒトＭＮにおける差次的ＩＴＧＢ１発現。（ａ、ｂ）６０日での、（ａ）Ａ２Ｇ２および（ｂ）ラミニンマトリックス上で培養したＭＮ神経突起（ＴＵＪ－１、緑色）およびＩＴＧＢ１受容体発現（ピンク色）の代表的な三次元ＳＩＭ顕微鏡写真。（ｃ）インビトロで６０日での、Ａ２Ｇ２（青色）とラミニンマトリックス上で培養したＭＮにおけるＩＴＧＢ１の強度解析。スケールバー：１０μｍ。
【0044】
図３１Ａ～Ｃ。Ａ２Ｇ２ ＩＫＶＡＶ ＰＡおよびラミニンコート表面上で培養したＭＮにおいて差次的に発現されたタンパク質の遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析によるＭＮ成熟の評価。タンデム質量分析は、ラミニンコート表面上にプレーティングしたＭＮ間の差次的に発現されたタンパク質を明らかにし、これは、ヒトＭＮ成熟に直接関連したＧＯタームに関連する（Ｈｏら、２０１６）。（ａ）Ａ２Ｇ２状態において差次的に発現されたタンパク質から、ヒトＭＮの成熟に関連する５８個のＧＯタームのうち２１個（３６％）を同定した。ＭＮ成熟関連タームはまた、Ａ２Ｇ２ ＩＫＶＡＶ ＰＡ対ラミニンコート表面上にプレーティングした培養物において、上方制御された（ｂ）および下方制御された（ｃ）タンパク質のリストから同定された。横棒グラフは、タンパク質データセットにおいて同定されたＭＮ成熟関連ＧＯタームのｐ値を表す。円グラフは、ＭＮ成熟に関連した前述のＧＯタームと比較した、この研究で得られたＧＯタームのパーセンテージを表す（Ｈｏら、２０１６）。
【0045】
図３２Ａ～Ｃ。ＩＫＶＡＶ ＰＡマトリックス上のヒト運動ニューロン（ＭＮ）の形態学的分析。（ａ、ｂ）インビトロで６０日での、Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡ超分子ファイバーおよびラミニンマトリックス上で培養した単一ヒトＭＮの代表的な共焦点顕微鏡写真。細胞を（ａ）ニューロンマーカーＭＡＰ－２（赤色）で染色した。（ｂ、ｃ）６０日での、ＭＮ培養物の（ｂ）細胞体の大きさおよび（ｃ）一次神経突起の数の分析。スケールバー：２５μｍ。データは、少なくとも３つの独立した分化の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【0046】
図３３Ａ～Ｄ。インビトロで６０日後のＩＫＶＡＶ ＰＡコーティング。（ａ、ｂ）Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡ上で培養したヒトＭＮの代表的な構造的照明顕微鏡（ＳＩＭ）顕微鏡写真。ＭＮをＴＵＪ－１（赤色）で染色し、ＩＫＶＡＶ ＰＡをａｌｅｘａ－４８８色素（緑色）と共有結合させた。（ｃ、ｄ）Ａ２Ｇ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡ上で培養したＭＮの神経突起を呈している走査型電子顕微鏡写真。スケールバー：（ｃ）５μｍ、（ｄ）２μｍ。
【0047】
図３４Ａ～Ｃ。ガラスカバースリップの修飾のためのＩＫＶＡＶペプチドの合成および液体クロマトグラフィー－質量分析。（ａ）ＩＫＶＡＶペプチドの概略の分子構造。（ｂ）精製ＩＫＶＡＶペプチドの分析用高性能液体クロマトグラフィー（分析用ＨＰＬＣ）トレース。（ｃ）ＩＫＶＡＶペプチドのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）。
【0048】
図３５Ａ～Ｅ。ＭＮ付着に対する固定化ＩＫＶＡＶの影響。（ａ）カバースリップ表面上の固定化ＩＫＶＡＶペプチドの概略図。（ｂ）明視野画像。（ｃ、ｄ）ＡＰＴＥＳおよびＩＫＶＡＶペプチドコーティング上で培養したＭＮの代表的な共焦点顕微鏡写真。細胞をニューロンマーカー（ｃ）ＩＳＬ１／２（緑色）およびＴＵＪ－１（赤色）ならびに（ｄ）ＣｈＡＴ（緑色）およびＭＡＰ－２（赤色）で染色した。核をＤＡＰＩ（青色）で染色した。（ｅ）ＡＰＴＥＳおよび固定化ペプチド（ＩＫＶＡＶ）上で培養したｍｍ２当たりの細胞数の定量。Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡおよびラミニンマトリックスをコントロールとして使用した。スケールバー：１００μｍ。データは、３つの独立した分化の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【0049】
図３６Ａ～Ｃ。スクランブルＶＫＩＶＡ ＰＡ上のヒトＭＮ付着。Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、およびＶＥＶＡ２を含んでいるスクランブルＶＫＩＶＡ ＰＡ配列上で培養したＭＮの（ａ）代表的な明視野画像および（ｂ）共焦点画像。細胞を、ｂにおいてＣｈＡＴ、ＭＡＰ－２およびＤＡＰＩで染色した。（ｃ）ａ、ｂにおいて参照された状態の、ｍｍ２培養あたりの細胞数の定量。Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡおよびラミニンマトリックスを、コントロールとして使用した。スケールバー：１００μｍ。データは、３つの独立した分化の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【0050】
図３７Ａ～Ｏ。他のヒトｉＰＳＣ由来運動ニューロン（１１ａ細胞株）に対するＩＫＶＡＶ ＰＡの影響。（ａ、ｂ）Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２ ＩＫＶＡＶ ＰＡ超分子ファイバーおよびラミニンマトリックス上で７２時間培養したＭＮ－１１ａの代表的な顕微鏡写真。細胞は、ニューロンおよび運動ニューロンマーカー、それぞれ、（ａ）におけるＴＵＪ－１（赤色）およびＩＳＬ１／２（緑色）；ＭＡＰ－２（赤色）およびＣｈＡＴ（緑色）で染色した。核をＤＡＰＩ（青色）で染色した。Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡ超分子ファイバーおよびラミニンコーティング上で培養した、（ｃ）７２時間でのｍｍ２あたりの細胞数の定量。（ｃ～ｆ）（ｃ）ＴＵＪ－１＋、（ｄ）ＩＳＬ１／２＋（ｆ）ＣｈＡＴ＋ＭＮパーセンテージの定量。（ｇ）６０日での、Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡおよびラミニンマトリックス上で培養したヒトＭＮ１１ａの代表的な共焦点顕微鏡写真。細胞を、ＭＮマーカーＣｈＡＴ（緑色）、微小管関連タンパク質－２（ＭＡＰ－２、赤色）および核（ＤＡＰＩ）で染色した。（ｈ）ｇにおいて示した画像のＤＡＰＩチャネル顕微鏡写真。（ｉ）ｇおよびｈにおいて参照された異なるマトリックス上の細胞分布のヒストグラム分析。（ｊ）６０日でのｍｍ２あたりの細胞数の定量および（ｋ）６０日でのＶ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡ超分子ファイバーおよびラミニン（黒色）コーティング上で培養したＣｈＡＴ＋ＭＮパーセンテージの定量。（ｌ～ｍ）（ｌ）Ａ２Ｇ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡおよび（ｍ）ラミニン上で培養したＭＮの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）顕微鏡写真。ＩＴＧＢ１受容体活性化、ニューロンマーカーＭＡＰ－２および運動ニューロンマーカーＣｈＡＴの（ｎ）ウエスタンブロットおよび（ｏ）正規化されたタンパク質レベル。全ての値をアクチンに対して正規化した。データは、３つの独立した分化の平均である：スケールバー（ａ、ｂ）５０μｍ、（ｇ、ｈ）１００μｍ、（ｌ，ｍ）５μｍ。データは、３つの独立した分化の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す;ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【0051】
図３８Ａ～Ｌ。ヒトｉＰＳＣ由来皮質ニューロン（ＣｘＮ）に対するＩＫＶＡＶ ＰＡの影響。（ａ）ｉＰＳＣ由来ＣｘＮ分化および超分子マトリックス上でのその培養の概略図。（ｂ～ｄ）（ｂ）７２時間および（ｃ、ｄ）６０日での、Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色） ＩＫＶＡＶ ＰＡ超分子ファイバーおよびラミニン（白色）マトリックス上で培養したＣｘＮの代表的な顕微鏡写真。細胞を、ニューロンマーカーＴＵＪ－１（赤色）、ＭＡＰ－２（緑色）およびＮＥＵＮ（赤色）、ならびに皮質マーカーＳＡＴＢ－２（緑色）で染色した。核をＤＡＰＩ（青）で染色した。（ｅ）７２時間でのｍｍ２あたりの細胞数の定量。（ｆ）６０日での細胞培地中のＬＤＨの放出によって評価した細胞生存率。（ｇ～ｊ）６０日での、Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡ超分子ファイバーおよびラミニン（黒色）コーティング上で培養した（ｇ）ＴＵＪ－１＋、（ｈ）ＭＡＰ２＋、（ｉ）ＮＥＵＮ＋および（ｊ）ＳＡＴＢ－２＋ニューロンパーセンテージの定量。ＩＴＧＢ１受容体活性化、ニューロンマーカーＭＡＰ－２、ＴＵＪ－１およびＮＥＵＮ、ならびにシナプス前マーカーＳＹＰの（ｋ）ウエスタンブロットおよび（ｌ）正規化されたタンパク質レベル。全ての値をアクチンに対して正規化した。データは、３つの独立した分化の平均である。スケールバー：（ｂ）１００μｍ、（ｃ、ｄ）５０μｍ。データは、３つの独立した分化の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【0052】
図３９Ａ～Ｇ。Ｖ２Ａ２およびＶＥＶＡ２ ＩＫＶＡＶ ＰＡ上で培養したヒト運動ニューロン（ＭＮ）における機能マーカーの発現。（ａ、ｂ）インビトロで４０日後の、Ａ２Ｇ２を含んでいるＩＫＶＡＶおよび（ｂ）ラミニンマトリックス上で培養したＭＮの神経突起にそって分布したシナプス小胞（ＳＹＮ－１、シナプス前、およびＰＳ９５、シナプス後）の代表的な共焦点顕微鏡写真。（ｃ、ｄ）Ｖ２Ａ２およびＶＥＶＡ２上で培養したＭＮにおける（ｃ）ＰＳＤ９５および（ｄ）ＳＹＮ－１の平均強度解析。Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２を含んでいる超分子ＩＫＶＡＶマトリックスおよびラミニンコーティング上で培養したヒトＭＮにおけるシナプスマーカーＰＳＤ９５、ＳＹＮ－１およびＳＹＰ、ならびにニューロンマーカーＤＣＸの（ｆ）ウエスタンブロット解析および（ｇ）正規化されたタンパク質レベル。スケールバー：データは、少なくとも３つの独立した分化の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【0053】
図４０Ａ～Ｆ。ＩＫＶＡＶ ＰＡ上で培養したヒトＭＮの電気生理学的研究。（ａ）ニューロン培養物の記録のためのマルチ電極アレイプレート（ＭＥＡプレート）の概略図。（ｂ、ｃ）（ｂ）ＩＫＶＡＶ ＰＡおよび（ｃ）ラミニンでコートしたＭＥＡプレート上にプレーティングしたニューロン（緑色）の概略図。（ｄ）Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡおよびラミニンでコートされたＭＥＡプレート上で培養したＭＮの明視野画像。（ｅ）ｄにおいて参照されたものと同じ状態での加重平均発火速度および（ｆ）バースト電極の数。スケールバー：１００μｍ。データは、２つの独立した分化の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【0054】
図４１Ａ～Ｃ。マウスにおける脊髄損傷試験。（ａ）マウスモデルにおけるＴ１０／１１における脊髄損傷の概略図。（ｂ）Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、Ｖ２Ａ２Ｅ２および生理食塩水溶液（コントロール）で処理した動物の衝撃力グラフ。（ｃ）（ｂ）に記載の状態のＢａｓｓｏ Ｍｏｕｓｅ ｓｃａｌｅ（ＢＭＳ）。
【0055】
［定義］
本明細書に記載されたものと類似または同等のあらゆる方法および材料が、本明細書に記載の実施形態の実施または試験において使用され得るが、いくつかの好ましい方法、組成物、装置、および材料が本明細書に記載される。しかし、本発明の材料および方法を記載する前に、本明細書に記載された特定の分子、組成物、方法論またはプロトコルは、通例の実験および最適化に従って変化し得るため、本発明がこれらの記載事項に限定されないということを理解されたい。また、本説明において使用される用語は、特定のバージョンまたは実施形態のみを説明するためのものであり、本明細書に記載の実施形態の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。
本明細書に記載されたものと類似または同等のあらゆる方法および材料が、本明細書に記載の実施形態の実施または試験において使用され得るが、いくつかの好ましい方法、組成物、装置、および材料が本明細書に記載される。しかし、本発明の材料および方法を記載する前に、本明細書に記載された特定の分子、組成物、方法論またはプロトコルは、通例の実験および最適化に従って変化し得るため、本発明がこれらの記載事項に限定されないということを理解されたい。また、本説明において使用される用語は、特定のバージョンまたは実施形態のみを説明するためのものであり、本明細書に記載の実施形態の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。
【0056】
別途規定されないかぎり、本明細書に用いられるすべての技術的および科学的な用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味をもつ。しかしながら、矛盾する場合には、定義を含んでいる本明細書が優先する。したがって、本明細書に記載の実施形態の文脈において、以下の定義が適用される。
【0057】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるとおり、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他を指示していない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「ペプチド両親媒性物質」への言及は、１つ以上のペプチド両親媒性物質および当業者に公知のその等価物などへの言及である。
【0058】
本明細書で使用される場合、用語「comprise（含む）」およびその言語的変形は、追加の特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などの存在を排除することなく、列挙された特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などの存在を意味する。これに対し、用語「consisting of（～からなる）」およびその言語的変形は、列挙された特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などの存在を示し、列挙されていない任意の特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などは、通常付随する不純物を除いて除外される。語句「consisting essentially of（本質的に～からなる）」は、列挙された特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）など、および組成物、システム、または方法の基本的性質に実質的に影響を及ぼさない任意の追加の特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などを示す。本明細書中の多くの実施形態は、オープンな「comprising（含む）」という言葉を使用して記載されている。そのような実施形態は、代替的にそのような言葉を使用して特許請求または説明され得る、実施形態の複数のクローズな「consisting of（～からなる）」および／または「consisting essentially of（本質的に～からなる）」を包含する。
【0059】
用語「アミノ酸」は、その構造がＤ体およびＬ体の立体異性体の形態を可能にする場合、特段の指示がない限り、すべてのＤ体およびＬ体の立体異性体における、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、およびアミノ酸類似物質を指す。
【0060】
天然アミノ酸には、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）およびバリン（ＶａｌまたはＶ）が含まれる。
【0061】
非天然アミノ酸には、アゼチジンカルボン酸、２－アミノアジピン酸、３－アミノアジピン酸、ベータ－アラニン、ナフチルアラニン（「ｎａｐｈ」）、アミノプロピオン酸、２－アミノ酪酸、４－アミノ酪酸、６－アミノカプロン酸、２－アミノヘプタン酸、２－アミノイソ酪酸、３－アミノイソ酪酸、２－アミノピメリン酸、テトラ－ブチルグリシン（「ｔＢｕＧ」）、２，４－ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２，２’－ジアミノピメリン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、ホモプロリン（「ｈＰｒｏ」または「ｈｏｍｏＰ」）、ヒドロキシリジン、アロ－ヒドロキシリジン、３－ヒドロキシプロリン（「３Ｈｙｐ」）、４－ヒドロキシプロリン（「４Ｈｙｐ」）、イソデスモシン、アロ－イソロイシン、Ｎ－メチルアラニン（「ＭｅＡｌａ」または「Ｎｉｍｅ」）、Ｎ－アルキルグリシン（「ＮＡＧ」）（Ｎ－メチルグリシンを含む）、Ｎ－メチルイソロイシン、Ｎ－アルキルペンチルグリシン（「ＮＡＰＧ」）（Ｎ－メチルペンチルグリシンを含む）、Ｎ－メチルバリン、ナフチルアラニン、ノルバリン（「Ｎｏｒｖａｌ」）、ノルロイシン（「Ｎｏｒｌｅｕ」）、オクチルグリシン（「ＯｃｔＧ」）、オルニチン（「Ｏｒｎ」）、ペンチルグリシン（「ｐＧ」または「ＰＧｌｙ」）、ピペコール酸、チオプロリン（「ＴｈｉｏＰ」または「ｔＰｒｏ」）、ホモリジン（「ｈＬｙｓ」）、およびホモアルギニン（「ｈＡｒｇ」）が含まれが、これらに限定されない。
【0062】
用語「アミノ酸類似物質」は、Ｃ末端カルボキシ基、Ｎ末端アミノ基および側鎖生理活性基の１つ以上が、可逆的もしくは不可逆的に化学的にブロックされているか、または別の生理活性基に修飾されている、天然または非天然アミノ酸を指す。例えば、アスパラギン酸－（ベータ－メチルエステル）はアスパラギン酸のアミノ酸類似物質であり；Ｎ－エチルグリシンはグリシンのアミノ酸類似物質であり；またはアラニンカルボキサミドはアラニンのアミノ酸類似物質である。他のアミノ酸類似物質には、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、Ｓ－（カルボキシメチル）－システイン、Ｓ－（カルボキシメチル）－システインスルホキシドおよびＳ－（カルボキシメチル）－システインスルホンが含まれる。
【0063】
本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって共に連結したアミノ酸の短いポリマーに対するオリゴマーを指す。他のアミノ酸ポリマー（例えば、タンパク質、ポリペプチドなど）とは対照的に、ペプチドは、約５０個以下のアミノ酸長である。ペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸類似物質、および／または修飾アミノ酸を含み得る。ペプチドは、天然に存在するタンパク質の部分配列または非天然（人工）配列であり得る。
【0064】
本明細書で使用される場合、用語「人工」は、ヒトによって設計または調製され、そして天然に存在しない組成物およびシステムを指す。例えば、人工のペプチド、ペプトイド、または核酸は、非天然配列を含んでいるものである（例えば、天然に存在するタンパク質またはその断片と１００％の同一性を有さないペプチド）。
【0065】
本明細書で使用される場合、「保存的」アミノ酸置換は、ペプチドまたはポリペプチド中のアミノ酸が、類似の化学的特性（例えば、サイズまたは電荷）を有している別のアミノ酸で置換されることを指す。本開示の目的のため、以下の８つの群のそれぞれには、互いの保存的置換であるアミノ酸が含まれている：
１）アラニン（Ａ）およびグリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）およびリジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、およびバリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、およびトリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）およびトレオニン（Ｔ）；ならびに
８）システイン（Ｃ）およびメチオニン（Ｍ）。
１）アラニン（Ａ）およびグリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）およびリジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、およびバリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、およびトリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）およびトレオニン（Ｔ）；ならびに
８）システイン（Ｃ）およびメチオニン（Ｍ）。
【0066】
天然に存在する残基は、共通の側鎖の特性に基づいて、例えば以下のクラスに分類することができる：正極性（または塩基性）（ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、およびアルギニン（Ｒ））；負極性（または酸性）（アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ））；中性極性（セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ））；非極性の脂肪族（アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ））；非極性の芳香族（フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ））；プロリンおよびグリシン；ならびにシステイン。本明細書で使用される場合、「半保存的」アミノ酸置換は、ペプチドまたはポリペプチド中のアミノ酸が、同じクラス内の別のアミノ酸で置換されることを指す。
【0067】
いくつかの実施形態において、特に明記しない限り、保存的または半保存的アミノ酸置換はまた、天然残基と同様の化学的特性を有する天然に存在しないアミノ酸残基を包含し得る。これらの非天然残基は、典型的には生体系における合成によるのではなく、化学的ペプチド合成によって組み込まれる。これらには、ペプチド模倣体、および他の逆転または反転した形態のアミノ酸部分が含まれるが、これらに限定されない。本明細書の実施形態は、いくつかの実施形態において、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、および／またはアミノ酸類似物質に限定され得る。
【0068】
非保存的置換は、あるクラスのメンバーを別のクラスのメンバーと置換することを含み得る。
【0069】
本明細書で使用される場合、用語「配列同一性」は、２つのポリマー配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸など）がモノマーサブユニットの同一の配列構成（sequential composition）を有する度合いを指す。用語「配列類似性」は、２つのポリマー配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸など）が保存的および／または半保存的アミノ酸置換によってのみ異なる度合いを指す。「パーセント配列同一性」（または「パーセント配列類似性」）は、（１）２つの最適にアラインメントした配列を、比較ウィンドウ（window of comparison）（例えば、より長い配列の長さ、より短い配列の長さ、特定のウィンドウなど）と比較すること、（２）同一の（または類似の）モノマーを含んでいる（例えば、同じアミノ酸が両方の配列中に存在する、類似のアミノ酸が両方の配列に存在する）位置の数を決定して、一致した位置の数を得ること、（３）一致した位置の数を、比較ウィンドウ（例えば、より長い配列の長さ、より短い配列の長さ、特定のウィンドウ）内の位置の総数で割ること、および（４）結果に１００を掛けて、パーセント配列同一性またはパーセント配列類似性を得ることによって算出される。例えば、ペプチドＡおよびＢが、両方とも２０アミノ酸長であり、且つ１位を除く全てにおいて同一のアミノ酸を有する場合、ペプチドＡおよびペプチドＢは９５％の配列同一性を有する。同一でない位置のアミノ酸が、同じ生物理学的特性（例えば、両方とも酸性）を共有する場合、ペプチドＡおよびペプチドＢは、１００％の配列類似性を有する。別の例として、ペプチドＣが２０アミノ酸長であり、ペプチドＤが１５アミノ酸長であり、且つペプチドＤの１５個のアミノ酸のうちの１４個のアミノ酸がペプチドＣの一部のアミノ酸と同一である場合、ペプチドＣおよびＤは７０％の配列同一性を有する。しかしながら、ペプチドＤは、ペプチドＣの最適な比較ウィンドウに対して９３．３％の配列同一性を有する。本明細書中の「パーセント配列同一性」（または「パーセント配列類似性」）を計算する目的のために、アラインメントした配列内の任意のギャップは、その位置におけるミスマッチとして扱われる。
【0070】
参照配列ＩＤ番号と特定のパーセント配列同一性または類似性（例えば、少なくとも７０％）を有するものとして本明細書に記載される任意のポリペプチドはまた、その参照配列に対する最大数の置換（または末端欠失）を有しているとして表され得る。例えば、配列番号Ｚ（例えば、１００個のアミノ酸）と少なくともＹ％の配列同一性（例えば、９０％）を有している配列は、配列番号Ｚと比較してＸ個（例えば、１０個）までの置換を有し得、したがってまた、「配列番号Ｚと比較して、Ｘ個（例えば、１０個）以下の置換を有している」として表され得る。
【0071】
本明細書で使用される場合、用語「ナノファイバー」は、典型的には１００ナノメートル未満の直径を有する、細長いまたは糸状のフィラメント（例えば、幅または直径よりも有意に大きい長さ寸法を有している）を指す。
【0072】
本明細書で使用される場合、用語「スキャフォールド」は、細胞の増殖および分化を支持可能な物質を指す。
本明細書で使用される場合、用語「超分子」（例えば、「超分子複合体」、「超分子相互作用」、「超分子ファイバー」、「超分子ポリマー」など）は、分子（例えば、ポリマー、高分子など）間の非共有相互作用、および結果として形成される多成分集合体、複合体、系、および／またはファイバーを指す。
本明細書で使用される場合、用語「超分子」（例えば、「超分子複合体」、「超分子相互作用」、「超分子ファイバー」、「超分子ポリマー」など）は、分子（例えば、ポリマー、高分子など）間の非共有相互作用、および結果として形成される多成分集合体、複合体、系、および／またはファイバーを指す。
【0073】
本明細書で使用される場合、用語「自己集合する」および「自己集合」は、構成要素の諸部分から個別の、非ランダムな凝集構造が形成されることを指し；前記集合は、これらの構成要素の固有の化学的または構造的特性および引力のみに起因して、構成要素（例えば、分子）のランダムな運動を介して自発的に生じる。
【0074】
本明細書で使用される場合、用語「ペプチド両親媒性物質」は、少なくとも、非ペプチド親油性（疎水性）セグメント、構造ペプチドセグメントおよび／または荷電ペプチドセグメント（多くの場合、両方）、ならびに任意選択により生理活性セグメント（例えば、リンカーセグメント、生理活性セグメントなど）を含む分子を指す。ペプチド両親媒性物質は、生理的ｐＨにおける正味の電荷、すなわち正味の正電荷または正味の負電荷のいずれかを発現し得るか、または両性イオン性（すなわち、正電荷および負電荷の両方を保有している）であり得る。特定のペプチド両親媒性物質は、（１）疎水性非ペプチドセグメント（例えば、炭素数６以上のアシル基を含んでいる）、（２）構造ペプチドセグメント、（３）荷電ペプチドセグメント、および（４）生理活性セグメント（例えば、リンカーセグメント）からなるか、またはそれらを含んでいる。
【0075】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、用語「親油性部分」または「疎水性部分」は、ペプチド両親媒性物質の一方の末端（例えば、Ｃ末端、Ｎ末端）に配置された部分（例えば、アシル部分、エーテル部分、スルホンアミド部分、またはホスホジエステル部分）を指し、本明細書およびその他では、親油性もしくは疎水性のセグメントまたは構成要素と称されてもよい。疎水性セグメントは、水または別の極性溶媒系中において両親媒性の挙動および凝集体（またはナノスフェアあるいはナノファイバー）形成を提供するのに十分な長さを有するべきである。従って、本明細書に記載された実施形態の文脈において、疎水性構成要素は、好ましくは、式：Ｃｎ－１Ｈ２ｎ－１Ｃ（Ｏ）--（式中、ｎ＝２～２５）の単一の直線状アシル鎖を含んでいる。いくつかの実施形態において、直線状アシル鎖は、親油性基（飽和または不飽和炭素）のパルミチン酸である。しかしながら、他の親油性基（例えば、ステロイド、リン脂質およびフルオロカーボン）をアシル鎖の代わりに使用してもよい。
【0076】
本明細書で互換的に使用される場合、用語「構造ペプチド」または「構造ペプチドセグメント」は、典型的には疎水性セグメントと荷電ペプチドセグメントとの間に配置される、ペプチド両親媒性物質の一部を指す。構造ペプチドは一般に、非極性非荷電側鎖を有する３～１０個のアミノ酸残基（例えば、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｐｈｅ（Ｆ））から構成され、これらのアミノ酸残基は、隣接する構造ペプチドセグメントの構造ペプチドセグメントと水素結合または他の安定化相互作用（例えば、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用など）を形成する傾向により選択される。いくつかの実施形態において、構造ペプチドセグメントを有しているペプチド両親媒性物質のナノファイバーは、顕微鏡によって観察した場合に直線状構造または２Ｄ構造を呈し、および／または円偏光二色性（ＣＤ）によって観察した場合にαヘリックスおよび／またはβシートの特徴を呈する。いくつかの実施形態において、４以下のβシート構造形成に関する全体の傾向を有する構造ペプチドセグメントを有しているペプチド両親媒性物質のナノファイバーは、あまり秩序化されていない特徴（例えば、あまり硬くないβシート構造などのあまり秩序化されていない二次構造）を呈する。いくつかの実施形態において、４以下のβシート構造形成に関する全体の傾向を有する構造ペプチドセグメント（例えば、Ａ２Ｇ２）を有しているペプチド両親媒性物質のナノファイバーは、ランダムコイル構造を形成する傾向を呈する。
【0077】
本明細書で使用される場合、用語「ベータ（β）シート形成ペプチドセグメント」は、（例えば、ＣＤによって分析される場合）βシート様の特徴を呈する傾向を有している構造ペプチドセグメントを指す。いくつかの実施形態において、ベータ（β）シート形成ペプチドセグメント内のアミノ酸は、ベータシート２次構造を形成する傾向により選択される。２０種の天然に存在するアミノ酸から選択された好適なアミノ酸残基の例としては、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ａｌａ（Ａ）、およびＧｌｙ（Ｇ）（ベータシートを形成する傾向の順に列挙されている）が挙げられる。しかし、類似のベータシート形成傾向の天然に存在しないアミノ酸もまた、使用され得る。相互作用してベータシートを形成することができる、および／またはベータシートを形成する傾向を有するペプチドセグメントが理解されている（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｙｏ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６），５：１３０１－１３１５を参照）。
【0078】
本明細書で使用される場合、用語「荷電ペプチドセグメント」は、荷電アミノ酸残基、または生理的条件下で正味の正荷電または負荷電を有するアミノ酸残基に富む（例えば、＞５０％、＞７５％など）ペプチド両親媒性物質の一部分を指す。荷電ペプチドセグメントは、酸性（例えば、負に荷電）、塩基性（例えば、正に荷電）、または両性イオン性（例えば、酸性および塩基性の両方の残基を有している）であり得る。
【0079】
本明細書で使用される場合、用語「カルボキシリッチペプチドセグメント」、「酸性ペプチドセグメント」、および「負荷電ペプチドセグメント」は、カルボン酸側鎖（例えば、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｓｐ（Ｄ）、または非天然アミノ酸）を呈している側鎖を有する１つ以上のアミノ酸残基を含んでいるペプチド両親媒性物質のペプチド配列を指す。カルボキシリッチペプチドセグメントは、任意選択により、１個以上の追加の（例えば、非酸性）アミノ酸残基を含んでもよい。当業者に明らであろうことだが、非天然アミノ酸残基、または酸性側鎖を有するペプチド模倣体を使用することができる。このセグメントには、約２個～約７個のアミノ酸、および／または約３個もしくは４個のアミノ酸が存在し得る。
【0080】
本明細書で使用される場合、用語「アミノリッチペプチドセグメント」、「塩基性ペプチドセグメント」、および「正荷電ペプチドセグメント」は、正に荷電した酸側鎖（例えば、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、もしくは非天然アミノ酸、またはペプチド模倣体）を呈している側鎖を有している１個以上のアミノ酸残基を含んでいるペプチド両親媒性物質のペプチド配列を指す。塩基性ペプチドセグメントは、任意選択により、１個以上の追加の（例えば、非塩基性）アミノ酸残基を含んでもよい。当業者に明らかであろうことだが、塩基性側鎖を有する非天然アミノ酸残基を使用することができる。このセグメントには、約２個～約７個のアミノ酸、および／または約３個もしくは４個のアミノ酸が存在し得る。
【0081】
本明細書で使用される場合、用語「生理活性ペプチド」は、関連する配列、分子、または超分子複合体の作用を媒介するアミノ酸配列を指す。生理活性ペプチド（例えば、ＩＫＶＡＶペプチド）を有しているペプチド両親媒性物質および構造（例えば、ナノファイバー）は、生理活性ペプチドの機能性を示す。
【0082】
本明細書で使用される場合、用語「生体適合性」は、細胞または有機体に対して毒性がない材料および薬剤を指す。いくつかの実施形態において、インビトロで物質を細胞へ添加したときに、細胞死が、約１０％以下、通常は５％未満、より通常は１％未満となる場合、物質は「生体適合性」であると判断される。
【0083】
本明細書で使用される場合、ポリマー、ヒドロゲル、および／または創傷被覆材を記載するために使用される「生分解性」は、本明細書において、生理的条件への曝露下で分解されるか、またはそうでなければ「崩壊する（broken down）」組成物を指す。いくつかの実施形態において、生分解性物質は、細胞機構、酵素分解、化学的プロセス、加水分解などによって崩壊する。いくつかの実施形態において、創傷被覆材または創傷コーティングは、生分解性を提供する加水分解性エステル結合を含んでいる。
【0084】
本明細書で使用される場合、語句「生理的条件」は、組織の細胞内液および細胞外液中で遭遇する可能性が高い化学的（例えば、ｐＨ、イオン強度）および生化学的（例えば、酵素濃度）条件の範囲に関連する。ほとんどの組織について、生理的ｐＨは、約７．０～７．４の範囲である。
【0085】
本明細書で使用される場合、用語「治療する（treat）」、「治療（treatment）」、および「治療すること（treating）」は、特定の状態、病態（例えば、ＣＮＳ損傷）、またはその症状の量もしくは重症度を、その状態または病態を現在経験しているかまたは罹患している被検体において、低減させることを指す。該用語は、必ずしも完全な治療（例えば、その状態、疾患、または症状の完全な排除）を示すものではない。「治療（treatment）」は、（例えば、ヒトを含む哺乳動物において）疾患に対する治療または技術の任意の投与または適用を包含し、そしてその疾患を阻害すること、その発症を止めること、その疾患を緩和すること、退縮させること、または失われた、不足している、もしくは不完全な機能を回復または修復すること；あるいは非効率的なプロセスを促進すること、を包含している。
【0086】
本明細書で使用される場合、用語「予防する（prevent）」、「予防（prevention）」、および「予防すること（preventing）」は、特定の状態または病態（例えば、ＣＮＳ損傷）が生じる可能性を、その状態または病態を現在経験していないか、または罹患していない被験体において、低減させることを指す。該用語は、必ずしも完全な予防または絶対的な予防を示すものではない。例えば、「ＣＮＳ損傷を予防すること（preventing CNS injury）」は、ＣＮＳ損傷を現在経験していないか、またはＣＮＳ損傷と診断されていない被験体において生じるＣＮＳ損傷の可能性を減少させることを指す。「ＣＮＳ損傷を予防する（prevent CNS injury）」ために、組成物または方法は、ＣＮＳ損傷の可能性を減少させるだけでよく、そのあらゆる可能性を完全にブロックする必要はない。「予防（prevention）」は、（例えば、ヒトを含む哺乳動物において）疾患が発症する可能性を減少させるための治療あるいは技術の任意の投与または適用を包含している。そのような可能性は、集団または個体について評価され得る。
【0087】
本明細書で使用される場合、用語「共投与（co-administration）」および「共投与すること（co-administering）」は、被験体への少なくとも２つの薬剤（複数可）または治療の投与（例えば、ＩＫＶＡＶ ＰＡナノファイバーおよび１つ以上の治療薬剤）を指す。いくつかの実施形態において、２つ以上の薬剤または治療の共投与は、同時に起こる。他の実施形態において、第１の薬剤／治療は、第２の薬剤／治療の前に投与される。当業者は、使用される種々の薬剤または治療の製剤および／または投与経路が変化し得ることを理解する。共投与のための適切な用量は、当業者によって容易に決定され得る。いくつかの実施形態において、薬剤または治療が共投与される場合、それぞれの薬剤または治療は、それらの単独投与に適切な用量よりも低い用量で投与される。したがって、薬剤または治療の共投与が潜在的に有害な（例えば、毒性の）薬剤の必須の用量を低下させる実施形態、および／または２つ以上の薬剤の共投与が、他の薬剤の共投与を介して、複数の薬剤のうちの１つの有益な作用に対する被験体の増感作用をもたらす実施形態において、共投与は特に望ましい。
【0088】
［詳細な説明］
本明細書では、生理活性ペプチドを含んでいるペプチド両親媒性物質（ＰＡ）、生理活性ＰＡを呈しているナノファイバー、およびそれらの使用方法が提供される。
本明細書では、生理活性ペプチドを含んでいるペプチド両親媒性物質（ＰＡ）、生理活性ＰＡを呈しているナノファイバー、およびそれらの使用方法が提供される。
【0089】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載された実施形態のペプチド両親媒性分子および組成物は、当業者に周知の調製技術を使用して、好ましくはペプチドのＮ末端（またはＣ末端）に標準アミノ酸に代えて脂肪酸を添加することを伴う標準固相ペプチド合成によって合成され、その結果、親油性セグメントを作製することができる（ただし、いくつかの実施形態において、ナノファイバーのアラインメントは、これまでに開示されていないか、または当技術分野で使用されていない技術（例えば、メッシュスクリーンを通した押出）を介して行われる）。合成は、典型的にはＣ末端から開始し、そこに、Ｒｉｎｋアミド樹脂（この樹脂からの切断後に、ペプチドのＣ末端に--ＮＨ２基を生じる）またはＷａｎｇ樹脂（Ｃ末端に--ＯＨ基を生じる）のいずれかを使用して、アミノ酸が連続的に付加される。従って、本明細書に記載されたいくつかの実施形態は、--Ｈ、--ＯＨ、--ＣＯＯＨ、--ＣＯＮＨ２、および--ＮＨ２からなる群より選択され得るＣ末端部分を有しているペプチド両親媒性物質を包含している。
【0090】
いくつかの実施形態において、ペプチド両親媒性物質は、ペプチドに連結された疎水性セグメント（すなわち、疎水性尾部）を含んでいる。いくつかの実施形態において、ペプチドは、構造ペプチドセグメントを含んでいる。いくつかの実施形態において、構造ペプチドセグメントは、水素結合形成セグメント、またはベータシート形成セグメントである。いくつかの実施形態において、構造ペプチドセグメントはランダムコイル構造を形成する傾向（例えば、４以下のβシート構造形成に関する全体の傾向）を有する。いくつかの実施形態において、ペプチドは、荷電セグメント（例えば、酸性セグメント、塩基性セグメント、両性イオン性セグメントなど）を含んでいる。いくつかの実施形態において、ペプチドは、溶解度、可撓性、セグメント間の距離などを付加するためのリンカーまたはスペーサーセグメントをさらに含んでいる。いくつかの実施形態において、ペプチド両親媒性物質は、疎水性セグメントとは反対のペプチド末端に、スペーサーセグメント（例えば、ペプチドおよび／または非ペプチドスペーサー）を含んでいる。いくつかの実施形態において、スペーサーセグメントは、ペプチドおよび／または非ペプチドエレメントを含んでいる。いくつかの実施形態において、スペーサーセグメントは、１つ以上の生理活性基（例えば、アルケン、アルキン、アジド、チオールなど）を含んでいる。いくつかの実施形態において、種々のセグメントは、リンカーセグメント（例えば、ペプチドリンカー（例えば、ＧＧ）または非ペプチドリンカー（例えば、アルキル、ＯＥＧ、ＰＥＧなど））によって連結され得る。
【0091】
親油性または疎水性セグメントは、典型的には最後のアミノ酸カップリング後に、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に組み込まれ、アシル結合を介してＮ末端またはＣ末端アミノ酸に連結される脂肪酸または他の酸から構成される。水溶液中で、ＰＡ分子は自己集合して（例えば、円筒形ミセル（別名、ナノファイバー）に）、親油性セグメントをそれらのコア中に埋め、そして表面上に生理活性ペプチドを呈する。いくつかの実施形態において、構造ペプチドが分子間水素結合を受けて、ミセルの長軸に平行に配向するベータシートを形成する。いくつかの実施形態において、構造ペプチドは弱い分子間水素結合を呈し、その結果、ナノファイバー内に、あまり硬くないベータシート構造が得られる。
【0092】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、疎水性セグメントおよびペプチドセグメントを順に含んでいるＰＡ形成ブロックを含んでいる。特定の実施形態において、十分な長さ（例えば、２個の炭素、３個の炭素、４個の炭素、５個の炭素、６個の炭素、７個の炭素、８個の炭素、９個の炭素、１０個の炭素、１１個の炭素、１２個の炭素、１３個の炭素、１４個の炭素、１５個の炭素、１６個の炭素、１７個の炭素、１８個の炭素、１９個の炭素、２０個の炭素、２１個の炭素、２２個の炭素、２３個の炭素、２４個の炭素、２５個の炭素、２６個の炭素、２７個の炭素、２８個の炭素、２９個の炭素、３０個の炭素もしくはそれより多く、またはそれらの間の任意の範囲）の疎水性（例えば、炭化水素および／もしくはアルキル／アルケニル／アルキニル尾部、またはコレステロールなどのステロイド）セグメントは、ペプチドセグメント（例えば、ベータストランド構造または他の超分子相互作用に対する優先傾向を有しているセグメントを含んでいるペプチド）に共有結合して、ペプチド両親媒性分子を生じる。いくつかの実施形態において、複数のそのようなＰＡは、水（または水溶液）中で自己集合して、ナノ構造（例えば、ナノファイバー）になる。種々の実施形態において、ペプチドセグメントおよび疎水性セグメントの相対的長さは、異なるＰＡ分子形状およびナノ構造アーキテクチャをもたらす。例えば、より広いペプチドセグメントおよびより狭い疎水性セグメントは、ＰＡの集合体に影響を及ぼす一般的に円錐の分子形状を生じる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＪ．Ｎ．Ｉｓｒａｅｌａｃｈｖｉｌｉ Ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｆｏｒｃｅｓ；第２版；Ａｃａｄｅｍｉｃ：Ｌｏｎｄｏｎ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９２を参照）。他の分子形状は、集合体およびナノ構造アーキテクチャに対して同様の効果を有する。
【0093】
いくつかの実施形態において、ペプチド両親媒性物質の水溶液の自己集合を誘導するために、溶液のｐＨを変化させる（上昇または低下させる）ことができ、またはカルシウムなどの多価イオンもしくは荷電ポリマーもしくは他の高分子を溶液に添加することができる。
【0094】
いくつかの実施形態において、疎水性セグメントは、非ペプチドセグメント（例えば、アルキル／アルケニル／アルキニル基）である。いくつかの実施形態において、疎水性セグメントは、炭素数４～２５（例えば、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個）のアルキル鎖（例えば、飽和）、フッ素化セグメント、フッ素化アルキル尾部、複素環、芳香族セグメント、パイ共役セグメント、シクロアルキル、オリゴチオフェンなどを含んでいる。いくつかの実施形態において、疎水性セグメントは、炭素数２～３０（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個）のアシル／エーテル鎖（例えば、飽和）を含んでいる。
【0095】
いくつかの実施形態において、ＰＡは、１つ以上のペプチドセグメントを含んでいる。ペプチドセグメントは、天然アミノ酸、修飾アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸類似物質、ペプチド模倣体、またはそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、ペプチドセグメントは、本明細書中に記載されたペプチド配列の１個以上に対して、少なくとも５０％の配列同一性または類似性（例えば、保存的または半保存的）を含んでいる。
【0096】
いくつかの実施形態において、ペプチド両親媒性物質は荷電ペプチドセグメントを含んでいる。荷電セグメントは、酸性、塩基性、または両性イオン性であり得る。
【0097】
いくつかの実施形態において、ペプチド両親媒性物質は酸性ペプチドセグメントを含んでいる。例えば、いくつかの実施形態において、酸性ペプチドは１個以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、またはそれより多く）の酸性残基（Ｄおよび／またはＥ）を配列中に含んでいる。いくつかの実施形態において、酸性ペプチドセグメントは７残基長までを含み、少なくとも５０％の酸性残基を含んでいる。いくつかの実施形態において、酸性ペプチドセグメントは（Ｘａ）１－７を含み、各々のＸａは、独立して、ＤまたはＥである。いくつかの実施形態において、酸性ペプチドセグメントは、Ｅ２－４を含んでいる。例えば、いくつかの実施形態において、酸性ペプチドセグメントはＥＥを含んでいる。いくつかの実施形態において、酸性ペプチドセグメントはＥＥＥを含んでいる。他の実施形態において、酸性ペプチドセグメントはＥＥＥＥを含んでいる。
【0098】
いくつかの実施形態において、ペプチド両親媒性物質は、塩基性ペプチドセグメントを含んでいる。例えば、いくつかの実施形態において、酸性ペプチドは、１個以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、またはそれより多く）の塩基性残基（Ｒ、Ｈ、および／またはＫ）を配列中に含んでいる。いくつかの実施形態において、塩基性ペプチドセグメントは、７残基長までを含み、少なくとも５０％の塩基性残基を含んでいる。いくつかの実施形態において、酸性ペプチドセグメントは（Ｘｂ）１－７を含み、各々のＸｂは、独立して、Ｒ、Ｈ、および／またはＫである。
【0099】
いくつかの実施形態において、ペプチド両親媒性物質は構造ペプチドセグメントを含んでいる。いくつかの実施形態において、構造ペプチドセグメントはベータシート形成セグメントである。いくつかの実施形態において、構造ペプチドセグメントは弱い水素結合を呈し、硬いベータシート構造よりもむしろランダムコイル構造を形成する傾向を有する。いくつかの実施形態において、構造ペプチドセグメントは、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、Ｇ、およびＡ残基のうちの１つ以上に富む。いくつかの実施形態において、構造ペプチドセグメントは、アラニンおよびバリンリッチなペプチドセグメント（例えば、ＶＶＡＡ、ＶＶＶＡＡＡ、ＡＡＶＶ、ＡＡＡＶＶＶ、またはＶおよびＡ残基の他の組み合わせなど）を含んでいる。いくつかの実施形態において、構造ペプチドセグメントは４個以上の連続するＡおよび／もしくはＶ残基、またはそれに対する保存的もしくは半保存的な置換を含んでいる。いくつかの実施形態において、構造ペプチドセグメントはＶ２Ａ２を含んでいる。いくつかの実施形態において、構造ペプチドセグメントはアラニンおよびグリシンリッチなペプチドセグメント（例えば、ＡＡＧＧ、ＡＡＡＧＧＧ、またはＡおよびＧ残基の他の組み合わせなど）を含んでいる。いくつかの実施形態において、構造ペプチドセグメントはＡ２Ｇ２を含んでいる。
【0100】
いくつかの実施形態において、構造ペプチドセグメントは、４個以上の連続した非極性脂肪族残基（例えば、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ））を含んでいる。いくつかの実施形態において、構造ペプチドセグメントは、２～１６アミノ酸長を含み、４個以上（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、またはそれらの間の範囲）の非極性脂肪族残基を含んでいる。いくつかの実施形態において、構造ペプチドセグメントはＶＥＶＡ２を含んでいる。
【0101】
いくつかの実施形態において、構造ペプチドセグメントは、４以下（例えば、４未満、３．９未満、３．８未満、３．７未満、３．６未満、３．５未満、３．４未満、３．３未満、３．２未満、３．１未満、３．０未満、２．９未満、２．８未満、２．７未満、２．６未満、２．５未満、２．４未満、２．３未満、２．２未満、２．１未満、２．０未満、１．９未満、１．８未満、１．７未満、１．６未満、１．５未満、１．４未満、１．３未満、１．２未満、１．１未満または１未満）のβシート構造形成に関する全体の傾向を有する。
【0102】
βシート構造形成に関する全体の傾向は、構造ペプチドセグメント中の各アミノ酸のβシート構造形成の傾向の合計として計算することができる。βシート構造形成に関する各アミノ酸の傾向およびその計算方法は、例えば、Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｋ．，Ｔｏｄａ，Ｈ．＆Ｉｋｅｇｕｃｈｉ，Ｍ． Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ α－ｈｅｌｉｃａｌ ａｎｄ β－ｓｈｅｅｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ
ｏｖｅｒａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄ ｔｙｐｅ ＢＭＣ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １２，１８（２０１２）（その全内容は、本明細書中に参考として援用される）に記載されている。例示的な値を以下の表１に示す。構造ペプチドセグメントのβシート構造形成に関する全体の傾向を計算する目的のために、各アミノ酸について表１の「全残基」欄に示された値を一緒に加える。例えば、Ａ２Ｇ２構造ペプチドセグメントの場合、βシート構造形成に関する全体の傾向は、０．７５＋０．７５＋０．６７＋０．６７＝２．８４である。構造ペプチドセグメントは、４以下のβシート構造形成に関する全体の傾向を達成するために、アミノ酸の任意の適切な数および組み合わせを含み得る。
ｏｖｅｒａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄ ｔｙｐｅ ＢＭＣ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １２，１８（２０１２）（その全内容は、本明細書中に参考として援用される）に記載されている。例示的な値を以下の表１に示す。構造ペプチドセグメントのβシート構造形成に関する全体の傾向を計算する目的のために、各アミノ酸について表１の「全残基」欄に示された値を一緒に加える。例えば、Ａ２Ｇ２構造ペプチドセグメントの場合、βシート構造形成に関する全体の傾向は、０．７５＋０．７５＋０．６７＋０．６７＝２．８４である。構造ペプチドセグメントは、４以下のβシート構造形成に関する全体の傾向を達成するために、アミノ酸の任意の適切な数および組み合わせを含み得る。
【0103】
【表1】
【0104】
いくつかの実施形態において、４以下のβシート構造形成に関する全体の傾向を有している構造ペプチドセグメントは、構造ペプチドセグメント内のアミノ酸が、隣接する分子とのより弱い相互作用を有していることを示す。例えば、構造ペプチドセグメントは、弱い水素結合能力を呈し得る。したがって、そのような構造ペプチドセグメントおよびそれを含んでいるペプチド両親媒性物質は、より動的なナノファイバー構造を作り出すことができる。例えば、Ａ２Ｇ２構造ペプチドセグメントは、硬いベータシート構造よりむしろランダムコイル構造を呈し得る。
【0105】
いくつかの実施形態において、ペプチド両親媒性物質は、非ペプチドスペーサーまたはリンカーセグメントを含んでいる。いくつかの実施形態において、非ペプチドスペーサーまたはリンカーセグメントは、疎水性セグメントとは反対のペプチド末端に位置する。いくつかの実施形態において、スペーサーまたはリンカーセグメントは、生理活性基のための取り付け部位を提供する。いくつかの実施形態において、スペーサーまたはリンカーセグメントは、ＰＡの官能化のための反応基（例えば、アルケン、アルキン、アジド、チオール、マレイミドなど）を提供する。いくつかの実施形態において、スペーサーまたはリンカーは、ＣＨ２、Ｏ、（ＣＨ２）２Ｏ、Ｏ（ＣＨ２）２、ＮＨ、およびＣ＝Ｏ基（例えば、ＣＨ２（Ｏ（ＣＨ２）２）２ＮＨ、ＣＨ２（Ｏ（ＣＨ２）２）２ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＣＨなど）の実質的に直線鎖である。いくつかの実施形態において、スペーサーまたはリンカーは、さらなる生理活性基、置換基、分岐などをさらに含んでいる。いくつかの実施形態において、リンカーセグメントは単一のグリシン（Ｇ）残基である。
【0106】
本明細書の材料用の適切なペプチド両親媒性物質、ならびにＰＡおよび関連材料の調製方法、ＰＡ用のアミノ酸配列、およびＰＡと共に使用することが見出される材料は、以下の特許に記載されている：米国特許第９，０４４，５１４号；米国特許第９，０４０，６２６号；米国特許第９，０１１，９１４号；米国特許第８，７７２，２２８号；米国特許第８，７４８，５６９号；米国特許第８，５８０，９２３号；米国特許第８，５４６，３３８号；米国特許第８，５１２，６９３号；米国特許第８，４５０，２７１号；米国特許第８，２３６，８００号；米国特許第８，１３８，１４０号；米国特許第８，１２４，５８３号；米国特許第８，１１４，８３５号；米国特許第８，１１４，８３４号；米国特許第８，０８０，２６２号；米国特許第８，０７６，２９５号；米国特許第８，０６３，０１４号；米国特許第７，８５１，４４５号；米国特許第７，８３８，４９１号；米国特許第７，７４５，７０８号；米国特許第７，６８３，０２５号；米国特許第７，５５４，０２１号；米国特許第７，５４４，６６１号；米国特許第７，５３４，７６１号；米国特許第７，４９１，６９０号；米国特許第７，４５２，６７９号；米国特許第７，３７１，７１９号；米国特許第７，０３０，１６７号；これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0107】
ＰＡ超分子構造の特性（例えば、形状、剛性、親水性など）は、ペプチド両親媒性物質の構成要素（例えば、親油性セグメント、酸性セグメント、構造ペプチドセグメント、生理活性セグメントなど）の同一性に依存する。例えば、ナノファイバー、ナノスフェア、中間体形状、および他の超分子構造は、ＰＡ構成要素の諸部分の同一性を調整することによって実現される。いくつかの実施形態において、ＰＡの超分子ナノ構造の特性は、集合後の操作（例えば、加熱／冷却、延伸など）によって変更される。
【0108】
いくつかの実施形態において、ペプチド両親媒性物質は、以下を含んでいる：（ａ）炭素数８～２４のアルキル鎖を含んでいる疎水性尾部；（ｂ）構造ペプチドセグメント（例えば、ＶＶＡＡ、ＡＡＧＧ、またはＶＥＶＡを含んでいる）；および（ｃ）荷電セグメント（例えば、ＥＥ、ＥＥＥ、ＥＥＥＥなどを含んでいる）。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された構成要素を含んでいる、本明細書に記載される範囲内の、または当業者の技術範囲内の任意のＰＡは、本明細書中に用途を見出すことができる。
【0109】
いくつかの実施形態において、ペプチド両親媒性物質は、生理活性部分（例えば、ＩＫＶＡＶペプチド）を含んでいる。特定の実施形態において、生理活性部分は、ＰＡの最もＣ末端またはＮ末端のセグメントである。いくつかの実施形態において、生理活性部分は、荷電セグメントの末端に取り付けられる。いくつかの実施形態において、生理活性部分が、集合したＰＡ構造（例えば、ナノファイバー）の表面上に露出される。生理活性部分は、典型的にはペプチドであるが、これに限定されない。
【0110】
いくつかの実施形態において、生理活性部分は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）において同定されたペプチドである。例えば、生理活性部分は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、またはラミニン中に見出されたペプチド配列であり得る。いくつかの実施形態において、生理活性部分は、ラミニン中に見出されたペプチド配列である。例えば、生理活性部分は、ラミニン－１、ラミニン－２、ラミニン－３、ラミニン－４、ラミニン－５、ラミニン－６、ラミニン－７、ラミニン－８、ラミニン－９、ラミニン－１０、ラミニン－１１、ラミニン－１２、ラミニン－１３、ラミニン－１４、またはラミニン－１５中に見出され得る。いくつかの実施形態において、生理活性部分は、ラミニン－１中に見出されたペプチド配列である。特定の実施形態において、生理活性部分はＩＫＶＡＶである。いくつかの実施形態において、生理活性部分は組換えペプチドである。いくつかの実施形態において、生理活性部分は、目的のペプチドまたはポリペプチド（例えば、ＥＣＭタンパク質）に結合するペプチド配列である。
【0111】
いくつかの実施形態において、ペプチド両親媒性物質は、（例えば、Ｃ末端からＮ末端へ、またはＮ末端からＣ末端へ）以下を含んでいる：生理活性ペプチド（例えば、ＩＫＶＡＶペプチド）－荷電セグメント（例えば、Ｅ２－４などを含んでいる）－構造ペプチドセグメント（例えば、Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２などを含んでいる）－疎水性尾部（例えば、炭素数８～２４のアルキル鎖を含んでいる）。
【0112】
いくつかの実施形態において、ペプチド両親媒性物質は（例えば、Ｃ末端からＮ末端へ、またはＮ末端からＣ末端へ）以下を含んでいる：生理活性ペプチド（例えば、ＩＫＶＡＶペプチド）－可撓性リンカー（例えば、Ｇなどを含んでいる）－荷電セグメント（例えば、Ｅ２－４などを含んでいる）－構造ペプチドセグメント（例えば、Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２などを含んでいる）－疎水性尾部（例えば、炭素数８～２４のアルキル鎖を含んでいる）。
【0113】
いくつかの実施形態において、ＰＡは、疎水性尾部をＰＡのペプチド部分に取り付けるための取り付けセグメントまたは残基（例えば、Ｋ）をさらに含んでいる。いくつかの実施形態において、疎水性尾部は、リジン側鎖に取り付けられる。
【0114】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたペプチド両親媒性物質から集合したナノファイバーおよびナノ構造が、本明細書中で提供される。いくつかの実施形態において、ナノファイバーは、本明細書に記載されたＰＡの自己集合によって調製される。いくつかの実施形態において、ナノファイバーは、ＩＫＶＡＶペプチドを呈しているＰＡを含んでいるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、ＩＫＶＡＶペプチドはナノファイバーの表面上に呈される。いくつかの実施形態において、ＩＫＶＡＶペプチドを呈しているＰＡに加えて、フィラーＰＡがナノファイバー中に含まれる。いくつかの実施形態において、フィラーＰＡは、本明細書に記載されたとおり、ペプチド両親媒性物質（例えば、構造ペプチドセグメント、荷電セグメント、疎水性セグメントなど）であるが、生理活性部分を欠いている。いくつかの実施形態において、フィラーペプチドは、生理活性部分を欠いている塩基性または酸性ペプチドである。いくつかの実施形態において、フィラーＰＡおよびＩＫＶＡＶ ＰＡが両方のタイプのＰＡを含んでいるナノファイバーに自己集合する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたペプチド両親媒性物質から集合したナノ構造（例えば、ナノファイバー）が提供される。
【0115】
いくつかの実施形態において、フィラーペプチド（例えば、塩基性ペプチド、酸性ペプチドなど）は、本明細書に記載されたＰＡナノファイバーを含んでいる材料に機械的特性を付与する。いくつかの実施形態において、０～７５％（質量％）の生理活性ＩＫＶＡＶ
ＰＡおよび２５～１００％（質量％）の塩基性フィラーＰＡから集合したナノファイバーは、塩基性ｐＨ条件（例えば、ｐＨ８．５～１１）でゲルになる。いくつかの実施形態において、７５～１００％（質量％）の生理活性ＩＫＶＡＶ ＰＡおよび０～２５％（質量％）の塩基性フィラーＰＡから集合したナノファイバーは、塩基性ｐＨ条件（例えば、ｐＨ８．５～１１）で液体である。いくつかの実施形態において、０～２０％（質量％）の生理活性ＩＫＶＡＶ ＰＡおよび８０～１００％（質量％）の酸性フィラーＰＡから集合したナノファイバーは、酸性ｐＨ条件（例えば、ｐＨ１～５）でゲルになる。いくつかの実施形態において、２０～８０％（質量％）の生理活性ＩＫＶＡＶ ＰＡおよび２０～８０％（質量％）の酸性フィラーＰＡから集合したナノファイバーは、中性ｐＨ条件（例えば、ｐＨ５～８．５）でゲルになる。いくつかの実施形態において、８０～１００％（質量％）の生理活性ＩＫＶＡＶ ＰＡおよび０～２０％（質量％）の酸性フィラーＰＡから集合したナノファイバーは、酸性ｐＨ条件（例えば、ｐＨ１～５）で液体である。
ＰＡおよび２５～１００％（質量％）の塩基性フィラーＰＡから集合したナノファイバーは、塩基性ｐＨ条件（例えば、ｐＨ８．５～１１）でゲルになる。いくつかの実施形態において、７５～１００％（質量％）の生理活性ＩＫＶＡＶ ＰＡおよび０～２５％（質量％）の塩基性フィラーＰＡから集合したナノファイバーは、塩基性ｐＨ条件（例えば、ｐＨ８．５～１１）で液体である。いくつかの実施形態において、０～２０％（質量％）の生理活性ＩＫＶＡＶ ＰＡおよび８０～１００％（質量％）の酸性フィラーＰＡから集合したナノファイバーは、酸性ｐＨ条件（例えば、ｐＨ１～５）でゲルになる。いくつかの実施形態において、２０～８０％（質量％）の生理活性ＩＫＶＡＶ ＰＡおよび２０～８０％（質量％）の酸性フィラーＰＡから集合したナノファイバーは、中性ｐＨ条件（例えば、ｐＨ５～８．５）でゲルになる。いくつかの実施形態において、８０～１００％（質量％）の生理活性ＩＫＶＡＶ ＰＡおよび０～２０％（質量％）の酸性フィラーＰＡから集合したナノファイバーは、酸性ｐＨ条件（例えば、ｐＨ１～５）で液体である。
【0116】
いくつかの実施形態において、ナノ構造は、（１）生理活性部分（例えば、ＩＫＶＡＶペプチド）を有しているＰＡ、および（２）フィラーＰＡ（例えば、生理活性部分を標識していないかまたは呈していない、酸性または塩基性ＰＡなど）から集合する。いくつかの実施形態において、ナノ構造（例えば、ナノファイバー）は、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％（またはそれらの間の任意の範囲）のＶＥＧＦ ＰＡを含んでいる。いくつかの実施形態において、ナノ構造（例えば、ナノファイバー）は、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％（またはそれらの間の任意の範囲）の酸性フィラーＰＡを含んでいる。いくつかの実施形態において、ナノ構造（例えば、ナノファイバー）は、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％（またはそれらの間の任意の範囲）の塩基性フィラーＰＡを含んでいる。いくつかの実施形態において、ナノファイバー中の酸性および／または塩基性ＰＡに対するＩＫＶＡＶ ＰＡの比率が、ナノファイバー材料の機械的特性（例えば、液体またはゲル）を決定し、どのような状態下で、材料が様々な特性（例えば、生理的状態に曝されるとゲル化する、生理的状態に曝されると液化するなど）をとるかを決定する。
【0117】
ペプチド両親媒性物質（ＰＡ）ナノファイバー溶液は、ＰＡの任意の適切な組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、溶液の少なくとも０．０５ｍｇ／ｍＬ（例えば、０．１０ｍｇ／ｍｌ、０．１５ｍｇ／ｍｌ、０．２０ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．３０ｍｇ／ｍｌ、０．３５ｍｇ／ｍｌ、０．４０ｍｇ／ｍｌ、０．４５ｍｇ／ｍｌ、０．５０ｍｇ／ｍｌ、０．６０ｍｇ／ｍｌ、０．７０ｍｇ／ｍｌ、０．８０ｍｇ／ｍｌ、０．９０ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌもしくはそれより多い、またはそれらの間の範囲）は、（例えば、生理活性部分を有さない）フィラーＰＡである。いくつかの実施形態において、溶液の少なくとも０．２５ｍｇ／ｍＬはフィラーＰＡである。いくつかの実施形態において、フィラーＰＡは、分子の末端（例えば、表面に呈された末端）において高度に荷電したグルタミン酸残基を有している非生理活性ＰＡ分子である。これらの負に荷電したＰＡは、イオン架橋を介してナノファイバー間でゲル化が起こることを可能にする。いくつかの実施形態において、フィラーＰＡは、分子の末端（例えば、表面に呈された末端）に高度に荷電したリジン残基を有している非生理活性ＰＡ分子である。これらの正に荷電したＰＡは、塩基性条件下でゲル化が起こることを可能にする。フィラーＰＡは、ナノファイバー溶液のゲル化能力を依然として保証しながら、ナノファイバーマトリックス中に他の生理活性ＰＡ分子を組み込む能力を提供する。いくつかの実施形態において、粘度を増加させ、ゲル化機構をより強くするために溶液をアニールする。これらのフィラーＰＡは、例えば、その全体が本明細書に参考として援用される、米国特許第８，７７２，２２８号に記載されている配列（例えば、Ｃ１６－ＶＶＶＡＡＡＥＥＥ）を有している。
【0118】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＰＡナノファイバーは、小さい断面直径（例えば、＜２５ｎｍ、＜２０ｎｍ、＜１５ｎｍ、約１０ｎｍなど）を示す。いくつかの実施形態において、ナノファイバーの小さい断面（～１０ｎｍ直径）は、当該ファイバーが脳実質に浸透することを可能にする。
【0119】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたＰＡおよびナノファイバーは、疾患を治療する方法に使用するための薬学的組成物に組み込まれ得る。例えば、本明細書に記載されたＰＡおよびナノファイバーは、被検体における神経系損傷の治療方法または予防方法に使用され得る。例えば、本明細書に記載されたＰＡおよびナノファイバーは、脳および脊髄を含む中枢神経系（ＣＮＳ）、または脳および脊髄の外側の神経ならびに神経節を含む末梢神経系（ＰＮＳ）に対する損傷の予防の処置のための方法において使用され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたＰＡおよびナノファイバーは、被検体におけるＣＮＳまたはＰＮＳへの損傷の治療または予防のために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、損傷は脊髄損傷である。脊髄損傷は、頸部、腰部、胸部、仙骨、またはそれらの任意の組合せであり得る。
【0120】
損傷は、外傷性損傷であり得る。外傷性損傷とは、外傷（例えば、自動車事故、落下、暴力、スポーツ損傷、外科的損傷などによって引き起こされる外傷）によって引き起こされる損傷を指す。例えば、本明細書に記載されたＰＡおよびナノファイバーは、外傷性脊髄損傷の治療に使用され得る。別の例として、本明細書に記載されたＰＡおよびナノファイバーは、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の治療に使用され得る。あるいは、損傷は、非外傷性損傷であり得る。例えば、損傷は、例えば癌、多発性硬化症、炎症、関節炎、脊柱管狭窄症、腫瘍、失血などによって引き起こされるＣＮＳ（例えば、脳および／または脊髄）またはＰＮＳに対する非外傷性損傷であり得る。
【0121】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたＰＡおよび／またはナノファイバーを含んでいる組成物は、外傷性脊髄損傷を有している疑いのある被検体に提供される。例えば、組成物は、身体の１つ以上の領域（例えば、手、腕、脚、足など）における感覚の喪失および／または運動制御の喪失、低血圧、血圧の調節不能、体温の調節不能、損傷領域より下の発汗不能、慢性疼痛、および／または脊髄の腫脹を含む１つ以上の症状を示している被験体に提供され得る。組成物は、損傷を治療するために被検体に提供されてもよい。いくつかの実施形態において、損傷の治療は、損傷に関連する１つ以上の症状の悪化を予防し得る。いくつかの実施形態において、損傷の治療は、損傷に関連する１つ以上の症状の重症度を低減および／または排除し得る。
【0122】
本明細書に記載されたＰＡおよび／またはナノファイバーを含んでいる組成物は、損傷を治療するために、損傷（例えば、外傷性脊髄損傷）後の任意の適切な時点で被検体に提供されてもよい。例えば、組成物は、損傷から２４時間以内（例えば、損傷から２４時間以内、１２時間以内、１０時間以内、９時間以内、８時間以内、７時間以内、６時間以内、５時間以内、４時間以内、３時間以内、２時間以内、または１時間以内）に被検体に提供され得る。いくつかの実施形態において、組成物は、損傷後または損傷の診断後、２４時間を超える持続時間が経過した後に被検体に提供されてもよい。
【0123】
組成物は、被験体の年齢、被験体の体重、損傷の重症度などを含む因子に依存して、任意の適切な量で投与され得る。組成物は、損傷の重症度が悪化することを防ぐために、損傷または予防手段に対する他の適切な処置と組み合わせて投与され得る。
【0124】
いくつかの実施形態において、本明細書のＰＡおよびナノファイバー組成物は、被検体への供給のために製剤化される。本明細書に記載された薬学的組成物を投与する適切な経路には、限定されないが、局所、皮下、経皮、皮内、損傷内（intralesional）、関節内、腹腔内、膀胱内、経粘膜（transmucosal）、歯肉、歯内、蝸牛内、鼓膜内、臓器内、硬膜外、髄腔内、筋肉内、静脈内、脈管内、骨内、眼周囲、腫瘍内、脳内、および脳室内（intracerebroventricular）投与が含まれる。いくつかの実施形態において、ＰＡ組成物は、非経口的に投与される。いくつかの実施形態において、非経口投与は、髄腔内投与、脳室内投与、または実質内投与による。本明細書のＰＡ組成物は、単独の活性剤として、または被験体における神経系損傷の治療において使用される他の薬剤のような他の医薬品と組み合わせて投与され得る。
【0125】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたＰＡおよびナノファイバー（例えば、ナノＩＫＶＡＶ）は、細胞培養方法における使用を見出す。例えば、本明細書に記載されたペプチド両親媒性物質を含んでいるスキャフォールドが本明細書にさらに開示される。スキャフォールドは、自己集合したペプチド両親媒性物質のナノファイバーを含んでもよく、ペプチド両親媒性物質の少なくとも一部は、疎水性尾部、構造ペプチドセグメント、荷電ペプチドセグメント、およびＩＫＶＡＶ生理活性ペプチドを含んでいる。スキャフォールドは、１つ以上のフィラーペプチド両親媒性物質をさらに含み得る。本明細書に記載されたスキャフォールドは、細胞の増殖および分化を支持することができる。従って、スキャフォールドは、細胞を培養するための方法におけるものであり得る。細胞を培養するための方法は、本明細書に記載のとおり、細胞をスキャフォールドと接触させることを含んでいる。いくつかの実施形態において、スキャフォールドは、任意の所望の細胞培養ツール（組織培養プレート、ペトリ皿、ガラススライドなど）用のコーティングとして使用され得る。
【0126】
本明細書に開示されたスキャフォールド上で培養した細胞は、開示されたスキャフォールドの非存在下で培養した細胞と比較して改善された特性を示し得る。例えば、細胞は、開示されたスキャフォールドの非存在下で培養された細胞と比較して、分化の改善、成熟の改善および／または長期生存率の改善を示し得る。
【0127】
いくつかの実施形態において、スキャフォールドは、ニューロン細胞を培養する方法において使用され得る。例えば、スキャフォールドは、ｈｉＰＳＣ由来の運動ニューロンなどのｈｉＰＳＣ由来のニューロン細胞を培養する方法において使用され得る。例えば、ｈｉＰＳＣは、神経誘導を刺激し、腹側／尾側パターン形成を促進することが知られている任意の標準的なカクテルを使用して分化され得る。このニューロンへの最初の分化に続いて、ニューロンを様々なＩＫＶＡＶスキャフォールド上で培養してもよい。開示されたＩＫＶＡＶスキャフォールド上での培養は、ｈｉＰＳＣ由来の運動ニューロンの効率的な生成および機能的成熟を可能にし得る。
【0128】
［実験］
［材料および方法］
［材料合成および調製および特徴付け］
ＰＡ合成および調製：ＣＥＭモデルＬｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを用いた標準フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相ペプチド合成によって、ＩＫＶＡＶ ＰＡ分子（Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶ、Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶ、Ｃ１６ＶＥＶＡ２ＧＩＫＶＡＶ）、ＶＫＩＶスクランブルＰＡ分子（Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＶＫＩＶＡ、Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＶＫＩＶＡ、Ｃ１６ＶＥＶＡ２ＧＶＫＩＶＡ）、および骨格配列（Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４、Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４、Ｃ１６ＶＥＶＡ２）を合成した。逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、ＰＡを精製した。ＨＰＬＣは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘカラム（Ｃ１８固定相、５μｍ、１００Å孔径、３０．０×１５０ｍｍ）を使用し、ＤＧＵ－２０Ａ５Ｒ脱気ユニット、２つのＬＣ－２０ＡＰ溶媒送達ユニット、ＳＰＤ－Ｍ２０Ａダイオードアレイ検出器、およびＦＲＣ－１０Ａフラクションコレクターを備えた島津モデルプロミネンスモジュラーＨＰＬＣシステム上で行われた。ＨＰＬＣは、０．１％のＮＨ４ＯＨ（ｖ／ｖ）を含むＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ勾配を溶離液として使用し、流速は２５．０ｍＬ／分であった。凍結乾燥したＰＡの純度を、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によって分析した。ＬＣ－ＭＳは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ ４μｍ Ｐｒｏｔｅｏ ９０Åカラム（Ｃ１２固定相、４μｍ、９０Å孔径、１×１５０ｍｍ）を使用し、Ａｇｉｌｅｎｔモデル１２００ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｒｉｅｓ二成分ＬＣ勾配システム上で行われた。ＬＣ－ＭＳは、０．１％のＮＨ４ＯＨ（ｖ／ｖ）を含むＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ勾配を溶離液として使用し、流速は５０μＬ／分であった。エレクトロスプレーイオン化質量（ＥＳＩ－ｍａｓｓ）分析を、Ａｇｉｌｅｎｔモデル６５１０ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ Ｔｉｍｅ－ｏｆ－Ｆｌｉｇｈｔ
ＬＣ／ＭＳ分光計上、ポジティブスキャンモードで、エレクトロスプレーイオン化質量（ＥＳＩ－ｍａｓｓ）分析を行った。凍結乾燥後、ＰＡ粉末を１２５ｍＭのＮａＣｌおよび３ｍＭのＫＣｌ溶液に再構成し、１ＮのＮａＯＨを１μＬずつ添加していくことによってｐＨ７．４に調整し、細胞適合性および材料の濃度を確保した。サーモサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ）を用いて、ＰＡ溶液を８０℃で３０分間アニールし、次いで、１℃／分でゆっくり冷却して、最終温度２７℃に到達させて、全てのサンプルを均一かつ制御して加熱および冷却した。ＰＡコート基板を調製するために、２４、１２、６ウェルポリスチレン細胞培養プレート、または／ならびに、１２ｍｍおよび１８ｍｍのカバーガラススリップを、３７℃で一晩、ポリ－Ｄ－リジン（０．０１ｍｇ／ｍＬ）を用いてコーティングした。翌日、プレートをＭｉｌｌｉＱ水で３回リンスし、続いて３０μＬのアニールしたＰＡ（１ｗｔ％）溶液で３時間コーティングした。さらなる使用の前に、過剰のＰＡ溶液を除去し、プレートをゲル化溶液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのＣａＣｌ２）で穏やかにリンスした。
［材料および方法］
［材料合成および調製および特徴付け］
ＰＡ合成および調製：ＣＥＭモデルＬｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを用いた標準フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相ペプチド合成によって、ＩＫＶＡＶ ＰＡ分子（Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶ、Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶ、Ｃ１６ＶＥＶＡ２ＧＩＫＶＡＶ）、ＶＫＩＶスクランブルＰＡ分子（Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＶＫＩＶＡ、Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＶＫＩＶＡ、Ｃ１６ＶＥＶＡ２ＧＶＫＩＶＡ）、および骨格配列（Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４、Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４、Ｃ１６ＶＥＶＡ２）を合成した。逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、ＰＡを精製した。ＨＰＬＣは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘカラム（Ｃ１８固定相、５μｍ、１００Å孔径、３０．０×１５０ｍｍ）を使用し、ＤＧＵ－２０Ａ５Ｒ脱気ユニット、２つのＬＣ－２０ＡＰ溶媒送達ユニット、ＳＰＤ－Ｍ２０Ａダイオードアレイ検出器、およびＦＲＣ－１０Ａフラクションコレクターを備えた島津モデルプロミネンスモジュラーＨＰＬＣシステム上で行われた。ＨＰＬＣは、０．１％のＮＨ４ＯＨ（ｖ／ｖ）を含むＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ勾配を溶離液として使用し、流速は２５．０ｍＬ／分であった。凍結乾燥したＰＡの純度を、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によって分析した。ＬＣ－ＭＳは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ ４μｍ Ｐｒｏｔｅｏ ９０Åカラム（Ｃ１２固定相、４μｍ、９０Å孔径、１×１５０ｍｍ）を使用し、Ａｇｉｌｅｎｔモデル１２００ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｒｉｅｓ二成分ＬＣ勾配システム上で行われた。ＬＣ－ＭＳは、０．１％のＮＨ４ＯＨ（ｖ／ｖ）を含むＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ勾配を溶離液として使用し、流速は５０μＬ／分であった。エレクトロスプレーイオン化質量（ＥＳＩ－ｍａｓｓ）分析を、Ａｇｉｌｅｎｔモデル６５１０ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ Ｔｉｍｅ－ｏｆ－Ｆｌｉｇｈｔ
ＬＣ／ＭＳ分光計上、ポジティブスキャンモードで、エレクトロスプレーイオン化質量（ＥＳＩ－ｍａｓｓ）分析を行った。凍結乾燥後、ＰＡ粉末を１２５ｍＭのＮａＣｌおよび３ｍＭのＫＣｌ溶液に再構成し、１ＮのＮａＯＨを１μＬずつ添加していくことによってｐＨ７．４に調整し、細胞適合性および材料の濃度を確保した。サーモサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ）を用いて、ＰＡ溶液を８０℃で３０分間アニールし、次いで、１℃／分でゆっくり冷却して、最終温度２７℃に到達させて、全てのサンプルを均一かつ制御して加熱および冷却した。ＰＡコート基板を調製するために、２４、１２、６ウェルポリスチレン細胞培養プレート、または／ならびに、１２ｍｍおよび１８ｍｍのカバーガラススリップを、３７℃で一晩、ポリ－Ｄ－リジン（０．０１ｍｇ／ｍＬ）を用いてコーティングした。翌日、プレートをＭｉｌｌｉＱ水で３回リンスし、続いて３０μＬのアニールしたＰＡ（１ｗｔ％）溶液で３時間コーティングした。さらなる使用の前に、過剰のＰＡ溶液を除去し、プレートをゲル化溶液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのＣａＣｌ２）で穏やかにリンスした。
【0129】
ガラス表面上へのＩＫＶＡＶペプチドの固定化：先に記載された技術（Ｏｌｂｒｉｃｈ，Ｋ．Ｃ． ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １７，７５９－７６４（１９９６）、および、Ｋａｍ，Ｌ． ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２３，５１１－５１５（２００２））に従って、ホウケイ酸ガラスカバースリップ（直径１２ｍｍ；Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を合成ＩＫＶＡＶペプチドで修飾した。ホウケイ酸ガラスカバースリップを、２％（ｖ／ｖ）ｍｉｃｒｏ－９０界面活性剤（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、６０℃で３０分間洗浄し、蒸留水で６回リンスし、エタノールでリンスし、次いで乾燥した。カバースリップを、Ｏ２を用いて３０秒間プラズマエッチングし（Ｈａｒｒｉｃｋ Ｐｌａｓｍａ ＰＤＣ－００１－ＨＰ）、直ちにエタノール中の２％（ｖ／ｖ）の（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液中で１５分間インキュベートした。次いで、カバースリップを、エタノールで２回、水で２回リンスし、次いでオーブン中で乾燥させた。次いで、１．２５ｍｇ／ｍＬの１－エチル－３－（ジメチル－アミノプロピル）カルボジイミド（Ａｒｃｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ）および２％のＤＭＦ（ジメチルホルムアミド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ））の溶液中で、ＩＫＶＡＶペプチド（図３４を参照のこと）を５０ｎｍｏｌ／ｍＬに調製した。カバースリップをこの溶液と共に４０℃で３．５時間インキュベートした。インキュベーション後、カバースリップを、１００％無水酢酸（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、２Ｍの塩酸（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、および０．２Ｍの重炭酸ナトリウムで順に洗浄した。過剰量の水でリンスした後、サンプルを４Ｍの尿素中で１０分間超音波処理し、続いて１ＭのＮａＣｌで１０分間洗浄し、次いで過剰量の水でリンスし、１００℃で１時間乾燥させた。
【0130】
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）：５μＬのサンプル溶液（Ｈ２Ｏ中で、［ＰＡ］＝０．０１ｗｔ％）を、カーボン支持膜を有する銅ＴＥＭグリッド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ）上に堆積させ、ピンセットを用いて５分間所定の位置に保持した。濾紙を用いた毛細管現象によってサンプル溶液を除去し、グリッドを１０分間乾燥させた。次いで、サンプルを１０μＬの酢酸ウラニル水溶液（２ｗｔ％、Ｓｉｇｍａ
Ａｌｄｒｉｃｈ）で３分間染色し、濾紙を用いた毛細管現象によって溶液を除去した。画像化の前に、グリッドを少なくとも２時間乾燥させた。Ｏｒｉｕｓ ＳＣ １０００Ａカメラを備え、１２０ｋＶで動作する日立モデルＨＴ－７７００電子顕微鏡を用いて、ＴＥＭ画像を得た。
Ａｌｄｒｉｃｈ）で３分間染色し、濾紙を用いた毛細管現象によって溶液を除去した。画像化の前に、グリッドを少なくとも２時間乾燥させた。Ｏｒｉｕｓ ＳＣ １０００Ａカメラを備え、１２０ｋＶで動作する日立モデルＨＴ－７７００電子顕微鏡を用いて、ＴＥＭ画像を得た。
【0131】
極低温透過型電子顕微鏡（ｃｒｙｏ－ＴＥＭ）：ｃｒｙｏ－ＴＥＭサンプル用のプランジ凍結をＦＥＩモデルＶｉｔｒｏｂｏｔ Ｍａｒｋ ＩＩＩを用いて調製した。６．５μＬのサンプル溶液（Ｈ２Ｏ中で、［ＰＡ］＝０．０１ｗｔ％）を、穴のあるカーボン支持膜を有するプラズマ洗浄した銅ＴＥＭグリッド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ）上に堆積させ、Ｖｉｔｒｏｂｏｔ上に取り付けられたピンセットを用いて所定の位置に保持した。標本を湿度１００％、２２℃の環境下でブロットし（ブロットオフセット：０．５ｍｍ、総ブロット：１、待機時間：０秒、ブロット時間：５秒、排出時間：０秒）、液体窒素で冷却した液体エタンリザーバに投入した。ガラス化したサンプルを液体窒素中で保存し、次いでＧａｔａｎ ｃｒｙｏ－ＴＥＭホルダーに移した。Ｏｒｉｕｓ ＳＣ １０００Ａカメラを備え、加速電圧１２０ｋＶで動作する日立モデルＨＴ－７７００電子顕微鏡を用いて、Ｃｒｙｏ－ＴＥＭ画像を得た。
【0132】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）：ＰＡサンプルを、リン酸緩衝食塩水（１Ｘ、Ｇｉｂｃｏ）中のパラホルムアルデヒド（２．０％、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、グルタルアルデヒド（２．５％、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の混合物中で、２０分間固定した。固定液を除去し、エタノール溶液勾配でサンプルをインキュベートすることによって、水をエタノールと交換した。勾配は、２００プルーフエタノール（Ｄｅｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の濃度を増加させた（３０～１００％）。臨界乾燥点（Ｔｏｕｓｉｍｉｓ Ｓａｍｄｒｉ－７９５）を使用して、過剰の水を除去した。１５分間のパージサイクルを使用した。得られた脱水サンプルカバースリップを、１２ｍｍカーボン接着テープ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてスタブ上に載せ、約６ｎｍのオスミウム（Ｆｉｌｇｅｎ，ＯＰＣ－６０Ａ）でコーティングして、画像化のためにサンプル表面を導電性にした。全ての画像は、日立ＳＵ８０３０ＳＥＭ装置を用いて、加速電圧２ｋＶで撮影した。
【0133】
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）：ＡＦＭ画像化および力測定を、Ａｘｉｏ Ｏｂｅｒｖｅｒ．Ｄ１ｍ倒立光学顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．）上に組み込まれたＢｉｏｓｃｏｐｅ Ｒｅｓｏｌｖｅ ＢｉｏＡＦＭ／Ｎａｎｏｓｃｏｐｅ Ｖシステム（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ）上で、室温で行った。名目チップ半径約２０ｎｍ、および、ばね定数約０．７Ｎ／ｍを有する窒化ケイ素三角形プローブ（ＳｃａｎＡｓｙｓｔ Ｆｌｕｉｄ，Ｂｒｕｋｅｒ）を、細いファイバーの画像化およびインデンテーションのために使用した。３０ｎｍの金コートを有する窒化ケイ素三角形カンチレバー（Ｎｏｖａｓｃａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に付着させた直径１μｍのＳｉＯ２ビーズを、厚いゲル上でのインデンテーション試験のために使用した。
【0134】
各プローブのたわみ感度を、ＭｉｌｌｉＱ水中の清浄なスライドガラス上での反復インデンテーションによって較正し、カンチレバーのばね定数を熱雑音法により推定した。各測定前に、円錐形（鋭い）プローブの有効チップ半径を、インデンテーション深さの関数として推定した。ここでは、チップ推定機能（ＮａｎｏＳｃｏｐｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｂｒｕｋｅｒ）を用いる、多結晶チタンチップ特性付けサンプル（ＲＳ－１５Ｍ、Ｂｒｕｋｅｒ）を用いた。
【0135】
制御された荷重力でサンプル表面にＡＦＭプローブを接触させ、荷重－除荷サイクル中の力－変位曲線を記録することによって、ＭｉｌｌｉＱ水中でインデンテーションを行った。インデンテーション中、塑性変形を避け、インデンテーションを弾性範囲内に保つために、＜１０ｎＮの最大荷重を各データ点に加えた。測定は、サンプル当たり約２５０個の力曲線を得ることによって行った。力曲線をフィッティングさせるために、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ Ｎａｎｏ－ｉｎｄｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＰＵＮＩＡＳ）を使用した。
【0136】
厚いゲル（厚さ数μｍ）の弾性率は、荷重力曲線をヘルツモデルにフィッティングさせることによって得られた：
【0137】
【数1】
【0138】
Ｆは力、δはサンプル変形、Ｅはヤング率、νはポアソン比、Ｒはインデンテーションプローブの半径である。力曲線にフィッティングさせるために、インデンテーション深さを２００ｎｍ、すなわち全膜厚の１０％以内に制御し、硬い基板の影響を最小化した。
【0139】
細いファイバーに対して鋭いプローブを用いて行った力曲線を、ＤＭＴ（Ｄｅｒｊａｇｕｉｎ，ＭｕｌｌｅｒおよびＴｏｐｏｒｏｖ）モデルによって、分析した。ＤＭＴモデルは、ヘルツモデルに基づくが接着の説明を含むものであり、小ファイバーに関する機械的研究において使用される標準的なモデルである［Ｂ．Ｒ．Ｎｅｕｇｉｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏｓｃａｌｅ ２０１６，８，８４１４－８４２６を参照のこと］。力曲線は、ＤＭＴモデルでは以下の方程式で記述される：
【0140】
【数2】
【0141】
Ｆ０は接着力である。力曲線のフィッティングは、硬い基板の影響を最小化するために、インデンテーション深さを４～５ｎｍ、すなわち全膜厚の１０％以内に制御することによって、行った。全てのサンプルは、非圧縮性であると考えられ、ポアソン比は０．５であった。
【0142】
コートカバースリップのプロフィロメトリー分析：サンプルカバースリップを、先に記載されているように調製した。Ｚｙｇｏ Ｎｅｘｖｉｅｗ ３Ｄ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｐｒｏｆｉｌｏｍｅｔｅｒを使用して、カバースリップの表面を画像化した。Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶ（Ｖ２Ａ２）、Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶ（Ａ２Ｇ２）、Ｃ１６ＶＥＶＡ２ＧＩＫＶＡＶ（ＶＥＶＡ２）、ラミニンコートカバースリップ、およびブランクカバースリップを、インビトロで７２時間および６０日間、試験された。画像を得るために、２倍ズームおよび１０μｍ走査長で１０倍対物レンズを使用した。サンプルを１０分間乾燥させた後、画像化した。外科用ブレードを使用して各カバースリップに引っ掻き傷を付け、サンプル条件当たり少なくとも９枚の画像を撮影した。表面厚さは、Ｚｙｇｏ’ｓ Ｍｘ ｓｏｆｔｗａｒｅの領域ツールを使用して分析した。引掻き面を基準面と設定し、測定したコーティング厚さを基準面に対するコーティングの平均深さとして計算した。視覚的比較のために、全ての画像を、－０．５μｍの最小値および２．４μｍの最大値を有する標準化スケールに正規化した。
【0143】
広角Ｘ線散乱（ＷＡＸＳ）：測定は、アルゴンヌ国立研究所のＡｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＰＳ）の５ＩＤにて、ファイバー結合素子（ＣＣＤ）検出器を用いて行った。入射Ｘ線の波長は０．７２９Åであり、入射エネルギーは１３ｋｅＶであった。１５０μＬのサンプル溶液（ＮａＣｌおよびＫＣｌの水溶液（［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭおよび［ＫＣｌ］＝３ｍＭ）中、［ＰＡ］＝５．３ｍＭ）を一定の直径のガラスキャピラリーに導入し、Ｘ線を３秒間照射した。照射中、１０μＬ／秒の流量のフローセルシステムを用いてサンプル溶液を連続的に振動させた。
【0144】
赤外（ＩＲ）分光：ＰＡサンプルのＩＲスペクトルを、ＢｒｕｋｅｒモデルＴｅｎｓｏｒ３７分光計で記録した。１００μＬのサンプル溶液（ＮａＣｌおよびＫＣｌの水溶液（［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭおよび［ＫＣｌ］＝３ｍＭ）中、［ＰＡ］＝１ｗｔ％）を凍結乾燥し、ゲルマニウム結晶を備えたＡＴＲサンプルステージ上に凍結乾燥粉末を置いた。ＩＲスペクトルを３２回スキャンし、次いで平均化した。
【0145】
蛍光観察のためのＤＰＨ包埋ＰＡサンプル：１，６－ジフェニル－１，３，５－ヘキサトリエン（ＤＰＨ；２．８ｍＭ）のＴＨＦ溶液（２μＬ）を、１００μＬのＰＡ水溶液（［ＰＡ］＝２ｍＭ、［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）に添加し、混合物を２５℃で３０分間インキュベートした。次に、混合物を、ＫＣｌおよびＮａＣｌの水溶液（１９００μＬ、［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）で希釈し、２５℃で１０分間インキュベートして、ＤＰＨ（２．８μＭ）包埋ＰＡ（１００μＭ）の溶液を得た。蛍光スペクトルは、光路長１ｃｍの石英セルを用いて、ＩＳＳモデルＰＣ１分光蛍光光度計で記録した。３３６ｎｍ平面偏光を用いて光励起時の偏光蛍光を測定し、蛍光異方性ｒを以下のように計算した：
【0146】
【数3】
【0147】
ここで、Ｉは蛍光強度を表し、添え字ＶおよびＨはそれぞれ励起偏光子および発光偏光子の垂直方向および水平方向を表し、ＧはＩＨＶ／ＩＨＨによって与えられ、垂直偏光および水平偏光に対する相対的な感度を説明する（Ｊ．Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚ，ｉｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｅｄ．３，２００６，ｐｐ．３５３－３８２）。
【0148】
蛍光観察のためのＴＭＡ－ＤＰＨ包埋ＰＡサンプル：１００μＬのＰＡ水溶液（［ＰＡ］＝２ｍＭ、［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）に、１－（４－トリメチルアンモニウムフェニル）－６－フェニル－１，３，５－ヘキサトリエンｐ－トルエンスルホネート（ＴＭＡ－ＤＰＨ；１．４ｍＭ）のエタノール溶液（４μＬ）を添加し、混合物を２５℃で３０分間インキュベートした。次も、混合物を、ＫＣｌおよびＮａＣｌの水溶液（１９００μＬ、［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）で希釈し、２５℃で１０分間インキュベートして、ＴＭＡ－ＤＰＨ（２．８μＭ）包埋ＰＡ（１００μＭ）の溶液を得た。蛍光スペクトルは、光路長１ｃｍの石英セルを用いて、ＩＳＳモデルＰＣ１分光蛍光光度計で記録した。
【0149】
レオロジー：上記の方法を使用して、ＰＡ材料を調製した。全てのレオロジー観察について、ＭＣＲ３０２レオメーター（Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ）を使用した。ＰＡ溶液をサンプルステージ（１５０μＬ）上に置き、材料の上の２５ｍｍコーンプレートの下側に、１５０ｍＭのＣａＣｌ２溶液（３０μＬ、最終濃度２５ｍＭ）をピペットで移した。インビトロ培養条件をシミュレーションするために、装置ステージを３７℃に設定した。プレートをゆっくりと測定位置まで下げ、湿度接管（humidity collar）を使用して、サンプルプランジャーを封入し、各４５分間の実験運転中のサンプル蒸発を防止した。各実験の最初の区間の間、１０［ｒａｄ／ｓ］および０．１％歪みの一定角周波数で３０分間、サンプルを平衡化した。水平状態が発生した後、区間の終わりに、貯蔵弾性率および損失弾性率（Ｇ’およびＧ’’）を記録した。角周波数は、２１点にわたって１００ｒａｄ／ｓから１ｒａｄ／ｓまで増分された。全ての周波数について、Ｇ’およびＧ’’を記録した。最後に、％歪みを３１点にわたって０．１から１００％まで漸増的に増加させ、Ｇ’およびＧ’’を記録した。
【0150】
［シミュレーション手順］
シミュレーションのためのＰＡは、Ａｖｏｇａｄｒｏにおいて作成されたものであり、脂肪族尾部を含むｍａｒｔｉｎｉｚｅ．ｐｙの修正バージョンを使用し、二次構造の選択としてコイルドコイルを使用して、ＭＡＲＴＩＮＩ力場ＣＧ表示に変換された。最後の２つのＥ（脂肪族尾部から最も遠い）およびＫは荷電している一方、２つの最初のＥは、予備シミュレーションにおいてファイバー形成のために理想的であることが見出されたので、プロトン化されたものとして扱われる。組み立てられたペプチドと遊離ペプチドとの間のプロトン化状態におけるこの差異は、以前に報告されている。したがって、最終的な電荷は（－２＋１＝）－１であるが、－２であるＶＥ（－）ＶＡ２コントロールを除く（図１２）。初期構造は、ランダムに配置され最低３Åの間隔を置いて配置された３００個の分子からなり、ＣＧ水で溶媒和されており、立方形箱２１．５×２１．５×２１．５ｎｍ３中でシステムを中和するために十分なイオンが添加された。
シミュレーションのためのＰＡは、Ａｖｏｇａｄｒｏにおいて作成されたものであり、脂肪族尾部を含むｍａｒｔｉｎｉｚｅ．ｐｙの修正バージョンを使用し、二次構造の選択としてコイルドコイルを使用して、ＭＡＲＴＩＮＩ力場ＣＧ表示に変換された。最後の２つのＥ（脂肪族尾部から最も遠い）およびＫは荷電している一方、２つの最初のＥは、予備シミュレーションにおいてファイバー形成のために理想的であることが見出されたので、プロトン化されたものとして扱われる。組み立てられたペプチドと遊離ペプチドとの間のプロトン化状態におけるこの差異は、以前に報告されている。したがって、最終的な電荷は（－２＋１＝）－１であるが、－２であるＶＥ（－）ＶＡ２コントロールを除く（図１２）。初期構造は、ランダムに配置され最低３Åの間隔を置いて配置された３００個の分子からなり、ＣＧ水で溶媒和されており、立方形箱２１．５×２１．５×２１．５ｎｍ３中でシステムを中和するために十分なイオンが添加された。
【0151】
これは、それぞれ５０ｍＭ（Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶ（Ｖ２Ａ２）、Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶ（Ａ２Ｇ２）、Ｃ１６ＶＥＶＡ２ＧＩＫＶＡＶ（ＶＥＶＡ２）について、それぞれ７．８、７．４、および８．３ｗｔ％）の濃度に対応する。これは、自己集合シミュレーションを迅速化するために一般的に使用される濃度の範囲内であり、実験系よりも１０倍まで高くすることができる。全ての視覚化は、Ｖｉｓｕａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ（ＶＭＤ）を用いてレンダリングした。
【0152】
粗視化分子動力学（ＣＧ－ＭＤ）シミュレーションはＧＲＯＭＡＣＳ ５．０．４で行った。これは、シミュレーションの分析にも用いた。分子間相互作用については、１．１ｎｍのカットオフを使用した。ここでは、静電学については比誘電率１５を有する反応場を使用し、Ｌｅｎｎａｒｄ－Ｊｏｎｅｓ相互作用については電位シフトを使用した。全てのシステムは、５０００ステップの間、または原子中の力が２０００ｐＮ未満に収束するまで、最小限にした。ＮＰＴアンサンブルにおいて２５ｆｓタイムステップを用いて、自己集合シミュレーションを行った。温度（３０３Ｋ、τＴ＝１ｐｓ）についてはＶリスケールアルゴリズムを用い、圧力（１バール、τＰ＝３ｐｓ）についてはＢｅｒｅｎｄｓｅｎを用いた。１０μｓの有効時間に対応する１００，０００，０００ステップの間、シミュレーションを行った。
【0153】
各骨格および脂肪族尾部ビーズの第１の溶媒和球について、半径方向の分布関数の積分を使用して、ＰＡの水接触を計算し（図５ｆ）、４ｘ因子を適用してＣＧ水を水分子に変換した。シミュレーションの最後の５μ秒（ファイバーは５μ秒後に平衡化される）にわたる二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）の変動として、ダイナミズムは測定される。
【0154】
［細胞培養および分析］
ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）培養条件：健常コントロールである個人（１１ａ：男性、３６歳；１８ａ：女性、５１歳）由来の皮膚線維芽細胞のレトロウイルス形質導入により、人工多能性幹細胞株を誘導した（Ｂｏｕｌｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ，２０１１ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。ｍＴｅＳＲ１培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）コートプレート上でｉＰＳＣを培養し、１ｍＭのＥＤＴＡまたはＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）を使用して週単位で継代した。全ての細胞培養物は、３７℃および５％のＣＯ２で維持し、マイコプラズマについて月単位で試験した。
ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）培養条件：健常コントロールである個人（１１ａ：男性、３６歳；１８ａ：女性、５１歳）由来の皮膚線維芽細胞のレトロウイルス形質導入により、人工多能性幹細胞株を誘導した（Ｂｏｕｌｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ，２０１１ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。ｍＴｅＳＲ１培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）コートプレート上でｉＰＳＣを培養し、１ｍＭのＥＤＴＡまたはＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）を使用して週単位で継代した。全ての細胞培養物は、３７℃および５％のＣＯ２で維持し、マイコプラズマについて月単位で試験した。
【0155】
運動ニューロン（ＭＮ）分化：７０％培養密度で、Ａｃｃｕｔａｓｅを用いてｉＰＳＣ培養物を分離させ、ｍＴｅＳＲ１中の１０μＭのＲＯＣＫインヒビター（Ｙ－２７６３２、ＤＮＳＫ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて、１０５細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングした。翌日（０日目）、１０μＭのＳＢ４３１５４２（ＤＮＳＫ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、１００ｎＭのＬＤＮ－１９３１８９（ＤＮＳＫ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、１μＭのレチノイン酸（ＲＡ，Ｓｉｇｍａ）および１μＭのＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニスト（ＳＡＧ，ＤＮＳＫ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を含有するＮ２Ｂ２７培地（５０％のＤＭＥＭ：Ｆ１２、５０％のＮｅｕｒｏｂａｓａｌであり、ＮＥＡＡ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｎ２およびＢ２７が補充されている；Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、培地を置換した。培養培地を６日目まで毎日交換し、次いで、１μＭのＲＡ、１μＭのＳＡＧ、５μＭのＤＡＰＴ（ＤＮＳＫ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）および４μＭのＳＵ５４０２（ＤＮＳＫ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を補充したＮ２Ｂ２７培地に切り替えた。１４日目まで細胞に毎日供給し、１４日目には、ＤＮａｓｅ Ｉ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を補充したＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＭＮを分離させ、予めコーティングしたポリ－Ｄ－リジン／ラミニン、または別のＩＫＶＡＶコーティング表面上にプレーティングした。週３回、アスコルビン酸（０．２μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦおよびＧＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、ならびに１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（ＮＢＭ：ＮＥＡＡ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｎ２およびＢ２７）をＭＮに供給した。
【0156】
皮質ニューロン分化：ｉＰＳＣからの皮質ニューロン分化は、Ｚｈａｎｇら、２０１５年に記載のプロトコルに基づいて、発生させた。Ａｃｃｕｔａｓｅを用いてｉＰＳＣを分離させ、まだｍＴＥＳＲ１＋１０μＭのＲＯＣＫインヒビターを含む懸濁液中で、３つのレンチウイルスの異なる構築物と共に細胞を形質導入した：１、構成的発現ｒｔＴＡを発現する；２、テトラサイクリン誘導性様式でピューロマイシン耐性遺伝子をＮｇｎ２と共発現する；３、テトラサイクリンの存在下でもＧＦＰを発現する。細胞をＭａｔｒｉｇｅｌコートプレート上に２４時間プレーティングした（９×１０５細胞／ｃｍ２）。翌日（１日目）、ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ－１９３１８９およびＸＡＶ９３９（ＤＮＳＫ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を補充したノックアウト血清置換培地（ＫＯＳＲ、Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中のドキシサイクリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加することによって、異なる構築物の発現を誘導した。２日目に、神経誘導培地（ＮＩＭ：ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋非必須アミノ酸（Ｃｏｒｎｉｎｇ）＋Ｎ２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋ヘパラン硫酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））で、補充ＫＯＳＲ培地を１：１で希釈する。ドキシサイクリンおよびピューロマイシンを添加し、Ｎｇｎ２感染細胞を選別した。翌日（３日目）に、ＮＩＭ、ドキシサイクリンおよびピューロマイシンを細胞に供給した。４日目に、Ａｃｃｕｔａｓｅを用いて細胞を分離させ、ＮＢＭ＋ドキシサイクリン＋ＢＤＮＦでコーティングした別の表面上にプレーティングする。分析まで、培地を週に３回交換した。
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中のドキシサイクリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加することによって、異なる構築物の発現を誘導した。２日目に、神経誘導培地（ＮＩＭ：ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋非必須アミノ酸（Ｃｏｒｎｉｎｇ）＋Ｎ２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋ヘパラン硫酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））で、補充ＫＯＳＲ培地を１：１で希釈する。ドキシサイクリンおよびピューロマイシンを添加し、Ｎｇｎ２感染細胞を選別した。翌日（３日目）に、ＮＩＭ、ドキシサイクリンおよびピューロマイシンを細胞に供給した。４日目に、Ａｃｃｕｔａｓｅを用いて細胞を分離させ、ＮＢＭ＋ドキシサイクリン＋ＢＤＮＦでコーティングした別の表面上にプレーティングする。分析まで、培地を週に３回交換した。
【0157】
細胞生存率アッセイ：細胞生存率を評価するために、ＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。これは、細胞溶解時に放出される安定なサイトゾル酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を定量的に測定する、比色アッセイである。別のコート表面上で培養した細胞からの細胞培地を異なる培養時点で収集し、４９０～４９２ｎｍの吸光度で読み取られる赤色ホルマザン生成物へのテトラゾリウム塩の変換を定量することによって、ＬＤＨ酵素の細胞外レベルを測定した。分析は、少なくとも３つの独立した分化において、条件当たり最低３回の技術的反復で、行った。β－インテグリン研究を行うために、運動ニューロンを、β１－インテグリン（１：１０００）またはβ４－インテグリン（１：１０００、Ａｂｃａｍ、ＵＫ）抗体で７２時間処理し、各条件についてＬＤＨ生存率および細胞付着を分析した。
【0158】
質量分析法：Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶ（Ａ２Ｇ２）上で６０日間培養した運動ニューロン、およびラミニンコーティングを、溶解緩衝液（０．５％のＳＤＳ（ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、５０ｍＭのＡｍＢｉｃ（ｆｉｓｈｅｒ）、５０ｍＭのＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＨＡＬＴプロテアーゼインヒビター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を用いて、消化し、短時間ボルテックスした。３０秒間を３回、サンプルを超音波処理した。処理されたサンプルにおけるタンパク質濃度を決定するために、ＢＣＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を行い、分析については１００μｇのタンパク質／状態を用いた。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによってペプチドを分析した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳは、Ｄｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｅ
３０００ Ｒａｐｉｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｎａｎｏＬＣ、およびＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）ＨＦ Ｈｙｂｒｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ（商標）質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。５％のＡＣＮ／０．１％のＦＡから、４０％のＡＣＮ／０．１％のＦＡへ、１８０分間の分析勾配にて、ペプチドを分離した。フラグメンテーションのために、各ＭＳ１走査における最も豊富な前駆体イオン上位１５個を選択した。前駆体を、２Ｄａの分離幅で選択し、ＨＣＤセル中で３０％正規化衝突エネルギーにて、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）により断片化した。
３０００ Ｒａｐｉｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｎａｎｏＬＣ、およびＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）ＨＦ Ｈｙｂｒｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ（商標）質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。５％のＡＣＮ／０．１％のＦＡから、４０％のＡＣＮ／０．１％のＦＡへ、１８０分間の分析勾配にて、ペプチドを分離した。フラグメンテーションのために、各ＭＳ１走査における最も豊富な前駆体イオン上位１５個を選択した。前駆体を、２Ｄａの分離幅で選択し、ＨＣＤセル中で３０％正規化衝突エネルギーにて、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）により断片化した。
【0159】
消化酵素トリプシンを想定して、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ＿２０１７＿１１データベース（ホモサピエンス用に選択、ｕｎｋｎｏｗｎバージョン、２０２４４エントリー）を検索するために設定したＭａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ；バージョン２．５．１）を用いて、全てのＭＳ／ＭＳサンプルを分析した。質量許容差０．０５０Ｄａのフラグメントイオンおよび許容差１０．０ＰＰＭの親イオンで、Ｍａｓｃｏｔを検索した。システインのカルバミドメチルが、固定修飾としてＭａｓｃｏｔに特定された。アスパラギンおよびグルタミンの脱アミド化物、メチオニンの酸化物、ｎ末端のアセチル、ならびにリジンおよびｎ末端のＴＭＴ６ｐｌｅｘが、可変修飾としてＭａｓｃｏｔに特定された。Ｓｃａｆｆｏｌｄ（バージョンＳｃａｆｆｏｌｄ＿４．８．４、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して、ＭＳ／ＭＳに基づくペプチドおよびタンパク質同定を検証した。それらが、Ｐｅｐｔｉｄｅ
Ｐｒｏｐｈｅｔアルゴリズム（Ｋｅｌｌｅｒ、Ａ ｅｔ ａｌ Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００２；７４（２０）：５３８３－９２）により、スキャフォールドデルタ質量補正を用いて９５．０％を超える確率で確立できた場合に、ペプチド同定を承認した。タンパク質同定は、９９．９％を超える確率で確立でき、少なくとも２つの同定されたペプチドを含んだ場合に、承認した。タンパク質の確率は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｐｈｅｔアルゴリズム（Ｎｅｓｖｉｚｈｓｋｉｉ，Ａｌ ｅｔ ａｌ Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００３；７５（１７）：４６４６－５８）を用いて、割り当てた。類似のペプチドを含み、ＭＳ／ＭＳ分析のみに基づいて区別することができなかったタンパク質は、最節約原理（principles of parsimony）を満たすようにグループ分けした。
Ｐｒｏｐｈｅｔアルゴリズム（Ｋｅｌｌｅｒ、Ａ ｅｔ ａｌ Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００２；７４（２０）：５３８３－９２）により、スキャフォールドデルタ質量補正を用いて９５．０％を超える確率で確立できた場合に、ペプチド同定を承認した。タンパク質同定は、９９．９％を超える確率で確立でき、少なくとも２つの同定されたペプチドを含んだ場合に、承認した。タンパク質の確率は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｐｈｅｔアルゴリズム（Ｎｅｓｖｉｚｈｓｋｉｉ，Ａｌ ｅｔ ａｌ Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００３；７５（１７）：４６４６－５８）を用いて、割り当てた。類似のペプチドを含み、ＭＳ／ＭＳ分析のみに基づいて区別することができなかったタンパク質は、最節約原理（principles of parsimony）を満たすようにグループ分けした。
【0160】
ウエスタンブロット：ウエスタンブロット分析のために、１４、１７、３０、４５および６０日後のヒトｉＰＳＣ由来ニューロン培養物からタンパク質抽出物を得、ＢＣＡアッセイを用いて全タンパク質抽出物を定量した。各サンプルのタンパク質１０～２０μｇをＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に電気泳動転写した。５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて膜をブロッキングし、最初に一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、次いでそれらの対応する二次ＨＲＰ結合抗体（１：３０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にインキュベートした。タンパク質シグナルをＥＣＬ化学発光システム（Ａｚｕｒｅ）によって検出した。タンパク質ローディングについてのコントロールとして、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、ＵＳＡ）を用いて、アクチンに標準化された密度測定分析を行った。定量のために、３～６つの分化物から得られたサンプルを分析した。
【0161】
細胞の免疫蛍光：免疫蛍光のために、固定化ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンを、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、次いでそれらの適切なウサギ、マウスおよびヤギ抗Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５５５またはＡｌｅｘａ６４７二次抗体（１：５００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と共にインキュベートした。ＤＡＰＩ（１：５００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して核を染色した。最後に、画像化のために、Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて調製物をカバースリップした。
【0162】
ウエスタンブロットおよび免疫蛍光のために使用した抗体：ウエスタンブロットおよび／または免疫細胞化学のために、以下の一次抗体を使用した：ヤギ抗コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ、１：１０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マウス抗ＩＳＬＥＴ１／２（ＩＳＬ１／２、１：５００、ハイブリドーマバンク、Ｉｏｗａ）、マウス抗ＦＯＸＡ－２（１：１０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ウサギ抗微小管関連タンパク質－２（ＭＡＰ－２、１：１０００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗マウス、ウサギおよびニワトリβ－チューブリンＩＩＩ（ＴＵＪ－１、ａｂｃａｍおよびＢｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ウサギ抗シナプス後肥厚９５（ＰＳＤ９５、１：１０００、Ａｂｃａｍ）、マウス抗シナプシン－１（ＳＹＮ－１、ａｂｃａｍ）、マウス抗シナプトフィジン（ＳＹＰ、１：５００、ａｂｃａｍ）、マウス抗１－インテグリン（ＨＵＴＳ４、１：５００、ａｂｃａｍ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）、ウサギ抗リン酸化接着斑キナーゼ（ｐ－ＦＡＫ、１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）、ウサギ抗接着斑キナーゼ（ＦＡＫ、１：１０００、Ｒａｂｂｉｔ）、抗マウスアクチン（１：２０００、ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ウサギ抗インテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ、１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）、ウサギ抗ラミニン（１：１０００、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ウサギ抗Ｋｉ６７（１：５００、ａｂｃａｍ）、ウサギ抗ＧＦＡＰ（１：１０００、Ｄａｋｏ）、ウサギ抗フィブロネクチン（１：１０００、Ａｂｃａｍ）、ウサギ抗ＧＡＰ４３（１：５００、Ａｂｃａｍ）、マウス抗ニューロン抗原Ｎ（ＮＥＵＮ、１：１０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マウス抗ＳＡＴＢ－２（１：２５０、Ａｂｃａｍ）。
【0163】
Ｓｈｏｌｌ分析：Ｆｉｊｉソフトウェア（米国国立衛生研究所、ＵＳＡ）により、抗ＭＡＰ２抗体で免疫標識したニューロンの共焦点顕微鏡写真を用いて、ニューロン形態分析を行った。最大の再構成物を、輝度とコントラストについて較正および調整し、続いて、、Ｓｉｍｐｌｅ Ｎｅｕｒｉｔｅ Ｔｒａｃｅｒ（ＳＮＴ）を用いて、半自動トレース処理した。得られた神経突起トレース処理画像から、Ｓｈｏｌｌ分析Ｆｉｊｉプラグインを用いて、ニューロンの分岐の複雑度を分析した。このツールは、ニューロン細胞体の周りに一連の同心円を生成し、異なる円を横切る神経突起の数を計算する。これらのデータのグラフ表示は、１つの特定のニューロンのニューロンの分岐（arbor）に沿った分岐の複雑さを示す。通常の分布を有する最低３つの独立の分化物から得られたデータについて、４つの実験群の比較のために、一元配置分散分析に続いて、ボンフェローニ事後検定を行った。
【0164】
マルチ電極アレイ（ＭＥＡ）記録：電気生理学研究のために、１２および２４ウェルＭＥＡプレートを、Ａｘｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓプロトコルに従ってポリエチレンアミン（ＰＥＩ）およびラミニンを用いて、または、ＰＥＩおよび種々のＩＫＶＡＶ ＰＡ（Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶ（Ｖ２Ａ２）、Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶ（Ａ２Ｇ２）、Ｃ１６ＶＥＶＡ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶ（ＶＥＶＡ２））を用いて、コーティングした。ヒトｉＰＳＣ由来運動ニューロン（１８ａ）を５０，０００細胞／ウェルの密度でコーティング上に直接播種し、４０日目まで培養した。コントロールとして、初期マウス皮質アストロサイトを、運動ニューロンを培養する２日前に播種した。Ａｘｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍａｅｓｔｒｏ ７６８チャネル増幅器およびＡｘｉｏｎ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓｔｕｄｉｏｓ（ＡｘＩＳ）ｖ２．４ソフトウェアを使用して、自発的ネットワークおよび同期した活動を記録した。増幅器は、１２００倍のゲインおよび１２．５ｋＨｚ／チャネルのサンプリングレートを用いて、全てのチャネルから同時に記録した。バターワースバンドパスフィルタ（３００～５０００Ｈｚ）オンラインスパイク検出（閾値＝６×各チャネル上の雑音の二乗平均平方根）を通過した後、軸適応スパイク検出器で行った。全ての記録は、適切な５％のＣＯ２／９５％のＯ２を用いて、３７℃で行った。自発的ネットワーク活動を、２０日目から開始して、５分間を週に３回、記録した。＞５スパイク／分を有するものとして活動電極を定義し、ベースライン記録期間中に１０を超える活動電極を有したウェルのみを分析に使用した。ウェル内の電極の２５％以上で互いに１００ｍｓ以内に生じたスパイクおよびバースト活動として、同期した活動を定義した。平均発火速度（Ｈｚ）、ネットワークバースト持続時間（ｓ）、およびネットワークバースト当たりのスパイク数は、ニューロン機能特性の成熟を示すため、ニューロン活動の尺度として使用した。全てのデータは、十分に広い平均を反映し、ここで、ｎの報告された値は、状態当たりのウェルの数を表す。
【0165】
電気生理現象：Ｆｌａｍｉｎｇ－Ｂｒｏｗｎ Ｐ－９７（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてガラス毛細管（製品番号ＴＷ１５０Ｆ－４、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＬ、ＵＳＡ）から引き出した２～４ＭΩガラス電極を用いて、全細胞パッチクランプを行った。Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＭＰ－２８５電動マイクロマニピュレーター（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて、電極を配置した。マルチクランプ７００Ｂ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＷｉｎｆｌｕｏｒソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｔｒａｔｈｃｌｙｄｅ、Ｇｌａｓｇｏｗ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）を用いて、室温で全細胞パッチクランプ測定を行った。簡単に述べると、１１１ＮａＣｌ、３．０９ＫＣｌ、２５．０ＮａＨＣＯ３、１．１０ＫＨ２ＰＯ４、１．２６ＭｇＳＯ４、２．５２ＣａＣｌ２、および１１．１グルコース（ｍＭ単位）を含有する改変リンゲル溶液で、スライスを潅流した。９５％のＯ２および５％のＣＯ２で溶液を酸素化し、潅流速度は１．５～２．０ｍｌ／分であった。パッチ電極は、１３８Ｋ－グルコネート、１０ＨＥＰＥＳ、５ＡＴＰ－Ｍｇ、０．３ＧＴＰ－ＬｉおよびＴｅｘａｓ Ｒｅｄデキストラン（７５μＭ、３０００ＭＷ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡから）（ｍＭ単位）を含有した。電圧クランプモードでは、マルチクランプ上の自動静電容量補償を用いて、全細胞静電容量と同様に、高速および低速過渡容量を補償した。電流クランプでは、Ｉ－ｏｎ（発火開始時の電流レベル）、Ｉ－ｏｆｆ（発火停止時の電流レベル）および周波数－電流の関係を試験するために、ニューロンを脱分極電流ランプに供した。刺激間には、過分極電流を用いてニューロンを－８０ｍＶ付近に保持した。選択したニューロンは、寸法が大きく（入力抵抗＜１０００ＭΩ）、静止膜電位が－３５ｍＶ以下であった。脱分極電流ランプによって誘発された第１の活動電位を使用して、Ｉ－ＯＮ（発火開始時の電流）を含む全てのパラメータを測定した。勾配が１０Ｖ／ｓを超えた電圧として、閾値電圧を定義した。オーバーシュート（０ｍＶを通る）マイナス閾値電圧を用いて、活動電位の大きさを測定した。活動電位の持続時間は、活動電位の高さの半分にて測定される。活動電位プロファイルの一次導関数のピークおよび谷間として、立ち上がりおよび立ち下がりの速度を定義する。
【0166】
細胞の画像化／分析：蛍光調製物を見て、ＧａＡｓＰ検出器を備えるニコンＡ１Ｒ共焦点レーザー走査型顕微鏡、ニコンスペクトル照明マイクロコピー（Ｎ－ＳＩＭ）またはニコンＴｉ２－Ｗｉｄｅｌｆｉｅｌｄを用いて、顕微鏡写真を撮影した。
【0167】
タンパク質発現研究のために、ＧａＡｓＰ検出器を備えるニコンＡ１Ｒ共焦点レーザー走査型顕微鏡、またはニコンスペクトル照明マイクロコピー（Ｎ－ＳＩＭ）によって、画像を取得した。×１００油浸対物レンズ（ＮＡ＝１．４）を使用し、ｚ方向に３～８枚の画像を０．１２５μｍ間隔で、１０２４×１０２４画素解像度で撮影した。取得パラメータは、全ての走査について同一に保たれた。Ｆｉｊｉソフトウェア（米国国立衛生研究所、ＵＳＡ）を用いて、画像の二次元平均投影再構成、蛍光分析および定量化を行った。
【0168】
細胞分布について、ＧａＡｓＰ検出器を備えたニコンＡ１Ｒ共焦点レーザー走査型顕微鏡によって、×２０対物レンズを用いて１０２４×１０２４画素解像度で、画像を取得した。細胞位置をＥｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアによって分析し、Ｍａｔｌａｂ Ｋｎｎｓｅａｒｃｈプラグインを用いてプロットした。
【0169】
［動物試験および分析］
動物：動物の収容および手順は全て、ヒトの治療および実験動物の使用に関する公衆衛生局の方針に従って実施し、全ての手順はノースウエスタン大学施設の動物管理使用委員会の承認を受けた。
動物：動物の収容および手順は全て、ヒトの治療および実験動物の使用に関する公衆衛生局の方針に従って実施し、全ての手順はノースウエスタン大学施設の動物管理使用委員会の承認を受けた。
【0170】
アストロサイト培養：先に述べたように新生マウス（Ｐ０）の大脳皮質から、グリア細胞を誘導した。ポリ－Ｄ－リジンおよびラミニンコーティングを有するＭＥＡプレート上で、３％の正常ヒト血清（ＮＨＳ）、１％のペニシリン－ストレプトマイシン（ｐｅｎ－ｓｔｒｅｐ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）および２ｍｍｌ－グルタミンを含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ中で、継代１の細胞を２×１０５細胞／ｃｍ２の密度で３日間培養した。ＩＰ由来運動ニューロンを４０日間、アストロサイト存在下で培養した。コントロールおよび参照グリア条件の細胞組成および生化学的特徴付けの両方は、先に記載されている。
【0171】
マウス脊髄損傷および動物：成熟雌ＣＤ－１マウス（体重２５～３０ｇ、８週齢）を用いて、実験を行った。無菌状態および全身麻酔下で椎弓切除を行い、Ｔ１１レベルで脊髄を露出させた。
【0172】
８０ｋｄｙｎの衝撃力および６０秒の滞留時間で、無限水平脊髄衝撃システム（ＩＨ－０４００ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ＬＬＣ、ＵＳＡ）を使用して、重篤な損傷を行った。衝撃によって誘発された脊髄の変位を、各動物について測定した。損傷後、９ｍｍ創傷クリップ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて皮膚を縫合し、加熱パッド上で動物を回復させて、体温を維持した。損傷後３日間、ブプレノルフィン麻酔薬（０．０５ｍｇ／ｋｇ、皮下投与、１ｍｌの滅菌生理食塩水中）を毎日投与した。感染のリスクを減らすために、損傷後３日間、バリトリル抗生物質（２．５ｍｇ／ｋｇ、皮下投与、１ｍｌの滅菌生理食塩水中）を毎日投与した。膀胱を毎日手動で絞り出した。神経行動学的解析は、他で発表されているようにマウス用のＢａｓｓｏ Ｍｏｕｓｅ ｓｃａｌｅ（ＢＭＳ）を用いて行った。
【0173】
ペプチド両親媒性物質注入：ＳＣＩの２４時間後、表面張力を減少させるためにＳｉｇｍａｃｏｔｅ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でコーティングしたホウケイ酸ガラス毛細管マイクロピペット（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）（外径１００μｍ）を用いて、生理食塩水溶液（ｎ＝１６）、１ｗｔ％のＣ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶ ＰＡ（ｎ＝１６）、またはＣ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶ ＰＡ（ｎ＝１０）溶液をマウスに与えた。Ｍｉｃｒｏ４マイクロシリンジポンプコントローラー（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって制御されるメスルアーアダプター（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＬ）を使用して、Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジに毛細管を装填した。イソフルオラン麻酔下で、オートクリップを除去し、損傷部位を露出させた。損傷後２４時間の時点では、椎弓切除は依然として無傷であり、損傷によって生じた打撲傷は明らかである。定位Ｋｏｐｆ装置を用いて、マイクロピペットを損傷のちょうど背側に配置した。マイクロピペットを脊椎の背側から測定して７５０μｍの深さまで下げ、２．５μｌの希釈した両親媒性物質溶液を１μｌ／分で注入した。マイクロピペットを２５０μｍの間隔で引き抜いて、脊椎中にＰＡの痕跡（腹側から背側へ）を残した。注入の終わりに、ピペットをさらに１分間その位置に残し、その後、ピペットを引き抜き、創傷を閉じた。コントロール条件として、等張性生理食塩水溶液（ＮａＣｌが０．９％、ＲＩＣＣＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）および骨格Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ２を使用した。全ての実験について、実験者は、動物の同一性について盲検化されたままであった。
【0174】
免疫組織化学：０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）中の４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて、マウスを潅流した。マウスの脊椎を、その後８～１２時間固定し、凍結保護し、凍結保存した。厚さ４０μｍの切片を凍結保護溶液中に収集し、さらなる使用まで－３０℃で保存した。スキャフォールド内部のタンパク質の表現型を特徴付けるために、以下の一次抗体を使用した：マウス抗ＮｅｕＮ（ニューロンマーカー、１：５００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ウサギ抗グリアファイバー酸性タンパク質（ＧＦＡＰ、成熟した反応性グリア細胞マーカー、１：１０００～８０００；Ｄａｋｏ）、ヤギ抗Ｉｂａ１（ミクログリアおよびマクロファージマーカー、１：２００；Ａｂｃａｍ）、マウス抗Ｔｕｊ－１（ニューロンマーカー、１：１０，０００；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ウサギ抗ＭＡＰ２（ニューロン細胞体および樹状突起マーカー、１：２０００；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ウサギ抗ダブルコルチン（ＤＣＸ、ニューロンマーカー、１：１０００；Ａｂｃａｍ）、ラット抗ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ（内皮マーカー、１：２００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ウサギ抗ラミニン（細胞外マトリックスおよび血管マーカー、１：５００；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ニワトリ抗ニューロフィラメント（ＮＦ、樹状突起マーカー、１：１０００、Ａｂｃａｍ）、ヤギ抗５ＨＴ（１：１０００、樹状突起マーカー、Ａｂｃａｍ）。
【0175】
［統計分析］
統計的検定、ならびにｎの定義および正確な値を含むパラメータを、対応する図の凡例に記載する。結果は、ｐ＜０．０５であれば有意とみなした。特に記載のない限り、全てのデータは平均値±ＳＤとして記載する。統計的評価は、実験デザインに応じて、対応のあるスチューデントのｔ検定、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、反復測定ＡＮＯＶＡ、またはフリードマン検定を用いて、行った。測定数が限られる場合、それらのノンパラメトリックな等価物を用いた：ウィルコクソン順位和検定、およびクラスカル－ウォリスの一元配置分散分析。テューキーの範囲検定およびボンフェローニ法を適用して、適宜に事後差異を検定した。全ての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェアで行った。
統計的検定、ならびにｎの定義および正確な値を含むパラメータを、対応する図の凡例に記載する。結果は、ｐ＜０．０５であれば有意とみなした。特に記載のない限り、全てのデータは平均値±ＳＤとして記載する。統計的評価は、実験デザインに応じて、対応のあるスチューデントのｔ検定、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、反復測定ＡＮＯＶＡ、またはフリードマン検定を用いて、行った。測定数が限られる場合、それらのノンパラメトリックな等価物を用いた：ウィルコクソン順位和検定、およびクラスカル－ウォリスの一元配置分散分析。テューキーの範囲検定およびボンフェローニ法を適用して、適宜に事後差異を検定した。全ての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェアで行った。
【0176】
［結果］
超分子ポリマーは、それらの構成モノマーが、魅力的な特徴を示す動的な様式で非共有結合相互作用を介して集合するため、独特である。さらに、超分子材料は、それらの表面上にて種々の生物学的シグナルを用いて調整され得、細胞接着、遊走、分裂および分化のような広範囲の生物学的応答を誘導する。構成超分子モノマーは、集合した構造の安定性が最大化するように設計されていることが多いが、超分子スキャフォールドの動的特徴にはほとんど注意が払われていない。多数の重要な生物学的事象は生体分子間の非共有結合相互作用によって制御されるので、ＥＣＭ模倣超分子材料の動的特徴はそれらの生物学的機能に影響を及ぼし得る。ここで、超分子材料は、ＣＮＳにおける動的ＥＣＭシグナルの重要な性質を解読するための好適なプラットフォームとして、実証される。この効果を調べるために、得られた生理活性に対する、分子の間の分子間凝集力の影響を、インビトロおよびインビボの両方で評価した。
超分子ポリマーは、それらの構成モノマーが、魅力的な特徴を示す動的な様式で非共有結合相互作用を介して集合するため、独特である。さらに、超分子材料は、それらの表面上にて種々の生物学的シグナルを用いて調整され得、細胞接着、遊走、分裂および分化のような広範囲の生物学的応答を誘導する。構成超分子モノマーは、集合した構造の安定性が最大化するように設計されていることが多いが、超分子スキャフォールドの動的特徴にはほとんど注意が払われていない。多数の重要な生物学的事象は生体分子間の非共有結合相互作用によって制御されるので、ＥＣＭ模倣超分子材料の動的特徴はそれらの生物学的機能に影響を及ぼし得る。ここで、超分子材料は、ＣＮＳにおける動的ＥＣＭシグナルの重要な性質を解読するための好適なプラットフォームとして、実証される。この効果を調べるために、得られた生理活性に対する、分子の間の分子間凝集力の影響を、インビトロおよびインビボの両方で評価した。
【0177】
４つの主要なセグメントから構成される一連のペプチド両親媒性物質（ＰＡ）が開発された：（１）水性環境中でナノ相分離を誘導する疎水性尾部、（２）高アスペクト比ナノファイバー構造を安定化させるための分子間水素結合（Ｈ結合）を形成する疎水性アミノ酸、（３）水性溶媒中に分子が溶解することを促進する親水性アミノ酸、および（４）細胞と相互作用するように設計され、集合体の最外層に曝露される生理活性ペプチド配列。この研究のために、ラミニン－１に見られる生理活性ペンタペプチド配列であるイソロイシン－リジン－バリン－アラニン－バリン（ＩＫＶＡＶ）を用いて、ＰＡを官能化した。
【0178】
超分子集合体内の分子間凝集力が細胞挙動に及ぼす影響を調べるために、Ｈ結合の傾向が異なる３つのＩＫＶＡＶ含有ＰＡ分子を設計した（図１Ａ）。バリン－バリン－アラニン－アラニン（Ｖ２Ａ２）Ｈ結合形成領域、４つのグルタミン酸（Ｅ４）およびグリシン残基（Ｇ）を含有し、それらの表面上に疎水性エピトープＩＫＶＡＶを示すＰＡは、束状に入り込んで、その結果エピトープの生理活性を増大させる傾向が小さかった（図１Ｂ）。同じ電荷および同じ生理活性ユニットを有するが、分子間凝集力は異なる一連のＩＫＶＡＶ ＰＡを開発するために、アラニン－アラニン－グリシン－グリシン（Ａ２Ｇ２）およびバリン－グルタミン酸－バリン－アラニン－アラニン（ＶＥＶＡ２）含有ＰＡを新たに設計した（図１Ｃ、Ｄ）。Ａ２Ｇ２は、その疎水性の低下により、Ｖ２Ａ２よりも弱い分子間相互作用を有することが期待された。ＩＫＶＡＶ ＰＡであるＶ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、およびＶＥＶＡ２は、固相ペプチド合成によって合成され、液体クロマトグラフィー－質量分析によって、明確に特徴付けられた（図６）。極透過型電子顕微鏡（ｃｒｙｏ－ＴＥＭ）および走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて、低温これら３つのＰＡが水性環境下でナノファイバーを形成することを確認した（図１Ｅ～Ｊ、図２）。ナノファイバー内でのＰＡ分子の水素結合（Ｈ結合）特性を評価するために、サンプルの赤外（ＩＲ）分光を行った（図１Ｋ）。図１Ｋに示すように、Ｖ２Ａ２およびＶＥＶＡ２は、１６２８ｃｍ－１に、アミドＩの振動バンドを示した。これは、βシート構造リッチなペプチド二次構造が存在することを示している。対照的に、Ａ２Ｇ２は、１６３４ｃｍ－１に頂点を有する広いアミドＩバンドを示した。これは、ペプチドが主にランダムコイル構造にあることを示している。さらに、液相広角Ｘ線散乱（ＷＡＸＳ）を用いて、βシートの含有量を定量した。図１Ｌに示すように、Ｖ２Ａ２およびＶＥＶＡ２は、４．７２Åのｄ間隔を有するブラッグピークを示した。これは、Ｈ結合したβシートペプチド鎖間の距離に対応している。さらに、ＶＥＶＡ２について観測されたブラッグピークは、ＶＥＶＡ２よりも強かった。これは、ＶＥＶＡ２の集合体がＶ２Ａ２よりも多いＨ結合の集団を含むことを示している。しかしながら、Ａ２Ｇ２は、ランダムコイル構造の存在を示す赤外分光分析と同様に、明確なピークを示さなかった。これらの証拠により、ＰＡ分子の種々のβシート形成ドメインが種々のＨ結合の傾向をもたらすことが確認された。
【0179】
次に、蛍光脱分極技術を用いて、集合体内のＰＡ分子の動力学を調査した（図２Ａ）。ここでは、ＰＡナノファイバーに包埋されたＤＰＨ（ＤＰＨ：１，６－ジフェニル－１，３，５－ヘキサトリエン）を利用して、別のＩＫＶＡＶ ＰＡの内部疎水性コアの微小粘度を測定した。注目すべきことに、ＰＡナノファイバーへのＤＰＨの取り込みは、それらのナノ構造を劣化させないことが、それらのｃｒｙｏ－ＴＥＭ顕微鏡写真によって確認された（図８）。Ｖ２Ａ２およびＶＥＶＡ２は、飽和リン脂質二重膜集合体について観察されるものに近い０．４ほどの高い異方性を示したが、興味深いことに、Ａ２Ｇ２は有意に低い異方性の値（０．２１）を示した。さらに、ＴＭＡ－ＤＰＨ包埋ＰＡナノファイバー（ＴＭＡ－ＤＰＨ：（１－（４－トリメチルアンモニウムフェニル）－６－フェニル－１，３，５－ヘキサトリエンｐ－トルエンスルホネート））を用いて、蛍光脱分極実験を行った（図９）。ＤＰＨは両親媒性分子の疎水性尾部の内側深くに包埋されていることが知られているが、ＴＭＡ－ＤＰＨは両親媒性集合体の親水性－疎水性界面に固定されていることが知られている（図１０）。ＤＰＨ包埋ＰＡで観察されたものと同様に、Ａ２Ｇ２は、Ｖ２Ａ２およびＶＥＶＡ２よりも有意に低い異方性を示した（図９ｅ）。これらの結果は、集合体内のＡ２Ｇ２の分子運動がＶ２Ａ２やＶＥＶＡ２と比較して有意に動的であることを示す。上記の節で議論したとおり、Ｖ２Ａ２およびＶＥＶＡ２は、分子間Ｈ結合を形成し、集合体内で順序付けられたβシート二次構造をとる一方で、Ａ２Ｇ２は、不規則構造を形成する。これらの結果は、分子運動の動力学を決定する際のＨ結合傾向の重要性を示す。ペプチドベースの自己集合材料の研究にうまく適合されたＭＡＲＴＩＮＩ力場を使用する粗視化分子動力学シミュレーション（ＣＧ－ＭＤ）を用いて、３つのＰＡの集合体をさらに研究した。シミュレーションは、３つのＰＡ配列について、実験的に観察されたファイバー形成を再現した（図２Ｂ）。３つのＰＡナノファイバーは類似しているように見えるが、Ａ２Ｇ２内のＰＡファイバーはよく順序付けられたコアシェル配置上には配置されていないことを、脂肪族尾部の配置が示している（図１１ａ～ｃ）。自己集合平衡化ファイバーのダイナミズム分析は、異方性分析によって得られた結果を裏付ける、Ａ２Ｇ２の有意な増大を示した（図２Ｃ、図１１ｄ～ｆ）。さらに、ＤＰＨ包埋Ａ２Ｇ２について観察された蛍光強度は、Ｖ２Ａ２およびＶＥＶＡ２のものと比較して、有意に低かった（図２Ｄ）。ＣＧ－ＭＤシミュレーションにおけるＰＡ水マッピングもまた、Ａ２Ｇ２の脂肪族尾部との水の接触が高いことを示した（図２Ｅ）。この挙動は、おそらく、コアシェルの秩序だった配列の喪失に起因し、Ａ２Ｇ２ナノファイバーの内部疎水性コアがＶ２Ａ２およびＶＥＶＡ２と比較してはるかに水和していることを示す。これらの結果は全て、集合体内のＰＡ分子の動力学、それらの水和度および分子間秩序が密接に関係していることを示唆している。
【0180】
スクランブル配列ＶＫＩＶＡを含有するＶ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、およびＶＥＶＡ２もまた、固相ペプチド合成によって合成され、液体クロマトグラフィー－質量分析によって特徴付けられた（図１３）。シミュレーションは、Ｃｒｙｏ－ＴＥＭによって裏付けられるように（図１５）、Ｖ２Ａ２およびＶＥＶＡ２に結合したスクランブル配列ＶＫＩＶＡがファイバーを形成することができることを示した（図１４）。しかしながら、ＶＫＩＶＡに結合したＡ２Ｇ２は、含水量が高く、秩序が低かった。これは、Ｃｒｙｏ－ＴＥＭによるファイバー形成の実験的欠陥に関連する可能性がある。ＰＡ分子骨格配列もまた、ファイバーを形成することができない（図１６および１７）。これは、ＩＫＶＡＶ配列がファイバー形成において重要な役割を果たすことを示唆した。最後に、他のラミニン模倣配列（ＬＧＴＩＰＧ、ＬＲＧＤＮ、ＰＤＧＳＲ、ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲ）は、Ａ２Ｇ２βシート配列を有するファイバー形成を駆動することができなかった。脂肪族コア中の含水量は、この傾向の良好な定量的尺度であった（図１８）。
【0181】
超分子集合体内の分子動力学が細胞の挙動に及ぼす影響を試験するために、次に、３つのＰＡマトリックス上でヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来ニューロンの使用を検討し、各ＰＡが機能的ヒト運動ニューロンを生成できる効率を決定した。ｉＰＳＣは、体内の任意の単細胞型に分化する能力に起因して、疾患モデリングおよび複雑な組織再生のための強力なツールである。ｈｉＰＳＣ由来ニューロン細胞を利用するインビトロモデルの開発は、疾患のメカニズムおよび治療の戦略に対して新たな知見を提供することが証明されている。それにもかかわらず、これらのモデルは、依然として、非効率的な成熟、異常な凝集および低い長期生存率などの、重大な技術的制限を示し、生理学的状態によりよく類似するように改善される必要がある。フィーダーフリー培養系上でｈｉＰＳＣ由来ニューロンを培養および成熟させるための現在の戦略は、ＥＣＭにおいて同定された、ラミニンまたはフィブロネクチンなどの組み換えタンパク質にから構成される静的２次元（２Ｄ）マトリックスに依存する。プラスチックペトリ皿などの古典的なシステムは単純性および利便性を提供するが、これらの材料がインビボ環境の重要な態様を模倣することができないことにより、しばしば非生理学的応答をもたらすことが、現在では広く認識されている。ｈｉＰＳＣ由来運動ニューロン（ＭＮ）を異なる動的特徴を有する一連の超分子スキャフォールドに供することは、分子間凝集力の強さがＭＮ成熟に及ぼす影響を研究し明らかにするための魅力的なモデルを提供し、ＥＣＭ－細胞相互作用への知見を提供する可能性がある。
【0182】
ＭＮは、小分子カクテルを利用することによって、ｈｉＰＳＣから分化された。小分子カクテルは、最初にニューロン誘導を刺激し、次いで腹側／尾側パターン化を促進する。分化プロトコル１４日目、有糸分裂後ニューロンの生成ピーク（８０～９０％のニューロン効率）を表し、ｈｉＰＳＣ由来ＭＮを、異なるＩＫＶＡＶ超分子スキャフォールド上で培養した（図１９ａ、ｂ）。別のコーティング上でのｉＰＳＣ由来ＭＮ培養物の応答を、プレーティング７２時間後の培養物の細胞組成を特徴付けることによって、評価した。Ａ２Ｇ２上で培養したニューロンは、従来のパターン化されていないＰＤＬ／ラミニンコートカバースリップ条件（ラミニン、８１％）と比較して、より高いパーセンテージのβ－ＩＩＩチューブリン（ＴＵＪ－１＋）ニューロン（９２％）を示した（図１９ｃ）。Ｉｓｌｅｔ１／２（ＩＳＬ１／２＋）およびコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）＋ＭＮ（図１９ｄ－ｇ）に対する免疫細胞化学（ＩＣＣ）によっても、ＭＮ生成の効率を評価した。Ｖ２Ａ２（５１％、６０％）、ＶＥＶＡ２（４１％、５７％）、およびラミニン（５２％、６２％）と比較して、Ａ２Ｇ２（６１％、７１％）上で成長したニューロンにおいて、より高いパーセンテージのＩＳＬ１／２＋およびＣｈＡＴ＋マーカーが見られた（図１９ｆ、ｇ）。しかし、ラミニン条件での細胞数は、３つのＩＫＶＡＶ ＰＡでのものよりも、有意に多い（図１９ｈ）。より多いニューロン数および減少した総細胞数は、本分化プロトコル（Ｚｉｌｌｅｒら、２０１８年）によって産生された別の脊髄細胞系統への前駆細胞の異なる細胞付着、細胞生存および／または最終分化によって、駆動される可能性がある。１７日目の細胞生存率は種々の条件間で有意な差を示さなかったが（図１９ｉ）、ラミニンコーティング中での培養物は、ＩＫＶＡＶ ＰＡマトリックスと比較して、より高いパーセンテージのＦＯＸＡ２＋底板細胞（２５％）を示した（図２０）。注目すべきことに、ＦＯＸＡ＋細胞のパーセンテージは、異なる条件におけるＴＵＪ１＋ニューロンのパーセンテージに相補的であった。特に、ラミニンとＡ２Ｇ２との間で、これらの差異はより大きく、ＰＡマトリックスの存在下でＦＯＸＡ＋細胞の劇的な減少が観測された。予想された通り、増殖マーカーＫｉ６７はＦＯＸＡ２＋細胞においてのみ観察された。これは、培養物中に存在する増殖性細胞のみが底板細胞であることを示す（図２０）。ＩＫＶＡＶ材料、および特にＡ２Ｇ２が、非ニューロン細胞の付着および／または増殖を減少させることによって、ｉＰＳＣ由来培養物におけるニューロン純度を改善させることを、これらの結果は示す。
【0183】
ＩＫＶＡＶは膜貫通型受容体β１－インテグリンに結合することがよく知られているので、次に、３つのＰＡナノファイバー上に示されるＩＫＶＡＶペプチドの影響を調査した。調査は、β１インテグリンの回復、および、その結果として起きる、「アウトサイドイン」シグナル伝達として知られる過程として、ｈｉＰＳＣ由来ＭＮに対する細胞内シグナル伝達を分析することによるものであった。試験した３つのＰＡが同じＩＫＶＡＶエピトープを有していたとしても、Ｖ２Ａ２、ＶＥＶＡ２およびラミニンと比較して、Ａ２Ｇ２は有意に高いレベルのβ１－インテグリン（ＩＴＧＢ１）、ならびに下流エフェクターであるインテグリン連結キナーゼ（ＩＬＫ）およびリン酸化接着斑キナーゼ（ｐ－ＦＡＫ）を誘導した（図２Ｆ～Ｉ、および図２１）。ＦＡＫおよびＩＬＫは、シグナル伝達インテグレーターとして作用することにより、ＥＣＭ刺激に応答して多くの細胞内経路に交差する、重要なシグナル伝達スキャフォールドタンパク質である。したがって、高度に動的なＡ２Ｇ２ ＰＡによって示されるエピトープＩＫＶＡＶは、Ｖ２Ａ２およびＶＥＶＡ２と比較して、受容体へのアクセシビリティが優れている。ＩＫＶＡＶ－インテグリンの活性化によってのみ細胞の結合および拡散が媒介されるかどうかを判定するために、ラミニン相互作用β－インテグリン（β１、β４）をブロックする抗体を用いた（図２２）。β１－インテグリン抗体下では、３つのＩＫＶＡＶマトリックス上に細胞の付着はなく、これは、ＩＫＶＡＶ表面によって誘導される生理活性がインテグリン係合に依存することを示す（図２２ｃ、ｅ）。しかし、β４－インテグリン抗体の存在下では、ＭＮは全ての実験条件で同様の付着を示した（図２２ｄ、ｆ）。これらの結果は、特にＩＫＶＡＶマトリックス上での、ＭＮの細胞結合および拡散がＩＴＧＢ１によって媒介されることを示唆した。ＰＡマトリックスの厚さを変更することによって、細胞シグナル活性化に対する機械的特性の効果を評価した（図２３ａ）。生物学的実験で使用された３つのＩＫＶＡＶ ＰＡおよびラミニンコーティングは、プロフィロメトリー分析によると２００ｎｍの厚さを示した（図２４）。しかしながら、Ａ２Ｇ２ファイバーは０．２ＭＰａの弾性率を示した一方、Ｖ２Ａ２およびＶＥＶＡ２はそれぞれ１３および２０ＭＰａのより高い弾性率を示した（図２３および２５）。３つのＩＫＶＡＶ ＰＡの厚さが増加すると、機械的特性が大幅に低下し、Ｖ２Ａ２（１ＫＰａ、１ＫＰａ）、ＶＥＶＡ２（４ＫＰａ、１ＫＰａ）と比較して、Ａ２Ｇ２についてはより高い弾性率および貯蔵弾性率（８ＫＰａ、５ＫＰａ）を示す（図２３、２０、２１）。これらのヒドロゲルは厚さに依存した様々な剛性を有するが、薄いゲルまたは厚いゲル上で培養した細胞では、差次的な細胞－受容体の活性化およびシグナル伝達は観察されなかった（図２３ｃ～ｆ）。これらの結果は、材料の異なる機械的特性が、Ａ２Ｇ２の動的分子運動に影響せず、受容体へのＩＫＶＡＶリガンドの同じアクセシビリティを可能にすることを示唆する。
【0184】
インビトロにおいてｈｉＰＳＣ由来ニューロン細胞の機能的成熟を達成することは、依然として、当技術分野における課題のままであるため、ヒトＭＮの時間発展を評価した（図３Ａ、図２７および２３）。インビトロで３０～６０日間培養したＭＮは、他の条件と比較して、ＩＴＧＢ１、ＩＬＫおよび運動ニューロンマーカーＣｈＡＴのより高い発現を維持した（図３Ｂ、Ｃ、図２７～３０）。次に、ｈｉＰＳＣ由来ニューロンをフィーダー層なしで長期間培養するというニューロン疾患細胞モデリングにおいて一般的に観察される成熟レベルの低下および細胞凝集の問題を、ＩＫＶＡＶ ＰＡによって誘発される差次的細胞シグナル伝達が改善できるかどうかを検証した。リガンド結合に際して、生存、接着、分化、成熟、ニューロン形態形成（Ｃｏｌｏｇｎａｔｏ ＆ Ｔｚｖｅｔａｎｏｖａ、２０１１；Ｇａｒｄｉｎｅｒ、２０１１；Ｋａｚａｎｉｓ ＆ ｆｒｅｎｃｈ－Ｃｏｎｓｔａｎｔ、２０１１；Ｍｙｅｒｓ、Ｓａｎｔｉａｇｏ Ｍｅｄｉｎａ ＆ Ｇｏｍｅｚ、２０１１、において総説）、およびシナプス可塑性（Ｐａｒｋ ＆ Ｇｏｄａ、２０１６、において総説）を含む種々のニューロンのプロセスにおいて、インテグリンは役割を果たすことが知られている（図３Ｄ）。この問題は、高スループットでバイアスのない方法を利用することによって解決され、Ａ２Ｇ２およびラミニンコーティングで２か月間培養したＭＮで発生したプロテオミクスの変化を調査することができた。タンデム質量タグ標識サンプルの定量的質量分析は、少なくとも９９％の信頼度で８９２のタンパク質を同定した。同定されたタンパク質の３０．３％における正規化された強度差が、Ａ２Ｇ２コーティング上で培養したＭＮとラミニンコーティング上で培養したＭＮとの間で観察された（図３Ｅ）。下方制御された（１９６）および上方制御された（７６）タンパク質の細胞関連性の状況を把握するため、遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析を行った。ラミニン－ＩＴＧＢ１シグナル伝達カスケードにおける前述の変化と一致して、Ａ２Ｇ２培養物において差次的に発現されたタンパク質に関連する最も有意なＧＯタームは、インテグリン経路であることが観察された。さらに、得られたデータセットにおいて、ＩＴＧＢ１シグナル伝達によって促進される細胞機能（細胞生存、増殖、細胞基質伝達など）もまた高められた（図３Ｆ、図３１）。これらのプロテオミクスの知見を検証するために、全てのプラットフォーム上で細胞の挙動の網羅的解析を行った。細胞生存率およびＣｈＡＴ陽性細胞を各種条件で分析した（図３Ｇ、Ｈ）。ＩＫＶＡＶマトリックス上で培養した細胞は、ラミニンコーティングと比較して、特にＡ２Ｇ２上で、より高い生存率および成熟を示した。ラミニン、ならびに、Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２およびＶＥＶＡ２を含むＩＫＶＡＶマトリックス上で培養したＭＮの形態学的特性（図３Ｉ～Ｌ、図２７）も分析した。Ｖ２Ａ２およびＡ２Ｇ２上のＭＮは、ラミニンコーティング上で培養したＭＮと比較して、より大きい体細胞サイズを示した。Ａ２Ｇ２上で培養したＭＮは、突起の数が有意に増加し、ニューロン分岐の複雑さも増加した（図３Ｉ～Ｌ、図３２）。ｈｉＰＳＣ由来ニューロン細胞を培養するための現在の方法は、ニューロンのクラスター化をもたらし、これは、個々のニューロンの分析を不可能にし、細胞死、細胞－細胞および細胞－基質相互作用を誘導することが示されているので、同様に、ＩＫＶＡＶマトリックスおよびラミニンコーティング（図３Ｍ、Ｎ）上でのインビトロの３０～６０日後の細胞生存率を調査した。共焦点画像の細胞分布分析は、ＩＫＶＡＶマトリックス上、特にＡ２Ｇ２において培養したＭＮが、長期にわたってプラットフォームに沿って高度に均質な分布およびネットワークコネクションを示すことを示した。ラミニンコーティング上で成長したＭＮは、不均一なニューロン成長を示し、プラットフォーム全体に沿って細胞クラスターを形成した。これらの結果と相関して、ラミニンコーティング上で培養したＭＮは、３つのＩＫＶＡＶマトリックス上で培養した細胞と比較して、細胞死において非常に有意な増加を示したことが見出された（図３Ｇ）。
【0185】
インビトロで６０日後の超分子ＰＡとのＭＮの相互作用を裏付けるために、プロフィロメトリーによって、ＩＫＶＡＶおよびラミニンコーティングの存在を分析した。短い（７２時間）および長い（６０日）時点でプラットフォームを分析すると、３つの超分子ペプチド両親媒性物質コーティングは、７２時間～６０日の間に厚さの減少をほとんど示さなかったが、ラミニンコーティングはインビトロで６０日後、有意に低下した（図２４）。構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ）およびＳＥＭ顕微鏡写真によって、細胞の存在下でのコーティングの存在が裏付けられた（図３３）。プロテオミクス解析による観察と一致して、これらのデータは全て、Ａ２Ｇ２とラミニンコーティングとの間の、ＭＮ成熟における定性的および定量的差異を示す。分子動力学超分子ナノ構造によるＩＫＶＡＶペプチド提示が細胞の挙動に対して重要な役割を果たすことを確認するために、ＩＫＶＡＶペプチドを固体表面上に固定化して、Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２およびＶＥＶＡ２を含有するＩＫＶＡＶ ＰＡマトリックスに対する種々の分子動力学を調べた（図３４、３５）。この目的のために、３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）処理したガラスカバースリップをＩＫＶＡＶペプチドで官能化した。固定化ＩＫＶＡＶペプチドでコーティングされた表面上では、ＭＮの付着が劇的に減少し、さらなる分析が不可能であった（図３５）。Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２およびＶＥＶＡ２を含有するスクランブルＶＫＩＶＡ ＰＡ（図３６）も試験した。３つのスクランブル配列のコーティング上で培養したＭＮは、７２時間でわずかに生存した。最後に、他の種類の運動ニューロン（ＭＮ－１１Ａ）および皮質ニューロン（Ｃｘ－１８Ａ）を、ＩＫＶＡＶ配列を示すＶ２Ａ２、Ａ２Ｇ２およびＶＥＶＡ２について試験し、細胞を付着させ、生存させ、増殖させ、ＩＴＧＢ１経路を上記と同様の方法で活性化させた（図３７および３８）。
【0186】
神経疾患の幹細胞ベースモデルの主な障害の１つは、生理学的状態を正確に反映できるｈｉＰＳＣ由来ニューロンにおいて機能的成熟を促進することが困難なことである。Ａ２Ｇ２超分子集合体内の分子動力学がｈｉＰＳＣ由来ＭＮにおける機能的成熟を誘導することを実証するために、インビトロで４０～６０日後のシナプス小胞の発現および電気生理学的特性を分析することによって、電気生理学的状態をモニターした。Ａ２Ｇ２上で培養したＭＮは、シナプス後マーカーＰＳＤ９５、ならびにシナプス前マーカーＳＹＮ－１およびＳＹＰ－１をより高いレベルで発現し、シナプスネットワークの増加を示唆した（図４Ａ～Ｅ）。Ｖ２Ａ２およびＶＥＶＡ２上の細胞は、ラミニンと比較して、同様のシナプスマーカーの発現を示した（図３９）。次に、異なるプラットフォーム上で培養したＭＮの細胞ネットワーク活性を、マルチ電極アレイ（ＭＥＡ）アプローチを用いて、評価した（図４Ｆ～Ｉ）。上述の凝集の減少と一致して、Ａ２Ｇ２上で培養したＭＮは、Ｖ２Ａ２、ＶＥＶＡ２およびラミニン培養物と比較して、活動電極の数の増加を示した。さらに、Ａ２Ｇ２中で成長したＭＮは、Ｖ２Ａ２、ＶＥＶＡ２およびラミニンコーティングと比較して、より高い自発的で同期した活動を示した。また、Ａ２Ｇ２上のＭＮは、ＶＥＶＡ２およびラミニン上のものよりも、ネットワークバースト当たりのスパイクが有意に多い、より長いネットワークバーストを発火することができた（図４Ｆ～Ｉ、図４０）。ｈｉＰＳＣに由来するヒトニューロンの形態学的および機能的成熟の両方を促進するために広く用いられているアプローチは、ニューロンをアストロサイトと共培養することである。一般的に使用される基質ラミニンと比較して、アストロサイトは、ニューロン樹状突起の複雑性、イオンチャネルおよび神経伝達物質受容体の発現、ならびにシナプス事象の頻度および振幅を有意に増強した。アストロサイト単層上で培養したＭＮは、Ａ２Ｇ２材料よりも高い興奮性を示した。これらの結果は、アストロサイトと共培養したニューロンと同等のレベルで、Ａ２Ｇ２超分子マトリックスがニューロンネットワーク活動を増強することを実証する。Ａ２Ｇ２上のＭＮＳの電気生理学的成熟度をさらに調査するために、Ａ２Ｇ２および市販のラミニン中で成長したＭＮ上で、全細胞パッチクランプ記録を行った。ＭＮの電気生理学的発達は、繰り返し発火させる能力、およびより大きな振幅のスパイクの発生によって、特徴付けられる（Ｃａｒｒａｓｃａｌら、２００５；Ｔａｄｒｏｓら、２０１５）。ニューロンの発達が進行するにつれて、より多くの電圧感応性イオンチャネルが細胞膜へ挿入され、より速くより大きな活動電位を生じる。５０日目に、Ａ２Ｇ２上で成長したＭＮは、より成熟したＭＮの特性を示した：より多くのＭＮが繰り返し発火させることができ（図４Ｊ、Ｋ、表２）、それらの活動電位は、図４Ｌに示すように、振幅がより大きく、上昇および降下速度がより速かった。アストロサイト上で成長したヒトＭＮの電気生理学的発達のマーカーは、Ａ２Ｇ２マトリックス上で成長したヒトＭＮの発達に匹敵する。アストロサイト上で成長したヒト胚性幹細胞由来ＭＮ（Ｐ４８～５０にて、先の研究のために記録された）は、この研究のためにＡ２Ｇ２マトリックス上で成長させたヒトｉＰＳＣ由来ＭＮと同様の特性（Ｉ－ｏｎ、電圧閾値、活動電位の振幅、ならびに上昇および降下速度の同様の値を含む）を有した。要約すると、ＭＥＡおよびパッチクランプデータの両方は、より高いスパイクおよびバースト活性で、繰り返しの発火／より高い発火速度を行う能力において、Ａ２Ｇ２マトリックス上で成長したＭＮの成熟度を強調する。
【0187】
【表2】
【0188】
Ａ２Ｇ２ ＩＫＶＡＶ ＰＡシステムはＣＮＳにおけるＥＣＭのダイナミズムのいくつかの態様を模倣することができるため、このナノ構造は、マウスインビボモデルにおける脊髄損傷（ＳＣＩ）を治療するためのスキャフォールドとして使用された。ＥＣＭは、ＣＮＳへの疾患または損傷の発生中およびその後に重要な役割を果たすことがよく知られている。ＥＣＭ成分の動的な時間的および空間的分布は、強力な治療アプローチを表す。しかし、脊髄損傷再生において、ＥＣＭの動的分布のための機能的役割は、解明されないままであった。分子動力学がどのように脊髄再生に影響するかをよりよく理解するために、Ｖ２Ａ２およびＡ２Ｇ２ ＩＫＶＡＶ ＰＡの影響を、脊髄損傷後に評価した。Ｔ１０／Ｔ１１セグメント上へのロボット的に制御された衝撃（７１±０．５ＫＤｙｎ）を用いて、マウス（図４Ｍ）において重篤な打撲傷をモデリングした（図４１ａ、ｂ）。この損傷は、マウスにおいて直ちに下肢麻痺を誘発した。損傷の２４時間後に、Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２を損傷部位に注入し、続いて、毎週、Ｂａｓｓｏ Ｍｏｕｓｅ Ｓｃａｌｅ（ＢＭＳ）を用いて移動の評価を行った。コントロールとして、生理食塩水溶液（コントロール）、および、それ自体で堅牢なナノリボンを形成する能力がよく知られているため、非生理活性骨格であるＶ２Ａ２Ｅ２ ＰＡを使用した。損傷直後は、ＰＡ処理群と生理食塩水コントロール群との間に検出可能な差はなかった。損傷の２週間後およびその後、Ａ２Ｇ２群は、コントロールおよびＶ２Ａ２と比較して、有意で持続的な挙動の改善を示した。特に、損傷の１２週間後、Ａ２Ｇ２処理群は、平均ＢＭＳスコア５．８±１．６を示し、Ｖ２Ａ２（３．８±０．７）よりも大幅に高かった（図４Ｎ）。コントロール群および非生理活性骨格ＰＡは、それぞれ平均スコア１．９±０．３および２．１±０．８を維持した（図４Ｎおよび図４１ｃ）。１２週間後の損傷した脊髄のウエスタンブロット解析では、ＩＫＶＡＶが示された条件、とりわけＡ２Ｇ２において、β－１インテグリン（ＩＴＧＢ１）の増加が示され、上記で示したインビトロの結果と一致した（図４Ｏ、Ｐ）。さらに、ウエスタンブロットは、線維性ＥＣＭタンパク質フィブロネクチンの減少、ならびに、Ｖ２Ａ２におけるＧＦＡＰの過剰発現によって特徴付けられる反応性グリオーシスの量の減少を示し、Ａ２Ｇ２についてより明らかであった。興味深いことに、ＥＣＭラミニンタンパク質は、Ａ２Ｇ２条件においてより高度に発現され、これは、損傷領域におけるより多量の基底膜を示唆している。さらなる組織学的実験は、その挙動を担う細胞集団を示すであろう。最後に、ニューロン再生および成長に関連するマーカーであるＧＡＰ４３は、高度に動的なＡ２Ｇ２ ＰＡにおいて高度に発現された（図４Ｏ、Ｐ）。
【0189】
前述の詳細な説明および添付の実施例は、単に例示的なものであり、本開示の範囲に対する限定として解釈されるべきではないことが理解される。本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物によってのみ規定される。
【0190】
開示された実施形態に対する様々な変更および修正が、当業者には明らかであろう。そのような変更および修正（本開示の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、製剤、または使用方法に関するものを含むがこれらに限定されない）は、その精神および範囲から逸脱することなく、なされ得る。
【0191】
本明細書で参照される任意の特許および刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【0192】
【図1】図１Ａ～Ｌ。ペプチド両親媒性物質（ＰＡ）によって形成された超分子ナノファイバーの特徴付け。（Ａ）ＩＫＶＡＶ ＰＡの概略の分子構造、ＩＫＶＡＶ ＰＡは、（Ｂ）Ｖ２Ａ２、（Ｃ）Ａ２Ｇ２、および（Ｄ）ＶＥＶＡ２を含んでいる。（Ｅ～Ｇ）ＫＣｌおよびＮａＣｌ水溶液の中の（Ｅ）Ｖ２Ａ２、（Ｆ）Ａ２Ｇ２、および（Ｇ）ＶＥＶＡ２の極低温ＴＥＭ顕微鏡写真（［ＰＡ］＝０．０１ｗｔ％、［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）。（Ｈ～Ｊ）（Ｈ）Ｖ２Ａ２、（Ｉ）Ａ２Ｇ２、および（Ｊ）ＶＥＶＡ２のＳＥＭ顕微鏡写真。（Ｋ）Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、およびＶＥＶＡ２（オレンジ色）のフィルムサンプルのＦＴ－ＩＲスペクトル（１５００～１８００ｃｍ－１）。（Ｌ）ＫＣｌおよびＮａＣｌ水溶液中のＶ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、およびＶＥＶＡ２（オレンジ色）のＷＡＸＳプロファイル（［ＰＡ］＝５．３ｍＭ、［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）。
【図2】図２Ａ～Ｉ。超分子ＩＫＶＡＶ ＰＡ内の動力学は、ヒト運動ニューロン（ＭＮ）信号に対して異なる効果を誘導する。（Ａ）ＫＣｌおよびＮａＣｌ水溶液中のＶ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、およびＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡに包埋されたＤＰＨ（２．８μＭ）の２５℃での蛍光脱分極プロファイル（λｅｘ＝３３６ｎｍ、λｅｍ＝４５０ｎｍ）（［ＰＡ］＝１００μＭ、［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）。（Ｂ）１０μ秒後のＶ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、およびＶＥＶＡ２（オレンジ色）ＰＡを含んでいる、単一ＩＫＶＡＶ ＰＡファイバーの自己集合構造および粗視化表示。顕微鏡写真は、（青色で）シミュレーションボックス内にファイバー形成軸を通る部分的な周期的画像を含んでいる。水およびイオンは、明確にするために省略されている。（Ｃ）Ｂにおいて形成された、Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、およびＶＥＶＡ２（オレンジ色）構造を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡの動力学解析。（Ｄ）ＫＣｌおよびＮａＣｌ水溶液中のＶ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡに包埋されたＤＰＨ（２．８μＭ）の２５℃での蛍光発光スペクトル（λｅｘ＝３３６ｎｍ）（［ＰＡ］＝１００μＭ、［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）。（Ｅ）Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡの含水量分析。（Ｆ）Ａ２Ｇ２およびラミニン上で培養した、ｂ－１インテグリン（ピンク、ＩＴＧＢ１）を含んでいるＭＮ神経突起（ＴＵＪ－１、緑色）の代表的な三次元ＳＩＭ顕微鏡写真（左側）および陰影再構成（右側）。（Ｇ）７２時間でのＡ２Ｇ２（青色）およびラミニン（黒色）マトリックス上で培養したＭＮにおけるＩＴＧＢ１の強度解析。７２時間での、Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいる超分子ＩＫＶＡＶマトリックス上で培養したＭＮにおけるＩＴＧＢ１および下流キナーゼ（ＩＬＫ、ｐＦＡＫ、ＦＡＫ）のウエスタンブロット解析（Ｈ）および（Ｉ）正規化されたタンパク質レベル。スケールバー：１０ｍｍ。データは、少なくとも４つの独立した分化の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図3】図３Ａ～Ｏ。ヒト運動ニューロン（ＭＮ）成熟に対するＡ２Ｇ２含有ＩＫＶＡＶ ＰＡの分子間凝集力の影響。（Ａ）超分子マトリックス上でのヒトＭＮ分化およびその培養の概略図。Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいる超分子ＩＫＶＡＶマトリックスおよびラミニン（黒色）上で培養したＭＮにおけるインテグリン活性化（ＩＴＧＢ１）、シグナル伝達経路（ＩＬＫ）および運動ニューロン成熟（ＣｈＡＴ）に関連する（Ｂ）ウエスタンブロットおよび（Ｃ）正規化されたタンパク質発現レベル（６０日後）。全ての値はアクチンに対して正規化した。（Ｄ）Ａ２Ｇ２含有ＩＫＶＡＶの動的提示に際して細胞挙動を媒介するインテグリンおよびシグナル伝達経路の概略図。全ての値はアクチンまたは総ＦＡＫ発現に対して正規化した。（Ｅ）Ａ２Ｇ２対ラミニン上で培養したＭＮのプロテオミクス変化を呈しているボルカノプロット。平均ｌｏｇ２（倍 変化）対Ｐ値（－ｌｏｇ１０）を示す。２倍変化およびＦＤＲ＜０．０５によって上方制御および下方制御されたタンパク質を、それぞれ緑色および赤色のドットによって標識する。（Ｆ）Ａ２Ｇ２コーティング対ラミニンコーティング中で培養したＭＮにおいて同定されたタンパク質の上方制御グループおよび下方制御グループにおいて濃縮された最も有意なＧＯタームのサブセット。（Ｇ）細胞培地中に放出されたＬＤＨ濃度によって評価した細胞生存率（６０日目）。（Ｈ）Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡおよびラミニン（黒色）マトリックス上で培養したＭＮ中のＣｈＡＴ＋細胞の定量（６０日後）。（Ｉ，Ｊ）（Ｉ）Ａ２Ｇ２および（Ｊ）ラミニンマトリックス上で培養したヒトのＭＮの共焦点顕微鏡画像。（Ｋ）Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡおよびラミニン（黒色）マトリックス上で培養したヒトＭＮの総神経突起プロセスの分析（６０日後）。（Ｌ）Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）およびラミニン（灰色）上で、インビトロで６０日間培養したＭＮの樹状突起分岐のＳｈｏｌｌ分析。（Ｍ）Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡおよびラミニン（白色）マトリックス上で培養したヒトＭＮの代表的な代表的な共焦点顕微鏡写真（６０日後）。細胞を、運動ニューロンマーカーＣｈＡＴ（緑色）、微小管関連タンパク質－２（ＭＡＰ－２、赤色）および核（ＤＡＰＩ）で染色した。（Ｎ）Ｍに示される画像のＤＡＰＩチャネル顕微鏡写真。（Ｏ）ＭおよびＮにおいて参照された異なるマトリックス上の細胞分布のヒストグラム分析。スケールバー：（Ｍ、Ｎ）１００μｍ。データは、少なくとも３つの独立した分化の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図4】図４Ａ～Ｐ。機能的成熟および再生に対する超分子集合体内の分子動力学の影響。（Ａ、Ｂ）（Ａ）Ａ２Ｇ２および（Ｂ）ラミニンマトリックス上で培養したヒトＭＮ神経突起に沿って分布したシナプス小胞（シナプス後ＰＳ９５およびシナプス前ＳＹＮ－１）の代表的な共焦点顕微鏡写真（５０日目）。（Ｃ）Ａ２Ｇ２およびラミニンコーティング上で培養したＭＮ上のＰＳＤ９５およびＳＹＮ－１の強度解析。Ａ２Ｇ２（青色）およびラミニン（黒色）上で培養したヒトＭＮにおけるシナプス前マーカーおよびシナプス後マーカー（それぞれＳＹＮ－１およびＰＳ９５）の（Ｄ）ウエスタンブロットおよび（Ｅ）正規化されたタンパク質レベル。全ての値はアクチンに対して正規化した。（Ｆ）Ａ２Ｇ２超分子ペプチド両親媒性物質でコーティングしたＭＥＡプレート上で４０日間培養したヒトＭＮの明視野画像。種々のＩＫＶＡＶ ＰＡ、ラミニンまたはグリアコーティング中のＭＮ培養物における、（Ｇ）スパイク数の差および（Ｈ）電極当たりのバースト数および（Ｉ）同調性指数を表すプロット。（Ｊ）Ａ２Ｇ２およびラミニンマトリックス上で培養し、パッチ電極を通してＴｅｘａｓ Ｒｅｄデキストランで満たした、ヒトＭＮの２光子顕微鏡画像（４８～４９日目）。（Ｋ）活動電位を繰り返し発火することができる、Ａ２Ｇ２およびラミニンマトリックス上で成長したニューロンのパーセンテージ。（Ｌ）Ａ２Ｇ２およびラミニンマトリックス上で成長したＭＮ由来の活動電位の代表的な例。Ａ２Ｇ２上で成長したＭＮは有意に大きく、上昇速度および降下速度がより速かった。（Ｍ）マウス脊髄における背腹性の挫傷の概略図。（Ｎ）生理食塩水溶液（コントロール）、Ｖ２Ａ２（赤色）Ａ２Ｇ２（青色）で処理した動物のＢａｓｓｏ Ｍｏｕｓｅ Ｓｃａｌｅ（ＢＭＳ）スコア。生理食塩水溶液（コントロール）、Ｖ２Ａ２（赤色）およびＡ２Ｇ２（青色）で処理した脊髄におけるβ－１インテグリン受容体（ＩＴＧＢ１）、種々のＥＣＭタンパク質（フィブロネクチンおよびラミニン）、アストログリアＧＦＡＰおよびニューロンＧＡＰ４３マーカーの（Ｏ）ウエスタンブロットおよび（Ｐ）正規化されたタンパク質レベル。全ての値は、ＧＡＰＤＨに対して正規化した。インビボデータは、少なくとも８匹の動物の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図5】図５Ａ～Ｆ。（ａ）Ｖ２Ａ２、（ｂ）Ａ２Ｇ２、（ｃ）ＶＥＶＡ２および（ｄ）ＶＥ（－）ＶＡ２のためのＭＡＲＴＩＮＩビーズタイプおよび電荷。（ｅ）ＰＡの電荷量。（ｆ）Ｖ２Ａ２（挿入物）の各骨格ビーズのための生の半径方向分布関数であり、第１の溶媒和球のための水接触を与えるために統合された領域を青色で示している。
【図6】図６Ａ～Ｆ。ＩＫＶＡＶ ＰＡの液体クロマトグラフィー－質量分析。（ａ－ｃ）精製された（ａ）Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶ、（ｂ）Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶ（ｃ）Ｃ１６ＶＥＶＡ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶの分析用高性能液体クロマトグラフィー（分析用ＨＰＬＣ）トレース。（ｄ～ｆ）（ｄ）Ｃ１６－Ｖ２Ａ２Ｅ４－ＧＩＫＶＡＶ、（ｅ）Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶおよび（ｆ）Ｃ１６ＶＥＶＡ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）。
【図7】図７Ａ～Ｉ。ＩＫＶＡＶ ＰＡの極低温－ＴＥＭおよびＳＥＭ画像。（ａ～ｃ）概略的な分子構造、（ａ、ｄ、ｇ）Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶ、（ｂ、ｅ、ｈ）Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶ（ｃ、ｆ、ｉ）Ｃ１６ＶＥＶＡ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶの、（ｄ～ｆ）極低温－ＴＥＭおよび（ｇ～ｉ）ＳＥＭ顕微鏡写真。
【図8】図８Ａ～Ｄ。ＤＰＨ包埋ＩＫＶＡＶ ＰＡのＴＥＭ画像。（ａ）１，６－ジフェニル－１，３，５－ヘキサトリエン（ＤＰＨ）の概略の分子構造。（ｂ～ｄ）酢酸ウラニルで染色した、ＤＰＨ包埋ＰＡ（ｂ）Ｃ１６－Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶ、（ｃ）Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶおよび（ｄ）Ｃ１６ＶＥＶＡ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶのＴＥＭ顕微鏡写真（ＫＣｌおよびＮａＣｌ水溶液（［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）中、［ＰＡ］＝１００μＭ、［ＤＰＨ］＝２．８μＭ）。
【図9】図９Ａ～Ｆ。ＴＭＡ－ＤＰＨ包埋ＩＫＶＡＶ ＰＡのＴＥＭ画像。（ａ）１－（４－トリメチルアンモニウムフェニル）－６－フェニル－１，３，５－ヘキサトリエンｐ－トルエンスルホネート（ＴＭＡ－ＤＰＨ）の概略的な分子構造。（ｂ～ｄ）酢酸ウラニルで染色した、ＴＭＡ－ＤＰＨ包埋ＩＫＶＡＶ ＰＡ（ｂ）Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶ（Ｖ２Ａ２）、（ｃ）Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶ（Ａ２Ｇ２）および（ｄ）Ｃ１６ＶＥＶＡ２ＧＩＫＶＡＶ（ＶＥＶＡ２）のＴＥＭ顕微鏡写真（ＫＣｌおよびＮａＣｌ水溶液（［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）中、［ＰＡ］＝１００μＭ、［ＴＭＡ－ＤＰＨ］＝２．８μＭ）。（ｅ）ＫＣｌおよびＮａＣｌ水溶液中で、Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２およびＶＥＶＡ２に埋め込まれた、ＴＭＡ－ＤＰＨ（２．８μＭ）の２５℃での蛍光脱分極プロファイル（λｅｘ＝３３６ｎｍ、λｅｍ＝ ４５０ｎｍ）（［ＰＡ］＝１００μＭ、［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）。（ｆ）ＫＣｌおよびＮａＣｌ水溶液中で、Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２およびＶＥＶＡ２に埋め込まれた、ＴＭＡ－ＤＰＨ（２．８μＭ）の２５℃での蛍光発光スペクトル（λｅｘ＝３３６ｎｍ）（［ＰＡ］＝１００μＭ、［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）。
【図11】図１１Ａ～Ｆ。ＩＫＶＡＶ ＰＡナノファイバーのシミュレーション結果。（ａ～ｃ）１０μ秒後の、（ａ）Ｖ２Ａ２、（ｂ）Ａ２Ｇ２、および（ｃ）ＶＥＶＡ２ＩＫＶＡＶ ＰＡの単一ファイバーの自己集合構造および粗視化表示。ファイバーは、パッチコアを示すために、Ｃ１６尾部以外全て透明で表される。顕微鏡写真は、ファイバー形成軸を通る部分的な周期的画像を含んでいる。シミュレーションボックスは青色で表示される。水およびイオンは、明確にするために省略されている。（ｄ～ｆ）（ｄ）Ｖ２Ａ２、（ｅ）Ａ２Ｇ２および（ｆ）ＶＥＶＡ２の二乗平均平方偏差（ＲＭＳＤ）対時間を表すグラフ。ＲＭＳＤプロットは、５つの独立したシミュレーションの平均である。
【図12】図１２Ａ～Ｅ。βシート領域に置かれたＥに荷電したＶＥ（－）ＶＡ２ ＰＡのシミュレーション結果。（ａ、ｂ）１０μ秒後の、ＶＥ（－）ＶＡ２ファイバーの自己集合構造。（ａ）βシート領域はオレンジ色で表され、ＩＫＶＡＶは緑色で表され、ファイバーの残りは黒色で表される。（ｂ）ファイバーはパッチコアを示すために、Ｃ１６尾部以外全て透明で表される。顕微鏡写真は、ファイバー形成軸を通る部分的な周期的画像を含む。シミュレーションボックスは青色で表示される。水およびイオンは、明確にするために省略されている。（ｃ）Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２と比較したＶＥ（－）ＶＡ２の水接触グラフ。（ｄ）（ａ～ｂ）Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２と比較したＶＥ（－）ＶＡ２のダイナミズム解析の二乗平均平方偏差（ＲＭＳＤ）対時間を表すグラフ。ｃ～ｄにおける分析は、５つの独立したシミュレーションの結果である。
【図13】図１３Ａ～Ｆ。スクランブルＶＫＩＶＡ ＰＡの液体クロマトグラフィー－質量分析。（ａ～ｃ）精製した（ａ）Ｃ１６－Ｖ２Ａ２Ｅ４－ＧＶＫＩＶＡ、（ｂ）Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＶＫＩＶＡ（ｃ）Ｃ１６ＶＥＶＡ２Ｅ４ＧＶＫＩＶＡの分析用高性能液体クロマトグラフィー（分析用ＨＰＬＣ）トレース。（ｄ～ｆ）（ｄ）Ｃ１６－Ｖ２Ａ２Ｅ４－ＧＩＫＶＡＶ、（ｅ）Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＶＫＩＶＡおよび（ｆ）Ｃ１６ＶＥＶＡ２Ｅ４ＧＶＫＩＶＡのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）。
【図14】図１４Ａ～Ｈ。スクランブルＶＫＩＶＡ－ＰＡのシミュレーション結果。（ａ～ｆ）１０μ秒後の、（Ａ、ｂ）Ｖ２Ａ２（赤色）、（ｃ、ｄ）Ａ２Ｇ２（青色）、および（ｅ，ｆ）ＶＥＶＡ２（オレンジ色）ＶＫＩＶＡの単一ファイバーの自己集合構造および粗視化表示。カラーコードは、ＰＡ配列において表示される。顕微鏡写真は、ファイバー形成軸を通る部分的な周期的画像を含む。シミュレーションボックスは青色で表示される。水およびイオンは、明確にするために省略されている。（ｂ、ｄ、ｆ）ファイバーは、そのパッチ性を示すために、Ｃ１６尾部以外全て透明で表示される。Ａ２Ｇ２平衡化構造は、典型的なファイバー構造とは異なる。（ｇ）ＩＫＶＡＶおよびＶＫＩＶＡ－ＰＡの水接触グラフ。（ｈ）スクランブルＶＫＩＶＡおよびＩＫＶＡＶ ＰＡのＣ１６クラスター解析。Ｃ１６クラスターの数の定量は、不規則性の定性的測定として使用されてきた。
【図15】図１５Ａ～Ｆ。スクランブルＶＫＩＶＡ－ＰＡのＣｒｙｏ－ＴＥＭ顕微鏡写真。スクランブルＩＫＶＡＶ配列（ａ、ｄ）Ｃ１６－Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＶＫＩＶＡ、（ｂ、ｅ）Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＶＫＩＶＡ（ｃ、ｆ）Ｃ１６ＶＥＶＡ２Ｅ４ＧＶＫＩＶＡの（ａ～ｃ）概略的な分子構造および（ｄ～ｆ）Ｃｒｙｏ－ＴＥＭ顕微鏡写真。スケールバー：５００ｎｍ。
【図16】図１６Ａ～Ｆ。骨格ＰＡの液体クロマトグラフィー－質量分析。（ａ～ｃ）精製した、（ａ）Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４、（ｂ）Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４（ｃ）Ｃ１６ＶＥＶＡ２Ｅ４の分析用高性能液体クロマトグラフィー（分析用ＨＰＬＣ）トレース。（ｄ～ｆ）（ｄ）Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４、（ｅ）Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４および（ｆ）Ｃ１６ＶＥＶＡ２Ｅ４のエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）。
【図17】図１７Ａ～Ｆ。骨格－ＰＡのＣｒｙｏ－ＴＥＭ顕微鏡写真。骨格配列（ａ、ｄ）Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４、（ｂ、ｅ）Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４（ｃ、ｆ）Ｃ１６ＶＥＶＡ２Ｅ４の（ａ～ｃ）概略的な分子構造および（ｄ～ｆ）Ｃｒｙｏ－ＴＥＭ顕微鏡写真。
【図18】図１８Ａ～Ｋ。他のラミニン模倣配列の分析。（ａ、ｃ、ｅ、ｇ、ｉ）１０μ秒後の、生理活性エピトープ（ａ、ｂ）ＬＧＴＩＰＧ、（ｃ、ｄ）ＬＲＧＤＮ、（ｅ、ｆ）ＰＤＧＳＲ、（ｇ、ｈ）ＲＧＤ、（ｉ、ｊ）ＹＩＧＳＲ配列を有するＣ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４Ｇファイバーの極低温ＴＥＭ顕微鏡写真および（ｂ、ｄ、ｆ、ｈ、ｊ）自己集合構造顕微鏡写真。シミュレートされた顕微鏡写真は、ファイバー形成軸を通る部分的な周期的画像を含む。シミュレーションボックスは青色で表示される。水およびイオンは、明確にするために省略されている。（ｋ）ＬＧＴＩＰＧ、ＬＲＧＤＮ、ＰＤＧＳＲ、ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲ配列についての水接触分析。ＩＫＶＡＶを参照として使用した。
【図19】図１９Ａ～Ｉ。ＩＫＶＡＶ ＰＡマトリックス上のｈｉＰＳＣ由来ＭＮの短期分析（７２時間）。（ａ）実験パラダイムの概略図。（ｂ）７２時間後に、ａｌｅｘａ－４８８色素（緑色）に共有結合したＡ２Ｇ２ ＩＫＶＡＶ ＰＡ上のＴＵＪ－１（赤色）で標識したＭＮのスペクトル照明顕微鏡写真。（ｃ）７２時間での、種々の条件下での細胞数／ｍｍ２の定量。（ｄ、ｅ）Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡ超分子ファイバーおよびラミニン（白色）コーティング上で培養したＭＮの代表的な共焦点顕微鏡写真。（ｄ、ｅ）細胞を、ニューロン（ＴＵＪ－１およびＭＡＰ－２、赤色）および運動ニューロン（ＩＳＬ１／２およびＣｈＡＴ、緑色）マーカーで一貫して染色した。核ＤＮＡをＤＡＰＩ、青色で染色した。（ｆ～ｈ）７２時間での、Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡ超分子ファイバーおよびラミニン（黒色）コーティング上で培養した、（ｆ）ＩＳＬ１／２＋および（ｇ）ＣｈＡＴ＋（ｈ）ＴＵＪ－１＋ＭＮパーセンテージの定量化。（ｉ）細胞生存率は、７２時間で、ＬＤＨアッセイによって評価した。スケールバー：５０μｍ。データは、少なくとも４つの独立した分化の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）、ｎ．ｓ：有意ではない。
【図20】図２０Ａ～Ｉ。ＩＫＶＡＶ ＰＡマトリックス上のＦＯＸＡ２集団の短期分析。（ａ、ｂ）７２時間での、（ａ）Ａ２Ｇ２ ＩＫＶＡＶ ＰＡおよび（ｂ）ラミニンマトリックス上で培養したＭＮの代表的な共焦点顕微鏡写真。細胞を、底板細胞マーカーＦＯＸＡ－２（緑色）、ニューロンマーカーＴＵＪ－１（赤色）および核マーカーＤＡＰＩ（青色）で染色した。７２時間での、Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡ超分子ファイバーおよびラミニン（黒色）上で培養したＭＮ中の底板マーカーＦＯＸＡ－２および増殖マーカーＰＨ３に関連するタンパク質発現の（ｃ）ウエスタンブロットおよび（ｄ）正規化されたレベル。（ｅ、ｆ）７２時間での、（ｅ）Ａ２Ｇ２ ＩＫＶＡＶ ＰＡおよび（ｆ）ラミニンマトリックス上で培養したＭＮの代表的な共焦点顕微鏡写真。細胞を、底板マーカーＦＯＸＡ－２（緑色）、ニューロンマーカーＴＵＪ－１（白色）、増殖マーカーＫＩ６７（赤色）および核マーカーＤＡＰＩ（青色）で染色した。（ｇ～ｉ）７２時間での、Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡ超分子ファイバーおよびラミニン（黒色）マトリックス上で培養した、（ｇ）ＦＯＸＡ２＋、（ｈ）ＫＩ６７＋および（ｉ）ＦＯＸＡ２＋／ＫＩ６７＋ＭＮパーセンテージの定量。全ての値をアクチンに対して正規化した。スケールバー：２５μｍ。データは、少なくとも３つの独立した分化の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図21】図２１Ａ～Ｇ。ＩＫＶＡＶ ＰＡ上で培養したヒトＭＮにおけるＩＴＧＢ１発現。（ａ～ｄ）７２時間での、Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡ超分子ファイバーおよびラミニンコーティング上で培養したＭＮ（緑色でＴＵＪ－１で標識した）の神経突起におけるＩＴＧＢ１受容体の発現の代表的な三次元共焦点顕微鏡写真。（ｆ、ｇ）ｃおよびｄにおいて参照された共焦点画像条件の３次元陰影再構成（Three-dimensional shadow reconstructions）。（ｅ）７２時間での、Ｖ２Ａ２（赤色）とＶＥＶＡ２（オレンジ色）マトリックス上で培養したＭＮにおけるＩＴＧＢ１の強度解析。スケールバー：２μｍ。
【図22】図２２Ａ～Ｆ。ＩＫＶＡＶ ＰＡへの付着および生存ＭＮに対するαＩＴＧＢ１遮断抗体の影響。（ａ）７２時間のαβ－１またはβ－４ ＩＴＧ抗体の存在下での超分子マトリックス上でのｈｉＰＳＣ由来ＭＮ分化およびその後の培養の概略図。（ｂ）７２時間で細胞培地中に放出されたＬＤＨレベルによって評価した、ＩＴＧＢ１で処理したＭＮの細胞生存率。（ｃ、ｄ）７２時間での、Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡ超分子ファイバーおよびラミニン（黒色）マトリックス上で培養した、（ｃ）β－１インテグリンまたは（ｄ）β－４インテグリン遮断抗体で処理したＭＮの代表的な共焦点顕微鏡写真。細胞をニューロンマーカーＴＵＪ－１（赤色）、運動ニューロンマーカーＩＳＬ１／２（緑色）で染色し、核をＤＡＰＩ（青色）で染色した。（ｅ、ｆ）ｃおよびｄにおいてそれぞれ参照された状態の細胞数／ｍｍ２の定量化。スケールバー：５０μｍ。データは、３つの独立した分化の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）、ｎ．ｓ：有意ではない。
【図23】図２３Ａ～Ｆ。ラミニン関連シグナル伝達に対する機械的特性の影響。（ａ）ｈｉＰＳＣ由来ＭＮ分化および異なる超分子マトリックスの厚さに対するその培養の概略図。（ｂ）Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２およびＶＥＶＡ２を含んでいる超分子ＩＫＶＡＶマトリックスの薄いコーティングおよび厚いゲルの弾性率（灰色および白色のグラフ）および貯蔵弾性率（濃い灰色のグラフ）。７２時間での、Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２を含んでいる超分子ＩＫＶＡＶマトリックスの（ｃ、ｄ）厚いコーティングまたは（ｅ、ｆ）薄いコーティング上で培養したヒトＭＮにおけるＩＴＧＢ１受容体活性化およびシグナル伝達経路（ＩＬＫ、ｐ－ＦＡＫ、ＦＡＫ）の（ｃ、ｅ）ウエスタンブロット解析および（ｄ、ｆ）正規化された発現レベル。ラミニンのコーティングをコントロールとして使用した。データは、少なくとも３回の独立した実験または分化の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図24】図２４Ａ～Ｉ。ＩＫＶＡＶ ＰＡおよびラミニンコーティングのプロフィロメトリー。（ａ～ｈ）インビトロにおける３日後（上部画像）後および６０日後（底部画像）の、（ａ、ｂ）Ｖ２Ａ２、（ｃ、ｄ）Ａ２Ｇ２、（ｅ、ｆ）ＶＥＶＡ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡおよび（ｇ、ｈ）ラミニンコーティングの代表的な画像。（ｉ）ａ～ｈにおいて参照したＩＫＶＡＶ ＰＡおよびラミニンコーティングの厚さ分析。データは、４回の独立した実験の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊＊＊Ｐ＜０．００１）で示す。
【図25】図２５Ａ～Ｌ。薄いＩＫＶＡＶ ＰＡゲルおよび厚いＩＫＶＡＶ ＰＡゲルのＦＭ特徴付け。（Ａ～ｃ）Ｖ２Ａ２、（ｂ）Ａ２Ｇ２および（ｃ）ＶＥＶＡ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡの薄いコーティングのＡＦＭトポグラフィー画像；（ｄ～ｆ）ａ～ｃに由来する薄いコーティングの弾性率分布；（ｇ～ｉ）Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２およびＶＥＶＡ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡインデンテーション実験の厚いゲルの光学顕微鏡画像；（ｊ～ｌ）ｇ～ｉにおいて参照された状態の厚いゲルの弾性率分布。
【図26】図２６Ａ～Ｆ。ＩＫＶＡＶ ＰＡゲルのレオロジー測定。（ａ～ｃ）（ａ）Ｖ２Ａ２、（ｂ）Ａ２Ｇ２、および（ｃ）ＶＥＶＡ２を含んでいる超分子ＩＫＶＡＶ ＰＡの０～１００の範囲のせん断ひずみにおける貯蔵弾性率Ｇ’、および損失弾性率Ｇ’’を示すひずみ掃引。（ｄ～ｆ）ａ～ｃにおいて参照された状態の０～１００ｒａｄ／ｓの範囲の角周波数についての貯蔵弾性率Ｇ’を示す周波数掃引。データは、ｎ＝３ゲルの平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す。
【図27】図２７Ａ～Ｃ。ＩＫＶＡＶ ＰＡマトリックス上で培養したヒトＭＮの時間経過。インビトロで（ａ）３０日、（ｂ）４５日および（ｃ）６０日での、Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡ超分子ファイバーおよびラミニン（黒色）マトリックス上で培養したＭＮの代表的な共焦点顕微鏡写真。細胞をニューロンマーカーＭＡＰ－２（赤色）、運動ニューロンマーカーＣｈＡＴ（緑色）で染色し、核をＤＡＰＩ（青色）で染色した。スケールバー：１００μｍ。
【図28】図２８Ａ～Ｆ。ＩＫＶＡＶ ＰＡマトリックス上でのヒトＭＮの長期培養。インビトロで（ａ、ｂ）３０日、（ｃ、ｄ）４５日および（ｅ、ｆ）６０日での、Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡ超分子ファイバーおよびラミニンマトリックス上で培養したＭＮの（ａ、ｃ、ｅ）代表的な明視野画像および（ｂ、ｄ、ｆ）共焦点顕微鏡写真。細胞をニューロンマーカーＭＡＰ－２（赤色）、運動ニューロンマーカーＣｈＡＴ（緑色）で染色し、核をＤＡＰＩ（青色）で染色した。スケールバー：２５μｍ。データは、６つの独立した分化の平均である。
【図29】図２９Ａ～Ｄ。異なる時点でのＩＫＶＡＶ ＰＡ上のヒトＭＮの特徴付け。Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいる超分子ＩＫＶＡＶマトリックス上で培養したヒトＭＮにおける（ａ、ｂ）ＩＴＧＢ１受容体活性化、運動ニューロンマーカーＣｈＡＴおよびＩＳＬ１／２ならびに（ＩＬＫ－１）、および（ｃ、ｄ）ニューロンマーカーＭＡＰ－２およびＴＵＪ－１の（ａ、ｃ）ウエスタンブロット解析および（ｂ、ｄ）正規化されたタンパク質レベル。データは、少なくとも３つの独立した分化の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）、ｎ．ｓ：有意ではない。
【図30】図３０Ａ～Ｃ。Ａ２Ｇ２ ＩＫＶＡＶ ＰＡおよびラミニン上で培養したヒトＭＮにおける差次的ＩＴＧＢ１発現。（ａ、ｂ）６０日での、（ａ）Ａ２Ｇ２および（ｂ）ラミニンマトリックス上で培養したＭＮ神経突起（ＴＵＪ－１、緑色）およびＩＴＧＢ１受容体発現（ピンク色）の代表的な三次元ＳＩＭ顕微鏡写真。（ｃ）インビトロで６０日での、Ａ２Ｇ２（青色）とラミニンマトリックス上で培養したＭＮにおけるＩＴＧＢ１の強度解析。スケールバー：１０μｍ。
【図31】図３１Ａ～Ｃ。Ａ２Ｇ２ ＩＫＶＡＶ ＰＡおよびラミニンコート表面上で培養したＭＮにおいて差次的に発現されたタンパク質の遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析によるＭＮ成熟の評価。タンデム質量分析は、ラミニンコート表面上にプレーティングしたＭＮ間の差次的に発現されたタンパク質を明らかにし、これは、ヒトＭＮ成熟に直接関連したＧＯタームに関連する（Ｈｏら、２０１６）。（ａ）Ａ２Ｇ２状態において差次的に発現されたタンパク質から、ヒトＭＮの成熟に関連する５８個のＧＯタームのうち２１個（３６％）を同定した。ＭＮ成熟関連タームはまた、Ａ２Ｇ２ ＩＫＶＡＶ ＰＡ対ラミニンコート表面上にプレーティングした培養物において、上方制御された（ｂ）および下方制御された（ｃ）タンパク質のリストから同定された。横棒グラフは、タンパク質データセットにおいて同定されたＭＮ成熟関連ＧＯタームのｐ値を表す。円グラフは、ＭＮ成熟に関連した前述のＧＯタームと比較した、この研究で得られたＧＯタームのパーセンテージを表す（Ｈｏら、２０１６）。
【図32】図３２Ａ～Ｃ。ＩＫＶＡＶ ＰＡマトリックス上のヒト運動ニューロン（ＭＮ）の形態学的分析。（ａ、ｂ）インビトロで６０日での、Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡ超分子ファイバーおよびラミニンマトリックス上で培養した単一ヒトＭＮの代表的な共焦点顕微鏡写真。細胞を（ａ）ニューロンマーカーＭＡＰ－２（赤色）で染色した。（ｂ、ｃ）６０日での、ＭＮ培養物の（ｂ）細胞体の大きさおよび（ｃ）一次神経突起の数の分析。スケールバー：２５μｍ。データは、少なくとも３つの独立した分化の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図33】図３３Ａ～Ｄ。インビトロで６０日後のＩＫＶＡＶ ＰＡコーティング。（ａ、ｂ）Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡ上で培養したヒトＭＮの代表的な構造的照明顕微鏡（ＳＩＭ）顕微鏡写真。ＭＮをＴＵＪ－１（赤色）で染色し、ＩＫＶＡＶ ＰＡをａｌｅｘａ－４８８色素（緑色）と共有結合させた。（ｃ、ｄ）Ａ２Ｇ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡ上で培養したＭＮの神経突起を呈している走査型電子顕微鏡写真。スケールバー：（ｃ）５μｍ、（ｄ）２μｍ。
【図34】図３４Ａ～Ｃ。ガラスカバースリップの修飾のためのＩＫＶＡＶペプチドの合成および液体クロマトグラフィー－質量分析。（ａ）ＩＫＶＡＶペプチドの概略の分子構造。（ｂ）精製ＩＫＶＡＶペプチドの分析用高性能液体クロマトグラフィー（分析用ＨＰＬＣ）トレース。（ｃ）ＩＫＶＡＶペプチドのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）。
【図35】図３５Ａ～Ｅ。ＭＮ付着に対する固定化ＩＫＶＡＶの影響。（ａ）カバースリップ表面上の固定化ＩＫＶＡＶペプチドの概略図。（ｂ）明視野画像。（ｃ、ｄ）ＡＰＴＥＳおよびＩＫＶＡＶペプチドコーティング上で培養したＭＮの代表的な共焦点顕微鏡写真。細胞をニューロンマーカー（ｃ）ＩＳＬ１／２（緑色）およびＴＵＪ－１（赤色）ならびに（ｄ）ＣｈＡＴ（緑色）およびＭＡＰ－２（赤色）で染色した。核をＤＡＰＩ（青色）で染色した。（ｅ）ＡＰＴＥＳおよび固定化ペプチド（ＩＫＶＡＶ）上で培養したｍｍ２当たりの細胞数の定量。Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡおよびラミニンマトリックスをコントロールとして使用した。スケールバー：１００μｍ。データは、３つの独立した分化の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図36】図３６Ａ～Ｃ。スクランブルＶＫＩＶＡ ＰＡ上のヒトＭＮ付着。Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、およびＶＥＶＡ２を含んでいるスクランブルＶＫＩＶＡ ＰＡ配列上で培養したＭＮの（ａ）代表的な明視野画像および（ｂ）共焦点画像。細胞を、ｂにおいてＣｈＡＴ、ＭＡＰ－２およびＤＡＰＩで染色した。（ｃ）ａ、ｂにおいて参照された状態の、ｍｍ２培養あたりの細胞数の定量。Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡおよびラミニンマトリックスを、コントロールとして使用した。スケールバー：１００μｍ。データは、３つの独立した分化の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図37】図３７Ａ～Ｏ。他のヒトｉＰＳＣ由来運動ニューロン（１１ａ細胞株）に対するＩＫＶＡＶ ＰＡの影響。（ａ、ｂ）Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２ ＩＫＶＡＶ ＰＡ超分子ファイバーおよびラミニンマトリックス上で７２時間培養したＭＮ－１１ａの代表的な顕微鏡写真。細胞は、ニューロンおよび運動ニューロンマーカー、それぞれ、（ａ）におけるＴＵＪ－１（赤色）およびＩＳＬ１／２（緑色）；ＭＡＰ－２（赤色）およびＣｈＡＴ（緑色）で染色した。核をＤＡＰＩ（青色）で染色した。Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡ超分子ファイバーおよびラミニンコーティング上で培養した、（ｃ）７２時間でのｍｍ２あたりの細胞数の定量。（ｃ～ｆ）（ｃ）ＴＵＪ－１＋、（ｄ）ＩＳＬ１／２＋（ｆ）ＣｈＡＴ＋ＭＮパーセンテージの定量。（ｇ）６０日での、Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡおよびラミニンマトリックス上で培養したヒトＭＮ１１ａの代表的な共焦点顕微鏡写真。細胞を、ＭＮマーカーＣｈＡＴ（緑色）、微小管関連タンパク質－２（ＭＡＰ－２、赤色）および核（ＤＡＰＩ）で染色した。（ｈ）ｇにおいて示した画像のＤＡＰＩチャネル顕微鏡写真。（ｉ）ｇおよびｈにおいて参照された異なるマトリックス上の細胞分布のヒストグラム分析。（ｊ）６０日でのｍｍ２あたりの細胞数の定量および（ｋ）６０日でのＶ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色）を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡ超分子ファイバーおよびラミニン（黒色）コーティング上で培養したＣｈＡＴ＋ＭＮパーセンテージの定量。（ｌ～ｍ）（ｌ）Ａ２Ｇ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡおよび（ｍ）ラミニン上で培養したＭＮの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）顕微鏡写真。ＩＴＧＢ１受容体活性化、ニューロンマーカーＭＡＰ－２および運動ニューロンマーカーＣｈＡＴの（ｎ）ウエスタンブロットおよび（ｏ）正規化されたタンパク質レベル。全ての値をアクチンに対して正規化した。データは、３つの独立した分化の平均である：スケールバー（ａ、ｂ）５０μｍ、（ｇ、ｈ）１００μｍ、（ｌ，ｍ）５μｍ。データは、３つの独立した分化の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す;ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図38】図３８Ａ～Ｌ。ヒトｉＰＳＣ由来皮質ニューロン（ＣｘＮ）に対するＩＫＶＡＶ ＰＡの影響。（ａ）ｉＰＳＣ由来ＣｘＮ分化および超分子マトリックス上でのその培養の概略図。（ｂ～ｄ）（ｂ）７２時間および（ｃ、ｄ）６０日での、Ｖ２Ａ２（赤色）、Ａ２Ｇ２（青色）、ＶＥＶＡ２（オレンジ色） ＩＫＶＡＶ ＰＡ超分子ファイバーおよびラミニン（白色）マトリックス上で培養したＣｘＮの代表的な顕微鏡写真。細胞を、ニューロンマーカーＴＵＪ－１（赤色）、ＭＡＰ－２（緑色）およびＮＥＵＮ（赤色）、ならびに皮質マーカーＳＡＴＢ－２（緑色）で染色した。核をＤＡＰＩ（青）で染色した。（ｅ）７２時間でのｍｍ２あたりの細胞数の定量。（ｆ）６０日での細胞培地中のＬＤＨの放出によって評価した細胞生存率。（ｇ～ｊ）６０日での、Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡ超分子ファイバーおよびラミニン（黒色）コーティング上で培養した（ｇ）ＴＵＪ－１＋、（ｈ）ＭＡＰ２＋、（ｉ）ＮＥＵＮ＋および（ｊ）ＳＡＴＢ－２＋ニューロンパーセンテージの定量。ＩＴＧＢ１受容体活性化、ニューロンマーカーＭＡＰ－２、ＴＵＪ－１およびＮＥＵＮ、ならびにシナプス前マーカーＳＹＰの（ｋ）ウエスタンブロットおよび（ｌ）正規化されたタンパク質レベル。全ての値をアクチンに対して正規化した。データは、３つの独立した分化の平均である。スケールバー：（ｂ）１００μｍ、（ｃ、ｄ）５０μｍ。データは、３つの独立した分化の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図39】図３９Ａ～Ｇ。Ｖ２Ａ２およびＶＥＶＡ２ ＩＫＶＡＶ ＰＡ上で培養したヒト運動ニューロン（ＭＮ）における機能マーカーの発現。（ａ、ｂ）インビトロで４０日後の、Ａ２Ｇ２を含んでいるＩＫＶＡＶおよび（ｂ）ラミニンマトリックス上で培養したＭＮの神経突起にそって分布したシナプス小胞（ＳＹＮ－１、シナプス前、およびＰＳ９５、シナプス後）の代表的な共焦点顕微鏡写真。（ｃ、ｄ）Ｖ２Ａ２およびＶＥＶＡ２上で培養したＭＮにおける（ｃ）ＰＳＤ９５および（ｄ）ＳＹＮ－１の平均強度解析。Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２を含んでいる超分子ＩＫＶＡＶマトリックスおよびラミニンコーティング上で培養したヒトＭＮにおけるシナプスマーカーＰＳＤ９５、ＳＹＮ－１およびＳＹＰ、ならびにニューロンマーカーＤＣＸの（ｆ）ウエスタンブロット解析および（ｇ）正規化されたタンパク質レベル。スケールバー：データは、少なくとも３つの独立した分化の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図40】図４０Ａ～Ｆ。ＩＫＶＡＶ ＰＡ上で培養したヒトＭＮの電気生理学的研究。（ａ）ニューロン培養物の記録のためのマルチ電極アレイプレート（ＭＥＡプレート）の概略図。（ｂ、ｃ）（ｂ）ＩＫＶＡＶ ＰＡおよび（ｃ）ラミニンでコートしたＭＥＡプレート上にプレーティングしたニューロン（緑色）の概略図。（ｄ）Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２、ＶＥＶＡ２を含んでいるＩＫＶＡＶ ＰＡおよびラミニンでコートされたＭＥＡプレート上で培養したＭＮの明視野画像。（ｅ）ｄにおいて参照されたものと同じ状態での加重平均発火速度および（ｆ）バースト電極の数。スケールバー：１００μｍ。データは、２つの独立した分化の平均である。全ての数値は平均値±ＳＤとして示す；ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】