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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024140077
(43)【公開日】2024-10-10
(54)【発明の名称】抗ムンプスウイルス剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/351 20060101AFI20241003BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20241003BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241003BHJP
A61K 31/381 20060101ALI20241003BHJP
A23L 33/10 20160101ALI20241003BHJP
【ＦＩ】
A61K31/351
A61P31/14
A61P43/00 111
A61K31/381
A23L33/10
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023051070
(22)【出願日】2023-03-28
(71)【出願人】
【識別番号】507219686
【氏名又は名称】静岡県公立大学法人
(71)【出願人】
【識別番号】503420833
【氏名又は名称】学校法人常翔学園
(74)【代理人】
【識別番号】100205914
【弁理士】
【氏名又は名称】堀越 総明
(74)【代理人】
【識別番号】100162189
【弁理士】
【氏名又は名称】堀越 真弓
(72)【発明者】
【氏名】高橋 忠伸
(72)【発明者】
【氏名】紅林 佑希
(72)【発明者】
【氏名】竹内 英之
(72)【発明者】
【氏名】大坪 忠宗
(72)【発明者】
【氏名】池田 潔
【テーマコード（参考）】
4B018
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B018LB10
4B018MD08
4B018MD18
4B018ME14
4B018MF06
4B018MF14
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA07
4C086BB02
4C086GA03
4C086GA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA52
4C086NA14
4C086ZB33
4C086ZC20
(57)【要約】
【課題】ムンプスウイルスに直接作用して抗ウイルス効果を示し、ムンプスウイルス感染症の予防・治療剤等に用いることのできる抗ウイルス剤を提供する。
【解決手段】本発明のムンプスウイルスに対する抗ウイルス剤は、下記の一般式（Ｉ）で表されるシアル酸誘導体若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する。
［式（Ｉ）中、Ｒ１は、エチル基、エチルニトリル基、ブチルニトリル基、アジドブチル基、アジドペンチル基又はブロモブチル基を示す。］
【選択図】なし
【解決手段】本発明のムンプスウイルスに対する抗ウイルス剤は、下記の一般式（Ｉ）で表されるシアル酸誘導体若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の一般式（Ｉ）で表されるシアル酸誘導体若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有するムンプスウイルスに対する抗ウイルス剤。
［式（Ｉ）中、Ｒ１は、エチル基、エチルニトリル基、ブチルニトリル基、アジドブチル基、アジドペンチル基又はブロモブチル基を示す。］
【化1】
【請求項2】
前記式（Ｉ）中、前記Ｒ１が、エチル基、エチルニトリル基又はアジドペンチル基であることを特徴とする請求項１に記載のムンプスウイルスに対する抗ウイルス剤。
【請求項3】
以下の一般式（Ｉ）で表されるシアル酸誘導体若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有するムンプスウイルス感染症の予防・治療剤。
［式（Ｉ）中、Ｒ１は、エチル基、エチルニトリル基、ブチルニトリル基、アジドブチル基、アジドペンチル基又はブロモブチル基を示す。］
【化2】
【請求項4】
前記式（Ｉ）中、前記Ｒ１が、エチル基、エチルニトリル基又はアジドペンチル基であることを特徴とする請求項３に記載のムンプスウイルス感染症の予防・治療剤。
【請求項5】
以下の一般式（Ｉ）で表されるシアル酸誘導体若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有するムンプスウイルス感染症の予防・改善用食品。
［式（Ｉ）中、Ｒ１は、エチル基、エチルニトリル基、ブチルニトリル基、アジドブチル基、アジドペンチル基又はブロモブチル基を示す。］
【化3】
【請求項6】
前記式（Ｉ）中、前記Ｒ１が、エチル基、エチルニトリル基又はアジドペンチル基であることを特徴とする請求項５に記載のムンプスウイルス感染症の予防・改善用食品。
【請求項7】
以下の一般式（Ｉ）で表されるシアル酸誘導体若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有するムンプスウイルスのシアリダーゼ阻害剤。
［式（Ｉ）中、Ｒ１は、エチル基、エチルニトリル基、ブチルニトリル基、アジドブチル基、アジドペンチル基又はブロモブチル基を示す。］
【化4】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ムンプスウイルス（Ｍｕｍｐｓ ｖｉｒｕｓ；おたふくかぜウイルス）に対する抗ウイルス剤に関する。
【背景技術】
【0002】
「おたふくかぜ」と呼ばれる流行性耳下腺炎は、日本国内だけで毎年平均１００万人に感染する小児を中心とするウイルス性疾患である。原因ウイルスは、パラミクソウイルス科のムンプスウイルス（ＭｕＶ）である。ムンプスウイルスの主な病症は、耳下腺の腫脹と疼痛、発熱であるが、下記表１に示すように、無菌性髄膜炎（発生頻度１０％）や脳炎・脊髄炎（発生頻度０．０２％）、膵炎、睾丸炎、ムンプス難聴等を合併する場合がある（非特許文献１参照）。青年期にムンプスウイルスに感染すると、睾丸炎や卵巣炎を合併することがあり「不妊」の原因となる。そして、このウイルスに特筆すべき後遺症は「ムンプス難聴」と呼ばれる回復の見込めない永続的な難聴であり、重篤な後遺症である。これらムンプス難聴や不妊などの重篤な後遺症は、ムンプスウイルスが神経組織や内分泌腺に直接侵襲したことに起因する。
【0003】
【表1】
【0004】
現状では、ムンプスウイルスに直接作用する治療薬は無いため、ワクチン接種による予防が現在取り得る最も有効な対処法である。しかしながら、日本では、ムンプスウイルスワクチンは任意接種で自己負担のため、接種率は３０～４０％程度と低い。それゆえ、ムンプスウイルスの国内流行を制御することは現状で困難であり、４～５年ごとの全国流行を繰り返している（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】“ムンプスウイルス病原体検査マニュアル”、[online]、国立感染症研究所 ウェブサイト、［２０２３年３月２４日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：https://www.niid.go.jp/niid/images/lab-manual/Mumps2015.pdf
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
このように、ワクチンの定期予防接種が導入されておらず、ワクチン接種率が低い現状においては、ワクチン以外の方法で、ムンプスウイルス感染による合併症や後遺症の発症を防ぐことが求められている。さらに、学校等における集団流行の発生時にワクチンを接種しても即時的な感染予防効果は期待できないという問題があった。
【0007】
したがって、本発明は上述した点に鑑みてなされたもので、その目的は、ムンプスウイルスに直接作用して抗ウイルス作用を示し、ムンプスウイルス感染症の予防・治療剤等に用いることのできる抗ウイルス剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、ウイルスの増殖に必須である酵素シアリダーゼの阻害剤について研究を行っていた際に、ムンプスウイルスのシアリダーゼ活性を特異的に阻害する化合物を見出した。この知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【0009】
上記課題を解決するため、本発明のムンプスウイルスに対する抗ウイルス剤は、以下の一般式（Ｉ）で表されるシアル酸誘導体若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有し、式（Ｉ）中、Ｒ１は、エチル基、エチルニトリル基、ブチルニトリル基、アジドブチル基、アジドペンチル基又はブロモブチル基を示している。
【0010】
【化1】
【0011】
上述の化合物により、ムンプスウイルスに直接作用する、ムンプスウイルスに対する抗ウイルス剤を得ることができる。これにより、ムンプスウイルス感染症を予防・治療又は改善等するための医薬や食品、ムンプスウイルスに関する研究開発試薬等に活用することができる。
【0012】
また、本発明のムンプスウイルスに対する抗ウイルス剤は、上述した式（Ｉ）中のＲ１が、エチル基、エチルニトリル基又はアジドペンチル基であることも好ましい。これにより、ムンプスウイルスに対する抗ウイルス剤として、抗ウイルス効果に優れる化合物が選択される。
【0013】
また、本発明のムンプスウイルス感染症の予防・治療剤は、上述した式（Ｉ）で表されるシアル酸誘導体若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有し、式（Ｉ）中、Ｒ１は、エチル基、エチルニトリル基、ブチルニトリル基、アジドブチル基、アジドペンチル基又はブロモブチル基を示している。これにより、ムンプスウイルス感染症の予防・治療剤として好適な化合物が選択され、ムンプスウイルス感染に伴う疾患や症状を改善、治療又は予防するための医薬にこれらの化合物を用いることができる。
【0014】
また、本発明のムンプスウイルス感染症の予防・治療剤は、上述した式（Ｉ）中のＲ１が、エチル基、エチルニトリル基又はアジドペンチル基であることも好ましい。これにより、ムンプスウイルス感染症の予防・治療剤として、より効果に優れる化合物が選択される。
【0015】
また、本発明のムンプスウイルス感染症の予防・改善用食品は、上述した式（Ｉ）で表されるシアル酸誘導体若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有し、式（Ｉ）中、Ｒ１は、エチル基、エチルニトリル基、ブチルニトリル基、アジドブチル基、アジドペンチル基又はブロモブチル基を示している。これにより、ムンプスウイルス感染症の予防・改善用食品として好適な化合物が選択され、ムンプスウイルス感染に伴う疾患や症状を改善、治療又は予防するための食品にこれらの化合物を用いることができる。
【0016】
また、本発明のムンプスウイルス感染症の予防・改善用食品は、上述した式（Ｉ）中のＲ１が、エチル基、エチルニトリル基又はアジドペンチル基であることも好ましい。これにより、ムンプスウイルス感染症の予防・改善用食品として、より効果に優れる化合物が選択される。
【0017】
また、本発明のムンプスウイルスのシアリダーゼ阻害剤は、上述した式（Ｉ）で表されるシアル酸誘導体若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有し、式（Ｉ）中、Ｒ１は、エチル基、エチルニトリル基、ブチルニトリル基、アジドブチル基、アジドペンチル基又はブロモブチル基を示している。上述の化合物を用いることにより、ムンプスウイルスのシアリダーゼ活性を特異的に阻害することができる。
【発明の効果】
【0018】
本発明によれば、以下のような優れた効果を有する抗ウイルス剤、ムンプスウイルス感染症の予防・治療剤及びムンプスウイルスのシアリダーゼ阻害剤を提供することができる。
（１）ムンプスウイルス感染に伴う病態、症状又は疾患を予防、改善又は治療することができる。
（２）ムンプスウイルスに直接作用するため、投与後すぐに予防効果を期待でき、周囲への流行拡大を防ぐ即効性の高い予防薬としても利用できる。
（３）ムンプスウイルスのシアリダーゼ活性を特異的に阻害することができる。
（１）ムンプスウイルス感染に伴う病態、症状又は疾患を予防、改善又は治療することができる。
（２）ムンプスウイルスに直接作用するため、投与後すぐに予防効果を期待でき、周囲への流行拡大を防ぐ即効性の高い予防薬としても利用できる。
（３）ムンプスウイルスのシアリダーゼ活性を特異的に阻害することができる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】実施例１における、（ａ）ムンプスウイルスのシアリダーゼ活性を阻害する化合物のスクリーニング結果を示すグラフ及び（ｂ）化合物ａ（○）、化合物ｂ（▲）、化合物ｄ（□）及び化合物ｉ（●）の各濃度におけるムンプスウイルスのシアリダーゼ活性阻害効果を示すグラフである。
【図2】実施例２における、化合物ａ、ｂ、ｄ及びｉのムンプスウイルスに対する増殖阻害試験結果を示すグラフである。
【図3】実施例４における、化合物ａ、ｂ、ｄ及びｉのムンプスウイルスに対する感染阻害試験結果を示すグラフである。
【図4】実施例５における、異なるウイルス種のシアリダーゼに対する、化合物ａ、ｂ、ｄ及びｉのシアリダーゼ活性阻害効果を示すグラフである。
【図5】実施例６における、化合物ａ、ｂ、ｄ及びｉの細胞毒性試験結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0020】
以下、本発明の抗ウイルス阻害剤、ムンプスウイルス感染症の予防・治療剤、ムンプスウイルス感染症の予防・改善用食品及びムンプスウイルスのシアリダーゼ阻害剤について詳細に説明する。
【0021】
明細書において、ムンプスウイルス（Ｍｕｍｐｓ ｖｉｒｕｓ；ＭｕＶ）とは、流行性耳下腺炎（おたふくかぜ）の原因となるウイルスである。ムンプスウイルスはパラミクソウイルス科パラミクソウイルス亜科ルブラウイルス属に分類されるウイルスで、表面にエンベロープを有する一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルスである。大きさは１００～６００ｎｍで、主に６つの構造タンパクを有している。エンベロープには２つの糖タンパク（hemagglutinin‐neuraminidase glycoprotein及びfusion glycoprotein）を有している。ムンプスウイルスはその遺伝子型によって１２群に分類され、ムンプスウイルス流行の動態把握が行われている。
【0022】
本発明におけるムンプスウイルスに対する抗ウイルス剤とは、ムンプスウイルスに対する抗ウイルス作用を示すことをいい、抗ウイルス作用には、ウイルスに感染した宿主細胞におけるウイルスの複製又は宿主細胞からの放出を阻害して、周囲の細胞や他の細胞への感染を抑制するウイルス増殖阻害作用、及びウイルスが細胞に吸着又は侵入して感染することを阻害するウイルス感染阻害作用が含まれる。また、抗ウイルス作用は、一例として、後述する実施例２～４に記載されたように、ウイルスを感染させた宿主細胞を含む培養上清のウイルス感染価を測定することや、ウイルスに感染した宿主細胞の数をフォーカス形成法等で測定することが可能である。
【0023】
また、本発明におけるムンプスウイルスのシアリダーゼ阻害剤とは、ムンプスウイルスのシアリダーゼの活性を抑制・阻害することをいい、本発明のシアリダーゼ阻害剤を添加又は投与されない状態のコントロールと比較して、シアリダーゼ活性が低下・抑制されていることを意味する。さらに、本発明におけるムンプスウイルスのシアリダーゼ阻害剤は、ムンプスウイルスのシアリダーゼ活性を特異的に阻害する機能を有することが好ましい。
【0024】
本発明の抗ウイルス阻害剤、ムンプスウイルス感染症の予防・治療剤、ムンプスウイルス感染症の予防・改善用食品及びムンプスウイルスのシアリダーゼ阻害剤には、以下式（Ｉ）で表されるシアル酸誘導体が含まれる。本発明に係るシアル酸誘導体に係る化合物は塩であってもよく、薬理学的に許容される塩であることが好ましい。この化合物の薬理学的に許容される塩としては、酸又は塩基と形成される塩であればよく、特に限定されない。また、この化合物又はその塩は、溶媒和物であってもよく、特に限定されないが、例えば、水和物、エタノール等の有機溶媒和物が挙げられる。
【0025】
【化2】
【0026】
上述した化合物を表す式（Ｉ）中、Ｒ１で示される原子又は分子としては、エチル基、エチルニトリル基、ブチルニトリル基、アジドブチル基、アジドペンチル基又はブロモブチル基が挙げられる。また、上述の式（Ｉ）で表される化合物は、具体的には、以下式に示される化合物（１）～（６）である。各式の化合物名は次の通りである。
・式（１）：２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－エトキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸、
・式（２）：２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－シアノエトキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸、
・式（３）：２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－アジドペンチルオキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸。
・式（４）：２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－シアノブトキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸、
・式（５）：２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－アジドブチルオキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸、
・式（６）：２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－ブロモブチルオキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸。
・式（１）：２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－エトキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸、
・式（２）：２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－シアノエトキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸、
・式（３）：２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－アジドペンチルオキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸。
・式（４）：２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－シアノブトキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸、
・式（５）：２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－アジドブチルオキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸、
・式（６）：２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－ブロモブチルオキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸。
【0027】
【化3】
【0028】
【化4】
【0029】
【化5】
【0030】
【化6】
【0031】
【化7】
【0032】
【化8】
【0033】
また、各式で表わされる化合物のうち、特にシアリダーゼ阻害作用の点から好ましい化合物としては、式（１）に示す２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－エトキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸、式（２）に示す２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－シアノエトキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸、式（３）に示す２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－アジドペンチルオキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸及び式（６）に示す２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－ブロモブチルオキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸が好ましく、式（１）に示す２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－エトキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸、及び式（６）に示す２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－ブロモブチルオキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸が特に好ましい。
【0034】
また、各式で表わされる化合物のうち、特に抗ウイルス作用の点から好ましい化合物としては、式（１）に示す２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－エトキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸、式（２）に示す２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－シアノエトキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸、及び式（３）に示す２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－アジドペンチルオキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸が好ましく、ムンプスウイルスの増殖阻害効果及び感染阻害効果を有する観点から、式（１）に示す２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－エトキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸、及び式（３）に示す２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－アジドペンチルオキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸がより好ましく、式（３）に示す２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－アジドペンチルオキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸が特に好ましい。
【0035】
上述した式（Ｉ）に示す化合物は、シアル酸誘導体の合成法に係る公知の合成方法で製造することができる。
【0036】
式（１）に示す化合物、２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－エトキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸は、以下式に示すように、本発明者らにより開示された方法（Bioorganic Medicinal Chemistry, Vol.14, pp.7893-7897, 2006年）により合成することができる。一例として、メチル５－アセタミド－８，９－Ｏ－イソプロピリデン－２，３，５－トリ－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－ノン－２－エノピラノソネートの４位の水酸基をエチル基で保護して以下式に示す化合物Ｘを得る。化合物Ｘを８０％酢酸に溶かして反応させ、以下式に示す化合物Ｙを得た後、ＮａＯＨ水溶液を加えて反応させることで、式（１）に示す化合物を得ることができる。
【0037】
【化9】
【0038】
また、一例として、式（２）に示す化合物、２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－シアノエトキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸は、以下式に示すように合成することができる。特に限定されないが、具体的には、メチル５－アセタミド－８，９－Ｏ－イソプロピリデン－２，３，５－トリ－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－ノン－２－エノピラノソネートとアクリロニトリルをアセトニトリルに溶かし、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）を加えて反応させて以下式に示す化合物Ｘを得る。化合物Ｘを８０％酢酸に溶かして反応させ、以下式に示す化合物Ｙを得た後、化合物ＹをＫＰＢ緩衝液に溶かし、カルボキシルエステラーゼ（ＰＬＥ）を加えて反応させることにより、式（２）に示す化合物を得ることができる。
【0039】
【化10】
【0040】
また、一例として、式（３）に示す化合物、２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－アジドペンチルオキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸は、以下式に示すように合成することができる。特に限定されないが、例えば、メチル５－アセタミド－８，９－Ｏ－イソプロピリデン－２，３，５－トリ－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－ノン－２－エノピラノソネートをＤＭＦに溶かし、Ａｒ置換した後、１，５－ジブロモペンタンとＮａＨを加えて反応させて以下式に示す化合物Ｘを得る。化合物ＸをＤＭＦに溶かしＡｒ置換した後、ＮａＮ３を加えて反応させ、以下式に示す化合物Ｙを得る。化合物Ｙを８０％酢酸に溶かして反応させ、ＮａＯＨ水溶液を加えて反応させることで、式（３）に示す化合物を得ることができる。
【0041】
【化11】
【0042】
また、一例として、式（４）に示す化合物、２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－シアノブトキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸は、以下式に示すように合成することができる。特に限定されないが、例えば、メチル５－アセタミド－８，９－Ｏ－イソプロピリデン－２，３，５－トリ－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－ノン－２－エノピラノソネートをＤＭＦに溶かし、Ａｒ置換し、４－ブロモブチルシアニドとＮａＨを加えて反応させて以下式に示す化合物Ｘを得る。化合物Ｘを８０％酢酸に溶かして反応させ、以下式に示す化合物Ｙを得た後、ＮａＯＨ水溶液を加えて反応させることで、式（４）に示す化合物を得ることができる。
【0043】
【化12】
【0044】
また、一例として、式（５）に示す化合物、２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－アジドブチルオキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸は、以下式に示すように合成することができる。特に限定されないが、例えば、メチル５－アセタミド－８，９－Ｏ－イソプロピリデン－２，３，５－トリ－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－ノン－２－エノピラノソネートをＤＭＦに溶かし、Ａｒ置換した後、１，４－ジブロモブタンと１５－クラウン－５－エーテルを加え、さらにＮａＨを加えて反応させ、以下式に示す化合物Ｘを得る。化合物ＸをＤＭＦに溶かし、Ａｒ置換した後、ＮａＮ３を加えて反応させ、以下式に示す化合物Ｙを得た後、８０％酢酸に溶かして反応させ、その後、ＮａＯＨ水溶液を加えて反応させることで、式（５）に示す化合物を得ることができる。
【0045】
【化13】
【0046】
また、一例として、式（６）に示す化合物、２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－４－ブロモブチルオキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸は、以下式に示すように合成することができる。特に限定されないが、例えば、メチル５－アセタミド－８，９－Ｏ－イソプロピリデン－２，３，５－トリ－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－ノン－２－エノピラノソネートをＤＭＦに溶かし、Ａｒ置換した後、１，４－ジブロモブタンと１５－クラウン－５－エーテルを加え、さらにＮａＨを加えて反応させ、以下式に示す化合物Ｘを得る。化合物Ｘを８０％酢酸に溶かして反応させ、以下式に示す化合物Ｙを得た後、ＮａＯＨ水溶液を加えて反応させることで、式（６）に示す化合物を得ることができる。
【0047】
【化14】
【0048】
本発明のムンプスウイルスに対する抗ウイルス剤は、上述した式（Ｉ）で表されるシアル酸誘導体を含むものであって、ムンプスウイルスに対する増殖阻害作用及び感染阻害作用を有する。そのため、上述した式（Ｉ）で表される化合物は、ムンプスウイルスの抗ウイルス剤、ムンプスウイルス感染症の予防・治療剤及びムンプスウイルス感染症の予防・改善用食品として、用いることができる。
【0049】
ここで、本明細書において、ムンプスウイルス感染症とは、ムンプスウイルスに感染することによって発症する流行性耳下腺炎（おたふくかぜ）をいう。ムンプスウイルス感染による典型的な症状としては、片側あるいは両側の唾液腺の腫脹・圧痛、嚥下痛、発熱等がみられるが、これらに限定されない。また、感染しても症状が現れない不顕性感染も多く存在するため、無症状も含まれる。また、ムンプスウイルス感染症の症状には、ムンプスウイルス感染による合併症及び後遺症も含まれる。具体的には、無菌性髄膜炎、脳炎、ムンプス難聴、精巣炎、卵巣炎及び膵炎等が挙げられ、これらに限定されない。すなわち、本発明のムンプスウイルス感染症の予防・治療剤及びムンプスウイルス感染症の予防・改善用食品は、ムンプスウイルス感染による典型的な耳下腺炎の症状のほか、種々の合併症及び後遺症の予防・治療・改善に用いられるものである。
【0050】
本発明のムンプスウイルスに対する抗ウイルス剤は、上述した式（Ｉ）で表される化合物を単独で含むものであっても、上述した式（Ｉ）で表される化合物を含む組成物であってもよい。また、本発明のムンプスウイルスに対する抗ウイルス剤、ムンプスウイルス感染症の予防・治療剤及びムンプスウイルス感染症の予防・改善用食品は、ヒト又は非ヒトのための医薬品、医薬部外品及び食品として用いることができる。
【0051】
本発明に係る抗ウイルス剤、ムンプスウイルス感染症の予防・治療剤を医薬品又は医薬部外品として用いる場合には、従来慣用されている方法により種々の形態に調製することができる。この場合、通常製剤用の薬理学的に許容される担体や賦形剤、滑沢剤、分散剤、崩壊剤、緩衝剤、溶剤、増量剤、保存剤、香料又は安定化剤など、医薬品等の添加剤として許容されている添加剤を用いて製剤化することができる。さらに、この化合物のバイオアベイラビリティーや安定性を向上させるために、マイクロカプセル、リポソーム製剤、微粉末化又はシクロデキストリン等を用いた包接化などの製剤技術を含むドラッグデリバリーシステムを用いることもできる。また、医薬品又は医薬部外品として用いる際には、本発明の有効成分の効能に影響を与えない範囲において、抗炎症剤、解熱鎮痛剤などの他の薬効成分や、ビタミン等の成分を種々組み合わせることも可能である。
【0052】
本発明に係る抗ウイルス剤、ムンプスウイルス感染症の予防・治療剤を経口投与製剤として用いる場合には、吸入剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤又は内服用液剤等の形態で用いることができる。また、流通性、保存性などの理由により所望される形態での製剤を提供する場合にも従来の製剤技術を用いることができる。また、外用剤等の非経口投与剤として用いる場合には、クリーム、軟膏、貼付剤などの経皮吸収剤のほか、注射剤および坐剤等の形態とすることができる。また、流通性や保存性などの理由から固形製剤を使用時に適当な溶剤で溶解してから用いることもでき、液剤および半固形剤の形態で提供することも従来の製剤技術により可能である。本発明の抗ウイルス剤、ムンプスウイルス感染症の予防・治療剤の投与量又は有効摂取量は、目標とする治療効果、投与方法、投与対象及び剤形によって異なるが、一例として、上述した式（Ｉ）で表される化合物として、通常一日０．１ｍｇ～２０００ｍｇ（６０ｋｇ体重）とすることが好ましく、１ｍｇ～１０００ｍｇ（６０ｋｇ体重）とすることがより好ましい。
【0053】
さらに、本発明に係るムンプスウイルス感染症の予防・改善用食品は、錠剤やカプセル剤、顆粒剤、シロップ剤などのサプリメント形態、清涼飲料、果汁飲料、アルコール飲料などの飲料、アメやガム、クッキー、ビスケット、チョコレート等の菓子、パン、粥、シリアル、麺類、ゼリー、スープ、乳製品、調味料等のあらゆる形態とすることができる。このように飲食品として用いる際には、本発明の有効成分の効能に影響を与えない範囲において、他の有効成分や、ビタミン、ミネラル若しくはアミノ酸等の栄養素等を種々組み合わせることも可能である。本発明の飲食品には、サプリメント、健康食品、機能性食品、機能性表示食品、特定保健用食品等が含まれる。また、本発明の飲食品の１日あたりの摂取量は、上述した式（Ｉ）で表される化合物として、通常一日０．１ｍｇ～２０００ｍｇ（６０ｋｇ体重）とすることが好ましく、１ｍｇ～１０００ｍｇ（６０ｋｇ体重）とすることがより好ましい。
【0054】
また、本発明のムンプスウイルスのシアリダーゼ阻害剤は、上述した式（Ｉ）で表されるシアル酸誘導体を含むものであって、ムンプスウイルスのシアリダーゼ活性を特異的に阻害する阻害剤として用いることができる。そのため、本発明のシアリダーゼ阻害剤は、ムンプスウイルス感染症に対する医薬等の開発やムンプスウイルスを用いる研究の際に、研究用試薬として用いることができる。本発明に係るシアリダーゼ阻害剤の使用濃度としては、適用する細胞、ムンプスウイルスシアリダーゼの発現量、環境中に存在する又は添加される成分の影響や目標とする阻害効果に応じて適宜調整可能であるが、一例として、０．１μＭ～１０００μＭ程度とすることが好ましく、０．５μＭ～１００μＭ程度とすることがより好ましく、１μＭ～１０μＭ程度とすることが特に好ましい。
【0055】
次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例によってなんら限定されるものではない。
【実施例0056】
［実施例１］
１．ムンプスウイルスのシアリダーゼ活性を阻害する化合物のスクリーニング
本実施例では、ムンプスウイルスのシアリダーゼ活性を阻害する化合物の探索を行った。スクリーニング対象には、公知のシアリダーゼ阻害剤であるＺａｎａｍｉｖｉｒの他、２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（以下、ＤＡＮＡとも称する）及びその誘導体を中心に、約５０種類のシアル酸誘導体を選択した。スクリーニング対象としたシアル酸誘導体の一部の化合物を以下表２に示す。化合物ａの２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＤＡＮＡ）及び化合物ｏのＺａｎａｍｉｖｉｒ（４－グアニジノ－２，４－ジデオキシ－２，３－ジデヒドロ－Ｎ－アセチルノイラミン酸）は、シグマ－アルドリッチ社製品及びトロント・リサーチ・ケミカルズ社製品を用いた。また、以下表２に示すｂ～ｎに示す化合物は、次のようにして合成した。
１．ムンプスウイルスのシアリダーゼ活性を阻害する化合物のスクリーニング
本実施例では、ムンプスウイルスのシアリダーゼ活性を阻害する化合物の探索を行った。スクリーニング対象には、公知のシアリダーゼ阻害剤であるＺａｎａｍｉｖｉｒの他、２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（以下、ＤＡＮＡとも称する）及びその誘導体を中心に、約５０種類のシアル酸誘導体を選択した。スクリーニング対象としたシアル酸誘導体の一部の化合物を以下表２に示す。化合物ａの２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＤＡＮＡ）及び化合物ｏのＺａｎａｍｉｖｉｒ（４－グアニジノ－２，４－ジデオキシ－２，３－ジデヒドロ－Ｎ－アセチルノイラミン酸）は、シグマ－アルドリッチ社製品及びトロント・リサーチ・ケミカルズ社製品を用いた。また、以下表２に示すｂ～ｎに示す化合物は、次のようにして合成した。
【0057】
【表2】
【0058】
［化合物ｂ（ＫＳ－２－８９）の合成］
化合物ｂは、メチル５－アセタミド－８，９－Ｏ－イソプロピリデン－２，３，５－トリ－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－ノン－２－エノピラノソネートの４位の水酸基をエチル基で保護したのち、８０％酢酸でイソプロピリデン基を脱保護し、塩基性条件下、メチルエステルを加水分解することで合成した。
化合物ｂは、メチル５－アセタミド－８，９－Ｏ－イソプロピリデン－２，３，５－トリ－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－ノン－２－エノピラノソネートの４位の水酸基をエチル基で保護したのち、８０％酢酸でイソプロピリデン基を脱保護し、塩基性条件下、メチルエステルを加水分解することで合成した。
【0059】
［化合物ｃ（ＫＳ－２－８８）の合成］
化合物ｃは、メチル５－アセタミド－８，９－Ｏ－イソプロピリデン－２，３，５－トリ－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－ノン－２－エノピラノソネートの４位の水酸基をｎ－プロピル基で保護したのち、８０％酢酸でイソプロピリデン基を脱保護し、塩基性条件下、メチルエステルを加水分解することで合成した（参考文献：Bioorganic Medicinal Chemistry, Vol.14, pp.7893-7897, 2006年）。
化合物ｃは、メチル５－アセタミド－８，９－Ｏ－イソプロピリデン－２，３，５－トリ－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－ノン－２－エノピラノソネートの４位の水酸基をｎ－プロピル基で保護したのち、８０％酢酸でイソプロピリデン基を脱保護し、塩基性条件下、メチルエステルを加水分解することで合成した（参考文献：Bioorganic Medicinal Chemistry, Vol.14, pp.7893-7897, 2006年）。
【0060】
［化合物ｄ（４８－１６）の合成］
化合物ｄは、次のようにして合成した。メチル５－アセタミド－８，９－Ｏ－イソプロピリデン－２，３，５－トリ－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－ノン－２－エノピラノソネート（８７ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）とアクリロニトリル（１３３ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２ｍＬ）に溶かし、氷冷下ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ、３８ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を加えた。反応終了後、減圧濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；１０％ＣＨＣｌ３－ＭｅＯＨ）で分離し、化合物Ｘ（４０ｍｇ、４０％）を得た。この化合物Ｘ（４０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を８０％酢酸（２ｍＬ）に溶かした。その後、８０℃の油浴で１時間攪拌し、反応終了後、減圧濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝６５：３５：５）で分離し、化合物Ｙ（３３ｍｇ，９２％）を得た。この化合物Ｙ（１２ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）を０．０１ＭのＫＰＢ緩衝液（２ｍＬ）に溶かし、カルボキシルエステラーゼ（ＰＬＥ、シグマアルドリッチ社製品、１３ｍｇ）を加え、３５℃で一晩撹拌した。濾過後、ろ液を減圧濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ＡｃＯＥｔ→２％ＡｃＯＥｔ－ＭｅＯＨ）で分離して化合物ｄ（２６ｍｇ、２６％）を得た。
化合物ｄは、次のようにして合成した。メチル５－アセタミド－８，９－Ｏ－イソプロピリデン－２，３，５－トリ－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－ノン－２－エノピラノソネート（８７ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）とアクリロニトリル（１３３ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２ｍＬ）に溶かし、氷冷下ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ、３８ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を加えた。反応終了後、減圧濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；１０％ＣＨＣｌ３－ＭｅＯＨ）で分離し、化合物Ｘ（４０ｍｇ、４０％）を得た。この化合物Ｘ（４０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を８０％酢酸（２ｍＬ）に溶かした。その後、８０℃の油浴で１時間攪拌し、反応終了後、減圧濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝６５：３５：５）で分離し、化合物Ｙ（３３ｍｇ，９２％）を得た。この化合物Ｙ（１２ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）を０．０１ＭのＫＰＢ緩衝液（２ｍＬ）に溶かし、カルボキシルエステラーゼ（ＰＬＥ、シグマアルドリッチ社製品、１３ｍｇ）を加え、３５℃で一晩撹拌した。濾過後、ろ液を減圧濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ＡｃＯＥｔ→２％ＡｃＯＥｔ－ＭｅＯＨ）で分離して化合物ｄ（２６ｍｇ、２６％）を得た。
【0061】
［化合物ｅ（５９－４９）の合成］
化合物ｅは、次のようにして合成した。メチル５－アセタミド－８，９－Ｏ－イソプロピリデン－２，３，５－トリ－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－ノン－２－エノピラノソネート（２０３ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）を減圧乾燥して、ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶かし、Ａｒ置換した。氷冷下で撹拌しながら、４－ブロモプロピルシアニド（１７８ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）とＮａＨ（２９ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を加えて３０分撹拌し、室温に戻して一晩反応させた。反応終了後、少量のメタノールを加え撹拌し、ＤＭＦを減圧留去した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ＡｃＯＥｔ－ｎ－Ｈｅｘａｎｅ １：１）で分離し、化合物Ｘ（３８ｍｇ、１５％）を得た。この化合物Ｘ（３８ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を８０％酢酸（２ｍＬ）に溶かした。その後、８０℃の油浴で１時間攪拌した。反応終了後、減圧留去して化合物Ｙを得た。この化合物Ｙにメタノール（２ｍＬ）を加え氷冷下で攪拌しながら０．１ＭのＮａＯＨ（２ｍＬ）を加え、室温に戻して一晩反応させた。反応終了後、ダウエックスイオン交換樹脂５０ＷＸ８を加え中和した。その後、吸引ろ過を行い、ろ液を減圧濃縮し濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝６５：３５：５）で分離し、化合物ｅ（３１ｍｇ、９６％）を得た。
化合物ｅは、次のようにして合成した。メチル５－アセタミド－８，９－Ｏ－イソプロピリデン－２，３，５－トリ－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－ノン－２－エノピラノソネート（２０３ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）を減圧乾燥して、ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶かし、Ａｒ置換した。氷冷下で撹拌しながら、４－ブロモプロピルシアニド（１７８ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）とＮａＨ（２９ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を加えて３０分撹拌し、室温に戻して一晩反応させた。反応終了後、少量のメタノールを加え撹拌し、ＤＭＦを減圧留去した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ＡｃＯＥｔ－ｎ－Ｈｅｘａｎｅ １：１）で分離し、化合物Ｘ（３８ｍｇ、１５％）を得た。この化合物Ｘ（３８ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を８０％酢酸（２ｍＬ）に溶かした。その後、８０℃の油浴で１時間攪拌した。反応終了後、減圧留去して化合物Ｙを得た。この化合物Ｙにメタノール（２ｍＬ）を加え氷冷下で攪拌しながら０．１ＭのＮａＯＨ（２ｍＬ）を加え、室温に戻して一晩反応させた。反応終了後、ダウエックスイオン交換樹脂５０ＷＸ８を加え中和した。その後、吸引ろ過を行い、ろ液を減圧濃縮し濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝６５：３５：５）で分離し、化合物ｅ（３１ｍｇ、９６％）を得た。
【0062】
［化合物ｆ（５９－５５）の合成］
化合物ｆは、次のようにして合成した。メチル５－アセタミド－８，９－Ｏ－イソプロピリデン－２，３，５－トリ－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－ノン－２－エノピラノソネート（５２５ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ）を減圧乾燥して、ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶かし、Ａｒ置換した。氷冷下で撹拌しながら、４－ブロモブチルシアニド（２６８ｍｇ、１．６５ｍｍｏｌ）を加え、さらにＮａＨ（４０ｍｇ、１．６７ｍｍｏｌ）を加えて３０分撹拌し、室温に戻して一晩反応させた。反応終了後、少量のメタノールを加えて撹拌し、ＤＭＦを減圧留去した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ＡｃＯＥｔ）で分離し、化合物Ｘ（１０７ｍｇ、１７％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４０３（Ｍ＋Ｎａ）＋。この化合物Ｘ（１０７ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を８０％酢酸（５ｍＬ）に溶かした。その後、８０℃の油浴で１時間攪拌した。反応終了後、減圧留去して化合物Ｙを得た。この化合物Ｙにメタノール（２ｍＬ）を加え氷冷下で攪拌しながら、０．１ＭのＮａＯＨ（２ｍＬ）を加え、室温に戻して一晩反応させた。反応終了後、ダウエックスイオン交換樹脂５０ＷＸ８を加え中和した。その後、吸引ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝６５：３５：５）で分離し、化合物ｆ（８４ｍｇ、９４％）を得た。
化合物ｆは、次のようにして合成した。メチル５－アセタミド－８，９－Ｏ－イソプロピリデン－２，３，５－トリ－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－ノン－２－エノピラノソネート（５２５ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ）を減圧乾燥して、ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶かし、Ａｒ置換した。氷冷下で撹拌しながら、４－ブロモブチルシアニド（２６８ｍｇ、１．６５ｍｍｏｌ）を加え、さらにＮａＨ（４０ｍｇ、１．６７ｍｍｏｌ）を加えて３０分撹拌し、室温に戻して一晩反応させた。反応終了後、少量のメタノールを加えて撹拌し、ＤＭＦを減圧留去した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ＡｃＯＥｔ）で分離し、化合物Ｘ（１０７ｍｇ、１７％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４０３（Ｍ＋Ｎａ）＋。この化合物Ｘ（１０７ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を８０％酢酸（５ｍＬ）に溶かした。その後、８０℃の油浴で１時間攪拌した。反応終了後、減圧留去して化合物Ｙを得た。この化合物Ｙにメタノール（２ｍＬ）を加え氷冷下で攪拌しながら、０．１ＭのＮａＯＨ（２ｍＬ）を加え、室温に戻して一晩反応させた。反応終了後、ダウエックスイオン交換樹脂５０ＷＸ８を加え中和した。その後、吸引ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝６５：３５：５）で分離し、化合物ｆ（８４ｍｇ、９４％）を得た。
【0063】
［化合物ｇ（ＡＭ－２４）の合成］
化合物ｇは、次のようにして合成した。メチル５－アセタミド－８，９－Ｏ－イソプロピリデン－２，３，５－トリ－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－ノン－２－エノピラノソネート（１００．３ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を減圧乾燥して、ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶かし、Ａｒ置換した。氷冷下で撹拌しながら、１，３－ジブロモプロパン（７１μＬ、０．７０ｍｍｏｌ）と１５－クラウン－５－エーテルを加え、さらにＮａＨ（３１．０ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を加えて３０分撹拌し、室温に戻して一晩反応させた。ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ）で確認後、少量のメタノールを加え撹拌し、ＤＭＦを減圧留去した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ＡｃＯＥｔ→１０％ＡｃＯＥｔ－ＭｅＯＨ）で分離し、化合物Ｘ（３６ｍｇ、３６％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４８８，４９０（Ｍ＋Ｎａ）＋。この化合物Ｘ（４４ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶かし、Ａｒ置換した。室温で攪拌しながらＮａＮ３（１９．７ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を加えた。その後、５０℃の油浴で３時間攪拌した。ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ）で確認後、ＤＭＦを減圧留去した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ＡｃＯＥｔ）で分離し化合物Ｙ（４０ｍｇ、９１％）を得た。この化合物Ｙ（８ｍｇ）を８０％酢酸（２ｍＬ）に溶かした。その後、８０℃の油浴で２時間攪拌した。ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ→ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝６５：３５：５）で確認後、減圧濃縮した。その後、トルエンを２回に分けて加え、減圧留去し、減圧乾燥した。その後、メタノール（２ｍＬ）を加え氷冷下で攪拌しながら０．１ＭのＮａＯＨ（２ｍＬ）を加え、室温に戻して一晩反応させた。反応終了後、ダウエックスイオン交換樹脂５０ＷＸ８を加え中和した。その後、吸引ろ過を行い、ろ液を減圧濃縮し、濃縮残渣をバイオゲルＰ－２ゲルカラム（溶出溶媒；蒸留水）で分離して化合物ｇ（５．２ｍｇ、６５％）を得た。
化合物ｇは、次のようにして合成した。メチル５－アセタミド－８，９－Ｏ－イソプロピリデン－２，３，５－トリ－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－ノン－２－エノピラノソネート（１００．３ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を減圧乾燥して、ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶かし、Ａｒ置換した。氷冷下で撹拌しながら、１，３－ジブロモプロパン（７１μＬ、０．７０ｍｍｏｌ）と１５－クラウン－５－エーテルを加え、さらにＮａＨ（３１．０ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を加えて３０分撹拌し、室温に戻して一晩反応させた。ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ）で確認後、少量のメタノールを加え撹拌し、ＤＭＦを減圧留去した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ＡｃＯＥｔ→１０％ＡｃＯＥｔ－ＭｅＯＨ）で分離し、化合物Ｘ（３６ｍｇ、３６％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４８８，４９０（Ｍ＋Ｎａ）＋。この化合物Ｘ（４４ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶かし、Ａｒ置換した。室温で攪拌しながらＮａＮ３（１９．７ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を加えた。その後、５０℃の油浴で３時間攪拌した。ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ）で確認後、ＤＭＦを減圧留去した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ＡｃＯＥｔ）で分離し化合物Ｙ（４０ｍｇ、９１％）を得た。この化合物Ｙ（８ｍｇ）を８０％酢酸（２ｍＬ）に溶かした。その後、８０℃の油浴で２時間攪拌した。ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ→ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝６５：３５：５）で確認後、減圧濃縮した。その後、トルエンを２回に分けて加え、減圧留去し、減圧乾燥した。その後、メタノール（２ｍＬ）を加え氷冷下で攪拌しながら０．１ＭのＮａＯＨ（２ｍＬ）を加え、室温に戻して一晩反応させた。反応終了後、ダウエックスイオン交換樹脂５０ＷＸ８を加え中和した。その後、吸引ろ過を行い、ろ液を減圧濃縮し、濃縮残渣をバイオゲルＰ－２ゲルカラム（溶出溶媒；蒸留水）で分離して化合物ｇ（５．２ｍｇ、６５％）を得た。
【0064】
［化合物ｈ（ＡＭ－１－１７）の合成］
化合物ｈは、次のようにして合成した。メチル５－アセタミド－８，９－Ｏ－イソプロピリデン－２，３，５－トリ－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－ノン－２－エノピラノソネート（１０１ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を減圧乾燥して、ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶かし、Ａｒ置換した。氷冷下で撹拌しながら１，４－ジブロモブタン（４２μＬ、０．３５ｍｍｏｌ）と１５－クラウン－５－エーテルを加え、さらにＮａＨ（１４ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を加えて３０分撹拌し、室温に戻して一晩反応させた。ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ）で確認後、少量のメタノールを加えて撹拌し、ＤＭＦを減圧留去した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ＡｃＯＥｔ→２％ＡｃＯＥｔ－ＭｅＯＨ）で分離して、化合物Ｘ（２６ｍｇ、２６％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５０２，５０４（Ｍ＋Ｎａ）＋。この化合物Ｘ（２６ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶かし、Ａｒ置換した。室温で攪拌しながらＮａＮ３（１２．８ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を加えた。その後、８０℃の油浴で３時間攪拌した。反応終了後、ＤＭＦを減圧留去した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；５％ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ）で分離し、化合物Ｙ（１２４ｍｇ、８１％）を得た。この化合物Ｙ（１２５ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を８０％酢酸（１０ｍＬ）に溶かした。その後、８０℃の油浴で２時間攪拌した。反応終了後、減圧濃縮した。その後、メタノール（２ｍＬ）を加え氷冷下で攪拌しながら、０．１ＭのＮａＯＨ（２ｍＬ）を加え、室温に戻して一晩反応させた。反応終了後、ダウエックスイオン交換樹脂５０ＷＸ８を加え中和した。減圧濃縮し、濃縮残渣をバイオゲルＰ－２ゲルカラム（溶出溶媒；蒸留水）で分離して化合物ｈ（２２．７ｍｇ、６５％）を得た。
化合物ｈは、次のようにして合成した。メチル５－アセタミド－８，９－Ｏ－イソプロピリデン－２，３，５－トリ－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－ノン－２－エノピラノソネート（１０１ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を減圧乾燥して、ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶かし、Ａｒ置換した。氷冷下で撹拌しながら１，４－ジブロモブタン（４２μＬ、０．３５ｍｍｏｌ）と１５－クラウン－５－エーテルを加え、さらにＮａＨ（１４ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を加えて３０分撹拌し、室温に戻して一晩反応させた。ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ）で確認後、少量のメタノールを加えて撹拌し、ＤＭＦを減圧留去した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ＡｃＯＥｔ→２％ＡｃＯＥｔ－ＭｅＯＨ）で分離して、化合物Ｘ（２６ｍｇ、２６％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５０２，５０４（Ｍ＋Ｎａ）＋。この化合物Ｘ（２６ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶かし、Ａｒ置換した。室温で攪拌しながらＮａＮ３（１２．８ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を加えた。その後、８０℃の油浴で３時間攪拌した。反応終了後、ＤＭＦを減圧留去した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；５％ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ）で分離し、化合物Ｙ（１２４ｍｇ、８１％）を得た。この化合物Ｙ（１２５ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を８０％酢酸（１０ｍＬ）に溶かした。その後、８０℃の油浴で２時間攪拌した。反応終了後、減圧濃縮した。その後、メタノール（２ｍＬ）を加え氷冷下で攪拌しながら、０．１ＭのＮａＯＨ（２ｍＬ）を加え、室温に戻して一晩反応させた。反応終了後、ダウエックスイオン交換樹脂５０ＷＸ８を加え中和した。減圧濃縮し、濃縮残渣をバイオゲルＰ－２ゲルカラム（溶出溶媒；蒸留水）で分離して化合物ｈ（２２．７ｍｇ、６５％）を得た。
【0065】
［化合物ｉ（４５－１２２）の合成］
化合物ｉは、次のようにして合成した。メチル５－アセタミド－８，９－Ｏ－イソプロピリデン－２，３，５－トリ－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－ノン－２－エノピラノソネート（３４５ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を減圧乾燥して、ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶かし、Ａｒ置換した。氷冷下で撹拌しながら１，５－ジブロモペンタン（４２．０μＬ、０．３５ｍｍｏｌ）を加え、さらにＮａＨ（２９ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を加えて３０分撹拌し、室温に戻して一晩反応させた。反応終了後、少量のメタノールを加え撹拌し、ＤＭＦを減圧留去した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ＡｃＯＥｔ→２％ＡｃＯＥｔ－ＭｅＯＨ）で分離し、化合物Ｘ（８７ｍｇ、１８％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５１６（Ｍ＋Ｎａ）＋。この化合物Ｘ（８７ｍｇ、０．１７６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３ｍＬ）に溶かし、Ａｒ置換した。室温で攪拌しながらＮａＮ３（３４ｍｇ，０．１７６ｍｍｏｌ）を加えた。その後、８０℃の油浴で３時間攪拌した。反応終了後、ＤＭＦを減圧留去した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；５％ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ）で分離して化合物Ｙ（１２４ｍｇ、８１％）を得た。この化合物Ｙ（１２４ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を８０％酢酸（１０ｍＬ）に溶かした。その後、８０℃の油浴で２時間攪拌した。反応終了後、減圧濃縮した。その後、メタノール（２ｍＬ）を加え氷冷下で攪拌しながら０．１ＭのＮａＯＨ（２ｍＬ）を加え、室温に戻して一晩反応させた。反応終了後、ダウエックスイオン交換樹脂５０ＷＸ８を加え中和した。吸引ろ過し、ろ液を減圧濃縮して濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝６５：３５：５）で分離し、化合物ｉ（６０ｍｇ、７５％）を得た。
化合物ｉは、次のようにして合成した。メチル５－アセタミド－８，９－Ｏ－イソプロピリデン－２，３，５－トリ－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－ノン－２－エノピラノソネート（３４５ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を減圧乾燥して、ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶かし、Ａｒ置換した。氷冷下で撹拌しながら１，５－ジブロモペンタン（４２．０μＬ、０．３５ｍｍｏｌ）を加え、さらにＮａＨ（２９ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を加えて３０分撹拌し、室温に戻して一晩反応させた。反応終了後、少量のメタノールを加え撹拌し、ＤＭＦを減圧留去した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ＡｃＯＥｔ→２％ＡｃＯＥｔ－ＭｅＯＨ）で分離し、化合物Ｘ（８７ｍｇ、１８％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５１６（Ｍ＋Ｎａ）＋。この化合物Ｘ（８７ｍｇ、０．１７６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３ｍＬ）に溶かし、Ａｒ置換した。室温で攪拌しながらＮａＮ３（３４ｍｇ，０．１７６ｍｍｏｌ）を加えた。その後、８０℃の油浴で３時間攪拌した。反応終了後、ＤＭＦを減圧留去した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；５％ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ）で分離して化合物Ｙ（１２４ｍｇ、８１％）を得た。この化合物Ｙ（１２４ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を８０％酢酸（１０ｍＬ）に溶かした。その後、８０℃の油浴で２時間攪拌した。反応終了後、減圧濃縮した。その後、メタノール（２ｍＬ）を加え氷冷下で攪拌しながら０．１ＭのＮａＯＨ（２ｍＬ）を加え、室温に戻して一晩反応させた。反応終了後、ダウエックスイオン交換樹脂５０ＷＸ８を加え中和した。吸引ろ過し、ろ液を減圧濃縮して濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝６５：３５：５）で分離し、化合物ｉ（６０ｍｇ、７５％）を得た。
【0066】
［化合物ｊ（ＡＭ－１－１８）の合成］
化合物ｊは、次のようにして合成した。メチル５－アセタミド－８，９－Ｏ－イソプロピリデン－２，３，５－トリ－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－ノン－２－エノピラノソネート（１０１ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を減圧乾燥して、ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶かし、Ａｒ置換した。氷冷下で撹拌しながら１，４－ジブロモブタン（４２．０μＬ、０．３５ｍｍｏｌ）と１５－クラウン－５－エーテルを加え、さらにＮａＨ（１４ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を加えて３０分撹拌し、室温に戻して一晩反応させた。反応終了後、少量のメタノールを加え撹拌し、ＤＭＦを減圧留去した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ＡｃＯＥｔ→２％ＡｃＯＥｔ－ＭｅＯＨ）で分離し、化合物Ｘ（２６ｍｇ，２６％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５０２，５０４（Ｍ＋Ｎａ）＋。この化合物Ｘ（３５ｍｇ）を８０％酢酸（３ｍＬ）に溶かした。その後、８０℃の油浴で２時間攪拌した。ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ）で確認後、減圧濃縮した。その後、トルエン（２ｍＬ）を２回に分けて加え、減圧留去し、減圧乾燥して化合物Ｙを得た。この化合物Ｙにメタノール（２ｍＬ）を加え、氷冷下で攪拌しながら０．１ＭのＮａＯＨ（２ｍＬ）を加え、室温に戻して一晩反応させた。反応終了後、ダウエックスイオン交換樹脂５０ＷＸ８を加え中和した。吸引ろ過し、ろ液を減圧濃縮して濃縮残渣をバイオゲルＰ－２ゲルカラム（溶出溶媒；蒸留水）で分離し、化合物ｊ（２２．７ｍｇ、６５％）を得た。
化合物ｊは、次のようにして合成した。メチル５－アセタミド－８，９－Ｏ－イソプロピリデン－２，３，５－トリ－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－ノン－２－エノピラノソネート（１０１ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を減圧乾燥して、ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶かし、Ａｒ置換した。氷冷下で撹拌しながら１，４－ジブロモブタン（４２．０μＬ、０．３５ｍｍｏｌ）と１５－クラウン－５－エーテルを加え、さらにＮａＨ（１４ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を加えて３０分撹拌し、室温に戻して一晩反応させた。反応終了後、少量のメタノールを加え撹拌し、ＤＭＦを減圧留去した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ＡｃＯＥｔ→２％ＡｃＯＥｔ－ＭｅＯＨ）で分離し、化合物Ｘ（２６ｍｇ，２６％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５０２，５０４（Ｍ＋Ｎａ）＋。この化合物Ｘ（３５ｍｇ）を８０％酢酸（３ｍＬ）に溶かした。その後、８０℃の油浴で２時間攪拌した。ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ）で確認後、減圧濃縮した。その後、トルエン（２ｍＬ）を２回に分けて加え、減圧留去し、減圧乾燥して化合物Ｙを得た。この化合物Ｙにメタノール（２ｍＬ）を加え、氷冷下で攪拌しながら０．１ＭのＮａＯＨ（２ｍＬ）を加え、室温に戻して一晩反応させた。反応終了後、ダウエックスイオン交換樹脂５０ＷＸ８を加え中和した。吸引ろ過し、ろ液を減圧濃縮して濃縮残渣をバイオゲルＰ－２ゲルカラム（溶出溶媒；蒸留水）で分離し、化合物ｊ（２２．７ｍｇ、６５％）を得た。
【0067】
［化合物ｋ（ＫＩ－６２－２６）の合成］
化合物ｋは、次のようにして合成した。メチル５－アセタミド－８，９－Ｏ－イソプロピリデン－２，３，５－トリ－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－ノン－２－エノピラノソネート（３４５ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶かし、氷冷下、ＮａＨ（６０％ｗ／ｗ）（４８ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）および１，５－ジブロモペンタン（３４５ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を加え反応を行った。反応終了後、常法で処理した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ＡｃＯＥｔ→１０％ＡｃＯＥｔ－ＭｅＯＨ）で分離し、化合物Ｘ（８７ｍｇ，１８％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５１６（Ｍ＋Ｎａ）＋。この化合物Ｘ（６０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を８０％酢酸（２ｍＬ）に溶かした。その後、８０℃の油浴で１時間攪拌して反応させ、減圧留去した。その後、メタノール（２ｍＬ）を加え、氷冷下で攪拌しながら０．１ＭのＮａＯＨ（２ｍＬ）を加え、室温に戻して一晩反応させた。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝６５：３５：５）で確認後、ダウエックスイオン交換樹脂５０ＷＸ８を加え中和した。吸引ろ過後、減圧濃縮し、濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝６５：３５：５）で分離し、化合物ｋ（５３ｍｇ、９８％）を得た。
化合物ｋは、次のようにして合成した。メチル５－アセタミド－８，９－Ｏ－イソプロピリデン－２，３，５－トリ－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－ノン－２－エノピラノソネート（３４５ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶かし、氷冷下、ＮａＨ（６０％ｗ／ｗ）（４８ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）および１，５－ジブロモペンタン（３４５ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を加え反応を行った。反応終了後、常法で処理した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ＡｃＯＥｔ→１０％ＡｃＯＥｔ－ＭｅＯＨ）で分離し、化合物Ｘ（８７ｍｇ，１８％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５１６（Ｍ＋Ｎａ）＋。この化合物Ｘ（６０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を８０％酢酸（２ｍＬ）に溶かした。その後、８０℃の油浴で１時間攪拌して反応させ、減圧留去した。その後、メタノール（２ｍＬ）を加え、氷冷下で攪拌しながら０．１ＭのＮａＯＨ（２ｍＬ）を加え、室温に戻して一晩反応させた。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝６５：３５：５）で確認後、ダウエックスイオン交換樹脂５０ＷＸ８を加え中和した。吸引ろ過後、減圧濃縮し、濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝６５：３５：５）で分離し、化合物ｋ（５３ｍｇ、９８％）を得た。
【0068】
［化合物ｌ（１４－１２８ａ）の合成］
化合物ｌは、７，８，９位の水酸基をアセチル基で保護したＮ－Ａｃ－ＤＡＮＡ誘導体の５位アミノ基をＢｏｃ化によりジアミド化し、ＴＦＡで処理して生成したアミノ基をＮ－イソプロピル化し、さらに４位の水酸基をプロパルギル基で保護したのち、パラジウム触媒存在下、薗頭カップリング法によりチエニル基を導入した。これを、さらに塩基性条件下、メチルエステルを加水分解することで合成した（参考文献：Tetrahedron, Vol.63, pp.7571-7581, 2007年）。
化合物ｌは、７，８，９位の水酸基をアセチル基で保護したＮ－Ａｃ－ＤＡＮＡ誘導体の５位アミノ基をＢｏｃ化によりジアミド化し、ＴＦＡで処理して生成したアミノ基をＮ－イソプロピル化し、さらに４位の水酸基をプロパルギル基で保護したのち、パラジウム触媒存在下、薗頭カップリング法によりチエニル基を導入した。これを、さらに塩基性条件下、メチルエステルを加水分解することで合成した（参考文献：Tetrahedron, Vol.63, pp.7571-7581, 2007年）。
【0069】
［化合物ｍ（ＳＫ－１－３６）の合成］
化合物ｍは、以下式に示すように、メチル５－アセタミド－８，９－Ｏ－イソプロピリデン－２，３，５－トリ－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－ノン－２－エノピラノソネートの４位の水酸基にアリル基を導入し、以下式に示す化合物Ｘとしたのち、Ｐｄ触媒存在下、クロスカップリング法により化合物Ｙとした。次に８０％酢酸でイソプロピリデン基を脱保護して化合物Ｚとし、塩基性条件下、メチルエステルを加水分解することで合成した。
化合物ｍは、以下式に示すように、メチル５－アセタミド－８，９－Ｏ－イソプロピリデン－２，３，５－トリ－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－ノン－２－エノピラノソネートの４位の水酸基にアリル基を導入し、以下式に示す化合物Ｘとしたのち、Ｐｄ触媒存在下、クロスカップリング法により化合物Ｙとした。次に８０％酢酸でイソプロピリデン基を脱保護して化合物Ｚとし、塩基性条件下、メチルエステルを加水分解することで合成した。
【0070】
【化15】
【0071】
［化合物ｎ（ＲＮ３９７）の合成］
化合物ｎは、８，９位の水酸基をイソプロピリデン基で保護した４－プロパルギル－ＤＡＮＡ誘導体をＭｓＮ３（メタンスルフォニルアジド）、ＮＨ４Ｃｌ、ＮＥｔ３、ＣｕＩを用いた４成分連結反応によりＮ－スルフォニルアミジン基を導入した。さらに８０％酢酸でイソプロピリデン基を脱保護し、塩基性条件下、メチルエステルを加水分解することで合成した（参考文献：Bioorganic Medicinal Chemistry, Vol.19, pp.2418-2427, 2011年及びChem. Pharm. Bull., Vol.61, pp.69-74, 2013年）。
化合物ｎは、８，９位の水酸基をイソプロピリデン基で保護した４－プロパルギル－ＤＡＮＡ誘導体をＭｓＮ３（メタンスルフォニルアジド）、ＮＨ４Ｃｌ、ＮＥｔ３、ＣｕＩを用いた４成分連結反応によりＮ－スルフォニルアミジン基を導入した。さらに８０％酢酸でイソプロピリデン基を脱保護し、塩基性条件下、メチルエステルを加水分解することで合成した（参考文献：Bioorganic Medicinal Chemistry, Vol.19, pp.2418-2427, 2011年及びChem. Pharm. Bull., Vol.61, pp.69-74, 2013年）。
【0072】
［ムンプスウイルスのシアリダーゼ活性阻害試験］
ムンプスウイルスのシアリダーゼ活性阻害試験は、ムンプスウイルスのシアリダーゼを発現する、ムンプスウイルスのヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）発現細胞を調製し、そのＨＮ発現細胞に各化合物を添加した際のシアリダーゼ活性を測定することによって行った。測定方法は具体的には次の通りである。
ムンプスウイルスのシアリダーゼ活性阻害試験は、ムンプスウイルスのシアリダーゼを発現する、ムンプスウイルスのヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）発現細胞を調製し、そのＨＮ発現細胞に各化合物を添加した際のシアリダーゼ活性を測定することによって行った。測定方法は具体的には次の通りである。
【0073】
細胞は、ヒト胎児腎細胞であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養には、Ｄ－ＭＥＭ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製品）に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、シグマ－アルドリッチ社製品）を添加したものを用い、５％ＣＯ２条件下、３７℃で培養した。また、プラスミドは、ｐＣＡＧＧＳベクターにムンプスウイルス １３Ｖ１６５Ｅ２株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド、ｐＣＡＧＧＳ－ＭｕＶ ＨＮを用いた。
【0074】
まず、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートの各ウェルに播種し、５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養して７０％コンフルエントの状態とした。リン酸緩衝液（１３１ｍＭ ＮａＣｌ、１４ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ ７．２、以下ＰＢＳと称する）を各ウェルに５００μＬずつ添加して細胞を洗浄し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製品）を、各ウェルに１２００μＬずつ加えた。トランスフェクション試薬（ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－２９３ Ｒｅａｇｅｎｔ、タカラバイオ株式会社製品）４μＬ／ウェル、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ培地を２００μＬ／ウェル、上述したプラスミドｐＣＡＧＧＳ－ＭｕＶ ＨＮ（ムンプスウイルス：１３Ｖ１６５Ｅ２株由来）を２０００ｎｇ／ウェルを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションし、３７℃で４８時間培養した。ＰＢＳを各ウェルに１０００μＬ添加し、細胞を懸濁したのち遠心分離（４℃、８００×ｇ、３分間）して上清を除去した。これを３回繰り返し、遠心分離により沈降した細胞を１０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ ４．５）５００μＬに懸濁してＨＮ発現細胞懸濁液とした。
【0075】
氷浴した９６ウェルの黒色プレートの各ウェルに、上述のようにして調製したＨＮ発現細胞懸濁液５μＬを加えた。スクリーニング対象のａ～ｏの各化合物を１０ｍＭ 酢酸緩衝液に溶解させて２倍段階希釈液に調製し、５μＬ／ウェル添加した。また、１０ｍＭ 酢酸緩衝液のみを５μＬ／ウェル添加し、ブランクコントロールとした。各ウェルにおいてピペッティングを１０回行い、３７℃で１０分間、氷浴上で１時間静置した。シアリダーゼ活性を蛍光検出できる基質である４ＭＵ－Ｎｅｕ５Ａｃ（４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸、シグマ－アルドリッチ社製品）を精製水で希釈して調製した０．４ｍＭ ４ＭＵ－Ｎｅｕ５Ａｃを各ウェルに２μＬずつ添加し、各ウェルにおいてピペッティングを１０回行い、３７℃で３０分間反応させた。１００ｍＭ 炭酸緩衝液（ｐＨ １０．７）を各ウェルに１００μＬずつ加えて酵素反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｍ２００、テカンジャパン株式会社）を用いて、シアリダーゼとの反応によって遊離した４ＭＵ（４－メチルウンベリフェロン）の励起波長３５６ｎｍ、測定波長４６６ｎｍ（Ｅｘ／Ｅｍ＝３５６ｎｍ／４６６ｎｍ）における蛍光強度を独立して３回測定した。ＩＣ５０値の計算には、ＨＮ発現細胞と４ＭＵ－Ｎｅｕ５Ａｃを添加した時の各ウェルにおける各化合物の最終濃度を使用した。また、統計解析ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５、グラフパッド・ソフトウェア社製品）を使用して以下表３に示すＩＣ５０値と９５％信頼区間（以下、９５％ＣＩと称する）を算出した。
【0076】
【表3】
【0077】
結果を図１（ａ）及び表３に示す。図１（ａ）の横軸は化合物Ｎｏ．を、縦軸はＩＣ５０値を示す。本発明者らは、公知のシアリダーゼ阻害剤である２－デオキシ－２，３－ジデヒドロ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＤＡＮＡ；化合物ａ）よりも高いシアリダーゼ活性阻害効果を示す化合物を見出した。具体的には、化合物ｂ（ＫＳ－２－８９）、化合物ｄ（４８－１６）、化合物ｆ（５９－５５）、化合物ｈ（ＡＭ－１－１７）、化合物ｉ（４５－１２２）及び化合物ｊ（ＡＭ－１－１８）のＩＣ５０は、ＤＡＮＡのＩＣ５０の約４分の１以下であり、このうち、化合物ｂ（ＫＳ－２－８９）のＩＣ５０は、ＤＡＮＡのＩＣ５０の約１０分の１以下であった。このことから、化合物ｂ（ＫＳ－２－８９）、化合物ｄ（４８－１６）、化合物ｆ（５９－５５）、化合物ｈ（ＡＭ－１－１７）、化合物ｉ（４５－１２２）及び化合物ｊ（ＡＭ－１－１８）はムンプスウイルスのシアリダーゼに対し、優れた活性阻害効果を有することが明らかとなった。
【0078】
そこで、特に高い阻害作用を示した化合物ｂ、ｄ及びｉについて、濃度依存的にムンプスウイルスのシアリダーゼ活性を阻害するか否かについて、上述と同様の方法で試験を行った。また、陽性対照として、公知のシアリダーゼ阻害剤であるＤＡＮＡ（化合物ａ）を用いて同様の試験を行った。結果を図１（ｂ）に示す。図１（ｂ）の横軸は化合物濃度を、縦軸は化合物を添加していないブランクコントロールのシアリダーゼ活性を１００％としたときの、各化合物濃度における相対シアリダーゼ活性（％）を示す。ＤＡＮＡ（化合物ａ）は白丸形のマーカー（○）、化合物ｂ（ＫＳ－２－８９）は三角形のマーカー（▲）、化合物ｄ（４８－１６）は四角形のマーカー（□）及び化合物ｉ（４５－１２２）は黒丸形のマーカー（●）で示している。
【0079】
この結果によれば、化合物ｂ（ＫＳ－２－８９）、ｄ（４８－１６）及びｉ（４５－１２２）は、濃度依存的にムンプスウイルスのシアリダーゼ活性を阻害し、いずれも公知のシアリダーゼ阻害剤であるＤＡＮＡ（化合物ａ）よりも高い阻害効果を示すことがわかった。
【0080】
［実施例２］
２．ムンプスウイルスの増殖阻害作用の検討
実施例１において、高いシアリダーゼ阻害効果を有することが見出された化合物ｂ、ｄ及びｉについて、ムンプスウイルスの増殖阻害能を調べた。ムンプスウイルスの増殖阻害能は、ムンプスウイルスに感染させてから４８時間後の培養上清のウイルス感染価を測定することで調べた。測定方法は具体的には次の通りである。
２．ムンプスウイルスの増殖阻害作用の検討
実施例１において、高いシアリダーゼ阻害効果を有することが見出された化合物ｂ、ｄ及びｉについて、ムンプスウイルスの増殖阻害能を調べた。ムンプスウイルスの増殖阻害能は、ムンプスウイルスに感染させてから４８時間後の培養上清のウイルス感染価を測定することで調べた。測定方法は具体的には次の通りである。
【0081】
宿主細胞はアフリカミドリザル腎由来細胞である、Ｖｅｒｏ細胞を用いた。Ｖｅｒｏ細胞の培養には、ＭＥＭ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製品）に５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、シグマ－アルドリッチ社製品）を添加したものを用い、５％ＣＯ２条件下、３７℃で培養した。
【0082】
まず、Ｖｅｒｏ細胞を４８ウェルプレートの各ウェルに播種し、５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養してコンフルエントの状態にした。２６×１０－３赤血球凝集活性（ＨＡＵ）のムンプスウイルス（１３Ｖ１６５Ｅ２株）－無血清ＭＥＭ懸濁液を５００μＬずつ各ウェルに添加して、３７℃で１時間静置し、Ｖｅｒｏ細胞にムンプスウイルス１３Ｖ１６５Ｅ２株を感染させた。５００μＬ／ウェルのＰＢＳで細胞を洗浄後、２μｇ／ｍＬのウシ膵臓由来アセチル化トリプシン（品番：Ｔ６７６３、シグマ－アルドリッチ社製品）含有の無血清ＭＥＭを５００μＬ／ウェルで置換すると共に、化合物ａ（ＤＡＮＡ）、化合物ｂ、ｄ及びｉを無血清ＭＥＭで溶解させた無血清ＭＥＭ溶液を、各化合物の最終濃度が０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ又は１００μＭとなるようにそれぞれウェルに添加した。また、化合物を添加しないものをブランクコントロールとした。添加後、５％ＣＯ２、３７℃で４８時間培養した。そのウイルス培養液を遠心（４℃、８００×ｇ、９分間）して細胞を沈降させ、ウイルス培養上清２００μＬを回収した。上清中のウイルス感染価を測定するまで－８０℃にて保存した。
【0083】
上清中のウイルス感染価の測定は、次のようにして行った。Ｖｅｒｏ細胞を１２ウェルプレートの各ウェルに播種し、５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養してコンフルエントの状態にした。１０００μＬ／ウェルのＰＢＳで細胞を洗浄後、上記で回収したウイルス培養上清の１０１～３倍の希釈液を１０００μＬ／ウェルで添加し、３７℃で３０分間静置して感染させた。１０００μＬ／ウェルのＰＢＳで細胞を洗浄後、２μｇ／ｍＬのウシ膵臓由来アセチル化トリプシン含有の１．２％結晶化セルロース（品名：アビセル、ＦＭＣバイオポリマー社製品）－無血清培地（ＳＦＭ；品番：１２３０００６７、品名：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製品）懸濁液２０００μＬ／ウェルで置換し、５％ＣＯ２、３７℃で４８時間培養した。培養上清を除去し、細胞を１０００μＬ／ウェルのＰＢＳで洗浄後、メタノールを５００μＬ／ウェルで添加し、室温で１分間固定化した。細胞を１０００μＬ／ウェルのＰＢＳで洗浄後、一次抗体として、ＰＢＳで２０００倍に希釈したマウス抗ムンプスウイルス核タンパク質のモノクローナル抗体７Ｂ１０（品番：ａｂ９８８０、アブカム社製品）５００μＬ／ウェルを加え、室温で１時間反応させた。細胞を５００μＬ／ウェルのＰＢＳで洗浄後、二次抗体として、ＰＢＳで３０００倍に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体（品番：１１５－０３６－０６８、ジャクソンイムノリサーチ社製品）５００μＬ／ウェルを加え、室温で１時間反応させた。細胞を５００μＬ／ウェルのＰＢＳで洗浄後、Ｎ，Ｎ－ジエチル－ｐ－フェニレンジアミン二塩酸塩（以下ＤＥＰＤＡ）発色液（０．１Ｍ クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）：１０ｍＬ、０．０６Ｍ ＤＥＰＤＡのアセトニトリル溶液：２００μＬ、０．１Ｍ ４－クロロ－１－ナフトールのアセトニトリル溶液：２００μＬ、３０％Ｈ２Ｏ２：１μＬ）５００μＬ／ウェルを加え、室温でウイルス感染細胞を発色させ、感染細胞数をカウントした。感染細胞数から感染価（％）を測定した。感染価（％）は、化合物を添加していないブランクコントロールの感染価を１００％としたときの相対感染価を示す。図２のグラフは、独立した３回の測定における相対感染価の平均値±標準誤差で示している。図２のグラフ中の＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊はｐ＜０．０１及び＊はｐ＜０．０５、いずれもｖｓブランクコントロールを示す（Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）。統計解析ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５、グラフパッド・ソフトウェア社製品）を使用して、以下表４に示す５０％効果濃度（５０％ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、以下ＥＣ５０）値と９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を算出した。
【0084】
【表4】
【0085】
この結果によれば、化合物ｂ（ＫＳ－２－８９）、ｄ（４８－１６）及びｉ（４５－１２２）は、公知のシアリダーゼ阻害剤であるＤＡＮＡ（化合物ａ）よりも著しく高いムンプスウイルスの増殖阻害効果を示した。ここで、化合物ｂ、ｄ及びｉのうち、シアリダーゼ活性阻害効果に最も優れるのは化合物ｂ（ＫＳ－２－８９）であったが、ウイルス増殖阻害効果は化合物ｉ（４５－１２２）が最も優れていた。化合物ｉのＥＣ５０は、ＤＡＮＡのＥＣ５０の２４２２分の１であった。このことから、化合物ｉには、単なるムンプスウイルスのシアリダーゼ阻害によるウイルス増殖阻害効果だけでなく、宿主細胞へのムンプスウイルスの感染自体を阻害する効果も有することが推測された。
【0086】
［実施例３］
３．ムンプスウイルスの感染阻害作用の検討（１）
（赤血球凝集阻害試験）
実施例２において、ムンプスウイルスの増殖阻害効果が確認された化合物ｂ、ｄ及びｉについて、さらに、感染阻害効果も有するかどうか確認すべく、ムンプスウイルスの感染阻害能を調べた。ムンプスウイルスの感染阻害能は、赤血球凝集阻害活性（ＨＩ）を測定することで調べた。測定方法は具体的には次の通りである。
３．ムンプスウイルスの感染阻害作用の検討（１）
（赤血球凝集阻害試験）
実施例２において、ムンプスウイルスの増殖阻害効果が確認された化合物ｂ、ｄ及びｉについて、さらに、感染阻害効果も有するかどうか確認すべく、ムンプスウイルスの感染阻害能を調べた。ムンプスウイルスの感染阻害能は、赤血球凝集阻害活性（ＨＩ）を測定することで調べた。測定方法は具体的には次の通りである。
【0087】
９６ウェルＵ底プレート（品番：４８４５－９６Ｕ、ワトソン社製品）のウェルに、ＰＢＳで４０μＭから２倍段階希釈した化合物ａ（ＤＡＮＡ）、化合物ｂ、ｄ及びｉをそれぞれ、２５μＬ／ウェルとなるように添加した。また、陰性コントロールとして、ＰＢＳを２５μＬ添加した。各ウェルに、ＰＢＳで希釈した４ＨＡＵのムンプスウイルス懸濁液を２５μＬずつ加えて混合後、４℃で１時間静置した。各ウェルに、０．８％モルモット赤血球－ＰＢＳ懸濁液を５０μＬずつ加えて混合後、４℃で４時間静置した。静置後のプレートにおける赤血球凝集像をスキャナー（品番：ＧＴ－Ｓ６４０、セイコーエプソン社製品）で画像データとした。赤血球凝集阻害活性（ＨＩ）は、凝集阻害が見られる各化合物の最小濃度を示す。結果を以下表５に示す。
【0088】
【表5】
【0089】
この結果によれば、化合物ｂ（ＫＳ－２－８９）、ｄ（４８－１６）及びｉ（４５－１２２）は、公知のシアリダーゼ阻害剤であるＤＡＮＡ（化合物ａ）と同等又はそれ以下の化合物濃度での赤血球凝集阻害作用が認められた。特に、化合物ｂとｉは、ＤＡＮＡよりも低い化合物濃度で赤血球凝集阻害作用が認められており、ムンプスウイルスに対する受容体結合の阻害効果を有することが見出された。
【0090】
［実施例４］
４．ムンプスウイルスの感染阻害作用の検討（２）
引き続き、化合物ｂ、ｄ及びｉによるムンプスウイルスの感染阻害作用について調べた。本実施例では、ムンプスウイルスに感染させてから４８時間後の感染細胞数を測定することでムンプスウイルスの感染阻害能を調べた。測定方法は具体的には次の通りである。
４．ムンプスウイルスの感染阻害作用の検討（２）
引き続き、化合物ｂ、ｄ及びｉによるムンプスウイルスの感染阻害作用について調べた。本実施例では、ムンプスウイルスに感染させてから４８時間後の感染細胞数を測定することでムンプスウイルスの感染阻害能を調べた。測定方法は具体的には次の通りである。
【0091】
Ｖｅｒｏ細胞を１２ウェルプレートの各ウェルに播種し、５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養してコンフルエントの状態にした。他方、ムンプスウイルス（感染価２０００フォーカス形成単位（ＦＦＵ／ｍＬ））－無血清ＭＥＭ懸濁液に、化合物ａ（ＤＡＮＡ）、化合物ｂ、ｄ及びｉを、各化合物の最終濃度が１μＭ、１０μＭ又は１００μＭとなるようにそれぞれ添加して、３７℃で１時間反応させた。１２ウェルプレートの各ウェルに１０００μＬのＰＢＳを添加してＶｅｒｏ細胞を洗浄後、各化合物を含有したムンプスウイルス－無血清ＭＥＭ懸濁液をそれぞれ５００μＬずつウェルに加え、５％ＣＯ２、３７℃で３０分間感染させた。ウイルス懸濁液を除去した後、各ウェルに２μｇ／ｍＬのウシ膵臓由来アセチル化トリプシン含有の１．２％結晶化セルロースアビセル－ＳＦＭ懸濁液を２０００μＬずつ添加し、５％ＣＯ２、３７℃で４８時間培養した。細胞を１０００μＬ／ウェルのＰＢＳで洗浄後、メタノールを５００μＬ／ウェルで添加し、室温で１分間固定化した。細胞を１０００μＬ／ウェルのＰＢＳで洗浄後、一次抗体として、ＰＢＳで２０００倍に希釈したマウス抗ムンプスウイルス核タンパク質のモノクローナル抗体７Ｂ１０を５００μＬずつ各ウェルに加え、室温で１時間反応させた。細胞を５００μＬ／ウェルのＰＢＳで洗浄後、二次抗体として、ＰＢＳで３０００倍に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体を５００μＬずつ各ウェルに加え、室温で１時間反応させた。細胞を５００μＬ／ウェルのＰＢＳで洗浄後、各ウェルにＤＥＰＤＡ発色液を５００μＬずつ加え、室温でウイルス感染細胞を発色させ、フォーカス（感染細胞の集団）の数をカウントした。フォーカス数（％）は、化合物を添加していないブランクコントロールのフォーカス数を１００％とした時の相対数を示す。図３のグラフは、独立した３回の測定における相対値の平均値±標準誤差で示している。図３のグラフ中の＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊はｐ＜０．０１及び＊はｐ＜０．０５、いずれもｖｓブランクコントロールを示す（Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）。統計解析ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５、グラフパッド・ソフトウェア社製品）を使用して、以下表４に示す５０％効果濃度（ＥＣ５０）値と９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を算出した。
【0092】
【表6】
【0093】
この結果によれば、化合物ｂ（ＫＳ－２－８９）及び化合物ｉ（４５－１２２）は、ムンプスウイルスの感染阻害効果を有することが明らかとなった。特に、化合物ｉ（４５－１２２）はＥＣ５０が３．９８と最も小さく、感染阻害効果に優れていることがわかった。この結果によれば、化合物ｂ（ＫＳ－２－８９）及び化合物ｉ（４５－１２２）は、ムンプスウイルスの増殖阻害効果だけでなく、ムンプスウイルスの感染阻害効果も有することが明らかとなった。
【0094】
［実施例５］
５．シアリダーゼ阻害作用の特異性の検討
これまでの試験において、化合物ｂ、ｄ及びｉは、ムンプスウイルスのシアリダーゼ活性を阻害する作用を有すると共に、ムンプスウイルスの増殖阻害作用・感染阻害作用を有することが見出された。そこで、他のウイルス種のシアリダーゼに対しても、シアリダーゼ活性の阻害作用を有するのかどうか確認する試験を行った。具体的には、各種ウイルスのシアリダーゼ発現細胞を調製し、そのシアリダーゼ発現細胞に化合物ｂ、ｄ又はｉを添加した際のシアリダーゼ活性を測定した。本実施例では、ウイルス種として、ムンプスウイルス１３Ｖ１６５Ｅ２株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清１型Ｃ３５株、Ａ型インフルエンザウイルスＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ Ｈ３Ｎ２株を選択し、これらのシアリダーゼ発現細胞を調製した。具体的には、プラスミドは以下のものを用いた。
・ｐＣＡＧＧＳ－ＭｕＶ ＨＮ：ｐＣＡＧＧＳベクターにムンプスウイルス １３Ｖ１６５Ｅ２株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド（実施例１で用いたものと同じ）。
・ｐＣＡＧＧＳ－ｈＰＩＶ１ ＨＮ：ｐＣＡＧＧＳベクターにヒトパラインフルエンザウイルス血清１型Ｃ３５株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳ－ＨＫ６８ ＮＡ：ｐＣＡＧＧＳベクターにＡ型インフルエンザウイルスＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ Ｈ３Ｎ２株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド
５．シアリダーゼ阻害作用の特異性の検討
これまでの試験において、化合物ｂ、ｄ及びｉは、ムンプスウイルスのシアリダーゼ活性を阻害する作用を有すると共に、ムンプスウイルスの増殖阻害作用・感染阻害作用を有することが見出された。そこで、他のウイルス種のシアリダーゼに対しても、シアリダーゼ活性の阻害作用を有するのかどうか確認する試験を行った。具体的には、各種ウイルスのシアリダーゼ発現細胞を調製し、そのシアリダーゼ発現細胞に化合物ｂ、ｄ又はｉを添加した際のシアリダーゼ活性を測定した。本実施例では、ウイルス種として、ムンプスウイルス１３Ｖ１６５Ｅ２株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清１型Ｃ３５株、Ａ型インフルエンザウイルスＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ Ｈ３Ｎ２株を選択し、これらのシアリダーゼ発現細胞を調製した。具体的には、プラスミドは以下のものを用いた。
・ｐＣＡＧＧＳ－ＭｕＶ ＨＮ：ｐＣＡＧＧＳベクターにムンプスウイルス １３Ｖ１６５Ｅ２株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド（実施例１で用いたものと同じ）。
・ｐＣＡＧＧＳ－ｈＰＩＶ１ ＨＮ：ｐＣＡＧＧＳベクターにヒトパラインフルエンザウイルス血清１型Ｃ３５株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳ－ＨＫ６８ ＮＡ：ｐＣＡＧＧＳベクターにＡ型インフルエンザウイルスＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ Ｈ３Ｎ２株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド
【0095】
実施例１のシアリダーゼ活性阻害試験において使用したプラスミドを、上述した３種のプラスミドにそれぞれ替えた以外は、実施例１と同様にして各種ウイルスのシアリダーゼ発現細胞を調製した。実施例１と同様の材料及び方法により、各種ウイルスのシアリダーゼ発現細胞に化合物ｂ、ｄ及びｉを添加した際のシアリダーゼ活性を測定した。結果を図４のグラフに示す。各グラフの縦軸はブランクコントロールのシアリダーゼ活性を１００％としたときの、各化合物濃度における相対シアリダーゼ活性（％）を示す。図４のグラフは、独立した３回の測定における相対値の平均値±標準誤差で示している。図４のグラフ中の＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊はｐ＜０．０１及び＊はｐ＜０．０５、いずれもｖｓブランクコントロールを示す（Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）。
【0096】
この結果によれば、ＤＡＮＡ（化合物ａ）は、ムンプスウイルスのシアリダーゼだけでなく、Ａ型ヒトインフルエンザウイルスのシアリダーゼ及びヒトパラインフルエンザウイルス１型のシアリダーゼに対しても阻害効果を示した。しかしながら、化合物ｂ、ｄ及びｉは、ムンプスウイルスのシアリダーゼに対する阻害効果は顕著であるが、他のウイルス種のシアリダーゼに対する阻害効果は弱いものであった。特に化合物ｂ（ＫＳ－２－８９）及び化合物ｉ（４５－１２２）は、他のウイルス種のシアリダーゼに対する阻害効果が小さく、ムンプスウイルス特異性を示した。
【0097】
［実施例６］
６．細胞毒性試験
本実施例では、化合物ｂ、ｄ及びｉが、細胞に与える毒性の程度を調べるため、細胞毒性試験を行った。試験は、市販の細胞毒性試験キット（品名：ＣｙｔｏＴｏｘ－ＯＮＥ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ、プロメガ社製品）を用いて行った。この細胞毒性試験キットにより、細胞毒性を起こし、細胞膜から漏出した乳酸脱水素酵素（Ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＬＤＨ）の酵素活性量を二段階の酵素反応により測定した。この試験キットに付属するＬｙｓｉｓ試薬は、実験条件において全細胞を溶解させて細胞毒性を起こすことで、最大のＬＤＨ放出量を求めることができる。この時の最大ＬＤＨ量を陽性コントロールとした。
６．細胞毒性試験
本実施例では、化合物ｂ、ｄ及びｉが、細胞に与える毒性の程度を調べるため、細胞毒性試験を行った。試験は、市販の細胞毒性試験キット（品名：ＣｙｔｏＴｏｘ－ＯＮＥ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ、プロメガ社製品）を用いて行った。この細胞毒性試験キットにより、細胞毒性を起こし、細胞膜から漏出した乳酸脱水素酵素（Ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＬＤＨ）の酵素活性量を二段階の酵素反応により測定した。この試験キットに付属するＬｙｓｉｓ試薬は、実験条件において全細胞を溶解させて細胞毒性を起こすことで、最大のＬＤＨ放出量を求めることができる。この時の最大ＬＤＨ量を陽性コントロールとした。
【0098】
Ｖｅｒｏ細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養してコンフルエントの状態にした。各ウェルにＰＢＳを１００μＬずつ添加して細胞を洗浄後、化合物ａ（ＤＡＮＡ）、化合物ｂ、ｄ及びｉについて、最終濃度０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ又は１００μＭとなるように調製した各化合物の水溶液を１μＬ／ウェル及びＳＦＭを１００μＬ／ウェルずつ添加して、５％ＣＯ２、３７℃で２４時間培養した。陽性コントロールとして化合物を添加していない細胞に試験キット付属のＬｙｓｉｓ試薬を２μＬ／ウェル添加して、３０分間、室温で静置した。各ウェルに、ＣｙｔｏＴｏｘ－ＯＮＥ Ｒｅａｇｅｎｔ溶液を１００μＬずつ加え、室温で１０分間反応させた後、試験キット付属の反応停止液を５０μＬずつ加えて反応を停止させた。マイクロプレートリーダーで励起波長５６０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍ（Ｅｘ／Ｅｍ＝５６０ｎｍ／５９０ｎｍ）における蛍光強度を測定した。結果を図５のグラフに示す。細胞毒性（％）は、陽性コントロールの測定値を１００％としたときの、独立した３回の測定における相対値の平均値±標準誤差を示す。
【0099】
この結果によれば、ＤＡＮＡ（化合物ａ）を含め、いずれの化合物についても、細胞毒性は観察されず、ＤＡＮＡ同様の安全性を有することが示された。
【0100】
本発明は、上記の実施形態又は実施例に限定されるものでなく、特許請求の範囲に記載された発明の要旨を逸脱しない範囲内での種々、設計変更した形態も技術的範囲に含むものである。
【産業上の利用可能性】
【0101】
本発明は、ムンプスウイルスに対する抗ウイルス剤及びムンプスウイルス感染症の予防・治療剤を提供するものであり、医薬及び医療等の分野の産業において幅広く役立つものである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】