特開 2024-138430 線虫の嗅覚を用いた癌検出法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024138430

(43)【公開日】2024-10-08

(54)【発明の名称】線虫の嗅覚を用いた癌検出法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/02 20060101AFI20241001BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20241001BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20241001BHJP

   C12N 1/11 20060101ALN20241001BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/02 ZNA

C12Q1/02

C12N15/12

C12N15/113 Z

C12N1/11

【審査請求】有

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024111212

(22)【出願日】2024-07-10

(62)【分割の表示】P 2022114543の分割

【原出願日】2014-12-10

(31)【優先権主張番号】61/982,341

(32)【優先日】2014-04-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】P 2013255145

(32)【優先日】2013-12-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(71)【出願人】

【識別番号】516266031

【氏名又は名称】株式会社ＨＩＲＯＴＳＵバイオサイエンス

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(72)【発明者】

【氏名】広津 崇亮

(72)【発明者】

【氏名】園田 英人

(57)【要約】

【課題】線虫における匂いの受容体の同定方法の提供。
【解決手段】線虫を用いて匂いの受容体の同定を行うことを特徴とする、線虫における匂
いの受容体の同定方法。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

線虫を用いて匂いの受容体の同定を行うことを特徴とする、線虫における匂いの受容体
の同定方法。

【請求項2】

前記受容体をコードする遺伝子の発現又は機能を阻害し、当該阻害された線虫における
匂いに対する反応を検査するものである請求項１に記載の方法。

【請求項3】

受容体遺伝子の発現又は機能阻害がRNAiによるものである請求項２に記載の方法。

【請求項4】

匂いが癌種の匂いである請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

同定される受容体の種類が、癌種により、又は匂い物質の濃度に依存して異なるもので
ある請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

線虫がシノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）である請求項１～
５のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、線虫の嗅覚を用いた癌検出方法に関する。

【背景技術】

【0002】

癌を含む悪性新生物は、1981 年より日本人の死因トップを占めている。世界保健機構
によれば、2005 年における世界の悪性新生物による死亡率は13%（760 万人）を占め、今
後も増加し続けると予測されている。
癌は、早期であればある程、診療にかかる精神的・身体的・経済的・社会的負担が軽く
、根治の可能性も高い。進行すればする程、根治の可能性は低下し、切除不能の進行再発
癌に至っては、多大の負担と損失のうえ、延命治療となる現実がある。癌は細胞の遺伝子
の異常が原因となり発生するため、ほとんどの癌において人口１０万対各年齢における発
生頻度は4-6 乗に比例して増加する（Cancer Patterns in Canada, 1982）。このため、
いずれの年齢や社会においても、癌を早期発見・早期治療できれば、様々な場面において
負担と損失が小さくできることは明白である。

【0003】

しかし、早期癌では症状が無い事が一般的であり、受診者は癌検診を受けるためのモチ
ベーションに欠けるのが現実である。実際、日本の癌検診受診率はすべてにおいて10-35
％程度であり、2017 年までに癌検診受診率50％以上を目指す日本のがん対策基本計画の
目標を大きく下回っている。内視鏡や手術技術など、早期癌に対する治療技術で世界トッ
プにある日本において、苦痛が少なく、簡単で安価、多くの人を対象として施行可能で高
精度な癌検診法が新たに開発・応用されれば、世界の癌診療に革命をもたらすと言っても
過言ではない。

【0004】

本発明者らを含めいくつかのチームでは、訓練された犬（がん探知犬）を用いて、癌に
は特有のニオイがあり、早期癌を含む検体に対して感度・特異度ともに90％を超える高い
精度で検出可能である事を報告してきた(非特許文献１：Sonoda, H. et al., Colorectal
cancer screening with odour material by canine scent detection. Gut, 60, 814-81
9, 2011)。
この事から、癌特有のニオイを検出すれば高精度の癌探知システムの構築が可能と考え
られる。

【0005】

しかし、がん探知犬の能力には個体差があり、気温の上昇する夏には集中力が低下する
。また、探知犬の訓練方法に関しても一定の方法論が存在しない。さらに、がん探知犬の
調子が整った状況でも１日に５回のテストが限界である。何よりも、正解が全く不明の検
診目的のサンプルにおいてテストを続ける行為は、がん探知犬が間違った行動をとっても
探知犬に「ボールで遊ぶ」という報酬を提供してしまうため、精度を落とす結果となる。
従って、探知犬を用いた癌検診を業務として行う事はできない。

【0006】

また、GC/MS (gas chromatography/mass spectroscopy)分析などの分析装置を用いて揮
発性物質を特定し、癌の診断を行う方法が報告されている(非特許文献２：Y. Hanai, et
al., Urinary volatile compounds as biomarkers for lung cancer. Biosci. Biotechno
l. Biochem. 76, 679-84, 2012) （非特許文献３：Khalid et al., A pilot study combi
ning a GC-sensor device with a statistical model for the identification of bladd
er cancer from urine headspace. PLoS ONE, 8, e69602, 2013）。しかし、日常的に存
在する揮発性物質がノイズとなる可能性が高く、検出するための機器の開発と作製に多額
の資金と分析技術が必要である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Sonoda, H. et al., Colorectal cancer screening with odour material by canine scent detection. Gut, 60, 814-819, 2011

【非特許文献2】Y. Hanai, et al. Urinary volatile compounds as biomarkers for lung cancer. Biosci. Biotechnol. Biochem. 76, 679-84, 2012

【非特許文献3】Khalid et al., A pilot study combining a GC-sensor device with a statistical model for the identification of bladder cancer from urine headspace. PLoS ONE, 8, e69602, 2013

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、線虫の嗅覚を利用した癌の検出方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、線虫の嗅覚に基づく化学
走性又は嗅覚神経の応答により、癌を検出し得ることを見出し、本発明を完成するに至っ
た。
すなわち、本発明は以下の通りである。

【0010】

（１）被検者由来の生体関連物質又はその処理物の匂いに対する線虫の反応を指標として
癌を検出することを特徴とする癌の検出方法。
（２）線虫がシノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）である（１）
に記載の方法。
（３）線虫が、野生型線虫、変異型線虫又はトランスジェニック線虫である（１）又は（
２）に記載の方法。
（４）被検者由来の生体関連物質又はその処理物の匂いに対して、線虫が正の応答を示し
たときは、被検者は癌である、又は癌のリスクがあると判定する、（１）～（３）のいず
れか１項に記載の方法。

【0011】

（５）被検者由来の生体関連物質又はその処理物の匂いに対して、線虫の嗅覚神経の応答
が大きいときは、被検者は癌である、又は癌のリスクがあると判定する、（１）～（４）
のいずれか１項に記載の方法。
（６）生体関連物質又はその処理物が、体液、細胞、組織、又は細胞若しくは組織の培養
物若しくは保存液である（１）～（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）体液が尿である（６）に記載の方法。
（８）保存液が生理食塩水である（６）に記載の方法。
（９）
線虫を用いて匂いの受容体の同定を行うことを特徴とする、線虫における匂いの受容体
の同定方法。
（１０）前記受容体をコードする遺伝子の発現又は機能を阻害し、当該阻害された線虫に
おける匂いに対する反応を検査するものである（９）に記載の方法。

【0012】

（１１）受容体遺伝子の発現又は機能阻害がRNAiによるものである（１０）に記載の方法
。
（１２）匂いが癌種の匂いである（９）～（１１）のいずれか１項に記載の方法。
（１３）同定される受容体の種類が、癌種により、又は匂い物質の濃度に依存して異なる
ものである（９）～（１２）のいずれか１項に記載の方法。
（１４）線虫がシノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）である（９
）～（１３）のいずれか１項に記載の方法。
（１５）被検者由来の生体関連物質又はその処理物の匂いに対する線虫の反応を指標とし
て癌種を同定することを特徴とする癌種の同定方法。

【0013】

（１６）以下の工程を含む、（１５）に記載の方法：
（ａ）前記（１）～（８）のいずれか１項に記載の方法により癌を検出し、
（ｂ）前記工程（ａ）において癌であることが検出された試料について、前記（９）～
（１４）のいずれか１項に記載の方法により同定された受容体を改変した改変体線虫を用
いて、匂いに対する反応を検査し、
（ｃ）前記改変体線虫と、前記工程（ａ）で使用した線虫との間で匂いに対する反応が
異なるときは、同定された受容体に対応する癌種を、同定の対象癌種であると判定する。
（１７）受容体の改変が、受容体の欠失、受容体の発現又は機能の阻害、及び受容体の高
発現又は高機能化からなる群から選ばれる少なくとも１つである（１６）に記載の方法。
（１８）線虫を含む、癌の検出又は同定用キット。
（１９）線虫がシノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）である（１
７）に記載のキット。
（２０）線虫が、野生型線虫、変異型線虫又はトランスジェニック線虫である（１８）又
は（１９）に記載のキット。
（２１）線虫と、
生体関連物質又はその処理物及び前記線虫を収容する収容部と、
前記収容部の線虫の匂いに対する反応を探知する探知部と、
を備える癌の検出システム。

【発明の効果】

【0014】

本発明により、線虫を用いた癌の検出方法が提供される。本発明の方法によれば、癌を
高感度かつ低コストで検出することができる。さらに、本発明の方法は、サンプルの採取
及び解析が容易であり、費用も安価である。さらに、本発明の方法は早期癌を検出するこ
とができる。従って、本発明の方法は、癌の臨床検査などに極めて有用である。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】健常者及び癌患者の尿に対する線虫の反応試験結果を示す図である。

【図2】本発明の方法に使用するシャーレのフォーマットを示す図である。

【図3】インディケーター遺伝子としてYellow Cameleon遺伝子を用いたときの測定原理を示す図である。

【図4】インディケーター遺伝子としてGCaMP遺伝子を用いたときの測定原理を示す図である。

【図5】線虫を配置するためのマイクロ流路を有するチップを示す図である。

【図6】マイクロ流路を有するチップ内での流路の切り替えを示す図である。

【図7】癌患者由来の尿に対し、線虫のAWC嗅覚神経の反応を試験した結果を示す図である。

【図8】癌患者由来の尿に対し、線虫のAWC嗅覚神経の反応を試験した結果を示す図である。

【図9】沈殿物及び固形物を除去した尿サンプルを用いて線虫の化学走性を試験した結果を示す図である。

【図10】癌患者由来の尿に対し、線虫のAWA嗅覚神経の反応を試験した結果を示す図である。

【図11】癌患者由来の尿に対し、線虫のAWA嗅覚神経の反応を試験した結果を示す図である。

【図12】アッセイプレートを示す図である。

【図13】癌細胞の培養培地に対する線虫の誘引行動を示す図である。

【図14】本発明の方法の中規模試験結果を示す図である。

【図15】本発明の方法と他の腫瘍マーカーを用いて中規模試験を行い、感度を比較した結果を示す図である。

【図16A】本発明のシステムのブロック図である。

【図16B】本発明のシステムの処理部の構成図である。

【図17】種々の濃度の繊維芽細胞培養培地に対する線虫の走性を示す図である。

【図18】種々の濃度の癌細胞培養培地に対する線虫の走性を示す図である。 colo205=大腸癌、MKN1=胃癌

【図19】S状結腸癌患者の癌組織及び健常組織に対する線虫の走性を示す図である。

【図20】ヒトの癌組織切片を生理食塩水に入れて保存した後の当該生理食塩水の希釈液に対する線虫の走性を示す図である。

【図21】尿の濃度を変えて線虫の走性を試験した結果を示す図である。

【図22】特定の匂い物質に対する応答に関与した嗅覚受容体についてのRNAiスクリーニングを示す図である。（A）RNAiスクリーニング戦略が効果的であったことの確認。ジアセチルの10-3希釈又はピラジンの10-3希釈に対する走化性応答におけるeri-1変異体でのodr-10を標的とするRNAiの効果を示す。対照との有意な差を示す（P<0.001、ステューデントt検定）。（B）匂い物質に対する走化性と関連付けられた、第三次スクリーニング後に得られた嗅覚受容体候補遺伝子の数。（C）srx-47又はsra-17プロモーターによって発現誘導された蛍光リポーターの発現パターン。緑色は、これらの遺伝子のプロモーターによって誘導される蛍光タンパク質Venusの発現を示す。マジェンタ色は、AWA、AWB、及びAWC嗅覚ニューロンにおけるmCherryの発現を示す。srx-47の発現は、AWA及びASHニューロンにおいて観察された。sra-17の発現は、AWAニューロンにおいて検出された。スケールバー、10μm。

【図23】嗅覚受容体候補遺伝子の発現パターンを示す図である。（左）緑色は、嗅覚受容体候補遺伝子のプロモーターによって発現誘導されたVenusの発現を示す。（中央）マジェンタ色は、AWA、AWB及びAWCニューロンにおけるmCherryの発現（A）又は色素（dye）染色された感覚ニューロン（ASH、ASJ、AWB、ASK、ADL、ASI、PHA及びPHBニューロン）（B－M）を示す。（右）重ね合わせた図。すべての画像は、尾部領域（C、下部）を除いて、線虫の頭部領域の左側面画像のものである。矢印及び矢じりは、受容体候補遺伝子が発現するニューロンの細胞体を示す。スケールバー＝10μm。

【図24】SRI-14はASHニューロンにおいて高濃度のジアセチルに対する応答に機能することを示す図である。（A）野生型（WT）、odr-10、及びsri-14変異体における低濃度及び高濃度のジアセチルに対する化学走性。ジアセチル濃度を下部に示す（n＝5）。（B）高濃度のジアセチル（5μl未希釈）に対する忌避応答におけるsri-14を標的とするRNAiの効果（n＝8）。（C）高濃度のジアセチル（5μl未希釈、Da）、イソアミルアルコール（5μl未希釈、Iaa）、及びベンズアルデヒド（1μl未希釈、Bz）、並びに忌避物質オクタノール（1μl未希釈、Oct）及びノナノン（1μl未希釈、Nona）に対するsri-14変異体の化学走性（n＝6）。（D）sri-14プロモーターによって発現誘導される蛍光リポーター（緑色）の発現パターン。矢じりは、それぞれmCherry又は蛍光色素によって同定されたAWC又はASHの細胞体を示す（マジェンタ）。（E）高濃度のジアセチル（5μl未希釈）に対する化学走性において、野生型線虫でsri-14をASH又はAWC特異的にRNAiしたときの効果（n＝5）。（F）高濃度のジアセチル（5μl未希釈）へのsri-14変異体の応答の欠陥についてsri-14 cDNAのニューロン特異的発現の効果（n＝5）。（G）ASHの感覚繊毛におけるSRI-14::GFPの局在。スケールバー、10μm（D及びG）。エラーバーはSEMを表す。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、ステューデントt検定（B及びC）又はダネット検定（A、E、及びF）。

【図25】RNAi処理された線虫の高濃度ジアセチル濃度に対する化学走性を繰り返しアッセイした結果を示す図である。sri-14に加えて、第三スクリーニング後に得られた高濃度ジアセチル（5μlの未希釈）に対する応答に関する受容体候補遺伝子のうち、srh-25、srh-79、srh-216、又はsrh-281のRNAiは、ジアセチルからの忌避行動に有意で再現性のある欠陥を引き起こした。誤差バーはSEMを表す。対照と比較した有意差を示す（*P<0.05、**P<0.01；ボンフェローニ補正を含むステューデントt検定）。

【図26】sri-14の構造を示す図である。 sri-14は7回膜貫通型タンパク質をコードする。（A）sri-14の構造。ok2685株の欠失領域を示す。（B）SRI-14の予測されたアミノ酸配列。隠れマルコフモデルによって予測された7回膜貫通型ドメインを示す。（C）SRI-14の疎水性プロット。プロットは、Kyte & Doolittleによって定義されたハイドロパシーパラメータに由来する。（D）sri-14変異体は、高い浸透圧刺激（4M NaCl）に対して正常な忌避行動を示した。誤差バーはSEMを表す。対照と比較した有意差を示す（**P<0.01、ダネット検定）。

【図27】高濃度ジアセチルに対する応答に関与するニューロンを示す図である。（A）感覚ニューロンが特異的に破壊された野生型線虫における高濃度ジアセチル（5μl未希釈）に対する化学走性（n≧8）。（B）AWAを除去された線虫における10-3希釈のジアセチルに対する化学走性。（C）AWA、ASH感覚ニューロンと4つの第一層介在ニューロンの間の神経配線の模式図。（D）介在ニューロンが特異的に阻害された野生型線虫における高濃度ジアセチル（5μl未希釈）に対する化学走性（n≧5）。（E）介在ニューロンが特異的に阻害された野生型線虫における10-3希釈のジアセチルに対する化学走性（n≧5）。誤差バーはSEMを表す。**P<0.01、***P<0.001、ダネット検定；†††P<0.001；ステューデントt検定。（A）において、アステリスクは、いずれのニューロンも除去、阻害されていない野生型対照株と比較した、統計学的な有意差を示す。

【図28】種々のジアセチル濃度に対するAWAニューロンの応答を示す図である。（A）指示された遺伝子型の線虫における低濃度のジアセチル（10-5希釈）による刺激後のAWAニューロンのカルシウム応答。曲線の周囲の陰影領域はSEMを表す（すべての遺伝子型についてn≧8）。黒色バーは、ジアセチル刺激が存在したことを示す。（B）低濃度のジアセチル（10-5希釈）を添加してから10秒後の平均蛍光変化。誤差バーはSEMを表す。**P<0.01、ダネット検定（それぞれの遺伝子型についてn≧8）。黒色はWTであり、赤色はsri-14変異体であり、青色はodr-10変異体である。（C）指示された遺伝子型の線虫における高濃度のジアセチル（10-3希釈）による刺激後のAWAニューロンのカルシウム応答。データは（A）と同じく示される（すべての遺伝子型についてn≧8）。（D）高濃度のジアセチル（10-3希釈）の添加から10秒後の平均蛍光変化。誤差バーはSEMを表す（すべての遺伝子型についてn≧8）。

【図29】種々のジアセチル濃度に対するASHニューロンの応答を示す図である。（A）野生型線虫における低濃度（10-5希釈）及び高濃度（10-3希釈）のジアセチル刺激後のASHニューロンのカルシウム応答（n≧11）。（B）sri-14変異体（n＝26）、odr-10変異体（n＝28）、sri-14 cDNAのASH特異的発現を伴うsri-14変異体（sri-14レスキュー、n＝9）、及びsri-14をASH特異的にRNAiした野生型線虫（n＝20）におけるASHニューロンのカルシウム応答。曲線の周囲の陰影領域はSEMを表す。黒色バーは、ジアセチル刺激が存在したことを示す。（C）高濃度ジアセチル（10-3希釈）を添加してから10秒後の平均蛍光変化。誤差バーはSEMを表す。*P<0.05、ダネット検定（n≧11）。

【図30】unc-13変異体及びAWAを破壊された線虫におけるASHニューロンのカルシウムイメージングの図である。野生型（A, N＝14）、unc-13変異体（B, N＝14）及びAWAを破壊された線虫（C, N＝11）における高濃度のジアセチル（10-3希釈）刺激後のASHニューロンのカルシウム応答。unc-13変異体及びAWAを破壊された線虫では、野生型線虫ニューロンと比較して、大きく長時間持続するカルシウム応答が観察された。曲線の周囲の陰影領域はSEMを表す。黒色バーは、ジアセチル刺激が存在したことを示す。（D）高濃度ジアセチルを添加してから10秒後の平均蛍光変化。誤差バーはSEMを表す。対照からの有意差は、（*P<0.05、ダネット検定）によって示される。

【図31】AWCニューロンが高濃度ジアセチルの除去に応答することを示す図である。野生型における高濃度ジアセチル（10-3希釈）の除去後のAWCニューロンのカルシウム応答（N＝10）。曲線の周囲の陰影領域はSEMを表す。黒色バーは、ジアセチルが存在したことを示す。

【図32】高濃度又は低濃度のジアセチルの除去に対するAWBニューロンの応答を示す図である。（A）野生型線虫（茶色、n＝10）又はAWBニューロンにおいてsri-14を異所性に発現させた線虫（橙色、n＝11）における、低濃度（10-5希釈、左）又は高濃度（10-3希釈、右）のジアセチルの除去後のAWBニューロンのカルシウム応答。曲線の周囲の陰影領域はSEMを表す。黒色バーは、ジアセチルが存在したことを示す。（B）ジアセチルを除去してから10秒後の平均蛍光変化。白色バー、野生型；橙色バー、AWBにおいてsri-14を異所性に発現させた株。誤差バーはSEMを表示す。***P<0.001、ステューデントt検定（n≧10）。

【図33】匂いの濃度に依存した嗅覚受容体のスイッチのモデル図である。低濃度ジアセチルに対しては、ASHニューロンにおけるSRI-14ではなく、AWAニューロンにおけるODR-10が、ジアセチル受容体として機能し、AWAの活性化及び誘引行動をもたらす。対照的に、高濃度ジアセチルは、ASHニューロンにおけるSRI-14によって感知されるが、AWAニューロンにおけるODR-10によって感知されない。ASHニューロンは、高濃度ジアセチルによってだけ活性化され、忌避行動を誘導する。AWAも高濃度ジアセチルに応答するが、これは、ODR-10以外の嗅覚受容体がAWAニューロンにおいて応答することを示す。

【図34】N2株及び遺伝子変異株における各種癌患者の尿に対する走性を示す図である。

【図35】N2株及び遺伝子変異株における各種化学物質に対する走性を示す図である。

【図36】嗅覚受容体ノックダウン株における乳癌患者の尿に対する走性を示す図である。

【図37】線虫の走性テストにより癌種を特定する方法の模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0016】

以下、本発明を詳細に説明する。
なお、本明細書において引用した文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は
、参照として本明細書に組み込むものとする。また本明細書は、本願優先権主張の基礎と
なる特願2013-255145号（2013年12月10日出願）及びUS 61/982,341号(2014年4月22日出願
)の明細書の内容を包含する。

【0017】

１．概要
（１）癌の検出
本発明は、線虫を、被検者由来の生体関連物質又はその処理物の存在下で飼育し、例え
ば線虫の嗅覚による化学走性などを指標として癌を検出することを特徴とする癌の検出方
法である。
本発明者は、被検者が癌であるか否かを検査するに際し、一態様として被検者由来のサ
ンプルに対する線虫C. elegansの嗅覚による化学走性に注目した。
線虫であるセノラブディティス・エレガンス(Caenorhabditis elegans、以下「C. eleg
ans」ともいう）は生物研究のモデル生物として、世界中の研究室で広く飼育、研究され
ているポピュラーな生物であり、飼育が容易で、嗅覚が優れている特徴がある。

【0018】

線虫は匂い物質に対して、寄る、逃げるといった化学走性を示すことから、本発明にお
いては、この行動を指標として癌の匂いに対する線虫の反応を調べる。
健常者、及び癌患者の尿に対する線虫の反応を調べたところ、健常者の尿に対しては忌
避行動を、癌患者の尿に対しては誘引行動を示し、30 検体を調べその精度は100％であっ
た（図1）。
また、早期癌を含む、胃癌、結腸・直腸癌、膵臓癌の全てに反応したことから、がん探
知犬の行動と同じく、様々な癌に共通した、癌特有の匂いに反応している事が示された。

【0019】

従って、本発明においては、胃癌、結腸・直腸癌、食道癌、膵臓癌、前立腺癌、胆管癌
、乳癌、悪性リンパ腫、消化管間葉性腫瘍、盲腸癌、肺癌などの癌種を検出の対象とする
ことができる。
この線虫を用いた癌診断システムは、以下の通り、従来の問題点の多くを解決できる。

【0020】

(i) 早期癌を検出することが可能である。
ステージ0、1の早期癌についても、高精度で検出可能である。尿を採取した時点（2011
年）で既存の腫瘍マーカーで陰性と判断された検体について、このテストでは陽性を示
した。この患者は、経過観察中の2 年間に癌を発症した。すなわち、既存の腫瘍マーカー
では検出できない癌を、本発明により検出することが可能である。
(ii) 多種類の癌の存在を単一の検査で診断することができる。すなわち、一度の検診で
多くの種類の癌について診断することができる。これまでのところ、胃癌、結腸・直腸癌
、食道癌、膵臓癌、前立腺癌、胆管癌、乳癌、悪性リンパ腫、消化管間葉性腫瘍、盲腸癌
、肺癌について検出可能であることを確認している。
(iii)高感度である。
30 検体のテストでは100％の感度・特異度で検出が可能であった。さらに、中規模テス
ト（242検体）を行っても、癌患者について100％の感度・95%の特異度で検出が可能であ
った。

【0021】

(iv) サンプルの採取が容易である。
尿サンプルの採取には、食事制限などの特別な条件を定めておらず、通常の定期検診で
採取した尿サンプルを用いて解析できる。このため、被検者は苦痛を伴わず、他の尿検査
と同時にサンプル採取が可能である。必要な尿の量は数μlで済む。

【0022】

(v) 解析が安価で容易にできる。
(v-1) 早い
短時間で解析可能。線虫の化学走性の解析は、1 時間半程度で行うことができる。トラ
ンスジェニック線虫を用いた嗅覚神経の応答の解析は、30分程度で行うことができる。
(v-2) 安価
例えば、1検体あたり、線虫飼育用シャーレ2 枚（1 枚約10 円）、走性解析用シャーレ
3～5枚（1 枚約10 円）。寒天はそれぞれのシャーレ1 枚あたり、2.5 円、10 円。その他
試薬を合わせても、1 検体あたり100 円程度。人件費を合わせても、非常に安価に解析で
きる。
(v-3) 解析が容易であり、専門的な技術は必要としない。
線虫の走性解析は非常に容易であり、誰でも行うことができる。線虫の飼育も容易であ
る。線虫に対する特別な訓練は必要とせず、通常飼育した線虫を用いて解析することがで
きる。
(v-4) 多検体の解析が可能
実験者1 人当たり1 日に150 回程度の回数で走性解析を行うことができる。1 検体あた
り3 回の走性を解析する場合、1 日に50検体を解析できる。この作業を自動化することも
可能である。

【0023】

(vi) 実用化が容易、全世界で導入可能
(vi-1) システム全体が安価で導入しやすい
線虫の飼育に特別な部屋は必要ない。必要とする機器は、20℃インキュベーターと実体
顕微鏡のみであり、安価かつ短時間でシステムの構築ができる。
(vi-2) 全世界に導入可能
高価な測定機器を必要としないことから、先進国だけでなく、全ての国に導入可能であ
る。

【0024】

(vii)癌治療後の再発診断に応用可能
全ての部位の癌を検出できることから、術後再発の可能性判断に応用できる。

【0025】

以上より、本発明は、被検者の苦痛が少なく、操作を簡単かつ安価に行うことができ、
多くの人を対象として実施可能であり高精度な新たな癌検診法として有用である。

【0026】

（２）嗅覚受容体の同定
匂いは嗅覚神経上の嗅覚受容体によって受け取られる。ヒトには約350種の嗅覚受容体
が存在し、約1万種の匂いを識別できると言われている。匂いの種類に対して圧倒的に少
ない受容体において、どのようにして膨大な種類の匂いを識別できるのかは不明であるこ
とから、それを明らかにするため、匂いと受容体との対応関係を明らかにする必要がある
。しかし、そのような試みは部分的にしか行われておらず、特に生体内における対応関係
はほとんどわかっていなかった。

【0027】

線虫C. elegansは生体内での解析に優れ、嗅覚神経がわずか10個程度（ヒトでは約500万
個）しかないことや、神経回路が全て同定されていること、さらには匂いを感じる仕組み
が哺乳類とほぼ同じであることから、嗅覚研究のモデル生物であると考えられている。線
虫の嗅覚受容体は哺乳類と同じ7回膜貫通型Gタンパク質共役型であり、ゲノム上に1200個
以上あると予想されている。しかし、匂いとの対応関係が判明している受容体はわずか1
個（ジアセチル受容体のODR-10）であり、匂いシグナルをどのようにして受容しているの
かが不明であった。

【0028】

そこで本発明者は、RNAiにより線虫体内で嗅覚受容体遺伝子の機能を阻害し、その個体
が11種の匂いに対してどのような反応を示すかを調べる、網羅的スクリーニングを行った
。匂いに対する反応に変化をもたらした遺伝子をピックアップし、解析を繰り返した。そ
の結果、調べた匂い全てについて候補遺伝子を得ることに成功した（図２２B）。

【0029】

次に、得られた候補遺伝子は本当に生体内で嗅覚受容体として機能しているのかどうか
を明らかにするために、本発明者は同一の匂いでも濃度によって嗜好性（好き嫌い）が変
化する現象に注目して、解析を進めることにした。ヒトでは、匂いの濃度によって嗜好性
が変化することが経験的に知られており、例えばインドールは低濃度ではジャスミンの香
り、高濃度では糞尿臭がする。線虫でも同様の現象が観察され、匂いの濃度によって活性
化する嗅覚神経の種類が変化し、それによって嗜好性が変化することを、本発明者は先行
研究により明らかにしている（Yoshida, K. et al.: Nature Communications 3, 739 (20
12)）。では、同一の匂いでも濃度によって反応する受容体が変化するのだろうか。この
興味深い疑問について解析するために、本発明者は高濃度ジアセチルの受容に関わるもの
として得られたsri-14遺伝子に着目した。

【0030】

sri-14機能低下型変異体は、低濃度ジアセチルへの反応は正常であり、高濃度ジアセチル
への反応にのみ異常を示した。一方、既知のジアセチル受容体ODR-10の変異体は、低濃度
のジアセチルへの反応のみ低下した（図24A）。ODR-10は好きな匂いを受容するAWA嗅覚神
経で機能していることが既に報告されていたが（Sengupta, P. et al. : Cell 84, 899-9
09 (1996)）、sri-14の発現解析や表現型回復実験、神経特異的遺伝子発現阻害実験によ
り、SRI-14は嫌いな匂いを受容するASH感覚神経で機能していることがわかった（図24）
。またSRI-14は嗅覚受容体が存在する感覚繊毛に局在が観察された（図24G）。

【0031】

ここで、遺伝子発現阻害実験は、例えばRNAiを利用した阻害、アンチセンス核酸を利用
した阻害、ドミナントネガティブ型変異遺伝子の発現による阻害などが挙げられるが、RN
Aiを利用した阻害が好ましい。

【0032】

次に、カルシウムイメージングを用いてAWA、ASH感覚神経のジアセチルに対する応答を
観察した。AWA神経は低濃度、高濃度どちらのジアセチルにも応答したが、odr-10変異体
では低濃度ジアセチルへの応答が見られなかった（図28）。sri-14変異体では正常であっ
た。一方、ASH感覚神経は高濃度ジアセチルにのみ応答を示し、その応答はsri-14変異体
で有意に低下した。odr-10変異体では正常であった（図29）。さらに、sri-14をジアセチ
ルに応答しない別の感覚神経AWBに異所的に発現させると、AWBが高濃度ジアセチルに強く
応答するようになったことから（図32）、SRI-14がジアセチル受容体として生体内で機能
していることが強く示唆された。以上の結果から、同一の匂いでも濃度によって受容体が
使い分けられており、低濃度ジアセチルはAWA神経にあるODR-10で受容して好きと感じ、
高濃度ジアセチルはASH神経にあるSRI-14が受容して嫌いと感じることがわかった（Tanig
uchi, G. et al. : Science Signaling 7, ra39 (2014)）（図33）。

【0033】

線虫は、犬とほぼ同数の嗅覚受容体を持つ嗅覚の優れた生物であることから、麻薬探知犬
のように有害な物質、有益な物質の匂いを感度良く認識している可能性がある。その場合
、本研究の成果から、それらの匂いの受容体を同定することができる。匂いと受容体の対
応関係がわかれば、その結合をモデルとした人工匂いセンサの開発が可能であると予想さ
れ、将来的に線虫を用いた嗅覚解析は広く社会に貢献するものとして有用である。

【0034】

２．検出方法
（１）線虫
本発明の方法に用いる線虫は土壌自活線虫の一種であり、生物研究のモデル生物として
広く研究に用いられている。本発明の方法に用いる線虫は、雌雄を問わないが、自家受精
により増殖することができる点で雌雄同体のものが好ましい。また、本発明において使用
する線虫は、シャーレの中で大腸菌を餌として飼育すればよく、飼育は容易である。親を
シャーレに移しておけば、4 日後には子供が産まれて成虫にまで成長し、50～100 倍に個
体数が増える。その間、インキュベーターに入れて放置しておけばよく、特別な操作は必
要ない。雌雄同体を使用する場合は、かけ合わせなどの操作も必要ない。飼育するのに必
要な設備は20℃インキュベーター及び実体顕微鏡であり、システムの立ち上げは短時間に
、安価に行える。

【0035】

本発明において使用される線虫としては、例えば野生型線虫の場合は、セノラブディテ
ィス・エレガンス(Caenorhabditis elegans) が挙げられ、C. elegans Briostol N2株の
雌雄同体を用いることが好ましいが、各種遺伝子を欠損した遺伝子変異株を用いることも
できる。これらの線虫は、例えばCaenorhabditis Genetic Center (CGC)より入手するこ
とができる。

【0036】

本発明においては、上記線虫（野生型線虫）のほかに、変異型線虫やトランスジェニッ
ク線虫を用いることができる。トランスジェニック線虫には、線虫の嗅覚神経AWC、AWAに
、インディケーター遺伝子を導入した線虫、癌の匂いの受容に関わる遺伝子（受容体遺伝
子）の発現または機能を阻害した線虫、癌の匂いの受容に関わる遺伝子（受容体遺伝子）
を高発現または高機能化した線虫、線虫の行動解析を容易にするために各細胞に蛍光タン
パク質を発現させた線虫などが例としてあげられるが、これらに限定されるものではなく
、外来遺伝子を導入した全てのトランスジェニック株を対象とする。

【0037】

本発明では、線虫の所定のプロモーターの直下に目的遺伝子を連結したDNAを構築し
、これを線虫の野生株や遺伝子変異株（例えば生殖腺）に微量注射する。これにより、外
来遺伝子を安定的に継代できるトランスジェニック線虫を作製することができる。カルシ
ウム濃度が上昇することは、神経が活性化したことを表すことから、例えば神経内カルシ
ウム濃度を測定できるインディケーター遺伝子を用い、カルシウム濃度の変化を指標とし
て癌を検出することができる。

【0038】

AWCに発現させるために使用するプロモーターとしては、例えばodr-1プロモーター（Yu
, S., Avery, L., Baude, E. & Garbers, D. L. Guanylyl cyclase expression in speci
fic sensory neurons: a new family of chemosensory receptors. Proc Natl Acad Sci
U S A 94, 3384-3387 (1997).）などが挙げられる。odr-1はAWCとAWB（AWCとは別の嗅覚
神経）に発現誘導する。
また、AWAに発現させるために使用するプロモーターとしては、例えばodr-10プロモー
ター（Sengupta, P., Chou, J. H. & Bargmann, C. I. odr-10 encodes a seven transme
mbrane domain olfactory receptor required for responses to the odorant diacetyl.
Cell 84, 899-909 (1996).）が挙げられる。odr-10はAWAのみに発現誘導することが知ら
れている。

【0039】

これらのプロモーターの塩基配列情報は、例えばアクセッション番号Z68118、FO080931
により得ることができる。また、プロモーターは線虫ゲノムDNAを精製し、それを鋳型と
してPCRにより増幅して入手することも可能である。
カルシウムインディケーター遺伝子としては、Yellow Cameleon (YC) 遺伝子（Nagai,
T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M. & Miyawaki, A. Expanded dynamic range
of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent
proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 10554-10559 (2004).）、GCaMP遺伝子（Naka
i, J., Ohkura, M. & Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a si
ngle green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001). ）などが挙
げられ、これらの遺伝子は、例えばアクセッション番号AB178712、HM143847により塩基配
列情報を得ることができる。また、これらの遺伝子は、addgeneにより入手することも可
能である。

【0040】

プロモーター直下にインディケーター遺伝子を連結する方法やマイクロインジェクショ
ン法などは当分野において周知であり、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual
(4th Edition)」（Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)）等を参照すればよい
。あるいは、線虫の生殖腺にDNA溶液を注入するには公知手法により行うことができる（M
ello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D.& Ambros, V. Efficient gene transfer i
n C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequen
ces. EMBO J 10, 3959-3970 (1991).）。
変異型線虫は、例えば野生型線虫のゲノムに多型が生じた線虫、癌種それぞれの匂いに
対する嗅覚受容体をを欠失した変異体などを意味する（後述の実施例において説明する）
。

【0041】

（２）被検者由来の生体関連物質又はその処理物
本発明において使用される試料は被検者（健常人、癌患者、癌が疑われる患者等、動物
）由来の生体関連物質である。「生体関連物質」とは、被検者から採取された生体試料で
あり、例えば体液（尿、汗、唾液、便汁）、細胞（生検細胞等）、癌組織（生検組織、組
織切片等）血液、呼気などが挙げられる。本発明においては、これらの生体試料そのもの
を使用することができるが、生体関連物質の処理物を使用することが好ましい。「処理物
」とは、生体関連物質を物理的及び/又は化学的に処理したサンプルを意味する。

【0042】

尿などの体液サンプルには固形物や沈殿物が含まれている。例えば尿は、採取されたも
のをそのまま用いることもできるが、細い管を通して線虫に与える必要があるので、フィ
ルター除去処理を行うことが好ましい（例えばpore size 0.22 μm, MillexGP, Merck Mi
llipore)。このようなフィルターにより固形物の除去処理を施した尿サンプルは、上記「
処理物」に含まれる。なお、本発明者は、予備実験により、フィルター処理によって線虫
の反応（尿に対する誘引行動）が変化しないことを確認した（図９）。

【0043】

上記と同様に、生体関連物質として細胞（例えば生検による癌細胞）を使用する場合は
、細胞培養後の培養物から遠心分離やフィルタリング等により細胞破砕物などの固形物を
除去し、固形物除去後の培養上清液を処理物として得る。
また、本発明においては、上記試料のほか癌細胞又は癌組織（生検組織、組織切片等）
の保存液を使用することもできる。保存液としては、例えば生理食塩水、緩衝液、ホルマ
リン、DMSOなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。保存液には凍結保存
に一般に使用される凍結保存用保存液が含まれ、凍結保存後は、融解して使用することが
できる。

【0044】

（３）線虫の嗅覚を利用した検出
まず、検出に必要な線虫を得るために増殖させる。
線虫（成虫）をシャーレ（大腸菌をまいたNGM 培地）に数匹置いて、3～6日、好ましく
は4日間、15～25℃、好ましくは20℃で飼育する。これにより次の世代の線虫が300～500
匹程度、成虫まで育つ。
次に、実際に検査を行うためのシャーレを作製する。シャーレに図2 のようなフォーマ
ットを作成し、4 点にアジ化ナトリウム（NaN₃）を置く（添加する）。アジ化ナトリウム
は線虫を麻酔して動かなくするためのものであり、添加量は１M濃度では0.2～3μl、好ま
しくは0.5μlである。

【0045】

シャーレにまいた大腸菌を洗浄バッファーにより除き、シャーレに生体関連物質又はそ
の処理物のサンプルを置く（添加する）。サンプルとして尿を使用する場合、尿サンプル
は原液を使用することもできるが、採取された尿を例えば滅菌水、緩衝液等により1.5～1
000倍に希釈してもよい。希釈倍率は10倍であることが好ましい。シャーレに添加する尿
サンプルは0.5～10μl、好ましくは1μl である。

【0046】

このようにして準備されたシャーレの中心に線虫を置く。
所定時間（1 時間程度）線虫を飼育する（泳がせる）。室温は23℃±1℃。
所定時間経過後、＋側の個体数、－側の個体数を数え、chemotaxis index （下記式）
を計算する。＋側の個体数をN(+)、－側の個体数をN(-)とすると、
chemotaxis index= N(+) - N(-) / 全個体数
となる。

【0047】

その後、正の応答又は負の応答を指標として、癌を検出する。
「正の応答」とは、線虫がサンプルに対して「好き」であること又は「興味ある」こと
を意味し、「負の応答」とは、線虫がサンプルに対して「嫌い」であること又は「興味な
い」ことを意味する。
化学走性を指標とする場合は、正の値（＋）は正の応答（正の化学走性、好き）、負の
値（－）は負の応答（負の化学走性、嫌い）を表す。

【0048】

chemotaxis index は＋１～－１の値を取り、誘引された場合プラスの値を、忌避した
場合マイナスの値を取る。
1 検体あたり1回の解析でもよいが、複数回の解析を行い、chemotaxis index の値の平
均値を計算することにより値の精度を高めることができる。解析により得られた値（複数
回行ったときはその平均値）が正の値の場合、癌である又は癌のリスク（可能性）がある
と予備的に又は確定的に判断できる。「癌である」との判断は、例えば癌の確定診断又は
予備的診断の補助資料として使用することができ、「癌のリスクがある」との判断は、例
えば健康診断や癌の初診等において癌を疑うための補助資料として使用することができる
。

【0049】

線虫の匂いに対する反応は、化学走性以外の行動や生体反応を指標として検出すること
もできる。例えば、線虫が匂いの濃度が高くなる方向へ向きを変える風見鶏行動（Iino &
Yoshida, The Journal of Neuroscience, 2009）や、匂いの濃度が低くなると起こすタ
ーン行動（Pierce-Shimomura et al., The Journal of Neuroscience, 1999）、体の屈曲
度（Luo et al., Journal of Neurophysiology, 2008）、神経の応答などが挙げられる。
風見鶏行動において、「正の応答」とは、線虫がサンプルの方向に向きを変えることを
意味する。また、ターン行動においては、サンプルが高い濃度から低い濃度に変わったと
きにターンすると、線虫は「負の応答」をしたといえる。体の屈曲度の場合は、頭部と尾
部の間の距離が長いと、「正の応答」をとったといえる。

【0050】

（４）遺伝子組み換え線虫を利用した検出
(i) 遺伝子組み換え線虫を利用した検出についても、上記の通り行うことができるが、線
虫の嗅覚神経AWC、AWAに、神経内カルシウム濃度を測定できるインディケーター遺伝子を
発現させたトランスジェニック線虫を用い、カルシウム濃度の変化（神経の応答）を指標
として検出する。この方法は線虫数個体で解析することができるため、線虫の培養にかか
るコストが低く、短時間で行うことができる利点がある。

【0051】

インディケーター遺伝子として Yellow Cameleon遺伝子を用いた時の測定原理を図３に
示す。
測定に使用するインディケータータンパク質は、カルシウム結合タンパク質CaMと、CaM
が結合するターゲットのM13とをつなぎ、その両端にCFP、YFPをつないだ融合タンパクで
ある（遺伝子にコードされており、遺伝学的に生体内で発現させることができる）。カル
シウム濃度が低いときは、CaMとM13が離れており、CFPとYFPも離れた位置にある（左図）
。そのため、CFPを励起させる光を与えると、CFPから青い光が発せられる。一方、カルシ
ウム濃度が高くなってCaMとM13が結合すると、CFPとYFPが近付き、両者の間で蛍光共鳴エ
ネルギー移動（又はフェルスター共鳴エネルギー移動）（FRET）が生じる。すると、CFP
を励起する光を与えても、YFPから黄色い光が発せられるようになる（右図）。そこで、
青い光、黄色い光を同時に計測し、その比を計算すれば、カルシウム濃度変化がわかる。

【0052】

インディケーター遺伝子としてGCaMP遺伝子を用いた時の測定原理を図４に示す。
インディケータータンパク質は、CaMとM13とをGFPにつないだ構造をしている融合タン
パク質である。このタンパク質も、遺伝子によりコードされており、遺伝学的に生体内で
発現させることができる。カルシウム濃度が高くなってCaMと結合すると、GFPの蛍光強度
が上昇する。そこで、GFPの蛍光を測定すれば、カルシウム濃度の変化がわかる。

【0053】

本発明においては、被検者由来の生体関連物質又はその処理物に対して、線虫の嗅覚神
経の応答が大きいとき、すなわちカルシウム濃度変化が大きいときは、被検者は癌である
、又は癌のリスクがあると判定する。ここで、「嗅覚神経の応答が大きいとき」及び「カ
ルシウム濃度変化が大きいとき」における「大きいとき」とは、対照（健常人由来の生体
関連物質又はその処理物）と比較して、被検者由来の生体関連物質又はその処理物を刺激
として与えた時の、蛍光強度比（ratio＝YFP/CFP）の変化、あるいはGFPの蛍光強度変化
が有意に大きいことを意味する。

【0054】

(ii) 嗅覚神経にカルシウムインディケーターを発現させた線虫個体を、樹脂製（例えば
ジメチルポリシロキサン（PDMS）樹脂製）のチップに入れる（図５）。図５では、PDMS樹
脂製のチップに、線虫を挟み込む部分と、4つの流路が形成されている。

【0055】

潅流装置（WPI社。Multi Channel Perfusion System MPS-2等）で1～4の流路を切り替
えることにより（図６）、尿刺激のON、OFFを行う（Chalasani, S. H. et al. Dissectin
g a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nature 450, 63-70
(2007) ; Chronis, N., Zimmer, M. & Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo im
aging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat Methods
4, 727-731 (2007).）。

【0056】

図６は、チップ内での流路の切り替えを示す図である。流路1、2及び4にバッファー、
流路3に尿を入れておく。流路2及び3は常にONにしておく。流路1がONで、流路4がOFFの時
は、線虫に尿刺激は当たらない。流路1をOFF、流路4をONにすると、線虫に尿刺激が与え
られる。

【0057】

AWC嗅覚神経は「匂いあり」→「なし」で反応する神経であるため（嗅覚-OFF反応）、
尿がある状態からない状態に変化させた時の反応を見る。AWA神経はその反対に、「匂い
なし」→「あり」に反応する神経であるため（嗅覚-ON反応）、尿がない状態からある状
態に変化させた時の反応を見る。
ところで、健常者の尿でも線虫の嗅覚神経は弱く反応するため、コントロールの尿（健
常者の尿）を用意し、同じ線虫個体にコントロール尿、検体尿を順番に与えて、その反応
の強さの違いにより、癌の検出を行うことが好ましい。

【0058】

(iii) 蛍光顕微鏡（Leica DMI3000B等）を用いて、対物レンズ（40倍）で蛍光画像を取
得する。画像の取得は、例えば200msごとに行うが、顕微鏡、レンズなどにより適宜変更
することができる。Yellow Cameleonの場合は、2波長の画像を分けて取得する必要がある
ので、カメラは、同時に2波長の画像を取得できるカメラ、例えばORCA-D2 digital camer
a（浜松ホトニクス）であることが好ましい（他にも同様の機能を持つカメラが販売され
ている）。GCaMPの場合1波長の画像を取得できればよいので、GFP画像を取得できる一般
的な顕微鏡用カメラがあればよい。

【0059】

(iv) 取得画像について、嗅覚神経の細胞体（最も変化が見えやすい部位）をROI（注目
領域）として囲み、各ピクセルごとの蛍光強度をソフトウェア（例えばMolecular device
s社Metamorph software）を使用して全ての計算と映像作成を行う。なお、各社から販売
されている他のソフトも使用可能である。Yellow Cameleonの場合、各ピクセルごとのYFP
/CFP ratioを計算し、ROI内での平均値を計算する。また、GCaMPの場合、ROI内での蛍光
強度の平均値を計算する。

【0060】

３．受容体の同定
本発明においては、線虫を用いて匂いの受容体の同定を行うことを特徴とする、線虫に
おける匂いの受容体の同定方法を提供する。
本発明の同定方法は、受容体をコードする遺伝子の発現又は機能を阻害し、当該阻害さ
れた線虫における匂いに対する反応を検査する工程を含む。
嗅覚受容体遺伝子の発現又は機能阻害は、前記の通りRNAiを利用した阻害、アンチセン
ス核酸を利用した阻害、ドミナントネガティブ型変異遺伝子の発現による阻害などが挙げ
られるが、RNAiを利用した阻害が好ましい。

【0061】

受容体遺伝子の発現を阻害した線虫を用いて、各種癌由来の試料の匂いに対する反応
を検査する。ある癌種によって匂いに対する反応がない場合は、受容体は当該癌種の匂い
に対する受容体であると判断することができる。
また、同定される受容体の種類は、又は匂い物質の濃度に依存して異なる。従って、ど
の濃度の試料に対して反応するかを検査し、高濃度の試料に対する受容体、及び低濃度の
試料に対する受容体を同定することができる。

【0062】

嗅覚系は、様々な匂い物質を感知し、応答する。嗅覚受容体は、大部分の生物において
、Gタンパク質（ヘテロ三量体グアニンヌクレオチド結合タンパク質）結合型受容体であ
り、揮発性又は可溶性匂い物質に直接結合する。哺乳動物のゲノムと比較して、線虫シノ
ラブディス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）のゲノムは、より多くの推定上の嗅
覚受容体遺伝子を含み、これは、線虫において、受容体－匂いの関係に対して、組み合わ
せ的な複雑さが存在し得ることを示唆している。本発明者は、特定の匂い物質に対する応
答に必要とされる線虫の嗅覚受容体を同定するために、RNA干渉（RNAi）スクリーニング
を用いた。このスクリーニングにより、11個の匂い物質に関連付けられた194個の候補嗅
覚受容体遺伝子を同定した。

【0063】

さらに、本発明者は、高濃度のジアセチルの感知に関与するものとしてSRI-14を同定した
。レスキュー及びニューロン特異的なRNAi実験により、SRI-14が、特定の化学感覚ニュー
ロンであるASHニューロン（嫌いな匂いや化学物質を受容する線虫の感覚神経）において
機能し、忌避応答をもたらすことを実証した。カルシウムイメージングにより、ASHニュ
ーロンは高濃度ジアセチルに対してのみ応答し、一方、別の種類の化学感覚ニューロンで
あるAWAニューロン（主に好きな匂いを受容する線虫の嗅覚感覚神経）は、低い濃度と高
い濃度の両方に反応することを示した。SRI-14の機能の喪失は、高濃度ジアセチルに対す
るASHの応答を妨げ、一方、ODR-10の機能の喪失は、低濃度ジアセチルに対するAWAの応答
を減少させた。SPI-14を異所的に発現している化学感覚ニューロンは、高濃度のジアセチ
ルに対して応答した。したがって、線虫は、嗅覚受容体レベルと感覚ニューロンレベルで
分別される、濃度依存的な匂い感受性機構を有する。

【0064】

一般に動物は、それらの嗅覚系を通じて様々な匂い物質を感知し、応答する。匂い物質
は、その大部分は揮発性化合物であり、嗅覚受容体ニューロン（ORN）によって感知され
る。ORNにおいて、匂い分子は、嗅覚受容体に直接結合し、次に、細胞内シグナル伝達経
路を介して情報を伝達する（1）。哺乳動物において、嗅覚受容体は、7回膜貫通型Ｇタン
パク質（ヘテロ三量体グアニンヌクレオチド結合タンパク質）結合型受容体（GPCR）ファ
ミリーの一員であり（2）、ただ1つの嗅覚受容体型が任意の個々のORNに存在する（3）。
しかしながら、匂いと受容体の対応関係の同定を目的とした各種研究にもかかわらず、個
々の匂いと受容体の関係は、ほとんどが未知のままである（4, 5）。味（味覚（gestatio
n））は類似したプロセスであるが、可溶性化学物質の検出に関与する。

【0065】

線虫シノラブディス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）は、匂い（smell）及び
味に関連した化学感覚プロセスの分析（嗅覚、揮発性シグナルの検出、及び味覚、可溶性
シグナルの検出）に用いられるモデル生物であり、化学物質に応答することが知られてい
る、約１３個の感覚ニューロンを通じて、多数の化学刺激（chemical cue）を感知し、応
答する（6, 7）。便宜上、本発明者は、嗅覚としてこの化学感覚プロセス、及び匂い物質
として化学物質に言及する。線虫（C. elegans）ゲノムは、GPCRをコードする1200を超え
る推定上の嗅覚受容体遺伝子を含むことが予測され、GPCRは化学感覚ニューロンのうち11
個において発現が見られる（8）。これらの所見は、嗅覚とは異なるが（3）、哺乳動物お
ける味認識（10）に類似した、それぞれのORNにおいて複数タイプの嗅覚受容体（9）が発
現している可能性があることを示している。しかしながら、受容体と匂い物質又は他の化
学物質の関係が、ジアセチルに特異的な受容体であるODR-10（11）及びフェロモン受容体
（GPCRでもある（12～14）)についてのみ同定されているだけであり、線虫（C. elegans
）のORNにおける受容体のこれらの組合せによってどのようにして匂い物質が感知される
かは知られていない。

【0066】

多くの動物と同様に、線虫（C. elegans）もまた、特定の匂い物質に嗜好性を示し、そ
れらをAWA又はAWC嗅覚ニューロンによって感知したとき、匂い物質に対する誘引行動（at
traction behavior）を示し、AWB、ASH、又はADL感覚ニューロンによって物質を感知した
とき、忌避行動を示す（6, 15, 16）。しかしながら、いくつかのニューロンは、忌避行
動と誘引行動の両方に関与しており、例えば、AWBニューロンが該当する（16）。本発明
者らは、これまでに、線虫（C. elegans）における、同一の匂い物質に対する誘引応答又
は忌避応答が、匂い物質の濃度に依存することを示した（17）。これは、同一の匂い物質
でも濃度によって異なる嗅覚受容体が機能するという可能性をもたらす。

【0067】

ここでは、本発明者は、ジアセチルの異なる濃度を異なる嗅覚受容体が媒介し、それに
よって嗜好性が変化することを示した。匂い－受容体対をスクリーニングすることによっ
て、本発明者は、11個の匂い物質に対して、194個の候補嗅覚受容体遺伝子を同定した。
これらのうち、本発明者は、高濃度のジアセチルに特異的に応答するものとしてSRI-14を
同定した。本発明者の結果は、ジアセチルの受容について、AWAニューロンにおけるODR-1
0は低濃度に対して誘引応答を媒介し、ASHニューロンにおけるSRI-14は高濃度に対して忌
避応答を媒介することを示した。

【0068】

４．癌種の特定
本発明においては、線虫走性テストにより癌種を特定することが可能となる。従って、
本発明においては、被検者由来の生体関連物質又はその処理物の匂いに対する線虫の反応
を指標として癌種を同定することを特徴とする癌種の同定方法を提供する。

【0069】

癌探知犬の研究から、癌種によって匂いが異なると予想されている。そこで、線虫にお
いて、癌種それぞれの匂いに対する嗅覚受容体を同定し、その受容体を改変した改変体を
作製する。改変体には、受容体遺伝子が欠失した株（欠失変異体）、受容体遺伝子の発現
または機能を阻害した株、受容体遺伝子を高発現または高機能化した株などが挙げられる
。

【0070】

欠失変異体の作製法としては、CRISPR/Cas9法(Friedland et al, Heritable genome ed
iting in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system, Nature Methods, 2013)などが挙げら
れる。また、受容体遺伝子の発現または機能を阻害した株、受容体遺伝子を高発現または
高機能化した改変線虫を作製する。発現又は機能を阻害するには、RNAiを利用した阻害、
アンチセンス核酸を利用した阻害、ドミナントネガティブ型変異遺伝子の発現による阻害
などが挙げられる。受容体遺伝子を高発現または高機能化するには、受容体遺伝子のプロ
モーターをタンデムに連結する方法、エンハンサーを導入する方法、受容体遺伝子を多コ
ピー導入する方法、受容体の匂いやGタンパク質との結合部位に改変を加える方法、受容
体の活性化や局在、匂いとの親和性を制御する部位に改変を加える方法などがある。

【0071】

本発明の同定方法は、例えば以下の工程を含む。
（ａ）まずSTEP 1として、前記本発明の検出方法により癌を検出する。例えば、N2株を
用いて、癌種の有無を検査する。
（ｂ）次に、STEP 2として、各癌種の受容体の変異体や受容体遺伝子の発現、機能を変
化させた株を用いて、癌種を特定する。
前記工程（ａ）において癌であることが検出された試料について、前記同定された嗅覚
受容体を欠失させた変異体線虫や受容体遺伝子の発現、機能を変化させた株を用いて、匂
いに対する反応を検査する。

【0072】

（ｃ）前記改変体線虫と、前記工程（ａ）で使用した線虫との間で匂いに対する反応が異
なるときは、同定された受容体に対応する癌種を、同定の対象癌種であると判定する。
例えば、前記変異体線虫や受容体遺伝子の発現または機能を阻害した線虫のうち匂いに
対する反応を示さなかった線虫において同定された受容体に対応する癌種を、同定の対象
癌種であると判定する。あるいは、受容体遺伝子を高発現または高機能化した線虫のうち
匂いに対する反応が亢進した線虫において同定された受容体に対応する癌種を、同定の対
象癌種であると判定する。
例えば、大腸癌の匂いの受容体変異体が誘引行動を示さない場合、大腸癌であると判断
（診断）できる（図37）。

【0073】

５．キット及びシステム
本発明は、線虫を含む癌の検出用キットを提供する。本発明のキットには線虫が含まれ
るが、本発明の検出方法を実施するために必要な１種以上の成分を含めることができる。
このような成分としては、例えば緩衝液、培養液、アジ化ナトリウム、大腸菌、シャーレ
、寒天などが挙げられる。また本発明のキットは、必要な成分のうちの一部のみを含む部
分的キットであってもよく、その場合には、ユーザーが他の成分を用意することができる
。また、本発明のキットには、検出法又は同定法を説明した使用説明書を含めることがで
きる。
また、本発明は、線虫と、生体関連物質又はその処理物及び前記線虫を収容する収容部
と、前記収容部の線虫の行動を探知する探知部とを備える癌の検出システムを提供する。

【0074】

図１６Ａは、本発明のシステムのブロック図である。図１６Ａにおいて、本発明のシス
テムは生体関連物質又はその処理物及び前記線虫を収容する収容部30と、前記収容部30の
線虫の匂いに対する反応を探知する探知部10と、探知された情報を処理する処理部20とを
有する。さらに、本発明のシステムは、前記処理部20で処理されたデータを保存する保存
部40を備えることができる。保存部40には、癌検出のためのプログラムやデータベースが
備えられている。

【0075】

収容部30は、シャーレ、培養皿、マイクロ流路を有するチップなどが例示されるが、線
虫及び試料を収容できる限り限定されるものではない。
本発明のシステムは、線虫の少なくとも１匹の動画像をリアルタイムで撮影することが
できる少なくとも１つの探知部10を含む。探知部10は線虫の画像、個体数、動きの軌跡等
のデータを取得するデバイスであり、顕微鏡又はカメラ、例えば蛍光顕微鏡、デジタル顕
微鏡、デジタルビデオカメラなどを備える。顕微鏡及びカメラには、線虫の動きを追随で
きる自動追尾（追跡）システムを備えることができ、線虫１匹ごとに又は複数匹を同時に
追跡する。そして、その軌跡から線虫の移動距離を測定する。あるいは、所定のエリアに
集合している線虫を撮影し、個体数を数える。また、顕微鏡及びカメラには、蛍光強度を
検出できるセンサーを備えることもできる。

【0076】

本発明のシステムでは、リアルタイムの画像により線虫の動きを測定することも、静止
画像（写真）を用いて線虫の動きを測定することもできる。リアルタイムで線虫の画像を
撮影すると、線虫の位置を動的に探し求めることが可能である。

【0077】

図１６Ｂは、本発明のシステムの処理部20の構成図である。処理部20は、計算手段110
とデータベース120から構成され、計算手段110は、(i) 検査条件設定手段111、(ii) 線虫
の反応検査手段112、(iii) 癌の判定手段113、及び(iv)検査結果表示手段114を備える。

【0078】

(i) 検査条件設定手段111
検査条件設定手段111は、GUI（Graphical User Interface）により、計算に必要な条件
を、マウスやキーボードから入力するための手段であり、入力された情報は、グラフによ
り確認することができる。

【0079】

検査条件設定手段により、本発明のシステムに、検査目的に応じて所定の条件を記憶さ
せておくことができる。条件として、例えば、線虫の個体数、線虫の特徴、chemotaxis i
ndexの採否、測定時間などがある。
線虫の特徴は、欠失変異体であること、遺伝子発現等を阻害した株であること、測定の
ために蛍光タンパク質をコードする遺伝子（例えばGFP遺伝子、RFP遺伝子等）が導入され
たことなどが含まれる。但し、条件はこれらに限定されるものではなく、検査目的に応じ
て適宜設定することができる。

【0080】

(ii)線虫の反応検査手段112
線虫の反応検査手段112は、検査条件設定手段111又はデータベース120から癌を検出又
は同定するための計算式（例えばchemotaxis index）を選択するとともに、それぞれの計
算式に基づいて、線虫の反応を計算する手段である。この手段では、所定エリア内の線虫
の個体数の測定、1匹の線虫が動いた総距離の測定、１匹の線虫が発する蛍光強度の検出
などを行い、被検サンプルに反応した線虫の行動を記録する。例えば、1匹の線虫に着目
してサンプルに誘引されて移動したときの距離を測定し、各線虫の移動距離を合算して総
和を求める。あるいは、線虫に蛍光タンパク質遺伝子を導入したときは、サンプルに反応
した線虫の蛍光強度を測定する。これも１匹の線虫あたりの蛍光強度を測定して線虫の総
和を求めてもよく、一定のエリアに集まった線虫全体から発する蛍光強度を、エリア単位
で測定することもできる。

【0081】

(iii) 癌の判定手段113
癌の判定手段113は、線虫の匂いに対する反応をもとに癌の有無を検出し、又は癌の種
類を同定する手段である。
検査条件として個体数を採用した場合、対照のエリアに移動した線虫の個体数に対し、
検査対象エリアに移動した線虫の個体の比又は差などを求める。検査条件として移動距離
を採用した場合、対照の線虫の移動距離と比較して何%多ければ反応したか、その差又は
比を求めることができる。予めこの差又は比の一定値を境界値として設定しておけば、こ
の境界値は癌の判定の判断基準として使用される。また、検査条件として蛍光強度を採用
した場合は、対照の線虫の蛍光強度と比較して何%多ければ反応したといえるか等、上記
移動距離と同様に境界値を設定することができる。
測定されたデータと、境界値と、サンプル情報（癌種の情報等）とを対比して、所定の
癌であるかどうかを判定する。

【0082】

(iv)判定結果出力手段114
判定結果出力手段114は、検出又は同定された癌種又は癌の有無に基づいてその情報を
出力する手段であり、癌種及びその確率（リスク）を表示する。表示はグラフでも表でも
よい。上記(ii)により計算された線虫の行動のアニメーションを表示することもできる。

【0083】

(v) データ蓄積手段
入力された検査条件と検査結果は、関連付けられてデータ蓄積手段としてデータベース
120に保存される。
保存された検査条件と計算結果は、再度データベース120から、あるいは検査条件設定
手段111と判定結果表示手段114から読み込むことができる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に
限定されるものではない。

【実施例0084】

癌の検出
(i) 線虫の飼育
野生型線虫N2 の成虫を6cm シャーレ（大腸菌をまいたNGM 培地）に5～6 匹置き、4日
間、20℃で培養した。次の世代の線虫を300～500 匹程度、成虫まで育てた。

【0085】

(ii) 走性解析
9cm シャーレに図2 に示すフォーマットを作成し、4 点にアジ化ナトリウム（NaN₃）を
0.5μl ずつ置いた。
線虫飼育プレートにwash buffer 1ml をかけ、浮いてきた線虫をbuffer ごとチューブ
に回収した。しばらく置いておくと線虫が下に沈むので、沈んだところで上清を廃棄した
。さらにチューブにwash buffer 1ml を入れ、線虫が下に沈んだところで上清を廃棄した
。この洗浄を3 回繰り返し、大腸菌を除去した。

【0086】

9cm シャーレの「＋」のところに、滅菌水により10 倍に薄めた尿サンプルを1μl ずつ
置いた。
次に、シャーレの中心に線虫を100 匹程度置き、 1 時間線虫を飼育した（泳がせた）
。室温は23℃±1℃で行った。
1 時間後、＋側の個体数、－側の個体数を数え、chemotaxis index を計算した。
1 検体あたり、5 回解析を行い、5 回分のchemotaxis index の値の平均値を計算した
。

【0087】

(iii) 結果
結果を図１に示す。図１より、健常者由来の対照の尿（c1～c10）はすべて負（－）のc
hemotaxis index（忌避反応）を示したのに対し、癌患者由来の尿（p1～p20）はすべて正
（＋）のchemotaxis index（誘引）を示し、100％の精度で癌を検出することができた。
なお、図１においてエラーバーはSEMを表す。

【実施例0088】

カルシウムイメージング
マイクロ流路を用いたイメージング実験においては、尿サンプルは薄いチューブ中に流
す必要があることから、尿中の沈殿物及び固形物を遠心及びろ過により除去した (pore s
ize 0.22 μm, MillexGP, Merck Millipore)。 AWC及びAWAニューロンをモニターするた
め、それぞれodr-1及びodr-10プロモーターによりYellow Cameleon遺伝子（YC3.60）を神
経細胞に発現させた。カルシウムイメージングは、公知方法で行った（Uozumi, T. et al
. Temporally-regulated quick activation and inactivation of Ras is important for
olfactory behaviour. Sci Rep 2, 500 (2012); Shinkai, Y. et al. Behavioral choic
e between conflicting alternatives is regulated by a receptor guanylyl cyclase,
GCY-28, and a receptor tyrosine kinase, SCD-2, in AIA interneurons of Caenorhabd
itis elegans. J Neurosci 31, 3007-3015 (2011))。

【0089】

線虫の頭部をマイクロチャンネルの外に出すことができるように、線虫をマイクロチャ
ンネルに固定した（図５）。対照の尿及び癌患者由来の尿のそれぞれについて、同一の線
虫を用いて反応を試験した。
YC3.60の蛍光画像は、Leica DMI3000B顕微鏡（40倍対物レンズ）及びORCA-D2 デジタル
カメラ(Hamamatsu) を用いて取得した。すべての画像は、露光時間200msで取得した。AWC
又はAWA神経のCFP及びYFPの蛍光強度を取得し、CFP の蛍光強度に対するYFPの蛍光強度の
比について、Metamorphソフトウエア(Molecular devices)により解析した。この蛍光強度
比は、YFP強度/CFP強度 (= R)として計算し、10-sウインドウの比の平均 (-10-0 s)をR0
としてセットした。

【0090】

癌患者由来の尿に対し、線虫のAWC及びAWA嗅覚神経の反応を試験した結果を図７、８に
示す。
図７において、左2つのパネルは対照尿、右2つのパネルは胃癌患者由来の尿を用いて試
験した結果である。図７はAWC嗅覚神経の尿刺激（尿あり→なし）に対するカルシウム濃
度変化（Yellow CameleonのYFP/CFP ratio変化）を示す図である。健常者の尿（対照）と
比較して、癌患者の尿に対して有意に強く反応した。図８は平均の蛍光強度比（YFP/CFP
ratio）の変化量を表す。＊＊＊はp<0.001で有意であることを示す。
なお、本実施例において尿中の沈殿物及び固形物は遠心分離及びろ過により除去したが
、この処理によって線虫の化学走性には影響しなかった（図９）。
AWA嗅覚神経についても、尿の添加により応答が観察された（図１０、１１）。

【0091】

これらの結果は、対照の尿と癌患者由来の尿とを識別するために線虫の嗅覚神経が重要
な役割を果たしていることを示すものであり、図７～１１より、線虫の嗅覚神経を利用し
て癌を検出できることを示すものである。なお、図８、９及び１１において、エラーバー
はSEMを表す。